JP2018515081A - 鎖特異的cDNAライブラリーを構築するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は2015年4月29日に出願された米国仮特許出願第62/154,584号の優先権を主張し、この開示はあらゆる目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、米国国立科学財団による助成金第DBI1238243号のもと、政府の支援を受けてなされたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。
ハイスループット次世代配列決定 (NGS) 技術における最近の進歩により、任意のトランスクリプトームの包括的な特徴づけおよび定量化を含む、全ゲノム配列決定および機能ゲノム科学への新たなアプローチが可能となった。RNA配列決定法 (RNA-Seq) は、メッセンジャーRNAおよび構造RNAから生成された相補的DNA (cDNA) の直接配列決定、ならびに遺伝子発現解析のためにその配列決定リードを参照ゲノムまたは遺伝子セットにマッピングすることを伴う。この技法を用いて、新規の転写物、低分子RNA、選択的スプライシング産物、融合転写物、センス転写物、およびアンチセンス転写物を同定することができる。デジタル遺伝子発現 (DGE) として知られる別の技法は、NGSを用いて、あるcDNA配列がある試料中で検出される回数を決定するものであり、この回数はその配列に対応するRNAの相対的発現と直接関係する。
I. 序論
次世代配列決定法 (NGS) において使用され得る鎖特異的RNA-seqライブラリーを作製するための組成物、キット、および方法が、本明細書において提供される。鎖特異的cDNAライブラリーを作製するための、所要時間がより少なくかつより費用効率の高いこれらの方法は、DNAブリージングという現象を用いて、二本鎖核酸分子中への定方向配列決定アダプターの捕捉および取り込みを促進する。特定配列の所与の温度において、二本鎖核酸分子(例えば、RNA-cDNA複合体)は、一時的に分離して塩基を露出させ得る(「ブリージングし得る」)。この過程は、二本鎖核酸分子の末端においてより高い割合で起こる。一過性の末端のブリージング中に、ポリヌクレオチドアダプターは、RNA-cDNA複合体の第1 cDNA鎖にアニールし得る。ポリメラーゼの存在下において、アダプターは伸長し、第1 cDNA鎖と相補的な第2鎖cDNAを生成し得る。アダプターが取り込まれた二本鎖cDNA分子は、増幅の準備ができた状態である。この手順により、第2鎖cDNA合成に対するおよびアダプターを添加する前のRNAの除去に対する必要性が回避される。本明細書において記載される方法を用いて、鎖特異的RNAライブラリーおよび3'デジタル遺伝子発現ライブラリーを作製することができる。
本明細書で用いられる場合、以下の用語は、特に指定がない限り、それらに帰する意味を有する。
元の一本鎖核酸分子の方向情報を保存する鎖特異的cDNAライブラリーを構築するための方法、組成物、およびキットが、本明細書において提供される。本発明は、cDNA-RNA二重鎖中のcDNAの3'末端に特異的にアニールし、伸長して鎖特異的cDNA分子を生成し得る新規アダプターの発見に一部基づいている。
本明細書において提供されるアダプターは、捕捉プライマーおよびブロックプライマーを含み、この場合、ブロックプライマーは捕捉プライマーの一部と相補的である。当業者は、ブロックプライマーが捕捉プライマーと100%相補的である必要はなく、実質的に相補的(例えば、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%相補的)であってよいことを認識するであろう。アダプターの核酸配列は、本発明の鎖特異的cDNA分子の下流の適用に基づき得る。例えば、アダプター配列は、特定のNGSプラットフォームと適合するように選択され得る。
の核酸配列を含む。捕捉領域を伴う捕捉プライマーは、SEQ ID NO:3 (Nが任意のデオキシリボヌクレオチドであってよい、
) の核酸配列を有し得る。いくつかの態様において、捕捉領域を伴う捕捉プライマーは、
の核酸配列を有する。場合によっては、ブロックプライマーは、
の核酸配列を含む。
本明細書において記載される方法は、生体試料由来のRNA-cDNA二重鎖の混合物から鎖特異的cDNAライブラリーを作製する段階を含む。そのようなRNA-cDNA二重鎖の混合物を生成することの詳細な説明は、例えば、Kumar et al., Front Plant Sci, 2012, 3 :202;「mRNA Sequencing: Sample Preparation Guide」, Illumina, Cat. # RS-930-1001, Part # 1004898;Maekawa et al., Methods Mol Biol, 2014, 1164:51-65、およびTariq et al., Nucl Acids Res, 2011, 39(18):el20に見出される。
任意の方法、生成物、およびキットを用いて、超並列配列決定法(すなわち、次世代配列決定法)またはハイブリダイゼーションプラットフォームなどの下流の適用のための、鎖特異的cDNAの増幅準備済み産物を生成することができる。いくつかの例では、濃縮PCRは、cDNA分子の5'アダプターおよび3'アダプターと適合するプライマーを用いて行われ、アダプターおよびcDNA分子を増幅し得る。増幅の方法は、当技術分野で周知である。適切な増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応法 (PCR) 鎖置換増幅(SDA)、線形増幅、多置換増幅 (MDA)、ローリングサークル増幅 (RCA)、単一プライマー等温増幅 (SPIA)、Ribo-SPIA、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない任意のDNA増幅反応を含み得る。
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法は、その配列が標的RNA分子に対応する増幅産物をDNA配列決定する段階を含む。DNA配列決定法の非限定的な例には、Sanger自動化シーケンシング(AB 13730x1ゲノム解析機)、固体支持体上でのピロシーケンシング(454シーケンシング、Roche)、可逆的ターミネーターを用いる合成によるシーケンシング(Illumina(登録商標)Genome Analyzer)、半導体を用いた合成によるシーケンシング(Ion Torrent(商標))、ライゲーションによるシーケンシング(ABI SOLiD(登録商標))、またはバーチャルターミネーターを用いる合成によるシーケンシング(HeliScope(商標))が含まれる。配列決定のための有用な方法は、Illumina、454/Roche Life Sciences、Applied Biosystems、Helicos Biosciences、Pacific Biosciences、Life Technologies等により商品化されている。
部分的二本鎖5'アダプター、および5'アダプターを配列決定するのに有用な配列決定プライマーを含むキットが、本明細書において提供される。5'アダプターは、少なくとも20個のデオキシヌクレオチドと、約6〜12個の連続したデオキシリボヌクレオチドを含む3'オーバーハングとを含む捕捉プライマー、および捕捉プライマーの少なくとも一部と相補的な少なくとも20個のデオキシヌクレオチドを含むブロックプライマーを含む。ブロックプライマーは、ブロックプライマーの長さにわたって、捕捉プライマーと100%相補的であってよい。3'オーバーハングを形成する6〜12個の連続したデオキシリボヌクレオチドは、ランダムであってよく、または関心対象の第1鎖cDNAに基づいて事前に選択された配列を示し得る。いくつかの例では、事前に選択された配列は、関心対象のcDNAの末端と少なくとも50%、例えば、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%相補的である。他の例では、事前に選択された配列は、関心対象のcDNAの末端と100%相補的である。
以下の実施例は説明のために提供するものであり、主張される本発明を限定するために提供するものではない。
次世代配列決定 (NGS) 技術は、急速にゲノム研究の基礎的手段となった (Koboldt et al., 2013)。特に、RNA配列決定 (RNA-seq) は、遺伝子発現解析を一変させ、実質的に任意の種のトランスクリプトームアセンブリを作成する能力により、非モデル生物の研究をかつてない詳細度で促進した (Semon, 2014)。最も一般的に使用されているIlluminaプラットフォームにおいて、多数の生体試料を配列決定する能力は、分子の末端において指定配列「アダプター」を用いて核酸試料からライブラリーを作製することを必要とする。種々の供給源材料由来の核酸試料からアダプター付加ライブラリーを作製するために使用可能な種々の方法が存在するが、その工程はなお技術的に困難で、手が掛かり、かつ高価なままであり、それによってこの技術への広範なアクセスは限定されている。
鎖特異的ライブラリー合成のための反応段階の模式図を図1に示す。非鎖特異的な「慣習的」(CNV) RNA-seqライブラリーのための簡潔なプロトコールは、以下に見出され得る。鎖特異的DGE RNA-seqおよび鎖特異的SHO RNA-seq、ならびに非鎖CNV RNA-seqおよびDNA-seqのプロトコール変形の詳細な説明もまた、以下に見出され得る。この研究で使用されるオリゴヌクレオチドはすべて、50ナノモルスケールでLife Technologies (Thermo Fisher Scientific) に注文したものであり、脱塩され、さらなる精製はされていない。
トマト種子(トマト (S. lycopersicum) cv M82: LA3475)は、Tomato Genetics Resource Center, University of California, Davisにより提供された。滅菌(50%漂白剤で1分間、およびその後の水によるすすぎ)後、種子をPhytatray (Sigma) 中の水に浸したペーパータオル上に乗せ、室温にて暗下で3日間おき、発芽させた。Phytatray内の発芽した種子を、22℃、相対湿度70%、および明期16時間/暗期8時間の光周期の生育チャンバー内に入れ、さらに4日間おいた。次いで、実生をSunshine Mix土壌 (Sun Gro) に移植した。土壌中で11日間生育させた後、かみそりの刃を用いて、P5葉原基(葉試料)ならびにSAM(SAMおよびより若い4つの葉原基からなる)を慎重に切断し、RNase不含チューブ中に収集した。
ジルコンビーズ、およびドデシル硫酸リチウムの代わりにドデシル硫酸ナトリウムを含有する溶解物結合緩衝液を用いて、Kumarら (Kumar et al., 2012) によって以前に記載されたように、組織を処理し溶解した。試料当たり200μlの溶解物からmRNAを単離した。5-プライム20ヌクレオチド任意スペーサー配列に続いて20個のチアミンヌクレオチドを含有する、12.5μMの5-プライムビオチン化ポリTオリゴヌクレオチド
1μlを各溶解物試料に添加し、数回のピペット操作により混合し、10分間静置させた。インキュベーション後、LBBで洗浄したストレプトアビジン被覆磁気ビーズ (New England BioLabs, Cat. # S1420S) 20μlを添加することにより、捕捉されたmRNAを溶解物から単離した。ビーズ-溶解物混合物をピペット操作によって混合し、さらに10分間静置させた。試料を96ウェル磁気分離器 (Edge BioSystems, Cat. # 57624) 上に置き、以下の修正を加えて、以前に記載されたように洗浄した (Kumar et al., 2012)。(A) WBA、WBB、およびLSBの洗浄容量はそれぞれ300μlとし、使用前に緩衝液を氷上で冷却した。(B) 1 mM β-メルカプトエタノールを含有する16μlの10 mM Tris-HCl pH 8中へのmRNAの溶出を行った。
mRNAの断片化は、高温でマグネシウムイオンを使用することにより達成した(図7A〜C)。cDNA合成反応のプライミングは、鎖特異的DGE用、鎖特異的RND用の単一反応混合物中で行い、かつ、非鎖特異的ライブラリーは、10μlの総反応容量中に1.5μlの5×RT緩衝液 (Thermo scientific, Cat. # EP0441)、1μlのプライミングアダプター、および7.5μlの試料mRNAを含有する反応物中で断片化された。混合物を遠心沈殿させ、サーモサイクラー中でインキュベートした。各ライブラリー型について、以下のオリゴヌクレオチドおよびサーモサイクラープログラムを使用した。
DGE:1μlの2μMオリゴL-3ILL-20TV.2
(25℃で1秒、94℃で1.5分、30℃で1分、20℃で4分、20℃で保持)。
SHO:1μlの5μMオリゴL-3ILL-N8.2
(25℃で1秒、94℃で1.5分、4℃で5分、20℃で保持)。
断片化およびプライミングされたmRNAに5μlの以下の反応混合物を添加することにより、cDNAを合成した:1.5μl 5×Thermo Scientific RT緩衝液 (Thermo scientific, Cat. # EP0441)、1.5μl 0.1 Mジチオスレイトール (DTT)、1μl H20、0.5μl 25 mM dNTP (Thermo Scientific, Cat. # R1121)、0.5μl RevertAid RT酵素 (Thermo Scientific, Cat. # EP0441)(総反応容量15μl)。反応混合物を室温で構成し、以下のプログラムを実行するサーモサイクラー中に入れた(25℃で10分、42℃で50分、50℃で10分、70℃で10分、4℃で保持)。「ブリージング捕捉」または第2鎖合成の前に、各試料に5μl 50 mM EDTA pH 8.0および30μl Agencourt AMPure XPビーズ (Beckman, Cat. # A63881) を添加し、ピペット操作で混合することにより、cDNAを浄化し、サイズ選択した。5分後、試料を磁気トレイ上に置き、上清を除去し、ペレットを破壊することなく300μl 80%エタノールでペレットを2回洗浄した。残存エタノールを20μlピペットチップで除去し、目に見える微量の液体が検出不能となるまで試料を風乾させた。
5-プライムアダプターの付加は、10μMの事前にアニールさせた5-プライム二本鎖アダプターオリゴ4μlで、ビーズ-ペレットに結合しているcDNAを室温で再水和することによって行った。二本鎖5-プライムアダプターは、H2O中にそれぞれ10 mMのオリゴ5pSense8n
および5pAnti
を含有する貯蔵溶液を作製し、ストリップチューブ中に100μL容量を分注し、以下のプログラムを実行するサーモサイクラー中でそれらをアニールさせることによって調製した:[94℃で1分(94℃で10秒) -1℃/サイクルで60サイクル、20℃で1分、4℃で保持]。その後、6μlの以下の反応混合物を添加し、ペレットを完全に再懸濁するようにピペット操作により混合し、室温で15分間インキュベートした:3.5μl H2O、1μl 10×Thermo Pol I反応緩衝液 (Thermo Scientific, Cat. # EP0041)、1μl 250 mM MgCl2(新たに作製し、-20℃で貯蔵)、0.25μl 25 mM dNTP (Thermo Scientific, Cat. # R1121)、0.25μl Thermo DNA Pol I (Thermo Scientific, Cat. # EP0041)(総反応容量10μl)。10μl 50 mM EDTA pH 8.0および30μl ABRを添加することにより、前段階から存在するAgencourt AMPure XPビーズを用いて、ビーズ上の濃縮前ライブラリーを洗浄してサイズ選択し、ピペット操作により完全に混合し、5分間静置させてから磁気トレイ上に置いた。上清を除去し、ペレットを破壊することなく300μl 80%エタノールでペレットを2回洗浄した。残存エタノールを20μlピペットチップで除去し、目に見える微量の液体が検出不能となるまで試料を風乾させた。ペレットを22μl 10 mM Tris pH 8.0中に再懸濁し、1分間静置させ、磁気トレイ上に置いた。ビーズを含めずに上清を新たなストリップチューブに移し、濃縮の前に-20℃で貯蔵した。
濃縮段階は、全アダプター配列を含有する全長オリゴヌクレオチド、および主として全長増幅産物とするための、アダプターアームの最遠位部と相補的な短いオリゴヌクレオチドを用いて行った。PCR濃縮は、20μlの総反応容量中に、1μlの2μM特有インデックス付きILL-INDEXオリゴヌクレオチド
を、9μLのマスターミックス:4μl 5×Phusion HF緩衝液、2.6μl H20、1μl 2μM PE1プライマー
、1μl 各8μM S1 + S2プライマー
、0.2μl 25 mM dNTP、0.2μl Phusionポリメラーゼ (Thermo Scientific, Cat. # F-530L)、および10μlの濃縮前cDNAを組み合わせることによって行った。PCR混合物の半量 (10μl) を別の試料チューブに入れ、より多くの濃縮サイクルが必要となった場合の試料のバックアップとして-20 Cで貯蔵した。残りの10μlを遠心沈殿させ、プログラム:[98℃で30秒、(98℃で10秒、65℃で30秒、72℃で30秒)を11サイクル、72℃で5分、10℃で保持]を用いるサーモサイクラー中に入れた。非常にわずかな濃縮しか示さない試料は、バックアップPCR試料から13サイクルの濃縮を用いて再増幅させた。2μlの各ライブラリー試料を、サイズおよび量の参照のための1μlのO'GeneRuler 100 bp DNAラダー (Thermo Scientific, Cat. # SM1143) と共に、1%アガロースゲル上で100ボルトで20分間泳動した。濃縮ライブラリー試料の残り8μlを、12μlの新たなAgencourt AMPure XPビーズを用いて浄化しサイズ選択し、以前の洗浄段階と同様に80%エタノールで2回洗浄した。10μlの10 mM Tris pH 8.0でライブラリーをペレットから溶出し、定量化し、以前に記載されたようにプールした (Kumar et al., 2012)。UC BerkeleyのVincent J. Coates Genomic sequencing Facilityにおいて、50 bp単一末端配列決定を行った。
バイオインフォマティクスおよび統計解析は、iPlant Atmosphereクラウドサービス (Goff et al., 2011) を用いて行った。リードは、FASTX-Toolkit(hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/のウェブサイトを参照されたい)およびComai lab, UC Davisによって開発されたスクリプト(comailab.genomecenter.ucdavis.eduのウェブサイトを参照されたい)を用いて、42 bpまでトリミングし、品質フィルタリングを行った。表1に指定されたパラメータと共にBowtie (Langmead et al., 2009) を用いて、リードをマッピングした。リードの品質解析は、FASTQC(www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/のウェブサイトを参照されたい)を用いて行った。バイオインフォマティクス段階の各々を実行するために使用されたコードは、ウェブサイトgithub.com/SinhaLab/townsley-fips-2015/において入手可能であり、本研究で用いられるRNA-seqデータのためのFASTQファイルは、Dryadデータリポジトリ(リンクは、Dryadデータホスティングポリシーにより、証明される場合に限り提供され得る)からダウンロードすることができる。
本発明者らの鎖特異的ライブラリー調製法を評価するために、ペアワイズ比較解析用に、新たなBrAD-seq DGE法および本発明者らが以前に開発したHTR法を用いて、茎頂分裂組織 (SAM) および葉原基 (Leaf) 試料を調製した。このプロトコールにおいて、本発明者らは、濃縮段階中に試料識別インデックス配列をライブラリー分子に付加した (Meyer and Kircher, 2010)。
手順の問題として本発明者らは典型的には、より高い処理量を維持するためにライブラリー合成の前にmRNA濃度を定量化しないが、不慣れな材料で実験を開始する場合には、どのくらいの濃縮サイクルが試すのに合理的であるかという考えをある程度もっておくことは有用であり得る。投入mRNA濃度と選択される濃縮サイクル数の関係を確認するために、DGEライブラリー合成に使用された22件のmRNA試料を、RNA 6000 Picoキット (Agilent Technologies) を用いてBIOANALYZER(商標)で定量化した。この情報を、各ライブラリー試料の濃縮に使用されたサイクル数および洗浄されたライブラリーの濃度と相互に関連づけた(図8)。この関係から、約10 ng/μl未満のmRNAでは、最初の試みにおいて約14の濃縮サイクルから開始することが有意義であり得ることが示唆されるが、ゲル像の解釈における個々の好みおよび試料のプールのための目標最終濃度が、最終的には、理想的な濃縮サイクル数を決定する際の重要な要素となると考えられる。
5-プライムアダプター捕捉鎖に起因する配列の包含を回避するために、DGEライブラリーの最初の8塩基を解析前にトリミングした。HTRライブラリーに関しても、最初の8塩基をトリミングした場合に、リードマッピングの割合がより高い(77.8%対74.1%)ことが見出されたため、すべての解析に関して、品質フィルタリング段階の前に、トリミングされたFASTQファイルを試料について作成した。cDNA合成中に、ランダムプライマーはミスマッチを伴ってアニールし、それによって非天然配列がcDNA分子中に取り込まれるため、マッピング率は、トリミングされたHTRライブラリーにおいて改善する。
アダプターの混入は、HTRではリードの〜1%からなるのに対してDGEではリードの〜5%からなり、HTRよりもDGEライブラリーにおいてより高かった(図3A)。これは、DGEプロトコールのビーズ洗浄段階においてより高いPEG濃度を使用したことに起因し得る。これは小さい産物のビーズ結合を増加させる可能性がある。HTRライブラリーでは0.22%〜0.39%(図3B)、および市販のIlluminaキット (Kumar et al., 2012) を用いて作製されたトマトライブラリーではおよそ3%であるのに対して、DGEライブラリーからのリードのおよそ1%がリボソームの混入に起因し得る。HTRと比較してDGEにおいてrRNAが増加しているのは、HTR過程では2段階のmRNA再単離であるのに対して、単一段階のmRNA単離であることによる可能性が高い。
DGEライブラリーとHTRライブラリーを確実に比較するため、本発明者らは、注釈付きトマトコード配列+終止コドンの3-プライム側のゲノム配列に対応する付加的な下流部分からなる、一組の参照配列を作出した。植物の3-プライム非翻訳領域 (3'-UTR) は、長さが可変で平均およそ200 bpであるが (Mignone et al., 2002)、多くの3'-UTRは注釈付けられない。本研究の目的のために、大部分の3'-UTR配列を包含するよう500 bpの下流ゲノム配列を選択し、注釈付きITAG2.4コード配列に付加した (ITAGcds+500)。特にDGEライブラリーのために、コード配列の3-プライム側500 bp+3'-UTRを示すさらなる500 bpからなる、さらなるマッピング参照を作成して (ITAG500+500)、コード配列内の任意のAリッチ領域に対する3-プライムポリT含有アダプターの誤プライミングの影響を最小限に抑えた。
mRNA転写物の3-プライム部分に関して、DGEライブラリープロトコールの強い選択性が存在するが、HTRに由来するリードは、転写物にわたってより均等に分布している(図12)。ITAG500+500参照配列はITAGcds+500参照配列よりも平均して608 bp短いが、ITAGcds+500参照に特有にマッピングされるHTRリード(73%〜78%)よりも多くのDGEリードが、ITAG500+500参照に特有かつ鎖特異的にマッピングされる(78%〜81%)。
DGEライブラリーの鎖特異性を評価するため、重複するUTR領域へのリードマッピングを排除するように、リードをトマトコード配列のみにマッピングした(図3D)。DGEライブラリーにおいてマッピングされたリードのおよそ99%およびHTRライブラリーにおいてマッピングされたリードの50%は、センス鎖に局在化し、これによりDGEライブラリーの鎖特異性が非常に高度であることが示される。RNA-cDNA二重鎖のcDNA鎖のみがPol Iの鋳型として機能し得るため、cDNA分子の方向情報が保存される。本発明者らは、大腸菌Pol I、クレノウ断片、およびクレノウexo-と共にこの方法を用いてライブラリーの作製に成功し(図7C)、これにより、この過程が効率的に働くのにPol Iのエキソヌクレアーゼ活性は必要ではないことが示される。
事前に品質フィルタリングされたリードの同等サイズのサブセットから、リードを解析した(表3)。リードがマッピングされた転写物の数は、複数カ所にマッピングされたリードを除外した場合に、DGEライブラリーおよびHTRライブラリーの両方において減少する。DGEライブラリーに組み込まれた転写物の限られた範囲を、1カ所にマッピングされたリードのみを保持することおよび配列特異性と組み合わせることで、転写物のゲノム位置が重複している、およびコード配列が高度に保存される転写物の偽検出が減少し得る。
本発明者らは、主に非修飾オリゴヌクレオチドを使用し、取扱い、段階、および試薬を最小限に抑えるプロトコールを開発することにより、ライブラリー調製のコストおよび複雑度を最小限に抑えようと努めた。mRNAを単離し、本方法を用いて鎖特異的ライブラリーを作製するコストは並外れて低く、磁気ビーズ、dNTP、および酵素のコストはmRNA単離を含め総額で$2.96/試料であり、またはmRNAからライブラリーを作製する場合には$1.98である。消耗品、化学試薬、および反応マスターミックスの追加の10%容量のさらなるコストを考慮に入れても、本方法は、使用可能な市販の鎖特異的方法(例えば、NEBNext(登録商標)Ultra(商標)Directional RNA Library Prep Kit for Illumina(登録商標)96反応 Cat. # E7420L、SureSelect Strand Specific RNA-Seq Library Preparation kit 96試料反応用 Cat. # G9691A)の20〜40倍のコスト削減を提供する。
本発明者らは、最初に鋳型乗換えプロトコールを修正しようと試みたが、最終的に、今日までにほぼ間違いなく最も安価でかつ最も迅速なRNA-seqプロトコーの作出を可能にする発見をした。本発明者らの本来の目標は、アダプターにコードされたインデックス配列を一次リード内のバーコード配列と共に用いて、試料の超高密度多重化を達成しようとすることであった。5-プライムアダプターは、部分的Illumina PE1配列の後に、MMLVポリメラーゼによりcDNAに付加される非鋳型性シトシンとの塩基対合を促進するための9塩基対配列(6塩基対バーコードおよび3つの末端グアニン)が続く一本鎖分子として設計された。アダプター配列のcDNAへの付加は、アダプターコンカテマーからなる「バックグラウンドcDNA」を回避するためのサイズ選択ビーズ浄化の後に、大腸菌ポリメラーゼIを用いる二次反応で行われた。
本発明者らは、多重化形式で組織から鎖特異的3-プライムDGE RNA-seqライブラリーを作製するための迅速でかつ安価な方法を開発した。1日の作業日で全過程を完了することができる。本発明者らの知る限り、これは、アダプター配列を選択的かつ定方向に付加するために核酸二重鎖の末端ブリージングを用いる初めてのライブラリー構築過程である。本発明者らはさらに、種々のライブラリー型の作製を可能にするモジュールを含めるための過程を開発した。本発明者らはまた、トマトに加え、アメリカネナシカズラ (C. pentagona)、S. ペンネリイ (S. pennellii)、S. ピンピネリフォリウム (S. pimpinellifolium)、S. ネオリッキイ (S. neorickii)、およびタバコ (N. tobacum) を含むいくつかの種において、核となるDGE法を使用した。今日までに、本発明者らのDGEプロトコールをうまく使用して、発生および非生物的ストレスに関するいくつかの研究において差次的遺伝子発現を研究し、良好な結果を得ている。本発明者らは自身の目的のためにこの核となるプロトコールにモジュールを付加して適合化させ、その上、他者もまたこのプロトコールを汎用性RNAおよびDNA-seqライブラリープロトコールファミリーの基礎として使用することができるように、それらのモジュールを提供する。NGS配列決定技術の大衆化の一助となることを望んで、本発明者らは、NGSライブラリーを調製するための安価でかつ容易に実行されるプロトコールを提供する。この研究は、Townsley et al., Frontiers in Plant Science, 2015, 6(366): 1-11, doi: 10.3389/fpls.2015.00366として発表された。
SEQ ID NO: 1
合成オリゴヌクレオチド
SEQ ID NO: 2
合成オリゴヌクレオチド
SEQ ID NO: 3
合成オリゴヌクレオチド
Nが任意のデオキシリボヌクレオチドであってよい、
SEQ ID NO: 4
合成オリゴヌクレオチド
SEQ ID NO: 5
合成オリゴヌクレオチド
SEQ ID NO: 6
合成オリゴヌクレオチド
SEQ ID NO: 7
合成オリゴヌクレオチド
SEQ ID NO: 8
合成オリゴヌクレオチド
SEQ ID NO: 9
合成オリゴヌクレオチド
SEQ ID NO: 10
合成オリゴヌクレオチド
SEQ ID NO: 11
合成オリゴヌクレオチド
SEQ ID NO: 11
合成オリゴヌクレオチド
SEQ ID NO: 12
合成オリゴヌクレオチド
SEQ ID NO: 13
合成オリゴヌクレオチド
SEQ ID NO: 14
合成オリゴヌクレオチド
SEQ ID NO: 15
合成オリゴヌクレオチド
SEQ ID NO: 16
合成オリゴヌクレオチド
SEQ ID NO: 17
合成オリゴヌクレオチド
SEQ ID NO: 18
合成オリゴヌクレオチド
SEQ ID NO: 19
合成オリゴヌクレオチド
SEQ ID NO: 20
合成オリゴヌクレオチド
5'-NNNNNNNN
SEQ ID NO: 21
合成オリゴヌクレオチド
5'-NNNNNNNN
Claims (32)
- 以下の段階を含む、RNA試料中のRNA分子から鎖特異的cDNA分子を生成する方法:
(a) 生体試料から該RNA試料を単離する段階;
(b) 逆転写により、該RNA分子と第1 cDNA鎖とを含むRNA相補的DNA (cDNA) 二重鎖を生成する段階;
(c) 部分的二本鎖オリゴヌクレオチド5'アダプターを該第1 cDNA鎖の3'末端にアニールさせる段階であって、該5'アダプターが、
(i) 少なくとも20個のデオキシヌクレオチドと、該第1 cDNA鎖の3'末端にアニールする約6〜12個の連続したランダムなデオキシリボヌクレオチドを含む3'オーバーハングとを含む、第1鎖捕捉オリゴヌクレオチド;および
(ii) 該第1鎖捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部と相補的な少なくとも20個のデオキシヌクレオチドを含む、第2鎖ブロックオリゴヌクレオチド
を含む、段階;ならびに
(d) 該鎖特異的cDNA分子を生成する段階。 - 段階 (a) の後に前記RNA分子を断片化する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記鎖特異的cDNA分子を生成する段階が、DNAポリメラーゼまたはその断片を用いて前記5'アダプターの前記第1鎖捕捉オリゴヌクレオチドを伸長させて、前記第1 cDNA鎖と相補的な第2 cDNA鎖を生成することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第2鎖ブロックオリゴヌクレオチドと相補的なプライマーを用いて前記第2 cDNA鎖を増幅する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 増幅する段階がポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項4に記載の方法。
- 増幅された前記第2 cDNA鎖の配列を決定する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記3'オーバーハングが、事前に選択された第1 cDNA鎖と実質的に相補的である約8〜12個の連続したデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記3'オーバーハングが、事前に選択された第1 cDNA鎖と100%相補的である約8〜12個の連続したデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記生体試料が動物組織試料である、請求項1に記載の方法。
- 前記生体試料が植物組織試料である、請求項1に記載の方法。
- 前記RNA試料を断片化する段階がMg2+含有緩衝液中で行われる、請求項1に記載の方法。
- 段階 (c) および/または (d) が室温で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼまたはその断片がDNAポリメラーゼIである、請求項1に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼまたはその断片がクレノウ断片である、請求項1に記載の方法。
- 前記5'アダプターの前記第2鎖ブロックオリゴヌクレオチドが5'リン酸化される、請求項1に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼがクレノウ断片およびリガーゼである、請求項15に記載の方法。
- (a) 少なくとも20個のデオキシヌクレオチドと、約6〜12個の連続したランダムなデオキシリボヌクレオチドを含む3'オーバーハングとを含む、第1鎖捕捉オリゴヌクレオチド、および
(b) 該第1鎖捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部と相補的な少なくとも20個のデオキシヌクレオチドを含む、第2鎖ブロックオリゴヌクレオチド
を含む、部分的二本鎖オリゴヌクレオチド5'アダプター;ならびに
該第2鎖ブロックオリゴヌクレオチドと相補的な配列決定プライマー
を含む、キット。 - 前記第2鎖ブロックオリゴヌクレオチドが5'リン酸化される、請求項17に記載のキット。
- 前記第1鎖捕捉オリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO: 1に記載される配列を含む、請求項17に記載のキット。
- 前記第2鎖ブロックオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO: 2に記載される配列を含む、請求項17に記載のキット。
- 前記5'アダプターの前記3'オーバーハングが、約8〜12個の連続したランダムなデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項17に記載のキット。
- 前記約8〜12個の連続したデオキシリボヌクレオチドが、RNA-cDNA二重鎖の事前に選択された第1 cDNA鎖と実質的に相補的である、請求項21に記載のキット。
- 前記約8〜12個の連続したデオキシリボヌクレオチドが、RNA-cDNA二重鎖の事前に選択された第1 cDNA鎖と100%相補的である、請求項21に記載のキット。
- 取扱説明書をさらに含む、請求項17に記載のキット。
- 生体試料に由来するRNA分子と、該RNA分子の逆転写によって生成された第1 cDNA鎖とを含む、RNA-cDNA二重鎖、ならびに
(a) 少なくとも20個のデオキシヌクレオチドと、約6〜12個の連続したランダムなデオキシリボヌクレオチドを含む3'オーバーハングとを含む、第1鎖捕捉オリゴヌクレオチド、および
(b) 該第1鎖捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部と相補的な少なくとも20個のデオキシヌクレオチドを含む、第2鎖ブロックオリゴヌクレオチド
を含み、該RNA-cDNA二重鎖の該第1 cDNA鎖の3'末端にアニールする、部分的二本鎖オリゴヌクレオチド5'アダプター
を含む、ポリヌクレオチド複合体。 - 前記第1 cDNA鎖が、ランダムなヌクレオチド配列を含む3'アダプターを用いて生成される、請求項25に記載のポリヌクレオチド複合体。
- 前記第1 cDNA鎖が、ポリT配列を含む3'アダプターを用いて生成される、請求項25に記載のポリヌクレオチド複合体。
- 前記第1鎖捕捉オリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO: 1に記載される配列を含む、請求項25に記載のポリヌクレオチド複合体。
- 前記第2鎖ブロックオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO: 2に記載される配列を含む、請求項25に記載のポリヌクレオチド複合体。
- 前記5'アダプターの前記3'オーバーハングが、約8〜12個の連続したランダムなデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項25に記載のポリヌクレオチド複合体。
- 前記約8〜12個の連続したデオキシリボヌクレオチドが、前記RNA-cDNA二重鎖の事前に選択された第1 cDNA鎖と実質的に相補的である、請求項30に記載のポリヌクレオチド複合体。
- 前記約8〜12個の連続したデオキシリボヌクレオチドが、前記RNA-cDNA二重鎖の事前に選択された第1 cDNA鎖と100%相補的である、請求項30に記載のポリヌクレオチド複合体。
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