JP3002259B2 - 置換を用いた転写による核酸増幅方法、及び該方法のための試薬及びキット - Google Patents

置換を用いた転写による核酸増幅方法、及び該方法のための試薬及びキット

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、標的核酸配列の増幅のための方法、試薬及
びキットに関する。特に、本発明は、置換を用いた転写
による核酸増幅方法及び該反応によって得られる増幅生
成物の検出にある。
核酸及び遺伝物質に関する技術においては、遺伝子、
遺伝子の一部又はヌクレオチド配列が生物、この生物の
細胞抽出物又は生物学的試料中に存在するかどうかをを
決定することがしばしば必要である。いずれの遺伝子又
は遺伝子の一部も、ヌクレオチド分子の全て又は一部を
形成する特定の配列のヌクレオチド塩基であるので、ポ
リヌクレオチドを含んでいる試料中の特定のヌクレオチ
ド配列の存在を直接的に捜すことが可能である。
特定のヌクレオチド配列の捜索の有用性は、特に病原
性生物の検出、対立遺伝子の存在決定、宿主ゲノム中の
遺伝的欠陥の存在の検出、及び特定のmRNAの存在又は細
胞宿主の修飾の検出のために、幅広い。遺伝病、例えば
ハンチントン病、デュシェンヌ筋症、フェニルケトン尿
症及びβ−タラセミアは、各個人からのDNAを分析する
ことにより診断されうる。更に、ウィルス、ウイロイ
ド、バクテリア、菌類、原生動物又は他の形態の植物或
いは動物を診断し、同定することも、核酸プローブを用
いたハイブリダイゼーション実験により行われうる。
核酸の検出のための種々のタイプの方法が、文献に記
載されている。これらの方法、及び特にポリヌクレオチ
ドの検出を要求する方法は、DNA−DNA、DNA−RNA及びRN
A−RNA複合体における、核酸の相補鎖のプリン−ピリミ
ジンン対合特性に基づいている。この対合プロセスは、
二本鎖DNAのアデノシン−チミン（Ａ−Ｔ）及びグアノ
シン−シトシン（Ｇ−Ｃ）塩基間の水素結合の形成によ
って起こり、アデノシン−ウラシル（Ａ−Ｕ）塩基対
も、DNA−RNA又はRNA−RNA対において水素結合によって
形成されうる。所与の核酸分子が存在するか否かの決定
ための核酸鎖の対合は、通常“核酸ハイブリダイゼーシ
ョン”又は単に“ハイブリダイゼーション”と呼ばれて
いる。
上記のいくつかの例においては、生物又は病気に特異
的である配列を同定した後、試料より核酸を抽出し、そ
してこの配列が存在するかどうかを決定するのが賢明で
ある。この目的のために多くの検出方法が開発された。
病気又は生物に特異的な１以上の配列を同定すること
が重要であるけれども、これらの配列の性質及びそれら
が同定されたところの模式は本発明を行う上で特に重要
ではない。核酸試料中における標的配列の存在を検出す
るための最も直接的な方法は、その配列が、標的核酸に
ハイブリダイズすべく標的核酸の一部に十分に相補的で
あるところの“プローブ”を得ることである。そのよう
に合成されたプローブが、核酸を含む試料に適用される
ことができ、そしてもし標的配列が存在すれば、プロー
ブは反応生成物を形成するためにハイブリダイズする。
標的配列が存在しない場合に、非特異的なハイブリダイ
ゼーション現象を避けることによって、反応生成物は形
成されない。もし合成されたプローブが検出できるマー
カーと結合されれば、反応生成物は、存在するマーカー
の量を測定することにより検出されうる。サザンブロッ
ティング（Southern E.M.,J.Mol.Biol.,第98巻、第503
頁、1975年）又はサンドイッチハイブリイゼーション
（Dunn A.R.,Hassel J.A.,Cell,第12巻、第23頁、1977
年）は、これらの方法が用いられるところの例の一部を
なす。
しかしながら、このアプローチの主要な難点は、試料
中に存在する標的配列のコピー数が低い場合（即ち107
未満）にはそれが直接適用できないということである。
これらの条件下では、重要なシグナル、即ち反応のバッ
クグランドノイズより大きいシグナルを識別する（即
ち、その標的配列上へのプローブの特異的結合を、プロ
ーブと標的配列とは異なる配列との間の非特異的結合と
区別する）のが困難である。この問題の解決策の一つ
は、追加の反応によって検出シグナルを増加させること
にある。従って、これらのハイブリダイゼーション技術
の検出力を増加させるために種々の方法が報告されてい
る。これらの、いわゆる“増幅”法は、核酸プローブに
よる検出法において種々の段階で用いられ得る。これら
の段階は、三つのカテゴリー、標的、プローブ或いはシ
グナルの増幅に分類される。一方ではLewis（1992年、G
enetic Engineering News,第12巻、第１〜９頁）による
文献、他方ではAbramsonとMyers（1993年、Curr.Opin.B
iotechnol.第４巻、第41〜47頁）による文献が、これら
の方法の優れた一般的な総論である。
標的の増幅は、特定の方法により、試料中に存在する
核酸フラグメントを増加させることからなる。そのこと
は、検出されるべき標的核酸配列のコピー数を著しく増
加させることを可能とする。
最も広く知られた方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（PC
Rと呼ばれている）であり、標的配列とハイブリダイズ
されたヌクレオチドプライマーの伸長によるインビトロ
ノのDNA合成サイクルの反復に基づいた標的増幅技術で
ある（Saikiら、1985年、Science第230巻、第1350〜135
4頁、米国特許第4683195、第4683202、第4800159号明細
書、ヨーロッパ特許第0201184号公報）。要約すれば、
標的DNAの２本鎖の一つの鎖の配列にそれぞれ相補的な
２つのヌクレオチドプライマーを合成する。デオキシリ
ボヌクレオキシドトリホスフェートを、熱安定性のDNA
依存DNAポリメラーゼ（Taqポリメラーゼ）の存在下に
て、過剰量で反応媒体に加える。もし標的DNAが試料中
に存在すれば、プライマーはそれらの特定の部位にハイ
ブリダイズし、そしてポリメラーゼは、標的に相補的な
ヌクレオチドを連続的に付加することによりこれらのプ
ライマーの３′末端を伸長する。連続サイクルとして温
度を上下することにより、伸長されたプライマーは標的
から分離し、元の標的と同様、過剰のヌクレオチドプラ
イマーと結合できる。プロセスを繰り返すことにより
（20〜40回）、２つのプライマー間の標的配列の指数的
な蓄積が得られる。
温度サイクルを用いた他の方法は、ヨーロッパ特許第
0320308号公報に記載されており、リガーゼ連鎖反応（L
CRと呼ばれる）と呼ばれている。２つの隣接するオリゴ
ヌクレオチドプローブ並びにそれらと相補的である２つ
の他のプローブを、DNAリガーゼの存在下にて、過剰に
反応媒体に加える。標的DNAの存在下、各オリゴヌクレ
オチドはその相補配列とハイブリダイズし、リガーゼは
２つの隣接してハイブリダイズしたプローブを連結しう
る。PCRにおけるのと同様に連続する温度サイクルによ
って、及び温度安定性リガーゼ（Barany、1991年、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA、第88巻、第189〜193頁）の使用
によって、連結されたプローブは標的から分離して、今
度は、過剰のプローブのための標的配列として働く。
修復連鎖反応法（RCRと呼ばれている）は、LCRに類似
した増幅法である（国際公開 第90/01069号公報）。そ
れは、PCR及びLCRの間の組み合せ法である。それは、熱
安定性DNAリガーゼ及び熱安定性DNAポリメラーゼの存在
下にて、標的に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプロ
ーブ及び及び反応媒体中の過剰の２つのプライマーを用
いる。標的DNAが存在する場合は、オリゴヌクレオチド
はそれらの標的配列とハイブリダイズして、数塩基のギ
ャップが、隣接するオリゴヌクレオチドプローブから各
プライマーの末端を分離する。ポリメラーゼは、このギ
ャップを埋めて、伸長されたプライマーを隣接するプロ
ーブに連結するリガーゼの作用をも可能とする。従っ
て、DNA修復の自然の方法に良く似ている。PCR及びLCR
におけるのと同様に、連続する温度サイクルによって、
オリゴヌクレオチドプローブに連結された伸長されたプ
ライマーは、今度は、プライマーのための標的として及
び過剰のプローブとして働きうる。
転写物の増幅に基づいた他の標的増幅法がある（TAS
と呼ばれている）。TAS（国際公開 第WO 88/10315号
公報に記載されている）は、３つの段階の反復サイクル
からなる。最初の段階は、逆転写酵素及びファージRNA
ポリメラーゼプロモーターの特定の配列を含む“ハイブ
リッド”デオキシヌクレオチドプライマーの存在下に
て、RNAからのcDNAの合成を可能とする。RNA/cDNAヘテ
ロ二本鎖を熱変性させた後、一本鎖cDNAをアンチセンス
オリゴヌクレオチドプライマーの存在下で逆転写酵素に
よって複製する。この第二段階においてかくして得られ
たDNAホモ二本鎖は、ファージDNA依存性RNAポリメラー
ゼが結合できるところの二本鎖プロモーターを含む。次
いでの第三段階はRNA分子の転写（鋳型当たり30〜100
0）からなり、該RNA分子は、再びcDNA合成のための鋳型
として働くことができ、これによって増幅サイクルが連
続する（Davisら、1990年、J.Infect.Dis、第162巻、第
13〜20頁）。
TASから派生した種々の方法がある。例えば、自己支
持配列複製（Self−Sustained Sequence Replication）
（3SRと呼ばれる）（これは国際公開 WO 90/06995及
びヨーロッパ特許第0373960号公報に記載されてい
る）、核酸配列に基づいた増幅（Nucleic Acid Sequenc
e−Based Amplifi cation）（NASBAと呼ばれる）（これ
は国際公開 WO 91/02818及びヨーロッパ特許第032982
2号公報に記載されている）及び単一プライマー配列複
製（Single Primer Sequence Replication）（SPSRと呼
ばれる）（これは米国特許第5194370号明細書に記載さ
れている）がある。これらの方法は、共通して、３つの
酵素活性、すなわちRNA依存性及びDNA依存性DNAポリメ
ラーゼ（逆転写酵素）、リボヌクレアーゼＨ（RNase
H、大腸菌酵素及び／又は逆転写酵素に付随する酵素活
性）及びDNA依存性RNAポリメラーゼ（T7バクテリオファ
ージRNAポリメラーゼ）の組み合わせを有する。これら
の方法は、同一の原理に基づいており、cDNAを介したRN
A標的を複製するために、逆転写及び転写反応の連続工
程に従って、固定化された温度（37〜45℃）において行
われる。TASの場合と同様に、RNAポリメラーゼ（T7ファ
ージ）結合部位が、逆転写段階のために用いられるプラ
イマーによって、cDNA中に導入される。しかしながら、
RNA/DNAヘテロ二本鎖の変性は、RNase H活性によるこの
ヘテロ二本鎖のRNAの特異的な加水分解によって一定温
度にて行われる。次いで、遊離のcDNAが、逆転写酵素に
よって、第二オリゴヌクレオチドプライマーから複製さ
れる。DNA/DNAホモ二本鎖は、T7RNAポリメラーゼによっ
てRNAへと転写され、そしてこのRNAは次のサイクルでの
鋳型として再び働くことができる。
他の方法、連結反応活性化転写（Ligation Activated
Transcription）（LATと呼ばれる）（これは、米国特
許第5194370号明細書に記載されている）は、3SR、SPSR
及びNASBAと同じ酵素活性を用い、そして同じサイクル
で操作される。しかしながら、プロモーター配列の設置
の様式が異なっており、この場合、該配列は、DNAリガ
ーゼの存在下にて、プロモーターを含んだステム−ルー
プ構造の連結反応によって、cDNAの末端に導入される。
他の標的増幅方法は、最近発表された。鎖置換増幅法
（Strand Displacement Amplification method）（SDA
と呼ばれる）（これはヨーロッパ特許第0497272号公報
に記載されている）は、適当な制限酵素及びエキソヌク
レアーゼ活性を欠損したDNA依存性DNAポリメラーゼを用
いた、標的DNA配列の一定温度（37℃）での増幅を許す
（Walkerら、1992年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第89
巻、第392〜396頁）。それは、５′末端に制限酵素を認
識する配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーのハイ
ブリダイゼーションに基づいている。これらのプライマ
ーは、少なくとも一つの修飾されたヌクレオチド（５′
［α−チオ］dNTP）の存在下にて、DNAポリメラーゼに
よって標的上で伸ばされる。制限エンドヌクレアーゼに
よるDNAの消化は、プライマーに対応する鎖の切断を起
こし、修飾された相補鎖をそのまま残す。DNAポリメラ
ーゼは、このようにして製造されたプライマーの伸長を
行うことができ、そしてDNAポリメラーゼの鎖置換性質
を用いて、反応媒体中へDNA鎖を遊離させることができ
る。次いで、この遊離された鎖は、制限酵素結合配列を
含むプライマーに結合でき、そしてその後、サイクルは
再び開始できる。更に、特定の末端を有し、増幅法、特
に上記SDA中で後に働くことができる、核酸を調製する
方法がヨーロッパ特許出願第543612号公報に記載されて
いる。しかしながら、この調製方法は、それ自身では、
いずれの場合でも、一定温度の増幅サイクルを引き起こ
すことが出来ないということを述べておくべきである。
エンドヌクレアーゼ活性の代わりにエキソヌクレアーゼ
活性を用いたSDAに同様の方法（エキソヌクレアーゼ仲
介鎖置換増幅（exonuclease−mediated strand displac
ement amplicationと呼ばれる）が、ヨーロッパ特許第0
500224号公報に記載されている。
上記の全ての方法のために、種々の検出法が用いられ
得る。それらの内の一つは、電気泳動分離による特定の
大きさを有した反応生成物の検出である。その方法は、
分離様式に従い変化し、ゲル分離、種々の固槽（ビー
ズ、マイクロタイタープレート、ラテックス、マグネチ
ック粒子）への結合を含む。他の方法は、放射性同位元
素、例えば32Pによる検出プローブの標識を用い、つい
で、電気泳動と組み合わせて或いは組み合わせずに、反
応生成物によって示された放射活性を検出する。他の方
法は、リガンド（例えば、ビオチン又ジゴキシゲニ
ン）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオ
キシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ）、蛍光マーカー
（例えば、フィコビリ蛋白質、フルオレセイン、ローダ
ミン）、ルミネセンスマーカー（例えばアクリジニウム
エステル）又はこれらの修飾の組み合わせを加えること
による、オリゴヌクレオチドプライマーの化学的修飾で
ある。他の方法は、増幅の反応生成物とハイブリダイズ
し、リボヌクレオシドトリホスフェートの存在下にポリ
メラーゼによって伸長される検出ヌクレオチドプライマ
ーの開発である（このプライマーは、この場合に、上記
のように修飾されることができる）。これら全ての方法
は、固層並びに液体（均一相）に適用されうる。
しかしながら、前記した全ての増幅技術は、少なくと
も一つの主要な限界を有する。それらは、標的核酸の単
一タイプ、即ちRNA又はDNAからのみ増幅生成物を得るこ
とが可能である。いくつかの場合、例えばPCR、LCR又は
RCRの場合には、最大の限定要因は、標的から反応生成
物を分離するために非常に多くの温度サイクルを行うこ
との必要性である。このことは、用いられ得る酵素の選
択を温度安定性の酵素に限定する。更に、このような連
続した温度サイクルを行うことは、これらの技術を自動
化することに対して欠点を構成する。ある種の増幅技術
の他の欠点は、増幅反応生成物の大きさの限界である。
たとえばPCRやLCRのような技術は、増幅工程において用
いられるヌクレオチドプライマー及びプローブに対応す
る標的の配列のみを増幅することができる。非特異的な
バックグランドノイズ（即ち、標的の存在しない場合）
はまた、ある種の技術例えばLCRの重大な欠点である。L
CRの場合には、過剰の遊離オリゴヌクレオチドの末端の
連結反応が標的の非存在下で起こる。他の方法、たとえ
ばSDAは、増幅されるべき標的配列のタイプが限定され
てしまう。なぜなら、この配列は、工程において用いら
れるエンドヌクレアーゼに対応する制限部位を含むべき
でないからである。それ故、もし増幅されるべきフラグ
メントの配列が判らない場合には、少なくとも該フラグ
メントの制限地図を知ることが必須である。さらにこの
限定は、以下の事実によって大きくなる。制限エンドヌ
クレアーゼの選択は、ヘミホスホロチオエート認識部位
（即ち、ホスホロチオエートタイプの少なくとも一つの
修飾されたヌクレオチドを有する二本鎖のDNAストラン
ドを含む）及びもっと一般的な観点からは、修飾された
ヌクレオチドを含む部位を切断する能力を有しているも
のに制限される。化学合成という理由での、修飾された
ヌクレオチドの選択における限定に加えて、増幅工程は
また、その収率によっても限定される。何故なら、修飾
されたヌクレオチドに対するポリメラーゼのKmはポリメ
ラーゼのための天然のヌクレオチドに対するKmより大き
く、従って、修飾されたヌクレオチドの増幅されるべき
標的中への酵素的な取り込みは効率的に低いということ
が知られている。ある種の増幅技術の他の主要な欠点
は、増幅工程において含まれる多数の酵素活性にある。
TASから派生した方法、たとえば3SR又はNASBAは、少な
くとも４つの酵素活性（DNA依存性DNAポリメラーゼ、RN
A依存性DNAポリメラーゼ、DNA依存性RNAポリメラーゼ、
RNase Ｈ）を要求し、またLATの場合には、５つの酵素
活性（更にDNAリガーゼ）を要求する。これらの４つ或
いは５つの酵素活性を同時に満足させる反応条件を得る
ことは困難であるので、結果として、これらの技術を効
率的にするのは非常に困難である。更に、これらの転写
技術は、RNA標的分子からのみ増幅を許し、DNAからはで
きない。最後に、種々の増幅技術は、核酸のストランド
を分離する手段としてヌクレアーゼ活性（エキソヌクレ
アーゼ、エンドヌクレアーゼ、RNase）を用いているが
（ヨーロッパ特許第0500224号公報）、このようなヌク
レアーゼ活性の調製においてときどき存在する望まない
ヌクレアーゼ活性によって標的又は反応生成物の分解が
あり得るので、それらの使用はやはり不利である。更
に、転写技術の場合には、RNaseの使用は、増幅された
物質の部分的分解をもたらし、それ故、収率及び技術の
感度をだめにする。更に、RNaseの作用は、含まれる種
々の酵素の作用との平衡を維持するために厳格に測定さ
れるべきである。これらの多くの限定の点より、これら
の既存の方法の代わりである他の増幅方法が望まれる。
本発明は、置換を用いた転写反応による、試料中の任
意の配列（並びにその相補配列）の標的核酸配列（RNA
及び／又はDNA）の増幅方法を提供する。該方法は、試
料中の標的核酸配列の検出を許す種々の段階を含む。該
方法は、特に、１）所望の標的配列を含みうる生物学的
試料からの核酸の抽出、２）標的配列の変性、即ちもし
標的が二本鎖であれば一本鎖フラグメントの製造、３）
（ａ）DNA依存性及びRNA依存性DNAポリメラーゼ活性、
及び鎖置換活性を有する酵素又は酵素混合物、（ｂ）RN
Aポリメラーゼ、（ｃ）（５′から３′へと）少なくと
も５ヌクレオチドの在ってもよい任意の配列、RNAポリ
メラーゼのためのプロモーター配列の全部または一部を
含む配列、及び次に標的核酸フラグメントの３′末端に
相補的な配列から順次なるオリゴヌクレオチドプライマ
ー、及び／又は（ｄ）その３′末端に３（ｃ）中で定義
したプライマーの任意の配列の全て又は一部を含む任意
的なオリゴヌクレオチドプライマー、及び／又は（ｅ）
その３′において３（ｃ）で定義したプライマーの全部
又は一部を有する任意的なヌクレオチドプライマー、但
し該３′末端は３（ｄ）中で定義されたプライマーの下
流（３′）にハイブリダイズし、そしてプロモーターの
センス配列の少なくとも５′部を含みうるが３（ｃ）で
定義されたプライマーの３′末端を含まない、（ｆ）デ
オキシリボヌクレオシドトリホスフェート及びリボヌク
レオシドトリホスフェート、（ｇ）酵素活性の機能に適
した緩衝液、を含む反応混合物の添加、及び（４）反応
生成物を製造するための最少時間での保温の実行を含み
うる。
本発明はまた、上記した方法を含む種々の方法による
反応生成物の、分離及び／又は検出方法にも及ぶ。分離
方法は、なかんずく、磁気的分離、固形支持体、膜、フ
ィルター又はポリマー上での捕獲を含む。それぞれの方
法において、捕獲基は、マグネチックビーズ、膜、フィ
ルター又はポリマーにくっ付きうる。ビーズ、膜、固形
支持体、フィルター又はポリマーは、次いで、増幅方法
の反応生成物の存在又は非存在について検定されうる。
たとえば、捕獲基は、増幅反応生成物と相補的な核酸配
列、又は用いられたプライマーの一つ中あるいは反応生
成物中に取り込まれたリガンド或いはハプテンに対して
向けられた蛋白質または抗体であり得る。
本発明の実行のために有用な検出系は、均質系（即
ち、分離系を要求しない）及び、一方で非物質系を含
む。個々の系において、１以上の検出マーカーが用いら
れ、そして検出系の反応又は放射が、好ましくは自動化
手段により測定される。均質検出系の具体例は、蛍光エ
ネルギーの移動、ハイブリダイゼーションによる保護
（アクリジニウムのルミネセンス）、クローン化された
酵素供与物の蛍光の偏光及び免疫学的検出を含む。非均
質系の具体例は、酵素マーカー（ペルオキシダーゼ、ホ
スファターゼ、β−ガラクトシダーゼ）、蛍光マーカー
（酵素的マーカー、ローダミン、フルオレセイン）、化
学発光及び生物発光を含む。これらの検出系において
は、検出できるマーカーは、捕獲基と直接的に又は間接
的に複合でき、または、増幅反応生成物は、蛋白質又
は、抗体のためのリガンド或いはハプテンによって認識
されうる抗体の存在下で生成されうる。
本発明の主体はまた、目的の分子を間接的に検出する
方法であって、目的の分子に連結されたマーカーである
ポリヌクレオチドを増幅する方法である。マーカーポリ
ヌクレオチドの増幅生成物は、それ自身、それらの合成
の間に、修飾されたヌクレオチド例えば［32P］又は［3
H］で標識されたヌクレオチドの取込みによって直接検
出されることができ、または上記方法に従って間接的に
も検出されることができる。
本発明はまた、プローブとして用いられることがで
き、またはそのヌクレオチド配列の決定のための鋳型と
して用いられることができる増幅生成物を製造する方法
に関する。増幅された生成物は、増幅に用いられた酵素
（DNAポリメラーゼ及びRNAポリメラーゼ）から分離され
て、他の酵素反応、他の増幅系、配列決定法又は核酸合
成法（いくつかの例を挙げると）を含む引き続くプロセ
スにおいて用いられることができる。
本発明の主体はまた、上記増幅方法の実行を許す、試
料中に存在しうる標的核酸を検出するためのキットであ
る。
これから、本発明を、添付した図を適宜参照して、更
に詳細に説明する。
図１は、ある種のポリメラーゼの鎖置換特性を用い
た、二本鎖からの核酸鎖の分離の原理を記載した。
図２は、均質相（単一段階及び単一温度）における、
標識的配列（RNA又はDNA）に相補的なRNAの転写による
製造のための、鎖置換によるRNAポリメラーゼプロモー
ターの設置法を記載する。プロモーターの配列は、黒い
四角によって表し、RNAは太線で表した。プライマーＸ
は、５′から３′へと、RNAポリメラーゼのためのプロ
モーターのセンス配列を含む配列及び標的の下流の配列
とハイブリダイズする配列を含み、プライマーＺは、そ
の伸長がプライマーＸから得られたフラグメントに相補
的な鎖を製造することを可能とするところのプライマー
を表し、そしてプライマーＹは、Ｘの下流でハイブリダ
イズし、かつその伸長がＸの伸長の生成物の置換を作る
ところの“置換”プライマーを表す、印、“＋”及び
“−”は、核酸の対向する鎖、即ち相補鎖に属する配列
を表す。
図３は、“置換を用いた転写反応”による、ホモ二本
鎖又はヘテロ二本鎖、一本鎖又は二本鎖のDNA又はRNA
（これらは図５に記載されている）からの、黒い長方形
で表されている完全なプロモーターセンス配列を有する
プライマーＡ及びＢ（これは、二本鎖の形で、機能的プ
ロモーターを製造する）を用いた、本発明の増幅方法の
導入ルート（エントリー）を記してある。
図４は、“置換を用いた転写反応”による、ホモ二本
鎖又はヘテロ二本鎖、一本鎖又は二本鎖のDNA又はRNA
（これらは図６に記載されている）からの、長い黒い長
方形で表される完全なプロモーターセンス配列を含むプ
ライマーＤ及びＦとは異なり、短い黒い長方形で表され
ているプロモーターのセンス配列の３′部のみを有する
プライマーＡ及びＢ（即ち、プライマーＡ及びＢに含ま
れた配列は、図４及び６の場合には、それらが二本鎖の
形の時、機能的プロモーターを形成しない）を用いた、
本発明の増幅方法の別の導入ルートを記してある。
図５は、黒い長方形で表される完全なプロモーターセ
ンス配列（これは二本鎖の形で、機能的プロモーターを
作る）を含むプライマーＡ、Ｂ、Ｄ及びＦの全てを用い
た、最初の標的の２本の相補鎖に対応するRNA及びDNAの
指数的蓄積をもたらす“置換を用いた転写反応”の増幅
サイクルを表す。
図６は、長い黒い長方形で表される完全なプロモータ
ーセンス配列を含むプライマーＤ及びＦとは異なり、短
い黒い長方形で表されているプロモーターのセンス配列
の３′部のみを有するプライマーＡ及びＢ（即ち、プラ
イマーＡ及びＢに含まれた配列は、図４及び６の場合に
は、それらが二本鎖の形の時、機能的プロモーターを形
成しない）を用いた、最初の標的の２本の相補鎖に対応
するRNA及びDNAの指数的蓄積をもたらす“置換を用いた
転写反応”の増幅サイクルを表す。従って、この増幅サ
イクルは、単一機能的プロモーターのみを運び、二本鎖
のうちの一本のみの転写を許す二本鎖ポリヌクレオチド
のみをふくむ。
図７は、図５に記載されたように、置換を用いた転写
による増幅サイクルの実行のために用いられ得るプライ
マーの特定の場合を記載している。
プライマーＤ（太字）は図５に記載されたそれに対応
し、そしてプライマーＣbisは、この場合はプライマー
Ｄとオーバーラップしている。この特定の場合は、標的
とのプライマーＣbisのハイブリダイゼーションは、プ
ライマーＤの５′未満のハイブリダイゼーションと比べ
て、熱力学の点より有利であると推定している。
図８は、実施例１に記載した、ポリアクリルアミドゲ
ル上での電気泳動分離、膜上への移動及びハイブリダイ
ゼーションによる、置換を用いた転写生成物の分析を表
す。矢印は、期待された263塩基の転写生成物を示す。
レーン１は、転写の対照である。レーン２は、置換プラ
イマーが存在しない場合の検定である。レーン３〜７
は、それぞれ5mM、500nM、50nM、5nM及び0.5nMを含む検
定である。
図９は、実施例２に記載した、ポリアクリルアミドゲ
ル上での電気泳動分離、膜上への移動及びハイブリダイ
ゼーションによる、置換を用いた転写生成物の分析を表
す。矢印は、期待された263塩基の転写生成物を示す。
レーン１は、プライマーA24（配列ID No.2）及び1028
（配列ID No.3）を用いてPCRにより得られた285塩基対
のサイズマーカーに対応する。検定は、逆転写酵素及び
T7RNAポリメラーゼの非存在下（レーン２）又は酵素の
存在下で、３つのタイプのプライマーＸ、Ｙ及びＺを用
いて（レーン３）、置換プライマーＹなしで（レーン
４）又はプライマーＺなし（レーン５）で行った。
図10は、実施例３に記載した、ポリアクリルアミドゲ
ル上での電気泳動分離、膜上への移動及びハイブリダイ
ゼーションによる、置換を用いた転写生成物の分析を表
す。レーン１は、プライマーA24（配列ID No.2）及び10
28（配列ID No.3）を用いてPCRにより得られた285塩基
対のサイズマーカーに対応する。レーン２は、T7RNAポ
リメラーゼ存在下での、285塩基対の標的転写の対照で
ある。レーン３〜６は、試薬、即ちT7RNAポリメラーゼ
（レーン３）、逆転写酵素（レーン４）、プライマーＺ
（レーン５）又は置換プライマーＹ（レーン６）の一つ
の非存在下で行った検定である。レーン７は、実施例３
に記載された全ての試薬の存在下での検定である。
図11は、実施例４に記載した、ポリアクリルアミドゲ
ル上での電気泳動分離、膜上への転写及び、プローブA2
8（配列ID No.5）（パネルＡ）又はプローブA19（配列I
D No.11）（パネルＢ）（これらは、それぞれ＋RNA又は
−RNAを検出する）のいずれかとのハイブリダイゼーシ
ョンによる、核酸鎖のいずれか一つの転写のために配向
された２つのプロモーターが両側にある核酸からの転写
生成物の分析を表している。レーン１は、275塩基対の
サイズマーカーに対応する。レーン２は、転写検定であ
る。
図12及び13は、それぞれ図３及び図５の、別の実施態
様を表している。
図14及び15は、それぞれ図３及び図５に記載された増
幅法を単純化した方法、即ちプロモーターＤ及び／又は
Ｆ（任意である）を反応媒体から除いている方法を表し
ている。
図16及び17は、それぞれ図３及び図５に記載された増
幅法を単純化した方法、即ちプライマーＡ及びＢは、も
はやプロモーターのセンス配列の上流の任意的な規定さ
れた配列を含まない方法を表している。従って、置換プ
ライマーＣ及びＥ（図５）の使用は、もはや必須ではな
い。酵素的な置換の役割は、Ａ及びＢに含まれるプロモ
ーターのセンス配列、即ちそれぞれプライマーＤ及びＦ
によって提供される。
本発明の方法に従って、標的核酸配列の増幅方法であ
って、該核酸配列がその５′末端から、５′−３′方向
に、少なくとも５ヌクレオチドを有する上流配列及び、
その３′末端から、３′−５′方向に、少なくとも５ヌ
クレチドを有する下流配列を含む核酸配列であるところ
の方法は、以下の段階： 増幅されるべき配列に対応する第一のセグメントを含
み、かつ更に、RNAポリメラーゼプロモーターのセンス
配列又はアンチセンス配列又は該センス又はアンチセン
ス配列の少なくとも一部を含むセグメントから選ばれる
少なくとも一つの第二のセグメントを含むポリヌクレオ
チドを得る段階（ここで、該センス配列又はその一部を
含むこのような第二のセグメントは該第一のセグメント
の５′末端の上流に置かれ、そして該アンチセンス配列
又はその一部を含むこのような第二のセグメントは該第
一のセグメントの３′末端の下流に置かれると理解され
る）、そして RNAポリメラーゼ活性、RNA依存性DNAポリメラーゼ活
性、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性及び鎖置換活性を有
する系の存在下で、該活性が作用する条件下で、そして
過剰のデオキシボヌクレオシドトリホスフェート及びリ
ボヌクレオシドトリホスフェートの存在下において、上
記ポリヌクレオチドをプライマーのセットと接触させる
段階を含み、ここで該プライマーのセットは、過剰に存
在し、かつ ａ）その５′末端から３′末端へと順次に以下のセグメ
ントを含む第一のプライマー： 任意の配列（第一のプライマーの構成要素としてのそ
の存在は任意である）の第一のポリヌクレオチドセグメ
ント、ここで該第一のセグメントは、存在する場合には
少なくとも５ヌクレオチドを含む、 RNAポリメラーゼのためのプロモーターのセンス配列
の全て又は一部を含む、又は３′末端部分を含む該セン
ス配列の少なくとも一部を含む第二のセグメント、 及び、該上流配列と同じ長さを有し、かつ該上流配列
に相同であるか又は該上流配列とハイブリダイゼーショ
ンできる第三のセグメント、 及び／又は ｂ）その５′末端から３′末端へと順次に以下のセグメ
ントを含む第二のプライマー： 第一のプライマーの第一のセグメントと同様に定義さ
れる（しかしそれと同一である必要はない）第一の任意
的のセグメント、 第一のプライマーの第二のセグメントと同様に定義さ
れる（しかしそれと同一である必要はない）第二のセグ
メント、 及び、該下流配列と同じ長さを有し、かつ該下流配列
に相同であるか又は該下流配列とハイブリダイゼーショ
ンできる第三のセグメント、ここで第一及び第二プライ
マーのうちの一つの第三のセグメントは増幅されるべき
該配列の上流又は下流配列の内の一つと相同であり、一
方、他のプライマーの第三のセグメントは、他の下流又
は上流の配列とハイブリダイゼーションできると理解さ
れる、 及び／又は ｃ）以下のいずれかの配列を含む第三の及び／又は第四
の任意的のプライマー それぞれ第一のプライマー及び第二のプライマーの第
二のセグメントに相同であり、５′末端部分を含む該RN
Aポリメラーゼプロモーターのセンス配列の少なくとも
一部を含む配列、又は それぞれ第一及び第二のプライマーの第一のセグメン
トの一部分に相同である配列（ただしそれらの５′部分
は含まない）、 及び／又は ｄ）以下のいずれかの配列を含む第五の及び／又は第六
の任意的のプライマー それぞれ第三の及び第四のプライマーの一部に相同な
配列であり、該一部は該第三の又は第四のプライマーの
３′末端ヌクレオチドを含まない配列、又は それぞれ、第一の及び第二のプライマーの該第一セグ
メントの少なくとも一部に相同な配列、 を含む。
本発明に従った増幅方法の特定の実施態様に従って、
増幅方法は以下の段階を： 増幅されるべき配列に対応する第一のセグメントを含
み、かつ更に、RNAポリメラーゼプロモーターのセンス
配列又はアンチセンス配列又は該センス又はアンチセン
ス配列の少なくとも一部を含むセグメントから選ばれる
少なくとも一つの第二のセグメントを含むポリヌクレオ
チドを得る段階（ここで、該センス配列又はその一部を
含むこのような第二のセグメントは該第一のセグメント
の５′末端の上流に置かれ、そして該アンチセンス配列
又はその一部を含むこのような第二のセグメントは該第
一のセグメントの３′末端の下流に置かれると理解され
る）、そして RNAポリメラーゼ活性、RNA依存性DNAポリメラーゼ活
性、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性及び鎖置換活性を有
する系の存在下で、該活性が作用する条件下で、そして
過剰のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート及び
リボヌクレオシドトリホスフェートの存在下において、
上記ポリヌクレオチドをプライマーのセットと接触させ
る段階を含み、ここで該プライマーのセットは、過剰に
存在し、かつ ａ）その５′末端から３′末端へと順次に以下のセグメ
ントを含む第一のプライマー： 任意の配列（第一のプライマーの構成要素としてのそ
の存在は任意である）の第一のポリヌクレオチドセグメ
ント、ここで該第一のセグメントは、存在する場合には
少なくとも５ヌクレオチドを含む、 RNAポリメラーゼのためのプロモーターのセンス配列
の全て又は一部を含む、又は３′末端部分を含む該セン
ス配列の少なくとも一部を含む第二のセグメント、 及び、該上流配列と同じ長さを有し、かつ該上流配列
に相同であるか又は該上流配列とハイブリダイゼーショ
ンできる第三のセグメント、 ｂ）その５′末端から３′末端へと順次に以下のセグメ
ントを含む第二のプライマー： 第一のプライマーの第一のセグメントと同様に定義さ
れる（しかしそれと同一である必要はない）第一の任意
的セグメント 第一のプライマーの第二のセグメントと同様に定義さ
れる（しかしそれと同一である必要はない）第二のセグ
メント、 及び、該下流配列と同じ長さを有し、かつ該下流配列
に相同であるか又は該下流配列とハイブリダイゼーショ
ンできる第三のセグメント、ここで第一及び第二プライ
マーのうちの一つの第三のセグメントは増幅されるべき
該配列の上流又は下流配列の内の一つと相同であり、一
方、他のプライマーの第三のセグメントは、他の下流又
は上流の配列とハイブリダイゼーションできると理解さ
れる、 ｃ）以下のいずれかの配列を含む第三の及び／又は第四
のプライマー それぞれ第一のプライマー及び第二のプライマーの第
二のセグメントに相同であり、５′末端部分を含む該RN
Aポリメラーゼプロモーターのセンス配列の少なくとも
一部を含む配列、又は それぞれ第一及び第二のプライマーの第一のセグメン
トの一部分に相同である配列（ただしそれらの５′末端
は含まない）、 及び／又は ｄ）以下のいずれかの配列を含む第五の及び／又は第六
のプライマー それぞれ第三の及び第四のプライマーの一部に相同な
配列であり、該一部は該第三の又は第四のプライマーの
３′末端ヌクレオチドを含まない配列、又は それぞれ、第一の及び第二のプライマーの該第一セグ
メントの少なくとも一部に相同な配列、 を含む。
本明細書においては、“上流”なる表現は、問題の核
酸又はポリヌクレオチド配列の５′末端側に置かれた領
域示し、そして、“下流”なる表現は、問題の核酸又は
ポリヌクレオチド配列の３′末端側に置かれた領域を示
す。
他の配列と相同な配列とは、他と同一の配列、又はそ
れが相同であるところの配列に厳密に相補的な配列とハ
イブリダイズするほとんど同一の配列を示す。
“ヘテロ二本鎖”なる語は、RNA/DNAハイブリッドを
意味する。“ホモ二本鎖”なる語は、DNA/DNA又はRNA/R
NAハイブリッドを示す。
“ヌクレオシドトリホスフェート”なる語は、デオキ
シリボヌクレオシドトリホスフェート及び／又はリボヌ
クレオシドトリホスフェートを示す。
直上で定義した方法においては、出発物質は、増幅さ
れるべき配列に“対応する”（これは、増幅されるべき
該配列であるか又は増幅されるべき該配列の相補鎖であ
るという意味である）第一のセグメントを含み、該方法
は、開始物質が一本鎖であっても、いずれの場合におい
ても２つの相補鎖の増幅を提供すると理解される。
ある種のポリメラーゼにおいて良く知られている鎖置
換能力は、なかんずく、DNA依存性DNAポリメラーゼにた
めのDNA合成及びRNA依存性DNAポリメラーゼによるDNA合
成に結び付けられる。もちろんこの鎖置換能力は、関与
するポリメラーゼが５′−３′エキソヌクレアーゼ活性
を有していない場合にはもっと効率的である。この鎖置
換能力は、以下に示すように、ポリメラーゼには依存し
ないと証明されうる。
用いられるポリメラーゼは、リボヌクレアーゼＨ活性
が増幅法の作用を妨げない限りは、該活性を持つことが
できるということに注目すべきである。
今まで明らかにした方法においては、第三及び第４の
プライマーが同一であり得るということは容易に判る。
同様に、第五及び第六のプライマーも同一であり得る。
上記した増幅方法を機能させるためには、もしそれら
が存在するならば、第三及び第四のプライマーは、RNA
ポリメラーゼプロモーターのセンス配列の少なくとも
５′部分を含む。これは、図４、５、６及び７で示され
たプライマーＤ、及び図４、５及び６で示されたプライ
マーＦの場合である。これらの図４及び６は、プライマ
ーＡ及び／又はＢが、RNAポリメラーゼのためのプロモ
ーターの完全な配列を含むことが必須でないということ
を示している。一方で、Ａ及びＦから、他方でＢ及びＤ
から導かれる反応生成物は、RNAポリメラーゼプロモー
ターの機能的なセンス配列を含むべきである。
“鎖置換活性”とは、鋳型（テンプレート）依存性核
酸合成と結びついて又はそれに近接して、生物学的、化
学的又は物理的要因、例えばDNAポリメラーゼが、５′
から３′の方向へ、その相補鎖から対合した核酸の解離
を起こす現象を示す。鎖置換は、対合した核酸配列の
５′末端で開始し、そしてそれ故、酵素は置換部位の
５′において同時に核酸合成を行う。新しく合成された
核酸及び置換された核酸は、一般的に、鋳型核酸鎖に相
補的である同じヌクレオチド配列を有する。鎖置換活性
は、核酸合成、特にDNA合成の活性を与える分子と同一
の分子上におかれることができ、または別個の独立した
活性でありうる。DNAポリメラーゼ、たとえばE.coli D
NAポリメラーゼＩ、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラ
グメント、T7又はT5バクテリオファージDNAポリメラー
ゼ、HIVウイルス逆転酵素は、ポリメラーゼ活性及び鎖
置換活性を有する酵素である。薬剤例えばヘリカーゼ
は、鎖置換効果、すなわち同じ配列の核酸合成と結び付
けられた核酸の置換を生じるために、鎖置換活性を有し
ない誘発剤と共同で用いられ得る。同様に、蛋白質たと
えばE.coli又は他の生物からのRecA又は一本鎖結合蛋白
質が、他の誘発剤と共同して、鎖置換を生じるために又
は促進するために用いられ得る。鎖置換の更なる説明及
び議論は、KORNBERG,A.とBAKER T.A.（1992年、DNA複
製、第２版、第113〜225頁、Freeman,N York）を参照。
RNAポリメラーゼのためのプロモーターは、転写を開
始するのを可能にする配列及び構造を指定する。
例として、転写を開始できる“ループ構造”を挙げる
ことができる（Mol legaard,N.ら、1994年、PNAS、第91
巻、第3892〜3895頁）。
RNAポリメラーゼプロモーターのセンス配列は、その
３′末端が、同一のプロモーターによって定義される転
写開始部位に隣接しているところの二本鎖プロモーター
の配列を示す。
RNAポリメラーゼプロモーターのアンチセンス配列
は、その５′末端が、同一のプロモーターによって定義
される転写開始部位に相補的なヌクレオチドに隣接して
いるところの二本鎖プロモーターの配列を示す。
特定の実施態様に従って、開始物質として用いたポリ
ヌクレオチドは更に、 ａ）該ポリヌクレオチドの該センス配列の全部又は一部
を含む該第二セグメントの５′末端の上流の、第一及び
第二プライマーの内の一つの第一セグメントに相同なセ
グメント 及び／又は ｂ）該ポリヌクレオチドの該アンチセンス配列を含む該
第二セグメントの３′末端の下流の、第一及び第二プラ
イマーの内の一つの第一セグメントとハイブリダイズで
きるセグメント を含む。
直前に示した種々の開始物質が、本発明に従った増幅
反応を引き起こすことは、容易に調べられる。
これらの開始物質は、適当な場合には、ヌクレオチド
合成又は半合成により調製できる。
特定の実施態様においては、開始ポリヌクレオチド
は、生物学的試料より単離されたRNA又はDNAであり得
る。この場合には、標的核酸から始めて、場合により標
的の変性の後に、単一段階において、全ての試薬（プラ
イマー、ポリメラーゼ等）を反応の開始から添加するこ
とにより、上記した増幅反応を得ることができる。この
特定の実施態様は、以下の事実によって特徴づけられ
る：上記した方法で開始物質として用いる該ポリヌクレ
オチドを得るために、増幅されるべき配列を含み、かつ
増幅されるべき該配列の３′末端を超えて、下流領域を
経由して、かつ増幅されるべき該配列の５′末端を超え
て、上流領域を経由して伸長する標的核酸から出発して
工程が実施される。
該核酸は、過剰のヌクレオシドトリホスフェート、及
び DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼ及び鎖置換活性を
有する該系、 及び上記したプライマーを含み、かつ更に、標的の下
流の該領域とハイブリダイズできる７番目のプライマー
及び上流の該領域に相補的な配列とハイブリダイズでき
る８番目のプライマーを含むプライマーのセットと接触
させられる。
本発明の特定の実施態様においては、本発明において
用いるヌクレオチドプライマーの数を制限するために、
第７及び／又は第８のプライマーの配列と同等な第一及
び／又は第二のプライマーの第一セグメントの配列を選
ぶことができる。
本発明はまた、標的核酸を増幅する方法（この方法は
上記した）実行するためのプライマーのセットに関す
る。
プライマーのこのセットは、少なくとも： ａ）その５′末端から３′末端に、順次以下のセグメン
トを含むプライマーA1、 任意の配列の第一の任意的なポリヌクレオチドセグメ
ント、ここで該第一のセグメントは、存在する場合は、
少なくとも５ヌクレオチドを含む、 RNAポリメラーゼのためのプロモーターのセンス配列
の全部又は一部を含むか、又はその３′末端を含む該セ
ンス配列の少なくとも一部を含む第二のセグメント、 及び標的配列とハイブリダイゼーションできる第三の
セグメント、 及び／又は ｂ）以下のいずれかの配列を含むプライマーA2: プライマーA1の第二セグメントの全て又は一部に相同
であり、かつ該RNAポリメラーゼプロモーターのセンス
配列の少なくとも５′部分を含む配列、 または、第一及び第二プライマーの第一セグメントに
一部分に相同であるが、それぞれそれらの５′部分は含
まない配列、 及び／又は ｃ）以下のいずれかの配列を含むプライマーA3: プライマーA2の一部に相同であるが、A2の３′末端ヌ
クレオチドは含むない配列、 又は、A1に存在する上記した第一セグメントの少なく
とも一部に相同な配列、を含む。
特定の実施態様に従って、プライマーのセットは、少
なくとも： ａ）その５′末端から３′末端に、順次以下のセグメン
トを含むプライマーA1、 任意の配列の第一の任意的なポリヌクレオチドセグメ
ント、ここで該第一のセグメントは、存在する場合は、
少なくとも５ヌクレオチドを含む、 RNAポリメラーゼのためのプロモーターのセンス配列
の全部又は一部を含むか、又はその３′末端を含む該セ
ンス配列の少なくとも一部を含む第二のセグメント、 及び標的配列とハイブリダイゼーションできる第三の
セグメント、 ｂ）以下のいずれかの配列を含むプライマーA2: プライマーA1の第二セグメントの全て又は一部に相同
であり、かつ該RNAポリメラーゼプロモーターのセンス
配列の少なくとも５′部分を含む配列、 または、第一及び第二プライマーの第一セグメントの
一部分に相同であるが、それぞれそれらの５′部分は含
まない配列、 及び／又は 以下のいずれかの配列を含むプライマーA3: プライマーA2の一部に相同であるが、A2の３′末端ヌ
クレオチドは含まない配列、 又は、A1に存在する上記した第一セグメントの少なく
とも一部に相同な配列、を含む。
この特定の実施態様の概略を、前もっての変性を当然
要求する二本鎖核酸の場合にて、図３に示した。
図３から明らかなように、標的（Ｉ）にそってプライ
マーＡの伸長生成物が、プライマーＧの伸長生成物によ
って置換され、それによって二本鎖生成物（III）及び
一本鎖DNA（II）の生成が起こる。同様に、標的の他の
鎖（Ｉ′）に沿ってプライマーＢの伸長生成物が、Ｈの
伸長生成物によって置換され、それによって二本鎖生成
物（III′）及び一本鎖DNA（II′）の生成が起こる。
プライマーＡ及びＧの、一本鎖DNA（II′）とのハイ
ブリダイゼーションは、同様に二本鎖DNA生成物
（Ｖ′）及び一本鎖DNA（IV′）の生成を起こす。プラ
イマーＢの一本鎖DNA（IV′）とのハイブリダイゼーシ
ョンは、二本鎖DNA生成物（VI）を生じ、該生成物は、
その鎖のそれぞれの上に、RNAポリメラーゼプロモータ
ーのセンス配列（又はプライマーＡ及びプライマーＢの
それぞれに存在するセンス配列の部分）を有する。
同様のハイブリダイゼーション、伸長、置換によっ
て、一本鎖DNA生成物（II）が同じ二本鎖DNA生成物（I
V）を生じることが容易に判りうる。
更に、二本鎖生成物（Ｖ）は、もしそれがRNAポリメ
ラーゼプロモーターの完全な配列を含んでいれば、Ｂ及
びＨとハイブリダイゼーションできる一本鎖RNA転写生
成物を与え、そしてこれらのプライマーの逆転写酵素に
よる、置換を伴う伸長は、一本鎖DNAの生成を生じ、そ
のために、Ａとのハイブリダイゼーション及び続く伸長
によって、二本鎖DNA生成物（VI）を得ることをまた可
能にするということを検定するが容易である。二本鎖DN
A（Ｖ′）から始まる類似の反応はまた、二本鎖DNA生成
物（VI）を生じる。図３において、第７及び第８のプラ
イマーＧ及びＨの使用が、二本鎖DNA生成物（VI）を生
じ、該生成物は、確かに、上記した一般的方法において
開始物質として用いることができるポリヌクレオチドで
ある。
本発明の特定の実施態様において、一本鎖核酸フラグ
メントの存在下、第一プライマー“A"（５′から３′に
向かって、順次、任意の配列、引き続くRNAポリメラー
ゼプロモーター又は配列の全て又は一部に対応する配
列、次いで標的に相補的な配列からなる）は、その標的
配列（Ｉ）とハイブリダイズする（図３）。DNAポリメ
ラーゼの存在下、ヌクレオチドが、標的配列（Ｉ）の全
体長さにそってこのプライマーの３′末端に加えられ
る。伸長生成物は、鎖置換によって標的核酸鎖から分離
され、次いで、プライマーＡの上流にハイブリダイズし
たプライマー“G"の伸長がおこり、それが二本鎖生成物
（III）及び一本鎖DNA（II）の生成を結果する。第二の
プライマー“B"（５′から３′に向かって、順次、任意
の配列、引き続くRNAポリメラーゼプロモーターの配列
の全て又は一部に対応する配列、次いで標的核酸配列か
らなる）は、新たに合成されそして媒体中に放たれた伸
長生成物（III）の３′末端においてハイブリダイズす
る。DNAポリメラーゼの存在下、ヌクレオチドは、新た
に合成された鎖の配列全体に沿って、このプライマーの
３′末端に付加される。この第二の新たに合成された鎖
は、鎖置換によって第一の鎖から分離され、次いでプラ
イマーＢの上流で標的とハイブリダイズされたプライマ
ー“H"の伸長がおこる。この第一のプライマーＡは、次
いで、この第二の放たれた鎖とハイブリダイズでき、ポ
リメラーゼ及びデオキシリボヌクレオシドトリホスフェ
ート（dNTP）の存在下で伸長されうる。それから得られ
た所定サイズの二本鎖反応生成物（VI）は、すると、そ
の末端において、任意の配列により５′側で先行されて
いる機能的RNAポリメラーゼプロモーター配列を含む
（図３）。
得られた生成物VIは、記載した増幅のための開始物質
である（図５）。
次いで、RNAポリメラーゼは、リボヌクレオシドトリ
ホスフェート（rNTP）の存在下、そのセンス配列がＡに
含まれるところのプロモーターを用いて転写する。それ
故、RNA（VII）は、その３′末端に、プライマーＢに相
補的な配列を含む（図５）。それぞれの転写されたRNA
は、その３′末端において、プライマーＢの任意の配列
の全て又は一部を含む配列をその３′末端に有するプラ
イマー“C"と、そしてＣの下流で、Ｂに含まれるプロモ
ーターのセンス配列の全て又は一部をその３′末端に有
するプライマー“D"と同時的にハイブリダイズする。RN
A依存DNAポリメラーゼは、dNTPの存在下、プライマーＣ
の３′末端を伸長し、そして同時にプライマーＤの伸長
から得られる上流の鎖を置換する。このことは、Ａのプ
ロモーターから転写されたRNAに相補的でかつその５′
末端にＢのプロモーターの配列を含む一本鎖DNA（VII
I）の、媒体中への放出を生じる。次いで、この鎖の
３′末端は、プライマーＡとハイブリダイズできる。DN
Aポリメラーゼは、DNA鎖にそってプライマーＡの３′末
端を、そしてプライマーＡに沿ってDNAの３′末端を伸
長する。次いで、所定サイズの得られる二本鎖反応生成
物（Ｘ）は、その一端に、Ｂに含まれる機能的RNAポリ
メラーゼプロモーター配列を、そして他の一端に、Ａに
含まれる機能的RNAポリメラーゼプロモーター配列を含
み、任意の配列が５′側で先行している。次いでRNAポ
リメラーゼは、rNTPの存在下、Ｂのプロモーターから転
写し、それ故、RNA（VII bis）は、その３′末端にプラ
イマーＡに相補的な配列を含む。
同様に、ついで、RNAポリメラーゼは、rNTPの存在
下、所定の配列により５′で先行されている機能的RNA
ポリメラーゼプロモーター配列を各端に有する所定のサ
イズの二本鎖核酸フラグメント（VI）の一本の鎖に含ま
れるＢに含まれるプロモーターから転写する。それ故、
RNA（VII bis）は、その３′末端にプライマーＡに相補
的な配列を有する（図５）。各転写されたRNAの３′末
端は、その３′末端にプライマーＡの“上流”配列の全
て又は一部を含む配列を有するプライマー“E"と、そし
てその３′末端にプライマーＡの配列の全て又は一部を
有するプライマー“F"と同時的にハイブリダイズする。
プロモーター配列Ｅ及びＦは、プライマーＦがＥの下流
に（即ち３′側に）ハイブリダイズするように選ばれ
る。RNA依存性DNAポリメラーゼは、dNTPの存在下、プラ
イマーＥの３′末端を伸長し、そして同時に、プライマ
ーＦの伸長から得られる下流の鎖を置換する。このこと
は、Ｂのプロモーターから転写されたRNAに相補的であ
りかつその５′末端にＡのプロモーター配列を含む一本
鎖DNA（VIII bis）の、媒体中への放出を生じる。つい
で、この鎖は、その３′末端において、プライマーＢと
ハイブリダイズできる。DNAポリメラーゼは、DNA鎖（VI
II bis）にそってプライマーＢの３′末端を、そしてプ
ライマーＢにそってDNA鎖（VIII bis）の３′末端を伸
長する。ついで、所定のサイズの得られる二本鎖反応生
成物（Ｘbis）は、一端に、Ａに含まれる機能的RNAポリ
メラーゼプロモーター配列を、そして他の一端に、Ｂに
含まれる機能的RNAポリメラーゼプロモーター配列を含
み、それらは所定の任意の配列により５′側で先行され
ている。ついで、RNAポリメラーゼは、rNTPの存在下、
Ａのプロモーターから転写する。それ故、RNA（VII）
は、それらの３′末端に、プライマーＢに相補的な配列
を含む。
それらの３′末端に、プライマーＢに相補的な配列を
含むRNA（VII）は、その各端にＡのプロモーターからの
機能的RNAポリメラーゼプロモーター配列（これは所定
の任意の配列により５′側で先行されている）を含む所
定のサイズの二本鎖核酸フラグメント（VI）を含む鋳型
から転写されたものと同一である。それ故、それらはプ
ライマーＣおよびＤを、ハイブリダイゼーションにより
結合し、上記反応サイクルは連続する。
同様に、それらの３′末端にプライマーＡに相補的な
配列を含むRNA（VII bis）は、その各端に“B"のプロモ
ーターからの機能的RNAポリメラーゼプロモーター配列
（これは、所定の任意の配列により５′側で先行されて
いる）を含む所定のサイズの二本鎖核酸フラグメント
（VI）を含む鋳型から転写されたものと同一である。そ
れ故、それらはプライマーＥおよびＦを、ハイブリダイ
ゼーションにより結合し、上記反応サイクルは連続す
る。
このことは、プライマーＡ及びＢの第二セグメントの
間の標的の指数的増幅をもたらし、増幅された標的に対
応する二本鎖DNA及び／又はRNAの蓄積を生じる。
本発明に記載された方法は、等温工程であり、たった
二つの酵素を使用でき、RNA及びDNAの双方を生成し、何
らの所定の末端なしで標的RNA及びDNAから行うことがで
き、標的配列の性質によって限定されず、かつ二重とな
った鎖の分離のための（リボ）ヌクレアーゼ活性を要求
しないという利点を有する。さらに、用いたポリメラー
ゼによる、増幅生成物中への修飾されたヌクレオチドの
取り込みは伴われない。
本発明はまた、上記方法を行うためのキットであっ
て、上記で定義したプライマーA1、A2、A3のセット、及
び ａ）その５′末端から３′末端に向かって、順次以下の
セグメントを含むプライマーB1、 任意の配列の第一の任意的なポリヌクレオチドセグメ
ント（該第一のセグメントは、存在する場合は、少なく
とも５ヌクレオチドを含む） RNAポリメラーゼのためのプロモーターのセンス配列
の全部又は一部を含むか、又はその３′末端を含む該セ
ンス配列の少なくとも一部を含む第二のセグメント、 及び標的上であって、プライマーA1がハイブリダイズ
できるところの配列の上流に位置する標的配列に相補的
なヌクレオチド配列とハイブリダイズできる第三のセグ
メント、 及び／又は ｂ）以下のいずれかの配列を含むプライマーB2: プライマーB1の第二セグメントの全て又は一部に相同
であり、かつ該RNAポリメラーゼプロモーターのセンス
配列の少なくとも５′部分を含む配列、 または、第一及び第二プライマーの第一セグメントの
一部分に相同であるが、それぞれそれらの５′部分は含
まない配列、 及び／又は ｃ）以下のいずれかの配列を含むプライマーB3: プライマーB2の一部に相同であるが、B2の３′末端ヌ
クレオチドは含まない配列、 又は、B1に存在する上記した第一セグメントの少なく
とも一部に相同な配列、 を含む少なくとも一つの第二のプライマーセットを含む
ことを特徴とするキットに関し、該キットは、場合によ
りさらに、上記で定義した第七及び第八のプライマーを
含む。
本発明に従ったキットの特定の実施態様に従って、プ
ライマーの第二のセットは、 ａ）その５′末端から３′末端に向かって、順次以下の
セグメントを含むプライマーB1、 任意の配列の第一の任意的なポリヌクレオチドセグメ
ント（該第一のセグメントは、存在する場合は、少なく
とも５ヌクレオチドを含む） RNAポリメラーゼのためのプロモーターのセンス配列
の全部又は一部を含むか、又はその３′末端を含む該セ
ンス配列の少なくとも一部を含む第二のセグメント、 及び標的上であって、プライマーA1がハイブリダイズ
できるところの配列の上流に位置する標的配列に相補的
なヌクレオチド配列とハイブリダイズできる第三のセグ
メント、 及び／又は ｂ）以下のいずれかの配列を含むプライマーB2: プライマーB1の第二セグメントの全て又は一部に相同
であり、かつ該RNAポリメラーゼプロモーターのセンス
配列の少なくとも５′部分を含む配列、 または、第一及び第二プライマーの第一セグメントの
一部分に相同であるが、それぞれそれらの５′部分は含
まない配列、 及び／又は ｃ）以下のいずれかの配列を含むプライマーB3: プライマーB2の一部に相同であるが、B2の３′末端ヌ
クレオチドは含まない配列、 又は、B1に存在する上記した第一セグメントの少なく
とも一部に相同な配列を含み、該キットは、場合により
さらに、上記で定義した第七及び第八のプライマーを含
む。
本発明において、分析されるべき試料は、標的核酸配
列を含むと思われる任意の開始物質から単離されうる。
動物、特に哺乳動物にとっては、これらの物質の起源
は、血液、骨髄、リンパ液、硬い組織（肝臓、脾臓、腎
臓、肺、卵巣等）、唾液、スミア（smear）、便、尿で
ありうる。開始物質のための他の起源は、植物、土壌試
料、食品生成物、並びに生物を含むと思われる他の起源
でありうる。
これらの開始物質からの核酸の単離は、種々の方法で
行われうる。これらの方法は、ライゼートを生じる界面
活性剤の使用、酵素（たとえば、リゾチーム、プロテイ
ナーゼＫ）の使用、超音波処理、ビーズの存在下での機
械的攪拌、またはフレンチプレスの使用を含む。いくつ
かの場合には、混入物たとえばヌクレアーゼを除くため
に、抽出された核酸を精製することが必要である。この
場合には、核酸の精製は、フェノール−クロロホルム抽
出、クロマトグラフィー、イオン交換、電気泳動、平衡
遠心分離により、また固体支持体上でのハイブリダイゼ
ーションによる捕獲により行われうる。
核酸は分離されるとすぐに、サイズが10キロベース未
満のフラグメントを得るために、たとえば超音波処理に
より、それらのいくつかの簡単なフラグメント化が行わ
れうる。このことは、特に二本鎖核酸の場合に、開始の
変性を容易にすることを可能とする。
上記の方法において用いられるプライマーは、５〜10
0ヌクレオチドの長さを有する。例えば、プライマーＡ
及びＢの長さは、一般的に30〜100ヌクレオチド、好ま
しくは40〜70ヌクレオチドである。一方、プライマー
Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨは、５〜50ヌクレオチド、好
ましくは10〜35ヌクレオチドである。プライマーＡ及び
Ｂは、それぞれ、それらの３′末端において、標的配列
（ここでは、一本鎖と仮定する）に実質的に相同又は相
補的であるべきであり、それによって、ドラスティック
な或いは高度に差別化条件下で、標的またはその相補鎖
の特定の部位とのハイブリダイゼーションが起こりう
る。プライマーＡ及びＢは、その５′末端に、少なくと
も５ヌクレオチドの長さの所定の任意の配列を含みう
る。この配列は、場合により、Ａ及びＢで共通であって
もよいが、同様に異なっていてもよい。該所定の配列
は、任意の手段によって選べれうるが、ただし、それは
標的との著しい相同性を含まず、かつプライマー内での
二次構造（例えば、ステム−ループまたは二重螺旋）の
形成も、ＡとＢの間のダイマーの形成も起こさない。こ
の所定の配列の下流において（即ち、３′に向かっ
て）、プライマーＡ及びＢは、その相補性によって、RN
Aポリメラーゼを結合し、RNAの転写を開始する能力を有
する配列のセンス配列を含むべきである。これらのいわ
ゆる“プロモーター”配列（或いは、“プロモーター”
のセンス又はアンチセンスと呼ばれる）は、例えば、フ
ァージRNAポリメラーゼプロモーター配列（例えば、バ
クテリオファージT7、T3及びSP6）である。T7ファージR
NAポリメラーゼは、効率的なRNAの転写のためには、DNA
上に特定のプロモーター配列の存在をを要求することが
知られている。この特定のプロモーター配列は、完全に
特徴づけられており（DunnとStudier、1993年、J.Mol.B
iol.第166巻、第477〜535頁）、そしてそのプロモータ
ーからのT7RNAポリメラーゼ転写の高い特異性が示され
ている（Baileyら、1983年、Proc.Natl.Acad Sci.第80
巻、第2814〜2818頁）。これらの特性は、機能的な二本
鎖プロモーターを含む鋳型から、インビトロでRNAを製
造するために用いられうる（KruppとSoll、1987年、FEB
S Lett.第２巻、第271〜275頁）。同様に、RNAは、二本
鎖プロモーター含む合成オリゴヌクレオチドの鋳型か
ら、T7RNAポリメラーゼを用いて、インビトロで転写さ
れうる（Milliganら、1987年、Nucl.Acids Res.第15
巻、第8783〜8798頁）。Kruppによる文献（1988年、Gen
e、第72巻、第75〜89頁）は、ファージRNAポリメラーゼ
を用いた方法及びインビトロでのRNA合成のための有用
な計画についての優れた総論である。用いられるプロモ
ーター配列はまた、真核生物のRNAポリメラーゼ、例え
ばRNAポリメラーゼIII（Sharpら、1985年、Crit.Rev.Bi
ochem.、第19巻、第107〜144頁）のためのプロモーター
配列であり得る。
本発明のいくつかのプリイマーは、相同な配列を含
む。種々のプライマーの相対濃度を調節することは、サ
イクルを良好に働かせるために、特定のハイブリダイゼ
ーションを促進することを可能とする。
本発明の方法においては、標的核酸フラグメントが得
られるとすぐに、適当な場合には、それらは変性されて
一本鎖にされて、プライマーＡ及びＧのハイブリダイゼ
ーションを許し、そして開始の核酸が二本鎖の場合に
は、Ｂ及びＨのハイブリダイゼーションを許す（或い
は、逆）。約95℃まで温度を上げることは変性のために
は好ましい。しかし、鎖の分離はまた、pHを増加させ、
そしてついでプライマーが標的とハイブリダイズするの
を許すために媒体を中和することにより行われ得る。標
的核酸を変性する前又は後に、過剰のデオキシリボヌク
レオシドトリホスフェート及びリボヌクレオシドトリホ
スフェート、RNAポリメラーゼ及びDNAポリメラーゼを含
む反応混合物が加えられる。標的核酸の変性のために温
度の上昇が用いられる場合は、温度安定性酵素を用いな
い限りは、変性後に酵素を添加するのが好ましい。本発
明に従った増幅反応を行うために必要な反応混合物はま
た、ポリオール、たとえはグリセロール、ソルビトー
ル、ポリエチレングリコール又は変性剤及び／又は溶
媒、たとえばジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキ
シド（DMSO）を含みうる。これらの試薬は、バックグラ
ンドノイズを生じうる非特異的なハイブリダイゼーショ
ン反応を減少することを可能とする。
本発明の方法において用いられるポリメラーゼは、鎖
置換活性を欠いているのが好ましい。この活性は、ある
種のポリメラーゼのよく知られた特性である（Sambrook
ら、1989年、Molecular Cloning:A Laboratory Manua
l、第２版、第5.33〜5.35頁、Cold Spring Harbor Labo
ratory、Cold Spring Harbor）。DNAポリメラーゼの特
性、及び特にそれらのいくつかの鎖置換活性は、Konber
gとBakerによって詳説されている（1992年、DNA Replic
ation、第２版、第113〜225頁、Freeman,New York）。
鎖置換活性は、はじめ、大腸菌のDNAポリメラーゼＩの
クレノウフラグメントにおいて示され（MasamuneとRich
ardson、1971年、J.Biol.Chem.、第246巻、第2692〜270
1頁）、それは、この酵素に、二本鎖DNA中の切断の３′
OH末端から核酸の複製を開始する能力を与える。この鎖
置換特性は、DNAポリメラーゼが５′−３′エキソヌク
レアーゼ活性を有する場合に限られる（LundquistとOli
vera、1982年、Cell,第31巻、第53〜60頁）。この鎖置
換活性はまた、熱安定性DNAポリメラーゼ、例えばTli
DNAポリメラーゼにおいても示されている（Kongら、199
3年、J.Biol.Chem.第268巻、第1965〜1975頁）。この場
合には、この酵素の変異した形ものは、５′−３′エキ
ソヌクレアーゼ活性を有さず、より大きい鎖置換能を有
することが知られている。鎖置換は、全てのDNAポリメ
ラーゼに共通の特性ではない。なぜならそれらのうちの
いくつか、例えばT4DNAポリメラーゼは、それ自身で
は、鎖置換を行うことができない。鎖置換活性はまた、
T7DNAポリメラーゼ（Lechnerら、1983年、J.Biol.Chem.
第258巻、第11174〜11184頁）及びHIV逆転写酵素（Hube
rら、1989年、J.Biol.Chem.、第264巻、第4669〜4678
頁）においても示されている。鎖置換能力、及び特に二
本鎖DNA中の切断の３′OH末端から（５′から３′方向
へと）重合を開始する能力を有するDNAポリメラーゼ
（図１）は、本発明の増幅反応を行うのに有用である。
好ましくは、５′−３′エキソヌクレアーゼ活性を欠い
ているDNAポリメラーゼが増幅サイクルを行うために用
いてられる。なぜなら、鎖置換活性の効率が、この活性
を欠いている酵素でより大きいからである。大腸菌のDN
AポリメラーゼＩのクレノウフラグメントは、５′−
３′エキソヌクレアーゼ活性を欠いているポリメラーゼ
の一例である。同様のポリメラーゼ、たとえばT4DNAポ
リメラーゼ、T7DNAポリメラーゼ又はシークエナーゼ（U
S Biochemical）、T5DNAポリメラーゼ又はPhi29DNAポ
リメラーゼもまた用いられうる。しかしながら、本発明
はまた、５′−３′エキソヌクレアーゼ活性が増幅方法
を実行するのを妨げない場合には、５′−３′エキソヌ
クレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼの使用を含
む。この場合には、増幅反応の収率は、用いられる反応
条件下で、DNAポリメラーゼの５′−３′エキソヌクレ
アーゼ活性を特異的に阻害することによって、増加させ
られ得る。
本発明の増幅方法は、転写されたRNAをcDNAへと、再
コピーするために、逆転写段階を要求する。この段階
は、特に、一般に市販されている、AMV（Avian Myelobl
astosis Virus）又はMMLV（Moloney Murine Leukemia V
irus）タイプの逆転写酵素を用いて行われうる。RNA及
び／又はDNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する他の酵
素もまた、本発明で用いられ得る。ただし、それは、鎖
置換活性を有すること。反対の場合には、鎖置換活性
は、指示試薬、ヘリカーゼまたはRec Ａタイプ活性に
よって与えられ得る。特に一本鎖DNA再会合のプロセス
においての、鎖捕獲または鎖同化のRec Ａ特性は、The
Enzymes、第14巻、第445〜470頁において、Mc ENTEEと
WEINSTOCKによって詳説されている。逆転写段階は、た
とえば、大腸菌DNAポリメラーゼＩを用いて行われう
る。なぜなら、この酵素はまたRNA依存性DNAポリメラー
ゼ活性を有していることが示されたからである（Ricche
ttiとBuc.、1993頁、EMBO第12巻、第387〜396頁）。本
発明はまた、この目的のために、熱安定性RAN及び／又
はDNA依存性DNAポリメラーゼ例えばTaqポリメラーゼ又
はTthポリメラーゼを用いることができる（熱安定性DNA
ポリメラーゼの特性に関する総論のためには、Rolfら、
1992年、PCR:Clinical Diagnostics and Research、第2
24〜258頁、Springer−Verlag,Heidelbergを参照）。
DNAポリメラーゼの鎖置換特性、又は他の関連する誘
導剤の使用の結果として、本発明はヌクレアーゼ活性、
即ちエンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ又はリボ
ヌクレアーゼ活性を要求しない。特に、本発明は、上記
した種々の他の増幅技術に共通し、かつ、ある種の逆転
写酵素により与えられ、大腸菌RNase Hの添加により補
われなければならないRNase H活性の使用を要しない。
本発明の方法においては、RNA−及びDNA−依存性DNAポ
リメラーゼとして、MMLV逆転写酵素を用いることがで
き、それはAMVのそれよりも低いRNase Ｈ活性を有する
（Sambrookら、1989年、Molecular Cloning:A Laborato
ry Manual、第２版、第5.52〜5.55、8.11、8.17頁、Col
d Spring Habor Laboratory,Cold Spring Habor）。RNa
se Ｈ活性を欠いている形のMMLV逆転写酵素の形は、本
発明において用いられ得る。MMLV逆転写酵素のRNase
Ｈ活性は、たしかに、この酵素の構造遺伝子の一部を欠
損することにより抑えられることができ（Kotewiczら、
1988年、Nucl.Acids Res.、第16巻、第265〜277頁）、
野生型MMLV逆転写酵素と比較して高められたポリメラー
ゼ効率をもたらし、それは、“Superscript"の名前で市
販されている（Gerardら、1989年、Focus、第11巻、第6
6〜69）。逆転写酵素のRNase Ｈ活性もまた、このポリ
メラーゼ活性を与える遺伝子の部分において点変異を起
こすことにより抑えられることができ（Gerardら、1992
年、Focus、第14巻、第91〜93頁）、増加した効率及びS
uperscriptよりも大きなDNA重合レベルを有する酵素を
もたらす。この酵素はまた、“Superscript II"（GIBCO
−BRL）の名前で市販されている。他の形態のものは、
“StrataScript"（STRATAGENE）という名前で市販され
ているものである。
種々の増幅方法とは反対に、本発明は、合成された鎖
を鋳型から分離するための温度サイクルを要求しない。
この方法においては、適当な場合には、標的の初めの変
性が行われるとすぐに、単一の温度を用いることができ
る。温度は、プライマーの標的との特異的なハイブリダ
イゼーションを許す差別化ハイブリダイゼーション条件
を定義すべく十分に高くすべきである。この温度は、た
とえば、慣用の酵素試薬で、37℃〜45℃であり、もし熱
安定性酵素が用いられる場合にはもっと高くてもよい。
図３及び図５は、置換を用いた転写反応による増幅法
を記載してある。図３は、増幅法の可能な導入ルートを
記してあり、図５は増幅サイクルそのものである。
標的核酸（ホモ又はヘテロ二本鎖、単一又は二本鎖DN
A又はRNA）の初めの変性の後に、プライマーＡ、Ｂ、Ｇ
及びＨをそれぞれの核酸鎖とハイブリダイズさせる（図
３）。過剰のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェー
ト及びDNAポリメラーゼ〔RNA及び／又はDNA依存性（標
的がDNAかRNAかに依存する）〕の存在下での、これらの
プライマー同時伸長は、Ｇ由来の鎖を伸長することによ
り、Ａの伸長から得られたDNA鎖の置換が起こり、そし
てＨ由来の鎖の伸長によって、Ｂの伸長により得られた
鎖の置換が起こる。一方でプライマーＡの伸長により、
他方でのプライマーＢの伸長により得られる一般鎖DNA
は、それぞれ、プライマーＢとＨ、及びＡとＧとハイブ
リダイズできる。Ｇの伸長は、プライマーＡから伸長し
ている鎖の置換を起こし、そしてＨの伸長は、プライマ
ーＢから伸長している鎖の置換を起こす。このようにし
て、放たれた所定の長さの２つの鎖は、完全に相補的で
あり、互いにハイブリダイズできるか又はプライマーＢ
（Ａの伸長に対応する鎖）又はＡ（Ｂの伸長に対応する
鎖）とハイブリダイズできる。これらの短いプライマー
のハイブリダイゼーションは、熱力学の点からさらに有
利である。従って、それぞれの鎖上でのＡ及びＢの伸長
は、プライマーＡ及びＢの第２のフラグメント間の標的
配列に対応し、かつ、RNAポリメラーゼプロモーターが
下流に続く所定の配列により各末端においてフランキン
グされているところの所定の長さの二本鎖核酸フラグメ
ントを生じる。
上記した導入ルート（図３）はまた、固定支持体上に
ついたプローブによって捕獲された標的を用いて達成さ
れうる。このプローブは、仏国特許第9109057号公報及
び国際公開 WO91/19812号公報に記載されているごと
く、共有結合的に又は受動的に固定化されうる。このプ
ローブの固定はまた、（コ）ポリマー、特にＮ−ビニル
ピロリジンコポリマーを用いて行われることができ、プ
ローブは、複合体を形成することにより、該ポリマーに
連結する。該複合体は、受動的な吸着により固体支持体
上に固定化される。特に、プライマーＡ及び／又はＢ、
又はＧ及び／又はＨは固体支持体上につけられうる。た
だし、この付着は、プライマーの３′未満を介して行わ
れてはならず、従ってこれらのプライマーの３′末端
は、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの存在
下でDNAポリメラーゼによって伸長できる。特に一方で
プライマーＡ及びＧ、他方でプライマーＢ及びＨの全て
又は一部が、任意の連結腕（たとえば、炭化水素又はヌ
クレオチド）及びそれらの５′末端からのこれによって
互いに連結されているのが有利でありうる。このこと
は、本発明の増幅反応において、一方でＧに対するＡの
比率、他方でＨに対するＢの比率を制御しかつ平衡にす
ることを可能とする。
このようにして得られた二本鎖鋳型は、過剰のリボヌ
クレオシドトリホスフェート及び各プロモーターに対応
するRNAポリメラーゼの存在下、標的配列にフランキン
グする各プロモーター（図５）からRNAを転写すること
を可能とする。本発明の増幅方法を単純化するために、
このプロモーター配列は、ファージRNAポリメラーゼの
プロモーターの配列でありうり、該プロモーター配列
は、プライマーＡ及びＢにおいて同じである（例えば、
T7ファージRNAポリメラーゼのプロモーターのコンセン
サス）。プライマーＡ及びＢが、同じプロモーター配列
を含む場合には、単一のRNAポリメラーゼが増幅反応に
おいて用いられ得る。
Ａに含まれるプロモーターから転写されたRNAは、ヌ
クレオチドプライマーＣ及びＤにくっつきうる。これら
のプライマーは、Ｂの一部に十分に相同であり、反応条
件下で、Ａのプロモーター相から転写されたRNAにハイ
ブリダイズできる。これらのプライマーＣ及びＤは近接
してもよい（即ち、少なくとも一つのヌクレオチドのギ
ャップによって標的が分かれている）、又は隣接しうる
（即ちそれらがハイブリダイズされたときに、それらの
３′及び５′末端が並列させられる）。プライマーＣ及
びＤはまた、オーバーラップしうる。即ち、プライマー
Ｃの３′末端がプライマーＤの５′末端と相同な配列を
有する。プライマーがオーバーラップする場合には、プ
ライマーＣの３′末端は、プライマーＤの５′末端に十
分に相同でありうる。ただし、Ｃ及びＤの間の競合ハイ
ブリダイゼーションは、Ｃの３′末端のハイブリダイゼ
ーションが有利に起こる。図７は、プライマーＣ及びＤ
がオーバーラップしているところの、本発明の特定の場
合を記載している。この場合には、プライマーＣ（Ｃbi
sと呼ぶ）は、プライマーＤの５′末端と同じヌクレオ
チド配列を有する。プライマーＣが、特にその３′末端
にて、有利に起こる競合ハイブリダイゼーションを促進
するために、RNAとのハイブリダイゼーションが、プラ
イマーＤのハイブリダイゼーションによって生じる安定
性よりも安定性が大きい二本鎖を生じるところの塩基同
族体又は修飾されたヌクレオチドを含みうる。これらの
修飾されたヌクレオチドはまた、ヌクレオチド間の結合
（たとえば、ホスホロチオエート、Ｈ−ホスホネート、
アルキルホスホネート結合）レベルで、骨格、例えばア
ルファ−オリゴヌクレオチド（仏国特許第2607507号公
報）又はPNA（Egholmら、1992年、J.Am.Chem.Soc.、第1
14巻、第1895〜1897頁）レベルで修飾されたものを含
む。しかしながら、一般に、Ｃのハイブリダイゼーショ
ンがＤの３′末端のハイブリダイゼーションを妨げない
ところの条件を確立することが必要である。Ｃ及びＤが
オーバーラップする場合には、Ｃの３′末端がＤのそれ
に対してあまりにも近くにハイブリダイズされることを
避けることが有利である。５ヌクレオチドのギャップ
は、ＣがＤのハイブリダイゼーションを妨げるのを避け
るための好ましい安全な余地を構成する。Ｄの後の伸長
が、RNAポリメラーゼを付着できかつ転写の開始を導き
うるプロモーターの再構成を許すと仮定すると、プライ
マーＤは、（特にプライマーＢ中に含まれた）プロモー
ターのセンス配列の５′末端を含むのが好ましい。プラ
イマーＣ及びＤの長さは、５〜100ヌクレオチドである
ことができ、かつ標的配列の一部を含むことができる
が、プライマーＡ及びＢの間の標的領域の長さを越えな
い。
特にRNA依存性活性を有するDNAポリメラーゼ及び過剰
のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの存在下
での、RNA鋳型上でのプライマーＣ及びＤの同時の伸長
は、Ｄから由来した鎖の置換を生じる。このようにして
放たれたDNA鎖は、プライマーＡとハイブリダイズでき
る。ついで、DNAポリメラーゼ（特に、DNA及び／又はRN
A依存性活性を含む）は、DNA鎖上でＡの３′末端及びプ
ライマーＡ上でDNA鎖の３′末端を伸長する。このよう
にして得られた所定のサイズの二本鎖DNAは、プライマ
ーＢの機能的プロモーター、並びにプライマーＡの機能
的プロモーターを有し、該プロモーターはこの側で任意
の配列により先行される。
このようにして得られた二本鎖鋳型は、過剰のリボヌ
クレオシドトリホスフェート及び各プロモーターに対応
するRNAポリメラーゼの存在下、所定のサイズのこのフ
ラグメントの末端に位置している各プロモーターからの
RNAの転写を可能とする。ついで、Ｂのプロモーターか
ら転写されたRNAは、プライマーＥ及びＦとハイブリダ
イズできる。
ヌクレオチドプライマーＥ及びＦは、反応条件下で、
Ｂのプロモーターから転写されたRNAにハイブリダイズ
できるべく、Ａの部分に十分に相同である。Ｃ及びＤと
同様に、プライマーＥ及びＦは、近接或いは隣接、又は
オーバーラップしてもよい。プライマーがオーバーラッ
プする場合には、プライマーＥの３′末端は、プライマ
ーＦの５′末端と十分に相同でありうるが、ただし、Ｅ
及びＦの間の競合ハイブリダイゼーションはＥの末端で
ハイブリダイゼーションが有利である。競合ハイブリダ
イゼーションがプライマーＥの末端が有利であることを
促進するために、プライマーＥは、Ｃ同様、RNAとのそ
のハイブリダイゼーションが、プライマーＦのハイブリ
ダイゼーションによって作られる安定性よりもより大き
く安定である二本鎖を生じるところの塩基同族体又は修
飾されたヌクレオチドを含みうる。しかしながら、Ｅの
ハイブリダイゼーションが、Ｆの３′末端のハイブリダ
イゼーションを妨げないところの条件を確立することが
必要である。Ｅ及びＦがオーバーラップする場合には、
Ｅの３′末端がＦのそれに対してあまりにも近くにハイ
ブリダイズされることを避けることが有利である。５ヌ
クレオチドのギャップは、好ましい安全な余地を構成す
る。この最小配列が、RNAポリメラーゼの後の付着及び
転写の開始を許すと仮定すると、プライマーＦの５′末
端は、プライマーＡ中に含まれるプロモーターの最小配
列を含むことが必須である。プライマーＥ及びＦの長さ
は、５〜100ヌクレオチドであってよく、かつ標的配列
の一部を含みうるが、プライマーＡ及びＢの間の標的領
域の長さを越えない。
特にRNA依存性活性を有するDNAポリメラーゼ及び過剰
のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの存在下
での、RNA鋳型上でのプライマーＥ及びＦの同時の伸長
は、Ｆから由来した鎖の置換を生じる。このようにして
放たれたDNA鎖は、プライマーＢとハイブリダイズでき
る。ついで、DNAポリメラーゼ（特に、DNA及び／又はRN
A依存性活性を含む）は、DNA鎖上でＢの３′末端及びプ
ライマーＢ上でDNA鎖の３′末端を伸長できる。従っ
て、このようにして得られた所定のサイズの二本鎖DNA
は、プライマーＡの機能的プロモーター、並びにプライ
マーＢの機能的プロモーターを有し、プライマーＢの機
能的プロモーターは任意の配列により先行される。
このようにして得られた二本鎖鋳型は、過剰のリボヌ
クレオシドトリホスフェート及び各プロモーターに対応
するRNAポリメラーゼの存在下、所定のサイズのこのフ
ラグメントの末端に位置している各プロモーターからの
RNAの転写を可能とする。ついで、Ａのプロモーターか
ら転写されたRNAは、プライマーＣ及びＤとハイブリダ
イズできる。ついで、Ｃ及びＤの伸長から生じるサイク
ルは、上記したように再び開始できる。
図４及び図６は、“置換を用いた転写反応”による増
幅法の特定のケースを記載しているが、そこでは、プラ
イマーＡ及びＢは、図３及び図５に記載された一般的方
法のプライマーＡ及びＢとは異なる。
実際、プライマーＡ及びＢは、所定の任意の配列、及
び標的配列に相補的な或いは相同な配列に加えて、RNA
ポリメラーゼのためのプロモーターのセンス配列の一部
のみを含む（この一部は、プロモーターのこのセンス配
列の３′末端を含み、そして、二本鎖の形態では、機能
的プロモーターの形成を生じない、即ちRNAポリメラー
ゼによって転写の開始を促進することができない）。
プライマーＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨは、一般的方法
において上記したものとおなじである。特に、プライマ
ーＦ及びＤは、プロモーターセンス配列の全て又は一部
を含む。
図４は、図６によって記載された増幅サイクルの導入
ルートに続くように記載してある。図３の記載と同様、
プライマーＡ及びＧは、変性された又は一本鎖の標的と
ハイブリダイズし、そして場合により、もし標的が二本
鎖であれば、Ｂ及びＨも同様である。同じ酵素が、上記
した反応媒体に対して加えられる。DNAポリメラーゼに
よるこれらのプライマーの同時伸長は、それぞれＧ又は
Ｈから由来した鎖を伸長することによって、Ａ又はＢの
伸長から得られたDNA鎖の置換を生じる。ついで、得ら
れた一本鎖DNAは、それぞれ、プライマーＢ及びＨ、ま
たはＡ及びＧとハイブリダイズできる。Ｇ又はＨの伸長
は、それぞれ、Ａ又はＢの伸長生成物の置換を生じる。
このようにして生成された所定の長さの２つの一本鎖DN
Aは、不完全なセンスプロモーター配列を有しており、
それぞれ、プライマーＤ及びＣ、又はＦ及びＥとハイブ
リダイズできる。Ｃ又はＥの伸長生成物は、それぞれ、
Ｅ又はＦの伸長生成物を置換し、それぞれ所定の長さの
一本鎖DNAを生じ、そしてプライマーＤ又はＦから得ら
れた完全なプロモーターセンス配列を有する。これらの
DNA鎖は、それぞれ、プライマーＡ又はＢとハイブリダ
イズでき、それらの各伸長は、標的配列に対応する、一
方の末端に完全なかつ機能的なRNAポリメラーゼのよう
なプロモーターが置かれ、そして他の末端に非機械的な
プロモーターの部分が置かれ、それに続き所定の任意の
配列がある二本鎖核酸を生成する。図３に記載した導入
ルートと同様に、図４に記載した導入ルートは、固体支
持体上に捕獲された標的を用いて達成されうる。
このようにして得られた二本鎖DNAは、図６に記した
増幅サイクルに入ることができる。それぞれ、完全な機
能的プロモーターからRNAの多数のコピーの転写を与え
る。一方は、標的配列を含む鎖を生成し、そして他方
は、標的に相補的な配列を含む鎖を生成する。これらの
RNA鎖は、ついで、それぞれ、プライマーＥ及びＦ、又
はプライマーＣ及びＤのいずれかとハイブリダイズでき
る。図５に記してある増幅サイクルにおけるごとく、プ
ライマーＣ及びＤ、又はＥ及びＦは、近傍、或いは隣
接、又はオーバーラップできる（ただし、Ｆ又はＤの
３′末端のRAN上でのハイブリダイゼーションが可能で
あること。）それぞれのRNA鋳型上での、Ｅ及びＦ、又
はＣ及びＤの同時伸長は、それぞれ、Ｆ又はＤから由来
した鎖の置換を生じる。このようにして放たれた２つの
DNA鎖は、それぞれＢ又はＡとハイブリダイズできる。
所定の長さの２つのDNA二本鎖は、新たに合成されたDNA
上でプライマーＡ及びＢの伸長、及びこれらのプライマ
ー上での新たに合成されたDNAの伸長により生成され
る。それらは、導入ルートの間に生成された２つの二本
鎖DNAと同一であるので、それらは再び、サイクルに入
る。
図５に記載したサイクルと同様、図６に記載したサイ
クルは、初めの標的に相補的な２つの二本鎖に対応する
RNA及びDNAの指数的増幅を生じる。
本発明において用いるプライマーの性質及び長さ、用
いられるプロモーターの配列及びプロモーターの各タイ
プについてのRNAポリメラーゼの濃度は、他と比較して
一つの増幅ルートが有利になるように、DNA又はRNAの一
つの形又は他の形が優先して得られるように選ぶことが
できる。従って、本発明に沿って、核酸変性段階なし
で、増幅生成物を検出する方法において直接検出できる
一本鎖RNAを有利に得ることが可能である。
記載された増幅法（図５）の２つのルートの一つから
由来するRNAは、第二サイクルのための基質であり、そ
して逆もまた同様であるので、それ故、本発明に従った
方法は、反応生成物の蓄積が指数的に起こるところの繰
り返しの増幅技術であると思われる。プロモーターを用
いて各転写段階は、DNA鋳型を用いて、500〜1000RANコ
ピーを得ることを可能とする。各RNAは、cDNAコピーを
得ることを可能とし、該cDNAのコピーは、鋳型のDNAに
相補的な500〜1000のRNAコピーの転写のために用いるこ
とができるDNA鋳型を生じる。それ故、その結果は、該
増幅方法の単一のサイクルにおいて、2.5×105〜106の
係数での標的配列の増幅であるというものである。該増
幅方法は最少限の反応時間なので（例えば、１時間或い
はそれ以上）、増幅試薬、例えばヌクレオシドトリホス
フェート及びプライマーがが枯渇するまでに、数反応サ
イクルを生じることができ、その収率は、単一の開始の
標的分子について作られた、109〜1012のDNA及びRAN分
子に対応するところの増幅となる。用いられる試薬の濃
度、そして特に種々のプライマーに依存して、上記増幅
方法により、核酸のいずれかの形態（DNA及び／又はRN
A）、そして開始の標的核酸のいずれかの鎖の生成を有
利にすることができる。
本発明において用いられる“核酸フラグメント”、又
は“オリゴヌクレオチド”なる語は、修飾されていな
い、又は少なくとも一つの修飾された塩基、例えばイノ
シン、５−メチルデオキシシチジン、５−ジメチルアミ
ノデオキシウリジン、デオキシウリジン、2,6−ジアミ
ノプリン、５−ブロモデオキシウリジン、シュードウリ
ジン、シュードイソシチジン或いはハイブリダイゼーシ
ョンを許す他の修飾された塩基を含む、天然のDNA又はR
NAフラグメント、天然の又は合成のポリヌクレオチド、
合成DNA又はRNAフラグメントを意味する。このポリヌク
レオチドは、少なくとも５のデオキシリボヌクレオチド
又はリボヌクレオチドの長さを有し、場合により少なく
とも一つの上記した修飾されたヌクレオチドを含む。こ
のポリヌクレオチドはまた、ヌクレオチド間結合（例え
ば、ホスホロチオエート、Ｈ−ホスホネート、アルキル
ホスホネート結合）のレベルで、骨格、例えばアルファ
−オリゴヌクレオチド（仏国特許第2607507号公報）又
はPNA（Egholmら、1992年、J.Am.Chem.Soc.第114巻、第
1895〜1897項）のレベルで修飾されることもできる。各
修飾は、組み合わせて行うこともできる。
ここで用いた、“固体支持体”なる語は、診断検定、
アファニティークロマトグラフィー及び分離工程で用い
るために核酸フラグメントがその上に固定化されうる全
ての物質を含む。天然又は合成物質、多孔性ないしはそ
うではない、磁気性ないしはそうではない、化学的に修
飾されたないしはそうでないものが、固体支持体として
用いられ、特にポリサッカライド、例えばセルロース物
質、例えば紙、セルロース誘導体、例えばセルロースア
セテート及びニトロセルロース；ポリマー、例えば塩化
ビニル、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリアクリレー
ト又はコポリマー、例えば塩化ビニルとポリプロピレン
ポリマー、塩化ビニルと酢酸ビニルポリマー；スチレン
ベースのコポリマー；天然繊維、例えばコットン及び合
成ファイバー、例えばナイロン；セラミックス、シリカ
である。本発明において用いられる支持体は、ポリスチ
レンポリマー、ブタジエン／スチレンコポリマー又は、
ポリスチレン、スチレン／アクリロニトリル或いはスチ
レン／メチル メチルメタクリレートコポリマー、ポリ
プロピレン、ポリカーボネート等から選ばれた１以上と
混合されたブタジエン／スチレンコポリマーである。有
利には、本発明の支持体は、ポリスチレン、又は10〜90
重量％のスチレン単位を含むスチレンベースのコポリマ
ー、又はシリカである。本発明に従った固体支持体は、
その形態に限定はなく、マイクロタイタープレート、シ
ート、円錐、チューブ、ウェル、ビーズ等の形態であり
得る。
“プライマー”なる語は、少なくとも５つのヌクレオ
チドからなる一本鎖オリゴヌクレオチド構造を示す。こ
れらのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド及び
／又はリボヌクレオチドであり得る。これらのヌクレオ
チドは、“核酸フラグメント”なる語の説明に関するパ
ラグラフにおいて記載したごとくして修飾されうる。実
質的に相補的な核酸配列（DNA、RNA又はキメラDNA−RNA
分子）といったんハイブリダイズされれば、オリゴヌク
レオチドプライマーは、ポリメラーゼの基質である。こ
れらのプライマーの３′OH末端は、適当なヌクレオチド
及びポリメラーゼの存在下で、延長されることができ、
核プライマーがハイブリダイズされるところの鋳型配列
に相補的な鎖の合成を生じる。プライマーはまた、それ
自身に対する一本鎖核酸の末端のハイブリダイゼーショ
ンによって形成されることもでき、特にヘアピン又はス
テム−ループ構造の形成が起こる。核酸配列とハイブリ
ダイズされたオリゴヌクレオチドプライマーは、その
３′OH末端においてポリメラーゼとつく性質を有する。
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する
が、それらに限定されない、特に断りがない限り、以下
の実施例に記載した実験を行うことに関する全ての方法
は、Sambrookら（1989年、Molecular Cloning:A Labor
atry Manual、第２版、Cold Spring Habor Laboratory,
Cold Spring Habor）の記載に従って行った。
実施例１ 増幅技術の可能性を、それに含まれる種々の段階を分
離することにより示す。方法の原理は、置換を用いる転
写反応に基づくので、置換後のDNA標的の転写の研究が
実施された（図２）。選ばれた研究モデルは、β−ラク
タマーゼをエンコードするtem遺伝子の配列であり、こ
の酸素は抗生物質アンピシリンに対する耐性を与える。
この遺伝子の配列は、ID No.1として記述される。この
配列は、クローニングベターpBR322中に存在する。この
核酸は、バクテリア培養物からのプラスミドの抽出、及
び続いて制限エンドヌクレアーゼでの消化によって得る
ことができる。あるいは、それは適当な増幅技術（Samb
rookら、1989.Molecular Cloning:A Laboratory Manua
l,第２版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring
Harbor）によって調製されうる。均質相中での転写に
よる標的配列（RNA又はDNA）に相補的なRNAの調製のた
めに、鎖置換によるRNAポリメラーゼプロモーターの組
み入れ可能性（図２）は、種々のDNAポリメラーゼにつ
いて研究されてきた。この特定の場合において、用いら
れるRNAポリメラーゼは、T7ファージのそれである。テ
ストは、50μの最終体積で、T7RNAポロメラーゼの使
用のためのMilliganら（1987.Nucl.Acids Res.15:8733
−8798）により記述された1X反応緩衝液中で、dATP,dCT
P,dGTP及びdTTP（各1mM,Pharmacia）、ATP,CTP,GTP及び
UTP（各4mM,Boehringer）、1U/μのRNAカード（Pharm
acia）の存在下で行われる。用いられる初めの標的の量
は、テスト当り1011コピーであり、T7RNAポリメレーゼ
（New England Biolabs）の濃度は1U/μであり、DNA
ポリメラーゼの濃度は0.1U/μである。標的に相補的
な配列を併置されるT7ファージプロモーターのコンセン
サス配列を含むプロモータープライマーA24（配列ID N
o.2）、ならびにプライマーＺ（1028と呼ばれる。配列I
D No.3）は、存在する場合、500nMの最終濃度である。
置換プライヤー（DIS1）と呼ばれる。配列ID No.4）
は、０〜５μＭの間の種々の濃度である。熱によって失
活されている可能性がある酸素混合物（DNAポリメラー
ゼ、RNAポリメラーゼ及びRNAガード）を除いて、種々の
反応剤は、標的と接触させられ、95℃（二本鎖DNAより
成る当初標的）又は65℃（一本鎖RNA）より成当初標
的）で３分間変性され、次に酸素混合物に添加のために
氷上で冷却される。酸素の添加の故にグリセロール濃度
は５％に等しい。−20℃での凍結により反応を停止させ
る前に37℃で２時間の温置を行う。
反応混合物の一部（0.2体積、すなわち10μ）を、S
ambrookら（1989.Moleclar Cloning:A Laboratory Manu
al,第２版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spirn
g Harbor）により記述された方法により調製された変性
性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。ゲ
ルは、0.1％TEMEDの存在下で、15％アクリルアミド、7M
尿素、0.26％ビスアクリルアミド、0.06％過硫酸アンモ
ニウム、90mM Tris−ボレート、2mM EDTA、pH8.3を含
む溶液の重合により調製される。それらは、「ミニプロ
ティンII電気泳動セル」電気泳動装置（Biorad）中に注
がれ、1mmの厚さである。分析されるべき試料は、反応
混合物10μと、0.035％キシレンシアノール溶液、0.0
35％ブロモフェノールブルー、1mM EDTA、98％ホルム
アミドの10μとを混合することにより調製される。ゲ
ルに与える前には、これら試料は、65℃で２分間変性さ
れ、次に氷上で迅速に冷却される。ブロモフェノールブ
ルーがゲルの底から1cmのところに泳動されるまで、電
気泳動を150ボルトで行う。次にゲルを、0.6μg/mlの臭
化エチジウム溶液中で10分間着色し、そしてMP4装置（P
olaroid）を用いてUVテーブル（312nm）上で写真にと
る。
電気泳動により分離された生成物を、「ミニトランス
ブロット電気泳動トランスファーセル」装置（Biorad）
を用いて、1mM EDTA、pH8.3を含む45mM Tris−ボレー
ト緩衝液中で４℃で、35ボルト／（時・cm）の電場下
で、Hybond N.ナイロン膜（Amersham）上に移す。次に
膜を80℃で５分間乾燥し、そしてUV照射（312nm）に３
分間晒すことにより核酸を膜上に固定する。
0.5M塩化ナトリウム、1mM EDTA、0.65％SDS、0.14mg
/mlサケDNA及び２％ポリエチレングリコール6000（PE
G）を含む0.1M リン酸ナトリウム緩衝液pH7.0の4ml中
で37℃で60分間温置することによって、膜はプレハイブ
リタイブされる。tem遺伝子の予期される生成物（配列I
D No.1の鎖に対応する）に対して相補的であり、前の国
際特許WO91/19812に記載された方法に従って５′でのカ
ップリングによりホースラディッシュ パーオキシダー
ゼでラベルされたオリゴヌクレオチド A28（配列ID N
o.5）を200ng/mlの濃度で含む同じ緩衝液5ml中で37℃で
60分間温置することにより、ハイブリダイゼーションを
行う。0.05％ Tween20を含む1X PBS緩衝液（Sambrook
ら、1989.Molecular Cloning:A Loboratory Manual,第
２版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Har
bor）の50ml中で30秒間、３度洗った後に、150mM 塩化
ナトリウム、2mg/mlウシ血清アルブミンを含む20mM リ
ン酸ナトリウム緩衝液pH7.2の20ml中のジアミノベンジ
ジンテトラヒドロクロライドジハイドレート（DAB）10m
gの存在下でパーオキシダーゼ活性により、ハイブリダ
イズされたオリゴヌクレオチドが現わされる。室温で光
から保護し15分間の温置後に、蒸留水ですすぐことによ
り反応を停止させる。
置換に依存する転写のテストは、エンドヌクレアゼー
Alu Iで予め開裂され、そして精製されたプラスミドpBR
322（1011コピー／テスト）より成る標的を用いて行わ
れた。用いられるDNAポリメラーゼは、置換プライマー
Ｙ（DIS1と呼ばれる。配列ID No.4）の種々の濃度、す
なわち５μＭ（約1014コピー）、500nM、50nM、5nM又は
0.5nMの存在下又は不存在下における、DNA依存性DNAポ
リメチラーゼ、クレノウ フラグメント（Boehringe,5U
/テスト）である。T7 RNAポリメラーゼ活性に対する対
照は、Alu I開裂されたpBR 322標的から、プライマーA
24（配列ID No.2）及び1028（配列ID No.3）を用いてPC
Rにより２本鎖DNAフラグメントを調製することにより予
め用意された。もちろん、少くとも一つのプロモーター
を含む定義された末端を有する２本鎖フラグメントは、
たとえば、プロモーターを含むプラスミド中に配列をク
ローニングし、制限酵素で消化し、そしてアガロースゲ
ル上で精製し、次に電気溶出させることにより調製され
ることができる。かくして得られた285塩基対の生成物
は、この場合、一端にT7ファージプロモーターを含み、
T7 RNAポリメラーゼによるその転写は、置換に依存す
る転写のテストの間に予期される反応生成物に対応する
263塩基のRNAを得ることを可能にする。T7 RNAポリメ
ラーゼ活性のためのマーカーは、上記した条件下で、但
しDNAポリメラーゼ及びdNTPの不存在下で、285塩基対フ
ラグメントの1011コピーを温置することにより作られ
る。この反応は、置換テストと並行して２時間行われ
る。
図８は、種々の量の置換プライマーＹの存在下でクレ
ノウフラグメントにより鎖置換のテストの間に得られた
結果を示す。予期されたように、転写生成物の存在は、
置換プライマーＹを含む試料に限られることを結果が示
している。置換プライマーＹの存在下の陽の転写結果
は、クレノウフラグメントの鎖置換能力を示す。実際、
tem標的に対し相補性でありかつtem標的上のプライマー
Ｘ及Ｚの間のギャップに対応するサイズのRNA（すなわ
ち転写制御から得られるものと同じ）の存在は、T7 RN
Aポリメラーゼ転写制御のフラグメントに等しくかつ、
後者と同様に機能性RNAポリメラーゼプロモーター（二
本鎖）を含むところの二本鎖DNAフラグメントを用いて
の転写から結果される。このフラグメントは、上述した
反応条件下で、T7 プロモーターを含むプロモータープ
ライマーＸの伸長の生成物（図２）とハイブリダイズさ
れたプライマーＺを伸長することによりのみ得られう
る。ここで、プライマーＺのハイブリダイゼーション及
び伸長は、一本鎖の形のプロモータープライマーＸの伸
長の生成物の存在下でのみ可能である。一本鎖の形のこ
の伸長生成物の存在は、プロモータープライマーＸの伸
長の生成物の放出を起す置換プライマリーＹの伸長から
のみ得られうる。
また、最終転写生成物の強度は、テスト中の置換プラ
イマーＹの濃度の関数として変化することを結果は示
す。転写された物質の量がT7 RNAポリメラーゼのため
に利用できる鋳型（テンプレート）の量に比例すると、
従って、置換及び伸長により合成される鋳型の量は、テ
ストで用いられた置換プライマーＹの量の関数として変
化すると思われる。プライマーＺの濃度が一定かつ過剰
であると、利用できる二本鎖鋳型の量は、プロモーター
プライマーの伸長の一本鎖生成物の量に依存する。従っ
て、放出された伸長生成物（一本鎖）の量はテスト中の
置換プライマーの濃度を関数として変化する。用いられ
た条件下で、50nM（すなわち存在する標的の量の10倍）
の置換のプライマー濃度（1/10の置換プライマー／プロ
モータープライマー比に相当する）は、置換の最良の収
量及び従って転写の最良の収量を与える。これらの結果
は、プロモータープライマーの上流に位置されたプライ
マーの伸長による核酸鎖の置換の収量に対する、置換プ
ライマー／プロモータープライマー比の影響を示す。こ
の最適のどちら側においても、置換収量は実質的に減少
する。すなわち、もし置換プライマーの濃度が大きくな
ると、熱動力学的条件は、標的との後者のハイブリダイ
ゼーションの好都合であり、従ってその伸長（ハイブリ
ダイゼーションの損失を払って）及び次にプロモーター
プライマーの伸長に好都合である。同様に結果は、もし
置換プライマー濃度が減少すると、プロモータープライ
マーの上流の置換プライマーのハイブリダイゼーション
の可能性は減少し、従って下流に位置される鎖の置換の
ための伸長の可能性が減少する。
この実施例は、所与の標的配列上にプロモーター配列
を設置するためにポリメラーゼの鎖置換特性を用いるこ
との可能性を示す。この方法は、熱的又は化学的変性段
階の必要なしに、又は一本鎖核酸上のプロモータープラ
イマーの伸長の生成物を放出するために、ヌクレアーゼ
タイプの酵素活性の作用を必要とせずに、RNAポリメラ
ーゼのためのDNA鋳型の生産を可能にする利点を有す
る。従って、結合された転写段階を用いて、２つのプラ
イマーＸとＺの間の標的配列に対応する、大きなコピー
数のRNAを合成することが可能である。図８は、標的配
列が、転写のための増幅のための段階なしで用いられた
方法により検出されないことを示す（レーン２）。対照
手に、置換プライマーと結びつけられた、鎖置換活性を
持つDNAポリメラーゼの使用は、標的に対応するRNAの複
数の鎖の合成を可能にする鋳型を得ることを可能にし、
その数はその検出を可能にし、当初試料中の標的の存在
を示す。従って、この実施例は、均質相（単一段階かつ
単一温度）における転写による、標的配列に相補的な複
数のRNA鎖の生産のために、鎖置換によるRNAポリメラー
ゼプロモーターを設置するための方法の有用性を示す。
この方法は、特に二本鎖標的の場合に、予め変性された
核酸標的に、プライマーＹ、プライマーＸ、プライマー
Ｚ、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート及びリ
ボヌクレオシドトリホスフェート、鎖置換能力を持つDN
Aポリメラーゼ、及びRNAポリメラーゼを含む反応混合物
を加えることにより標的配列の転写物を直接に得ること
を可能にする。従って、この方法は、後の又は中間での
反応剤の添加、又は酵素活性、特にヌクレアーゼ活性の
使用のない、単一段階より成る。
実施例２ 本発明の可能性は、また、実施例１で記載されるよう
に均質相における転写がRNA分子を用いても実施されう
ることを示す。このRNA分子は、存在の増幅による決定
が本発明により可能にされるところの当初標的であって
も、あるいは増幅方法のサイクルの中間生成物（図５）
であってもよい。この中間生成物はたとえば、実施例１
の場合における転写により得られたRNAであることがで
きる。この可能性は、鎖置換能力を有するDNAポリメラ
ーゼ（RNA依存性かつDNA依存性）の使用を前提とする。
この可能性を示すために、RNAすなわちtem配列（配列ID
No.1）に相補性の配列に対応するRNAが、DNA鋳型の10
12コピーを用いて、MEGAスクリプト キット（Ambion）
の反応条件下でT7 RNAポリメラーゼを用いてインビト
ロで合成された。これを行うために、pBR322からPROANT
I（配列ID No.6）及びORF1（配列ID No.7）を用いてPCR
により二本鎖DNA鋳型が合成された。かくして得た889塩
基対生成物は、この場合、T7 ファージプロモーターを
一端に含み、T7 RNAポリメラーゼによるその転写はtem
遺伝子（配列ID No.1）の配列に相補的な配列に対応す
る867塩基のRNAを得ることを可能にする。合成されたRN
Aは、鋳型DNAを除去するためにDNase Iで処理され、フ
ェノール／クロロホルム抽出により精製され、そして酢
酸アンモニウム塩の存在下でエタノールにより沈澱され
る。かくして得たRNAは、予めジエチルピロカーボネー
ト（DEPC）で処理された水中に移され、変性性ポリアク
リルミドゲル電気泳動により分析され、260nmでの吸収
により評価される。標的RNAの1011コピーに相当する量
（5nM最終）がテスト当り用いられ、反応条件は、上述
のプライマーＸ、Ｙ及びＺの存在下で実施例１で記載し
たのと同じである。しかし、これらテストの枠内で用い
られるDNAポリメラーゼは、AMVビールス逆転写酵素（Se
ikagaku）であり、上記で決定した最適にセットされた
置換プライマー／プロモータープライマー比（1/10）を
用いた。これは50nM最終に等しい最終置換プライマー濃
度に相当する。反応生成物の分析は、電気泳動分離、膜
上への移動、及びホースラディッシュパーオキシダーゼ
でラベルされたプローブA28（配列ID No.5）を用いるハ
イブリダイゼーションにより実施例１記載のように行わ
れる。図９は、種々の反応テストの間に得られた結果を
示す。プライマーA24（配列ID No.2）及び1028（配列ID
No.3）を用いて得られた、一端にT7 プロモーターを
含む、285塩基対のPCRフラグメントの1012コピーに等し
い量が装填されて（レーン１）、実施されたテストの間
に予期されるRNA（263塩基）のためのサイズマーカー
（同じフラグメントの転写に相当する。）として働く。
テストは、逆転酵素及びT7 RNAポリメラーゼの不存在
下で（レーン２）、酵素の存在下でプライマーＸ、Ｙ及
びを用いて（レーン３）、置換プライマーＹなしで（レ
ーン４）、又はプライマーＺなしで（レーン５）、行わ
れた。予期された263塩基のRNAは、総ての酵素剤及びプ
ライマーを含むテストからのみ検出され、一方、置換プ
ライマーの不存在下では転写生成物が得られない。従っ
てこの結果は、DNAポリメラーゼの作用による鎖置換の
可能性を確認し、AMV逆転写酵素の鎖置換能力による、R
NA鋳型上での置換の可能性を示す。従って、AMV逆転写
酵素は、予め伸長されたプライマーの上流に位置された
プライマーの伸長の間に、RNA−DNAへテロ二本鎖を分離
することができる。RNA−DNAヘテロ二本鎖の安定性は、
DNA−DNAホモ二本鎖の安定性より大きいと知られている
ので、この逆転写酵素は、プライマー伸長により、DNA
標的とハイブリダイズされたDNA鎖を置換できること
が、全く確かである。AMV逆転写酵素と結び付けられたR
Nese H活性が記述されるが、置換プライマーの不存在下
で転写生成物は得られない。このことは、これらのテス
トで用いられた緩衝液条件はこのRNese H活性のために
適当でないこと、又は用いられたRNA標的の配列が後者
に作用にあまり敏感ではないことを示唆する。従って、
標的RNA−cDNA二本鎖のRNAは減成され得ず、プロモータ
ープライマーの伸長の生成物は従って、その上でのプラ
イマーＺのハイブリダイゼーション及び伸長のために放
出されることができない。この結果は従って、AMV逆転
写酵素の鎖置換能力に加えて、AMV逆転写酵素と結び付
けられたRNese Hの作用によるcDAN−RNAヘテロ二本鎖か
らcDNAの分離の効率の全くの欠加（これらの条件下で
の）を示し、上記した転写増幅法における外来エシェリ
ヒアコリRNese H、たとえばNASBA、3SR又はLATの使用を
正当化する。プライマーＺの不存在では（しかし置換プ
ライマーＹの存在下で）、転写生成物は得られず、この
ことは、本反応の条件下でプロモータープライマーの伸
長から誘導されたcDNAの３′末端において自己プライミ
ング反応が起きないことを示す。しかし、この特性は特
定の条件下で逆転写酵素において従来記載されている。
従って、この実施例は、図２に示されるように均質相
（単一段階かつ単一温度）における転写によりRNA標的
配列に相補性のRNAの製造のために及び所与の標的RNA鎖
に相補性の多数のRNA鎖を作るために、鎖置換によりRNA
ポリメラーゼプロモーターを設置する方法の有効性を示
す。従って、その方法は、反応剤の後の又は中間の添加
なしの単一段階より成り、RNA−DNAヘテロ二本鎖からの
cDNAの分離のためにヌクレアーゼ（特にRNese H）活性
を必要としない。特に、反応条件下でAMV逆転写酵素
は、RNA鋳型上でプロモータープライマーから伸長され
た鎖の放出（置換プライマーの不存在下で）を可能にす
るRNese H活性を示さない。従ってAMV逆転写酵素の鎖置
換能力は、増幅サイクルの可能性を示し、従って、RNA
又はDNA標的からの反応生成物の蓄積の指数凾数的性質
を示す。
実施例３ 鎖置換によるDNA−RNAヘテロ二本鎖からDNA分子の分
離の可能性を確かめるため、及びある逆転写酵素に固有
の何らかの残りのRNese H活性とは独立にこれを確かめ
るために、RNese H活性を欠くMMLV逆転写酵素を用いて
テストを行った。遺伝子工学により得られるそのような
酵素は、SuperscriptIIという名でGIBCO−BRLから市販
入手できる。テストは、同じRNA標的を用い、上記のプ
ライマーＸ、Ｙ及びＺを用いて実施例２のように行われ
た。SuperscriptIIは、4U/μ（200U/テスト）の最終
濃度に加えられ、置換プライマー及びプロモータープラ
イマーは1/10の比で存在する。反応生成物は、実施例１
記載のように分析される。得た結果を図10に示す。転写
生成物の存在は、置換プライマーＹを含むサンプルに限
られることが判り（レーン７）、これはRNese H活性を
欠くMMLV逆転写酵素の鎖置換能力を確認する。置換プラ
イマーの不存在下（レーン６）、転写シグナルは得られ
ず、これは逆転写酵素の鎖置換特性によるRNA−DNAヘテ
ロ二本鎖からのDNAの分離の有効性を確認する。プライ
マーＺの不存在下で（レーン５）、転写生成物は得られ
ず、このことは実施例２におけるように、MMLV逆転写酵
素SuperscriptIIが、これら反応条件下でcDNAの３′末
端の自己再プライミングを実施しないことを確認する。
従って、この実施例は、RNA標的から、置換を用いて
転写による増幅の方法の可能性を確認し、またはこのこ
とを、反応媒体中に存在するかも知れないRNese H活性
と完全に独立の様式で確認する。従って、本発明で記載
される増幅方法は、逆転写酵素及びRNAポリマラーゼを
用いて、何らの他の追加の酵素活性なしに実施されう
る。
実施例４ 本発明で記載される増幅方法の可能性はまた、特に図
３及び５に記載される方法において、末端の夫々に機能
性RNAポリラーゼプロモーターを含む一つの同じ二本鋳
型から相補性RNAを転写するRNAポリメラーゼの能力に依
存する。この仮説を検証するために、標的pBR322からプ
ライマーDTA1（配列ID No.8）及びDTA2（配列ID No.9）
の存在下でPCRにより二本鎖DNA鋳鎖が合成された。かく
して得た275塩基対フラグメントを精製する。それは、T
7 ファージRNAポリメラーゼのために二つのプロモータ
ーによりフランキングされ、かつtem配列の鎖のいずれ
かの転写のために配向されたtem遺伝子の配列の一部
（配列ID No.1のヌクレオチド312〜486）を含む。各プ
ロモーターセンサ配列は、５′においてプライマーF220
（配列ID No.10）に対する配列により先導される。その
末端に位置されるプロモーターの夫々からそのようなフ
ラグメントの転写は理論的に、二つのRNA集団の合成を
もたらすはずであり、それらは互いに相補的であり、か
つそれらの３′末にT7A プロモーターのアンチセンス
配列（すなわちT7 プロモーターのセンス配列に相補的
な配列）を含み、オリゴヌクレオチド F220（配列ID N
o.10）に相補的な配列が続く。予期されるRNAのサイズ
は231塩基であり、それらはtem遺伝子（配列ID No.1）
のヌクレオチド312〜486の配列、又は後者に相補的な配
列を含む。転写テストは、各末端にプロモーターを含む
PCRフラグメントを用い、Milliganら（1987.Nucl.Acids
Res.15:8783−8798）により記述された1X反応緩衝液中
で、50μの最終体積で、各4mMのATP、CTP、GTP及びVT
P、1U/μのT7 ファージRNAポリメラーゼ（New Engla
nd Biolabs）及び1U/μのRNAguard（Pharmacia）の存
在下で実施される。PCR鋳型はテスト当り1011コピーで
用いられ、酵素の添加によるグリセロール濃度は５％で
ある。転写は、37℃で２時間行われ、−20℃に凍結する
ことにより停止される。反応生成物（10μ）は、実施
例１記載のように、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳
動分離により分析され、次にナイロン膜上に移される。
このようにして、一方でホースラディッシュパーオキシ
ダーゼで５′においてラベルされたプローブA28（配列I
D No.5）及び他でホースラディッシュパーオキシダーゼ
で５′においてラベルされたプローブA19（配列ID No.1
1）のハイブリダイゼーションを用いるために、二つの
膜が調製される。プローブA19は、記載されるtem配列
（配列ID No.1）に相補的なRNAを検出することを可能に
し、一方、プローブA28は、記載されるtem配列（配列ID
No.1）に対応するRNAの検出を可能にする。図11は、こ
れらテストの間に得られた結果を示す。プローブA28及
びA19は、275塩基対の二本鎖標的DNA鋳型の1012コピー
を検出することを可能にし（レーン）、または転写テス
トの場合に231塩基のRNAの検出を可能にする（レーン
２）。２つのタイプのプローブ19（Ａ部）及びA28（Ｂ
部）を用いての、予期された転写物の検出は、相補的RN
Aの転写が、DNA鋳型の夫々のプロモーターからT7 RNA
ポリメラーゼにより実施されたことを示す。この端の夫
々にプロモーターを含む共通のDNA鋳型からの相補的RNA
の生産は、T7 RNAポリメラーゼが、同じ鋳型上での一
点に集中する前進によりRNAの重合を実施できることを
示す。従ってRNAポリメラーゼを用いてこれら条件下で
相補的RNAを生産する可能性は、図３及び５に記載され
る本発明の増幅法の可能性を確認する。従って、これら
結果は、図３及び５において本発明で記載される増幅サ
イクルが指数凾数的性質を持つことを確認し、この性質
は、配列がプロモータープライマーＡとＢと間の標的の
部分に対応するところのRNA及びDNAの実質的蓄積を結果
する（図５）。
実施例５ DTR増幅法の実験的有効性は、本発明で、特に図15で
記載される増幅サイクルの一つを研究することによって
照明された。これを行うために、167塩基対のPCRフラグ
メントが、PBR322から、プライマーDTA7（配列ID No.1
2）及びDTA8（配列ID No.13）を用いて合成された。こ
れは従って、tem遺伝子の配列の一部（配列ID No.1のヌ
クレオチド336〜402）を含む。このPCRフラグメント
は、増幅サイクル中へのエントリーのための分子の一タ
イプに相当し、従ってその末端の夫々に、規定された配
列たとえばF220配列（配列ID No.10）により５′におい
て先導されるRNAポリメラーゼプロモーター配列（特にT
7 ファージプロモーター）を含む。方法の指数凾数的
特徴を示すために、先の精製されたPCRフラグメント
（増幅サイクル中へのエントリーに対応する）より成る
標的分子の減少して行く種々の量（テスト当り1010〜10
16コピー）の存在下で種々の増幅反応を並行して行っ
た。反応は、50μの最終体積で、夫々の4mMのATP、CT
P、GTP及びUTP、夫々1mMのdATP、dCTP、dGTP及びdTTP、
1U/μのT7 ファージRNAポリメラーゼ（New England
Biolabs）、4U/μのMMLV逆転写酸素SuperscriptII（G
IBCO−BRL）（RNase H活性を欠く）、及び1U/μのRNA
guard（Pharmacia）の存在下で行った。加えて反応媒体
は、DTA7及びDTA8（夫々、配列ID No.12及び13）に対応
する種々のプロモータープライマーを0.01μＭの濃度
で、及びF220（配列ID No.10）に対応するＥに等しい置
換プライマーＣを１μＭの濃度で含んだ。37℃で２時間
の温置の後に、−20℃に反応媒体を凍結することにより
増幅反応を停止する。５μのフラクション、すなわち
反応体積の1/10を、ELOSA法（酸素結合されたオリゴ吸
着剤アッセイ）に従う捕捉及び特異的検出による定量的
に分析される。この方法は、固体支持体マイクロタイタ
ープレート）上への捕捉オリゴヌクレオチドの付着、反
応生成物の変性、増幅された配列に対して特異的な捕捉
プローブとそれとのハイブリダイゼーション、及びホー
スラディッシュパーオキシダーゼに結合された検出プロ
ーブによる検出を含む。捕捉オリゴヌクレオチドA20
（配列ID No.14）は、フランス国特許91 09057号にすで
に記載されている方法に従ってMaxisorp Nunc−Immuno
プレート マイクロタイタープレートのくぼみ上に受動
的に付着され、１くぼみ当り約５ピコモルのオリゴヌク
レオチドの付着を許す。付着の後に、1X PBS−Tween緩
衝液で３回洗う。捕捉された増幅生成物の検出は、フラ
ンス国特許91 09057号に記載されている方法に従って行
われる。分析されるべき５μフラクションが、1M 塩
化ナトリウム、2mM EDTA、1.3％SDS、0.24mg/mlサケDN
A、４％ ポリエチレングリコール（PEG）6000を含む0.
2Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0の35μ体積に加えら
れる。この試料に含まれる核酸は、2M 水酸化ナトリウ
ムの５μの添加により室温で変性され、３分間後に2M
酢酸５μの添加により中和される。対照として及び
較正のために、予期された増幅生成物に対応する二つの
RNA希釈シリーズを用意する。次に、試料を、オリゴヌ
クレオチド捕捉プローブA20（配列ID No.14）が予め付
着されているマイクロタイタープレートのくぼみに入れ
る。入れられる量は、希釈されていない試料の50μ、
又は1/10又は1/100希釈された試料の同量である。直ち
に、1M 塩化ナトリウム、2mM EDTA、1.3％SDS、0.24m
g/mlサケDNAS、４％ ポリエチレングリコール（PEG）6
000及びホースラディッシュパーオキシダーゼに結合さ
れた検出オリゴヌクレオチドプローブA18（配列ID No.1
5）の5ngを含む0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0の50
μ体積を加える。37℃で60分間の温置の後に、1X PB
S−Tweenで、くぼみを洗う。増幅生成物とハイブリダイ
ズされたパーオキシダーゼ−A18プローブの検出は、基
質オルトフェニレンジアミン（OPD）を含む溶液100μ
の添加により行われる。20分後に1M 硫酸100μの添
加により、比色反応を停止させる。492nmにおける光密
度を、AXIAマイクロリーダー（Bio Merieux）を用いて
読む。得た結果を、図18の度数分布により示す。標的希
釈物の夫々について、３つのテスト、すなわち完全なテ
スト（上述のような）、置換プライマーF220（配列ID N
o.10）なしのテスト、及びMMLV逆転写酵素Superscript
IIなしのテストを行った。結果は、増幅方法（完全な
系）がこれらの条件下で、テスト当り107コピーの当初
標的量より下でかなりの特異的シグナルを検出すること
を可能にする、すなわち106コピーの感度を有すること
を示す。なぜなら、反応媒体の10分の１に等しいフラク
ションがこれらの条件下で分析されるからである。この
感度は端に相対的であり、もし比色以外の検出系（たと
えば螢光、化学発光又は生物学的光）が用いられるな
ら、大きく増大されうる。結果は特に、置換プライマー
F220の不存在下でテスト当り1010コピーに等しい標的量
に対してのみ特異的シグナルが得られることを示す。従
って、置換プライマーありとなしとの間の検出感度の差
は、103、つまり3log10である。このことは、該方法が
増幅生成物の実質的蓄積を許し、これは増幅サイクルを
実施することによってのみ得られることを示す。従っ
て、このサイクル繰返しは、置換プライマーたとえばプ
ライマーF220の存在の故にのみ可能である。同様に、も
しMMLV逆転写酵素SuperscriptIIが抑止されるなら、検
出シグナルは、テスト当り1010コピー以上の当社標的量
についてのみ得られる。これら後者の反応条件は事実
上、実施例４に記載されるように増幅サイクル中へのエ
ントリーに対応する二官能性分子について実施される転
写段階に相当する。従ってこれらデータは、本方法が転
写単独よりも著しく敏感であること、及びこの感度は、
特に逆転写酵素のようなDNAポリメラーゼの存在下での
置換プライマーを用いての酵素的置換段階を用いる転写
段階までの方法のサイクリングの依存することを示す。
電気泳動分離、ナイロン膜への移動、実施例１に記載さ
れるような、ホースラディッシュパーオキシダーゼに結
合された、一方ではプローブA28（配列ID No.5）及び他
方ではプローブA18（配列ID No.15）とのハイブリダイ
ゼーションによる増幅テストの定量的分析は、予期され
た増幅生成物（117塩基）に対応する120塩基の２つの相
補的RNA分子を検出することを可能にする。
同じ様式で、もしF220（配列ID No.10）に対応する第
一の置換プライマー（この特定の場合にＥは等しい）に
加えて、図５に従いT7 pro（配列ID No.16）に対応す
る第二の置換プライマーＤ（Ｆに等しい）を含む媒体中
で、先の増幅テストが行われるならば、唯一つのタイプ
の置換プライマーを用いて得られるのと類似の結果及び
感度が得られる。このことは、該手法が単純化されるこ
とができ、そして増幅されるべき該標的の性質に結びつ
けられた特定の場合に従って採用されるべき十分に進歩
的であることを示す。
この実施例で用いられた比色検出法の検出限界（テス
ト当り1010コピー以上）は従って、２時間の反応におい
て104以上の増幅ファクターを推論することを可能にす
る。
実施例６ 本発明で記載される“DTR"増幅法は、転写と鎖置換を
係合した様式で用いる指数凾数的サイクルに基づく。特
に、酸素的鎖置換は図15に示されるように、逆転写、置
換プライマーＣ（この実施例においてＥに等しい）、及
び置換されるべき二つのプロモータープライマー（Ａ及
びＢ）を活用する。増幅サイクル内において、置換プラ
イマー／置換されたプライマー（ここでのプロモーター
プライマー）の比は、本方法の増幅収量に大きく影響す
る。もし、増幅が、先の反応条件下で、当初標的の108
又は109コピーの存在下で、DTA7（配列ID No.12）及びD
TA8（配列ID No.13）に対応するプロモータープライマ
ーＡ及びＢの一定濃度0.1μＭ、及びF220（配列ID No.1
0）に対応する置換プライマーＣの濃度0.001、0.01、0.
1、０又は10μＭを用いて行われるなら、置換プライマ
ー／置換されたプライマーの比と共に増大する置換収量
が得られる（図19）。捕捉プローブA25（配列ID No.1
7）及び検出プローブA28（配列ID No.5）を用いる、実
施例５記載のようなマイクロタイタープレートにおける
定量的分析は（図19）、100に等しい置換プライマー／
置換されたプライマー比がこの場において最も好都合で
あることを示す（2500に等しい価が装置の光学的飽和に
相当し、従って2500以上のシグナルに対応することを注
記する）。この比は、酸素的鎖置換によるサイクリング
段階を促進するために、用いられた置換又はプロモータ
ープライマーの長さに従って、又は標的配列の性質に従
って調節されねばならない。
実施例７ “DTR"手法の指数凾数的増幅の効率は、増幅シグナル
の出現の動力学の分析により示されうる。これを行うた
めに、標的分子の109コピーを用いて、実施例５の条件
に従って増幅反応を行った。一定間隔で、反応混合物の
５μフラクションを集め、直ちに−20℃に凍結した。
これらフラクションの増幅シグナルの定量的分析は、実
施例５記載のように、捕捉プローブA25（配列ID No.1
7）及び検出プローブA28（配列ID No.5）を用いて行っ
た。並行して、置換プライマーF220の不存在下で増幅テ
ストを行った。図20のカーブにより示される結果は、反
応の１時間から平坦に達しているので、シグナルの出現
が指数的かつ極めて迅速であることを明瞭を示す。並行
して、置換プライマー不存在の、従って単純な転写反応
に相当する増幅反応は、シグナルの直線的増加を結果
す。従って、“DTP"増幅法は、転写単独と対照的に、当
初標的配列から生成物の迅速かつ指数的蓄積をもたらす
方法である。
実施例８ 本発明の“DTR"増幅法は本質的に、標的配列の一部に
対応する二本鎖RNAを結果する。ハイブリダイゼーショ
ン法によるこの二本鎖RNAの検出を容易にするために、
又は一本鎖RNAの生産の特別の場合において、RNA鎖の出
現を、その相補性物の犠牲において有利にすることが有
用でありうる。このことは、バランスのくずれたRNAポ
リメラーゼ濃度の存在下でファージ（たとえばT7及びT
3）RNAポリメラーゼのための一つの異なるプロモーター
を含むプロモータープライマーＡ及びＢの二つのタイプ
を組み合せて用いることにより実行される。たとえば、
T7 プロモーターを含むプライマーDTA8（配列ID No.1
3）及びT3 プロモーターを含むDTA9（配列ID No.18）
を用いて本発明の増幅サイクルの一つ（図15）中へのエ
ントリーに対応する167塩基対の二本鎖DNA分子をPCRに
より我々は合成した。増幅テストは、実施例５に従うこ
との標的の希釈のうえで、０〜50U/テストのT7 RNAポ
リメラーゼ濃度及び50U/テストの一定のT3RNAポリメラ
ーゼ濃度の存在下で実施された。図21は、T3 RNAポリ
メラーゼの50Uに対するT7 RNAポリメラーゼの6.25Uの
酵素比が、夫々プローブA25（配列ID No.17）及びA28
（配列ID No.5）を用いる捕捉及び検出により、増大さ
れた増幅シグナルを得ることを可能にし、そして比色検
出によりテスト当り105コピー（標的分子の104コピーの
感度に相当する）の標的量より下で著しいシグナルをも
たらすことを示す。検出方法の感度が1010コピーである
ことを知ると、この標的増幅法の増幅ファクターは、従
って105コピーであり、それによって本方法を多数の用
途に有用となす有効性を本方法に与える。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 レヴァシュール、ピエール フランス国、69002 リヨン、リュ オ ーギュスト‐コンテ 54 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/00 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】標的核酸配列の増幅方法において、該核酸
    配列が、その５′末端から、５′−３′方向に、少なく
    とも５ヌクレオチドを有する上流配列及びその３′末端
    から、３′−５′方向に、少なくとも５ヌクレオチドを
    有する下流配列を含む核酸配列であり、 該方法が、以下の段階： 増幅されるべき配列に対応する第一のセグメントを含
    み、かつ更に、第１のRNAポリメラーゼプロモーターの
    センス配列又は第２のRNAポリメラーゼプロモーターの
    アンチセンス配列又は該センス又はアンチセンス配列の
    少なくとも一部を含む少なくとも一つの第二のセグメン
    トを含むポリヌクレオチドを得る段階（ここで、第１の
    プロモーターの該センス配列又はその一部を含むこのよ
    うな第二のセグメントは、該第一のセグメントの５′末
    端の上流に位置され、そして第２のプロモーターの該ア
    ンチセンス配列又はその一部を含むこのような第二のセ
    グメントは、該第一のセグメントの３′末端の下流に位
    置される）、及び RNAポリメラーゼ活性、RNA依存性DNAポリメラーゼ活
    性、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性及び鎖置換活性を有
    する系の存在下で、該活性を作用させる条件下で、かつ
    過剰量のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート及
    びリボヌクレオシドトリホスフェートの存在下におい
    て、上記ポリヌクレオチドを過剰量のプライマーのセッ
    トと接触させて、標的核酸の上記配列を増幅させる段階
    を含み、ここで該プライマーのセットは、 ａ）下記からなる群から選ばれる少なくとも１つのプラ
    イマー： １）その５′末端から３′末端へ向かって、順次に以下
    のセグメントを含む第一のプライマー： −少なくとも５ヌクレオチドを含む任意の配列の第一の
    任意的なポリヌクレオチドセグメント、 −その３′末端部分を含む該第１のRNAポリメラーゼプ
    ロモーターのセンス配列の少なくとも一部を含む第二の
    セグメント、 −及び、該上流配列と同じ長さを有し、かつ該上流配列
    に相同であるか又は該上流配列とハイブリダイズできる
    第三のセグメント、 ２）その５′末端から３′末端へ向かって順次に以下の
    セグメントを含む第二のプライマー： −少なくとも５ヌクレオチドを含む任意の配列の第一の
    任意的なセグメント、 −その３′末端部分を含む該第２のRNAポリメラーゼプ
    ロモーターのセンス配列の少なくとも一部を含む第二の
    セグメント、 −及び、該下流配列と同じ長さを有し、かつ該下流配列
    に相同であるか又は該下流配列とハイブリダイズできる
    第三のセグメント、 ここで、第一及び第二のプライマーの両者が存在する場
    合、第一及び第二のプライマーの一つの第三のセグメン
    トは増幅されるべき該配列の上流又は下流の配列のうち
    の一つと相同であり、かつ、他方のプライマーの第三の
    セグメントは他方の下流又は上流の配列とハイブリダイ
    ズできる、及び ｂ）下記からなる群から選ばれる少なくとも１つのプラ
    イマー： １）以下のいずれかの配列を含む第三のプライマー： 第一のプライマーの第二のセグメントの全体又は一部に
    相同であるセグメントを含み、かつ該第１のRNAポリメ
    ラーゼプロモーターの該センス配列の５′末端を含む配
    列、又は 第一のプライマーの第一のセグメントの一部分に相同で
    あって、しかしその５′末端を含まない配列、 ２）以下のいずれかの配列を含む第四のプライマー： 第二のプライマーの第二のセグメントの全体又は一部に
    相同であるセグメントを含み、かつ、該第二のRNAポリ
    メラーゼプロモーターの該センス配列の５′末端を含む
    ところの配列、又は 第二のプライマーの第一セグメントの一部に相同であ
    り、しかしその５′末端を含まない配列、 ３）以下のいずれかの配列を含む第五のプライマー： 第三のプライマーの一部に相同な配列（該部分は、該第
    三のプライマーの３′末端ヌクレオチドを含まない）、
    又は 第一のプライマーの該第一セグメントの少なくとも一部
    に相同な配列、及び４）以下のいずれかの配列を含む第
    六のプライマー： 第四のプライマーの一部に相同な配列（該部分は、該第
    四のプライマーの３′末端ヌクレオチドを含まない）、
    又は 第二のプライマーの該第一セグメントの少なくとも一部
    に相同な配列 を含むものであるところの方法。
  2. 【請求項２】上記ポリヌクレオチドが、下記よりなる群
    から選ばれた少なくとも１つの第三のセグメントを更に
    含んでいる請求項１の方法： ａ）上記第一のプロモーターのセンス配列又はその部分
    を含む上記第二のセグメントの５′末端の上流におけ
    る、第一のプライマー又は第二のプライマーの第一のセ
    グメントに相同なセグメント、及び ｂ）上記第二のプロモーターのアンチセンス配列又はそ
    の部分を含む上記第二のセグメントの３′末端の下流に
    おける、第一のプライマー又は第二のプライマーの第一
    のセグメントとハイブリダイズできるセグメント。
  3. 【請求項３】上記標的核酸が、増幅されるべき配列を含
    み、かつ増幅されるべき該配列の３′末端を越えて下流
    領域を経て、かつ増幅されるべき該配列の５′末端を越
    えて上流領域を経て延びる、請求項１の方法において、 RNAポリメラーゼ活性、RNA依存性DNAポリメラーゼ活
    性、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性及び鎖置換活性を有
    する系の存在下で、該活性を作用させる条件下で、かつ
    過剰量のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート及
    びリボヌクレオチドトリホスフェートの存在下におい
    て、上記標的核酸を過剰量のプライマーのセットと接触
    させて、標的核酸の上記配列を増幅させる段階を含み、
    ここで該プライマーのセットは、 ａ）請求項１で定義された第１のプライマー及び第２の
    プライマーよりなる群から選ばれる少なくとも１つのプ
    ライマー、 ｂ）請求項１で定義された第３のプライマー、第４のプ
    ライマー、第５のプライマー及び第６のプライマーより
    なる群から選ばれる少なくとも１つのプライマー、及び ｃ）ｉ）標的核酸の上記下流領域とハイブリダイズでき
    る第七のプライマー、ならびに ii）標的核酸の上記上流領域に相補的な配列とハイブリ
    ダイズできる第八のプライマー よりなる群から選ばれた少なくとも１つのプライマー を含むところの請求項１の方法。
  4. 【請求項４】該プライマーのセットが、上記第１のプラ
    イマー及び上記第２のプライマーを含む請求項１〜３の
    いずれか１つに記載の方法。
  5. 【請求項５】上記の第１のRNAポリメラーゼプロモータ
    ーが、上記の第２のRNAポリメラーゼプロモーターと同
    じである請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
  6. 【請求項６】上記の第１のRNAポリメラーゼプロモータ
    ーが、上記の第２のRNAポリメラーゼプロモーターと同
    じである請求項１の方法。
  7. 【請求項７】標的核酸の配列を増幅するためのプライマ
    ーのセットであって、 ａ）下記からなる群から選ばれる少なくとも１つのプラ
    イマー： １）その５′末端から３′末端へ向かって、順次に以下
    のセグメントを含むプライマーA1: −少なくとも５ヌクレオチドを含む任意の配列の第一の
    任意的なポリヌクレオチドセグメント、 −その３′末端部分を含む第１のRNAポリメラーゼプロ
    モーターのセンス配列の少なくとも一部を含む第二のセ
    グメント、 −及び、標的配列とハイブリダイズできる第三のセグメ
    ント、及び ２）その５′末端から３′末端へ向かって順次に以下の
    セグメントを含むプライマーB1: −少なくとも５ヌクレオチドを含む任意の配列の第一の
    任意的なポリヌクレオチドセグメント、 −その３′末端部分を含む該第２のRNAポリメラーゼプ
    ロモーターのセンス配列の少なくとも一部を含む第二の
    セグメント、 −及び、標的上において、プライマーA1がハイブリダイ
    ズできるところの配列の上流に位置される標的の配列に
    相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズできる第３
    のセグメント、及び ｂ）下記からなる群から選ばれる少なくとも１つのプラ
    イマー： １）以下のいずれかの配列を含むプライマーA2: プライマーA1の第二のセグメントの全体又は一部に相同
    であり、該RNAポリメラーゼプロモーターのセンス配列
    の５′末端を含む配列、又は 上記のプライマーA1又はB1の第一のセグメントの一部分
    に相同であって、しかしその５′部分を含まない配列、 ２）以下のいずれかの配列を含むプライマーA3: プライマーA2の一部に相同であって、A2の３′末端ヌク
    レオチドを含まない配列、又は プライマーA1の第一セグメントの少なくとも一部に相同
    な配列、 ３）以下のいずれかの配列を含むプライマーB2: プライマーB1の第二のセグメントの全体又は一部に相同
    であって、該RNAポリメラーゼプロモーターのセンス配
    列の５′末端を含む配列、又は プライマーA1又はB1の第一のセグメントの一部分に相同
    であって、しかしその５′部分を含まない配列、 ４）以下のいずれかの配列を含むプライマーB3: プライマーB2の一部に相同であって、B2の３′末端ヌク
    レオチドを含まない配列、又は プライマーB1の第一セグメントの少なくとも一部に相同
    な配列、 を含むプライマーのセット。
  8. 【請求項８】増幅されるべき配列の下流の標的核酸の領
    域とハイブリダイズできる第７のプライマー、及び増幅
    されるべき配列の上流の標的核酸の領域に相補的な配列
    とハイブリダイズできる第８のプライマー、の少なくと
    も１つを更に含む請求項７のプライマーのセット。
  9. 【請求項９】上記第１のRNAポリメラーゼプロモーター
    が、上記第２のRNAポリメラーゼプロモーターと同じで
    ある請求項７のプライマーのセット。
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Families Citing this family (136)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2737223B1 (fr) * 1995-07-24 1997-09-12 Bio Merieux Procede d'amplification de sequences d'acide nucleique par deplacement, a l'aide d'amorces chimeres
WO1998005766A1 (fr) 1996-08-02 1998-02-12 Bio Merieux Procede d'amplification d'une sequence d'un acide nucleique cible
ATE444760T1 (de) * 1997-01-13 2009-10-15 Univ Emory Glutathion zur behandlung von influenzainfektionen
FR2761695B1 (fr) 1997-04-04 1999-09-24 Bio Merieux Arn polymerase fonctionnant preferentiellement sur matrice d'arn, sa preparation et son utilisation
US7745142B2 (en) 1997-09-15 2010-06-29 Molecular Devices Corporation Molecular modification assays
WO2000042209A1 (en) 1999-01-15 2000-07-20 Ljl Biosystems, Inc. Methods and apparatus for detecting polynucleotide hybridization
US6297018B1 (en) 1998-04-17 2001-10-02 Ljl Biosystems, Inc. Methods and apparatus for detecting nucleic acid polymorphisms
US6270973B1 (en) 1998-03-13 2001-08-07 Promega Corporation Multiplex method for nucleic acid detection
US6270974B1 (en) 1998-03-13 2001-08-07 Promega Corporation Exogenous nucleic acid detection
US6277578B1 (en) 1998-03-13 2001-08-21 Promega Corporation Deploymerization method for nucleic acid detection of an amplified nucleic acid target
US6703211B1 (en) 1998-03-13 2004-03-09 Promega Corporation Cellular detection by providing high energy phosphate donor other than ADP to produce ATP
US6312902B1 (en) 1998-03-13 2001-11-06 Promega Corporation Nucleic acid detection
US7090975B2 (en) * 1998-03-13 2006-08-15 Promega Corporation Pyrophosphorolysis and incorporation of nucleotide method for nucleic acid detection
US6268146B1 (en) 1998-03-13 2001-07-31 Promega Corporation Analytical methods and materials for nucleic acid detection
US6235480B1 (en) 1998-03-13 2001-05-22 Promega Corporation Detection of nucleic acid hybrids
US6391551B1 (en) 1998-03-13 2002-05-21 Promega Corporation Detection of nucleic acid hybrids
US8445664B2 (en) * 1998-06-24 2013-05-21 Enzo Diagnostics, Inc. Kits for amplifying and detecting nucleic acid sequences
ATE426045T1 (de) * 1998-11-09 2009-04-15 Eiken Chemical Prozess zur synthetisierung von nukleinsaure
US6838444B1 (en) 1999-06-01 2005-01-04 Baylor College Of Medicine Compositions and methods for the therapeutic use of an atonal-associated sequence for deafness, osteoarthritis, and abnormal cell proliferation
US6531300B1 (en) * 1999-06-02 2003-03-11 Saigene Corporation Target amplification of nucleic acid with mutant RNA polymerase
US6846626B1 (en) * 1999-09-01 2005-01-25 Genome Technologies, Llc Method for amplifying sequences from unknown DNA
US6692918B2 (en) * 1999-09-13 2004-02-17 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences
DK1218542T3 (da) * 1999-09-13 2004-08-02 Nugen Technologies Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til lineær isotermisk amplifikation af polynukleotidsekvenser
JP4598338B2 (ja) * 1999-10-04 2010-12-15 オリンパス株式会社 核酸検出方法
EP1136568A4 (en) * 1999-10-04 2004-12-15 Olympus Optical Corp Ltd METHOD FOR DETERMINING NUCLEIC ACID
US6582938B1 (en) * 2001-05-11 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Amplification of nucleic acids
US6794138B1 (en) * 1999-12-16 2004-09-21 Affymetrix, Inc. Methods of small sample amplification
WO2003074738A1 (en) * 2000-01-18 2003-09-12 Quantom Dot Corporation Oligonucleotide-tagged semiconductor nanocrystals for microarray and fluorescence in situ hybridization
EP1275715B1 (en) * 2000-04-07 2015-07-15 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Method for amplifyingand detecting a nucleic acid by using double-stranded nucleic acid as template
DE10123183A1 (de) * 2000-05-18 2001-11-22 Becton Dickinson Co Modifizierte Amplifikationsprimer und ihre Verwendung
US7846733B2 (en) 2000-06-26 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
US6686156B2 (en) 2000-06-26 2004-02-03 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
US6706479B2 (en) 2000-10-05 2004-03-16 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Bio-chip, photoluminescent methods for identifying biological material, and apparatuses for use with such methods and bio-chips
EP1427847B1 (en) 2000-12-13 2010-07-28 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for generation of multiple copies of nucleic acid sequences and methods of detection thereof
WO2002065093A2 (en) * 2001-02-14 2002-08-22 Baylor College Of Medicine Methods and compositions of amplifying rna
IL153504A0 (en) 2001-03-09 2003-07-06 Nugen Technologies Inc Methods and compositions for amplification of rna sequences
EP1390537B1 (en) 2001-03-09 2013-11-13 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for amplification of rna sequences
US8137911B2 (en) 2001-05-22 2012-03-20 Cellscript, Inc. Preparation and use of single-stranded transcription substrates for synthesis of transcription products corresponding to target sequences
US7074558B2 (en) * 2001-06-07 2006-07-11 Pbi Technology, Inc. Nucleic acid amplification using an RNA polymerase and DNA/RNA mixed polymer intermediate products
WO2003008624A2 (en) * 2001-07-15 2003-01-30 Keck Graduate Institute Nucleic acid amplification using nicking agents
US20030165911A1 (en) * 2001-07-15 2003-09-04 Keck Graduate Institute Gene expression analysis using nicking agents
CA2492007A1 (en) * 2001-07-15 2003-01-30 Keck Graduate Institute Amplification of nucleic acid fragments using nicking agents
US20030166282A1 (en) 2002-02-01 2003-09-04 David Brown High potency siRNAS for reducing the expression of target genes
EP2213292B2 (en) 2002-02-01 2016-06-22 Life Technologies Corporation Double-stranded oligonucleotides
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
US7399590B2 (en) * 2002-02-21 2008-07-15 Asm Scientific, Inc. Recombinase polymerase amplification
US8030000B2 (en) * 2002-02-21 2011-10-04 Alere San Diego, Inc. Recombinase polymerase amplification
EP1992706B1 (en) * 2002-02-21 2014-11-19 Alere San Diego, Inc. Recombinase polymerase amplification
US7211382B2 (en) * 2002-04-09 2007-05-01 Orchid Cellmark Inc. Primer extension using modified nucleotides
US6916474B2 (en) 2002-07-15 2005-07-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibodies with increased affinities for anthrax antigens
EP2269618A1 (en) 2002-08-12 2011-01-05 Jennerex Biotherapeutics ULC An oncolytic vaccinia virus for use in combination with a chemotherapy for treating cancer.
US7413857B2 (en) 2002-11-21 2008-08-19 Epicentre Technologies Methods for using riboprimers for strand displacement replication of target sequences
US20040101844A1 (en) * 2002-11-21 2004-05-27 Amorese Douglas A. Methods and compositions for producing linearly amplified amounts of (+) strand RNA
US20040115643A1 (en) * 2002-12-12 2004-06-17 Lizardi Paul M. Thermodynamic equilibrium extension of primers
US7309571B2 (en) * 2003-02-03 2007-12-18 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Amplification of self-ligated, circularized cDNA for expression profiling
AU2004230494A1 (en) 2003-04-14 2004-10-28 Nugen Technologies, Inc. Global amplification using a randomly primed composite primer
WO2005010159A2 (en) * 2003-07-17 2005-02-03 Children's Hospital Medical Center Rolling circle amplification of micro-rna samples
US20050059054A1 (en) 2003-07-25 2005-03-17 Richard Conrad Methods and compositions for preparing RNA from a fixed sample
US20050059024A1 (en) 2003-07-25 2005-03-17 Ambion, Inc. Methods and compositions for isolating small RNA molecules
KR100968901B1 (ko) 2003-12-10 2010-07-14 다카라 바이오 가부시키가이샤 핵산의 증폭방법
AU2005284822B2 (en) 2004-09-14 2011-03-24 Regents Of The University Of Colorado Method for treatment with bucindolol based on genetic targeting
WO2007096702A2 (en) 2005-07-25 2007-08-30 Asm Scientific, Inc. Methods for multiplexing recombinase polymerase amplification
EP1929046B1 (en) 2005-09-07 2012-07-11 Nugen Technologies, Inc. Improved nucleic acid amplification procedure
US8980246B2 (en) 2005-09-07 2015-03-17 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Oncolytic vaccinia virus cancer therapy
KR20090004839A (ko) 2005-09-07 2009-01-12 제네렉스, 인코포레이티드 Ｇｍ-ｃｓｆ를 발현하는 폭스바이러스를 사용한 전이성및/또는 전신 파종성 암의 전신 치료법
AU2006303809B2 (en) 2005-10-20 2012-11-15 Epipharm Ag Treatment and prevention of benign pigmented moles (naevi) using artemisinine and the derivatives thereof
EP2368570A3 (en) 2006-01-18 2012-05-02 University Of Chicago Compositions and methods related to staphylococcal bacterium proteins
EP2426221B1 (en) 2006-05-04 2016-06-22 Alere San Diego, Inc. Recombinase polymerase amplification
US8481023B2 (en) 2006-09-15 2013-07-09 Ottawa Hospital Research Institute Oncolytic rhabdovirus
US8067179B2 (en) 2006-11-30 2011-11-29 Research Development Foundation Immunoglobulin libraries
AU2007348215A1 (en) * 2007-03-01 2008-09-12 Gen-Probe Incorporated Methods and kits for amplifying DNA
US8629245B2 (en) 2007-05-01 2014-01-14 Research Development Foundation Immunoglobulin Fc libraries
US8034568B2 (en) 2008-02-12 2011-10-11 Nugen Technologies, Inc. Isothermal nucleic acid amplification methods and compositions
US7846666B2 (en) 2008-03-21 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods of RNA amplification in the presence of DNA
CN102333540B (zh) 2008-10-06 2015-04-22 芝加哥大学 与细菌eap、emp和/或adsa蛋白相关的组合物和方法
EP3272879B1 (en) 2008-10-24 2019-08-07 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
US9080211B2 (en) 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
CN102216472A (zh) * 2008-11-13 2011-10-12 里博克斯艾克斯有限公司 Rna检测方法
AU2010271116B2 (en) 2009-04-03 2015-08-13 University Of Chicago Compositions and methods related to Protein A (SpA) variants
US9469867B2 (en) * 2009-05-20 2016-10-18 Alere San Diego, Inc. DNA glycosylase/lyase and AP endonuclease substrates
EP3360974A1 (en) 2009-06-05 2018-08-15 Alere San Diego, Inc. Recombinase polymerase amplification reagents
EP2789689B1 (en) 2009-06-29 2016-04-27 Luminex Corporation Chimeric primers with hairpin conformations and methods of using same
US9409983B2 (en) 2009-07-23 2016-08-09 The Board Of Trustess Of The University Of Illinois Methods and compositions involving PBEF inhibitors for lung inflammation conditions and diseases
US20110059453A1 (en) * 2009-08-23 2011-03-10 Affymetrix, Inc. Poly(A) Tail Length Measurement by PCR
WO2011032088A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Arca Biopharma, Inc. Polymorphisms in the pde3a gene
DK2477499T3 (en) 2009-09-14 2018-06-06 Sillajen Biotherapeutics Inc COMBINATION CANCER THERAPY WITH ONCOLYTIC VACCINIA VIRUS
AU2010329551B2 (en) 2009-12-10 2016-02-11 Turnstone Limited Partnership Oncolytic rhabdovirus
US20130131161A1 (en) 2009-12-23 2013-05-23 Michael R. Bristow Methods and compositions for cardiovascular diseases and conditions
US8808699B2 (en) 2010-04-05 2014-08-19 The University Of Chicago Compositions and methods related to protein A (SpA) antibodies as an enhancer of immune response
ES2655701T3 (es) 2010-07-02 2018-02-21 The University Of Chicago Composiciones y métodos relacionados con variantes de la proteína A (SpA)
JP5793194B2 (ja) 2010-09-09 2015-10-14 ザ・ユニバーシティ・オブ・シカゴＴｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｃｈｉｃａｇｏ 感染防御ブドウ球菌抗原が関与する方法および組成物
JP6121910B2 (ja) 2011-01-04 2017-04-26 シラジェン バイオセラピューティクス インコーポレイテッド 腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与による腫瘍抗原に対する抗体の生成および腫瘍特異的補体依存性細胞傷害の生成
EP2673299B1 (en) 2011-02-07 2017-05-10 Research Development Foundation Engineered immunoglobulin fc polypeptides
US20140057295A1 (en) 2011-02-28 2014-02-27 Barbara J. Stegmann Anti-mullerian hormone changes in pregnancy and prediction of adverse pregnancy outcomes and gender
CA2829300A1 (en) 2011-03-08 2012-09-13 King Abdullah University Of Science And Technology Molecular biomarker set for early detection of ovarian cancer
EP3202918B1 (en) 2011-04-07 2021-10-20 Abbott Diagnostics Scarborough, Inc. Monitoring recombinase polymerase amplification mixtures
EP3406628A1 (en) 2011-04-08 2018-11-28 Evaxion Biotech ApS Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting staphylococcus aureus
US8945588B2 (en) 2011-05-06 2015-02-03 The University Of Chicago Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens, such as EBH polypeptides
EP2718427B1 (en) 2011-06-08 2017-01-11 Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute Inc. Compositions for glioblastoma treatment
WO2013036799A2 (en) 2011-09-09 2013-03-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions involving nkg2d inhibitors and cancer
WO2013053899A1 (en) 2011-10-12 2013-04-18 Moeller Niels Iversen Peptides derived from campylobacter jejuni and their use in vaccination
EP3269820A1 (en) 2011-12-22 2018-01-17 Ibis Biosciences, Inc. Kit for the amplification of a sequence from a ribonucleic acid
EP2809783A2 (en) 2012-02-02 2014-12-10 Invenra, Inc. High throughput screen for biologically active polypeptides
ES2806945T3 (es) 2012-04-26 2021-02-19 Univ Chicago Antígenos de coagulasa estafilocócica y métodos para su uso
WO2014116721A1 (en) 2013-01-22 2014-07-31 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Geminiviral vector for expression of rituximab
ES2741147T3 (es) 2013-02-21 2020-02-10 Turnstone Lp Composición de vacuna
BR112016007391A2 (pt) 2013-10-03 2017-08-01 Oklahoma Med Res Found biomarcadores da atividade, da intensidade e da fase aguda da doença lúpus eritematoso sistêmico
EP4227685A3 (en) 2013-12-03 2024-02-28 Evaxion Biotech A/S Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting staphylococcus aureus
JP6451046B2 (ja) * 2013-12-17 2019-01-16 東ソー株式会社 核酸増幅方法および当該方法を利用した核酸増幅試薬
US10017759B2 (en) 2014-06-26 2018-07-10 Illumina, Inc. Library preparation of tagged nucleic acid
CA2967351A1 (en) 2014-11-11 2016-05-19 Illumina, Inc. Polynucleotide amplification using crispr-cas systems
EP3218002B1 (en) 2014-11-13 2020-08-19 Evaxion Biotech ApS Peptides derived from acinetobacter baumannii and their use in vaccination
CA2969145A1 (en) 2014-11-26 2016-06-02 The Regents Of The University Of California Therapeutic compositions comprising transcription factors and methods of making and using the same
US10434162B2 (en) 2015-01-12 2019-10-08 Evaxion Biotech Aps Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting Klebsiella pneumoniae
US10457737B2 (en) 2015-02-09 2019-10-29 Research Development Foundation Engineered immunoglobulin Fc polypeptides displaying improved complement activation
EP3070178B1 (en) 2015-03-20 2020-02-12 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Method for diagnosing breast cancer
EP4116316A1 (en) 2015-07-04 2023-01-11 Evaxion Biotech A/S Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting pseudomonas aeruginosa
WO2017040380A2 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Research Development Foundation Engineered antibody fc variants
US10946084B2 (en) 2016-02-22 2021-03-16 Evaxion Biotech Aps Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting Staphylococcus aureus
WO2017197027A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Illumina, Inc. Polynucleotide enrichment and amplification using argonaute systems
EP3565576A1 (en) 2017-01-05 2019-11-13 Evaxion Biotech ApS Vaccines targeting pseudomonas aeruginosa
EP3565907B1 (en) 2017-01-06 2022-05-04 Editas Medicine, Inc. Methods of assessing nuclease cleavage
AU2018213315A1 (en) 2017-01-26 2019-07-25 Oklahoma Medical Research Foundation Biomarkers for systemic lupus erythematosus disease activity, and intensity and flare
WO2018157100A1 (en) * 2017-02-27 2018-08-30 Bioo Scientific Corporation Methods and kits for depleting undesired nucleic acids
US10914729B2 (en) 2017-05-22 2021-02-09 The Trustees Of Princeton University Methods for detecting protein binding sequences and tagging nucleic acids
CA3116539C (en) 2018-10-18 2023-10-03 Oklahoma Medical Research Foundation Biomarkers for a systemic lupus erythematosus (sle) disease activity immune index that characterizes disease activity
EP3870207A1 (en) 2018-10-22 2021-09-01 Evaxion Biotech ApS Vaccines targeting m. catharrhalis
EP3931206A1 (en) 2019-02-27 2022-01-05 Evaxion Biotech ApS Vaccines targeting h. influenzae
JP7275767B2 (ja) * 2019-03-29 2023-05-18 東ソー株式会社 末端に相補領域を有する一本鎖核酸の増幅試薬および増幅方法
EP3772543B1 (en) 2019-08-09 2023-09-27 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Method for diagnosing breast cancer
US20230050225A1 (en) 2020-01-06 2023-02-16 Evaxion Biotech A/S Vaccines targeting Neisseria gonorrhoeae
JP2024509446A (ja) 2021-03-09 2024-03-01 イルミナ インコーポレイテッド 細胞におけるタンパク質コード変異体の発現の分析
JP2024510206A (ja) 2021-03-09 2024-03-06 イルミナ インコーポレイテッド ＣＡＳ－ｇＲＮＡリボ核タンパク質を使用するゲノムライブラリー調製及び標的化エピジェネティックアッセイ
CN117915944A (zh) 2021-07-05 2024-04-19 伊沃逊生物科技股份公司 靶向淋病奈瑟氏菌的疫苗
WO2023018730A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Illumina, Inc. Detection of analytes using targeted epigenetic assays, proximity-induced tagmentation, strand invasion, restriction, or ligation
US20240010742A1 (en) 2022-06-10 2024-01-11 Research Development Foundation Engineered fcriib selective igg1 fc variants and uses thereof

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1340843C (en) * 1987-07-31 1999-12-07 J. Lawrence Burg Selective amplification of target polynucleotide sequences
CA1340807C (en) * 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
ATE108491T1 (de) * 1988-03-18 1994-07-15 Baylor College Medicine Mutationsnachweis durch kompetitiven oligonukleotid-priming.
ES2091225T3 (es) * 1989-07-11 1996-11-01 Gen Probe Inc Metodos para la amplificacion de las secuencias de acidos nucleicos.
US5599696A (en) * 1989-10-17 1997-02-04 California Institute Of Technology Method of preparing nucleic acids having an undefined nucleotide sequence amplification
DE4106473C2 (de) * 1991-03-01 1994-03-10 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur Herstellung in vitro replizierbarer Nukleinsäuren
US5169766A (en) * 1991-06-14 1992-12-08 Life Technologies, Inc. Amplification of nucleic acid molecules
AU2663292A (en) * 1991-09-10 1993-04-05 Jack D. Love Dna/rna target and signal amplification
US5270184A (en) * 1991-11-19 1993-12-14 Becton, Dickinson And Company Nucleic acid target generation
US5348853A (en) * 1991-12-16 1994-09-20 Biotronics Corporation Method for reducing non-specific priming in DNA amplification
US5422252A (en) * 1993-06-04 1995-06-06 Becton, Dickinson And Company Simultaneous amplification of multiple targets
AT402203B (de) 1995-06-13 1997-03-25 Himmler Gottfried Dipl Ing Dr Verfahren zur transkriptionsfreien amplifizierung von nucleinsäuren

Also Published As

Publication number Publication date
CA2145533C (fr) 2003-11-11
US5849547A (en) 1998-12-15
WO1995003426A3 (fr) 1995-06-15
FR2708288B1 (fr) 1995-09-01
EP1318203A3 (fr) 2004-02-04
CA2145533A1 (fr) 1995-02-02
FR2708288A1 (fr) 1995-02-03
JPH08509382A (ja) 1996-10-08
EP0662155A1 (fr) 1995-07-12
EP1318203A2 (fr) 2003-06-11
US6218151B1 (en) 2001-04-17
WO1995003426A2 (fr) 1995-02-02

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