NO338640B1 - Fremgangsmåte for påvisning av genmutasjon ved amplifisering av DNA med et mutasjonssete ved hjelp av DNA-polymerase, hybridisering og påvisning av en hybrid som dannes ved affinitetskromatografi. - Google Patents

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å påvise en basesekvens, og mer spesielt en fremgangsmåte for å påvise en basesekvens som inneholder et mutasjonssete, slik som en punktmutasjon, for å derved påvise en genmutasjon.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Det foreligger et antall genpolymorfismer i genomet som har blitt ansett å være sterkt assosiert med mottakelighet for sykdommer, individuelle variasjoner i legemiddel-metabolisme og lignende. Påvisningen av genpolymorfismen er uunnværlig for såkalt skreddersydd medisin og blir en av de mest viktige temaene av kliniske applikasjoner i genomisk forskning. Blant annet er mye interesse i den senere tid fokusert på SNP (enkeltnukleotidpolymorfisme, genpolymorfisme som er forårsaket av substitusjon av en enkelt base) som en markør for genpolymorfismen, og en stor mengde forskningsmidler har blitt brukt på denne på en global basis. På den annen side har data fra genmutasjoner som er assosiert med ulike genetiske sykdommer blitt akkumulert i databaser i kraft av progresjonen i molekylærgenetisk forskning. I kraft av dette har det blitt virkelighet å utføre diagnosen av genetiske sykdommer eller forutsigelsen av kliniske kategorier ved å screene for kjente genmutasjoner som allerede er funnet å være patogene på bakgrunn av disse databasene. Spesielt er en genmutasjon som forekommer med høy frekvens i visse populasjoner eller mellom raser, av stor diagnostisk verdi.

Genpolymorfismen og genmutasjonen inkluderer for eksempel en basesubstitusjon, -delesjon, -innskudd, og variasjoner i antallet repeterte sekvenser, og blant dem utgjør en punktmutasjon forårsaket av substitusjon av en enkelt base majoriteten. En fremgangsmåte for enkel og rask påvisning av en punktmutasjon er uunnværlig for å anvende resultatene av human genomforskning til kliniske formål.

Til nå har en mengde ulike fremgangsmåter blitt funnet opp for å påvise en punktmutasjon (se Cotton RGH. Mutation Detection. Sidene 1-198, Oxford University Press, Oxford, 1997). Typiske fremgangsmåter inkluderer den allelspesifikke oligonukleotid-hybridiseringsfremgangsmåten (ASO), den allelspesifikke amplifiseringsfremgangsmåten, restriksjonsenzymfordøyingsfremgangsmåten, ligasekjedereaksjonen og minisekvenserings-fremgangsmåten. Disse fremgangsmåtene er avhengige av kompliserte prosedyrer, inkludert hybridisering eller elektroforese etter DNA-amplifisering. På den annen side erTaqMan-fremgangsmåten, invasjonsanalysen, DNA-mikroarray (DNA-chip)-analysen, TOF-MASS-fremgangsmåten ved hjelp av et massespektrometer og lignende, som nylig har blitt utviklet for å fremme den humane genomanalysen og forskningen, velegnet til å behandle et stort antall prøver. Imidlertid krever disse fremgangsmåtene dyre spesialiserte instrumenter og kan ikke utføres i kliniske laboratorier på noen enkel måte. Alternativt er SSCP-fremgangsmåten, den kjemiske kløvingsfremgangsmåten og DHPLC-fremgangsmåten meget benyttet for screening av genmutasjoner, og er svært effektive for bred screening av ukjente genmutasjoner, men er utilstrekkelige for pålitelig påvisning av en kjent mutasjon. I tillegg krever påvisningen av en punktmutasjon ved hjelp av sekvenseringsfremgangsmåten kompliserte prosedyrer og høye kostnader, og er unektelig av for stor kvalitet for påvisningen av en kjent mutasjon. Per i dag involverer alle disse fremgangsmåtene som er beskrevet ovenfor, spesiell behandling som blir utført på et genforskningslaboratorium og er vanskelig å benytte i raske utførelser i kliniske settinger (eller ved sykesengen).

Prober som er anvendt i ASO-fremgangsmåten har vanligvis vært av 15- til 25-mer (se Saiki RK, Erlich HA.) Påvisning av mutasjoner ved hjelp av hybridisering med sekvens-spesifikke oligonukleotidprober. I: Mutation Detection: A Practical Approach. Sidene 113-129, IRL Press, Oxford, 1998). Videre er det kjent at spesifisiteten til en merket probe for hybridisering blir forbedret ved å benytte et oligonukleotid som konkurrerer med proben (se Nozari G, Rahbar S, Wallace RB. Discrimination of the transcript of the allelic human p-globin genes pA, ps and pc using oligodeoxynucleotide hybridization probes, Gene 43: 23-28, 1986).

Både WO 9206216 og WO 9011369 omtaler fremgangsmåter for amplifisering og hybridisering av nukleinsyrer, men skiller seg fra foreliggende oppfinnelse ved at reaksjonene ikke finner sted i ett reaksjonssystem, men utføres i separate trinn.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Et mål for foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en fremgangsmåte som enkelt og raskt påviser en genmutasjon.

De gjeldende oppfinnerne har for å oppnå foreliggende oppfinnelse anvendt funnene av at anvendelsen av visse primere og prober under visse betingelser muliggjør både amplifisering og hybridisering av nukleinsyrer i ett reaksjonssystem, og også muliggjør en enkel påvisning av et hybrid dannet ved hybridiseringen.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer det følgende:

(1) En fremgangsmåte for å påvise en basesekvens som omfatter trinnene med å: amplifisere DNA som inneholder en målbasesekvens som skal påvises som har et mutasjonssete ved å anvende DNA-polymerase, hybridisere det amplifiserte DNA til en hybridiseringsprobe som har en basesekvens som er komplementær til målbasesekvensen som skal påvises, og påvise en hybrid dannet ved hybridiseringen, hvor minst én av primerne som skal benyttes i DNA-amplifiseringen, er merket med en første markør, slik at det amplifiserte DNA vil være merket med den første markøren, hybridiseringsproben er merket med en andre markør og inneholdt i en reaksjonsløsning for å få til DNA-amplifiseringen, basesekvensen til hybridiseringsproben er designet slik at den ikke inhiberer DNA-amplifiseringen, og hybriden blir påvist ved hjelp av affinitetskromatografi ved anvendelsen av den første og den andre markøren. (2) Fremgangsmåten ifølge punkt (1), hvor mutasjonssetet er en punktmutasjon og reaksjonsløsningen for å utføre DNA-amplifiseringen inneholder et umerket oligonukleotid som har en basesekvens som er forskjellig i en enkel base på posisjonen for punktmutasjonen i forhold til basesekvensen til den merkede hybridiseringsproben, i en mengde som er tilstrekkelig til å forbedre spesifisiteten for hybridisering av det amplifiserte DNA til hybridiseringsproben. (3) Fremgangsmåten ifølge punkt (1) eller (2) hvor DNA-amplifiseringen blir utført ved hjelp av PCR. (4) Et sett som omfatter: primere for å amplifisere DNA inneholdende en målbasesekvens som skal påvises, som har et mutasjonssete, ved å benytte DNA-polymerase, en hybridiseringsprobe som haren base som er komplementær til målbasesekvensen som skal påvises, og en teststripe for affinitetskromatografi, hvor minst én av primerne som skal benyttes i DNA-amplifiseringen er merket med en første markør, slik at det amplifiserte DNA vil være merket med den første markøren, hybridiseringsproben er merket med en andre markør, basesekvensen til hybridiseringsproben er designet slik at den ikke inhiberer DNA-amplifiseringen, og teststripen muliggjør påvisningen av en hybrid av det amplifiserte DNA og hybridiseringsproben med anvendelsen av det første og den andre markøren. (5) Settet ifølge punkt (4) der mutasjonssetet er en punktmutasjon og der settet ytterligere omfatter et umerket oligonukleotid som har en basesekvens som er forskjellig i én enkelt base på posisjonen for punktmutasjonen i forhold til basesekvensen til den merkede hybridiseringsbasen.

(6) Settet ifølge punkt (4) eller (5) der primerne er primere for PCR.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 viser prinsippet for påvisningsfremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse (når normalt DNA blir benyttet som en prøve). Fig. 2 viser prinsippet for påvisningsfremgangsmåten ifølge oppfinnelsen (når mutant-DNA blir benyttet som en prøve). Fig. 3 viser et eksempel på prosedyre som er benyttet i påvisningsfremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Fig. 4 viser resultatet av påvisning (kromatogrambilder) i tilfellet der det er benyttet en 17-mer hybridiseringsprobe. Fig. 5 viser resultatet av påvisning (kromatogrambilder) i tilfellet der det er benyttet en 17-mer hybridiseringsprobe og der en konkurrerende probe er tilsatt. Fig. 6 viser resultatet av påvisning (kromatogrambilder) i tilfellet der hybridiseringsprober av ulike lengder er benyttet og en konkurrerende probe er tilsatt. Fig. 7 viser resultatet av påvisning (kromatogrambilder) i tilfellet der det er benyttet en 12-mer hybridiseringsprobe og der en konkurrerende probe er tilsatt. Fig. 8 viser resultatet av påvisningen (kromatogrambilder) av en rekke mutasjoner. Fig. 9 viser resultatet av påvisningen (kromatogrambilder) av en rekke mutasjoner.

Beste utførelsesform av oppfinnelsen

Påvisningsfremgangsmåte ifølge den foreliggende oppfinnelsen

I foreliggende oppfinnelse blir det tilveiebrakt en fremgangsmåte for å påvise en basesekvens som omfatter trinnene med å: amplifisere DNA som inneholder en målbasesekvens som skal bli påvist, som har et mutasjonssete, ved anvendelse av DNA-polymerase, hybridisere det amplifiserte DNA til en hybridiseringsprobe som har en basesekvens som er komplementær med målbasesekvensen som skal bli påvist, og påvise en hybrid som blir dannet ved hybridiseringen,

som er kjennetegnet ved at minst én av primerne som skal anvendes i DNA-amplifiseringen, er merket med en første markør, slik at det amplifiserte DNA vil være merket med den første markøren, hybridiseringsproben er merket med en andre markør og inneholdt i en reaksjonsløsning for å få til DNA-amplifiseringen, basesekvensen til hybridiseringsproben er designet slik at den ikke inhiberer DNA-amplifiseringen og hybriden blir påvist ved hjelp av affinitetskromatografi med anvendelsen av den første og den andre markøren. I det følgende vil hvert av trinnene bli beskrevet.

(1) DNA-amplifisering

DNA-amplifiseringen blir utført, hvis DNA-polymerase blir anvendt, uten noen spesiell begrensning. Enhver amplifiseringsfremgangsmåte som omfatter trinnene med å syntetisere DNA ved hjelp av DNA-polymerase, kan anvendes. Eksempler på DNA-amplifiseringsfremgangsmåten inkluderer PCR-, TMA-, NASBA- og LAMP-fremgangsmåter.

Syntesen av DNA med DNA-polymerase krever primere. Primerne blir designet med en fremgangsmåte som er kjent på fagområdet, avhengig av amplifiseringsfremgangsmåten som skal anvendes og målbasesekvensen som skal påvises. I foreliggende oppfinnelse er minst én av primerne som skal anvendes i DNA-amplifiseringen merket med en første markør, slik at det amplifiserte DNA vil være merket med den første markøren.

For eksempel når DNA-amplifiseringen blir utført ved hjelp av PCR-fremgangsmåten, blir et par med primere anvendt og minst én av disse er merket slik at det amplifiserte DNA kan bli merket. Alternativt er en primer som virker på stadiet for DNA-syntese i DNA-amplifisering ved hjelp av en NASBA- og TMA-fremgangsmåtene, eller minst én av de indre primerne i DNA-amplifisering ved hjelp av LAMP-fremgangsmåten, merket, for derved å tillate merkingen av det amplifiserte DNA.

Merkingen av primere ble utført slik at DNA-syntesereaksjonen ikke blir inhibert. Slik merking kan utføres i henhold til fremgangsmåter som er kjent på fagområdet, og en primer blir vanligvis merket på 5'-enden.

En markør som skal anvendes i merkingen kan være de til hvilket et korresponderende stoff kan være biospesifikt bundet. Et par av markøren og stoffet som biospesifikt er bundet dertil, inkluderer et antigen og et antistoff, et enzym og en inhibitor, en sukkerkjede og lektin, et hormon og en reseptor, og et metallbindende protein og et metallelement. Nærmere bestemt kan et par av digoksigenin og et anti-digoksigenin-antistoff og et par av biotin og streptavidin bli benyttet. I disse parene kan hvilken som helst av de to være en markør. Imidlertid er partneren med minst molekylvekt vanligvis anvendt som en markør.

Primere og DNA-amplifiseringsbetingelser som skal anvende, blir passende justert på basis av type av amplifiseringsfremgangsmåte og målbasesekvens som skal påvises. Se f.eks. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3. utg.), bind 2, kapittel 8, side 8.1-8.126, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001, for PCR-fremgangsmåten, PCR Methods and Applications, 1, 25-33 (1991) for NASBA-fremgangsmåten og Nucleic Acids Research, bind 28, nr. 12, side i-vii (2000) for LAMP-fremgangsmåten.

Test-DNA som fungerer som et templat i DNA-amplifisering, kan fremstilles fra en testprøve ved hjelp av en konvensjonell fremgangsmåte.

Målbasesekvensen som skal påvises blir passende valgt avhengig av typen av en amplifiseringsfremgangsmåte, slik at målbasesekvensen som håret mutasjonssete kan amplifiseres spesifikt. Vanligvis er mutasjonssetet som inneholdes i målbasesekvensen som skal påvises, kjent som et sete for genmutasjon eller genpolymorfisme. Mutasjonen på setet kan være en punktmutasjon, en insersjonsmutasjon eller en delesjonsmutasjon.

Vanlige eksempler på genmutasjonen og genpolymorfismen som skal analyseres ved hjelp av påvisningsfremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, inkluderer g727t-mutasjon observert med høy frekvens i japanske pasienter med glykogenlagringssykdom type Ia, a985g-mutasjon (Lys329Glu-mutasjon) observert med høy frekvens i kaukasoide pasienter med mellomkjedet acyl-CoA-dehydrogenase defekt, gl691t-mutasjon (Ser564Ile-mutasjon) i GLDC-genet observert med høy frekvens i finske pasienter med hyperglysinemi, genpolymorfisme (CYP2C19<*>2, g681a) i legemiddelmetaboliserende enzym-gen CYP2C19, genpolymorfisme (E487K) i en aldehyddehydrogenase-2 som bestemmer individuelle variasjoner i alkoholmetabolisme, deltaF508-delesjonsmutasjon i genet for cystisk fibrose transmembrantregulatorprotein, 1277insTATC insersjonsmutasjon i HEXA-gen assosiert med Tay-Sachs sykdom, 5382insC-innskudds-mutasjon i BRCAl-genet assosiert med brystkreft, 6174delT-delesjonsmutasjon i BRCA2-gen assosiert med brystkreft og G1691A-punktmutasjon i blodkoagulasjonsfaktor-V-gen assosiert med trombose. ;Glykogenlagringssykdom type Ia er en medfødt forstyrrelse i karbohydrat-metabolisme som er arvet i en autosomal recessiv måte og forårsaket av mangel på glukose-6-fosfatase i glykogenmetabolismeveien, og fører til en akkumulering av overskuddet av glykogen, hovedsakelig i leveren. Pasienter med glykogenlagringssykdom type Ia er funnet å ha hypoglykemi, hepatomegali, kortvoksthet, nyreskade, hyperlipidemi, hyperuricemia eller lignende. Mutasjon g727t i genet for dette enzymet er en hyppig forekommende mutasjon som utgjør omtrent 90 % av patogene mutasjoner i japanske tilfeller og genererer avvikende spleising av dets mRNA. Selv om diagnosen for denne sykdommen vanligvis har blitt utført inntil ganske nylige ved å måle enzymaktivitet i levervev, har fremveksten av genetisk diagnostisering eliminert behovet for leverbiopsi. Antallet bærere av denne mutasjonen i den japanske befolkningen er én av omtrent 200 mennesker. ;Ikke-ketotisk hyperglysinemi er en arvelig forstyrrelse i aminosyremetabolisme (autosomal recessiv arv) som er forårsaket av mangel av et enzym i glysinkløyvings-systemet, og oppviser alvorlige neurologiske symptomer inkludert neonatale kramper i den neonatale perioden. Mutasjon gl691t i GLDC-genet til enzymet i glysinkløyvingssystemet blir observert med høy frekvens (omtrent 70 % av muterte gener) hos finske pasienter. Denne mutasjonen forårsaker en aminosyresubstitusjon med Ser564Ile. ;Mellomkjedet acyl-CoA-dehydrogenase defekt er en medfødt forstyrrelse i organisk syremetabolisme (autosomal recessiv arv) som er forårsaket av mangel på enzymet (mellomkjedet acyl-CoA-dehydrogenase, MCAD) som spiller en nøkkelrolle i fettsyre-p-oksidasjonsveien, og som forårsaker hypoglykemi og bevissthetsforstyrrelser ved fasting og infeksjon. Det er kjent at mellomkjedet acyl-CoA-dehydrogenase defekt ofte er feil-diagnostisert som krybbedød eller akutt encefalopati (Reye syndrom). Mutasjon a985g i genet for dette enzymet er en hyppig forekommende mutasjon som utgjør omtrent 90 % av patogene mutasjoner i kaukasoide tilfeller, og gir en aminosyresubstitusjon med Lys329Glu. Dessuten er bærere som har denne mutasjonen, funnet i stort antall i kaukasoid befolkning (én av 40 i Storbritannia). I USA og i europeiske land er den genetiske diagnosen for å påvise denne a985g-mutasjonen mye anvendt for diagnose av denne sykdommen. ;CYP2C19-genet spilleren nøkkelrolle i metabolismen av omeprazol (inhibitor av mavesyre sekresjon) eller lignende. CYP2C19<*>2, som er en SNP i genet, viser 681A>G-mutasjon i ekson 5, noe som fører til avvikende spleising, og som dermed til slutt minsker den metabolske aktiviteten for dette legemidlet. Et individ som har en slik polymorfisme (dårlig metaboliserer) trenger en minsket mengde av legemidlet administrert til individet. Det er av den grunn klinisk fordelaktig å bestemme genotypen til en pasient i forkant av medisineringen. Denne genpolymorfismen er funnet i omtrent 23 % av genet i den japanske populasjonen.

Genpolymorfismen (Glu487Lys) i aldehyd-dehydrogenase-2 er en SNP, som i hovedsak er observert i orientalsk populasjon, som bestemmer individuelle variasjoner i alkoholmetabolisme. Fordi enzymet som har genpolymorfismen er mindre aktivt for å bremse ned metabolismen av acetaldehyd som er generert fra alkohol, viser et individ som har denne polymorfismen en vedvarende «lav toleranse for alkohol». Omtrent 30 % av den japanske befolkningen er heterozygote for denne genpolymorfismen og omtrent 5 % er homozygote.

(2) Hybridisering

Hybridiseringen av det amplifiserte DNA til en hybridiseringsprobe som har en basesekvens som er komplementær med målbasesekvensen som skal påvises, kan bli utført på samme måte som vanlig hybridisering, bortsett fra at en spesiell hybridiseringsprobe anvendes.

Hybridiseringsproben anvendt i foreliggende oppfinnelse, er merket med en andre markør og inneholdt i en reaksjonsløsning for å utføre DNA-amplifiseringen, og basesekvensen til hybridiseringsproben er designet slik at den ikke inhiberer DNA-amplifiseringen.

Den andre markøren er definert som beskrevet for den første markøren; forutsatt at substansen som anvendes må være forskjellig fra den første markøren. Merkingen av hybridiseringsproben kan bli utført ved hjelp av en fremgangsmåte som er kjent på fagområdet, slik at hybridiseringen ikke blir inhibert. Merkingen av hybridiseringsproben blir fortrinnsvis utført på dens 3' ende. Dette er fordi en slik merking forhindrer at oligo-nukleotidkjeden blir forlenget under DNA-amplifiseringsreaksjonen. Hvis kjeden blir forlenget, blir Tm-verdien for denne økt, og dermed kan hybridisering foregå selv om det er mismatcher.

Design av basesekvensen til hybridiseringsproben, slik at DNA-amplifiseringen ikke blir inhibert, kan vanligvis bli valgt ved å justere kjedelengden eller lignende til hybridiseringsproben, slik at hybridiseringen av hybridiseringsproben ikke vil foregå ved betingelsene for DNA-amplifisering.

Hybridiseringsproben som ble anvendt i den foreliggende oppfinnelsen, haren basesekvens som er designet slik at den ikke inhiberer DNA-amplifiseringen, og kan dermed bli inneholdt i en reaksjonsløsning for å utføre DNA-amplifiseringen. Reaksjonsløsningen etter at DNA-amplifiseringen er fullført, blir av den grunn plassert direkte under en slike betingelse at det amplifiserte DNA kan hybridiseres til hybridiseringsproben, for derved å tillate hybridisering.

Kjedelengden til hybridiseringsproben og betingelsene for hybridisering blir hensiktsmessig valgt, avhengig av en fremgangsmåte som anvendes for DNA-amplifiseringen. I DNA-amplifisering med anvendelse av DNA-polymerase, fordi amplifiseringen utførtes ved en temperaturbetingelse som er egnet for DNA-polymerasen å oppvise sin aktivitet, velges kjedelengden slik at hybridiseringen ikke vil foregå ved denne temperaturen. I tillegg er temperaturen der hybridiseringen foregår, ikke spesielt begrenset så lenge DNA-amplifisering ikke blir inhibert, men er fortrinnsvis valgt slik at den genererte hybriden ikke blir dissosiert, selv ved romtemperatur.

En spesifikk betingelse der basesekvensen til proben ikke inhiberer DNA-amplifiseringen, inkluderer en betingelse der Tm for proben er designet slik at den er 25 til 40°C (fortrinnsvis 30 til 35°C) lavere enn Tm-verdien for primerne.

For eksempel, tatt i betraktning vanlige betingelser for PCR-fremgangsmåten, så bør proben typisk være 10-mertil 13-mer. Dette er mye kortere enn 15-mertil 25-mer prober (se den ovenfor nevnte ikke-patent-referansen 2) som tradisjonelt har blitt anvendt som en probe for allelspesifikk oligonukleotidhybridisering. I sammenhengen med at lengre prober har blitt omfattende anvendt tidligere, har det vært en teori om at en sekvens på minst omtrent 4 opphøyd i 15 er nødvendig for å konstruere en probe som har spesifisitet ved kombinasjoner av fire ulike baser i hele genomsekvensen (3 mill. basepar). Dette er imidlertid tilfellet for tilfeller der hybridisering er rettet mot hele genomsekvensen. Når hybridiseringen er rettet mot et PCR-amplifisert DNA-fragment som har flere hundre baser, er en slik lengde eller spesifisitet ikke ansett å være nødvendig for prober hvor spesifisiteten for hybridisering er tilstrekkelig opprettholdt med den tidligere proben som vist ovenfor.

Ved anvendelse av påvisningsfremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse til påvisningen av en hvilken som helst genmutasjon eller polymorfisme, er det nødvendig at hybridiseringsproben blir justert til en optimal kjedelengde. Den optimale lengden kan bestemmes ved et standardforsøk, som beskrevet i eksemplene nedenfor. Fordi en meget kort lengde for en probe vanligvis anvendes i påvisningsfremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen, er dannelsen av en diagnostisk linje funnet dramatisk å variere, avhengig av lengdevariasjonene av en enkelt base. Når fremkomsten av en falsk positiv eller svak positiv reaksjon observeres, er det foretrukket at en probe som har en kortere eller lengre lengde enn den for proben som er designet basert på sin Tm-verdi, blir konstruert for å velge den mest hensiktsmessige. Med hensyn på dette, fordi en probe som har en normal basesekvens og en probe som har en mutant basesekvens er forskjellige i Tm-verdi på grunn av basesubstitusjonen, selv om de har samme kjedelengde, bør hver optimale kjedelengde designes uavhengig.

Det er foretrukket å designe basesekvensen til hybridiseringsproben slik at mutasjonssetet vil være posisjonert omtrent i midten av basesekvensen.

Hybridisering blir vanligvis utført ved å øke temperaturen inntil dobbelttrådet DNA blir denaturert, etterfulgt av gradvis å senke temperaturen. Hybridiseringen kan på det vis utføres ved bare en prosedyre for å endre temperaturen i en reaksjonsløsning der DNA-amplifisering er fullført, uten behovet for andre prosedyrer. I tilfellet av anvendelse av en programmerbar termosykler ved DNA-amplifisering, kan en temperaturbetingelse for hybridisering programmeres i tillegg til en temperaturbetingelse som er nødvendig for DNA-amplifisering, for derved å utføre amplifiseringen og hybridiseringen som en serie av reaksjoner etter at en prøve er satt på termosykleren.

Anvendelse av en kort lengde for proben som er designet som beskrevet ovenfor, tilveiebringer de følgende tre fordeler: 1) forskjellen i Tm-verdier mellom tilfellet der det er en mismatch av en enkelt base og tilfellet der det ikke er noen mismatch, kan gjøres større enn den for en lengre lengde for en probe, og således kan spesifisiteten til proben være forholdsvis øket, 2) hybridiseringstemperaturen for proben kan være så lav som 25°C i påvisningsfremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelsen, selv om den tradisjonelt er 37 til 65°C, og således kan en påfølgende serie av prosedyrer utføres ved romtemperatur, og 3) en kort lengde av proben har en redusert Tm-verdi og hybridiserer ikke under PCR-reaksjonen, og således påvirker ikke proben PCR-reaksjonen selv om den tidligere er blandet inn i PCR-reaksjonsløsningen. Denne proben muliggjør prosedyren PCRvarme denaturering -v hybridisering i å bli utført som en serie av reaksjoner uten utførelse av ytterligere prosedyrer, slik som tilsettingen av et reagens i løpet av reaksjonene. Disse fortrinnene kan likeledes oppnås i andre DNA-amplifiseringsfremgangsmåter ved anvendelsen av en forlengelsesreaksjon med DNA-polymerase, som i PCR-fremgangsmåten.

(3) Påvisning av hybrid

En hybrid dannet ved hybridiseringen har både den første markøren og den andre markøren. Hybriden påvises ved affinitetskromatografi ved anvendelse av den første og den andre markøren.

Affinitetskromatografien kan utføres med en teststripe som er konstruert for dette formålet. Påvisningen av en hybrid ved affinitetskromatografi ved anvendelsen av to ulik markører kan utføres i henhold til en fremgangsmåte som er kjent på fagområdet, og en teststripe anvendt i denne fremgangsmåten, kan lages i henhold til en vanlig fremgangsmåte.

Et eksempel på en slik teststripe er laget slik at en hybrid omsettes med et stoff som er i stand til spesifikt å bindes til den første markøren, og er koplet med en markør (f. eks. gullkolloid) for å bli synlig når det akkumuleres, og overføres til en kromatografi-bærer på hvilken et stoff som er i stand spesifikt å bindes til den andre markøren immobiliseres for å tillate observasjonen av den synlige markøren når det akkumuleres på immobiliseringsstedet. En slik teststripe i seg selv også hittill blitt benyttet i en fremgangsmåte for enkelt å påvise et visst gen (J. Clin. Microbiol. 38: 2525-2529, 2000).

I det påfølgende vil en illustrasjon bli tilveiebrakt for et spesifikt tilfelle hvor den første markøren er digoksigenin, den andre markøren er biotin og markøren som er synlig når den er akkumulert, er gullkolloid. De følgende setene er plassert i rekkefølgen i forhold til migrasjonsretningen foret kromatografiløsemiddel (vanligvis en bufferløsning): et neddykkingssete som er neddykket i et kromatografiløsemiddel for å tilveiebringe kromatografiløsemidlet på stripen til kromatografibæreren, et kompleksbærende sete som har en pute som bærer et anti-digoksigeninantistoff konjugert til gullkolloid (et kompleks) på en måte som gjør at dette antistoffet kan bli frigjort inn i kromatografiløsemidlet, et prøvepåsetningssete, på hvilket reaksjonsløsningen inneholdende en hybrid blir påsatt, et streptavidinimmobilisert sete, på hvilket et bånd med streptavidin er immobilisert perpendikulært i forhold til migrasjonsretningen til kromatografiløsemidlet, et antistoff-immobilisert sete, på hvilket et antistoff mot anti-digoksigenin antistoffet er immobilisert, og et absorpsjonssete som har en pute som absorberer kromatografiløsemidlet.

Teststripen benyttes som beskrevet nedenfor. Etterat reaksjonsløsningen som inneholder hybriden er påsatt på prøvepåsetningssetet og det neddykkede sete er neddykket i kromatografiløsemidlet, blir teststripen fjernet fra kromatografiløsemidlet og hensatt. Når kromatografiløsemidlet migrerer gjennom kromatografibæreren ved hjelp av kapillærkrefter og når det kompleksbærende setet, vil kromatografiløsemidlet inneholdende komplekset migrere forover. Når dette kromatografiløsemidlet når prøvepåsetningssetet, vil digoksigeninet på hybriden i den påsatte reaksjonsløsningen binde til anti-digoksigeninantistoffet på komplekset for å danne hybriden som har gullkolloidet, som ytterligere migrerer forover gjennom kromatografibæreren ved hjelp av kromatografiløsemidlet. Når hybriden når det streptavidinimmobiliserte setet, vil hybriden akkumulere på det streptavidinimmobiliserte setet via bindingen av biotin og streptavidin, og til slutt vil et synlig signal sees når hybriden er til stede. Komplekset som har passert gjennom det streptavidinimmobiliserte setet, blir akkumulert på det antistoffimmobiliserte setet for å generere et synlig signal som viser at kromatogrammet har foregått normalt. Kromatografiløsemidlets videre migrering vil bli absorbert og holdt på absorpsjonssetet.

I påvisningsfremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, hvis mutasjonssetet er en punktmutasjon, vil reaksjonsløsningen for å utføre DNA-amplifiseringen fortrinnsvis ytterligere inneholde, sammen med hybridiseringsproben, et umerket oligonukleotid (heretter også referert til som en «konkurrerende probe») som har en basesekvens som er forskjellig i en enkelt base på posisjonen for punktmutasjonen i forhold til basesekvensen til den merkede hybridiseringsproben, i en mengde som er tilstrekkelig til å øke spesifisiteten til hybridiseringen av det amplifiserte DNA til den merkede hybridiseringsproben.

Den konkurrerende proben er designet på samme måte som hybridiseringsproben bortsett fra at den er forskjellig fra hybridiseringsproben i en enkelt base på posisjonen for punktmutasjonen. Lengden til den konkurrerende proben kan være forskjellig fra den til hybridiseringsproben.

Mengden av den konkurrerende proben som er tilstrekkelig til å øke spesifisiteten til hybridiseringen av det amplifiserte DNA til den merkede hybridiseringsproben, varierer avhengig av betingelser, slik som målbasesekvensen som skal bli påvist og basesekvensen til hybridiseringsproben, mens den konkurrerende proben i prinsippet kan foreligge i en mengde fra omtrent en tilsvarende mengde til 5-gangers overskudd (molart forhold) i forhold til mengden av hybridiseringsproben. Ikke desto mindre når positiv reaksjon er vesentlig redusert, kan utelatelse av den konkurrerende proben, hvis det er bekreftet at det ikke forårsaker falske positiver, noen ganger gi det beste resultatet. Fordi dannelsen av en diagnostisk linje er signifikant påvirket av kjedelengden til hybridiseringsproben og tilstedeværelsen eller fraværet av en konkurrerende probe, vil en optimal reaksjons-betingelse være relativt lett å finne.

Spesifisiteten til hybridiseringsproben kan bli økt og ikke-spesifikk hybridisering kan bli undertrykket ved å tilsette et umerket konkurrerende oligonukleotid i hybridiseringen.

I påvisningsfremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan ulike markører anvendes for å merke en hybridiseringsprobe for å påvise en normal basesekvens og en hybridiseringsprobe for å påvise en mutant basesekvens for å integrere to reaksjonssystemer for å påvise en normal basesekvens og for å påvise en mutant basesekvens i et reaksjonssystem. Det betyr at hybridiseringsprobene for å påvise en normal basesekvens og for å påvise en mutant basesekvens, kan være forskjellig merket og blandet sammen i forholdet 1:1 for å integrere reaksjonssystemene til ett, mens disse hybridiseringsprobene blir tillatt å konkurrere med hverandre. Etter reaksjonen, ved å anvende kompleksene med stoffer som er i stand til spesifikt å binde til de henholdsvise markørene, og en markør som blir synlig når den akkumuleres, utføres affinitetskromatografi for å bestemme en genotype. Påvisningsfremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse harde følgende fortrinn: (1) anvendelighet: fremgangsmåten er basert på allelspesifikk oligonukleotidhybridisering som har vært mye anvendt som en påvisningsfremgangsmåte i lang tid, og som derfor er tilpassingsdyktig til påvisning av et bredt spekter av basesekvensmutasjoner, slik som en insersjonsmutasjon, en substitusjonsmutasjon og en punktmutasjon, (2) hurtighet: bestemmelsen av en genotype kan utføres i løpet av 10 minutter etter at amplifiseringen og hybridiseringsreaksjonen har blitt fullført i en termosykler og anvendelsen av en kapillærtype PCR-amplifiseringsinnretning ved nukleinsyreamplifiseringen muliggjør også at alle trinnene kan bli fullført innen 1 time hvis en DNA-prøve er klargjort, og (3) enkelhet: etter PCR-reaksjonen kan en genotype bli makroskopisk bestemt og dermed eliminere behovet for et instrument, slik som en gelektroforeseinnretning eller en fluorescensdetektor. En termosykler for å utføre PCR-reaksjonen er et standard instrument for klinisk undersøkelse, for eksempel en undersøkelse av smittsomme sykdommer, og har allerede blitt utplassert i mange sykehus. Dessuten er reaksjonsprosedyren enkel og uten behov for spesielle tekniske ferdigheter. De ovenfor beskrevne fortrinnene kan også bli oppnådd når nukleinsyrereaksjoner (TMA, NASBA, LAMP osv.) forskjellig fra PCR anvendes.

Prinsippet for påvisningsfremgangsmåten ifølge oppfinnelsen vil bli mer inngående illustrert i tilfellet ved anvendelse av PCR med referanse til figurene 1 til 3.

Fig. 1 viser en reaksjon ved anvendelsen av normalt DNA som en prøve. Reaksjonssystem 1 er et system til hvilket det tilsettes en hybridiseringsprobe for å påvise en normal basesekvens og reaksjonssystem 2 er et system til hvilket det tilsettes en hybridiseringsprobe for å påvise en mutant basesekvens. I denne figuren representerer den sorte sirkelen en normal base, det sorte triangel representerer en mutant base, Dig representerer et digoksigeninmarkør, B representerer et biotinmarkør og GP representerer en gullpartikkel.

Først amplifiseres et gensete som har en punktmutasjon (målbasesekvensen som skal påvises) ved hjelp av PCR. Én primer i PCR-primerparet som er anvendt i dette tilfellet, har på forhånd blitt merket på sin 5'-ende med digoksigenin. I en PCR-reaksjonsløsning har to oligonukleotider (hybridiseringsprobe og konkurrerende probe) blitt blandet med typiske komponenter. I denne kombinasjonen av oligonukleotidene eksisterer det to kombinasjoner for påvisning av en normal basesekvens og for påvisning av en mutant basesekvens. I kombinasjonen for påvisning av en normal basesekvens er én et oligonukleotid (normal probe) som haren normal basesekvens med punktmutasjonssete lokalisert i den midtre delen derav, og merket med biotin på sin 3'-ende, og den andre er et umerket konkurrerende oligonukleotid (mutant probe) som haren mutant basesekvens med punktmutasjonssete lokalisert i den midtre delen derav. I kombinasjonen for påvisning av en mutant basesekvens er én et oligonukleotid (mutant probe) som har en mutant basesekvens med punktmutasjonssete lokalisert i den midtre delen derav og merket biotin på sin 3'-ende, og den andre er et umerket konkurrerende oligonukleotid (normal probe) som haren normal basesekvens med punktmutasjonssete lokalisert i den midtre delen derav. En hvilken som helst av disse oligonukleotidene er designet for å være en reverstråd i forhold til PCR-primeren merket med digoksigenin.

Sammensetningen av PCR-reaksjonsløsningen er for eksempel 50 til 100 ng prøve-DNA, 10 mM Tris-HCI (pH 8,3), 50 mM KCI, 1,5 mM MgCI2, 250 uM av hver dNTP, 1 uM PCR forover-primer (merket med digoksigenin på sin 5'-ende), 1 uM PCR revers-primer, 600 nM hybridiseringsprobe (merket med biotin på sin 3'-ende, 3 uM umerket konkurrerende oligonukleotid og 1,25 U Taq-DNA-polymerase og mengden av PCR-reaksjonsløsning er 20 ul. PCR-betingelsene er: for eksempel, oppvarming til 94 °C i 2 minutter, 35 sykler med 98 °C i 10 sek., 55 °C i 30 sek. og 72 °C i 30 sek., etterfulgt av 72 °C i 3 minutter, 98 °C i 3 minutter, 65 °C i 1 minutt, 55 °C i 1 minutt, 45 °C i 1 minutt, 35 °C i 1 minutt og 25 °C i 1 minutt. Etter at syklusreaksjonene er gjentatt, blir i denne prosessen et PCR-produkt som er merket med digoksigenin hybridisert med oligonukleotid som haren basesekvens som er fullstendig komplementær med basesekvens til PCR-produktet. For eksempel, når oligonukleotidene for å påvise en normal basesekvens anvendes med DNAet som har en normal basesekvens i kombinasjon, danner et PCR-produkt som er merket med digoksigenin og et oligonukleotid som er merket med biotin, en hybrid (fig. 1, reaksjonssystem 1). En alikvot (5 ul) av denne løsningen prikkes inn på prøvepåsettingssete på en teststripe til affinitetskromatografi, slik som DNA-påvisningsteststripe (Roche, kat.nr. 1-965-484), på hvilken streptavidin er immobilisert og på hvilken et anti-digoksigeninantistoff som er merket med gullkolloid blir holdt på en måte som gjør at antistoffet kan migrere, og den nedre delen av teststripen senkes ned i en buffer i 5 sekunder. Mens stripen hensettes ved romtemperatur i 5 minutter mens bufferen utvikles, binder anti-digoksigeninantistoffet merket med gullkolloid til hybriden av PCR-produktet som er merket med digoksigenin og oligonukleotidet som er merket med biotin. Denne hybriden fanges videre av streptavidin immobilisert på teststripen for å danne en rød linje som kan observeres makroskopisk. På den annen side, når oligonukleotider for å påvise en mutant basesekvens benyttes med DNA som har en normal basesekvens i kombinasjon, danner et PCR-produkt som er merket med digoksigenin, og et umerket oligonukleotid, en hybrid. Etter at denne løsningen er påsatt på prøvepåsettingssetet på teststripen og utsatt for en utvikling med en buffer, binder et anti- digoksigeninantistoff merket med gullkolloid til hybriden og PCR-produktet som er merket med digoksigenin og det umerkede oligonukleotid. Fordi denne hybriden imidlertid ikke blir fanget av streptavidin på teststripen, dannes ikke en rød linje (fig. 1, reaksjonssystem 2). Som beskrevet ovenfor vil makroskopisk observering av dannelsen av en rød linje i hver av de to ulike reaksjonssystemene gjøre det mulig å bestemme genotypen til DNA som er gitt som en prøve. Prinsippet for reaksjonen med DNA som har en mutant basesekvens, er den samme som ovenfor (fig. 2).

Operasjonsprosedyrene når det gjelder dette aspektet, er vist i fig. 3. Først blir en DNA-prøve blandet med et reaksjonsreagens i et PCR-rør og varmet/avkjølt ved hjelp av en termosykler i henhold til programmet for å utføre DNA-amplifisering og dannelsen av en hybrid (Trinn 1). En alikvot (5 ul) av reaksjonsløsningen prikkes inn på prøvepåsettingssetet på teststripen og den nederste enden av teststripen blir nedsenket i en buffer, etterfulgt av henstand ved romtemperatur (Trinn 2). Etter 5 minutter blir diagnostiseringen utført på bakgrunn av tilstedeværelsen eller fraværet av den diagnostiske linjen til å bestemme en genotype (Trinn 3). Hvorvidt affinitetskromatografien er fullstendig normal eller ikke, kan bekreftes ved å undersøke tilstedeværelsen eller fraværet av en kontrollinje.

Påvisningsfremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte som er i stand til raskt og enkelt å bestemme tilstedeværelsen eller fraværet av en genmutasjon med en nøyaktighet og uten anvendelse av en spesiell innretning, og som er egnet til å utføre en genetisk test på et sykehus poliklinikk eller ved sykesengen. Det betyr at påvisningsfremgangsmåten tillater en genetisk diagnose som Point-of-Care. Mer spesielt vil genpolymorfismen for legemiddelmetaboliserende enzymer, inkludert CYP2C19 bestemmes, som gjør det mulig å bestemme på stedet hvorvidt eller ikke et visst legemiddel er egnet for en pasient og for å assistere i justeringen av doseringen. I dette tilfellet er et viktig fortrinn at et testresultat kan bli oppnådd i løpet av kort tid.

<2> Sett ifølge foreliggende oppfinnelse

Settet ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter: primere for å amplifisere DNA inneholdende en målbasesekvens som skal påvises, som har et mutasjonssete, ved anvendelse DNA-polymerase, en hybridiseringsprobe som haren basesekvens som er komplementær til målbasesekvensen som skal påvises, og en teststripe for affinitetskromatografi, som er kjennetegnet ved at minst én av primerne som skal anvendes i DNA-amplifiseringen er merket med en første markør, slik at det amplifiserte DNA vil være merket med den første markøren, hybridiseringsproben er merket med en annen markør, basesekvensen til hybridiseringsproben er designet slik at den ikke inhiberer DNA-amplifiseringen, og teststripen tillater påvisning av en hybrid av det amplifiserte DNA og hybridiseringsproben ved hjelp av den første og den andre markøren. Settet ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for å utføre påvisningsfremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

Primerne, hybridiseringsproben og teststripen for affinitetskromatografi er som beskrevet ovenfor i påvisningsfremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

Hvis mutasjonssetet er en punktmutasjon, omfatter fortrinnsvis settet ifølge foreliggende oppfinnelse ytterligere et umerket oligonukleotid (konkurrerende probe) som har en basesekvens som er forskjellig i en enkelt base på posisjonen for punktmutasjonen i forhold til basesekvensen til den merkede hybridiseringsproben. Dette oligonukleotidet er som beskrevet ovenfor i påvisningsfremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPLER

Foreliggende oppfinnelse vil bli beskrevet i detalj med referanse til de etterfølgende eksempler.

Eksempel 1:

Påvisning av mutasjon g727t i Glykogenose Type Ia

(1) Reaksjonssystem og eksperimentell prosedyre

For å påvise g727t-mutasjon i glykogenose Type Ia ble primere som er listet opp i Tabell 1 fremstilt på basis av kjente basesekvenser rundt mutasjonssetet.

For å undersøke effekten av kjedelengder for prober, ble oligonukleotider som er listet opp i Tabell 2, fremstilt som hybridiseringsprober og konkurrerende prober.

PCR-reaksjonsløsningen består av 50-100 ng med prøve-DNA, 10 mM Tris-HCI

(pH 8,3), 50 mM KCI, 1,5 mM MgCI2, 250 uM av hver dNTP, 1 uM PCR-forwardprimer, 1 uM PCR-reversprimer (merket med digoksigenin på den 5' enden), 600 nM hybridiseringsprobe (merket med biotin på den 3' enden), umerket konkurrerende oligonukleotid ved en forhåndsbestemt konsentrasjon og 1,25 U Taq-DNA-polymerase i et sluttvolum på 20 ul. PCR ble utført ved oppvarming til 94 °C i 2 minutter og gjenta 35 ganger i en syklus med 98 °C i 10 sekunder, 55 °C i 30 sekunder og 72 °C i 30 sekunder, etterfulgt av 72 °C i 3 minutter, 98 °C i 3 minutter, 65 °C i 1 minutt, 55 °C i 1 minutt, 45 °C i 1 minutt, 35 °C i 1 minutt og 25 °C i 1 minutt.

En alikvot (5 ul) av løsningen prikket inn på et prøvepåsettingssete på en teststripe (DNA Detection Test Strip, Roche Co., Ltd., kat. nr 1-965-484, en affinitetskromatografi-teststripe på hvilken streptavidin er immobilisert og på hvilken et anti-digoksigenin-antistoff som er merket med gullkolloid, holdes på en bevegelig måte), og deretter ble den nederste enden av stripen senket ned i en buffer i 5 sekunder. Deretter ble teststripen hensatt 5 minutter i romtemperatur for å la bufferen bevege seg gjennom stripen. Etter henstand ble tilstedeværelsen eller fraværet av en genotype diagnostisk linje makroskopisk bestemt.

(2) Undersøkelse av konkurranse med umerket oligonukleotid

Den merkede hybridiseringsproben som ble anvendt, var en 17-mer og påvisningen ble deretter utført uten tilsetting av en konkurrerende probe i en reaksjonsløsning. DNA- prøvene som ble anvendt, var en homozygot for g727-allel (normal DNA) og en homozygot for t727-allel (mutant DNA), og hybridiseringsprobene som ble anvendt var de for påvisningen av en normal basesekvens og for påvisningen av en mutant basesekvens. Resultatene er vist i fig. 4. I denne figuren representerer «Wt» og «Mut» med hensyn til «DNA», henholdsvis det normale DNA og det mutante DNA, mens «Wt» og «Mut» med hensyn til «hybridiseringsprobe», representerer hybridiseringsprobene for påvisningen av henholdsvis en normal basesekvens og for påvisning av en mutant basesekvens (det samme gjelder for fig. 5 til fig. 7 beskrevet nedenfor).

I en hvilken som helst av kombinasjonene som ble testet, ble en falsk rød positiv reaksjonslinje gjenkjent. Av den grunn var genotypingen mislykket (fig. 4, linje 1-4).

Et tilsvarende eksperiment ble utført ved å tilsette 5-50 ganger større mengde (molare konsentrasjoner) av den konkurrerende probe (17-mer) enn den av hybridiseringsproben til reaksjonsløsningen. Resultatene er vist i fig. 5.

Tilsettingen av den konkurrerende proben resulterte i en vesentlig minskning i falske positive reaksjoner. Med andre ord ble bare svært svake røde reaksjonslinjer observert i reaksjonssystemer med prober for å påvise en mutant basesekvens med normalt DNA (fig. 5, linje 6-8) og reaksjonssystemer med probe for påvisning av en normal basesekvens med et mutant DNA (fig. 5, linje 10-12). Ingen forskjell ble funnet i inhibitorisk effekt på en falsk positiv reaksjon i en hvilken som helst mengde av konkurrerende probe tilsatt, og til og med tilsettingen av 50-gangers mengde kunne ikke fullstendig inhibere den falske positive reaksjonen. Tvert i mot ble det funnet at tilsettingen av 25-50 gangers mengde inhiberte normale positive reaksjoner, slik at reaksjonslinjene hadde en tendens til å bli ganske svake (fig. 5, linje 3, 4, 15 og 16).

(3) Undersøkelse av kjedelengde for hybridiseringsprobe

Hybridiseringsprobene og de konkurrerende probene som ble anvendt i denne studien, var 17-merer, 15-merer, 13-merer og 11-merer. Mengden av de konkurrerende probene som ble tilsatt til reaksjonsløsningen ble satt til 30 ganger mer enn mengden av hybridiseringsproben. Resultatene er vist i fig. 6.

I reaksjonssystemet med prober for påvisning av en mutant basesekvens for et normalt DNA fremkom en svak falsk positiv linje i tilfellet med 15-merer (fig. 6, linje 4), men fremkom ikke i tilfellene med 13-merer og 11-merer (fig. 6, linje 5 og 6). I reaksjonssystemet med probe for påvisning av normal basesekvens med en mutant DNA, fremkom ingen falske positiver i noen tilfeller med 15-merer, 13-merer og 11-merer (fig. 6, linje 7 til 9). Ikke desto mindre ble det funnet at de normale positive reaksjonene hadde en tendens til å bli minsket i tilfellet med 11-mer (fig. 6, linje 3 til 12).

I betraktning av resultatene av undersøkelsene som er beskrevet ovenfor, ved å anvende hybridiseringsprobene og de konkurrerende probene som var 12-merer i lengde (Tabell 3) med 5-gangers mengde av den konkurrerende proben tilsatt, ble påvisningen utført på en lignende måte for prøver med normalt DNA (homozygot for g727-allel), bærer-DNA (heterozygot for g727-allel og t727-allel) og pasientens DNA (homozygot for t727-allel). Resultatene er vist i fig. 7.

Resultatene som ble oppnådd korresponderte fullstendig med genotypen, med distinkte positive reaksjonslinjer observert (fig. 7, linje 1 og 4 og linje 5 og 6). Ingen falske positive reaksjoner ble funnet (linje 2 og 3).

Eksempel 2:

Påvisning av mutasjon a985g i mellomkjedet acyl-CoA dehydrogenase defekt, mutasjon gl691t i GLDC-gen i hyperglycinemi, mutasjon g681a i legemiddelmetaboliserende enzymgen CYP2C19 og punktmutasjon i Glu487Lys i aldehyddehydrogenase-2-polymorfisme.

Påvisningfremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse ble utført for å påvise en punktmutasjon, inkludert mutasjon a985g i mellomkjedet acyl-CoA-dehydrogenase defektl, mutasjon gl691t i GLDC-gen i hyperglycinemi, mutasjon g681a i legemiddelmetaboliserende enzymgen CYP2C19 og punktmutasjon i Glu487Lys i aldehyddehydro-genase-2-polymorfisme.

PCR-primerne for amplifisering av basesekvenser inneholdende de respektive punktmutasjonssetene ble justert i kjedelengde, slik at PCR-reaksjoner kunne bli utført med en annealing-temperatur på 55 °C. I tillegg ble hybridiseringsprobene designet for å ha Tm-verdier i området 35 til 40 °C. Som et resultat av dette var kjedelengdene 10-merer til 15-merer. Basesekvensene for primerne, hybridiseringsprobene og konkurrerende prober er listet opp i Tabell 4.

Alle PCR-betingelsene eller betingelsene inkludert konsentrasjonene av prober var de samme som de i eksempel 1 i et hvilket som helst av tilfellene for å påvise mutasjonene beskrevet ovenfor, bortsett fra at primerne og probene ovenfor må benyttes.

Påvisningene, som utført under disse betingelsene, viste den korrekte bestemmelsen av genotyper i alle deteksjonssystemene (fig. 8, a, b, c og d). I påvisningen av Glu487Lys i aldehyddehydrogenase-2-genpolymorfisme var reaksjonslinjen som ble oppnådd, svak i reaksjonssystemet for påvisning av en mutant basesekvens. Når umerket konkurrerende oligonukleotid ikke ble blandet i dette reaksjonssystemet, ble imidlertid dannelsen av distinkt reaksjonslinje observert. I hver av reaksjonene ble ingen falske positive observert.

Bestemmelsen av genotype ble fullført innen 10 minutter etter at reaksjonen i termosykleren var fullført. Selv minst to år etter at teststripen ble tørket uten noen som helst behandling og lagret ved romtemperatur var en makroskopisk bestemmelse av den mulig.

De ovenfor nevnte resultatene viser at påvisningsfremgangsmåten ifølge oppfinnelsen muliggjør den enkle og raske påvisningen av hver mutasjon eller polymorfisme av de fem genene for å bestemme genotypen til prøve-DNA, selv om designet av primere og hybridiseringsprober og konkurrerende prober og reaksjonsbetingelsene må bli justert litt avhengig av de respektive genmutasjonene. Derfor er det konkludert med påvisningsfremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli benyttet for mange oppgaver.

Eksempel 3:

Påvisning av Delta F508 delesjonsmutasjon i cystisk fibrose transmembrant regulatorprotein-gen, 1277insTATC-insersjonsmutasjon i HEXA-gen i Tay-Sachs-sykdom, 538insC-insersjonsmutasjon i BRCAl-gen i brystkreft, 6174delT-delesjonsmutasjon i BRCA2-gen i brystkreft og G1691A-punktmutasjon i blodkoagulasjonsfaktor-V-gen i trombose.

Påvisningsfremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse ble utført for å påvise en mutasjon, inkludert deltaF508-delesjonsmutasjon i genet for cystisk fibrose transmembrant regulatorprotein, 1277insTATC-insersjonsmutasjon i HEXA-gen i Tay-Sachs-sykdom, 5382insC-insersjonsmutasjon i BRCAl-gen i brystkreft, 6174delT-delesjonsmutasjon i BRCA2-gen i brystkreft og G1691A punktmutasjon i blodkoagulasjonsfaktor-V-gen i trombose.

PCR-primerne for amplifisering av basesekvenser inneholdende de respektive mutasjonssetene ble justert i kjedelengde for å utføre PCR-reaksjonene med en innstilling av annealing-temperatur på 55 °C. I tillegg ble hybridiseringsprobene designet for å ha Tm-verdier i området 35 til 40 °C. Som et resultat av dette var kjedelengdene 10-merer til 15-merer. Basesekvensene til primere, hybridiseringsprober og konkurrerende prober er vist i Tabell 5. I (I) til (IV) var målmutasjonene som skulle bli påvist basedelesjoner eller insersjoner og av den grunn ble ingen konkurrerende probe anvendt. I (III) til (V) ble i tillegg ingen probe for å påvise den normale basesekvensen anvendt, fordi til og med en pasient som er heterozygot for den gjeldende mutasjonen viser symptomet, noe som indikerer at det ikke er noe klinisk behov for å undersøke tilstedeværelsen eller fraværet av genet som her den normale basesekvensen.

Alle PCR-betingelsene eller betingelsene inkludert konsentrasjoner av prober var de samme som de i eksempel 1 i hvert tilfelle for påvisning av mutasjonene beskrevet ovenfor, bortsett fra at primerne og probene ovenfor må anvendes.

Påvisningene som utført under disse betingelsene, viste den korrekte bestemmelsen av genotyper i alle påvisningssystemene (fig. 9). I hver av reaksjonene ble ingen falske positive observert.

Bestemmelsen av genotype var fullført innen 10 minutter etter at reaksjonen i termosykleren var fullført. Selv minst to år etter at teststripen var tørket uten noen behandling og lagret ved romtemperatur var en makroskopisk bestemmelse av den mulig.

De ovenfor nevnte resultatene viser at påvisningsfremgangsmåten ifølge oppfinnelsen muliggjør den enkle og raske påvisningen av mutasjoner inkludert innskudds-og delesjonsmutasjoner for å bestemme genotypen til prøve-DNA, selv om design av primere og hybridiseringsprober og konkurrerende prober og reaksjonsbetingelsene må bli noe justert, avhengig av de respektive genmutasjonene. Derfor er det konkludert med at påvisningsfremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli benyttet til mange formål.

Industriell anvendbarhet

Ifølge foreliggende oppfinnelse kan identifiseringen av patogene genmutasjoner og påvisning av polymorfisme i sykdomsrelaterte gener og legemiddelmetaboliserende enzymgener bli utført på en enkel, rask og nøyaktig måte, uten anvendelse av andre spesielle innretninger og utstyr enn en standard termosykler. Påvisningsfremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse tillater påvisningen ved sykesengen og anses således å forenkle den skreddersydde medisinen.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for å påvise en basesekvens som omfatter trinnene: amplifisering av DNA inneholdende en målbasesekvens som skal påvises, som har et mutasjonssete, ved å benytte DNA-polymerase, hybridisering av det amplifiserte DNA til en hybridiseringsprobe som har en basesekvens som er komplementær til målbasesekvensen som skal påvises, og påvisning av en hybrid som dannes ved hybridiseringen,karakterisert vedat minst én av primerne som skal benyttes i DNA-amplifiseringen er merket med en første markør, slik at det amplifiserte DNA vil være merket med den første markøren, hybridiseringsproben er merket med en andre markør og inneholdt i en reaksjonsløsning for å utføre DNA-amplifiseringen, basesekvensen til hybridiseringsproben er designet slik at den ikke inhiberer DNA-amplifiseringen, og hybriden blir påvist ved affinitetskromatografi ved hjelp av den første og den andre markøren.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor mutasjonssetet er en punktmutasjon og reaksjonsløsningen for å utføre DNA-amplifiseringen ytterligere inneholder et umerket oligonukleotid som har en basesekvens som er forskjellig i en enkelt base ved posisjonen for punktmutasjonen i forhold til basesekvensen til den merkede hybridiseringsproben, i en mengde som er tilstrekkelig til å øke spesifisiteten av hybridisering av det amplifiserte DNA til hybridiseringsproben.

3. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 eller 2, hvor DNA-amplifiseringen blir utført ved hjelp av PCR.