CN109306376B - 检验核酸扩增均一性的质量控制标准品及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检验核酸扩增均一性的质量控制标准品及其制备方法，所述标准品的核酸序列包括第一序列和第二序列，所述第一序列从5’‑3’方向顺序地包括以下序列：Tran、B、D、E、Tran*、M和H，其中B、D和E构成一端哑铃的环；所述第二序列从5’‑3’方向顺序地包括以下序列：Tran、B、D、K、Tran*、L和H*，其中B、D和K构成另一端哑铃的环。

Description

检验核酸扩增均一性的质量控制标准品及其制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及检验核酸扩增均一性的质量控制标准品及其制备方法。
背景技术
扩增均一性是DNA测序(DNA-seq)方法的一个关键限制，其不仅导致拷贝数目变异偏差，而且导致单核苷酸变异扩增偏差，对于单细胞测序尤为重要。单细胞DNA-seq方法多以指数增长的PCR技术为基础，指数式的扩增所造成极大的数量偏差，使得原始序列的拷贝数信息丢失，扩增不均一而降低覆盖率，同时由于错误扩增问题，指数性放大扩增偏差，导致测序假阳性的产生，进一步限制了单细胞DNA-seq的准确性。虽然通过额外的统计学方法可进行错误修正，并发现单碱基突变，但对于单细胞测序而言，由于缺乏好的对照，错误修正尤为困难，关键是我们根本不知道单个细胞之间究竟会有多少个变异。但基于线性扩增的核酸扩增测序过程，与以指数扩增基础的方法相比，在扩增基因覆盖率、保真性等所有指标上都有大幅度提高，让单细胞扩增与测序更加精准。
基于线性的扩增方法是使用Tn5转座酶在基因组内引入随机转座子序列，使基因组DNA被分割成小片段DNA的基础上进行的。Tn5转座酶切DNA的位置并非固定，也即即使完全相同的基因组DNA，重复实验过程中，经酶切后所得片段序列及长短也各不相同。基因组DNA经Tn5 转座酶切后，后续还需要经过缺口补平，链置换；体外转录；逆转录等步骤完成单细胞基因组的扩增过程。面对转座后得到的核酸序列和长度不确定的DNA片段的海洋，如何重复可控其后续反应？为此我们设计并制备了可用于基于线性扩增的核酸扩增测序过程的质量控制的标准品核酸序列，在反应的每一步，通过Sanger测序，质量控制经转座酶切后的每个步骤。
发明内容
本发明提供一种检验核酸扩增均一性的质量控制标准品，
所述标准品的核酸序列结构由图1所示，
图1序列包括第一序列和第二序列，
其中所述第一序列从5’-3’方向顺序地包括以下序列：Tran、B、D、E、 Tran*、M和H，其中B、D和E构成一端哑铃的环；所述第二序列从5’-3’方向顺序地包括以下序列：Tran、B、D、K、Tran*、L和H*，其中B、D和 K构成另一端哑铃的环；所述第一序列和所述第二序列各自的Tran和Tran* 在各自形成哑铃的环两端，Tran为转座酶能识别的一个已知序列，Tran*是所述Tran的互补序列，两者之间形成双链；B为能够被转录酶识别的一个已知序列；D为任意长度的已知序列；E和K均为任意长度的随机序列；H 和H*分别为任意长度的已知序列，H*是所述H的互补序列，两者之间形成双链；M和L为任意长度的已知序列或随机序列，在M下方和L上方各自形成一个相应长度的序列缺口；和上述各序列之间可以存在任意长度的随机序列或已知序列。
在一种实施方式中，所述Tran是Tn家族转座酶能识别的已知序列，优选地为可以被Tn5转座酶识别的已知序列；所述Tran优选地为5’-CTG ACT CTT ATA CAC AAG T-3’、5’-CTG TCT CTT GAT CAG ATC T-3’或5’- CTG TCT CTT ATA CAC ATC T-3’，更优选地为5’-CTG TCT CTT ATA CAC ATC T-3’。
在一种实施方式中，所述序列B为T7转录酶识别序列，优选序列为5′ -TAA TACGAC TCA CTA TAG G-3’。
在一种实施方式中，所述序列D是6-60bp的已知序列，更优选长度为 10-30bp。
在一种实施方式中，所述序列E和所述序列K的序列长度均为4-20bp，优选地序列长度为5-15bp。
在一种实施方式中，所述序列M和所述序列L的序列长度均为4-20bp 的已知序列或随机序列，优选地序列长度均为5-15bp的已知序列。
在一种实施方式中，所述序列H和H*长度均为30-5000bp随机序列，优选地序列长度均为50-500 bp的已知序列。
在一种实施方式中，提供一种制备上述质量控制标准品的方法，所述方法包括下列步骤：
步骤1：设计和合成如式2和式3所示的两条ssDNA核酸序列，其中 Tran为转座酶能识别的一个已知序列，Tran*是所述Tran的互补序列；B为能够被转录酶识别的一个已知序列，D为任意长度的已知序列；E和K均为任意长度的随机序列；H和H*分别为任意长度的已知序列，H*是所述H 的互补序列；M和L为任意长度的已知序列或随机序列；和上述各序列之间可以存在任意长度的随机序列或已知序列。
式2 Tran B D E Tran＊ M H
式3 Tran B D K Tran＊ L H＊
步骤2：将上述设计好的2条ssDNA通过杂交方法制备成如式1所示的序列。
在一种实施方式中，在步骤2中将所述2条ssDNA分别制备为1-50uM 的溶解液，以等摩尔浓度混合均匀，室温下孵育1-5小时。
本发明的质量控制标准品作为阳性对照，在经转座酶切基因组DNA后，再进行基于线性扩增的单细胞核酸扩增测序的每一反应过程中，可通过 Sanger测序，明确反应过程的正确性，从而达到质量控制的目的。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明质量控制标准品的结构示意图；
图2是本发明质量控制标准品的杂交链示意图；
图3是本发明的质量控制标准品在DNA聚合酶I作用后所得DI序列示 意图；
图4是本发明的质量控制标准品在Q5聚合酶作用后所得D5序列示意 图；
图5为以Tran为引物时PCR产物琼脂糖凝胶电泳图和相应产物示意图； 其中M表示DNA Marker，DI代表DNA聚合酶I实验组，Q5代表Q5聚合 酶实验组，NC(左)代表DNA聚合酶I阴性对照组，NC(右)代表Q聚 合酶阴性对照组；右上图是为长片段产物序列示意图，右下图是为短片段产 物序列示意图；
图6为以Tran*为引物时PCR产物琼脂糖凝胶电泳图和相应产物示意 图；其中M表示DNA Marker，DI代表DNA聚合酶I实验组组，Q5代表 Q5聚合酶实验组，NC(左)代表DNA聚合酶I阴性对照组，NC(右)代 表Q聚合酶阴性对照组；右图为产物序列示意图；
图7为本发明质量控制标准品的进行体外转录起始序列示意图；
图8为本发明质量控制标准品的体外转录后所得产物序列示意图；
图9为本发明质量控制标准品的体外逆转录cDNA一链合成后所得产 物序列示意图；
图10为本发明质量控制标准品的体外逆转录cDNA一链合成验证所得 产物序列、体外逆转录cDNA二链合成及验证所得产物序列示意图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述。
实施例一：标准品的制备
1.设计合成ssDNA核酸序列
设计2条ssDNA核酸序列，分别称为序列F和序列R，具体碱基序列和序列的各个部分如下。
Figure RE-GDA0001925942090000051
2.溶解ssDNA核酸序列
将序列F和R分别制备为10uM的溶解液。
3.杂交反应标准品形成
将中已溶解的F和R等摩尔浓度混合均匀，室温下孵育2小时，随后通过2％琼脂糖凝胶电泳初步鉴定其杂交情况并对杂交链进行胶回收即可得到标准品。
实施例二：标准品制备后的验证
1.标准品验证步骤一
将上述制备得到的产物，分别通过两种不同反应性质的DNA聚合酶， DNA聚合酶I和Q5DNA聚合酶对其进行缺口补平后再进行鉴定。
如图2所示，DNA聚合酶I通过其聚合酶活性将缺口补平，并通过 其缺口平移活性，经其作用后得到5’端和3’端无Tran/Tran*的DNA片 段，称之为D1，示意图如图3所示；Q5DNA聚合酶则通过其聚合酶活 性将缺口补平的同时，进行链置换反应，得到由哑铃型结构变为全长线性 长度的dsDNA序列，称之为Q5，示意图如图4所示。经相应酶作用后所 得序列经Sanger测序进行验证。
2.标准品验证步骤二
分别以Tran和Tran*为引物，步骤一中所得产物为模板，进行PCR 反应。因为D1序列无5’和3’端的Tran的反向序列，所以如以Tran作 为引物，则无产物产生；而Q5如以Tran作为引物，则产生一长一短两 种产物，琼脂糖凝胶电泳图如图5所示。以Tran*为引物，则不论以D1， 还是以Q5作为模板，均产生单一条带产物，琼脂糖凝胶电泳图如图6所 示。所得序列均经Sanger测序进行验证。
实施例三：标准品制备后的应用
1.片段化核酸体外转录扩增
转录扩增是为了将片段化核酸进行预扩增，使其数量满足测序建库 的要求。体外转录能将一条双链DNA变为多条单链RNA，达到核酸扩增 的效果。使用T7RNA聚合酶进行体外转录时，它能够结合到转录启动子 序列B上并向它的下游启动转录如图7所示，形成与已知序列B下游单 链序列对应的单链RNA序列。由于片段化DNA上共有2个B序列，因 此T7 RNA聚合酶可以有两个不同的转录方向，体外转录会生成两类不 同的产物如图8所示。由于每个DNA模板每启动一次体外转录，就可以 生成一条额外的RNA，因此体外转录是一种扩增方法，可以将一个DNA 片段转化为许多RNA片段，产物为RNA文库rP。
2.RNA文库纯化
利用RNA纯化试剂盒对上述步骤所得产物进行纯化(Zymo Research,R1015)。
3.逆转录cDNA一链合成
转录生成的RNA在常温下非常容易降解，如需稳定地保存转录的产 物，一般会在完成转录后立即进行逆转录，将RNA转变为互补DNA。利 用cDNA合成逆转录试剂盒进行逆转录cDNA一链合成并同时去除RNA 模板(life Technologies,18080-51)。在该过程进行中，RNA文库产物可自 动部分互补，提供3’端，故无需特别引物。由于体外转录有两种不同的产物，逆转录也有两种不同的产物，如图9所示。
4.逆转录cDNA一链验证
分别以D和L的反向序列，及D和M的反向序列为引物，3中所 得产物为模板，进行PCR反应。所得产物示意如图10所示。
5.逆转录cDNA二链合成
以D为引物，3中所得产物为模板，用Q5聚合酶进行PCR反应。 所得产物图示如图10所示。
6.逆转录cDNA二链验证
该步骤的验证方法同步骤4，所得产物示意如图10所示。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质， 因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方 式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附 的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在 本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在 所附的权利要求中。

Claims (17)

1.一种检验核酸扩增均一性的质量控制标准品，其特征在于，所述标准品的核酸序列结构由式1所示；所述式1序列包括第一序列和第二序列，
式1：
Figure FDA0003405937990000011
其中所述第一序列从5’-3’方向顺序地包括以下序列：Tran、B、D、E、Tran*、M和H，其中B、D和E构成一端哑铃的环；所述第二序列从5’-3’方向顺序地包括以下序列：Tran、B、D、K、Tran*、L和H*，其中B、D和K构成另一端哑铃的环；所述第一序列和所述第二序列各自的Tran和Tran*在各自形成哑铃的环两端，Tran为转座酶能识别的一个已知序列，Tran*是所述Tran的互补序列，两者之间形成双链；B为能够被转录酶识别的一个已知序列；D为任意长度的已知序列；E和K均为任意长度的随机序列；H和H*分别为任意长度的已知序列，H*是所述H的互补序列，两者之间形成双链；M和L为任意长度的已知序列或随机序列，在M下方和L上方各自形成一个相应长度的序列缺口；上述各序列之间存在任意长度的随机序列或已知序列。
2.根据权利要求1所述的质量控制标准品，其特征在于，所述Tran是Tn家族转座酶能识别的已知序列。
3.根据权利要求2所述的质量控制标准品，其特征在于，所述Tran为被Tn5转座酶识别的已知序列。
4.根据权利要求3所述的质量控制标准品，其特征在于，所述Tran是5’-CTG ACT CTTATA CAC AAG T-3’、5’-CTG TCT CTT GAT CAG ATC T-3’或5’-CTG TCT CTT ATA CAC ATCT-3’。
5.根据权利要求4所述的质量控制标准品，其特征在于，所述Tran是5’-CTG TCT CTTATA CAC ATC T-3’。
6.根据权利要求1所述的质量控制标准品，其特征在于，所述序列B为T7转录酶识别序列。
7.根据权利要求6所述的质量控制标准品，其特征在于，所述序列B为T7转录酶识别序列为5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG G-3’。
8.根据权利要求1所述的质量控制标准品，其特征在于，所述序列D为6-60bp的已知序列。
9.根据权利要求8所述的质量控制标准品，其特征在于，所述序列D长度为10-30bp。
10.根据权利要求1所述的质量控制标准品，其特征在于，所述序列E和所述序列K的序列长度均为4-20bp。
11.根据权利要求10所述的质量控制标准品，其特征在于，所述序列E和所述序列K的序列长度均为5-15bp。
12.根据权利要求1所述的质量控制标准品，其特征在于，所述序列M和所述序列L的序列长度均为4-20bp的已知序列或随机序列。
13.根据权利要求12所述的质量控制标准品，其特征在于，所述序列M和所述序列L的序列长度均为5-15bp的已知序列。
14.根据权利要求1所述的质量控制标准品，其特征在于，所述序列H和H*长度均为30-5000bp随机序列。
15.根据权利要求14所述的质量控制标准品，其特征在于，所述序列H和H*长度均为50-500bp的已知序列。
16.一种制备权利要求1-15任一所述的质量控制标准品的方法，所述方法包括下列步骤：
步骤1：设计和合成如式2和式3所示的两条ssDNA核酸序列，其中Tran为转座酶能识别的一个已知序列，Tran*是所述Tran的互补序列；B为能够被转录酶识别的一个已知序列，D为任意长度的已知序列；E和K均为任意长度的随机序列；H和H*分别为任意长度的已知序列，H*是所述H的互补序列；M和L为任意长度的已知序列或随机序列；和上述各序列之间存在任意长度的随机序列或已知序列；
式2
Figure FDA0003405937990000031
式3
Figure FDA0003405937990000032
步骤2：将上述设计好的2条ssDNA通过杂交方法制备成如式1所示的序列。
17.根据权利要求16所述的方法，在步骤2中将所述2条ssDNA分别制备为1-50uM的溶解液，以等摩尔浓度混合均匀，室温下孵育1-5小时。
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