ES2960366T3 - Método para diagnosticar cáncer de mama - Google Patents

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Abstract

La invención se refiere a un método de diagnóstico de cáncer de mama y al uso de biomarcadores para la detección y diagnóstico de cáncer de mama. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método para diagnosticar cáncer de mama
Antecedentes de la invención
El claro impacto del cáncer de mama (CM) en la salud femenina y la esperanza de vida asociada se refleja en un número cada vez mayor de tasas de incidencia global durante el transcurso de las últimas décadas. La verificación de datos de registros de cáncer de 102 países en el período 1990 - 2016 como parte del estudio Carga Global de Enfermedad (GBD) [1] identificó el cáncer de mama (CM) como la enfermedad maligna más frecuente en mujeres con 1,7 millones de casos en todo el mundo en 2016 [2]. Las neoplasias malignas que se originan en el tejido mamario representan el 25 % de todos los cánceres femeninos [3]. Desde 1990, las tasas de incidencia de cáncer de mama aumentaron a más del doble en 60/102 países, afectando tanto a regiones desarrolladas como en desarrollo [2]. La detección precoz del cáncer de mama es el factor decisivo para la tasa de curación [4-6], aunque las tasas de mortalidad asociadas al cáncer de mama podrían reducirse en general gracias a mejores opciones de detección y tratamiento, los patrones de calidad heterogéneos en diferentes países sustentan un punto débil crucial en la gestión del CM [2, 7]. Los métodos de detección de CM de rutina, incluidos palpación, mamografía y ecografía, se caracterizan por diversas limitaciones, por ejemplo, tasas moderadas de sensibilidad y especificidad, especialmente en tejido mamario más denso, menor cumplimiento del paciente [8, 9]. Por lo tanto, existe una enorme demanda de innovación en los métodos para mejorar el diagnóstico (precoz) del cáncer de mama.
Los biomarcadores de enfermedades basados en biopsias líquidas ofrecen una variedad de perspectivas prometedoras como herramientas importantes de pronóstico, diagnóstico y teranóstico [10]. Hay varios tipos de biomarcadores disponibles en líquidos corporales mediante procedimientos de muestreo mínimos o no invasivos [10]. Entre otras cosas, las moléculas de microARN circulantes (miARN/miR) parecen ser matrices robustas y fiables en cuanto a detectabilidad y especificidad en el diagnóstico y seguimiento de enfermedades [10, 11]. Recientemente, se ha podido demostrar la viabilidad de los miR urinarios en la detección del cáncer de mama [12]. De forma similar, la aplicabilidad de los miR urinarios con características diagnósticas también se demostró en otros tipos de tumores [10, 13-15]. Posteriormente al aislamiento de miR de exosomas en muestras de orina, el análisis de expresión de estos pequeños ácidos nucleicos proporciona un patrón característico distintivo para distinguir a los pacientes con cáncer de los controles sanos [12, 14, 16].
La expresión mal regulada de los miembros de la familia let-7 de miARN podría estar relacionada con la carcinogénesis de mama [17-22]. Los distintos miARN let-7 tienen el potencial de emplearse como posibles marcadores moleculares en el diagnóstico de CM y como objetivos terapéuticos [22-25].
La implicación funcional y las supuestas implicaciones diagnósticas de miR-17 en el CM podrían demostrarse en varios estudios [26-29] y uno de ellos señaló el potencial predictivo en el tratamiento de la recurrencia del CM [30]. Los niveles de expresión aberrantes de miR-125 se relacionan con la tumorigénesis del CM, dentro del cual muestra una correlación funcional con el subtipo de CM que sobreexpresa HER2, lo que influye en el riesgo metastásico y el pronóstico correspondientes [31-34]. Se descubrió que la transformación maligna del tejido mamario iba acompañada de actividades de miR-222 que regulan vías de señalización decisivas en la progresión del tumor [35-37]. Lo más interesante es que miR-222 ofrece potencialmente poder predictivo en el CM positivo a receptores hormonales [38]. La transferencia intercelular de miR-222 mediada por exosomas se encontró asociada con metástasis de CM [39]. Con especial atención en el CM, el potencial biomarcador de miR-107 podría demostrarse en varios estudios funcionales, que también reveló su impacto en la actividad de BRCA1 y la predicción de la recurrencia de CM en el CM triple negativo (CMTN) [40-45]. Entre otras cosas, se descubrió que los niveles de miR-107 circulante se correlacionaban con la metástasis en los ganglios linfáticos y el estado del receptor en pacientes con CM [46]. Se descubrió que la vía de señalización Wnt/p-catenina en el CM estaba regulada por miR-194, afectando así a la proliferación, la migración y la invasión de las células cancerosas [47]. Las moléculas de miR-194 circulantes podrían estar relacionadas con el riesgo de recurrencia del cáncer de mama [48], pero también mostraron una interrelación funcional con el agente anti-HER2 trastuzumab [49].
El trasfondo funcional de miR-423 y el impacto crucial de los SNP (polimorfismos de un solo nucleótido) alterados en el gen miR-423 en la biología del CM se hicieron evidentes en investigaciones recientes [50, 51]. Otro aspecto funcional lo proporcionan los niveles de expresión combinada de miR-423 y miR-4417, lo que podría diferenciar el 70,1 % de los CM hereditarios y no hereditarios [52].
Aparte del impacto regulatorio relevante para el cáncer en el CM de tipo basal [53], las actividades supresoras de tumores que influyen en la resistencia a la quimioterapia del CM podrían describirse para miR-424 [54]. Un estudio de biomarcadores de CM basado en suero podría identificar una firma de 3 miR que comprende los niveles de expresión de miR-424, miR-29c y miR-199a con la mayor precisión diagnóstica para distinguir a los pacientes con cáncer de mama de los controles sanos [55]. Los efectos oncogénicos podrían estar relacionados con la expresión de miR-660, con funciones desencadenantes en la proliferación, migración y actividades antiapoptóticas del C<m>[56]. Un análisis de secuenciación de próxima generación derivado de tejido de C<m>extrajo miR-660 como un candidato a biomarcador prometedor con características pronósticas significativas en la supervivencia global (SG) y la supervivencia libre de recurrencia (SLR) en pacientes de CM [57]. En este estudio, se analizaron los niveles de expresión de un conjunto de trece tipos distintos de miARN en la orina de pacientes con CM no tratados en comparación con controles sanos para extraer una herramienta de biomarcadores no invasiva aplicable para el diagnóstico de CM. El documento EP 3070178 A1 describe estudios sobre muestras de orina de pacientes con cáncer de mama. Se descubrió que los miARN urinarios miR-21, miR-125b, miR-375 y miR-451 mostraban niveles de expresión significativamente reducidos en pacientes con cáncer de mama en comparación con los controles sanos. Adicionalmente, el miARN urinario miR-155 mostró un mayor nivel de expresión en pacientes con cáncer de mama. El documento EP 3070178 A1 sugiere, en particular, la determinación del nivel de expresión de los cuatro miARN miR-21, miR-125b, miR-155 y miR-451 en muestras de orina permite discriminar entre individuos sanos y pacientes con CM.
Existe una necesidad continua de métodos mejorados para diagnosticar el cáncer de mama.
Sumario de la invención
Los inventores investigaron muestras de orina de pacientes con cáncer de mama y sorprendentemente descubrieron que ciertos tipos de miARN y combinaciones de los mismos son útiles en el diagnóstico del cáncer de mama. En particular, un panel de tipos de miARN, que comprende al menosmiR-424, miR-660ylet7-yo,se descubrió que era una herramienta de biomarcadores combinados altamente específica para discriminar pacientes con cáncer de mama frente a controles sanos según una muestra de orina. Los inventores desarrollaron además un método altamente eficaz para aislar exosomas de orina y otros fluidos corporales, lo cual es particularmente útil en el método para diagnosticar CM descrito en el presente documento.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Valores de NRQ de expresión de miR en muestras de orina de pacientes con CM.
Figura 2:Valores de NRQ de expresión de miR en muestras de orina de controles sanos.
Figura 3: Rutas de coeficientes para el procedimiento de refuerzo gradual. El eje x muestra las etapas de refuerzo (aquí de 1 a 1500), el eje y muestra las estimaciones de coeficientes para cada variable seleccionada. Después de 1500 etapas, se habían seleccionado siete variables.
Figura 4:Esquema de flujo de trabajo sobre el aislamiento de microvesículas de fluidos corporales.
Figura 5:Montaje de equipos de método de filtración.
Figura 6:Transferencia Western que muestra el resultado del Ejemplo 2.
Descripción detallada
La presente invención abarca métodos para diagnosticar si un sujeto tiene, o está en riesgo de desarrollar, cáncer de mama, que comprende determinar el nivel de productos del gen miR en una muestra de orina del sujeto y comparar el nivel de los productos del gen miR en la muestra de orina con el nivel de los respectivos productos del gen miR en una muestra de control.
En particular, la invención se refiere a un método para diagnosticar si un sujeto tiene cáncer (por ejemplo, cáncer de mama), que comprende determinar el nivel de productos del gen miR en una muestra de orina del sujeto, en donde un aumento o una disminución en el nivel de los productos del gen miR en la muestra de orina, en relación con el nivel de los respectivos productos del gen miR en una muestra de control, es indicativo de que el sujeto tiene cáncer (por ejemplo, cáncer de mama), en donde los productos del gen miR son miR-424, miR-660, let7-i.
Como se usa en el presente documento de manera indistinta, un "producto del gen miR", "microARN", "miR", o "miARN" se refiere al transcrito de ARN no procesado (por ejemplo, precursor) o procesado (por ejemplo, maduro) de un gen miR. Como los productos del gen miR no se traducen en proteínas, el término "productos del gen miR" no incluye proteínas. El transcrito del gen miR sin procesar también se denomina "precursor de miR" o "miR prec" y normalmente comprende un transcrito de ARN de aproximadamente 70-100 nucleótidos de longitud. El precursor de miR puede procesarse mediante digestión con una ARNasa (por ejemplo, Dicer, Argonauta o ARNasa III (por ejemplo, ARNasa III de E. coli)) en una molécula de ARN activa de 19-25 nucleótidos. Esta molécula de ARN activa de 19-25 nucleótidos también se denomina transcrito del gen miR "procesado" o miARN "maduro". La molécula de ARN activa de 19-25 nucleótidos se puede obtener a partir del precursor de miR mediante rutas de procesamiento naturales (por ejemplo, usando células intactas o lisados celulares) o mediante rutas de procesamiento sintéticas (por ejemplo, usando enzimas de procesamiento aisladas, tales como Dicer, Argonaut o ARNasa III aislados). Se entiende que la molécula de ARN activa de 19-25 nucleótidos también puede producirse directamente mediante síntesis biológica o química, sin haber sido procesado a partir del precursor miR. Cuando en el presente documento se hace referencia a un microARN por su nombre, el nombre corresponde tanto a la forma precursora como a la madura, a menos que se indique otra cosa. La Tabla 1 representa las secuencias de nucleótidos de microARN humanos maduros preferidos utilizados en la presente invención.
Tabla 1
Tal como se usa en el presente documento, un "sujeto" puede ser cualquier mamífero que tiene, o se sospecha que tiene, cáncer de mama. En una realización preferida, el sujeto es un ser humano que tiene, o se sospecha que tiene, cáncer de mama. Lo más preferentemente, el sujeto es una mujer, por ejemplo, una mujer de entre 30 y 70 años, de 35 a 69 años, de 40 a 67 años o de 45 a 65 años.
La expresión "muestra de orina" se refiere a una muestra que comprende o consiste en orina, o que se deriva de orina. Para determinar el nivel de productos del gen miR en la muestra de orina, la orina nativa generalmente se procesa antes del análisis. El procesamiento puede incluir (pero sin limitaciones) aislamiento y/o purificación de ARN, centrifugación, precipitación de ácido nucleico, disolución del ácido nucleico precipitado, concentración, dilución, filtración y combinaciones de los mismos. Estas muestras procesadas están abarcadas por el término "muestra de orina". En una realización, la muestra de orina a analizar se puede obtener o se obtiene enriqueciendo o aislando vesículas extracelulares de la orina. En otra realización, la muestra de orina se puede obtener o se obtiene enriqueciendo o aislando exosomas de la orina. En realizaciones preferidas, la muestra de orina que se va a analizar se puede obtener o se obtiene mediante un método para aislar exosomas que se describe a continuación.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "vesículas extracelulares" (VE) se refiere a vesículas contenidas en membranas liberadas por las células. Las VE se pueden clasificar en términos generales en 3 clases principales: (a) Microvesículas (o micropartículas o ectosomas) que se producen por gemación y fisión de la membrana plasmática; (b) Exosomas que se forman dentro de la red endosómica y se liberan tras la fusión de cuerpos multivesiculares con la membrana plasmática; y (c) Cuerpos apoptóticos que se liberan como ampollas de células que experimentan apoptosis.
El nivel de productos del gen miR se determina en una muestra de orina obtenida del sujeto. Una muestra de control correspondiente, que también es una muestra de orina, puede obtenerse de un individuo humano sano o de una población de individuos sanos. El individuo "control" sano tiene, preferentemente, el mismo sexo que el sujeto y, opcionalmente, una edad similar (es decir, /- 10 años la edad del sujeto). Lo más preferentemente, el individuo "control" es una mujer sana de entre 30 y 70 años, de 35 a 69 años, de 40 a 67 años o de 45 a 65 años. Luego, la muestra de orina de control se procesa junto con la muestra de orina del sujeto, de modo que los niveles del producto del gen miR en la muestra de orina del sujeto se puedan comparar con los niveles respectivos del producto del gen miR en la muestra de control. También se puede utilizar como control un patrón de expresión de miR de referencia para la muestra de orina.
Una alteración (por ejemplo, un aumento o disminución) en el nivel de un producto del gen miR en la muestra obtenida del sujeto, en relación con el nivel del producto génico miR respectivo en una muestra de control, tal como se describe a continuación, es indicativo de la presencia de cáncer de mama en el sujeto. En una realización, el nivel de al menos un producto del gen miR en la muestra de prueba es mayor que el nivel del producto del gen miR respectivo en la muestra de control (es decir, la expresión del producto del gen miR está "regulada positivamente"). Tal como se usa en el presente documento, la expresión de un producto del gen miR está "regulada positivamente" cuando la cantidad del producto del gen miR en una muestra de orina de un sujeto es mayor que la cantidad del mismo producto del gen en una muestra de control.
En otra realización, el nivel de al menos un producto del gen miR en la muestra de orina es menor que el nivel del producto del gen miR respectivo en la muestra de control (es decir, la expresión del producto del gen miR está "regulada positivamente"). Tal como se usa en el presente documento, la expresión de un gen miR está "regulada negativamente" cuando la cantidad de producto del gen miR producido a partir de ese gen en una muestra de orina de un sujeto es menor que la cantidad producida a partir del mismo gen en una muestra de control.
La expresión relativa del gen miR en las muestras normales y de control se puede determinar con respecto a uno o más patrones de expresión de ARN. Los patrones pueden comprender, por ejemplo, el nivel de expresión del gen miR urinario en un sujeto sano, o el nivel promedio de expresión del gen miR urinario obtenido previamente para una población de controles humanos sanos. "Sano" significa que el sujeto o los controles humanos no tienen cáncer de mama u otro tipo de cáncer.
El método comprende determinar el nivel de un producto del gen miR-424, un producto del gen miR-660 y un producto del gen let7-i, en donde una disminución en los niveles de los productos de los genes let7-i y miR-660 en la muestra de orina, con respecto a los niveles respectivos de los respectivos productos del gen miR en una muestra de control, y un aumento en el nivel del producto del gen miR-424 en la muestra de orina, en relación con el nivel del producto del gen miR-424 en la muestra de control, es indicativo de que el sujeto tiene cáncer de mama.
Determinación del nivel de productos del gen miR
El nivel de un producto del gen miR en una muestra de orina se puede medir usando cualquier técnica que sea adecuada para detectar niveles de expresión de ARN en una muestra de orina. Los ácidos nucleicos pueden usarse como sondas o cebadores para realizaciones que implican hibridación de ácidos nucleicos. Así, se pueden utilizar para evaluar la expresión de miARN. Las secuencias de nucleótidos de la invención se pueden usar por su capacidad para formar selectivamente moléculas dúplex con tramos complementarios de ADN y/o ARN o para proporcionar cebadores para la amplificación de ADN o ARN a partir de muestras.
Preferentemente, la eficiencia del procesamiento con respecto a la extracción de ARN, la síntesis de ADN complementario (transcripción inversa) y la amplificación por PCR se controlan mediante la adición de una muestra de ARN de control "añadida" de concentración definida al tampón de lisis de ARN, según lo recomendado por Marabita [4]. El procedimiento detallado se describe en el presente documento en la sección 1.6 del Ejemplo 1.
En otra realización preferida, la cantidad de cada producto del gen miR se normaliza convirtiéndola en cantidades relativas normalizadas (NRQ) para el producto del gen miR respectivo. En dicha realización, el NRQ se usa como el nivel del producto del gen miR.
Se puede usar la transcripción inversa (RT) de ARN a ADNc seguida de PCR cuantitativa (RT-PCR) para determinar las concentraciones relativas de especies de ARNm específicas. Al determinar que la concentración de una especie de ARNm específica varía, se muestra que el gen que codifica las especies de mARN específicas se expresa de manera diferencial. Otro método de amplificación es la reacción en cadena de la ligasa ("LCR"). La patente de EE.UU. n.° 4.883.750 describe un método similar a LCR para unir pares de sondas a una secuencia diana. También se puede usar un método basado en PCR™ y ensayo de oligonucleótido ligasa (OLA), como se divulga en la patente de los Estados Unidos n.° 5.912.148. Los métodos alternativos para la amplificación de secuencias de ácidos nucleicos diana que se pueden usar en la práctica de la presente invención se divulgan en las patentes de EE. UU. n.° 5.843.650, 5.846.709, 5.846.783, 5.849.546, 5.849.497, 5.849.547, 5.858.652, 5.866.366, 5.916.776, 5.922.574, 5.928.905, 5.928.906, 5.932.451, 5.935.825, 5.939.291 y 5.942.391, la solicitud GB N.° 2.202.328 y en la solicitud PCT N.° PCT/US89/01025, cada una de las cuales se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad. Como alternativa, se puede utilizar PCT digital o PCR de gotas digitales o secuenciación de próxima generación para determinar el nivel del producto del gen miR en la muestra de orina. Puede usarse cualquier otro método adecuado para determinar la cantidad de microARN.
Como alternativa, se puede construir una oligobiblioteca, en formato de microchip (es decir, una micromatriz), que contiene un conjunto de sondas oligonucleotídicas que son específicas para un conjunto de genes miR. Usando tal micromatriz, el nivel de expresión de múltiples microARN en una muestra de orina se puede determinar mediante transcripción inversa de los ARN para generar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana e hibridarlos para sondear los oligonucleótidos en la micromatriz para generar un perfil de hibridación o expresión. Luego, el perfil de hibridación de la muestra de prueba se puede comparar con el de una muestra de control para determinar qué microARN tienen un nivel de expresión alterado en las células de cáncer de mama. Tal como se usa en el presente documento, "sonda oligonucleotídica" o "sonda oligodesoxinucleotídica" se refiere a un oligonucleótido que es capaz de hibridar con un oligonucleótido diana. "Oligonucleótido diana" u "oligodesoxinucleótido diana" se refiere a una molécula que se va a detectar (por ejemplo, mediante hibridación). Por "sonda oligonucleotídica específica de miR" o "sonda oligonucleotídica específica de miR" se entiende una sonda oligonucleotídica que tiene una secuencia seleccionada para hibridarse con un producto del gen miR específico o con un transcrito inverso del producto del gen miR específico.
El método de la invención puede comprender además la etapa de comparar el nivel del producto del gen miR en la muestra de orina con un nivel de control del producto del gen miR (por ejemplo, el nivel en una muestra de control) y diagnosticar si el sujeto tiene cáncer de mama, en donde una disminución o aumento del producto del gen miR en la muestra de orina, en relación con el nivel de control del producto del gen miR es indicativo de que el sujeto tiene cáncer de mama.
El cáncer de mama es un cáncer que comienza en la mama, generalmente en el revestimiento interno de los conductos o lóbulos galactóforos. Hay diferentes tipos de cáncer de mama, con diferentes estadios (propagación), agresividad y composición genética. Los subtipos de cáncer de mama se pueden clasificar según una base inmunohistoquímica. El cáncer de mama a diagnosticar, detectar, seguir o examinar de acuerdo con la presente invención puede ser carcinoma ductal invasivo, carcinoma ductalin situo carcinoma lobulillar invasivo. Como alternativa, el CM puede clasificarse según el estado del receptor. En otra realización, por tanto, el cáncer de mama a diagnosticar, detectar, seguir o examinar de acuerdo con la presente invención puede ser:
CM "normal" (ER+, PR+, HER2+, citoqueratina 5/6+ y HER1+),
CM "luminal A" (ER+ y/o PR+, HER2-),
CM "luminal B" (ER+ y/o PR+, HER2+),
CM "triple negativo" (ER-, PR-, HER2-),
CM "HER2+/ER-" (ER-, PR- y HER2+) o
"CM no clasificado" (ER-, PR-, HER2-, citoqueratina 5 /6-y HER1-).
En el método de la invención, el nivel de un producto del gen miR en la muestra de orina, en relación con el nivel del producto génico miR respectivo en una muestra de control, normalmente se incrementa en al menos un 10 % o al menos un 25 % o al menos un 50 % o al menos un 100 %, para ser indicativo de cáncer de mama. El nivel de un producto del gen miR en la muestra de orina, en relación con el nivel del producto génico miR respectivo en una muestra de control, normalmente se reduce en al menos un 10 %, al menos un 25 % o al menos un 50 %, para ser indicativo de cáncer de mama.
En el método de la invención, el nivel del producto del gen miR-660 y/o del producto del gen let7-i en la muestra de orina del sujeto, en relación con el nivel de control del producto del gen miR correspondiente, puede reducirse en al menos un 25 % para ser indicativo de cáncer de mama y/o el nivel del producto del gen miR-424, en la muestra de orina del sujeto, en relación con el nivel de control del producto del gen miR-424, puede aumentarse en al menos un 50 % para ser indicativo de cáncer de mama.
En otra realización, el nivel del producto del gen miR-660 y/o del producto del gen let7-i en la muestra de orina del sujeto, en relación con el nivel de control del correspondiente producto del gen miR, puede reducirse en al menos un 50 % para ser indicativo de cáncer de mama y/o el nivel del producto del gen miR-424, en la muestra de orina del sujeto, en relación con el nivel de control del producto del gen miR-424, puede aumentarse en al menos un 100 % para ser indicativo de cáncer de mama.
En otra realización, el nivel del producto del gen miR-660 y/o del producto del gen let7-i en la muestra de orina del sujeto, en relación con el nivel de control del correspondiente producto del gen miR, puede reducirse en al menos un 75 % para ser indicativo de cáncer de mama y/o el nivel del producto del gen miR-424, en la muestra de orina del sujeto, en relación con el nivel de control del producto del gen miR-424, puede aumentarse en al menos un 200 % para ser indicativo de cáncer de mama.
Al sujeto se le puede diagnosticar cáncer de mama si
- el nivel del producto del gen miR-424 en la muestra de orina del sujeto es superior al 110 %, superior al 125 %, superior al 150 % o superior al 200 % del nivel de control del producto del gen miR-424 (por ejemplo, el nivel en la muestra de control);
- el nivel del producto del gen miR-660 en la muestra de orina del sujeto es inferior al 90 %, inferior al 75 % o inferior al 50 % del nivel de control del producto del gen miR-660 (por ejemplo, el nivel en la muestra de control); y
- el nivel del producto del gen let7-i en la muestra de orina del sujeto es inferior al 90 %, inferior al 75 % o inferior al 50 % del nivel de control del producto del gen let7-i (por ejemplo, el nivel en la muestra de control);
y opcionalmente si, además,
- el nivel del producto del gen miR-423 en la muestra de orina del sujeto es inferior al 90 %, inferior al 75 % o inferior al 50 % del nivel de control del producto del gen miR-423 (por ejemplo, el nivel en la muestra de control);
- el nivel del producto del gen miR-125b en la muestra de orina del sujeto es superior al 110 %, superior al 125 %, superior al 150 % o superior al 200 % del nivel de control del producto del producto del gen miR-125b (por ejemplo, el nivel en la muestra de control); y/o
- el nivel del producto del gen let7-d en la muestra de orina del sujeto es superior al 110 %, superior al 125 %, superior al 150%o superior al 200%del nivel de control del producto del gen let7-d (por ejemplo, el nivel en la muestra de control).
En una realización particular, al sujeto se le diagnostica cáncer de mama si
- el nivel del producto del gen miR-424 en la muestra de orina del sujeto es superior al 110 %, superior al 125 %, superior al 150 % o superior al 200 % del nivel de control del producto del gen miR-424 (por ejemplo, el nivel en la muestra de control);
- el nivel del producto del gen miR-660 en la muestra de orina del sujeto es inferior al 90 %, inferior al 75 % o inferior al 50 % del nivel de control del producto del gen miR-660 (por ejemplo, el nivel en la muestra de control); y
- el nivel del producto del gen let7-i en la muestra de orina del sujeto es inferior al 90 %, inferior al 75 % o inferior al 50 % del nivel de control del producto del gen let7-i (por ejemplo, el nivel en la muestra de control);
y opcionalmente si, además,
- el nivel del producto del gen miR-423 en la muestra de orina del sujeto es inferior al 90 %, inferior al 75 % o inferior al 50 % del nivel de control del producto del gen miR-423 (por ejemplo, el nivel en la muestra de control);
- el nivel del producto del gen miR-125b en la muestra de orina del sujeto es superior al 110 %, superior al 125 %, superior al 150 % o superior al 200 % del nivel de control del producto del producto del gen miR-125b (por ejemplo, el nivel en la muestra de control); o
- el nivel del producto del gen let7-d en la muestra de orina del sujeto es superior al 110 %, superior al 125 %, superior al 150 % o superior al 200 % del nivel de control del producto del gen let7-d (por ejemplo, el nivel en la muestra de control).
Kits
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un kit de diagnóstico o una micromatriz, que comprende un oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:11, un oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:12 y un oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:17, para la detección o diagnóstico del cáncer de mama. El kit preferentemente comprende además un oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:10 o un oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:7 o un oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:14.
Tal como se usa en el presente documento, "capaz de hibridarse" se refiere, preferentemente, a condiciones de hibridación de alta rigurosidad. Por "condiciones de alta rigurosidad" se entiende que la secuencia de nucleótidos se hibrida específicamente con una secuencia diana (la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento) en una cantidad que es detectablemente más fuerte que la hibridación no específica. Las condiciones de alta rigurosidad incluyen condiciones que distinguirían un polinucleótido con una secuencia complementaria exacta de una secuencia aleatoria que tenía unas pocas regiones pequeñas (por ejemplo, 3-10 bases) que coincidían con la secuencia de nucleótidos. Estas pequeñas regiones de complementariedad se funden más fácilmente que un complementario de longitud completa de 14-17 o más bases, y una hibridación de alta rigurosidad las hace fácilmente distinguibles. Las condiciones de alta rigurosidad incluirían, por ejemplo, condiciones de baja salinidad y/o alta temperatura, tales como las que proporciona el NaCl 0,02-0,1 M, a temperaturas de 50-70 °C (por ejemplo, NaCl 0,05 M a 60 °C).
En otro aspecto más, la invención se refiere al uso de un oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:11, un oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:12 y un oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la s Eq ID NO:17 para el diagnóstico de cáncer de mama, comprendiendo dicho uso poner en contacto dicho(s) oligonucleótido(s) con una muestra de orina. El uso preferentemente comprende además poner en contacto un oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:10, un oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:7 o un oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:14 con dicha muestra de orina. Los oligonucleótidos pueden inmovilizarse en una micromatriz.
En realizaciones particulares del kit o uso descrito anteriormente, el oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:11 es perfectamente complementario de la SEQ ID NO:11, el oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:12 es perfectamente complementario con la SEQ ID NO:12 y/o el oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:17 es perfectamente complementario con la SEQ ID NO:17. Además, el oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:10 puede ser perfectamente complementario de la SEQ ID NO:10. Además, el oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:7 puede ser perfectamente complementario de la SEQ ID NO:7. Además, el oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:14 puede ser perfectamente complementario de la SEQ ID NO:14. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "complementario" se refiere al complementario inverso, a menos que se indique lo contrario.
En otras realizaciones, el kit contiene un par de cebadores para amplificar un miR descrito en el presente documento. El kit puede comprender un par de cebadores capaces de amplificar miR-424, un par de cebadores capaces de amplificar miR-660 y un par de cebadores capaces de amplificar let7-i. El kit puede comprender además un par de cebadores capaces de amplificar miR-423, un par de cebadores capaces de amplificar miR-125b y/o un par de cebadores capaces de amplificar let7-d. El kit puede comprender además un par de cebadores capaces de amplificar miR-17, un par de cebadores capaces de amplificar let7-f, un par de cebadores capaces de amplificar miR-222 y/o un par de cebadores capaces de amplificar miR-194.
El kit puede comprender además un cebador universal para la reacción de transcripción inversa.
Este kit de diagnóstico se puede utilizar para el cribado de mamas, por ejemplo, al identificar cambios en los niveles de miARN en orina en pacientes con cáncer de mama en comparación con individuos normales sin cáncer, en un grupo de control. El kit puede usarse además para el pronóstico y/o predicción del resultado, por ejemplo, identificando diferencias entre pacientes con cáncer en etapa temprana o tardía, así como estratificar a los pacientes en subtipos moleculares. Esta información puede ayudar en la planificación estratégica del régimen terapéutico de un paciente individual. Asimismo, el kit puede utilizarse para el seguimiento de la respuesta a los tratamientos, por ejemplo, mediante mediciones seriadas de miARN urinario; particularmente en entornos de quimioterapia neoadyuvante y enfermedad metastásica.
Los métodos, usos y kits de la invención se han descrito anteriormente en relación con el cáncer de mama. La invención también es aplicable para el diagnóstico, detección y/o cribado de otros tipos de cáncer, por ejemplo, carcinomas de mama, carcinomas de pulmón, carcinomas gástricos, carcinomas esofágicos, carcinomas colorrectales, carcinomas hepáticos, carcinomas de ovario, tecomas, arrenoblastomas, carcinomas de cuello de útero, carcinoma de endometrio, hiperplasia endometrial, endometriosis, fibrosarcomas, coriocarcinoma, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma nasofaríngeo, carcinomas de laringe, hepatoblastoma, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas de piel, hemangioma, hemangioma cavernoso, hemangioblastoma, carcinomas de páncreas, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, schwannoma, oligodendroglioma, meduloblastoma, neuroblastomas, rabdomiosarcoma, sarcoma osteogénico, leiomiosarcomas, carcinomas del tracto urinario, carcinomas tiroideos, tumor de Wilm, carcinoma de células renales, carcinoma de próstata, proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales) y/o síndrome de Meigs. Las realizaciones descritas anteriormente en relación con el CM se aplican a estos otros tipos de cáncermutatis mutandis.
Otro aspecto de la presente divulgación es un método para enriquecer o aislar vesículas extracelulares, en particular exosomas, de una muestra de fluido corporal. El fluido corporal puede ser cualquier fluido corporal, incluyendo, pero sin limitación, sangre, plasma, orina, ascitis, líquido amniótico y saliva.
El método comprende filtrar la muestra de fluido corporal a través de una membrana de filtro que tiene propiedades de unión a proteínas. La membrana filtrante es preferentemente una membrana de poliamida, por ejemplo, una membrana de nailon. El tamaño de los poros es típicamente de aproximadamente 0,1 pm a aproximadamente 1 pm, preferentemente de aproximadamente 0,15 pm a aproximadamente 500 pm, más preferentemente de aproximadamente 0,18 pm a aproximadamente 0,25 pm, por ejemplo, aproximadamente 0,22 pm.
En ciertas realizaciones, el método comprende además, antes de la filtración a través de la membrana de unión a proteínas, una prefiltración a través de una membrana que no tiene propiedades de unión a proteínas. La prefiltración puede servir para separar EV más grandes, tales como microvesículas, de exosomas que tienen un tamaño más pequeño. Por consiguiente, el tamaño de poro de la membrana de prefiltración es típicamente de aproximadamente 0,18 pm a aproximadamente 0,25 pm, preferentemente de aproximadamente 0,19 pm a aproximadamente 0,21 pm, por ejemplo, aproximadamente 0,2 pm. La membrana de prefiltración puede estar hecha de un material celulósico tal como acetato de celulosa.
Inicialmente, la muestra de líquido corporal se puede centrifugar para eliminar los restos celulares.
Después de la filtración a través de la membrana de unión a proteínas, los exosomas se unen a la membrana. El método de la invención comprende además recuperar los exosomas de la membrana. Esto normalmente se logra poniendo en contacto la membrana con una solución adecuada, tal como un tampón de lisis. Los tampones adecuados pueden incluir una sustancia tampón para mantener el pH del tampón de lisis en un intervalo de aproximadamente 6,5 a 8, o de 7 a 7,5, por ejemplo, de aproximadamente 7,2. El tampón de lisis puede contener un tensioactivo o detergente. Los tensioactivos adecuados incluyen laurilsulfato de sodio y Triton X100.
El método para enriquecer o aislar exosomas o vesículas extracelulares se puede usar en el método de diagnóstico de cáncer descrito en el presente documento, por ejemplo, para proporcionar la muestra de orina.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben entenderse como limitantes de la invención a las realizaciones ilustradas.
Ejemplo 1
1. Métodos
1.1 Cohorte
La cohorte de casos y controles estuvo compuesta por 69 pacientes no tratados, recién diagnosticados con CM primario en el entorno adyuvante y 40 controles de sexo femenino sanas en el Departamento de Obstetricia y Ginecología, Centro Médico Universitario de Friburgo. El estado de salud del control se confirmó mediante una exploración médica realizada por un médico clínico experimentado que incluyó ganglios linfáticos regionales y mamarios para excluir posibles cánceres de mama y cualquier historial de otras enfermedades (malignas) o inflamación actual. Además, los controles sanos se sometieron a ecografía y mamografía de mama y axila. Al organizar los procedimientos de acuerdo con las directrices nacionales actuales, todos los pacientes con CM fueron evaluados para excluir casos de estadios avanzados con metástasis a distancia.
Los protocolos de investigación correspondientes (36/12 y 386/16) fueron aprobados por la junta de revisión ética institucional de la Universidad de Friburgo. Todos los pacientes y controles sanos implicados otorgaron su consentimiento informado por escrito. Las características de la cohorte clínica se resumen en la Tabla 2.
Tabla 2: Características de cohorte de pacientes con cáncer de mama (CM) y controles sanos
Pacientes con CM Controles sanos valor de p
N 69 40
mediana de la edad, y 58 (30-79) 45 (20-72) 0.
Histología
ductal invasivo 49
lobulillar invasivo 5
Estadio tumoral
pT1a 2
pT1b 5
pT1c 39
pT2 17
pT3 2
Estado nodal
pN0 53
pN1 11
pN2 1
Gradación
G1 10
G2 43
G3 8
Pacientes con CM Controles sanos valor de p
Estado de receptor hormonal
Positivo para ER 53
Positivo para PR 50
Estado de HER2neu
positivo 4
1.2 Muestra de miARN
Este estudio de identificación de biomarcadores con aplicabilidad diagnóstica con respecto a la detección de cáncer de mama se basa en el análisis de expresión de tipos de miARN circulantes en orina. El conjunto elegido de trece muestras de miARN se caracteriza por las características combinadas de una relación funcional comprobada con el cáncer de mama y una detectabilidad sólida y fiable en muestras de orina humana. Debido a los propósitos de normalización en la cuantificación relativa de los niveles de expresión de miARN, en un estudio previo se pudieron identificar dos muestras de miARN con características internas (miR16, -26b) [12]. En la Tabla 2 se enumera información definitiva sobre los tipos de miARN, incluidas las secuencias diana.
Tabla 2: Información sobre nombres y secuencias de miARN utilizados en el análisis de expresión.
miARN Secuencia de miARN SEQ ID NO:
cel-miR39-3p# UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG 1
ath-miR159a# UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA 2
hS8-miR16-5p UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG 3
hsa-miR17-5p CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG 4
hsa-miR26b-5p UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU 5
hS8-miR107-5p AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA 6
hS8-miR125b-5p UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA 7
hS8-miR194-5p UGUAACAGCAACUCCAUGUGGA 8
hS8-miR222-3p AGCUACAUCUGGCUACUGGGU 9
hsa-miR423-5p UGAGGGGCAGAGAGCGAGACUUU 10
hsa-miR424-5p CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA 11
hsa-miR660-5p UACCCAUUGCAUAUCGGAGUUG 12
hsa-let7a-5p UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU 13
hsa-let7d-5p AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU 14
hsa-let7e-5p UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU 15
hsa-let7f-5p UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU 16
hsa-let7i-5p UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU 17 #muestra de ARN de control de adición sintética exógena
1.3 Muestreo y almacenamiento
Se recogieron muestras de orina espontánea nativa en vasos de muestreo de orina estériles de 100 ml (Sarstedt, Alemania) y se almacenaron en alícuotas de 10 ml (Urin Monovette, Sarstedt, Alemania) a -80 °C hasta su posterior procesamiento.
1.4 Preparación de la muestra, aislamiento de ARN y transcripción inversa
Las muestras de orina nativa criopreservadas se descongelaron a temperatura ambiente y se centrifugaron (4000 rpm; 15 min; 4 °C) para eliminar posibles residuos de restos celulares u otros precipitados sólidos del sobrenadante de orina pura.
Para el aislamiento de exosomas/microvesículas cargados de miARN a partir de muestras de orina, se transfirieron 10 ml de orina centrifugada a una jeringa de 10 ml (n.° 4617207V; BRAUN, Melsungen, Alemania) con un filtro de jeringa de nailon de 0,22 pm roscado (n.° 02542904; Perkin Elmer, Waltham, USA). Con el pistón insertado, la muestra se filtró gota a gota a través del filtro roscado. Después de la filtración, los filtros se lavaron con 5 ml de tampón DPBS (n.° 14190185; ThermoFisher Scientific, Karlsruhe, Alemania) usando una jeringa nueva de 5 ml (n.° 4617053V; BRAUN, Melsungen, Alemania) para eliminar residuos de muestras que posiblemente interfieran con aplicaciones posteriores. Después del lavado, el aislamiento de ARN total se realizó utilizando el kit de purificación de ARN total Norgen (n.° 17200, NORGEN Biotek Corp., Thorold, Canadá). Según el protocolo del fabricante [58] (Apéndice B: "Purificación de ARN total a partir de plasma o suero") se extruyeron 600 pl de tampón de lisis a través de una membrana de filtro. El ARN purificado se eluyó en 35 pl de tampón de elución. El procesamiento adicional de la muestra de ARN se definió en un volumen estándar de 2,5 pl.
La transcripción inversa (RT) de miARN se realizó utilizando 2,5 pl de muestra de ARN, 5 pl de tampón RT 5x, 0,1 mM de ATP, cebador RT de 0,5 pM, 0,1 mM de cada desoxinucleótido (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 25 unidades de Maxima Reverse Transcriptase (Thermo) y 1 unidad de poli(A) polimerasa (New England Biolabs GmbH, Frankfurt, Alemania) en un volumen final de 25 pl. La incubación de la reacción se fijó en 30 min a 42 °C seguida de la inactivación enzimática a 85 °C durante 10 min.
El diseño del cebador para la reacción RT se adaptó a la herramienta de software "miRprimer" de Busk [59]. La información del cebador RT se incluye en la Tabla 3. Las muestras de ADNc se diluyeron en H2O hasta un volumen final de 200 j l y se almacenaron a -20 °C hasta su posterior procesamiento.
Tabla 3: Información sobre cebadores utilizados en el análisis de expresión de tipos de miARN.
miARN Cebador sentido Cebador antisentido
cel-miR39-3p# GTCACCGGGTGTAAATCAG (SEQ ID GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTCAAG (SEQ ID NO:18) NO:19)
ath-miR159a# GCGCAGTTTGGATTGAAG (SEQ ID AGGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTAGAG (SEQ ID NO:20) NO:21)
hsa-miR16-5p CGCAGTAGCAGCACGTA (SEQ ID CAGTTTTTTTTTTTTTTTCGCCAA (SEQ ID NO:23)
NO:22)
hsa-miR17-5p GCAAAGTGCTTACAGTGCAG (SEQ GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTCTAC (SEQ ID ID NO:24) NO:25)
hsa-miR26b-5p CGCAGTTCAAGTAATTCAGGAT GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTACCT (SEQ ID (SEQ ID NO:26) NO:27)
hsa-miR107-5p GCAGAGCAGCATTGTACAG (SEQ ID GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTGATAG (SEQ ID NO:28) NO:29)
hsa-miR125b-5p GCAGTCCCTGAGACCCT (SEQ ID CCAGTTTTTTTTTTTTTTTCACAAGT (SEQ ID NO:30) NO:31)
hsa-miR194-5p CAGTGTAACAGCAACTCCA(SEQ ID TCCAGTTTTTTTTTTTTTTTCCACAT (SEQ ID NO:32) NO:33)
hsa-miR222-3p GCAGAGCTACATCTGGCT (SEQ ID CCAGTTTTTTTTTTTTTTTACCCAGT (SEQ ID NO:34) NO:35)
hsa-miR423-5p CAGTGAGGGGCAGAGAG (SEQ ID GGTCCAGTTTT TTTTTTTTTTTAAAGTC (SEQ ID NO:36) NO:37)
hsa-miR424-5p AGCAGCAGCAATTCATGT (SEQ ID AGGTCCAGTTT TTTTTTTTTTTTCAA (SEQ ID NO:38) NO:39)
hsa-miR660-5p AGTACCCATTGCATATCGGA (SEQ GGTCCAGTTTT TTTTTTTTTTTCAAC (SEQ ID ID NO:40) NO:41)
hsa-let7a-5p GCAGTGAGGTAGTAGGTTG (SEQ ID GGTCCAGTTTT TTTTTTTTTTTAACTATAC (SEQ NO:42) ID NO:43)
hsa-let7d-5p CGCAGAGAGGTAGTAGGTTG (SEQ GGTCCAGTTTT TTTTTTTTTTTAACTATG (SEQ ID ID NO:44) NO:45)
hsa-let7e-5p GCAGTGAGGTAGGAGGTTG (SEQ GGTCCAGTTTT TTTTTTTTTTTAACTATAC (SEQ ID NO:46) ID NO:47)
hsa-let7f-5p CGCAGTGAGGTAGTAGATTG (SEQ CAGGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTAAC (SEQ ID ID NO:48) NO:49)
hsa-let7i-5p GCAGTGAGGTAGTAGTTTGTG (SEQ GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTAACAG (SEQ ID ID NO:50) NO:51)
RT de miARN* CAGGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTVN ;(SEQ ID NO:52) ;#muestra de ARN de control de adición sintética exógena; *cebador universal para la reacción de transcripción inversa (RT).
1.5 Cuantificación de miARN basada en qPCR
La determinación cuantitativa de los niveles de expresión de miARN se realizó mediante PCR en tiempo real en LightCycler® 480 (Roche, Mannheim, Alemania). Configuración de la reacción de PCR: 1 j l de ADNc, tampón qPCR interno (que contiene TRIS pH8,1, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, amonio de magnesio, de potasio, SYBRGreen (Jena Bioscience, Jena, Alemania), potenciadores) 0,25 U de HotStart Taq Polymerase (Jena Bioscience) en un volumen total de 10 jl.
Los cebadores para la qPCR se diseñaron mediante el software "miRprimer" [59] y se enumeran en la Tabla 3.
Programa de PCR compuesto por desnaturalización inicial (95 °C; 2 min); 40 ciclos: desnaturalización (95 °C; 5 s)/hibridación/extensión (60 °C; 30 s); curva de fusión.
La cuantificación relativa de los niveles de expresión de miARN se realizó en un análisis por duplicado basado en el método ACt normalizado en los valores medios de expresión correspondientes de los miARN constitutivos miR-16 y -26b. La validación de los miARN internos aplicables para el establecimiento del análisis de miARN urinario se demostró en el estudio anterior de los inventores [12] y está descrita metódicamente por Marabita.et al.[60].
1.6 Normalización del procesamiento técnico mediante ARN de control de adición
El seguimiento de la eficiencia del procesamiento con respecto a la extracción de ARN, la síntesis de ADN complementario (transcripción inversa) y la amplificación por PCR se realizaron mediante la adición de una muestra de ARN de control de concentración definida al tampón de lisis de ARN según lo recomendado por Marabita.et al.
[60]. Con eso, 5fM dos tipos de ARN sintético exógeno(Caenorhabditis elegans:cel-miR-39 yArabidopsis thaliana:re-miR-159; Biomers.net GmbH, Ulm, Alemania; secuencias en la Tabla 3) se añadieron al tampón de lisis de ARN (Norgen).
La normalización técnica de los datos de expresión obtenidos por qPCR se realizó en función de puntos umbral (Ct) con cantidades relativas (CR) definidas como aquellos valores de Ct escalados a la media geométrica de los ARN de adición de referencia y conversión a una escala lineal CR = 2-ACt con ACt =Ct miARN - Ct media geométrica de la adición.
El factor de normalización (FN) se calculó como la media geométrica de los normalizadores seleccionados (muestra de miARN interna (miR16, -26b) para cada muestra(j).Por lo tanto, el FN se aplica para extraer las cantidades relativas normalizadas (CRN) para cada muestra de miARN i yj:
NRQi j= R Q ijlNFy [60]
1.7 Análisis estadístico
La evaluación de biomarcadores se centró en la extracción del valor diagnóstico de los trece tipos de miARN analizados y sus combinaciones con respecto a la detección del cáncer de mama en la orina. Con este objetivo se usaron varios enfoques estadísticos, descritos a continuación.
1. Frecuencias de selección variables con validación cruzada: En cada una de las 10.000 repeticiones, se seleccionaron aleatoriamente una submuestra de tamaño 2/3 de los datos (la muestra de entrenamiento), ajustados a un modelo de regresión logística utilizando selección directa y se determinó la frecuencia de inclusión de cada variable. A continuación, se eligieron las 7 variables con mayor frecuencia de inclusión, se ajustaron un modelo al conjunto de datos completo y se redujo aún más este modelo mediante selección directa, eligiendo finalmente dentro de todos los modelos convergentes el que minimizó el criterio de información de Akaike (AIC).
2. Frecuencias de selección de variables conbootstrap:Se extrajeron 10.000 muestras debootstrap(con repetición). En cada muestra debootstrap,se realizó el modelado y la selección de variables como en el primer enfoque.
3. Análisis ROC/validación cruzada: Similar al enfoque 1, pero ahora se aplicó el modelo que se ajustó en la muestra de entrenamiento a la muestra de prueba (restante), con coeficientes fijos (100 repeticiones). Se construyeron las curvas de características operativas del receptor (ROC) y se usó el área bajo la curva (AUC) como medida de bondad de ajuste.
Frecuencias de selección variables con refuerzo: El refuerzo es un procedimiento gradual y regularizado para ajustar modelos lineales generalizados. Comenzando por establecer todos los coeficientes de regresión en cero, en cada etapa se actualiza un coeficiente, tal que el ajuste del modelo mejora más. El número de etapas se determina mediante validación cruzada. Como muchos coeficientes nunca se actualizarán, el refuerzo proporciona un modelo escaso. El resultado se visualizó mostrando las rutas de los coeficientes. El refuerzo se realizó utilizando el paquete R GAMBoost [61].
4.Regresión de todos los subconjuntos: Todos los modelos posibles 212 = 4096 se ajustaron y compararon según el AIC. A continuación, se restringió la lista a modelos convergentes con como máximo 4 variables.
Todos los análisis se realizaron utilizando el entorno de software estadístico abierto R [62].
2. Resultados
El panel completo de las trece muestras de miARN circulantes se pudo detectar de manera confiable en todas las muestras de orina de la cohorte de prueba. Las variaciones dependientes de la muestra en los niveles de expresión de miARN debido a parámetros variables de la orina (por ejemplo, dilución, concentración de ácidos nucleicos) podían equilibrarse mediante la normalización frente al conjunto de dos miARN constitutivos expresados de manera estable 16 y 26b.
Basado en niveles de expresión de miARN derivados de qPCR convertidos a cantidades relativas normalizadas (CRN; Figura 1 y Figura 2), la evaluación de la potencia diagnóstica específica del tipo de miARN con respecto a los propósitos de discriminación de los casos de cáncer de mama frente a controles sanos se evaluó empleando varios métodos estadísticos (consulte la sección Métodos). De este modo se comparó la aplicabilidad y validez de los métodos. Estos métodos se consideraron tanto de manera singular cada uno como de manera combinada. La información resumida resultante de los análisis estadísticos utilizados se describe en los siguientes (1)-(5).
(1) Frecuencias de selección variables con validación cruzada
Las funciones empíricas de distribución acumulativa de los coeficientes de regresión en las 10.000 repeticiones dieron como resultado el siguiente esquema de clasificación en frecuencias de tipo de miARN (frecuencia de inclusión, en relación con todos los modelos seleccionados, entre paréntesis; aumento = expresión regulada por aumento, disminución = expresión regulada por disminución).
1. miR-424 (95.98 %; aumento)
2. miR-423 (72.3 %; disminución)
3. miR-660 (68.7 %; disminución)
4. let7-i (59.97 %; disminución)
5. miR-17 (15.96 %; aumento)
6. let7-f (14.65 %; disminución)
7. miR-222 (9.82 %; aumento)
8. miR-194 (8.59 %; aumento)
9. miR-125b (3.57 %; aumento)
10. let7-d (3.25 %; disminución)
La selección directa basada en estas diez variables (tipos de miARN) condujo a un modelo que incluye las primeras cinco variables (miR-424, miR-423, miR-660, let7-i, miR-17). Dado que los modelos con más de cuatro variables (tipos de miARN) no lograron converger, estos fueron excluidos de una evaluación estadística adicional. Aplicando estas restricciones, este enfoque estadístico proporcionó el modelo:miR-424 miR-423 miR-660 let7-i.
(2) Frecuencias de selección de variables conbootstrap
Las funciones empíricas de distribución acumulativa de los coeficientes de regresión en las 10.000 repeticiones dieron como resultado la siguiente clasificación de los tipos de miARN elegidos con mayor frecuencia
1. miR-424 ; aumento)
2. miR-660 (64.23 %; disminución)
3. miR-423 (58.96 %; disminución)
4. let7-i (58.96 %; disminución)
5. let7-f ; disminución)
6. miR-17 (12.46 %; aumento)
7. miR-222 , aumento)
8. miR-194 (9.44 %; aumento)
9. miR-125b (5.82 %; aumento)
10. let7-d (3.57 %; aumento)
La selección directa condujo a un modelo con los cinco tipos de miARN let7-i, let7-f, miR-423, miR-424, miR-660. De nuevo, la falta de convergencia de modelos con más de cuatro variables llevó a la reducción a la siguiente combinación de tipos de miARN, lo que es idéntico al resultado del primer enfoque estadístico:miR-424 miR-423 miR-660 let7-i.
(3) Análisis ROC/validación cruzada
El modelo previamente preferido con cuatro variables miR-424, miR-423, miR-660, let7-i (1, 2)) fue seleccionado en 18 de 100 repeticiones. En todas estas repeticiones, la AUC fue 1 tanto para la muestra de entrenamiento como para la muestra de prueba, si se instaló de nuevo el mismo modelo. Cuando se aplicó el modelo ajustado con coeficientes fijos a la muestra de prueba, los valores de AUC oscilaron entre 0,905 y 1 con un valor mediano de 0,995.
Hubo varios modelos alternativos con como máximo cuatro tipos de miARN con valores de AUC prometedores. La combinación más frecuentemente seleccionada de cinco tipos de miARN fue nuevamente miR-424, miR-423, miR660, let7-i y miR-17.
(4) Frecuencias de selección variables con refuerzo
Después de 1500 etapas de refuerzo, se seleccionaron siete tipos de miARN (incluidos los obtenidos mediante enfoques anteriores). Estos eran miR-424 (aumento), miR-423 (disminución), miR-660 (disminución), let-7i (disminución), miR-194 (aumento), let7-a (disminución), miR-125b (aumento), véase la figura 3.
(5) Regresión de todos los subconjuntos
Se instalaron los 4.096 posibles modelos candidatos. La restricción a modelos convergentes con como máximo cuatro variables proporcionó los siguientes modelos superiores:
1. miR-424 miR-660 let7-i miR-125b (AIC 15,0)
2. miR-424 mi-R423 miR-660 let7-i (AIC 16,3)
3. miR-424 miR-660 let7-i let7-d (AIC 17.2)
4. miR-424 miR-660 let7-i (AIC 19.2)
El primer modelo caracterizado por el AIC más bajo (AIC = 15,0) se produjo sólo aquí, no en los enfoques anteriores. El segundo modelo contiene los cuatro tipos de miARN (miR-424 miR-423 miR-660 let7-i) con la mayor frecuencia de inclusión en los enfoques (1) y (2). El segundo modelo ocurrió también en el enfoque (3).
Obsérvese que la regresión de todos los subconjuntos funciona sin validación cruzada, ya que todos los modelos se ajustan al conjunto de datos completo. Por lo tanto, este método de regresión carece de información sobre el rendimiento predictivo de los modelos.
Resumiendo, un panel de cuatro tipos de miARN, que comprendemiR-424, miR-423, miR-660ylet7-ipodría elegirse como una herramienta de biomarcadores combinatorios altamente específica para discriminar pacientes con cáncer de mama frente a controles sanos basándose en una muestra de orina.
Abreviaturas
AIC criterio de información de Akaike
AUC área bajo la curva
miARN/miR ácido micro ribonucleico
FN factor de normalización
NGS secuenciación de última generación
CRN cantidades relativas normalizadas
PET tomografía por emisión de positrones
qPCR reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa
ROC característica operativa del receptor
SNP polimorfismo de un único nucleótido
Referencias
1. Disease, G.B.D., I. Injury, and C. Prevalence, Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet, 2017. 390(10100): págs. 1211-1259.
2. Sharma, R., Breast cancer incidence, mortality and mortality-to-incidence ratio (MIR) are associated with human development, 1990-2016: evidence from Global Burden of Disease Study 2016. Breast Cancer, 2019.
3. Momenimovahed, Z. y H. Salehiniya, Epidemiological characteristics of and risk factors for breast cancer in the world. Breast Cancer (Dove Med Press), 2019. 11: págs. 151-164.
4. Oeffinger, K.C.,et al.,Breast Cancer Screening for Women at Average Risk: 2015 Guideline Update From the American Cancer Society. JAMA, 2015. 314(15): págs. 1599-614.
5. Tabar, L.,et al.,Insights from the breast cancer screening trials: how screening affects the natural history of breast cancer and implications for evaluating service screening programs. Breast J, 2015. 21(1): págs. 13-20. 6. Wockel, A.,et al.,Interdisciplinary Screening, Diagnosis, Therapy and Follow-up of Breast Cancer. Guideline of the DGGG and the DKG (S3-Level, AWMF Registry Number 032/045OL, December 2017) - Part 1 with Recommendations for the Screening, Diagnosis and Therapy of Breast Cáncer. Geburtshilfe Frauenheilkd, 2018.
78(10): págs. 927-948.
7. Sankaranarayanan, R.,et al.,Cancer survival in Africa, Asia, and Central America: a population-based study. Lancet Oncol, 2010. 11(2): págs. 165-73.
8. Kolb, T.M., J. Lichy y J.H. Newhouse, Comparison of the performance of screening mammography, physical examination, and breast US and evaluation of factors that influence them: an analysis of 27.825 patient evaluations. Radiology, 2002. 225(1): págs. 165-75.
9. Wang, L., Early Diagnosis of Breast Cancer. Sensors (Basel), 2017. 17(7).
10. Arneth, B., Update on the types and usage of liquid biopsies in the clinical setting: a systematic review. BMC Cancer, 2018. 18(1): pág. 527.
11. Salehi, M. y M. Sharifi, Exosomal miRNAs as novel cancer biomarkers: Challenges and opportunities. J Cell Physiol, 2018. 233(9): págs. 6370-6380.
12. Erbes, T.,et al.,Feasibility of urinary microRNA detection in breast cancer patients and its potential as an innovative non-invasive biomarker. BMC Cancer, 2015. 15: pág. 193.
13. Balacescu, O.,et al.,Urinary microRNAs for prostate cancer diagnosis, prognosis, and treatment response: are we there yet? Wiley Interdiscip Rev RNA, 2017. 8(6).
14. Gasparri, M.L.,et al.,Beyond circulating microRNA biomarkers: Urinary microRNAs in ovarian and breast cancer. Tumour Biol, 2017. 39(5): pág. 1010428317695525.
15. Grayson, K.,et al.,Urine Biomarkers for the Early Detection of Ovarian Cancer -A re We There Yet? Biomark Cancer, 2019. 11: p. 1179299X19830977.
16. Franzen, C.A.,et al.,Urinary Exosomes: The Potential for Biomarker Utility, Intercellular Signaling and Therapeutics in Urological Malignancy. J Urol, 2016. 195(5): págs. 1331-1339.
17. Balzeau, J.,et al.,The LIN28/let-7 Pathway in Cancer. Front Genet, 2017. 8: pág. 31.
18. Dufresne, S.,et al.,A Review of Physical Activity and Circulating miRNA Expression: Implications in Cancer Risk and Progression. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2018. 27(1): págs. 11-24.
19. Elghoroury, E.A.,et al.,Evaluation of miRNA-21 and miRNA Let-7 as Prognostic Markers in Patients With Breast Cancer. Clin Breast Cancer, 2018. 18(4): p. e721-e726.
20. Masood, N.,et al.,Entangling Relation of Micro RNA-let7, miRNA-200 and miRNA-125 with Various Cancers. Pathol Oncol Res, 2017. 23(4): págs. 707-715.
21. Sen, C.K.,et al.,Micromanaging vascular biology: tiny microRNAs play big band. J Vasc Res, 2009. 46(6): págs. 527-40.
22. Thammaiah, C.K. y S. Jayaram, Role of let-7 family microRNA in breast cancer. Noncoding RNA Res, 2016.
1(1): págs. 77-82.
23. de Anda-Jauregui, G.,et al.,Nonredundant, Highly Connected MicroRNAs Control Functionality in Breast Cancer Networks. Int J Genomics, 2018. 2018: pág. 9585383.
24. Lehmann, T.P.,et al.,Relative levels oflet-7a, miR-17, miR-27b, miR-125a, miR-125b and miR-206 as potential molecular markers to evaluate grade, receptor status and molecular type in breast cancer. Mol Med Rep, 2015.
12(3): págs. 4692-4702.
25. Sun, H.,et al.,Let7 miRNAs sensitize breast cancer stem cells to radiationinduced repression through inhibition of the cyclin D1/Akt1/Wnt1 signaling pathway. Mol Med Rep, 2016. 14(4): págs. 3285-92.
26. Bobbili, M.R.,et al.,OncomiR-17-5p: alarm signal in cancer? Oncotarget, 2017. 8(41): págs. 71206-71222. 27. Hesari, A.,et al.,Expression of circulating miR-17, miR-25, and miR-133 in breast cancer patients. J Cell Biochem, 2018.
28. Li, J.,et al.,miR-17-5p suppresses cell proliferation and invasion by targeting ETV1 in triple- negative breast cáncer. BMC Cáncer, 2017. 17(1): pág. 745.
29. Swellam, M.,etal.,Role of some circulating MiRNAs on breast cancer diagnosis. Arch Physiol Biochem, 2018: págs. 1-9.
30. Wang, Y.,et al.,MiR-17-5p may serve as a novel predictor for breast cancer recurrence. Cancer Biomark, 2018.
22(4): págs. 721-726.
31. Feliciano, A.,et al.,miR-125b acts as a tumor suppressor in breast tumorigenesis via its novel direct targets ENPEP, CK2-alpha, CCNJ, and MEGF9. PLoS One, 2013. 8(10): p. e76247.
32. Ferracin, M.,et al.,miR-125b targets erythropoietin and its receptor and their expression correlates with metastatic potential and ERBB2/HER2 expression. Mol Cancer, 2013. 12(1): pág. 130.
33. Luo, Y.,et al.,Elevated microRNA-125b levels predict a worse prognosis in HER2-positive breast cancer patients. Oncol Lett, 2017. 13(2): págs. 867-874.
34. Mar-Aguilar, F.,et al.,Differential expression of miR-21, miR-125b and miR-191 in breast cancer tissue. Asia Pac J Clin Oncol, 2013. 9(1): págs. 53-9.
35. Amini, S.,et al.,Expression Analysis of MicroRNA-222 in Breast Cancer. Clin Lab, 2018. 64(4): págs. 491-496.
36. Liu, S.,et al.,miR-221/222 activate the Wnt/beta-catenin signaling to promote triple-negative breast cancer. J Mol Cell Biol, 2018. 10(4): págs. 302-315.
37. Liang, Y.K.,et al.,MiR-221/222 promote epithelial-mesenchymal transition by targeting Notch3 in breast cancer cell lines. NPJ Breast Cancer, 2018. 4: pág. 20.
38. Han, S.H.,et al.,MicroRNA-222 Expression as a Predictive Marker for Tumor Progression in Hormone Receptor-Positive Breast Cancer. J Breast Cancer, 2017. 20(1): págs. 35-44.
39. Ding, J.,et al.,Exosome-mediated miR-222 transferring: An insight into NF-kappaB-mediated breast cancer metastasis. Exp Cell Res, 2018. 369(1): págs. 129-138.
40. Gao, B.,et al.,MicroRNA-107 is downregulated and having tumor suppressive effect in breast cancer by negatively regulating brain-derived neurotrophic factor. J Gene Med, 2017. 19(12).
41. Petrovic, N.,et al.,MicroRNA in breast cancer: The association with BRCA1/2. Cancer Biomark, 2017. 19(2): págs. 119-128.
42. Ai, H.,et al.,microRNAs-107 inhibited autophagy, proliferation, and migration of breast cancer cells by targeting HMGB1. J Cell Biochem, 2018.
43. Zhang, L.,et al.,MiR-107 down-regulates SIAH1 expression in human breast cancer cells and silencing of miR-107 inhibits tumor growth in a nude mouse model of triple-negative breast cancer. Mol Carcinog, 2016. 55(5): págs.
768-77.
44. Li, X.Y.,et al.,MiRNA-107 inhibits proliferation and migration by targeting CDK8 in breast cancer. Int J Clin Exp Med, 2014. 7(1): págs. 32-40.
45. Kleivi Sahlberg, K.,et al.,A serum microRNA signature predicts tumor relapse and survival in triple-negative breast cancer patients. Clin Cancer Res, 2015. 21(5): págs. 1207-14.
46. Stuckrath, I.,et al.,Aberrant plasma levels of circulating miR-16, miR-107, miR-130a and miR-146a are associated with lymph node metastasis and receptor status of breast cancer patients. Oncotarget, 2015. 6(15): págs. 13387-401.
47. Yang, F., Z. Xiao y S. Zhang, Knockdown of miR-194-5p inhibits cell proliferation, migration and invasion in breast cancer by regulating the Wnt/beta-catenin signaling pathway. Int J Mol Med, 2018. 42(6): págs. 3355-3363.
48. Huo, D.,et al.,Identification of a circulating microRNA signature to distinguish recurrence in breast cancer patients. Oncotarget, 2016. 7(34): págs. 55231-55248.
49. Le, X.F.,et al.,Modulation of MicroRNA-194 and cell migration by HER2-targeting trastuzumab in breast cancer. PLoS One, 2012. 7(7): p. e41170.
50. Zhao, H.,et al.,Genetic analysis and preliminary function study of miR-423 in breast cáncer. Tumour Biol, 2015.
36(6): págs. 4763-71.
51. Smith, R.A.,et al.,A genetic variant located in miR-423 is associated with reduced breast cancer risk. Cancer Genomics Proteomics, 2012. 9(3): págs. 115-8.
52. Murria Estal, R.,et al.,MicroRNA signatures in hereditary breast cancer. Breast Cancer Res Treat, 2013. 142(1): págs. 19-30.
53. Wang, J.,et al.,miR-424-5p regulates cell proliferation, migration and invasion by targeting doublecortin-like kinase 1 in basal-like breast cancer. Biomed Pharmacother, 2018. 102: págs. 147-152.
54. Rodriguez-Barrueco, R.,et al.,miR-424(322)/503 is a breast cancer tumor suppressor whose loss promotes resistance to chemotherapy. Genes Dev, 2017. 31(6): págs. 553-566.
55. Zhang, L.,et al.,A circulating miRNA signature as a diagnostic biomarker for non-invasive early detection of breast cancer. Breast Cancer Res Treat, 2015. 154(2): págs. 423-34.
56. Shen, Y.,et al.,Inhibition of miR-660-5p expression suppresses tumor development and metastasis in human breast cancer. Genet Mol Res, 2017. 16(1).
57. Krishnan, P.,et al.,Next generation sequencing profiling identifies miR-574-3p and miR-660-5p as potential novel prognostic markers for breast cancer. BMC Genomics, 2015. 16: pág. 735.
58. Norgen-Biotek-Corp. Total RNA Purification Kit Product Insert Product # 17200, 37500, 17250 https://norqenbiotek.com/sites/default/files/resources/Total%20RNA%20Purification%20Kit% 20Insert%20PI17200-33.pdf. 2018.
59. Busk, P.K., A tool for design of primers for microRNA-specific quantitative RT-qPCR. BMC Bioinformatics, 2014.
15: pág. 29.
60. Marabita, F.,et al.,Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Brief Bioinform, 2016. 17(2): págs. 204-12.
61. Tutz, G. y H. Binder, Generalized additive modeling with implicit variable selection by likelihood-based boosting. Biometrics, 2006. 62(4): págs. 961-71.
62. R-Core-Team, R: A language and environment for statistical computing https.-//www.r-proiect.org/.2018. 63. Ghosh, R.K., T. Pandey y P. Dey, Liquid biopsy: A new avenue in pathology. Cytopathology, 2019. 30(2): págs.
138-143.
64. Mader, S. y K. Pantel, Liquid Biopsy: Current Status and Future Perspectives. Oncol Res Treat, 2017. 40(7-8): págs. 404-408.
65. Pantel, K. y C. Alix-Panabieres, Liquid biopsy and minimal residual disease - latest advances and implications for cure. Nat Rev Clin Oncol, 2019. 16(7): págs. 409-424.
66. Rossi, G. y M. Ignatiadis, Promises and Pitfalls of Using Liquid Biopsy for Precision Medicine. Cancer Res, 2019. 79(11): págs. 2798-2804.
67. Alimirzaie, S., M. Bagherzadeh y M.R. Akbari, Liquid biopsy in breast cancer: A comprehensive review. Clin Genet, 2019. 95(6): págs. 643-660.
68. Wang, H.X. y G. Olivier, Tumor-derived extracellular vesicles in breast cancer: from bench to bedside. Cancer Lett, 2019.
69. Zubor, P.,et al.,Why the Gold Standard Approach by Mammography Demands Extension by Multiomics? Application of Liquid Biopsy miRNA Profiles to Breast Cancer Disease Management. Int J Mol Sci, 2019. 20(12).
70. Beretov, J.,et al.,Proteomic Analysis of Urine to Identify Breast Cancer Biomarker Candidates Using a Label-Free LC-MS/MS Approach. PLoS One, 2015. 10(11): p. e0141876.
71. Burton, C.,et al.,Urinary metallomics as a novel biomarker discovery platform: Breast cancer as a case study. Clin Chim Acta, 2016. 452: págs. 142-8.
72. Guo, C.,et al.,Discriminating patients with early-stage breast cáncer from benign lesions by detection of oxidative DNA damage biomarker in urine. Oncotarget, 2017. 8(32): págs. 53100-53109.
73. Herman-Saffar, O.,et al.,Early non-invasive detection of breast cancer using exhaled breath and urine analysis. Comput Biol Med, 2018. 96: págs. 227-232.
74. Woollam, M.,et al.,Detection of Volatile Organic Compounds (VOCs) in Urine via Gas Chromatography-Mass Spectrometry QTOF to Differentiate Between Localized and Metastatic Models of Breast Cancer. Sci Rep, 2019.
9(1): pág. 2526.
75. Hofbauer, S. L.,et al.,A urinary microRNA (miR) signature for diagnosis of bladder cancer. Urol Oncol, 2018.
36(12): p. 531 e1-531 e8.
76. Kutwin, P.,et al.,Urine miRNA as a potential biomarker for bladder cancer detection - a meta-analysis. Cent European J Urol, 2018. 71(2): págs. 177-185.
77. Lekchnov, E.A.,et al.,Searching for the Novel Specific Predictors of Prostate Cancer in Urine: The Analysis of 84 miRNA Expression. Int J Mol Sci, 2018. 19(12).
78. Moldovan, L.,et al.,Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J Cell Mol Med, 2014. 18(3): págs. 371-90.
79. Liu, J.,et al.,Tumour-suppressive microRNA-424-5p directly targets CCNE1 as potential prognostic markers in epithelial ovarian cancer. Cell Cycle, 2018. 17(3): págs. 309-318.
80. Wei, S.,et al.,miR-424-5p promotes proliferation of gastric cancer by targeting Smad3 through TGF-beta signaling pathway. Oncotarget, 2016. 7(46): págs. 75185-75196.
81. Wu, K.,et al.,MicroRNA-424-5p suppresses the expression of SOCS6 in pancreatic cancer. Pathol Oncol Res, 2013. 19(4): págs. 739-48.
82. Xu, J.,et al.,Suppressed miR-424 expression via upregulation of target gene Chk1 contributes to the progression of cervical cancer. Oncogene, 2013. 32(8): págs. 976-87.
83. Xie, D.,et al.,MicroRNA424 serves an antioncogenic role by targeting cyclindependent kinase 1 in breast cancer cells. Oncol Rep, 2018. 40(6): págs. 3416-3426.
84. Shivapurkar, N.,et al.,Circulating microRNAs in patients with hormone receptor-positive, metastatic breast cancer treated with dovitinib. Clin Transl Med, 2017. 6(1): pág. 37.
85. Fortunato, O.,et al.,Mir-660 is downregulated in lung cancer patients and its replacement inhibits lung tumorigenesis by targeting MDM2-p53 interaction. Cell Death Dis, 2014. 5: p. e1564.
86. He, T.,et al.,miR6605p is associated with cell migration, invasion, proliferation and apoptosis in renal cell carcinoma. Mol Med Rep, 2018. 17(1): págs. 2051-2060.
87. He, X. e Y. Shu, RNA N6-methyladenosine modification participates in miR-660/E2F3 axis- mediated inhibition of cell proliferation in gastric cancer. Pathol Res Pract, 2019. 215(6): pág. 152393.
88. Borzi, C.,et al.,mir-660-p53-mir-486 Network: A New Key Regulatory Pathway in Lung Tumorigenesis. Int J Mol Sci, 2017. 18(1).
89. Zhang, P.,et al.,Downregulation of microRNA660 inhibits cell proliferation and invasion in osteosarcoma by directly targeting forkhead box O1. Mol Med Rep, 2018. 18(2): págs. 2433-2440.
90. Zhou, C.,et al.,Combination of serum miRNAs with Cyfra21-1 for the diagnosis of non-small cell lung cancer. Cancer Lett, 2015. 367(2): págs. 138-46.
91. Elkhadragy, L.,et al.,A regulatory BMI1/let-7i/ERK3 pathway controls the motility of head and neck cancer cells. Mol Oncol, 2017. 11(2): págs. 194-207.
92. Gadducci, A.,et al.,Micro-RNAs and ovarian cancer: the state of art and perspectives of clinical research. Gynecol Endocrinol, 2014. 30(4): págs. 266-71.
93. Hur, K.,et al.,Identification of a metastasis-specific MicroRNA signature in human colorectal cancer. J Natl Cancer Inst, 2015. 107(3).
94. Qin, M.M.,et al.,let-7i inhibits proliferation and migration of bladder cáncer cells by targeting HMGA1. BMC Urol, 2019. 19(1): pág. 53.
95. Xie, J.,et al.,miR-7 inhibits the invasion and metastasis of gastric cancer cells by suppressing epidermal growth factor receptor expression. Oncol Rep, 2014. 31(4): págs. 1715-22.
96. Yang, W.H.,et al.,Repression of bone morphogenetic protein 4 by let-7i attenuates mesenchymal migration of head and neck cancer cells. Biochem Biophys Res Commun, 2013. 433(1): págs. 24-30.
97. Mahn, R.,et al.,Circulating microRNAs (miRNA) in serum of patients with prostate cancer. Urology, 2011. 77(5): p. 1265 e9-16.
98. Xiao, D.,et al.,Melanoma cell-derived exosomes promote epithelial-mesenchymal transition in primary melanocytes through paracrine/autocrine signaling in the tumor microenvironment. Cancer Lett, 2016. 376(2): págs.
318-27.
99. Chakraborty, C. y S. Das, Profiling cell-free and circulating miRNA: a clinical diagnostic tool for different cancers. Tumour Biol, 2016. 37(5): págs. 5705-14.
100. Zhu, Y.,et al.,Identification of a serum microRNA expression signature for detection of lung cancer, involving miR-23b, miR-221, miR-148b and miR-423-3p. Lung Cancer, 2017. 114: págs. 6-11.
101. Du, W., Z. Feng y Q. Sun, LncRNA LINC00319 accelerates ovarian cancer progression through miR-423-5p/NACC1 pathway. Biochem Biophys Res Commun, 2018. 507(1-4): págs. 198-202.
102. Lin, H.,et al.,Inhibition of miR-423-5p suppressed prostate cancer through targeting GRIM-19. Gene, 2019.
688: págs. 93-97.
103. Yang, H.,et al.,Exosomal miR-423-5p targets SUFU to promote cancer growth and metastasis and serves as a novel marker for gastric cancer. Mol Carcinog, 2018. 57(9): págs. 1223-1236.
104. McDermott, A.M.,et al.,Identification and validation of oncologic miRNA biomarkers for luminal A-like breast cancer. PLoS One, 2014. 9(1): p. e87032.
105. Ding, H.X.,et al.,MiRNA Polymorphisms and Cancer Prognosis: A Systematic Review and Meta-Analysis. Front Oncol, 2018. 8: pág. 596.
106. Campos-Parra, A.D.,et al.,Micro-RNAs as Potential Predictors of Response to Breast Cancer Systemic Therapy: Future Clinical Implications. Int J Mol Sci, 2017. 18(6).
107. Liu, B.,et al.,Serum miR-21 and miR-125b as markers predicting neoadjuvant chemotherapy response and prognosis in stage II/IN breast cancer. Hum Pathol, 2017. 64: págs. 44-52.
108. Xie, X.,et al.,The role of miR-125b-mitochondria-caspase-3 pathway in doxorubicin resistance and therapy in human breast cancer. Tumour Biol, 2015. 36(9): págs. 7185-94.
109. Hong, L.,et al.,miR-125b inhibited epithelial-mesenchymal transition of triple-negative breast cancer by targeting MAP2K7. Onco Targets Ther, 2016. 9: págs. 2639-48.
110. Matamala, N.,et al.,Tumor microRNA expression profiling identifies circulating microRNAs for early breast cancer detection. Clin Chem, 2015. 61(8): págs. 1098-106.
111. Das, R.,et al.,MicroRNA-194 Promotes Prostate Cancer Metastasis by Inhibiting SOCS2. Cancer Res, 2017.
77(4): págs. 1021-1034.
112. Kong, Q.,et al.,MicroRNA-194 suppresses prostate cancer migration and invasion by downregulating human nuclear distribution protein. Oncol Rep, 2017. 37(2): págs. 803-812.
113. Peng, Y.,et al.,MiRNA-194 activates the Wnt/beta-catenin signaling pathway in gastric cancer by targeting the negative Wnt regulator, SUFU. Cancer Lett, 2017. 385: págs. 117-127.
114. Zhang, X.,et al.,MicroRNA-194 represses glioma cell epithelialtomesenchymal transition by targeting Bmi1. Oncol Rep, 2017. 37(3): págs. 1593-1600.
115. Chen, Y.,et al.,Promotional effect of microRNA-194 on breast cancer cells via targeting F- box/WD repeatcontaining protein 7. Oncol Lett, 2018. 15(4): págs. 4439-4444.
116. Gilles, M.E. y F.J. Slack, Let-7 microRNA as a potential therapeutic target with implications for immunotherapy. Expert Opin Ther Targets, 2018. 22(11): págs. 929-939.
117. Chernyi, V.S.,et al.,Search of MicroRNAs Regulating the Receptor Status of Breast Cancer In Silico and Experimental Confirmation of Their Expression in Tumors. Bull Exp Biol Med, 2017. 163(5): págs. 655-659.
118. Sueta, A.,et al.,Differential expression of exosomal miRNAs between breast cancer patients with and without recurrence. Oncotarget, 2017. 8(41): págs. 69934-69944.
119. Zavesky, L.,et al.,Supernatant versus exosomal urinary microRNAs. Two fractions with different outcomes in gynaecological cancers. Neoplasma, 2016. 63(1): págs. 121-32.
120. Armand-Labit, V. y A. Pradines, Circulating cell-free microRNAs as clinical cancer biomarkers. Biomol Concepts, 2017. 8(2): págs. 61-81.
121. Nedaeinia, R.,et al.,Circulating exosomes and exosomal microRNAs as biomarkers in gastrointestinal cancer. Cancer Gene Ther, 2017. 24(2): págs. 48-56.
122. Pritchard, C.C.,et al.,Blood cell origin of circulating microRNAs: a cautionary note for cancer biomarker studies. Cancer Prev Res (Phila), 2012. 5(3): págs. 492-497.
123. Zhang, J.,et al.,Exosome and exosomal microRNA: trafficking, sorting, and function. Genomics Proteomics Bioinformatics, 2015. 13(1): págs. 17-24.
124. Larssen, P.,et al.,Tracing Cellular Origin of Human Exosomes Using Multiplex Proximity Extension Assays. Mol Cell Proteomics, 2017. 16(3): págs. 502-511.
Ejemplo 2: Sólo las muestras de orina son conforme a la invención
Materiales y métodos
Origen de la muestra
Los fluidos corporales humanos, incluidos suero, orina, ascitis y líquido amniótico, sirvieron como matrices para probar el método de aislamiento de microvesículas basado en filtros. La totalidad de las muestras de especímenes humanos utilizadas en este estudio, provienen de material sobrante de intervenciones médicas de rutina o de donantes voluntarios.
Pretratamiento de la muestra y condiciones de almacenamiento
Las muestras de biopsia líquida se obtuvieron de acuerdo con la declaración de Helsinki de la WMA [30]. En general, las muestras de fluido corporal se recogieron y almacenaron en tubos de muestreo estériles a -20 °C hasta su posterior procesamiento. A continuación se describen etapas de pretratamiento adicionales e información detallada para cada matriz de muestra.
Suero:Las muestras de sangre se recogieron utilizando S-Monovette Serum Gel (n.° 04.1925, Sarstedt AG, Nuembrecht, Alemania) y se dejaron coagular a temperatura ambiente durante 20 minutos, seguido de una centrifugación a 2500 g durante 10 minutos a 20 °C para obtener suero puro. Las muestras de suero se transfirieron a un tubo nuevo de polipropileno (pp) de 15 ml (n.° 62.554.502; Sarstedt AG) y se almacenó a -20 °C hasta su posterior procesamiento.
Orina:Los pacientes proporcionaron una muestra de orina recogida en un tubo de muestreo de orina con tapón de rosca estéril de 70 ml (n.° 75.9922.745, Sarsted AG). Las muestras de orina se transfirieron y se dividieron en alícuotas en 10 ml de Urine Monovette (n.° 10.252; Sarsted AG) y se almacenaron a -20 °C hasta su posterior procesamiento.
Aislamiento de microvesículas
Pretratamiento después del almacenamiento
Las muestras de biopsia líquida recién congeladas se descongelaron a temperatura ambiente y se centrifugaron a 4000 g durante 15 minutos para eliminar sedimentos y restos celulares. Después de la centrifugación, el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo de pp de 15 ml (Sarstedt AG) para su posterior procesamiento.
Debido a la mayor viscosidad y contenido de proteínas, el suero de las matrices de muestras, ascitis y líquido amniótico se diluyeron con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 1x estéril (DPBS, n.° 14190185; ThermoFisher Scientific, Karlsruhe, Alemania) en una proporción de 2:3 (muestra de 2 ml: DPBS de 3 ml) para facilitar el proceso de filtración. En la Figura 4 se visualizan ejemplos de variaciones metódicas en el flujo de trabajo que dependen de la matriz.
Disposición de equipos y procesamiento general
Los líquidos de muestra pretratados se transfirieron individualmente a una jeringa de 20 ml (n.° 4617207V; BRAUN, Melsungen, Alemania) con un filtro de jeringa de acetato de celulosa (CA) roscado de 0,2 pm (n.° 514-0061; VWR International GmbH, Darmstadt, Alemania) seguido de un segundo filtro de jeringa de nailon roscado de 0,22 pm (n.° 02542904; Perkin Elmer, Waltham, USA). Al insertar el pistón, las muestras individuales se filtraron gota a gota a través de filtros roscados (Fig. 5). Después de la filtración del volumen completo de la muestra, los filtros en cascada se lavaron con 5 ml de 1x DPBS (Thermo) usando una jeringa nueva de 5 ml (n.° 4617053V; BRAUN, Melsungen, Alemania). El lavado garantiza la eliminación de residuos de muestras que caen por debajo del límite de filtro preestablecido y que posiblemente interfieran con las aplicaciones posteriores. Luego se separaron los filtros aclarados.
El filtro CA retuvo todas las partículas >200 nm, incluyendo microvesículas dentro del límite de tamaño molecular respectivo. Debido a las características de unión no proteica del filtro CA ascendente, todas las microvesículas <200 nm fluyen a través y posteriormente se unen a la membrana de nailon de unión a proteínas del segundo filtro.
La elución de las dos fracciones de microvesículas unidas a filtros diferentes se llevó a cabo extruyendo 500 pl de tampón de lisis de proteínas (HEPES 100 mM, pH 7,2, SDS al 0,1 %, 0,1 % de TRITON X100) a través de cada uno de los filtros separados usados con una jeringa nueva de 2 ml.
Procesamiento específico de matriz de muestra
Para el aislamiento de microvesículas urinarias se utilizaron 20 ml de orina/muestra centrifugada en la etapa de filtración con un rendimiento satisfactorio independiente de las diferencias de concentración entre muestras.
Las muestras de suero, ascitis y líquido amniótico se diluyeron con DPBS como se ha citado anteriormente y se filtraron un volumen final de 5 ml para recolectar las dos fracciones de microvesículas de diferentes tamaños.
Análisis por transferencia Western
Las concentraciones de proteínas de los aislados de muestras se cuantificaron utilizando el método BCA (n.° 23227; ThermoFisher Scientific, Karlsruhe, Alemania). Los extractos de proteínas obtenidos mediante el nuevo método de aislamiento se analizaron mediante la técnica de transferencia Western. Se separaron 10 pg de proteína total mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana IMMOBILON-P (n.° IPVH00010; Merck, Darmstadt, Alemania) mediante el uso de una tetracélula Mini PROTEAN (BioRad, Munich, Alemania). Después de la transferencia, las membranas se bloquearon con leche descremada al 3 % en PBS-T y posteriormente se incubaron con el anticuerpo primario (Anexina V n.° 8555, Flotilina 1 n.° 18634S, HSP70 n.° 46477S, CD9 n.° 13174S CellSignaling Technology, p-Actina n.° SC-69879 Santa Cruz Biotechnology) durante la noche a 4 °C.
El anticuerpo primario se lavó mediante dos etapas de lavado con PBS-T, antes de que las membranas se incubaran con el anticuerpo secundario (anti-conejo HRP n.° 7074S, CellSignaling Technology, anti-ratón HRP n.° 115-036-003, Jackson ImmunoResearch Europe) durante 1 hora a temperatura ambiente. La incubación con anticuerpo secundario se detuvo mediante lavado de membrana por triplicado con PBS-T.
La reacción ECL se llevó a cabo según Haan y Behrmann [31]. Las películas de rayos X (Super RX-N, Fujifilm Europe, Düsseldorf, Alemania) se procesaron utilizando el procesador de películas de rayos X AGFA CP1000.
Resultados
Los resultados se representan en la transferencia Western que se muestra en la Figura 6.
Referencias solo para el Ejemplo 2:
1. Kreger, B.T.,et al.,Microvesicle Cargo and Function Changes upon Induction of Cellular Transformation. J Biol Chem, 2016. 291(38): págs. 19774-85.
2. Tricarico, C., J. Clancy y C. D'Souza-Schorey, Biology and biogenesis of shed microvesicles. Small GTPases, 2017. 8(4): págs. 220-232.
3. Colombo, M., G. Raposo y C. Thery, Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol, 2014. 30: págs. 255-89.
4. Bakhshandeh, B., M.A. Kamaleddin y K. Aalishah, A Comprehensive Review on Exosomes and Microvesicles as Epigenetic Factors. Curr Stem Cell Res Ther, 2017. 12(1): págs. 31-36.
5. Vitkova, V., J. Zivny y J. Janota, Endothelial cell-derived microvesicles: potential mediators and biomarkers of pathologic processes. Biomark Med, 2018. 12(2): págs. 161-175.
6. van der Pol, E.,et al.,Recent developments in the nomenclatura, presence, isolation, detection and clinical impact of extracellular vesicles. J Thromb Haemost, 2016. 14(1): págs. 48-56.
7. Kowal, J.,et al.,Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A, 2016. 113(8): p. E968-77.
8. Cocucci, E. y J. Meldolesi, Ectosomes and exosomes: shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends Cell Biol, 2015. 25(6): págs. 364-72.
9. Minciacchi, V.R., M.R. Freeman y D. Di Vizio, Extracellular vesicles in cancer: exosomes, microvesicles and the emerging role of large oncosomes. Semin Cell Dev Biol, 2015. 40: págs. 41-51.
10. Gopal, S.K.,et al.,Extracellular vesicles: their role in cancer biology and epithelial-mesenchymal transition. Biochem J, 2017. 474(1): págs. 21-45.
11. Xu, R.,et al.,Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. J Clin Invest, 2016.
126(4): págs. 1152-62.
12. Chen, Y.,et al.,Extracellular vesicles as novel biomarkers and pharmaceutic targets of diseases. Acta Pharmacol Sin, 2018. 39(4): págs. 499-500.
13. Valencia, K. y F. Lecanda, Microvesicles: Isolation, Characterization forIn VitroandIn VivoProcedures. Methods Mol Biol, 2016. 1372: págs. 181-92.
14. Erdbrugger, U. y J. Lannigan, Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques. Cytometry A, 2016. 89(2): págs. 123-34.
15. Choi, D.S.,et al.,Proteomics of extracellular vesicles: Exosomes and ectosomes. Mass Spectrom Rev, 2015.
34(4): págs. 474-90.
16. Choi, D.S.,et al.,Proteomics, transcriptomics and lipidomics of exosomes and ectosomes. Proteomics, 2013.
13(10-11): págs. 1554-71.
17. Enderle, D.,et al.,Characterization of RNA from Exosomes and Other Extracellular Vesicles Isolated by a Novel Spin Column-Based Method. PLoS One, 2015. 10(8): p. e0136133.
18. Chiriaco, M.S.,et al.,Lab-on-Chip for Exosomes and Microvesicles Detection and Characterization. Sensors (Basel), 2018. 18(10).
19. Szatanek, R.,et al.,Isolation of extracellular vesicles: Determining the correct approach (Review). Int J Mol Med, 2015. 36(1): págs. 11-7.
20. Yuana, Y.,et al.,Handling and storage of human body fluids for analysis of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles, 2015. 4: pág. 29260.
21. Giebel, B. y C. Helmbrecht, Methods to Analyze EVs. Methods Mol Biol, 2017. 1545: págs. 1-20.
22. Keerthikumar, S.,et al.,Bioinformatics Tools for Extracellular Vesicles Research. Methods Mol Biol, 2017. 1545: págs. 189-196.
23. Yuana, Y., A. Sturk y R. Nieuwland, Extracellular vesicles in physiological and pathological conditions. Blood Rev, 2013. 27(1): págs. 31-9.
24. Boing, A.N.,et al.,Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. J Extracell Vesicles, 2014. 3.
25. Coumans, F. A.,et al.,Reproducible extracellular vesicle size and concentration determination with tunable resistive pulse sensing. J Extracell Vesicles, 2014. 3: pág. 25922.
26. Gray, W.D., A.J. Mitchell y C.D. Searles, An accurate, precise method for general labeling of extracellular vesicles. MethodsX, 2015. 2: págs. 360-7.
27. Mrvar-Brecko, A.,et al.,Isolated microvesicles from peripheral blood and body fluids as observed by scanning electron microscope. Blood Cells Mol Dis, 2010. 44(4): págs. 307-12.
28. Sun, Y.,et al.,Facile preparation of salivary extracellular vesicles for cancer proteomics. Sci Rep, 2016. 6: pág.
24669.
29. Yuana, Y.,et al.,Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. J Extracell Vesicles, 2014. 3.
30. The World Medical Association, I. WMA Declaration of Helsinki - Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects 2018 [citado 2018; Disponible en: https://www.wma.net/policies-post/wma-declarationof-helsinki-ethical-principles-for-medical-research-involving-human-subjects/.
31. Haan, C. y I. Behrmann, A cost effective non-commercial ECL-solution for Western blot detections yielding strong signals and low background. J Immunol Methods, 2007. 318(1-2): págs. 11-9.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método para diagnosticar si un sujeto tiene cáncer, que comprende determinar el nivel de miR-424, miR-660 y let7-i en una muestra de orina, en donde una alteración en el nivel de miR-424, miR-660 y let7-i en la muestra de orina, en relación con el nivel de los respectivos productos del gen miR en una muestra de control, es indicativo de que el sujeto tiene cáncer.
2. El método de la reivindicación 1, que comprende además determinar el nivel de miR-423, miR-125b o let7-d en la muestra de orina, en donde una alteración en el nivel de miR-423, miR-125b o let7-d en la muestra de orina, en relación con el nivel de los respectivos productos del gen miR en la muestra de control, es indicativo de que el sujeto tiene cáncer.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, que comprende además determinar el nivel de let7-f, miR-222, miR-194 y/o miR-17 en la muestra de orina del sujeto, en donde una alteración en el nivel de let7-f, miR-222, miR-194 y/o miR-17 en la muestra de orina, en relación con el nivel de los respectivos productos del gen miR en la muestra de control, es indicativo de que el sujeto tiene cáncer.
4. El método de la reivindicación 1, que comprende
a) determinar en la muestra de orina del sujeto el nivel de miR-424, miR-660 y let7-i,
b) comparar el nivel de miR-424 en la muestra de orina con un nivel de control de miR-424, comparar el nivel de miR-660 en la muestra de orina con un nivel de control de miR-660 y comparar el nivel de let7-i en la muestra de orina con un nivel de control de let7-i; y
c) diagnosticar si el sujeto tiene cáncer (por ejemplo, cáncer de mama), en donde (i) una disminución en el nivel de miR-660 en la muestra de orina, en relación con el nivel de control de miR-660, (ii) una disminución en el nivel de let7-i en la muestra de orina, en relación con el nivel de control de let7-i y (iii) un aumento en el nivel de miR-424 en la muestra de orina, en relación con el nivel de control de miR-424, es indicativo de que el sujeto tiene cáncer (por ejemplo, cáncer de mama).
5. El método de la reivindicación 4, que comprende además:
a) determinar en la muestra de orina del sujeto el nivel de miR-423, miR-125b o let7-d,
b) comparar el nivel de miR-423, miR-125b o let7-d en la muestra de orina hasta el nivel de control del producto del gen miR respectivo y
c) diagnosticar si el sujeto tiene cáncer (por ejemplo, cáncer de mama), en donde un aumento en el nivel de miR-125b o let7-d en la muestra de orina, en relación con el nivel de control respectivo de miR-125b o let7-d o una disminución en el nivel de miR-423 en la muestra de orina, en relación con el nivel de control de miR-423, es indicativo de que el sujeto tiene cáncer (por ejemplo, cáncer de mama).
6. El método de la reivindicación 4 o 5, que comprende además:
a) determinar en la muestra de orina del sujeto el nivel de miR-17, let7-f, miR-222 y/o miR-194,
b) comparar el nivel de miR-17, let7-f, miR-222 y/o miR-194 en la muestra de orina hasta un nivel de control del producto del gen miR respectivo y
c) diagnosticar si el sujeto tiene cáncer (por ejemplo, cáncer de mama), en donde un aumento en el nivel de miR-17, miR-222 y/o miR-194 en la muestra de orina, en relación con el nivel de control respectivo de miR-17, miR-222 o miR-194, y/o una disminución en el nivel de let7-f, en relación con el nivel de control de let7-f, es indicativo de que el sujeto tiene cáncer (por ejemplo, cáncer de mama).
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra de control es una muestra de orina de uno o más individuos sanos.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sujeto es un ser humano mujer.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el nivel de producto(s) del gen miR se mide mediante RT-PCR cuantitativa, PCR digital, secuenciación de última generación o mediante hibridación utilizando una micromatriz de oligonucleótidos.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los niveles de miR-660 y let7-i en la muestra de orina del sujeto, en relación con los respectivos niveles de control de los respectivos productos genéticos, están disminuidos en al menos un 25 % para ser indicativos de cáncer de mama, y/o en donde el nivel de miR-424, en la muestra de orina del sujeto, en relación con el nivel de control del producto del gen miR-424, aumenta al menos un 25 % para ser indicativo de cáncer de mama.
11. El uso de un kit para la detección o diagnóstico de cáncer de mama, comprendiendo dicho kit un oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:11, un oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:12 y un oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:17; comprendiendo opcionalmente además un oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la s Eq ID NO:7, un oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:10 y/o un oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:14.
12. El uso de un oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:11, de un oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:12 y de un oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:17 para el diagnóstico de cáncer de mama, comprendiendo dicho uso poner en contacto el(los) oligonucleótido(s) con una muestra de orina, en donde dicho uso opcionalmente comprende además poner en contacto un oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:7, un oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO:10 y/o un oligonucleótido capaz de hibridarse con un ácido nucleico que consiste en la<s>E<q>ID NO:14 con dicha muestra de orina.
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la muestra de orina se proporciona enriqueciendo o aislando vesículas extracelulares o exosomas mediante un método que comprende (i) opcionalmente filtrar la orina a través de una primera membrana, en donde dicha primera membrana tiene un tamaño de poro de 180 nm a 250 nm y no se une a proteínas; (ii) filtrar la orina o, si se lleva a cabo la etapa (i), el filtrado obtenido de la etapa (i) a través de una segunda membrana, en donde dicha segunda membrana tiene un tamaño de poro de 180 nm a 250 nm y es una membrana de unión a proteínas; y (iii) recuperar las vesículas extracelulares o exosomas de la segunda membrana.
14. El método de la reivindicación 13, en donde la segunda membrana tiene un tamaño de poro de aproximadamente 0,22 |jm y comprende, o consiste sustancialmente en, una poliamida.
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Applications Claiming Priority (1)

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ES19190989T Active ES2960366T3 (es) 2019-08-09 2019-08-09 Método para diagnosticar cáncer de mama
ES20750680T Active ES2961524T3 (es) 2019-08-09 2020-08-07 Método para diagnosticar cáncer de mama

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Country Status (6)

Country Link
US (1) US20220325355A1 (es)
EP (2) EP3772543B1 (es)
KR (1) KR20220042223A (es)
AU (1) AU2020328835A1 (es)
ES (2) ES2960366T3 (es)
WO (1) WO2021028339A1 (es)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024151873A1 (en) * 2023-01-12 2024-07-18 The General Hospital Corporation Molecular analysis of extracellular vesicles (evs) for the prediction and monitoring of drug resistance in cancer

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4883750A (en) 1984-12-13 1989-11-28 Applied Biosystems, Inc. Detection of specific sequences in nucleic acids
AU622104B2 (en) 1987-03-11 1992-04-02 Sangtec Molecular Diagnostics Ab Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore
US5858652A (en) 1988-08-30 1999-01-12 Abbott Laboratories Detection and amplification of target nucleic acid sequences
US5846709A (en) 1993-06-15 1998-12-08 Imclone Systems Incorporated Chemical process for amplifying and detecting nucleic acid sequences
FR2708288B1 (fr) 1993-07-26 1995-09-01 Bio Merieux Procédé d'amplification d'acides nucléiques par transcription utilisant le déplacement, réactifs et nécessaire pour la mise en Óoeuvre de ce procédé.
US5928905A (en) 1995-04-18 1999-07-27 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
DE69527355T2 (de) 1994-05-28 2003-03-06 Tepnel Medical Ltd., Manchester Herstellung von nukleinsaeurekopien
US5942391A (en) 1994-06-22 1999-08-24 Mount Sinai School Of Medicine Nucleic acid amplification method: ramification-extension amplification method (RAM)
CA2195562A1 (en) 1994-08-19 1996-02-29 Pe Corporation (Ny) Coupled amplification and ligation method
US5935825A (en) 1994-11-18 1999-08-10 Shimadzu Corporation Process and reagent for amplifying nucleic acid sequences
US5843650A (en) 1995-05-01 1998-12-01 Segev; David Nucleic acid detection and amplification by chemical linkage of oligonucleotides
US5612473A (en) 1996-01-16 1997-03-18 Gull Laboratories Methods, kits and solutions for preparing sample material for nucleic acid amplification
US5928906A (en) 1996-05-09 1999-07-27 Sequenom, Inc. Process for direct sequencing during template amplification
US5939291A (en) 1996-06-14 1999-08-17 Sarnoff Corporation Microfluidic method for nucleic acid amplification
US5849546A (en) 1996-09-13 1998-12-15 Epicentre Technologies Corporation Methods for using mutant RNA polymerases with reduced discrimination between non-canonical and canonical nucleoside triphosphates
US5849497A (en) 1997-04-03 1998-12-15 The Research Foundation Of State University Of New York Specific inhibition of the polymerase chain reaction using a non-extendable oligonucleotide blocker
US5866366A (en) 1997-07-01 1999-02-02 Smithkline Beecham Corporation gidB
US5916776A (en) 1997-08-27 1999-06-29 Sarnoff Corporation Amplification method for a polynucleotide
US5932451A (en) 1997-11-19 1999-08-03 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Method for unbiased mRNA amplification
US20100286044A1 (en) * 2005-12-29 2010-11-11 Exiqon A/S Detection of tissue origin of cancer
FR2957821B1 (fr) 2010-03-24 2014-08-29 Inst Francais Du Petrole Nouvelle zone de regeneration du catalyseur divisee en secteurs pour unites catalytiques regeneratives
JP5823031B2 (ja) * 2011-06-10 2015-11-25 日立化成株式会社 小胞捕捉デバイスおよびそれを用いるための方法
CN116064800A (zh) * 2015-03-09 2023-05-05 新加坡科技研究局 通过检测微小RNA(miRNA)的表达水平来确定患乳腺癌的风险的方法
EP3070178B1 (en) 2015-03-20 2020-02-12 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Method for diagnosing breast cancer
WO2019132688A1 (ru) * 2017-12-26 2019-07-04 Общество С Ограниченной Ответственностью "Простагност" Способ и устройство для выделения внеклеточных везикул из биологических жидкостей с помощью каскадной ультрафильтрации

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