JPH08509382A

JPH08509382A - 置換を用いた転写による核酸増幅方法、及び該方法のために試薬及びキット

Info

Publication number: JPH08509382A
Application number: JP7504988A
Authority: JP
Inventors: クルチア、フィリップ; ギロ‐ボンニシ、フランソワズ; マレ、フランソワ; レヴァシュール、ピエール
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1993-07-26
Filing date: 1994-07-26
Publication date: 1996-10-08
Anticipated expiration: 2015-01-24
Also published as: EP0662155A1; CA2145533C; US6218151B1; EP1318203A2; FR2708288A1; FR2708288B1; CA2145533A1; JP3002259B2; EP1318203A3; WO1995003426A2; US5849547A; WO1995003426A3

Abstract

(57)【要約】ポリヌクレオチド例えば増幅されるべき配列を含むVII、並びにＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を準備し、そして該ポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する系及び鎖置換能力の存在下で、プライマー例えば増幅されるべき配列の一部に相補的なセグメントとハイブリダイズできるＡを含むプライマーのセットと接触させることによる標的核酸配列を増幅する方法であって、Ａは、上流のＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、次いで任意の配列を含み、プライマー例えばＤは、該ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、そしてプライマー例えばＣは、該任意の配列を含む。Ｄの伸長生成物は、Ｃの伸長生成物によって置換され、従って、Ｄの伸長生成物は一本鎖VIIIの形態で得られる。VIII上でのＡのハイブリダイゼーションに引き続く伸長は、二本鎖生成物Ｘを形成し、該Ｘは、転写、増幅を受け、一本鎖ＲＮＡ VIIbisを与える。３つのプライマー、Ｂ、Ｅ及びＦの類似の系は、同様に、VIIbisから一本鎖ＲＮＡ VIIを生成する。従って、増幅法は、等温で操作できるので循環的である。

Description

【発明の詳細な説明】置換を用いた転写による核酸増幅方法、及び該方法のために試薬及びキット本発明は、標的核酸配列の増幅のための方法、試薬及びキットに関する。特に、本発明は、置換を用いた転写による核酸増幅方法及び該反応によって得られる増幅生成物の検出にある。核酸及び遺伝物質に関する技術においては、遺伝子、遺伝子の一部又はヌクレオチド配列が生物、この生物の細胞抽出物又は生物学的試料中に存在するかどうかをを決定することがしばしば必要である。いずれの遺伝子又は遺伝子の一部も、ヌクレオチド分子の全て又は一部を形成する特定の配列のヌクレオチド塩基であるので、ポリヌクレオチドを含んでいる試料中の特定のヌクレオチド配列の存在を直接的に捜すことが可能である。特定のヌクレオチド配列の捜索の有用性は、特に病原性生物の検出、対立遺伝子の存在決定、宿主ゲノム中の遺伝的欠陥の存在の検出、及び特定のｍＲＮＡの存在又は細胞宿主の修飾の検出のために、幅広い。遺伝病、例えばハンチントン病、デュシェンヌ筋症、フェニルケトン尿症及びβ−タラセミアは、各個人からのＤＮＡを分析することにより診断されうる。更に、ウィルス、ウイロイド、バクテリア、菌類、原生動物又は他の形態の植物或いは動物を診断し、同定することも、核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション実験により行われうる。核酸の検出のための種々のタイプの方法が、文献に記載されている。これらの方法、及び特にポリヌクレオチドの検出を要求する方法は、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡ複合体における、核酸の相補鎖のプリン−ピリミジンン対合特性に基づいている。この対合プロセスは、二本鎖ＤＮＡのアデノシン−チミン（Ａ−Ｔ）及びグアノシン−シトシン（Ｇ−Ｃ）塩基間の水素結合の形成によって起こり、アデノシン−ウラシル（Ａ−Ｕ）塩基対も、ＤＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ−ＲＮＡ対において水素結合によって形成されうる。所与の核酸分子が存在するか否かの決定ための核酸鎖の対合は、通常“核酸ハイブリダイゼーション”又は単に“ハイブリダイゼーション”と呼ばれている。上記のいくつかの例においては、生物又は病気に特異的である配列を同定した後、試料より核酸を抽出し、そしてこの配列が存在するかどうかを決定するのが賢明である。この目的のために多くの検出方法が開発された。病気又は生物に特異的な１以上の配列を同定することが重要であるけれども、これらの配列の性質及びそれらが同定されたところの様式は本発明を行う上で特に重要ではない。核酸試料中における標的配列の存在を検出するための最も直接的な方法は、その配列が、標的核酸にハイブリダイズすべく標的核酸の一部に十分に相補的であるところの“プローブ”を得ることである。そのように合成されたプローブが、核酸を含む試料に適用されることができ、そしてもし標的配列が存在すれば、プローブは反応生成物を形成するためにハイブリダイズする。標的配列が存在しない場合に、非特異的なハイブリダイゼーション現象を避けることによって、反応生成物は形成されない。もし合成されたプローブが検出できるマーカーと結合されれば、反応生成物は、存在するマーカーの量を測定することにより検出されうる。サザンブロッティング（Southern E.M .，J.Mol．Biol.，第98巻、第503頁、1975年）又はサンドイッチハイブリイゼーション（Dunn A.R.，Hassel J.A.，Cell，第12巻、第23頁、1977年）は、これらの方法が用いられるところの例の一部をなす。しかしながら、このアプローチの主要な難点は、試料中に存在する標的配列のコピー数が低い場合（即ち１０⁷未満）にはそれが直接適用できないということである。これらの条件下では、重要なシグナル、即ち反応のバックグランドノイズより大きいシグナルを識別する（即ち、その標的配列上へのプローブの特異的結合を、プローブと標的配列とは異なる配列との間の非特異的結合と区別する）のが困難である。この問題の解決策の一つは、追加の反応によって検出シグナルを増加させることにある。従って、これらのハイブリダイゼーション技術の検出力を増加させるために種々の方法が報告されている。これらの、いわゆる“増幅”法は、核酸プローブによる検出法において種々の段階で用いられ得る。これらの段階は、三つのカテゴリー、標的、プローブ或いはシグナルの増幅に分類される。一方ではLewis（1992 年、Genetic Engineering News，第12巻、第１〜９頁）による文献、他方ではAb ramsonとMyers（1993年、Curr．Opin．Biotechnol．第４巻、第41〜47頁）による文献が、これらの方法の優れた一般的な総論である。標的の増幅は、特定の方法により、試料中に存在する核酸フラグメントを増加させることからなる。そのことは、検出されるべき標的核酸配列のコピー数を著しく増加させることを可能とする。最も広く知られた方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲと呼ばれている）であり、標的配列とハイブリダイズされたヌクレオチドプライマーの伸長によるインビトロノのＤＮＡ合成サイクルの反復に基づいた標的増幅技術である（Saiki ら、1985年、Science第230巻、第1350〜1354頁、米国特許第4683195、第4683202 、第4800159号明細書、ヨーロッパ特許第0201184号公報）。要約すれば、標的ＤＮＡの２本鎖の一つの鎖の配列にそれぞれ相補的な２つのヌクレオチドプライマーを合成する。デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートを、熱安定性のＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）の存在下にて、過剰量で反応媒体に加える。もし標的ＤＮＡが試料中に存在すれば、プライマーはそれらの特定の部位にハイブリダイズし、そしてポリメラーゼは、標的に相補的なヌクレオチドを連続的に付加することによりこれらのプライマーの３’末端を伸長する。連続サイクルとして温度を上下することにより、伸長されたプライマーは標的から分離し、元の標的と同様、過剰のヌクレオチドプライマーと結合できる。プロセスを繰り返すことにより（２０〜４０回）、２つのプライマー間の標的配列の指数的な蓄積が得られる。温度サイクルを用いた他の方法は、ヨーロッパ特許第0320308号公報に記載されており、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲと呼ばれる）と呼ばれている。２つの隣接するオリゴヌクレオチドプローブ並びにそれらと相補的である２つの他のプローブを、ＤＮＡリガーゼの存在下にて、過剰に反応媒体に加える。標的ＤＮＡの存在下、各オリゴヌクレオチドはその相補配列とハイブリダイズし、リガーゼは２つの隣接してハイブリダイズしたプローブを連結しうる。ＰＣＲにおけるのと同様に連続する温度サイクルによって、及び温度安定性リガーゼ（Barany、1991年、Proc．Natl． Acad．Sci．USA、第88巻、第189〜193頁）の使用によって、連結されたプローブは標的から分離して、今度は、過剰のプローブのための標的配列として働く。修復連鎖反応法（ＲＣＲと呼ばれている）は、ＬＣＲに類似した増幅法である（国際公開第９０／０１０６９号公報）。それは、ＰＣＲ及びＬＣＲの間の組み合せ法である。それは、熱安定性ＤＮＡリガーゼ及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの存在下にて、標的に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプローブ及び反応媒体中の過剰の２つのプライマーを用いる。標的ＤＮＡが存在する場合は、オリゴヌクレオチドはそれらの標的配列とハイブリダイズして、数塩基のギャップが、隣接するオリゴヌクレオチドプローブから各プライマーの末端を分離する。ポリメラーゼは、このギャップを埋めて、伸長されたプライマーを隣接するプローブに連結するリガーゼの作用をも可能とする。従って、ＤＮＡ修復の自然の方法に良く似ている。ＰＣＲ及びＬＣＲにおけるのと同様に、連続する温度サイクルによって、オリゴヌクレオチドプローブに連結された伸長されたプライマーは、今度は、プライマーのための標的として及び過剰のプローブとして働きうる。転写物の増幅に基づいた他の標的増幅法がある（ＴＡＳと呼ばれている）。ＴＡＳ（国際公開第ＷＯ８８／１０３１５号公報に記載されている）は、３つの段階の反復サイクルからなる。最初の段階は、逆転写酵素及びファージＲＮＡポリメラーゼプロモーターの特定の配列を含む“ハイブリッド”デオキシヌクレオチドプライマーの存在下にて、ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成を可能とする。ＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロ二本鎖を熱変性させた後、一本鎖ｃＤＮＡをアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーの存在下で逆転写酵素によって複製する。この第二段階においてかくして得られたＤＮＡホモ二本鎖は、ファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが結合できるところの二本鎖プロモーターを含む。次いでの第三段階はＲＮＡ分子の転写（鋳型当たり３０〜１０００）からなり、該ＲＮＡ分子は、再びｃＤＮＡ合成のための鋳型として働くことができ、これによって増幅サイクルが連続する（Davisら、1990年、J．Infect．Dis、第162巻、第13〜20頁）。ＴＡＳから派生した種々の方法がある。例えば、自己支持配列複製（Self-Sus tained Sequence Replication）（３ＳＲと呼ばれる）（これは国際公開ＷＯ９０／０６９９５及びヨーロッパ特許第0373960号公報に記載されている）、核酸配列に基づいた増幅（Nucleic Acid Sequence-Based Amplifi cation）（ＮＡＳＢＡと呼ばれる）（これは国際公開ＷＯ９１／０２８１８及びヨーロッパ特許第0329822号公報に記載されている）及び単一プライマー配列複製（Single Pr imer Sequence Replication）（ＳＰＳＲと呼ばれる）（これは米国特許第51943 70号明細書に記載されている）がある。これらの方法は、共通して、３つの酵素活性、すなわちＲＮＡ依存性及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ、大腸菌酵素及び／又は逆転写酵素に付随する酵素活性）及びＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ）の組み合わせを有する。これらの方法は、同一の原理に基づいており、ｃＤＮＡを介したＲＮＡ標的を複製するために、逆転写及び転写反応の連続工程に従って、固定化された温度（３７〜４５℃）において行われる。ＴＡＳの場合と同様に、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ファージ）結合部位が、逆転写段階のために用いられるプライマーによって、ｃＤＮＡ中に導入される。しかしながら、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖の変性は、ＲＮａｓｅＨ活性によるこのヘテロ二本鎖のＲＮＡの特異的な加水分解によって一定温度にて行われる。次いで、遊離のｃＤＮＡが、逆転写酵素によって、第二オリゴヌクレオチドプライマーから複製される。ＤＮＡ／ＤＮＡホモ二本鎖は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡへと転写され、そしてこのＲＮＡは次のサイクルでの鋳型として再び働くことができる。他の方法、連結反応活性化転写（Ligation Activated Transcription）（ＬＡＴと呼ばれる）（これは、米国特許第5194370号明細書に記載されている）は、３ＳＲ、ＳＰＳＲ及びＮＡＳＢＡと同じ酵素活性を用い、そして同じサイクルで操作される。しかしながら、プロモーター配列の設置の様式が異なっており、この場合、該配列は、ＤＮＡリガーゼの存在下にて、プロモーターを含んだステム−ループ構造の連結反応によって、ｃＤＮＡの末端に導入される。他の標的増幅方法は、最近発表された。鎖置換増幅法（Strand Displacement Amplification method）（ＳＤＡと呼ばれる）（これはヨーロッパ特許第049727 2号公報に記載されている）は、適当な制限酵素及びエキソヌクレアーゼ活性を欠損したＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いた、標的ＤＮＡ配列の一定温度（３７℃）での増幅を許す（Walkerら、1992年、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、第89巻、第392〜396頁）。それは、５’末端に制限酵素を認識する配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーションに基づいている。これらのプライマーは、少なくとも一つの修飾されたヌクレオチド（５’［α−チオ］ｄＮＴＰ）の存在下にて、ＤＮＡポリメラーゼによって標的上で伸ばされる。制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡの消化は、プライマーに対応する鎖の切断を起こし、修飾された相補鎖をそのまま残す。ＤＮＡポリメラーゼは、このようにして製造されたプライマーの伸長を行うことができ、そしてＤＮＡポリメラーゼの鎖置換性質を用いて、反応媒体中へＤＮＡ鎖を遊離させることができる。次いで、この遊離された鎖は、制限酵素結合配列を含むプライマーに結合でき、そしてその後、サイクルは再び開始できる。更に、特定の末端を有し、増幅法、特に上記ＳＤＡ中で後に働くことができる、核酸を調製する方法がヨーロッパ特許出願第543612号公報に記載されている。しかしながら、この調製方法は、それ自身では、いずれの場合でも、一定温度の増幅サイクルを引き起こすことが出来ないということを述べておくべきである。エンドヌクレアーゼ活性の代わりにエキソヌクレアーゼ活性を用いたＳＤＡに同様の方法（エキソヌクレアーゼ仲介鎖置換増幅（exonuclease-mediated strand displacement a mplicationと呼ばれる）が、ヨーロッパ特許第0500224号公報に記載されている。上記の全ての方法のために、種々の検出法が用いられ得る。それらの内の一つは、電気泳動分離による特定の大きさを有した反応生成物の検出である。その方法は、分離様式に従い変化し、ゲル分離、種々の固層（ビーズ、マイクロタイタープレート、ラテックス、マグネチック粒子）への結合を含む。他の方法は、放射性同位元素、例えば³²Ｐによる検出プローブの標識を用い、ついで、電気泳動と組み合わせて或いは組み合わせずに、反応生成物によって示された放射活性を検出する。他の方法は、リガンド（例えば、ビオチン又ジゴキシゲニン）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ）、蛍光マーカー（例えば、フィコビリ蛋白質、フルオレセイン、ローダミン）、ルミネセンスマーカー（例えばアクリジニウムエステル）又はこれらの修飾の組み合わせを加えることによる、オリゴヌクレオチドプライマーの化学的修飾である。他の方法は、増幅の反応生成物とハイブリダイズし、リボヌクレオシドトリホスフェートの存在下にポリメラーゼによって伸長される検出ヌクレオチドプライマーの開発である（このプライマーは、この場合に、上記のように修飾されることができる）。これら全ての方法は、固層並びに液体（均一相）に適用されうる。しかしながら、前記した全ての増幅技術は、少なくとも一つの主要な限界を有する。それらは、標的核酸の単一タイプ、即ちＲＮＡ又はＤＮＡからのみ増幅生成物を得ることが可能である。いくつかの場合、例えばＰＣＲ、ＬＣＲ又はＲＣＲの場合には、最大の限定要因は、標的から反応生成物を分離するために非常に多くの温度サイクルを行うことの必要性である。このことは、用いられ得る酵素の選択を温度安定性の酵素に限定する。更に、このような連続した温度サイクルを行うことは、これらの技術を自動化することに対して欠点を構成する。ある種の増幅技術の他の欠点は、増幅反応生成物の大きさの限界である。たとえばＰＣＲやＬＣＲのような技術は、増幅工程において用いられるヌクレオチドプライマー及びプローブに対応する標的の配列のみを増幅することができる。非特異的なバックグランドノイズ（即ち、標的の存在しない場合）はまた、ある種の技術例えばＬＣＲの重大な欠点である。ＬＣＲの場合には、過剰の遊離オリゴヌクレオチドの末端の連結反応が標的の非存在下で起こる。他の方法、たとえばＳＤＡは、増幅されるべき標的配列のタイプが限定されてしまう。なぜなら、この配列は、工程において用いられるエンドヌクレアーゼに対応する制限部位を含むべきでないからである。それ故、もし増幅されるべきフラグメントの配列が判らない場合には、少なくとも該フラグメントの制限地図を知ることが必須である。さらにこの限定は、以下の事実によって大きくなる。制限エンドヌクレアーゼの選択は、ヘミホスホロチオエート認識部位（即ち、ホスホロチオエートタイプの少なくとも一つの修飾されたヌクレオチドを有する二本鎖のＤＮＡストランドを含む）及びもっと一般的な観点からは、修飾されたヌクレオチドを含む部位を切断する能力を有しているものに制限される。化学合成という理由での、修飾されたヌクレオチドの選択における限定に加えて、増幅工程はまた、その収率によっても限定される。何故なら、修飾されたヌクレオチドに対するポリメラーゼのＫｍはポリメラーゼのための天然のヌクレオチドに対するＫｍより大きく、従って、修飾されたヌクレオチドの増幅されるべき標的中への酵素的な取り込みは効率的に低いということが知られている。ある種の増幅技術の他の主要な欠点は、増幅工程において含まれる多数の酵素活性にある。ＴＡＳから派生した方法、たとえば３ＳＲ又はＮＡＳＢＡは、少なくとも４つの酵素活性（ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨ）を要求し、またＬＡＴの場合には、５つの酵素活性（更にＤＮＡリガーゼ）を要求する。これらの４つ或いは５つの酵素活性を同時に満足させる反応条件を得ることは困難であるので、結果として、これらの技術を効率的にするのは非常に困難である。更に、これらの転写技術は、ＲＮＡ標的分子からのみ増幅を許し、ＤＮＡからはできない。最後に、種々の増幅技術は、核酸のストランドを分離する手段としてヌクレアーゼ活性（エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ）を用いているが（ヨーロッパ特許第05 00224号公報）、このようなヌクレアーゼ活性の調製においてときどき存在する望まないヌクレアーゼ活性によって標的又は反応生成物の分解があり得るので、それらの使用はやはり不利である。更に、転写技術の場合には、ＲＮａｓｅの使用は、増幅された物質の部分的分解をもたらし、それ故、収率及び技術の感度をだめにする。更に、ＲＮａｓｅの作用は、含まれる種々の酵素の作用との平衡を維持するために厳格に測定されるべきである。これらの多くの限定の点より、これらの既存の方法の代わりである他の増幅方法が望まれる。本発明は、置換を用いた転写反応による、試料中の任意の配列（並びにその相補配列）の標的核酸配列（ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ）の増幅方法を提供する。該方法は、試料中の標的核酸配列の検出を許す種々の段階を含む。該方法は、特に、１）所望の標的配列を含みうる生物学的試料からの核酸の抽出、２）標的配列の変性、即ちもし標的が二本鎖であれば一本鎖フラグメントの製造、３）（ａ）ＤＮＡ依存性及びＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、及び鎖置換活性を有する酵素又は酵素混合物、（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ、（ｃ）（５’から３’へと）少なくとも５ヌクレオチドの在ってもよい任意の配列、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列の全部または一部を含む配列、及び次に標的核酸フラグメントの３’末端に相補的な配列から順次なるオリゴヌクレオチドプライマー、及び／又は（ｄ）その３’末端に３（ｃ）中で定義したプライマーの任意の配列の全て又は一部を含む任意的なオリゴヌクレオチドプライマー、及び／又は（ｅ）その３’において３（ｃ）で定義したプライマーの全部又は一部を有する任意的なヌクレオチドプライマー、但し該３’末端は３（ｄ）中で定義されたプライマーの下流（３’）にハイブリダイズし、そしてプロモーターのセンス配列の少なくとも５’部を含みうるが３（ｃ）で定義されたプライマーの３’末端を含まない、（ｆ）デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート及びリボヌクレオシドトリホスフェート、（ｇ）酵素活性の機能に適した緩衝液、を含む反応混合物の添加、及び（４）反応生成物を製造するための最少時間での保温の実行を含みうる。本発明はまた、上記した方法を含む種々の方法による反応生成物の、分離及び／又は検出方法にも及ぶ。分離方法は、なかんずく、磁気的分離、固形支持体、膜、フィルター又はポリマー上での捕獲を含む。それぞれの方法において、捕獲基は、マグネチックビーズ、膜、フィルター又はポリマーにくっ付きうる。ビーズ、膜、固形支持体、フィルター又はポリマーは、次いで、増幅方法の反応生成物の存在又は非存在について検定されうる。たとえば、捕獲基は、増幅反応生成物と相補的な核酸配列、又は用いられたプライマーの一つ中あるいは反応生成物中に取り込まれたリガンド或いはハプテンに対して向けられた蛋白質または抗体であり得る。本発明の実行のために有用な検出系は、均質系（即ち、分離系を要求しない）及び、一方で非物質系を含む。個々の系において、１以上の検出マーカーが用いられ、そして検出系の反応又は放射が、好ましくは自動化手段により測定される。均質検出系の具体例は、蛍光エネルギーの移動、ハイブリダイゼーションによる保護（アクリジニウムのルミネセンス）、クローン化された酵素供与物の蛍光の偏光及び免疫学的検出を含む。非均質系の具体例は、酵素マーカー（ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ）、蛍光マーカー（酵素的マーカー、ローダミン、フルオレセイン）、化学発光及び生物発光を含む。これらの検出系においては、検出できるマーカーは、捕獲基と直接的に又は間接的に複合でき、または、増幅反応生成物は、蛋白質又は、抗体のためのリガンド或いはハプテンによって認識されうる抗体の存在下で生成されうる。本発明の主体はまた、目的の分子を間接的に検出する方法であって、目的の分子に連結されたマーカーであるポリヌクレオチドを増幅する方法である。マーカーポリヌクレオチドの増幅生成物は、それ自身、それらの合成の間に、修飾されたヌクレオチド例えば［³²Ｐ］又は［³Ｈ］で標識されたヌクレオチドの取込みによって直接検出されることができ、または上記方法に従って間接的にも検出されることができる。本発明はまた、プローブとして用いられることができ、またはそのヌクレオチド配列の決定のための鋳型として用いられることができる増幅生成物を製造する方法に関する。増幅された生成物は、増幅に用いられた酵素（ＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮＡポリメラーゼ）から分離されて、他の酵素反応、他の増幅系、配列決定法又は核酸合成法（いくつかの例を挙げると）を含む引き続くプロセスにおいて用いられることができる。本発明の主体はまた、上記増幅方法の実行を許す、試料中に存在しうる標的核酸を検出するためのキットである。これから、本発明を、添付した図を適宜参照して、更に詳細に説明する。図１は、ある種のポリメラーゼの鎖置換特性を用いた、二本鎖からの核酸鎖の分離の原理を記載した。図２は、均質相（単一段階及び単一温度）における、標的配列（ＲＮＡ又はＤＮＡ）に相補的なＲＮＡの転写による製造のための、鎖置換によるＲＮＡポリメラーゼプロモーターの設置法を記載する。プロモーターの配列は、黒い四角によって表し、ＲＮＡは太線で表した。プライマーＸは、５’ から３’へと、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターのセンス配列を含む配列及び標的の下流の配列とハイブリダイズする配列を含み、プライマーＺは、その伸長がプライマーＸから得られたフラグメントに相補的な鎖を製造することを可能とするところのプライマーを表し、そしてプライマーＹは、Ｘの下流でハイブリダイズし、かつその伸長がＸの伸長の生成物の置換を作るところの“置換” プライマーを表す。印、“＋”及び“−”は、核酸の対向する鎖、即ち相補鎖に属する配列を表す。図３は、“置換を用いた転写反応”による、ホモ二本鎖又はヘテロ二本鎖、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ（これらは図５に記載されている）からの、黒い長方形で表されている完全なプロモーターセンス配列を有するプライマーＡ及びＢ（これは、二本鎖の形で、機能的プロモーターを製造する）を用いた、本発明の増幅方法の導入ルート（エントリー）を記してある。図４は、“置換を用いた転写反応”による、ホモ二本鎖又はヘテロ二本鎖、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ（これらは図６に記載されている）からの、長い黒い長方形で表される完全なプロモーターセンス配列を含むプライマーＤ及びＦとは異なり、短い黒い長方形で表されているプロモーターのセンス配列の３’部のみを有するプライマーＡ及びＢ（即ち、プライマーＡ及びＢに含まれた配列は、図４及び６の場合には、それらが二本鎖の形の時、機能的プロモーターを形成しない）を用いた、本発明の増幅方法の別の導入ルートを記してある。図５は、黒い長方形で表される完全なプロモーターセンス配列（これは二本鎖の形で、機能的プロモーターを作る）を含むプライマーＡ、Ｂ、Ｄ及びＦの全てを用いた、最初の標的の２本の相補鎖に対応するＲＮＡ及びＤＮＡの指数的蓄積をもたらす“置換を用いた転写反応”の増幅サイクルを表す。図６は、長い黒い長方形で表される完全なプロモーターセンス配列を含むプライマーＤ及びＦとは異なり、短い黒い長方形で表されているプロモーターのセンス配列の３’部のみを有するプライマーＡ及びＢ（即ち、プライマーＡ及びＢに含まれた配列は、図４及び６の場合には、それらが二本鎖の形の時、機能的プロモーターを形成しない）を用いた、最初の標的の２本の相補鎖に対応するＲＮＡ及びＤＮＡの指数的蓄積をもたらす“置換を用いた転写反応”の増幅サイクルを表す。従って、この増幅サイクルは、単一機能的プロモーターのみを運び、二本鎖のうちの一本のみの転写を許す二本鎖ポリヌクレオチドのみをふくむ。図７は、図５に記載されたように、置換を用いた転写による増幅サイクルの実行のために用いられ得るプライマーの特定の場合を記載している。プライマーＤ（太字）は図５に記載されたそれに対応し、そしてプライマーＣ bisは、この場合はプライマーＤとオーバーラップしている。この特定の場合は、標的とのプライマーＣbisのハイブリダイゼーションは、プライマーＤの５’ 末端のハイブリダイゼーションと比べて、熱力学の点より有利であると推定している。図８は、実施例１に記載した、ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動分離、膜上への移動及びハイブリダイゼーションによる、置換を用いた転写生成物の分析を表す。矢印は、期待された２６３塩基の転写生成物を示す。レーン１は、転写の対照である。レーン２は、置換プライマーが存在しない場合の検定である。レーン３〜７は、それぞれ５ｍＭ、５００ｎＭ、５０ｎＭ、５ｎＭ及び０．５ｎＭを含む検定である。図９は、実施例２に記載した、ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動分離、膜上への移動及びハイブリダイゼーションによる、置換を用いた転写生成物の分析を表す。矢印は、期待された２６３塩基の転写生成物を示す。レーン１は、プライマーＡ２４（配列ＩＤＮｏ．２）及び１０２８（配列ＩＤＮｏ．３）を用いてＰＣＲにより得られた２８５塩基対のサイズマーカーに対応する。検定は、逆転写酵素及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼの非存在下（レーン２）又は酵素の存在下で、３つのタイプのプライマーＸ、Ｙ及びＺを用いて（レーン３）、置換プライマーＹなしで（レーン４）又はプライマーＺなし（レーン５）で行った。図１０は、実施例３に記載した、ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動分離、膜上への移動及びハイブリダイゼーションによる、置換を用いた転写生成物の分析を表す。レーン１は、プライマーＡ２４（配列ＩＤＮｏ．２）及び１０２８（配列ＩＤＮｏ．３）を用いてＰＣＲにより得られた２８５塩基対のサイズマーカーに対応する。レーン２は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ存在下での、２８５塩基対の標的転写の対照である。レーン３〜６は、試薬、即ちＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（レーン３）、逆転写酵素（レーン４）、プライマーＺ（レーン５）又は置換プライマーＹ（レーン６）の一つの非存在下で行った検定である。レーン７は、実施例３に記載された全ての試薬の存在下での検定である。図１１は、実施例４に記載した、ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動分離、膜上への転写及び、プローブＡ２８（配列ＩＤＮｏ．５）（パネルＡ）又はプローブＡ１９（配列ＩＤＮｏ．１１）（パネルＢ）（これらは、それぞれ＋ＲＮＡ又は−ＲＮＡを検出する）のいずれかとのハイブリダイゼーションによる、核酸鎖のいずれか一つの転写のために配向された２つのプロモーターが両側にある核酸からの転写生成物の分析を表している。レーン１は、２７５塩基対のサイズマーカーに対応する。レーン２は、転写検定である。図１２及び１３は、それぞれ図３及び図５の、別の実施態様を表している。図１４及び１５は、それぞれ図３及び図５に記載された増幅法を単純化した方法、即ちプロモータ−Ｄ及び／又はＦ（任意である）を反応媒体から除いている方法を表している。図１６及び１７は、それぞれ図３及び図５に記載された増幅法を単純化した方法、即ちプライマーＡ及びＢは、もはやプロモーターのセンス配列の上流の任意的な規定された配列を含まない方法を表している。従って、置換プライマーＣ及びＥ（図５）の使用は、もはや必須ではない。酵素的な置換の役割は、Ａ及びＢに含まれるプロモーターのセンス配列、即ちそれぞれプライマーＤ及びＦによって提供される。本発明の方法に従って、標的核酸配列の増幅方法であって、該核酸配列がその５’末端から、５’−３’方向に、少なくとも５ヌクレオチドを有する上流配列及び、その３’末端から、３’−５’方向に、少なくとも５ヌクレオチドを有する下流配列を含む核酸配列であるところの方法は、以下の段階：増幅されるべき配列に対応する第一のセグメントを含み、かつ更に、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのセンス配列又はアンチセンス配列又は該センス又はアンチセンス配列の少なくとも一部を含むセグメントから選ばれる少なくとも一つの第二のセグメントを含むポリヌクレオチドを得る段階（ここで、該センス配列又はその一部を含むこのような第二のセグメントは該第一のセグメントの５’末端の上流に置かれ、そして該アンチセンス配列又はその一部を含むこのような第二のセグメントは該第一のセグメントの３’末端の下流に置かれると理解される）、そしてＲＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性及び鎖置換活性を有する系の存在下で、該活性が作用する条件下で、そして過剰のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート及びリボヌクレオシドトリホスフェートの存在下において、上記ポリヌクレオチドをプライマーのセットと接触させる段階を含み、ここで該プライマーのセットは、過剰に存在し、かつａ）その５’末端から３’末端へと順次に以下のセグメントを含む第一のプライマー：任意の配列（第一のプライマーの構成要素としてのその存在は任意である）の第一のポリヌクレオチドセグメント、ここで該第一のセグメントは、存在する場合には少なくとも５ヌクレオチドを含む、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターのセンス配列の全て又は一部を含む、又は３’末端部分を含む該センス配列の少なくとも一部を含む第二のセグメント、及び、該上流配列と同じ長さを有し、かつ該上流配列に相同であるか又は該上流配列とハイブリダイゼーションできる第三のセグメント、及び／又はｂ）その５’末端から３’末端へと順次に以下のセグメントを含む第二のプライマー：第一のプライマーの第一のセグメントと同様に定義される（しかしそれと同一である必要はない）第一の任意的のセグメント、第一のプライマーの第二のセグメントと同様に定義される（しかしそれと同一である必要はない）第二のセグメント、及び、該下流配列と同じ長さを有し、かつ該下流配列に相同であるか又は該下流配列とハイブリダイゼーションできる第三のセグメント、ここで第一及び第二プライマーのうちの一つの第三のセグメントは増幅されるべき該配列の上流又は下流配列の内の一つと相同であり、一方、他のプライマーの第三のセグメントは、他の下流又は上流の配列とハイブリダイゼーションできると理解される、及び／又はｃ）以下のいずれかの配列を含む第三の及び／又は第四の任意的のプライマーそれぞれ第一のプライマー及び第二のプライマーの第二のセグメントに相同であり、５’末端部分を含む該ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのセンス配列の少なくとも一部を含む配列、又はそれぞれ第一及び第二のプライマーの第一のセグメントの一部分に相同である配列（ただしそれらの５’部分は含まない）、及び／又はｄ）以下のいずれかの配列を含む第五の及び／又は第六の任意的のプライマーそれぞれ第三の及び第四のプライマーの一部に相同な配列であり、該一部は該第三の又は第四のプライマーの３’末端ヌクレオチドを含まない配列、又はそれぞれ、第一の及び第二のプライマーの該第一セグメントの少なくとも一部に相同な配列、を含む。本発明に従った増幅方法の特定の実施態様に従って、増幅方法は以下の段階を：増幅されるべき配列に対応する第一のセグメントを含み、かつ更に、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのセンス配列又はアンチセンス配列又は該センス又はアンチセンス配列の少なくとも一部を含むセグメントから選ばれる少なくとも一つの第二のセグメントを含むポリヌクレオチドを得る段階（ここで、該センス配列又はその一部を含むこのような第二のセグメントは該第一のセグメントの５’末端の上流に置かれ、そして該アンチセンス配列又はその一部を含むこのような第二のセグメントは該第一のセグメントの３’末端の下流に置かれると理解される）、そしてＲＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性及び鎖置換活性を有する系の存在下で、該活性が作用する条件下で、そして過剰のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート及びリボヌクレオシドトリホスフェートの存在下において、上記ポリヌクレオチドをプライマーのセットと接触させる段階を含み、ここで該プライマーのセットは、過剰に存在し、かつａ）その５’末端から３’末端へと順次に以下のセグメントを含む第一のプライマー：任意の配列（第一のプライマーの構成要素としてのその存在は任意である）の第一のポリヌクレオチドセグメント、ここで該第一のセグメントは、存在する場合には少なくとも５ヌクレオチドを含む、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターのセンス配列の全て又は一部を含む、又は３’末端部分を含む該センス配列の少なくとも一部を含む第二のセグメント、及び、該上流配列と同じ長さを有し、かつ該上流配列に相同であるか又は該上流配列とハイブリダイゼーションできる第三のセグメント、ｂ）その５’末端から３’末端へと順次に以下のセグメントを含む第二のプライマー：第一のプライマーの第一のセグメントと同様に定義される（しかしそれと同一である必要はない）第一の任意的セグメント第一のプライマーの第二のセグメントと同様に定義される（しかしそれと同一である必要はない）第二のセグメント、及び、該下流配列と同じ長さを有し、かつ該下流配列に相同であるか又は該下流配列とハイブリダイゼーションできる第三のセグメント、ここで第一及び第二プライマーのうちの一つの第三のセグメントは増幅されるべき該配列の上流又は下流配列の内の一つと相同であり、一方、他のプライマーの第三のセグメントは、他の下流又は上流の配列とハイブリダイゼーションできると理解される、ｃ）以下のいずれかの配列を含む第三の及び／又は第四のプライマーそれぞれ第一のプライマー及び第二のプライマーの第二のセグメントに相同であり、５’末端部分を含む該ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのセンス配列の少なくとも一部を含む配列、又はそれぞれ第一及び第二のプライマーの第一のセグメントの一部分に相同である配列（ただしそれらの５’末端は含まない）、及び／又はｄ）以下のいずれかの配列を含む第五の及び／又は第六のプライマーそれぞれ第三の及び第四のプライマーの一部に相同な配列であり、該一部は該第三の又は第四のプライマーの３’末端ヌクレオチドを含まない配列、又はそれぞれ、第一の及び第二のプライマーの該第一セグメントの少なくとも一部に相同な配列、を含む。本明細書においては、“上流”なる表現は、問題の核酸又はポリヌクレオチド配列の５’末端側に置かれた領域を示し、そして、“下流”なる表現は、問題の核酸又はポリヌクレオチド配列の３’末端側に置かれた領域を示す。他の配列と相同な配列とは、他と同一の配列、又はそれが相同であるところの配列に厳密に相補的な配列とハイブリダイズするほとんど同一の配列を示す。 “ヘテロ二本鎖”なる語は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを意味する。“ホモ二本鎖”なる語は、ＤＮＡ／ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを示す。 “ヌクレオシドトリホスフェート”なる語は、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート及び／又はリボヌクレオシドトリホスフェートを示す。直上で定義した方法においては、出発物質は、増幅されるべき配列に“対応する”（これは、増幅されるべき該配列であるか又は増幅されるべき該配列の相補鎖であるという意味である）第一のセグメントを含み、該方法は、開始物質が一本鎖であっても、いずれの場合においても２つの相補鎖の増幅を提供すると理解される。ある種のポリメラーゼにおいて良く知られている鎖置換能力は、なかんずく、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにためのＤＮＡ合成及びＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成に結び付けられる。もちろんこの鎖置換能力は、関与するポリメラーゼが５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有していない場合にはもっと効率的である。この鎖置換能力は、以下に示すように、ポリメラーゼには依存しないと証明されうる。用いられるポリメラーゼは、リボヌクレアーゼＨ活性が増幅法の作用を妨げない限りは、該活性を持つことができるということに注目すべきである。今まで明らかにした方法においては、第三及び第４のプライマーが同一であり得るということは容易に判る。同様に、第五及び第六のプライマーも同一であり得る。上記した増幅方法を機能させるためには、もしそれらが存在するならば、第三及び第四のプライマーは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのセンス配列の少なくとも５’部分を含む。これは、図４、５、６及び７で示されたプライマーＤ、及び図４、５及び６で示されたプライマーＦの場合である。これらの図４及び６は、プライマーＡ及び／又はＢが、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターの完全な配列を含むことが必須でないということを示している。一方で、Ａ及びＦから、他方でＢ及びＤから導かれる反応生成物は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの機能的なセンス配列を含むべきである。 “鎖置換活性”とは、鋳型（テンプレート）依存性核酸合成と結びついて又はそれに近接して、生物学的、化学的又は物理的要因、例えばＤＮＡポリメラーゼが、５’から３’の方向へ、その相補鎖から対合した核酸の解離を起こす現象を示す。鎖置換は、対合した核酸配列の５’末端で開始し、そしてそれ故、酵素は置換部位の５’において同時に核酸合成を行う。新しく合成された核酸及び置換された核酸は、一般的に、鋳型核酸鎖に相補的である同じヌクレオチド配列を有する。鎖置換活性は、核酸合成、特にＤＮＡ合成の活性を与える分子と同一の分子上におかれることができ、または別個の独立した活性でありうる。ＤＮＡポリメラーゼ、たとえばＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ７又はＴ５バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼ、ＨＩＶウイルス逆転写酵素は、ポリメラーゼ活性及び鎖置換活性を有する酵素である。薬剤例えばヘリカーゼは、鎖置換効果、すなわち同じ配列の核酸合成と結び付けられた核酸の置換を生じるために、鎖置換活性を有しない誘発剤と共同で用いられ得る。同様に、蛋白質たとえばＥ．ｃｏｌｉ又は他の生物からのＲｅｃＡ又は一本鎖結合蛋白質が、他の誘発剤と共同して、鎖置換を生じるために又は促進するために用いられ得る。鎖置換の更なる説明及び議論は、KORNBERG，A．とBAKER T.A．（1992年、ＤＮＡ複製、第２版、第113〜225頁、Freeman，N York）を参照。ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターは、転写を開始するのを可能にする配列及び構造を指定する。例として、転写を開始できる“ループ構造”を挙げることができる（Mol lega ard，N.ら、1994年、PNAS、第91巻、第3892〜3895頁）。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのセンス配列は、その３’末端が、同一のプロモーターによって定義される転写開始部位に隣接しているところの二本鎖プロモーターの配列を示す。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのアンチセンス配列は、その５’末端が、同一のプロモーターによって定義される転写開始部位に相補的なヌクレオチドに隣接しているところの二本鎖プロモーターの配列を示す。特定の実施態様に従って、開始物質として用いたポリヌクレオチドは更に、ａ）該ポリヌクレオチドの該センス配列の全部又は一部を含む該第二セグメントの５’末端の上流の、第一及び第二プライマーの内の一つの第一セグメントに相同なセグメント及び／又はｂ）該ポリヌクレオチドの該アンチセンス配列を含む該第二セグメントの３’末端の下流の、第一及び第二プライマーの内の一つの第一セグメントとハイブリダイズできるセグメントを含む。直前に示した種々の開始物質が、本発明に従った増幅反応を引き起こすことは、容易に調べられる。これらの開始物質は、適当な場合には、ヌクレオチド合成又は半合成により調製できる。特定の実施態様においては、開始ポリヌクレオチドは、生物学的試料より単離されたＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。この場合には、標的核酸から始めて、場合により標的の変性の後に、単一段階において、全ての試薬（プライマー、ポリメラーゼ等）を反応の開始から添加することにより、上記した増幅反応を得ることができる。この特定の実施態様は、以下の事実によって特徴づけられる：上記した方法で開始物質として用いる該ポリヌクレオチドを得るために、増幅されるべき配列を含み、かつ増幅されるべき該配列の３’末端を超えて、下流領域を経由して、かつ増幅されるべき該配列の５’末端を超えて、上流領域を経由して伸長する標的核酸から出発して工程が実施される。該核酸は、過剰のヌクレオシドトリホスフェート、及びＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ及び鎖置換活性を有する該系、及び上記したプライマーを含み、かつ更に、標的の下流の該領域とハイブリダイズできる７番目のプライマー及び上流の該領域に相補的な配列とハイブリダイズできる８番目のプライマーを含むプライマーのセットと接触させられる。本発明の特定の実施態様においては、本発明において用いるヌクレオチドプライマーの数を制限するために、第７及び／又は第８のプライマーの配列と同等な第一及び／又は第二のプライマーの第一セグメントの配列を選ぶことができる。本発明はまた、標的核酸を増幅する方法（この方法は上記した）を実行するためのプライマーのセットに関する。プライマーのこのセットは、少なくとも：ａ）その５’末端から３’末端に、順次以下のセグメントを含むプライマーＡ１、任意の配列の第一の任意的なポリヌクレオチドセグメント、ここで該第一のセグメントは、存在する場合は、少なくとも５ヌクレオチドを含む、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターのセンス配列の全部又は一部を含むか、又はその３’末端を含む該センス配列の少なくとも一部を含む第二のセグメント、及び標的配列とハイブリダイゼーションできる第三のセグメント、及び／又はｂ）以下のいずれかの配列を含むプライマーＡ２：プライマーＡ１の第二セグメントの全て又は一部に相同であり、かつ該ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのセンス配列の少なくとも５’部分を含む配列、または、第一及び第二プライマーの第一セグメントに一部分に相同であるが、それぞれそれらの５’部分は含まない配列、及び／又はｃ）以下のいずれかの配列を含むプライマーＡ３：プライマーＡ２の一部に相同であるが、Ａ２の３’末端ヌクレオチドは含まない配列、又は、Ａ１に存在する上記した第一セグメントの少なくとも一部に相同な配列、を含む。特定の実施態様に従って、プライマーのセットは、少なくとも：ａ）その５’末端から３’末端に、順次以下のセグメントを含むプライマーＡ１、任意の配列の第一の任意的なポリヌクレオチドセグメント、ここで該第一のセグメントは、存在する場合は、少なくとも５ヌクレオチドを含む、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターのセンス配列の全部又は一部を含むか、又はその３’末端を含む該センス配列の少なくとも一部を含む第二のセグメント、及び標的配列とハイブリダイゼーションできる第三のセグメント、ｂ）以下のいずれかの配列を含むプライマーＡ２：プライマーＡ１の第二セグメントの全て又は一部に相同であり、かつ該ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのセンス配列の少なくとも５’部分を含む配列、または、第一及び第二プライマーの第一セグメントの一部分に相同であるが、それぞれそれらの５’部分は含まない配列、及び／又は以下のいずれかの配列を含むプライマーＡ３：プライマーＡ２の一部に相同であるが、Ａ２の３’末端ヌクレオチドは含まない配列、又は、Ａ１に存在する上記した第一セグメントの少なくとも一部に相同な配列、を含む。この特定の実施態様の概略を、前もっての変性を当然要求する二本鎖核酸の場合にて、図３に示した。図３から明らかなように、標的（Ｉ）にそってプライマーＡの伸長生成物が、プライマーＧの伸長生成物によって置換され、それによって二本鎖生成物（III ）及び一本鎖ＤＮＡ（II）の生成が起こる。同様に、標的の他の鎖（Ｉ’）に沿ってプライマーＢの伸長生成物が、Ｈの伸長生成物によって置換され、それによって二本鎖生成物（III’）及び一本鎖ＤＮＡ（II’）の生成が起こる。プライマーＡ及びＧの、一本鎖ＤＮＡ（II’）とのハイブリダイゼーションは、同様に二本鎖ＤＮＡ生成物（Ｖ’）及び一本鎖ＤＮＡ（IV’）の生成を起こす。プライマーＢの一本鎖ＤＮＡ（IV’）とのハイブリダイゼーションは、二本鎖ＤＮＡ生成物（VI）を生じ、該生成物は、その鎖のそれぞれの上に、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのセンス配列（又はプライマーＡ及びプライマーＢのそれぞれに存在するセンス配列の部分）を有する。同様のハイブリダイゼーション、伸長、置換によって、一本鎖ＤＮＡ生成物（ II）が同じ二本鎖ＤＮＡ生成物（IV）を生じることが容易に判りうる。更に、二本鎖生成物（Ｖ）は、もしそれがＲＮＡポリメラーゼプロモーターの完全な配列を含んでいれば、Ｂ及びＨとハイブリダイゼーションできる一本鎖ＲＮＡ転写生成物を与え、そしてこれらのプライマーの逆転写酵素による、置換を伴う伸長は、一本鎖ＤＮＡの生成を生じ、そのために、Ａとのハイブリダイゼーション及び続く伸長によって、二本鎖ＤＮＡ生成物（VI）を得ることをまた可能にするということを検定するが容易である。二本鎖ＤＮＡ（Ｖ’）から始まる類似の反応はまた、二本鎖ＤＮＡ生成物（VI）を生じる。図３において、第７及び第８のプライマーＧ及びＨの使用が、二本鎖ＤＮＡ生成物（VI）を生じ、該生成物は、確かに、上記した一般的方法において開始物質として用いることができるポリヌクレオチドである。本発明の特定の実施態様において、一本鎖核酸フラグメントの存在下、第一プライマー“Ａ”（５’から３’に向かって、順次、任意の配列、引き続くＲＮＡポリメラーゼプロモーター又は配列の全て又は一部に対応する配列、次いで標的に相補的な配列からなる）は、その標的配列（Ｉ）とハイブリダイズする（図３）。ＤＮＡポリメラーゼの存在下、ヌクレオチドが、標的配列（Ｉ）の全体長さにそってこのプライマーの３’末端に加えられる。伸長生成物は、鎖置換によって標的核酸鎖から分離され、次いで、プライマーＡの上流にハイブリダイズしたプライマー“Ｇ”の伸長がおこり、それが二本鎖生成物（III）及び一本鎖ＤＮＡ（II）の生成を結果する。第二のプライマー“Ｂ”（５’から３’に向かって、順次、任意の配列、引き続くＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列の全て又は一部に対応する配列、次いで標的核酸配列からなる）は、新たに合成されそして媒体中に放たれた伸長生成物（III）の３’末端においてハイブリダイズする。ＤＮＡポリメラーゼの存在下、ヌクレオチドは、新たに合成された鎖の配列全体に沿って、このプライマーの３’末端に付加される。この第二の新たに合成された鎖は、鎖置換によって第一の鎖から分離され、次いでプライマーＢの上流で標的とハイブリダイズされたプライマー “Ｈ”の伸長がおこる。この第一のプライマーＡは、次いで、この第二の放たれた鎖とハイブリダイズでき、ポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）の存在下で伸長されうる。それから得られた所定サイズの二本鎖反応生成物（VI）は、すると、その末端において、任意の配列により５ ’側で先行されている機能的ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含む（図３）。得られた生成物VIは、記載した増幅のための開始物質である（図５）。次いで、ＲＮＡポリメラーゼは、リボヌクレオシドトリホスフェート（ｒＮＴＰ）の存在下、そのセンス配列がＡに含まれるところのプロモーターを用いて転写する。それ故、ＲＮＡ（VII）は、その３’末端に、プライマーＢに相補的な配列を含む（図５）。それぞれの転写されたＲＮＡは、その３’末端において、プライマーＢの任意の配列の全て又は一部を含む配列をその３’末端に有するプライマー“Ｃ”と、そしてＣの下流で、Ｂに含まれるプロモーターのセンス配列の全て又は一部をその３’末端に有するプライマー“Ｄ”と同時的にハイブリダイズする。ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼは、ｄＮＴＰの存在下、プライマーＣの３’末端を伸長し、そして同時にプライマーＤの伸長から得られる上流の鎖を置換する。このことは、Ａのプロモーターから転写されたＲＮＡに相補的でかつその５’末端にＢのプロモーターの配列を含む一本鎖ＤＮＡ（VIII）の、媒体中への放出を生じる。次いで、この鎖の３’末端は、プライマーＡとハイブリダイズできる。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鎖にそってプライマーＡの３’末端を、そしてプライマーＡに沿ってＤＮＡの３’末端を伸長する。次いで、所定サイズの得られる二本鎖反応生成物（Ｘ）は、その一端に、Ｂに含まれる機能的ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を、そして他の一端に、Ａに含まれる機能的ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、任意の配列が５’側で先行している。次いでＲＮＡポリメラーゼは、ｒＮＴＰの存在下、Ｂのプロモーターから転写し、それ故、ＲＮＡ（VII bis）は、その３’末端にプライマーＡに相補的な配列を含む。同様に、ついで、ＲＮＡポリメラーゼは、ｒＮＴＰの存在下、所定の配列により５’で先行されている機能的ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を各端に有する所定のサイズの二本鎖核酸フラグメント（VI）の一本の鎖に含まれるＢに含まれるプロモーターから転写する。それ故、ＲＮＡ（VII bis）は、その３’末端にプライマーＡに相補的な配列を有する（図５）。各転写されたＲＮＡの３’ 末端は、その３’末端にプライマーＡの“上流”配列の全て又は一部を含む配列を有するプライマー“Ｅ”と、そしてその３’末端にプライマーＡの配列の全て又は一部を有するプライマー“Ｆ”と同時的にハイブリダイズする。プロモーター配列Ｅ及びＦは、プライマーＦがＥの下流に（即ち３’側に）ハイブリダイズするように選ばれる。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ｄＮＴＰの存在下、プライマーＥの３’末端を伸長し、そして同時に、プライマーＦの伸長から得られる下流の鎖を置換する。このことは、Ｂのプロモーターから転写されたＲＮＡに相補的でありかつその５’末端にＡのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡ（VIII bis）の、媒体中への放出を生じる。ついで、この鎖は、その３’末端において、プライマーＢとハイブリダイズできる。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鎖（VIII bis）にそってプライマーＢの３’末端を、そしてプライマーＢにそってＤＮＡ鎖（VIII bis）の３’末端を伸長する。ついで、所定のサイズの得られる二本鎖反応生成物（Ｘ bis）は、一端に、Ａに含まれる機能的ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を、そして他の一端に、Ｂに含まれる機能的ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、それらは所定の任意の配列により５’側で先行されている。ついで、ＲＮＡポリメラーゼは、ｒＮＴＰの存在下、Ａのプロモーターから転写する。それ故、ＲＮＡ（VII）は、それらの３’末端に、プライマーＢに相補的な配列を含む。それらの３’末端に、プライマーＢに相補的な配列を含むＲＮＡ（VII）は、その各端にＡのプロモーターからの機能的ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列（これは所定の任意の配列により５’ 側で先行されている）を含む所定のサイズの二本鎖核酸フラグメント（VI）を含む鋳型から転写されたものと同一である。それ故、それらはプライマーＣおよびＤを、ハイブリダイゼーションにより結合し、上記反応サイクルは連続する。同様に、それらの３’末端にプライマーＡに相補的な配列を含むＲＮＡ（VII bis）は、その各端に“Ｂ”のプロモーターからの機能的ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列（これは、所定の任意の配列により５’側で先行されている）を含む所定のサイズの二本鎖核酸フラグメント（VII）を含む鋳型から転写されたものと同一である。それ故、それらはプライマーＥおよびＦを、ハイブリダイゼーションにより結合し、上記反応サイクルは連続する。このことは、プライマーＡ及びＢの第二セグメントの間の標的の指数的増幅をもたらし、増幅された標的に対応する二本鎖ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの蓄積を生じる。本発明に記載された方法は、等温工程であり、たった二つの酵素を使用でき、ＲＮＡ及びＤＮＡの双方を生成し、何らの所定の末端なしで標的ＲＮＡ及びＤＮＡから行うことができ、標的配列の性質によって限定されず、かつ二重となった鎖の分離のための（リボ）ヌクレアーゼ活性を要求しないという利点を有する。さらに、用いたポリメラーゼによる、増幅生成物中への修飾されたヌクレオチドの取り込みは伴われない。本発明はまた、上記方法を行うためのキットであって、上記で定義したプライマーＡ₁、Ａ₂、Ａ₃のセット、及びａ）その５’末端から３’末端に向かって、順次以下のセグメントを含むプライマーＢ１、任意の配列の第一の任意的なポリヌクレオチドセグメント（該第一のセグメントは、存在する場合は、少なくとも５ヌクレオチドを含む）ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターのセンス配列の全部又は一部を含むか、又はその３’末端を含む該センス配列の少なくとも一部を含む第二のセグメント、及び標的上であって、プライマーＡ１がハイブリダイズできるところの配列の上流に位置する標的配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズできる第三のセグメント、及び／又はｂ）以下のいずれかの配列を含むプライマーＢ２：プライマーＢ１の第二セグメントの全て又は一部に相同であり、かつ該ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのセンス配列の少なくとも５’部分を含む配列、または、第一及び第二プライマーの第一セグメントの一部分に相同であるが、それぞれそれらの５’部分は含まない配列、及び／又はｃ）以下のいずれかの配列を含むプライマーＢ３：プライマーＢ２の一部に相同であるが、Ｂ２の３’末端ヌクレオチドは含まない配列、又は、Ｂ１に存在する上記した第一セグメントの少なくとも一部に相同な配列、を含む少なくとも一つの第二のプライマーセットを含むことを特徴とするキットに関し、該キットは、場合によりさらに、上記で定義した第七及び第八のプライマーを含む。本発明に従ったキットの特定の実施態様に従って、プライマーの第二のセットは、ａ）その５’末端から３’末端に向かって、順次以下のセグメントを含むプライマーＢ１、任意の配列の第一の任意的なポリヌクレオチドセグメント（該第一のセグメントは、存在する場合は、少なくとも５ヌクレオチドを含む）ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターのセンス配列の全部又は一部を含むか、又はその３’末端を含む該センス配列の少なくとも一部を含む第二のセグメント、及び標的上であって、プライマーＡ１がハイブリダイズできるところの配列の上流に位置する標的配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズできる第三のセグメント、及び／又はｂ）以下のいずれかの配列を含むプライマーＢ２：プライマーＢ１の第二セグメントの全て又は一部に相同であり、かつ該ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのセンス配列の少なくとも５’部分を含む配列、または、第一及び第二プライマーの第一セグメントの一部分に相同であるが、それぞれそれらの５’部分は含まない配列、及び／又はｃ）以下のいずれかの配列を含むプライマーＢ３：プライマーＢ２の一部に相同であるが、Ｂ２の３’末端ヌクレオチドは含まない配列、又は、Ｂ１に存在する上記した第一セグメントの少なくとも一部に相同な配列を含み、該キットは、場合によりさらに、上記で定義した第七及び第八のプライマーを含む。本発明においては、分析されるべき試料は、標的核酸配列を含むと思われる任意の開始物質から単離されうる。動物、特に哺乳動物にとっては、これらの物質の起源は、血液、骨髄、リンパ液、硬い組織（肝臓、脾臓、腎臓、肺、卵巣等）、唾液、スミア（smear）、便、尿でありうる。開始物質のための他の起源は、植物、土壌試料、食品生成物、並びに生物を含むと思われる他の起源でありうる。これらの開始物質からの核酸の単離は、種々の方法で行われうる。これらの方法は、ライゼートを生じる界面活性剤の使用、酵素（たとえば、リゾチーム、プロテイナーゼＫ）の使用、超音波処理、ビーズの存在下での機械的攪拌、またはフレンチプレスの使用を含む。いくつかの場合には、混入物たとえばヌクレアーゼを除くために、抽出された核酸を精製することが必要である。この場合には、核酸の精製は、フェノールークロロホルム抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、電気泳動、平衡遠心分離により、また固体支持体上でのハイブリダイゼーションによる捕獲により行われうる。核酸は分離されるとすぐに、サイズが１０キロベース未満のフラグメントを得るために、たとえば超音波処理により、それらのいくつかの簡単なフラグメント化が行われうる。このことは、特に二本鎖核酸の場合に、開始の変性を容易にすることを可能とする。上記の方法において用いられるプライマーは、５〜１００ヌクレオチドの長さを有する。例えば、プライマーＡ及びＢの長さは、一般的に３０〜１００ヌクレオチド、好ましくは４０〜７０ヌクレオチドである。一方、プライマーＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨは、５〜５０ヌクレオチド、好ましくは１０〜３５ヌクレオチドである。プライマーＡ及びＢは、それぞれ、それらの３’末端において、標的配列（ここでは、一本鎖と仮定する）に実質的に相同又は相補的であるべきであり、それによって、ドラスティックな或いは高度に差別化条件下で、標的またはその相補鎖の特定の部位とのハイブリダイゼーションが起こりうる。プライマーＡ及びＢは、その５’末端に、少なくとも５ヌクレオチドの長さの所定の任意の配列を含みうる。この配列は、場合により、Ａ及びＢで共通であってもよいが、同様に異なっていてもよい。該所定の配列は、任意の手段によって選べれうるが、ただし、それは標的との著しい相同性を含まず、かつプライマー内での二次構造（例えば、ステム‐ループまたは二重螺旋）の形成も、ＡとＢの間のダイマーの形成も起こさない。この所定の配列の下流において（即ち、３’に向かって）、プライマーＡ及びＢは、その相補性によって、ＲＮＡポリメラーゼを結合し、ＲＮＡの転写を開始する能力を有する配列のセンス配列を含むべきである。これらのいわゆる“プロモーター”配列（或いは、“プロモーター”のセンス又はアンチセンスと呼ばれる）は、例えば、ファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列（例えば、バクテリオファージＴ７、Ｔ３及びＳＰ６）である。Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼは、効率的なＲＮＡの転写のためには、ＤＮＡ上に特定のプロモーター配列の存在をを要求することが知られている。この特定のプロモーター配列は、完全に特徴づけられており（Du nnとStudier、1993年、J．Mol．Bio1．第166巻、第477〜535頁）、そしてそのプロモーターからのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写の高い特異性が示されている（Ba ileyら、1983年、Proc．Natl．Acad Sci．第80巻、第2814〜2818頁）。これらの特性は、機能的な二本鎖プロモーターを含む鋳型から、インビトロでＲＮＡを製造するために用いられうる（KruppとSoll、1987年、FEBS Lett．第２巻、第271 〜275頁）。同様に、ＲＮＡは、二本鎖プロモーター含む合成オリゴヌクレオチドの鋳型から、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、インビトロで転写されうる（ Milliganら、1987年、Nucl．Acids Res．第15巻、第8783〜8798頁）。 Kruppによる文献（1988年、Gene、第72巻、第75〜89頁）は、ファージＲＮＡポリメラーゼを用いた方法及びインビトロでのＲＮＡ合成のための有用な計画についての優れた総論である。用いられるプロモーター配列はまた、真核生物のＲＮＡポリメラーゼ、例えばＲＮＡポリメラーゼIII（Sharpら、1985年、Crit．Rev ．Biochem．、第19巻、第107〜144頁）のためのプロモーター配列であり得る。本発明のいくつかのプライマーは、相同な配列を含む。種々のプライマーの相対濃度を調節することは、サイクルを良好に働かせるために、特定のハイブリダイゼーションを促進することを可能とする。本発明の方法においては、標的核酸フラグメントが得られるとすぐに、適当な場合には、それらは変性されて一本鎖にされて、プライマーＡ及びＧのハイブリダイゼーションを許し、そして開始の核酸が二本鎖の場合には、Ｂ及びＨのハイブリダイゼーションを許す（或いは、逆）。約９５℃まで温度を上げることは変性のためには好ましい。しかし、鎖の分離はまた、ｐＨを増加させ、そしてついでプライマーが標的とハイブリダイズするのを許すために媒体を中和することにより行われ得る。標的核酸を変性する前又は後に、過剰のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート及びリボヌクレオシドトリホスフェート、ＲＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼを含む反応混合物が加えられる。標的核酸の変性のために温度の上昇が用いられる場合は、温度安定性酵素を用いない限りは、変性後に酵素を添加するのが好ましい。本発明に従った増幅反応を行うために必要な反応混合物はまた、ポリオール、たとえばグリセロール、ソルビトール、ポリエチレングリコール又は変性剤及び／又は溶媒、たとえばジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含みうる。これらの試薬は、バックグランドノイズを生じうる非特異的なハイブリダイゼーション反応を減少することを可能とする。本発明の方法において用いられるポリメラーゼは、鎖置換活性を欠いているのが好ましい。この活性は、ある種のポリメラーゼのよく知られた特性である（Sa mbrookら、1989年、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第２版、第5.33 〜5.35頁、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor）。ＤＮＡポリメラーゼの特性、及び特にそれらのいくつかの鎖置換活性は、KonbergとBaker によって詳説されている（1992年、DNA Replication、第２版、第113〜225頁、F reeman，New York）。鎖置換活性は、はじめ、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントにおいて示され（MasamuneとRichardson、1971年、J．Bio l．Chem.、第246巻、第2692〜2701頁）、それは、この酵素に、二本鎖ＤＮＡ中の切断の３’ＯＨ末端から核酸の複製を開始する能力を与える。この鎖置換特性は、ＤＮＡポリメラーゼが５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する場合に限られる（LundquistとOlivera、1982年、Cell，第31巻、第53〜60頁）。この鎖置換活性はまた、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴｌｉＤＮＡポリメラーゼにおいても示されている（Kongら、1993年、J．Biol．Chem．第268巻、第1965〜1975頁）。この場合には、この酵素の変異した形ものは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有さず、より大きい鎖置換能を有することが知られている。鎖置換は、全てのＤＮＡポリメラーゼに共通の特性ではない。なぜならそれらのうちのいくつか、例えばＴ４ＤＮＡポリメラーゼは、それ自身では、鎖置換を行うことができない。鎖置換活性はまた、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Lechnerら、1983年、J． Biol．Chem．第258巻、第11174〜11184頁）及びＨＩＶ逆転写酵素（Huberら、19 89年、J．Biol．Chem.、第264巻、第4669〜4678頁）においても示されている。鎖置換能力、及び特に二本鎖ＤＮＡ中の切断の３’ＯＨ末端から（５’から３’ 方向へと）重合を開始する能力を有するＤＮＡポリメラーゼ（図１）は、本発明の増幅反応を行うのに有用である。好ましくは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているＤＮＡポリメラーゼが増幅サイクルを行うために用いられる。なぜなら、鎖置換活性の効率が、この活性を欠いている酵素でより大きいからである。大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているポリメラーゼの一例である。同様のポリメラーゼ、たとえばＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ又はシークエナーゼ（ＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ又はＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼもまた用いられうる。しかしながら、本発明はまた、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が増幅方法を実行するのを妨げない場合には、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの使用を含む。この場合には、増幅反応の収率は、用いられる反応条件下で、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を特異的に阻害することによって、増加させられ得る。本発明の増幅方法は、転写されたＲＮＡをｃＤＮＡへと、再コピーするために、逆転写段階を要求する。この段階は、特に、一般に市販されている、ＡＭＶ（ Avian Myeloblastosis Virus）又はＭＭＬＶ（Moloney Murine Leukemia Virus ）タイプの逆転写酵素を用いて行われうる。ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する他の酵素もまた、本発明で用いられ得る。ただし、それは、鎖置換活性を有すること。反対の場合には、鎖置換活性は、指示試薬、ヘリカーゼまたはＲｅｃＡタイプ活性によって与えられ得る。特に一本鎖ＤＮＡ再会合のプロセスにおいての、鎖捕獲または鎖同化のＲｅｃＡ特性は、The Enzymes、第14巻、第445〜470頁において、Mc ENTEEとWEINSTOCKによって詳説されている。逆転写段階は、たとえば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて行われうる。なぜなら、この酵素はまたＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有していることが示されたからである（RicchettiとBuc.、1993頁、EMBO 第12巻、第387〜396頁）。本発明はまた、この目的のために、熱安定性ＲＡＮ及び／又はＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ例えばＴａｑポリメラーゼ又はＴｔｈポリメラーゼを用いることができる（熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの特性に関する総論のためには、Rolfら、1992年、ＰＣＲ：Clinical Diagnostics and Research、第224〜258頁、Sprin ger-Verlag，Heidelbergを参照）。ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換特性、又は他の関連する誘導剤の使用の結果として、本発明はヌクレアーゼ活性、即ちエンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ又はリボヌクレアーゼ活性を要求しない。特に、本発明は、上記した種々の他の増幅技術に共通し、かつ、ある種の逆転写酵素により与えられ、大腸菌ＲＮase Ｈの添加により補われなければならないＲＮase Ｈ活性の使用を要しない。本発明の方法においては、ＲＮＡ−及びＤＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼとして、ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いることができ、それはＡＭＶのそれよりも低いＲＮａｓｅＨ活性を有する（Sambrookら、1989年、Molecular Cloning：ALaboratory Manual、第２版、第5.52〜5.55、8.11、8.17頁、Cold Spring Habor Laborator y，Cold Spring Habor）。ＲＮａｓｅＨ活性を欠いている形のＭＭＬＶ逆転写酵素の形は、本発明において用いられ得る。ＭＭＬＶ逆転写酵素のＲＮａｓｅＨ活性は、たしかに、この酵素の構造遺伝子の一部を欠損することにより抑えられることができ（Kotewiczら、1988年、Nucl．Acids Res.、第16巻、第 265〜277頁）、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素と比較して高められたポリメラーゼ効率をもたらし、それは、“Superscript”の名前で市販されている（Gerardら、1 989年、Focus、第11巻、第66〜69）。逆転写酵素のＲＮａｓｅＨ活性もまた、このポリメラーゼ活性を与える遺伝子の部分において点変異を起こすことにより抑えられることができ（Gerardら、1992年、Focus、第14巻、第91〜93頁）、増加した効率及びSuperscriptよりも大きなＤＮＡ重合レベルを有する酵素をもたらす。この酵素はまた、“Superscript II”（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）の名前で市販されている。他の形態のものは、“StrataScript”（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）という名前で市販されているものである。種々の増幅方法とは反対に、本発明は、合成された鎖を鋳型から分離するための温度サイクルを要求しない。この方法においては、適当な場合には、標的の初めの変性が行われるとすぐに、単一の温度を用いることができる。温度は、プライマーの標的との特異的なハイブリダイゼーションを許す差別化ハイブリダイゼーション条件を定義すべく十分に高くすべきである。この温度は、たとえば、慣用の酵素試薬で、37℃〜45℃であり、もし熱安定性酵素が用いられる場合にはもっと高くてもよい。図３及び図５は、置換を用いた転写反応による増幅法を記載してある。図３は、増幅法の可能な導入ルートを記してあり、図５は増幅サイクルそのものである。標的核酸（ホモ又はヘテロ二本鎖、単一又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ）の初めの変性の後に、プライマーＡ、Ｂ、Ｇ及びＨをそれぞれの核酸鎖とハイブリダイズさせる（図３）。過剰のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート及びＤＮＡポリメラーゼ〔ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ依存性（標的がＤＮＡかＲＮＡかに依存する）〕の存在下での、これらのプライマー同時伸長は、Ｇ由来の鎖を伸長することにより、Ａの伸長から得られたＤＮＡ鎖の置換が起こり、そしてＨ由来の鎖の伸長によって、Ｂの伸長により得られた鎖の置換が起こる。一方でプライマーＡの伸長により、他方でのプライマーＢの伸長により得られる一般鎖ＤＮＡは、それぞれ、プライマーＢとＨ、及びＡとＧとハイブリダイズできる。Ｇの伸長は、プライマーＡから伸長している鎖の置換を起こし、そしてＨの伸長は、プライマーＢから伸長している鎖の置換を起こす。このようにして、放たれた所定の長さの２つの鎖は、完全に相補的であり、互いにハイブリダイズできるか又はプライマーＢ（Ａの伸長に対応する鎖）又はＡ（Ｂの伸長に対応する鎖）とハイブリダイズできる。これらの短いプライマーのハイブリダイゼーションは、熱力学の点からさらに有利である。従って、それぞれの鎖上でのＡ及びＢの伸長は、プライマーＡ及びＢの第２のフラグメント間の標的配列に対応し、かつ、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが下流に続く所定の配列により各末端においてフランキングされているところの所定の長さの二本鎖核酸フラグメントを生じる。上記した導入ルート（図３）はまた、固体支持体上についたプローブによって捕獲された標的を用いて達成されうる。このプローブは、仏国特許第９１０９０５７号公報及び国際公開ＷＯ９１／１９８１２号公報に記載されているごとく、共有結合的に又は受動的に固定化されうる。このプローブの固定はまた、（コ）ポリマー、特にＮ−ビニルピロリジンコポリマーを用いて行われることができ、プローブは、複合体を形成することにより、該ポリマーに連結する。該複合体は、受動的な吸着により固体支持体上に固定化される。特に、プライマーＡ及び／又はＢ、又はＧ及び／又はＨは固体支持体上につけられうる。ただし、この付着は、プライマーの３’末端を介して行われてはならず、従ってこれらのプライマーの３’末端は、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの存在下でＤＮＡポリメラーゼによって伸長できる。特に一方でプライマーＡ及びＧ、他方でプライマーＢ及びＨの全て又は一部が、任意の連結腕（たとえば、炭化水素又はヌクレオチド）及びそれらの５’末端からのこれによって互いに連結されているのが有利でありうる。このことは、本発明の増幅反応において、一方でＧに対するＡの比率、他方でＨに対するＢの比率を制御しかつ平衡にすることを可能とする。このようにして得られた二本鎖鋳型は、過剰のリボヌクレオシドトリホスフェート及び各プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼの存在下、標的配列にフランキングする各プロモーター（図５）からＲＮＡを転写することを可能とする。本発明の増幅方法を単純化するために、このプロモーター配列は、ファージＲＮＡポリメラーゼのプロモーターの配列でありうり、該プロモーター配列は、プライマーＡ及びＢにおいて同じである（例えば、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼのプロモーターのコンセンサス）。プライマーＡ及びＢが、同じプロモーター配列を含む場合には、単一のＲＮＡポリメラーゼが増幅反応において用いられ得る。Ａに含まれるプロモーターから転写されたＲＮＡは、ヌクレオチドプライマーＣ及びＤにくっつきうる。これらのプライマーは、Ｂの一部に十分に相同であり、反応条件下で、Ａのプロモーターから転写されたＲＮＡにハイブリダイズできる。これらのプライマーＣ及びＤは近接してもよい（即ち、少なくとも一つのヌクレオチドのギャップによって標的が分かれている）、又は隣接しうる（即ちそれらがハイブリダイズされたときに、それらの３’及び５’末端が並列させられる）。プライマーＣ及びＤはまた、オーバーラップしうる。即ち、プライマーＣの３’末端がプライマーＤの５’末端と相同な配列を有する。プライマーがオーバーラップする場合には、プライマーＣの３’末端は、プライマーＤの５’末端に十分に相同でありうる。ただし、Ｃ及びＤの間の競合ハイブリダイゼーションは、Ｃの３’末端のハイブリダイゼーションが有利に起こる。図７は、プライマーＣ及びＤがオーバーラップしているところの、本発明の特定の場合を記載している。この場合には、プライマーＣ（Ｃ bisと呼ぶ）は、プライマーＤの５’末端と同じヌクレオチド配列を有する。プライマーＣが、特にその３’末端にて、有利に起こる競合ハイブリダイゼーションを促進するために、ＲＮＡとのハイブリダイゼーションが、プライマーＤのハイブリダイゼーションによって生じる安定性よりも安定性が大きい二本鎖を生じるところの塩基同族体又は修飾されたヌクレオチドを含みうる。これらの修飾されたヌクレオチドはまた、ヌクレオチド間の結合（たとえば、ホスホロチオエート、Ｈ−ホスホネート、アルキルホスホネート結合）レベルで、骨格、例えばアルファーオリゴヌクレオチド（仏国特許第２６０７５０７号公報）又はＰＮＡ（Egholmら、1992年、J.Am．Chem． Soc.、第114巻、第1895〜1897頁）レベルで修飾されたものを含む。しかしながら、一般に、ＣのハイブリダイゼーションがＤの３’末端のハイブリダイゼーションを妨げないところの条件を確立することが必要である。Ｃ及びＤがオーバーラップする場合には、Ｃの３’末端がＤのそれに対してあまりにも近くにハイブリダイズされることを避けることが有利である。５ヌクレオチドのギャップは、ＣがＤのハイブリダイゼーションを妨げるのを避けるための好ましい安全な余地を構成する。Ｄの後の伸長が、ＲＮＡポリメラーゼを付着できかつ転写の開始を導きうるプロモーターの再構成を許すと仮定すると、プライマーＤは、（特にプライマーＢ中に含まれた）プロモーターのセンス配列の５’末端を含むのが好ましい。プライマーＣ及びＤの長さは、５〜１００ヌクレオチドであることができ、かつ標的配列の一部を含むことができるが、プライマーＡ及びＢの間の標的領域の長さを越えない。特にＲＮＡ依存性活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及び過剰のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの存在下での、ＲＮＡ鋳型上でのプライマーＣ及びＤの同時の伸長は、Ｄから由来した鎖の置換を生じる。このようにして放たれたＤＮＡ鎖は、プライマーＡとハイブリダイズできる。ついで、ＤＮＡポリメラーゼ（特に、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ依存性活性を含む）は、ＤＮＡ鎖上でＡの３ ’末端及びプライマーＡ上でＤＮＡ鎖の３’末端を伸長する。このようにして得られた所定のサイズの二本鎖ＤＮＡは、プライマーＢの機能的プロモーター、並びにプライマーＡの機能的プロモーターを有し、該プロモーターはこの側で任意の配列により先行される。このようにして得られた二本鎖鋳型は、過剰のリボヌクレオシドトリホスフェート及び各プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼの存在下、所定のサイズのこのフラグメントの末端に位置している各プロモーターからのＲＮＡの転写を可能とする。ついで、Ｂのプロモーターから転写されたＲＮＡは、プライマーＥ及びＦとハイブリダイズできる。ヌクレオチドプライマーＥ及びＦは、反応条件下で、Ｂのプロモーターから転写されたＲＮＡにハイブリダイズできるべく、Ａの部分に十分に相同である。Ｃ及びＤと同様に、プライマーＥ及びＦは、近接或いは隣接、又はオーバーラップしてもよい。プライマーがオーバーラップする場合には、プライマーＥの３’末端は、プライマーＦの５’末端と十分に相同でありうるが、ただし、Ｅ及びＦの間の競合ハイブリダイゼーションはＥの末端でハイブリダイゼーションが有利である。競合ハイブリダイゼーションがプライマーＥの末端が有利であることを促進するために、プライマーＥは、Ｃ同様、ＲＮＡとのそのハイブリダイゼーションが、プライマーＦのハイブリダイゼーションによって作られる安定性よりもより大きく安定である二本鎖を生じるところの塩基同族体又は修飾されたヌクレオチドを含みうる。しかしながら、Ｅのハイブリダイゼーションが、Ｆの３’末端のハイブリダイゼーションを妨げないところの条件を確立することが必要である。Ｅ及びＦがオーバーラップする場合には、Ｅの３’末端がＦのそれに対してあまりにも近くにハイブリダイズされることを避けることが有利である。５ヌクレオチドのギャップは、好ましい安全な余地を構成する。この最小配列が、ＲＮＡポリメラーゼの後の付着及び転写の開始を許すと仮定すると、プライマーＦの５’末端は、プライマーＡ中に含まれるプロモーターの最小配列を含むことが必須である。プライマーＥ及びＦの長さは、５〜１００ヌクレオチドであってよく、かつ標的配列の一部を含みうるが、プライマーＡ及びＢの間の標的領域の長さを越えない。特にＲＮＡ依存性活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及び過剰のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの存在下での、ＲＮＡ鋳型上でのプライマーＥ及びＦの同時の伸長は、Ｆから由来した鎖の置換を生じる。このようにして放たれたＤＮＡ鎖は、プライマーＢとハイブリダイズできる。ついで、ＤＮＡポリメラーゼ（特に、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ依存性活性を含む）は、ＤＮＡ鎖上でＢの３’末端及びプライマーＢ上でＤＮＡ鎖の３’末端を伸長できる。従って、このようにして得られた所定のサイズの二本鎖ＤＮＡは、プライマーＡの機能的プロモーター、並びにプライマーＢの機能的プロモーターを有し、プライマーＢの機能的プロモーターは任意の配列により先行される。このようにして得られた二本鎖鋳型は、過剰のリボヌクレオシドトリホスフェート及び各プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼの存在下、所定のサイズのこのフラグメントの末端に位置している各プロモーターからのＲＮＡの転写を可能とする。ついで、Ａのプロモーターから転写されたＲＮＡは、プライマーＣ及びＤとハイブリダイズできる。ついで、Ｃ及びＤの伸長から生じるサイクルは、上記したように再び開始できる。図４及び図６は、“置換を用いた転写反応”による増幅法の特定のケースを記載しているが、そこでは、プライマーＡ及びＢは、図３及び図５に記載された一般的方法のプライマーＡ及びＢとは異なる。実際、プライマーＡ及びＢは、所定の任意の配列、及び標的配列に相補的な或いは相同な配列に加えて、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターのセンス配列の一部のみを含む（この一部は、プロモーターのこのセンス配列の３’末端を含み、そして、二本鎖の形態では、機能的プロモーターの形成を生じない、即ちＲＮＡポリメラーゼによって転写の開始を促進することができない）。プライマーＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨは、一般的方法において上記したものとおなじである。特に、プライマーＦ及びＤは、プロモーターセンス配列の全て又は一部を含む。図４は、図６によって記載された増幅サイクルの導入ルートに続くように記載してある。図３の記載と同様、プライマーＡ及びＧは、変性された又は一本鎖の標的とハイブリダイズし、そして場合により、もし標的が二本鎖であれば、Ｂ及びＨも同様である。同じ酵素が、上記した反応媒体に対して加えられる。ＤＮＡポリメラーゼによるこれらのプライマーの同時伸長は、それぞれＧ又はＨから由来した鎖を伸長することによって、Ａ又はＢの伸長から得られたＤＮＡ鎖の置換を生じる。ついで、得られた一本鎖ＤＮＡは、それぞれ、プライマーＢ及びＨ、またはＡ及びＧとハイブリダイズできる。Ｇ又はＨの伸長は、それぞれ、Ａ又はＢの伸長生成物の置換を生じる。このようにして生成された所定の長さの２つの一本鎖ＤＮＡは、不完全なセンスプロモーター配列を有しており、それぞれ、プライマーＤ及びＣ、又はＦ及びＥとハイブリダイズできる。Ｃ又はＥの伸長生成物は、それぞれ、Ｅ又はＦの伸長生成物を置換し、それぞれ所定の長さの一本鎖ＤＮＡを生じ、そしてプライマーＤ又はＦから得られた完全なプロモーターセンス配列を有する。これらのＤＮＡ鎖は、それぞれ、プライマーＡ又はＢとハイブリダイズでき、それらの各伸長は、標的配列に対応する、一方の末端に完全なかつ機能的なＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターが置かれ、そして他の末端に非機能的なプロモーターの部分が置かれ、それに続き所定の任意の配列がある二本鎖核酸を生成する。図３に記載した導入ルートと同様に、図４に記載した導入ルートは、固体支持体上に捕獲された標的を用いて達成されうる。このようにして得られた二本鎖ＤＮＡは、図６に記した増幅サイクルに入ることができる。それぞれ、完全な機能的プロモーターからＲＮＡの多数のコピーの転写を与える。一方は、標的配列を含む鎖を生成し、そして他方は、標的に相補的な配列を含む鎖を生成する。これらのＲＮＡ鎖は、ついで、それぞれ、プライマーＥ及びＦ、又はプライマーＣ及びＤのいずれかとハイブリダイズできる。図５に記してある増幅サイクルにおけるごとく、プライマーＣ及びＤ、又はＥ及びＦは、近接、或いは隣接、又はオーバーラップできる（ただし、Ｆ又はＤの３’ 末端のＲＮＡ上でのハイブリダイゼーションが可能であること）。それぞれのＲＮＡ鋳型上での、Ｅ及びＦ、又はＣ及びＤの同時伸長は、それぞれ、Ｆ又はＤから由来した鎖の置換を生じる。このようにして放たれた２つのＤＮＡ鎖は、それぞれＢ又はＡとハイブリダイズできる。所定の長さの２つのＤＮＡ二本鎖は、新たに合成されたＤＮＡ上でのプライマーＡ及びＢの伸長、及びこれらのプライマー上での新たに合成されたＤＮＡの伸長により生成される。それらは、導入ルートの間に生成された２つの二本鎖ＤＮＡと同一であるので、それらは再び、サイクルに入る。図５に記載したサイクルと同様、図６に記載したサイクルは、初めの標的に相補的な２つの二本鎖に対応するＲＮＡ及びＤＮＡの指数的増幅を生じる。本発明において用いるプライマーの性質及び長さ、用いられるプロモーターの配列及びプロモーターの各タイプについてのＲＮＡポリメラーゼの濃度は、他と比較して一つの増幅ルートが有利になるように、ＤＮＡ又はＲＮＡの一つの形又は他の形が優先して得られるように選ぶことができる。従って、本発明に沿って、核酸変性段階なしで、増幅生成物を検出する方法において直接検出できる一本鎖ＲＮＡを有利に得ることが可能である。記載された増幅法（図５）の２つのルートの一つから由来するＲＮＡは、第二サイクルのための基質であり、そして逆もまた同様であるので、それ故、本発明に従った方法は、反応生成物の蓄積が指数的に起こるところの繰り返しの増幅技術であると思われる。プロモーターを用いた各転写段階は、ＤＮＡ鋳型を用いて、５００〜１０００ＲＮＡコピーを得ることを可能とする。各ＲＮＡは、ｃＤＮＡコピーを得ることを可能とし、該ｃＤＮＡのコピーは、鋳型のＤＮＡに相補的な５００〜１０００のＲＮＡコピーの転写のために用いることができるＤＮＡ鋳型を生じる。それ故、その結果は、該増幅方法の単一のサイクルにおいて、２．５×１０⁵〜１０⁶の係数での標的配列の増幅であるというものである。該増幅方法は最少限の反応時間なので（例えば、１時間或いはそれ以上）、増幅試薬、例えばヌクレオシドトリホスフェート及びプライマーが枯渇するまでに、数反応サイクルを生じることができ、その収率は、単一の開始の標的分子について作られた、１０⁹〜１０¹²ＤＮＡ及びＲＮＡ分子に対応するところの増幅となる。用いられる試薬の濃度、そして特に種々のプライマーに依存して、上記増幅方法により、核酸のいずれかの形態（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）、そして開始の標的核酸のいずれかの鎖の生成を有利にすることができる。本発明において用いられる“核酸フラグメント”、又は“オリゴヌクレオチド ”なる語は、修飾されていない、又は少なくとも一つの修飾された塩基、例えばイノシン、５−メチルデオキシシチジン、５−ジメチルアミノデオキシウリジン、デオキシウリジン、２，６−ジアミノプリン、５−ブロモデオキシウリジン、シュードウリジン、シュードイソシチジン或いはハイブリダイゼーションを許す他の修飾された塩基を含む、天然のＤＮＡ又はＲＮＡフラグメント、天然の又は合成のポリヌクレオチド、合成ＤＮＡ又はＲＮＡフラグメントを意味する。このポリヌクレオチドは、少なくとも５のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの長さを有し、場合により少なくとも一つの上記した修飾されたヌクレオチドを含む。このポリヌクレオチドはまた、ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエート、Ｈ−ホスホネート、アルキルホスホネート結合）のレベルで、骨格、例えばアルファーオリゴヌクレオチド（仏国特許第２６０７５０７号公報）又はＰＮＡ（Egholmら、1992年、J．Am．Chem．Soc．、第114巻、第1895〜1897頁）のレベで修飾されることもできる。各修飾は、組み合わせて行うこともできる。ここで用いた、“固体支持体”なる語は、診断検定、アフィニティークロマトグラフィー及び分離工程で用いるために核酸フラグメントがその上に固定化されうる全ての物質を含む。天然又は合成物質、多孔性ないしはそうではない、磁気性ないしはそうでない、化学的に修飾されたないしはそうでないものが、固体支持体として用いられ、特にポリサッカライド、例えばセルロース物質、例えば紙、セルロース誘導体、例えばセルロースアセテート及びニトロセルロース；ポリマー、例えば塩化ビニル、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリアクリレート又はコポリマー、例えば塩化ビニルとポリプロピレンポリマー、塩化ビニルと酢酸ビニルポリマー；スチレンベースのコポリマー；天然繊維、例えばコットン及び合成ファイバー、例えばナイロン；セラミックス、シリカである。本発明において用いられる支持体は、ポリスチレンポリマー、ブタジエン／スチレンコポリマー又は、ポリスチレン、スチレン／アクリロニトリル或いはスチレン／メチルメチルメタクリレートコポリマー、ポリプロピレン、ポリカーボネート等から選ばれた１以上と混合されたブタジエン／スチレンコポリマーである。有利には、本発明の支持体は、ポリスチレン、又は１０〜９０重量％のスチレン単位を含むスチレンベースのコポリマー、又はシリカである。本発明に従った固体支持体は、その形態に限定はなく、マイクロタイタープレート、シート、円錐、チューブ、ウェル、ビーズ等の形態であり得る。 “プライマー”なる語は、少なくとも５つのヌクレオチドからなる一本鎖オリゴヌクレオチド構造を示す。これらのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドであり得る。これらのヌクレオチドは、“核酸フラグメント”なる語の説明に関するパラグラフにおいて記載したごとくして修飾されうる。実質的に相補的な核酸配列（ＤＮＡ、ＲＮＡ又はキメラＤＮＡ−ＲＮＡ分子）といったんハイブリダイズされれば、オリゴヌクレオチドプライマーは、ポリメラーゼの基質である。これらのプライマーの３’ＯＨ末端は、適当なヌクレオチド及びポリメラーゼの存在下で、延長されることができ、該プライマーがハイブリダイズされるところの鋳型配列に相補的な鎖の合成を生じる。プライマーはまた、それ自身に対する一本鎖核酸の末端のハイブリダイゼーションによって形成されることもでき、特にヘアピン又はステムーループ構造の形成が起こる。核酸配列とハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマーは、その３ ’ＯＨ末端においてポリメラーゼとつく性質を有する。以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、それらに限定されない。特に断りがない限り、以下の実施例に記載した実験を行うことに関する全ての方法は、Sambrookら（1989年、Molecular Cloning：A Laboratry Manual、第２版、Cold Spring Habor Laboratory，Cold Spring Hab or）の記載に従って行った。実施例１増幅技術の可能性を、それに含まれる種々の段階を分離することにより示す。方法の原理は、置換を用いる転写反応に基づくので、置換後のＤＮＡ標的の転写の研究が実施された（図２）。選ばれた研究モデルは、β‐ラクタマーゼをエンコードするtem遺伝子の配列であり、この酵素は抗生物質アンピシリンに対する耐性を与える。この遺伝子の配列は、配列ＩＤNo.１として記述される。この配列は、クローニングベクターｐＢＲ３２２中に存在する。この核酸は、バクテリア培養物からのプラスミドの抽出、及び続いて制限エンドヌクレアーゼでの消化によって得ることができる。あるいは、それは適当な増幅技術（Sambrookら、 1989．Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor）によって調製されうる。均質相中での転写による標的配列（ＲＮＡ又はＤＮＡ）に相補的なＲＮＡの調製のために、鎖置換によるＲＮＡポリメラーゼプロモーターの組み入れの可能性（図２）は、種々のＤＮＡポリメラーゼについて研究されてきた。この特定の場合において、用いられるＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ファージのそれである。テストは、50μｌの最終体積で、Ｔ７ＲＮＡポロメラーゼの使用のためのMilliganら（1987．Nucl．Ac ids Res.15：8783‐8798）により記述されたＩＸ反応緩衝液中で、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（各１ｍＭ，Pharmacia）、ＡＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ及びＵＴＰ（各４ｍＭ，Boe hringer）、１Ｕ／μｌのＲＮＡガード（Pharmacia）の存在下で行われる。用いられる初めの標的の量は、テスト当り10¹¹コピーであり、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）の濃度は１Ｕ／μｌであり、ＤＮＡポリメラーゼの濃度は0.1Ｕ／μｌである。標的に相補的な配列と併置されるＴ７ファージプロモーターのコンセンサス配列を含むプロモータープライマーＡ２４（配列ＩＤNo .２）、ならびにプライマーＺ（1028と呼ばれる。配列ＩＤNo．３）は、存在する場合、500ｎＭの最終濃度である。置換プライヤーＹ（ＤＩＳ１と呼ばれる。配列ＩＤNo.４）は、０〜５μＭの間の種々の濃度である。熱によって失活されている可能性がある酵素混合物（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ及びＲＮＡガード）を除いて、種々の反応剤は、標的と接触させられ、95℃（二本鎖ＤＮＡより成る当初標的）又は65℃（一本鎖ＲＮＡより成る当初標的）で３分間変性され、次に酵素混合物の添加のために氷上で冷却される。酵素の添加の故にグリセロール濃度は５％に等しい。−２０℃での凍結により反応を停止させる前に37℃で２時間の温置を行う。反応混合物の一部（0.2体積、すなわち10μｌ）を、Sambrookら（1989．Molec lar Cloning：A Laboratory Manual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory ，Cold Spring Harbor）により記述された方法により調製された変性性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。ゲルは、0.1％ＴＥＭＥＤの存在下で、15％アクリルアミド、７Ｍ尿素、0.26％ビスアクリルアミド、0.06％過硫酸アンモニウム、90ｍＭ Tris-ボレート、２ｍＭＥＤＴＡ、pH8.3を含む溶液の重合により調製される。それらは、「ミニプロティンII電気泳動セル」電気泳動装置（Biorad）中に注がれ、１mmの厚さである。分析されるべき試料は、反応混合物10μｌと、0.035％キシレンシアノール溶液、0.035％ブロモフェノールブルー、１ｍＭＥＤＴＡ、98％ホルムアミドの1 0μｌとを混合することにより調製される。ゲルに与える前に、これら試料は、6 5℃で２分間変性され、次に氷上で迅速に冷却される。ブロモフェノールブルーがゲルの底から１cmのところに泳動されるまで、電気泳動を150ボルトで行う。次にゲルを、0.6μｇ／mlの臭化エチジウム溶液中で10分間着色し、そしてＭＰ４装置（Polaroid）を用いてＵＶテーブル（312nm）上で写真にとる。電気泳動により分離された生成物を、「ミニトランスブロット電気泳動トランスファーセル」装置（Biorad）を用いて、１ｍＭＥＤＴＡ、pH8.3を含む45ｍＭ Tris-ボレート緩衝液中で４℃で、35ボルト／（時・cm）の電場下で、Hybon d Ｎ．ナイロン膜（Amersham）上に移す。次に膜を80℃で５分間乾燥し、そしてＵＶ照射（312nm）に３分間晒すことにより核酸を膜上に固定する。 0.5Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、0.65％ＳＤＳ、0.14mg／mlサケＤＮＡ及び２％ポリエチレングリコール6000（ＰＥＧ）を含む0.1Ｍリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0の４ml中で37℃で60分間温置することによって、膜はプレハイブリタイブされる。tem遺伝子の予期される生成物（配列ＩＤNo.１の鎖に対応する）に対して相補的であり、前の国際特許ＷＯ91／19812に記載された方法に従って５′でのカップリングによりホースラディッシュパーオキシダーゼでラベルされたオリゴヌクレオチドＡ２８（配列ＩＤNo.５）を200ｎｇ／mlの濃度で含む同じ緩衝液５ml中で37℃で60分間温置することにより、ハイブリダイゼーションを行う。0.05％Tween２０を含む１ＸＰＢＳ緩衝液（Sambrookら、1989 ．Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第２版，Cold Spring Harbor Lab oratory，Cold Spring Harbor）の50ml中で30秒間、３度洗った後に、150ｍＭ塩化ナトリウム、２mg／mlウシ血清アルブミンを含む20ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液pH7.2の20ml中のジアミノベンジジンテトラヒドロクロライドジハイドレート（ＤＡＢ）10mgの存在下でパーオキシダーゼ活性により、ハイブリダイスされたオリゴヌクレオチドが現わされる。室温で光から保護して15分間の温置後に、蒸留水ですすぐことにより反応を停止させる。置換に依存する転写のテストは、エンドヌクレアーゼＡｌｕＩで予め開裂され、そして精製されたプラスミドｐＢＲ３２２（10¹¹コピー／テスト）より成る標的を用いて行われた。用いられるＤＮＡポリメラーゼは、置換プライマーＹ（ＤＩＳ１と呼ばれる。配列ＩＤNo.４）の種々の濃度、すなわち５μＭ（約１０¹⁴コピー）、500ｎＭ、50ｎＭ、５ｎＭ又は0.5ｎＭの存在下又は不存在下における、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメチラーゼ、クレノウフラグメント（Boehringer，５Ｕ／テスト）である。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ活性に対する対照は、ＡｌｕＩ開裂されたｐＢＲ３２２標的から、プライマーＡ２４（配列ＩＤNo.２）及び１０２８（配列ＩＤNo.３）を用いてＰＣＲにより２本鎖ＤＮＡフラグメントを調製することにより予め用意された。もちろん、少くとも一つのプロモーターを含む定義された末端を有する２本鎖フラグメントは、たとえば、プロモーターを含むプラスミド中に配列をクローニングし、制限酵素で消化し、そしてアガロースゲル上で精製し、次に電気溶出させることにより調製されることができる。かくして得られた２８５塩基対の生成物は、この場合、一端にＴ７ファージプロモーターを含み、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるその転写は、置換に依存する転写のテストの間に予期される反応生成物に対応する２６３塩基のＲＮＡを得ることを可能にする。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ活性のためのマーカーは、上記した条件下で、但しＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰの不存在下で、２８５塩基対フラグメントの10¹¹コピーを温置することにより作られる。この反応は、置換テストと並行して２時間行われる。図８は、種々の量の置換プライマーＹの存在下でクレノウフラグメントにより鎖置換のテストの間に得られた結果を示す。予期されたように、転写生成物の存在は、置換プライマーＹを含む試料に限られることを結果が示している。置換プライマーＹの存在下の陽の転写結果は、クレノウフラグメントの鎖置換能力を示す。実際、tem標的に対し相補性でありかつtem標的上のプライマーＸ及びＺの間のギャップに対応するサイズのＲＮＡ（すなわち転写制御から得られるものと同じ）の存在は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ転写制御のフラグメントに等しくかつ、後者と同様に機能性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（二本鎖）を含むところの二本鎖ＤＮＡフラグメントを用いての転写から結果される。このフラグメントは、上述した反応条件下で、Ｔ７プロモーターを含むプロモータープライマーＸの伸長の生成物（図２）とハイブリダイズされたプライマーＺを伸長することによりのみ得られうる。ここで、プライマーＺのハイブリダイゼーション及び伸長は、一本鎖の形のプロモータープライマーＸの伸長の生成物の存在下でのみ可能である。一本鎖の形のこの伸長生成物の存在は、プロモータープライマーＸの伸長の生成物の放出を起す置換プライマーＹの伸長からのみ得られうる。また、最終転写生成物の強度は、テスト中の置換プライマーＹの濃度の関数として変化することを結果は示す。転写された物質の量がＴ７ＲＮＡポリメラーゼのために利用できる鋳型（テンプレート）の量に比例すると、従って、置換及び伸長により合成される鋳型の量は、テストで用いられた置換プライマーＹの量の関数として変化すると思われる。プライマーＺの濃度が一定かつ過剰であると、利用できる二本鎖鋳型の量は、プロモータープライマーの伸長の一本鎖生成物の量に依存する。従って、放出された伸長生成物（一本鎖）の量はテスト中の置換プライマーの濃度の関数として変化する。用いられた条件下で、50ｎＭ（すなわち存在する標的の量の10倍）の置換プライマー濃度（１／10の置換プライマー／プロモータープライマー比に相当する）は、置換の最良の収量及び従って転写の最良の収量を与える。これらの結果は、プロモータープライマーの上流に位置されたプライマーの伸長による核酸鎖の置換の収量に対する、置換プライマー／プロモータープライマー比の影響を示す。この最適のどちら側においても、置換収量は実質的に減少する。すなわち、もし置換プライマーの濃度が大きくなると、熱動力学的条件は、標的との後者のハイブリダイゼーションに好都合であり、従ってその伸長（ハイブリダイゼーションの損失を払って）及び次にプロモータープライマーの伸長に好都合である。同様に結果は、もし置換プライマー濃度が減少すると、プロモータープライマーの上流の置換プライマーのハイブリダイゼーションの可能性は減少し、従って下流に位置される鎖の置換のための伸長の可能性が減少する。この実施例は、所与の標的配列上にプロモーター配列を設置するためにポリメラーゼの鎖置換特性を用いることの可能性を示す。この方法は、熱的又は化学的変性段階の必要なしに、又は一本鎖核酸上のプロモータープライマーの伸長の生成物を放出するために、ヌクレアーゼタイプの酵素活性の作用を必要とせずに、ＲＮＡポリメラーゼのためのＤＮＡ鋳型の生産を可能にする利点を有する。従って、結合された転写段階を用いて、２つのプライマーＸとＺの間の標的配列に対応する、大きなコピー数のＲＮＡを合成することが可能である。図８は、標的配列が、転写のための増幅のための段階なしで用いられた方法により検出されないことを示す（レーン２）。対照的に、置換プライマーと結びつけられた、鎖置換活性を持つＤＮＡポリメラーゼの使用は、標的に対応するＲＮＡの複数の鎖の合成を可能にする鋳型を得ることを可能にし、その数はその検出を可能にし、当初試料中の標的の存在を示す。従って、この実施例は、均質相（単一段階かつ単一温度）における転写による、標的配列に相補的な複数のＲＮＡ鎖の生産のために、鎖置換によるＲＮＡポリメラーゼプロモーターを設置するための方法の有用性を示す。この方法は、特に二本鎖標的の場合に、予め変性された核酸標的に、プライマーＹ、プライマーＸ、プライマーＺ、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート及びリボヌクレオシドトリホスフェート、鎖置換能力を持つＤＮＡポリメラーゼ、及びＲＮＡポリメラーゼを含む反応混合物を加えることにより標的配列の転写物を直接に得ることを可能にする。従って、この方法は、後の又は中間での反応剤の添加、又は酵素活性、特にヌクレアーゼ活性の使用のない、単一段階より成る。実施例２本発明の可能性は、また、実施例１で記載されるように均質相における転写がＲＮＡ分子を用いても実施されうることを示す。このＲＮＡ分子は、存在の増幅による決定が本発明により可能にされるところの当初標的であっても、あるいは増幅方法のサイクルの中間生成物（図５）であってもよい。この中間生成物はたとえば、実施例１の場合における転写により得られたＲＮＡであることができる。この可能性は、鎖置換能力を有するＤＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ依存性かつＤＮＡ依存性）の使用を前提とする。この可能性を示すために、ＲＮＡすなわちte m配列（配列ＩＤNo.１）に相補性の配列に対応するＲＮＡが、ＤＮＡ鋳型の10¹² コピーを用いて、ＭＥＧＡスクリプトキット（Ambion）の反応条件下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロで合成された。これを行うために、ｐＢＲ３２２からＰＲＯＡＮＴＩ（配列ＩＤNo.６）及びＯＲＦ１（配列ＩＤNo.７）を用いてＰＣＲにより二本鎖ＤＮＡ鋳型が合成された。かくして得た８８９塩基対生成物は、この場合、Ｔ７ファージプロモーターを一端に含み、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるその転写はtem遺伝子（配列ＩＤNo.１）の配列に相補的な配列に対応する８６７塩基のＲＮＡを得ることを可能にする。合成されたＲＮＡは、鋳型ＤＮＡを除去するためにＤＮase Ｉで処理され、フェノール／クロロホルム抽出により精製され、そして酢酸アンモニウム塩の存在下でエタノールにより沈澱される。かくして得たＲＮＡは、予めジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理された水中に移され、変性性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析され、260nmでの吸収により評価される。標的ＲＮＡの10¹¹コピーに相当する量（５ｎＭ最終）がテスト当り用いられ、反応条件は、上述のプライマーＸ、Ｙ及びＺの存在下で実施例１で記載したのと同じである。しかし、これらテストの枠内で用いられるＤＮＡポリメラーゼは、ＡＭＶビールス逆転写酵素（Seikagaku ）であり、上記で決定した最適にセットされた置換プライマー／プロモータープライマー比（１／10）を用いた。これは50ｎＭ最終に等しい最終置換プライマー濃度に相当する。反応生成物の分析は、電気泳動分離、膜上への移動、及びホースラディッシュパーオキシダーゼでラベルされたプローブＡ２８（配列ＩＤNo. ５）を用いるハイブリダイゼーションにより実施例１記載のように行われる。図９は、種々の反応テストの間に得られた結果を示す。プライマーＡ２４（配列ＩＤNo.２）及び１０２８（配列ＩＤNo.３）を用いて得られた、一端にＴ７プロモーターを含む、２８５塩基対のＰＣＲフラグメントの10¹²コピーに等しい量が装填されて（レーン１）、実施されたテストの間に予期されるＲＮＡ（２６３塩基）のためのサイズマーカー（同じフラグメントの転写に相当する。）として働く。テストは、逆転写酵素及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼの不存在下で（レーン２）、酵素の存在下でプライマーＸ、Ｙ及びＺを用いて（レーン３）、置換プライマーＹなしで（レーン４）、又はプライマーＺなしで（レーン５）、行われた。予期された２６３塩基のＲＮＡは、総ての酵素剤及びプライマーを含むテストからのみ検出され、一方、置換プライマーの不存在下では転写生成物が得られない。従ってこの結果は、ＤＮＡポリメラーゼの作用による鎖置換の可能性を確認し、ＡＭＶ逆転写酵素の鎖置換能力による、ＲＮＡ鋳型上での置換の可能性を示す。従って、ＡＭＶ逆転写酵素は、予め伸長されたプライマーの上流に位置されたプライマーの伸長の間に、ＲＮＡ‐ＤＮＡヘテロ二本鎖を分離することができる。ＲＮＡ‐ＤＮＡヘテロ二本鎖の安定性は、ＤＮＡ‐ＤＮＡホモ二本鎖の安定性より大きいと知られているので、この逆転写酵素は、プライマー伸長により、ＤＮＡ標的とハイブリダイズされたＤＮＡ鎖を置換できることが、全く確かである。ＡＭＶ逆転写酵素と結び付けられたＲＮase Ｈ活性が記述されるが、置換プライマーの不存在下で転写生成物は得られない。このことは、これらのテストで用いられた緩衝液条件はこのＲＮase Ｈ活性のために適当でないこと、又は用いられたＲＮＡ標的の配列が後者の作用にあまり敏感ではないことを示唆する。従って、標的ＲＮＡ‐ｃＤＮＡ二本鎖のＲＮＡは減成され得ず、プロモータープライマーの伸長の生成物は従って、その上でのプライマーＺのハイブリダイゼーション及び伸長のために放出されることができない。この結果は従って、ＡＭＶ逆転写酵素の鎖置換能力に加えて、ＡＭＶ逆転写酵素と結び付けられたＲＮase Ｈの作用によるｃＤＮＡ‐ＲＮＡヘテロ二本鎖からｃＤＮＡの分離の効率の全くの欠如（これらの条件下での）を示し、上記した転写増幅法における外来エシェリヒアコリＲＮase Ｈ、たとえばＮＡＳＢＡ、３ＳＲ又はＬＡＴの使用を正当化する。プライマーＺの不存在では（しかし置換プライマーＹの存在下で）、転写生成物は得られず、このことは、本反応の条件下でプロモータープライマーの伸長から誘導されたｃＤＮＡの３′末端において自己プライミング反応が起きないことを示す。しかし、この特性は特定の条件下で逆転写酵素において従来記載されている。従って、この実施例は、図２に示されるように均質相（単一段階かつ単一温度）における転写によりＲＮＡ標的配列に相補性のＲＮＡの製造のために及び所与の標的ＲＮＡ鎖に相補性の多数のＲＮＡ鎖を作るために、鎖置換によりＲＮＡポリメラーゼプロモーターを設置する方法の有効性を示す。従って、この方法は、反応剤の後の又は中間の添加なしの単一段階より成り、ＲＮＡ ‐ＤＮＡヘテロ二本鎖からのｃＤＮＡの分離のためにヌクレアーゼ（特にＲＮａｓｅＨ）活性を必要としない。特に、反応条件下でＡＭＶ逆転写酵素は、ＲＮＡ鋳型上でプロモータープライマーから伸長された鎖の放出（置換プライマーの不存在下で）を可能にするＲＮase Ｈ活性を示さない。従ってＡＭＶ逆転写酵素の鎖置換能力は、増幅サイクルの可能性を示し、従って、ＲＮＡ又はＤＮＡ標的からの反応生成物の蓄積の指数幽数的性質を示す。実施例３鎖置換によるＤＮＡ‐ＲＮＡヘテロ二本鎖からＤＮＡ分子の分離の可能性を確かめるため、及びある逆転写酵素に固有の何らかの残りのＲＮase Ｈ活性とは独立にこれを確かめるために、ＲＮase Ｈ活性を欠くＭＭＬＶ逆転写酵素を用いてテストを行った。遺伝子工学により得られるそのような酵素は、Superscript^II という名でＧＩＢＣＯ‐ＢＲＬから市販入手できる。テストは、同じＲＮＡ標的を用い、上記のプライマーＸ、Ｙ及びＺを用いて実施例２のように行われた。Su perscrlpt^IIは、４Ｕ／μｌ（200Ｕ／テスト）の最終濃度に加えられ、置換プライマー及びプロモータープライマーは１／10の比で存在する。反応生成物は、実施例１記載のように分析される。得た結果を図10に示す。転写生成物の存在は、置換プライマーＹを含むサンプルに限られることが判り（レーン７）、これはＲＮase Ｈ活性を欠くＭＭＬＶ逆転写酵素の鎖置換能力を確認する。置換プライマーの不存在下で（レーン６）、転写シグナルは得られず、これは逆転写酵素の鎖置換特性によるＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二本鎖からのＤＮＡの分離の有効性を確認する。プライマーＺの不存在下で（レーン５）、転写生成物は得られず、このことは実施例２におけるように、ＭＭＬＶ逆転写酵素Superscript^IIが、これら反応条件下でｃＤＮＡの３′末端の自己再プライミングを実施しないことを確認する。従って、この実施例は、ＲＮＡ標的から、置換を用いて転写による増幅の方法の可能性を確認し、またこのことを、反応媒体中に存在するかも知れないＲＮas e Ｈ活性と完全に独立の様式で確認する。従って、本発明で記載される増幅方法は、逆転写酵素及びＲＮＡポリマラーゼを用いて、何らの他の追加の酵素活性なしに実施されうる。実施例４本発明で記載される増幅方法の可能性はまた、特に図３及び５に記載される方法において、末端の夫々に機能性ＲＮＡポリラーゼプロモーターを含む一つの同じ二本鎖鋳型から相補性ＲＮＡを転写するＲＮＡポリメラーゼの能力に依存する。この仮説を検証するために、標的ｐＢＲ３２２からプライマーＤＴＡ１（配列ＩＤNo.８）及びＤＴＡ２（配列ＩＤNo.９）の存在下でＰＣＲにより二本鎖ＤＮＡ鋳型が合成された。かくして得た２７５塩基対フラグメントを精製する。それは、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼのための二つのプロモーターによりフランキングされ、かつtem配列の鎖のいずれかの転写のために配向されたtem遺伝子の配列の一部（配列ＩＤNo.１のヌクレオチド３１２〜４８６）を含む。各プロモーターセンス配列は、５′においてプライマーＦ２２０（配列ＩＤNo.10）に対応する配列により先導される。その末端に位置されるプロモーターの夫々からのそのようなフラグメントの転写は理論的に、二つのＲＮＡ集団の合成をもたらすはずであり、それらは互いに相補的であり、かつそれらの３′末端にＴ７プロモーターのアンチセンス配列（すなわちＴ７プロモーターのセンス配列に相補的な配列）を含み、オリゴヌクレオチドＦ２２０（配列ＩＤNo.10）に相補的な配列が続く。予期されるＲＮＡのサイズは２３１塩基であり、それらはtem遺伝子（配列ＩＤNo.１）のヌクレオチド３１２〜４８６の配列、又は後者に相補的な配列を含む。転写テストは、各末端にプロモーターを含むＰＣＲフラグメントを用い、 Milliganら（1987．Nucl．Acids Res.15：8783‐8798）により記述された１Ｘ反応緩衝液中で、50μｌの最終体積で、各４ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰ、１Ｕ／μｌのＴ７ファージＲＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs ）及び１Ｕ／μｌのＲＮＡguard（Pharmacia）の存在下で実施される。ＰＣＲ鋳型はテスト当り10¹¹ コピーで用いられ、酵素の添加によるグリセロール濃度は５％である。転写は、 37℃で２時間行われ、−20℃に凍結することにより停止される。反応生成物（10 μｌ）は、実施例１記載のように、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動分離により分析され、次にナイロン膜上に移される。このようにして、一方でホースラディッシュパーオキシダーゼで５′においてラベルされたプローブＡ２８（配列ＩＤNo.５）及び他方でホースラディッシュパーオキシダーゼで５′においてラベルされたプローブＡ１９（配列ＩＤNo.11）のハイブリダイゼーションを用いるために、二つの膜が調製される。プローブＡ１９は、記載されるtem配列（配列ＩＤNo.１）に相補的なＲＮＡを検出することを可能にし、一方、プローブＡ２８は、記載されるtem配列（配列ＩＤNo.１）に対応するＲＮＡの検出を可能にする。図11は、これらテストの間に得られた結果を示す。プローブＡ２８及びＡ１９は、２７５塩基対の二本鎖標的ＤＮＡ鋳型の10¹²コピーを検出することを可能にし（レーン１）、また転写テストの場合に２３１塩基のＲＮＡの検出を可能にする（レーン２）。２つのタイプのプローブＡ１９（Ａ部）及びＡ２８（Ｂ部）を用いての、予期された転写物の検出は、相補的ＲＮＡの転写が、ＤＮＡ鋳型の夫々のプロモーターからＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより実施されたことを示す。その端の夫々にプロモーターを含む共通のＤＮＡ鋳型からの相補的ＲＮＡの生産は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、同じ鋳型上での一点に集中する前進によりＲＮＡの重合を実施できることを示す。従ってＲＮＡポリメラーゼを用いてこれら条件下で相補的ＲＮＡを生産する可能性は、図３及び５に記載される本発明の増幅法の可能性を確認する。従って、これら結果は、図３及び５において本発明で記載される増幅サイクルが指数幽数的性質を持つことを確認し、この性質は、配列がプロモータープライマーＡとＢの間の標的の部分に対応するところのＲＮＡ及びＤＮＡの実質的蓄積を結果する（図５）。実施例５ＤＴＲ増幅法の実験的有効性は、本発明で、特に図15で記載される増幅サイクルの一つを研究することによって証明された。これを行うために、１６７塩基対のＰＣＲフラグメントが、ＰＢＲ３２２から、プライマーＤＴＡ７（配列ＩＤNo .12）及びＤＴＡ８（配列ＩＤNo.13）を用いて合成された。これは従って、tem 遺伝子の配列の一部（配列ＩＤNo.１のヌクレオチド３３６〜４０２）を含む。このＰＣＲフラグメントは、増幅サイクル中へのエントリーのための分子の一タイプに相当し、従ってその末端の夫々に、規定された配列たとえばＦ２２０配列（配列ＩＤNo.10）により５′において先導されるＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列（特にＴ７ファージプロモーター）を含む。方法の指数幽数的特徴を示すために、先の精製されたＰＣＲフラグメント（増幅サイクル中へのエントリーに対応する）より成る標的分子の減少して行く種々の量（テスト当り10¹⁰〜10⁶コピー）の存在下で種々の増幅反応を並行して行った。反応は、50μｌの最終体積で、夫々の４ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰ、夫々１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、ＩＵ／μｌのＴ７ファージＲＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）、４Ｕ／μｌのＭＭＬＶ逆転写酵素Superscript^II（ＧＩＢＣＯ‐ＢＲＬ）（ＲＮase Ｈ活性を欠く）、及びＩＵ／μｌのＲＮＡguar d（Pharmacia）の存在下で行った。加えて反応媒体は、ＤＴＡ７及びＤＴＡ８（夫々、配列ＩＤNo.12及び13）に対応する種々のプロモータープライマーを0.01 μＭの濃度で、及びＦ２２０（配列ＩＤNo.10）に対応するＥに等しい置換プライマーＣを１μＭの濃度で含んだ。37℃で２時間の温置の後に、−20℃に反応媒体を凍結することにより増幅反応を停止する。５μｌのフラクション、すなわち反応体積の１／10を、ＥＬＯＳＡ法（酵素結合されたオリゴ吸着剤アッセイ）に従う捕捉及び特異的検出により定量的に分析される。この方法は、固体支持体（マイクロタイタープート）上への捕捉オリゴヌクレオチドの付着、反応生成物の変性、増幅された配列に対して特異的な捕捉プローブとそれとのハイブリダイゼーション、及びホースラディッシュパーオキシダーゼに結合された検出プローブによる検出を含む。捕捉オリゴヌクレオチドＡ２０（配列ＩＤNo.14）は、フランス国特許91 09 057号にすでに記載されている方法に従ってMaxisorp Nunc‐Ｉmmunoプレートマイクロタイタープレートのくぼみ上に受動的に付着され、１くぼみ当り約５ピコモルのオリゴヌクレオチドの付着を許す。付着の後に、ＩＸＰＢＳ‐Tween 緩衝液で３回洗う。捕捉された増幅生成物の検出は、フランス国特許91 09057号に記載されている方法に従って行われる。分析されるべき５μｌフラクションが、１Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、1.3％ＳＤＳ、0.24mg／mlサケＤＮＡ、４％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）6000を含む0.2Ｍリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.0の35μｌ体積に加えらえる。この試料に含まれる核酸は、２Ｍ水酸化ナトリウムの５μｐの添加により室温で変性され、３分間後に２Ｍ酢酸５μ ｌの添加により中和される。対照として及び較正のために、予期された増幅生成物に対応する二つのＲＮＡ希釈シリーズを用意する。次に、試料を、オリゴヌクレオチド捕捉プローブＡ２０（配列ＩＤNo.14）が予め付着されているマイクロタイタープレートのくぼみに入れる。入れられる量は、希釈されていない試料の 50μｌ、又は１／10又は１／100希釈された試料の同量である。直ちに、１Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、1.3％ＳＤＳ、0.24mg／mlサケＤＮＡ、４％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）6000及びホースラディッシュパーオキシダーゼに結合された検出オリゴヌクレオチドプローブＡ１８（配列ＩＤNo.15）の５ｎｇを含む0 .2Ｍリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0の50μｌ体積を加える。37℃で60分間の温置の後に、ＩＸＰＢＳ‐Tweenで、くぼみを洗う。増幅生成物とハイブリダイズされたパーオキシダーゼ‐Ａ１８プローブの検出は、基質オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）を含む溶液100μｌの添加により行われる。20分後に１Ｍ硫酸1 00μｌの添加により、比色反応を停止させる。492ｎｍにおける光密度を、ＡＸＩＡマイクロリーダー（Bio Merieux）を用いて読む。得た結果を、図18の度数分布により示す。標的希釈物の夫々について、３つのテスト、すなわち完全なテスト（上述のような）、置換プライマーＦ２２０（配列ＩＤNo.10）なしのテスト、及びＭＭＬＶ逆転写酵素Superscript^IIなしのテストを行った。結果は、増幅方法（完全な系）がこれらの条件下で、テスト当り10⁷コピーの当初標的量より下でかなりの特異的シグナルを検出することを可能にする、すなわち10⁶コピーの感度を有することを示す。なぜなら、反応媒体の10分の１に等しいフラクションがこれらの条件下で分析されるからである。この感度は単に相対的であり、もし比色以外の検出系（たとえば螢光、化学発光又は生物学的発光）が用いられるなら、大きく増大されうる。結果は特に、置換プライマーＦ２２０の不存在下でテスト当り10¹⁰コピーに等しい標的量に対してのみ特異的シグナルが得られることを示す。従って、置換プライマーありとなしとの間の検出感度の差は、10³、つまり３log₁₀である。このことは、該方法が増幅生成物の実質的蓄積を許し、これは増幅サイクルを実施することよってのみ得られることを示す。従って、このサイクル繰返しは、置換プライマーたとえばプライマーＦ２２０の存在の故にのみ可能である。同様に、もしＭＭＬＶ逆転写酵素Superscript^IIが抑止されるなら、検出シグナルは、テスト当り10¹⁰コピー以上の当初標的量についてのみ得られる。これら後者の反応条件は事実上、実施例４に記載されるように増幅サイクル中へのエントリーに対応する二官能性分子について実施される転写段階に相当する。従ってこれらデータは、本方法が転写単独よりも著しく敏感であること、及びこの感度は、特に逆転写酵素のようなＤＮＡポリメラーゼの存在下での置換プライマーを用いての酵素的置換段階を用いる転写段階までの方法のサイクリングに依存することを示す。電気泳動分離、ナイロン膜への移動、実施例１に記載されるような、ホースラディッシュパーオキシダーゼに結合された、一方ではプローブＡ２８（配列ＩＤNo.５）及び他方ではプローブＡ１８（配列ＩＤNo.15）とのハイブリダイゼーションによる増幅テストの定量的分析は、予期された増幅生成物（１１７塩基）に対応する１２０塩基の２つの相補的ＲＮＡ分子を検出することを可能にする。同じ様式で、もしＦ２２０（配列ＩＤNo.10）に対応する第一の置換プライマーＣ（この特定の場合にＥに等しい）に加えて、図５に従いＴ７ pro（配列ＩＤNo.16）に対応する第二の置換プライマーＤ（Ｆに等しい）を含む媒体中で、先の増幅テストが行われるならば、唯一つのタイプの置換プライマーを用いて得られるのと類似の結果及び感度が得られる。このことは、該手法が単純化されることができ、そして増幅されるべき該標的の性質に結びつけられた特定の場合に従って採用されるべく十分に進歩的であることを示す。この実施例で用いられた比色検出法の検出限界（テスト当り10¹⁰コピー以上）は従って、２時間の反応において10⁴以上の増幅ファクターを推論することを可能にする。実施例６本発明で記載される“ＤＴＲ”増幅法は、転写と鎖置換を結合した様式で用いる指数由数的サイクルに基づく。特に、酵素的鎖置換は図15に示されるように、逆転写、置換プライマーＣ（この実施例においてＥに等しい）、及び置換されるべき二つのプロモータープライマー（Ａ及びＢ）を活用する。増幅サイクル内において、置換プライマー／置換されたプライマー（ここでのプロモータープライマー）の比は、本方法の増幅収量に大きく影響する。もし、増幅が、先の反応条件下で、当初標的の10⁸又は10⁹コピーの存在下で、ＤＴＡ７（配列ＩＤNo.12）及びＤＴＡ８（配列ＩＤNo.13）に対応するプロモータープライマーＡ及びＢの一定濃度0.1μＭ、及びＦ２２０（配列ＩＤN o.10）に対応する置換プライマーＣの濃度0.001、0.01、0.1、１又は10μＭを用いて行われるなら、置換プライマー／置換されたプライマーの比と共に増大する置換収量が得られる（図19）。捕捉プローブＡ２５（配列ＩＤNo.17）及び検出プローブＡ２８（配列ＩＤNo.５）を用いる、実施例５記載のようなマイクロタイタープレートにおける定量的分析は（図19）、100に等しい置換プライマー／置換されたプライマー比がこの場において最も好都合であることを示す（２５００に等しい価が装置の光学的飽和に相当し、従って２５００以上のシグナルに対応することを注記する）。この比は、酵素的鎖置換によるサイクリング段階を促進するために、用いられた置換又はプロモータープライマーの長さに従って、又は標的配列の性質に従って調節されねばならない。実施例７ “ＤＴＲ”手法の指数凾数的増幅の効率は、増幅シグナルの出現の動力学の分析により示されうる。これを行うために、標的分子の10⁹コピーを用いて、実施例５の条件に従って増幅反応を行った。一定間隔で、反応混合物の５μｌフラクションを集め、直ちに−20℃に凍結した。これらフラクションの増幅シグナルの定量的分析は、実施例５記載のように、捕捉プローブＡ２５（配列ＩＤNo.17）及び検出プローブＡ２８（配列ＩＤNo.５）を用いて行った。並行して、置換プライマーＦ２２０の不存在下で増幅テストを行った。図20のカーブにより示される結果は、反応の１時間から平坦に達しているので、シグナルの出現が指数的かつ極めて迅速であることを明瞭に示す。並行して、置換プライマー不存在の、従って単純な転写反応に相当する増幅反応は、シグナルの直線的増加を結果する。従って、“ＤＴＲ”増幅法は、転写単独と対照的に、当初標的配列から生成物の迅速かつ指数的蓄積をもたらす方法である。実施例８本発明の“ＤＴＲ”増幅法は本質的に、標的配列の一部に対応する二本鎖ＲＮＡを結果する。ハイブリダイゼーション法によるこの二本鎖ＲＮＡの検出を容易にするために、又は一本鎖ＲＮＡの生産の特別の場合において、ＲＮＡ鎖の出現を、その相補性物の犠牲において有利にすることが有用でありうる。このことは、バランスのくずれたＲＮＡポリメラーゼ濃度の存在下でファージ（たとえばＴ７及びＴ３）ＲＮＡポリメラーゼのための一つの異なるプロモーターを含むプロモータープライマーＡ及びＢの二つのタイプを組合せて用いることにより実行されうる。たとえば、Ｔ７プロモーターを含むプライマーＤＴＡ８（配列ＩＤNo .13）及びＴ３プロモーターを含むＤＴＡ９（配列ＩＤNo.18）を用いて本発明の増幅サイクルの一つ（図15）中へのエントリーに対応する１６７塩基対の二本鎖ＤＮＡ分子をＰＣＲにより我々は合成した。増幅テストは、実施例５に従うこの標的の希釈のうえで、０〜50 Ｕ／テストのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ濃度及び50Ｕ／テストの一定のＴ３ＲＮＡポリメラーゼ濃度の存在下で実施された。図21は、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼの50Ｕに対するＴ７ＲＮＡポリメラーゼの6.25Ｕの酵素比が、夫々プローブＡ２５（配列ＩＤNo.17）及びＡ２８（配列ＩＤNo.５）を用いる捕捉及び検出により、増大された増幅シグナルを得ることを可能にし、そして比色検出によりテスト当り10⁵コピー（標的分子の１０⁴コピーの感度に相当する）の標的量より下で著しいシグナルをもたらすことを示す。検出方法の感度が10¹⁰コピーであることを知ると、この標的増幅法の増幅ファクターは、従って10⁵コピーであり、それによって本方法を多数の用途に有用となす有効性を本方法に与える。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者レヴァシュール、ピエールフランス国、69002 リヨン、リュオーギュスト‐コンテ 54 【要約の続き】て、増幅法は、等温で操作できるので循環的である。

Claims

【特許請求の範囲】１．標的核酸配列の増幅方法において、該核酸配列が、その５’末端から、５ ’−３’方向に、少なくとも５ヌクレオチドを有する上流配列及びその３’末端から、３’−５’方向に、少なくとも５ヌクレオチドを有する下流配列を含む核酸配列であって、該方法が、以下の段階：増幅されるべき配列に対応する第一のセグメントを含み、かつ更に、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのセンス配列又はアンチセンス配列又は該センス又はアンチセンス配列の少なくとも一部を含むセグメントから選ばれる少なくとも一つの第二のセグメントを含むポリヌクレオチドを得る段階（ここで、該センス配列又はその一部を含むこのような第二のセグメントは、該第一のセグメントの５’ 末端の上流に位置され、そして該アンチセンス配列又はその一部を含むこのような第二のセグメントは、該第一のセグメントの３’末端の下流に位置されると理解される）、及びＲＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性及び鎖置換活性を有する系の存在下で、該活性が作用する条件下で、かつ過剰のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート及びリボヌクレオシドトリホスフェートの存在下において、上記ポリヌクレオチドをプライマーのセットと接触させる段階（ここで該プライマーのセットは、過剰に存在し、かつａ）その５’末端から３’末端へ向かって、順次に以下のセグメントを含む第一のプライマー：任意の配列（第一のプライマーの構成要素としてのその存在は任意である）の第一のポリヌクレオチドセグメント、ここで、該第一のセグメントは、存在する場合には少なくとも５ヌクレオチドを含む、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターのセンス配列の全て又は一部を含む、又は３’末端部分を含む該センス配列の少なくとも一部を含む第二のセグメント、及び、該上流配列と同じ長さを有し、かつ該上流配列に相同であるか又は該上流配列とハイブリダイズできる第三のセグメント、及び／又はｂ）その５’末端から３’末端へ向かって順次に以下のセグメントを含む第二のプライマー：第一のプライマーの第一のセグメントと同様に定義される（しかしそれと同一である必要はない）第一の任意的セグメント、第一のプライマーの第二のセグメントと同様に定義される（しかしそれと同一である必要はない）第二のセグメント、及び、該下流配列と同じ長さを有し、かつ該下流配列に相同であるか又は該下流配列とハイブリダイズできる第三のセグメント、ここで、第一及び第二のプライマーのうちの一つの第三のセグメントは増幅されるべき該配列の上流又は下流の配列のうちの一つと相同であり、一方、他のプライマーの第三のセグメントは、他の下流又は上流の配列とハイブリダイズできると理解される、及び／又はｃ）以下のいずれかの配列を含む第三及び／又は第四の任意的プライマー：それぞれ第一のプライマー及び第二のプライマーの第二のセグメントに相同であり、かつ５’末端部分を含む該ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのセンス配列の少なくとも一部を含む配列、又はそれぞれ第一及び第二のプライマーの第一のセグメントの一部分に相同であって、その５’末端は含まない配列、及び／又はｄ）以下のいずれかの配列を含む第五及び／又は第六の任意的プライマー：それぞれ第三及び第四のプライマーの一部に相同な配列であって、該一部は該第三又は第四のプライマーの３’末端ヌクレオチドを含まないところの配列、又は、それぞれ、第一及び第二のプライマーの該第一セグメントの少なくとも一部に相同な配列、を含む）を含む方法。２．請求の範囲第１項記載の増幅方法であって、該方法が以下の段階：増幅されるべき配列に対応する第一のセグメントを含み、かつ更に、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのセンス配列又はアンチセンス配列又は該センス又はアンチセンス配列の少なくとも一部を含むセグメントから選ばれる少なくとも一つの第二のセグメントを含むポリヌクレオチドを得る段階（ここで、該センス配列又はその一部を含むこのような第二のセグメントは、該第一のセグメントの５’ 末端の上流に位置され、そして該アンチセンス配列又はその一部を含むこのような第二のセグメントは、該第一のセグメントの３’末端の下流に位置されると理解される）、及びＲＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性及び鎖置換活性を有する系の存在下で、該活性が作用する条件下で、かつ過剰のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート及びリボヌクレオシドトリホスフェートの存在下において、上記ポリヌクレオチドをプライマーのセットと接触させることからなる段階（ここで該プライマーのセットは、過剰に存在し、かつａ）その５’末端から３’末端へ向かって、順次に以下のセグメントを含む第一のプライマー：任意の配列（第一のプライマーの構成要素としてのその存在は任意である）の第一のポリヌクレオチドセグメント、ここで、該第一のセグメントは、存在する場合には少なくとも５ヌクレオチドを含む、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターのセンス配列の全て又は一部を含む、又は３’末端部分を含む該センス配列の少なくとも一部を含む第二のセグメント、及び、該上流配列と同じ長さを有し、かつ該上流配列に相同であるか又は該上流配列とハイブリダイズできる第三のセグメント、ｂ）その５’末端から３’末端へ向かって順次に以下のセグメントを含む第二のプライマー：第一のプライマーの第一のセグメントと同様に定義される（しかしそれと同一である必要はない）第一の任意的セグメント、第一のプライマーの第二のセグメントと同様に定義される（しかしそれと同一である必要はない）第二のセグメント、及び、該下流配列と同じ長さを有し、かつ該下流配列に相同であるか又は該下流配列とハイブリダイズできる第三のセグメント、ここで、第一及び第二のプライマーのうちの一つの第三のセグメントは増幅されるべき該配列の上流又は下流の配列のうちの一つと相同であり、一方、他のプライマーの第三のセグメントは、他の下流又は上流の配列とハイブリダイズできると理解される、ｃ）以下のいずれかの配列を含む第三及び／又は第四のプライマーそれぞれ第一のプライマー及び第二のプライマーの第二のセグメントに相同であり、かつ５’末端部分を含む該ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのセンス配列の少なくとも一部を含む配列、又はそれぞれ第一及び第二のプライマーの第一のセグメントの一部に相同であるがそれらの５’末端は含まない配列、及び／又はｄ）以下のいずれかの配列を含む第五及び／又は第六のプライマーそれぞれ第三の及び第四のプライマーの一部に相同な配列であり、該一部は該第三又は第四のプライマーの３’末端ヌクレオチドを含まない配列、又はそれぞれ、第一及び第二のプライマーの該第一セグメントの少なくとも一部に相同な配列、を含む）を含むことを特徴とする方法。３．請求の範囲第１項又は第２項のいずれかに記載の方法であって、該ポリヌクレオチドが、更に：ａ）該ポリヌクレオチドの該センス配列の全部又は一部を含む該第二セグメントの５’末端の上流の、第一及び第二のプライマーのうちの一つの第一セグメントに相同なセグメント及び／又はｂ）該ポリヌクレオチドの該アンチセンス配列を含む該第二セグメントの３’末端の下流の、第一及び第二のプライマーのうちの一つの第一セグメントとハイブリダイズできるセグメントを含むことを特徴とする方法。。４．請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか一つに記載の方法であって、該ポリヌクレオチドを得るために、増幅されるべき配列を含み、かつ、増幅されるべき該配列の３’末端を超えて、下流領域を経由して、かつ増幅されるべき該配列の５’末端を超えて、上流領域を経由して伸長する標的核酸から出発して工程が実施される、該核酸は、過剰のヌクレオシドトリホスフェート、及びＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ及び鎖置換活性を有する該系、及び請求の範囲第１項又は第２項で定義したプライマーを含み、かつ更に、標的の下流の該領域とハイブリダイズできる第７のプライマー及び上流の該領域に相補的な配列とハイブリダイズできる第８のプライマーを含むプライマーのセットと接触させられる、ことを特徴とする方法。５．請求の範囲第４項に記載の方法であって、初めの核酸が二本鎖の形態の場合には、それを前もって変性操作に付することを特徴とする方法。６．請求の範囲第１項乃至第５項のいずれか一つに記載の標的核酸を増幅する方法を行うためのプライマーのセットであって、該セットが、少なくとも：ａ）その５’末端から３’末端に向かって、順次以下のセグメントを含むプライマーＡ１、任意の配列の第一の任意的なポリヌクレオチドセグメント、ここで該第一のセグメントは、存在する場合は、少なくとも５ヌクレオチドを含む、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターのセンス配列の全部又は一部を含むか、又はその３’末端を含む該センス配列の少なくとも一部を含む第二のセグメント、及び標的配列とハイブリダイズできる第三のセグメント、及び／又はｂ）以下のいずれかの配列を含むプライマーＡ２：プライマーＡ１の第二セグメントの全て又は一部に相同であり、かつ該ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのセンス配列の少なくとも５’部分を含む配列、又は、第一及び第二のプライマーの第一セグメントの一部に相同であるが、それぞれそれらの５’部分は含まない配列、及び／又はｃ）以下のいずれかの配列を含むプライマーＡ３：プライマーＡ２の一部に相同であるが、Ａ２の３’末端ヌクレオチドは含まない配列、又は、Ａ１に存在する上記した第一セグメントの少なくとも一部に相同な配列、を含むことを特徴とするセット。７．請求の範囲第６項に記載のプライマーのセットであって、該セットが少なくとも：ａ）その５’末端から３’末端に向かって、順次以下のセグメントを含むプライマーＡ１、任意の配列の第一の任意的なポリヌクレオチドセグメント、ここで該第一のセグメントは、存在する場合は、少なくとも５ヌクレオチドを含む、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターのセンス配列の全部又は一部を含むか、又はその３’末端を含む該センス配列の少なくとも一部を含む第二のセグメント、及び標的配列とハイブリダイズできる第三のセグメント、及び／又はｂ）以下のいずれかの配列を含むプライマーＡ２：プライマーＡ１の第二セグメントの全て又は一部に相同であり、かつ該ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのセンス配列の少なくとも５’部分を含む配列、又は、第一及び第二のプライマーの第一セグメントの一部に相同であるが、それぞれそれらの５’部分は含まない配列、及び／又はｃ）以下のいずれかの配列を含むプライマーＡ３：プライマーＡ２の一部に相同であるが、Ａ２の３’末端ヌクレオチドは含まない配列、又は、Ａ１に存在する上記した第一セグメントの少なくとも一部に相同な配列、を含むことを特徴とするセット。８．請求の範囲第１項乃至第５項のいずれか一つに記載の方法を行うためのキットであって、該キットが、請求項第６項又は第７項で定義されたプライマーのセット、及び少なくとも：ａ）その５’末端から３’末端に向かって、順次以下のセグメントを含むプライマーＢ１、任意の配列の第一の任意的なポリヌクレオチドセグメント、ここで該第一のセグメントは、存在する場合は、少なくとも５ヌクレオチドを含む、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターのセンス配列の全部又は一部を含むか、又はその３’末端を含む該センス配列の少なくとも一部を含む第二のセグメント、及び標的上であって、プライマーＡ１がハイブリダイズできるところの配列の上流に位置する標的配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズできる第三のセグメント、及び／又はｂ）以下のいずれかの配列を含むプライマーＢ２：プライマーＢ１の第二セグメントの全て又は一部に相同であり、かつ該ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのセンス配列の少なくとも５’部分を含む配列、又は、第一及び第二のプライマーの第一セグメントの一部に相同であるが、それぞれそれらの５’部分は含まない配列、及び／又はｃ）以下のいずれかの配列を含むプライマーＢ３：プライマーＢ２の一部に相同であるが、Ｂ２の３’末端ヌクレオチドは含まない配列、又は、Ｂ１に存在する上記した第一セグメントの少なくとも一部に相同な配列、を含む少なくとも一つの第二のプライマーセットを含むキットであって、該キットは、場合によりさらに、請求の範囲第４項で定義した第七及び第八のプライマーを含むことを特徴とするキット。９．請求の範囲第８項に記載のキットであって、該キットが、請求項第６項又は第７項で定義されたプライマーのセット、及び少なくとも：ａ）その５’末端から３’末端に向かって、順次以下のセグメントを含むプライマーＢ１、任意の配列の第一の任意的なポリヌクレオチドセグメント、ここで該第一のセグメントは、存在する場合は、少なくとも５ヌクレオチドを含む、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターのセンス配列の全部又は一部を含むか、又はその３’末端を含む該センス配列の少なくとも一部を含む第二のセグメント、及び標的上であって、プライマーＡ１がハイブリダイズできるところの配列の上流に位置する標的配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズできる第三のセグメント、及び／又はｂ）以下のいずれかの配列を含むプライマーＢ２：プライマーＢ１の第二セグメントの全て又は一部に相同であり、かつ該ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのセンス配列の少なくとも５’部分を含む配列、又は、第一及び第二のプライマーの第一セグメントの一部に相同であるが、それぞれそれらの５’部分は含まない配列、及び／又はｃ）以下のいずれかの配列を含むプライマーＢ３：プライマーＢ２の一部に相同であるが、Ｂ２の３’末端ヌクレオチドは含まない配列、又は、Ｂ１に存在する上記した第一セグメントの少なくとも一部に相同な配列、を含む少なくとも一つの第二のプライマーセットを含むキットであって、該キットは、場合によりさらに、請求の範囲第４項で定義した第七及び第八のプライマーを含むことを特徴とするキット。