JP2020202766A - プライマー及びＷＴ１ ｍＲＮＡの検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】試料中に存在するＷＴ１ ｍＲＮＡを高感度、迅速かつ特異的に増幅検出する方法を提供する。【解決手段】試料中に含まれるＷＴ１ ｍＲＮＡの特定塩基配列の３’末端部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の５’末端部と相同的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであって、第一のプライマーが、特定の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが、別の特定の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、前記プライマーセットを用いてＷＴ１ ｍＲＮＡを検出する。【選択図】なし

Description

本発明は、試料中に含まれるＷＴ１ ｍＲＮＡを迅速、高感度かつ特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー、および当該プライマーを用いたＷＴ１ ｍＲＮＡの検出方法に関する。

ウイルムズ腫瘍−１(ＷＴ１)遺伝子は小児の腎腫瘍の原因遺伝子として単離された遺伝子である。ＷＴ１は急性白血病の多くに発現していることが知られており、急性骨髄性白血病の治療にて微小残存病変のモニタリングマーカーとして、または骨髄異形成症候群患者における診断の補助および進行度モニタリングマーカーとして使用されている。臨床的に用いられているＷＴ１ ｍＲＮＡ検出法として、ＲＴＰＣＲ法（特許文献１、特許文献２、非特許文献１）用いたものがある。しかし、ＲＴＰＣＲ法による検出法は、感度、特異性とも極めて高いが、検査に時間がかかり、操作が煩雑である。

ＴＲＣ法（特許文献３、特許文献４）では精製から検出まで一体となった装置が市販されており、１時間程度で結果を得ることができるうえ、操作が簡便である。また、感度、特異度ともに他の核酸増幅による検出法と遜色はない。

ＴＲＣ法は比較的低温の一定温度（例えば、４０℃から５０℃）条件下でＲＮＡの増幅を行う方法であり、このような方法では、増幅対象核酸が高次構造を形成しやすくなる。また、ＷＴ１のゲノムを検出せず、ｍＲＮＡだけを検出するためには複数のエクソンをまたぐように増幅領域を設計する必要があり、当該プライマーセットやオリゴヌクレオチドプローブの設計は困難であった。

ＷＯ２０１４／１１５７７９ 特開平１１−８９５９９号公報 特開２０００−１４４００号公報 特開２００１−３７５００号公報

ＩｎｔＪ Ｈｅｍａｔｏｌ （２０１６）１０３：５３−６２

本発明の目的は、試料中に存在するＷＴ１ ｍＲＮＡに由来する核酸を高感度、迅速かつ特異的に増幅し得るプライマー、および、当該プライマーを用いたＷＴ１ ｍＲＮＡの検出方法を提供することにある。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下のとおりである。

（１） 試料中に含まれるＷＴ１ ｍＲＮＡの特定塩基配列の３’末端部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の５’末端部と相同的な配列を有する第
二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであって、
第一のプライマーが、配列番号１、５および９のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号１４または２０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、
前記プライマーセット。

（２） 第一のプライマーが少なくとも１７塩基からなり、第二のプライマーが少なくとも１６塩基からなるオリゴヌクレオチドである、（１）に記載のプライマーセット。

（３） 第一のプライマーが、配列番号２、６および１０のいずれかに記載の塩基配列中、少なくとも連続する１６塩基からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号１５もしくは２１に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１６塩基からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、（１）または（２）に記載のプライマーセット。

（４） 第一のプライマーが配列番号３、４、７、８、１１、１２および１３のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号１６〜１９および２２〜３２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、（１）〜（３）のいずれかに記載のプライマーセット。

（５） 第一のプライマーが配列番号７、８、１１および１２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号２２〜３２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、
（１）〜（４）のいずれかに記載のプライマーセット。

（６） 第一のプライマーが配列番号７、８および１２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号２６、２８、２９および３０のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、
（１）〜（５）のいずれかに記載のプライマーセット。

（７） （１）〜（６）のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、ＷＴ１ ｍＲＮＡの特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅し、前記核酸の一
部とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な、インターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ＷＴ１ ｍＲＮＡを検出する工程を含む、ＷＴ１ ｍＲＮＡの検出方法。

（８） （１）〜（６）のいずれかに記載のプライマーセットと、配列番号３３または３４に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブとを含む、ＷＴ１ ｍＲＮＡ検出試薬。

本発明のプライマーセットはＷＴ１ ｍＲＮＡに特異的な塩基配列を含む配列（特定塩基配列）およびその相補配列の一部にそれぞれハイブリダイズすることより、ＷＴ１ ｍＲＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を特異的に増幅させることができる。
本発明のプライマーセットを用いたＷＴ１ ｍＲＮＡ検出法は、試料中に含まれるＷＴ１ ｍＲＮＡを迅速、高感度に検出できる。そのため、検査結果を早急に医師に提示することが可能となる。

以下に本発明を詳細に説明する。
本発明のプライマーセットは、試料中に含まれるＷＴ１ ｍＲＮＡの特定塩基配列の３’末端部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の５’末端部と相同的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであって、第一のプライマーが、配列番号１、５および９のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが、配列番号１４または２０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、プライマーセットである。

なお、本発明において、「相補的な配列を有する」とは対象核酸に対しストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を有することをいい、「相同的な配列を有する」とは対象核酸の相補鎖に対しストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を有することをいう。

（試料）
本発明において「試料」とは、検出対象であるＷＴ１ ｍＲＮＡを含む可能性のある限り限定されないが、例えばヒト由来の細胞、組織、血液（全血等）、尿またはそれらの処理物等の生体試料が挙げられる。ＷＴ１ ｍＲＮＡを含有する可能性のある試料から公知の方法で処理することで得られるＲＮＡ、あるいはｍＲＮＡを富化した試料等も使用できる。試料中のＲＮＡ量としては、限定されないが、例えば、反応液１００μｌ当り０．０１ｎｇ〜１０μｇ程度である。

（対象遺伝子）
本発明のプライマーセットおよび方法は、ＷＴ１遺伝子、特にヒトＷＴ１遺伝子を検出対象とする。より具体的には、本発明のプライマーセットおよび方法は、ＷＴ１ ｍＲＮＡを検出対象とする。ＷＴ１遺伝子は、前述するように小児腎腫瘍の原因遺伝子として同定された遺伝子であり、ヒトＷＴ１ ｍＲＮＡとしては、ＷＴ１ ｍＲＮＡ配列(ＶａｒｉａｎｔＥ)（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１）、ＷＴ１ ｍＲＮＡ配列(ＶａｒｉａｎｔＤ)（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿０２４４２６）、ＷＴ１ ｍＲＮＡ配列(ＶａｒｉａｎｔＦ)（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５２）等がＮＣＢＩに登録されている。

本発明のプライマーセットおよび方法が検出対象とするＷＴ１ ｍＲＮＡとしては、本発明のプライマーセットおよび方法により検出される限り限定されないが、好ましくは、ＷＴ１ ｍＲＮＡ配列ＶａｒｉａｎｔＥ、ＶａｒｉａｎｔＤ、ＶａｒｉａｎｔＦ等が挙げられる。

本発明において「特定塩基配列」とは、ＷＴ１ ｍＲＮＡに特異的な塩基配列を含む配列であって、ＷＴ１ ｍＲＮＡのうち、本発明の第二のプライマーとの相同領域の５’末端から本発明の第一のプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列のことをいう。すなわち、本発明では前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が増幅されることになる。

（プライマーセット）
本発明のプライマーセットは、ＷＴ１ ｍＲＮＡにおける特定塩基配列または特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅し得るプライマーセットである。
より具体的には、本発明のプライマーセットにおける第一のプライマーは、配列番号１、５および９のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーは、配列番号１４または２０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。

本発明における「ストリンジェントな条件」の例としては、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性（例えば、同一性や類似性）が高いポリヌクレオチド同士、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い相同性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。限定されないが、具体的には、ハイブリダイゼーション条件として、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムが存在する条件や、本明細書の実施例に記載の核酸増幅条件があげられる。また、洗浄条件として、６０℃、１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは０．１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１ｘＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳ、より好ましくは６８℃、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ等のストリンジェントな条件に相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件等が挙げられる。さらに、当業者であれば、本明細書の記載、および、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｗｏｏｄｂｕｒｙ， ＮＹ （２００１））等を参照し、本発明の第一のプライマー（配列番号１、５または９に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド）、および、本発明の第二のプライマー（配列番号１４または２０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド）を容易に取得することができる。

また、前述したストリンジェントな条件下で、前記特定塩基配列またはその相補配列と、十分に特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能であり、かつ、前記特定塩基配列またはその相補配列を増幅可能であれば、第一および第二のプライマーの塩基配列は、前記特定塩基配列またはその相補配列と比較して、１または数個程度（例えば、プライマー配列の塩基数の１０％以下程度）の置換、欠失、挿入、付加および／または修飾があっ
てもよい。なお、プライマーの３’末端に相当する塩基配列には、置換、欠失、挿入および付加はないことが好ましい。

すなわち、第一および第二のプライマーは、特定塩基配列の３’末端部の配列番号１、５および９のいずれかに記載の塩基配列の相補配列の一部もしくは全長、または、前記特定塩基配列の５’末端部の配列番号１４または２０に記載の塩基配列の一部もしくは全長と、７０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつプライマーとしての機能を有するオリゴヌクレオチドであってよい。第一および第二のプライマーは、好ましくは、配列番号１、５および９のいずれかに記載の塩基配列の相補配列の一部もしくは全長、または、配列番号１４または２０に記載の塩基配列の一部もしくは全長と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有する。

本明細書における塩基配列の相同性（同一性または類似性ともいう）は、例えば、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用いて計算することができる。

第一および第二のプライマーの長さは任意に設定できるが、好ましくは１０塩基から５０塩基、さらに好ましくは１６塩基〜３０塩基、より好ましくは１７塩基〜２５塩基までの範囲である。なお、もっとも好ましい態様では、ストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドとは、対象塩基配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。

プライマーは１種または２種以上を組み合わせて使用することができる。プライマーの反応系への添加量は、本明細書の記載および公知の核酸増幅技術を参照し、反応系に応じ適宜決定することができる。プライマーは、本明細書の記載および公知技術に基づいて、製造することができる。

本発明は、ＷＴ１ ｍＲＮＡの特定塩基配列の３’末端部と相補的な配列を有する第一のプライマーとして、配列番号１に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の５４３番目から５６６番目までの塩基配列）または配列番号５に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１ＮＭ＿００１１９８５５１の９５９番目から９８２番目までの塩基配列）または配列番号９に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の１００５番目から１０４４番目までの塩基配列）とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、またＷＴ１ ｍＲＮＡの特定塩基配列の５’末端部と相同的な配列を有する第二のプライマーとして、配列番号１４に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の３６１番目から３９７番目までの塩基配列の相補配列）または配列番号２０に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の８０５番目から８４７番目までの塩基配列の相補配列）とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いることを特徴としている。

その中でも第一のプライマーが少なくとも１７塩基からなり、第二のプライマーが少なくとも１６塩基からなることが好ましい。

第一のプライマーの一例として、配列番号１に記載の塩基配列の相補配列である配列番号２に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１８塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の５４３番目から５６０番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の５４５番目から５６６番目までの塩基配
列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

また第一のプライマーの一例として、配列番号５に記載の塩基配列の相補配列である配列番号６に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１７塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の９５９番目から９７５番目までの塩基配列の相補配列）または配列番号８（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の９６１番目から９８２番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

また第一のプライマーの一例として、配列番号９に記載の塩基配列の相補配列である配列番号１０に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１８塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号１１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の１００５番目から１０２５番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号１２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の１０１１番目から１０３０番目までの塩基配列の相補配列）または配列番号１３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の１０２７番目から１０４４番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

第二のプライマーの一例として、配列番号１４に記載の塩基配列の相補配列である配列番号１５に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１８塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号１６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の３６１番目から３７９番目までの塩基配列）および配列番号１７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の３６５番目から３８４番目までの塩基配列）、配列番号１８（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の３７０番目から３９２番目までの塩基配列）または配列番号１９（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の３８０番目から３９７番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

また第二のプライマーの一例として、配列番号２０に記載の塩基配列の相補配列である配列番号２１に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１６塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号２２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の８０５番目から８２４番目までの塩基配列）、配列番号２３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の８１３番目から８３０番目までの塩基配列）、配列番号２４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の８１９番目から８３４番目までの塩基配列）、配列番号２５（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の８２３番目から８４２番目までの塩基配列）、配列番号２６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の８２１番目から８４２番目までの塩基配列）、配列番号２７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の８１９番目から８４２番目までの塩基配列）、配列番号２８（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の８２３番目から８４５番目までの塩基配列）、配列番号２９（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の８２３番目から８４７番目までの塩基配列）、配列番号３０（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の８２０番目から８４４番目までの塩基配列）、配列番号３１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の８２４番目から８４１番目までの塩基配列）または配列番号３２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の８２３番目から８４０番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

中でもＷＴ１ ｍＲＮＡを迅速かつ特異的に検出可能であるという点で、第一のプライマーが配列番号７、８、１１、１２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが、配列番号２２〜３２のいずれかに記載の塩基配列から
なるオリゴヌクレオチドであるプライマーセットが好ましい。その中でも第一のプライマーが配列番号７、８、１２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが、配列番号２６、２８、２９、３０のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセットがより好ましい。その中でも第一のプライマーと第二のプライマーの組み合わせが、配列番号１２と２６、１２と２８、１２と２９、１２と３０のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセットがさらに好ましい。

本発明のプライマーセットは、ＲＴ−ＰＣＲ法等、当業者が通常用いる核酸増幅法を利用した、ＷＴ１ ｍＲＮＡの特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットとして有用である。なお、第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターをさらに付加させると、前記プロモーターに対応したＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを付加した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が合成されるため、これら核酸からＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法を用いて、ＲＮＡを増幅させることができる点で好ましい。プライマーの５’末端側に付加するプロモーターは、ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼ（例えば、分子生物学の分野で汎用される、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼやＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）に対応したプロモーターを用いればよい。また前記プロモーターに、転写効率に影響を及ぼすことが知られている転写開始領域をさらに付加してもよい。ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼとしてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたときの、プライマーの５’末端側に付加するプロモーター（Ｔ７プロモーター）の具体例として、配列番号３５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

本発明のプライマーセットを用いて増幅したＷＴ１ ｍＲＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を含む核酸の検出は、従来から知られた核酸検出方法を利用することができる。
具体的には、
（Ａ）電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、
（Ｂ）検出可能な標識で標識されたオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション法、
（Ｃ）当該増幅産物の塩基配列の一部とハイブリダイズすることで蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを用いた方法、
等があげられる。
前記（Ｃ）の蛍光色素標識プローブの一例として、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した蛍光標識プローブや、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブが挙げられる。

（検出試薬）
本発明の検出試薬は、ＷＴ１ ｍＲＮＡの検出に用いられる試薬であって、本発明のプライマーセット、および、増幅産物の塩基配列の一部とハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを含む、ＷＴ１ ｍＲＮＡ検出試薬である。オリゴヌクレオチドプローブの反応系への添加量は、本明細書の記載および公知の核酸増幅技術を参照し、反応系に応じ適宜決定すればよい。

本発明の検出試薬は、試料中に含まれるＷＴ１ ｍＲＮＡの発現量を迅速、高感度に検出できる。そのため、種々の検査、特に臨床診断用試薬として有用であり、白血病の検査、固形ガンの転移の検査、微小残存病変の検査等に用いることができる。

本発明の検出試薬には、本発明の効果を妨げない限り、上記成分以外に、さらに任意の反応、検出等に用いられる成分、例えば、ｐＨ緩衝剤、２価の金属イオン、デオキシリボヌクレオチド等から選択される少なくとも１種を含んでもよい。

（プローブ）
前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブの一例として、ＷＴ１ ｍＲＮＡの特定塩基配列または当該特定塩基配列の相補配列を含む核酸の一部とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの３’末端側、５’末端側、リン酸ジエステル部または塩基部分に、適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブがある。前記プローブはＷＴ１ ｍＲＮＡの特定塩基配列（または当該特定塩基配列の相補配列）と相補的２本鎖を形成すると、インターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることで蛍光特性が変化するプローブである。標識するインターカレーター性蛍光色素に特に限定はなく、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、ヘミシアニン等の汎用されている蛍光色素、およびこれらの誘導体の中から、蛍光強度や蛍光特性を考慮して、適宜選定すればよい。なお３’末端側に蛍光色素を標識する場合を除き、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端側は当該末端側からの核酸伸長反応を防止する意味で、グリコール酸等の適当な修飾がされているとよい。

前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを構成するオリゴヌクレオチドの好ましい例として、配列番号３３に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の４６１番目から４７５番目までの塩基配列）またはその相補配列、または配列番号３４に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の９４１番目から９５６番目までの塩基配列）またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを挙げることができる。

（検出方法）
本発明のプライマーセットを用いてＷＴ１ ｍＲＮＡを検出するには、例えば以下の（１）から（６）に示す工程により実施すればよい。

（１）配列番号１、５および９のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第一のプライマーがＷＴ１ ｍＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ＲＮＡとのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）該１本鎖ＤＮＡに、配列番号１４または２０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第二のプライマーがハイブリダイズし（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターが付加される）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーターを含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生産する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）配列番号３３または３４またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、前記ＲＮＡ転写産物量を経時的に測定する工程。

前記（１）の工程で用いるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、前記（２）の工程で用いるＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素、および前記（３）の工程で用いるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、それぞれ別個あるいは種々の組合せで添加することもできるが、前記活性を併せ持つレトロウイルス由来の逆転写酵素を使用することもできる。該逆転写酵素は特に限定されないが、分子生物学の分野で汎用される、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ
Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素等が使用できる。各酵素の反応系への添加量は、本明細書の記載および公知の核酸増幅技術を参照し、反応系に応じ適宜決定すればよい。

前述した態様によるＷＴ１ ｍＲＮＡ検出方法における反応温度は、使用する各酵素の耐熱性や活性、ならびにプライマー／プローブのＴｍ等に依存するが、使用する酵素がＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼであり、プライマー／プローブの長さが１６から３０塩基の範囲である場合は、３５から６５℃の範囲で反応温度を設定すればよく、４０から５０℃の範囲で設定するとより好ましい。反応時間は、必要な目的物量等に応じて、適宜設定可能である。

前述した態様によるＷＴ１ ｍＲＮＡ検出方法は、蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅および測定をあわせて通例２０分以内で終了することが可能である。

前述した態様によるＷＴ１ ｍＲＮＡ検出方法は、前述した第一のプライマー、第二のプライマー、およびインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含むＷＴ１ ｍＲＮＡ試薬に試料を添加し、経時的に蛍光検出可能な温調ブロックに載置することで、自動的にＷＴ１ ｍＲＮＡを増幅し検出することができる。本発明のＷＴ１ ｍＲＮＡ検出試薬において、オリゴヌクレオチドプローブを構成するオリゴヌクレオチドは、配列番号３３または３４に記載の塩基配列からなるものが好ましい。

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。

＜実施例１＞ 標準ＲＮＡ調製
後述の実施例で使用する、ＷＴ１ ｍＲＮＡ標準ＲＮＡ（ＶａｒｉａｎｔＤ、Ｅ、Ｆ）を以下に示す方法でそれぞれ調製した。なお調製した各標準ＲＮＡの定量は、２６０ｎｍにおける吸光度を基に実施した。

（１）ＷＴ１ ｍＲＮＡ
ＷＴ１ ｍＲＮＡ配列(ＶａｒｉａｎｔＥ)（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１）、ＷＴ１ ｍＲＮＡ配列(ＶａｒｉａｎｔＤ)（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿０２４４２６）、ＷＴ１ ｍＲＮＡ配列(ＶａｒｉａｎｔＦ)（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５２）に基づき、人工的に２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を作製し、インビ
トロ転写した後、転写産物を精製することで、ＷＴ１ ｍＲＮＡ標準ＲＮＡ（Ｖａｒｉａｎｔ Ｄ、Ｅ、Ｆ）を調製した。

＜実施例２＞ インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの調製
下記（Ａ）に示す、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（以下、ＩＮＡＦプローブと記載する）を特開２０００−３１６５８７号公報で開示の方法に基づき作製した。

（Ａ）配列番号３３からなるオリゴヌクレオチドの５’末端から１２番目のグアニンと１３番目のシトシンとの間に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識したもの。または配列番号３４からなるオリゴヌクレオチドの５’末端から１３番目のグアニンと１４番目のシトシンとの間に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識したもの。

＜実施例３＞ ＷＴ１ ｍＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドの検討
表１に示す、第一のプライマー、第二のプライマーおよびＩＮＡＦプローブの組み合わせ（以下、オリゴヌクレオチドの組み合わせと記載する）を用いて、以下に示す方法で評価した。なお表１に記載のＩＮＡＦプローブは実施例２で作製したプローブである。

（１）実施例１で調製した標準ＲＮＡのうち、ＷＴ１ ｍＲＮＡ（実施例１（１））は、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ コール酸ナトリウム）を用いて１００００コピー／１５μＬになるように希釈し、これらをＲＮＡ試料として用いた。

（２）以下の組成からなる反応液を蒸発乾燥用チューブに分注し、蒸発乾燥した。
反応液の組成：濃度はＲＮＡ試料、開始液、添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３５）
３００ｍＭ トレハロース
各０．４８ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各１．８ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
１．３ｍＭ ＧＴＰ
２．９ｍＭ ＩＴＰ
０．２μＭ 第一のプライマー（各配列番号の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端側にＴ７プロモーター（配列番号３５）を付加したもの）
０．２μＭ 第二のプライマー
５０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製したもの）
０．０２５ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素

（３）上記の蒸発乾燥後にＲＮＡ試料を１５μＬ添加後、４６℃で５分間保温し、その後、以下の組成からなる開始液１５μＬを添加し撹拌した。
開始液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
１０．０７％ ジメチルスルホキシド
２１ｍＭ 塩化マグネシウム
１０５ｍＭ 塩化カリウム

（４）引き続き蒸発乾燥用チューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度を経時的に２０分間測定した。

開始液を加え撹拌を終えた時点を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強
度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．３を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表１および２に示す。実験は表１および２に記載された回数実施した。

ＷＴ１ ｍＲＮＡの検出性能（表１）については、本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせ（Ａ０１からＡ５６）いずれもが１００００コピー／ｔｅｓｔのＷＴ１
ｍＲＮＡ（Ｖａｒｉａｎｔ Ｄ）を２０分以内に検出した。特に、オリゴヌクレオチドの組み合わせＡ０９からＡ４５は１００００コピー／ｔｅｓｔのＷＴ１ ｍＲＮＡを７分以内に検出しており、ＷＴ１ ｍＲＮＡを高感度、迅速かつ特異的に検出可能なオリゴヌクレオチドの組み合わせといえる。

異なる遺伝子型の検出（表２）については、本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせのうち、Ａ１０、Ａ１２、Ａ３６、Ａ３８がＷＴ１ ｍＲＮＡの３種類のＶａｒｉａｎｔ（Ｄ、Ｅ、Ｆ）をほぼ同等の時間で検出した。ＶａｒｉａｎｔによらずＷＴ１
ｍＲＮＡを検出可能なオリゴヌクレオチドの組み合わせといえる。

本発明は、試薬等に適用できる。

＜配列の説明＞
配列番号１ ： ヒトＷＴ１ ｍＲＮＡの部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の５４３番目から５６６番目までの塩基配列）
配列番号２ ： 配列番号１の相補配列
配列番号３ ： 配列番号２の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の５４３番目から５６０番目までの塩基配列の相補配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号４ ： 配列番号２の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の５４５番目から５６６番目までの塩基配列の相補配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号５ ： ヒトＷＴ１ ｍＲＮＡの部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１ＮＭ＿００１１９８５５１の９５９番目から９８２番目までの塩基配列）配列番号６ ： 配列番号５の相補配列
配列番号７ ： 配列番号６の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の９５９番目から９７５番目までの塩基配列の相補配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号８ ： 配列番号６の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の９６１番目から９８２番目までの塩基配列の相補配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号９ ： ヒトＷＴ１ ｍＲＮＡの部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の１００５番目から１０４４番目までの塩基配列）
配列番号１０： 配列番号９の相補配列
配列番号１１： 配列番号９の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の１００５番目から１０２５番目までの塩基配列の相補配列）（第一のプライマーの
一例）
配列番号１２： 配列番号９の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の１０１１番目から１０３０番目までの塩基配列の相補配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号１３： 配列番号９の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の１０２７番目から１０４４番目までの塩基配列の相補配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号１４： ヒトＷＴ１ ｍＲＮＡの部分配列の相補配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の３６１番目から３９７番目までの塩基配列の相補配列）
配列番号１５： 配列番号１４の相補配列
配列番号１６： 配列番号１５の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の３６１番目から３７９番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号１７： 配列番号１５の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の３６５番目から３８４番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号１８： 配列番号１５の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の３７０番目から３９２番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号１９： 配列番号１５の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の３８０番目から３９７番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号２０： ヒトＷＴ１ ｍＲＮＡの部分配列の相補配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の８０５番目から８４７番目までの塩基配列の相補配列）
配列番号２１： 配列番号２０の相補配列
配列番号２２： 配列番号２１の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の８０５番目から８２４番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号２３： 配列番号２１の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の８１３番目から８３０番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号２４： 配列番号２１の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の８１９番目から８３４番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号２５： 配列番号２１の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の８２３番目から８４２番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号２６： 配列番号２１の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の８２１番目から８４２番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号２７： 配列番号２１の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の８１９番目から８４２番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号２８： 配列番号２１の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の８２３番目から８４５番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号２９： 配列番号２１の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の８２３番目から８４７番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号３０： 配列番号２１の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の８２０番目から８４４番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号３１： 配列番号２１の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の８２４番目から８４１番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号３２： 配列番号２１の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の８２３番目から８４０番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号３３： ヒトＷＴ１ ｍＲＮＡの部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の４６１番目から４７５番目までの塩基配列）（オリゴヌクレオチドプローブの一例）
配列番号３４： ヒトＷＴ１ ｍＲＮＡの部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１９８５５１の９４１番目から９５６番目までの塩基配列）（オリゴヌクレオチドプローブの一例）
配列番号３５： Ｔ７プロモーター

Claims (8)

1. 試料中に含まれるＷＴ１ ｍＲＮＡの特定塩基配列の３’末端部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の５’末端部と相同的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであって、
   第一のプライマーが、配列番号１、５および９のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、
   第二のプライマーが、配列番号１４または２０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、
   前記プライマーセット。
2. 第一のプライマーが少なくとも１７塩基からなり、第二のプライマーが少なくとも１６塩基からなるオリゴヌクレオチドである、
   請求項１に記載のプライマーセット。
3. 第一のプライマーが、配列番号２、６および１０のいずれかに記載の塩基配列中、少なくとも連続する１７塩基からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
   第二のプライマーが、配列番号１５もしくは２１に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１６塩基からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、
   請求項１または２に記載のプライマーセット。
4. 第一のプライマーが配列番号３、４、７、８、１１、１２および１３のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
   第二のプライマーが、配列番号１６〜１９および２２〜３２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、
   請求項１〜３のいずれか一項に記載のプライマーセット。
5. 第一のプライマーが配列番号７、８、１１および１２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
   第二のプライマーが、配列番号２２〜３２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、
   請求項１〜４のいずれか一項に記載のプライマーセット。
6. 第一のプライマーが配列番号７、８および１２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
   第二のプライマーが、配列番号２６、２８、２９および３０のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、同オリゴヌクレオチドにおいて、１もしくは数
   個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、
   請求項１〜５のいずれか一項に記載のプライマーセット。
7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて、ＷＴ１ ｍＲＮＡの特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅し、前記核酸の一部とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な、インターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ＷＴ１ ｍＲＮＡを検出する工程を含む、
   ＷＴ１ ｍＲＮＡの検出方法。
8. 請求項１〜６のいずれか一項に記載のプライマーセットと、
   配列番号３３または３４に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブ、とを含む、
   ＷＴ１ ｍＲＮＡ検出試薬。