DK175614B1 - Transkriptionsbaseret nukleinsyre-forstærknings/påvisningssystemer - Google Patents

Description

DK 175614 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår generelt fremskridt inden for molekylbiologi og molekylgenteknologi.

Nærmere bestemt angår den foreliggende opfindelse hidtil 5 ukendte fremgangsmåder indeholdende nødvendige reagen ser og midler til forøgelse af in vitro eller x-vivo kopiantallet, dvs. forstærkning, af i det mindste et udvalgt segment (sekvens) af nukleinsyre eller dets komplement eller hybridi-serende homologe segment i en prøve omfattende en eller flere 10 nukleinsyrer, som kan indbefatte RNA, DNA eller begge.

Blandt de anvendelser, hvor fremgangsmåderne ifølge den foreliggende opfindelse finder anvendelse er 1) ved analyser af legemsvæsker og -væv til påvisningen af specifikke 15 nukleinsyresekvenser, som er karakteristiske for en genetisk eller patogen sygdom eller tilstand ved in vitro eller x-vivo nukleinsyresondehybridi ser ingsanalyser, og 2) ved den selektive kloning af enkelt-kop i gener eller sjældne gener eller gener, som udtrykkes i lille mængde.

20

Meget af arbejdet inden for molekylbiologi, molekylgenteknologi og anvendelser deraf, såsom f.eks. nukleinsyresondehybri diser i ngsana 1 yser for blodbårne patogener eller mangelfulde gener, involverer påvisningen eller isoleringen af en bestemt 25 nukleinsyresekvens. Et fundamentalt problem inden for dette arbejde er at påvise eller isolere og derefter kvantitetsbestemme en nukleinsyresekvens, som har interesse. Det har været et vanskeligt problem, da biologiske materialer, såsom cellekulturer, vævsstoffer og blodprøver typisk er sammensat 30 af en kompleks blanding af RNA- og DNA-entiteter, hvoraf for det meste kun en meget lille fraktion har en sekvens, som har interesse.

Praktiske anvendelser af nukleinsyresondehybridiseringsanaly-35 ser har faktisk været begrænset på grund af, at analysernes følsomhed, når de blev udført sammen med reagenser, som er egnede til rutinebrug, og i løbet af acceptabelt korte tidsrum

I DK 175614 B1 I

I 2 I

I er for ringe til at påvise sekvenser, som har interesse, i de I

I lave koncentrationer, hvorved de forekommer i virkelige prø- I

I ver. I

I 5 Problemet med påvisning af en nukleinsyresekvens, som har in- I

I teresse ("målsegment") og som er til stede i en lav koncen- I

I tration i en kompleks blanding af nukleinsyrer, er blevet an- I

I grebet på to fundamentalt forskellige måder.

I 10 Ved den· første metode ændres mængden af nukleinsyre (omfatten- I

I de mål segmentet) i en prøve ikke, men i stedet sættes et sig- I

I nalfrembri ngende system i forbindelse med målsegmentet og

I frembringer et påviseligt signal, som repræsenterer antallet I

I af målsegmentmolekyler. F.eks. forbindes en nukleinsyresonde, I

I 15 som har en sekvens, der er komplementær til sekvensen af et I

I undersegment af må 1 segmentet, til et enzym, såsom alkalisk I

I phosphatase og blandes med prøven under hybridiseringsbetin- I

I gelser, som vil bevirke hybridi ser ing mellem sonden og målseg- I

I mentet (men ikke væsentligt mellem sonde og andre nukleinsyre- I

I 20 sekvenser i prøven). Efter fjernelse af enzymforbundet sonde, I

I som ikke hybri di serede, tilsættes et chromogent substrat for

I alkalisk phosphatase under passende forhold og i princippet I

I fremstilles et stort antal påviselige, farvede molekyler hur- I

I tigt for hvert sondemolekyle, som er hybridiseret til målseg- ' I 25 ment.

I Adskillige andre systemer til påvisning af nukleinsyresekven- I

I ser uden ændring af mængden af må 1nuk 1 einsyre i prøven er I

I kendt inden for området. Et andet eksempel er den almindeligt H

I 30 anvendte mærkning af en nukleinsyresonde med radioaktive ato- H

I mer, såsom 32P og derefter påvisning af sonde, som er hybridi- I

I seret til mål via forstærket signal, som er initieret ved hen- I

I fald af de radioaktive kerner. Endnu et andet eksempel invol- I

I verer, at man til en sonde for målsegmentet binder en anden H

I 35 nukleinsyre, som er i stand til replikation, således at den I

I let kan påvises ved hjælp af kendte teknikker. Der kendes vis- I

I se RNA'er, som er modtagelige for (autokatalytisk) replikase- I

3 DK 175614 B1 induceret replikation af en bestemt polymerase, såsom bakte-riofag-RNA-afhængig RNA-po1 ymerase, såsom QØ-replikase og replikasen fra bromemosaikvirus (BMV). I et sådant system er både en RNA-sekvens og RNA'et med komplementær sekvens skabe-5 loner for replikation af RNA-polymerasen. Således forøges mængden af replikeret RNA eksponentielt med tiden, {så længe, at antallet af RNA-skabelonmolekyler ikke overstiger antallet af RNA-polymerasemolekyler i et system). Se Miele et al., J.

Mol. Biol. 171 , 281 ( 1983). Et system, hvori en sonde for et 10 målsegment er forbundet til RNA, som er i stand til at blive replikeret ved hjælp af Q/3-rep 1 ikase, er beskrevet af Chu et al., Nucl. Acids Res. 14, 5591 (1986), og det af BMV-replikase af March et al., Positive Strand RNA Viruses, Alan R. Liss (pubir.; New York) (1987; Proceedings of UCLA Symposium, 15 1986).

Den første metode har to alvorlige ulemper. For det første er kopiantallet af målsegment i mange tilfælde i en prøve af praktisk størrelse så lav, at selv med rimeligt hurtig .signal-' 20 frembringende systemer, er tidsrummet, som er nødvendigt for at frembringe et påviseligt signal, dvs. signifikant over baggrund, upraktisk lang. Dernæst forekommer signa1frembringe1 se i alt væsentlig i den samme grad fra "bagrunds"-signalfrem-bringende molekyler som fra s igrialfrembringende molekyler, som 25 er forbundet med målet. I en hvilken som helst analyse for et målsegment er et signal, som skyldes "baggrund" ikke til at undgå. Dvs. der vil ufravigeligt være noget af signalet, som skyldes sonde, som ikke-specifikt klæber til filtre eller andre faste bærere eller hybridiserer til segmenter med se-30 kvenser, som nøje ligner mål segmentets . Hvis må 1 kop ianta11 et er for lavt, vil det tidskonstante forhold mellem signal fra mål samt baggrund (dvs. "signal") og signal fra baggrund (dvs. "støj") være for lavt til signifikant at være påviseligt over baggrund. Disse og andre ulemper har ført til, at fagfolk in-35 den for området har forsøgt at angribe problemet med påvisning af et målsegment, som er til stede i en lav mængde i en kompleks blanding af nukleinsyrer, på en anden måde.

DK 175614 B1 I

Denne anden måde er fundamentalt anderledes og involverer for- I

øgelse af kopiantallet af selve målsegmentet, fortrinsvis til I

en grad større end den af andre sekvenser i en prøve, især så-

danne, som muligvis fejlagtig ville blive påvist som målseg- H

5 ment på grund af ligheder i sekvens. Eksempler på denne anden H

måde omfatter forskellige dyrkningsteknikker, hvor cellerne, H

som indeholder mål segmentet, fås til at forøges i antal, til H

tider hurtigere end antallet af andre celler, eller hvor be- H

stemte nukleinsyrer (f.eks. plasmider, RNA'er) deri med dispo- I

10 neret målsegment fås til at forøges i antal. H

Ulemperne ved sådanne dyrkningsteknikker er, at de er besvær- H

lige og problematiske og tidsforbrugende, og giver udslag i H

det uundgåelige: andre nukleinsyrer end de, som omfatter mål- I

15 segment forøges samtidigt i kopiantal, og "baggrund" forøges I

således potentielt. En anden ulempe er den resulterende vækst H

af potentielt farlige organismer som et nødvendigt trin til at I

opnå forstærkning. I

20 Et andet eksempel på denne anden måde er forstærkning af et I

DNA-må1 segment ved hjælp af en såkaldt "polymerasekædereak- I

tion" ("PCR"). Denne teknik er en lånt tilpasning af kendte H

naturligt forekommende processer, som sker ved repli kat ions- H

processen af f.eks. enkelt-strengede DNA-genomer af visse H

25 vi rusent i-teter og repræsenterer i alle tilfælde en anvendelse H

beslægtet med cDNA-fremst i 11 ing ala Hong, Bioscience Reports H

1, 243 (1981); Cooke et al., J. Biol. Chem. 255, 6502 (1980); I

og Zoller et al;, Methods in Enzymology 100, 468-500 (1983). H

Ved denne teknik forøges et bestemt segment i kopiantal ekspo- I

30 nentielt med et antal cyklusser, som hver medfører (1) hybri- I

disering af en DNA-primer til et 3'-terminalt undersegment af H

hver af målsegmentet og dets komplement (dvs. segmentet med en H

sekvens komplementær til sekvensen af må 1 segmentet), (2) for- I

længelse af hver af primerne med en DNA-polymerase, og (3) I

35 at gøre enkelt-strenget ved termisk denaturering af duplexer- I

ne, som er et resultat af trin (2). Denne teknik er beskrevet I

i Saiki et al.. Science 230, 1350 (1985) og Mullis et al., I

5 DK 175614 B1 europæisk patentansøgning med publikationsnummeret 200362 og 201184. Se ligeledes US patentskriftet nr. 4.683.195 og 4.683.202. Således kan kopiantallet af et målsegment forøges 5 med en faktor på ca. 105 ved anvendelse af teknikken i 20 cyklusser i løbet af ca. 3 timer. På grund af, at kun de segmenter, hvortil en specifik primer hybridiserer med en tilstrækkelig stabilitet til at initiere kædefor 1ænge1 se af polymerasen til dannelse af komp 1 ementen, og som har en komplement, hvortil en anden specifik primer hybridiserer på lignen-10 de måde. til opnåelse af målsegment ved kædeforlængelse, forøges de eksponentielt i kopiantal, mens andre ikke-målsegmen-ter, som ikke fejlagtigt er hybridiseret med den anvendte primer, forøges, hvis overhovedet, højst lineært i kopiantal som en funktion af antallet af cyklusser. Polymerasekædereak-tionsteknikken kan i høj grad forøge ikke kun kopiantallet af 15 målsegment, men også forholdet mellem mængden af målsegment og mængden af bagrundsforårsagende segmenter i en prøve.

Det følger selvsagt, at denne anden måde kan anvendes på en prøve i forbindelse med anvendelse af den første måde anvendt med det forstærkede målsegment til tilvejebringelse af et 20 endnu stærkere påvisningssignal.

En yderligere udvikling af den anden måde er beskrevet i EP-A-031029, der tilhører den kendte teknik i kraft af Artikel 54(3) EPC. Fremgangsmåden indbefatter frembrin-25 gelse af et dobbeltstrenget DNA-mell emprodukt omfattende en promotor efterfulgt af en målsekvens. Dette mellemprodukt anvendes så til at fremstille mangfoldige RNA-kopier ved brug af en RNA-polymerase.

I DK 175614 B1 I

I I

I Det er formålet med den foreliggende opfindelse at løse pro- H

I blemerne, som den kendte teknik har behandlet, og at overkomme H

I de ulemper, som er specificeret i forbindelse med tidligere I

I forskerers bestræbelser på at løse disse problemer. Det er et I

I yderligere formål med den foreliggende opfindelse at tilveje- I

I ^ bringe en ligefrem teknik, som kan udnyttes i løbet af et ac- I

I ceptabelt kort tidsrum under anvendelse af hensigtsmæssigheden I

I ved kendte reagenser og med den nødvendige præcision til at nå I

I ensartede videnskabelige resultater. En teknik, som kan anven- I

I des i et reproducerbart analysemiljø, og som kan tilpasses til I

I brug i sæt til laboratorieanalyser/kliniske analyser. I

I ίο

I Det er således et formål med den foreliggende opfindelse at I

I forøge påviseligheden af bestemte nuk1ei nsyresekvenser (mål- I

I segmenter) ved forstærkning af må 1 sekvenserne i et in vitro- I

I eller x-vivo-system, der ikke har de ulemper, som indtil nu er

I opstået ved bestræbelser inden for den kendte teknik. H

I 15 I

I Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt teknik til H

I udøvelse af den anden metode til påvisning af et målsegment, H

I som er til stede i en lav koncentration i en kompleks blanding I

I af nukleinsyrer. Den udnytter et hidtil ukendt RNA-transkript- H

I produktionstrin i forbindelse med og hidrørende fra en synte- I

I jo I tiseret dobbelt-strenget cDNA-kopi af målsekvensen som en

I fuldstændig cyklus. Der kan anvendes flere cyklusser. På grund I

I af, at transkriptionstrinneter det dominerende nyhedsaspekt I

I er det hensigtsmæssigt refereret til heri som et transkrip- H

I tionsbaseret forstærkningssystem (TAS), Den hidtil ukendte H

I teknik ifølge den foreliggende TAS-opfi ndel se resulterer i I

I 25 H

I hurtig forøgelse i kopiantal af et udvalgt målsegment ved at

I gøre brug af to egenskaber hos DNA-afhængig RNA-polymerase: I

I (1) væsentlig initiering af transkription udfra kun et lille H

I antal sekvenser, som er specifikke for hver polymerase, se I

I f.eks. Brown et al., Nuel . Acids Res. 14, 3521 ( 1986); og (2) I

I hurtig fremstilling af et stort antal transkripter fra hver I

I 30 I

I kopi af en promotor (typisk 102-104 per time) genkendt af en I

7 DK 175614 B1 RNA-polymerase. Se Milligan et al., Nucleic Acids Res. 15, 8783 (1987). Teknikken ifølge den foreliggende opfindelse kan også udnytte egenskaben hos RNA'er sammen med visse sekvenser 5 til at blive hurtigt (autokatalytisk) replikeret ved hjælp af RNA-afhængige RNA-replikaser. Se også Miele et al., supra. Endvidere tilvejebringer den en standardi seringsteknik, som gør entydig måling af mængden af mål-DNA til stede i en prøve mulig.

10

Den foreliggende opfindelse (med mindre induceret {autokatalytisk) replikation anvendes) giver et enkelt-strenget RNA-transkript eller, når der ikke tages skridt til at forhindre dets dannelse, et RNA-DNA-duplex dannet derfra, som har et undersegment, der har mål segmentets sekvens, eller sekvensen, som er komplementær til mål segmentets sekvens, og som er til stede i stort overskud i forhold til nukleinsyre med et undersegment af komplementær sekvens. Dette overskud indledningsvis af et enkelt-strenget RNA-transkript er fordelagtigt i visse metoder til påvisning af forstærket produkt med en mærket nu-kleinsyresonde på grund' af, at der kun er lidt segment roed komplementær sekvens til stede til at konkurrere med sonde om hybridi ser ing til det forstærkede produkt. Endvidere afstryges det enkelt-strengede RNA-transkriptprodukt heraf mere eller mindre kontinuert og giver direkte påvisning af målsegment 2^ uden nødvendigheden af besværlige fej11i 1bøjelige gentagende PCR-cyklusser og strengadskillelse. Sådanne fordele tilvejebringes ikke ved hjælp af PCR-teknikken, som giver dobbeltstrenget DNA (hvoraf en streng omfatter målsegment, og hvoraf den anden streng omfatter komplement af målsegment), som skal adskilles før påvisning og kun efter et stort antal gentagne cyklusser, som er nødvendige for at nå acceptable forstærk-n i ngsmængder.

I DK 175614 B1 I

I 8 I

Teknikken ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringer I

I forstærkning af et udvalgt målsegment i en udstrækning i det I

I 5 mindste lige så stor som ved PCR-teknikken i løbet af ca. det I

samme tidsrum, men på en langt simplere og mere reducerbar I

I måde og forskellig fra naturligt forekommende processer eller I

anden teknik. I

I 10 1 overensstemmelse med den foreliggende opfindelse ér der specielt anvist en frem- I

I gangsmåde til forstærkning (dvs. mangfoldiggørelse eller amplifikation) af en mål- I

I nukleinsyresekvens i en prøve indeholdende nukleinsyre, omfattende: I

I 1) hybridisering af en første enkeltstrenget DNA-primer med nævnte målnukleinsy- I

I 15 resekvens, hvor nævnte primer omfatter en promotorsekvens, som med en se- I

I kvens af 0 til 100 nukleotider er bundet til en sekvens af nukleotider, der er kom- I

I plementære med 3’-enden af nævnte målsekvens, idet nævnte komplementære se- I

kvens i det mindste har en længde på 10 nukleotider, I

I 20 2) forlængelse af nævnte første primer, som er hybridiseret i overensstemmelse med I

I trin (1), ved en reaktion, der er katalyseret med en DNA-polymerase, til dannelse I

I af en første komplementær DNA-sekvens, I

I 3) adskillelse af duplexen dannet i trin (2) i enkeltstrenge, I

I 25 I

I 4) hybridisering af en anden enkeltstrenget DNA-primer, som har en sekvens med i I

I det mindste 10 nukleotider svarende til 5’-enden af nævnte målsekvens og even- I

I tuelt en yderligere DNA-sekvens af op til 100 nukleotider, med nævnte første I

I komplementære DNA-sekvens, I

I 30 I

9 DK 175614 B1 5) forlængelse af nævnte anden primer, der er hybridiseret i overensstemmelse med trin (4), ved en reaktion, som er katalyseret med en DNA-polymerase, til dannelse af en anden komplementær DNA-sekvens og 5 6) anvendelse af det dobbeltstrengede DNA-produkt fra trin (5) til fremstilling af en mængde RNA-transkripter, der er komplementære med nævnte målsekvens, ved en reaktion, som er katalyseret med en DNA-afhængig RNA-polymerase med specificitet for promotoren, som er indbefattet i nævnte første primer.

10

Den foreliggende opfindelses opfindere har fundet frem til, hvorledes DNA-afhængig bakteri ofag-RNA-polymerase kan anvendes til hurtigt at forstærke (dvs. forøge kopiantallet af) en ud-valgt målnukleinsyresekvens (målsekvens eller segment), som er til stede i en prøve af nukleinsyrer. De har endvidere fundet ud af, hvorledes DNA-afhængig bakteriofag-RNA-polymerase kan anvendes sammen med RNA-afhængig bakteriofag-RNA-polymerase til opnåelse af det samme resultat. Det har ikke tidligere været erkendt, at sådan bakteriofag-RNA-polymerase kunne anvendes til dette formål.

20

Den foreliggende opfindelse omfatter fremgangsmåder, som er baseret på disse opdagelser.

25

DK 175614 B1 I

10 I

Disse fremgangsmåder er særligt anvendelige, når de anvendes i forbindelse med nu- I

kleinsyresondehybridiseringsanalyser for en nukleinsyre, som omfatter et målsegment, I

der er forstærket ifølge den foreliggende opfindelse. Den foreliggende opfindelse om- I

fatter således fremgangsmåder til påvisning af tilstedeværelsen eller fraværet af et seg- I

5 ment i en prøve af en nukleinsyre, som omfatter et bestemt segment, ved hjælp af en I

sonde hybridiseret til segmentet efter forstærkning ifølge den foreliggende opfindelse. -

Til grund for den foreliggende opfindelse er hidtil ukendte I

visse RNA-transkripter, fremstilling deraf, eventuel replika- I

10 tion og brug til opnåelse af ønsket forstærkning og påvisning I

af tilsvarende (i sekvens) målnukleinsyresekvens. Opfindelsen I

udøves i et in vitro- eller x-vivo-miljø og anvendes i forbin- I

delse med syntesen af en dobbelt-strenget cDNA-kop i af mål- I

sekvensen for at fremstille en dobbelt-strenget nukleinsyre- I

skabelon, som på sin side anvendes til produktion af RNA-

transkripterne. Denne fremgangsmåde med dobbelt-strenget cDNA- I

syntese og RNA-transkripti on udgør en enkelt cyklus af det I

foreliggende transkriptions-baserede forstærkningssystem I

(TAS). Om ønsket kan denne cyklus gentages for at opnå endnu I

højere forstærkningsniveauer. I kraft af fremgangsmåden, ved H

hvilke de fremstilles (og reproduceres) svarer transkripterne I

(identiske eller komplementære) i sekvens til en målnuklein- I

syresekvens indeholdt i en oprindelig prøve blandt en blanding I

af nukleinsyrer og derfor giver tilstedeværelsen af transkrip- H

terne i forstærket form påvisning deraf og således ved over- H

ensstemmelse dermed in vitro- eller x-vivo-påvisningen af til- I

stedeværelsen af målnukleinsyresekvensen i prøven. I

Den foreliggende opfindelse involverer således in vitro- eller I

x-vivo-påvisning af i det mindste en specifik nukleinsyrese- H

kvens (målsekvens eller segment) i en prøve indeholdende nu- I

DK 175614 B1 Π kleinsyre. Den foreliggende opfindelse omfatter en fremgangsmåde, som omfatter, at man fremstiller en dobbelt-strenget nukleinsyre indeholdende en sekvens, som svarer til en målsekvens operabelt forbundet til en promotor derfor, anvender 5 den dobbelt-strengede nukleinsyre som en dobbelt-strenget nukleinsyreskabelon til fremstillingen af en række RNA-tran-skripter derfra, som hver har en RNA-sekvens, som svarer til må 1 sekvensen, og påviser tilstedeværelsen af RNA-sekvensen og ved analogi tilstedeværelsen af målsekvens, 10

Den foreliggende opfindelse er rettet mod alle fremgangsmåder og midler, som er forbundet med fremstillingen og brug af sådanne RNA-transkripter. Den foreliggende opfindelse er således rettet mod den eventuelt repetitive fremgangsmåde til frem-15 stilling af nævnte dobbelt-strengede nukleinsyreskabelon, som defineret ovenfor, hvilken fremgangsmåde omfatter, at man tilvejebringer en første nukleinsyreprimer i ndeholdende en promotorsekvens, som er operabel forbundet til en sekvens svarende til et segment af en målsekvens, som ovenfor defineret, under 20 passende betingelser hybridiserer den første nukleinsyreprimer med målsekvens i en prøve indeholdende nukleinsyre, forlænger den hybridiserede nævnte første nukleinsyreprimer i en poly-meraseforlængel sesreaktion komplementært til målsekvensen til dannelse af en tilsvarende duplexnukleinsyre, adskiller du-25 plexens strenge, hybridiserer til den fraskilte promotorhol-dige sekvensstreng under passende betingelser en anden nu-* k 1 ei nsy r epr i mer ved enden modsat promotorsekvensen og forlænger den hybridi serede nævnte anden nukleinsyreprimer i en polymeraseforlængelsesreaktion komplementært til den promotor-30 holdige sekvens.

Den foreliggende opfindelse er endvidere rettet mod yderligere og alternative fremgangsmåder og midler til fremst i 11ing . af den dobbelt-strengede nukleinsyreskabelon (supra), f.eks. en . i 35 alt væsentligt enke 1t-beho1 derreakt i on, som omfatter, at man tilvejebringer en første nukleinsyreprimer indeholdende en promotorsekvens, som er operabel forbundet til en sekvens kom-

I DK 175614 B1 I

i 12 I

I plementær til et segment af en målsekvens, og en anden nukle- I

I insyreprimer med en sekvens, som er identisk med et segment af I

I en må 1 sekvens, idet primerne svarer til forskellige regioner i I

I nævnte målsekvens, men ikke eller ikke i alt væsentligt over- I

I 5 lapper i deres overensstemmelse med målet, og vælges således, I

I at et forlængelsesprodukt af en, når adskilt fra dens komple- I

I ment, kan tjene som en skabelon for et forlængelsesprodukt af I

I den anden, bringer en prøve indeholdende nukleinsyre omfatten- I

I de målsekvens i kontakt med primerne under sekventiel hybri- I

I 10 diserings- og strengseparationsbetingelser for at fremstille I

I skiftevisforlængelsesprodukterafprimerne. I

I Den foreliggende opfindelse er yderligere retfet mod frem- I

I gangsmåder og midler under anvendelse af den dobbe1t-strengede I

I 15 nukleinsyre supra som en skabelon ved fremstillingen af en I

I række RNA-transkripter derfra i en reaktion, som er kataly- I

I seret af en DNA-afhængig RNA-polymerase, som genkender promo- I

I toren deraf og påvisning og måling af tilstedeværelsen af I

I nævnte RNA-transkripter. I

I 20 I

I Den foreliggende opfindelse er yderligere rettet mod frem- I

gangsmåder og midler til standardisering af mængden af påvist I

I målsekvens (svarende til mængden af påvist RNA-transkript) I

I ved yderligere korrelation med tilstedeværelsen af kendt nu- I

25 kleinsyre anvendt som en indre standard. Kopiantallet af Stan- I

I darden er bestemt i forvejen, standarden skal udsættes for de I

samme betingelser således forudbestemt under udøvelse af op- I

I findelsen som må 1 sekvensen, og den skal derfor tjene som en I

I bedømmelsesmetode til bestemmelse af relative mængder tran- I

I 30 skripter, som er fremstillet parallelt af den og af målse- I

I kvens. I

I Den foreliggende opfindelse er endvidere rettet mod yderligere I

I replikation af opnåede RNA-transkripter, som defineret oven- I

I I

35 for,viatilstedevære Isen deri af replikasegenkendelsessteder. I

I Dette opnås hensigtsmæssigt ved tilvejebringelse den første I

I nuk1einsyreprimer som defineret ovenfor yderligere bærende en I

13 DK 175614 B1 replikasegenkende1 sesstedsekvens, fortrinsvis mellem promotorsekvensen og sekvens som svarer til målsekvens og/eller yderligere indeholdende et rep 1 ikasegenkende1 sessted på den anden nukleinsyreprimer defineret ovenfor. Ved efterfølgende tran-5 skription indeholder de deraf følgende transkripter replikase- genkendelsesstedet eller -stederne, således at tilstedeværelsen af en replikase (i reaktionsområdet eller sættet f.eks.) (autokatalytisk) inducerer replikation af transkripterne, hvilket frembringer yderligere kopier til yderligere at lette 10 påvisning.

Fig. 1A, IB og 1C illustrerer en fremgangsmåde ifølge den foreliggende opfindelse til forstærkning af et målsegment af en nukleinsyre (nukleinsyre Aj, som er en DNA eller RNA, hvor der 15 fremstilles mange kopier af en første FWA (RNA I) med et segment med en sekvens komplementær til sekvensen af målsegment.

Fig. 2 A, 2 B og 2C illustrerer den yderligere forstærkning ifølge den foreliggende opfindelse af et segment af et RNA I, 20 som er fremstillet, som illustreret i figurerne 1A, IB og 1C til fremstilling af mange kopier af et andet RNA (RNA II) med et segment med en sekvens, som er den samme som sekvensen af et undersegment af målsegmentet, som blev forstærket til fremstilling af RNA I.

2 5

Fig. 3 viser autoradiogrammer, der viser forskellige koncentrationer af HIV-RNA forstærket ved hjælp af TAS samtidig med en fastsat koncentration af humant /5-globinnukleinsyre.

30 Fig. 4 viser en general strategi, hvorved RNA fremstillet ved hjælp af en DNA-afhængig RNA-polymerase giver et RNA-molekyle,

I DK 175614 B1 I

I 14 I

I som kan tjene som en skabelon for en RNA-afhængig replikase. I

I Der henvises til standardbøger inden for molekylbiologi, som I

I indeholder definitioner og fremgangsmåder og midler til ud- I

I 5 øvelse af grundlæggende teknikker ifølge den foreliggende op- I

I findelse, såsom: DNA-sondefremsti 11ing eller primerfremstil-

I ling omfattende DNA-syntese; hybridiseringsmetodologi omfat- I

I tende variationer inden for styrke af betingelser til frem- I

I bringelse af mere eller mindre hybridiseringssikkerhed afhæn- I

I 10 gig af graden af homologi mellem primeren og en mål-DNA-se- I

I kvens; identifikation, isolering eller fremstilling af promo- I

I torer eller nærmere bestemt promotorer eller steder genkendt I

I af ONA-afhængige bakteriofag-RNA-polymerase og RNA-afhængige I

I bakteriefag-RNA-polymerase, eller ved anvendelsen af eukaryote I

I 15 systemer, virale DNA- og RNA-afhærtgige RNA-polymeraser, f.eks. I

I adenovirusindkodet RNA-po1 ymerase og bromemosaikvirus-RNA- I

I polymerase; betingelser, som fører til fremstilling af RNA- I

I transkripter omfattende såkaldte transkriptionsforøgersekven- I

I ser; mekanismen og metodologien for (induceret) replikation; I

I 20 polymerasekædereaktionsmetoder omfattende de heri anvendte I

I reagenser, osv. Se f.eks. Maniatis et al., Molecular Cloning: I

I A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York I

I (1982) og de forskellige referencer nævnt deri; US patent- I

I skrift nr. 4.683.195; US patentskrift nr. 4.683.202; Hong, I

I 25 Bioscience Reports 1, 243 (1981); Cooke et al., J. Biol. Chem. I

I 255 6502 (1980); og Zoller et al., Methods in Enzymology 100, I

I 468-500 (1983); Crea et al., Nucleic Acids Res. 8, 2331 I

I (1980); Narang et al., Meth. Enzym. 68, 90 (1979); Beaucage et

I al., Tetrahedron Letters 22, 1859 (1981); Brown et al., Meth. I

I 30 Enzym. 68, 109 (1979); Caruthers et al., Meth. Enzym. 154, 287 I

I (1985); Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980); Lee I

et al., Science 239, 1288 ( 1988); Milligan et al., Nucleic I

I Acids Res. 15, 8783 (1987); Miller et al., Virology 125, 236 I

(1983) , Ahlquist et al., J. Mol. Biol. 153, 23 (1981); Miller I

35 et al., Nature 313, 68 (1985); Ahlquist et al., J. Mol. Biol. I

172' 369 (1984); Ahlquist et al., Plant Mol. Biol. 3, 37 I

(1984) ; Ou et al., PNAS 79, 5235 (1982); Chu et al., Nucl.

15 DK 175614 B1

Acids Res. 14, 5591 (1986); europæisk patentansøgning roed pub-li kat ionsnr . (EPA) 194.809; Marsh et al., Positive Strand RNA Viruses, side 327-336, Alan R. Liss (publ.; New York) (1987; Proceedings of UCLA Symposium, 1986); Miller et al., J. Mol.

5 Biol . 187 , 537 ( 1986); Stoflet et al., Science 239 , 491 (1988); og Murakawa et al., DNA 7, 287 (1988).

Alle de førnævnte publikationer er ved denne henvisning herved inkorporeret ved henvisning heri.

10

Ved udtrykket "promotor" menes en nukleinsyresekvens (naturligt forekommende eller syntetisk fremstillet eller et produkt af restriktionsfordøjelse), soro specifikt genkendes af en RNA-polymerase, som binder til en genkendt sekvens og indleder 15 transkriptionsprocessen, hvorved der fremstilles et RNA-tran-skript. Den kan eventuelt indeholde nukleotidbaser, som strækker sig ud over det faktiske genkendelsessted, som tænkes at bibringe yderligere stabilitet over for nedbrydningsprocesser.

I princippet kan en hvilken som helst promotorsekvens anven-20 des, for hvilken der er en kendt og tilgængelig polymerase, som er i stand til at genkende begyndelsessekvensen. Typisk er kendte og egnede promotorer sådanne, som genkendes af visse bakteri ofagpo1 ymerase, såsom bakteri ofag-T3, -T7 eller -SP6.

Se Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980). Disse er kun ek- 25 sempler på sådanne polymeraser, som kan anvendes ved udøvelsen af den foreliggende opfindelse sammen med deres forbundne promotorsekvenser.

"RNA-transkriptet" heraf er den ribonukleinsyresekvens, som 30 fremstilles efter transkriptionsi ni tiering efter RNA-polyme- rasegenkende1 se af promotorsekvensen (se supra). Fremstillingen af sådanne transkripter er mere eller mindre kontinuert delvis afhængig af mængden af tilstedeværende polymerase.

35 Ved udtrykket "primer" menes i den foreliggende sammenhæng en nukleinsyresekvens (naturligt forekommende eller syntetisk fremstillet eller et produkt af ; restriktionsfordøjelse), som

I DK 175614 B1 I

I 16 I

I har tilstrækkelig homologi med målsekvensen, således at den I

I under egnede hybridiser ingsbeti ngel ser er i stand til hybridi- I

I sering, dvs. binding til målsekvensen. En typisk primer er I

mindst ca. 10 nukleotider i længde og mest foretrukket med en I

I 5 længde på ca. 35 eller flere nukleotidbaser og er i dens mest I

foretrukne udførelsesformer identisk eller er meget homolog I

med målsekvensen. Se f.eks. EPA 128042 (publiceret 12. decern- I

I ber 1984). I

10 Udtrykket "operabelt forbundet" især i forbindelse med bindin- I

I gen af en promotorsekvens inden i en primersekvens refererer I

I til funktionsdygtigheden af den endelige "dobbelt-strengede I

I nukleinsyreskabelon" ifølge den foreliggende opfindelse, såle- I

des at den, skabelonen, er i stand til at fremstille tilsva- I

I 15 rende RNA-transkripter, når promotoren genkendes af den pas- I

I sende polymerase - se ovenfor. I

Primerforlængelsesreaktionen til fremstilling af en duplex er I

kendt per se. Se referencer ovenfor. Polymeraser, som er egne- I

I 20 de til dette formål, omfatter E. co1 i-DNA-po1 ymerase I, Kle- I

I now-fragment af E. co1 i-DNA-polymerase I, T4-DNA-polymerase, I

I omvendt transkriptase, osv. I

I Teknikken til dannelse af et påvisningssignal, såsom via I

I 25 radioaktiv mærkning eller farvedannelsesmid1 er under anvende!- I

I se af et farvefølsomt enzym, er også velkendt og dokumenteret I

I inden for området. Se diskussionen ovenfor. I

I Anvendelsen af en "replikase" til (autokatalytisk} replika- I

I 30 tions indukti on af RNA-transkripterne ifølge den foreliggende I

I opfindelse er generelt kendt inden for området. Egnede eksemp- I

I ler på sådanne replikaser, som er anvendelige ifølge den fore- I

I liggende opfindelse, omfatter den såkaldte Q/3-vi r usrepl i kase, I

I som genkender visse nukleinsyresekvenssteder ved både 3'- og I

I 35 5'-enderne af det givne RNA-transkript, og den såkaldte brome- I

I mosaikvirus (BMV) såvel som ct-vi rusrepl ikaser, som menes at I

I genkende nukleinsyresekvenssteder ved 3'-enden af et givent . I

17 DK 175614 B1 RNA-transkript. Disse replikaser tjener til at repli kere, dvs. reproducere RNA-transkripterne og komplementer for at mangfoldiggøre kopier deraf. Når et sådant enzym er til stede i reaktionsstedet under transkripti onsprocessen, kan det forudses, 5 at de mange transkripter, som fremstilles under transkription selv kan undergå replikation for således eksponentielt at forøge mængden af RNA-trånskriptprodukt.

Indre standardisering er defineret som en fremgangsmåde, som 10 anvendes til: a) at sikre, at TAS-forstærkningsprocessen ikke har slået fejl på grund af en fremgangsmådefejl, og b) måle mængderne af må 1nuklei nsyre i forhold til en i forvejen bestemt mængde nukleinsyre, som altid er forbundet med prøven, som har interesse. En sådan indre standardisering forekommer 15 ved co-f orstærkning af en del af roålsekvensen såvel som en endogen sekvens ved den samme reaktion. Ved f.eks. at kende det tilstedeværende celleantal i den biologiske prøve, kunne et enke 1 t-kop igen (f.eks. Ø-globin) anvendes som en indre standard, og da det ikke udtrykkes i form af RNA, er dets be-20 gyndelseskopiantal lig med to gange det samlede antal celler i prøven. Ved at co-forstærke dele af β-globinet og målsekvenser, som har interesse, kan forholdene mellem de forstærkede signaler sammenlignes for at størrelsesbestemme mængderne af målsekvens, som har interesse. Da hver celle har to kopier (i 25 diploide celler) af denne indre standard, uanset hvorvidt den biologiske prøve indeholder separate målsekvenser (f.eks. HIV), forventes hver prøve at fremstille et positivt forstærkningssignal som et resultat af den indre standard. Se Groudine et al., Nucleic Acids Research 12, 1427 (1984) og McKnight, 30 Cell 31, 355 (1982). Se også britisk patentansøgning med publikationsnummeret 2187283 A (publiceret 3. september 1987).

Et aspekt ifølge den foreliggende opfindelse er en fremgangsmåde til forstærkning af et målnukleinsyresegment med formlen 35 I

I DK 175614 B1 I

I 18 I

I 3'-{første undersegment)t-(andet undersegment)t-{tredje under- I

I segment) f5' I

I I

I 5 hvor (første undersegment)t er et nukleinsyresegment med kendt I

I sekvens på i det mindste 10 nukleotider, som støder op til I

I 3'-enden af (andet undersegment)t, (andet undersegment)t er et I

I nukleinsyresegment med 0 eller flere nukleotider, og (tredje I

I undersegment)^ er et nukleinsyresegment med kendt sekvens på i I

I 10 det mindste 10 nukleotider, som støder op til 51-enden af (an- I

I det undersegment)t, hvilken fremgangsmåde omfatter, at man: I

I (1) til (første undersegment)t af målsegmentet hybridiserer én I

I første primer, som er et enkeltstrenget ONA, som omfatter et I

I 15 3 *-terminalt undersegment med formlen II I

I 51-(promotor)j-(var iabelt undersegment)}- I

I (3 *-primer-undersegment)}-31 I

I I

I 20 I

I hvor (promotor)} er et enkelt-strenget DNA-segment med sekven- I

I sen af plus-strengen af en DNA-afhængig RNA-po1ymerasespecifik I

I bakteri ofagpromotor, (variabelt undersegment)} er et enkelt- I

I strenget DNA-segment med 0 til 100 nukleotider, som støder op I

I 25 til det 3'-terminale nukleotid i (promotor)} og det 5'-termi- I

I nåle nukleotid af (3 '-primer-undersegment)} og (3'-primer-un- I

I dersegment)} er et enkelt-strenget DNA-segment med i det mind- I

I ste 10 nukleotider med en sekvens, som er komplementær til I

I sekvensen af et undersegment af (første undersegment) t, som I

I 30 afsluttes med det 3'-terminale nukleotid af (første underseg- I

I ment)t, idet nævnte (promotor)} støder op til 5'-enden af I

I nævnte (31-primer-undersegment) }, hvis nævnte (variabelt un- I

I dersegment)} har 0 nukleotider;

35 (2) forlænger den første primer, som er hybridiseret i over- I

ensstemmelse med trin (1), i en reaktion, som er katalyseret I

af en første DNA-polymerase til fremstilling af et første kom- I

19 DK 175614 B1

plementært DNA-segment, som omfatter et undersegment med formlen III

5'-(promotor)^-{variabelt undersegment) 5 (første undersegment)tc-(andet undersegment)tc-(tredje undersegment)*c-3',

III

hvor (første undersegment)er DNA-segmentet med sekvensen 10 komplementær til sekvensen af (første undersegment)*, (andet undersegment)er DNA-segmentet med sekvensen komplementær til sekvensen af (andet undersegment)t, og (tredje underseg-ment)tc er DNA-segmentet med sekvensen komplementær til sekvensen af (tredje undersegment)t, forudsat at, hvis målseg-15 mentet er et RNA-segment, er nævnte første DNA-polymerase en omvendt transkriptase; (3) gør den ved reaktionen i trin (2) dannede duplex enkelt-strenget; 20 (4) til (tredje undersegment)tc af det første komplementære DNA med formlen (III) hybridiserer en anden primer, som er et enkelt-strenget DNA med i det mindste 10 nukleotider med formlen (IV) 25 3,-(5,-primer-undersegment)2”(variabelt undersegment)2-5',

IV

hvor (5'-pr imer-undersegment)2 har sekvensen af et underseg-30 ment af (tredje undersegraent)t, som afsluttes med det 5’-ter-minale nukleotid af (tredje undersegment)*, og hvor (variabelt undersegment) 2 er et segment med 0 til 100 nukleotider, som støder op til 5'-enden af (5’-pr imer-undersegment)2; 35 (5) forlænger det andet primersegment, som er hybridiseret i overensstemmelse med trin (4) ved en reaktion, som katalyseres af en anden DNA-polymerase til dannelse af et andet komplementært DNA-segment, som omfatter et undersegment med formlen (V)

20 I

DK 175614 B1 I

S(variabelt undersegment)2-(tredje undersegment)t-(andet I

undersegment)t-(første undersegment)t-(var i abe 11 under- I

segment)}C-(promotor)}C-3 ' , I

hvor (variabelt undersegment)}C er DNA-segmentet med sekvensen I

komplementær til sekvensen af (variabelt undersegment)} og I

(promotor)jc er DNA-segmentet med sekvensen komplementær til I

sekvensen af (promotor)}, forudsat at den anden DNA-polymerase I

10 er den samme som eller forskellig fra den første DNA-polymera- I

se, og I

(6) anvender det dobbelt-strengede produkt fra trin (5) som I

skabelonen ved en reaktion, som katalyseres af en første DNA- I

15 afhængig bakteriofag-RNA-polymerase, som genkender promotoren, I

hvoraf en streng er (promotor)} til fremstillingen af et før- I

ste RNA-produkt med formlen (VI) I

5 '-(var iabelt undersegment)}Γ-(første undersegment)tcr- H

20 (andet undersegment)tcr-(tredje undersegment)tcr- H

variabelt undersegment)2cr-3' I

hvor (variabelt undersegment)}r er RNA-segmentet med sekvensen H

25 af (variabelt undersegment)}, (første undersegment)tcr er RNA- I

segmentet med sekvensen komplementær til sekvensen af (første H

undersegment)t, (andet undersegment)tcr er RNA-segmentet med H

sekvensen komplementær til sekvensen af (andet undersegment) t, I

(tredje undersegment)tcr er RNA-segmentet med sekvensen kom- I

30 plementær til sekvensen af (tredje undersegment)t og (varia- I

belt undersegment)2Cr er RNA-segmentet med sekvensen komple- I

mentær til sekvensen af (variabelt undersegment)2. I

Ifølge et andet af den foreliggende opfindelses aspekter om- H

35 fatter den en fremgangsmåde, hvor (første undersegment)t har H

en længde på i det mindste 10 nukleotider og har formlen H

(XIII) I

21 DK 175614 B1 3’-(første undersegment)t2*(første undersegment) ti-5 ' ,

XIII

hvor (første undersegment)t2 har 0 eller flere nukleotider og 5 hvis flere end 0 støder op til 3'-enden af (første underseg-ment)ti og (første undersegment) har er> lsngde på i det mindste 10 nukleotider, hvor (tredje undersegment)t har formlen XIV

10 3'-(tredje undersegment)tl-(tredje undersegment)t2-5»

XIV

hvor (tredje undersegment)t2 har 0 eller f 1 ere .nukleotider, og hvis flere end 0 støder op til S’-enden af (tredje underseg-15 nient)t|, og (tredje undersegment)har en længde på i det mindste 10 nukleotider, hvor (3'-primer-undersegment)j har sekvensen komplementær til sekvensen af et undersegment af målsegment, som består af hele (første undersegment)t2 °9 0 eller flere nukleotider af (første undersegment), hvor (S'-primer-20 underségment)2 er et undersegment, som består af hele (tredje undersegment)t2 °9 0 eller flere nukleotider af (tredje under-segment).^, og hvorefter trin (1) til (6) supra, RNA-segmentet med formlen VII

25 5'-(første undersegment)t]cr-(andet undersegment)tcr-(tredje undersegment) t ) cr-3 ’

VII

hvor (første undersegment)tier er RNA-segmentet med sekvensen 30 komplementær til sekvensen af (første undersegment)og (tredje undersegment)tjcr er RNA-segmentet med sekvensen komplementær til sekvensen af (tredje undersegment), yderligere forstærkes ved hjælp af en fremgangsmåde, som omfatter, at man: 35

(7) til det første RNA-produkt med formlen (VI) hybridiserer en tredje primer, som er et enkelt-strenget DNA, som omfatter et 3'-terminalt undersegment med formlen VIII

I DK 175614 B1 I

I 22 I

I 5'-{promotor)3-(var i abe 11 undersegment)3- I

I (3'-pr imer-undersegment)3-3' , I

I VIII I

I 5 hvor (promotor)3 er et enkelt-strenget DNA-segment med sekven-

I sen af plus-strengen af en DNA-afhængig RNA-polymerasespecifik I

I bakteri ofagpromotor, idet sekvensen af (promotor^ er den sam- I

I me som eller forskellig fra sekvensen af (promotor)^, (varia- I

I belt undersegment)3 er et enkelt-strenget DNA-segment med 0 I

I 10 til 100 nukleotider, som støder op til det 3'-terminale nu- I

I kleotid i (promotor)3 og det 5’-terminale nukleotid i (3'-pr i - I

I mer-undersegment)3, og (31-primer-undersegment)3 er et enkelt- I

I strenget DNA-segment, som har den samme sekvens som (tredje I

I undersegment) tj, og støder op til det 3'-terminale nukleotid I

I 15 i (promotor)3, hvis (variabelt undersegment)3 har 0 nukleoti-

I der; I

I (8) forlænger den tredje primer hybridiseret i overensstem- H

I melse med trin (7) ved en reaktion katalyseret af en tredje

I 20 DNA-pol ymerase, som er en omvendt transkriptase og er den H

I samme som eller forskellig fra den første og anden DNA-poly- I

I merase, til fremstilling af et tredje komplementært DNA-seg- I

I ment, som omfatter et 3 1 -terminalt undersegment med formlen IX I

I 25 5'-(promotor}3-(var iabelt undersegment)3- I

I (tredje undersegment)tl-(andet undersegment)t- I

I (første undersegment)-(første undersegment)t2~ I

I (variabelt undersegment)ic-3' I

30

hvor (variabelt undersegment)er det DNA med sekvensen kom- I

plementær til sekvensen af (variabelt undersegment)j;

(9) gør den ved reaktionen i trin (8) dannede duplex enkelt- I

35 strenget; I

(10) til det tredje komplementære DNA, som er fremstillet ved I

reaktionen i trin (8), hybridiserer en fjerde primer med form- I

23 DK 175614 B1

len X

5'-(variabelt undersegment )4-(5'-pr imer-undersegment)4

X

5

hvor (variabelt undersegment)4 er et segment med 0 til 100 nukleotider og (5'-primer-undersegment)4 er et undersegment med kendt sekvens, som støder op til 3'-nukleotidet i (variabelt undersegment)4, hvis (variabelt undersegment)4 har flere end 0 10 nukleotider, og som omfatter i det mindste 10 nukleotider af segmentet med formlen XX

S(var iabelt undersegment)j-(første undersegment)t2c"i første undersegment)tlc-3'

15 XX

hvor (første undersegment)*2c er DNA-segmentet med sekvensen komplementær til sekvensen af (første undersegment)*2 °9 (første undersegment)tic er DNA-segmentet med sekvensen komplemen-20 tær til sekvensen af (første undersegment), forudsat at i det mindste en af nævnte i det mindste 10 nukleotider er ved eller 5' fra det 5'-terminale nukleotid i (første underseg-*ent)tic» 25 (11) forlænger den fjerde primer, som er hybridiseret i over

ensstemmelse med trin (10), ved en reaktion katalyseret af en fjerde DNA-po1 ymerase,. som er den samme som eller forskellig fra den første, anden og tredje DNA-polymerase til dannelse af et fjerde komplementært DNA, som omfatter et segment med form-30 len XI

5’-(første undersegment)tic-(andet segment)tc-(tredje under-segment)tic-(variabelt undersegment)3C-(promotor)3C-3',

XI

35 hvor (andet undersegment)er DNA-segmentet med sekvensen komplementær til sekvensen af (andet undersegment)^, (tredje

I DK 175614 B1 I

I 24 I

I undersegment) tic er DNA-segmentet med sekvensen komplementær I

I til sekvensen af (tredje under segment), (variabelt underseg- I

I ment)3C er DNA-segmentet med sekvensen komplementær til se- I

I kvensen af (variabelt segment^, og (promotor>3C er DNA-seg- I

I 5 mentet med sekvensen komplementær til sekvensen (promotor^, I

I 09 I

I (12) anvender det dobbelt-strengede produkt fra trin (11), som I

I skabelonen i en reaktion katalyseret af en anden DNA-afhængig I

I 10 bakteri ofag-RNA-polymerase, som er den samme som eller for- I

I skellig fra den første DNA-afhængige bakteriofag-RNA-polyme- I

I rase, og som genkender promotoren, hvoraf en streng er (promo- I

I tor)3 til fremstilling af et andet RNA-produkt med et 5'-ter- I

minalt undersegment med formlen XII I

I 15 I

5 '-(variabelt undersegment)3r-(tredje undersegment)r-{andet I

I undersegment)*r-(fønste undersegment)tlr~x12“(variabelt under- I

I segment)4cr-3' , I

I XII I

I 20 I

I hvor (variabelt undersegment)3Γ er RNA-segmentet med sekvensen I

I af (variabelt undersegment)3, (tredje undersegment)r er RNA- I

segmentet med sekvensen af (tredje undersegment)t^, (andet un- I

dersegment)tr er RNA-segmentet med sekvensen af (andet under- I

25 segment)t, (første undersegment)t^r er RNA-segmentet med se- I

kvensen af (første undersegment), (variabelt underseg- I

ment)4Cr er RNA-segmentet med sekvensen komplementær til se- I

kvensen af (variabelt undersegment)4, og X^2 er RNA-segmentet I

med sekvensen komplementær til sekvensen af under segmentet af I

30 (5 ’-primer-undersegment)4, som er 5’ fra 5'-enden af (første I

undersegment)tjc. I

Som beskrevet ovenfor omfatter opfindelsen også sæt til ud- I

øvelse af forstærkningsfremgangsmåderne ifølge opfindelsen. I I

35 tilfældet med fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som omfatter, I

at man fremstiller et første RNA-produkt, ville et sæt ifølge I

opfindelsen omfatte de to primere, den tilsvarende DNA-afhæn- I

25 DK 175614 B1 gige bakteriofag-RNA-polymerase og DNA-polymerasen. Et sæt til udøvelse af en fremgangsmåde ifølge opfindelsen, som omfatter, at man fremstiller både et første og et andet RNA-produkt ville omfatte fire hensigtsmæssige primere (to sæt af to) med de 5 tilsvarende nødvendige polymeraser.

Fremgangsmåder og sæt ifølge den foreliggende opfindelse til udøvelse af nukleinsyrehybridiseringssondeanalyser, som omfatter forstærkning af et målsegment ifølge opfindelsen opfindel-10 sen omfatter udover trinnene og bestanddelene i henholdsvis fremgangsmåderne og sættene til forstærkning, trin og bestanddele, som er nødvendige til påvisning af RNA-produktet, som er et resultat af forstærkning ifølge opfindelsen. Fagmanden inden for området forstår de forskellige yderligere henholdsvis 15 trin og bestanddele, som er nødvendige til at påvise RNA fra en forstærkningsfremgangsmåde ved hjælp af en hvilken som helst af de adskillige nukleinsyresondehybridiseringsanalyse-metoder, som er kendt inden for området. En foretrukken nu-kleinsyresondehybridiseringsanalysemetode, som involverer per-20 le-indfangning af mærket RNA-forstærkning, er illustreret i følgende eksempel 2.

Det foretrækkes at (3'-primer-undersegment)^, (51-primer-un- dersegment)2. (3 *-primer-undersegment)3 og (5’-primer-under- 25 segment)4 har mellem 20 og 40 nukleotider, og mere foretrukket ca. 30 nukleotider for at forøge den specificitet, med hvilken de forskellige primere binder til enderne af målsegmenterne, som ønskes forstærket.

30 Det foretrækkes også, at målsegmentet af en nukleinsyre, som har interesse, og som er udvalgt til forstærkning (i kraft af udvælgelse af (første undersegment)t og (tredje undersegment)t vælges således, at (andet undersegment)har i det mindste 30 og mere foretrukket i det mindste ca. 50 nukleotider. Dette 35 muliggør brug af (andet undersegment)*cr eller (andet under-segment).^ i det forstærkede RNA-produkt til at være mål for nukleinsyresonder, som ikke har sekvenser, der overlapper de hos nogen af pr imerundersegmenterne.

I DK 175614 B1 I

I 26 I

I Selvom DNA-afhangige bakteriofag-RNA-polymerasen kan anvende I

I skabeloner, som er længere end 100 bp, formindskes deres tran- I

I skriptionseffekti vitet i takt med, at skabelonen bliver længe- I

I re. Således foretrækkes målsegmenter mindre end 1000 baser I

5 lange. I

I Det foretrækkes at anvende det identiske sæt primere anvendt I

I ved syntesen af RNA til fremstilling af RNA i en anden TAS- I

I cyklus. Som nævnt i den del, som beskriver fremstilling af I

I 10 RNA, bør primer-parret ikke lappe over hinanden. Ved udøvelsen I

af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvori fremstillingen af I

RNA ønskes, er det muligt at undersegmentet af målsegment med I

I sekvens, som er komplementær til sekvens af {5'-pr imer-under- I

segment)4 er i 5'-retningen fra og ikke overlapper underseg- I

IS mentet af målsegment med sekvens, som er komplementær med se- I

I kvens af (3 '-pr imer-undersegment)i. På lignende måde foretræk- I

I kes det, at undersegmentet af målsegment med sekvens, som er I

I den samme som sekvensen af (3'-primer-undersegment)3 er i I

I 3'-retningen fra og ikke overlapper undersegmentet af målseg- I

I 20 ment med sekvens, som er den samme som sekvens af (5'-primer- I

I undersegment)2 Denne strategi kan være foretrukken, fordi den I

I reducerer konkurrencen mellem de forskellige primere for de I

I samme steder og kan derved i udpræget grad forøge effektivi- I

I teten af forstærkning ifølge opfindelsen. I det tilfælde hvor I

I 25 der er nogen overlapning mellem sæt af sammensatte primere I

I foretrækkes det at fjerne eventuelt ikke-brugt første sæt af I

I primere før det andet sæt anvendes. I

I Der sættes ifølge den foreliggende opfindelse fokus på DNA-af- I

I 30 hængig bakteri ofag-RNA-polymerase på grund af deres høje spe- I

I cificitet over for bestemte promotorer. Anden polymerase, som I

I har lignende høj specificitet over for bestemte promotorer I

I kunne anvendes ifølge den foreliggende opfindelse i stedet for I

I bakteriofag-polymerasen, og opfindelsen er ment ligeledes at I 35 omfatte sådan anden polymerase. I 1

De foretrukne blandt de DNA-afhængige bakteriofag-RNA-polyme- I

I raser er sådanne fra T7, T3 og SP6. Foretrukne promotorer til I

27 DK 175614 B1 brug sammen med disse polymeraser er beskrevet i eksemplerne og kravene, men adskillige andre promotorer for disse polyme-raser er kendte inden for området og kan ligeledes anvendes.

5 Endvidere kan polymeraser fra andre bakteriofager end de foretrukne tre og promotorer, som genkendes af sådanne andre poly-meraser, anvendes ifølge den foreliggende opfindelse.

Det foretrækkes som DNA-po1 ymerase i fremgangsmåderne ifølge 10 opfindelsen at anvende omvendte transkriptaser og DNA-polyme-rase, som mangler 5’ til 3 '-exonuk1easeakti vitet. Det er roest foretrukket at en enkelt DNA-polymerase anvendes ved alle trinnene i fremgangsmåderne. Mest foretrukne blandt DNA-poly-meraserne er AMV-omvendt-transkriptase og rekombineret MMLV-15 orovendt-transkriptase. Andre polymeraser er imidlertid også acceptable, såsom den varmestabile DNA-polymerase fra Thermus aquaticus (se Chien et al. «3. Bacteriol . 127, 1550 (1976)),

Sequenase rekombineret T7-DNA-polymerase fra U.S. Biochemicals Corp., Cleveland, Ohio, U.S.A., og det velkendte Klenow-frag-20 ment af E. col i-DNA-polymerase I og kalvethymuskirtel-DNA-polymerase-a.

De "variable undersegmenter", som eventuelt er indbefattet i de forskellige primere, tjener tre funktioner. Faktisk burde 25 de mere rammende betegnes "mu 11i formål-undersegmenter". For det første for den første og tredje primer, som omfatter promotorer, omfatter promotorundersegmenterne fortrinsvis transkr i pt i onsinitieringssekvenser, som foretrækkes af RNA-polymerasen svarende til promotoren. Dernæst for alle primerne kan 30 et variabelt undersegment eventuelt indeholde et bestemt segment, hvorved RNA-produktet fra forstærkningen kan påvises i en nukleinsyresondehybridiseringsanalyse. Faktisk kan forstærkning (og analyse) foregå for flere forskellige målsegmenter samtidigt ved anvendelse af sæt af primere, som er for-35 skellige med hensyn til deres genkendelsessegmenter (f.eks.

(3'-priroer-undersegroent)j), men omfatter et alment variabelt undersegment. Det variable undersegment kan også indeholde en

I DK 175614 B1 I

I 28 I

I polykoblersekvens, som hensigtsmæssigt indeholder en række I

I restriktionssteder for at lette efterfølgende kloning. Endelig I

kan de variable undersegmenter anvendes til at inkorporere ind I

I i RNA-produktet fra forstærkning, sekvenser som er nødvendige I

I 5 for at gøre det muligt for RNA-produktet at blive (autokata- I

I lytisk} replikeret ved hjælp af en RNA-specifik bakteriofag- I

I RNA-polymerase, såsom Q/3-repl ikasen, se Miele et al., supra, I

I og BMV-sekvenser fra RNA-3-kromosomet hos piantevirusen, som I

I fremmer syntesen af kappe-mRNA. Se Ahlquist et al., J. Mol. I

I 10 B i o 1 . 172, 369 (1984); Ahlquist et al., Plant Mol. Biol. 3. 37 I

I (1984); Ahlquist et al., J. Mol. Biol. 153, 23 (1981); Miller I

I et al., Nature 313 , 68 (1985); Miller et al., Virology 125, I

I 236 (1983); og Ou et al., PNAS 79, 5235 (1982). I

I 15 I tilfældet med Q/3-rep 1 i kasen, som er kendt inden for området, I

I udføres dette fortrinsvis ved at indbefatte sekvensen I

I 5'-CGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTC6TGC-31 i (varia- I

I belt undersegment)2 og sekvensen I

I 5 *-TGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3' i (variabelt under- I

I 20 segment)^, og derefter (autokatalytisk) replikere det første I

I RNA-produkt (dvs. RNA I i f i g. 1; se også fig. 4), eller ved I

I at indbefatte sekvensen I

I S'-CGCGCTCTCCCAGCTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGTGC-S’ i (varia- I

I belt undersegment)4 og sekvensen I

I 25 5'-TGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3’ i (variabelt under- I

I ségment)3, og derefter (autokatalytisk) replikere det andet I

I RNA-produkt (dvs. RNA II i fig. 1; se også fig. 4). I

I 35 I

I tilfældet med ligeledes kendt BMV-replikase-anvendelse, ud- I

I 30' føres dette fortrinsvis ved at indbefatte den følgende sekvens I

I for BMV i variabel sekvens 2 (baser 1-25) (ved den specifikke I

I anvendelse i HIV-eksemplet nedenfor): I

29 DK 175614 B1 BMV-promotor TCS = 87-29 (HIV-specifik) 10 20 30 40 50

I I I I I

5 5'-AAGATCTATGTCCTAATTCAGCGTA j ACAGCATATGTATGTTCAG6GAAAGCTA-3 ' (54 baser), som en kernesekvens, yderligere AU-righoldig sekvens 5'- deraf kan anvendes til at fremme replikaseaktiviteten fra BMV. Dette 10 oligo skal anvendes som den anden primer. Den første primer anvendt sammen med denne anden primer er en T7-baseret HIV-specifik primer.

T7-promotor TCS = 87-34 15

+ iS

10 20 30 40 50

I i l i I

TAATACGACTCACTATA | G6GA | CACCTAGGGCTAACTATGTGTCCTAATAAGG 20 (52 baser). 1 de følgende eksempler er der anført yderligere ikke-begræn-sende detaljer for at bidrage til forståelsen af opfindelsen:

25 EKSEMPEL I

10 ml blod fra en patient, som mistænkes for at være inficeret med en human immunodefekt virus-type 1 (ΗIV — 1) fraktioneres med et Sepracel1-apparat (Sepratech Corp., Oklahoma City, 30 Oklahoma, U.S.A.), eller alternativt med en Ficoll-gradient for at isolere lymfocytter. Lymfocytterne 1yseres derefter og nukleinsyre fra dem isoleres med et ekstraktionsapparat (Molecular Biosystems, Inc., San Oiego, Californien, U.S.A.), eller alternativt lyseres lymfocytterne ved standardnatriumdodecyl-35 sulfat (SDS)-enzymbehandl ing, og nukleinsyren isoleres ved hjælp af kromatografi til omvendt fase over DEAE-cellulose. Dette udføres på følgende måde:

I DK 175614 B1 I

I 30 I

I Bundfæld celler ved rotation: 5 k o/m i ,4' fra 1 ml Tris-puf- I

ret saltopløsning (TBS), pH-værdi 7,5. I

I Fjern supernatant.. I

I I

I Gensuspender pellet i: I

I 500 μΐ 0,3 M NaCl/20 mM Tris, pH-værdi 7,5 Bland godt, I

I 100 μΐ 2% SOS før tilsæt- I

I 10 200 μΐ 5 mg/ml proteinase K ning til I

I 200 μΐ 0,25 Η Ε0ΤΑ pellet. I

I Hvirvl kraftigt og inkuber ved 50°C i 45’, hvirvl i 10 til 15 I

I sekunder hver 10'. I

I 15 I

I Fyld på drænet ekstraktionssøjle og lad den komme i. I

I Vask søjle lx 4 ml 0,3 M NaCl/20 mM Tris, pH-værdi 7,5. I

I 20 Eluer DNA/RNA med 4 ml 0,5 M NaCl/20 mM Tris, pH-værdi 7,5. I

I Sæt til eluatet: 5 μΊ glycogen I

I 400 μΐ 3 M NaOAc I

I 9,0 ml is-kold ΕΐΟΗ I

I 25 blandt godt I

I Præcipiter ved -20CC natten over. Et tørt is/ethanolbad i en I

I time kan anvendes. I

I 30 Bundfæld ved rotation DNA/RNA i 15' ved 10.000 o/m i en svin- I

I gende beholderrotor; hæld EtOH af og dræn tørt på en "kim- I

I wipe"-2'. I

I Lyofiliser i 10'. I

I 35 I

I Gensuspender pellet i 170 μΐ TE. I

DK 175614 B1 31

Inkuber ved 37eC i 5'.

Påfyld en 1 ml roteringssøjle på følgende måde:

Tilstop en 1 ml sprøjte med en lille mængde glasuld 5 (autoklaveret).

Fyld sprøjte med TE (tri s-EDTA) behandlet med diethyl pyrocarbonat (DEPC).

Tilsæt hurtigt fin sephadex G-50 (i TE; autoklaveret ) .

10 Forsæt med at tilsætte, indtil den faste matriks strømmer over sprøjtens top.

Roter 30 sekunder ved 1000 o/m i en IEC-bordcentri-fuge.

Vask med 100 μΐ TE, roter i 1' ved middel hast ighed 15 (ca. 1000 o/m). Kasser vaskevand.

Fyld ekstrakten på søjlen, Roter igen il'.

Skyl med 150 μΐ TE, roter ved 1000 o/m i 1’. Sammenhæld skyl-20 levand og den første fraktion. Prøver kan opdeles til flere reaktioner på dette trin.

Tilsæt 1/10 volumen 8 M LiCl. Bland med 2,5 x vol. 100% EtOH. Hvirvl godt. ppt. tøris/EtOH i 30 minutter.

25

Bundfæld ved rotation i 15' ved højeste hastighed i en mikro-fuge ved 4eC.

Tør pellet.

30

Efter isoleringen opløses total nukleinsyre fra prøven i 100 μΐ TE-puffer (10 mM Tris.Cl, 1 mM EDTA, pH-værdi 8). 10 μΐ af 100 μΐ af den totale nukleinsyre opløses til et slutvolumen på 100 μΐ indeholdende: 40 mM Tris.Cl, pH-værdi 8 25 mM NaC1 35

I DK 175614 B1 I

I 32 I

10 mM MgCl 2 I

I 10 mM dithiolthreitol (DTT) I

2 mM spermidin I

100 pg/ml bovint serumalbumin I

I 5 400 mM hver af dATP, dCTP, dGTP og TTP I

30 nM af det 101 baseholdige enkeltstrengede DNA med I

sekvens 5’-GAACGCGGCT ACAATTAATA CATAACCTTA TGTATCATAC I

ACATACGATT TAGGTGACAC TATA GAATAC TTTCGTAACA CTAGGCAAAG I

I GTGGCTTTAT C -3’ primer A tilsættes. 30 nM af det 29 basehol- I

10 dige DNA med sekvens 5' -ACACCATATG TATGTTTCAG GGAAAGCTA-3', I

primer B tilsættes. Primer B, som er den anden primer, har I

basesekvensen 5151-5179 i SOR-genet fra HIV-1. Et alternativt I

segment for den anden primer svarende til baser 5357-5387 i I

I SOR-genet fra HIV-1 har sekvensen 5 *-GCACACAAGT AGACCCTGAA I

15 CTAGCAGHACC A-3', og er, hvis anvendt, også til stede ved 30 I

nM. Primer A er den første primer. Dens 64 51nukleoti der dan- I

ner plus-strengen af en promotor for den SP6 DNA-afhængige I

RNA-polymerase. Dens segment med sekvens 5'-GAATAC-3’ er (al- I

H ternativt undersegment)j, som omfatter transkriptionsstart- I

I 20 stedet (5 * -G) og andre baser, som tilsyneladende foretrækkes I

af SP6 RNA-polymerasen ved 5'-enden af sekvenser, som tran- I

I skriberes af den. Til slut danner de 31 31-terminøle nukléoti- I

I der (primer under segment)j og har en sekvens, som er komple- I

I mentær til sekvensen af baser 5577-5547 i SOR-genet fra et I

I 25 HIV-l-isolat. (Se Ratner et al., Nature 313, 277 (1985) for I

I fuldstændig sekvens). (HIV-isolatet refereres der til i disse I

I eksempler som "HIV-1"). I

Bemærk at alle oligonukleotider, som anvendes i disse eksemp- I

I 30 ler, fremstilles ved fast-fasesyntese på et automatiseret syn- I

I teseapparat (Model nr. 380A) fra Applied Biosystems INc. I

I (Foster City, Californien, U.S.A.) og oprenses kromatografisk I

I i alt væsentligt til homogenitet ved hjælp af HPLC under an- I

I vendelse af en C8-søjle med omvendt fase. Alternativt kunne I

I 35 andre kommercielt tilgængelige synteseapparater og standard- I

I oprensningsfremgangsmåder anvendes til at fremstille oligo- I

I nukleoti derne. I

DK 175614 B1 33 100 μΐ af opløsningen opvarmes ved 65*C i 2 minutter og afkøles derefter til 42°C i løbet af 1 minut. Denne opvarmning og derefter henstand ved 42®C eller over i kombination med opløsningens sammensætning giver tilstrækkeligt strenge betingelser 5 til tilvejebringelse af hybridisering af (3 ’-primer-underseg-ment)}, med tilstrækkelig stabilitet til at prime DNA-syntese, med høj specificitet over for sekvensen, som er komplementær til sekvensen af {3 '-primer-undersegment)j.

10 Oerefter tilsættes 10 enheder aviær myoblastosis-virus-om-vendt-transkriptase (AMV) eller 500 enheder rekombineret rourin Moloney-leukæmi-vi rus-omvendt-transkriptase (MMLV), som leveret fra Life Sciences, Inc., St. Petersburg, Florida, U.S.A., til opløsningen, og opløsningen inkuberes i 10 minutter ved 15 42°C (En enhed inkorporerer 1 nmol af TTP til syre-præcipiter- bar form i løbet af 10 minutter ved 37°C under anvendelse af pol y(A).o 1igo(T)^2-18 soro skabelon-primer som defineret af Houts et al., J. Virol. 29, 517 (1979)). Efter de 10 minutters inkubering anbringes opløsningen i et kogende vandbad i 1 mi-20 nut. Denne opvarmning forårsager strengadskillelse af det ved hjælp af omvendt transkriptase dannede duplex.

Derefter afkøles opløsningen til 42®C i løbet af 1 minut. I løbet af denne afkøling hybridiserer den anden primer til det 25 3'-terminale segment af komplementen af målsegment dannet ved reaktionen katalyseret af den omvendte transkriptase. Igen er hybridiseringsbetihgelserne tilstrækkeligt strenge til tilstrækkel i g specifik hybr idi sering mellem den anden primer og sekvens komplementær til sekvensen af anden primer.

30

Efter afkølingen tilsættes 10 yderligere enheder AMV-omvendt-transkriptase eller 500 yderligere enheder klonet MMLV-om-vendt-transkriptase, og der inkuberes yderligere i 10 minutter ved 42°C.

Derefter tilsættes ribonuklease i nhi bi tor med handelsnavnet RNasin fra Promega Biotec, Madison, Wisconsin, U.S.A. (even- 35

I DK 175614 B1 I

I 34 I

I tuelt) i en koncentration på 1 enhed per ml. (1 enhed er den I

I mængde inhibitor, som er nødvendig til at inhibere aktiviteten I

I af 5 ng ribonuklease A med 50% A. Roth, Meth. Cancer Res. 3, I

151 (1976)). Endvidere tilsættes hver af ribonukleosid-51-tri- I

I 5 phosphaterne ATP, 6TP, CTP og UTP til 400 mM. Til sidst til- I

sættes mellem 10 og 20 enheder DNA-afhængig SP6-RNA-po1 ymera- I

I se, som leveres af Promega Biotech, og den opnåede opløsning I

inkuberes ved 42°C i 30 til 60 minutter. (1 enhed er den mæng- I

I de af RNA-polymerasen, som er nødvendig til at katalysere in- I

10 korporering af 1 nmol ribonukleosidtriphosphat til syreuop- I

I løseligt produkt i 60 minutter ved 37eC under standard reak- I

I tionsbeti ngel ser (40 mM Tris.Cl, pH-værdi 7,9, 6 mM MgCl2» 10 I

I mM DTT, 2 mM spermidin, 0,5 mM af hver af ATP, GTP, CTP og I

I UTP, 0,5 Ci af ^H-CTP, 1 g SP6-DNA og enzymet i et samlet I

I 15 volumen på 50 μΐ)). I

I Derefter tilsættes hver af de følgende oligonukleotider for at I

I bringe dets koncentration til 30 nM: I

I 20 tredje primer: I

I 5'-GAACGCGGCT ACAATTAATA CATAACCTTA TGTATCATAC ACATACGATT I

I TAGGTGACAC TATA GAATAC ACTAATTCAT CTGTATTACT TTGACTGTTT TTC-3' I

I fjerde primer: I

I 25 51-TTTTTTGGTG TTATTAATGC TGCTAGTGCC-3’ I

I den tredje primer som i den første er de 5'-terminale 64 I

I baser promotorsegmentet og de næste 6 baser er det variable I

I segment. Det variable segment er de første seks baser tran- I

I 30 skri beret fra promotoren af SP6 RNA-polymerasen, og disse I

I baser udvælges til at forøge niveauet af en sådan transkrip- I

I tion. Endelig er (31-primerundersegment)3~delen af den tredje I

I primer de 3'-terminale 33 baser, i den samme sekvens som baser

I 5388-5420 i det korte åbne læserammegen (SOR) fra HIV-1. Den I

I 35 fjerde primer har den sekvens, som er komplementær til sekven- I

I sen af baser 5546-5517 i SOR-genet fra HIV-1. I

DK 175614 B1 35

Efter tilsætning af den tredje og fjerde primer inkuberes oplosningen ved 4 2eC i 1 minut. I løbet af dette tidsrum foregår hybridisering mellem (3 *-pr i merundersegment}3 fra tredje primer og det første RNA, som er dannet ved reaktionen, kataly-5 seret af SP6-RNA-polymerasen. På grund af hybridi ser ingsbetin-gelsernes strenghed hybridiserer (3'-primerundersegment)3, med en stabilitet, som er tilstrækkelig til priming af DNA-synte-se, med høj specificitet til segmentet med komplementær sekvens i det første RNA.

1°

Efter inkubering tilsættes 10 enheder AMV-omvendt-transkrip-tase eller 500 enheder klonet MMLV-omvendt-transkriptase, og opløsningen inkuberes i 10 minutter ved 42eC til dannelse af det tredje komplementære DNA.

15

Opløsningen suspenderes derefter i et kogende vandbad i 1 minut og afkøles til 42°C i løbet af 1 minut for først at gøre duplexen mellem tredje komplementære DNA og første RNA enkelt-strenget og dernæst for at muliggøre hybridisering mellem 20 fjerde primer og tredje komplementære DNA. Som for de andre hybridiseringer er betingelserne tilstrækkelig strenge til hybridisering af fjerde primer, med stabilitet tilstrækkelig til at prime DNA-syntese, forekommer med høj specificitet til segmentet af tredje komplementære DNA med sekvens komplementær 25 til sekvens af fjerde primer.

Derefter tilsættes igen 10 enheder AMV-omvendt-transkriptase eller 500 enheder klonet MMLV-omvendt-transkriptase og opløsningen inkuberes i 10 minutter ved 42°C.

30

Derefter tilsættes ribonukleaseinhibitor med navnet RNasin (eventuelt) til· 1 enhed per ml efterfulgt af 10-20 enheder SP6-RNA-polymerase og derefter inkuberes opløsningen i 30 minutter i 1 time ved 42 “C.

Det opnåede andet RNA kan derefter påvises ved hjælp af nukleinsyre sonde hybrid i seringsteknik.

35

I DK 175614 B1 I

I 36 I

I EKSEMPEL II I

I Den i eksempel I beskrevne fremgangsmåde følges med den neden- I

I for bemærkede modificering for tre prøver: (A) en prøve på 10 I

I 5 ml menneskeblod, som vides at være fri for HIV, (B) en prøve I

I af 10 ml kultur, som vides at have ca. 103 HIV-1 inficerede I

I celler per ml, og (C) en prøve på 10 ml. blod fra en person, I

I som mistankes for at være inficeret med HIV-1. Modifikationen I

I af fremgangsmåden er, at der indbefattes et a-32P-mærket ribo- I

I 10 nukleosid triphosphat, som et substrat ved reaktionen, som I

I katalyseres af SP6 RNA-polymerase for at fremstille det andet I

I RNA. Det andet RNA er som følge heraf 32P-mærket. I

I Makroporøse Sephacryl-S500®-perler der ivat i seres med en car- I

I 15 boxylgruppe-afsiuttet kobler (med formlen -C(=NH)NH(CH2)5 I

I CO2-) og derefter med et 51 -(6-aminohexy1phosphoramidat)-der i - I

I vatiseret oligonukleotid med sekvensen 5 *-TGGTCTGCTA I

I GTTCAGGGTC TACTTGTGTG C-3', som er sekvensen, som er komple- I

I mentær til sekvensen af baser 5357-5387 i SOR-genet fra HIV-1.

I 20 (Sekvensen af baser 4901-4932 i SOR-genet forekommer i et I

I hvilket som helst andet RNA, som er fremstillet under for- I

I stærkning af nukleinsyre fra en prøve). Fremstilling af per-

I lerne foregik efter fremgangsmåderne beskrevet i ansøgerens US

I patentansøgning med serienr. 895.756, indleveret 11. august I

I 25 1986, og inkorporeret heri ved henvisning. Kort beskrevet er I

I bærermaterialerne porøst silikatglas eller makroporøst tvær- H

bundet dextran der i vat i seret med en amino-afsluttet kobler, idet i alt væsentligt alle am inogrupperne, som ikke er kova-

lent forbundet gennem en phosphoramidatgruppe til det termi- I

30 nåle nukleosid af indfangningssonden, er blokeret fra at rea- I

gere ikke-specifikt med nukleinsyre med en alifatisk acylgrup- I

pe,· makroporøst tværbundet dextran aktiveret med cyanogenbro- I

mid, som reagerer med aminer til binding til aminoalkylphos- I

phoramidatderivatiserede oligonukleotider og porøst silikat- I

35 glas, makroporøs tværbundet dextran eller divinylbenzen-tvær- I

bundet polystyren der ivatiseret med en carboxyl-afsluttet el- H

ler succinimidester-afsluttet kobler med en fraktion af car- I

DK 175614 B1 37 boxy 1 grupperne forbundet i en amidbinding til en aminogruppe i en diaminoalkan, hvor den anden aminogruppe er del af et phos-phoramidat, som på sin side er bundet direkte til det terminale nukleotid i indfangningssonden. Foretrukne bærermateria-5 ler er langkædede alkylamin-derivatiserede og carboxyl-der i -vatis.erede kontrollerede poreglas, som sælges af Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, U.S.A. under produktnumrene henholdsvis 24875 og 23735 i form af perler med nominel porediameter på 500 Ångstrøm og partikeldiametre mellem ca. 125 og 10 177 mikron, og "Sephacry1"® S-500, som sælges af Pharmacia

Inc., Piscataway, New Jersey, U.S.A., under kodenr. 17-0475-01 i form af perler med en våddiameter på ca. 40 til 105 mikron og et udelukkelsesvolumen for dextraner med molekylvægt over ca. 2 xlO7 dalton, idet nævnte "Sephacryl" skal der ivatiseres 15 med cyanogenbromid eller med en am ino-afs 1uttet eller car- boxyl-afsluttet kobler. I et aspekt er den faste bærer en blandt: (A) porøs silikatglas derivatiseret ved siliciumatomer med 20 (1) grupper med formlen -(CH2)n(NH)(c°)(CH2)cch3 og -(CH2)n(NH)(P02)0-(01igo), 25 med i alt væsentligt intet siliciumatom derivatiseret med en gruppe afsluttet med en aminogruppe, hvor c er 0 til 5, n er 2 til 8, -O-(Oligo) er o 1 igonuk1eotidsonden, og oxygenatomet bundet til {01 i go) er oligonukleotidsonden, og oxygena tornet bundet til {Oli go) er 5'-oxygenet af 5'-nukleosidet eller 30 3'-oxygenet af 3'-nukleosidet i sonden, eller {2) grupper med formlen -(CH2)n(NH) (CO) (CH2)mC02H og -CH2)n(NH)(c°)(CH2)m(C0)(NH)(CH2)pNH(P02)0-(01igo) , hvor m, n og p er ens eller forskellige, og hver er 2 til 8, eller 35

I DK 175614 B1 I

I 38 I

I (B) et tværbundet makroporøst dextranmateriale, som er deriva- I

tiseret ved hydroxyloxygenatomer, som er på carbonatomer i I

I sukkerdelene, som har i det mindste et nabocarbonatom med en I

ikke-derivatiseret hydroxylgruppe, med I

Is I

I (1) grupper med formlen I

I -C(=NH)NH(CH2)q(NH)(CO)(CH2)cCH3 og I

I -C(=NH)NH(CH2)p(NH)(P02)0-01igo), I

I 10 med i alt væsentligt intet hydroxy 1 oxygen derivatiseret med en I

I gruppe afsluttet med en aminogruppe, eller I

(2) grupper med formlen I

I -C(=NH)NH(CH2)qC02H og I

I 15 -C(=NH)NH(CH2)q{C0){NH)(CH2)pNH(P02)0-(01igo), I

hvor c, q og p er ens eller forskellige, og q er 2 til 10, og I

I (C) di vi ny 1benzen-tværbundet polystyren derivatiseret ved phe- I

I 20 nylgrupper med grupper med formlen I

I -(CH2)sC02H og I

I "(CH2)s(C0)(NH)(CH2)pNH(P02)0-(01igo), I

I 25 hvor s og p er ens eller forskellige, og s er 2 til 10. Se I

I Ghosh et al., Nucleic Acids Research 15, 5353 (1987). I

Hver af tre portioner på 50 mg "Sephacry1"-perler, som er de- I

rivatiseret som ovenfor beskrevet, iblødsættes i 15 minutter I

30 ved 3 7 * C i 250 μΐ af en forhybridiseringsopløsning indeholden- I

de 0,1% SDS, 10% dextransulfat, 1 mg/ml 1aksesperm-DNA og 5x I

SSPE (0,75 M NaCl, 50 mM NaH2P04, pH-værdi 7,4 og 5 mM EDTA). I

Efter iblødsætningen pelleteres perlematerialet ved centrifu- I

gering og forhybridiseringsopløsningen fjernes ved sugning. I

35 I

Nukleinsyren fra forstærkningsproceduren på hver af de tre I

prøver isoleres ved ethanolpræcipitation og opløses derefter I

39 DK 175614 B1 til 250 μΐ i en opløsning, som er den samme som for-hybridise-ringsopløsningen men mangler 1aksesperm-DNA. Hver af de opnåede nuk1einsyreop1øsni nger forenes derefter med en portion forhybrid i serede oligonukleotid-derivatiserede "Sephacryl"-5 perler, og den opnåede blanding inkuberes ved svag omrøring ved 42eC i 90 minutter.

"Sephacryl"-perlerne pelleteres derefter ved centrifugering, hybridiseringsopløsningen fjernes ved sugning, og perlerne 10 vaskes derefter tre gange 10 minutter hver gang ved 37°C i 1 ml af en opløsning af 2x SSC (0,30 M NaCl, 0,03 M Na,citrat, pHværdi 7,0). Efter hver vask pelleteres perlerne ved centrifugering, og opløsningen fjernes ved sugning.

15 Øjeblikkelig efter den tredje vask underkastes perlerne Ceren-kov-optælling.

Perlerne med forstærket nukleinsyre fra prøve A giver én lav optæl 1 ingsmangde knapt over baggrundsoptælli nger fra scintil-20 lationsvæske alene. Perlerne med forstærket nukleinsyre fra prøve B giver optællinger i et meget højere niveau end det, der blev iagttaget med perler forbundet med prøve A. Perlerne med forstærket nukleinsyre fra prøve C viser, hvis de giver et optællingsniveau signifikant over det niveau, som nås med 25 perler forbundet med prøve A, at den person, hvis blod blev < brugt i prøve C, er inficeret med HIV-1.

EKSEMPEL III

30 De i eksempel I og II beskrevne fremgangsmåder udføres med j T7-RNA-polymerase {Promega Biotech) i stedet for SP6-RNA-poly-merase med hver af undersegmentet 5’-(promotor)j-(variabelt undersegment)j-3 ' af første primer og undersegmentet 5'-(pro-motor)3-(var iabelt undersegment) 3-3 ' af tredje primer, som har 35 sekvensen 5'-TAATACGACT CACTATA GGGA-3', hvor de 17 S'-termi-nale baser er promotorundersegmentet, og de fire 3'-baser er det variable undersegment. Det variable segment svarer til de

I DK 175614 B1 I

I 40 I

I 4 .5'-terminale baser af transkriptet fra promotoren. Ribo- I

I nukleaseinhibitor anvendes ikke i noget trin ved denne frem- I

I gangsmåde, i det mindste med polymerasepræparatet fra Promega I

I Biotech. I

I I

I EKSEMPEL IV I

I De i eksemplerne I og II beskrevne fremgangsmåder udføres med. I

I T3-RNA-polymerase (fra Stratagene, San Diego, Californien) i I

I 10 stedet for SP6-RNA-polymerasen og med det følgende segment

I anvendt som (promotor) j-(var iabelt undersegment)j-underseg- I

I mentet af første primer og (promotor)3-(variabelt underseg- I

I ment)3-undersegmentet af tredje primer: 5'-TATTAACCCT CACTAAA I

I GGGA-31, hvor de 17 5'-terminale baser er promotorsegmentet, H

I 15 og de 4 3’-terminale baser det variable segment, indbefattende H

I de 5'-terminale 4 baser i transkripter fra promotoren. H

I EKSEMPEL V I

I 20 Under anvendelse af T7-RNA-polymerasen som i eksempel III for- H

I stærkes målsegment i HIV-genomet fra menneskeblodprøver under H

I anvendelse af de følgende primere i stedet for de i eksempel I H

I anførte primere: H

I 25 Første primer: 5'-TAATACGACT CACTATA GGGA TCTAATTACT I

I ACCTCTTCTT CTGCTAGACT-3’, hvor de 30 3'-terminale baser er I

I komplementære i sekvens til baser 7076-7047 i ENV-genet fra I

I HIV-1. I

I 30 Anden primer: 51 -ACAAGTTGTA ACACCTCAGT CATTACACAG-3' med base- I

I sekvensen 6838-6866 i ENV-genet fra HIV-1. I

Tredje primer: Samme 21 5'-term i nåle baser som første primer i H

I dette eksempel forbundet til de følgende 27 3'-terminale ba- H

35 ser: 5'-AAAGGTATCC TTTGAGCCAA TTCCCATA-3’, som har basesekven- I

sen 6875-6902 i ENV-genet fra HIV-1. I

41 DK 175614 B1

Fjerde primer: 5'-AGTTGATACTACTGGCCTAATT-31 , med den sekvens, som er komplementær til basesekvensen 7033-7007 i ENV-genet fra HIV-1.

5 EKSEMPEL VI

Under anvendelse af T7-RNA-polymerasen som i eksempel III forstærkes målsegment i HIV-genomet fra menneskeblodprøver under anvendelse af de følgende primere i stedet for de i eksempel I 10 anførte primere: Første primer: Samme 21 5'-terminale nukleotider som den første og tredje primer fra eksempel V forbundet til de følgende 31 3'-terminale nukleotider: 5'-CACCTAGGGC TAACTATGTG 15 TCCTAATAAG G-3*, som har sekvensen, som er komplementær til basesekvensen 5471-5441 i SOR-genet fra HIV-1.

Anden primer: 5'-ACACCATATG TATGTTTCAG GGAAAGCTA-3', som har den samme sekvens som baser 5151-5179 i SOR-genet fra HIV-1.

20

Tredje primer: Samme 21 5'-termina1e nukleotider som den første og tredje primer fra eksempel V forbundet til de følgende 31 3'-terminale nukleotider: 5'-AAGAATAAGTTCAGAAGTACACATCCCACT-3', som har den samme sek-25 vens som baser 5220-5249 i SOR-genet fra HIV.

Fjerde primer: 5'-TGGTCTGCTAGTTCAGGGTCTACTTGTGTC-3', som har den sekvens, som er komplementær til basesekvensen 5387-5357 i SOR-genet fra HIV-1.

30

EKSEMPEL VII

Den i eksempel I beskrevne fremgangsmåde følges for isoleringen af nukleinsyre fra: 1) en prøve indeholdende 103 HIV-infi-35 cerede CEM-celler blandet med 106 ikke-i nf icerede CEM-celler (Cancer Center Research Foundation; CCRF-CEM; ATCC nr. CCL 119) og 2) en prøve indeholdende 106 ikke-i nf icerede CEM-cel-

I DK 175614 B1 I

I 42 I

I ler. Disse prøver gensuspenderes i 100 μΐ 10 mM Tris-HCl, pH- I

I værdi 7,4, 1 mM EDTA (TE) efter ethanolpræcipitationstrinnet I

I for at koncentrere prøven, som er opnået fra Extractor-søjlen I

I (MBI). De gensuspenderede prøver fraktioneres på en Sephadex I

I 5 G-50 fin roteringssøjle (Maniatis supra), idet der blev elue- I

I ret med TE. De eluerede prøver koncentreredes ved ethanolpræ- I

I cipitation (i 0,8 M LiCl, 3 volumer ethanol, i tør is/ethanol- I

I bad i 15 minutter). Den præci piterede prøve pelleteres véd I

I centrifugering. Pelleten drænes, tørres og gensuspenderes I

I 10 derefter i 100 μΐ indeholdende 40 mM Tris-HCl, pH-værdi 8,1, 8 I

I mM MgCl2# 25 mM NaCl, 2 mM spermidin, 5 mM dithiothreitol, 100 I

I μΜ af hver dATP, dGTP, dCTP og dTTP, 1 mM af hver rATP, rCTP, I

I rGTP og rUTP, 100 pg/ml BSA (nuklease-fri) og 250 nM af hver I

I af DNA-oligonukleotidprimer A I

I 15 (5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGACACCTAGGGCTAACTATGTCCTAATAAGG-3) I

I og primer (51-ACACCATATGTATGTTTCAGGGGAAAGCTA-3'). I

I Som kontrol prøver blev dobbeltprøver af oprenset HIV-RNA i en I

I koncentration på 0,01 fm gensuspenderet i 100 μΐ af den oven- I

I 20 for beskrevne puffer. Til sidst blev en 10 fm Ø-globi nsekvens I

I indeholdt i plasmid H/319A [Wallace et al., Nucl. Acids Res. 9, I

I 3647 (1981), som var blevet lineariseret ved hjælp af Hindlll

I gensuspenderet i 100 μΐ af den ovenfor beskrevne puffer, .dog H

I uden o 1 igonukleotidpri merne . 01 igonukleotidprimer D I

I 25 (5'-ACATTGCTTCTGACACAACTGTGTTCA-’) og o 1 igonuk1eotidpri mer C I

I (5'-TAATACGACTCACTATAGGGACAAAGGACTCAAA-3'), som er specifikke I

I for β-globinsekvens, blev sat til β-globi nreakt ionen ved 250 I

I nm hver. · . I

30 Bortset fra β-globi nprøven opvarmes reaktionsblandingerne til H

I 65*C i 1*. β-globinprøven koges i 1'. Alle prøver afkøles til I

I 42°C i 1 minut. Derefter tilsættes 10 enheder AMV-omvendt- I

I transkriptase. Reaktionsblandingerne inkuberes i 15 minutter I

I ved 42 ° C, koges i 1 minut og afkøles derefter ved 42eC il I

I 35 minut. 10 yderligere enheder AMV-omvendt-transkriptase til- I

I sættes, idet der blev inkuberet ved 42°C i 15 minutter. 100 I

I enheder T7-RNA-polymerase sættes til reaktionsblandingerne, og I

I reaktionsblandingerne inkuberes ved 37^ i 30 ninutter. I

43 DK 175614 B1

Prøverne koges i 1 minut og afkøles ved 42eC i 1 minut efterfulgt af tilsætningen af 10 enheder AMV-omvendt-transkriptase. Reaktionsblandingerne inkuberes ved 42®C i 15 minutter, koges i 1 minut og afkøles til 42eC i 1 minut. Yderligere 10 énheder 5 omvendt-transkriptase tilsættes efterfulgt af inkubering ved 42 * C i 15 minutter. Hundrede enheder T7-RNA-polymerase tilsættes med en 30 minutters inkubering ved 37*C. Denne cyklus gentages to yderligere gange.

10 Oet forstærkede mål påvises derefter under anvendelse af Oli-goBeads som beskrevet nedenfor.

"Sephacry1"-per ler indeholdende HlV-1-specifikke oligonukleo-tider blev fremstillet som beskrevet og lagret i TE ved 4eC 15 ved en koncentration, således at 250 μΐ af suspensionen indeholder 50 mg "Sephacry V'-perler . 01 igonukleotider blev syn tetiseret, og HPLC oprenset som beskrevet.

De til både forbinding til perlerne og påvisning anvendte oli-20 gonukleoti der er homologe med SOR-regionen i HIV-l-genomet. De ved disse undersøgelser anvendte oligonukleotider var 86-31 {påvisningsol igonukleotid) (5'-GCACACAAGTAGACCCTGAACTAGCAGACCA-3·) og 87-83 (indfang-sningso1 igonuk1eotid på perlen: 25 5'-ATGCTAGATTGGTAATAACAACATATT-3'), som er homologe med non- sens-strengen i SOR-regionen og adskilt af ca. 100 nukleoti-der. Til påvisning blev oligonukleotiderne slutmærket med 32-p efter en standardprotokol. Det ikke-inkorporerede mærke blev fjernet ved gelfiltrering på en fin Sephadex G-50-søjle, og 30 oligonukleotidet blev lagret ved -20°C. 1 et typisk perlebaseret sandwichhybridi ser ingssystemsforsøg {BBSHS) denatureres målet og 32P-mærket påvisningso1igonuk1eo-tid i 10 μΐ TE indeholdende 0,2% SDS ved 65* C i 5 minutter i 35 et Eppendorf-rør. Til dette sættes 10 μΐ 2x opl øsningshybri diser i ngsb 1 and i ng (lOx SSPE/10% dextransulfat). Opløsningen blandes, centrifugeres 2 sekunder og inkuberes ved 42°C i 1 time.

I DK 175614 B1 I

I 44 I

I I løbet af dette tidsrum forhybridi seres "SephacryV'-perlerne. I

I Råsuspensionen af perler blandes godt, og 250 μΐ portioner (50 I

I mg perler) overføres til Eppendorf-rør med blanding mellem I

I hver fjernelse for at sikre en ensartet suspension. Portioner- I

5 ne centrifugeres i 10 sekunder og TE fjernes ved hjælp af en I

udtrukket Pasteur-pipette. Efter at 250 μΐ hybridiseringsop- I

I løsning (5x SSPE [0,9 M NaCl, 50 mM NaH2P0a, pH-værdi 7,4, 1 I

mM EDTA] 10% dextransulfat/0,1% SDS) er tilsat, suspenderes I

I perlerne ved forsigtig rystning og inkuberes ved 37eC i 30-60 I

I 10 minutter med lejlighedsvis blanding. Umiddelbart før indfang- I

I ningstrinnet centrifugeres perlerne i 10 sekunder, forhybridi- I

I seringsopløsningen fjernes, 80 μΐ hybrid i seringsopløsning ved I

I 37eC tilsættes, og perlene bringes tilbage til 37°C. I

I 15 Opløsningshybri di ser i ngen centrifugeres i 2 sekunder og over- I

føres til perlerne og hybridiseringsopløsning. Perlerne sus- I

I penderes og inkuberes ved 37°C i 1 time med hyppig blanding I

I for at bevare suspensionen. I

I 20 Efter indfangningen centrifugeres perlerne i 10 sekunder, og I

I hybridiseringsopløsningen indeholdende ikke-indfangede mål og I

påvisningsoligonukleotid overføres til en scinti1lationstæl- I

I lerflaske. Perlerne vaskes derefter 5 gange med 2x SSC ved I

37°C. De første tre vask er hurtige, 1 ml vaskevand tilsættes, I

I 25 perlerne blandes godt og centrifugeres 10 sekunder, og vaske- I

vandet overføres til en optællingsflaske. Til de 2 slutvask I

tilsættes 1 ml vaskevand, og perlerne blandes og inkuberes ved I

I 37 * C i 5 minutter før de centrifugeres. Hvert vaskevand optæl- I

I les separat for at overvåge proceduren. I

I 30 I

Cerenkov-optæl 1 i nger af hybridiseringsopløsningen, 5 vaske- I

vand, og perler måles i 5-10 minutter. Baggrundsoptællingen I

trækkes fra alle prøver. Det påviste fm-mål beregnes på føl- I

gende måde: I

35 I

(CPM på perler/samlet CPM) X fm oligonukleotid I

45 DK 175614 B1

Hvor hvor samlet CPM er summen af CPM for hybridi ser ingsop1øs-ningen, 5 vaskevand, og perler.

PÅVISNING AF FORSTÆRKEOE MAL VED BBSHS 5 MAL μ 1 ANVENDT (FM) PAVIST

10“15 MOL

103 HIV-inficerede celler 0,33 0,06 1θ5 CEM ikke-inficerede celler 0,66 0,13 10® ikke-inficerede CEM-celler 0,07 0,01 10 0,14 0,015 0,7 0,01 10 0,008 0,01 fm HIV-RNA 0,007 0,14 0,014 0,29 15 10 fm j5-globin DNA 10 0,014

EKSEMPEL VIII

Der følges den i eksempel I beskrevne fremgangsmåde til iso-20 lering af nukleinsyrer fra to prøver: a) 103 HIV-inficerede CEM-celler med 10® ikke-i nf icerede CEM-celler, og b) 106 ikke-inficerede dyrkede CEM-celler, hvortil 0,01 fmol oprenset HIV er tilsat efter ekstraktion. Fremgangsmåden modificeres derefter ved yderligere oprensning gennem en Sephadex G-50 (fin) 25 rotationssøjle (Maniatis supra), idet der elueres med TE efter Extractor-søjletrinnet. Dette efterfølges af en ethanolpræci-pitation af nukleinsyren (i 0,8 M LiCl og 2,5 volumen EtOH). Nukleinsyren gensuspenderes derefter i 100 μΐ indeholdende-.

30 40 mM Tris-HCl, pH-værdi 8,1 8 mM MgCl2 25 mM NaCl 2 mM spermidin 5 mM DTT (dithiothreitol) 35 100 μΜ dATP, dTTP, dCTP, dGTP (hver) 1 μιη rATP, rCTP, rGTP, rUTP 100 μg/m^, BSA nukleasefri

I DK 175614 B1 I

I 46 I

I 250 nM 29 bp DNA-o1 igonuk1eotid med sekvensen I

I 5'ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA-3' (Primer B) I

I 250 nM 56 bp DNA-oligonukleotid med sekvensen I

I 5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGACACCTAGGGCTAACTATGTGTCCTAA I

I 5 TAAGG-3') (Primer A) I

I 100 μΐ af opløsningen opvarmes til 65°C i 1 minut og afkøles I

I til 42eC i løbet af 1 minut. Denne opvarmning og derefter op- I

I hold ved 42°C eller over i kombination med sammensætningen af I

I 10 opløsningen giver tilstrækkelig strenge forbindelser for hy- I

I bridisering af (31-primerundersegment)j , (se fig. 1) med til- I

I strækkelig stabilitet til sekvensen, som er komplementær til I

I sekvensen af (3 ’ -primerundersegment)j i mål-HIV-RNA med høj I

I specificitet. I

I 15 I

I Derefter tilsættes 10 enheder aviær myoblastosisvi rus-omvendt- I

I transkriptase (AMV) (Life Sciences, Inc.) til opløsningen, og I

I opløsningen inkuberes i 10 minutter ved 42°C. [En enhed inkor- I

I porerer 1 nmol TTP i syrepræcipiterbar form i 10 minutter ved I

I 20 37°C under anvendelse af poly(A)-oligo (T)12 — 18 som skabelon- I

I primer, som defineret af Houts et al., J. Virol. 29, 517 I

I (1979)]. Efter en 10 minutters inkubering anbringes opløsnin-

I gen i et kogende vandbad i 1 minut. Denne opvarmning forårsa- I

I ger strengadskillelse af duplexet, som er dannet ved hjælp af I

25 omvendt-transkriptase og inaktivering af det omvendte-tran-

skriptase. I

Derefter afkøles opløsningen til 42°C i løbet af 1 minut. I I

løbet af denne afkøling hybridiserer den anden primer, primer I

30 B, til den 3''-terminale ende (tredje undersegment) t2c · se ^9- I

1, af målkomplementen af DNA-streng, som er dannet ved reak- I

tionen katalyseret af den omvendte transkriptase i det fore- H

gående trin. Igen er hybridiseringsbetingelserne tilstrækkelig I

strenge til specifik hybridisering mellem den anden primer og

35 sekvensen, som er komplementær til sekvensen af den anden pri- I

mer. I

DK 175614 B1 I

47 I

Efter afkøling tilsættes 10 yderligere enheder AMV-omvendt- I

transkriptase og yderligere inkubering udføres i 10 minutter I

ved 42 eC . I

5 100 enheder T7-po lyenerase sættes til reaktionsblandingen. I

Reaktionsblandingen inkuberes derefter ved 3 7 °C i 30 minutter. I

Der syntetiseres et RNA-transkript, som er komplementært til I

det oprindelige mål-HIV-RNA startende fra T7-promotoren til I

stede ved 5'-enden af duplex-DNA-skabelonen, som lige er syn- I

10 tetiseret af den omvendte-transkriptase. Transkriptet har sek- I

I vensen 5'-GGGAf derefter fortsættes med sekvensen, som er I

I komplementær til det andet undersegment af målsegmentet {dvs. I

I andet under segmenter * se fig· 1)· 0a den omvendte-transkrip- I

I tase ikke er blevet inaktiveret før dette trin, og da primer B I

I 15 er til stede såvel som deoxynukleotidtriphosphaterne, foregår I

I der en sekundær syntese ved dette trin. Primer B hybridiserer I

I til 3'-regionen af det nyligt syntetiserede RNA-transkript I

I (tredje undersegment)t2cr» se fig· 1* som er komplementær til I

I 8-primer. Den omvendte-transkriptase, som er blevet tilsat i I

I 20 det foregående trin, syntetiserer en DNA-streng under anven- I

I delse af det nyligt syntetiserede RNA-transkript (fremstillet I

I af T7-polymerase) som en skabelon og under anvendelse af oli- I

I gonukleotid B som primeren ved 5'-enden. I

I 25 Reaktionsblandingen koges derefter i 1 minut for at denaturere I

I RNA:DNA-duplexen. Reaktionsblandingen afkøles derefter til I

I 42° C i løbet af et minut. I løbet af dette afkølingstrin hy- I

I bridiserer det må 1komp1ementære segment af primer A til 0NA- I

I strengen, som er syntetiseret i løbet af det foregående trin. I

I 30 På samme tidspunkt hybridiserer primer B til dens komplemen- I

I tære sekvens på RNA-1ranskriptet, som er syntetiseret i det I foregående trin. 1

Efter afkøling tilsættes 10 yderligere enheder AMV-omvendt- I 35 transkriptase, og der foretages yderligere inkubering i 10

I minutter ved 42°C. Omvendt-transkriptase syntetiserer DNA

I komplementær til HIV-målet under anvendelse af o 1 igonukleotid

I DK 175614 B1 I

I 48 I

I A som en primer ved 5’-enden og DNA fremstillet i det tidli- I

gere trin som en skabelon. En anden DNA-streng syntetiseres I

under anvendelse af ol igonukleotid B som en primer og det i I

det tidligere trin fremstillede RNA-transkript som en skabe- I

5 Ion. I

I Reaktionsblandingen koges i l minut for at denaturere DNA- I

I duplexen og RNA-.DNA-duplexen. Reaktionsblandingen afkøles til I

I 42°C i løbet af et minut. Primer A hybridiserer til cDNA, som I

I 10 er fremstillet under anvendelse af RNA-transkriptet som skabe- I

I Ion i det foregående trin (hvis 3’-enden af skabelon-strengen I

I også anvendes som en omvendt-transkriptaseprimer fremstilles I

et produkt identisk med slutproduktet fra den næste reaktion). I

Primer B hybridiserer til DNA-strengen, som er komplementær I

I 15 til mål-HIV-RNA. Denne anden syntese frembringer et produkt, I

som er. en duplex-DNA indeholdende en T7-promotorsekvens ved I

I dens 5’-ende såvel som et 4 bp "variabelt" segment 5’-GGGA-3'. I

100 enheder T7-polymerase sættes til reaktionsblandingen. I

I 20 Reaktionsblandingen inkuberes i 30 minutter til 37eC. T7-RNA- I

I polymerasen anvender den dobbeltstrengede duplex-DNA indehol- I

I dende en dupiex-T7-promotor som en skabelon til at transkri- I

I bere RNA, som er komplementær til det andet mål undersegment I

I indeholdende den yderligere sekvens 5’-GGGA-3' ved dens I

I 25 5’-ende. I

I Denne cyklus (koge 1', 1' ved 42eC, omvendt-transkriptase 10’ I

I ved 42eC, omvendt transkriptase 10' ved 42eC, T7-polymerase I

I 37eC 30') kan gentages så mange gange, som det er nødvendigt I

30 for at opnå den ønskede forstærkning af målsekvens. Det op- I

nåede produkt kan derefter påvises ved hjælp af nukleinsyre- I

sondehybridiseringsteknik. I

EKSEMPEL IX I

35 I

Oprenset HIV-RNA i en koncentration på 1 fmol blev gensuspen- I

deret i: I

49 DK 175614 B1 40 mM Tris-HCl, pH-værdi 8,1 8 mM MgCl2 25 mM NaCl 2 mM spermidin 5 5 mM dithiothreitol 100 μΜ dATP, dTTP, dCTP, dGTP (hver) 1 μΜ hver rATP, rCTP, rGTP, rUTP 100 ug/ml BSA nukleasefri 250 nM 29 bp DNA-oligonukleotid med sekvensen 10 5’ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA-3' (Primer B) 250 nM 56 bp ONA-oligonukleotid med sekvensen 5·-AATTT AATACGACTCACTATAGGGACACCTAGGGCT AACTATGTGTCCTAA TAAGG-3') (Primer A) 15 De 100 μΐ opløsning opvarmes til 65eC i 1 minut og afkøles til 42*0 i løbet af 1 minut. Dette opvarmningstrin og afkølingstrin i kombination med sammensætningen af opløsningen giver tilstrækkelig strenge betingelser for hybri di ser i ngen af primer A med tilstrækkelig stabilitet til sekvensen komplementær 20 til sekvensen af primer A-regionen i mål-HIV-RNA [(første undersegment)t2 "i fig· 1] med høj specificitet.

Derefter tilsættes 10 enheder aviær myoblastos i svi rus-omvendt-transkriptase (AMV) (Life Science, Inc.) til opløsningen, og 25 opløsningen inkuberes i 10 minutter ved 42°C. Efter en 10 minutters inkubering anbringes opløsningen i et kogende vandbad i 1 minut. Denne opvarmning forårsager strengadskillelse af duplexen dannet af omvendt-transkriptase og inaktivering af omvendt-transkriptase.

30

Opløsningen afkøles til 42°C i løbet af 1 minut. I løbet af denne afkøling hybridiserer den anden primer B til 3'-enden af den nyligt syntetiserede mål-komplementære streng [eller (tredje undersegment)t2c 1 fig· 11· Igen er hybri diser ings-35 betingelserne tilstrækkelig strenge til specifik hybridi ser ing mellem den anden primer og sekvensen, som er komplementær til sekvensen af den anden primer.

I DK 175614 B1 I

I 50 I

I Efter afkøling tilsættes 10 yderligere enheder AMV-omvendt- I

I transkriptase, og der foretages yderligere inkubering i 10 mi- I

I nutter ved 42eC. I

I 5 100 enheder T7-RNA-polymerase (New England Biolabs} sættes til I

I reaktionsblandingen. Reaktionsblandingen inkuberes derefter I

I ved 3 7 0 C i 30 minutter. Der syntetiseres et RNA-transkript, I

I som er komplementær til det oprindelige mål-HIV-RNA startende I

I fra T7-promotoren, som er til stede ved 5'-enden af duplex- I

I 10 ONA-skabelonen, som er syntetiseret af omvendt-transkriptase. I

I RNA-transkriptet har sekvensen 5'-GGGA, derefter fortsættes I

I med sekvensen, som er komplementær til det andet undersegment I

I af målsekvensen (dvs. andet undersegment^cr, fig. 1). Da den I

I omvendte transkriptase ikke er blevet inaktiveret før dette I

I 15 trin, og da primer B er til stede såvel som deoxynukleotid- I

I triphosphaterne, foregår en anden syntese på dette trin. Pri- I

I mer B hybridiserer til 3'-regionen af det nyligt syntetiserede I

I RNA-transkript [(tredje undersegment)t2cr· se fi*9· 1], som er I

I komplementær til primer B. Den omvendte transkriptase (som var I

I 20 blevet tilsat i det forudgående trin) syntetiserer en DNA- I

I streng under anvendelse af det nye syntetiserede RNA-tran- I

I skript (fremstillet af T7-RNA-polymerasen) som en skabelon og I

I oligonukleotid B som en primer ved 5'-enden. I

I 25 Reaktionsblandingen koges derefter i 1 minut for at denaturere I

I RNA:DNA-dup1exen. Reaktionsblandingen afkøles derefter til

I 42eC i løbet af et minut. .1 løbet af dette afkølingstrin hy- I

I bridiserer det må 1-komp1ementære segment af primer A til DNA- I

I strengen, som er syntetiseret i det forudgående trin. På det I

I 30 samme tidspunkt hybridiserer primer B til dens komplementære I

I sekvens på RNA-transkriptet, som er syntetiseret i det forud- I

I gående trin.

I Efter afkøling tilsættes 10 enheder AMV-omvendt-transkriptase, I

I 35 og der inkuberes yderligere i 10 minutter ved 42°C. Omvendt- I

I transkriptase syntetiserer DNA komplementær til HIV-målet un- I

I der anvendelse af oligonukleotid A som en primer ved 5'-enden I

51 DK 175614 B1 og ONA fremstillet i det forudgående trin som en skabelon.

3’-enden af skabelonstrengen anvendes som en primer til fremstilling af et siut-duplex-DNA med et dobbeltstrenget T7-pro-motorsted ved dets 5'-ende. En anden DNA-streng syntetiseres 5 under anvendelse af ol igonukleotid B som en primer, og RNA-transkriptet, som er fremstillet i det foregående trin som en skabelon.

100 enheder T7-polymerase sættes til reaktionsblandingen.

10 Reaktionsblandingen inkuberes i 30 minutter ved 37°C. T7-RNA- polymerasen syntetiserer et RNA-transkript under anvendelse af j duplex-ONA indeholdende polymerasebindingsstedet (T7-promotor) ved dets 5’-ende som en skabelon. RNA-transkriptet er komplementær til mål-andet undersegment, se fig. 1, indeholdende den 15 yderligere sekvens 5'-GG6A-3’ ved dens 5'-ende. Der kan foretages yderligere cykler til forøgelse af forstærkningen. De opnåede produkter kan påvises ved hjælp af en nukleinsyrehy-bridiseringsprotokol.

20 EKSEMPEL X

Protokol for s idste-rundemærkning af et TAS-forstærket produkt.

25 A. Søjle til fjernelse af ikke-inkorporerede kolde nukleotider 1. TAS-reaktionsblandingen (100 μΐ ) tages efter cDNA-syntesen i slutcyklusen af TAS. Tilsæt 400 μΐ reagens A (0,1 M Tris-HC1, pH-værdi 7,7, 10 mM tri ethyl ami η, 1 mM di natrium-EDTA) 30 til reaktionsblandingen.

2. Ækvilibrer en NENSORB20 (Dupont)-forpakket søjle ved be-fugtning af søjlematerialet i 100% methanol (HPLC-kvali-tet), derefter ækvi1 ibrering med 2 ml reagens A.

35 3. Påfyld prøve på søjle.

I DK 175614 B1 I

I 52 1

I 4. Vask søjlen 3 gange med 1 ml reagens A. I

I 5. Vask søjlen 3 gange med 1 ml vand. H

I 56. Eluer nukleinsyrerne med 50% methanol, opsamlende 250-300 I

I μΐ fraktioner i op til 1 ml samlet volumen. (De første to H

I fraktioner vil indeholde størstedelen af nukleinsyren). H

I 7. Tør fraktionerne i "speed-vac” eller lyofi 1 i ser ingsapparat. H

I 10 I

I B. Protokol til mærkning af det forstærkede produkt. I

I 1. Gensuspender fraktionerne fra NENSORB2o_søJlen (de første I

I to fraktioner kan forenes) i 40 mM Tris-HCl, pH-værdi 8,1, I

I 15 8 mM MgCl2, 25 mM NaCl, 2 mM spermidin-(HC1)3, 5 mM dithio- I

I threitol, 400 μΜ af hver rATP, rCTP og rGTP, 12 μΜ rUTP og I

I 25 MCi a-32p-rUTP (800 Ci/mmol). I

I 2. Tilsæt 50 enheder T7-RNA-polymerase (New England Biolabs) I

I 20 for hver 50 μΐ prøve. Inkuber ved 37eC i 30 minutter. I

I 3. Det ikke-inkorporerede mærke kan fjernes ved hjælp af en H

I G-50-roteringssøjle (Maniatis supra). H

I 25 4. Oen mærkede prøve kan køres på en sekvensbestemme 1sespo1y- H

I acrylamidgel for at fastlægge størrelsen af det forstærkede H

I produkt. Det mærkede produkt kan også påvises under anven- H

I delse af 01 igo-Beads®. I

I 30 EKSEMPEL XI I

I Anvendelse af en indre standard under TAS-forstærkning H 1

Der blev fremstillet prøver med: 1) 0,1 fm HIV-RNA- og 0,1 fm I

I 8-globin-DNA-sekvenser (Ηβ19Α kløvet med PstI), 2) 0,01 fm

I 35 HIV-RNA og 0,1 fm /3-globin-DNA (H/319A kløvet raed PstI), 3) 0,1 I

I fm HIV-RNA, eller 4) 0,1 fm jS-g 1 ob i n-DNA (H/319A kløvet med I

I PstI i 100 μΐ indeholdende 40 mM Tris-HCl, pH-værdi 8,1, 8 mM I

53 DK 175614 B1

MgCl2, 25 mM NaCl, 2 mM spermidin-(HCl)3, 5 mM dithiothreitol,

100 μΐ af hver dATP, dTTP, dCTP og dGTP, 1 mM af hver rATP, rUTP, rCTP og rGTP, 100 pg/rol BSA (nuklease-f ri) og 250 nM primer A

5 (5’-aatttaatacgactcactatagggacacctagggctaactatgtgtcctaataagg- 3'), 250 nM primer B (5'-ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA-3'),

250 nM primer C

(5’-TAATACGACTCACTATAGGGAACTAAAGGCACCGAGCACTTTCTTGCC-31), og 250 nM primer D (5'-ACATTGCTTCTGACACAACTGTGTTCA-3 ' ) . En prøve 10 med 1/20 udgangsnukleinsyrer blev anbragt i denatureringsopløsningen 7,4% formaldehyd, lOx SSC (1,5 M NaCl , 0,15 M Na-ci-trat, pH-værdi 7,4) for nultidspunktprøverne.

Prøverne blev kogt i 1 minut og afkølet ved 42°C i 1 minut ef-15 terfulgt at tilsætningen af 10 enheder AMV-omvendt-transkrip-tase. Reaktionsblandingerne i nkuberes ved 42°C i 15 minutter, koges i 1 minut og afkøles ved 42°C i 1 minut. Yderligere 10 enheder AMV-omvendt-transkriptase tilsættes efterfulgt af i n-kubering ved 42®C i 15 minutter. 100 enheder T7-RNA-polymerase 20 tilsættes efterfulgt af inkubering ved 37°C i 30 minutter. Denne cyklus gentages endnu engang. (Der kan udføres flere cykler afhængig af den nødvendige forstærkning). To prøver indeholdende 1/20 af udgangsmålnukleinsyrer blev anbragt i denatureringsopløsning for den anden transkr i ptions-tidspunkt-25 prøver.

Alle prøver blev opvarmet til 55eC i 30 minutter før filtrering på to nitrocellulosemembraner. Nukleinsyrerne blev fikse-ret til membranen ved bestråling med 254 nm UV-lys i 4 minut-30 ter. Som kontrol prøver blev 1, 0,1 og 0,01 fm plasmid pARV7/2 [Luciw et al.. Nature 312, 760 (1984)], som indeholder hele HIV-genom-cDNA' et såvel som plasmid H/319A [Wallace et al., Nucl. Acids Res. 9, 3647 (1981)], denatureret i 0,2 N NaOH, neutraliseret med et lige så stort volumen 2 M ammoniumacetat 35 og derefter filtreret på nitrocellulosemembranen. En membran blev hybrid i seret med 32p-mærket oligonukleotid 86-31 *, som er specifik for det forstærkede produkt af HIV. Den anden membran

I DK 175614 B1 I

I 54 I

I blev hybridiseret til 32p-raærket oligonukleotid B7-4592, som I

I vil hybridisere til det forstærkede /5—g 1 obi nprodukt såvel som I

til mål-Ø-globinplasmidet. I

I 5 Hybridiseringerne blev foretaget i 1% SDS, 0,9 H NaCl, 50 nM I

I NaH2P04 (pH-værdi 7,4), 5 mM EDTA (pH-værdi 7,4) og 106 cpm/m. I

I 32p-mærket oligonukleotid i 1 time ved 55°C. Membranerne blev I

I vasket 3 gange i 1% SDS, 0,18 M NaCl, 10 mM NaH2P04 (pH-værdi I

I 7,4) og 1 mM EDTA ved stuetemperatur efterfulgt af 1 vask i I

I 10 den samme puffer ved 55eC. I

I Membranerne blev derefter autoradiograferet i 16 timer på I

I Kodak XAR-film ved -70eC med en forstærkningsskærm. I

I I

I 15 Bemærkn i nqer I

I 1. 86-31: 5'-GCACACAAGTAGACCCTGAACTAGCAGACCA-3' I

I 2. 87-459: 5'-AGGTTTAAG6AGACCAATAGAAACT-3 * I

I Autoradiografiet i fig. 3 viser mængden af HIV- og Ø-globin- I

I 20 sekvenser påvist efter to TAS-cyklusser udført samtidig på I

I HIV og β-globinnukleinsyre. Udgangsmængden af β-globin blev I

I holdt konstant, mens mængden af HIV-mål blev varieret. I 1

Selvom opf i ndel sen er blevet beskrevet med nogen specificitet I

I 25 i den foreliggende beskrivelse, vil fagmanden inden for det I

I foreliggende område kunne se variationer og modifikationer af I

I opfindelsen som beskrevet, som er inden for den foreliggende I

I opfindelses omfang. Sådanne variationer og modifikationer er I

også inden for den foreliggende opfindelse som beskrevet og I

30 gjort til genstand for krav heri. I

Opfindelsen har yderligere træk: I

I. Fremgangsmåden beskrevet i følgende krav 21 er karakterise- I

35 ret ved at (1) den DNA-afhængige bakteriofag-RNA-polymerase er I

T7-RNA-polymerase, (promotor)} er 5'-TAATACGACTCACTATA-3’ og I

(variabelt undersegment)} har et dinukleotid med sekvensen I

55 DK 175614 B1 5'-GG-3' ved dets S'-ende, eller (2) den DNA-afhæng ige bakte-ri of ag-RNA-polymer ase er T3-RNA-polymerase, (promotor)} er 5'-TATTAACCCTCACTAAA-3' og (variabelt undersegment)} har et tetranukleotid med sekvensen 5’-GGGA-3’ ved dets S'-ende, el-5 ler (3) den DNA-afhængige bakteriofag-RNA-polymerase er SP6-RNA-polyroerase, (promotor)} er 51-GAACGCGGCTACAATTAATACATAACCTTATGTATCATACACATACGATTTAGGTGA-CACTATA-3', og (variabelt undersegment)} har et hexanukleotid med sekvensen 5'-GAATAC-3' ved dets S'-ende.

10 II. Fremgangsmåden ifølge I er karakteriseret ved at S’-enden af den første primer er B'-nukleotidet af (promotor)}.

III. Fremgangsmåden ifølge II er karakteriseret ved, at hvis IS den DNA-afhængige bakteriofag-RNA-polymerase er T7-eller T3-RNA-polymerasen, har (variabelt undersegment)j sekvensen B’-GGGATGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3' og, hvis den DNA-afhængige bakteriofag-RNA-polymerase er SP6-RNA-poly-merasen, har (variabelt undersegment)} sekvensen 20 5'-GAATACTGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3'.

IV. Fremgangsmåden ifølge krav 32, 33, 34, 3S, 36 eller 37 er karakteriseret ved, at (A) (i) hvis den første DNA-afhængige bakteriofag-RNA-polymerase er T7- eller T3-RNA-polymerase, har 2B (variabelt undersegment)} sekvensen S'-GGGATGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3', og anden primer (variabelt undersegment) 2 har sekvenisen 5'-CGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGTGC-3'; eller (i i) hvis den første DNA-afhængige bakteriofag-DNA-RNA-polyme-30 rase er SP6-RNA-polymerase, har (variabelt undersegment)} sekvensen 5'-GAATACTGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3’ og anden primer (variabelt undersegment)2 har sekvensen 5·-CGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGTGC-31, (B) (i) hvis den anden DNA-afhængige bakter i ofag-RNA-po1 ymera-3 S se er T7- eller T3-RNA-polymerase, har (variabelt underseg-ment)3 sekvensen B1-GGGATGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3’j (ii) hvis den

I DK 175614 B1 I

I 56 I

I anden DNA-afhæng ige bakteriofag-RNA-po1 ymerase er SP6-RNA-po- I

I lymerase, har (variabelt undersegment )3 sekvensen I

I 5’-GAATACGGGATGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3', og den I

I fjerde primer har som 5'-enden 40 nukleotider I

I 5 5’-CGCGCTCTCCCAGGTGAQGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGTGC-3'; og (C) I

I efter trin (12) replikeres det andet RNA autokatalytisk med I

I Q/3-rep 1 ikase. I

I V. Fremgangsmåden ifølge krav 41 er karakteriseret ved, at I

I 10 5'-enden af den første primer er 5'-nukleotidet af (promo- I

I tor)}, at hvis den DNA-afhængige bakteriofag-RNA-polymerase er I

I T7-RNA-polymerase, har undersegmentet (promotor)j-(var i abe 11 I

I undersegment)1 af den første primer sekvensen 5'-TAATACGACTCA- I

I CTATAGGGACGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGTGC-3 ' ; at I

I 15 hvis den DNA-afhæng ige bakteriofag-RNA-polymerase er T3-RNA- I

I polymerase, har undersegmentet (promotor)}-(variabelt under- I

I segment)} af den første primer sekvensen 5'-TATTAACCCTCA- I

I CTAAAGGGACGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGTGC-31; at I

I hvis den DNA-afhængige bakteriofag-RNA-polymerase er SP6RNA- I

I 20 polymerase, har undersegmentet (promotor)}-(variabelt under- I

I segment)} af den første primer sekvensen 5'-GAACGCGGCTACAATTA- I

I ATACATAACCTTATGTATCATACACATACGATTTAGGTGACACTATAGAATACCGCGCTCT- I

I CCCAG6TGACGCCTCGA6AAGAGGCGCGACCTTCGTGC-3’; at (variabelt I

I undersegment )2 har sekvensen I

I 25 5'-TGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3' ; og at, efter trin I

I (6)* replikeres det første RNA autokatalytisk med Q/3-repli- I

I kase. I

I 35 I

30 I

Claims (18)

1. 57 I PATENTKRAV I l. Fremgangsmåde til amplifikation af en målnukleinsyresekvens i en prøve in- I 5 deholdende nukleinsyre, omfattende: I 1. hybridisering af en første enkeltstrenget DNA-primer med nævnte målnukleinsy- I resekvens, hvor nævnte primer omfatter en promotorsekvens, som med en se- I kvens af 0 til 100 nukleotider er bundet til en sekvens af nukleotider, der er kom- I 10 plementære med 3'-enden af nævnte målsekvens, idet nævnte komplementære se- I I kvens i det mindste har en længde på 10 nukleotider, I I 2) forlængelse af nævnte første primer, som er hybridiseret i overensstemmelse med I I trin (1), ved en reaktion, der er katalyseret med en DNA-polymerase, til dannelse I I 15 afen første komplementær DNA-sekvens, I I 3) adskillelse af duplexen dannet i trin (2) i enkeltstrenge, I I 4) hybridisering af en anden enkeltstrenget DNA-primer, som har en sekvens med i I I 20 det mindste 10 nukleotider svarende til 5'-enden af nævnte målsekvens og even- I tuelt en yderligere DNA-sekvens af op til 100 nukleotider, med nævnte første I komplementære DNA-sekvens, I 5) forlængelse af nævnte anden primer, der er hybridiseret i overensstemmelse med I 25 trin (4), ved en reaktion, som er katalyseret med en DNA-polymerase, til dannelse I af en anden komplementær DNA-sekvens og 1 6. anvendelse af det dobbeltstrengede DNA-produkt fra trin (5) til fremstilling af en I mængde RNA-transkripter, der er komplementære med nævnte målsekvens, ved I 30 en reaktion, som er katalyseret med en DNA-afhængig RNA-polymerase med I specificitet for promotoren, som er indbefattet i nævnte første primer. I DK 175614 B1 I I 58 I
2. 2. Fremgangsmåde til amplificering af en målnukleinsyresekvens ifølge krav 1, I hvor nævnte målsekvens yderligere amplificeres ved I I (7) hybridisering af en tredje enkeltstrenget DNA-primer med RNA-transkripteme I I 5 fremstillet i trin (6), hvor nævnte primer omfatter en promotorsekvens, der I med en sekvens af 0 til 100 nukleotider er bundet til en sekvens af nukleotider, I I som er komplementære med 3’-enden af nævnte målsekvens, idet nævnte I I komplementære sekvens i det mindste har en længde på 10 nukleotider og I I eventuelt ikke eller ikke væsentligt overlapper med sekvensen af i det mindste 1 I 10 10 nukleotider, som svarer til 5'-enden af nævnte målsekvens i nævnte anden I primer, idet nævnte promotorsekvens er den samme som eller forskellig fra I I promotorsekvensen i nævnte første DNA-primer; I I (8) forlængelse af nævnte tredje primer ved en reaktion katalyseret med en DNA- I I 15 polymerase til dannelse af en tredje komplementær DNA-sekvens; I I (9) adskillelse af nukleinsyreduplexen dannet i trin (8) i enkeltstrenge; I I (10) hybridisering af en fjerde enkeltstrenget DNA-primer med nævnte tredje kom- I I 20 plementære DNA-sekvens, hvilken primer har en sekvens med i det mindste I I 10 nukleotider svarende til 5'-enden af RNA-transkripteme fremstillet i trin (6) I I og eventuelt en yderligere DNA-sekvens med op til 100 nukleotider, idet I I nævnte tilsvarende sekvens eventuelt ikke eller ikke væsentligt overlapper med I I sekvensen med i det mindste 10 nukleotider, der er komplementære med 3’- I I 25 enden af nævnte målsekvens i nævnte første primer; (11) forlængelse af nævnte fjerde primer ved en reaktion katalyseret med en DNA- I polymerase til dannelse af et fjerde komplementært DNA og I 30 (12) anvendelse af det dobbeltstrengede DNA-produkt fra trin (5) til fremstilling af I en mængde transkripter svarende til nævnte målsekvens ved en reaktion kata- I 59 DK 175614 B1 lyseret med en DNA-afhængig RNA-polymerase med specificitet for promotoren, der er indbefattet i nævnte tredje primer.
3. 3. Fremgangsmåde, der er nyttig til påvisning af i det mindste én specifik nu-I 5 kleinsyremålsekvens i en prøve indeholdende nukleinsyre, omfattende fremstilling, I ifølge krav 1 eller 2, af RNA-transkripter, der indeholder en sekvens, som er komple- I mentær med eller svarer til nævnte målsekvens, og påvisning af tilstedeværelsen af I nævnte RNA-sekvens. I 10
4. 4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, hvor nævnte transkripter indeholder et replika- I segenkendelsessted for replikation af nævnte transkripter ved replikaseinduktion.
5. 5. Fremgangsmåde ifølge krav 3 eller krav 4, hvor den påviste RNA-sekvens af I nævnte RNA-transkripter måles på en standardiseret måde for at måle mængden af I 15 målsekvens indeholdt i en prøve af nukleinsyre, som anvendes til fremstilling af det I dobbeltstrengede nukleinsyretemplat.
6. 6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, hvor den påviste RNA-sekvens i nævnte RNA- I transkripter måles på en måde, der er internt standardiseret med tilstedeværelsen af et I 20 kendt kopiantal af nukleinsyre, der ligeledes indgår i nævnte prøve.
7. 7. Fremgangsmåde ifølge krav 3, hvor nævnte nukleinsyresekvens er et segment I af et humant immundefektvirus. I 25
8. 8. Fremgangsmåde ifølge krav 1-4, hvor promotoren svarende til promotorse- I kvensen i den første primer, er en bakteriofag-T7-promotor, og RNA-transkripteme I frembringes under anvendelse af T7-RNA-polymerase.
9. 9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 -4, hvor promotoren I 30 svarende til promotorsekvensen i den første primer er en bakteriofag-SP6-promotor, og I RNA-transkripteme frembringes under anvendelse af SP6-RNA-polymerase. I DK 175614 B1 I 60 I
10. 10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, hvor målsekvensen I I er en DNA-sekvens, og polymeraseforlængelsesreaktionen katalyseres med E. coli I I DNA-polymerase I. I I 5
11. 11. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, hvor målsekvensen I I er en DNA-sekvens, og polymeraseforlængelsesreaktionen katalyseres med Klenow- I I fragmentet af E. coli DNA-polymerase I. I
12. 12. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, hvor målsekvensen I I 10 er en DNA-sekvens, og polymeraseforlængelsesreaktionen katalyseres med T4-DNA- I polymerase. I
13. 13. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, hvor alle polymera- I seforlængelsesreaktioneme katalyseres med en revers transkriptase. I
14. 14. Fremgangsmåde ifølge krav 3, hvor nævnte RNA-transkripter er mærket før I påvisning. I
15. 15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, hvor nævnte RNA-transkripter er radiomær- I 20 ket. I

    15 I
16. 16. Fremgangsmåde ifølge krav 14, hvor nævnte RNA-transkripter er chromofor- I mærket. I
17. 17. Fremgangsmåde ifølge krav 13, hvor den reverse transkriptase er valgt ffa I gruppen bestående af AMV-revers transkriptase og MMLV-revers transkriptase. I
18. 18. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-17, hvor strengene I adskilles ved termisk denaturering. I