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Die Erfindung betrifft ein leicht reproduzierbares, schnelles und hochsensitives Verfahren zur Detektion intrazellulärer viraler Sequenzen sowie zur Quantifizierung der Genamplifikation, wobei kleinste Mengen des zu untersuchenden Materials, in der Grössenordnung von 100-1000 Zellen zur Durchführung genügen.
Tumorigene Viren scheinen in der Pathogenese menschlicher Malignome eine wichtige Rolle zu spielen. Die Zahl der Berichte über eine Beteiligung onkogener Viren bei malignen Erkrankungen des Menschen hat in den letzten Jahren erheblich zugenommen (Reitz et al. : Cancer Surveys 4,313, 1985 ; Salahuddin et al. : Science 243, 596, 1986 ; Duerst et al : Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 1070, 1987 ; Schreier et al. JNCI 76, 1255, 1986 ; Mann et al. Science 236,1103, 1987). Sowohl DNA-Viren (z. B. EBV) als auch RNA-Viren (z. B. HTLV l) wurden mit bestimmten bösartigen Erkrankungen in kausalen Zusammenhang gebracht (Matsuo et al. : Science 226,1322, 1984 ; Reitz et al. Cancer Surveys 4,313, 1985).
Der Virus-Nachweis hat nicht nur diagnostische, sondern bei einer Reihe von Erkrankungen auch prognostische und therapeutische Bedeutung erlangt. Die Entwicklung schneller, sensitiver und gut reproduzierbarer Methoden zum Nachweis derartiger Viren stellt daher eine wesentliche Aufgabe dar.
Dabei ist auf jene Methoden besonderes Augenmerk zu richten, welche einen direkten Virus-Nachweis ermöglichen. Mit Hilfe molekularer Hybridisierung zum Beispiel kann die Präsenz infizierter Zellen direkt und eindeutig bestimmt werden. Eine Reihe von molekulargenetischen Methoden, etwa der Southern Transfer (Southern : J. Mol. Bio1. 98, 503,1975) oder herkömmliche Dot Blot Techniken (z. B. Thomas : Proc. Natl. Acad. Sci. 77,5201, 1980) stehen bereits seit längerem zur Verfügung, sie sind aber relativ zeitaufwendig und erfordern überdies verhältnismässig grosse Mengen infizierter Zellen, welche häufig nicht verfügbar sind. Andere, schnellere Methoden wurden beschrieben (z. B. Meinkoth : Anal. Biochem. 138, 267, 1984 ; Bresser : Anal.
Biochem. 129,357, 1983), die jedoch in vielen Laboratorien nicht reproduzierbar waren. Gegenüber der "DE-Al-3 211 311" stellt die im folgenden beschriebene Erfmduog ein einfach reproduzierbares, hochsensitives und schnelles Verfahren dar, mit dessen Hilfe routinemässig an Hand von 100-1000 infizierter Zellen ein Nachweis viraler Sequenzen durchgeführt werden kann. Die hohe Sensitivität des Verfahrens und damit die Minimierung des erforderlichen Untersuchungsmaterials konnte durch Optimierung verschiedener Arbeitsschritte, insbesondere durch Ausschalten einiger mit der DNA-Bindung an die Membran interferrierender Faktoren erreicht werden, wodurch die Effizienz der DNA-Bindung stark verbessert werden konnte.
Die Tatsache, dass 100-1000 Zellen als Ausgangsmaterial genügen, ist insbesondere bei Infektionen durch Retroviren (z. B. HTLV III) von entscheidender Bedeutung, da diese nur einige kleine Subpopulationen von Zellen infizieren und damit einem direkten Nachweis schwer zugänglich sind.
Ausserdem gestattet das Verfahren die gleichzeitige Durchführung mehrerer Experimente, auch wenn nur kleinste Mengen an Tumormaterial verfügbar sind (z. B. Zellen, die aus der Zerebrospinalflüssigkeit gewonnen wurden), oder wenn kleine spezifische Zellpopulationen analysiert werden sollen (z. B. Zellen, die über einen Zellsorter separiert wurden).
Ein weiteres Anwendungsgebiet dieses Verfahrens ist die Quantifizierung der Gen-Amplifikation. Da auch für den Nachweis eines "single-copy" Gens etwa 100-1000 Zellen genügen, ist es beispielsweise möglich, das Ausmass der Amplifikation von Onkogenen bei diversen Tumoren oder von Chemoresistenzgenen (z. B. mdr-1) bei Patienten vor-und unter Chemotherapie aus minimalen Testmaterialmengen zu bestimmen (siehe Anwendungsmöglichkeiten).
Beispiel
Die zu untersuchenden Zellen, aus einer Zellkultur oder direkt vom Patienten gewonnen, werden in einem Puffer gewaschen, welcher keine mit der DNA-Bindung an eine Membran interferrierenden Ionen (insbesondere Phosphor und dessen Verbindungen) enthalten darf. Dieses ist ein für die Sensitivität der Methode wesentliches Kriterium. In unseren Händen hat sich lxSSC (=0. 158 M NaCV 0. 015 M NaCitrat ; pH 7, 0) als Puffer für diesen Zweck bewährt. Je nach Menge des vorhandenen Zellmaterials werden sodann 100-1000 oder mehr Zellen (bis zu 100 000) in 100 p. l dieses Puffers in einem Eppendorf Gefäss suspendiert und 60 Minuten bei 45 C in 0. 5 % SDS* und 200 gg/ml Proteinase K zur Zellyse inkubiert.
Das Lysat wird anschliessend zweimal mit Phenol/Chloroform (1 : 1) und einmal mit Chloroform extrahiert.
Die wässrige Phase wird 10 Minuten lang bei 45 C in 0. 125 N NaOH zur Denaturierung der DNA inkubiert. dann auf Eis kaltgestellt. Die denaturierte DNA-Lösung wird anschliessend auf 0. 125 x SSC/0. 125 N NaOH eingestellt. Eventuell kann die DNA in 0. 125 x SSC/0. 125 N NaOH seriell verdünnt werden. Die DNA-Lösung wird mit Hilfe eines Dot Blot (oder Slot Blot) Apparats auf einer Nylon-Membran (GeneScreen Plus) immobilisiert, indem sie unter Vakuum durch die in 0. 4 M Tris-HCl, pH 7. 5 vorher benekte Membran filtriert wird. Die Membran, bei Raumtemperatur getrocknet, wird in 0. 1-0. 2 ml/cm2 Prähybridisierungslösung bestehend aus : 10 % filtriertem Dextransulfat/1M NaCI/l % SDS für mindestens 15 Minuten bei 65 OC vorhybridisiert.
Zur Hybridisierung werden SS (Salmon sperm) -DNA (250 Jlg/ml Endkonzentration) und die mit p32 markierte Gensonde (1x105 - lx106 cpm/ml Prähybridisierungslösung) zusammen 10 Minuten gekocht, auf Eis abgekühlt und der Prähybridisierungslösung=Hybridisierungslösung zugesetzt.
Die Hybridisierung erfolgt bei 65 OC für 4-16 Stunden unter konstantem Schütteln. Anschliessend wird die Membran zweimal 5 Minuten bei Raumtemperatur in 2xSSC, zweimal 30 Minuten bei 65 C in 2xSSC/1 %
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SDS und zweimal 30 Minuten bei Raumtemperatur in O. IxSSC unter Schütteln gewaschen und beize für 6 bis 96 Stunden zur Autoradiographie aufgesetzt. Die Quantifizierung der Signale erfolgt mit Densitometrie.
Das Verfahren wurde an Zellinien und an klinischem Material in mehreren Laboratorien ausgiebig getestet.
Im folgenden werden einige Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung angeführt und mit Abbildungen illustriert : D Nachweis eines DNA - Virus (hier : Epstein Barr Virus-EBV)
Bei diesem Nachweis wurden zwei gleichartige Zellinien, welche aus B-Zell Lymphomen (Burkitt-Typ) etabliert wurden, verwendet. Während eine der Zellinien (Daudi) mit dem EBV Virus transformiert wurde, fehlt dieses Virus in der anderen (Loukes). In Abb. 1 ist eine Dot Blot Analyse der DNA dieser Zellinien mit radioaktiv markierter EBV-DNA Sonde dargestellt. Die Zahlen entlang der Abszisse geben die Anzahl der Zellen wieder, die als Ausgangsmaterial für die DNA-Extraktion verwendet wurden. Entlang der Ordinate ist eine Verdünnungsreihe der DNA aufgetragen.
Das Hintergrundsignal der EBV-negativen Loukes-Zellen liegt mindestens drei Grössenordnungen unter jenem der virushaltigen Daudi-Zellen. Ein positives Signal ist ab 100 Zellen als Ausgangsmaterial bereits sichtbar.
2) Nachweis eines RNA-Virus (hier : Human T-Cell Leukemia Virus-HTLV D
Bei diesem Nachweis wurden zwei T-Zell Leukämie/Lymphom Zellinien verwendet. HUT-102 wurde aus einer akuten T-Zell Leukämie etabliert und enthält das HTLV I-Virus. Dieses ist in HUT 78, einer aus einer Mycosis fungoides etablierten Zellinie, nicht präsent. Das Ergebnis einer Dot Blot Analyse mit markierter HTLV-I DNA Sonde ist analog der Abb. 1 in Abb. 2 dargestellt. Als zusätzliche Negativkontrolle wurde bei dem abgebildeten Experiment DNA eines Patienten mit Haarzell-Leukämie (HCL), einer B-Zell Erkrankung, ebenfalls analysiert.
3) Nachweis einer Onkogen-Amplifikadon (hier : c-myc Onkogen)
Bei diesem Nachweis wurde die DNA der Zellinie Colo 320, einer Colon-Karzinom Zellinie, analysiert, welche ein amplifiziertes c-myc Onkogen enthält (ca. 20 Kopien pro Zelle). Bei der Hybridisierung mit markierter c-myc DNA Sonde dienten normale menschliche Lymphozyten als Negativkontrolle. Auf dem in Abb.
3 präsentierten Ergebnis ist zu beachten, dass bis zu 106 negativer Kontroll-Zellen gegenüber maximal 105 Colo 320- Zellen zum Vergleich herangezogen wurden. Auch hier ist das Hintergrundsignal einige Grössenordnungen schwächer als das Positivsignal und auch hier ist bereits ein Positivsignal bei nur 100 Zellen als Ausgangsmaterial gut sichtbar.
4) Nachweis einer Resistenzgen-Amplifikation (hier : multidrug resistance gene. mdr-l)
Bei diesem Nachweis wurden zwei menschliche Epidermoid-Karzinom Zellinien, KB-V 1 und KB-3-1, verwendet. Während die Zellen der Linie KB- V 1 etwa hundert Kopien des Chemoresistenz-Gens mdr-l enthalten, ist in KB-3-1 Zellen das Gen als "single copy gene" vorhanden. Ziel des hier gezeigten Experiments war es, die Sensitivität des Verfahrens in bezug auf Detektion und Diskriminierung von Unterschieden in der Zahl vorhandener Genkopien festzustellen. Dazu wurden die Zellen der verwendeten Zellinien in verschiedem Verhältnis gemischt und gleichbleibende Mengen DNA (aus je 104 Zellen) wurden mit markierter mdr-l DNA Sonde analysiert. In Abb. 4 wird das Ergebnis eines derartigen Experiments gezeigt.
Die Zahlen entlang der Abszisse geben die Anzahl der mdr-l Gen-Kopien in der untersuchten DNA wieder. Unter"A"und"B"finden sich Signale einer DNA-Verdünnungsreihe von 104 bzw. 103 KB-3-1 Zellen. Wie die Abbildung zeigt, ist es mit dem Verfahren möglich, ein "single copy gene" in etwa 1000 Zellen als Ausgangsmaterial nachzuweisen.