NO303068B1

NO303068B1 - FremgangsmÕter for amplifisering, fremgangsmÕte for detektering, og sett for anvendelse ved deteksjon, av targetsekvens i en pr÷ve inneholdende nukleinsyre

Info

Publication number: NO303068B1
Application number: NO895090A
Authority: NO
Inventors: Thomas Raymond Gingeras; Ulrich Merten; Deborah Yantis Kwoh
Original assignee: Akzo Nobel Nv
Priority date: 1987-06-19
Filing date: 1989-12-18
Publication date: 1998-05-25
Also published as: HUT52823A; DE3852177D1; ATE196657T1; IL86724A; IL86724A0; EP0368906B2; FI896077A0; FI93743B; KR890701741A; EP0368906B1; DE3856428D1; NO895090L; IE881848L; FI93743C; NZ225077A; BR8807097A; PT87769A; DE3852177T3; EP0623683A1; DK644489D0

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter for amplifisering, en fremgangsmåte for detektering, og et sett for anvendelse ved deteksjon, av targetsekvens i en prøve inneholdende nukleinsyre.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører generelt fremskritt i molekylær-biologien og molekylær-genetikken.

Mer spesielt vedrører den foreliggende oppfinnelse nye fremgangsmåter og sett inneholdende nødvendige reagenser og midler for å øke in vitro eller x-vivo kopitallet, dvs. amplifisering, av minst ett selektert segment (sekvens) av nukleinsyre eller dens komplement eller hybridiserende homologe segment, i en prøve omfattende en eller flere nukleinsyrer, som kan inkludere RNA, DNA eller begge deler.

Blant de anvendelser hvor fremgangsmåtene og settene i henhold til den foreliggende oppfinnelse kommer til nytte er 1) analyser av kroppsvæsker og vev for detektering av spesifikke nukleinsyresekvenser som er karakteristisk for en genetisk eller patogen sykdom eller tilstand ved in vitro eller x-vivo nukleinsyreprobe-hybridiseringsbestemmelser og 2) ved selektiv kloning av enkeltkopi eller sjeldne eller lav-ekspresjons-gener.

Mye av arbeidet innen molekylær-biologien, molekylær-genetikken og anvendelser derav, som for eksempel nukleinsyreprobe-hybridiseringsbestemmelser for blodoverførte patogener eller defekte gener, involverer deteksjon eller isolering av en spesiell nukleinsyresekvens. Et fundamentalt problem i slikt arbeide er å detektere eller isolere og deretter kvantitere en nukleinsyresekvens av interesse. Problemet har vært et vanskelig sådant på grunn av at biologiske materialer, som cellekulturer, vevsprøver og blodprøver, typisk er sammensatt av en kompleks blanding av RNA og DNA deler hvorav høyst en meget liten fraksjon har en sekvens av interesse. Praktiske anvendelser av nukleinsyreprobe-hybridiseringsbestemmelser har vært begrenset på grunn av følsomheten av bestemmelsene, når disse gjennomføres med reagenser egnet for rutinebruk og over aksepterbare korte tidsperioder, er for lav for å detektere sekvenser av interesse ved den lave konsentrasjon hvormed de foregår i reelle prøver.

To fundamentalt forskjellige metoder har vært anvendt med hensyn til problemet med å detektere en nukleinsyresekvens av interesse ("targetsegment") tilstede i en liten mengde i en kompleks blanding av nukleinsyrer.

Ved den første metode blir mengden av nukleinsyre (inkluderende targetsegmentet) i en prøve ikke endret. I stedet blir et signalgenererende system assosiert med targetsegmentet og frembringer et detekterbart signal som er representativt for antallet av molekyler av targetsegment. For eksempel blir en nukleinsyreprobe, med en sekvens komplementær til sekvensen av et subsegment av targetsegmentet knyttet til et enzym som for eksempel alkalisk fosfatase og blir blandet med en prøve under hybridiserende betingelser som vil bevirke hybridisering mellom proben og targetsegmentet (men ikke i særlig grad mellom proben og andre nukleinsyresekvenser i prøven). Etter fjernelse av den enzymtilknyttede probe som ikke hybridiserte tilsettes et kromogent substrat for alkalisk fosfatase under passende betingelser og i prinsippet blir et stort antall detekterbare fargede molekyler hurtig frembragt for hvert probemolekyl hybridisert til targetsegmentet.

Tallrike andre systemer for detektering av nukleinsyresekvenser uten å endre mengden av target nukleinsyre i prøven er kjent på området. Et ytterligere eksempel er den vanlige merking av en nukleinsyreprobe med radioaktive atomer som<32>P og deretter detektere proben hybridisert til target via forsterket signal initiert ved nedbrytning av den radioaktive kjerne. Enda et ytterligere eksempel involverer knytting av proben for targetsegmentet en ytterligere nukleinsyre som er i stand til replikasjon slik at den lett kan detekteres ved hjelp av kjente metoder. Visse RNA er kjent som er i stand til (autokatalytisk) replikaseindusert replikasjon ved hjelp av visse polymeraser, som for eksempel bakteriofag RNA avhengig RNA polymerase, som Qfi replikase og replikase fra brom-mosaikkvirus (BMV). I et slikt system er både et RNA og RNA av komplementær sekvens templater for replikasjon ved hjelp av RNA polymerase. Følgelig øker mengden av replikert RNA eksponentialt med tiden (så lenge som antallet RNA templatmolekyler ikke overstiger antallet av RNA polymerase-molekyler i et system) . Se Miele et al, J. Mol. Biol. 171, 281 (1983). Et system hvori probe for et targetsegment er knyttet til et RNA som kan replikeres ved hjelp av Qft replikase er beskrevet av Chu et al, Nucl. Acids Res. 14, 5591

(1986) og ved hjelp av BMV replikase beskrevet av Marsh et al, "Positive Strand RNA Viruses", Alan R. Liss (utgiver, New York) (1987); Proceedings of UCLA Symposium, 1986.

Den første metode har to alvorlige ulemper. For det første, er i mange tilfeller kopitallet av targetsegment i en prøve av praktisk størrelse så lavt at selv for rimelig hurtige signalgenererende systemer, er den tid som er nødvendig for generering av detekterbart signal som er tydelig over bak-grunnsstøyen upraktisk lang. For det annet foregår signal-generering med omtrent samme grad fra "bakgrunn" signalgenererende molekyler som fra signalgenererende molekyler assosiert med target. Ved enhver bestemmelse for et targetsegment er et signal som skyldes "bakgrunnen" uunngåelig. Det vil si at det bestandig vil være noe signal som skyldes proben og som ikke spesifikt fester seg til filteret eller andre faste bærere eller hybridiserer til segmenter med sekvenser meget like sekvensen av targetsegment. Hvis kopitallet av target er for lavt, vil tidskonstantforholdet av signal fra target pluss bakgrunn (dvs. "signal") i forhold til signal fra bakgrunnen (dvs. "støy") være for lavt til tydelig å være detekterbart over bakgrunnen. Disse og andre ulemper har ført teknikken til en andre metodikk i forbindelse med problemet med detektering av et targetsegment tilstede i et lavt nivå i en kompleks blanding av nukleinsyrer.

Denne andre metode er fundamentalt forskjellig og involverer økning av kopitallet av selve targetsegmentet, foretrukket i en større utstrekning enn for andre sekvenser i en prøve, særlig dem som feilaktig kunne detekteres som targetsegment på grunn av likheter i sekvensen. Eksempler på denne andre metode inkluderer forskjellige dyrkningsteknikker hvori celler inneholdende targetsegmentet bringes til å øke i antall, noen ganger hurtigere enn antallet av andre celler, eller hvori spesielle nukleinsyrer (f.eks. plasmider, RNA) hvori det er deponert targetsegment, bringes til å øke i antall.

Slike dyrkingsteknikker har ulemper med at de er omstendelige og problematiske og tidkrevende og fastslår det uunngåelige forhold at andre nukleinsyrer enn dem som inkluderer targetsegment samtidig øker i kopitall, slik at "bakgrunnen" potensielt øker. En annen ulempe er den resulterende vekst av potensielt farlige organismer som et nødvendig trinn for å oppnå amplifisering.

Et ytterligere eksempel på denne andre metode er amplifisering av et DNA targetsegment i en såkalt "polymerase chain reaction" ("PCR"). Denne teknikk er en lånt adaptering av kjente, naturlig forekommende prosesser som opptrer ved den replikative prosess med for eksempel enkelttrådede DNA genomer av visse virustyper, og representerer i alle fall en anvendelse fremmed for cDNA fremstilling i samsvar med Hong, Bioscience Reports 1, 243 (1981); Cooke et al, J. Biol. Chem. 255, 6502 (1980); og Zoller et al, "Methods in Enzymology" 100, 468-500 (1983). Ved denne teknikk øker et spesielt segment i kopitall eksponentialt med et antall sykluser, hvorav hver medfører (1) hybridisering til et 3<1->terminalt subsegment av hver av targetsegment og dets komplement (dvs. segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av targetsegment) , en DNA primer, (2) hver av primerne forlenges med en DNA polymerase, og (3) dupleksene som skriver seg fra trinn (2) gjøres enkelttrådet ved termisk denaturering. Denne teknikk er beskrevet i Saiki et al, Science 230, 1350 (1985) ogMullis et al, europeiske patentpublikasjoner nr. 200362 og 201184. Se også US patentskrifter nr. 4683195 og 4683202. I henhold til det som er rapportert, ved å anvende teknikken i 20 sykluser i løpet av omtrent 3 timer, kan kopitallet av et targetsegment økes med en faktor på omtrent IO<5>. På grunn av at bare de segmenter hvortil en spesifikk primer hybridiserer med en tilstrekkelig stabilitet til å initiere kjedeforlengelse med polymerasen til å danne komplementet og som har et komplement hvortil en ytterligere spesifikk primer hybridiserer på tilsvarende måte til å gi targetsegment etter kjedeforlengelse, øker de eksponentialt i kopitall mens andre ikke-targetsegmenter som ikke feilaktig er blitt hybridisert med den anvendte primer øker, om overhodet, høyst lineært i kopitall som en funksjon av antallet sykluser. Polymerase Chain Reaction teknikken kan sterkt øke ikke bare kopitallet av targetsegment, men også forholdet av mengden targetsegment i forhold til mengden av bakgrunnsbevirkende segmenter i en prøve.

Det følger selvfølgelig at denne andre metode kan anvendes for en prøve i forbindelse med bruk av den første metode anvendt med det amplifiserte targetsegment for å tilveiebringe endog et sterkere deteksjonssignal.

Det er et formål for den foreliggende oppfinnelse å løse de problemer som den tidligere teknikk tok sikte på og å over-vinne ulempene opplyst i forbindelse med tidligere forskeres anstrengelser for å løse disse problemer. Det er et ytterligere formål for den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en enkel teknikk som kan anvendes i en aksepterbar kort tid under anvendelse av fordelen med kjente reagenser og med nødvendig presisjon for å oppnå konsekvente vitenskapelige resultater, en teknikk som kan anvendes ved et reproduserbart bestemmelsesopplegg og som kan tilpasses for bruk i sett for laboratorie/kliniske analyser.

Det er således et formål for den foreliggende oppfinnelse å øke detekterbarheten av visse nukleinsyresekvenser (targetsegmenter) ved amplifisering av de nevnte target-sekvenser i et in vitro eller x-vivo system uten de ulemper som hittil er påpekt ved tidligere anstrengelser.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en ny teknikk for å gjennomføre den andre metode for å detektere et targetsegment tilstede i en liten mengde i en kompleks blanding av nukleinsyrer. Den anvender et nytt RNA transkript-produksjonstrinn i sammenheng med og avledet fra en syntetisert dobbelttrådet cDNA kopi av target-sekvensen som en komplett syklus. Flere sykluser kan anvendes. På grunn av at transkripsjonstrinnet er det dominerende nyhetsaspekt blir det heri passende omtalt som et transkripsjonsbasert ampiifiseringssystem (TAS). Den nye teknikk ved den foreliggende TAS oppfinnelse resulterer i hurtig økning i kopitallet av et selektert targetsegment ved å anvende to av egenskapene av DNA avhengig RNA polymerase: (1) betraktelig initiering av transkripsjon fra bare et lite antall sekvenser spesifikke for hver polymerase, se f.eks. Brown et al, Nucl. Acids Res. 14, 3521 (1986) og (2) hurtig produksjon av et stort antall transkripter fra hver kopi av en promoter (typisk 10<2->10<4>pr. time) som gjenkjennes av en RNA polymerase. Se Milligan et al, Nucl. Acids Res. 15, 8783

(1987). Teknikken i samsvar med oppfinnelsen kan også anvende evnen til RNA med visse sekvenser til å bli hurtig (autokatalytisk) replikert ved hjelp av RNA avhengige RNA replikaser. Se også Miele et al, supra. I tillegg tilveiebringer den en standardiseringsteknikk som gjør det mulig med utvetydig måling av mengden av target DNA tilstede i en prøve.

Den foreliggende oppfinnelse (med mindre indusert (autokatalytisk) replikasjon anvendes) gir et enkelttrådet RNA transkript, eller et RNA-DNA dupleks tildannet derfra når foran-staltninger ikke tas for å hindre dannelse derav, som har et subsegment som har sekvensen av targetsegmentet eller sekvensen komplementær til sekvensen av targetsegmentet, og som er tilstede i et stort overskudd i forhold til nukleinsyre med et subsegment av komplementær sekvens. Dette initiale overskudd av et enkelttrådet RNA transkript er fordelaktig i visse metoder for detektering av amplifisert produkt med en merket nukleinsyreprobe på grunn av at lite segment av komplementær sekvens er tilstede for å konkurrere med proben for hybridisering til det amplifiserte produkt. Det enkelttrådete RNA transkriptprodukt herav blir også tilkjennegitt nøyaktig mer eller mindre kontinuerlig og gir direkte deteksjon av targetsegment uten nødvendigheten av omstendelige, gjentatte og gjerne feilaktige PCR sykluser og trådseparering. Slike fordeler tilveiebringes ikke av PCR teknikken som gir dobbelttrådet DNA (en tråd som omfatter targetsegment og den andre tråd som omfatter komplement av targetsegment) som må separeres før deteksjon og bare etter et stort antall gjentatte sykluser nødvendig for å nå aksepterbare amplifiseringsnivåer.

Metodene ved den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer amplifisering av et selektert targetsegment i en grad i hvert fall like så stor som ved PCR teknikken i løpet av omtrent samme tidsperiode, men på en langt mer enkel og reproduserbar måte og distinkt fra naturlige prosesser eller annen teknikk.

Det er oppdaget hvorledes bakteriofag DNA avhengig RNA polymerase kan anvendes for hurtig å amplifisere (dvs. øke kopitallet av) en selektert target nukleinsyresekvens (target-sekvens eller -segment) tilstede i en prøve av nukleinsyrer. Videre er det oppdaget hvorledes bakteriofag DNA avhengig RNA polymerase kan anvendes sammen med bakteriofag RNA avhengig RNA polymerase for å oppnå det samme resultat. Det har hittil ikke vært erkjent at slik bakteriofag RNA polymerase kunne anvendes for dette formål.

Oppfinnelsen fører til fremgangsmåter basert på disse erkjen-nelser og sett for gjennomføring av de nevnte fremgangsmåter.

Disse fremgangsmåter og sett blir særlig nyttig anvendt i forbindelse med nukleinsyreprobe-hybridiseringsbestemmelser for en nukleinsyre som inkluderer et targetsegment amplifisert i samsvar med oppfinnelsen. Oppfinnelsen medfører således også fremgangsmåter og sett for å gjennomføre metodene for detektering av nærvær eller fravær av et segment i en prøve av nukleinsyre, omfattende et spesielt segment, ved hjelp av en probe hybridisert til dette segment etter amplifisering i samsvar med oppfinnelsen.

Den foreliggende oppfinnelse er basert på nyheten ved visse RNA transkripter, deres produksjon, eventuell replikasjon og anvendelse til å oppnå ønsket amplifisering og deteksjon av tilsvarende (i sekvens) target nukleinsyresekvens. Oppfinnelsen praktiseres i et in vitro eller x-vivo opplegg og anvendes i forbindelse med syntese av en dobbelttrådet cDNA kopi av target-sekvensen for å produsere et dobbelttrådet nukleinsyretemplat som i sin tur anvendes for produksjon av de nevnte RNA transkripter. Denne prosess med dobbelttrådet cDNA syntese og RNA transkripsjon utgjør en enkel syklus av det foreliggende transkripsjonsbaserte amplifikasjonssystem (TAS). Om ønsket kan denne syklus gjentas for oppnå enda høyere amplifikasjonsnivåer. På grunn av den metode hvorved de produseres (og reproduseres) tilsvarer transkriptene (identisk eller komplementært) i sekvens en target nukleinsyresekvens inneholdt i en opprinnelig prøve blant en blanding av nukleinsyrer og nærværet av transkriptene i amplifisert form tilveiebringer derfor deres deteksjon, og følgelig tilsvarende in vitro eller x-vivo deteksjonen av nærværet av target nuklein-syresekvensen i den nevnte prøve.

Den foreliggende oppfinnelse involverer således in vitro eller x-vivo deteksjon av minst en spesifikk nukleinsyresekvens (target-sekvens eller -segment) i en prøve inneholdende nukleinsyre. Den foreliggende oppfinnelse reduseres til en metode omfattende fremstilling av en dobbelttrådet nukleinsyre inneholdende en sekvens tilsvarende en target-sekvens operabelt knyttet til en promoter derfor, den nevnte dobbelttrådete nukleinsyre anvendes som et dobbelttrådet nukleinsyretemplat for fremstilling av et flertall RNA transkripter derfra, som hver inneholder en RNA sekvens tilsvarende den nevnte target-sekvens, og detektering av nærværet av den nevnte RNA sekvens og ved analogi nærværet av target-sekvens.

I den foreliggende oppfinnelses sammenheng muliggjøres ulike metoder og midler assosiert med fremstillingen og bruk av slike RNA transkripter, og således den eventuelt repetitive metode for fremstilling av det nevnte dobbelttrådete nukleinsyretemplat som er definert i det foregående.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører således en fremgangsmåte for amplifisering av en targetsekvens i en prøve inneholdende nukleinsyre, som er kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: (A) tilveiebringelse av en første nukleinsyreprimer inneholdende en promotersekvens operabelt knyttet til en sekvens som korresponderer til et første segment av targetsekvensen, idet nevnte første segment inkluderer 3'-enden av targetsekvensen, og en andre nukleinsyreprimer, som er hybridiserbar til en sekvens komplementær til et andre segment av targetsekvensen, idet nevnte andre

segment inkluderer 5'-enden av targetsekvensen,

(B) hybridisering under egnede betingelser av nevnte første nukleinsyreprimer med targetsekvens i en prøve inneholdende nukleinsyre, (C) forlengelse av nevnte hybridiserte første nukleinsyreprimer ved en polymeraseforlengelsesreaksjon komplementær

til targetsekvensen til å danne en første dupleks nukleinsyre,

(D) dupleksen dannet i trinn (C) gjøres enkelttrådet,

(E) hybridisering under egnede betingelser av nevnte andre

nukleinsyreprimer til den resulterende promotersekvens-inneholdende tråd,

(F) forlengelse av nevnte hybridiserte andre nukleinsyreprimer i en polymeraseforlengelsesreaksjon komplementær til

nevnte promotersekvens-inneholdende tråd til å danne en

andre dupleks nukleinsyre, og

(G) anvendelse av nevnte andre dupleks som et templat for fremstilling av et flertall RNA transkripter derfra i en

reaksjon katalysert ved en RNA polymerase som gjenkjenner promoteren som korresponderer til promotersekvensen av den første primeren, idet hver av nevnte transkripter bærer en RNA sekvens som korresponderer til nevnte targetsekvens, (H) eventuell anvendelse av nevnte RNA transkripter som en basis for videre amplifisering av targetsekvensen.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også en fremgangsmåte for detektering av minst en spesifikk nukleinsyretargetsekvens i en prøve inneholdende nukleinsyre, som er kjennetegnet ved at den omfatter fremstilling, i samsvar med oppfinnelsen, av replikerte RNA transkripter som inneholder en sekvens som korresponderer til den nevnte targetsekvens og detektering av nærværet av nevnte RNA sekvens.

I den foreliggende oppfinnelses sammenheng muliggjøres videre ytterligere og alternative metoder og midler for fremstilling av det nevnte dobbelttrådete nukleinsyretemplat (ovenfor), for eksempel en reaksjon som hovedsakelig foregår i en eneste beholder omfattende tilveiebringelse av en første nukleinsyreprimer inneholdende en promotersekvens operabelt knyttet til en sekvens komplementær til et segment av en target-sekvens og en andre nukleinsyreprimer med en sekvens identisk med et segment av en target-sekvens, idet de nevnte primere

tilsvarer forskjellige regioner i den nevnte target-sekvens, men som ikke eller ikke i vesentlig grad overlapper i deres tilsvarighet til target og er valgt slik at et forlengelsesprodukt av den ene når den er separert fra sitt komplement kan tjene som et templat for et forlengelsesprodukt av den annen, en prøve inneholdende nukleinsyre inkluderende target-sekvens bringes i kontakt med de nevnte primere under sekvensmessig hybridisering og trådsepareringsbetingelser slik at det i sin tur frembringes forlengelsesprodukter av de nevnte primere.

I den foreliggende oppfinnelses sammenheng muliggjøres videre metoder og midler for å anvende den ovennevnte dobbelttrådete nukleinsyre, som et templat for fremstilling av et flertall RNA transkripter derfra ved en reaksjon katalysert ved hjelp av en DNA avhengig RNA polymerase som gjenkjenner promotoren derav, og nærværet av de nevnte RNA transkripter detekteres og måles.

I den foreliggende oppfinnelses sammenheng muliggjøres videre metoder og midler for å standardisere den mengde target-sekvens som detekteres (ved tilsvarighet til den mengde RNA transkript som detekteres) ved videre korrelasjon til nærværet av kjent nukleinsyre anvendt som en intern standard. Kopitallet av standarden forutbestemmes idet standarden skal erfare de samme betingelser, og følgelig skjebne, under utøvelsen av den foreliggende oppfinnelse som target-sekvens og skal derfor tjene som et bedømmelsesmiddel ved å bestemme relative mengder av transkripter fremstilt i parallell for denne og for target-sekvens.

I den foreliggende oppfinnelses sammenheng muliggjøres videre den ytterligere replikasjon av oppnådde RNA transkripter definert ovenfor via nærværet deri av replikase-gjen-kjennelsesseter. Dette oppnås passende ved å tilveiebringe den nevnte første nukleinsyreprimer som definert i det foregående som ytterligere bærer en replikase-gjenkjennelses-setesekvens, foretrukket mellom promotersekvensen og sekvens som tilsvarer target-sekvens, og/eller ytterligere inneholder et replikase-gjenkjennelsessete på den andre nukleinsyreprimer som definert i det foregående. Ved etterfølgende transkripsjon bærer de etterfølgende transkripter det eller de replikase-gj enkjennende seter slik at nærværet av en replikase (i reaksjonslokus eller sett for eksempel) (autokatalytisk) induserer replikasjon av transkriptene slik at det produseres ytterligere kopier for ytterligere å lette deteksjonen.

I den foreliggende oppfinnelses sammenheng muliggjøres ytterligere sett omfattende nødvendige reagenser og assosierte midler nyttige ved in vitro eller x-vivo deteksjon av minst en spesifikk nukleinsyresekvens (target-sekvens) i en prøve inneholdende nukleinsyre, ved anvendelse av metoder og midler definert ovenfor.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører således videre et sett for anvendelse ved deteksjon av minst en spesifikk nukleinsyre-targetsekvens i en prøve inneholdende nukleinsyre, som er kjennetegnet ved at det omfatter en første nukleinsyreprimer inneholdende en promotersekvens operabelt knyttet til en sekvens, komplementær til et segment av en targetsekvens, og en andre nukleinsyreprimer med en sekvens identisk med et segment av en targetsekvens, idet primerne tilsvarer forskjellige regioner i targetsekvensen, men ikke, eller i vesentlig grad ikke, overlapper i deres tilsvarighet til targetet og er valgt slik at et forlengelsesprodukt av en av dem når den separeres fra sitt komplement kan tjene som et templat for et forlengelsesprodukt av den annen, og midler for hybridisering av den nevnte første primer til den nevnte targetsekvens, for kjedeforlenging av den hybridiserte primer, for trådseparering av det resulterende dupleks, for hybridisering av den andre nukleinsyreprimer til den promoterinneholdende separerte tråd, for kjedeforlenging av den hybridiserte primer, for å bringe den således fremstilte dobbelttrådete nukleinsyre inneholdende en promotersekvens til å fremstille transskripter, og for detektering av disse transskripter. Figurene IA, IB og 1C illustrerer en fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen for amplifisering av et targetsegment av en nukleinsyre (nukleinsyre A) som er et DNA eller RNA, hvori mange kopier av en første RNA (RNA I) med et segment med en sekvens komplementær til sekvens av targetsegment dannes. Figurene 2A, 2B, 2C illustrerer den ytterligere amplifisering i henhold til oppfinnelsen av et segment av en RNA I, fremstilt som illustrert i figurene IA, IB og 1C, for fremstilling av mange kopier av en andre RNA (RNA II) med et segment med en sekvens som er den samme som sekvensen for et subsegment av targetsegmentet, som ble amplifisert for å fremstille RNA I. Figur 3 avbilder autoradiogrammer som viser forskjellige konsentrasjoner av HIV RNA amplifisert ved hjelp av TAS samtidig med en fiksert konsentrasjon av human ft-globin nukleinsyre. Figur 4 viser en generell strategi hvorved RNA fremstilt gjennom en DNA avhengig RNA polymerase gir et RNA molekyl som kan tjene som et templat for en RNA avhengig replikase.

Det refereres til standard lærebøker i molekylær-biologi som inneholder definisjoner og fremgangsmåter og midler for gjennomføring av basisteknikkene ved den foreliggende oppfinnelse som: DNA probe- eller primerfremstilling, inkluderende DNA syntese; hybridiseringsmetodologi inkluderende variasjoner i stringensbetingelser for fremstilling av mer eller mindre hybridiseringssikkerhet avhengig av graden av homologi av primeren til en target DNA sekvens; identifise-ring, isolering eller fremstilling av promotere, eller mer spesifikt promotere eller seter som gjenkjennes av bakteriofag DNA avhengig RNA polymerase og bakteriofag RNA avhengig RNA polymerase, eller ved anvendelse av eukaryotiske systemer, virale DNA og RNA avhengige RNA polymeraser, for eksempel adenovirus-kodet RNA polymerase og brom-mosaikkvirus RNA polymerase; betingelser som fører til produksjon av RNA transkripter, inkluderende såkalte transkripsjons-forøkende sekvenser; mekanismen og metodologien for (indusert) replikasjon; Polymerase Chain Reaction metoder inkluderende reagen-sene anvendt deri; og så videre. Se for eksempel Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1982) og de forskjellige referanser som er angitt deri; US patentskrift nr. 4683195, US patentskrift nr. 4683202; Hong, Bioscience Reports 1, 243 (1981); Cooke et al, J. Biol. Chem. 255 6502 (1980); og Zoller et al, Methods inEnzymology 100, 468-500 (1983); Crea et al, Nucleic Acids Res. 8, 2331 (1980); Narang et al, Meth. Enzym. 68, 90 (1979); Beaucage et al, Tetrahedron Letters 22, 1859 (1981); Brown et al, Meth. Enzym. 68, 109 (1979); Caruthers et al, Meth. Enzym. 154, 287 (1985); Hitzeman et al, J. Biol. Chem. 255, 2073

(1980); Lee et al, Science 239, 1288 (1988); Milligan et al, Nucleic Acids Res. 15, 8783 (1987); Miller et al, Virology 125, 236 (1983), Ahlquist et al, J. Mol. Biol. 153, 23 (1981); Miller et al, Nature 313, 68 (1985); Ahlquist et al, J. Mol. Biol. 172, 369 (1984); Ahlquist et al, Plant Mol. Biol. 3, 37

(1984); Ou et al, PNAS 79, 5235 (1982); Chu et al, Nucl. Acids Res. 14, 5591 (1986); europeisk patentsøknad nr. (EPA) 194809; Marsh et al, Positive Strand RNA Viruses, s. 327-336, Alan R. Liss (utgitt, New York) (1987; Proceedings of UCLA Symposium, 1986); Miller et al, J. Mol. Biol. 187, 537 (1986); Stoflet et al, Science 239, 491 (1988); og Murakawa et al, DNA 7, 287

(1988) .

Med betegnelsen "promoter" menes en nukleinsyresekvens (naturlig forekommende eller syntetisk fremstilt eller et produkt av restriksjonsbehandling) som spesifikt gjenkjennes av en RNA polymerase som binder til en gjenkjent sekvens og initierer transkripsjonsprosessen hvorved et RNA transkript fremstilles. Den kan eventuelt inneholde nukleotidbaser som strekker seg forbi det aktuelle gjenkjennelsessete, antatt å meddele ytterligere stabilitet overfor nedbrytningsprosesser. I prinsippet kan en hvilken som helst promotersekvens anvendes for hvilken der er en kjent og tilgjengelig polymerase som er i stand til å gjenkjenne initieringssekvensen. Typisk er kjente og nyttige promotere slike som gjenkjennes av visse bakteriofag polymeraser som bakteriofag T3, T7 eller SP6. Se Siebenlist et al, Cell 20, 269 (1980) . Disse er eksempler på slike polymeraser som kan anvendes ved utøvelse av den foreliggende oppfinnelse i forbindelse med deres assosierte promotersekvenser.

"RNA transkript" heri er ribonnukleinsyre-sekvensen produsert etter transkripsjonsinitiering etter RNA polymerase-gjenkjen-nelse av promotersekvensen (se ovenfor). Fremstillingen av slike transkripter er mer eller mindre kontinuerlig, avhengig delvis av mengden av tilstedeværende polymerase.

Med betegnelsen "primer" menes i den foreliggende sammenheng en nukleinsyresekvens (naturlig forekommende eller fremstilt syntetisk eller et produkt fra restriksjonsbehandling) som har tilstrekkelig homologi med target-sekvensen slik at den under passende hybridiseringsbetingelser er i stand til hybridisering, dvs. binding til, target-sekvensen. En typisk primer har typisk lengde på minst omtrent 10 nukleotider og har mest foretrukket en lengde på omtrent 35 eller flere nukleotidbaser, og i de mest foretrukne utførelsesformer deler den identitet eller meget høy homologi med target-sekvensen. Se for eksempel EPA 128042 (publisert 12. des. 1984).

Betegnelsen "operabelt knyttet" særlig i forbindelse med tilknytningen av en promotersekvens inne i en primersekvens, refererer til funksjonaliteten av det endelige "dobbelttrådete nukleinsyretemplat" i den foreliggende oppfinnelses sammenheng slik at det, altså témplatet, er i stand til å produsere tilsvarende RNA transkripter når promotoren gjenkjennes av den passende polymerase - se ovenfor.

Primer-forlengelsesreaksjonen for å fremstille en dupleks er kjent i og for seg. Se henvisninger i det foregående. Polymerase nyttig for dette formål inkluderer E. coli DNA polymerase I, Klenow fragment av E. coli DNA polymerase I, T4 DNA polymerase, revers transkriptase, og så videre.

Teknikkene med å danne et deteksjonssignal som for eksempel via radioaktiv merking eller kromogene midler under anvendelse av et kromogent mottagelig enzym er også vel kjent og doku-mentert på området. Se drøftelsen i det foregående.

Anvendelsen av en "replikase" for (autokatalytisk) induksjon av replikasjon av RNA transkriptene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse er generelt kjent på området. Passende eksempler på slike replikaser som er brukbare ved den foreliggende oppfinnelse inkluderer den såkalte Qli virus replikase som gjenkjenner visse nukleinsyresekvensseter ved både 3'- og 5'-endene av det gitte RNA transkript og det såkalte brom-mosaikkvirus (BMV) såvel som de alfa virus replikaser som tenkes å gjenkjenne nukleinsyresekvensseter ved 3'-enden av et gitt RNA transkript. Disse replikaser tjener til å replikere, det vil si reprodusere, RNA transkriptene og komplementene slik at de mangedobler kopier derav. Når slikt enzym er tilstede i reaksjonslokus under transkripsjonsprosessen, kan det foresees at de multiple transkripter som fremstilles under transkripsjonen i seg kan undergå replikasjon slik at mengden av RNA transkriptprodukt økes eksponentialt.

Intern standardisering defineres som en prosess som anvendes for: a) å sikre at TAS amplifiseringsprosessen ikke har sviktet på grunn av en prosedyrefeil, og b) å måle nivåer av target nukleinsyre i forhold til en forutbestemt mengde av nukleinsyre som alltid er assosiert med prøven av interesse. Slik intern standardisering foregår ved koamplifisering av en del av target-sekvensen, så vel som en endogen sekvens, i den samme reaksjon. Ved for eksempel å vite celletallet tilstede i den biologiske prøve, kan et enkeltkopi gen (f.eks. £>-globin) anvendes som en intern standard og ettersom dette ikke uttrykkes i form av RNA, er dets initiale kopitall lik to ganger det totale antall celler i prøven. Ved koamplifisering av deler av ft-globin og target-sekvenser av interesse, kan forholdene mellom de amplifiserte signaler sammenlignes for å kvantitere nivåer av target-sekvens av interesse. Ettersom hver celle har to kopier (i diploide celler) av denne interne standard, uansett om den biologiske prøve inneholder separate target-sekvenser (f.eks. HIV), forventes hver prøve å frem-bringe et positivt amplifiseringssignal som skriver seg fra den interne standard. Se Groudine et al, Nucleic Acids Research 12, 1427 (1984) og McKnight, Cell 31, 355 (1982). Se også britisk patentsøknad med publikasjonsnr. 2187283 A (publisert 3. sept. 1987).

Den foreliggende oppfinnelse vedrører videre en fremgangsmåte for amplifisering av et target nukleinsyresegment med formel I

hvori (første subsegment)ter et nukleinsyresegment av kjent sekvens på minst 10 nukleotider som slutter seg til 3'-enden av (andre subsegment)t, (andre subsegment)ter et nukleinsyresegment med 0 eller flere nukleotider, og (tredje subsegment)t

er et nukleinsyresegment med kjent sekvens på minst 10 nukleotider som slutter seg til 5'-enden av (andre subsegment) t, som er kjennetegne ved at fremgangsmåten omfatter: (1) til (første subsegment)tav det nevnte targetsegment hybridiseres en første primer, som er et enkelttrådet DNA omfattende et 3'-terminalt subsegment med formel II

hvor (promoter)2er et enkelttrådet DNA segment med sekvensen av plusstråden av en bakteriofag DNA avhengig RNA polymerase-spesifikk promoter, (variabelt subsegment) i er et enkelttrådet DNA segment med 0 til 100 nukleotider som slutter seg til det 3'-terminale nukleotid av (promoter)!og det 5'-terminale nukleotid av (3'-primer subsegment)!, og (3'-primer subsegment)!er et enkelttrådet DNA segment på minst 10 nukleotider med en sekvens som er komplementær til sekvensen av et subsegment av (første subsegment)tsom ender med det 3'-terminale nukleotid av det (første subsegment)t, idet (promoteren)!slutter seg til 5'-enden av det nevnte (3'-primer subsegment)!, hvis det nevnte (variable subsegment)!har 0 nukleotider (2) den nevnte første primer, hybridisert i samsvar med trinn (1), forlenges ved en reaksjon katalysert ved hjelp av en første DNA polymerase for fremstilling av et første komplementært DNA segment, som omfatter et subsegment med formel III

hvori (første subsegment)tcer DNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (første subsegment)t, (andre subsegment)tcer DNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (andre subsegment)t, og (tredje subsegment)tcer

DNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (tredje subsegment)t, med den betingelse at hvis targetsegmentet er et RNA segment er den nevnte første DNA polymerase en revers transkriptase, (3) duplekset tildannet i reaksjonen i trinn (2) gjøres enkelttrådet, (4) til (tredje subsegment) tc av det første komplementære DNA med formel III hybridiseres en andre primer, som er et enkelttrådet DNA på minst 10 nukleotider med formel IV

hvori (5'-primer subsegment)2har sekvensen av et subsegment av (tredje subsegment)tsom ender med det 5'-terminale nukleotid av (tredje subsegment)tog hvori (variabelt subsegment) 2 er et segment med 0 til 100 nukleotider som slutter seg til 5'-enden av (5'-primer subsegment)2, (5) det andre primersegment, hybridisert i samsvar med trinn (4), forlenges ved en reaksjon katalysert ved hjelp av en andre DNA polymerase til å danne et andre komplementært DNA segment som omfatter et subsegment med formel (V)

hvori (variabelt subsegment)lcer DNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (variabelt subsegment)!og (promoter)lcer DNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (promoter)!, med den betingelse at den andre DNA polymerase er den samme som eller forskjellig fra den første DNA polymerase, og (6) det dobbelttrådete produkt fra trinn (5) anvendes som et templat ved en reaksjon katalysert ved hjelp av en første bakteriofag DNA avhengig RNA polymerase, som gjenkjenner promoteren hvorav en tråd er (promoter)!, for fremstilling av et første RNA produkt med formel VI

hvori (variabelt subsegment)lr er RNA segmentet med sekvensen av (variabelt subsegment)!, (første subsegment)ter er RNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (første subsegment)t, (andre subsegmen<t>)tcr er RNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (andre subsegment)t, (tredje subsegment)tcrer RNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (tredje subsegment)tog (variabelt subsegment)2crer RNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (variabelt subsegment)2• I en utførelsesform utgjør oppfinnelsen en fremgangsmåte hvori (første subsegment)thar lengde minst 10 nukleotider og har formel XIII

hvori (første subsegment)t2har 0 eller flere nukleotider, og hvis det har flere enn 0, slutter det seg til 3'-enden av (første subsegment)tlog (første subsegment)tlhar lengde minst 10 nukleotider, hvori (tredje subsegment)thar formel

XIV

hvori (tredje subsegment)t2har 0 eller flere nukleotider, og hvis det har flere enn 0, slutter det seg til 5'-enden av

(tredje subsegment)tlog (tredje subsegment)tlhar lengde minst 10 nukleotider, hvori

(3'-primer subsegment)!har sekvensen komplementær til sekvensen av et subsegment av targetsegment bestående av hele (første subsegment)t2og 0 eller flere nukleotider av (første subsegment)tl, hvori (5'-primer subsegment)2er et subsegment som består av hele (tredje subsegment) t2 og 0 eller flere nukleotider av (tredje subsegment)tl/og hvori, etter trinnene (1) til (6) i det foregående, RNA subsegmentet med formel VII

hvori (første subsegment)tlcrer RNA segmentet med sekvensen komplementær til sekvensen av (første subsegment)tlog (tredje subsegment)tlcr er RNA segmentet med sekvensen komplementær til sekvensen av (tredje subsegment)tl, blir ytterligere amplifisert ved hjelp av en metode omfattende: (7) hybridisering til det nevnte første RNA produkt med formel VI av en tredje primer som er et enkelttrådet DNA omfattende et 3'-terminalt subsegment med formel VIII

hvori (promoter)3er et enkelttrådet DNA segment med sekvensen av plusstråden av en bakteriofag DNA avhengig RNA polymerase-spesifikk promoter, idet sekvensen av (promoter)3er den samme som eller forskjellig fra sekvensen av (promoter) lf (variabelt subsegment)3er et enkelttrådet DNA segment på 0 til 100 nukleotider som slutter seg til det 3'-terminale nukleotid av (promoter)3og det 5'-terminale nukleotid av (3'-primer subsegment)3, og (3'-primer subsegment)3er et enkelttrådet

DNA segment som har samme sekvens som (tredje subsegment)tlog slutter seg til det 3'-terminale nukleotid av (promoter)3hvis (variabelt subsegment)3har 0 nukleotider;

(8) den tredje primer hybridisert i samsvar med trinn (7) forlenges i en reaksjon katalysert ved hjelp av en tredje DNA polymerase, som er en revers transkriptase og er den samme som eller forskjellig fra den nevnte første og andre DNA polymerase, for å danne et tredje komplementært DNA segment som omfatter et 3'-terminalt subsegment med formel IX

hvori (variabelt subsegment)lcer det DNA som har sekvensen komplementær ti-1 sekvensen av (variabelt subsegment) 1; (9) duplekset dannet i reaksjonen i trinn (8) gjøres enkelttrådet; (10) hybridisering til det tredje komplementære DNA dannet i reaksjonen i trinn (8) av en fjerde primer med formel X

hvori (variabelt subsegment)4er et segment med 0 til 100 nukleotider, og (5'-primer subsegment)4er et subsegment med kjent sekvens som slutter seg til 3'-nukleotidet av (variabelt subsegment)4, hvis (variabelt subsegment)4har mer enn 0 nukleotider, og som omfatter minst 10 nukleotider av segmentet med formel XX

hvori (første subsegment)t2cer DNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (første subsegment) t2 og (første subsegment)tlcer DNA segmentet med sekvensen komplementær til sekvensen av (første subsegment)tl, med den betingelse at minst en av de nevnte minst 10 nukleotider ved eller i retning 5' fra det 5'-terminale nukleotid av (første subsegment)tlc; (11) den nevnte fjerde primer hybridisert i samsvar med trinn (10) forlenges i en reaksjon katalysert ved hjelp av en fjerde DNA polymerase, som er den samme som eller forskjellig fra den nevnte første, andre og tredje DNA polymerase, til å danne et fjerde komplementært DNA som omfatter et segment med formel XI

hvori (andre subsegment)tcer DNA segmentet med sekvensen komplementær til sekvensen av (andre subsegment)t, (tredje subsegment)tlcer DNA segmentet med sekvensen komplementær til sekvensen av (tredje subsegment)tl, (variabelt subsegment)3cer DNA segmentet med sekvensen komplementær til sekvensen av (variabelt segment)3, og (promoter)3cer DNA segmentet med sekvensen komplementær til sekvensen av (promoter)3, og (12) det dobbelttrådete produkt fra trinn (11) anvendes som templat i en reaksjon katalysert ved hjelp av en andre bakteriofag DNA avhengig RNA polymerase, som er den samme som eller forskjellig fra den nevnte første bakteriofag DNA avhengige RNA polymerase og som gjenkjenner promotoren hvorav en tråd er (promoter)3, til å danne et andre RNA produkt med et 5'-terminalt subsegment med formel XII 5'-(variabelt sub-

hvori (variabelt subsegment) 3r er RNA segmentet med sekvensen av (variabelt subsegment)3, (tredje subsegment)tlrer RNA segmentet med sekvensen av (tredje subsegment)tl, (andre subsegment)trer RNA segmentet med sekvensen av (andre subsegment) t (første subsegment)tlrer RNA segmentet med sekvensen av (første subsegment) tl, (variabelt subsegment) 4cr er RNA segmentet med sekvensen komplementær til sekvensen av (variabelt subsegment)4, og X12er RNA segmentet med sekvensen komplementær til sekvensen av subsegmentet av (5'-primer subsegment)4som er i retning 5' fra 5'-enden av (første subsegment)tlc.

Som bemerket i det foregående omfatter oppfinnelsen også sett for gjennomføring av amplifiseringsmetodene i samsvar med oppfinnelsen. I tilfellet av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen som går ut på å fremstille et første RNA produkt, vil et sett i samsvar med oppfinnelsen omfatte de to primere, den tilsvarende bakteriofag DNA avhengige RNA polymerase og DNA polymerasen. Et sett for gjennomføring av en fremgangsmåte i samsvar med oppfinnelsen som medfører fremstilling av både et første og et andre RNA produkt vil omfatte fire passende primere (to sett av to) med de tilsvarende nødvendige polymeraser.

Fremgangsmåter og sett i samsvar med oppfinnelsen for gjennom-føring av nukleinsyre-hybridiseringsprobebestemmelser som medfører amplifisering av et targetsegment i samsvar med oppfinnelsen omfatter i tillegg til de respektive trinn og komponenter av fremgangsmåtene og settene for amplifisering, trinn og komponenter nødvendige for detektering av RNA produktet som resulterer fra amplifiseringen i samsvar med oppfinnelsen. Den fagkyndige vil forstå de forskjellige ytterligere respektive trinn og komponenter som er nødvendige for å detektere RNA fra en amplifiseringsprosess ved hjelp av hvilke som helst av de tallrike nukleinsyreprobe-hybridise-ringsbestemmelsesmetoder kjent på området..En foretrukket nukleinsyreprobe-hybridiseringsbestemmelsesmetode som involverer kuleinnfanging av merket RNA amplifisering, er illustrert i eksempel II i det følgende.

Det foretrekkes at (3'-primer subsegment) lr (5'-primer subsegment)2, (3'-primer subsegment)3og (5'-primer subsegment) 4 har mellom 20 og 40 nukleotider, og mer foretrukket omtrent 30 nukleotider for å øke den spesifisitet hvormed de forskjellige primere binder til endene av de targetsegmenter som søkes amplifisert.

Det er også foretrukket at targetsegmentet av en nukleinsyre av interesse som selekteres for amplifisering (i kraft av seleksjon av (første subsegment)tog (tredje subsegment)tvelges slik at (andre subsegment)trhar minst 30 og mer foretrukket minst omtrent 50 nukleotider. Dette tillater at bruken av (andre subsegment)tcr eller (andre subsegment)tri det amplifiserte RNA produkt blir targeter for nukleinsyre-prober som ikke vil ha sekvenser som overlapper sekvensene i noen av primer subsegmentene.

Selv om den bakteriofag DNA avhengige RNA polymerase kan anvende templater lengre enn 1000 bp, blir deres effektivitet ved transkripsjonen mindre etter som templatet blir lengre.Targetsegmenter på mindre enn 1000 bp foretrekkes derfor.

Det foretrekkes å anvende det identiske sett av primere anvendt i syntesen av RNA, for å fremstille RNA i en andre syklus av TAS. Som angitt i den delen som beskriver fremstillingen av RNA bør primerparet ikke overlappe. Ved gjennom-føring av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen hvori fremstilling av RNA er ønsket, er det mulig at subsegmentet av targetsegmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (5'-primer subsegment)4er i 5'-retningen fra og ikke overlapper subsegmentet av targetsegment med sekvens komplementær til sekvensen av (3'-primer subsegment)2. Tilsvarende foretrekkes det at subsegmentet av targetsegment med samme sekvens som sekvensen av (3'-primer subsegment)3er i 3'-retningen fra og ikke overlapper subsegmentet av targetsegment med samme sekvens som sekvensen av (5'-primer subsegment)2• Denne strategi kan være å foretrekke på grunn av at den reduserer konkurransen mellom de forskjellige primere for de samme seter og øker derved markert effektiviteten av amplifiseringen i henhold til oppfinnelsen. Hvor der er noen overlapping mellom sett av sammenpakkede primere, er det foretrukket å fjerne ethvert ubrukt første sett av primere før det andre sett anvendes.

Fokus ved den foreliggende oppfinnelse er på bakteriofag DNA avhengige RNA polymeraser på grunn av deres høye spesifisitet for visse promotere. Andre polymeraser som ville ha tilsvarende høy spesifisitet for spesielle promotere kan også anvendes i samsvar med oppfinnelsen i stedet for. bakteriofag-polymerasen.

De foretrukne av de bakteriofag DNA avhengige RNA polymeraser er polymeraser fra T7, T3 og SP6. Foretrukne promotere for bruk med disse polymeraser er beskrevet i eksemplene og patentkravene, men tallrike andre promotere for disse polymeraser er kjent på området og kan også anvendes.

Videre kan polymerase fra andre bakteriofager enn de foretrukne tre, og promotere som gjenkjennes av slike andre polymeraser, anvendes i samsvar med oppfinnelsen.

Det foretrekkes at det som DNA polymerase ved fremgangsmåtene i henhold til oppfinnelsen anvendes reverse transkriptaser og DNA polymerase som mangler 5' til 3' eksonukleaseaktivitet. Det er mest foretrukket at en enkel DNA polymerase anvendes for alle trinn i fremgangsmåtene. Mest foretrukne av DNA polymerasene er AMV revers transkriptase og rekombinant MMLV revers transkriptase. Andre polymeraser er imidlertid brukbare, som for eksempel den varmestabile DNA polymerase fra Thermus aquaticus (se Chien et al, J. Bacteriol. 127, 1550

(1976), Sequenase type rekombinant T7 DNA polymerase fra U.S. Biochemicals Corp., Cleveland, Ohio, U.S.A., og det velkjente Klenow Fragment av E. coli DNA polymerase I, og kalvethymus DNA polymerase alfa.

De "variable subsegmenter" som eventuelt inkluderes i de forskjellige primere tjener tre funksjoner. De kan faktisk mer passende betegnes "flerformåls subsegmenter". For det første, for de første og tredje primere, som inkluderer promotere, inkluderer promotersubsegmentene foretrukket transkripsjons-initiasjonssekvenser som foretrekkes av RNA polymerasen tilsvarende promoteren. For det andre, for samtlige av primerne, kan et variabelt subsegment eventuelt inneholde et spesielt segment hvormed RNA produktet fra amplifiseringen kan detekteres ved en nukleinsyreprobe-hybridiseringsbestemmelse. Amplifisering (og bestemmelse) kan faktisk foregå for flere forskjellige targetsegmenter samtidig ved å anvende sett av primere som er forskjellig med hensyn til deres gjenkjennelsessegmenter (f.eks. (3'-primer subsegment) ■]_) men inkluderer et felles variabelt subsegment. Det variable subsegment kan også inneholde en polylinkersekvens som passende inneholder et flertall restriksjonsseter for lettere etterfølgende kloning. Endelig kan de variable subsegmenter anvendes for i RNA produktet fra amplifiseringen å innlemme sekvenser nødvendige for å tillate at RNA produktet kan (autokatalytisk) replikeres ved hjelp av en bakteriofag RNA spesifikk RNA polymerase, som for eksempel Qfl replikase, se Miele et al i det foregående, og BMV sekvenser fra RNA-3 kromosom av det plantevirus som fremmer syntesen av kappe mRNA. Se Ahlquist et al, J. Mol. Biol. 172, 369 (1984); Ahlquist et al, Plant Mol. Biol. 3, 37 (1984); Ahlquist et al, J. Mol. Biol. 153, 23 (1981); Miller, et al, Nature 313, 68

(1985); Miller et al, Virology 125, 236 (1983); og Ou et al, PNAS 79, 5235 (1982).

I tilfellet av Qfi replikase, som er kjent på området, gjennom-føres dette foretrukket ved at det i (variabelt subsegment)2inkluderes sekvensen

I tilfellet av anvendelse av BMV replikase, også kjent, gjennomføres dette foretrukket ved å inkludere den følgende sekvens for BMV i variabel sekvens 2 (baser 1-25) (ved den spesifikke bruk av HIV eksempel infra):

50

I

AAGCTA-3' (54 baser), som en kjernesekvens, idet i tillegg AU rik sekvens 5'-derav kan anvendes for å øke replikaseaktivi-teten fra BMV. Denne oligo kan anvendes som den andre primer. Den første primer anvendt med denne andre primer er en T7-basert, HIV-spesifikk primer.

I tillegg er detaljer for å lette forståelsen av oppfinnelsen tilveiebragt i de etterfølgende eksempler:

4. Eksempler

EKSEMPEL I

10 ml blod fra en pasient som muligens er smittet med human immunodefisiens virus-type 1 (HIV-1) fraksjoneres ved hjelp av et Sepracell apparat (Sepratech Corp., Oklahoma City, Oklahoma, U.S.A.) eller alternativt med en Ficoll-gradient, for å isolere lymfocytter. Lymfocyttene blir så lysert og nukleinsyre derfra isoleres ved hjelp av et ekstraktorapparat

(Molecular Biosystems, Inc., San Diego, California, U.S.A.)

eller alternativt blir lymfocyttene lysert ved hjelp av standard natriumdodecylsulfat (SDS)-enzymbehandling og nukleinsyren isolert ved hjelp av reversfase-kromatografi over DEAE cellulose. Dette gjøres som følger: Separering av celler: 5000 omdreininger pr. min. i 4'

(minutter) fra 1 ml tris-bufret saltløsning (TBS), pH 7,5.

Supernatant trekkes av.

Pelleten resuspenderes i:

500 ul 0,3 M NaCl/20 mM tris, ph 7,5") Dette blandes 100 pl 2 % SDS godt og til-

200 pl 5 mg/ml proteinase K settes så til 200 pl 0,25 M EDTA pelleten

Blandingen vorteks-behandles kraftig og inkuberes ved 50°C i 45' med vorteks-omrøring i 10-15''(sekunder) hvert 10'.

Ifylling i tømt ekstraktorkolonne med innslipping.

Kolonnen vaskes lx med 4 ml 0,3 M NaCl/20 mM tris, pH 7,5.

DNA/RNA elueres med 4 ml 0,5 M NaCl/20 mM tris pH 7,5.

For eluering tilsettes: 5 pl glykogen

4 00 pl 3 M NaOAc

9,0 ml iskald EtOH

det blandes godt

Utfelling foretas over natten ved -20°C. Et bad av kullsyreis/etanol i én time kan anvendes.

Separering av DNA/RNA i 15' ved 10 000 omdreininger pr. min. i en svingende bøtterotor. EtOH avhelles og blandingen får avrenne tørt på en "kimwipe" i 2'.

Det frysetørkes i 10'.

Pellet resuspenderes i 170 ul TE.

Det inkuberes ved 37°C i 5'.

En 1 ml spinnkolonne behandles som følger:

En 1 ml sprøyte plugges med en liten mengde glassull (autoklavbehandlet).

Sprøyten fylles med TE (tris-EDTA) behandlet med dietylpyro-karbonat (DEPC).

Det tilsettes hurtig fin Sephadex G-50 (i TE; autoklavbehandlet) .

Tilsetningen fortsettes inntil den faste matriks munner opp over toppen av sprøyten.

Det separeres i 30 sekunder ved 1000 omdreininger pr. min. i en IEC bordsentrifuge.

Det vaskes med 100 ul TE, separeres i 1' ved middels hastighet (ca. 1000 omdreininger pr. min.). Vaskeløsningen kastes.

Ekstrakten fylles på kolonnen. Det roteres på nytt il'.

Det renses med 150 pl TE, det roteres ved 1000 omdreininger pr. min. i 1'. Renseløsning og den første fraksjon slås sammen. Prøvene kan oppdeles for flere reaksjoner ved dette trinn.

Det tilsettes 1/10 volum 8 M LiCl. Det blandes med 2,5 x vol. 100 % EtOH. Det vorteksomrøres kraftig. Utfelling skjer med kullsyreis/EtOH i 30'.

Det separeres i 15' ved topphastighet i en mikrofuge ved 4°C.

Pelleten tørkes.

Etter isolering oppløses total nukleinsyre fra prøven i 100 pl TE buffer (10 mM tris Cl, 1 mM EDTA, pH 8). 10 pl av de 100 pl av total nukleinsyre oppløses til et sluttvolum på 100 pl inneholdende:

40 mM tris Cl, pH 8

25 mM NaCl

10 mM MgCl2

10 mM ditiothreitol (DTT)

2 mM spermidin

100 pg/ml bovint serumalbumin

400 mM av hver av dATP, dCTP, dGTP og TTP

30 nM av det 101 base enkelttrådete DNA med sekvens

5'-GAACGCGGCT ACAATTAATA CATAACCTTA TGTATCATAC

ACATACGATT TAGGTGACAC TATA GAATAC TTTCGTAACA CTAGGCAAAG

GTGGCTTTAT C -3' primer A tilsettes. 30 nM av det 29 base DNA med sekvens 5'-ACACCATATG TATGTTTCAG GGAAAGCTA-3', primer B tilsettes. Primer B, som er den andre primer, har sekvensen av baser 5151-5179 i SOR genet av HIV-1. Et alternativt segment for den andre primer, tilsvarende baser 5357-5387 i SOR genet av HIV-1, har sekvensen 5'-GCACACAAGT AGACCCTGAA CTAGCAGACC A-3', og, hvis den anvendes, er den også tilstede med 30 nM. Primer A er den første primer. Dens 64 5'-nukleotider danner plusstråden av en promoter for SP6 DNA avhengig RNA polymerase. Dets segment med sekvens 5'-GAATAC-3' er (alternativt subsegment) lr som inkluderer transkripsjons-startsetet (5'-G) og andre baser øyensynlig favorisert av SP6 RNA polymerasen ved 5'-enden av sekvensene transkribert dermed. Endelig danner de 31 3'-terminale nukleotider (primer subsegment) i og har en sekvens komplementær til sekvensen av basene 5577-5547 i SOR-genet av et HIV-1 isolat (se Råtner et al, Nature 313, 277 (1985) for fullstendig sekvens). (HIV-isolatet refereres til i disse eksempler som "HIV-1".)

Bemerk at alle oligonukleotider som anvendes i disse eksempler fremstilles ved hjelp av fastfasesyntese på en Applied Biosystems, Inc. (Foster City, California, U.S.A.) automa-tisert syntetisator (modell nr. 380A) og renses kromatografisk til essensiell homogenitet ved hjelp av HPLC under anvendelse av en C8 reversfasekolonne. Alternativt kan andre kommersielt tilgjengelige syntetisatorer og standard renseprosedyrer anvendes for å fremstille oligonukleotidene.

Den 100 pl oppløsning oppvarmes ved 65°C i 2 minutter og avkjøles så til 42°C i løpet av 1 minutt. Denne oppvarming og etterfølgende opprettholdelse ved 42°C eller mer, i kombinasjon med sammensetningen av oppløsningen, tilveiebringer betingelser med tilstrekkelig stringens til å bevirke hybridisering av (3'-primer subsegment)!, med tilstrekkelig stabilitet til å igangsette DNA syntese, med høy spesifisitet til sekvensen komplementær til sekvensen av (3'-primer subsegment ) 1.

Deretter blir 10 enheter av aviant myoblastosevirus (AMV) revers transkriptase eller 500 enheter av rekombinant Moloney murint leukemivirus (MMLV) revers transkriptase, erholdt fra Life Sciences, Inc., St. Petersburg, Florida, U.S.A., tilsatt til oppløsningen og oppløsningen inkuberes i 10 minutter ved 42°C. (Én enhet innlemmer 1 nmol av TTP i syreutfellbar form i løpet av 10 minutter ved 37°C under anvendelse av poly(A) oligo (T)i2"i8 som templat-primer som definert av Houts et al., J. Virol. 29, 517 (1979).) Etter den 10 minutters inkubasjon anbringes oppløsningen i et kokende vannbad i 1 minutt. Denne oppvarming bevirker trådseparering av duplekset dannet ved den reverse transkriptase.

Deretter avkjøles oppløsningen til 42°C i løpet av 1 minutt. Under denne avkjøling hybridiserer den andre primer til det 3'-terminale segment av komplementet av targetsegment dannet i reaksjonen katalysert av den reverse transkriptase. På nytt er hybridiseringsbetingelsene tilstrekkelig stringente for tilstrekkelig spesifikk hybridisering mellom den andre primer og sekvensen komplementær til sekvensen av den andre primer.

Etter avkjølingen tilsettes 10 ytterligere enheter av AMV revers transkriptase eller 500 ytterligere enheter av klonetMMLV revers transkriptase og ytterligere inkubering i 10 minutter ved 42°C gjennomføres.

Deretter blir RNasin type ribonukleaseinhibitor fra PromegaBiotec, Madison, Wisconsin, U.S.A. tilsatt (eventuelt) til en konsentrasjon på 1 enhet pr. ml. (1 enhet er den mengde inhibitor som kreves for å inhibere aktiviteten av 5 ng ribonuklease A med 50 %. Roth, Meth. Cancer Res. 3, 151

(1976).) Videre blir hver av ribonukleosid 5'-trifosfater, ATP, GTP, CTP og UTP tilsatt til 400 mM. Til slutt blir mellom 10 og 20 enheter av SP6 DNA avhengig RNA polymerase, erholdt fra Promega Biotec, tilsatt og den resulterende oppløsning inkuberes ved 42°C i 30 til 60 minutter. (1 enhet er den mengde av RNA polymerase som kreves for å katalysere innlemmelsen av 1 nmol ribonukleosidtrifosfat til syreuopp-løselig produkt i løpet av 60 minutter ved 37°C under standard reaksjonsbetingelser (40 mM tris Cl, pH 7,9, 6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM spermidin, 0,5 mM av hver av ATP, GTP, CTP og UTP, 0,5 Ci av<3>H-CTP, 1 g av SP6 DNA og enzymet i et totalt volum på 50 ul).)

Deretter tilsettes de følgende oligonukleotider for å bringe deres konsentrasjon til 30 nM:

I den tredje primer, som i den første, er de 5'-terminale 64 baser promotersegmentet og de neste 6 baser er det variable segment. Dette variable segment er de første seks baser transkribert fra promoteren ved hjelp av SP6 RNA polymerase, og disse baser selekteres for å øke nivået av denne transkripsjon. Endelig er (3'-primer subsegment)3delen av den tredje primer de 3'-terminale 33 baser, i den samme sekvens som basene 5388-5420 i det korte, åpne leserramme (SOR) gen av HIV-1. Den fjerde primer har sekvensen komplementær til sekvensen av basene 5546-5517 i SOR-genet av HIV-1.

Etter tilsetning av den tredje og fjerde primer blir opp-løsningen inkubert ved 42°C i 1 minutt. Under denne periode foregår hybridisering mellom (3'-primer subsegment)3av den tredje primer og det første RNA dannet i reaksjonen katalysert av SP6 RNA polymerasen. På grunn av stringensen av hybridiseringsbetingelsene hybridiserer (3'-primer subsegment)3med stabilitet tilstrekkelig for igangsetning av DNA syntese, med høy spesifisitet til segmentet med komplementær sekvens i det første RNA.

Etter inkubasjonen blir 10 enheter av AMV revers transkriptase eller 500 enheter av klonet MMLV revers transkriptase tilsatt og oppløsningen inkubert i 10 minutter ved 42°C for å danne det tredje komplementære DNA.

Oppløsningen blir så suspendert i et kokende vannbad i 1 minutt og avkjølt til 42°C i løpet av 1 minutt for først å gjøre duplekset mellom tredje komplementært DNA og første RNA enkelttrådet, og for det annet å tillate hybridisering mellom fjerde primer og tredje komplementært DNA. Som med de andre hybridiseringer er betingelsene tilstrekkelig stringente til at hybridisering av fjerde primer, med stabilitet tilstrekkelig til å igangsette DNA syntesen, foregår med høy spesifisitet til segmentet av tredje komplementært DNA med sekvens komplementær til sekvensen av den fjerde primer.

Deretter blir på nytt 10 enheter av AMV revers transkriptase eller 500 enheter av klonet MMLV revers transkriptase tilsatt og oppløsningen inkuberes i 10 minutter ved 42°C.

Deretter tilsettes RNasin type ribonukleaseinhibitor (eventuelt) til 1 enhet pr. ml, etterfulgt av 10-20 enheter av SP6RNA polymerase, og oppløsningen inkuberes i 30 minutter til 1 time ved 42°C.

Det resulterende andre RNA kan så detekteres ved hjelp av en teknikk med nukleinsyreprobe-hybridisering.

EKSEMPEL II

Prosedyren i eksempel I følges, med en modifikasjon anført i det følgende, med tre prøver: (A) en av 10 ml humant blod kjent å være fritt for HIV, (B) en av 10 ml kultur kjent å ha omtrent IO<3>HIV-1 smittede celler pr. ml, og (C) en av 10 ml blod fra en person som kan være smittet med et HIV-1. Modifiseringen av prosedyren er at et alfa-32p-merket ribonukleosidtrifosfat inkluderes som et substrat i reaksjonen katalysert av SP6 RNA polymerase for å danne det andre RNA. Dette andre RNA er følgelig<32>P-merket.

Sephacryl-S500 makroporøse kuler derivatiseres med en kar-boksylgruppeavsluttet linker (med formel -C(=NH)NH(CH2)5C02-) og deretter med 5'-(6-aminoheksylfosfor-amidat)-derivatisert oligonukleotid med sekvens 5'-TGGTCTGCTA GTTCAGGGTC TACTTGTGTG C-3' som er sekvensen komplementær til sekvensen i basene 5357-5387 i SOR-genet av HIV-1. (Sekvensen av basene 4901-4932 av SOR-genet forekommer i ethvert andre RNA fremstilt under amplifisering av nukleinsyre fra en prøve.) Fremstillingen av kulene skjedde i henhold til prosedyrer beskrevet i felles overdratt US patentansøkning med løpenr. 895,756 inngitt 11. august 1986. Kort sagt er bærermaterialene porøst silikatglass eller makroporøst fornettet dekstran, derivatisert med en aminoavsluttet linker, hvor hovedsakelig alle aminogruppene som ikke er kovalent knyttet gjennom en fosforamidatgruppe til det terminale nukleosid av innfangningsproben blokkert fra å interagere ikke-spesifikt med nukleinsyre med en alifatisk acylgruppe; makroporøst fornettet dekstran aktivert med bromcyan, som reagerer med aminer for tilknytning til amino-alkylfosforamidat-derivatiserte oligonukleotider; og porøst silikatglass, makroporøst fornettet dekstran eller divinyl-benzen-fornettet polystyren derivatisert med en karboksylavsluttet eller suksinimidester-avsluttet linker, med en fraksjon av karboksylgruppene knyttet i en amidbinding til en aminogruppe i et diaminoalkan, hvorav den annen aminogruppe er en del av et fosforamidat som i sin tur er bundet direkte til det terminale nukleosid av innfangningsproben. Foretrukne bærermaterialer er langkjede-alkylaminderivatisert og karbok-sylderivatisert glass med styrt porestørrelse solgt av Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, U.S.A. under produktnr. 24875 henholdsvis 23735, i form av kuler med nominell pore-diameter på 500 Ångstrøm og partikkeldiametre mellom omtrent 125 og 177 mikrometer, og Sephacryl S-500 solgt av Pharmacia Inc., Piscataway, New Jersey, U.S.A. under Code No. 17-0475-01 i form av kuler med en fuktig diameter på omtrent 40 til omtrent 105 mikrometer og et eksklusjonsvolum for dekstraner med molekylvekt over omtrent 2xl0<7>dalton, idet det nevnte Sephacryl skal være derivatisert med bromcyan eller med en aminoavsluttet eller karboksylavsluttet linker. Ved et aspekt er den faste bærer en av:

(A) et porøst silikatglass derivatisert med silikoner med

(1) grupper med formel

idet hovedsakelig ikke noe silisium derivatisert med en gruppe avsluttet med en aminogruppe, hvori c er 0 til 5, n er 2 til 8, -O-(Oligo) er oligonukleotidproben, og oksygenatomet bundet til (Oligo) er fra oligonukleotidproben, og oksygenatomet bundet til (Oligo) er 5'-oksygenet av 5'-nukleosidet eller 3'-oksygenet av 3'-nukleosidet av proben, eller

(2) grupper med formel

hvori m, n og p er like eller forskjellige og er hver 2 til 8, eller

(B) et fornettet makroporøst dekstranmaterial derivatisert ved hydroksyloksygenatomene, knyttet til karbonatomene i de

sukkerdeler som har minst et nabokarbonatom med et uderivati-sert hydroksyl, med

(1) grupper med formel

med hovedsakelig ikke noe hydroksyloksygen derivatisert med en gruppe avsluttet med en aminogruppe, eller

(2) grupper med formel

hvori c, q og p er like eller forskjellige og q er 2 til 10, og (C) divinylbenzenfornettet polystyren derivatisert ved fenylgruppene med grupper med formel

hvori s og p er like eller forskjellige og s er 2 til 10. Se Ghosh et al, Nucleic Acids Research 15, 5353 (1987) .

Hver av tre porsjoner av 50 mg Sephacryl-kuler, derivatisert som beskrevet i det foregående, bløtlegges i 15 minutter ved 37°C i 250 pl av en forhybridiseringsoppløsning inneholdende 0,1 % SDS, 10 % dekstransulfat, 1 mg/ml DNA fra laksesperm, og 5 x SSPE (0,75 M NaCl, 50 mM NaH2P04, pH 7,4, og 5 mM EDTA) . Etter bløtleggingen blir kulematerialet pelletisert ved sentrifugering og forhybridiseringsoppløsning fjernes ved aspirasjon.

Nukleinsyren fra amplifiseringsprosedyren med hver av de tre prøver isoleres ved hjelp av etanolutfelling og oppløses så til 250 ul i oppløsning som er det samme som forhybridise- ringsoppløsningen men mangler DNA fra laksesperm. Hver av de resulterende nukleinsyreoppløsninger kombineres så med en porsjon av forhybridisert oligonukleotid-derivatiserte Sephacryl-kuler og den resulterende blanding inkuberes med forsiktig omrøring ved 42°C i 90 minutter.

Sephacryl-kulene blir så pelletisert ved sentrifugering, hybridiseringsoppløsningen fjernes ved aspirasjon, og kulene vaskes så tre ganger, 10 minutter hver gang ved 37°C, i 1 ml av en oppløsning av 2 x'sSC (0,30 M NaCl, 0,03 M Na citrat, pH 7,0). Etter hver vasking pelletiseres kulene ved sentrifugering og oppløsningen fjernes ved aspirasjon.

Umiddelbart etter den tredje vasking underkastes kulene for Cerenkov-telling.

Kulene med amplifisert nukleinsyre fra prøve A frembringer et lavt impulstallnivå, knapt over bakgrunnstallene fra scintil-lasjonsyæsken alene. Kulene med amplifisert nukleinsyre fra prøve B frembringer impulstall med et mye høyere nivå enn hva som iakttas med kuler assosiert med prøve A. Kulene med amplifisert nukleinsyre fra prøve C, hvis de frembringer et nivå for impulstall vesentlig over det nivå som frembringes med kuler assosiert med prøve A, indikerer at den person, hvis blod ble tatt for prøve C, er smittet med HIV-1.

EKSEMPEL III

Prosedyrene i eksemplene I og II gjennomføres med T7 RNA polymerase (Promega Biotec) i stedet for SP6 RNA polymerase, med hver av subsegmentet 51 -(promoter) 1-(variabelt subsegment) i~ 3' av den første primer og subsegmentet ,5'-(promoter) 3-(variabelt subsegment)3-3<1>av den tredje primer med sekvensen 5'-TAATACGACT CACTATA GGGA-3', hvori de 17 5'-terminale baser er promotersubsegmentet og de 4 3'-baser er det variable subsegment. Det variable segment tilsvarer de 4 5'-terminale baser av transkriptet fra promoteren. Ribonuklease-inhibitor anvendes ikke i noe trinn i denne prosess, i det minste med polymerasepreparatet fra Promega Biotec.

EKSEMPEL IV

Prosedyrene i eksemplene I og II gjennomføres med T3 RNA polymerase (fra Stratagene, San Diego, California) i stedet for SP6 RNA polymerasen og med det følgende segment anvendt som (promoter) x-(variabelt subsegment) subsegment av den første primer og (promoter)3-(variabelt subsegment)3subsegment av den tredje primer: 5'-TATTAACCCT CACTAAA GGGA-3', hvori de 17 5'-terminale baser er promotersegmentet og de 4 3'-terminale baser er det variable segment, inkluderende de 5'-terminale 4 baser i transkriptene fra promoteren.

EKSEMPEL V

Under anvendelse av T7 RNA polymerase som i eksempel III, blir targetsegment i genomet av HIV fra prøver av humant blod amplifisert under anvendelse av følgende primere i stedet for primerne spesifisert i eksempel I:

EKSEMPEL VI

Under anvendelse av T7 RNA polymerase som i eksempel III, blir targetsegment i genomet av HIV fra prøver av humant blod amplifisert under anvendelse av de følgende primere i stedet for primerne spesifisert i eksempel I:

Første primer: De samme 21 5'-terminale nukleotider som de første og tredje primere i eksempel V knyttet til de følgende 31 3'-terminale nukleotider: 5'-CACCTAGGGC TAACTATGTG TCCTAATAAG G-3', som har sekvensen komplementær til sekvensen i basene 5471-5441 i SOR-genet av HIV-1.

Tredje primer: De samme 21 5'-terminale nukleotider som de første og tredje primere i eksempel V knyttet til de følgende 31 3'-terminale nukleotider:

EKSEMPEL VII

Prosedyren i eksempel I følges for isoleringen av nukleinsyre fra: 1) en prøve inneholdende IO<3>HIV-smittede CEM celler blandet med IO<6>usmittede CEM celler (Cancer Center Research Foundation; CCRF-CEM; ATCC nr. CCL 119); og 2) en prøve inneholdende IO<6>usmittede CEM celler. Disse prøver resuspenderes i 100 pl 10 mM tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA (TE) etter etanolutfellingstrinnet for å konsentrere prøven oppnådd fra Extractor kolonnen (MBI). De resuspenderte prøver fraksjoneres på en SephadexG-50 fin spinnkolonne (Maniatis, se det foregående) under eluering med TE. De eluerte prøver konsen-treres ved hjelp av etanolutfelling (i 0,8 M LiCl, 3 volum etanol, i et bad av kullsyreis/etanol i 15 minutter). Den utfelte prøve pelletiseres ved sentrifugering. Pelleten dreneres, tørkes og blir deretter resuspendert i 100 pl inneholdende 40 mM tris-HCl, pH 8,1, 8 mM MgCl2, 25 mM NaCl, 2 mM spermidin, 5 mM ditiothreitol, 100 pM av hver av dATP, dGTP, dCTP og dTTP, 1 mM av hver av rATP, rCTP, rGTP og rUTP, 100 pg/ml BSA (nuklease-fri) og 250 nM av hver av DNA oligonukleotid primer A

Som kontroller ble duplikatprøver av renset HIV RNA med en konsentrasjon på 0,01 fm resuspendert i 100 pl av bufferen beskrevet i det foregående. Endelig ble en 10-fm ft-globin sekvens inneholdt i plasmid HB19A (Wallace et al, Nucl. Acids Res. 9, 3647 (1981)), som var blitt linearisert ved hjelp av Hindlll, resuspendert i 100 pl av bufferen beskrevet ovenfor, med unntagelse av oligonukleotidprimerne. Oligonukleotid-primer D (5'-ACATTGCTTCTGACACAACTGTGTTCA-3<1>) og primer C (5'-TAATACGACTCACTATAGGGACAAAGGACTCAAA-3'), som er spesifikke for 13-globinsekvens, ble tilsatt til ft-globinreaksjonen hver med 250 nM.

Med unntagelse av ft-globinprøven blir reaksjonsblandingene oppvarmet til 65°C il', fi-globinprøven kokes il'. Alle prøver avkjøles til 42°C i 1 minutt. Deretter tilsettes 10 enheter av AMV revers transkriptase. Reaksjonsblandingene inkuberes i 15 minutter ved 42°C, kokes i 1 minutt og avkjøles déretter til 42°C i 1 minutt. 10 ytterligere enheter av AMV revers transkriptase tilsettes, med inkubering ved 42°C i 15 minutter. 100 enheter av T7 RNA polymerase tilsettes til reaksjonsblandingene, og reaksjonsblandingene inkuberes ved 37°C i 30 minutter.

Prøvene kokes i 1 minutt og avkjøles til 42°C i løpet av 1 minutt, etterfulgt av tilsetning av 10 enheter AMV revers transkriptase. Reaksjonsblandingene inkuberes ved 42°C i 15 minutter, kokes i 1 minutt og avkjøles til 42°C i løpet av 1 minutt. Ytterligere 10 enheter revers transkriptase tilsettes, etterfulgt av inkubasjon ved 42°C i 15 minutter. 100 enheter av T7 RNA polymerase tilsettes, med en 30 minutters inkubasjon ved 37°C. Denne syklus gjentas ytterligere to ganger.

Det amplifiserte target blir så detektert under anvendelse av OligoBeads som beskrevet i det følgende.

Sephacryl-kuler inneholdende HIV-l-spesifikke oligonukleotider ble fremstilt som beskrevet og lagret i TE ved 4°C ved en konsentrasjon slik at 250 ul av suspensjonen inneholder 50 mg Sephacryl-kuler. Oligonukleotider ble syntetisert og HPLC renset som beskrevet.

Oligonukleotidene anvendt for både tilknytning til kulene og deteksjon er homologe til SOR regionen av HIV-l-genomet. Oligonukleotidene anvendt i disse undersøkelser var 86-31 (deteksjon oligonukleotid) (5'-GCACACAAGTAGACCCTGAACTAGCAGAC-CA-3') og 87-83 (innfangnings-oligonukleotid på kulene: (5 ' -ATGCTAGATTGGTAATAACAACATATT-3 ' ) , som er homologe til den meningsløse tråd av SOR regionen, og separert ved omtrent 100 nukleotider. For deteksjon ble oligonukleotidene endemerket med<32>P i henhold til en standard protokoll. Den uinnlemmede merking ble fjernet ved gelfiltrering på en Sephadex G-50 fin kolonne, og oligonukleotidet ble lagret ved -20°C.

I et typisk forsøk med et kulebasert sandwich-hybridiserings-system (BBSHS) blir target og<32>P-merket deteksjons-oligonukleotid denaturert i 10 pl TE inneholdende 0,2 % SDS ved 65°C i 5 minutter i et Eppendorf-rør. Til dette tilsettes 10 ul av 2x Solution Hybridization Mix (10x SSPE/10 % dekstransulfat). Oppløsningen blandes, sentrifugeres i 2 sekunder og inkuberes ved 42°C i 1 time.

Under denne tid blir Sephacryl-kulene forhybridisert.

Utgangssuspensjonen av kuler blandes godt og 250 pl delmengder (50 mg kuler) overføres til Eppendorf-rør med blanding mellom hver fjernelse for å sikre en ensartet suspensjon. Delprøvene sentrifugeres i 10 sekunder og TE fjernes med hjelp av en uttrukket Pasteur pipette. Etter 250 pl av Hybridization Solution (5x SSPE (0,9 M NaCl, 50 mM NaH2P04, pH 7,4, 1 mM EDTA) 10 % dekstransulfat/O,1 % SDS) er tilsatt, blir kulene suspendert ved forsiktig rysting og inkubert ved 37°C i 30-60 minutter med leilighetsvis blanding. Umiddelbart før inn-fangningstrinnet blir kulene sentrifugert i 10 sekunder, forhybridiseringsoppløsningen fjernes, 80 pl av Hybridization Solution ved 37°C tilsettes, og kulene returneres til 37°C.

Hybridiseringsoppløsningen sentrifugeres i 2 sekunder og overføres til kulene og Hybridization Solution. Kulene suspenderes og inkuberes ved 37°C i 1 time med hyppig blanding for å opprettholde suspensjonen.

Etter innfangningen sentrifugeres kulene 10 sekunder og Hybridization Solution, inneholdende uinnfanget target og deteksjons-oligonukleotid, overføres til et scintillasjons-tellerglass. Kulene vaskes så 5 ganger med 2x SSC ved 37°C. De første 3 vaskinger foregår hurtig; 1 ml vaskeløsning tilsettes, kulene blandes godt og sentrifugeres i 10 sekunder, og vaskeløsningen overføres til et telleglass. For de endelige 2 vaskinger ble 1 ml vaskeløsning tilsatt og kulene blandes og inkuberes ved 37°C i 5 minutter før sentrifugering. Hver vaskeløsning telles separat for å overvåke prosedyren.

Cerenkov-tall av Hybridization Solution, 5 vaskinger, og kulene måles i 5-10 minutter. Tellerbakgrunnen trekkes fra for alle prøver. fm target detektert beregnes som følger:

(CPM på kuler/total CPM) x fm oligonukleotid

hvor total CPM er summen av CPM for Hybridization Solution, 5 vaskinger, og kuler.

EKSEMPEL VIII

Prosedyren i eksempel I følges for isolering av nukleinsyre fra to prøver: a) IO<3>HIV-smittede CEM celler med IO<6>usmittede CEM celler; og b) IO<6>usmittede dyrkede CEM celler hvortil 0,01 fmol renset HIV er tilsatt etter ekstraksjon. Prosedyren modifiseres så ved ytterligere rensing gjennom en Sephadex G-50 (fin) spinnkolonne (Maniatis, se det foregående) under eluering med TE etter trinnet med Extractor-kolonne. Dette etterfølges av en etanolutfelling av nukleinsyren (i 0,8 M LiCl og 2,5 volum EtOH). Nukleinsyren blir så resuspendert i 100 pl inneholdende:

40 mM tris-HCl, pH 8,1

8 mM MgCl2

25 mM NaCl

2 mM spermidin

5 mM DTT (ditiothreitol)

100 uM dATP, dTTP, dCTP, dGTP (hver)

1 mM rATP, rCTP, rGTP, rUTP

100 ug/ml BSA nuklease-fri

250 nM 2 9 bp DNA oligonukleotid med sekvensen

250 nM 56 bp DNA oligonukleotid med sekvensen

Den 100 ul oppløsning oppvarmes til 65°C i 1 minutt og avkjøles deretter til 42°C i løpet av 1 minutt. Denne oppvarming og etterfølgende opprettholdelse ved 42°C eller mer, i kombinasjon med sammensetningen av oppløsningen, tilveiebringer betingelser med tilstrekkelig stringens for hybridisering av (3'-primer subsegment) lr (se figur 1) med tilstrekkelig stabilitet til sekvensen komplementær til sekvensen av (3'-primer subsegment)xi target HIV RNA med høy spesifisitet.

Deretter tilsettes 10 enheter aviant myoblastosevirus (AMV) revers transkriptase (Life Sciences, Inc.) til oppløsningen og denne inkuberes i 10 minutter ved 42°C. (En enhet overfører 1 nmol av TTP i syreutfellbar form i løpet av 10 minutter ved 37°C under anvendelse av poly(A)-oligo (T)12-18 som templat-primer, som definert av Houts et al, J. Virol. 29, 517,

(1979).) Etter en 10 minutters inkubasjon anbringes opp-løsningen i et kokende vannbad i et minutt. Denne oppvarming bevirker trådseparering av duplekset dannet ved revers transkriptase og inaktivering av den reverse transkriptase.

Deretter avkjøles oppløsningen til 42°C i løpet av 1 minutt. Under denne avkjøling hybridiserer den andre primer, primer B, til den 3'-terminale ende (tredje subsegment) t2c, se figur 1, av targetkomplementet av DNA tråden dannet i reaksjonen katalysert av den reverse transkriptase i det foregående trinn. På nytt er hybridiseringsbetingelsene tilstrekkelig stringente for spesifikk hybridisering mellom den andre primer og sekvensen komplementær til sekvensen av den andre primer.

Etter avkjøling tilsettes 10 ytterligere enheter AMV revers transkriptase og ytterligere inkubasjon gjennomføres i 10 minutter ved 42°C.

100 enheter av T7 polymerase tilsettes til reaksjonen. Reaksjonen inkuberes så ved 37°C i 30 minutter. Et RNA transkript syntetiseres som er komplementært til det opprinnelige target HIV RNA ved å gå ut fra T7 promoteren tilstede ved 5' enden av dupleks DNA templatet nylig syntetisert av den reverse transkriptase. Transkriptet har

sekvensen 5'-GGGA, og fortsetter så med sekvensen som er komplementær til det andre subsegment av targetsekvensen (dvs. andre subsegmenttcr, se figur 1) . Etter som den reverse transkriptase ikke er blitt inaktivert før dette trinn, og etter som primer B er tilstede, så vel som deoksynukleotid-trifosfåtene, foregår en sekundær syntese i dette trinn. Primer B hybridiserer til 3' regionen av det nylig syntetiserte RNA transkript (tredje subsegment)t2cr, se figur 1, som er komplementært til B-primeren. Den reverse transkriptase (som var blitt tilsatt i det foregående trinn) syntetiserer en DNA tråd under anvendelse av det nylig syntetiserte RNA transkript (fremstilt ved hjelp av T7 polymerase) som et templat, og under anvendelse av oligonukleotid B som primeren ved 5' enden.

Reaksjonsblandingen kokes så 1 minutt for denaturering av RNA:DNA duplekset. Reaksjonsblandingen blir så avkjølt til 42°C i løpet av 1 minutt. Under dette avkjølingstrinn hybridiserer target-komplementærsegmentet av primer A til DNA tråden syntetisert under det foregående trinn. Samtidig hybridiseres primer B til sin komplementære sekvens på RNA transkriptet syntetisert i det foregående trinn.

Etter avkjøling tilsettes 10 ytterligere enheter AMV revers transkriptase og ytterligere inkubasjon i 10 minutter ved 42°C gjennomføres. Revers transkriptase syntetiserer DNA fullstendig til HIV-targetet under anvendelse av oligonukleotid A som en primer ved 5' enden og DNA fremstilt i det foregående trinn som et templat. En andre DNA tråd syntetiseres under anvendelse av oligonukleotid B som en primer og RNA transkriptet fremstilt i det foregående trinn som et templat.

Reaksjonsblandingen kokes i 1 minutt for å denaturere DNA duplekset og RNA:DNA duplekset. Reaksjonsblandingen avkjøles til 42°C i løpet av 1 minutt. Primer A hybridiserer til det fremstilte cDNA under anvendelse av RNA transkriptet som templat i det foregående trinn. (Hvis 3' enden av templattråden anvendes også som en revers transkriptaseprimer, dannes også et produkt identisk med sluttproduktet for den neste reaksjon.) Primer B hybridiseres til DNA tråden som er komplementær til target HIV RNA. Denne andre syntese frembringer et produkt som er et dupleks DNA inneholdende en T7 promoter sekvens ved sin 5' ende, så vel som et 4 bp "variabelt" segment, 5'-GGGA-3'.

100 enheter T7 polymerase tilsettes til reaksjonsblandingen. Reaksjonsblandingen inkuberes i 30 minutter ved 37°C. T7 RNA polymerasen anvender det dobbelttrådete dupleks DNA inneholdende en dupleks T7 promoter som et templat for å transkribere et RNA som er komplementært til targetets andre subsegment inneholdende den ytterligere sekvens 5'-GGGA-3' ved sin 5' ende.

Denne syklus (koking 1', 1' ved 42°C, RT 10' ved 42°C, RT 10' ved 42°C, T7 polymerase 37°C i 30') kan gjentas så mange ganger som det er nødvendig for å oppnå den ønskede amplifisering av targetsekvens. Det resulterende produkt kan så detekteres ved hjelp av en hybridiseringsteknikk med nukleinsyreprobe .

EKSEMPEL IX

Renset HIV RNA med en konsentrasjon på 1 fmol ble resuspendert i:

40 mM tris-HCl, pH 8,1

8 mM MgCl2

25 mM NaCl

2 mM spermidin

5 mM ditiothreitol

100 uM dATP, dTTP, dCTP, dGTP (hver)

1 mM av hver av rATP, rCTP, rGTP, rUTP

100 ug/ml BSA nuklease-fri

250 nM 29 bp DNA oligonukleotid med sekvensen

250 nM 56 bp DNA oligonukleotid med sekvensen

100 pl av oppløsningen oppvarmes til 65°C i 1 minutt og avkjøles deretter til 42°C i løpet av 1 minutt. Dette oppvarmings-og avkjølingstrinn, i kombinasjon med sammensetningen av oppløsningen, tilveiebringer betingelser med tilstrekkelig stringens for hybridiseringen av primer A med tilstrekkelig stabilitet til sekvensen komplementær til sekvensen av primer A regionen i target HIV RNA ((første subsegment).t2, i figur 1)

med tilstrekkelig spesifisitet.

Deretter ble 10 enheter av aviant myoblastosevirus (AMV)

revers transkriptase (Life Science, Inc.) tilsatt oppløsningen og oppløsningen inkuberes i 10 minutter ved 42°C. Etter en 10 minutters inkubasjon anbringes oppløsningen i et kokende vannbad i 1 minutt. Denne varmingen bevirker trådseparering av duplekset dannet ved revers transkriptase og inaktivering av den reverse transkriptase.

Oppløsningen avkjøles til 42°C i løpet av 1 minutt. Under

denne avkjøling hybridiserer den andre primer B til 3' enden av den nysyntetiserte target-komplementære tråd (eller (tredje subsegment)t2ci figur 1). Også her er hybridiseringsbetingelsene tilstrekkelig stringente for spesifikk hybridisering mellom den andre primer og sekvensen komplementær til sekvensen av den andre primer.

Etter avkjøling tilsettes ytterligere 10 enheter av AMV revers transkriptase og ytterligere inkubasjon gjennomføres i 10 minutter ved 42°C.

100 enheter av T7 RNA polymerase (New England Biolabs)

tilsettes til reaksjonsblandingen. Reaksjonsblandingen blir

så inkubert ved 37°C i 30 minutter. Et RNA transkript syntetiseres som er komplementært til det opprinnelige target

HIV RNA ved å gå ut fra T7 promoteren tilstede ved 5' enden av

det duplekse DNA templat syntetisert ved den reverse transkriptase. RNA transkriptet har sekvensen 5'-GGGA og fort-

setter så med den sekvens som er komplementær til det andre subsegment av targetsekvensen (dvs. det andre subsegmenttcr, figur 1). Etter som den reverse transkriptase ikke er blitt inaktivert før dette trinn, og etter som primer B er tilstede så vel som deoksynukleotid-trifosfåtene, foregår en sekundær syntese ved dette trinn. Primer B hybridiserer til 3' regionen av det nylig syntetiserte RNA transkript ((tredje subsegment) t2cr, seg figur 1) som er komplementært til primer B. Den reverse transkriptase (som er blitt tilsatt i det foregående trinn) syntetiserer en DNA tråd under anvendelse av det nylig syntetiserte RNA transkript (fremstilt ved hjelp av T7 RNA polymerase) som et templat, og oligonukleotid B som en primer ved 5' enden.

Reaksjonsblandingen kokes så i 1 minutt for å denaturere RNA:DNA duplekset. Reaksjonsblandingen avkjøles så til 42°C i løpet av 1 minutt. Under dette avkjølingstrinn hybridiserer target-komplementærsegmentet av primer A til DNA tråden syntetisert i det foregående trinn. Samtidig hybridiserer primer B til sin komplementære sekvens på RNA transkriptet syntetisert i det foregående trinn.

Etter avkjøling tilsettes 10 enheter av AMV revers transkriptase og ytterligere inkubasjon i 10 minutter ved 42°C gjennom-føres. Revers transkriptase syntetiserer DNA komplementært til HIV targetet under anvendelse av oligonukleotid A som en primer ved 5' enden og DNA fremstilt i det foregående trinn som et templat. 3' enden av templattråden anvendes som en primer for å produsere et endelig dupleks DNA med et dobbelttrådet, T7 promotersete ved sin 5' ende. En andre DNA tråd syntetiseres under anvendelse av oligonukleotid B som en primer og RNA transkriptet fremstilt i det foregående trinn som et templat.

100 enheter T7 polymerase tilsettes til reaksjonsblandingen.

Reaksjonsblandingen inkuberes i 30 minutter ved 37°C. T7 RNA polymerase syntetiserer et RNA transkript under anvendelse av det duplekse DNA inneholdende det polymerasebindende sete (T7 promoter) ved sin 5' ende som et templat. RNA transkriptet er komplementært til target - andre subsegment, se figur 1, inneholdende den ytterligere sekvens 5'-GGGA-3' ved sin 5' ende. Ytterligere sykluser kan utføres for å øke amplifiseringen. De resulterende produkter kan detekteres ved hjelp av en nukleinsyre-hybridiseringsprotokoll.

EKSEMPEL X

Protokoll for en siste- rundes merking av et TAS amplifisert produkt.

A. Kolonne for å fjerne uinnlemmede kalde nukleotider.

1. TAS reaksjonen (100 pl) foretas etter cDNA syntesen i den siste syklus av TAS. 400 pl av reagens A (0,1 M tris-HCl, pH 7,7, 10 mM trietylamin, 1 mM dinatrium EDTA) tilsettes til reaksj onsblandingen. 2. En Nensorb2Q(Dupont) på forhånd fylt kolonne ekvilibreres ved fukting av kolonnematerialet i 100 % metanol (HPLC renhet), deretter foretas ekvilibrering med 2 ml reagens A.

3. Prøven fylles på kolonnen.

4. Kolonnen vaskes 3 ganger med 1 ml reagens A.

5. Kolonnen vaskes 3 ganger med 1 ml vann.

6. Nukleinsyren elueres med 50 % metanol, og det oppsamles 250-300 pl fraksjoner opp til 1 ml totalt volum. (De første to fraksjoner vil inneholde hoveddelen av nukleinsyren.)

7. Fraksjonene tørkes i Speed-vac eller frysetørkes.

B. Protokoll for å merke det amplifiserte produkt.

1. Fraksjonene fra Nensorb20kolonnen (de første to fraksjoner kan kombineres) resuspenderes i 40 mM tris-HCl, pH 8,1, 8 mM MgCl2, 25 mM NaCl, 2 mM spermidin (HC1)3, 5 mM ditiothreitol, 400 pM av hver av rATP, rCTP og rGTP, 12 pM rUTP, og 25 pCi a-32p-rUTP (800 Ci/mmol). 2. 50 enheter T7 RNA polymerase (New England Biolabs) tilsettes for hver 50 pl av prøve. Det inkuberes ved 37°C i 30 minutter. 3. Den uinnlemmede merking kan fjernes.ved hjelp av en G-50

spinnkolonne (Maniatis, se det foregående).

4. Den merkede prøve kan kjøres på en sekvenserende poly-akrylamidgel for å bestemme størrelsen av det amplifiserte produkt. Det merkede produkt kan også detekteres under anvendelse av Oligo-Beads.

EKSEMPEL XI

Bruk av en intern standard under TAS amplifiseringen

Prøver ble fremstilt med:

1. 0,1 fm HIV RNA og 0,1 fm I3-globin DNA sekvenser (HIJ19A spaltet med Pstl); 2. 0,01 fm HIV RNA og 0,1 fm Ji-globin DNA (HB19A spaltet med Pstl) ;

3. 0,1 fm HIV RNA; eller

4. 0,1 fm fi-globin DNA (HB19A spaltet med Pstl) i 100 pl inneholdende 40 mM tris-HCl, pH 8,1, 8 mM MgCl2, 25 mM NaCl, 2 mM spermidin-(HC1)3, 5 mM ditiothreitol, 100 pl av hver av dATP, dTTP, dCTP og dGTP, 1 mM av hver av rATP, rUTP, rCTP og rGTP, 100 pg/ml BSA (nuklease-fri), og 250 nM primer A (5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGACACCTAGGGCTAACTATGTGTCCTAATAAGG-3'), 250 nM primer.

En prøve med 1/20-del av utgangs-nukleinsyrene ble anbragt i en denaturerende oppløsning av 7,4 % formaldehyd, 10x SSC (1,5 M NaCl, 0,15 M Na citrat, pH 7,4) for prøvene med tidspunkt 0.

Prøvene ble kokt i 1 minutt og avkjølt ved 42°C i 1 minutt, etterfulgt av tilsetning av 10 enheter AMV revers transkriptase.Reaksjonsblandingene inkuberes ved 42°C i 15 minutter, kokes i 1 minutt og avkjøles ved 42°C i 1 minutt. Ytterligere 10 enheter av AMV revers transkriptase tilsettes, etterfulgt

av inkubasjon ved 42°C i 15 minutter. 100 enheter av T7 RNA polymerase tilsettes, etterfulgt av inkubasjon ved 37°C i 30

minutter. Denne syklus gjentas en gang til. (Flere sykluser kan gjennomføres, i avhengighet av den amplifisering som trenges.) To prøver inneholdende 1/20-del av utgangs-target-nukleinsyrene ble anbragt i denaturerende oppløsning for prøvene for det andre transkripsjonstidspunkt.

Alle prøvene ble oppvarmet til 55°C i 30 minutter før fil-trering på to nitrocellulosemembraner. Nukleinsyrene ble fiksert til membranen ved bestråling med 254 nM UV lys i 4 minutter. Som kontroller ble 1, 0,1, og 0,01 fm plasmid pARV7/2 (Luciw et al, Nature 312, 760 (1984)), som inneholder det hele HIV genom cDNA så vel som plasmid HJ319A (Wallace et al, Nucl. Acids Res. 9, 3647 (1981)), denaturert i 0,2 N NaOH, nøytralisert med et like stort volum av 2 M ammoniumacetat og deretter filtrert på nitrocellulosemembranen. En membran ble hybridisert med<32>P-merket oligonukleotid 86-31<1>, som er spesifikk for det amplifiserte produkt av HIV. Den annen membran ble hybridisert til<32>P-merket oligonukleotid 87-459<2>, som vil hybridisere til det amplifiserte ft-globinprodukt, så vel som til target li-globinplasmidet.

Hybridiseringene var i 1 % SDS, 0,9 M NaCl, 50 nM NaH2P04(pH 7,4), 5 mM EDTA (pH 7,4), og IO<6>cpm/m<32>P-merket oligonukleotid i 1 time ved 55°C. Membranene ble vasket 3 ganger i 1 % SDS, 0,18 M NaCl, 10 mM NaH2P04(pH 7,4), og 1 mM EDTA ved romtemperatur, etterfulgt av 1 vasking i den samme buffer ved 55°C.

Membranene ble så autoradiografert i 16 timer på Kodak XAR film ved -70°C med en intensiverende skjerm.

Autoradiografen i figur 3 viser mengden av HIV og B-globin-sekvenser detektert etter to sykluser av TAS gjennomført samtidig på HIV og ft-globinnukleinsyre. Utgangsmengden av fi>- globin ble holdt konstant mens mengden av HIV target ble variert.

Claims

1. Fremgangsmåte for amplifisering av en targetsekvens i en prøve inneholdende nukleinsyre, karakterisert vedat den omfatter trinnene: (A) tilveiebringelse av en første nukleinsyreprimer inneholdende en promotersekvens operabelt knyttet til en sekvens som korresponderer til et første segment av targetsekvensen, idet nevnte første segment inkluderer 3'-enden av targetsekvensen, og en andre nukleinsyreprimer, som er hybridiserbar til en sekvens komplementær til et andre segment av target-sekvensen, idet nevnte andre segment inkluderer 5'-enden av targetsekvensen, (B) hybridisering under egnede betingelser av nevnte første nukleinsyreprimer med targetsekvens i en prøve inneholdende nukleinsyre, (C) forlengelse av nevnte hybridiserte første nukleinsyreprimer ved en polymeraseforlengelsesreaksjon komplementær til targetsekvensen til å danne en første dupleks nukleinsyre, (D) dupleksen dannet i trinn (C) gjøres enkelttrådet, (E) hybridisering under egnede betingelser av nevnte andre nukleinsyreprimer til den resulterende promotersekvens-inneholdende tråd, (F) forlengelse av nevnte hybridiserte andre nukleinsyreprimer i en polymeraseforlengelsesreaksjon komplementær til nevnte promotersekvens-inneholdende tråd til å danne en andre dupleks nukleinsyre, og (G) anvendelse av nevnte andre dupleks som et templat for fremstilling av et flertall RNA transkripter derfra i en reaksjon katalysert ved en RNA polymerase som gjenkjenner promoteren som korresponderer til promotersekvensen av den første primeren, idet hver av nevnte transkripter bærer en RNA sekvens som korresponderer til nevnte targetsekvens, (H) eventuell anvendelse av nevnte RNA transkripter som en basis for videre amplifisering av targetsekvensen.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat, i den første primeren, sekvensen som korresponderer til et første segment av target-sekvensen er komplementær til nevnte første segment, den andre primeren har en sekvens identisk til den av et andre segment av targetsekvensen, nevnte første og andre segmenter av targetsekvensen overlapper ikke, og alle polymerasefor-lengelsesreaksjonene katalyseres ved den samme reverse transkriptase.

3. Fremgangsmåte for detektering av minst en spesifikk nukleinsyretargetsekvens i en prøve inneholdende nukleinsyre,karakterisert vedat den omfatter fremstilling, i samsvar med krav 1 eller 2, av replikerte RNA transkripter som inneholder en sekvens som korresponderer til den nevnte targetsekvens og detektering av nærværet av nevnte RNA sekvens.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3,karakterisert vedat nevnte transkripter inneholder replikasegjenkjennelsessete for replikasjon av nevnte transkripter ved replikaseinduksjon.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 3,karakterisert vedat den detekterte RNA sekvens av nevnte RNA transkripter måles på en standardisert måte for å bestemme mengden av targetsekvens inneholdt i en prøve av nukleinsyre anvendt ved fremstilling av det dobbelt-trådede nukleinsyretemplat.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert vedat den detekterte RNA sekvens av nevnte RNA transkripter måles på en måte som er internt standardisert med nærværet av et kjent kopitall av nukleinsyre som også er inneholdt i nevnte prøve.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 3,karakterisert vedat nevnte targetsekvens er beliggende innenfor en nukleinsyresekvens assosiert med egenskapene av en genetisk eller patogen sykdom eller tilstand.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 7,karakterisert vedat nevnte nukleinsyresekvens er et segment av et humant immundefisiensvirus.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 8,karakterisert vedat nevnte nukleinsyresekvens er et segment av et defekt gen.

10. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, karakterisert vedat enten (a) promoteren er en bakteriofag T7 promoter og RNA transkriptene fremstilles ved anvendelse av T7 RNA polymerase, eller (b) at promoteren er en SP6 promoter og RNA transkriptene fremstilles ved anvendelse av SP6 RNA polymerase.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat forlengelsesreaksjonen katalyseres ved hjelp av et enzym valgt fra gruppen bestående av E. coli DNA polymerase I, Klenow fragment av E. coli DNA polymerase I, T4 DNA polymerase og revers transkriptase.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 3,karakterisert vedat nevnte RNA transkripter merkes før detektering.

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 12, karakterisert vedat nevnte RNA transkripter radiomerkes eller kromoformerkes.

14. Et sett for anvendelse ved deteksjon av minst en spesifikk nukleinsyre-targetsekvens i en prøve inneholdende nukleinsyre, karakterisert vedat det omfatter en første nukleinsyreprimer inneholdende en promotersekvens operabelt knyttet til en sekvens, komplementær til et segment av en targetsekvens, 'og en andre nukleinsyreprimer med en sekvens identisk med et segment av en targetsekvens, idet primerne tilsvarer forskjellige regioner i targetsekvensen, men ikke, eller i vesentlig grad ikke, overlapper i deres tilsvarighet til targetet og er valgt slik at et forlengelsesprodukt av en av dem når den separeres fra sitt komplement kan tjene som et templat for et forlengelsesprodukt av den annen, og midler for hybridisering av den nevnte første primer til den nevnte targetsekvens, for kjedeforlenging av den hybridiserte primer, for trådseparering av det resulterende dupleks, for hybridisering av den andre nukleinsyreprimer til den promoterinneholdende separerte tråd, for kjedeforlenging av den hybridiserte primer, for å bringe den således fremstilte dobbelttrådete nukleinsyre inneholdende en promotersekvens til å fremstille transskripter, og for detektering av disse transskripter .

15. Fremgangsmåte for amplifisering av et target nukleinsyresegment med formel I

hvori (første subsegment)ter et nukleinsyresegment av kjent sekvens på minst 10 nukleotider som slutter seg til 3'-enden av (andre subsegment)t, (andre subsegment)ter et nukleinsyresegment med 0 eller flere nukleotider, og (tredje subsegment)ter et nukleinsyresegment med kjent sekvens på minst 10 nukleotider som slutter seg til 5'-enden av (andre subsegment) t, karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter: (1) til (første subsegment)tav det nevnte targetsegment hybridiseres en første primer, som er et enkelttrådet DNA omfattende et 3'-terminalt subsegment med formel II

hvor (promoter) 1 er et enkelttrådet DNA segment med sekvensen av plusstråden av en bakteriofag DNA avhengig RNA polymerase-spesifikk promoter, (variabelt subsegment) 1 er et enkelttrådet DNA segment med 0 til 100 nukleotider som slutter seg til det 3'-terminale nukleotid av (promoter) 1 og det 5'-terminale nukleotid av (3'-primer subsegment)x, og (3'-primer subsegment) x er et enkelttrådet DNA segment på minst 10 nukleotider med en sekvens som er komplementær til sekvensen av et subsegment av (første subsegment)tsom ender med det 3'-terminale nukleotid av det (første subsegment)t, idet (promoteren) 1 slutter seg til 5'-enden av det nevnte (3'-primer subsegment)lfhvis det nevnte (variable subsegment)xhar 0 nukleotider (2) den nevnte første primer, hybridisert i samsvar med trinn (1), forlenges ved en reaksjon katalysert ved hjelp av en første DNA polymerase for fremstilling av et første komplementært DNA segment, som omfatter et subsegment med formel III

hvori (første subsegment) tc er DNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (første subsegment)t, (andre subsegment) tc er DNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (andre subsegment)t, og (tredje subsegment)tcer DNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (tredje subsegment)t, med den betingelse at hvis targetsegmentet er et RNA segment er den nevnte første DNA polymerase en revers transkriptase,

(3) duplekset tildannet i reaksjonen i trinn (2) gjøres enkelttrådet,

(4) til (tredje subsegment)tcav det første komplementære DNA med formel III hybridiseres en andre primer, som er et enkelttrådet DNA på minst 10 nukleotider med formel IV

hvori (5'-primer subsegment)2har sekvensen av et subsegment av (tredje subsegment)tsom ender med det 5'-terminale nukleotid av (tredje subsegment)tog hvori (variabelt subsegment) 2 er et segment med 0 til 100 nukleotider som slutter seg til 5'-enden av (5'-primer subsegment)2,

(5) det andre primersegment, hybridisert i samsvar med trinn (4), forlenges ved en reaksjon katalysert ved hjelp av en andre DNA polymerase til å danne et andre komplementært DNA segment som omfatter et subsegment med formel (V)

hvori (variabelt subsegment)lcer DNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (variabelt subsegment) l og (promoter)lcer DNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (promoter)x, med den betingelse at den andre DNA polymerase er den samme som eller forskjellig fra den første DNA polymerase, og

(6) det dobbelttrådete produkt fra trinn (5) anvendes som et templat ved en reaksjon katalysert ved hjelp av en første bakteriofag DNA avhengig RNA polymerase, som gjenkjenner promoteren hvorav en tråd er (promoter) lr for fremstilling av et første RNA produkt med formel VI

hvori (variabelt subsegment)lr er RNA segmentet med sekvensen av (variabelt subsegment) i, (første subsegment)tcr er RNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (første subsegment)t, (andre subsegment) tcr er RNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (andre subsegment)t, (tredje subsegment)tcrer RNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (tredje subsegment)tog (variabelt subsegment)2crer RNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (variabelt subsegment)2 •

16. Fremgangsmåte som angitt i krav 15,karakterisert vedat (første subsegment)thar lengde minst 10 nukleotider og har formel XIII

hvori (første subsegment)t2har 0 eller flere nukleotider og hvis det har mer enn 0, slutter det seg til 3'-enden av (første subsegment)tl, og (første subsegment)tlhar lengde minst 10 nukleotider, hvori (tredje subsegment)thar formel XIV

hvori (tredje subsegment)t2har 0 eller flere nukleotider og hvis det har flere enn 0, slutter det seg til 5'-enden av (tredje subsegment)tl, og (tredje subsegment) tl har lengde minst 10 nukleotider, hvori (3'-primer subsegment)jhar sekvens komplementær til sekvensen av et subsegment av targetsegment bestående av hele (første subsegment)t2og 0 eller flere nukleotider av (første subsegment)tl, hvori (5'-primer subsegment)2er et subsegment som består av hele (tredje subsegment)t2og 0 eller flere nukleotider av (tredje subsegment)tl, hvori (variabelt subsegment)2har 0 nukleotider, og hvori etter trinnene (1) til (6) av krav 1, RNA subsegmentet med formel VII

hvori (første subsegment)tlcrer RNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (første subsegment)tlog (tredje subsegment)tlcr er RNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (tredje subsegment)tl, amplifiseres videre ved hjelp av en metode omfattende: (7) til det første RNA produkt med formel VI hybridiseres en tredje primer, som er et enkelttrådet DNA omfattende et 3'-terminalt subsegment med formel VIII

hvori (promoter)3er et enkelttrådet DNA segment med sekvensen av pluss-tråden av en bakteriofag DNA avhengig RNA polymerase-spesifikk promoter, idet sekvensen av (promoter)3er den samme som eller forskjellig fra sekvensen av (promoter) lr (variabelt subsegment)3er et enkelttrådet DNA segment med 0 til 100 nukleotider som slutter seg til det 3'-terminale nukleotid av (promoter)3og det 5'-terminale nukleotid av (3'-primer subsegment)3, og (3'-primer subsegment)3er et enkelttrådet DNA segment som har samme sekvens som (tredje subsegment) tl og slutter seg til det 3'-terminale nukleotid av (promoter)3hvis (variabelt subsegment)3har 0 nukleotider,

(8) den tredje primer hybridisert i samsvar med trinn (7) forlenges i en reaksjon katalysert ved hjelp av en tredje DNA polymerase, som er en revers transkriptase og er den samme som eller forskjellig fra den nevnte første og andre DNA polymerase, for fremstilling av et tredje komplementært DNA segment som omfatter et 3'-terminalt subsegment med formel IX

hvori (variabelt subsegment) lc er DNA med sekvens komplementær til sekvensen av (variabelt subsegment) 1

(9) duplekset dannet i reaksjonen i trinn (8) gjøres enkelttrådet,

(10) til det tredje komplementære DNA fremstilt i reaksjonen i trinn (8) hybridiseres en fjerde primer med formel X

hvori (første subsegment)t2cer DNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (første subsegment)t2og (første subsegment)tlcer DNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (første subsegment)tl, med den betingelse at minst en av de nevnte ti nukleotider er ved eller i retning 5' fra det 5'-terminale nukleotid av (første subsegment)tlc,

(11) den fjerde primer hybridisert i samsvar med trinn (10) forlenges i en reaksjon katalysert ved hjelp av en fjerde DNA polymerase, som er den samme som eller forskjellig fra den nevnte første, andre og tredje DNA polymerase, for å danne et fjerde komplementært DNA som omfatter et segment med formel XI

hvori (andre subsegment)tcer DNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (andre subsegment)t, (tredje subsegment)tlcer DNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (tredje subsegment)tl, (variabelt subsegment)3cer DNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (variabelt segment)3, og (promoter) 3c er DNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av (promoter)3og

(12) det dobbelttrådete produkt fra trinn (11) anvendes som templat i en reaksjon katalysert ved hjelp av en andre bakteriofag DNA avhengig RNA polymerase, som er den samme som eller forskjellig fra den nevnte første bakteriofag DNA avhengige RNA polymerase og som gjenkjenner promoteren hvorav en tråd er (promoter)3, for å danne et andre RNA produkt med et 5'-terminalt subsegment med formel XII

hvori (variabelt subsegment)3rer RNA segmentet med sekvensen av (variabelt subsegment)3, (tredje subsegment)tlrer RNA segmentet med sekvensen av (tredje subsegment)tl, (andre subsegment)trer RNA segmentet med sekvensen av (andre subsegment)t, (første subsegment)tlrer RNA segmentet med sekvensen av (første subsegment)tl, (variabelt subsegment)4crer RNA segmentet med sekvens komplementær til sekvens av (variabelt subsegment)4, og X12er RNA segmentet med sekvens komplementær til sekvensen av subsegmentet av (5'-primer subsegment)4som er i retning 5' fra 5'-enden av (første subsegment)tlc.

17. Fremgangsmåte som angitt i krav 15, karakterisert vedat hver av (variabelt subsegment) 1 og (variabelt subsegment)2har 0 til 60 nukleotider, hver av (3'-primer subsegment)!og (5'-primer subsegment) 2 har 15 til 45 nukleotider, (andre subsegment)thar minst 30 nukleotider, og targetsegment har 1000 eller færre nukleotider.

18. Fremgangsmåte som angitt i krav 16, karakterisert vedat targetsegmentet er et DNA segment, hvor produktet fra trinn (2) gjøres enkelttrådet ved hjelp av termisk denaturering, hvori (variabelt subsegment) 2 har 0 nukleotider, hvori hver av den første og andre DNA polymerase er valgt fra gruppen bestående av Klenow Fragment av E. coli DNA polymerase I, AMV revers transkriptase, klonet MMLV revers transkriptase, kalvethymus DNA polymerase alfa, Thermus åquaticus varmestabil DNA polymerase, og Sequenase-klonet T7 DNA polymerase, og hvori bakteriofag DNA avhengig RNA polymerase er valgt fra gruppen bestående av T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase og SP6 RNA polymerase.

19. Fremgangsmåte som angitt i krav 18, karakterisert vedat hver av den første og andre DNA polymerase er valgt fra gruppen bestående av Klenow Fragment av E. coli DNA polymerase I, AMV revers transkriptase og klonet MMLV revers transkriptase.

20. Fremgangsmåte som angitt i krav 17,karakterisert vedat targetsegmentet er RNA segment, hvor produktet fra trinn (2) gjøres enkelttrådet ved termisk denaturering, hvor (variabelt subsegment)2har 0 nukleotider, hvor den første DNA polymerase er valgt fra gruppen bestående av AMV revers transkriptase og klonet MMLV revers transkriptase, hvori den andre DNA polymerase er valgt fra gruppen bestående av Klenow Fragment av E. coli DNA polymerase I, AMV revers transkriptase, klonet MMLV revers transkriptase, kalvethymus DNA polymerase alfa, Thermus aquaticus varmestabil DNA polymerase, og Sequenase-klonet T7 DNA polymerase, og hvor den bakteriofag DNA avhengige RNA polymerase er valgt fra gruppen bestående av T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase og SP6 RNA polymerase.

21. Fremgangsmåte som angitt i krav 20,karakterisert vedat den andre DNA polymerase er valgt fra gruppen bestående av Klenow Fragment av E. coli DNA polymerase I, AMV revers transkriptase, og klonet MMLV revers transkriptase.

22. Fremgangsmåte som angitt i krav 19 eller 21,karakterisert vedat(l) bakteriofag DNA avhengig RNA polymerase er T7 RNA polymerase, (promoter) 1 er 5'-TAATACGACTCACTATA-3' og (variabelt subsegment) 1 har et dinukleotid med sekvens 5'-GG-3' ved sin 5'-ende, eller (2) den bakteriofag DNA avhengige RNA polymerase er T3 RNA polymerase, (promoter) 1 er 5'-TATTAACCCTCACTAAA-3' og (variabelt subsegment) 1 har et tetranukleotid med sekvens 5'-GGGA-3' ved sin 5'-ende, eller (3) bakteriofag DNA avhengig RNA polymerase er SP6 RNA polymerase, (promoter) 1 er 5'-GAACGCGGCTACAATTAATACATAAC-CTTATGTATCATACACATACGATTTAGGTGACACTATA-3', og (variabelt subsegment) 1 har et heksanukleotid med sekvens 5'-GAATAC-3' ved sin 5'-ende.

23. Fremgangsmåte som angitt i krav 22, karakterisert vedat 5<1->enden av den første primer er 5'-nukleotidet av (promoter) 1.

24. Fremgangsmåte som angitt i krav 23,karakterisert vedat hver av den første og andre DNA polymerase er valgt fra AMV revers transkriptase og klonet MMLV revers transkriptase.

25. Fremgangsmåte som angitt i krav 23,karakterisert vedat hvis den bakteriofag DNA avhengige RNA polymerase er T7 eller T3 RNA polymerase har (variabelt subsegment) 1 sekvensen 5'-GGGATGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3' og hvis den bakteriofag DNA avhengige RNA polymerase er SP6 RNA polymerase har (variabelt subsegment) 1 sekvensen 5'-GAATACTGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3'.

26. Fremgangsmåte som angitt i krav 20, 21, 22, 23, 24 eller 25,karakterisert vedat targetsegmentet er et segment av genomet av et humant immunodefisiensvirus som er et HIV-1 virus og hvori (1) (3'-primer subsegment) 1 har sekvensen 5'-TCTAATTACTACCTCTTCTTCTGCTAGACT-3' og (5'-primer CCTCTTCTTCTGCTAGACT-3' og (5'-primer subsegment)2har sekvensen 5'-ACAAGTTGTAACACCTCAGTCATTACACAG-3' eller (2) (3'-primer subsegment) 1 har sekvensen

5 i-TTTCGTAACACTAGGCAAAGGTGGCTTTATC-3' og (5'-primer subsegment) o har sekvensen valgt fra gruppen bestående av

27. Fremgangsmåte som angitt i krav 16,karakterisert vedat hver av (variabelt subsegment)xog (variabelt subsegment)3har 0 til 60 nukleotider, hvor hver av (3'-primer subsegment) 1 , (5'-primer subsegment) 2r (3'-primer subsegment)3, og (5'-primer subsegment) 4 har 15 til 45 nukleotider, (andre subsegment)thar minst 30 nukleotider og targetsegment har 1000 eller færre nukleotider.

28. Fremgangsmåte som angitt i krav 27,karakterisert vedat (A) hvis targetsegmentet er et DNA segment, gjøres produktet fra trinn (2) enkelttrådet ved hjelp av termisk denaturering og produktet fra trinn (8) gjøres enkelttrådet ved termisk denaturering, hver av første, andre og fjerde DNA polymerase er valgt fra gruppen bestående av Klenow Fragment av E. coli DNA polymerase I, AMV revers transkriptase, klonet MMLV revers transkriptase, kalvethymus DNA polymerase alfa, Thermus aquaticus varmestabil DNA polymerase, og Sequenase-klonet T7 DNA polymerase, den tredje DNA polymerase er valgt fra gruppen bestående av AMV revers transkriptase og klonet MMLV revers transkriptase, og hver av første og andre bakteriofag DNA avhengig RNA polymerase er valgt fra gruppen bestående av T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase og SP6 RNA polymerase, og (B) hvis targetsegmentet er et RNA segment, gjøres hver av produktet fra trinn (2) og produktet fra trinn (8) enkelttrådet ved termisk denaturering, hver av andre og fjerde DNA polymerase er valgt fra gruppen bestående av Klenow Fragment av E. coli DNA polymerase I, AMV revers transkriptase, klonet MMLV revers transkriptase, kalvethymus DNA polymerase alfa, Thermus aquaticus varmestabil DNA polymerase, og Sequenase-klonet T7 DNA polymerase, idet hver av første og tredje DNA polymerase er valgt fra gruppen bestående av AMV revers transkriptase og klonet MMLV revers transkriptase, og hver av første og andre bakteriofag DNA avhengig RNA polymerase er valgt fra gruppen bestående av T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase og SP6 RNA polymerase.

29. Fremgangsmåte som angitt i krav 28,karakterisert vedat targetsegmentet er et RNA segment og hvor hver av andre og fjerde DNA polymerase er valgt fra gruppen bestående av Klenow Fragment av E. coli DNA polymerase I, AMV revers transkriptase, og klonet MMLV revers transkriptase og hvor hver av første og tredje DNA polymerase er valgt fra gruppen bestående av AMV revers transkriptase og klonet MMLV revers transkriptase.

30. Fremgangsmåte som angitt i krav 28, karakterisert vedat subsegmentet av targetsegment som har sekvens komplementær til sekvensen av (3'-primer subsegment) 1 er i 3'-retningen fra og overlapper ikke subsegmentet av targetsegment som har sekvensen komplementær til sekvensen av (5'-primer subsegment)4, og hvor subsegmentet av targetsegment som har sekvensen av (5'-primer subsegment)2ikke overlapper subsegmentet av targetsegment som har sekvensen av (3'-primer subsegment)3.

31. Fremgangsmåte som angitt i krav 30,karakterisert vedat subsegmentet av tredje komplementært DNA med sekvensen komplementær til sekvensen av (3'-primer subsegment) 1 er i 5'-retningen fra og overlapper ikke subsegmentet av tredje komplementært DNA som har sekvensen komplementær til sekvensen av (5'-primer subsegment)4, og hvor subsegmentet av targetsegment som har sekvensen av (5'-primer subsegment)2ikke overlapper subsegmentet av targetsegment som har sekvensen av (3'-primer subsegment)3.

32. Fremgangsmåte som angitt i krav 31,karakterisert vedat i det tredje komplementære DNA har (variabelt subsegment) lc mer enn 0 nukleotider og hvori, i duplekset mellom (5'-primer subsegment)4og tredje komplementære DNA, i det'minste et subsegment av (5'-primer subsegment)4er hybridisert til (variabelt subsegment)lc.

33. Fremgangsmåte som angitt i krav 31,karakterisert vedat subsegmentet av targetsegment som har sekvensen komplementær til sekvensen av (3'-primer subsegment) 1 er i 3'-retningen fra og overlapper ikke subsegmentet av targetsegment som har sekvensen komplementær til sekvensen av (5'-primer subsegment)4, og hvor subsegmentet av targetsegment som har sekvensen av (5'-primer subsegment)2ikke overlapper subsegmentet av targetsegment som har sekvensen av (3'-primer subsegment)3.

34. Fremgangsmåte som angitt i krav 31, karakterisert vedat subsegmentet av tredje komplementært DNA med sekvensen komplementær til sekvensen av (3'-primer subsegment) 1 er i 5'-retningen fra og ikke overlapper subsegmentet av tredje komplementært DNA som har sekvensen komplementær til sekvensen av (5'-primer subsegment) 4, og hvor subsegmentet av targetsegment som har sekvensen av (5'-primer subsegment)2ikke overlapper subsegmentet av targetsegment som har sekvensen av (3'-primer subsegment)3.

35. Fremgangsmåte som angitt i krav 34,karakterisert vedat i det tredje komplementære DNA har (variabelt subsegment) lc mer enn 0 nukleotider og hvori, i duplekset mellom (5'-primer subsegment)4og tredje komplementære DNA, er i det minste et subsegment av (5'-primer subsegment)4hybridisert til (variabelt subsegment)lc.

36. Fremgangsmåte som angitt i krav 30, 31, 32, 33, 34 eller 35,karakterisert vedat (1) hvis T7 RNA polymerase anvendes i trinn (6) eller trinn (12) har (promoter) 1 hvis trinnet er trinn (6), eller (promoter)3hvis trinnet er trinn (12) sekvensen 5'-TAATACGACTCACTATA-3' og (variabelt subsegment) 1 hvis trinnet er trinn (6), eller (variabelt subsegment)3hvis trinnet er trinn (12), har et dinukleotid med sekvens 5'-GG-3' ved sin 5'-ende, eller (2) hvis T3 RNA polymerase anvendes i trinn (6) eller trinn (12) har (promoter)2hvis trinnet er trinn (6), eller (promoter)3hvis trinnet er trinn (12), sekvensen 5'-TATTAACCCTCACTAAA-3' og (variabelt subsegment) 1 hvis trinnet er trinn (6), eller (variabelt subsegment)3hvis trinnet er trinn (12), har et tetranukleotid med sekvens 5'-GGGA-3' ved sin 5'-ende, eller (3) hvis SP6 RNA polymerase anvendes i trinn (6) eller trinn (12), har (promoter)xhvis trinnet er trinn (6), eller (promoter) 3 hvis trinnet er trinn (12), sekvensen 5'-GAACGCGGCTACAATTAATACATAACCTTATGTATCATACACATACGAT-TTAGGTGACACTATA-3', og (variabelt subsegment) 1 hvis trinnet er trinn (6), eller (variabelt subsegment)3hvis trinnet er trinn (12), har et heksanukleotid med sekvens 5'-GAATAC-3' ved sin 5'-ende, og hvor 5'-enden av den første primer er 5'-nukleo tidet av (promoter) 1 og 5'-enden av den tredje primer er 5'-nukleotidet av (promoter)3.

37. Fremgangsmåte som angitt i krav 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 eller 35, karakterisert vedat targetsegmentet er et segment av genomet av et humant immunodefisiensvirus som er et HIV-1 virus og hvor (1)

38. Fremgangsmåte som angitt i krav 17,karakterisert vedat (A) hvis targetsegmentet er et DNA segment, gjøres produktet fra trinn (2) enkelttrådet ved termisk denaturering, hver av første og andre DNA polymerase er valgt fra gruppen bestående av Klenow Fragment av E. coli DNA polymerase I, AMV revers transkriptase, klonet MMLV revers transkriptase, kalvethymus DNA polymerase alfa, Thermus aquaticus varmestabil DNA polymerase, og Sequenase-klonet T7 DNA polymerase, og den første bakteriofag DNA avhengige RNA polymerase er valgt fra gruppen bestående av T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase og SP6 RNA polymerase, og (B) hvis targetsegmentet er et RNA segment, gjøres produktet fra trinn (2) enkelttrådet ved termisk denaturering, den andre DNA polymerase er valgt fra gruppen bestående av Klenow Fragment av E. coli DNA polymerase I, AMV revers transkriptase, klonet MMLV revers transkriptase, kalvethymus DNA polymerase alfa, Thermus aquaticus varmestabil DNA polymerase, og Sequenase-klonet T7 DNA polymerase, den første DNA polymerase velges fra gruppen bestående av AMV revers transkriptase og klonet MMLV revers transkriptase, og den første bakteriofag DNA avhengige RNA polymerase er valgt fra T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase og SP6 RNA polymerasen.

39. Fremgangsmåte som angitt i krav 38,karakterisert vedat hver av den første og andre DNA polymerase er valgt fra gruppen bestående av AMV revers transkriptase og klonet MMLV revers transkriptase.