DK175944B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af en dobbeltstrenget nucleinsyre som inkluderer en promotor der er operabelt forbundet til en sekvens, som skal detekteres, og en fremgangsmåde, der er anvendelig til detektion af en specifik nucleinsyresekvens ...... - Google Patents

Description

DK 175944 B1

OPFINDELSENS BAGGRUND

Nyere fremskridt inden for molekylærbiologiens generelle område har gjort det muligt at detektere specifikke nucleinsyresekvenser af klinisk og kom-5 merciel betydning. For eksempel har analyser af nucleinsyresekvenseme i forskellige humane gener afsløret unikke sekvensændringer, der er forbundet med specifikke sygdomme. På lignende måde er der inden for forskellige patogeners genom identificeret sekvenser, som på unik vis karakteriserer hver organisme og adskiller dem fra selv nært beslægtede arter. Tilgænge-10 ligheden af sådan sekvensinformation har gjort det muligt at diagnosticere sygdomme på det genetiske niveau.

Den mest almindelige metode til detektion af en specifik nucleinsyresekvens er hybridisering. Ved denne metode udnyttes den evne, som en nucleinsyre-15 sekvens har til at danne et stabilt ikke-covalent kompleks med en komplementær nucleinsyresekvens. For at bestemme, om en specifik nucleinsyresekvens er til stede i en prøve, fremstilles en komplementær nucleinsyreson-de mærket med en detekterbar kemisk modifikation, og denne sættes til prøven. Hvis den sekvens, der ønskes detekteret, er til stede, vil den mærkede 20 probe blive hybridiseret til den, idet det detekterbare mærke tilvejebringer en måde til på kendt vis at bestemme, om der er sket hybridisering og i hvilken grad.

Den væsentligste begrænsning af anvendelsen af de nuværende hybridise-„ 25 ringsmetoder til bestemmelse af en nucleinsyresekvens i en prøve er, at de ikke er tilstrækkeligt følsomme og derfor kræver en relativt stor prøvemængde for på præcis måde at verificere tilstedeværelsen af en specifik nucleinsyresekvens. Denne begrænsning giver markante praktiske vanskeligheder under kliniske forhold på grund af den begrænsede prøvemængde, der typisk 30 vil være tilgængelig for analyse. Som en følge heraf har der været rettet stor opmærksomhed mod udvikling af metoder til forbedring af hybridiseringsme- DK 175944 B1 2 todens følsomhed til at detektere en specifik nucleinsyresekvens i en prøve og derved udvide dens anvendelse til diagnostiske formål.

En generel fremgangsmåde til forbedring af hybridiseringsmetodens følsom-5 hed har været at forhøje det signal, hybridiseringssonden frembringer. Der er for eksempel beskrevet metoder til fremstilling af nucleinsyreprober mærket til høj specifik aktivitet med radioaktive mærker, enten ved nick-translation (Rigby, et al., 1977, J. Mol. Biol. 113:237) eller ved SP6 transkription (Melton, et al., 1984, Nuc. Acids Res. 12:7035).

10

Schneider, et al., PCT patentansøgning WO 87/03622, beskriver anvendelsen af multipel signalfrembringende sekundære prober, der hver er i stand til at binde til en primær probe, som er hybridiseret til en DNA- eller RNA-sekvens, man er interesset i, som en måde til forstærkning af det af hybridi-15 seringshændelsen frembragte signal.

Chu et al., PCT patentansøgning WO 87/06270, beskriver anvendelsen af "replikativ RNA", alene eller sammen med et affinitetsmolekyle, som en nucleinsyre-hybridiseringsprobe, og anvendelsen af en RNA-afhængig RNA-20 polymerase til at replikere den bundne probe-RNA og derved forstærke det af dette frembragte signal.

Rodland, et al., US patentskrift nr. 4 647 529 beskriver anvendelsen af thio-nucleotider, som, når de inkorporeres i en hybridiseringssonde, forhøjer 25 mængden af bindingsomfanget mellem proben og den nucleinsyresekvens, der ønskes detekteret.

I modsætning til den store indsats, der er gjort for at forhøje følsomheden af probe-detektionsmetoder, er der viet relativt lidt forskning til metoder til ampli- 30 fikation af den nucleinsyresekvens, man ønsker at detektere, i en prøve, så- ! i DK 175944 B1 3 ledes at den dannes i tilstrækkelige mængder til at kunne detekteres ved gængse hybridiseringsmetoder.

Mullis, et al., US patentskrift nr. 4 683 195, beskriver en fremgangsmåde til 5 forstærkning af en specifik nucleinsyresekvens i en prøve ved anvendelse af i to oligonucleotid-primere og syntese af primer-forlængelsesprodukter (primer extension products). Når den ene primers forlængelsesprodukt hybridiseres til den anden primer, bliver det en skabelon til dannelse af den ønskede specifikke nucleinsyresekvens og vice versa, og denne fremgangsmåde genta-10 ges så ofte, det er nødvendigt, til dannelse af den ønskede mængde af den specifikke sekvens.

Mullis, et al. beskriver også anvendelsen af denne amplifikationsmetode til fremstilling af store mængder af en rekombinant nucleinsyre, idet er anven-15 des primere, hvortil er ligeret en ikke-komplementær sekvens. Mullis, et al. beskriver ligering af en nucleotidsekvens for en promotorsekvens, koblingssekvens eller kodningssekvens til én eller begge primere, hvorved den ikke-komplementære sekvens forstærkes sammen med nucleinsyresekvensen i prøven. På denne måde dannes en stor mængde af en rekombinant nuclein-20 syre bestående af en eksisterende nucleinsyresekvens fra prøven ligeret til en udvalgt exogen nucleinsyresekvens.

Essensen i fremgangsmåden beskrevet af Mullis, et al. er derfor amplifikatio-nen af en ønsket nucleinsyresekvens i form af komplementære primer-25 forlængelsesprodukter. Fordi hvert dannet primer-fortængelsespradukt tjener som skabelonen til syntese af endnu et primer-forlængelsesprodukt, skulle multiple gentagelser af primer-forlængelsesproceduren beskrevet af Mullis, et al. teoretisk resultere i akkumulationen af den ønskede sekvens i en eksponentiel rate i forhold til antallet af reaktionscykler. I modsætning dertil forven-30 tes biprodukter, dannet ved andre primer-hybridiseringer end de tilsigtede, ikke at være selvkatalytiske og skulle derfor akkumulere i en lineær rate.

— · - - _ DK 175944 B1 4

Specificiteten og nøjagtigheden af fremgangsmåden beskrevet af Mullis, et al. ses således at være nøje afhængig af den væsentligt forhøjede synteserate af den ønskede nucleinsyresekvens i forhold til biprodukternes. Imidlertid observeres det i praksis, at akkumulationen af biprodukter kan foregå med en 5 meget større hastighed end den af teoretiske beregninger forudsagte. For eksempel omtaler Mullis, et al. anvendelsen af deres fremgangsmåde til forstærkning af en del af det humane β-hæmoglobingen, som er til stede i en prøve indeholdende humant genomisk DNA, og finder, at på grund af ampli-fikation af andre sekvenser i genomet, svarer kun 1% af den resulterende 10 slutpopulation af forstærkede sekvenser til den ønskede sekvens.

I den udstrækning, at processen beskrevet af Mullis, et al. resulterer i amplifi-kation af andre nucleinsyresekvenser end den ønskede, foretager metoden prøvning af en større mængde af den ønskede nucleinsyresekvens, end der 15 faktisk er til stede i prøven, og frembringer falsk-positive resultater. Det tilsigtes derfor med opfindelsen, at angive en fremgangsmåde til specifikt og kvantitativt at amplificere en ønsket nucleinsyresekvens i en prøve, og derved forbedre detektionsfølsomheden for den ønskede sekvens, medens problemerne med falsk-positive og på anden måde upræcise resultater forbun-20 det med den eksisterende teknologi undgås.

Endvidere omfatter fremgangsmåden ifølge Mullis, et al. multiple primer-hybridiseringscykler og primer-forlængelsessyntesecykler, hvilket resulterer i byrdefuldt arbejde eller udgifter til automatisering. Automatisering af frem-25 gangsmåden ifølge Mullis, et al. nødvendiggør ikke blot brugen af specialiseret udstyr, men ogsåaf et specialiseret reagens, en varmestabil DNA-polyme-rase, og reaktionsbetingelser skræddersyet til hvert analyt testsystem, således at primer-hybridiserings- og primerforlængelsessyntesetrinene kan udføres kontinuerligt. Det tilsigtes således endvidere med opfindelsen at angive 30 en fremgangsmåde til detektion af en specifik nucleinsyresekvens i en prøve, hvilken fremgangsmåde er hurtig og enkel at udføre uden bekostelige reakti- DK 175944 B1 5 onstrin, der skal gentages, specialiseret udstyr og reagenser eller byrdefulde krav til ændring af reaktionsbetingelseme for hver forskellig prøve.

SAMMENFATNING AF OPFINDELSEN 5

Formålene med opfindelsen opnås ved en fremgangsmåde til fremstilling af en dobbeltstrenget nucleinsyre som inkluderer en promotor der er operabelt forbundet til en sekvens som skal detekteres, hvilken fremgangsmåde er· ejendommelig ved, 10 (a) at der tilvejebringes en oligonucleotid-promotor-primer, (b) at promotor-primeren bringes i kontakt med en nucleinsyre omfattende sekvensen der skal detekteres, under betingelser der tillader hybridise-ring af promotor-primeren til nucleinsyresekvensen der skal detekteres, 15 (c) at der syntetiseres et forlængelsesprodukt fra 3-enden af promotor- primeren, hvilket forlængelsesprodukt er komplementært til nucleinsyresekvensen der skal detekteres, (d) at produktet fra trin (c) bringes i kontakt med et middel der har 3-5’-exonucleaseaktivitet, og 20 (e) at der syntetiseres et forlængelsesprodukt fra 3-enden af sekvensen der skal detekteres, hvilket forlængelsesprodukt er komplementært til promotoren i promotor-primeren, hvorved promotor-primeren fra trin (a) er den eneste primer der anvendes.

25

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til detektion af en specifik nucleinsyre-sekvens i en prøve indeholdende nucleinsyre, hvilken fremgangsmåde indebærer syntese af en mangfoldighed af RNA-transcripter ud fra en dobbeltstrenget nucleinsyre fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, 30 hvorved hvert RNA-transcript omfatter en RNA-sekvens svarende til den specifikke nucleinsyresekvens der skal detekteres, og bestemmelse af tiiste- DK 175944 B1 6 deværelsen af nævnte RNA-sekvens. Fordelen opnået ved amplifikation i form af RNA-transcripter i stedet for DNA-primer-forlængelsesprodukter er, at syntesen af RNA-transcripter, i nærvær af et polymerisationsenzym og ribo-nucleosidtriphosphater, foregår kontinuerligt, og således kan danne ethvert 5 ønsket amplifikationsniveau af den nucleinsyresekvens, der ønskes detekte-ret, uden at skulle gennemgå gentagne cykler af krævende og, ifølge sagens natur, fejlbehæftede primer-hybridiseringsreaktioner.

KORT BESKRIVELSE AF TEGNINGEN

10

Fig. 1 viser hybridiseringen af en oligonucleotid-promotor-primer til en specifik sekvens, der ønskes detekteret, beliggende i en enkeltstrenget nucleinsyre, syntese af en dobbeltstrenget nucleinsyre, der omfatter den sekvens, der ønskes detekteret, og promotor-primerens promo-15 tor, samt syntese, under promotorens styring, af en mangfoldighed af RNA-transcripter ud fra den dobbeltstrengede nucleinsyre.

Fig. 2 viser en udførelsesform for opfindelsen, hvori en oligonucleotid-promotor-primer bruges sammen med en sekundær oligonucleotid-20 primer til dannelse af en dobbeltstrenget nucleinsyre indeholdende den sekvens, der ønskes detekteret, og promotor-primerens promotor. Promotor-primeren hybridiseres til den sekvens, der ønskes detekteret, inde i en enkeltstrenget nucleinsyre, og den sekundære primer hybridiseres til en sekvens inde i promotor-primer-25 forlængelsesproduktet, som er komplementært til den sekvens, der ønskes detekteret.

Fig. 3 viser en yderligere udførelsesform for opfindelsen, hvori en oligonucleotid-promotor-primer bruges sammen med en sekundær oligo-30 nucleotid-primer. I dette tilfælde hybridiseres sekundær oligonucleo- tid-primeren til den sekvens, der ønskes detekteret, inde i en enkelt- DK 175944 B1 7 strenget nucleinsyre, og oligonucleotid-promotor-primeren hybri-diseres til en sekvens inde i det sekundære primer-foriængelsesprodukt, som er komplementært til den sekvens, der ønskes detekteret.

5

DETAILBESKRIVELSE AF OPFINDELSEN

Udtrykket "promotor" henviser i nærværende beskrivelse med krav til en nucleinsyresekvens, hvortil et RNA-polymeraseenzym binder og initierer syn-10 tesen af RNA-transcripter. Promotoren er fortrinsvis en dedikeret promotor, og RNA-polymerasen er fortrinsvis en dedikeret RNA-polymerase. Udtrykket "dedikeret" henviser til promotorens evne til overvejende kun at blive genkendt af en anden RNA-polymerase end den, der typisk er til stede i den prøve, der skal prøves. På lignende måde vil den dedikerede RNA-polymerase 15 kun, eller fortrinsvis kun, binde til den dedikerede promotor, sammenlignet med andre promotorer tilstede i prøven, og syntetisere RNA-transcripter af enhver nucleinsyresekvens, der befinder sig nedstrøms for promotoren. Kombinationen af en dedikeret promotor og en dedikeret RNA-polymerase resulterer i en usædvanligt specifik promotor-RNA-polymerase-interaktion.

20

Typisk opnås den dedikerede promotor og dedikerede RNA-polymerase fra samme kilde, som for eksempel bakteriofag T7 eller bakteriofag SP6. I tilfældet af såvel T7 som SP6 intierer den fag-kodede RNA-polymerase på effektiv vis kun syntese af RNA-transcripter ved den beslægtede fag-promotor. RNA-25 transcripter resultererende fra initiering ved andre prokaryote eller eukaryote promotorer ses sjældent. Endvidere resulterer transcriptionsreakti-onsblandingen, der består af en simpel saltpuffer, dobbeltstrenget nucleinsy-reskabelon, ribonucleosidtriphosphater og fag-RNA-polymerase, i hurtig syntese af store mængder RNA. Det er ønskeligt, at promotoren er valgt, eller 30 dens nucleotidsekvens modificeret, ud fra den naturligt forekommende se- DK 175944 B1 8 kvens med henblik på at minimere enhver tilfældig hybridisering til nogen kendte sekvenser i prøve-DNAet.

Udtrykket "primer* henviser i nærværende beskrivelse med krav til en oligo-5 nucleotidsekvens, uanset om den forekommer naturligt eller er syntetisk fremstillet, som i alt væsentligt er komplementær til eller homolog med hele eller en del af en nucleinsyresekvens, der ønskes detekteret. Primeren skal være tilstrækkeligt lang til at hybridisere med en skabelon-nucleinsyre indeholdende den sekvens, der ønskes detekteret, eller dens komplement, og til 10 at initiere (prime) syntesen af et forlængelsesprodukt i nærvær af et polymerisationsmiddel. Primerens nøjagtige længde afhænger af mange faktorer, herunder hybridiseringsbetingelser og primer-forlængelses-syntesereaktions-betingelser, og sammensætningen af den specifikke nucleinsyresekvens, der ønskes detekteret. Typisk vil primeren indeholde 10-25 eller flere nucleotider, 15 skønt den kan indeholde færre nucleotider. Det er imidlertid ikke nødvendigt, at primeren afspejler den nøjagtige sekvens eller komplementet af den nucleinsyresekvens, der ønskes detekteret. For eksempel kan ikke-komplementære baser anbringes spredt i primeren, eller komplementære baser kan deleteres fra primeren, forudsat at primeren er i stand til at hybridi-20 sere specifikt med den nucleinsyresekvens, der ønskes detekteret, eller komplementet deraf under de valgte betingelser.

Udtrykket "promotor-primer" henviser i nærværende beskrivelse med krav til et oligonucleotid, uanset om det forekommer naturligt eller er syntetisk frem-25 stillet, som omfatter en promotor forbundet til 5'-enden af en primer. Under passende betingelser og i nærvær af et polymerisationsmiddel er promotor-primeren i stand til at fungere som et initieringspunkt i et promotor-primer-foriængelsesprodukt omfattende nucleinsyresekvensen, der ønskes detekteret, eller dens komplementære sekvens og promotor-primerens promotor.

30 Promotor-primeren er fortrinsvis enkeltstrenget med henblik på maksimal hybridiseringseffektivitet, men kan alternativt være dobbeltstrenget. Hvis DK 175944 B1 9 ! promotor-primeren er dobbeltstrenget, behandles den først med henblik på at adskille dens strenge, før den anvendes til fremstilling af forlængelsesprodukter.

5 Udtrykket "sekundær primer" henviser i nærværende beskrivelse med krav til et oligonucleotid, uanset om det forekommer naturligt eller er syntetisk fremstillet, som under passende betingelser og i nærvær af et polymerisationsmiddel er i stand til at fungere som et initieringspunkt for et se-kundær-primer-forlængelsesprodukt omfattende den nucleinsyresekvens, der 10 ønskes detekteret, eller dens komplement. Den sekundære primer er fortrinsvis enkeltstrenget for maksimal hybridiseringseffektivitet, men kan alternativt være dobbeltstrenget. Hvis den sekundære primer er dobbeltstrenget, behandles den først med henblik på at adskille dens strenge, før den anvendes til fremstilling af forlængelsesprodukter. Den sekundære primer kan be-15 stå af en hvilken som helst nucleotidsekvens, der i det væsentlige er komplementær til eller homolog med hele eller en del af en nucleinsyresekvens, der ønskes detekteret, men er fortrinsvis valgt således, at den ikke er komplementær til promotor-primeren.

20 Udtrykket "probe" henviser i nærværende beskrivelse med krav til et oligonucleotid, uanset om det forekommer naturligt eller er syntetisk fremstillet, der enten er homologt med eller komplementært til hele eller en del af en nucleinsyresekvens, der ønskes detekteret. Proben vælges fortrinsvis således, at den under passende forhold er i stand til at hybridisere specifikt til 25 RNA-transcriptater af den nucleinsyresekvens, der ønskes detekteret.

Udtrykket "oligonucleotid" defineres med reference til primere og prober i nærværende beskrivelse med krav som et nucleinsyremolekyle bestående af to eller flere deoxyribonucleotider eller ribonucleotider. Et ønsket oligonucleo-30 tid kan fremstilles ved enhver egnet metode, såsom oprensning fra en naturligt forekommende nucleinsyre eller de novo syntese. Der er i litteraturen be- 10 DK 175944 B1 skrevet adskillige metoder, for eksempel til syntese af oligonucleotider ud fra nucleosidderivater under anvendelse af forskellige teknikker fra den organiske kemi. Een type organisk syntese er phosphotriestermetoden, hvori phosphotriestemucleosider forbindes til dannelse af et oligonucleotid med en 5 ønsket sekvens (Narang, et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90). Andre organiske syntesemetoder, der er blevet beskrevet, omfatter brugen af phospho-diesternucleosider (Brown, et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:109) eller phosphoramidatnucleosider (Caruthers, et al., 1985, Meth. Enzymol.

154:287). Oligonucleotider syntetiseret ved enhver af disse metoder kan si- 10 den forbindes til dannelse af et enkelt oligonucleotid med enhver krævet længde og sekvens. Alternativt dannes oligonucleotider ved in vitro tran-scriptionel amplifikation ved kloning i værtsceller eller ved indvinding fra naturlige kilder ved brug af passende restriktionsenzymer.

15 Udtrykket "RNA-transcriptat" henviser i nærværende beskrivelse med krav til et ribonucleinsyremolekyle syntetiseret af et RNA-polymeraseenzym under styring af promotor-primerens promoter. RNA-transcriptatet af en specifik nucleinsyresekvens, som ønskes detekteret, er enten homologt med eller komplementært til denne sekvens, afhængig af promotor-primerens art.

20

Udtrykket "forlængelses-produkt" henviser i nærværende beskrivelse med krav til et nucleinsyremolekyle, hvis syntese initieres i 3'-terminus af en primer under anvendelse af det nucleinsyremolekyle, hvortil primeren er hybri-diseret, som skabelon for syntese.

25

Udtrykket "polymerisationsmidder skal i nærværende beskrivelse med krav almindeligvis opfattes som henvisende til ethvert enzym, der katalyserer syntesen af et nucleinsyremolekyle ud fra deoxyribonucleotider eller ribonucleo-tider under anvendelse af en eksisterende nucleinsyre som skabelon.

30 11 DK 175944 B1

Enhver nucleinsyrekilde, i oprenset eller ikke-oprenset form, kan anvendes som prøve. Prøven kan for eksempel være et mad- eller landbrugsprodukt eller en human eller veterinær klinisk prøve. Typisk er prøven en biologisk væske, såsom urin, blod, plasma, serum, spyt eller lignende. Nucleinsyren, 5 der ønskes detekteret i prøven, er DNA eller RNA, herunder messenger-RNA, fra enhver kilde, inklusive bakterier, gær, vira og celler eller væv fra højere organismer, såsom planter eller dyr. Metoder til ekstraktion og/eller oprensning af sådanne nucleinsyrer er blevet beskrevet af for eksempel Ma-niatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York, Cold Spring 10 Harbor Laboratory, 1982).

Nucleinsyresekvensen, der ønskes detekteret i prøven, kan fra starten være til stede som et selvstændigt molekyle, således at sekvensen, der ønskes detekteret, udgør hele nucleinsyren, eller kan blot være en del af et større 15 molekyle. Det er ikke nødvendigt, at nucleinsyresekvensen, der ønskes detekteret, fra starten er til stede på ren form. Prøven kan indeholde en kompleks blanding af nucleinsyrer, hvoraf den nucleinsyresekvens, der ønskes detekteret, omfatter en lille del. Den nucleinsyresekvens, der ønskes detekteret, kan for eksempel svare til et oncogen indeholdt i totalt humant genomisk 20 DNA eller en del af nucleinsyresekvensen i en patogen organisme, hvilken organisme er en mindre del af en klinisk prøve.

Enhver nucleinsyresekvens kan detekteres ved den foreliggende opfindelse.

Det er kun nødvendigt, at der kendes et tilstrækkeligt antal nucleotider af se-25 kvensen til, at der kan fremstilles mindst én og fortrinsvis to primere, som er i stand til at hybridisere med den nucleinsyresekvens, der ønskes detekteret, eller med dens komplement. Den nucleinsyresekvens, der ønskes detekteret, kan for eksempel fastlægges ved enhver af de kendte metoder til nucleinsy-resekvensbestemmelse, eller kan forudsiges på basis af en bestemt protein-30 sekvens. Jo større kendskabet er til den nucleinsyresekvens, der ønskes de- i DK 175944 B1 12 tekteret, jo større kan specificiteten af de valgte primere blive, og dermed fås større nøjagtighed af opfindelsen.

Der bør for eksempel være tilstrækkelig sekvensinformation tilgængelig til at 5 tillade udvælgelsen af en promotor-primer, der vil hybridisere specifikt med den nucleinsyresekvens, der ønskes detekteret, eller med dens komplement, men ikke med nogen anden sekvens i prøven under de valgte hybridise-ringsbetingelser. Dersom såvel en promotor-primer og en sekundær primer anvendes, er det ønskeligt, at nucleinsyresekvensen, der ønskes detekteret, 10 er kendt i et sådant omfang, at primerne kan vælges, så de ikke er komplementære til hinanden.

Idet der henvises til metoderne afbildet i fig. 1-3, har hver metode som sit centale første trin fremstillingen af en dobbelsstrenget nucleinsyre indehol-15 dende den sekvens, der ønskes detekteret, og en promotor. Generelt indebærer fremstillingen af denne dobbeltstrengede nucleinsyre syntese af et promotor-primer-forlængelsesprodukt og eventuelt et sekundær-primer-forlængelsesprodukt under anvendelse af en enkeltstrenget nucleinsyre, hvortil primeren er hybridiseret, som skabelon. I afhængighed af, om en pro-20 motor-primer bruges alene eller i kombination med en sekundær primer, vil skabelonen derfor omfatte en nucleinsyre fra prøven indeholdende den sekvens, der ønskes detekteret, eller et tidligere syntetiseret primerforlængelsesprodukt, som indeholder komplementet til den nucleinsyresekvens, der ønskes detekteret.

25

Dersom skabelonen oprindelig er indeholdt i en dobbeltstrenget nucleinsyre, er det nødvendigt at adskille nucleinsyrestrengene før eller samtidig med syntesen af et primer-forlængelsesprodukt. Det er ønskeligt at udføre adskillelse af strengene ved varmedenaturering, hvor prøven opvarmes til ca. 90-30 100 °C i tidsrum på fra ca. 1-10 minutter, skønt andre fysiske, kemiske eller enzymatiske denatureringsprocedurer kan anvendes.

DK 175944 B1 13

Primerhybridisering udføres typisk i en pufret vandig opløsning, for hvilken i temperaturforhold, koncentration af salte og pH er valgt til opnåelse af tilstrækkelig stringens, således at primeren vil hybridisere specifikt til den nucleinsyresekvens, der ønskes detekteret, eller til dens komplement, men 5 ikke til nogen anden sekvens. Hybridiseringseffektiviteten mellem primeren og skabelonen vil almindeligvis forbedres under betingelser, hvor mængden af tilsat primer er i molært overskud i forhold til skabelonen, fortrinsvis i et molært overskud på fra 103 til 106. Det vil imidlertid forstås, at mængden af skabelon i prøven måske ikke er kendt, således at mængden af primer i for-10 hold til skabelon ikke kan bestemmes med sikkerhed.

I fig. 1A-G er afbildet én udførelsesform for opfindelsen, hvori en promotor-primer anvendes til at fremstille en dobbeltstrenget nucleinsyre indeholdende den sekvens, der ønskes detekteret, samt en promotor.

15 I fig. 1A er promotor-primerens c d primer c vist, via ikke-covalent baseparring e af komplementære nucleotidsekvenser, at hybridisere med den nucleinsyre b, som ønskes detekteret, og som er en del af en nucleinsyre a. Promotor-primerens promotor d, der fortrinsvis vælges således, at den ikke 20 er komplementær til nogen kendt nucleinsyresekvens i prøven, forbliver uhybridiseret.

Den efterfølgende tilsætning af en polynucleotid-polymerase f, i nærvær af nucleosidtriphosphater, resulterer (fig. 1B-C) i syntese af et promotor-primer-25 forlængelsesprodukt g, der initieres ved primerens 3-ende og fortsætter i 5'-retningen langs den enkeltstrengede skabelon, som består af prøvens nucleinsyresekvens a, der flankerer 5'-siden af sekvensen b, inden for hvilken primeren oprindeligt er hybridiseret. Primer-forlængelsesproduktet er således komplementært til den nucleinsyresekvens, der ønskes detekteret, ! 30 og til den eventuelt i prøven indeholdte i 5'-retning flankerende nucleinsyresekvens, hvorved dannes et dobbeltstrenget molekyle.

DK 175944 B1 14 I nærvær af et middel h, der har 3-5' exonucleaseaktivitet, udskæres den enkeltstrengede sekvens i 3'-enden af den eventuelt i prøven indeholdte nucleinsyre som vist i fig 1D, og udskiftes med ny nucleinsyre (fig. 1E-G), hvis syntese initieres af en polynucleotid-polymerase f i 3’-enden af den i 5 prøven indeholdte nucleinsyre under anvendelse af promotor-primerens promotor som skabelon.

Metoden afbildet i fig. 1A-G til dannelse af et dobbeltstrenget molekyle indeholdende den sekvens, der ønskes detekteret, samt en promotor er afhængig 10 af hybridisering af en promotor-primer til den nucleinsyresekvens, der ønskes detekteret, samt efterfølgende trin til syntese af promotor-primer-forlængelse, nucleinsyreudskæring samt udskiftningssyntese. Skønt udskæringsreaktionen kan udføres ved hjælp af et middel h, der er forskelligt fra det f anvendt ved promotor-primer-forlængelsessyntese og udskiftningssyntese, er det øn-15 skeligt at anvende ét enkelt middel, således at syntesen af det dobbeltstren- j gede produkt kan udføres på kontinuerlig vis efter hybridiseringen af promotor-primer. Som en følge heraf er polynucleotid-polymerasen fortrinsvis en polymerase, der har både 5-3' polymeraseaktivitet og 3'-5’ exonucleaseaktivitet, såsom for eksempel E. coli DNA-polymerase I, E. coli Klenow-20 fragmentet af DNA-polymerase I og T4 DNA-polymerase. Da hvert af disse enzymer kræver en DNA-skabelon til primer-forlængelsessyntese, vil det forstås, at ifølge metoden afbildet i fig. 1B og 1F vil deres anvendelse være passende i tilfælde, hvor nucleinsyresekvensen, der ønskes detekteret, er DNA.

25

Den dobbeltstrengede nucleinsyre indeholdende den sekvens, der ønskes detekteret, samt en promotor, tjener som kilde til en mangfoldighed af RNA-transcriptater af den sekvens, der ønskes detekteret. Som afbildet i fig 1 H-l fører tilsætning til prøven af en passende RNA-polymerase aa til bindingen af 30 RNA-polymerasen til det dobbeltstrengede produkts promotor og, i nærvær af ribonucleosidtriphosphater, til efterfølgende syntese af RNA-transcripter bb DK 175944 B1 15 af nucleinsyresekvensen beliggende nedstrøms for promotoren, herunder af den nucleinsyresekvens, der ønskes detekteret.

Under passende reaktionsbetingelser, herunder tilstedeværelsen af de nød-5 vendige reagenser, vil syntesen af RNA-transcripter foregå kontinuerligt og i forhold til den mængde af nucleinsyresekvensen, der ønskes detekteret, som oprindelig var tilstede i prøven. Der kan som nødvendigt tilsættes yderligere reagenser til dannelse af den ønskede mængde RNA-transcripter. Syntesen af RNA-transcripter udføres fortrinsvis i nærvær af en ribonucleaseinhibitor, 10 såsom for eksempel vanadyl-ribonucleosid-komplekser eller human placental ribonucleaseinhibitor, for at undgå en mulig nedbrydning af transcripteme af en tilfældigt tilstedeværende ribonucleasekontaminant. Berger, 1987, Meth.

Enzymol. 152:227, de Martynoff, et al., 1980, Biochem, Biophys. Res. Com-mun. 93:645, Sheel, et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. 76:4898. Efter, at en 15 passende tid er hengået til dannelse af den ønskede mængde RNA-transcripter, kan reaktionen standses ved inaktivering af RNA-polymerasen på enhver kendt måde eller ved adskillelse af reaktionskomponenterne.

Bestemmelse af de dannede specifikke RNA-transcripter udføres ved enhver 20 egnet metode, såsom for eksempel ved mærkning af RNA-transcripteme med en detekterbar del under eller efter deres syntese, eller ved brug af en mærket probe, der er i stand til at hybridisere specifikt med RNA-transcripteme af den nucleinsyresekvens, der skal detekteres.

25 RNA-transcripter kan for eksempel mærkes ved at tilvejebringe ribonucleo-sidtriphosphater, der selv er mærket med en detekterbar del, og som bruges som substrat af RNA-polymerase og derved indbygges i RNA-transcripter.

Den detekterbare del kan være en hvilken som helst del, der er i stand til enten direkte eller indirekte at danne et detekterbart signal. I én udførelsesform 30 kan den detekterbare del for eksempel være en radioisotop, såsom 32P, 3H 14C, 125l eller 35S. Ved en anden udførelsesform kan den detekterbare del 16 DK 175944 B1 være en ikke-radioaktiv kemisk modifikation, der er i stand til at producere et detekterbart signal ved samvirke med ét eller flere passende midler. Således kan, for eksempel, den detekterbare del være biotin og det detekterbare signal frembringes ved dannelse af et kompleks mellem biotindelen og et prote-5 in, der er i stand til at binde specifikt til biotin, som for eksempel avidin, strep-tavidin eller anti-biotin antistof, hvilket bindende protein er konjugeret med et detekterbart molekyle, såsom fluorescein, eller med et enzym, der reagerer med et passende substrat til dannelse af et fluorescerende, luminescerende eller farvet produkt. Langer, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. 78:6633, Bay-10 er og Wilchek, 1980, Meth. Biochem. Anal. 16:1.

I en yderligere udførelsesform kan det dannede specifikke RNA-transcript bestemmes ved brug af en nucleinsyrehybridiseringsprobe. Falkow, et al., US. patentskrift nr. 4 358 535, Goodson, et al., EP patentansøgning nr. 0 238 15 332. Proben vælges fortrinsvis således, at den hybridiserer inden for den del af RNA-transcriptets sekvens, der enten er komplementær til eller homolog med den nucleinsyresekvens, der ønskes detekteret. Hybridiseringsmetoden kan være enhver egnet metode, herunder de flydende hybridiseringsmetoder beskrevet i EP patentskrifter nr. 70 685 og 70 687, samt de flydende-faste 20 hybridiseringsmetoder beskrevet i US patentskrifter nr. 4 358 535 (Falkow) og 4 647 529 (Rodland), EP patentansøgning nr. 0 238 332 (Goodson) og Ranki, et al., 1983, Gene 21:77. I tilfælde af flydende-fast-hybridisering, kan enten probemolekyleme eller RNA-transcripteme være immobiliserede på det faste underlag.

25

Til korrelering af mængden af RNA-transcripter med mængden af nucleinsyresekvens, der skal detekteres i prøven, kan bruges enhver egnet metode, herunder for eksempel bestemmelse af en fastsat mængde af en standard nucleinsyre, som indeholder den sekvens, der ønskes detekteret, eller en 30 anden kendt sekvens, samtidigt med eller parallelt med bestemmelse af se- DK 175944 B1 17 kvensen, der ønskes detekteret i prøven. Ranki, et al., UK patentansøgning nr. 2 187 283 A.

Ved yderligere udførelsesformer for opfindelsen udføres syntesen af en dob-5 beltstrenget nucleinsyre indeholdende den sekvens, der ønskes detekteret, samt en promotor ved at bruge en promotor-primer sammen med en sekundær primer for at initiere syntese af to forskellige primer-forlængelsesprodukter, som er i stand til at hybridisere til hinanden.

10 Fig. 2A-F viser metoden, hvor syntesen af promotor-primer- forlængelsesproduktet udføres først og efterfølges af syntesen af sekundær-primer-forlængelsesproduktet. I fig. 2A vises hybridisering af promotor-primerens c d primer c til 3-enden af den nucleotidsekvens b, der skal detek-teres, via ikke-covalent baseparring e af komplementære nucleotidsekven-15 ser. Efter tilsætning af et polymerisationsmiddel f, og i nærvær af nucleo-sidtriphosphater, syntetiseres et forlængelsesprodukt g, der initieres ved promotor-primerens 3-ende og fortsætter i 5'-retningen langs den enkeltstrengede skabelon. Det herved fremkomne produkt er således en dobbeltstrenget nucleinsyre, hvoraf én streng er den i prøven indeholdte nucleinsyre, 20 og den anden er promotor-primer-forlængelsesproduktet g.

I det næste trin (fig. 2D) adskilles de to strenge under anvendelse af enhver af de ovenfor beskrevne procedurer til opnåelse af enkeltstrengede molekyler. Efter dette trin til adskillelse af strengene bringes prøven i kontakt med 25 den sekundære primer h under betingelser, der er egnede til hybridisering af den sekundære primer til den sekvens indeholdt i promotor-primer-forlængelsesproduktet, som er komplementær til den sekvens, der ønskes detekteret. Da det imidlertid, med henblik på at forbedre prøvningsmetodens nøjagtighed, er ønskeligt, at den sekundære primer ikke er komplementær til 30 promotor-primeren, vælges den sekundære primer fortrinsvis således, at den hybridiserer ved 3-enden af den komplementære sekvens (fig. 2E).

DK 175944 B1 18

Ved den fortsatte tilstedeværelse af polymerisationsmidlet f anvendt til syntese af promotor-primer-forlængelsesproduktet eller ved tilsætning af et polymerisationsmiddel i syntetiseres et sekundær-primer-forlængelsesprodukt, der initieres ved 3’-enden af den sekundære primer og fortsætter i 5'-5 retningen langs promotor-primer-forlængelsesproduktets skabelon (fig 2F). Sekundær-primer-forlængelsesproduktet bliver således komplementært til promotor-primer-forlængelsesproduktet og hybridiserer med det til dannelse af en dobbeltstrenget nucleinsyre, der indeholder den sekvens, der ønskes detekteret, samt promotor-primérens promotor.

10

Polymerisationsmidlet anvendt til syntetisering af promotor-primer-forlængelsesproduktet er fortrinsvis T7 DNA-polymerase med ringe indhold af exonuclease (Tabor og Richardson, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:4767), skønt der kan anvendes andre midler, herunder revers transcriptase og an-15 dre polynucleotid-polymeraser med ringe 3-5' exonuclease-aktivitet. I den i udstrækning kommercielt tilgængelig T7 DNA-polymerase med ringe indhold af exonuclease (Sequenase ™, United States Biochemical Corp., Cleveland,

Ohio) har residual 3’-5’ exonucleaseaktivitet, kan dens anvendelse i visse tilfælde være uønsket, som for eksempel hvor den uhybridiserede 3'-ende af 20 den i prøven indeholdte deoxyribonucleinsyre, hvortil en promotor-primer er bundet, kan være udskåret før trinet til adskillelse af strengene vist i fig. 2D.

Dette kan forventes at finde sted under forhold, hvor den i prøven indeholdte nucleinsyre er skåret over på mekanisk vis eller nedbrudt med et restriktionsenzym, hvorved længden af den i prøven indeholdte nucleinsyre på 3-siden 25 af sekvensen, hvortil promotor-primeren er bundet, reduceres.

Syntese af sekundær-primer-foriængelsesproduktet udføres under anvendelse af ethvert polymerisationsmiddel, der er i "stand til at initiere syntese i 3’-enden af den sekundære primer og fortsætte i 5’-retningen langs promotor-30 primer-forlængelsesproduktets skabelon. Egnede enzymer til dette formål omfatter for eksempel E. coli DNA-polymerase I, E. coli Klenow-fragmentet af 19 • i DK 175944 B1 | i ! DNA-polymerase I, T4 DNA-polymerase, T7 DNA-polymerase med ringe indhold af exonuclease og revers transcriptase.

Fig. 3A-I viser metoden, hvor syntesen af et sekundær-primer-5 forlængelsesprodukt udføres først og efterfølges af syntesen af et promotor-primer-forlængelsesprodukt. I fig. 3A vises hybridisering af den sekundære primer ctil 3-enden af den nucleotidsekvens b, der skal påvises, via ikke-covalent baseparring d af komplementære nucleotidsekvenser. Efter tilsætning af et polymerisationsmiddel e, og i nærvær af nucleosidtriphosphater, 10 syntetiseres et forlængelsesprodukt f, der initieres ved den sekundære primers 3’-ende og fortsætter i 5’-retningen langs den enkeltstrengede skabelon. Det herved fremkomne produkt (fig 3c) er således en dobbeltstrenget nucleinsyre, hvoraf én streng er den i prøven indeholdte nucleinsyre, og den anden er sekundær-primer-forlængelsesproduktet.

15 I det næste trin (fig. 3D) adskilles de to strenge under anvendelse af enhver af de oven for beskrevne procedurer til opnåelse af enkeltstrengede molekyler. Efter dette trin til adskillelse af strengene bringes prøven i kontakt med promotor-primeren g h under betingelser, der er egnede til hybridisering af 20 promotor-primeren til den sekvens indeholdt i sekundær-primer-forlængelsesproduktet, som er komplementær til nucleinsyresekvensen, der ønskes detekteret. Da det med henblik på at forbedre prøvningsmetodens nøjagtighed er ønskeligt, at promotor-primeren ikke er komplementær til den sekundære primer, vælges promotor-primerens primer fortrinsvis således, at 25 den hybridiserer ved 3-enden af den komplementære sekvens.

Ved den fortsatte tilstedeværelse af polymerisationsmidlet e, anvendt til syntese af sekundær-primer-forlængelsesproduktet, eller ved tilsætning af et polymerisationsmiddel [ syntetiseres et promotor-primer-forlængelsesprodukt 30 j, der initieres ved 3'-enden af promotor-primeren og fortsætter i 5'-retningen langs sekundær-primer-forlængelsesproduktets skabelon. Promotor-primer- DK 175944 B1 20 forlængelsesproduktet indeholder den nucleinsyresekvens, der ønskes de-tekteret, hvilken sekvens er hybridiseret til sit komplement indeholdt i sekun-dær-primer-forlængelsesproduktet, samt promotoren. Det herved fremkomne produkt er således en dobbeltstrenget nucleinsyre indeholdende den se-5 kvens, der ønskes detekteret, samt promotor-primerens promotor.

I nærvær af et middel k, der har 3'-5' exonucleaseaktivitet, udskæres den eventuelt tilstedeværende enkeltstrengede sekvens i 3'-enden af promotor-primer-forlængelsesproduktet og udskiftes med en til promotoren komple-10 mentær sekvens (fig. 3G-I), hvis syntese initieres af et polymerisationsmiddel ] i 3'-enden af promotor-primer-forlængelsesproduktet, under anvendelse af promotor-primerens promotor som skabelon.

Syntese af sekundær-primer-forlængelsesproduktet udføres under anvendel-15 se af ethvert polymerisationsmiddel, der er i stand til at initiere syntese i 3'-enden af den sekundære primer og fortsætte i 5'-retningen langs nuclein-syreskabelonen indeholdt i prøven. Egnede enzymer til dette formål omfatter for eksempel E. coli DNA-polymerase I, E. coli Klenow-fragmentet af DNA-polymerase I, T4 DNA-polymerase, T7 DNA-polymerase med ringe indhold 20 af exonuclease og revers transcriptase. Syntese af promotor-primer-forlængelsesproduktet og syntese af promotorens komplementære sekvens kan udføres under anvendelse af det samme middel eller forskellige midler, herunder polymerisationsmidlet anvendt ved sekundær-primer-forlængelsessyntese. Til forbedring af effektiviteten af den i fig. 3 afbildede 25 fremgangsmåde er det imidlertid ønskeligt, at midlet anvendt til syntese af promotor-primer-forlængelsesproduktet også er i stand til at udføre udskæringsreaktionen vist i fig. 3G, hvorved enhver uhybridiseret sekvens i 3'-enden af sekundær-primer-forlængelsesproduktet fjernes. Enzymer egnede til udførelse af både syntese- og udskæringsreaktioner omfatter de poly-30 nucleotidpolymeraser, der har 3-5' exonucleaseaktivitet, såsom E. coli DNA- DK 175944 B1 21 polymerase I, E. coli Klenow-fragmentet af DNA-polymerase I og T4 DNA-polymerase.

Efter det er dannet, tjener det dobbeltstrengede nucleinsyreprodukt fremstillet 5 ved denne eller den foregående fremgangsmåde som en kilde til en mangfoldighed af RNA-transcripter af den sekvens, der ønskes detekteret, hvis syntese og bestemmelse kan udføres under anvendelse af enhver af procedurerne beskrevet ovenfor.

10 Een fordel, der opnås ved at bruge kombinationen af en promotor-primer og en sekundær primer til dannelse af en dobbeltstrenget nucleinsyre indeholdende den sekvens, der ønskes detekteret, samt en promotor, er større nøjagtighed af prøvningsmetoden. I tilfælde af, at enten promotor-primeren eller den sekundære primer ved en fejl hybridiserer til en anden sekvens end den, 15 der ønskes detekteret, eller dens komplement, forventes den ikke, hverken ved hybridisering til prøvens nucleinsyre eller til et andet primerforlængelsesprodukt, at danne et dobbeltstrenget produkt, hvorfra der vil blive syntetiseret RNA-transcripter.

20 En anden fordel ved at bruge kombinationen af de to primere er, at RNA-transcripteme af den sekvens, der ønskes detekteret, vil være af en afgrænset størrelse. Ved at vælge promotor-primeren og den sekundære primer således, at den ene primer hybridiserer til 3-enden af den sekvens, der ønskes detekteret, og den anden primer hybridiserer til 3’-enden af den kom-25 plementære sekvens, kan, som det er vist i fig. 2 og 3, det dobbeltstrengede område af nucleinsyreproduktet, hvorfra RNA-transcripter syntetiseres, begrænses til den sekvens, der ønskes detekteret, samt promotor-primerens promotor. Den afgrænsede størrelse af de herved opnåede RNA-transcripter kan være fordelagtig ved den efterfølgende detektion eller isolering af 30 transcripteme, som for eksempel ved adskillelse af de ønskede RNA-transcripter fra prøven ved gelfiltreringschromatografi. Endvidere vil, i den DK 175944 B1 22 udstrækning de dannede transcripter er kortere end de dannet ifølge fremgangsmåden vist i fig. 1, deres syntese foregå hurtigere og kræve mindre reagensmængder.

5 De følgende eksempler er illustrative og skal ikke pånogen måde opfattes som begrænsende. Alle referencer betragtes som inkorporeret i nærværende beskrivelse med krav.

EKSEMPEL 1 10

Dette eksempel belyser brugen af en deoxyribonucleotid promotor-primer med sekvensen 5’ AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATGTACCTCTGTATCATATGC 3' 15 til detektion af env genet i HIV (human immundefekt virus, før kaldt HTLV-lll/LAV). Denne promotor-primers sekvens er valgt således, at 5-enden af promotor-primeren svarer til sekvensen i det funktionelle domæne af en bak-teriofag T7 klasse III promotor (Dunn og Studier, 1983, J. Mol. Biol. 166:477), 20 og 3-enden er komplementær til en del af HIV env genets kodningssekvens, beliggende mellem nucleotideme 5981-6000 i HIV genomsekvensen (Mue-sing et al., 1985, Nature 313:450).

Fra prøver bestående af citratbehandlet humant blod eller virusinficerede H9-25 celler (Popovic, et al., 1984, Science 224:497) ekstraheres nucleinsyre til analyse under anvendelse af teknikkerne beskrevet af Hermann og Fischauf, 1987, Meth. Enzymol. 152:180.

En total mængde på 10 pg nucleinsyre fra prøven sættes til 100 pmol promo-30 tor-primer i 100 μ! reaktionspuffer indeholdende 40 mM Tris HCI (pH 8,0), 20 mM MgCfe, 1 mM dithiothreitol, 5 mg/ml gelatine, 10 mM vanadyl-ribo- DK 175944 B1 23 nucleosid-komplekser og 10 mM af hver af de fire deoxy-ribonucleosidtriphosphater (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) og de fire ribo-nucleosidtriphosphater (ATP, UTP, GTP, CTP). Blandingen opvarmes til 100 °C i et minut og får lov at afkøle til 37 °C. 5 enheder Klenow-fragment fra E.

5 coli DNA-polymerase I og 5 enheder T7 RNA-polymerase sættes derpå til blandingen, og reaktionerne får lov at fortsætte i en time ved 37 °C.

De dannede RNA-transcripter detekteres ved dot-blot-hybridisering under anvendelse af et “P endemærket deoxyoligonucleotid med sekvensen 10 5’ TTGATGATCTGTAGTGCTAC 3’ som hybridiseringsprobe.

15 Denne probes sekvens blev valgt til at være homolog med en del af kodningssekvensen for HIV env genet, der findes mellem nucleotideme 5875 og 5895 i HIV genomsekvensen.

Portioner fra RNA-syntesereaktionen sættes til 100 μΙ 15X SSC puffer (1X 20 SSC = 0,15 M natriumchlorid, 0,015 M natriumcitrat, pH 7,0) og filtreres gennem nitrocellulosefiltre vædet med 6X SSC. Filtrene bages derpå i en time ved 80 °C i en vakuumovn.

Efter bagning bringes hvert filter i kontakt med hybridiseringsopløsning be-25 stående af 6X SSC, 50 mM natriumphosphat (pH 6,5), 5X Denhardts opløsning (1X = 0,02% polyvinylpyrrolidon, 0,02% Ficoll, 0,02% bovint serum-albumin, 0,2 mM Tris HCI, 0,2 mM EDTA, pH 8,0), 0,1% natriumdodecylsulfat og 0,2% denatureret laksesperm-DNA i en time ved 42 °C. Den mærkede probe sættes derpå til hybridiseringsopløsningen til en slutkoncentration 30 på107 cpm/ml, og inkubering af filtrene fortsættes i to timer ved 42 °C.

DK 175944 B1 24

Til slut vaskes filtrene i 6X SSC i en time ved 37 °C i to hold puffer. Efter tørring bliver filtrene autoradiograferet eller talt for Cerenkov radioaktivitet.

EKSEMPEL 2 5 .

Dette og det følgende eksempel belyser anvendelsen af en promotor-primer i kombination med en sekundær primer til detektion af HIV env genet.

10 pg prøve-nucleinsyre fremstillet ud fra humant blod eller virus-inficerede 10 H9-celler som beskrevet i eksempel 1 blandes med 100 pmol promotorprimer og 100 pmol sekundær primer (5' ATGAGAGTGAAGGAGAAATA 3') i 100 pi reaktionspuffer. Denne sekundære primer er homolog med HIV env genets aminoterminale kodningssekvens (nucleotideme 5803-5822). Denne specifikke kombination af promotor-primer og sekundær primer blev valgt 15 således, at der vil dannes en dobbeltstrenget nucleinsyre på 225 basepar ' indeholdende 198 basepar af den sekvens af HIV env genet, hvorfra et RNA-transcript på 206 nucleotider vil blive syntetiseret under transcriptionel styring af en flankerende T7-promotor.

20 Blandingen af de to primere og prøvens nucleinsyre opvarmes til 100 °C i et minut og får lov at afkøle til 37 °C, hvorpå der tilsættes 5 enheder T7 DNA-polymerase med lavt indhold af exonuclease (Sequenase ™, United States Biochemical Corp.). Efter inkubering ved 37 °C i 5 minutter opvarmes reaktionsblandingen igen til 100 °C i et minut og får lov at afkøle til 37 °C. 5 enhe-25 der Sequenase ™ og 5 enheder T7 RNA-polymerase sættes til blandingen, og reaktionen får lov at fortsætte ved 37 °C i fra 30 minutter til en time. Til slut opvarmes reaktionsblandingen til 100 °C i 5 minutter og får lov at afkøle til 42 °C.

30 De herved fremkomne RNA-transcripter bestemmes ved revers transcription, j t som er specifikt primet ved hybridisering af den sekundære primer med de DK 175944 B1 25 tilblivende RNA-transcripter. a-32P-dTTP (specifik aktivitet ca. 3000 Ci/mmol) sættes til prøve-reaktionsblandingen til en slutkoncentration på 1 pM sammen med 5 enheder revers transcriptase, og blandingen inkuberes derpå i 15 minutter ved 42 °C.

5 “P-mærkede revers transcriptionsprodukter kvantificeres ved bestemmelse af den totale syreuopløselige radioaktivitet i reaktionsblandingen. Portioner af reaktionsblandingen sættes til 500 pi 10% trichloreddikesyre (TCA) indeholdt i polystyrenrør og inkuberes på is i 10 minutter. Hvert nars indhold filtreres 10 derpå gennem et Whatman glasfiberfilter med sug, og filteret vaskes med iskold TCA. Efter tørring tælles filtrene for Cerenkov radioaktivitet.

EKSEMPEL 3 j ! 15 Nucleinsyre isoleret fra humant blod eller HIV-inficerede H9-celler forskydes mekanisk ved ultralydsbehandling til dannelse af fragmenter med en gennemsnitlig længde på 500 nucleotider. 10 pg mekanisk forskudt nucleinsyre fra prøven blandes derpå med 100 pmol promotor-primer og 100 pmol sekundær primer i 100 pi buffer indeholdende 40 mM Tris HCI (pH 8,0), 20 mM 20 MgCh, 1 mM dithiothreitol, 5 mg/ml gelatine, 10 mM vanadyl-ribonucleosid-komplekser, 10 mM hver af de fire deoxyribonucleosidtriphosphater (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), 500 pM ATP, 500 pM UTP, 500 pM GTP, 500 pM CTP og 1 pM a-”P-UTP (specifik aktivitet ca. 3000 Ci/mmol). Blandingen opvarmes til 100 °C i et minut og får lov at afkøle til 28 °C, hvorpå der tilsættes 5 25 enheder revers transcriptase. Efter inkubering ved 28 °C i 15 minutter gen- opvarmes reaktionsblandingen til 100 °C i et minut og får lov at afkøle til 28 °C. Der tilsættes derpå 5 enheder revers transcriptase og 5 enheder T7 DNA-polymerase, og reaktionerne får lov at fortsætte i en time ved 28 °C.

30 ^-mærkede transcriptater kvantificeres ved bestemmelse af den totale syreuopløselige radioaktivitet i reaktionsblandingen som beskrevet ovenfor. De DK 175944 B1 26 206 nucleotidmærkede RNA-transcriptater kan også bestemmes ved autoradiografi af urinstof-polyacrylamidgeler, hvorpåportioner af RNA-syntesereaktionsblandingen køres parallelt med forskellige mængder af radiomærkede standard-RNAer. Kvantificering af de 206 nucleotidtranscriptater 5 af env gensekvensen udføres derpå ved densitometrisk analyse af det fremkaldte autoradiogram.

10

Claims (11)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en dobbeltstrenget nucleinsyre som inkluderer en promotor der er operabelt forbundet til en sekvens som skal detekteres, kendetegnet ved, 5 (a) at der tilvejebringes en oligonucleotid-promotor-primer, (b) at promotor-primeren bringes i kontakt med en nucleinsyre omfattende sekvensen der skal detekteres, under betingelser der tillader hybridi-sering af promotor-primeren til nucleinsyresekvensen der skal detekteres, 10 (c) at der syntetiseres et forlængelsesprodukt fra 3-enden af promotor- primeren, hvilket forlængelsesprodukt er komplementært til nucleinsyresekvensen der skal detekteres, (d) at produktet fra trin (c) bringes i kontakt med et middel der har 3'-5'-exonucleaseaktivitet, og 15 (e) at der syntetiseres et forlængelsesprodukt fra 3'-enden af sekvensen der skal detekteres, hvilket forlængelsesprodukt er komplementært til promotoren i promotor-primeren, hvorved promotor-primeren fra trin (a) er den eneste primer der anvendes.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den inklude- 20 rer nedbrydning af nucleinsyren omfattende sekvensen der skal detekteres, . med et restriktionsenzym.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at syntesen af forlængelsesprodukteme i trin (c) og (e) udføres under anvendelse af et enzym valgt blandt E. coli DNA-polymerase I, Klenow-fragmentet af E. 25 coli DNA-polymerase I og T4 DNA-polymerase. DK 175944 B1 28

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at midlet i trin (d) er et enzym valgt blandt E. coli DNA-polymerase I, Klenow-fragmentet af E. coli DNA-polymerase I og T4 DNA-polymerase.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at syn-5 tesen af forlængelsesprodukteme i trin (c) og (e) gennemføres ved brug af det sammme middel som anvendt i trin (d).

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de forudgående krav, kendetegnet ved, at trinene (c), (d) og (e) udføres samtidigt i den samme reaktionsbeholder.

7. Fremgangsmåde, der er anvendelig til detektion af en specifik nucleinsyresekvens i en prøve indeholdende nucleinsyre, kendetegnet ved, at den omfatter syntese af en mangfoldighed af RNA-transcripter ud fra en dobbeltstrenget nucleinsyre fremstillet ved fremgangsmåden ifølge et hvilket som helst af de forudgående krav, hvorved hvert RNA-transcript omfatter en 15 RNA-sekvens svarende til den specifikke nucleinsyresekvens der skal detek-teres, og bestemmelse af tilstedeværelsen af nævnte RNA-sekvens.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at mangfoldig heden af RNA-transcripter syntetiseres under anvendelse af T7 RNA-polymerase.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at mangfoldig heden af RNA-transcripter syntetiseres under anvendelse af SP6 RNA-polymerase.

10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 7, 8 og 9, kendetegnet ved, at tilstedeværelsen af nævnte RNA-sekvens bestemmes 25 ved under hybridiserende betingelser at bringe RNA-transcripteme i kontakt med en oligonucleotidprobe, der er valgt således, at den hybridiserer med en forudbestemt sekvens i RNA-transcripterne. DK 175944 B1 29

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at RNA- transcripteme immobiliseres på et fast underlag. r