KR100257438B1 - 인간 면역결핍 바이러스 1형 검출용 프라이머 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 면역결핍 바이러스 1형(Human Immunodeficiency Virus type 1, 이후로는 HIV-1)의 개그(gag) 유전자의 핵산 서열을 폴리머레이즈 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, 이후로는 PCR)으로 증폭시키기위한 개선된 프라이머(primer)를 제공한다. 본 발명의 프라이머 및 증폭 방법은 모든 HIV-1 M군 단리물을 거의 일정한 효율로 검출할 수 있게한다.
Description
본 발명은 분자 생물학 및 핵산 화학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1)을 검출하기위한 방법 및 시약에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 일반적으로 의학 분야, 구체적으로 의학 진단술 분야, 및 분자 생물학 분야의 용도를 갖는다.
핵산의 특정한 서열을 증폭시키기위한 본 발명의 방법, 구체적으로 폴리머레이즈 연쇄 반응(PCR)은 이전에는 검출할 수 없는 낮은 양이었던 시료에 존재하는 핵산을 신속하게 검출할 수 있게한다(미국 특허 제 4,683,195 호; 제 4,683,202 호; 및 제 4,965,188 호를 참조할 수 있다). PCR의 발전 및 용도는 문헌에 광범위하게 개시되어있다. 예를 들면, PCR에 연관된 항목의 범위는 문헌[PCR Technology-principles and applications for DNA amplification, 1989,(H.A.Erlich 편집), Stockton Press, New York, NY; PCR Protocols: A guide to methods and applications, 1990(이니스(M.A. Innis) 등 편집), Academic Press, San Diego, CA; 및 PCR Strategies, 1995(이니스 등 편집), Academic Press, San Diego, CA]에 개시되어있다. 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)(코넥티컷주 노르워크 소재)와 같은 상업적인 판매자는 PCR 시약을 팔고 PCR 프로토콜을 발행한다.
HIV-1 핵산을 증폭 및 검출하기위한 PCR 및 프로브 하이브리드의 사용은 쿡(Kwok)의 문헌[1992, Ann. Med. 24: 211-214] 및 쿠틀리(Coutlee) 등의 문헌[1991, Mol. Cell. Probes 5: 241-259]에 개론되어있다. PCR을 기본으로한 HIV-1 검출 분석은 예를 들면 미국 특허 제 5,008,182 호 및 제 5,176,775 호; 켈로그(Kellogg) 및 쿡의 문헌[1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(이니스 등 편집), Academic Press, San Diego, CA: 337-347]; 홀로드니(Holodniy) 등의 문헌[1991, J. Inf. Dis. 163: 802-865]; 잭슨(Jackson) 등의 문헌[1991, AIDS 5: 1463-1467] 및 뮬더(Mulder) 등의 문헌[1994, J. Clin. Microbiol. 32(2): 292-300]에 개시되어있다.
HIV-1의 증폭 및 검출을 위한 상업적인 키트는 호프만-라 롯슈(뉴저지주 뉴틀리 소재)에서 시판된다. 앰플리코(Amplicor)TMHIV-1 테스트는 HIV-1 프로바이러스 DNA의 검출을 위한 생체외 분석법이다. 앰플리코 HIV-1 모니터TM테스트는 HIV-1 RNA를 정량하기위한 생체외 분석법이다. 앰플리코 분석법 둘 모두는 뮬더 등의 문헌[1994, J. Clin. Microbiol. 32(2): 292-300]에 의해 개시되어있고 앰플리코 HIV-1 프라이머에 대해 본원에서 설명된 바와 같이 프라이머 쌍 SK462(서열 식별 번호: 5) 및 SK431(서열 식별 번호: 6)을 이용하여 HIV-1 핵산을 증폭시킨다.
HIV-1은 상당한 게놈 서열 다양성을 나타낸다. HIV-1 개그 및 엔브(env) 유전자의 핵산 서열의 계통발생학적 분석은 본원에 참고로 혼입된 메이어스(Myers) 등의 문헌[1993, Human Retrovirus and AIDS 1993, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM]에 개시되어있다. M군내의 아형 A 내지 J가 확인되었다.
당분야의 기술 범위인 분자 생물학 및 핵산 화학의 종래의 기술이 문헌에 설명된다. 예를 들면 샴브룩(Sambrook) 등의 문헌[1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York]; [Oligonucleotide Synthesis(가이트(M.J. Gait) 편집, 1984)]; [Nucleic Acid Hybridization(하메스(B.D. Hames) 및 히긴스(S.J. Higgins) 편집, 1984]; 및 [Methods in Enzymology(Academic Press, Inc)]을 참조할 수 있다.
다수의 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1)의 M군 단리물은 증폭되지않거나, 이전에 개시된 개그 유전자 프라이머, 구체적으로 앰플리코 HIV-1 프라이머, SK462(서열 식별 번호: 5) 및 SK431(서열 식별 번호: 6)를 이용하여서는 효과적으로 증폭되지않는 것으로 확인되었다. 이들 단리물은 앰플리코 HIV-1 프라이머의 프라이머 결합 부위를 포함하는 영역 이내에서 이전에 없었던 서열 변이를 나타낸다.
본 발명의 목적은 앰플리코 HIV-1 프라이머로 증폭가능한 모든 단리물에 추가하여 이들 새로 발견된 단리물이 효과적으로 증폭되게 하는 개선된 프라이머를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 프라이머는 거의 일정한 효율로 모든 공지된 HIV M군 단리물의 증폭을 가능하게한다.
본 발명의 한 양태는 표적이 아닌 서열을 동시에 증폭시키지않고 거의 일정한 효율로 HIV-1 M군 아형 A 내지 G의 단리물의 개그 유전자 영역을 폴리머레이즈 연쇄 반응(PCR) 증폭할 수 있는 개선된 올리고뉴클레오티드 프라이머에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1) 핵산을 증폭하기위한 올리고뉴클레오티드 프라이머에 관한 것이고, 이때, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 SKCC1(서열 식별 번호: 3) 및 SKCC3(서열 식별 번호: 4)로 구성된 군에서 선택된다.
바람직하게는, 이들 프라이머 각각은 SK145(서열 식별 번호: 1) 및 SKCC1(서열 식별 번호: 3)으로 구성된 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 SK145(서열 식별 번호: 1) 및 SKCC3(서열 식별 번호: 4)으로 구성된 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 조합된다.
또다른 양태에서는, 이들 한쌍의 프라이머는 올리고뉴클레오티드 프라이머 SK145(서열 식별 번호: 1), SKCC1(서열 식별 번호: 3) 및 SK145M2(서열 식별 번호: 2)로 구성된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 또는 올리고뉴클레오티드 프라이머 SK145(서열 식별 번호: 1), SKCC3(서열 식별 번호: 4) 및 SK145M2(서열 식별 번호: 2)로 구성된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 같이 프라이머 SK145M2(서열 식별 번호: 2)와 함께 조합될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함을 포함하는 HIV-1 M군 아형들의 개그 유전자의 영역을 증폭시키는 개선된 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 증폭 프라이머를 포함하는 키트에 관한 것이다. 이들 키트는 검출 프로브 또는 하나이상의 증폭 시약, 예를 들면 폴리머레이즈, 완충용액 및 뉴클레오사이드 트리포스페이트와 같은 추가의 시약을 포함할 수 있다.
본 발명의 이해를 돕기위해서, 여러 용어를 하기에 정의한다.
용어 "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 폴리데옥시라이보뉴클레오티드(2-데옥시-D-라이보즈를 포함한다), 폴리라이보뉴클레오티드(D-라이보즈를 포함한다) 및 푸린 또는 피리미딘 염기 또는 개질된 푸린 또는 피리미딘 염기의 N 글리코사이드인 임의의 다른 유형의 폴리뉴클레오티드를 의미한다. "핵산"과 "올리고뉴클레오티드"란 용어는 의도적으로 길이를 구분하여 사용되지않고, 이들 용어는 상호교환되어 사용될 것이다. 이들 용어는 분자의 1차 구조만을 설명한다. 따라서, 이들 용어는 이중- 및 단일-쇄 DNA, 및 이중- 및 단일-쇄 RNA를 포함한다.
올리고뉴클레오티드는 예를 들면, 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소분해, 및 나랭(Narang) 등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth. Enzymol. 68: 90-99]; 보카지(Beaucage) 등의 디에틸포스포라미다이트 방법[1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862]; 및 미국 특허 제 4,458,066 호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 적합한 방법으로 제조될 수 있다. 합성 방법의 개론은 굿차일드(Goodchild)의 문헌[1990, Bioconjugate Chemistry 1(3): 165-187]에 의해 제공된다.
용어 "하이브리드"는 상보적 염기 쌍에 의해 2개의 단일-쇄 핵산이 이중 구조를 형성함을 의미한다. 하이브리드는 완전히 상보적인 핵산 쇄사이 또는 소수의 짝을 이루지못한 영역을 포함하는 "실질적으로 상보적인" 핵산 쇄사이에서 형성될 수 있다. 완전히 상보적인 핵산 쇄만이 하이브리드를 형성하는 조건은 "엄격한 하이브리드 형성 조건" 또는 "서열-특이적 하이브리드 형성 조건"으로 언급된다. 실질적으로 상보적인 서열의 안정한 이중 구조는 덜 엄격한 하이브리드 형성 조건하에서 수득될 수 있고, 짝을 이루지 않는 허용가능한 정도는 하이브리드 조건을 적합하게 조정하여 제어될 수 있다. 핵산 기술의 분야에서 숙련된 이들은 당분야에서 제공된 지침(예를 들면, 샴브룩 등의 문헌[1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York] 및 웨트머(wetmur)의 문헌[1991, Critical Reviews in Biochem. and Mol. Biol. 26(3/4): 227-259]을 참조할 수 있다)에 따라 예를 들면 올리고뉴클레오티드의 길이 및 염기 쌍 농도, 이온 강도 및 짝을 이루지못한 염기 쌍의 빈도를 포함하는 다수의 변수를 실험적으로 고려하여 이중 구조의 안정성을 결정할 수 있다.
용어 "프라이머"는 핵산 쇄에 상보적인 프라이머 연장 생성물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 적절한 완충용액 및 적합한 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시되는 지점으로 작용할 수 있는, 합성물 또는 천연물인 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머는 바람직하게는 단일-쇄 올리고데옥시라이보뉴클레오티드이다. 프라이머의 적절한 길이는 프라이머의 의도된 용도에 의존하지만, 전형적으로 15 내지 35개의 뉴클레오티드 범위이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기위해서 더 낮은 온도를 필요로한다. 프라이머가 주형 핵산의 정확한 서열을 반영할 필요는 없지만, 이는 주형과 하이브리드를 형성하도록 충분하게 상보적이어야만 한다. 프라이머는 프라이머를 검출 또는 부동화시킬 수 있지만 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 예를 들면, 프라이머는 표적 핵산과 하이브리드를 형성하지않지만 증폭된 생성물의 클로닝을 돕는 추가의 핵산 서열을 5' 말단에 포함할 수 있다. 하이브리드를 형성하도록 주형에 충분히 상보적인 프라이머의 영역은 본원에서는 하이브리드 영역으로 언급된다.
본원에서 사용되는 "상향" 프라이머는 그의 연장 생성물이 코딩 쇄의 서열의 일부인 프라이머를 의미한다. "하향" 프라이머는 그의 연장 생성물이 상보적인 비-코딩 쇄의 서열의 일부인 프라이머를 의미한다.
용어 "표적 서열", "표적 영역" 및 "표적 핵산"은 증폭, 검출 또는 달리 분석되는 핵산의 영역을 의미한다.
프라이머와 표적 서열사이에 존재하는 짝을 이루지못하는 수가 시료에 존재할 수 있는 비-표적 서열과 프라이머사이에 존재하는 짝을 이루지못하는 수보다 더 적으면, 본원에서 사용되는 프라이머는 표적 서열에 대해 "특이적"이다. 하이브리드 형성 조건은 존재하는 짝을 이루지못하는 수가 프라이머와 표적 서열사이에 존재하는 짝을 이루지못하는 수 보다 적은 경우에만 안정한 이중 구조가 형성되도록 선택될 수 있다. 이런 조건하에서는, 표적-특이적 프라이머는 표적 서열과 안정한 이중 구조만을 형성할 수 있다. 따라서, 적합하게 엄격한 증폭 조건하에서는 표적-특이적 프라이머를 이용하면 표적 프라이머 결합 부위를 함유하는 서열을 특이적으로 증폭시킬 수 있다. 유사하게, 적합하게 엄격한 하이브리드 형성 조건하에서 표적-특이적 프로브를 이용하면 특이적 표적 서열이 검출될 수 있다.
용어 "증폭 반응 혼합물"은 증폭 반응을 수행하기에 필요한 시약 및 전형적으로 적합한 완충용액중의 프라이머, 열안정성 DNA 폴리머레이즈, dNTP 및 2가 금속 양이온을 함유하는 용액을 의미한다. 반응 혼합물은 반응을 수행하기에 필요한 모든 시약을 함유한다면 완전한 것이고, 필요한 시약의 일부만을 함유한다면 불완전한 것으로 언급된다. 반응 성분을 편의성, 저장 안정성의 이유로, 또는 성분 농도를 용도에 의존하여 조절하기위해 총 성분의 일부를 각각 함유한 개별적인 용액으로 일반적으로 저장할 수 있고, 완전한 반응 혼합물을 생성하기위해 반응 성분을 반응전에 혼합하는 것을 당분야에 숙련된 이들은 이해할 것이다. 또한, 반응 성분이 상업적으로 개별적으로 포장되고, 유용한 상업적 키트는 본 발명의 프라이머를 포함한 반응 성분의 임의의 일부를 포함할 수 있음을 당분야에 숙련된 이들은 이해할 것이다.
HIV-1 증폭 프라이머
본 발명의 프라이머는 HIV-1 M군 아형의 핵산을 증폭할 수 있다. 프라이머는 새로 발견된 단리물을 포함하는, M군에 속한 아형 A 내지 G의 모든 단리물의 개그 유전자 영역의 핵산을 거의 일정한 효율로 증폭시킬 수 있으므로 이전에 개시된 프라이머에 비해 상당한 개선을 나타낸다. 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 하기에 개시되고 왼쪽에서 오른쪽으로 5'에서 3' 방향으로 도시된다.
상향 프라이머
SK145(서열 식별 번호: 1)
SK145M2(서열 식별 번호: 2)
하향 프라이머
SKCC1(서열 식별 번호: 3)
SKCC3(서열 식별 번호: 4)
본 발명의 하향 프라이머는 본원에 개시된 임의의 상향 프라이머와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 하향 프라이머는 바람직하게는 선택적으로 상향 프라이머 SK145M2(서열 식별 번호: 2)와 함께, 상향 프라이머 SK145(서열 식별 번호: 1)과 함께 사용된다. 상향 프라이머 SK145(서열 식별 번호: 1)은 켈로그 및 쿡의 문헌[1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, (이니스 등 편집), Academic Press, San Diego, CA: 337-347]에 개시되어있다. 제 2 상향 프라이머, SK145M2(서열 식별 번호: 2)는 SK145(서열 식별 번호: 1)와 동일한 영역에서 하이브리드를 형성하지만, 아형 A 및 E의 특정한 HIV-1 단리물의 뉴클레오티드 서열에 보다 밀접하게 일치하도록 디자인된다. 실시예에 도시된 바와 같이, 상향 프라이머를 둘 모두 사용하면 특정한 아형의 증폭 효율을 동등하게할 수 있다.
증폭
증폭은 모든 HIV-1 M군 아형을 증폭시킬 수 있지만 비-표적 서열의 증폭을 피할 수 있는 충분히 엄격한 조건하에서 수행된다. 바람직한 증폭 반응 조건은 뮬더 등의 문헌[1994, J. Clin. Microbiol. 32(2): 292-300]의 실시예 및 앰플리코 HIV-1 모니터 테스트의 제품 설명서에 개시되어있다. 정확한 조건은 본 발명의 결정적인 양태가 아니다. 증폭 조건의 최적화는 본원에 제공된 지침을 기준으로 일상적으로 수행될 수 있다.
본 발명의 프라이머 및 방법은 HIV-1 프로바이러스 DNA 또는 HIV-1 RNA중 하나를 검출하기위해 사용될 수 있다. 역전사/폴리머레이즈 연쇄 반응(RT-PCR)을 이용한 RNA의 증폭은 당분야에 공지되어있고 미국 특허 제 5,322,770 호 및 제 5,310,652 호; 메이어스 및 겔판드(Gelfand)의 문헌[1991, Biochemistry 30(31): 7661-7666] 및 영(Young) 등의 문헌[1993, J. Clin. Microbiol. 31(4): 882-886]에 개시되어있다. HIV-1 RNA의 RT-PCR 증폭은 뮬더 등의 문헌[1994, J. Clin. Microbiol. 32(2): 292-300] 및 홀로드니 등의 문헌[1991, J. Inf. Dis. 163:802-865]에 개시되어있다.
HIV-1 DNA 및 RNA의 증폭에 적합한 시료 제조 방법은 문헌에 개시되어있다. 사용되는 특정한 방법은 본 발명의 결정적인 양태가 아니다. 당분야에 숙련된 이들은 본원에서 제공된 지침을 기준으로 적합한 시료 제조 방법을 선택하고 최적화시킬 수 있을 것이다. HIV-1 프로바이러스 DNA를 검출하기위해 이용되는 바람직한 시료 제조 방법은 카사릴레(Casareale) 등의 문헌[1992, PCR Methods and Applications 2: 149-153] 및 부쳐(Butcher) 및 스패도로(Spadoro)의 문헌[1992, Clin. Immunol. Newsletter 12: 73-76]에 개시되어있다. HIV-1 프로바이러스 DNA를 검출하기위한 바람직한 시료 제조 키트는 앰플리코 HIV-1 테스트의 일부로서 시판된다. 혈장에서 HIV-1 프로바이러스 RNA를 검출하기위한 바람직한 시료 준비 키트는 뮬더 등의 문헌[1994, J. Clin. Microbiol. 32(2): 292-300]에 개시되어있다. HIV-1 RNA의 검출 및/또는 정량을 위한 바람직한 시료 준비 키트는 앰플리코 HIV-1 모니터 테스트의 일부로서 시판된다.
증폭된 생성물의 분석
본 발명의 증폭 프라이머 및 방법은 증폭된 핵산을 이용하는 임의의 용도에 적합하다. 예를 들면, 본 발명의 프라이머를 사용하면 HIV-1 서열의 클로닝 및/또는 서열화가 용이해진다. PCR 증폭된 핵산을 검출하는 방법은 당분야에 잘 공지되어있다. 증폭된 핵산을 분석하기위해 사용되는 방법은 본 발명의 결정적인 양태가 아니고, 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, HIV-1 RNA를 바이러스 부하량을 정량하기위해서 실시예에서 개시된 바와 같이 증폭시킨다.
증폭된 핵산을 검출하는 방법의 예는 겔 전기영동, 및 상보적 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한 하이브리드 형성에 의한 검출에 의해 증폭된 생성물을 분석하는 것을 포함한다. 표적-프로브 하이브리드 형성을 검출하기위한 적합한 분석 형태는 당분야에 공지되어있고 점-블롯(dot-blot) 및 역 점-블롯 분석 형태를 포함한다.
점-블롯 형태에서는, 증폭된 표적 DNA를 나일론 멤브레인과 같은 고형 지지체에 고정화시킨다. 멤브레인-표적 복합체를 적합한 하이브리드 형성 조건하에서 표지된 프로브와 함께 항온처리하고, 하이브리드를 형성하지않은 프로브는 적합하게 엄격한 조건하에서 세척에 의해 제거되고, 멤브레인을 결합된 프로브의 존재에 대해 모니터링한다. PCR 증폭된 생성물의 점-블롯 검출은 예를 들면 사이키(Saiki) 등의 문헌[1986, Nature, 324: 163-166] 및 미국 특허 제 5,468,613 호에 개시되어있다.
역 점-블롯 형태에서는, 프로브는 나일론 멤브레인과 같은 고형 지지체상에 고정되고, 증폭된 표적 DNA를 표지화시킨다. 표적 DNA는 전형적으로 표지된 프라이머의 혼입에 의해 증폭되는동안 표지화된다. 프라이머중 하나 또는 둘 모두를 표지화시킬수 있다. 멤브레인-프로브 복합체를 적합한 하이브리드 형성 조건하에서 표지된 증폭된 표적 DNA와 함께 항온처리하고, 하이브리드를 형성하지않은 표적 DNA를 적합하게 엄격한 조건하에서 세척하여 제거한 다음, 결합된 표적 DNA의 존재에 대해 필터를 모니터링한다. 역 점-블롯 방법은 사이키 등의 문헌[1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230] 및 미국 특허 제 5,468,613 호에 개시된다.
다르게는, 역 점-블롯 분석법은 다수의 프로브 하이브리드 형성 부위 또는 웰을 갖는 고형 지지체를 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 마이크로웰 플레이트는 본 발명의 방법을 대규모의 임상 용도에서 사용하기에 특히 유용하다. 프로브는 수동적 결합, 또는 마이크로웰 플레이트에 점착하는 소의 혈청 알부민(BSA)와 같은 단백질 중간체중 하나를 이용하여 마이크로웰 플레이트에 부동화된다(예를 들면, 텅(Tung) 등의 문헌[1991, Bioconjugate Chem. 2: 464-465]을 참조할 수 있다). 마이크로웰 플레이트에서 수행되는 역 점-블롯 방법은 미국 특허 제 5,232,829 호; 로에펠홀츠(Loeffelholz) 등의 문헌[1992, J. Clin. Microbiol. 30(11): 2847-2851]; 잭슨(Jackson) 등의 문헌[1991, AIDS 5: 1463-1467]; 뮬더 등의 문헌[1994, J. Clin. Microbiol. 32(2): 292-300]; 앰플리코 HIV-1 테스트 제품 설명서; 및 앰플리코 HIV-1 모니터 테스트 제품 설명서에 개시되어있다.
바람직하게는, 증폭된 생성물의 검출 및/또는 정량은 앰플리코 HIV-1 테스트 또는 앰플리코 HIV-1 모니터 테스트의 시약 및 프로토콜을 이용하여 마이크로웰 플레이트상에서 부동화되는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여 하이브리드 형성하여 수행된다. 본 발명의 방법을 HIV-1 RNA를 정량하는데 이용하는 것은 실시예에 더욱 개시되어있다.
다르게는 BSA-공액된 프로브를 자기 미세입자에 결합시킨다. 결합된 프로브를 용액중에서 표지된 증폭 생성물에 하이브리드시키고, 결과로 생성된 것을 자기적으로 용액으로부터 수득한다. 그런다음 자기 부동화된 하이브리드 이중 구조를 상기 개시된 방법에서와 같이 검출한다.
5'-뉴클리에이즈(nuclease) 분석법으로 언급되는 다른 적합한 분석 방법은 미국 특허 제 5,210,015 호 및 제 5,487,972 호 및 홀랜드(Holland) 등의 문헌[1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280]에 개시되어있다. 5'-뉴클리에이즈 분석법에서는, 프로브가 DNA 합성을 위한 프라이머로서 작용하는 것을 방해하도록 변형된 표지된 검출 프로브를 반응 혼합물을 증폭하는 동안 첨가한다. 각각의 합성 단계, 즉 프라이머 연장동안 표적 DNA에 하이브리드를 형성한 임의의 프로브는 택(Taq) DNA 폴리머레이즈와 같은 DNA 폴리머레이즈의 5'에서 3'으로의 엑소뉴클리에이즈(exonuclease) 활성에 의해 분해된다. 그런다음, 프로브로부터의 분해 생성물을 검출한다. 따라서, 프로브 분해 생성물의 존재는 프로브와 표적 DNA사이의 하이브리드가 형성되었고 증폭 반응이 일어났음을 의미한다. 미국 특허 제 5,491,063 호 및 제 5,571,673 호는 증폭과 동시에 일어난 프로브의 분해를 검출하는 개선된 방법을 개시한다.
상기 개시된 분석 형태는 전형적으로 하이브리드 이중 구조의 검출을 용이하게하기위해 표지된 올리고뉴클레오티드를 이용한다. 올리고뉴클레오티드는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 혼입함으로써 표지될 수 있다. 유용한 표지는32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(통상적으로 ELISAS에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐, 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다. 본 발명의 표지된 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드를 합성하기위해 상기 개시된 기술을 이용하여 합성 및 표지될 수 있다.
반응 혼합물에서 이중-쇄 DNA 총량의 증가를 모니터링함으로써 HIV-1 핵산의 증폭을 탐지하기위한 다른 방법이 히구치(Higuchi) 등의 문헌[1992, Bio/Technology 10: 413-417]; 히구치 등의 문헌[1993, Bio/Technology 11: 1026-1030]; 및 유럽 특허 공개 공보 제 512,334 호에 개시되어있다. 이중-쇄 표적 DNA의 검출은 이중-쇄 DNA에 결합했을 때 에티디움 브로마이드(EtBr) 및 다른 DNA 결합 표지가 나타내는 증가된 형광에 의존한다. DNA 결합 표지를 증폭용 반응 혼합물에 첨가한다. 표적 서열의 증폭은 이중-쇄 DNA의 양을 증가시키고, 이는 형광을 검출가능하게 증가시킨다.
본 발명은 또한, 본 발명의 방법을 실행하기위한 유용한 성분을 포함하는 키트, 멀티컨테이너 유니트에 관한 것이다. 유용한 키트는 HIV-1 핵산의 PCR 증폭을 위한 프라이머를 함유한다. 키트는 또한 올리고뉴클레오티드 프로브와 같은 증폭된 HIV-1 핵산을 검출하기위한 수단을 함유할 수 있다. 일부 경우에, 프로브는 적절한 지지체 멤브레인에 고정된다. 키트의 다른 선택적 성분은 예를 들면 프라이머 연장 생성물의 합성을 촉진시키는 시약, 기질인 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 표지하기위해 이용되는 수단(예를 들면, 아비딘-효소 공액, 및 표지가 바이오틴인 경우 효소 기질 및 색원체), PCR 또는 하이브리드 형성 반응에 적절한 완충용액, 및 본 발명의 방법을 수행하기위한 지침을 포함한다.
하기 제시된 본 발명의 실시예는 단지 예시 목적이고 본 발명의 범위를 한정하고자함이 아니다. 실시예 다음의 특허청구범위의 범위이내인 본 발명의 다양한 양태는 전술한 본문 및 하기 실시예를 읽음으로써 당분야에 숙련된 이들에게는 명확해질 것이다.
실시예 1
정량 표준의 구축
앰플리코 HIV-1 모니터 테스트를 이용하여 수행되는 것과 같은 바이러스 부하의 정량은 동일한 프라이머 쌍을 이용하여 증폭되지만 별개의 프로브를 이용하여 검출되는 정량 표준(QS)을 이용한다. QS는 공지된 참고 신호를 제공하기위해 공지된 농도로 시험 시료에 첨가된다. 광범위한 범위의 표적 농도의 경우, 증폭된 표적 또는 증폭된 QS로부터 생성되는 신호는 존재하는 양에 비례한다. 표적 카피 수는 미지의 표적을 증폭하여 발생된 신호를 공지된 QS로부터 발생된 신호와 비교하여 계산된다.
본 발명의 프라이머는 앰플리코 HIV-1 모니터 테스트(앰플리코 QS)에 포함되는 QS내에 완전히 포함되지않는 영역을 증폭시킨다. 따라서, 본 발명의 프라이머를 이용하기위한 신규한 QS가 구축되었다. 새로운 QS는 SKCC1(서열 식별 번호: 3) 및 SKCC3(서열 식별 번호: 4)의 결합 부위를 포함하는 앰플리코 QS 서열을 연장시킴으로써 앰플리코 QS로부터 구축되었다. 결과로 생성된 QS는 앰플리코 HIV-1 모니터 테스트에서 사용된 QS-특이적 프로브를 이용하여 검출될 수 있다. QS RNA가 전사된 것으로부터 새로운 QS 서열을 포함하는 플라스미드를 하기 개시된 바와 같은 표준 기술을 이용하여 구축할 수 있다.
앰플리코 HIV-1 모니터 테스트로부터 수득된 앰플리코 QS는 본질적으로 하기 실시예 2에서 개시된 조건하에서 SK145(서열 식별 번호: 1) 및 SK151(서열 식별 번호: 7)을 이용하여 증폭된다. 증폭은 SK145(서열 식별 번호: 1) 및 SK151(서열 식별 번호: 7)에 대한 프라이머 결합 부위를 포함하고 QS-특이적 프로브의 결합 부위를 포함하는 내부 서열을 보유하는 DNA 생성물을 생성시킨다.
그런 다음, 결과로 생성된 증폭된 생성물을 SKCC1(서열 식별 번호: 3)의 프라이머 결합 부위를 포함하도록 연장시키고, 생성물을 클로닝하기위해 링커를 첨가한다. 이는 HindIII 링커 및 SKCC1(서열 식별 번호: 3)을 포함하도록 5' 말단에서 연장되는 SK145(서열 식별 번호: 1)를 이용하여 생성물을 다시 증폭시킴으로써 수득된다. 적합한 증폭 조건은 켈로그 및 쿡의 문헌[1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(이니스 편집), Academic Press, San Diego, CA): 337-347]에 개시되어있고, 단 SKCC1(서열 식별 번호: 3)과 하이브리드를 형성하기위해서 더 낮은 어닐링(annealing)/연장 온도(예를 들면 42℃)를 이용한다.
그런 다음, SKCC3(서열 식별 번호: 4)의 프라이머 결합 부위를 포함하도록 결과로 생성된 증폭된 생성물을 더욱 연장시키고 제 2 링커를 다른 말단에 첨가하여 생성물이 클로닝되게한다. 이는 상기 개시된 증폭 조건과 동일한 조건을 이용하여 XBa I 링커를 포함하도록 5' 말단에서 연장된 SKCC3(서열 식별 번호: 4)와 함께, 상기 개시된 바와 같이 HindIII 링커를 포함하도록 5' 말단에서 연장된 SK145(서열 식별 번호: 1)를 이용하여 생성물을 증폭시켜 수득된다.
그런다음, 증폭된 생성물을 플라스미드에 삽입하였다. 증폭된 DNA 및 플라스미드 pSP64(위스콘신주 매디슨소재의 프로메가)를 개별적으로 HindIII 및 XBaI을 이용하여 분해시킨후, 표준 방법을 이용하여 라이게이션(ligation)시켰다. 컴피튼트(Competent) 세포를 재조합 플라스미드를 이용하여 형질전환시키고, 정확한 삽입물을 포함하는 클론을 수득한다. 돌연변이가 프라이머 또는 프로브 결합 부위에 도입되지않았음을 확인하기위해 결과로 생성된 재조합 플라스미드에서 클로닝된 삽입물을 서열화하여만한다.
QS RNA는 메가스크립트(MEGAscript)TMSP6 키트(텍사스주 오스틴 소재의 앰비온 인코포레이티드(Ambion Inc.))를 이용하여 QS 서열을 함유하는 재조합 플라스미드로부터 전사된다.
실시예 2
HIV-1 RNA 정량
이 실시예는 다양한 HIV-1 단리물의 상대적인 증폭 효율의 평가를 개시한다. 비교하기위해서, 또한 앰플리코 HIV-1 모니터 테스트 키트를 이용하여 증폭하였다.
HIV-1 단리물을 HIV-1 양성인 임상 시료로부터 수득하였다. 개그 유전자 영역을 클로닝하고 표준 방법을 이용하여 서열화하고, 클로닝된 HIV-1의 아형을 서열을 기준으로 결정하였다. 다수의 이들 HIV-1 단리물은 신규한 것으로 발견되었다. 이 실시예의 경우, 뉴클레오티드 서열을 기준으로 선택된 특정한 단리물은 앰플리코 HIV-1 모니터 테스트의 경우 문제가 될 것으로 예상되었다. 또한 M군 아형에 존재하는 서열 변이의 대표적인 단리물을 사용하였다.
표적 핵산
각각의 단리물로부터 HIV-1 개그 유전자 영역을 함유하는 플라스미드를 구축하고, HIV-1 RNA 주형을 본질적으로 홀로드니 등의 문헌[1991, J. Inf. Dis. 163: 802-865]에 개시된 것과 같이 전사하였다. 각각의 주형의 저장 용액을 제조하고, 주형 농도를 분석하였다. 각각의 반응물에 첨가된 주형의 농도가 동일해지도록 저장 용액을 추정된 상대 농도를 기준으로 희석하였다. 반응물에 첨가된 주형의 카피의 절대수는 약 4000 내지 8000이었다.
정량 표준
실시예 1에 개시된 바와 같은 QS를 전형적으로 반응물당 약 100 카피의 공지된 농도로 각각의 반응 혼합물에 도입하였다.
프라이머
반응 A 내지 F를 하기 프라이머 조합을 이용하여 수행하였다.
프라이머 조합 비교
| 반응 | 프라이머 조합 |
| A | SK462(서열 식별 번호: 5)SK431(서열 식별 번호: 6) |
| B | SK145(서열 식별 번호: 1)SK151(서열 식별 번호: 7) |
| C | SK145(서열 식별 번호: 1)SKCC1(서열 식별 번호: 3) |
| D | SK145(서열 식별 번호: 1) 및 SK145M2(서열 식별 번호: 2)SKCC1(서열 식별 번호: 3) |
| E | SK145(서열 식별 번호: 1)SKCC3(서열 식별 번호: 4) |
| F | SK145(서열 식별 번호: 1) 및 SK145M2(서열 식별 번호: 2)SKCC3(서열 식별 번호: 4) |
모든 프라이머는 5'을 바이오티닐화시켜 역 점-블롯, 마이크로웰 플레이트 형식에서 검출될 수 있게 하였다. 상기 개시되지않은 추가의 프라이머의 서열은 하기에 5'에서 3'쪽으로 도시된다.
상향 프라이머
SK462(서열 식별 번호: 5)
하향 프라이머
SK431(서열 식별 번호: 6)
SK151(서열 식별 번호: 7)
증폭
앰플리코 HIV-1 모니터 테스트의 시약과 조건을 이용하여 증폭 반응 A를 수행하였다.
증폭 반응 B를 하기 시약을 함유하는 100㎕ 부피에서 수행하였다:
HIV-1 주형 RNA
QS RNA
50mM 비신(Bicine), pH 8.3
111mM K(OAc)
3.6mM Mn(OAc)2
500μM dUTP
300μM의 각각의 dATP, dCTP 및 dGTP
50μM dTTP
15% 글리세롤
0.2μM의 각각의 바이오티닐화된 프라이머
2유니트의 UNG*
10유니트의 rTth DNA 폴리머레이즈*
* 호프만-라 롯슈에 의해 제조 및 개발되고 퍼킨 엘머(코넥티컷주 노르워크 소재)에 의해 시판된다.
증폭 반응 C 및 D는 본질적으로 반응 B에서 사용된 조건하에서 수행되고, 단 차이점은 다음과 같다:
100mM K(OAc)
500μM의 각각의 dATP, dCTP 및 dGTP
7.5% 글리세롤
10 유니트의 UNG.
증폭 반응 E 및 F는 본질적으로 반응 C 및 D에서 사용된 조건하에서 수행되고, 단, 10% 농도의 글리세롤을 사용하였다. 각각의 프라이머 쌍에 대한 증폭 조건을 미리 최적화시켰기 때문에 반응 혼합물의 차이는 최소이다.
증폭 반응 B 내지 F를 하기 온도 프로파일을 이용하여 TC9600 DNA 열 순환기(코넥티컷주 노르워크 소재의 퍼킨 엘머)에서 수행하였다:
반응전 항온처리: 50℃에서 2분;
역전사: 60℃에서 30분;
4 주기: 변형: 95℃에서 10초
어닐링: 55℃에서 10초 및
연장: 72℃에서 10초;
26 주기: 변형: 90℃에서 10초
어닐링: 60℃에서 10초 및
연장: 72℃에서 10초;
최종 연장: 72℃에서 15분.
프로브 하이브리드 형성에 의한 증폭된 생성물의 검출
앰플리코 HIV-1 모니터 테스트의 시약 및 프로토콜을 이용하여 증폭된 생성물을 검출하였다. 추정된 초기 표적 농도를 본원에 개시된 바와 같이 계산하였다.
결과
앰플리코 HIV-1 모니터 테스트 정량 방법에서는, 초기 표적 농도는 표적을 증폭시킨후에 발생한 신호를 공지된 농도의 QS를 증폭시킨후에 발생한 신호와 비교하여 추정된다. QS의 공지된 농도가 증폭 전의 값이고, 비교되는 신호는 증폭후의 신호이므로, 증폭의 상대적인 효율의 변화는 미지의 표적의 초기 농도의 추정에 영향을 미친다. 앰플리코 HIV-1 모니터 테스트 정량은 HIV-1 B아형의 증폭 효율을 기준으로 계산된다. HIV-1 아형은 더 낮은 효율로 증폭될 수 있고, 결과적으로 추정된 표적 농도는 진정한 농도를 평가절하한 것이다.
본 실험에서는, 표적 RNA를 공지된 농도로 각각의 반응물에 첨가하였다. 따라서, 각각의 단리물의 상대적인 증폭 효율은 추정된 표적 농도를 비교함으로써 결정될 수 있다. 앰플리코 HIV-1 모니터 테스트 정량은 HIV-1 아형 B의 증폭 효율을 기준으로 계산되므로, 아형 B(클론 105-1)의 추정된 표적 농도를 기준으로 사용하였다. 각각의 단리물의 경우, 아형 B(클론 105-1)에 대해 추정된 표적 농도를 단리물의 추정된 표적 농도로 나누어 상대적인 증폭 효율의 척도를 제공한다. 이들 상대적인 증폭 효율은 하기 표에서 보고된다. "---"는 반응이 수행되지않았음을 나타낸다.
아형 B에 대한 효율
| 클론 | 아형 | A | B | C | D | E | F |
| 113-1 | A | 694.3 | 1.7 | 0.9 | 1.4 | 1.4 | 0.9 |
| 113-2 | A | 19 | --- | 1.3 | 1.1 | 1.3 | 0.6 |
| 114-1 | A | 12.4 | --- | 1.4 | 1.3 | 0.7 | 0.9 |
| 114-2 | A | 9.8 | 1.2 | 1.1 | 1.8 | 1.5 | 0.8 |
| 115-1 | A | 497.6 | 0.8 | 1.2 | 1 | 1.6 | |
| 115-2 | A | 646.4 | 2.4 | 1 | 1.5 | 0.9 | 1.4 |
| 105-1 | B | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 101-15 | C | 7.3 | --- | 1.1 | 3.5 | 1.9 | 1.4 |
| 107-6 | D | 0.8 | --- | 0.6 | 0.7 | 0.7 | 0.8 |
| 308-1 | D | 0.9 | --- | 0.6 | 0.7 | 0.7 | 0.5 |
| 110-5 | E | 520.7 | 465.7 | 3.5 | 1.2 | 4.6 | 0.8 |
| 111-6 | E | 0.8 | --- | 1.1 | 1.6 | 0.9 | 1.1 |
| 112-7 | E | 3.3 | 0.8 | 1.5 | 1.9 | 1.2 | 1.4 |
| 106-1 | G | 1.9 | --- | 2.3 | 2 | 1.8 | 1.5 |
| 108-3 | G | 0.6 | --- | 0.5 | 0.8 | 0.5 | 0.5 |
| 109-1 | G | 32.5 | 1 | 0.5 | 0.6 | 0.6 | 0.3 |
결과는 앰플리코 HIV-1 모니터 테스트(반응 A)가 상이한 HIV-1 단리물을 매우 다양한 효율로 증폭시킴을 나타낸다. 아형 E 단리물, 클론 110-5를 포함하는 여러 단리물이 아형 B, 클론 105-1의 증폭 효율보다 약 500 배 더 낮은 효율로 증폭된다.
비록 모든 단리물이 시험된 것은 아니지만, 프라이머 쌍 SK145(서열 식별 번호: 1) 및 SK151(서열 식별 번호: 7)를 이용하면(반응 B) 증폭 효율의 균일성을 상당히 개선시킨 것으로 보인다. 그러나, 아형 E 단리물, 클론 110-5는 여전히 아형 B, 클론 105-1의 증폭 효율보다 약 500배 이상 더 낮은 효율로 증폭되었다.
SK145(서열 식별 번호: 1) 및 SKCC1(서열 식별 번호: 3)을 이용하면(반응 3) 아형 E 단리물, 클론 110-5를 포함하는 모든 단리물이 아형 B, 클론 105-1의 증폭 효율의 약 3배이내인 효율로 증폭될 수 있다. SK145M2(서열 식별 번호: 2)를 첨가하면(반응 D) 또한 아형 B 참고 균주의 것과 거의 동일한 단리물 110-5의 증폭 효율을 개선시킨다.
유사하게는, SK145(서열 식별 번호: 1) 및 SKCC3(서열 식별 번호: 4)를 이용하면(반응 E), 아형 E 단리물, 클론 110-5를 포함하는 모든 단리물이 아형 B, 클론 105-1의 증폭 효율의 약 5 배이내의 효율로 증폭시킬 수 있다. SK145M2(서열 식별 번호: 2)를 첨가하면(반응 F)는 또한 아형 B 참고 균주의 증폭 효율과 거의 동일하도록 단리물 110-5의 증폭 효율을 더욱 개선시킨다.
실시예 3
임상 시료에서의 HIV-1의 정량
이 실시예에서는, 세네갈(Senegal) 소재의 혈청양성 환자로부터 수득된 30개의 임상 시료를 HIV-1 RNA의 존재에 대해 분석하였다. 임상 시료에 존재하는 아형은 결정되지않았다. 그러나, 아형 A 및 D가 아프리카의 이 영역에서는 통상적이기 때문에, 임상 시료의 일부는 증폭되지않거나 앰플리코 HIV-1 모니터 테스트를 이용하여 유효하게 증폭되지않으리라 예측되었다.
시료를 다음과 같이 제조하였다. 혈장 시료(80 내지 250㎕)를 20㎕의 0.25%(w/v) 적색 이스타포(Estapor) 폴리스티렌 미세구(인디아나주 카멜 소재의 뱅스 래보레이토리즈 인코포레이티드(Bangs Laboratories, Inc.))와 함께 1.5㎖ 원추형 원심분리 튜브에서 혼합하고 4℃에서 25,300xg에서 1시간동안 원심분리하였다. 상층액을 흡입기를 통해 빨아내어 제거하고 펠렛을 250㎕의 용해 완충용액(50㎕의 용해 완충용액은 6.7㎕의 30U/㎕ RNasin(위스콘신주 매디슨 소재 프로메가); 0.67㎕의 100mM DTT; 2㎕의 10% NP40(일리노아주 록포드 소재의 피어스(Pierce)); 0.25㎕의 4㎎/㎖ 폴리-rA RNA; 및 40.4㎕의 Depc 처리된 H2O에 상응한다)에 재현탁시켰다. 펠렛을 실온에서 15분이상 항온처리하고 와동시켜 혼합되게하였다.
최종 시약 농도가 상기 개시된 바와 같아지도록 제형화된 증폭 시약의 2X 혼합물 50㎕ 및 바이러스 용해물 용액 50㎕를 포함하는 100㎕의 반응물에서 증폭을 수행하였다. 약 100 카피의 적절한 QS를 시약 혼합물의 일부로서 각각의 반응물에 첨가하였다. 상기 개시된 바와 같이 앰플리코 HIV-1 모니터 테스트의 시약 및 프로토콜을 이용하여 증폭된 생성물을 검출하였다.
하기 프라이머의 조합을 이용하여 각각의 시료를 증폭하였다.
비교된 프라이머 조합
| 반응 | 프라이머 조합 |
| A | SK462(서열 식별 번호: 5)SK431(서열 식별 번호: 6) |
| B | SK145(서열 식별 번호: 1)SKCC1(서열 식별 번호: 3) |
| C | SK145(서열 식별 번호: 1) 및 SK145M2(서열 식별 번호: 2)SKCC1(서열 식별 번호: 3) |
혈장 ㎖당 HIV-1 주형의 카피로 표현되는 결과가 하기에 요약된다.
추정되는 표적 농도(카피/㎖)
| 단리물 | A | B | C | ||
| 2 세트 | 2 세트 | ||||
| DKN 035 | 0 | 800 | 1860 | 1600 | 1100 |
| DKN 079 | 360 | 30060 | 37240 | 91780 | 152300 |
| DKN 154 | 1140 | 21660 | 54560 | 68820 | 67120 |
| DKN 162 | 0 | 16020 | 25980 | 64340 | 21880 |
| DKN 162 | 0 | 12180 | 10520 | 14300 | 18320 |
| DKN 169 | 0 | 3140 | 7000 | 5651 | 8047 |
| DKN 171 | 1180 | 640 | 500 | 560 | 1040 |
| DKN 282 | 560 | 3400 | 4360 | 5560 | 3460 |
| DKN 402 | 340 | 4260 | 10520 | 7000 | 5060 |
| MBN 26 | 27740 | 16940 | 19220 | 16700 | 18680 |
| MBN 31 | 180 | 1820 | 1820 | 1720 | 2240 |
| MBN 34 | 840 | 2160 | 2200 | 3100 | 3120 |
| MIH 002 | 2320 | 51320 | 121100 | 144180 | 123900 |
| MIH 012 | 2960 | 33620 | 40920 | 40740 | 75840 |
| MIH 013 | 30360 | 31980 | 55360 | 42800 | 71220 |
| MIH 030 | 17625 | 178500 | 273938 | 169750 | 189625 |
| MIH 053 | + | 534960 | 231620 | 530900 | 878340 |
| MIH 055 | 10560 | 43960 | 54220 | 49400 | 37400 |
| MIH 074 | 5700 | 3980 | 6020 | 3640 | 4940 |
| MIH 112 | 30480 | 271980 | 490780 | 423600 | 416140 |
| MIH 157 | 520 | 165480 | 82920 | 169980 | 146320 |
| MIN 003a | 1300 | 57720 | 21620 | 35380 | 34560 |
| MIN 003b | 1760 | 32820 | 30940 | 27760 | 26600 |
| MIN 017 | 540 | 437380 | 375120 | 447740 | 902780 |
| MIN 067 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MIN 126 | 44320 | 63600 | 38460 | 56680 | 40300 |
| MIN 139 | 460 | 146320 | 142800 | 94520 | 105600 |
| MIN 146 | 200 | 49920 | 32100 | 19900 | 30400 |
| MIN 217 | 0 | 3220 | 1880 | 2320 | 2580 |
| MIN 589 | 154780 | 267740 | 127100 | 144160 | 228040 |
결과는 본 발명의 프라이머, 조합 B 및 C가 더 많은 임상 시료를 증폭시킴을 나타낸다. 프라이머 조합 B 및 C는 30개의 시료중 1개를 제외한 모든 것을 증폭시킬 수 있다. 대조적으로, 앰플리코 HIV-1 모니터 테스트는 29개의 시료에서 6개를 증폭하지 못하였다. 앰플리코 HIV-1 모니터 테스트를 이용하여 시료 MIH 053을 증폭시키면 강한 표적 신호가 생성되지만, QS 신호를 발생시키는 것은 실패하였다. 따라서, 시료는 정량될 수 없고 상기 표에서 +로 표시된다.
또한, 상당수의 시료의 경우, 프라이머 조합 B 또는 C중 하나를 이용하였을 때 추정되는 카피 수는 앰플리코 HIV-1 모니터 테스트를 이용했을 때 추정되는 것보다 상당히 더 높다. 상기 실시예 2에 개시된 증폭 효율 다양성을 기준으로하였을 때, 앰플리코 HIV-1 모니터를 이용하여 수득되는 주형의 더 낮은 추정 농도는 상당히 더 낮은 증폭 효율에 기인한다.
바이러스 RNA는 시료 MIN 067에서 검출되지않았다. 그러나, 이것이 프라이머 하이브리드 형성 또는 프로브 하이브리드 형성, 또는 일부 다른 이유로 방해되는 표적 서열의 보이지않는 다양성에 기인한 것인지의 여부는 알려지지않았다.
서열 리스트
(1) 일반적인 정보:
(i) 출원인:
(A) 성명: 에프 호프만-라 롯슈 아크티엔게젤샤프트
(B) 거리: 그렌짜헤르스트라세 124
(C) 시: 바즐
(D) 주: BS
(E) 국가: 스위스
(F) 우편 번호: 체하-4070
(G) 전화번호: 061-688 37 82
(H) 텔레팩스: 061-688 13 95
(I) 텔렉스: 962292/965542 hlr ch
(ii) 발명의 명칭: 인간 면역결핍 바이러스 1형 검출용 프라이머
(iii) 서열의 수: 7
(iv) 컴퓨터 판독형:
(A) 매체형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: 애플 매킨토시
(C) 작동 시스템: 시스템 7.1(매킨토시)
(D) 소프트웨어: 워드 5.1
(v) 이전의 출원 자료:
출원 번호: 60-037744
출원일: 1997년 1월 17일
(2) 서열 식별 번호 1에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄 형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: DNA(게놈)
(xi) 서열 개시: 서열 식별 번호: 1:
서열 1
(2) 서열 식별 번호 2에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄 형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: DNA(게놈)
(xi) 서열 개시: 서열 식별 번호: 2:
서열 2
(2) 서열 식별 번호 3에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 28 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄 형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: DNA(게놈)
(xi) 서열 개시: 서열 식별 번호: 3:
서열 3
(2) 서열 식별 번호 4에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄 형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: DNA(게놈)
(xi) 서열 개시: 서열 식별 번호: 4:
서열 4
(2) 서열 식별 번호 5에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄 형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: DNA(게놈)
(xi) 서열 개시: 서열 식별 번호: 5:
서열 5
(2) 서열 식별 번호 6에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄 형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: DNA(게놈)
(xi) 서열 개시: 서열 식별 번호: 6:
서열 6
(2) 서열 식별 번호 7에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄 형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: DNA(게놈)
(xi) 서열 개시: 서열 식별 번호: 7:
서열 7
본 발명에 의하면, 종래의 프라이머로 증폭되지않았던 단리물을 포함하는 HIV-1 M군 단리물을 거의 일정한 효율로 증폭시키는 HIV-1 검출용의 개선된 프라이머 및 이를 이용한 검출 방법을 제공할 수 있다.
Claims (15)
- SKCC1(서열 식별 번호: 3) 및 SKCC3(서열 식별 번호: 4)으로 구성된 군에서 선택되는 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1) 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머.
- SK145(서열 식별 번호: 1) 및 SKCC1(서열 식별 번호: 3)로 구성된 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머.
- 제 2 항의 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 SK145M2(서열 식별 번호: 2)로 구성된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
- SK145(서열 식별 번호: 1) 및 SKCC3(서열 식별 번호: 4)으로 구성된 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머.
- 제 4 항의 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 SK145M2(서열 식별 번호: 2)로 구성된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
- 제 1 항의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1) 핵산 검출용 키트.
- 제 2 항의 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1) 핵산 검출용 키트.
- 제 3 항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1) 핵산 검출용 키트.
- 제 4 항의 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1) 핵산 검출용 키트.
- 제 5 항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1) 핵산 검출용 키트.
- SKCC1(서열 식별 번호: 3) 또는 SKCC3(서열 식별 번호: 4)을 이용하여 폴리머레이즈 연쇄 반응시킴을 포함하는, 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1)의 증폭 방법.
- 제 11 항에 있어서,SK145(서열 식별 번호: 1) 및 SKCC1(서열 식별 번호: 3)을 이용하여 폴리머레이즈 연쇄 반응시키는 방법.
- 제 12 항에 있어서,SK145M2(서열 식별 번호: 2)를 또한 이용하여 폴리머레이즈 연쇄 반응시키는 방법.
- 제 11 항에 있어서,SK145(서열 식별 번호: 1) 및 SKCC3(서열 식별 번호: 4)을 이용하여 폴리머레이즈 연쇄 반응시키는 방법.
- 제 11 항에 있어서,SK145M2(서열 식별 번호: 2)를 또한 이용하여 폴리머레이즈 연쇄 반응시키는 방법.
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