HU216317B - Eljárás transzkripcióra alapozott nukleinsav sokszorozó/észlelő rendszerek előállítására - Google Patents

Eljárás transzkripcióra alapozott nukleinsav sokszorozó/észlelő rendszerek előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU216317B
HU216317B HU884791A HU479188A HU216317B HU 216317 B HU216317 B HU 216317B HU 884791 A HU884791 A HU 884791A HU 479188 A HU479188 A HU 479188A HU 216317 B HU216317 B HU 216317B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
segment
sub
sequence
dna
polymerase
Prior art date
Application number
HU884791A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT52823A (en
Inventor
Thomas Raymond Gingeras
Deborah Yantis Kwoh
Ulrich Merten
Original Assignee
Akzo Nobel N.V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26744190&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU216317(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Akzo Nobel N.V. filed Critical Akzo Nobel N.V.
Publication of HUT52823A publication Critical patent/HUT52823A/hu
Publication of HU216317B publication Critical patent/HU216317B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6867—Replicase-based amplification, e.g. using Q-beta replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6865—Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Abstract

A találmány tárgya eljárás egy célszekvencia amplifikálására egynűkleinsav-tartalmú mintában. A találmány értelmében úgy járnak el,hőgy i) előállítanak egy első nűkleinsav primert, amely egy prőmőterszekvenciát tartalmaz működőképesen hőzzákapcsőlva a célszekvencia egyelső szegmentűmának megfelelő szekvenciáhőz, mely első szegmentűtartalmazza a célszekvencia 3'-végét; és előállítanak egy másődiknűkleinsav primert, amely a célszekvencia egy másődik szegmentűmávalkőmplementer szekvenciáhőz hibridizálható, mely másődik szegmen űmtartalmazza a célszekvencia 5'-végét; ii) az első nűkleinsav primertegy nűkleinsavat tartalmazó mintában a célszekvenciáhőz hibridizálják;iii) a hibridizált első nűkleinsav primert pőlimeráz extenziósreakcióban kiterjesztik a célszekvenciával kőmplementer szekvenciával,így egy első dűplex nűkleinsavat kapnak; iv) a iii) lépésben kapőttelső dűplexet egyszálúvá alakítják; v) a prőmőter szekvenciáttartalmazó kapőtt szálhőz hibridizálják a másődik nűkleinsav primert;vi) a hibridizált másődik nűkleinsav primert pőlimeráz extenziósreakcióban kiterjesztik a prőmőter szekvenciát tartalmazó szállalkőmplementer szekvenciával, így egy másődik dűplex nű leinsavatkapnak; és vii) a kapőtt másődik dűplexet templátként alkalmazva RNS-átiratőkat – mely átiratők mindegyike tartalmaz egy, a célszekvenciánmegfelelő RNS-szekvenciát – készítenek őlyan RNS-pőlimer zzalkatalizált reakcióban, amely RNS-pőlimeráz felismeri az első primerprőmőter szekvenciájának megfelelő prőmőtert; és viii) kívánt esetbena kapőtt RNS-átiratőkat a célszekvencia tővábbi amplifikálásárahasználják fel. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás transzkripcióra alapozott nukleinsav sokszorozó/észlelő rendszerek előállítására.
Részletesebben, a találmány új eljárásokra és megfelelő reagenseket tartalmazó készletekre (kitekre) vonatkozik, továbbá olyan eljárásokra, amelyekkel egy mintában, amely egy vagy több nukleinsavat - RNS-t, DNS-t vagy mindkettőt - tartalmaz, a nukleinsav vagy a komplementer nukleinsav legalább egy kiválasztott szegmentumának vagy hibridizáló homológ szegmentumának in vitro vagy x-vivo másolatszáma növelését, azaz sokszorozását érjük el.
A találmány szerinti eljárások és kitek hasznosítására többek között a következő alkalmazok esetén kerül sor. 1) testnedvek és szövetek analízisénél az olyan specifikus nukleinsav-szekvenciák észlelésére in vitro vagy xvivo nukleinsavpróba hibridizációs vizsgálatok segítségével, amelyek valamilyen genetikai vagy fertőző betegségre vagy állapotra jellemzőek; 2) egymásolatú vagy ritka vagy alacsony expressziós tulajdonságú gének szelektív klónozásánál.
A molekuláris biológia és a molekuláris genetika alkalmazásakor végzett legtöbb vizsgálat - ilyenek például a nukleinsavpróba hibridizációs vizsgálatok vér-eredetű kórokozókra vagy hibás génekre - magában foglalja valamilyen speciális nukleinsav kimutatását vagy izolálását. Egy ilyen munkánál alapprobléma a kívánt nukleinsav-szekvencia észlelése, izolálása, majd mennyiségi meghatározása. Ez eddig nehéz problémát jelentett, mivel a biológiai anyagok, mint a sejttenyészetek, szövetminták és vérminták egyedi RNS-ek és DNS-ek komplex keverékéből állnak, amelyek közül csupán egy egészen kis frakció tartalmazza a kérdéses szekvenciát.
A nukleinsavpróba hibridizációs vizsgálatok gyakorlati alkalmazása valóban korlátozott volt, mivel a vizsgálatok érzékenysége - ha azokat a rutinhasználatban alkalmazott reagensekkel és elfogadhatóan rövid időn belül végzik el - túl alacsony ahhoz, hogy a keresett szekvenciákat olyan alacsony koncentrációban, ahogyan a természetes mintákban előfordulnak, észlelni lehessen.
A kutatók két alapvetően különböző megközelítéssel láttak hozzá e problémák megoldásához, azaz, hogy nukleinsavak komplex keverékében a kis mennyiségben jelen lévő kívánt nukleinsav-szekvencia („target segment”=célszegmentum) kimutatását megoldják.
Az első megközelítésnél a mintában lévő nukleinsav (amely a célszegmentumot tartalmazza) mennyiségét nem változtatták, ehelyett egy jelképző rendszert kapcsoltak a célszegmentumhoz, amely olyan észlelhető szignált adott, amely a célszegmentum molekuláinak a számát jelezte. Például: egy nukleinsavpróbát, amelynek a szekvenciája a célszegmentum egy szubszegmentumával komplementer, hozzákapcsolnak egy enzimhez, például alkalikus foszfatázhoz, s ezt hozzákeverik a mintához olyan hibridizációs körülmények mellett, amelyek a próba és a célszegmentum hibridizációját eredményezik (ugyanakkor a próba és a mintában lévő egyéb nukleinsav-szekvenciák közötti hibridizáció nem észlelhető). A nem hibridizáló enzimmel jelzett próba eltávolítása után, az alkalikus foszfatáz számára megfelelő feltételek mellett hozzáadnak a reakcióelegyhez egy kromogén szubsztrátumot, és ekkor általában gyorsan nagyszámú észlelhető, színezett molekula keletkezik minden egyes olyan próba molekulának megfelelően, amely a célszegmentummal hibridizált.
Ezen a szakterületen a nukleinsav-szekvenciák észlelésére számos más olyan rendszer is ismeretes, amelyben a mintában lévő célnukleinsav mennyisége nem változik. Egy másik példa a nukleinsavpróba hagyományos jelölése radioaktív atomokkal, például 32P-vel, majd a célmolekulával hibridizált próba észlelése a radioaktív mag bomlása által gerjesztett felnagyított jel segítségével. Még egy másik példa szerint a célszegmentum próbájához egy másik olyan nukleinsavat kapcsolnak, amely replikációra képes, s így könnyen észlelhető ismert módszerekkel. Ismeretes, hogy bizonyos RNS-ek hajlamosak (autokatalitikusan) replikáz indukálta replikációra, meghatározott polimeráz révén, ilyen a bakteriofág RNS-fuggő RNS-polimeráz, mint a QB replikáz és a Bromus (rozsnok) mozaikvírus (BMV) replikáz. Egy ilyen rendszerben mind az RNS, mind a komplementer szekvencia RNS-e templátként szolgál az RNS-polimeráz által megindított replikációhoz: ennek következtében a replikálódott RNS mennyisége exponenciálisan nő az idővel, ameddig a rendszerben az RNS templát molekulák száma nem haladja meg az RNS-polimeráz molekulák számát. [Lásd: Miele és munkatársai, J. Mól. Bioi., 171, 281 (1983)], Chu és munkatársai [Nucl. Acids Rés., 14, 5591 (1986)] írtak le egy olyan rendszert, amelyben egy célszegmentumhoz szolgáló próbát olyan RNS-hez kötöttek, amely képes volt QB replikáz hatására replikálódni. Marsh és munkatársai (Positive Strand RNA Viruses, kiadó: Alán L. Liss, New York, 1987; Proceedings of UCLA Symposium, 1986) ugyanezt írták le BMV replikáz hatásával kapcsolatban.
Az első megközelítésnek két komoly hátránya van. Az első az, hogy sok esetben a gyakorlatban előforduló mintában lévő célszegmentum-másolat száma olyan alacsony, hogy még elfogadhatóan gyors jelképző rendszerekben is az az idő, amely a háttér felett szignifikánsan észlelhető jel képződéséhez szükséges, a használhatóság szempontjából hosszú. Másodszor a szignál képződése lényegében ugyanolyan sebességű a „háttér” szignált adó molekuláknál, mint a célmolekulával összekapcsolt jelképző molekuláknál. Egyetlen célszegmentum-vizsgálatban sem lehet elkerülni a „háttér” szignált; azaz a próbának mindig van bizonyos olyan szignálja, amely annak tudható be, hogy nem specifikusan tapad a szűrőkhöz vagy más szilárd hordozóhoz, vagy a célszegmentummal nagyon hasonló szekvenciájú szegmentumokkal hibridizál. Ha a célmolekula másolatszáma túl alacsony, a cél plusz a háttérből származó jel (azaz „szignál”) időkonstansának aránya a háttérről származó jelhez [azaz „zaj” (nőise)] képest túl alacsony lesz ahhoz, hogy szignifikánsan lehessen észlelni a háttér felett. Ezek és más hátrányok vezették a szakembereket egy második megközelítéshez, azaz megkísérelték egy nukleinsavból álló komplex keverékben kis mennyiségben jelen lévő célszegmentum észlelésének a problémáját megoldani.
Ez a második megközelítés alapvetően különbözik az elsőtől, és magában foglalja a célszegmentum-másolat számának a megnövelését, előnyösen olyan mértékben, hogy nagyobb legyen a mintában lévő más olyan szekvenciák számánál, főleg olyanoknál, amelyeket tévesen mint célszegmentumokat lehetne észlelni a szekvenciák hasonlósága miatt. E második megközelítés eljárásai különböző tenyésztési technikákat tartalmaznak, amelyekben a célszegmentumot viselő sejtek számát néha sokkal gyorsabban növelik, mint a többi sejtek számát, vagy amelyekben azoknak a speciális nukleinsavaknak (például plazmidok, RNS-ek) a számát növelik, amelyekben a célszegmentum helyezkedik el.
Az ilyen tenyésztési technikáknak az a hátránya, hogy nehézkesek, problematikusak, időigényesek, és elkerülhetetlennek tűnik, hogy a célszegmentumot nem tartalmazó nukleinsavak száma ugyancsak megnövekedjék, miáltal potenciálisan nő a „háttér”. Egy másik hátránya, hogy előidézi a potenciálisan veszélyes mikroorganizmusok szaporodását, mintegy a sokszorozódás elérésének szükséges lépéseként.
A második megközelítés egy másik példája a DNScélszegmentum-sokszorozása (amplifikációja) az úgynevezett „polimeráz láncreakcióban” (polymerase chain reaction=PCR). Ezt az eljárást olyan ismert, természetben előforduló folyamatokból kölcsönözték, mint amilyenek például bizonyos vírusegységek egyszálú DNS genomjának replikációs folyamatában fordulnak elő, és ez minden esetben a cDNS előállításához hasonló alkalmazást jelent [Hong, Bioscience Reports, 1, 243 (1981); Cooke és munkatársai, J. Bioi. Chem., 255, 6502 (1980); Zoller és munkatársai, Methods in Enzymology, 100, 648-500 (1983)]. Ezzel a technikával a szóban forgó szegmentum másolatszáma exponenciálisan nő a ciklusok számával. Minden ciklusban 1) egy DNS prímért hibridizálnak minden egyes célszegmentum 3 ’-terminális szubszegmentumához és komplementeréhez (ez a célszegmentum szekvenciájával komplementer szekvenciaszegmentuma), 2) DNS-polimeráz segítségével minden prímért kiterjesztenek és 3) az ebben a lépésben keletkező duplexeket hődenaturációval egyszálúvá alakítják. Ezt az eljárást Saiki és munkatársai [Science, 230, 1350 (1985)], valamint Millis és munkatársai (200362 és 2001184 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentések) írták le. Utalunk még a 4683 195 és 4683202 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokra is. Ha az eljárást 20 ciklusban, körülbelül 3 órán át folytatták, a közlések szerint a célszegmentum másolatszámát körülbelül 105 faktorral tudták növelni. Csak azoknak a szegmentumoknak a kópiaszáma nő exponenciálisan, amelyekhez megfelelő stabilitással specifikus prímért hibridizálnak a polimerázzal indítandó lánchosszabbítás céljából, amikor is komplementer lánc képződik, amivel egy másik specifikus primer hibridizál, ami hasonló módon, lánchosszabbítás révén célszegmentumot eredményez, míg a többi nem célszegmentum másolatszáma, hacsak nem hibridizálnak tévesen a használt príménél, legfeljebb - ha egyáltalán - lineárisan növekszik a ciklusok számának függvényében. A polimeráz láncreakció technika nemcsak a célszegmentum másolatszámát növelheti nagymértékben, hanem egy mintában a célszegmentum mennyiségi arányát is a háttérkiváltó szegmentumokhoz képest.
Természetesen ebből következik, hogy egy mintánál ezen második megközelítés együtt alkalmazható az első megközelítéssel - mely a sokszorozott célszegmentumra vonatkozik -, hogy még erősebb észlelési szignált kaphassanak.
A találmány célkitűzése a korábbi ismert eljárások hátrányainak kiküszöbölése; ennek érdekében egy olyan lényegre törő eljárást dolgoztunk ki, amely elfogadhatóan rövid időn belül alkalmazható az ismert reagensek megfelelő felhasználásával, és amely olyan precizitású, hogy helytálló tudományos eredmények elérését biztosítja; ez az eljárás reprodukálható vizsgálati rendszerben alkalmazható és klinikai, valamint laboratóriumi analízisekhez szolgáló kitekben való felhasználásra adaptálható.
A találmány tárgya tehát bizonyos nukleinsav-szekvenciák (célszegmentumok) észlelhetőségének megnövelése ezeknek a célszegmentumoknak a megsokszorozásával olyan in vitro vagy x-vivo rendszerben, mely mentes azoktól a hátrányoktól, amelyek a technika állása szerinti tudományos kísérletekben eddig megnyilvánultak.
A találmány szerinti eljárás értelmében egy célszekvencia amplifikálását egy nukleinsavat tartalmazó mintában úgy végezzük, hogy
i) előállítunk egy első nukleinsav prímért, amely egy promoter szekvenciát tartalmaz működőképesen hozzákapcsolva a célszekvencia egy első szegmentumának megfelelő szekvenciához, mely első szegmentum tartalmazza a célszekvencia 3’ végét; és előállítunk egy második nukleinsav prímért, amely a célszekvencia egy második szegmentumával komplementer szekvenciához hibridizálható, mely második szegmentum tartalmazza a célszekvencia 5’ végét;
ii) az első nukleinsav prímért egy nukleinsavat tartalmazó mintában a célszekvenciához hibridizáljuk;
iii) a hibridizált első nukleinsav prímért polimeráz extenziós reakcióban kiterjesztjük a célszekvenciával komplementer szekvenciával, így egy első duplex nukleinsavat kapunk;
iv) a iii) lépésben kapott első duplexet egyszálúvá alakítjuk;
v) a promoter szekvenciát tartalmazó kapott szálhoz hibridizáljuk a második nukleinsav prímért;
vi) a hibridizált második nukleinsav prímért polimeráz extenziós reakcióban kiterjesztjük a promoter szekvenciát tartalmazó szállal komplementer szekvenciával, így egy második duplex nukleinsavat kapunk; és vii) a kapott második duplexet templátként alkalmazva RNS-átiratokat - mely átiratok mindegyike tartalmaz egy, a célszekvenciának megfelelő RNS-szekvenciát - készítünk olyan RNS-polimerázzal katalizált reakcióban, amely RNS-polimeráz felismeri az első primer promoter szekvenciának megfelelő promotert; és viii) kívánt esetben a kapott RNS-átiratokat a célszekvencia további amplifikálására használjuk fel.
A találmány a nukleinsavak komplex keverékében kis koncentrációban jelen lévő célszegmentumok észlelésére szolgáló fenti második megközelítés egy új végrehajtási technikájával foglalkozik. A technika egy új RNS-átiratot termelő lépést tartalmaz a célszekvencia egy szintetizált kétszálú cDNS-másolatával együtt, s ebből kiindulva, s így egy teljes ciklust alkot. Több ciklus is alkalmazható. A transzkripciós lépés alapján, tekintve, hogy ez találmányunk újdonság szempontjából domináns eleme, célszerű, ha az eljárást egy transzkripción alapuló sokszorozó (amplifikációs) rendszernek nevezzük (transcription-based amplification system=TAS). A jelen találmány szerinti új TAS technika egy kiválasztott célszegmentum másolatszámának gyors növelését eredményezi azáltal, hogy felhasználjuk a DNS-függő RNS-polimeráz két tulajdonságát: 1) már egész kis számú olyan szekvencia, amely minden polimerázra specifikus, észlelhetően megindítja a transzkripciót [lásd például : Brown és munkatársai, Nucl. Acids Rés., 14,3521 (1986)]; és 2) egy RNS-polimeráz által felismert promoter minden egyes másolatáról gyorsan nagyszámú átirat termelődik (óránként rendesen ΙΟ2—104). Lásd: Milligan és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 15, 8783 (1987)]. A találmány szerinti technika ugyancsak felhasználhatja bizonyos szekvenciájú RNS-ek azon képességét, hogy gyorsan (autokatalitikusan) replikálódnak RNS-függő RNS-replikázok segítségével (Miele és munkatársai, lásd fent). Ezenkívül ez egy olyan standardizációs technikát jelent, amely egy mintában a jelen lévő cél-DNS mennyiségének egyértelmű meghatározását teszi lehetővé.
A jelen találmány [hacsak nem alkalmazunk indukált (autokatalitikus) replikációt] egy egyszálú RNS-átiratot eredményez - vagy ebből képződő RNS-DNS-duplexet, ha nem intézkedünk képződésének megakadályozására -, amely egy olyan szubszegmentumot tartalmaz, amelynek a szekvenciája olyan, mint a célszegmentumé vagy pedig a célszegmentummal komplementer, és amely nagy túlsúlyban van jelen egy komplementer szekvenciájú szubszegmentummal rendelkező nukleinsavhoz viszonyítva. Az egyszálú RNS-átirat kezdeti túlsúlya előnyös bizonyos olyan módszerekben, amelyek jelzett nukleinsavpróbával ellátott sokszorozott termék észlelésére szolgálnak, mivel a komplementer szekvenciából kevés szegmentum van jelen a sokszorozott termékkel történő hibridizációhoz szolgáló próbával való versenyzéshez. Tehát az egyszálú RNS-átirat-termék ettől kezdve többé-kevésbé folyamatosan kinyomtatódik és a célszegmentum közvetlen észlelésére szolgál anélkül, hogy szükség lenne a nehézkes és hibákkal járó ismételt PCR-ciklusokra és szálelválasztásra. Ezeket az előnyöket nem adja meg az a PCR technika, amely kétszálú DNS-t eredményez (az egyik szál tartalmazza a célszegmentumot, a másik szál a célszegmentum komplementerét), amelyeket el kell választani az észlelés előtt, és számos ismételt ciklus szükséges ahhoz, hogy eléijük az elfogadható sokszorozási szintet.
A találmány szerinti eljárás egy kiválasztott célszegmentumnak legalább olyan mértékben történő sokszorozását biztosítja, mint a PCR technika, körülbelül ugyanazon időtartam alatt, de sokkal egyszerűbb és reprodukálhatóbb módon, a természetes folyamatoktól vagy más módszerektől eltérően.
Felismertük, hogy a bakteriofág DNS-függő RNSpolimerázt hogyan lehet felhasználni egy nukleinsavmintában jelen lévő kiválasztott célnukleinsav-szekvencia (célszekvencia vagy -szegmentum) gyors sokszorozására (azaz másolatszámának növelésére). Továbbá megállapítottuk, hogy a bakteriofág DNS-függő RNS-polimerázt hogyan lehet felhasználni a bakteriofág RNS-függő RNS-polimerázzal együtt hasonló eredmény eléréséhez. Eddig nem ismerték fel annak lehetőségét, hogy a bakteriofág DNS- vagy RNS-függő RNS-polimeráz erre a célra felhasználható.
A találmány oltalmi körébe tartoznak az olyan eljárások, amelyek ezeken a felismeréseken alapulnak és az olyan kitek, amelyek ezen eljárások kivitelezésére szolgálnak.
Ezek az eljárások és kitek különösen hasznosan alkalmazhatók a nukleinsavpróba hibridizációs vizsgálatokkal együtt olyan nukleinsav vizsgálatára, amely egy találmány szerint sokszorozott célszegmentumot tartalmaz. Ennélfogva a találmány azokra az eljárásokra és az eljárások elvégzéséhez szükséges kitekre is vonatkozik, amelyek egy speciális szegmentumot tartalmazó nukleinsavmintában a szegmentum jelenlétének vagy távollétének az észlelésére szolgálnak egy olyan próba segítségével, amelyet a találmány szerinti amplifikáció után ezzel a szegmentummal hibridizálunk.
A jelen találmány meghatározott RNS-átiratok újdonságán alapszik. Vonatkozik továbbá a találmány ezen átiratok termelésére, adott esetben replikációjára és felhasználására olyan célból, hogy eléijük (a szekvenciában) a megfelelő célnukleinsav kívánt sokszorozódását és kimutatását. A találmány in vitro vagy xvivo rendszerben nyer gyakorlati alkalmazást, és együtt alkalmazzuk a célszekvencia kétszálú cDNS-másolatának szintézisével abból a célból, hogy egy kétszálú nukleinsavtemplátot állítsunk elő, amelyet ezután az említett RNS-átiratok termelésére használunk. A kétszálú cDNS-szintézist és RNS-transzkripciót tartalmazó eljárás a jelenlegi transzkripcióra alapozott sokszorozórendszer (TAS) egyetlen ciklusából áll. Ha kívánt, a ciklus megismételhető abból a célból, hogy az amplifikáció még magasabb szintjét érjük el. Az eljárás alapján termelt (és újratermelt) átiratok szekvenciája megfelel (azonosan vagy komplementer módon) egy természetes mintában lévő nukleinsav-keverékből származó célnukleinsav-szekvenciának, s így a sokszorozott átiratok észlelhetővé válnak, és ennek megfelelően lehetővé válik az említett mintában a célnukleinsav-szekvencia jelenlétének in vitro vagy x-vivo kimutatása.
Ekképpen a találmány egy nukleinsav-tartalmú mintában legalább egy specifikus nukleinsav-szekvencia (célszekvencia vagy -szegmentum) in vitro vagy x-vivo észlelésére vonatkozik. A találmány szerinti eljárás lényegében a következőkből áll: előállítunk egy kétszálú nukleinsavat, amely egy célszekvenciának megfelelő olyan szekvenciát tartalmaz, amely funkcionálisan kapcsolódik egy promoterhez; az említett kétszálú nuklein4 savat kétszálú nukleinsavtemplátként használjuk, hogy belőle az RNS-átiratok sokaságát állítsuk elő, amelyek mindegyike olyan RNS-szekvenciát hordoz, amely megfelel az említett célszekvenciáknak; végül kimutatjuk az említett RNS-szekvencia jelenlétét és ezzel egyezően a célszekvencia jelenlétét.
A jelen találmány minden olyan módszerre és eszközre vonatkozik, amelyek az ilyen RNS-átiratok előállításával és felhasználásával kapcsolatosak. Tehát a találmány a fentiekben meghatározott említett kétszálú nukleinsavtemplát készítésének tetszés szerinti ismétléses módszerére vonatkozik, amely abból áll, hogy készítünk egy első nukleinsav prímért, ez tartalmaz egy promoter szekvenciát, amely funkcionálisan kapcsolódik egy fent definiált célszekvencia egy szegmentumának megfelelő szekvenciához, ezt az első nukleinsav prímért alkalmas körülmények között egy nukleinsav-tartalmú mintában lévő célszekvenciával hibridizáljuk, a hibridizált említett első nukleinsav prímért kiteijesztjük egy polimeráz extenziós reakcióban úgy, hogy a célszekvenciával komplementer legyen, s, hogy egy megfelelő duplex nukleinsav keletkezzék, ezután az illető duplex szálait szétválasztjuk, a promotert tartalmazó elválasztott szekvencia szálhoz - megfelelő körülmények mellett - az említett promoter szekvenciával ellenkező véghez egy második nukleinsav prímért hibridizálunk és az illető hibridizált második nukleinsav prímért kiteijesztjük egy polimeráz extenziós reakcióban úgy, hogy komplementer legyen az említett promoter-tartalmú szekvenciával.
Vonatkozik továbbá a találmány további alternatív eljárásokra és eszközökre, amelyekkel az említett kétszálú nukleinsavtemplátot (lásd fentebb) előállítjuk, ilyen például egy lényegében egyedényes reakció, amely abból áll, hogy előállítunk egy első nukleinsav prímért, ez tartalmaz egy promoter szekvenciát, amely funkcionálisan kapcsolódik egy célszekvencia szegmentumával komplementer szekvenciához, és előállítunk egy második nukleinsav prímért, amelynek a szekvenciája egy célszekvencia egy szegmentumával azonos, az említett primerek a szóban forgó célszekvencia különböző szakaszainak felelnek meg, de a célszekvenciával való megfelelőségük nem, vagy lényegesen nem fedi át egymást, továbbá úgy vannak megválasztva, hogy az egyik meghosszabbításával kapott termék, ha elválasztjuk komplementerétől, templátként szolgálhat a másik extenziós termékhez, majd a nukleinsav-tartalmú mintát, amely a célszekvenciát tartalmazza, összehozzuk az említett primerekkel, egymást követő hibridizációt és szálszétválasztást elősegítő körülmények mellett úgy, hogy sorban keletkezzenek az említett primerek kiterjesztett termékei.
A találmány olyan eljárásokra és eszközökre is vonatkozik, amikor az említett kétszálú nukleinsavat (lásd fent) templátként használjuk RNS-átiratok sokaságának az előállítására egy olyan DNS-függő RNS-polimerázzal katalitizált reakcióban, ahol a polimeráz ezek promoterét felismeri, majd észleljük és mérjük az említett RNS-átiratok jelenlétét.
Vonatkozik még a találmány az olyan eljárásokra és eszközökre, amelyekkel az észlelt célszekvencia mennyiségét (az RNS-átirat mennyiségének megfelelően) standardizáljuk, egy jelen lévő ismert nukleinsavhoz, mint belső standardhoz való további viszonyítás révén. A standard másolatszáma előre meghatározott, és a standard a célszekvenciával azonos körülmények közé kerül és ugyanaz történik vele a találmány megvalósítása során, mint a célszekvenciával, és így a kiértékelés eszközéül szolgál az átiratok - amelyek párhuzamosan készülnek a standardról és a célszekvenciáról relatív mennyiségének meghatározásában.
A találmány vonatkozik továbbá a fent meghatározott RNS-átiratok további replikációjára, amely a bennük jelen lévő replikázfelismerő helyek révén megy végbe. Ezt célszerűen a következőképpen éljük el: a fent meghatározott első nukleinsav prímért úgy állítjuk elő, hogy kiegészítésül egy replikázfelismerő helyet viseljen, előnyösen a promoter szekvencia és a célszekvenciának megfelelő szekvencia között és/vagy ezenkívül a fent meghatározott második nukleinsav primer is tartalmazzon egy replikázfelismerő helyet. A következő transzkripciónál kapott átiratok tartalmazni fogják a replikázfelismerő helyet (helyeket), azaz egy replikáz jelenléte (például a reakció helyén vagy a kitben) indukálni fogja (autokatalitikusan) az átiratok replikációját, s így újabb másolatok keletkeznek az észlelés további könnyítésére.
A találmány tárgyát olyan kitek is képezik, amelyek a szükséges reagenseket és a hozzá tartozó eszközöket tartalmazzák. Ezek a kitek egy nukleinsav-tartalmú mintából legalább egy specifikus nukleinsav (célszekvencia) in vitro vagy x-vivo kimutatására használhatók a fent említett eljárások és eszközök alkalmazásával.
Az ΙΑ, 1B és IC ábra egy nukleinsav (nukleinsav A) - mely DNS vagy RNS lehet - egy célszegmentumának a találmány szerinti eljárással végzett sokszorozását ábrázolja. Az eljárásban egy, a célszegmentummal komplementer szekvenciát tartalmazó szegmentumot magában foglaló első RNS-ből (RNS I) sok másolatot készítünk olyan szekvenciával, amely komplementer a célszegmentum szekvenciájával.
A 2A, 2B és 2C ábra az ΙΑ, 1B és IC ábrák szerint előállított RNS I egy szegmentumának találmány szerinti további sokszorozását ábrázolja, amikor is egy második RNS-ből (RNS II) sok másolatot készítünk olyan szegmentummal, amelynek a szekvenciája azonos a célszegmentum - ezt sokszoroztuk az RNS I előállítása céljából - szubszegmentumának szekvenciájával.
A 3. ábrán autoradiogramok láthatók, amelyek TAS-eljárással sokszorozott HÍV RNS különböző koncentrációt ábrázolják a humán B-globin nukleinsav fix koncentrációja mellett.
A 4. ábra egy olyan általános stratégiát mutat be, amellyel egy DNS-függő RNS-polimerázzal előállított RNS olyan RNS-molekulát eredményez, amely templátként szolgálhat egy RNS-fuggő replikáz számára.
Az alábbiakban molekuláris biológiával foglalkozó standard kézikönyvekre hivatkozunk, amelyek definíciókat, eljárásokat és a jelen találmány alapeljárásainak kivitelezéséhez szükséges eszközök leírását tartalmazzák. Például: DNS-próba vagy primer előállítás, beleértve a DNS-szintézisét; a hibridizálás metodológiája, mely tartalmazza azon szigorúan meghatározott körül5 mények változatait, amelyek több vagy kevesebb hibridizációs biztonságot teremtenek attól függően, hogy a primemek milyen fokú a homológiája a cél-DNS-szekvenciával; promoterek azonosítása, izolálása és előállítása, vagy részletesebben, bakteriofág DNS-függő RNS-polimeráz és bakteriofág RNS-függő RNSpolimeráz, vagy - eukarióta rendszerek használata esetén - vírus DNS- és RNS-függő RNS-polimerázok például adenovírus által kódolt polimeráz és Bromus mozaikvírus polimeráz - által felismert promoterek vagy helyek azonosítása, izolálása és előállítása; RNSátiratok termeléséhez vezető feltételek, ilyenek az úgynevezett transzkripciófokozó (enhancer) szekvenciák; az (indukált) replikáció mechanizmusa és metodológiája; polimeráz láncreakció módszerek, amelyek az itt használt reagenseket tartalmazzák; és így tovább. Lásd például: Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982), és benne a különböző közlemények; a 4683 195 és 4683 202 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Hong, Bioscience Report, 1, 243 (1981); Cooke és munkatársai, J. Bioi. Chem., 255, 6502 (1980); Zoller és munkatársai, Methods in Enzymology, 100, 468-500 (1983); Crea és munkatársai, Nucleic Acid Rés., 8, 2331 (1980); Narang és munkatársai, Meth. Enzym., 68, 90 (1979); Beaucage és munkatársai, Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981); Brown és munkatársai, Meth. Enzym., 68, 109 (1979); Caruthers és munkatársai, Meth. Enzym., 154, 287 (1985); Hitzeman és munkatársai, J. Bioi. Chem., 255, 2073 (1980); Lee és munkatársai, Science, 239,1288 (1988); Milligan és munkatársai, Nucl. Acids Rés., 15, 8783 (1987); Miller és munkatársai, Virology, 125, 236 (1983); Ahlquist és munkatársai, J. Mól. Bioi., 153, 23 (1981); Miller és munkatársai, Natúré, 313, 68 (1985); Ahlquist és munkatársai, J. Mól. Bioi., 172,369 (1984); Ahlquist és munkatársai, Plánt Mól. Bioi, 3, 37 (1984); Ou és munkatársai PNAS 79, 5235 (1982); Chu és munkatársai, Nucl. Acids Rés., 14, 5591 (1986); EPA 194809 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés; Marsh és munkatársai, Positive Strand RNA Viruses, 327-336 old., Alán R. Liss (New York, 1987), Proceedings of UCLA Symposium (1986); Miller és munkatársai, J. Mól. Bioi., 187, 537 (1986); Stoflet és munkatársai, Science, 239, 491 (1988); Murakawa és munkatársai, DNA, 7, 287 (1988).
„Promoter” kifejezés alatt egy olyan nukleinsavszekvenciát (a szekvencia előfordulhat a természetben, vagy szintetikus úton előállított vagy restrikciós emésztés terméke lehet) értünk, egy RNS-polimeráz specifikusan felismer, hozzákötődik a felismert szekvenciához, ezzel megindítja a transzkripció folyamatát, amelyben egy RNS-átirat képződik. Ez adott esetben olyan nukleotid bázisokat tartalmazhat, amelyek a tényleges felismerőhelyen túlra terjednek ki, és feltehető, hogy további stabilitást biztosítanak a degradációs folyamatokkal szemben. Elvileg bármilyen promoter szekvencia felhasználható, amelyhez ismert és hozzáférhető olyan polimeráz áll rendelkezésre, amely képes felismerni az iniciációs szekvenciát. A tipikusan ismert és használt promoterek azok, amelyeket bizonyos bakteriofág polimerázok felismernek, ilyen a T3, T7 vagy SP6 bakteriofág polimeráz [Siebenlist és munkatársai, Cell, 20, 269 (1980)]. Ezek csupán példák az olyan polimerázokra, amelyek a jelen találmány szerinti gyakorlatban a társpromoter szekvenciákkal együtt alkalmazhatók.
Az „RNS-átirat” itt ribonukleinsav-szekvenciát jelent, amely a transzkripció megindítása után keletkezik, miután a promoter szekvenciát az RNS-polimeráz felismerte (lásd fent). Az ilyen átiratok keletkezése többékevésbé folyamatos, s részben a jelen lévő polimeráz mennyiségétől függ.
„Primer” alatt a jelen összefüggésben olyan nukleinsav-szekvenciát (a szekvencia előfordulhat a természetben, vagy lehet szintetikus úton előállított vagy restrikciós emésztés terméke) értünk, amely eléggé homológ a célszekvenciával ahhoz, hogy alkalmas hibridizációs körülmények között képes legyen hibridizációra, azaz a célszekvenciához kötődni. Egy tipikus primer legalább körülbelül 10 nukleotid hosszú, legelőnyösebben körülbelül 35 vagy több nukleotidbázis hosszú, és még előnyösebb megjelenési formájában identikus vagy igen nagy mértékben homológ a célszekvenciával. Lásd például az EPA 128042 számú szabadalmi bejelentést (nyilvánosságra hozva 1984. december 12-én).
A „funkcionálisan összekapcsolva” kifejezés, különösen azzal összefüggésben, hogy egy promoter szekvencia a primer szekvencián belül hogyan kapcsolódik, a találmány szerinti végleges „kettős szálú nukleinsavtempláf ’ működőképességére utal, vagyis, hogy a templát akkor képes a megfelelő RNS-átiratok termelésére, ha a promoter a megfelelő polimerázt (lásd fentebb) felismeri.
A primer extenziós reakció a duplex képzésére önmagában ismert reakció (vö. a fent felsorolt közleményekkel). Az erre a célra alkalmas polimerázokhoz tartozik az E. coli DNS-polimeráz I, az E. coli DNSpolimeráz I Klenow ffagmentje, a T4 DNS-polimeráz, a reverz transzkriptáz, és így tovább.
Az észlelési szignálok képzési módszerei - például radioaktív jelzés vagy kromogén anyagokkal színképzésre hajlamos enzim alkalmazása - a szakterületen szintén jól ismertek és jól dokumentáltak, mint azt a fentiekben ismertettük.
A „replikáz” használata a jelen találmány szerinti RNS-átiratok replikációjának (autokatalitikus) indukciójára általánosan ismert e szakterületen. Az ebben a találmányban felhasználható ilyen replikázok közé tartozik az úgynevezett QB vírus replikáz, amely bizonyos nukleinsavszekvencia-helyeket ismer fel az adott RNSátiratnak mind 3’, mind 5’-helyén, és az úgynevezett Bromus mozaikvírus (BMV), valamint az α-vírus replikázok, amelyekről úgy tudjuk, hogy felismerik egy adott RNS-átirat 3’ végén lévő nukleinsav-szekvenciákat. Ezek a replikázok arra szolgálnak, hogy az RNS-átiratokat és komplementereiket replikálják, azaz reprodukálják úgy, hogy másolataikat megsokszorozzák. Ha a transzkripció folyamán a reakció helyén ilyen enzim van jelen, akkor előreláthatóan az történik, hogy a transzkripció folyamán keletkezett sok átirat saját maga
HU 216 317 Β is replikálódik, s így exponenciálisan növekszik az átírt RNS-termék mennyisége.
A belső standardizálást úgy definiáljuk, hogy ez egy eljárás, amelyet arra használunk, hogy 1) biztosítsa, hogy a TAS amplifikációs folyamat ne hiúsuljon meg valamilyen módszerbeli hiba miatt, és hogy 2) mérje a célnukleinsav-szint viszonyát egy előre meghatározott mennyiségű nukleinsavhoz képest, amely mindig része a szóban forgó mintának. Az ilyen belső standardizáció úgy folyik, hogy ugyanazon reakcióban együtt sokszorozzuk a célszekvencia egy részét, valamint egy endogén szekvenciát. Például ismerve a biológiai mintában lévő sejtszámot, egy egymásolatú gént (ilyen például a β-globin) használhatunk belső standardként, minthogy az RNS alakban nem jelenik meg, s a kezdeti másolatszáma egyenlő a mintában lévő össz-sejtszám kétszeresével. A β-globin rész és a kívánt célszekvenciák együttes sokszorozása révén össze lehet hasonlítani a megsokszorozódott szignálok arányait a szóban forgó célszekvencia-szint meghatározására. Minthogy a belső standardban minden sejt (diploid sejteknél) két másolattal rendelkezik, függetlenül attól, hogy a biológiai minta külön célszekvenciákat (például HÍV szekvenciákat) tartalmaz, várható, hogy minden minta pozitív amplifikációs szignált ad a belső standardból eredően. [Groudine és munkatársai, Nucl. Acids Rés., 12, 1427 (1984) és McKnight, Cell, 31, 355 (1982); továbbá a 2 187 283A számú nyilvánosságra hozott brit szabadalmi bejelentés (1987. szeptember 3.)].
A találmány szerinti, az alábbi célnukleinsav-szegmentum-sokszorozására szolgáló eljárásnak több megvalósítási módja lehet.
A célnukleinsav-szegmentum szerkezete:
(I) : 3'-(első szubszegmentum)t-(második szubszegmentum),-harmadik szubszegmentum),-5’ ahol az (első szubszegmentum), egy legalább 10 nukleinsavból álló ismert szekvenciájú nukleinsav-szegmentum, amely a (második szubszegmentum), 3’-végéhez csatlakozik, a (második szubszegmentum), 0 vagy több nukleotidból álló nukleinsav-szegmentum és a (harmadik szubszegmentum), egy legalább 10 nukleinsavból álló ismert szekvenciájú nukleinsav-szegmentum, amely a (második szubszegmentum)5 5’ végéhez kapcsolódik. Egy lehetséges eljárás (a továbbiakban I. eljárás) a következő lépésekből áll:
i) az említett célnukleinsav (első szubszegmentum), részéhez egy első prímért hibridizálunk, amely olyan egyszálú DNS, amely a (II) általános képletű 3’-terminális szubszegmentumból áll:
(II) : 5’-(promoter)[-(variábilis szubszegmentum), -(3’primer szubszegmentum),-3’ ahol a (promoter), egy olyan egyszálú DNS-szegmentum, amelynek a szekvenciája egy bakteriofág DNS-függő RNS-poiimeráz specifikus promoter pluszszálával egyenlő, a (variábilis szubszegmentum), egy 0-100 nukleotidból álló egyszálú DNS-szegmentum, amely a (promoter), 3’-terminális nukleotidjához és a (3’-primer szubszegmentum), 5’-terminális nukleotidjához kapcsolódik és a (3’-primer szubszegmentum), egy legalább 10 nukleotidból álló egyszálú DNS-szegmentum, amelynek a szekvenciája az (első szubszegmentum), egy olyan szubszegmentumának a szekvenciájával komplementer, amely az (első szubszegmentum), 3'-terminális nukleotidjával fejeződik be, s az említett (promoter), a (3'-primer szubszegmentum), 5’ végéhez kapcsolódik, amennyiben az említett (variábilis szubszegmentum), 0 nukleotidból áll;
ii) az említett első prímért - amelyet az 1) lépés szerint hibridizáltunk - kiteijesztjük egy olyan reakcióban, amelyet egy első DNS-polimeráz katalizál, hogy megkapjuk az első olyan komplementer DNS-szegmentumot, amely a (III) általános képletű szubszegmentumból áll.
(III) : 5’-(promoter),-(variábilis szubszegmentum),-(első szubszegmentum)tc-(második szubszegmentum),c-(harmadik szubszegmentum),c -3’, amelyben az (első szubszegmentum),c olyan DNS-szegmentum, amelynek a szekvenciája az (első szubszegmentum), szekvenciával komplementer, a (második szubszegmentum),c olyan DNSszegmentum, amelynek a szekvenciája a (második szubszegmentum), szekvenciával komplementer és a (harmadik szubszegmentum),,. olyan DNS-szegmentum, amely a (harmadik szubszegmentum), szekvenciával komplementer, azzal a kikötéssel, hogy ha a célszegmentum egy RNS-szegmentum, az említett első DNS-polimeráz egy reverz transzkriptáz; iii) az ii) reakcióban képződött duplexet egyszálúvá változtatjuk; iv) a (III) általános képlet szerinti szóban forgó első komplementer DNS (harmadik szubszegmentum),c részéhez egy második prímért hibridizálunk, amely a (IV) általános képletű, legalább 10 nukleotidból álló egyszálú DNS;
(IV) : 3’-(5’-primer szubszegmentum)2-(variábilis szubszegmentum)2-5’, amelyben az (5’-primer szubszegmentum)2 a (harmadik szubszegmentum), egy szubszegmentumának a szekvenciájával - amely a (harmadik szubszegmentum)5 5'-terminális nukleotidjával végződik - egyenlő, és amelyben a (variábilis szubszegmentum)2 egy 0-100 nukleotidból álló szegmentum, amely az (5-primer szubszegmentum)2 5’ végéhez csatlakozik; v) az említett második prímért, amelyet az iv) lépés szerint hibridizáltunk, kiteijesztjük egy olyan reakcióban, amelyet egy második DNS-polimeráz katalizál, hogy egy második olyan DNS-szegmentum képződjék, amely az (V) általános képletű szubszegmentumból áll:
(V) : 5'-(variábilis szubszegmentum)2-(harmadik-szubszegmentum),- (második szubszegmentum),- (első szubszegmentum),- (variábilis szubszegmentum) ,c(promoter),c-3’ amelyben a (variábilis szubszegmentum),,. egy olyan DNS-szegmentum, amely a (variábilis szubszegmentum), szekvenciával komplementer és a (promoter),c egy olyan DNS-szegmentum, amely a (promoter), szekvenciával komplementer; és az említett második DNS-polimeráz ugyanaz, mint az említett első DNSpolimeráz, vagy különbözik tőle; és vi) az v) lépés szerinti kétszálú terméket templátként használjuk egy olyan reakcióban, amelyet egy olyan első bakteriofág DNS-fiiggő RNS-polimeráz katalizál, amely felismeri a promotert, amelynek az egyik szála a (promoter),, s így képződik a (VI) általános képletű első RNS-termék:
(VI) : 5'-(variábilis szubszegmentum),r-(első szubszegmentum ),„- (második szubszegmentum),cr(harmadik szubszegmentum)lcr-(variábilis szubszegmentum)2cr-3 ’, amelyben a (variábilis szubszegmentum), r egy RNSszegmentum, amelynek a szekvenciája azonos a (variábilis szubszegmentum), szekvenciával, az (első szubszegmentum)tcr egy olyan RNS-szegmentum, amelynek a szekvenciája komplementer az (első szubszegmentum)t szekvenciával, a (második szubszegmentum),cr egy RNS-szegmentum, amelynek a szekvenciája a (második szubszegmentum), szekvenciával komplementer, a (harmadik szubszegmentum),cr egy olyan RNS-szegmentum, amelynek a szekvenciája komplementer a (harmadik szubszegmentum), szekvenciával és a (variábilis szubszegmentum)2cr olyan RNS-szegmentum, amelynek a szekvenciája a (variábilis szubszegmentum)2 szekvenciával komplementer.
Egy másik megvalósítási módnál (a továbbiakban II. eljárás) az (első szubszegmentum), legalább 10 nukleotid hosszú, és (XIII) általános képlete a következő:
(XIII): 3’-(első szubszegmentum),2-(első szubszegmentum),|-5’, amelyben az (első szubszegmentum),2 0 vagy több nukleotidot tartalmaz, ha 0-nál többet, akkor az (első szubszegmentum),, 3’ végéhez csatlakozik és az (első szubszegmentum),, legalább 10 nukleotid hosszú;
az eljárásban a (harmadik szubszegmentum), (XIV) általános képlete a következő:
(XIV): 3'-(harmadik szubszegmentum),,-(harmadik szubszegmentum),2-5’, amelyben a (harmadik szubszegmentum),2 0 vagy több nukleotidból áll, s ha 0-nál többet tartalmaz, úgy a (harmadik szubszegmentum),, 5’ végéhez csatlakozik, s a (harmadik szubszegmentum),, legalább 10 nukleotid hosszú;
az eljárásban a (3'-primer szubszegmentum), szekvenciája komplementer a célszegmentum egy szubszegmentumával, amely a teljes (első szubszegmentum),2-ből és az (első szubszegmentum),, 0 vagy több nukleotidjából áll; az eljárásban az (5’-primer szubszegmentum)2 egy olyan szubszegmentum, amely a teljes (harmadik szubszegmentum),2-ből és a (harmadik szubszegmentum),, 0 vagy több nukleotidjából áll;
és végül az eljárás i)-vi) lépései (lásd fent) után kapjuk a (VII) általános képletű RNS-szubszegmentumot.
(VII) : 5'-(első szubszegmentum),,cr-(második szubszegmentum), (harmadik szubszegmentum)Ucr-3 ’, amelyben az (első szubszegmentum)„cr olyan RNS-szegmentum, amelynek a szekvenciája komplementer az (első szubszegmentum),, szekvenciával és a (harmadik szubszegmentum),,cr olyan RNS-szegmentum, amelynek a szekvenciája komplementer a (harmadik szubszegmentum),, szekvenciával, s a szekvenciát tovább sokszorozzuk a következő lépesekből álló eljárással:
viii) a (VI) általános képletű első RNS-termékhez egy harmadik prímért hibridizálunk. Ez egy egyszálú
DNS, amely a (VIII) általános képletű 3'-terminális szubszegmentumot tartalmazza.
(VIII): 5’-(promoter)3-(variábilis szubszegmentum)33'-primer szubszegmentum)3-3’.
A képletben a (promoter)3 egy bakteriofág DNSíuggő RNS-polimeráz specifikus promoter plusz szálának szekvenciájából álló egyszálú DNS-szegmentum, s az említett (promoter)3 szekvenciája azonos a (promoter), szekvenciával, vagy ettől különbözik, a (variábilis szubszegmentum)3 3'-terminális nukleotidjához és a (3’-preimer szubszegmentuma)3 egy 0-100 nukleotidból álló egyszálú DNS-szegmentum, amely a (promoter)3 3'-terminális nukleotidjához és a (3'-primer szubszegmentum)3 5’-terminális nukleotidjához csatlakozik és a (3'-primer szubszegmentum)3 egy olyan egyszálú DNS-szegmentum, amelynek a szekvenciája azonos a (harmadik szubszegmentum),, szekvenciával és a (promoter)3 3’-terminális nukleotidjához csatlakozik, ha a (variábilis szegmentum^ nukleotidból áll;
viii) a vii) lépés szerint hibridizált említett harmadik prímért kibővítjük egy olyan reakcióban, amelyet egy harmadik DNS-polimeráz katalizál. Ez a DNS-polimeráz egy reverz transzkriptáz, és azonos az első és második DNS-polimerázzal vagy ezektől különbözik. A reakcióban egy harmadik komplementer DNS-szegmentum jön létre, amely egy (IX) általános képletű 3’terminális szubszegmentumot tartalmaz.
(IX) : 5’-(promoter)3-(variábilis szubszegmentum)3(harmadik szubszegmentum),[-(második szubszegmentum),-(első szubszegmentum),, (első szubszegmentum),2-(variábilis szubszegmentum), c-3’, amelyben a (variábilis szubszegmentum),,. olyan DNS, melynek a szekvenciája a (variábilis szubszegmentum), szekvenciával egyenlő;
ix) : a reakció viii) lépésben keletkezett duplexet egyszálúvá alakítjuk;
x) : a viii) lépésben előállított harmadik komplementer DNS-hez egy negyedik, (X) általános képletű prímért hibridizálunk:
(X) : 5'-(variábilis szubszegmentum)4-(5'-primer szubszegmentum),,, amelyben a (variábilis szubszegmentum), egy 0-100 nukleotidból álló szegmentum és az (5'-primer szubszegmentum), egy ismert szekvenciájú szubszegmentum, amely a (variábilis szubszegmentum), 3'-nukleotidjához csatlakozik, ha a (variábilis szubszegmentum), 0-nál több nukleotidból áll, és amely egy legalább 10 nukleotidból álló (XX) általános képletű szegmentumot tartalmaz:
(XX): 5'-(variábilis szubszegmentum),-(első szubszegmentum),2c-(első szubszegmentum),,c-3 ’, amelyben az (első szubszegmentum),2c olyan DNSszekvencia, amely komplementer az (első szubszegmentum),2 szekvenciával és az (első szubszegmentum),,c olyan szekvencia, amely komplementer az (első szubszegmentum),, szekvenciával, azzal a kikötéssel, hogy az említett legalább 10 nukleotidból legalább egy az (első szubszegmentum),,,. 5'-terminális nukleotidja vagy ettől 5'-helyzetben van;
xi): az (x) lépés szerint hibridizált negyedik prímért kiterjesztjük egy olyan reakcióban, amelyet egy negye8
HU 216 317 Β dik DNS-polimeráz katalizál, s ez azonos az első, második és harmadik DNS-polimerázzal, vagy ezektől különbözik. A reakcióban egy negyedik komplementer DNS keletkezik, amely a (XI) általános képletű szegmentumot tartalmazza:
(XI) : 5’-(első szubszegmentum)tlc—(második szubszegmentum)tc-(harmadik szubszegmentum),lc-(variábilis szubszegmentum)3c- (promoter)3c-3 ’, amelyben a (második szubszegmentum)tc egy olyan DNS-szegmentum, amelynek a szekvenciája a (második szubszegmentum), szekvenciával komplementer, a (harmadik szubszegmentum),k olyan DNS-szegmentum, amelynek a szekvenciája a (harmadik szubszegmentum),, szekvenciával komplementer, a (variábilis szubszegmentum )3c egy DNS-szegmentum, amelynek a szekvenciája a (variábilis szubszegmentum)3 szekvenciával komplementer, és a (promoter) egy olyan DNS-szegmentum, amely komplementer a (promoter)3c szekvenciával; és xii) a xi) lépésben előállított kétszálú terméket templátként használjuk a második bakteriofág DNSfiiggő RNS-polimeráz által katalizált reakcióban. Ez a polimeráz azonos az említett első bakteriofág DNS-fuggő RNS-polimerázzal vagy ettől különbözik, és felismeri azt a promotert, amelynek az egyik szála a promoter)3. Ezáltal egy második RNS-termék keletkezik, amely a (XII) általános képletű 5’-terminális szubszegmentumot tartalmazza:
(XII) : 5‘-(variábilis szubszegmentum)3r-(harmadik szubszegmentum),, r- (második szubszegmentum),,. (első szubszegmentum),lr-X12-(variábilis szubszegmentum)4cr-3 ’, amelyben a (variábilis szubszegmentum)3r egy RNSszegmentum, amelynek a szekvenciája a (variábilis szubszegmentum)3-mal megegyező, a (harmadik szubszegmentum )tlr egy RNS-szegmentum, amelynek a szekvenciája megegyezik a (harmadik szubszegmentum),, szekvenciával, a (második szubszegmentum),, egy RNSszegmentum, amelynek a szekvenciája a (második szubszegmentum), szekvenciával azonos, az (első szubszegmentum), |r egy RNS-szegmentum, amelynek a szekvenciája megegyezik az (első szubszegmentum),, szekvenciával, a (variábilis szubszegmentum)^, egy RNS-szegmentum, amelynek a szekvenciája a (variábilis szubszegmentum^ szekvenciával komplementer és az X12 egy olyan RNS-szegmentum, amelynek a szekvenciája komplementer az (5’-primer szubszegmentum)4 szubszegmentum szekvenciájával, amely az (első szubszegmentum), ,c 5’ végétől 5’ irányban helyezkedik el.
Amint ezt fentebb említettük, a találmány tárgyát képezik azok a kitek, amelyek a találmány szerinti sokszorozási (amplifikációs) eljárások kivitelezésére szolgálnak. Abban az esetben, ha a találmány szerinti eljárással az első RNS-terméket állítjuk elő, a találmány szerinti kit tartalmazni fogja a két prímért, a megfelelő bakteriofág DNS-függő RNS-polimerázt és a DNSpolimerázt. Az a kit, amely a találmány szerinti eljárással mind az első, mind a második RNS-termék előállítására szolgál, négy alkalmas prímért (két kettős készletet) tartalmaz, a megfelelő szükséges polimerázokkal együtt.
Az olyan nukleinsav hibridizációs próba vizsgálatokhoz szolgáló találmány szerinti eljárások és kitek, amelyek együtt járnak a találmány szerinti célszegmentum sokszorozásával (amplifikációjával), a sokszorozáshoz szükséges eljárás lépésein kívül, illetve a kitek komponensein kívül olyan lépéseket, illetve komponenseket tartalmaznak, amelyek az RNS-termék - mely a találmány szerinti amplifikáció eredménye - észleléséhez szükséges. Akik járatosak a szakmában, ismerik a különböző további lépéseket, illetve komponenseket, és hogy a számos ismert nukleinsavpróba hibridizációs vizsgálati módszer közül melyek szükségesek egy amplifikációs eljárásból származó RNS észleléséhez. Az egyik előnyös nukleinsavpróba hibridizációs vizsgálati módszert amely a jelzett RNS amplifikáció bead-capture módszerét tartalmazza - az alábbiakban a II. példa mutatja be.
Előnyös, ha a (3’-primer szubszegmentum) b az 5’primer szubszegmentum)2, a (3’-primer szubszegmentum)3 és az (5’-primer szubszegmentum)4 20-40 nukleotidot tartalmaz, de előnyösebb, ha 30 nukleotidot tartalmaz, ugyanis ez fokozza azt a specifícitást, amellyel a különböző primerek azoknak a célszegmentumoknak végeihez kötődnek, amelyeknek a kiterjesztésére törekszünk.
Előnyös, ha a számunkra fontos nukleinsav célszegmentumát, amelyet kiválasztottunk a sokszorozásra [az (első szubszegmentum), és a (harmadik szubszegmentum), kiválasztása alapján] úgy választjuk meg, hogy a (második szubszegmentum),,. legalább 30 és előnyösebben legalább körülbelül 50 nukleotidot tartalmazzon. Ez lehetővé teszi a (második szubszegmentum),cr vagy a (második szubszegmentum),, használatát a sokszorozott nukleinsavpróbák céljára szánt RNS-termékben, amelyben nem lesznek olyan szekvenciák, amelyek a primer szubszegmentumok bármelyikének szekvenciáját átfednék.
Jóllehet a bakteriofág DNS-fíiggő RNS-polimeráz 1000 bp-nál hosszabb templátokat is tud használni, transzkripciós hatékonysága a templát hosszával csökken. Tehát előnyösen az 1000 bázisnál rövidebb célszegmentumokat alkalmazzuk.
Előnyös, ha az RNS-szintéziséhez használt primerekkel azonos primerkészletet használunk a TAS második ciklusában történő RNS-termeléshez. Az RNS előállítását leíró részben leszögezzük, hogy a primerpár nem fedheti egymást. A találmány szerinti eljárás kivitelezésénél, amikor RNS termelése a kívánt, lehetőség van arra, hogy a célszegmentum szubszegmentuma, melynek szekvenciája az (5’-primer szubszegmentum)4 szekvenciával komplementer, a (3’-primer szubszegmentum)! szekvenciával komplementer célszegmentum szubszegmentumától 5’ irányban helyezkedjék el, és ezt ne fedje. Hasonlóképpen kívánatos, hogy a (3’-primer szubszegmentum)3-mal azonos szekvenciájú célszegmentum-szubszegmentum 3’ irányban helyezkedjék el az (5’-primer szubszegmentum)2-vel azonos szekvenciájú célszegmentum-szubszegmentumtól, és ezt ne fedje. Ez a stratégia előnyös lehet, mivel csökkenti a különböző primerek versengését az azonos helyekért, és jelentősen fokozhatja a találmány szerinti amplifikáció
HU 216 317 Β hatékonyságát. Ahol előadódik bizonyos átfedés az egymásba illő primerkészletek között, előnyös, ha teljesen eltávolítjuk a primerek fel nem használt első készletét, mielőtt a második készletet használnánk.
A jelen találmány középpontjában állnak a bakteriofág eredetű DNS-függő RNS-polimerázok, mivel bizonyos promoterekre erősen specifikusak. A találmány szerint más olyan polimerázok is - amelyek hasonló erős specifitással rendelkeznek bizonyos promoterekkel szemben - felhasználhatók a bakteriofág polimerázok helyett és az ilyen más polimerázok is a találmány körébe tartalomnak.
Az előnyös bakteriofág DNS-függő RNS-polimerázok a T7-ből, T3-ból és SP6-ból származnak. Az ezen polimerázokkal előnyösen felhasználható promoterek leírása a példákban és az igénypontokban található meg, de számos más olyan promoter is ismeretes ezen a szakterületen, amelyeket ezekhez a polimerázokhoz használhatunk.
Ezenkívül, a három előnyös bakteriofágon kívül más bakteriofágok és az ezek által felismert promoterek is alkalmazhatók a találmány értelmében.
Előnyös, ha a találmány eljárásaiban DNS-polimeráz gyanánt reverz transzkriptázt használunk, és olyan DNSpolimerázt, amelynek nincs 5’ —> 3’ exonukleáz aktivitása. A legelőnyösebb, ha az eljárás minden lépéséhez egyetlen DNS-polimerázt használunk. A legelőnyösebb DNS-polimerázok közé tartoznak az AMV reverz transzkriptáz és a rekombináns MMLV reverz transzkriptáz. (AMV=avian myeloblastosis vírus; MMLV= Moloney murine leukémia vírus). Egyébként más polimerázok is elfogadhatók, ilyen a Thermus aquaticusból származó hőstabil DNS-polimeráz [Chien és munkatársai, J. Bacteriol., 127,1550 (1976)], a Sequenase™ márkanevű rekombináns T7 DNS-polimeráz (U.S. Biochemicals Corp., Cleveland, Ohio, USA) és az E. coli DNS-polimeráz I jól ismert Klenow-fragmentuma, továbbá a boqútimusz DNS-polimeráz-a.
A „variábilis szubszegmentumok”-nak, amelyek alkalmanként a különböző primerekhez tartoznak, három funkciójuk van. Valójában sokkal helyesebb volna, ha ezeknek a „több célra használható szubszegmentumok” elnevezést adnánk. Először: ami az első és a harmadik prímért illeti - amelyek a promotereket tartalmazzák előnyös, ha a promoter szubszegmentumok olyan transzkripcióindító szekvenciákat tartalmaznak, amelyek a promotemek megfelelő RNS-polimeráz részére előnyösek. Másodszor: minden primerre nézve igaz, hogy egy variábilis szubszegmentum - adott esetben BMV promoter
20 egy olyan egyedi szegmentumot tartalmazhat, amely által a sokszorozás révén kapott RNS-terméket egy nukleinsavpróba hibridizációs vizsgálatban észlelhetjük. Valóban, a sokszorozás és a vizsgálat (az ampli5 fikáció és az assay) egyszerre végezhető számos különböző célszegmentumnál, ha olyan primerkészleteket használunk, amelyek ugyan felismerő szegmentumaikban különböznek [például: (3’-primer szubszegmentum)!], de egy közös variábilis szubszegmentumot tar10 talmaznak. A variábilis szubszegmentum olyan polilinker szekvenciát tartalmazhat, amely alkalmas módon sok restrikciós helyet tartalmaz az ezután következő klónozás megkönnyítéséhez. Végül, a variábilis szubszegmentumokat felhasználhatjuk amplifikációs szek15 venciáknak az RNS-termékbe való beépítéséhez. Ezek a szekvenciák ahhoz szükségesek, hogy lehetővé tegyék az RNS-termék autokatalitikus replikálódását bakteriofág eredetű RNS-specifikus RNS-polimeráz segítségével, mint amilyen a QB replikáz (Miele és munkatársai, lásd fent) és a BMV szekvenciák, amelyek a növényi vírus RNS-3 kromoszómából - ez segíti elő a burok mRNS-szintézisét - származnak. [Lásd: Ahlguist és munkatársai, J. Mól. Bioi., 172, 369 (1984); Ahlguist és munkatársai, Plánt Mól. Bioi., 3, 37 (1984); Ahlquist és munkatársai, J. Mól. Bioi, 153, 23 (1981); Miller és munkatársai, Natúré, 313, 68 (1985); Miller és munkatársai, Virology, 125, 236 (1983); Ou és munkatársai, PNAS, 79, 5235 (1982)].
A szakterületen ismert QB replikáz esetében ezt elő30 nyösen úgy hajtjuk végre, hogy a (variábilis szubszegmentum)2-be beépítjük az ’-CGCGCTCTCCC AGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGTGC-3’ szekvenciát és a (variábilis szubszegmentum))-be az 5’-TGGGGAACCC35 CCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3’ szekvenciát. Ezután replikáljuk (autokatalitikusan) az első RNS-terméket (lásd az 1. ábrán az RNS I-et; lásd még a 4. ábrát), vagy a (variábilis szubszegmentum)4-be bevisszük az 5’-CGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTC40 GAGAAGAGGCGCGACCTTCGTGC-3’ szekvenciát és a (variábilis szubszegmentum)3-ba az 5’-TGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3’ szekvenciát, majd ezután (autokatalitikusan) replikáljuk a második RNS-terméket (lásd a 2. ábrán az RNS Il-t;
lásd még a 4. ábrát).
A szintén ismert BMV replikáz esetében előnyösen úgy járunk el, hogy az alábbi BMV szekvenciát bevezetjük a variábilis szekvencia 2-be (1-25 bázis; a HIVre vonatkozó példa - lásd alább - speciális esetében):
TCS=87-29 (HlV-specifikus)
40 50
5’-AAGATCTATGTCCTAATTCAGCGTA/ACAGCATATGTATGTTCAGGGAAAGCTA-3’ (54 bázis), mint magszekvenciát, ezenkívül 5’-nél AU használandó. Az első primer, amit ezen második prigazdag szekvenciát használhatunk a BMV replikáz ak- 55 merrel használunk, a T7-en alapuló HIV-specifikus pritivitás fokozására. Ez az oligomer második primerként mer.
T7 promoter TCS=87-34 +1S 20 30 40 50
III I I I
T AAT ACGACTCACTATA/GGGA/CACCTAGGGCTAACTATGTGTCCTAAT AAGG (52. bázis).
HU 216 317 Β
Az alábbi példákban közölt részletek, amelyek a találmány megértését segítik elő, nem korlátozzák a találmány oltalmi körét.
I. példa
Egy betegtől, akinél felmerült a gyanú, hogy 1-es típusú humán immunelégtelenség vírussal (HIV-1) fertőződött, leveszünk 10 ml vért, s ezt Sepracell™ készülékkel (Sepratech Corp., Oklahoma City, Oklahoma, USA) vagy - más módon - Ficoll grádiensben frakcionáljuk limfociták izolálása céljából. A limfocitákat ezután lizáljuk és a belőlük származó nukleinsavat extraháló készülékkel (Molecular Biosystems, Inc., San Diego, Califomia, USA) izoláljuk, vagy egy másik módszer szerint, standard nátrium-dodecil-szulfát (SDS)-enzim kezelésnek vetjük alá a limfocitákat, és a nukleinsavat DEAE cellulózon, reverz fázisú kromatográfiával izoláljuk. A következőképpen járunk el.
A sejteket lecentrifugáljuk (5000 ford/perc; 4 perc; 1 ml trisszel pufferolt konyhasóoldat (TBS), pH=7,5). A felülúszót leszívatjuk;
Az üledéket a következő összetételű oldatban reszuszpendáljuk:
500 μΐ 0,3 M NaCl/20 mM trisz, pH=7,5
100 μΐ 2%-os SDS
200 μΐ 5 mg/ml proteináz K
200 μΐ 0,25 M EDTA
Az oldatokat jól összekeverjük, majd hozzáadjuk az üledékhez. A szuszpenziót Vortex-készülékben tárjuk fel és 50 °C-on 45 percig inkubáljuk, miközben minden 10 percben 10-15 másodpercig működtetjük a készüléket.
Az anyagot rávisszük az extraktor oszlopra és hagyjuk, hogy behatoljon.
Az oszlopot 1x4 ml 0,3 M NaCl/20 mM trisz (pH=7,5) oldattal mossuk.
A DNS/RNS kioldását 4 ml 0,5 M NaCl/20 mM trisz (pH=7,5) oldattal végezzük.
Az eluátumhoz hozzáadjuk a következő összetételű, előzőleg jól összekevert oldatot:
μΐ glikogén
400 μΐ 3 M Na-acetát
9,0 ml jéghideg etanol.
A kicsapás -20 °C-on egy éjszakán át folyik. Használhatunk egyórás szárazjég/etanol fürdőt is.
Az RNS/DNS-t 15 percig 10 000 ford/perc mellett lengő hüvelyes rotorban centrifugáljuk; az etanolt leöntjük és szárazra szívatjuk itatással (kimwipe); 2 perc.
Liofilezés következik; 10 perc.
Az üledéket 170 μΐ TE pufferben reszuszpendáljuk.
Az elegyet 37 °C-on inkubáljuk; 5 perc.
Megtöltünk egy 1 ml-es centrifugaoszlopot (spin column) a következőképpen:
Egy 1 ml-es fecskendőt kevés üveggyapottal (autoklávozott) bedugaszolunk;
A fecskendőt megtöltjük dietil-pirokarbonáttal (DEPC) kezelt TE-oldattal (trisz-EDTA);
Gyorsan hozzáadjuk a Sephadex G-50 fine (TE-oldatban autoklávozva) oszloptöltetet;
Az adagolást addig folytatjuk, amíg a szilárd mátrix ki nem dudorodik a fecskendő tetején;
Centrifugálás következik IEC asztali centrifúgában, 1000 ford/perc mellett 30 másodpercig;
Mosás 100 μΐ TE-pufferrel, centrifugálás 1 percig közepes sebességgel (körülbelül 1000 ford/perc);
A mosófolyadékot elöntjük;
A kivonatot rávisszük az oszlopra. Újból 1 percig centrifugálunk;
Mosás 150 μΐ TE-pufferrel, centrifugálás 1000 ford/perc mellett 1 percig. A mosófolyadékot és az első frakciót egyesítjük. Ennél a lépésnél mintákat lehet készíteni több reakcióhoz;
A poolhoz 1/10 térfogat 8 M lítium-klorid-oldatot adunk és elkeverjük 2,5 térfogat 100%-os etanollal. Vortex-készülékben jól homogenizáljuk az elegyet;
Kicsapás következik szárazjég/etanol fürdőben 30 percig;
Centrifúgálás 15 percig nagy sebességgel 4 °C-on mikrofugában;
Az üledéket szárítjuk;
Izolálás után a mintában lévő össznukleinsavat 100 μΐ TE-pufferben (10 mM trisz.HCl, 1 mM EDTA, pH=8) oldjuk fel. Az össznukleinsavat tartalmazó 100 μΐ-ből 10 μΐ-t 100 μΐ végtérfogatra töltünk fel, ami az alábbi összetevőket tartalmazza:
mM trisz.HCl (pH=8) mM NaCl lOmM MgCl2 mM ditiotreitol (DTT) mM spermidin
100 pg/ml marha-szérumalbumin
400-400 mM dATP, dCTP, dGTP és dTTP 30 nM primer A, amely 101 bázisból álló 5’GAACGCGGCT ACAATTAATA CATAACCTTA TGTATCATAC ACATACGATT TAGGTGACAC TATA GAATAC TTTCGTAACA CTAGGCAAAG GTGGCTTTAT C -3’-szekvenciájú egyszálú DNS, nM primer B, mely egy 29 bázis hosszú DNS következő szekvenciával: 5’-ACACCATATG TATGTTTCAG GGAAAGCTA-3’. A primer B-nek - ez a második primer - szekvenciája a HIV-1 SOR génjének [Ratner és munkatársai: Natúré 313, 277 (1985)] 5151-5179 bázisaiból áll. A második primemek megfelelő alternatív szegmentumnak - amely a HIV-1 SOR génjében az 5357-5387 bázisoknak felel meg - a következő a szekvenciája:
5’-GCACACAAGT AGACCCTGAA CTAGCAGACC A-3’, s ha ezt használjuk, akkor ebből is 30 nM-t adunk az elegyhez. A primer A az első primer; ennek 645’ nukleotidja képezi az SP6 DNS-függő RNS-polimeráz egy promoterének pluszszálát. Ennek 5’-GAATAC-3’ szekvenciájú szegmentuma az (alternatív szubszegmentum), amely tartalmazza a transzkripció starthelyét (5’-G) és más olyan bázisokat, amelyeket feltehetően előnyben részesít az SP6 RNSpolimeráz az általa átírt szekvenciák 5’ végénél. Végül a 31 3’-terminális nukleotid képezi a (primer szubszegmentum),-et, és ez a szekvencia komplementer egy HIV-l-ből izolált SOR génben lévő 5577-5547 bázis11
HU 216 317 Β ból álló szekvenciával [a teljes szekvenciára nézve lásd: Ratner és munkatársai, Natúré, 313, 277 (1985)]. (Az izolált HIV-et ezekben a példákban HÍV-1-nek nevezzük).
Megjegyezzük, hogy a példákban felhasznált összes oligonukleotidot az Applied Biosystems, Inc. (Foster City, California, USA) automata szintetizátorával (Model No. 380A), szilárd fázisú szintézissel állítottuk elő és lényegében homogenitásig tisztítottuk HPLC-vel, C8 reverz fázisú oszlop használatával. Emellett más, kereskedelemben kapható szintetizátorok és standard tisztítási eljárások is használhatók az oligonukleotidok előállítására.
A 100 μΐ-nyi oldatot 65 °C-on hevítjük 2 percig, majd 1 perc alatt 42 °C-ra hűtjük le. Ha a hevítést, majd a 42 °C-on vagy efölött való tartást és az oldat összetételét megfelelően kombináljuk egymással, úgy eléggé szigorúan meghatározott feltételeket biztosítunk ahhoz, hogy elősegítsük a (3’-primer szubszegmentum)| jó stabilitással történő hibridizációját annak érdekében, hogy meginduljon a (3’-primer szubszegmentum)i szekvenciájával komplementer DNS-szekvencia szintézise nagy specifitással.
Ezután az AMV (avian myeloblastosis vírus) reverz transzkriptázból 10 egységet vagy a rekombináns MMLV (Moloney murine leukémia vírus) reverz transzkriptázból 500 egységet [a Life Science, Inc., cégtől (St. Petersburg, Florida, USA) szereztük be] adunk az oldathoz, amelyet 10 percig 42 °C-on inkubálunk. [Egy egység az az enzimmennyiség, amely szükséges ahhoz, hogy 1 nM TTP-t (timidin-trifoszfát) savval precipitálható formává alakítson 10 percen belül 37 °C-on, poIi(A).oligo(T)|2_ix mint templát-primer használatával [Houts és munkatársai, J. Virol., 29, 517, (1979)]. A 10 percig tartó inkubálás után az oldatot 1 percre forró vízfürdőbe helyezzük. A hevítés a reverz transzkriptáz hatására képződött duplexben a szálakat szétválasztja.
Ezután az oldatot 42 °C-on hűtjük 1 percig. A hűtés alatt a második primer a célszegmentum komplementerének 3’-terminális szegmentumával hibridizál, amely a reverz transzkriptáz által katalizált reakcióban képződött. Ezek a hibridizációs körülmények ugyancsak elég szigorúan meghatározottak ahhoz, hogy megfelelően specifikus hibridizáció jöjjön létre a második primer és a második primer szekvenciájával komplementer szekvencia között.
Lehűtés után további 10 egység AMV reverz transzkriptázt vagy további 500 egység klónozott MMLV reverz transzkriptázt adunk a reakcióelegyhez és tovább inkubáljuk 10 percig 42 °C-on.
Ezután RNasinR márkanevű ribonukleáz inhibitorból (Promega Biotec, Madison, Wisconsin, USA) annyit adunk a reakcióelegyhez, hogy koncentrációja 1 egység legyen ml-enként. [1 egység az inhibitor azon mennyisége, amely szükséges ahhoz, hogy 5 ng ribonukleáz A aktivitását 50%-ban gátolja; Roth, A.: Meth. Cancer Rés., 3, 151 (1976)]. Ezután mindegyik ribonukleozid-5’-trifoszfátból - ATP, GTP, CTP és UTP 400 mM - adunk az elegyhez. Végül az SP6 DNS-függő RNS-polimerázból (Promega Biotec) 10-20 egység közötti mennyiséget adunk az elegyhez. A kapott oldatot 42 °C-on 30-60 percig inkubáljuk [1 egység az RNS-polimeráz azon mennyisége, amely szükséges ahhoz, hogy 1 nmol ribonukleozid-trifoszfát savval oldhatatlan termékké való átalakulását katalizálja 60 perc alatt 37 °C-on, standard reakciófeltételek mellett (40 mM trisz.HCl, pH=7,9, 6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM spermidin, 0,5-0,5 mM ATP, GTP, CTP és UTP, 0,5 Ci 3H-CTP, 1 g SP6 DNS és az enzim 50 μΐ össztérfogatban)].
Ezután az alábbi oligonukleotidokból annyit adunk a reakcióelegyhez, hogy koncentrációjuk 30 nM legyen.
Harmadik primer:
5’-GAACGCGGGCT ACAATTAATA CATAACCTTA TGTATCATAC ACATACGAAT TAGGTGACAC TATA GAATAC ACTAATTCAT CTGTATTACT TTGACTGTTT TTC-3’
Negyedik primer:
A harmadik primerben - úgy, mint az elsőben - az 5’-terminális 64 bázis alkotja a promoter szegmentumot, a következő 6 bázis a variábilis szegmentumot. A variábilis szegmentum az első hat olyan bázis, amely a promoter révén átíródik az SP6 RNS-polimeráz segítségével, és ezeket a bázisokat választjuk ki a transzkripció szintjének a fokozására. Végül a harmadik primer (3’-primer szubszegmentum)3-ból álló része egyenlő azzal a 3’-terminális 33 bázissal, amelyek szekvenciája ugyanaz, mint a HIV-1 SOR gén rövid nyílt leolvasási keretében lévő 5388-4520 bázisoké. A negyedik primer szekvenciája a HIV-1 SOR gén 5546-5517 bázisaival komplementer.
A harmadik és negyedik primer hozzáadása után az oldatot 42 °C-on 1 percig inkubáljuk. Ezalatt az idő alatt hibridizáció megy végbe a harmadik primerben lévő (3’-primer szubszegmentum)3 és az SP6 RNSpolimeráz által katalizált reakcióban keletkezett első RNS között. A hibridizációs feltételek szigorúsága következtében a (3’-primer szubszegmentum)3 nagy specifitással hibridizál - elégséges stabilitással ahhoz, hogy DNS-szintézist indítson - az első RNS-ben lévő komplementer szekvenciájú szegmentummal.
Inkubálás után 10 egység AMV reverz transzkriptázt vagy 500 egység klónozott MMLV reverz transzkriptázt adunk az oldathoz, amelyet ekkor 10 percig inkubálunk 42 °C-on, s így képződik a harmadik komplementer DNS.
Az oldatot ezután forró vízfürdőbe mártjuk 1 percre, majd 42 °C-ra hűtjük 1 perc alatt, egyrészt, hogy a duplexet a harmadik komplementer DNS és az első RNS között egyszálúvá alakítsuk, másodszor, hogy elősegítsük a negyedik primer és a harmadik komplementer DNS közti hibridizációt. Mint a többi hibridizációnál, úgy a feltételek itt is megfelelő szigorúsággal vannak meghatározva ahhoz, hogy nagy specifitással menjen végbe a negyedik primer hibridizációja - és elégséges stabilitással a DNS-szintézis megindításához - a negyedik primer szekvenciájával komplementer szekvenciájú harmadik komplementer DNS-szegmentummal.
Ezután újból 10 egység AMV reverz transzkriptázt vagy 500 egység klónozott MMLV reverz transzkriptázt adunk az oldathoz és 10 percig 42 °C-on inkubáljuk.
Ekkor annyi RNasinR ribonukleáz inhibitort adunk az elegyhez (kívánt esetben), hogy 1 egységet tartalmazzon ml-enként, majd 10-20 egység SP6 RNS-polimerázt, ezután az oldatot 30 perc-1 óra időtartam alatt 42 °C-on inkubáljuk.
Ezután a kapott második RNS-nukleinsavszonda hibridizációs technikával kimutatható.
II. példa
Az I. példában leírt eljárást - egy alábbi módosítással - alkalmazzuk a következő három mintánál: (A) 10 ml biztosan HIV-mentes humán vér, (B) 10 ml sejttenyészet, mely körülbelül 103 HÍV-1-gyei fertőzött sejtet tartalmaz ml-enként és (C) valószínűleg HÍV-1-gyei fertőzött személytől származó 10 ml vér. Az eljárás módosítása abban áll, hogy egy a-32P-jelzett ribonukleozid-trifoszfát vesz részt szubsztrátumként a második RNS előállítására szolgáló, SP6 RNS-polimeráz által katalizált reakcióban. A második RNS ennek megfelelően 32P-vel jelzett.
Makroporózus Sephacryl-S500™ szemcséket reagáltatunk karboxilcsoporttal végződő linkerrel (képlete: -C(=NH)NH(CH2)5CO2-), majd 5’-(6-aminohexil-foszforamidát)-tal kezelt olyan 5’-TGGTCTGCTA GTTCAGGGTC TACTTGTGTG C-3’ szekvenciájú oligonukleotiddal, amely a HIV-1 SOR gén 5357-5387 bázisaival komplementer. (A SOR gén 4901-4932 bázisaiból álló szekvencia minden második olyan RNSben előfordul, amely a mintából származó nukleinsav sokszorozása során keletkezik). A szemcsék előállítását a 895,756 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (benyújtva 1986. augusztus 11-én) írja le. Röviden: a hordozóanyag vagy porózus szilikát üveg vagy aminocsoport végződésű linkerrel reagáltatott makroporózus térhálós dextrán, amelyben lényegében minden olyan aminocsoportot, amely foszforamidát-csoporton keresztül nincs kovalens kötésben a befogópróba terminális nukleozidjával, úgy blokkolnak, hogy nem specifikusan reagáltatják alifás acilcsoportot tartalmazó nukleinsawal; a bróm-ciánnal aktivált makroporózus térhálós dextrán aminokkal reagál, s így kötődik amino-alkil-foszforamidát oligonukleotid származékhoz; a porózus szilikát üveget, a makroporózus térhálós dextránt vagy divinil-benzol-térhálós polisztirolt karboxil- vagy szukcinimid-észter végű linkénél reagáltatják, ahol a karboxilcsoportok egy része amidkötéssel kapcsolódik egy diamino-alkán egyik aminocsoportjához, másfelől a másik aminocsoport mely része egy foszfor-amidátnak - közvetlenül kötődik a befogópróba terminális nukleozidjához. Előnyös hordozóanyag a hosszú szénláncú alkil-aminnal reagáltatott és a karboxilcsoporttal reagáltatott ellenőrzött porózus üveg, melyet a Pierce Chemical Co., (Rockford, Illinois, USA) szemcsés formában hoz forgalomba, termékszámúk 24875, illetve 23735, névleges pórusátmérő 500 Á, a részecskék átmérője 125-177 mikron, továbbá a Sephacryl S-500, melyet a Pharmacia Inc., (Piscataway, New Yersey, USA) szemcsés formában hoz forgalomba 17-0475-01 kódszám alatt, nedves átmérője 40-105 mikron, kiszorítási térfogata dextránokra körülbelül 2,107 molekulatömeg felett van. Az említett Sephacrylt bróm-ciánnal vagy amino- vagy karboxilcsoport végű linkerrel reagáltatják.
A következő szilárd hordozókat ismertetjük: (A) Porózus szilikát üveg, amelyből szilikonok segítségével az alábbi képletű csoportokkal készítünk származékot:
-(CH2)n(NH)(CO)(CH2)cCH3 és
-(CH2)n(NH)(PO2)O-(Oligo), lényegében szilikon nélküli származék egy aminocsoporttal végződő csoporttal, ahol c jelentése 0-5, n jelentése 2-8, az -O-(Oligo) oligonukleotidpróbát jelent és az (Oligo)-hoz kötött oxigénatom a szonda 5’nukleozidjának 5’-oxigénje vagy 3’-nukleozidjának 3’oxigénje, vagy
-(CH2)n(NH)(CO)(CH2)mCO2H és
-(CH2)n(NH)(CO)(CH2)m(CO)(NH)(CH2pNH(PO2)O-(Oligo), amelyekben m, n és p azonosak, vagy egymástól különböznek, és értékük egyenként 2-8 lehet; vagy (B) makroporózus térhálós dextrán alapanyag, melyből hidroxil oxigéneken keresztül - ezek az oxigének cukorrészek szénatomjaihoz kapcsolódnak, ahol a szomszédságban legalább egy szénatomon átalakítatlan hidroxicsoport van - az alábbi képletű csoportokkal készítünk származékot:
-C(=NH)NH(CH2)q(NH)(CO)(CH2)cCH3 és
-C(=NH)NH(CH2)p(NH)(PO2)O-(Oligo), lényegében hidroxil oxigén nélkül, aminocsoporttal végződő csoporttal készített származék, vagy
-C(=NH)NH(CH2)qCO2H és
-C(=NH)NH(CH2)q(CO)(NH)(CH2)p NH(PO2)O(Oligo), melyben s és p azonos vagy különbözik és s 2-10 lehet. Lásd Ghosh és munkatársai, Nucl. Acids Rés., 15, 5353 (1987).
A fent leírt módon átalakított Sephacryl szemcsékből három 50 mg-os tételbe 15 perc alatt 37 °C-on beitatunk 250 μ prehibridizációs oldatot, melynek összetétele a következő: 0,1% SDS, 10% dextrán-szulfát, 1 mg/ml lazacsperma DNS és 5 χ SSPE (0,75 mól NaCl, 50 mmol NaH2PO4, pH=7,4, 5 mmol EDTA). Beitatás után a szemcsés anyagot centrifúgálással ülepítjük és a prehibridizáló oldatot leszívatjuk.
A három mintán végzett sokszorozóeljárásból származó nukleinsavat etanolos kicsapással izoláljuk, majd feloldjuk 250 μΐ olyan oldattal, amely azonos a prehibridizációs oldattal, de nem tartalmaz lazacsperma DNS-t. A kapott nukleinsavoldatokat ezután összehozzuk egy tétel előhibridizált oligonukleotiddal átalakított Sephacryl szemcsével és a kapott keveréket óvatos keverés mellett 42 °C-on 90 percen át inkubáljuk.
A Sephacryl szemcséket ezután centrifúgálással ülepítjük, a hibridizációs oldatot leszívással eltávolítjuk és a szemcséket ezután háromszor mossuk 10-10 percig 37 °C-on 1-1 ml 2xSSC oldatban (0,30 mól NaCl, 0,03 mól nátrium-citrát, pH=7,0). Minden mosás után
HU 216 317 Β centrifiigálással ülepítjük a szemcséket és az oldatot leszívással távolítjuk el.
A harmadik mosás után azonnal Cerenkov-számlálásnak vetjük alá a szemcséket.
Az A mintából származó sokszorozott nukleinsavat hordozó szemcséknél alacsony beütési számot kapunk, mely alig haladta meg a szcintillációs folyadék háttérszámait. A B mintából származó sokszorozott nukleinsavat hordozó szemcséknél sokkal magasabb volt a beütések szintje, mint amit az A mintával kapcsolatban figyeltünk meg. A C mintából származó sokszorozott nukleinsavat hordozó szemcséknél a beütési szám szignifikánsan magasabb volt, mint amit az A mintából származó szemcséknél kaptunk, s ez azt jelenti, hogy az a személy, akitől vért vettünk a C mintához, HÍV-1-gyei fertőzött.
III. példa
Az I. és II. példa eljárásaiban T7 RNS-polimerázt (Promega Biotec) alkalmaztunk SP6 RNS-polimeráz helyett mind az első primer 5’-(promoter) [-(variábilis szubszegmentum)i-3’ szubszegmentumánál, mind az 5’-TAATACGACT CACTATA GGGA-3’ szekvenciájú harmadik primer 5’-(promoter)3-(variábilis szubszegmentum)3-3 ’ szubszegmentumánál, amelyben a 17 5’-terminális bázis a promoter szubszegmentum és a 43’-bázis variábilis szubszegmentum. A variábilis szegmentum a promoterből átírt négy 5’-terminális bázisnak felel meg. Ribonukleáz inhibitort ebben az eljárásban egyik lépésnél sem használtunk, legfeljebb a Promega Biotectől származó polimeráz készítménynél.
IV. példa
Az I. és II. példa szerinti eljárásokban T3 RNS-polimerázt (Stratagene, San Diego, Califomia, USA) használtunk az SP6 RNS-polimeráz helyett és a következő szegmentumot használtuk az első primer (promoter),(variábilis szubszegmentum), szubszegmentuma és a harmadik primer (promoter)3-(variábilis szubszegmentum)3 szubszegmentuma gyanánt: 5’-TATTAACCCT CACTAAA GGGA-3’, amelyben a 17 5’-terminális bázis a promoter szegmentum és a 43’-bázis a variábilis szegmentum, beleértve a promoter átirataiban lévő 5’terminális 4 bázist.
V. példa
A III. példában leírt módon T7 RNS-polimerázt alkalmazva emberi vérmintákból származó HÍV genomjában lévő célszegmentumot amplifikálunk az I. példa szerinti primerek helyett a következő primereket alkalmazva:
Első primer: 5’-TAATACGACT CACTATA GGGA TCTAATTACT ACCTCTTCTT CTGCTAGACT-3’, ahol a 3O3’-terminális bázis szekvenciálisán komplementer a HIV-1 ENV génjének 7076-7047. bázisaival.
Második primer: 53’-ACAAGTTGTA ACACCTCAGT CATTACACAG-3’, a HIV-1 ENV génjének 6838-6866. bázisszekvenciájával.
Harmadik primer: Ugyanaz a 21 5’-terminális bázis, mint az ebben a példában megadott első prímeméi, a következő 27 3’-terminális bázishoz csatlakozva: 5’AAAGGTATCC TTTGAGCCAA TTCCCATA-3’, ami a HIV-1 ENV génjének 6875-6902. bázisszekvenciájával rendelkezik.
Negyedik primer: 5’-AGTTGATACTACTGGCCTAATT-3’, a HIV-1 ENV génjének 7033-7007. bázisszekvenciájával komplementer.
VI. példa
A T7 RNS-polimeráz alkalmazása mellett - mint a III. példában - a humán vér mintákból származó HÍV genomjában lévő célszegmentumot a következő primerek használatával (az I. példában meghatározott primerek helyett) sokszorozzuk:
Első primer: 5’-TAATACGACT CACTATA GGGA TCTAATTACT ACCTCTTCTT CTGCTAGACT-3’, melyben a 303’-terminális bázisból álló szekvencia a HIV-1 ENV génjének [Ratner és munkatársai: Natúré, 313, 277 (1985)] 7076-7047. bázisaiból álló szekvenciával komplementer.
Második primer: 5’-ACAAGTTGTA ACACCTCAGT CATTACACAG-3’, s ez a szekvencia a HIV1 SOR génjében lévő 5151-5179. bázisokból álló szekvenciával azonos.
Harmadik primer: 5’-terminális nukleotidjai azonosak az V. példa első és harmadik primeijének 21 nukleotidjával, s ehhez a következő 31 3’-terminális nukleotid kapcsolódik: 5’-AAGAATAAGTTCAGAAGTACACATCCCACT-3’, mely szekvencia azonos a HÍV SOR génjének 5220-5249. bázisaiból álló szekvenciával.
Negyedik primer: 5’-TGGTCTGCTAGTTCAGGGTCTACTTGTGTC-3’, s ez a szekvencia a HIV1 SOR génjének 5387-5357. bázisait tartalmazó szekvenciával komplementer.
VII. példa
Az I. példában leírt eljárást alkalmazzuk nukleinsavak izolálására 1) olyan mintából, mely 103 HIV-vel fertőzött CEM sejtet tartalmaz 106 nem fertőzött CEM sejttel (Cancer Center Research Foundation; CCRF-CEM; ATCC No. CC1119) keverve és 2) olyan mintából, amely 106 nem fertőzött CEM sejtet tartalmaz. Az Extractor™ oszlopról (MBI) kapott minta koncentrálására végzett etanolos kicsapási lépés után a mintákat 100 μΐ trisz.HClt (pH=7,4) és 1 mM EDTA-t tartalmazó oldatban (TEpuffer) reszuszpendáljuk. A reszuszpendált mintákat Sephadex G-50 fine töltetű centrifugaoszlopon frakcionáljuk (Maniatis, lásd fentebb) és TE-pufferrel eluáljuk. A kioldott mintákat etanolos kicsapással koncentráljuk (0,8 ml lítium-kloridot tartalmazó oldatban 3 térfogat etanollal; 15 percig szárazjég/etanol fürdőben). A kicsapott mintát centriíugálással ülepítjük. Az üledéket leszívjuk, szárítjuk, majd 100 μΐ 40 mM trisz.HCl (pH=8,l), 8 mM MgCl2, 25 mM NaCl, 2 mM spermidin, 5 mM DTT, 100-100 μΜ dATP, dGTP, dCTP és dTTP, 1-1 mM rATP, rCTP, rGTP és rUTP, 100 μg/ml BSA (nukleázmentes) és 250 nM DNS-oligonukleotid primer A: (5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGACACCTAGGGCTAACTATGTCCTAATAAGG-3’) és 250 nM DNS-oligonukleotid primer B:
HU 216 317 Β (5’-ACACCATATGTATGTTTCAGGGGAAAGCTA-3’) tartalmú oldatban reszuszpendáljuk.
Kontrollként két párhuzamos tisztított HÍV RNS mintát használunk 0,01 fM (fentomól = 10 15 mól) koncentrációban, 100 pl fent leírt pufferben reszuszpendálva. Végül 10 fM β-globin szekvenciát - a ΗΒ 19A plazmid tartalmazza [Wallace és munkatársai, Nucl. Acids Rés., 9, 3647 (1981)] - HindlII-mal linearizálunk és 100 μΐ fent leírt pufferban - az oligonukleotidok nélkül - reszuszpendáljuk. Az oligonukleotid primer D-ből (5 ’-ACATTGCTTCTGACACAACTGTGTTCA-3 ’) és az oligonukleotid primer C-ből (5’-TAATACGACTCACTATAGGGACAAAGGACTCAAA-3’) - a primerek a B-globin szekvenciára specifikusak 250-250 mM-t adunk a β-globin reakcióhoz.
A B-globin mintát kivéve a reakcióelegyeket 65 °Con hevítjük 1 percig. A B-globin mintát 1 percig forraljuk. Mindegyik mintát 42 °C-on hűtjük 1 percig, ezután 10 egység AMV reverz transzkriptázt adunk a mintához. A reakcióelegyeket 15 percen át 42 °C-on inkubáljuk, 1 percig forraljuk, majd 1 percig 42 °C-on hűtjük. Ezután újból 10 egység AMV reverz transzkriptázt adunk a reakcióhoz, s 42 °C-on 15 percig inkubálunk. A reakcióhoz 100 egység T7 RNS-polimerázt adunk, s az elegyeket 37 °C-on 30 percen át inkubáljuk.
A mintákat 1 percig forraljuk és 1 percig 42 °C-on hűtjük, majd 10 egység AMV reverz transzkriptázt adunk hozzájuk. A reakcióelegyeket 42 °C-on 15 percig inkubáljuk, 1 percig forraljuk és 42 °C-on 1 percig hűtjük. Újból 10 egység reverz transzkriptázt adagolunk, s ezt követően 42 °C-on 15 percen át inkubálunk. Ezután 100 egység T7 RNS-polimerázt adunk a reakcióhoz és 30 percig 37 °C-on inkubálunk. ezt a ciklust még kétszer megismételjük.
A megsokszorozott célszekvenciát ezután az alább leírt módon OligoBeads™ használatával észleljük.
HIV-1 specifikus oligonukleotidokat tartalmazó Sephacryl szemcséket készítünk - mint már leírtuk és TE-pufferben 4 °C-on olyan koncentrációban tároljuk a szuszpenziót, hogy 250 μΐ-ben 50 mg Sephacryl szemcsét tartalmazzon. Az oligonukleotidokat szintetizáljuk és HPLC-vel tisztítjuk a leírtak szerint.
Úgy a szemcsékhez való kötéshez, mint az észleléshez használt oligonukleotidok homológok a HIV-1 genom SOR szakaszával. Az ebben a vizsgálatban használt oligonukleotidok a következők:
86-31 (észlelési oligonukleotid) 5’-GCACACAAGTAGACCCTGAACTAGCAGACCA-3’ és 87-83 (befogott oligonukleotid a szemcsén) 5’-ATGCTAGATTGGTAATAACAACATATT-3’, amelyek a SOR szakasz értelmetlen (nonsense) szálával homológok, és mintegy 100 nukleotid választja el őket. Az észleléshez az oligonukleotidokat 32P-vel végjelezzük standard technika szerint. A be nem épült jelzőt Sephadex G-50 fíne oszlopon gélszűréssel távolítjuk el és az oligonukleotidot -20 °C-on tároljuk.
Egy tipikus, szemcsére alapozott szendvics hibridizációs rendszerben (BBSHS=bead based sandwich hybridization system) a célszekvenciát és a 32P-vel jelzett észlelendő oligonukleotidot Eppendorf-csőben μΐ 0,2% SDS-tartalmú TE-pufferben 65 °C-on 5 percig denaturáljuk. Ehhez hozzáadunk 10 μΐ 3 χ hibridizációs oldat keveréket (10xSSPE/10% dextrán-szulfát). Az oldatot összekeverjük, 2 másodpercig centrifugáljuk és 1 órán át 42 °C-on inkubáljuk.
Ez idő alatt a Sephacryl szemcsék prehibridizálódnak. A szemcse törzsoldatot jól felkeverjük és belőle 250 μΐ alikvot mennyiségeket (50 mg szemcse) viszünk át az Eppendorf-csövekbe és minden egyes kivétel közben jól felkeverjük, hogy a szuszpenzió egyenletességét biztosítsuk. Az alikvot részeket 10 másodpercig centrifugáljuk, a TE-oldatot Pasteur-pipettával eltávolítjuk. Miután hozzáadtuk a 250 μΐ hibridizáló oldatot [5 χ SSPE (0,9 M NaCl, 50 mM NaH2PO4, pH=7,4,1 mM EDTA), 10% dextránszulfát/0,1% SDS], a szemcséket óvatos rázással szuszpendáljuk és 37 °C-on 30-60 percig - időnként megkeverve - inkubáljuk. Közvetlenül a befogási lépés előtt a szemcséket 10 másodpercig centrifugáljuk, a prehibridizáló oldatot eltávolítjuk, hozzáadunk 80 μΐ hibridizáló oldatot 37 °C-on és a szemcséket újból 37 °C-ra állítjuk be.
A hibridizációs oldatot 2 másodpercig centrifugáljuk és átvisszük a szemcsékre plusz a hibridizáló oldatra. A szemcséket felszuszpendáljuk és 37 °C-on 1 órán át inkubáljuk gyakori keverés közben a szuszpenzió fenntartása érdekében.
A befogás után a szemcséket 10 másodpercig centrifugáljuk és a hibridizáló oldatot, amely a befogatlan célszekvenciát és a detektálandó oligonukleotidot tartalmazza, átvisszük a szcintillációs számláló fiolájába. A szemcséket ezután ötször mossuk 2 χ SSC oldattal 37 °C-on. Az első három mosás gyors; 1 ml mosófolyadékot adunk a szemcséhez, jól elkeverjük és 10 másodpercig centrifugáljuk. A mosófolyadékot átvisszük egy számláló csőbe. A végső két mosásnál 1 ml mosófolyadékot mérünk a szemcsékhez, elkeveqük és centrifugálás előtt 37 °C-on 5 percig inkubáljuk. Minden mosóoldatnál külön elvégezzük a számlálást, hogy az eljárást ellenőrizzük.
A hibridizáló oldat, az öt mosóoldat és a szemcsék Cerenkov-számlálását 5-10 percig végezzük. A számláló háttér-értékét minden mintánál levonjuk. Az észlelt célszekvencia fM mennyiségét a következőképpen számítjuk ki: (cpm a szemcséken/össz cmpm). fM oligonukleotid, ahol az ossz cpm a hibridizáló oldat, az öt mosóoldat és a szemcsék cpm-értékének az összege.
Sokszorozott célszekvencia észlelése BBSHS módszerrel
Célszekvencia Felhasznált μΐ Észlelt 10 15 mól (fM)
103 HIV-vel fertőzött sejt+ 0,33 0,06
106 nem fertőzött CEM sejt 0,66 0,13
106 nem fertőzött CEM sejt 0,07 0,14 0,7 10 0,01 0,015 0,01 0,08
0,01 fM HÍV RNS 0,007 0,014 0,14 0,29
10 fM β-globin DNS 10 0,014
VIII. példa
Az I. példa szerinti eljárást alkalmazzuk nukleinsavak izolálására két mintából: 1) 103 HIV-vel fertőzött CEM sejt 106 nem fertőzött CEM sejttel keverve; és 2) 106 nem fertőzött, tenyésztett CEM sejt, melyhez 0,01 fM tisztított HIV-et adunk extrakció után. Az eljárást ezután úgy módosítjuk, hogy az Extractor oszlop után további tisztítást végzünk Sephadex G-50 fine töltetű centrifugaoszlopon (Maniatis, lásd fent), amelyet TE-oldattal eluálunk. Ezt követi a nukleinsavak etanolos kicsapása (0,8 M LiCl és 2,5 térfogat etanol). A nukleinsavat ezután 100 μΐ következő összetételű oldatban reszuszpendáljuk:
mM trisz.HCl, pH=8,l mM MgCl2 mM NaCl mM spermidin mM DTT (ditiotreitol)
100-100 μΜ dATP, dTTP, dCTP, dGTP
1-1 mM rATP, rCTP, rGTP, rUTP
100 mg/ml BSA (nukleázmentes)
250 mM 29 bp DNS-oligonukleotid, melynek szekvenciája 5 ’ -AC ACC AT ATGT ATGTTTC AGGGAA AGGTA-3’ (primer B)
250 mM 56 bp DNS-oligonukleotid, melynek szekvenciája 5 ’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGACACCTAGGGCTAACTATGTGTCCTAATAAGG-3’ (primer A)
A 100 μΐ oldatot 65 °C-on melegítjük 1 percig és 42 °C-on hűtjük 1 percig. A felmelegítésnek, majd a 42 °C-on vagy efölött való tartásnak és az oldat összetételének a kombinációja olyan határozott körülményeket eredményez, amelyek elégségesek ahhoz, hogy a (3’-primer szubszegmentumjj (lásd az 1. ábrát) megfelelő stabilitással és nagy specifitással hibridizáljon a cél HTV RNS-ben lévő (3’-primer szubszegmentum)|-gyel komplementer szekvenciával.
Ezután 10 egység avian myeloblastosis vírus (AMV) reverz transzkriptázt (Life Science Inc.) adunk az oldathoz, amelyet 10 percig 42 °C-on inkubálunk. [Egy egység az enzimnek azon mennyisége, amely szükséges ahhoz, hogy 1 mM TTP-t savval precipitálható formává alakítson 10 percen belül 37 °C-on, poli(A)-oligo(T)l2 -18’ mint templát-primer használata mellett; Houts és munkatársai, J. Virol., 29, 517 (1979)]. A 10 perces inkubálás után az oldatot egy percre forró vízfürdőbe helyezzük. A hevítés a reverz transzkriptáz hatására képződött duplex szálainak szétválását eredményezi és inaktiválja a reverz transzkriptázt.
Ezután az oldatot egy percig 42 °C-on hűtjük. A hűtés folyamán a második primer, a primer B, hibridizál az előző lépésben a reverz transzkriptáz által katalizált reakcióban képződött DNS-szállal komplementer célszekvenciának 3’-terminális végével, (harmadik szubszegmentum),2c (lásd az 1. ábrát). A hibridizációs feltételek itt szintén megfelelően szigorúak ahhoz, hogy specifikus hibridizáció jöjjön létre a második primer és a második primer szekvenciájával komplementer szekvencia között.
Hűtés után további 10 egység AMV reverz transzkriptázt adunk a reakcióelegyhez és tovább inkubálunk 10 percig 42 °C-on.
Ezután a T7 polimerázból száz egységet adunk a reakcióhoz, majd 37 °C-on 30 percig inkubálunk. Egy RNS-átirat szintetizálódik, amely komplementer az eredeti cél HÍV RNS-sel és a reverz transzkriptáz révén újonnan szintetizálódott duplex DNS-templát 5’ végénél lévő T7 promotertől kezdődik. Az átirat szekvenciája 5’GGGA-val kezdődik, majd folytatódik a célszekvencia második szubszegmentumával komplementer szekvenciával [azaz: (második szubszegmentum)tcr; lásd az 1. ábrát]. Minthogy ez előtt a lépés előtt nem inaktiváltuk a reverz transzkriptázt, és mivel jelen van a primer B, valamint a dezoxinukleotid-trifoszfátok, egy szekunder szintézis megy végbe ennél a pontnál. A primer B az újonnan szintetizálódott RNS-átirat 3’ szakaszával (második szubszegmentum)t2cr (lásd az 1. ábrát) - mely a primer B-vel komplementer - hibridizál. A reverz transzkriptáz (amelyet az előző lépésben adagoltunk) egy DNS-szálat szintetizál, templátként használva az újonnan szintetizálódott RNS-átiratot (amelyet a T7 polimeráz révén kaptunk) és primerként használva az 5’-végen lévő oligonukleotid B-t.
A reakcióelegyet ezután 1 percig forraljuk, hogy az RNS:DNS duplexet denaturáljuk. Az elegyet ezután 1 percig 42 °C-on hűtjük. Ezen hűtési lépés alatt a primer A komplementer célszegmentuma az előző lépésben szintetizálódott DNS-szállal hibridizál. Ugyanakkor a primer B az előző lépésben szintetizálódott RNSátiraton lévő komplementer szekvenciával hibridizál.
Hűtés után további 10 egység AMV reverz transzkriptázt adunk az elegyhez, melyet tovább inkubálunk 42 °C-on 10 percig. A reverz transzkriptáz a HÍV célszekvenciával komplementer DNS-t szintetizálja az 5’végen lévő oligonukleotid A-t primerként és az előző lépésben keletkezett DNS-t templátként használva. Egy második DNS-szál szintetizálódik az oligonukleotid Bnek, mint primemek a használatával és az előző lépésben keletkezett RNS-átiratnak, mint templátnak a használatával.
A reakcióelegyet 1 percig forraljuk, hogy az RNS: DNS duplexet denaturáljuk. A reakciót 1 percig 42 °Con hűtjük. A primer A azzal a cDNS-sel hibridizál, amely az előző lépésben, az RNS-átiratnak mint templátnak a felhasználásával készült. (Ha a templátszál 3’ végét, mint reverz transzkriptáz prímért is használjuk, úgy a következő reakció végtermékével azonos termék keletkezik). A primer B azzal a DNS-szállal hibridizál, amely a cél HÍV RNS-sel komplementer. A második szintézis egy olyan terméket eredményez, amely 5’ végénél egy T7 promoter szekvenciát, valamint egy 4 bp „variábilis” szegmentumot - 5’-GGGA-3’ - tartalmazó duplex DNS-t tartalmaz.
A reakcióelegyhez száz egység T7 polimerázt adunk. Az elegyet 30 percen át 37 °C-on inkubáljuk. A T7 RNS-polimeráz templátként használja a duplex T7 promotert tartalmazó kétszálú duplex DNS-t egy olyan RNS átírásához, amely készítmény a cél-második szubszegmentummal, mely 5’ végénél a kiegészítő 5’GGGA-3’ szekvenciát tartalmazza.
A ciklust (1 perc forralás, 1 perc 42 °C, szobahőmérséklet, 10 perc 42 °C, szobahőmérséklet, 10 perc °C, T7 polimeráz 30 perc 37 °C) annyiszor ismételhetjük, amennyi szükséges ahhoz, hogy a célszekvencia kívánt sokszorozódását elérjük. A kapott termék ezután nukleinsavpróba hibridizációs technikával észlelhető.
IX. példa
Tisztított HÍV RNS-t reszuszpendálunk 1 fM koncentrációban a következő összetételű oldatban:
mM trisz.HCl, pH=8,l mM MgCl2 mM NaCl mM spermidin mM DTT
100-100 μΜ dATP, dTTP, dCTP, dGTP
1-1 mM rATP, rCTP, rGTP, rUTP
100 pg/ml BSA (nukleázmentes)
250 mM 29 bp 5’-ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA-3’ szekvenciájú DNS-oligonukleotid (primer B)
250 mM 56 bp 5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGACACCTAGGGCTAACTATGTGTCCTAATAAGG-3’ szekvenciájú DNS-oligonukleotid (primer A)
Az oldat 100 μΐ-ét 65 °C-on melegítjük 1 percig, majd 1 percig 42 °C-on hűtjük. A melegítésnek, hűtésnek és az oldat összetételének a kombinációja olyan szigorúságú körülményeket eredményez, amelyek elégségesek ahhoz, hogy a primer A megfelelő stabilitással és nagy specifitással hibridizáljon azzal a szekvenciával, amely a cél HÍV RNS-ben a primer A szakasz szekvenciájával [(első szubszegmentum)t2; 1. ábra] komplementer.
Ezután 10 egység AMV reverz transzkriptázt (Life Science, Inc.) adunk az oldathoz és az oldatot 10 percen át 42 °C-on inkubáljuk. A tízperces inkubálás után az oldatot forró vízfürdőbe helyezzük 1 percre. Ez a hevítés a reverz transzkriptáz hatására keletkezett duplex szálait szétválasztja és inaktiválja a reverz transzkriptázt.
Hűtés után további 10 egység AMV reverz transzkriptázt adunk az elegyhez és 10 percen át újból 42 °Con inkubálunk.
A reakcióelegyhez 100 egység T7 RNS-polimerázt (New England Biolabs) adunk. A reakcióelegyet ezután 37 °C-on 30 percen át inkubáljuk. Egy olyan RNS-átirat szintetizálódik, amely az eredeti cél HÍV RNS-sel komplementer, a reverz transzkriptáz által szintetizált duplex DNS templát 5’ végénél lévő T7 promotertől kiindulva. Az RNS-átirat szekvenciája 5’-GGGA-val kezdődik és folytatódik egy olyan szekvenciával, amely a célszekvencia második szubszegmentumával [azaz: (második szubszegmentum)tcr, 1. ábra] komplementer. Minthogy a reverz transzkriptázt ezen lépés előtt nem inaktiváltuk és minthogy jelen vannak a primer B és a dezoxinukleotid-trifoszfátok, egy második szintézis megy végbe ebben a szakaszban. A primer B hibridizál az újonnan szintetizálódott RNS-átirat 3’ szakaszával [(harmadik szubszegmentum)t2cr, 1. ábra], amely a primer B-vel komplementer. A reverz transzkriptáz (amelyet az előző lépésben adagoltunk) egy DNS-szálat szintetizál az újonnan szintetizálódott RNS-átiratnak (melyet a T7 RNS-polimeráz hozott létre) templátként és az 5’-végnél lévő oligonukleotid B-nek primerként való használatával.
A reakcióelegyet ezután 1 percig forraljuk, hogy denaturáljuk az RNS:DNS duplexet. Az elegyet ezután 1 percig 42 °C-on hűtjük. A hűtési lépés folyamán a primer A célkomplementer szegmentuma az előző lépésben szintetizálódott DNS-szállal hibridizál. Ugyanakkor a primer B az előző lépésben szintetizálódott DNS-átiraton lévő komplementer szekvenciával hibridizál.
Lehűtés után 10 egység AMV reverz transzkriptázt adunk a reakcióelegyhez, amelyet 10 percen át 42 °Con inkubálunk. A reverz transzkriptáz egy HÍV célszekvenciával komplementer DNS-t szintetizál, primerként használva az 5’-végnél lévő oligonukleotid A-t és az előző lépésben előállított DNS-t templátként használva. A templátszál 3’ vége primerként szolgál egy végső duplex DNS előállításához, 5’ végénél egy kétszálú T7 promoter területtel. Egy második DNS-szál szintetizálódik az oligonukleotid B-nek primerként és az előző lépésben elkészült RNS-átiratnak templátként való felhasználásával.
A reakcióelegyhez 100 egység T7 polimerázt adunk. Az elegyet 30 percen át 37 °C-on inkubáljuk. A T7 RNS-polimeráz egy RNS-átiratot szintetizál, templátként használván a duplex DNS-t, amely 5’ végén polimeráz kötőhelyet (T7 promoter) tartalmaz. Az RNSátirat a cél-második szubszegmentummal komplementer (lásd az 1. ábrát), amely 5’ végén a kiegészítő 5’GGGA-3’ szekvenciát tartalmazza. További ciklusok is végezhetők a sokszorozódás növelése érdekében. A kapott termékek nukleinsav hibridizációs technikákkal kimutathatók.
X. példa
Egy TAS módszerrel sokszorozott termék utolsó lépésben végzett jelölésének előirata.
A. A be nem épült nukleotidok eltávolítására szolgáló oszlop.
1. Az utolsó TAS-ciklusban végbement cDNS-szintézis után 100 μΐ-t veszünk ki a TAS reakcióelegyből. Az elegyhez hozzáadunk 400 μΐ A reagenst (0,1 M trisz.HCl, pH=7,7,10 mM trietil-amin, 1 mM dinátriumEDTA).
2. Kiegyensúlyozunk egy NENSORB20™ (Dupont) prepac oszlopot. Az oszloptöltetet 100%-os metanolban (HPLC-minőség) áztatjuk, majd 2 ml A reagenssel hozzuk egyensúlyba.
3. A mintát felvisszük az oszlopra.
4. Az oszlopot háromszor mossuk 1 ml A reagenssel.
5. Az oszlopot háromszor mossuk 1 ml vízzel.
6. A nukleinsavakat 50%-os metanollal oldjuk le, 250-300 μΐ-es frakciókat szedünk, 1 ml összmennyiségig. (Az első két frakció tartalmazza a nukleinsavak nagy részét).
7. A frakciókat speed-vac készülékben szárítjuk vagy liofilizáljuk.
B. A sokszorozott termék jelölési módszerének előirata.
HU 216 317 Β
1. A NENSORB2o™ oszlopról származó frakciókat (az első két frakciót egyesítjük) a következő összetételű oldatban reszuszpendáljuk: 40 mM trisz.HCl, pH=8,l 8 mM MgCl2, 25 mM NaCl, 2 mM spermidin(HC1)3, 5 mM DTT, 400-400 μΜ rATP, rCTP, rGTP, 12 μΜ rUTP és 25 μ Ci cc-32P-rUTP (800 Ci/mM).
2. Minden 50 μΐ mintához 50 egység T7 RNSpolimerázt (New England Biolabs) adunk, majd 37 °Con 30 percen át inkubálunk.
3. A be nem épült jelzést G-50 spin oszlopon távolíthatjuk el (Maniatis, lásd fent).
4. A jelzett mintákat szekvenáló poli(akril-amid) gélben futtatjuk, hogy meghatározzuk a sokszorozott termék méretét. A jelzett terméket Oligo-Beads™ használatával szintén észlelhetjük.
XI. példa
Belső standard alkalmazása TAS sokszorozás folyamán
Mintákat készítünk a következő összetétellel:
1) 0,1 fM HÍV RNS és 0,1 fM B-globin DNS-szekvenciák (Pstl-gyel hasított HB19A;
2) 0,01 fM HÍV RNS és 0,1 fM B-globin DNS (Pstlgyel hasított HB19A);
3) 0,1 fM HÍV RNS;
4) 0,1 fM B-globin DNS (Pstl-gyel hasított HB19A ΙΟΟμΙ-ben, melynek tartalma a következő: 40 mM trisz.HCl, pH=8,l, 8 mM MgCl2, 25 mM NaCl, 2 mM spermidin-(HCl)3, 5 mM DTT, 100-100 μΜ dATP, dTTP, dCTP és dGTP, 1-1 mM rATP, rUTP, rCTP és rGTP, 100 μg/ml BSA (nukleázmentes), 250 mM primer A (5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGACACCTAGGGCTAACTATGTGTCCTAATAAGG-3’), 250 mM primer B (5’-ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA-3’), 250 mM primer C (5’TAATACGACTCACTATAGGGAACTAAAGGCACCGAGCACTTTCTTGCC-3’) és 250 mM primer D (5 ’-AC ATTGCTTCTGACAC AACTGTGTTC A-3 ’). Egy olyan mintát, amely a kiindulási nukleinsavak 1/20-át tartalmazza, denaturáló oldatba helyezünk [7,4% formaldehid, lOxSSC (1,5 M NaCl, 0,15 M nátrium-citrát, pH=7,4)] a nulla időpontminták céljára.
A mintákat 1 percig forraljuk, 1 percig 42 °C-on hűtjük, majd hozzáadunk 10 egység AMV reverz transzkriptázt. A reakcióelegyeket 42 °C-on 15 percen át inkubáljuk, 1 percig forraljuk, majd 1 percig 42 °Con hűtjük. További 10 egység AMV reverz transzkriptázt adagolunk, s ezután 15 percen át 42 °C-on inkubáljuk a mintákat. A mintákhoz 100 egység T7 RNSpolimerázt adunk, s ezután 37 °C-on 30 percen át inkubálunk. A ciklust másodszor is ismételjük. (Több ciklus is végezhető a kívánt sokszorozástól függően). Két mintát, amelyek a kiindulási célnukleinsavakból 1/20 részt tartalmaznak, denaturáló oldatba helyezünk, a második transzkripcióhoz szolgáló időpontminták céljára.
Minden mintát először 55 °C-ra hevítünk 30 percig, majd a mintákat két nitrocellulóz membránon átszűrjük. A nukleinsavakat a membránra fixáljuk oly módon, hogy 4 percig besugározzuk 254 nm UV-fénnyel. Kontrollok céljára a teljes HÍV genom cDNS-t tartalmazó pARV7/2 plazmidból [Luciw és munkatársai, Natúré, 312, 760 (1984)] 1, 0,1 és 0,01 fM-t és a HB19A plazmidot [Wallace és munkatársai, Nucl. Acids Rés., 9, 3647 (1981)] 0,2 n NaOH-ban denaturáljuk, ezután azonos térfogatú 2 M ammónium-acetáttal denaturálunk, majd nitrocellulóz membránon szűrünk. Az egyik membránt 32P-vel jelzett, a HÍV sokszorozott termékére specifikus 86-31 oligonukleotiddal (5’-GCACACAAGTAGACCCTGAACTAGCAGACCA-3’) hibridizáljuk. A másik membránt 32P-vel jelzett 87-459 oligonukleotiddal (5 ’ -AGGTTTAAGGAGACC AATAGAAACT-3’) hibridizáljuk. Ez az oligonukleotid a sokszorozott B-globin termékkel és a cél B-globin plazmiddal hibridizál.
A hibridizálást 1 órán át 55 °C-on végezzük a következő összetételű oldatban: 1% SDS, 0,9 M NaCl, 50 M NaH2PO4 (pH=7,4), 5 mM EDTA (pH=7,4) és 106 cpm/mol 32P-vel jelzett oligonukleotid. A membránokat háromszor mossuk 1% SDS, 0,18 M NaCl, 10 mM NaH2PO4 (pH=7,4) és 1 mM EDTA tartalmú oldattal szobahőmérsékleten, majd egyszer ugyanezen pufferrel 55 °C-on.
A membránokat 16 órán át -70 °C-on autoradiografáljuk Kodak XAR film és erősítőszűrő segítségével. A 3. ábrán bemutatott autoradiogrammon azok a HÍV és B-globin szekvenciák láthatók, amelyeket HÍV és B-globin nukleinsavval szimultán végzett két TAS-ciklus után mutattunk ki. A B-globin kiindulási mennyisége konstans maradt, míg a cél HIV-mennyisége változott.
Bár a találmányt a jelen leírás meglehetős részletességgel tárgyalja, a vonatkozó szakterületen általános jártassággal rendelkező szakemberek előtt nyilvánvaló, hogy a találmányban olyan változtatásokat és módosításokat eszközölhetnek, amelyek a találmány szellemétől nem térnek el. Az ilyen változtatások és módosítások mint írtuk és igényeltük - szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak.

Claims (46)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1 .Eljárás egy célszekvencia amplifikálására egy nukleinsavat tartalmazó mintában, azzal jellemezve, hogy
    i) előállítunk egy első nukleinsav prímért, amely egy promoter szekvenciát tartalmaz működőképesen hozzákapcsolva a célszekvencia egy első szegmentumának megfelelő szekvenciához, mely első szegmentum tartalmazza a célszekvencia 3’-végét; és előállítunk egy második nukleinsav prímért, amely a célszekvencia egy második szegmentumával komplementer szekvenciához hibridizálható, mely második szegmentum tartalmazza a célszekvencia 5’-végét;
    ii) az első nukleinsav prímért egy nukleinsavat tartalmazó mintában a célszekvenciához hibridizáljuk;
    iii) a hibridizált első nukleinsav prímért polimeráz extenziós reakcióban kiterjesztjük a célszekvenciával komplementer szekvenciával, így egy első duplex nukleinsavat kapunk;
    iv) az ifi) lépésben kapott első duplexet egyszálúvá alakítjuk;
    v) a promoter szekvenciát tartalmazó kapott szálhoz hibridizáljuk a második nukleinsav prímért;
    vi) a hibridizált második nukleinsav prímért polimeráz extenziós reakcióban kiterjesztjük a promoter szekvenciát tartalmazó szállal komplementer szekvenciával, így egy második duplex nukleinsavat kapunk; és vii) a kapott második duplexet templátként alkalmazva RNS-átiratokat - mely átiratok mindegyike tartalmaz egy, a célszekvenciának megfelelő RNS-szekvenciát - készítünk olyan RNS-polimerázzal katalizált reakcióban, amely RNS-polimeráz felismeri az első primer promoter szekvenciájának megfelelő promoter; és viii) kívánt esetben a kapott RNS-átiratokat a célszekvencia további amplifíkálására használjuk fel.
    (Elsőbbsége: 1987.06. 19.)
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan első prímért alkalmazunk, amelyben a célszekvencia első szegmentumának megfelelő szekvencia komplementer az első szegmentummal; olyan második prímért alkalmazunk, amely a célszekvencia második szegmentumával azonos szekvenciát tartalmaz, mi mellett a célszekvencia első és második szegmentumai nem fedik át egymást; és mindegyik polimeráz-kiteijesztési reakció katalizálására azonos reverz transzkriptázt alkalmazzuk.
    (Elsőbbsége: 1987.06. 19.)
  3. 3. Eljárás legalább egy specifikus nukleinsav célszekvencia kimutatására egy nukleinsavat tartalmazó mintában, azzal jellemezve, hogy az 1. vagy a 2. igénypont szerint a célszekvenciának megfelelő szekvenciát tartalmazó replikáit RNS-átiratokat állítunk elő, és kimutatjuk az RNS-szekvencia jelenlétét.
    (Elsőbbsége: 1987. 06. 19.)
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan átiratokat állítunk elő, amelyek tartalmaznak replikázfelismerő helyeket az átiratok replikázindukcióval való replikálásához.
    (Elsőbbsége: 1987. 06. 19.)
  5. 5. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az RNS-átiratok kimutatott RNS-szekvenciáját standard módszerrel, a kétfonalas nukleinsavtemplát előállításához használt nukleinsavmintában lévő célszekvencia mennyiségének mérésével méijük.
    (Elsőbbsége: 1987.06. 19.)
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az RNS-átiratok kimutatott RNS-szekvenciáját belső standard alkalmazásával, a mintában ismert számú nukleinsav-másolat jelenlétében határozzuk meg.
    (Elsőbbsége: 1987. 06. 19.)
  7. 7. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a célszekvencia egy genetikai vagy patogén megbetegedés vagy állapot jellemzőihez kapcsolódó nukleinsav-szekvenciában helyezkedik el.
    (Elsőbbsége: 1988.06.06.)
  8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav-szekvencia egy humán immunelégtelenség-vírus egy szegmentuma.
    (Elsőbbsége: 1988.06. 06.)
  9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav-szekvencia egy hibás gén szegmentuma.
    (Elsőbbsége: 1987.06.19.)
  10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként egy bakteriofág T7 promotert alkalmazunk, és az RNS-átiratokat T7 RNS-polimerázzal állítjuk elő.
  11. 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként egy SP6 promotert alkalmazunk, és az RNS-átiratokat SP6 RNSpolimerázzal állítjuk elő.
    (Elsőbbsége: 1987. 06. 19.)
  12. 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS-célszekvencia előállítására az extenziós reakciót E. coli DNS-polimerázzal katalizáljuk.
    (Elsőbbsége: 1987.06.19.)
  13. 13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS-célszekvencia előállítására az extenziós reakciót E. coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmentumával katalizáljuk.
    (Elsőbbsége: 1987.06. 19.)
  14. 14. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS-célszekvencia előállítására az extenziós reakciót T4 DNS-polimerázzal katalizáljuk.
    (Elsőbbsége: 1988.06.06.)
  15. 15. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az extenziós reakciót reverz transzkriptázzal katalizáljuk.
    (Elsőbbsége: 1987. 06. 19.)
  16. 16. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az RNS-átiratokat kimutatás előtt jelöljük.
    (Elsőbbsége: 1988. 06. 06.)
  17. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy az RNS-átiratokat radioaktív jelöléssel látjuk el.
    (Elsőbbsége: 1987.06. 19.)
  18. 18. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az RNS-átiratokat kromoforral jelöljük.
    (Elsőbbsége: 1987.06. 19.)
  19. 19. Reagens kit legalább egy specifikus nukleinsav célszekvencia kimutatására nukleinsav-tartalmú mintában, azzal jellemezve, hogy a következőket tartalmazza : egy első nukleinsav prímért, amelyben egy promoter szekvencia van, amely működőképesen egy célszekvencia egy szegmentumával komplementer szekvenciához van kapcsolva; egy második nukleinsav prímért, melynek van egy, a célszekvencia egy szegmentumával azonos szekvenciája, mimellett a két primer a célszekvencia különböző régióinak felel meg, és egyáltalán nem, vagy csak kismértékben fedik át egymást, mi mellett továbbá az egyik primer extenziós terméke - amennyiben a komplementerével képzett duplexből egyfonalassá alakítjuk - templátként szolgálhat a másik primer extenziós termékének; tartalmazza továbbá a következő reakciókhoz szükséges eszközöket és reagens(eke)t: az első primemek a célszekvenciához való hibridizálása; a hibridizált primer lánchosszabbítása; átiratok készítése a promoter szekvenciát tartalmazó kétfonalas nukleinsavval; az átiratok kimutatása.
    (Elsőbbsége: 1987.06. 19.)
  20. 20. Eljárás az (I) általános képletű nukleinsav célszegmentum - amelyben az (első szubszegmentum), egy legalább 10 nukleotidból álló ismert szekvenciájú nukleinsav szegmentum, amely a (második szubszegmentum), 3’-végéhez kapcsolódik, a (második szubszegmentum), 0 vagy több nukleotidból álló nukleinsav szegmentum, és a (harmadik szubszegmentum), egy legalább 10 nukleotidból álló, ismert szekvenciájú nukleinsav szegmentum, amely a (második szubszegmentum), 5’-végéhez kapcsolódik - amplifikálására, azzal jellemezve, hogy
    i) a célszegmentum (első szubszegmentum), szakaszához egy első prímért hibridizálunk, amely olyan egyszálú DNS, amely a (II) általános képletű 3’-végi szubszegmentumot tartalmazza - amelyben a (promoter), egy bakteriális DNS-fuggő RNS-polimeráz specifikus promoter pluszszálával egyenlő, a (variábilis szubszegmentum), egy 0-100 nukleotidból álló egyszálú DNSszegmentum, a (3’-primer szubszegmentum), egy legalább 10 nukleotidból álló, egyszálú DNS-szegmentum, amelynek a szekvenciája az (első szubszegmentum), egy olyan szubszegmentumának a szekvenciájával komplementer, amely az (első szubszegmentum), 3’végi nukleotidjával fejeződik be -, ii) az i) lépésben hibridizált első prímért kiterjesztjük egy olyan reakcióban, amelyet egy első DNS-polimeráz katalizál, így az első komplementer DNS-szegmentumot kapjuk, amely a (III) általános képletű szubszegmentumot tartalmazza - amelyben az (első szubszegmentum),c az (első szubszegmentum), szekvenciájával komplementer, a (második szubszegmentum),,. a (második szubszegmentum), szekvenciájával komplementer, és a (harmadik szubszegmentum),c a (harmadik szubszegmentum), szekvenciájával komplementer - , és ha a célszegmentum egy RNS-szegmentum, akkor az első polimeráz egy reverz transzkriptáz, ifi) az ii) reakcióban képződött duplexet egyszálúvá alakítjuk, ív) a (III) általános képletű első komplementer DNS (harmadik szubszegmentum),c szakaszához egy második prímért hibridizálunk, amely egy (IV) általános képletű, legalább 10 nukleotidból álló, egyszálú DNS amelyben az (5’-primer szubszegmentum)2 a (harmadik szubszegmentum), egy szubszegmentumának [amely a (harmadik szubszegmentum), 5’-végi nukleotidjával végződik) a szekvenciájával azonos, és amelyben a (variábilis szubszegmentum)2 egy 0-100 nukleotidból álló szegmentum -,
    v) a második prímért kiterjesztjük egy olyan reakcióban, amelyet egy második DNS-polimeráz katalizál, így egy második olyan DNS-szegmentumot kapunk, amely az (V) általános képletű szubszegmentumot tartalmazza - amelyben a (variábilis szubszegmentum),c a (variábilis szubszegmentum), szekvenciájával komplementer, és a (promoter),c a (promoter), szekvenciájával komplementer -és a második DNS-polimeráz ugyanaz, mint az első polimeráz, vagy különbözik ettől, és vi) az v) lépés szerinti kétszálú terméket templátként használjuk egy olyan reakcióban, amelyet egy első bakteriofág DNS-fuggő RNS-polimeráz katalizál, amely felismeri azt a promotert, amelynek az egyik szála a (promoter),, s így a (VI) általános képletű első RNSterméket állítjuk elő - amelyben a (variábilis szubszegmentum) ,r szekvenciája azonos a (variábilis szubszegmentum), szekvenciával, az (első szubszegmentum),cr komplementer az (első szubszegmentum), szekvenciával, a (második szubszegmentum),cr a (második szubszegmentum), szekvenciával komplementer, a (harmadik szubszegmentum),cr a (harmadik szubszegmentum), szekvenciával komplementer, és a (variábilis szubszegmentum)2cr a (variábilis szubszegmentum)2 szekvenciával komplementer -.
    (Elsőbbsége: 1988.06.06.)
  21. 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (első szubszegmentum), legalább 10 nukleotid hosszú és (XIII) általános képletű - amelyben az (első szubszegmentum)^ 0 vagy több nukleotidot tartalmaz, és az (első szubszegmentum),, legalább 10 nukleotid hosszú -, továbbá a (harmadik szubszegmentum), (XIV) általános képletű - amelyben a (harmadik szubszegmentum),2 0 vagy több nukleotidot tartalmaz, és a (harmadik szubszegmentum),, legalább 10 nukleotid hosszú -, továbbá a (3’-primer szubszegmentum), szekvenciája komplementer a célszegmentum egy szubszegmentumával, amely a teljes (első szubszegmentum)t2-ből és az (első szubszegmentum),, 0 vagy több nukleotidjából áll, továbbá az (5’-primer szubszegmentum)2 egy olyan szubszegmentum, amely a teljes (harmadik szubszegmentum),2-ből és a (harmadik szubszegmentum),, 0 vagy több nukleotidjából áll, továbbá a (variábilis szubszegmentum)2 0 nukleotidot tartalmaz, továbbá az i)-vi) lépések után a (VII) általános képletű RNS-szubszegmentumot kapjuk - amelyben az (első szubszegmentum), ,cr komplementer az (első szubszegmentum),, szekvenciával és a (harmadik szubszegmentum)„cr komplementer a (harmadik szubszegmentum),, szekvenciával -.
    (Elsőbbsége: 1987. 06. 19.)
  22. 22. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mind a (variábilis szubszegmentum),, mind a (variábilis szubszegmentum)2 0-60 nukleotidból áll, továbbá mind a (3’-primer szubszegmentum),, mind az (5’-primer szubszegmentum)2 12-45 nukleotidból áll, továbbá a (második szubszegmentum), legalább 30 nukleotidot tartalmaz, továbbá a célszegmentum 1000 vagy ennél kevesebb nukleotidot tartalmaz.
    (Elsőbbsége: 1987.06. 19.)
  23. 23. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a célszegmentum egy DNS-szegmentum, továbbá hogy az ii) lépés termékét hődenaturációval egyszálúvá alakítjuk, továbbá hogy a (variábilis szubszegmentum)2 0 nukleotidot tartalmaz, és hogy mind az első, mind a második DNS-polimeráz az E. coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmentuma lehet, vagy AMV reverz transzkriptáz, vagy klónozott MMLV reverz transzkriptáz, vagy boíjútimusz DNS-polimeráz a, vagy egy Thermus aquaticus hőstabil DNS-polimeráz, vagy Sequenase™ klónozott T7 DNS-polimeráz, lehet, s hogy a bakteriofág DNS-függő RNS-polimeráz vagy T7 RNSpolimeráz vagy T3 RNS-polimeráz, vagy SP6 RNSpolimeráz lehet.
    (Elsőbbsége: 1987. 06. 19.)
  24. 24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mind az első, mind a második DNS-polimeráz vagy az E. coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmentuma, vagy AMV reverz transzkriptáz vagy klónozott MMLV reverz transzkriptáz lehet.
    (Elsőbbsége: 1987.06. 19.)
  25. 25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (1) a bakteriofág DNS-fiiggő RNS-polimeráz a T7 RNS-polimeráz, a (promoter), képlete 5’-TAATACGACTCACTATA-3’ és a (variábilis szubszegmentum), 5’-végénél egy 5’-GG-3’ szekvenciájú dinukleotid van; vagy hogy (2) a bakteriofág DNS-fiiggő RNSpolimeráz a T3 RNS-polimeráz, a (promoter)) képlete 5’TATTAACCCTCACTAAA-3’ és a (variábilis szubszegmentum)) 5-végénél egy 5’-GGGA-3’ szekvenciájú tetranukleotid van; vagy hogy (3) a bakteriofág DNS-fiiggő RNS-polimeráz az SP6 RNS-polimeráz, a (promoter)) képlete 5 ’-GAACGCGGCTACAATTAATACATAACCTTATGTATCATACACATACGATTTAGGTGACACTATA-3’, és a (variábilis szubszegmentum)] 5’-végénél egy 5’-GAATAC-3’ hexanukleotid van.
    (Elsőbbsége: 1987.06. 19.)
  26. 26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első primer 5’-vége a (promoter)) 5’ nukleotidja.
    (Elsőbbsége: 1987.06. 19.)
  27. 27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ha a bakteriofág DNS-függő RNS-polimeráz a T7 vagy a T3 RNS-polimeráz, úgy a (variábilis szubszegmentum)) szekvenciája 5’-GGGATGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3’, és ha a bakteriofág DNS-függő RNS-polimeráz az SP6 RNSpolimeráz, úgy a (variábilis szubszegmentum), szekvenciája 5 ’ -GAATACTGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTC ACCTCGCGCAGC-3 ’.
    (Elsőbbsége: 1987. 06. 19.)
  28. 28. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a célszegmentum egy RNS-szegmentum, hogy az ii) lépés termékét hődenaturációval alakítjuk egyszálúvá, hogy a (variábilis szubszegmentum)2 nulla nukleotidot tartalmaz, hogy az első DNS-polimeráz vagy AMV reverz transzkriptáz vagy klónozott MMLV reverz transzkriptáz lehet, hogy a második DNS-polimeráz az E. coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmentuma, vagy AMV reverz transzkriptáz, vagy boíjútimusz DNS-polimeráz a, vagy Thermus aquaticus hőstabil DNS-polimeráz, vagy Sequenase™ klónozott T7 DNS-polimeráz, lehet, vagy hogy a bakteriofág DNS-függő RNS-polimeráz vagy T7 RNS-polimeráz, vagy T3 RNS-polimeráz, vagy SP6 RNS-polimeráz lehet.
    (Elsőbbsége: 1987.06. 19.)
  29. 29. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a második DNS-polimeráz az E. coli DNSpolimeráz I Klenow-fragmentuma vagy a klónozott MMLV reverz transzkriptáz.
    (Elsőbbsége: 1987.06. 19.)
  30. 30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (1) a bakteriofág DNS-függő RNS-polimeráz a T7 RNS-polimeráz, a (promoter)) képlete 5’-TAATACGACTCACTATA-3’, és a (variábilis szubszegmentum)) 5’-végénél az 5’-GG-3’ szekvenciájú dinukleotid van, vagy hogy (2) a bakteriofág DNS-függő RNS-polimeráz a T3 RNS-polimeráz, a (promoter)) képlete 5’-TATTAACCCTCACTAAA-3’ és a (variábilis szubszegmentum)) 5’-végénél az 5’-GGGA-3’ tetranukleotid van, vagy hogy (3) a bakteriofág DNSfüggő RNS-polimeráz az SP6 RNS-polimeráz, a (promoter)) képlete 5’-GAACGCGGCTACAATTAATACATAACCTTATGTATCATACA- CATACGATTTAGGTGACACTATA-3’, és a (variábilis szubszegmentum)) 5’-végénél az 5’-GAATAC-3’ szekvenciájú hexanukleotid van.
    (Elsőbbsége: 1987. 06. 19.)
  31. 31. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első primer 5’-vége a (promoter), 5’-nukleotidja.
    (Elsőbbsége: 1987. 06. 19.)
  32. 32. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mind az első, mind a második DNS-polimeráz AMV reverz transzkriptáz.
    (Elsőbbsége: 1987. 06. 19.)
  33. 33. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ha a bakteriofág DNS-függő RNS-polimeráz a T7 vagy a T3 RNS-polimeráz, úgy a (variábilis szubszegmentum), szekvenciája 5’-GGGATGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3 ’ és ha a bakteriofág DNS-függő RNS-polimeráz az SP6 RNS-polimeráz, úgy a (variábilis szubszegmentum), szekvenciája 5’-GAATACTGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGC AGC-3 ’.
    (Elsőbbsége: 1987. 06. 19.)
  34. 34. A 28-33. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a célszegmentum egy humán immunelégtelenség-vírus - azaz a HIV-1 vírus - genomjának egy szegmentuma, továbbá, hogy (1) a (3’primer szubszegmentum), szekvenciája 5’-TCTAATTACTACCTCTTCTTCTGCTAGACT-3’, és az (5’primer szubszegmentum)2 szekvenciája 5’-ACAAGTTGTAACACCTCAGTCATTACACAG-3’, vagy (2) a (3’-primer szubszegmentum), szekvenciája 5’-TTTCGTAACACTAGGCAAAGGTGGCTTTATC-3 ’, és az (5’-primer szubszegmentum)2 szekvenciája vagy 5’GCACACAAGTAGACCCTGAACTAGCAGACCA-3’, vagy 5’-ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA-3’.
    (Elsőbbsége: 1987. 06. 19.)
  35. 35. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mind a (variábilis szubszegmentum),, mind a (variábilis szubszegmentum)3 0-60 nukleotidból áll, a (3’primer szubszegmentum),, az (5’-primer szubszegmentum)^ a (3’-primer szubszegmentum)3 és az (5’-primer szubszegmentum)4 mindegyike 15-45 nukleotidot tartalmaz, a (második szubszegmentum), legalább
    30 nukleotidból és a célszegmentum 1000 vagy ennél kevesebb nukleotidból áll.
    (Elsőbbsége: 1987. 06. 19.)
  36. 36. A 35. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (A) ha a célszegmentum egy DNS-szegmentum, úgy az ii) lépés termékét hődenaturációval alakítjuk egyszálúvá és a viii) lépés termékét is hődenaturációval alakítjuk egyszálúvá, hogy az első, második és negyedik DNS-polimeráz mindegyike az E. coli DNSpolimeráz I Klenow-fragmentuma vagy AMV reverz transzkriptáz, vagy klónozott MMLV reverz transzkriptáz, vagy borjútimusz DNS-polimeráz a, vagy Thermus aquaticus hőstabil DNS-polimeráz, vagy Sequenase™ klónozott T7 DNS-polimeráz; hogy a harmadik DNSpolimeráz AMV reverz transzkriptáz vagy klónozott MMLV reverz transzkriptáz; hogy mind az első, mind a második bakteriofág DNS-függő RNS-polimeráz T7 RNS-polimeráz, vagy T3 RNS-polimeráz, vagy SP6 RNS-polimeráz; továbbá, hogy (B) ha a célszegmentum egy RNS-szegmentum, mind az ii), mind a viii) lépés termékét hődenaturációval alakítjuk egyszálúvá; hogy mind a második, mind a negyedik DNS-polimeráz az E. coli DNSpolimeráz I Klenow-fragmentuma vagy AMV reverz transzkriptáz, vagy klónozott MMLV reverz transzkriptáz, vagy borjútimusz DNS-polimeráz a, vagy Thermus aquaticus hőstabil DNS-polimeráz, vagy Sequenase™ klónozott T7 DNS-polimeráz; hogy mind az első, mind a harmadik DNS-polimeráz AMV reverz transzkriptáz vagy klónozott MMLV reverz transzkriptáz lehet; s hogy mind az első, mind a második bakteriofág DNSfüggő RNS-polimeráz T7 RNS-polimeráz vagy T3 RNS-polimeráz lehet.
    (Elsőbbsége: 1987.06.19.)
  37. 37. A 36. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a célszegmentum egy RNS-szegmentum, és hogy mind a második, mind a negyedik DNS-polimeráz vagy az E. coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmentuma vagy AMV reverz transzkriptáz, vagy klónozott MMLV reverz transzkriptáz, s hogy mind az első, mind a harmadik DNS-polimeráz AMV reverz transzkriptáz vagy klónozott MMLV reverz transzkriptáz lehet.
    (Elsőbbsége: 1987. 06. 19.)
  38. 38. A 36. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a célszegmentum szubszegmentuma, amelynek a szekvenciája komplementer a (3’-primer szubszegmentum), szekvenciával, a célszegmentum azon szubszegmentumától - melynek szekvenciája komplementer az (5’-primer szubszegmentum)4 szekvenciával - 5’ irányban van és azt nem fedi át, és hogy a célszegmentum szubszegmentuma, amelynek a szekvenciája azonos az (5’-primer szubszegmentum)2 szekvenciával, nem fedi át a célszegmentum azon szubszegmentumát, amelynek a szekvenciája azonos a (3'-primer szubszegmentum)3 szekvenciával.
    (Elsőbbsége: 1987.06. 19.)
  39. 39. A 38. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a harmadik komplementer DNS-szubszegmentuma, amelynek a szekvenciája komplementer a (3'-primer szubszegmentum), szekvenciával, 5'-irányban helyezkedik el a harmadik komplementer DNS-azon szubszegmentumától - és ezt nem fedi át -, amelynek a szekvenciája komplementer az (5’-primer szubszegmentum)4 szekvenciával, és hogy a célszegmentum szubszegmentuma, amelynek a szekvenciája olyan, mint az (5'-primer szubszegmentum)2 szekvencia, nem fedi át a célszegmentum azon szubszegmentumát, amelynek a szekvenciája azonos a (3'-primer szubszegmentum)3 szekvenciával.
    (Elsőbbsége: 1987. 06. 19.)
  40. 40. A 39. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a harmadik komplementer DNS-ben a (variábilis szubszegmentum), c 0-nál több nukleotidból áll, és hogy az (5’-primer szubszegmentum)4 és a harmadik komplementer DNS közötti duplexben az (5'-primer szubszegmentum)4 szekvenciának legalább egy szubszegmentumát a (variábilis szubszegmentum), c szekvenciával hibridizáljuk.
    (Elsőbbsége: 1987.06. 19.)
  41. 41. A 38-40. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (1) ha a vi) lépésben T7 RNS-polimerázt használunk, úgy a (promoter),-nek vagy a (promoter)3-nak a szekvenciája 5’-TAATACGACTCACTATA-3’, és a (variábilis szubszegmentum)! vagy (variábilis szubszegmentum)3 egy 5’-GG-3’ szekvenciájú dinukleotidot tartalmaz 5'-végénél; és hogy (2) ha a vi) lépésben T3 RNS-polimerázt használunk, úgy a (promoter), vagy a (promoter)3 szekvenciája 5’-TATTAACCCTCACTAAA-3’, és a (variábilis szubszegmentum), vagy a (variábilis szubszegmentum)3 egy 5’-GGGA-3’ szekvenciájú tetranukleotidot tartalmaz az 5'-végnél; hogy (3) ha a vi) lépésben SP6 RNS-polimerázt használunk, úgy a (promoter), vagy a (promoter)3 szekvenciája 5’-GAACGCGGCTACAATTAATACATAACCTTATGTATCATACACATACGATTTAGGTGACACTATA-3’, és a (variábilis szubszegmentum),, vagy a (variábilis szubszegmentum)3 egy 5’-GAATAC-3’ szekvenciájú hexanukleotidot tartalmaz az 5’-végnél; és hogy az első primer 5'-vége a (promoter), 5’-nukleotidja és a harmadik primer 5’-vége a (promoter)3 5’-nukleotidja.
    (Elsőbbsége: 1987. 06. 19.)
  42. 42. A 38-40. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (A) (1) ha az első bakteriofág DNS-függő RNS-polimeráz a T7 vagy a T3 RNS-polimeráz, úgy a (variábilis szubszegmentum), szekvenciája 5’-GGGATGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCA- GC3’ és a második primer (variábilis szubszegmentum)2 szekvenciája 5’-CGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGTGC-3 ’; vagy (2) ha az első bakteriofág DNS-függő RNS-polimeráz az SP6 RNS-polimeráz, úgy a (variábilis szubszegmentum), szekvenciája 5’-GAATACTGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3’, és a második primer (variábilis szubszegmentum)2 szekvenciája 5'-CGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGTGC-3 ’ továbbá, hogy
    HU 216 317 Β (Β) (1) ha a második bakteriofág DNS-függő RNSpolimeráz a T7 vagy a T3 RNS-polimeráz, úgy a (variábilis szubszegmentum)3 szekvenciája 5’-GGGATGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3’; vagy (2) ha a második bakteriofág DNS-függő RNS-polimeráz az SP6 RNS-polimeráz, úgy a (variábilis szubszegmentum)3 szekvenciája 5’-GAATACGGGATGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3’ és a negyedik primer 5’-terminálisa a következő 40 nukleotid: 5’-CGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGTGC-3 ’.
    (Elsőbbsége: 1987.06. 19.)
  43. 43. A 35-40. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a célszegmentum a humán immunelégtelenség vírusa, azaz a HÍV-1 vírus genomnak egy szegmentuma, és hogy (1) a (3’-primer szubszegmentum), szekvenciája: 5’TCTAATTACTACCTCTTCTTCTGCTAGA- CT-3 ’, az (5’-primer szubszegmentum)2 szekvenciája: 5’-ACAAGTTGTAACACCTCAGTCATTACACAG-3’, a (3’-primer szubszegmentum)3 szekvenciája: 5’-AAAGGTATCCTTTGAGCCAATTCCCATA-3’ (2) a (3’-primer szubszegmentum),, szekvenciája: 5’TTTCGTAAC ACT AGGC AAAGGTGGCTTTATC-3 ’, az (5’-primer szubszegmentum)2 szekvenciája vagy 5 ’ -GC AC AC AAGTAGACCCTGAACTAGCAG ACCA-3’ vagy 5’-ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA-3’ és a negyedik primer szekvenciája:
    5 ’ -TTTTTTGGTGTT ATTAATGCTGCT AGTGCC-3 ’.
    (Elsőbbsége: 1987.06. 19.)
  44. 44. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (A) ha a célszegmentum egy DNS-szegmentum, úgy az ii) lépés termékét hődenaturációval alakítjuk egyszálúvá; mind az első, mind a második polimeráz az E. coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmentuma vagy AMV reverz transzkriptáz, vagy klónozott MMLV reverz transzkriptáz, vagy borjútimusz DNS-polimeráz a, vagy Thermus aquaticus hőstabil DNS-polimeráz, vagy Sequenase™ klónozott T7 DNS-polimeráz lehet, és hogy az első bakteriofág DNS-függő RNS-polimeráz T7 RNSpolimeráz, vagy T3 RNS-polimeráz, vagy SP6 RNSpolimeráz lehet; továbbá hogy (B) ha a célszegmentum egy RNS-szegmentum, úgy az ii) lépés termékét hődenaturációval alakítjuk egyszálúvá; a második DNS-polimeráz az E. coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmentuma vagy AMV reverz transzkriptáz, vagy klónozott MMLV reverz transzkriptáz, vagy borjútimusz DNS-polimeráz a, vagy Thermus aquaticus hőstabil DNS-polimeráz, vagy Sequenase™ klónozott T7 DNS-polimeráz lehet; az első DNS-polimeráz AMV reverz transzkriptáz vagy klónozott MMLV reverz transzkriptáz lehet; és az első bakteriofág DNS-függő RNS-polimeráz, T7 RNS-polimeráz vagy T3 RNS-polimeráz, vagy SP6 RNS-polimeráz lehet.
    (Elsőbbsége: 1987. 06. 19.)
  45. 45. A 44. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mind az első, mind a második DNS-polimeráz vagy AMV reverz transzkriptáz, vagy klónozott MMLV reverz transzkriptáz.
    (Elsőbbsége: 1988.06.06.)
  46. 46. A 45. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első primer 5’-vége a (promoter), 5’-nukleotidja; hogy ha a bakteriofág DNS-függő RNS-polimeráz a T7 RNS-polimeráz, úgy az első primer (promoter),-(variábilis szubszegmentum), szubszegmentumának a szekvenciája;
    5’-TAATACGACTCACTATAGGGACGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGTGC-3’;
    hogy ha a bakteriofág DNS-függő RNS-polimeráz a T3 RNS-polimeráz, úgy az első primer (promoter),(variábilis szubszegmentum), szubszegmentumának szekvenciája: 5’-TATTAACCCTCACTAAAGGGACGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGTGC-3 ’;
    s hogy ha a bakteriofág DNS-függő RNS-polimeráz az SP6 RNS-polimeráz, úgy az első primer (promoter),-(variábilis szubszegmentum), szekvenciája: 5’GAACGCGGCTACAATTAATACATAACCTTATGTATCATACACATACGATTTAGGTGACACTATAGAATACCGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGTGC-3’, továbbá, hogy a (variábilis szubszegmentum)2 szekvenciája : 5 ’-TGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3’, és hogy a vi)-os lépés után az első RNS autokatalitikusan replikálódik QB replikáz hatására.
    (Elsőbbsége: 1987. 06. 19.)
HU884791A 1987-06-19 1988-06-17 Eljárás transzkripcióra alapozott nukleinsav sokszorozó/észlelő rendszerek előállítására HU216317B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6414187A 1987-06-19 1987-06-19
US20297888A 1988-06-06 1988-06-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT52823A HUT52823A (en) 1990-08-28
HU216317B true HU216317B (hu) 1999-06-28

Family

ID=26744190

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU884791A HU216317B (hu) 1987-06-19 1988-06-17 Eljárás transzkripcióra alapozott nukleinsav sokszorozó/észlelő rendszerek előállítására

Country Status (17)

Country Link
EP (2) EP0623683B1 (hu)
JP (1) JP2843586B2 (hu)
KR (1) KR960014107B1 (hu)
AT (2) ATE196657T1 (hu)
BR (1) BR8807097A (hu)
DE (2) DE3852177T3 (hu)
DK (1) DK175614B1 (hu)
ES (1) ES2009286A6 (hu)
FI (1) FI93743C (hu)
GR (1) GR880100396A (hu)
HU (1) HU216317B (hu)
IE (1) IE65089B1 (hu)
IL (1) IL86724A (hu)
NO (1) NO303068B1 (hu)
NZ (1) NZ225077A (hu)
PT (1) PT87769B (hu)
WO (1) WO1988010315A1 (hu)

Families Citing this family (419)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5356774A (en) * 1986-04-16 1994-10-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Replicative RNA-based amplification/detection systems
CA1340843C (en) * 1987-07-31 1999-12-07 J. Lawrence Burg Selective amplification of target polynucleotide sequences
DE68908054T2 (de) * 1988-01-21 1994-03-10 Genentech Inc Verstärkung und nachweis von nukleinsäuresequenzen.
EP0358737A4 (en) * 1988-01-28 1992-04-08 Mayo Foundation For Medical Education And Research Genomic amplification with direct sequencing
CA1340807C (en) * 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
US5130238A (en) * 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
CA1339991C (en) * 1988-09-08 1998-08-11 The Trustees Of Columbia University Replicative rna-based amplification/detection system
WO1990002819A1 (en) * 1988-09-08 1990-03-22 The Salk Institute For Biological Studies Replicative rna-based amplification detection systems
DE68926460T2 (de) * 1988-12-05 1996-09-12 Salk Inst For Biological Studi Systeme für amplifikation/nachweis von nukleinsäuren
BR8907830A (pt) 1988-12-16 1991-10-22 Siska Diagnostics Inc Processo para preparar uma dna de filamento duplo que codifica uma sequencia que corresponde a uma sequencia objetivada de acido nucleico e processo util para deteccao de pelo menos uma sequencia de acido nucleico objetivada especifica
US5237016A (en) * 1989-01-05 1993-08-17 Siska Diagnostics, Inc. End-attachment of oligonucleotides to polyacrylamide solid supports for capture and detection of nucleic acids
WO1990009457A2 (en) * 1989-02-14 1990-08-23 Biogen, Inc. Oligonucleotide primer pairs for sequence independent gene amplification and methods which employ them
IE66597B1 (en) * 1989-05-10 1996-01-24 Akzo Nv Method for the synthesis of ribonucleic acid (RNA)
US5112734A (en) * 1989-05-26 1992-05-12 Gene-Trak Systems Target-dependent synthesis of an artificial gene for the synthesis of a replicatable rna
US5683896A (en) 1989-06-01 1997-11-04 Life Technologies, Inc. Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
CA2020958C (en) * 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
US5766849A (en) * 1989-07-11 1998-06-16 Gen-Probe Incorporated Methods of amplifying nucleic acids using promoter-containing primer sequence
AU650622B2 (en) * 1989-07-11 1994-06-30 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid sequence amplification methods utilizing a transcription complex
US6589734B1 (en) 1989-07-11 2003-07-08 Gen-Probe Incorporated Detection of HIV
US7009041B1 (en) 1989-07-11 2006-03-07 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides for nucleic acid amplification and for the detection of Mycobacterium tuberculosis
US5219727A (en) * 1989-08-21 1993-06-15 Hoffmann-Laroche Inc. Quantitation of nucleic acids using the polymerase chain reaction
DE3929030A1 (de) * 1989-09-01 1991-03-07 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur vermehrung von nukleinsaeuren
US5545522A (en) * 1989-09-22 1996-08-13 Van Gelder; Russell N. Process for amplifying a target polynucleotide sequence using a single primer-promoter complex
US7049102B1 (en) 1989-09-22 2006-05-23 Board Of Trustees Of Leland Stanford University Multi-gene expression profile
US5215899A (en) * 1989-11-09 1993-06-01 Miles Inc. Nucleic acid amplification employing ligatable hairpin probe and transcription
US7585512B1 (en) 1990-05-08 2009-09-08 Thomas Jefferson University Composition and method of using tumor cells
US5194370A (en) * 1990-05-16 1993-03-16 Life Technologies, Inc. Promoter ligation activated transcription amplification of nucleic acid sequences
US5645994A (en) * 1990-07-05 1997-07-08 University Of Utah Research Foundation Method and compositions for identification of species in a sample using type II topoisomerase sequences
JPH04141098A (ja) * 1990-09-29 1992-05-14 Shimadzu Corp Ｒｎａ検出用試薬及びそれを用いたｒｎａの検出方法
US5474895A (en) * 1990-11-14 1995-12-12 Siska Diagnostics Inc. Non-isotopic detection of nucleic acids using a polystyrene support-based sandwich hybridization assay and compositions useful therefor
KR100231383B1 (ko) 1990-12-31 1999-11-15 랜들 엘. 다이어몬드 Rna 레플리카제의 dna-의존성 rna 폴리머라제 활성을 이용한 핵산 증폭
US5518900A (en) * 1993-01-15 1996-05-21 Molecular Tool, Inc. Method for generating single-stranded DNA molecules
WO1992020820A1 (en) * 1991-05-15 1992-11-26 Vanderbilt University Method to determine metastatic potential of tumor cells
US5169766A (en) * 1991-06-14 1992-12-08 Life Technologies, Inc. Amplification of nucleic acid molecules
ES2092056T3 (es) * 1991-09-23 1996-11-16 Pfizer Procedimiento para detectar arnm y adn especificos en celulas.
DE4132133A1 (de) * 1991-09-26 1993-04-01 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur spezifischen herstellung von ribonukleinsaeuren
DE4213029A1 (de) * 1991-09-26 1993-04-01 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur spezifischen vervielfaeltigung von nukleins aeuresequenzen
US5981179A (en) * 1991-11-14 1999-11-09 Digene Diagnostics, Inc. Continuous amplification reaction
AU681082B2 (en) * 1992-05-06 1997-08-21 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit
US6261808B1 (en) 1992-08-04 2001-07-17 Replicon, Inc. Amplification of nucleic acid molecules via circular replicons
US5733733A (en) * 1992-08-04 1998-03-31 Replicon, Inc. Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules
WO1994003624A1 (en) * 1992-08-04 1994-02-17 Auerbach Jeffrey I Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules
KR100316498B1 (ko) * 1992-08-04 2002-06-20 다니엘 엘. 캐시앙, 헨리 엘. 노르호프, 피터 알. 쉬어리 핵산서열증폭방법
US5614389A (en) * 1992-08-04 1997-03-25 Replicon, Inc. Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules
US5834202A (en) * 1992-08-04 1998-11-10 Replicon, Inc. Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules
AU686616B2 (en) 1993-03-26 1998-02-12 Gen-Probe Incorporated Detection of human immunodeficiency virus type 1
AU689789B2 (en) * 1993-07-23 1998-04-09 Gen-Probe Incorporated Methods for enhancing nucleic acid amplification
EP1251182A3 (en) * 1993-12-01 2002-11-27 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Method of amplifying and detecting target nucleic acid sequence by using thermostable enzymes
FR2714062B1 (fr) * 1993-12-22 1996-02-16 Bio Merieux Promoteur modifié pour ARN polymérase, sa préparation et ses applications.
JPH09510351A (ja) * 1994-03-16 1997-10-21 ジェン−プローブ・インコーポレイテッド 等温鎖置換核酸増幅法
US5863724A (en) * 1994-04-13 1999-01-26 Baylor College Of Medicine Methods of screening for persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy
FR2724934B1 (fr) * 1994-09-26 1997-01-24 Bio Merieux Oligonucleotide chimere et son utilisation dans l'obtention de transcrits d'un acide nucleique
US5514551A (en) * 1994-10-14 1996-05-07 Gen-Probe Incorporated Compositions for the detection of Chlamydia trachomatis
FR2726277B1 (fr) 1994-10-28 1996-12-27 Bio Merieux Oligonucleotide utilisable comme amorce dans une methode d'amplification basee sur une replication avec deplacement de brin
US5606043A (en) * 1994-11-03 1997-02-25 The Regents Of The University Of California Methods for the diagnosis of glaucoma
US5789169A (en) * 1994-11-03 1998-08-04 Regents Of The University Of California Methods for the diagnosis of glaucoma
US5849879A (en) * 1994-11-03 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Methods for the diagnosis of glaucoma
US5654141A (en) * 1994-11-18 1997-08-05 Thomas Jefferson University Amplification based detection of bacterial infection
DE4441626A1 (de) * 1994-11-23 1996-05-30 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum besonders sensitiven Nachweis von Nukleinsäuren
US6001610A (en) * 1994-11-23 1999-12-14 Roche Diagnostics, Gmbh Method for the particularly sensitive detection of nucleic acids
US5739311A (en) * 1995-06-07 1998-04-14 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of phosphorothioate oligonucleotides using restriction endonucleases
US5932450A (en) * 1995-06-07 1999-08-03 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of oligonucleotides using digestible templates
US5916777A (en) * 1995-06-07 1999-06-29 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of oligonucleotides using 3'-ribonucleotide primers
US5652126A (en) * 1995-06-07 1997-07-29 Gen-Probe Incorporated Use of restriction endonuclease sequences for cleaving phosphorothioate oligonucleotides
US6218107B1 (en) 1996-05-22 2001-04-17 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting the presence of Mycobacterium kansassii
US5914229A (en) * 1996-06-14 1999-06-22 Sarnoff Corporation Method for amplifying a polynucleotide
JPH1028585A (ja) * 1996-07-16 1998-02-03 Toyobo Co Ltd 耐熱性リボヌクレアーゼｈを用いる核酸増幅法
US6132954A (en) * 1996-08-20 2000-10-17 Baylor College Of Medicine Methods of screening for agents that delay a cell cycle and compositions comprising era and an analogue of wild-type era
US6043283A (en) * 1996-09-20 2000-03-28 Baylor College Of Medicine Tyramine compounds and their neuronal effects
US6071493A (en) * 1996-09-20 2000-06-06 Baylor College Of Medicine Method of screening for an agent that inhibits mononuclear phagocyte-plaque component complex formation
US6379929B1 (en) 1996-11-20 2002-04-30 The Regents Of The University Of Michigan Chip-based isothermal amplification devices and methods
US6025133A (en) * 1996-12-30 2000-02-15 Gen-Probe Incorporated Promoter-sequestered oligonucleoside and method of use
JP3968810B2 (ja) * 1997-01-24 2007-08-29 東ソー株式会社 核酸配列分析方法
US6171788B1 (en) 1997-01-28 2001-01-09 The Regents Of The University Of California Methods for the diagnosis, prognosis and treatment of glaucoma and related disorders
US7138511B1 (en) 1997-01-28 2006-11-21 The Regents Of The University Of California Nucleic acids, kits and methods for the diagnosis, prognosis and treatment of glaucoma and related disorders
US6475724B1 (en) 1997-01-28 2002-11-05 The Regents Of The University Of California Nucleic acids, kits, and methods for the diagnosis, prognosis and treatment of glaucoma and related disorders
US6482795B1 (en) 1997-01-30 2002-11-19 Myriad Genetics, Inc. Tumor suppressor designated TS10q23.3
US6262242B1 (en) 1997-01-30 2001-07-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Tumor suppressor designated TS10Q23.3
GB9703146D0 (en) 1997-02-14 1997-04-02 Innes John Centre Innov Ltd Methods and means for gene silencing in transgenic plants
US6713300B1 (en) 1997-02-27 2004-03-30 University Of Utah Research Foundation Nucleic acid and amino acid sequences for ATP-binding cassette transporter and methods of screening for agents that modify ATP-binding cassette transporter
EP3034626A1 (en) 1997-04-01 2016-06-22 Illumina Cambridge Limited Method of nucleic acid sequencing
US6534273B2 (en) 1997-05-02 2003-03-18 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
KR20010012175A (ko) * 1997-05-02 2001-02-15 다니엘 엘. 캐시앙, 헨리 엘. 노르호프, 피터 알. 쉬어리 폴리뉴클레오티드의 2단계 혼성화 및 포획법
US6287770B1 (en) * 1997-07-08 2001-09-11 Cytocell Limited Nucleic acid promoters
ID25877A (id) 1997-08-08 2000-11-09 Akzo Nobel Nv Urutan asam nukleat yang dapat digunakan sebagai primer dan kuar dalam aplifikasi dan deteksi dari seluruh subtipe hiv-1
BR9814294B1 (pt) 1997-12-18 2011-10-18 polipeptìdeo cry3bb de b, thuringiensis modificado, composição compreendendo o mesmo, processo para a produção da referida composição, polinucleotìdeo, vetor, vìrus, microorganismo transgênico e métodos para matar e controlar uma população de insetos coleópteros e para preparar uma planta transgênica resistente a coleópteros e uma semente de planta resistente a coleópteros e uma semente de planta resistente a ataque por insetos coleópteros.
US6673914B1 (en) 1998-01-22 2004-01-06 John Wayne Cancer Institute Human tumor-associated gene
US20020147143A1 (en) 1998-03-18 2002-10-10 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
EP1614475B1 (en) 1998-05-01 2007-05-30 Gen-Probe Incorporated Device for agitating the fluid contents of a container
DE19834948A1 (de) * 1998-08-03 2000-02-17 Monika Jecht Verfahren zur spezifischen Detektion von RNA
US6207379B1 (en) 1998-09-11 2001-03-27 One Lambda Method for amplification of DNA
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
EP1131633A2 (en) 1998-11-16 2001-09-12 Board of Regents, The University of Texas System Hiv-specific t-cell induction
US6156515A (en) * 1999-02-09 2000-12-05 Urocor, Inc. Prostate-specific gene for diagnosis, prognosis and management of prostate cancer
AU4807400A (en) 1999-04-30 2000-11-17 University Of Florida Adeno-associated virus-delivered ribozyme compositions and methods of use
PT1471926E (pt) 1999-06-01 2011-03-11 Baylor College Medicine Composições e métodos para a utilização terapêutica de uma sequência associada a atonal
WO2000079009A2 (en) 1999-06-22 2000-12-28 Invitrogen Corporation Improved primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
US6830902B1 (en) 1999-07-02 2004-12-14 Invitrogen Corporation Compositions and methods for enhanced sensitivity and specificity of nucleic acid synthesis
US6692918B2 (en) 1999-09-13 2004-02-17 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences
KR100527265B1 (ko) 1999-09-13 2005-11-09 뉴젠 테크놀로지스 인코포레이티드 폴리뉴클레오티드 서열의 선형 등온 증폭을 위한 방법 및조성물
US6489114B2 (en) 1999-12-17 2002-12-03 Bio Merieux Process for labeling a ribonucleic acid, and labeled RNA fragments which are obtained thereby
US6902891B2 (en) 1999-12-17 2005-06-07 Bio Merieux Process for labeling a nucleic acid
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
EP2192128A3 (en) 2000-04-21 2010-09-22 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
US7846733B2 (en) 2000-06-26 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
WO2002000938A2 (en) 2000-06-26 2002-01-03 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
JP2004513615A (ja) 2000-06-28 2004-05-13 コリクサ　コーポレイション 肺癌の治療および診断のための組成物および方法
CA2835978C (en) 2000-09-01 2016-10-11 Gen-Probe Incorporated Amplification of hiv-1 sequences for detection of sequences associated with drug-resistance mutations
WO2002034951A2 (en) 2000-10-23 2002-05-02 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting human immunodeficiency virus 2 (hiv-2)
AR031640A1 (es) 2000-12-08 2003-09-24 Applied Research Systems Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido
US6858413B2 (en) 2000-12-13 2005-02-22 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for generation of multiple copies of nucleic acid sequences and methods of detection thereof
CA2439795A1 (en) * 2001-03-07 2002-09-12 Biomerieux B.V. Method for the amplification and detection of dna using a transcription based amplification
MXPA02012739A (es) 2001-03-09 2004-04-20 Nugen Technologies Inc Metodos y composiciones para amplificacion de secuencias de arn.
JP2005504513A (ja) 2001-05-09 2005-02-17 コリクサ コーポレイション 前立腺癌の治療及び診断のための組成物及び方法
US7452705B2 (en) 2001-05-22 2008-11-18 The University Of Chicago N4 virion single-stranded DNA dependent RNA polymerase
EP1908851A3 (en) 2001-09-19 2008-06-25 Intergenetics Incorporated Genetic analysis for stratification of cancer risk
EP2135960A1 (en) 2001-09-19 2009-12-23 Intergenetics Incorporated Genetic analysis for stratification of cancer risk by determining the allelic profile of the VDR-ApaI and CYP11B2 genes
EP1430150B1 (en) 2001-09-24 2015-08-19 One Lambda, Inc. Diagnostic probe detection system
US20030165859A1 (en) 2001-10-23 2003-09-04 Invitrogen Corporation Primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
ES2405790T3 (es) 2001-12-17 2013-06-03 Corixa Corporation Composiciones y métodos para la terapia y el diagnóstico de enfermedad inflamatoria del intestino
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
JP2005515780A (ja) 2002-02-01 2005-06-02 セクイター インコーポレイテッド 二本鎖オリゴヌクレオチド
EP1506413B1 (en) 2002-05-17 2016-07-06 Becton Dickinson and Company Automated system for isolating, amplyifying and detecting a target nucleic acid sequence
EP2292801B1 (en) 2002-06-14 2018-08-08 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting hepatitis b virus
US7504215B2 (en) 2002-07-12 2009-03-17 Affymetrix, Inc. Nucleic acid labeling methods
ATE497774T1 (de) 2002-07-15 2011-02-15 Univ Texas Screening kombinatorischer proteinbibliotheken mittels periplasmatischer expression
WO2004014314A2 (en) 2002-08-12 2004-02-19 David Kirn Methods and compositions concerning poxviruses and cancer
AU2002951411A0 (en) 2002-09-16 2002-09-26 The University Of Sydney Genotype screen
US7115374B2 (en) 2002-10-16 2006-10-03 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting West Nile virus
US7074561B2 (en) 2002-10-22 2006-07-11 Biomerieux, Inc. Isothermal amplification based assay for the detection and quantitation of alpha-fetoprotein mRNA
US7960522B2 (en) 2003-01-06 2011-06-14 Corixa Corporation Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use
WO2004062599A2 (en) 2003-01-06 2004-07-29 Corixa Corporation Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use
US6852494B2 (en) 2003-01-10 2005-02-08 Linden Technologies, Inc. Nucleic acid amplification
ES2342665T3 (es) 2003-01-29 2010-07-12 454 Corporation Secuenciacion desde dos extremos.
US7718403B2 (en) 2003-03-07 2010-05-18 Rubicon Genomics, Inc. Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a DNA polymerization process
EP1606419A1 (en) 2003-03-18 2005-12-21 Quantum Genetics Ireland Limited Systems and methods for improving protein and milk production of dairy herds
CA2521084A1 (en) 2003-04-14 2004-10-28 Nugen Technologies, Inc. Global amplification using a randomly primed composite primer
CA3084542A1 (en) 2003-06-10 2005-01-06 The Trustees Of Boston University Gene expression analysis of airway epithelial cells for diagnosing lung cancer
EP1654361B2 (en) 2003-07-25 2023-01-18 Life Technologies Corporation Methods and compositions for preparing rna from a fixed sample
US20050059024A1 (en) 2003-07-25 2005-03-17 Ambion, Inc. Methods and compositions for isolating small RNA molecules
WO2005014795A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Genenews Inc. Osteoarthritis biomarkers and uses thereof
DE602004030271D1 (de) 2003-09-12 2011-01-05 Univ Cincinnati Verfahren zur risikobeurteilung, überlebensvorhersage und behandlung von herzversagen und anderen leiden auf der grundlage von polymorphismen adrenerger rezeptoren
EP1709198B1 (en) 2003-11-26 2013-08-14 AdvanDx, Inc. Peptide nucleic acid probes for analysis of certain staphylococcus species
DE602004028862D1 (de) 2003-12-19 2010-10-07 Gen Probe Inc Der nukleinsäuren von hiv-1 und hiv-2
US20050191682A1 (en) 2004-02-17 2005-09-01 Affymetrix, Inc. Methods for fragmenting DNA
BRPI0507929A (pt) 2004-02-19 2007-07-17 Univ Alberta polimorfismos de promotor de leptina e seus usos
EP1598428A1 (en) 2004-05-18 2005-11-23 Georg Dewald Methods and kits to detect Hereditary angioedema type III
EP2270034A3 (en) 2004-06-03 2011-06-01 Athlomics Pty Ltd Agents and methods for diagnosing stress
ES2392445T3 (es) 2004-07-13 2012-12-10 Gen-Probe Incorporated Composiciones y métodos para la detección de ácido nucleico del virus de la hepatitis A
US7713697B2 (en) 2004-08-27 2010-05-11 Gen-Probe Incorporated Methods and kits for amplifying DNA
AU2005280162B2 (en) 2004-08-27 2012-04-26 Gen-Probe Incorporated Single-primer nucleic acid amplification methods
EP1630236A3 (de) 2004-08-30 2006-05-03 FBF- Förderverein Biologieforschung der Deutschen Schweineproduktion e.V. Hernia inguinalis/scrotalis assozieerte Genomregionen
ATE469245T1 (de) 2004-09-14 2010-06-15 Univ Colorado Auf genetischem targeting basierendes verfahren zur behandlung mit bucindolol
US20060073506A1 (en) 2004-09-17 2006-04-06 Affymetrix, Inc. Methods for identifying biological samples
US20060068380A1 (en) 2004-09-30 2006-03-30 Gen-Probe Incorporated Assay for detecting and quantifying HIV-1
US20060073511A1 (en) 2004-10-05 2006-04-06 Affymetrix, Inc. Methods for amplifying and analyzing nucleic acids
CA2524964A1 (en) 2004-10-29 2006-04-29 Affymetrix, Inc. Automated method of manufacturing polymer arrays
US7682782B2 (en) 2004-10-29 2010-03-23 Affymetrix, Inc. System, method, and product for multiple wavelength detection using single source excitation
ES2391744T3 (es) 2004-11-01 2012-11-29 George Mason University Composiciones y procedimientos para el diagnóstico de trastornos del colon
US20060223080A1 (en) 2004-11-09 2006-10-05 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting group a streptococci
WO2006086438A2 (en) 2005-02-07 2006-08-17 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting group b streptococci
CA2599589A1 (en) 2005-02-07 2006-08-17 Genenews,Inc. Mild osteoarthritis biomarkers and uses thereof
DK1853706T3 (da) 2005-02-18 2011-03-07 Gen Probe Inc Prøve-fremstillingsfremgangsmåde med et alkali-chock
CN101128604A (zh) 2005-02-28 2008-02-20 生物探索公司 用于进行涉及核酸分子的直接酶反应的方法
RU2400538C2 (ru) 2005-03-05 2010-09-27 Сиджен, Инк. Олигонуклеотид с двойственной специфичностью и способы, в которых он используется
WO2006095941A1 (en) 2005-03-05 2006-09-14 Seegene, Inc. Processes using dual specificity oligonucleotide and dual specificity oligonucleotide
EP1712557A1 (en) 2005-04-14 2006-10-18 RWTH Aachen New s-adenosyl-L-methionine analogues with extended activated groups for transfer by methyltransferases
EP3770278A1 (en) 2005-04-14 2021-01-27 The Trustees of Boston University Diagnostic for lung disorders using class prediction
JP4773513B2 (ja) 2005-05-06 2011-09-14 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド Ａ型及びｂ型インフルエンザウイルスの核酸を検出するための組成物及びアッセイ
EP2623597B1 (en) 2005-05-13 2014-10-01 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Primer and probe for use in detection of Mycobacterium kansasii and method for detection of Mycobacterium kansasii using the same
CA2608636C (en) 2005-05-17 2015-02-10 Frank Koentgen Sequential cloning system
EP1910565A4 (en) 2005-07-07 2009-10-28 Athlomics Pty Ltd POLYNUCLEOTIDE MARKER GENES AND THEIR EXPRESSION IN THE DIAGNOSIS OF ENDOTOXEMIA
US7494788B2 (en) 2005-07-11 2009-02-24 Molecular Kinetics, Inc. Entropic bristle domain sequences and their use in recombinant protein production
US7838646B2 (en) 2005-08-18 2010-11-23 Quest Diagnostics Investments Incorporated Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene mutations
US8980246B2 (en) 2005-09-07 2015-03-17 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Oncolytic vaccinia virus cancer therapy
WO2007030759A2 (en) 2005-09-07 2007-03-15 Nugen Technologies, Inc. Improved nucleic acid amplification procedure
WO2007047912A2 (en) 2005-10-17 2007-04-26 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect legionella pneumophila nucleic acid
US8249814B2 (en) 2005-10-21 2012-08-21 Genenews Inc. Method, computer readable medium, and system for determining a probability of colorectal cancer in a test subject
EP2368868A1 (en) 2005-10-28 2011-09-28 Praecis Pharmaceuticals Inc. Methods for identifying compounds of interest using encoded libraries
EP1785434A1 (en) 2005-11-11 2007-05-16 Ludwig-Maximilians-Universität München Targeting and tracing of antigens in living cells
US7831417B2 (en) 2005-11-14 2010-11-09 Gen-Probe Incorporated Parametric calibration method
US8014957B2 (en) 2005-12-15 2011-09-06 Fred Hutchinson Cancer Research Center Genes associated with progression and response in chronic myeloid leukemia and uses thereof
EP2605018A1 (en) 2006-03-09 2013-06-19 The Trustees of the Boston University Diagnostic and prognostic methods for lung disorders using gene expression profiles from nose epithelial cells
US9234247B2 (en) 2006-03-13 2016-01-12 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Method for detection of mutant gene
AU2007225038B2 (en) 2006-03-15 2013-08-29 Perkinelmer Health Sciences, Inc. Integrated nucleic acid assays
CN101432426B (zh) 2006-05-02 2012-09-19 和光纯药工业株式会社 胞内分枝杆菌检测用引物和探针、以及使用该引物和探针的胞内分枝杆菌的检测方法
CA2651946A1 (en) 2006-05-12 2007-11-22 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect enterococci nucleic acid
EP2455491A3 (en) 2006-05-25 2012-07-18 Monsanto Technology LLC A method to identify disease resistant quantitative trait loci in soybean and compositions thereof
CA2654266A1 (en) 2006-06-12 2007-12-27 Oncomethylome Sciences S.A. Methylation markers for early detection and prognosis of colon cancers
JP5244103B2 (ja) 2006-08-09 2013-07-24 ホームステッド クリニカル コーポレイション 器官特異的蛋白質およびその使用方法
CA2921063C (en) 2006-09-15 2020-01-28 Ottawa Hospital Research Institute Oncolytic rhabdovirus
US9845494B2 (en) 2006-10-18 2017-12-19 Affymetrix, Inc. Enzymatic methods for genotyping on arrays
CA2668235A1 (en) 2006-11-02 2008-06-05 Yale University Assessment of oocyte competence
US8293684B2 (en) 2006-11-29 2012-10-23 Exiqon Locked nucleic acid reagents for labelling nucleic acids
CA2671264C (en) 2006-11-30 2015-11-24 Research Development Foundation Improved immunoglobulin libraries
CN103397024B (zh) 2006-12-18 2015-11-25 和光纯药工业株式会社 鸟分枝杆菌检测用引物和探针、以及使用它们检测鸟分枝杆菌的方法
ATE528286T1 (de) 2006-12-20 2011-10-15 Bayer Healthcare Llc 4-ä4-ä(ä3-tert-butyl-1-ä3-(hydroxymethyl)phenyl - 1h-pyrazol-5-ylücarbamoyl)-aminoü-3- chlorophenoxyü-n-methylpyridin-2-carboxamid als inhibitor der vegfr kinase zur behandlung von krebs
EP3095873B1 (en) 2006-12-21 2018-04-18 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
US7794937B2 (en) 2006-12-22 2010-09-14 Quest Diagnostics Investments Incorporated Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene mutations
GB0701253D0 (en) 2007-01-23 2007-02-28 Diagnostics For The Real World Nucleic acid amplification and testing
WO2008093098A2 (en) 2007-02-02 2008-08-07 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
US8183359B2 (en) 2007-03-01 2012-05-22 Gen-Probe Incorporated Kits for amplifying DNA
DK2623605T3 (en) 2007-04-09 2019-03-25 Univ Florida RAAV VECTOR COMPOSITIONS WITH TYROSIN MODIFIED CAPSIDE PROTEINS AND PROCEDURES FOR USE THEREOF
AU2008239594B2 (en) 2007-04-13 2013-10-24 Beth Israel Deaconess Medical Center Methods for treating cancer resistant to ErbB therapeutics
US8629245B2 (en) 2007-05-01 2014-01-14 Research Development Foundation Immunoglobulin Fc libraries
US7595164B2 (en) 2007-12-26 2009-09-29 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect Candida albicans nucleic acid
JPWO2009099037A1 (ja) 2008-02-08 2011-05-26 和光純薬工業株式会社 クラミドフィラ・キャビエ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたクラミドフィラ・キャビエの検出方法
US8034568B2 (en) 2008-02-12 2011-10-11 Nugen Technologies, Inc. Isothermal nucleic acid amplification methods and compositions
EP2250287B1 (en) 2008-02-19 2013-09-18 MDxHealth SA Detection and prognosis of lung cancer
US7846666B2 (en) 2008-03-21 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods of RNA amplification in the presence of DNA
EP2626435B1 (en) 2008-03-21 2016-06-01 MDxHealth S.A. Detection and prognosis of cervical cancer
EP2281070B1 (en) 2008-04-21 2015-01-21 Gen-Probe Incorporated Method for detecting chikungunya virus
CN103224932A (zh) 2008-05-28 2013-07-31 和光纯药工业株式会社 胞内分枝杆菌检测用引物和探针、以及使用该引物和探针检测胞内分枝杆菌的方法
EP2151502A1 (en) 2008-07-30 2010-02-10 Lohmann Tierzucht GmbH Genetic variations associated with feather pecking behaviour in avians
CA2679750A1 (en) 2008-09-23 2010-03-23 Nexus Dx, Inc. Methods for detecting nucleic acids in a sample
WO2010038042A1 (en) 2008-10-02 2010-04-08 Illumina Cambridge Ltd. Nucleic acid sample enrichment for sequencing applications
EP2210944A1 (en) 2009-01-22 2010-07-28 ATG:biosynthetics GmbH Methods for generation of RNA and (poly)peptide libraries and their use
JP2012517238A (ja) 2009-02-11 2012-08-02 カリス エムピーアイ インコーポレイテッド 腫瘍の分子プロファイリング法
EP3705486B1 (en) 2009-02-26 2022-11-16 Gen-Probe Incorporated Assay for detection of human parvovirus nucleic acid
KR101815716B1 (ko) 2009-04-22 2018-01-05 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 만성 폐쇄성 폐 질환 및 천식의 치료에 사용하기 위한 조성물
WO2010126913A1 (en) 2009-04-27 2010-11-04 Gen-Probe Incorporated Methods and kits for use in the selective amplification of target sequences
US9212397B2 (en) 2009-06-23 2015-12-15 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting nucleic acid from mollicutes
JP5785942B2 (ja) 2009-06-29 2015-09-30 ルミネックス コーポレーション ヘアピンコンフォメーションを有するキメラプライマーおよびその使用法
WO2011003020A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
US9409983B2 (en) 2009-07-23 2016-08-09 The Board Of Trustess Of The University Of Illinois Methods and compositions involving PBEF inhibitors for lung inflammation conditions and diseases
US10174368B2 (en) 2009-09-10 2019-01-08 Centrillion Technology Holdings Corporation Methods and systems for sequencing long nucleic acids
WO2011032040A1 (en) 2009-09-10 2011-03-17 Centrillion Technology Holding Corporation Methods of targeted sequencing
WO2011032088A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Arca Biopharma, Inc. Polymorphisms in the pde3a gene
EP3409119B1 (en) 2009-09-14 2020-08-12 SillaJen Biotherapeutics, Inc. Oncolytic vaccinia virus combination cancer therapy
US8182994B2 (en) 2009-09-15 2012-05-22 Illumina Cambridge Limited Centroid markers for image analysis of high denisty clusters in complex polynucleotide sequencing
WO2011036173A1 (en) 2009-09-24 2011-03-31 Oncomethylome Sciences S.A. Detection and prognosis of cervical cancer
WO2011056688A2 (en) 2009-10-27 2011-05-12 Caris Life Sciences, Inc. Molecular profiling for personalized medicine
KR20110050327A (ko) 2009-11-07 2011-05-13 주식회사 씨젠 Ｔｈｄ 프라이머 타겟 검출
US8501122B2 (en) 2009-12-08 2013-08-06 Affymetrix, Inc. Manufacturing and processing polymer arrays
MX337062B (es) 2009-12-10 2016-02-11 Ottawa Hospital Res Inst Rabdovirus oncolítico.
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
RU2551321C2 (ru) 2009-12-21 2015-05-20 Сиджен, Инк. Обнаружение мишени tsg-праймером
ES2587191T3 (es) 2009-12-23 2016-10-21 Arca Biopharma, Inc. Métodos y composiciones para enfermedades y afecciones cardiovasculares
EP2529026B1 (en) 2010-01-25 2013-11-13 Rd Biosciences Inc. Self-folding amplification of target nucleic acid
CA2786569C (en) 2010-01-29 2019-04-09 Micronics, Inc. Sample-to-answer microfluidic cartridge
EP3604558B1 (en) 2010-02-17 2022-10-12 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect atopobium vaginae nucleic acid
WO2011118496A1 (ja) 2010-03-23 2011-09-29 和光純薬工業株式会社 クラミジア・トラコマティス検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたクラミジア・トラコマティスの検出方法
WO2011127933A1 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Nuevolution A/S Bi-functional complexes and methods for making and using such complexes
CN103079567A (zh) 2010-04-17 2013-05-01 拜尔健康护理有限责任公司 用于疾病和病症的治疗和预防的氟取代的ω-羧基芳基二苯脲的合成代谢产物
CA3074551C (en) 2010-04-21 2021-05-04 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits to detect herpes simplex virus nucleic acids
JP5454338B2 (ja) 2010-04-28 2014-03-26 株式会社島津製作所 液滴操作によるリアルタイム核酸増幅法
KR101176139B1 (ko) 2010-05-20 2012-08-22 광주과학기술원 관절염 동물모델로서 연골 특이적 ＨＩＦ?２α 형질전환 마우스 및 이의 용도
KR101223660B1 (ko) 2010-05-20 2013-01-17 광주과학기술원 ＨＩＦ－２α 억제제를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
EP3305920B1 (en) 2010-07-12 2020-02-12 Gen-Probe Incorporated Compositions and assays to detect seasonal h3 influenza a virus nucleic acid
EP2749887A3 (en) 2010-07-23 2014-10-01 Beckman Coulter, Inc. System Or Method Of Including Analytical Units
WO2012030856A2 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and reaction mixtures for the detection of xenotropic murine leukemia virus-related virus
JP5904501B2 (ja) 2010-09-02 2016-04-13 国立研究開発法人理化学研究所 ２型糖尿病の検出方法
EP3438289A1 (en) 2010-10-04 2019-02-06 Gen-Probe Prodesse, Inc. Compositions, methods and kits to detect adenovirus nucleic acids
WO2012054639A2 (en) 2010-10-22 2012-04-26 T2 Biosystems, Inc. Nmr systems and methods for the rapid detection of analytes
US8563298B2 (en) 2010-10-22 2013-10-22 T2 Biosystems, Inc. NMR systems and methods for the rapid detection of analytes
CN105772122B (zh) 2010-12-21 2017-11-03 株式会社岛津制作所 用于在管内操作对象成分的器件和方法
WO2012090073A2 (en) 2010-12-30 2012-07-05 The Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting chemotherapy sensitivity
WO2012094386A1 (en) 2011-01-04 2012-07-12 Jennerex Inc. Generation of antibodies to tumor antigens and generation of tumor specific complement dependent cytotoxicity by administration of oncolytic vaccinia virus
CA2826467C (en) 2011-02-07 2019-11-12 Research Development Foundation Engineered immunoglobulin fc polypeptides
AU2012214312A1 (en) 2011-02-09 2013-08-22 Bio-Rad Laboratories, Inc. Analysis of nucleic acids
EP3062108B1 (en) 2011-02-24 2019-06-19 Hill's Pet Nutrition, Inc. Methods for diagnosing kidney disorders in a feline
US20140057295A1 (en) 2011-02-28 2014-02-27 Barbara J. Stegmann Anti-mullerian hormone changes in pregnancy and prediction of adverse pregnancy outcomes and gender
US9057107B2 (en) 2011-03-08 2015-06-16 King Abdullah University Of Science And Technology Molecular biomarker set for early detection of ovarian cancer
US9512467B2 (en) 2011-03-10 2016-12-06 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for the selection and optimization of oligonucleotide tag sequences
US20120252682A1 (en) 2011-04-01 2012-10-04 Maples Corporate Services Limited Methods and systems for sequencing nucleic acids
US20140287931A1 (en) 2011-04-04 2014-09-25 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut - Antoni Van Leeuwenhoek Ziekenhuis Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment
WO2012138783A2 (en) 2011-04-04 2012-10-11 Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment
KR101291668B1 (ko) 2011-04-21 2013-08-01 서울대학교산학협력단 미코박테리아―대장균용 셔틀 벡터 및 이의 용도
EP3604559A1 (en) 2011-04-25 2020-02-05 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bv-associated bacterial nucleic acid
AP2013007180A0 (en) 2011-04-25 2013-10-31 Advanced Bioscience Lab Inc Truncated HIV envelope proteins (ENV), methods andcompositions related thereto
ES2627529T3 (es) 2011-06-08 2017-07-28 Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. Composiciones para tratamiento de glioblastoma
US10144969B2 (en) 2011-06-15 2018-12-04 Colgate-Palmolive Company Compositions and methods for diagnosing and monitoring hyperthyroidism in a feline
WO2012177595A1 (en) 2011-06-21 2012-12-27 Oncofactor Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of cancer
CA2839896A1 (en) 2011-06-21 2012-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Assays and methods for determining activity of a therapeutic agent in a subject
CN103703148B (zh) 2011-07-15 2021-03-12 简.探针公司 在单路或多路测定法中用于检测人细小病毒核酸和用于检测甲型肝炎病毒核酸的组合物和方法
WO2013024175A2 (en) 2011-08-17 2013-02-21 Technische Universität München Diagnostic means and methods for type 2 diabetes
EP2753713B1 (en) 2011-09-08 2017-07-19 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bv-associated bacterial nucleic acid
US10040853B2 (en) 2011-09-09 2018-08-07 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions involving NKG2D inhibitors and cancer
FR2981088B1 (fr) 2011-10-06 2013-11-29 Biomerieux Sa Arn polymerases mutees
WO2013064163A1 (en) 2011-11-01 2013-05-10 Academisch Medisch Centrum Methylation markers for colorectal cancer
US9482684B2 (en) 2011-11-07 2016-11-01 Beckman Coulter, Inc. Centrifuge system and workflow
US9446418B2 (en) 2011-11-07 2016-09-20 Beckman Coulter, Inc. Robotic arm
JP2014532881A (ja) 2011-11-07 2014-12-08 ベックマン コールター， インコーポレイテッド 標本輸送システムのための磁気制動
EP3373015A1 (en) 2011-11-07 2018-09-12 Beckman Coulter Inc. Aliquotter system and workflow
BR112014011043A2 (pt) 2011-11-07 2017-06-13 Beckman Coulter Inc detecção de recipiente de espécime
BR112014010955A2 (pt) 2011-11-07 2017-06-06 Beckman Coulter Inc sistema e método para processar amostras
CA2855640C (en) 2011-11-14 2020-03-10 The General Hospital Corporation Assays and methods for selecting a treatment regimen for a subject with depression
DE102011120550B4 (de) 2011-12-05 2013-11-07 Gen-Probe Prodesse, Inc. Zusammensetzungen, Verfahren und Kits zur Detektion von Adenovirusnukleinsäuren
CA2859149A1 (en) 2011-12-19 2013-06-27 Hill's Pet Nutrition, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating hyperthyroidism in companion animals
WO2013093629A2 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Netherlands Cancer Institute Modular vaccines, methods and compositions related thereto
JP5807542B2 (ja) 2011-12-22 2015-11-10 株式会社島津製作所 対象成分を操作するためのチップデバイス及びそれを用いた方法
EP3269820A1 (en) 2011-12-22 2018-01-17 Ibis Biosciences, Inc. Kit for the amplification of a sequence from a ribonucleic acid
JP6196241B2 (ja) 2012-02-02 2017-09-13 インベンラ， インコーポレイテッド 生物学的に活性なポリペプチドのハイスループットスクリーニング
AU2013205010B2 (en) 2012-02-24 2016-10-20 Gen-Probe Incorporated Detection of Shiga toxin genes in bacteria
CA2865575C (en) 2012-02-27 2024-01-16 Cellular Research, Inc. Compositions and kits for molecular counting
US11177020B2 (en) 2012-02-27 2021-11-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and uses for molecular tags
WO2013129542A1 (ja) 2012-02-29 2013-09-06 独立行政法人理化学研究所 Ｈｌａ－ａ＊３１：０１アレルの検出方法
CN104471075B (zh) 2012-04-19 2018-06-22 生命技术公司 核酸扩增
EP3095879B1 (en) 2012-04-19 2018-09-19 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
AU2013205110B2 (en) 2012-04-24 2016-10-13 Gen-Probe Incorporated Compositions, Methods and Kits to Detect Herpes Simplex Virus Nucleic Acids
AU2013205064B2 (en) 2012-06-04 2015-07-30 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Amplifying and Characterizing HCV Nucleic Acid
AU2013205087B2 (en) 2012-07-13 2016-03-03 Gen-Probe Incorporated Method for detecting a minority genotype
EP2877952B1 (en) 2012-07-27 2023-04-12 Gen-Probe Incorporated Dual reference calibration method and system for quantifying polynucleotides
AU2013202808B2 (en) 2012-07-31 2014-11-13 Gen-Probe Incorporated System and method for performing multiplex thermal melt analysis
US9139870B2 (en) 2012-08-30 2015-09-22 Gen-Probe Incorporated Multiphase nucleic acid amplification
EP2895620B1 (en) 2012-09-11 2017-08-02 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
WO2014043143A1 (en) 2012-09-11 2014-03-20 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
US9725774B2 (en) 2012-10-04 2017-08-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and reagents for detection, quantitation, and serotyping of dengue viruses
AU2013205122B2 (en) 2012-10-11 2016-11-10 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Human Papillomavirus Nucleic Acid
EP3524691A1 (en) 2012-12-07 2019-08-14 SuppreMol GmbH Stratification and treatment of patients of idiopathic thrombocytopenic purpura
AU2013205090B2 (en) 2012-12-07 2016-07-28 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Gastrointestinal Pathogen Nucleic Acid
WO2014100732A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Micronics, Inc. Fluidic circuits and related manufacturing methods
US10518262B2 (en) 2012-12-21 2019-12-31 Perkinelmer Health Sciences, Inc. Low elasticity films for microfluidic use
EP2935559B1 (en) 2012-12-21 2020-09-16 PerkinElmer Health Sciences, Inc. Fluorescence detection system
WO2014116721A1 (en) 2013-01-22 2014-07-31 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Geminiviral vector for expression of rituximab
CA2897474A1 (en) 2013-01-24 2014-07-31 California Institute Of Technology Chromophore-based characterization and detection methods
US10077475B2 (en) 2013-01-24 2018-09-18 California Institute Of Technology FRET-based analytes detection and related methods and systems
CN105658790A (zh) 2013-02-21 2016-06-08 东安大略研究所儿童医院有限公司 疫苗组合物
AU2013202805B2 (en) 2013-03-14 2015-07-16 Gen-Probe Incorporated System and method for extending the capabilities of a diagnostic analyzer
US9255265B2 (en) 2013-03-15 2016-02-09 Illumina, Inc. Methods for producing stranded cDNA libraries
EP2971090B1 (en) 2013-03-15 2020-05-06 Gen-Probe Incorporated Calibration method, apparatus and computer program product
KR101403507B1 (ko) 2013-03-21 2014-06-09 주식회사 현일바이오 결핵균 및 비결핵 마이코박테리아의 선택적 검출 방법, 그리고 이를 이용한 키트
WO2014160818A2 (en) 2013-03-27 2014-10-02 Sample Technologies, Inc. Recombinant phage and bacterial detection methods
KR101507505B1 (ko) 2013-04-18 2015-04-07 사회복지법인 삼성생명공익재단 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단 방법
US10386377B2 (en) 2013-05-07 2019-08-20 Micronics, Inc. Microfluidic devices and methods for performing serum separation and blood cross-matching
CN105189750B (zh) 2013-05-07 2020-07-28 珀金埃尔默健康科学有限公司 使用粘土矿物和碱性溶液制备含核酸样品的方法
JP6484222B2 (ja) 2013-05-07 2019-03-13 マイクロニクス， インコーポレイテッド 核酸の調製および分析のためのデバイス
US20160186263A1 (en) 2013-05-09 2016-06-30 Trustees Of Boston University Using plexin-a4 as a biomarker and therapeutic target for alzheimer's disease
US9828625B2 (en) 2013-06-19 2017-11-28 Phage Diagnostics, Inc. Phage-based bacterial detection assay
US9547006B2 (en) 2013-08-08 2017-01-17 Institut Pasteur Correlation of disease activity with clonal expansions of human papillomavirus 16-specific CD8+ T-cells in patients with severe erosive oral lichen planus
US10053742B2 (en) 2013-08-14 2018-08-21 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting HEV nucleic acid
AU2014312208B2 (en) 2013-08-28 2019-07-25 Becton, Dickinson And Company Massively parallel single cell analysis
AU2014329535B2 (en) 2013-10-03 2017-09-07 Oklahoma Medical Research Foundation Biomarkers for systemic lupus erythematosus disease activity, and intensity and flare
CN105940115B (zh) 2013-11-15 2021-07-06 巴斯德研究所 恶性疟原虫青蒿素耐药性的分子标记物
CN106103713B (zh) 2014-02-03 2021-05-28 赛默飞世尔科技波罗的海封闭股份公司 用于经控制dna片段化的方法
EP3154693B1 (en) 2014-06-11 2021-11-03 PerkinElmer Health Sciences, Inc. Method for performing a sample assay with a microfluidic cartridges with integrated assay controls
GB201415349D0 (en) 2014-08-29 2014-10-15 Univ Leuven Kath Cofactor analogues for methyltransferases
US20180057839A1 (en) 2014-11-26 2018-03-01 The Regents Of The University Of California Therapeutic compositions comprising transcription factors and methods of making and using the same
SG10202012249YA (en) 2014-12-08 2021-01-28 Berg Llc Use of markers including filamin a in the diagnosis and treatment of prostate cancer
EP3242956B1 (en) 2015-01-09 2020-06-17 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for diagnosing bacterial vaginosis
KR101718800B1 (ko) 2015-01-21 2017-03-24 주식회사 디알나노 약물 및 ｓｉＲＮＡ의 공동―운반용 나노복합체 및 이의 용도
CA2976236A1 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Research Development Foundation Engineered immunoglobulin fc polypeptides displaying improved complement activation
EP3064592A1 (en) 2015-03-06 2016-09-07 Brigitte König Methods for the qualitative and quantitative detection of microbes in a sample
US10550438B2 (en) 2015-03-16 2020-02-04 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for detecting bacterial nucleic acid
EP3653728B1 (en) 2015-06-09 2023-02-01 Life Technologies Corporation Methods, systems, compositions, kits, apparatus and computer-readable media for molecular tagging
RU2018105835A (ru) 2015-07-17 2019-08-19 Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж Способы амплификации последовательностей нуклеиновых кислот
US10526408B2 (en) 2015-08-28 2020-01-07 Research Development Foundation Engineered antibody FC variants
US20180305748A1 (en) 2015-10-18 2018-10-25 Affymetrix, Inc. Multiallelic Genotyping of Single Nucleotide Polymorphisms and Indels
KR101651817B1 (ko) 2015-10-28 2016-08-29 대한민국 Ngs 라이브러리 제작용 프라이머 세트 및 이를 이용한 ngs 라이브러리 제작방법 및 키트
WO2017100283A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Life Technologies Corporation Detection and quantification of nucleic acid molecules associated with a surface
US11111549B2 (en) 2016-01-04 2021-09-07 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for detecting Candida species
LT3402880T (lt) 2016-01-15 2024-03-12 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Termofiliniai dnr polimerazės mutantai
CA3011991A1 (en) 2016-01-21 2017-07-27 T2 Biosystems, Inc. Rapid antimicrobial susceptibility testing using high-sensitivity direct detection methods
KR101845957B1 (ko) 2016-02-23 2018-04-05 전남대학교기술지주회사(주) 프로히비틴 유전자 타깃 백혈병 진단용 키트 및 이를 이용한 진단 방법
WO2017180745A1 (en) 2016-04-14 2017-10-19 T2 Biosystems, Inc. Methods and systems for amplification in complex samples
US20200185063A1 (en) 2016-06-05 2020-06-11 Berg Llc Systems and methods for patient stratification and identification of potential biomarkers
EP3985131A1 (en) 2016-06-10 2022-04-20 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting zika virus nucleic acid
US20190218623A1 (en) 2016-08-10 2019-07-18 Institut Pasteur Methods and reagents for detecting piperaquine-resistant plasmodium falciparum malaria
WO2018071522A1 (en) 2016-10-11 2018-04-19 Life Technologies Corporation Rapid amplification of nucleic acids
WO2018075633A2 (en) 2016-10-19 2018-04-26 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying hepatitis c virus
EP3541959A1 (en) 2016-11-21 2019-09-25 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying hepatitis b virus
KR102402712B1 (ko) 2016-12-29 2022-05-26 주식회사 씨젠 프라이머 다이머 형성을 감소시키고 증폭 효율을 증가시키는 방법
KR101936799B1 (ko) 2017-01-09 2019-01-11 주식회사 엠이티라이프사이언스 구강전암의 치료용 약학 조성물 및 구강전암 또는 구강암의 예측 또는 진단 방법
AU2018213315A1 (en) 2017-01-26 2019-07-25 Oklahoma Medical Research Foundation Biomarkers for systemic lupus erythematosus disease activity, and intensity and flare
WO2018146162A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Academisch Medisch Centrum Molecular biomarker for prognosis of sepsis patients
EP4212634A1 (en) 2017-03-24 2023-07-19 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detection of flu b in samples
CA3057154A1 (en) 2017-03-24 2018-09-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying parainfluenza virus
CN110914448A (zh) 2017-06-02 2020-03-24 昂飞股份有限公司 使用差异性标记的等位基因特异性探针分析混合样品的基于阵列的方法
US11441174B2 (en) 2017-06-02 2022-09-13 Affymetrix, Inc. Array-based methods for analysing mixed samples using differently labelled allele-specific probes
JP7292217B2 (ja) 2017-06-07 2023-06-16 ジーイーエヌ－プローブ・インコーポレーテッド 試料中のバベシア種の核酸の検出
GB2578038B (en) 2017-06-16 2022-11-23 Life Technologies Corp Control nucleic acids, and compositions, kits, and uses thereof
EP3645710A1 (en) 2017-06-26 2020-05-06 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Thermophilic dna polymerase mutants
EP3651893B1 (en) 2017-07-10 2023-11-15 Gen-Probe Incorporated Analytical systems and methods for nucleic acid amplification using sample assigning parameters
WO2019017680A2 (ko) 2017-07-19 2019-01-24 국민대학교 산학협력단 파킨슨병 바이오마커로서의 miRNA 및 이를 이용한 진단키트
KR101956315B1 (ko) 2017-07-19 2019-03-08 국민대학교 산학협력단 파킨슨병 바이오마커로서의 miR494 및 이를 이용한 진단키트
EP4219766A3 (en) 2017-08-11 2023-10-11 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting staphylococcus aureus
EP3707278A1 (en) 2017-11-09 2020-09-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Assays and methods for determining expression of the lect2 gene
CA3082909C (en) 2017-11-17 2023-07-25 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting c1orf43 nucleic acid
CA3089078A1 (en) 2018-01-29 2019-08-01 Gen-Probe Incorporated Analytical systems and methods
CA3103442A1 (en) 2018-06-13 2019-12-19 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting group b streptococcus nucleic acid
US20210317515A1 (en) 2018-07-10 2021-10-14 Gen-Probe Incorporated Methods and systems for detecting and quantifying nucleic acids
CA3106975A1 (en) 2018-08-01 2020-02-06 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting nucleic acids of epstein-barr virus
CN109306376B (zh) * 2018-08-03 2022-06-24 国家卫生计生委科学技术研究所 检验核酸扩增均一性的质量控制标准品及其制备方法
EP3841223A1 (en) 2018-08-08 2021-06-30 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting mycoplasma genitalium
JP2021534758A (ja) 2018-08-21 2021-12-16 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド ヒトサイトメガロウイルスを増幅、検出、または定量化するための組成物および方法
JP7389111B2 (ja) 2018-08-24 2023-11-29 ジェン－プローブ・インコーポレーテッド 細菌の核酸を検出し、細菌性膣炎を診断するための組成物および方法
WO2020053808A1 (en) 2018-09-12 2020-03-19 Georg Dewald Method of diagnosing vasoregulatory disorders
CA3112651A1 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bordetella pertussis and bordetella parapertussis nucleic acid
JP2022508954A (ja) 2018-10-22 2022-01-19 ジェン－プローブ・インコーポレーテッド ヒトポリオーマウイルスｂｋウイルスを増幅、検出または定量化するための組成物および方法
WO2020089841A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Garcia Joe G N Biomarkers and methods of use for radiation-induced lung injury
MX2021006234A (es) 2018-11-30 2021-09-10 Caris Mpi Inc Perfilado molecular de proxima generacion.
TW202030333A (zh) 2018-12-20 2020-08-16 美商簡 探針公司 用於檢測瘧原蟲物種核酸之組成物及方法
WO2020142347A2 (en) 2018-12-31 2020-07-09 Gen-Probe Incorporated Systems and methods for filling multi-well cartridges with solid reagents
JP2022529294A (ja) 2019-04-17 2022-06-20 アイジェノミクス、ソシエダッド、リミターダ 子宮平滑筋腫および平滑筋肉腫の早期診断のための改良方法
KR20220015394A (ko) 2019-04-30 2022-02-08 라리마 테라퓨틱스, 인코포레이티드 프라탁신 대체 요법의 유효성 결정을 위한 프라탁신 민감성 마커
CA3176699A1 (en) 2019-05-03 2020-11-12 Gen-Probe Incorporated Receptacle transport system for an analytical system
BR112021024853A2 (pt) 2019-06-14 2022-01-18 Seegene Inc Método implementado por computador para o desenvolvimento colaborativo de reagentes para a detecção de ácidos nucleicos-alvo
CA3144452A1 (en) 2019-07-03 2021-01-07 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides for use in determining the presence of trichomonas vaginalis in a sample
US20220298548A1 (en) 2019-08-23 2022-09-22 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting treponema pallidum
CA3153514A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Gen-Probe Incorporated Detection of chlamydia trachomatis nucleic acid variants
IL293489A (en) 2019-12-02 2022-08-01 Caris Mpi Inc predictor of pan-cancer platinum response
AU2020402029B2 (en) 2019-12-09 2022-12-15 Gen-Probe Incorporated Quantification of polynucleotide analytes from dried samples
AU2021230341A1 (en) 2020-03-04 2022-10-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting SARS-CoV-2 nucleic acid
US20230220499A1 (en) 2020-05-07 2023-07-13 Grifols Diagnostic Solutions Inc. Methods and compositions for detecting sars-cov-2 nucleic acid
EP4163397A1 (en) 2020-06-05 2023-04-12 Seegene, Inc. Specimen transport kit for detecting respiratory pathogens and methods for detecting respiratory pathogens using same
WO2022006286A1 (en) 2020-06-30 2022-01-06 Lunglife Ai Methods for detecting lung cancer
WO2022047359A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Berg Llc Protein biomarkers for pancreatic cancer
CN116323440A (zh) 2020-10-21 2023-06-23 简·探针公司 流体容器管理系统
US20230059578A1 (en) 2021-04-06 2023-02-23 Berg Llc Protein markers for estrogen receptor (er)-positive-like and estrogen receptor (er)-negative-like breast cancer
EP4320440A1 (en) 2021-04-06 2024-02-14 BPGbio, Inc. Protein markers for estrogen receptor (er)-positive luminal a(la)-like and luminal b1 (lb1)-like breast cancer
CA3214833A1 (en) 2021-04-06 2022-10-13 Bpgbio, Inc. Protein markers for the prognosis of breast cancer progression
AU2022315102A1 (en) 2021-07-21 2024-02-22 Seegene, Inc. Assembled analysis system, method, and computer readable recording medium
CA3226812A1 (en) 2021-07-27 2023-02-02 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting gastrointestinal pathogens
US20230357851A1 (en) 2022-04-06 2023-11-09 Larimar Therapeutics, Inc. Frataxin-sensitive markers for monitoring frataxin-replacement therapy
EP4282980A1 (en) 2022-05-23 2023-11-29 Mobidiag Oy Methods for amplifying a nucleic acid
WO2023230531A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Lunglife Ai, Inc. Methods for detecting circulating genetically abnormal cells
WO2023240201A1 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Larimar Therapeutics, Inc. Frataxin-sensitive markers for monitoring progression and treatment of leigh syndrome
US20240010742A1 (en) 2022-06-10 2024-01-11 Research Development Foundation Engineered fcriib selective igg1 fc variants and uses thereof
WO2024054924A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Gen-Probe Incorporated Method of detecting nucleic acid analytes using dual-specificity primers

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0128042A3 (en) 1983-06-06 1985-01-16 Genentech, Inc. A process for indentifying or isolating a dna sequence, and a dna hybridization probe therefor
CA1288073C (en) 1985-03-07 1991-08-27 Paul G. Ahlquist Rna transformation vector
ES8706823A1 (es) 1985-03-28 1987-06-16 Cetus Corp Un procedimiento para detectar la presencia o ausencia de al menos una secuencia especifica de acidos nucleicos en una muestra
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
AU606043B2 (en) * 1985-03-28 1991-01-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Detection of viruses by amplification and hybridization
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
CA1339653C (en) * 1986-02-25 1998-02-03 Larry J. Johnson Appartus and method for performing automated amplification of nucleic acid sequences and assays using heating and cooling steps
FI76119C (fi) 1986-02-27 1988-09-09 Orion Yhtymae Oy Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet.

Also Published As

Publication number Publication date
JPH02500565A (ja) 1990-03-01
KR890701741A (ko) 1989-12-21
DE3856428T2 (de) 2001-04-19
NZ225077A (en) 1991-06-25
PT87769A (pt) 1989-05-31
NO895090D0 (no) 1989-12-18
DK175614B1 (da) 2004-12-27
EP0368906A1 (en) 1990-05-23
DE3852177T3 (de) 2000-06-15
DK644489A (da) 1990-02-19
FI896077A0 (fi) 1989-12-19
WO1988010315A1 (en) 1988-12-29
EP0623683B1 (en) 2000-09-27
EP0368906B2 (en) 1999-08-04
EP0368906B1 (en) 1994-11-23
DE3852177D1 (de) 1995-01-05
FI93743C (fi) 1995-05-26
IE65089B1 (en) 1995-10-04
BR8807097A (pt) 1989-10-17
NO895090L (no) 1990-02-19
IL86724A0 (en) 1988-11-30
IE950293L (en) 1988-12-19
JP2843586B2 (ja) 1999-01-06
KR960014107B1 (ko) 1996-10-14
DE3852177T2 (de) 1995-04-06
ATE196657T1 (de) 2000-10-15
FI93743B (fi) 1995-02-15
IE881848L (en) 1988-12-19
NO303068B1 (no) 1998-05-25
ATE114335T1 (de) 1994-12-15
DE3856428D1 (de) 2000-11-02
PT87769B (pt) 1992-10-30
HUT52823A (en) 1990-08-28
IL86724A (en) 1995-01-24
ES2009286A6 (es) 1989-09-16
DK644489D0 (da) 1989-12-19
GR880100396A (el) 1989-03-08
EP0623683A1 (en) 1994-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU216317B (hu) Eljárás transzkripcióra alapozott nukleinsav sokszorozó/észlelő rendszerek előállítására
CA2005589C (en) Self-sustained, sequence replication system
JP2648802B2 (ja) 増強された核酸増幅方法
US5112734A (en) Target-dependent synthesis of an artificial gene for the synthesis of a replicatable rna
JP3936798B2 (ja) Ｒｎａ標的配列の増幅方法
US6063603A (en) Nucleic acid amplification process
US5409818A (en) Nucleic acid amplification process
JPH08205894A (ja) 核酸の高感度検出方法
AU623602B2 (en) Transcription-based nucleic acid amplification/detection systems
EP0418960A2 (en) Nucleic acid detection method using unequal primer concentrations in polymerase chain reaction
IE83297B1 (en) Transcription-based nucleic acid amplification/detection systems
JPH0852000A (ja) 核酸の同時増幅方法
IE19950293A1 (en) Transcription-based nucleic acid amplification/detection systems

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: AKZO NOBEL N.V., NL