JP2003516764A

JP2003516764A - マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種の核酸増幅および検出

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Publication number: JP2003516764A
Application number: JP2001545587A
Authority: JP
Inventors: ブレンターノ，スティーブン・ティー; ジュッカー，マーカス・ティー; デルガド，フランシスコ・ディー; クレウズィアット，フィリップ; ロドリーグ，マルク
Original assignee: ジェン−プローブ・インコーポレーテッド; ビヨメリュー・ソシエテ・アノニム
Priority date: 1999-12-17
Filing date: 1999-12-17
Publication date: 2003-05-20
Anticipated expiration: 2019-12-17
Also published as: WO2001044510A3; CA2389523A1; ATE495268T1; AU2482200A; EP1242633B1; EP1242633A1; CA2389523C; DE69943134D1; AU781192B2; WO2001044510A2; JP4744053B2

Abstract

(57)【要約】マイコバクテリウム属内の多くの種に関して、１６ＳｒＲＮＡ配列または１６ＳｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ核酸増幅をプライミングするのに用いられるオリゴヌクレオチドが開示される。こうしたオリゴヌクレオチドを含むキットが開示される。ｉｎｖｉｔｒｏ核酸増幅においてオリゴヌクレオチドを用いてマイコバクテリウム属種を検出する方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、病原性細菌のｉｎｖｉｔｒｏ診断検出に関し、そして具体的には
、ｉｎｖｉｔｒｏ核酸増幅および増幅された産物の検出を用いることによって
、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の多くの種を検出する
ための組成物およびアッセイに関する。発明の背景臨床種におけるマイコバクテリウム属種の検出は、臨床診断ツールとして重要
である。歴史的には、ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は、こ
の属の唯一の臨床的に重要な病原体であると考えられていた。ヒト型結核菌の薬
剤耐性株の発生が増加して、この種を検出する必要性がさらにきわだってきてい
る。しかし、他のマイコバクテリウム属種もまた、臨床的に重要である。これら
はときに、ヒト型結核菌以外のマイコバクテリウム属を表す、「ＭＯＴＴ」と称
され、通常、臨床標本中の鳥型結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）／イントラセルラレ
（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）複合体生物（鳥型結核菌、Ｍ・イントラセル
ラレ、パラ結核菌（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、通常、ＭＡＩ
Ｃと称される）、Ｍ・ゴルドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｍ・フォルツイツ
ム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、Ｍ・ケロネ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、Ｍ
・ムコジェニクム（Ｍ．ｍｕｃｏｇｅｎｉｃｕｍ）およびマイコバクテリウム
属種の混合物が含まれる。例えば、ＡＩＤＳおよび他の免疫無防備状態個体にお
いて、鳥型結核菌複合体（ＭＡＣ）細菌による迅速増殖日和見感染が頻繁に起こ
ることが示されている。こうした感染した個体において、少なくとも１０⁶ Ｍ
ＡＣ細胞／ｍｌの痰沈降物が見出されている。したがって、マイコバクテリウム
属の多くの種を検出し、そして最適にはこれらを区別することが可能な検出アッ
セイが、臨床的に重要である。

【０００２】試料中のマイコバクテリウム属種を検出しそして同定するための多くの臨床的
方法は、細菌の物理的特性（例えば酸迅速染色および桿菌の顕微鏡的検出）、生
理学的特性（例えば定義された培地上の増殖）または生化学的特性（例えば膜脂
質組成）の解析を必要とする。これらの方法は、試料中に比較的高濃度の細菌が
存在することが必要であり、臨床技術者の経験および専門技術に応じて主観的で
ある可能性があり、そして時間がかかる。マイコバクテリウム属種は、しばしば
、ｉｎｖｉｔｒｏで増殖させるのが困難であり、そして培養中で有用な密度に
到達するのに数週間かかる可能性があるため、これらの方法はまた、患者治療の
遅延および診断が完了するまで感染個体を隔離するのに関連する費用も生じる可
能性がある。

【０００３】より最近、アッセイの感受性および相対速度のため、試料中の細菌由来の核酸
の存在を検出するアッセイが好まれている。特に、臨床試料に存在する核酸のｉ
ｎｖｉｔｒｏ核酸増幅を用いるアッセイは、検出の感受性の増加および特異性
を提供することが可能である。しかし、こうしたアッセイは、増幅されるおよび
／または検出される配列に応じ、１つまたはいくつかのマイコバクテリウム属種
を検出するよう限定される可能性がある。

【０００４】マイコバクテリウム属核酸配列を検出するためのアッセイおよび試薬は、例え
ば、米国特許第５，５５４，５１６号、第５，７６６，８４９号、第５，７９５
７５２号、第５，９０６，９１７号、第５，９０８，７４４号；欧州特許第ＥＰ０５２８３０６号および第ＥＰ０８１８４６５号；および公告ＰＣＴ特許出
願ＷＯ９６３６７３３およびＷＯ９７２３６１８に、先に開示されている。

【０００５】本発明は、臨床試料に存在する可能性がある広い範囲のマイコバクテリウム属
種を検出する、組成物および比較的単純な診断法を提供する。発明の概要本発明の１つの側面にしたがい、生物学的試料に存在するマイコバクテリウム
属種を検出する方法が提供される。該方法は、マイコバクテリウム属１６Ｓリボ
ソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）またはマイコバクテリウム属１６ＳリボソームｒＲＮ
ＡをコードするＤＮＡを含む、少なくとも１つのマイコバクテリウム属種由来の
核酸を含む生物学的試料を提供し；少なくとも１つのポリメラーゼ活性、並びに
配列番号１から配列番号３４、配列番号３７および配列番号３８からなる群より
選択される配列を有する、少なくとも２つのプライマーを含む、ｉｎｖｉｔｒ
ｏ核酸増幅混合物中で、マイコバクテリウム属１６ＳｒＲＮＡまたはＤＮＡを
増幅して、増幅されたマイコバクテリウム属核酸を産生し；そして増幅されたマ
イコバクテリウム属核酸と関連する標識を検出することによって、増幅されたマ
イコバクテリウム属核酸を検出する工程を含む。１つの態様において、該方法は
また、増幅工程前に、ハイブリダイゼーション条件下で、マイコバクテリウム属
１６ＳｒＲＮＡに特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの捕捉オリゴヌ
クレオチド、および捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする固定化核酸を
、生物学的試料に添加して、ハイブリダイゼーション複合体を産生し；そして生
物学的試料の他の構成要素から、ハイブリダイゼーション複合体を分離する工程
をさらに含む。好ましい態様において、増幅工程は、ヒト型結核菌またはヒト型
結核菌以外のマイコバクテリウム属（ＭＯＴＴ）種の１６ＳｒＲＮＡまたはＤ
ＮＡを増幅する。他の好ましい態様において、増幅工程は、カメ結核菌（Ｍ．
ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、アフリカ菌（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、Ｍ・アシア
ティクム（Ｍ．ａｓｉａｔｉｃｕｍ）、鳥型結核菌、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂ
ｏｖｉｓ）、Ｍ・セラツム（Ｍ．ｃｅｌａｔｕｍ）、Ｍ・ケロネ、Ｍ・フラベ
センス（Ｍ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、Ｍ・フォルツイツム、Ｍ・ガストリ（
Ｍ．ｇａｓｔｒｉ）、Ｍ・ゴルドネ、Ｍ・ヘモフィルム（Ｍ．ｈａｅｍｏｐ
ｈｉｌｕｍ）、Ｍ・イントラセルラレ、Ｍ・インテルジェクツム（Ｍ．ｉｎｔ
ｅｒｊｅｃｔｕｍ）、Ｍ・インテルメディウム（Ｍ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ
）、Ｍ・カンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ・マルモエンセ（Ｍ．ｍａ
ｌｍｏｅｎｓｅ）、Ｍ・マリヌム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）、Ｍ・ノンクロモジ
ェニクム（Ｍ．ｎｏｎ−ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ）、パラ結核菌（Ｍ．
ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、チモテ菌（Ｍ．ｐｈｌｅｉ）、Ｍ・ス
クロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、Ｍ・シモデイ（Ｍ．ｓ
ｈｉｍｏｄｅｉ）、Ｍ・シミエ（Ｍ．ｓｉｍｉａｅ）、スメグマ菌（Ｍ．ｓ
ｍｅｇｍａｔｉｓ）、Ｍ・ツルガイ（Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ）、Ｍ・テレ（Ｍ．ｔｅｒｒａｅ）、Ｍ・トリビアレ（Ｍ．ｔｒｉｖｉａｌｅ）、ヒト型結核菌
、Ｍ・ウルセランス（Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ）またはＭ・ゼノパイ（Ｍ．ｘ
ｅｎｏｐｉ）の１６ＳｒＲＮＡまたはＤＮＡを増幅する。別の態様において、
検出工程は、増幅されたマイコバクテリウム属核酸に特異的にハイブリダイズす
る、少なくとも１つのプローブを用いる。検出工程は、増幅されたマイコバクテ
リウム属核酸に特異的にハイブリダイズする、少なくとも１つの標識化プローブ
を用いることが可能であるし、または、増幅されたマイコバクテリウム属核酸に
特異的にハイブリダイズする、複数のプローブを用いることが可能である。好ま
しい態様において、増幅工程は、少なくとも、第一のプライマーおよび第二のプ
ライマーの組み合わせを用い、第一のプライマーは、配列番号１から配列番号１
２からなる群より選択され、そして第二のプライマーは、配列番号１３から配列
番号３４、配列番号３７および配列番号３８からなる群より選択される。さらな
る態様は、増幅工程において、少なくとも、第一のプライマーおよび第二のプラ
イマーの組み合わせを用い、第一のプライマーが、配列番号７から配列番号１２
からなる群より選択され、そして第二のプライマーが、配列番号１３から配列番
号３４、配列番号３７および配列番号３８からなる群より選択される。増幅工程
で用いる第一および第二のプライマーの好ましい組み合わせは：第一のプライマ
ーが配列番号７の配列を有し、そして第二のプライマーが配列番号１３の配列を
有するか；第一のプライマーが配列番号７の配列を有し、そして第二のプライマ
ーが配列番号１４の配列を有するか；第一のプライマーが配列番号７の配列を有
し、そして第二のプライマーが配列番号１５の配列を有するか；第一のプライマ
ーが配列番号７の配列を有し、そして第二のプライマーが配列番号１６の配列を
有するか；第一のプライマーが配列番号８の配列を有し、そして第二のプライマ
ーが配列番号１３の配列を有するか；第一のプライマーが配列番号８の配列を有
し、そして第二のプライマーが配列番号１４の配列を有するか；第一のプライマ
ーが配列番号８の配列を有し、そして第二のプライマーが配列番号１５の配列を
有するか；第一のプライマーが配列番号９の配列を有し、そして第二のプライマ
ーが配列番号１３の配列を有するか；第一のプライマーが配列番号９の配列を有
し、そして第二のプライマーが配列番号１４の配列を有するか；第一のプライマ
ーが配列番号９の配列を有し、そして第二のプライマーが配列番号１５の配列を
有するか；第一のプライマーが配列番号１０の配列を有し、そして第二のプライ
マーが配列番号１６の配列を有するか；第一のプライマーが配列番号１１の配列
を有し、そして第二のプライマーが配列番号１３の配列を有するか；第一のプラ
イマーが配列番号１１の配列を有し、そして第二のプライマーが配列番号１６の
配列を有するか；第一のプライマーが配列番号１１の配列を有し、そして第二の
プライマーが配列番号１７の配列を有するか；第一のプライマーが配列番号１１
の配列を有し、そして第二のプライマーが配列番号１８の配列を有するか；第一
のプライマーが配列番号１１の配列を有し、そして第二のプライマーが配列番号
１９の配列を有するか；第一のプライマーが配列番号１１の配列を有し、そして
第二のプライマーが配列番号２０の配列を有するか；または第一のプライマーが
配列番号１２の配列を有し、そして第二のプライマーが配列番号１５の配列を有
する。１つの態様において、増幅工程は、少なくとも、第一のプライマーおよび
第二のプライマーの組み合わせを用い、第一のプライマーは配列番号１１の配列
を有し、そして第二のプライマーは配列番号１６、配列番号３０または配列番号
３７の配列を有する。別の態様において、増幅工程は、配列番号１１の配列を有
する第一のプライマー、および２つの第二のプライマーの組み合わせを用い、一
方の第二のプライマーは配列番号１６の配列を有し、そして他方の第二のプライ
マーは配列番号３７の配列を有するものである。

【０００６】本発明の別の側面は、ｉｎｖｉｔｒｏ増幅反応において、マイコバクテリウ
ム属１６ＳｒＲＮＡ配列またはマイコバクテリウム属１６ＳｒＲＮＡをコー
ドするＤＮＡを増幅するための組成物であって、配列番号１から配列番号３４、
配列番号３７および配列番号３８からなる群より選択される塩基配列を有する１
以上のオリゴヌクレオチドを含む、前記組成物である。好ましい態様において、
組成物は、配列番号１から配列番号１２のいずれか１つの配列を含む、少なくと
も１つの第一のオリゴヌクレオチド、および配列番号１３から配列番号３４、配
列番号３７または配列番号３８のいずれか１つの配列を含む、少なくとも１つの
第二のオリゴヌクレオチドを含む。別の態様において、組成物は、配列番号７か
ら配列番号１２のいずれか１つの配列を含む、少なくとも１つの第一のオリゴヌ
クレオチド、および配列番号１３から配列番号３４、配列番号３７または配列番
号３８のいずれか１つの配列を含む、少なくとも１つの第二のオリゴヌクレオチ
ドを含む。

【０００７】本発明の別の側面は、配列番号１から配列番号３４、配列番号３７および配列
番号３８からなる群より選択される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのいず
れかを含むキットである。好ましい態様において、該キットは、配列番号１から
配列番号１２のいずれか１つの配列を含む、少なくとも１つの第一のオリゴヌク
レオチド、および配列番号１３から配列番号３４、配列番号３７または配列番号
３８のいずれか１つの配列を含む、少なくとも１つの第二のオリゴヌクレオチド
を含む。別の態様において、該キットは、配列番号７から配列番号１２のいずれ
か１つの配列を含む、少なくとも１つの第一のオリゴヌクレオチド、および配列
番号１３から配列番号３４、配列番号３７または配列番号３８のいずれか１つの
配列を含む、少なくとも１つの第二のオリゴヌクレオチドを含む。

【０００８】詳細な説明本発明は、ヒト由来の生物学的試料、好ましくはプロセシングされた痰試料に
存在する、マイコバクテリウム属核酸、具体的には１６ＳｒＲＮＡ配列を検出
する方法を含む。本発明はまた、生物学的試料に存在するマイコバクテリウム属
１６ＳｒＲＮＡ配列を特異的に捕捉するのに用いられる核酸オリゴマー（「捕
捉オリゴヌクレオチド」）、捕捉された１６ＳｒＲＮＡ配列の選択された部分
を特異的に増幅するのに用いられる増幅核酸オリゴマー（「プライマー」）、お
よび増幅されたマイコバクテリウム属配列を検出するための核酸オリゴマー（「
プローブ」または「標識化プローブ」）も含む。

【０００９】本発明の核酸配列は、多様なマイコバクテリウム属種のいずれを含む生物学的
試料に存在するマイコバクテリウム属核酸を捕捉し、増幅し、そして検出するの
にも有用である。本発明の方法は、生物学的試料中のマイコバクテリウム属核酸
を検出するのに価値があり、そしてしたがって、いくつかのマイコバクテリウム
属種から生じる可能性がある感染の診断に重要である。これらの方法は、ＭＯＴ
Ｔ種による日和見感染、またはヒト型結核菌感染に関してスクリーニングするの
に特に重要である。

【００１０】本発明を説明する際に用いられる用語の理解を補助するため、以下の定義が提
供される。「生物学的試料」により、マイコバクテリウム属核酸を含む可能性がある生存
しているまたは死亡したヒト由来のいずれかの組織または成分を意味する。試料
は、例えば、痰、呼吸組織または滲出物、末梢血、血漿または血清、子宮頚スワ
ブ試料、生検組織、胃腸組織、尿、糞便、精液または他の体液、組織または成分
を含む。試料はまた、細菌培養（液体培地中または固体培地上）および環境試料
も含む。生物学的試料を処理し、物理的に組織または細胞構造を破壊し、こうし
て、解析用に試料を調製するのに用いられる、酵素、緩衝剤、塩、界面活性剤お
よびそれらに匹敵するものをさらに含んでもよい溶液中に、細胞内構成要素を遊
離させることが可能である。

【００１１】「核酸」により、窒素性複素環塩基、または塩基類似体（ａｎａｌｏｇ）を有
する、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含み、ヌクレオシドが主鎖構造
を介して共有結合し、ポリヌクレオチドを形成する、多量体化合物を意味する。
用語「核酸」には、慣用的なリボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）が含まれ、その類似体も同様である。核酸主鎖は、当該技術分野に知られる
多様な連結を含む可能性があり、該連結には、例えば、１以上の糖−ホスホジエ
ステル連結、ペプチド−核酸結合（「ペプチド核酸」と称される、Ｈｙｄｉｇ−
Ｈｉｅｌｓｅｎら、ＰＣＴ国際公報第ＷＯ９５／３２３０５号）、ホスホロチ
オエート連結、メチルホスホネート連結またはそれらの組み合わせが含まれる。
核酸の糖部分は、リボースまたはデオキシリボース、あるいは、例えば、２’メ
トキシ置換および／または２’ハロゲン化物置換などの既知の置換を有する同様
の化合物であってもよい。窒素性塩基は、慣用的な塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）
、その既知の類似体（例えばイノシンまたは他のもの；ＴｈｅＢｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙｏｆｔｈｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ５−３６，Ａｄ
ａｍｓら監修，第１１版，１９９２を参照されたい）、あるいはプリンまた
はピリミジン塩基類の既知の誘導体（Ｃｏｏｋ、ＰＣＴ国際公報第ＷＯ９３／
１３１２１号を参照されたい）、および１以上の残基に関し、主鎖が窒素性塩基
を含まない、「無塩基性（ａｂａｓｉｃ）」残基（Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第
５，５８５，４８１号）であってもよい。核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡに見られ
るような慣用的な糖、塩基および連結のみを含んでもよいし、または慣用的な構
成要素および置換両方（例えばメトキシ主鎖を介して連結される慣用的塩基、ま
たは慣用的塩基および１以上の塩基類似体を含む核酸）を含んでもよい。

【００１２】「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」により、一般的に１，０００残
基未満を有する核酸を意味し、約２から５ヌクレオチド残基の下限および約５０
０から９００ヌクレオチド残基の上限を有する大きさの範囲にあるポリマーが含
まれる。好ましいオリゴマーは、約５から約１５残基の下限および約５０から６
００残基の上限を有する大きさの範囲にあり；より好ましくは、約１０残基の下
限および約１００残基の上限を有する大きさの範囲にある。オリゴマーは、天然
に存在する供給源から精製してもよいが、好ましくは、公知の方法を用い、合成
する。

【００１３】「増幅オリゴヌクレオチド」または「増幅オリゴマー」により、標的核酸また
はその相補体にハイブリダイズし、そしてｉｎｖｉｔｒｏ核酸増幅反応に関与
するオリゴヌクレオチド（例えばプライマーおよびプロモーター・プライマー）
を意味する。好ましくは、増幅オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列（またはそ
の相補鎖）の領域に相補的である、少なくとも約１０の連続する塩基、そしてよ
り好ましくは、少なくとも約１２の連続する塩基を含む。連続する塩基は、好ま
しくは、増幅オリゴヌクレオチドが結合する配列に、少なくとも８０％、より好
ましくは、少なくとも９０％相補的である。増幅オリゴヌクレオチドは、好まし
くは、長さ約１０から約６０塩基であり、そして修飾ヌクレオチドまたは塩基類
似体を含んでもよい。

【００１４】増幅オリゴヌクレオチドおよびオリゴマーは、「プライマー」または「プロモ
ーター−プライマー」と称される可能性がある。「プライマー」は、テンプレー
ト核酸にハイブリダイズし、そして通常、酵素に仲介される重合反応において、
伸長する３’端を有する、オリゴヌクレオチドを指す。プライマーの５’領域は
、標的核酸に非相補的であり、そしてプロモーター配列のようなさらなる塩基を
含んでもよい。こうしたプライマーは、「プロモーター・プライマー」と称され
る。当業者は、プライマーとして機能することが可能ないかなるオリゴマーも、
５’プロモーター配列を含むよう修飾され、そしてしたがってプロモーター・プ
ライマーとして機能することが可能であることを認識するであろう。同様に、い
かなるプロモーター・プライマーも、そのプロモーター配列機能と独立にプライ
マーとして働くことが可能である。

【００１５】「増幅」により、標的核酸配列、またはその相補体または断片の多コピーを得
るためのいかなる既知のｉｎｖｉｔｒｏ法も意味する。ｉｎｖｉｔｒｏ増幅
は、完全標的領域配列またはその相補体より短い配列を含む可能性がある増幅さ
れた核酸の産生を指す。既知の増幅法には、例えば、転写仲介増幅、レプリカー
ゼ仲介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ
）および鎖置換増幅（ＳＤＡ）が含まれる。レプリカーゼ仲介増幅は、自己複製
ＲＮＡ分子、およびＱＢレプリカーゼのようなレプリカーゼを用いる（Ｋｒａｍ
ｅｒら、米国特許第４，７８６，６００号；ＰＣＴ国際公報第ＷＯ９０／１
４４３９号）。ＰＣＲ増幅は公知であり、そしてＤＮＡポリメラーゼ、プライマ
ーおよび熱反復を用い、多コピーのＤＮＡまたはｃＤＮＡの２つの相補鎖を合成
する（Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０
２号、および第４，８００，１５９号；ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ，１９８７，Ｖｏｌ．１５５：３３５−３５０）。ＬＣＲ増幅は
、少なくとも４つの別個のオリゴヌクレオチドを用い、ハイブリダイゼーション
、連結、および変性の多周期を用いることにより、標的およびその相補鎖を増幅
する（欧州特許出願公報第０３２０３０８号）。ＳＤＡは、エンドヌクレア
ーゼが標的配列を含む半修飾ＤＮＡ二重鎖の１つの鎖にニックを入れ、続いて、
一連のプライマー伸長および鎖置換工程において増幅が起こるように、プライマ
ーが制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む方法である（Ｗａｌｋｅｒら，
１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：
３９２−３９６；および米国特許第５，４２２，２５２号）。転写仲介増幅は、
本発明の好ましい態様である。当業者は、本発明のオリゴヌクレオチド・プライ
マー配列が、ポリメラーゼによるプライマー伸長に基づくいかなるｉｎｖｉｔ
ｒｏ増幅法でも容易に用いることが可能であることを理解するであろう。

【００１６】「転写仲介増幅」または「転写関連増幅」により、ＲＮＡポリメラーゼを用い
、核酸テンプレートから多数のＲＮＡ転写物を産生する核酸増幅のいかなる種類
も意味する。転写仲介増幅（ＴＭＡ）は、一般的に、ＲＮＡポリメラーゼ活性、
ＤＮＡポリメラーゼ活性、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシ
ド三リン酸、並びにプロモーター・プライマーおよび第二の非プロモーター・プ
ライマーを使用し、そして所望により、１以上のさらなるオリゴヌクレオチド（
ときに「ヘルパー」と称される）を含んでもよい。転写関連増幅法は、別に詳細
に開示されるように、当該技術分野に公知である（Ｋａｃｉａｎら、米国特許第
５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号；Ｋａｃｉａｎら、ＰＣ
Ｔ国際公報第ＷＯ９３／２２４６１号；Ｂｕｒｇら、米国特許第５，４３７
，９９０号；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、ＰＣＴ国際公報第ＷＯ８８／０１３０２
号および第ＷＯ８８／１０３１５号；Ｍａｌｅｋら、米国特許第５，１３０
，２３８号；Ｕｒｄｅａら、米国特許第４，８６８，１０５号および第５，１
２４，２４６号；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、ＰＣＴ国際公報第ＷＯ９４／０３
４７２号；およびＲｙｄｅｒら、ＰＣＴ国際公報第ＷＯ９５／０３４３０号）
。本発明の好ましい転写仲介増幅法は、Ｋａｃｉａｎら（米国特許第５，３９９
，４９１号および第５，５５４，５１６号；ＰＣＴ出願第ＷＯ９３／２２４
６１号）に開示されるものである。

【００１７】「プローブ」により、核酸またはその相補体、好ましくは増幅された核酸の標
的配列に、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で特異的にハイブリダイズ
し、それにより標的配列または増幅された核酸の検出を可能にする、核酸オリゴ
マーを意味する。検出は、直接（すなわち標的配列または増幅された核酸に直接
ハイブリダイズするプローブから生じる）であっても、または間接的（すなわち
プローブを標的配列または増幅された核酸に連結する中間分子構造にハイブリダ
イズするプローブから生じる）であってもよい。プローブの「標的」は、一般的
に、標準的水素結合（すなわち塩基対形成）を用い、プローブ・オリゴマーの少
なくとも一部に特異的にハイブリダイズする、増幅された核酸配列内の配列（す
なわちサブセット）を指す。「十分に相補的な」配列は、２つの配列が完全に相
補性でなくても、標的配列へのプローブ・オリゴマーの安定なハイブリダイゼー
ションを可能にする。プローブは、用いる検出法に応じ、標識されていても、ま
たはされていなくてもよい。

【００１８】「十分に相補的」により、一連の相補的塩基間の水素結合により、別の塩基配
列にハイブリダイズすることが可能な、連続する核酸塩基配列を意味する。相補
的塩基配列は、標準的塩基対形成（例えばＧ：Ｃ、Ａ：ＴまたはＡ：Ｕ対形成）
を用い、配列中の各位で相補的であってもよいし、または標準的水素結合を用い
て相補的ではない１以上の残基（無塩基性残基を含む）を含むが、相補的塩基配
列が、適切なハイブリダイゼーション条件において、別の塩基配列と特異的にハ
イブリダイズすることが可能であるものであってもよい。連続する塩基は、オリ
ゴマーが特異的にハイブリダイズする配列に、好ましくは、少なくとも約８０％
、より好ましくは、少なくとも約９０％相補的である。当業者には、適切なハイ
ブリダイゼーション条件が公知であり、該条件は、配列組成および条件に基づい
て予測することが可能であるか、または日常的な試験を用いることにより、実験
的に決定することが可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２
版（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓ
ｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，１９８９）§§１．９０
−１．９１、７．３７−７．５７、９．４７−９．５１および１１．４７−１１
．５７、特に§§９．５０−９．５１、１１．１２−１１．１３、１１．４５−
１１．４７および１１．５５−１１．５７を参照されたい）。

【００１９】「捕捉オリゴヌクレオチド」または「捕捉オリゴマー」により、塩基対ハイブ
リダイゼーションに基づき、標的配列および固定化オリゴマーに特異的に連結す
るための手段を提供する、少なくとも１つの核酸オリゴマーを意味する（ＰＣＴ
出願ＷＯ９８／５０５８３を参照されたい）。一般的に、捕捉オリゴマーは、
２つの結合領域：標的特異的結合領域および固定化プローブ特異的結合領域を含
む。ときに、捕捉オリゴマーは、「捕捉プローブ」と称される。

【００２０】「固定化プローブ」または「固定化核酸」により、捕捉オリゴマーを、直接ま
たは間接的に固体支持体に連結する核酸を意味する。固定化プローブは、試料中
の非結合成分から結合標的配列の分離を促進する、固体支持体に連結したオリゴ
マーである。いかなる既知の素材（例えばニトロセルロース、ナイロン、ガラス
、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレンおよ
び金属粒子、好ましくは常磁性粒子）でできた、マトリックスおよび溶液中に遊
離の粒子などの、いかなる既知の固体支持体を用いてもよい。好ましい支持体は
、それにより、一貫した結果を提供し、固定化プローブが直接（例えば共有結合
、キレート化、またはイオン性相互作用を介し）、または間接的に（例えば１以
上のリンカーを介し）安定して連結され、溶液中の別の核酸へのハイブリダイゼ
ーションを可能にする、単分散常磁性球体（すなわち大きさが±約５％で均一）
である。

【００２１】「分離」または「精製」により、生物学的試料の１以上の構成要素が、該試料
の１以上の他の構成要素から除去されることを意味する。試料構成要素には、他
の成分（例えばタンパク質、炭水化物、脂質および／または核酸）を含む可能性
がある、一般的に水性溶液中の核酸が含まれる。好ましくは、分離または精製工
程は、少なくとも約７０％、より好ましくは、少なくとも約９０％、そしてさら
に好ましくは、少なくとも約９５％の、試料に存在する他の構成要素を除去する
。

【００２２】「標識」により、検出することが可能であるかまたは検出可能反応を導くこと
が可能である分子部分または化合物を意味する。標識は、直接または間接的に、
核酸プローブまたは検出しようとする核酸（例えば増幅された産物）に連結され
る。直接標識は、標識をプローブに連結する結合または相互作用（例えば共有結
合または非共有相互作用）を通じて起こる可能性がある。間接的標識は、直接ま
たは間接的に標識される、架橋部分またはさらなるオリゴヌクレオチド（類）な
どの「リンカー」の使用を通じて起こる可能性がある。架橋部分を用いて、検出
可能シグナルを増幅することが可能である。標識は、いかなる既知の検出可能部
分（例えば、放射性核種、ビオチンまたはアビジンなどのリガンド、酵素または
酵素基質、反応性基、あるいは色素または有色粒子などの発色団、生物発光剤、
燐光剤または化学発光化合物などの発光化合物、および蛍光化合物）も含む。好
ましくは、標識化プローブ上の標識は、均一アッセイ系において検出可能である
（すなわち、混合物において、結合した標識化プローブが、非結合標識化プロー
ブに比較し、検出可能なシグナルを示す）。均一アッセイで使用するのに好まし
い標識は、化学発光化合物（米国特許第５，６５６，２０７号、第５，６５８，
７３７号および第５，６３９，６０４号を参照されたい）、より好ましくは、標
準的ＡＥまたはその誘導体などのアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物で
ある。核酸に標識を付着させ、そして標識を検出する方法は、当該技術分野に公
知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ
，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版（ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ニューヨーク州コ
ールドスプリングハーバー，１９８９），第１０章；米国特許第５，６５８
，７３７号、第５，６５６，２０７号、第５，５４７，８４２号、第５，２８３
，１７４号および第４，５８１，３３３号；および欧州特許出願第０７４７
７０６号を参照されたい）。

【００２３】「均一検出可能標識」は、標識が、標的配列にハイブリダイズしているプロー
ブ上にあるかどうかに基づき、均一な様式で、その存在を検出することが可能な
標識を指す。すなわち、均一検出可能標識は、標識または標識化プローブの非ハ
イブリダイズ型からハイブリダイズ型を物理的に除去することなく、検出するこ
とが可能である。均一検出可能標識およびこれらを検出する方法は、先に詳細に
記載されている（米国特許第５，２８３，１７４号、第５，６５６，２０７号、
および第５，６５８，７３７号）。

【００２４】「本質的に、からなる」により、本発明の基本的なそして新規の特性を実質的
に変化させない、さらなる構成要素（類）、組成物（類）または方法工程（類）
が、本発明の組成物またはキットまたは方法に含まれていてもよいことを意味す
る。こうした特性には、試料あたりコピー数約１００以上で、生物学的試料中の
マイコバクテリウム属種ｒＲＮＡ配列および／または該ｒＲＮＡをコードするＤ
ＮＡ配列を検出する能力が含まれる。本発明の基本的な特性に実質的な影響を有
する、いかなる構成要素（類）、組成物（類）または方法工程（類）も、この用
語の外に属する。

【００２５】別に定義されない限り、本明細書に用いられるすべての科学的および技術的用
語は、相当する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同一の意味を有する
。本明細書に用いられる多くの用語の一般的な定義は、例えば、ＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第２版（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，１９９４，ＪｏｈｎＷｉ
ｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ニューヨーク州ニューヨーク）またはＴｈｅＨａｒｐｅｒＣｏｌｌｉｎｓＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＢｉｏｌｏｇｙ（Ｈａ
ｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，１９９１，ＨａｒｐｅｒＰｅｒｅｎｎｉａｌ，ニューヨーク州ニューヨーク）に見られる。別に言及されない限り、本明細書
に使用されるまたは意図される技術は、一般の当業者に公知の標準的方法論であ
る。

【００２６】本発明は、ヒト生物学的試料中のマイコバクテリウム属種核酸を検出するため
の組成物（核酸捕捉オリゴマー、増幅オリゴマーおよびプローブ）および方法を
含む。捕捉オリゴマー、プライマーおよびプローブとして用いるのに適したＤＮ
Ａ配列を選択するため、公共にアクセス可能なデータベース（例えばＧｅｎＢａ
ｎｋ）から入手可能な、部分的または相補配列を含む、ヒト型結核菌、並びにＭ
・セラツムおよびＭ・ゼノパイなどのＭＯＴＴ種由来の既知のｒＲＮＡまたは対
応するゲノム配列を、公知の分子生物学技術を用いて、同一のまたは類似の配列
の領域をマッチさせることによって、並列した。配列比較は、アルゴリズムを用
いることによって容易にすることが可能であるが、当業者は、こうした比較を、
手動で、そして視覚的に、容易に行うことが可能である。比較配列間で、比較的
少ない配列変動を含む配列部分を、増幅された配列の捕捉、増幅および検出に適
した合成オリゴマーを設計する基礎として、選択した。オリゴマーの設計の際の
他の考慮は、すべて当業者に公知である、配列の相対ＧＣ含量（約３０−５５％
の範囲）および配列内の予測される二次構造（例えばヘアピン構造）の相対的な
欠如を含んだ。これらの解析に基づき、配列番号１から配列番号３５の配列を有
するオリゴマーを設計し、そして合成した。

【００２７】好ましくは、方法に標的捕捉を含み、ｉｎｖｉｔｒｏ増幅前に標的核酸の濃
度または純度を増加させる。好ましくは、標的捕捉は、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ
９８／５０５８３号に詳細に記載されるように、標的核酸をハイブリダイズさせ
そして単離する、比較的単純な方法を伴う。簡潔には、固体支持体に付着したオ
リゴヌクレオチドを、適切なハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸を含む
混合物と接触させ、標的核酸が固体支持体に遊離可能に付着することを可能にす
る。標的捕捉は、標的核酸および固体支持体に付着したオリゴヌクレオチドの間
の直接ハイブリダイゼーションから生じる可能性があるし、または固体支持体に
付着したオリゴヌクレオチドに標的核酸を連結させるハイブリダイゼーション複
合体を形成する１以上のオリゴヌクレオチドを用いて、間接的である可能性があ
る。固体支持体は、好ましくは、溶液から容易に分離することが可能な粒子であ
り、より好ましくは、容器に磁場を適用することによって、回収することが可能
な常磁性粒子である。その後、固体支持体に連結した標的核酸は洗浄され、そし
てｉｎｖｉｔｒｏ増幅反応において、適切なプライマー、基質および酵素への
曝露に際して、増幅される。

【００２８】一般的に、捕捉オリゴマー配列では、該オリゴマーは、標的配列に特異的に結
合する配列、および固体支持体上の固定化配列（例えばＴ₁₄オリゴマー）への複
合体の捕捉に用いられる「テール」配列を含む。すなわち、捕捉オリゴマーは、
３’テール配列（例えば固定化配列に相補的なポリＡ配列）に共有結合した、マ
イコバクテリウム属ｒＲＮＡ配列に特異的に結合する配列を含む。捕捉オリゴマ
ーの塩基配列を連結するいかなる主鎖を用いてもよいが、好ましくは、捕捉オリ
ゴマー主鎖は、Ｏ−メトキシ連結を含む。テール配列（好ましくは長さ５−５０
ｎｔ）は、固定化相補配列にハイブリダイズし、他の試料構成要素から、ハイブ
リダイズした標的核酸を精製する。好ましい捕捉オリゴマーは、配列番号３５の
配列（ＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＣＧＴＡＴＴＴＴ（Ａ）₃₀）を有する。

【００２９】捕捉された標的領域の、少なくとも２つのプライマーを用いた増幅は、多様な
既知の核酸増幅反応を用いて達成することが可能であるが、好ましくは、転写関
連増幅反応を用いる。こうしたｉｎｖｉｔｒｏ増幅法を用いて、多くの核酸鎖
が、標的核酸の単一コピーから産生され、こうして増幅された配列を１以上の検
出可能プローブに特異的に結合させることにより、標的の検出が可能になる。転
写関連増幅は、別の場所に詳細に記載されてきている（Ｋａｃｉａｎら、米国特
許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号）。好ましくは、転写
関連増幅は、溶液中で、２種類のプライマー（１つはＲＮＡポリメラーゼのプロ
モーター配列を含むため、プロモーター−プライマーと称される）、２つの酵素
（逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼ）、基質（デオキシリボヌクレオシド三
リン酸、リボヌクレオシド三リン酸）並びに適切な塩および緩衝剤を用い、核酸
テンプレートから多数のＲＮＡ転写物を産生する。簡潔には、第一の工程におい
て、プロモーター−プライマーが、標的ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズし
、そして逆転写酵素が、プロモーター−プライマーの３’端からの伸長により、
第一鎖ｃＤＮＡを生成する。ｃＤＮＡを第二のプライマーとのハイブリダイゼー
ションに利用可能にするのは、当該技術分野に公知の技術を用いることによって
、例えば、二重鎖を変性させるか、またはＲＮアーゼＨ活性を用いることによっ
て、達成可能になる。好ましくは、逆転写酵素に供給されるＲＮアーゼＨ活性が
、生じたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖中のＲＮＡを分解する。その後、第二のプライマ
ーがｃＤＮＡに結合し、そしてＤＮＡの新規鎖が逆転写酵素を用い第二のプライ
マーの端から合成され、機能するプロモーター配列を一端に有する二本鎖ＤＮＡ
が生成される。ＲＮＡポリメラーゼは、二本鎖プロモーター配列に結合し、そし
て転写は、多数の転写物または「単位複製配列（ａｍｐｌｉｃｏｎ）」を生じる
。これらの単位複製配列は、その後、転写関連増幅過程に用いられ、各々、複製
の新規周期のテンプレートとして働き、こうして、多量の一本鎖増幅核酸（単一
テンプレートから合成される約１００から約３，０００コピーのＲＮＡ転写物）
が生成される。好ましくは、増幅は、実質的に一定の反応条件を用いる（例えば
実質的に等温である）。

【００３０】プライマー配列（配列番号１から配列番号３４、配列番号３７）は、標的配列
または標的配列の相補体に特異的に結合するが、標的配列またはその相補体に結
合しない配列を含んでもよい。特に、Ｔ７プロモーター・プライマー（配列番号
７から配列番号１２）は、標的またはその相補体に結合するプライマー配列の一
部に付着したＴ７プロモーター配列（配列番号３６に別個に示される）を含む。
当業者は、付着するプロモーター配列（配列番号１から配列番号６）を含むまた
は含まない標的特異的プライマー配列が、多様なｉｎｖｉｔｒｏ増幅条件にお
いて、プライマーとして有用である可能性があることを認識するであろう。

【００３１】本発明の好ましい方法が、以下の実施例に記載される。簡潔には、アッセイは
、標的マイコバクテリウム属ｒＲＮＡを含む生物学的試料を提供し、ｒＲＮＡの
標的捕捉を行い、ｉｎｖｉｔｒｏ核酸増幅を行い、増幅された核酸産物を検出
する工程を含む。転写仲介増幅（ＴＭＡ）を用いる好ましい態様において、最終
増幅混合物は、捕捉された標的ｒＲＮＡ、標的特異的配列およびＴ７プロモータ
ー配列を含む少なくとも１つのＴ７プロモーター・プライマー、Ｔ７プロモータ
ー・プライマーを用いて標的から作成された第一鎖ｃＤＮＡに特異的にハイブリ
ダイズする少なくとも１つの第二の（非Ｔ７）プライマー、並びに混合物中の逆
転写酵素およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる酵素的重合の基質および補因子
を含む。捕捉された標的ｒＲＮＡは、ＴＭＡ反応に用いるために、固体支持体か
ら分離する必要はない。Ｔ７プロモーター配列は、二重鎖になったとき、Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼの機能するプロモーターとして働き、多数の転写物を産生す
る。増幅された産物は、相補的プローブ配列への増幅された産物またはその一部
のハイブリダイゼーションを含む、多様な既知の方法のいずれかを用いて検出す
ることが可能である。プローブは、２つの増幅オリゴヌクレオチドを用いて増幅
される標的領域の一部に特異的にハイブリダイズする配列を含む。ある態様では
、標識化プローブを用い、増幅された産物を検出するが、他の態様では、増幅さ
れた産物を標識し、そして固定化プローブ、好ましくはアレイで存在する多くの
プローブにハイブリダイズさせる。その後、プローブおよび増幅されハイブリダ
イズした産物の複合体を検出する。

【００３２】より具体的には、典型的なアッセイは、以下の工程および条件を用いた。試料（例えば０．５ｍｌの痰沈降物または細菌培養、陽性対照反応には、既知
の量のｒＲＮＡを含む等体積の水または緩衝液）を、試験管中で、等量の２Ｘ溶
解緩衝液（例えば２０ｍＭＨＥＰＥＳ、０．５％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチ
ウム、ｐＨ８．０）と混合した。細菌から核酸を遊離させるため、ガラスビーズ
の存在下で混合物を１５分間ボルテックスするか、または超音波処理し、そして
その後、９５℃で１５分間インキュベーションすることによって、溶解されずに
残った生物を熱殺した。

【００３３】新たな試験管中で、標的捕捉工程において、一般的に２５０μｌの溶解物を用
いた。標的ｒＲＮＡを捕捉するため、混合物は、２５０μｌの調製試料、５ｐｍ
ｏｌの配列番号３５を含む２５０μｌの標的捕捉溶液、および固定化ポリｄＴ₁₄ プローブが付着した５０μｇの常磁性粒子（０．７−１．０５μ粒子、Ｓｅｒａ
ｄｙｎ、インディアナ州インディアナポリス）を含んだ。固定化プローブは、標
準的カルボジイミド化学反応法（Ｌｕｎｄら，１９８８，Ｎｕｃ．Ａｃｉ
ｄｓＲｅｓ．１６：１０８６１−１０８８０）を用いて、付着させた。標的
捕捉混合物を、６０℃で約２０分間加熱し、そしてその後、室温に冷却し、ハイ
ブリダイゼーションさせた。磁場を５分間適用し、標的ＲＮＡを含む付着複合体
と共に、磁気粒子を反応容器上の位置にひきつけた（実質的に米国特許第４，８
９５，６５０号に記載されるとおり）。その後、１ｍｌの洗浄緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、６．５ｍＭＮａＯＨ、１ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣ
ｌ、０．１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウム）に粒子を再懸濁し、そしてそ
の後、磁気分離工程を反復することにより、洗浄緩衝液で２回洗浄した。

【００３４】実質的に先に記載されるように行う転写仲介増幅（Ｋａｃｉａｎら、米国特許
第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号）のため、洗浄粒子を、
７５μｌの増幅試薬溶液（１．１ｍＭｒＵＴＰ、４ｍＭｒＡＴＰ、２．７ｍ
ＭｒＣＴＰ、６．７ｍＭｒＧＴＰ、各０．６７ｍＭのｄＮＴＰ、１３．３ｍ
ＭＫＣｌ、４７ｍＭＴｒｉｓ、１７．１ｍＭＭｇＣｌ）および少なくとも
２つのプライマー・オリゴマー（少なくとも１つのプロモーター・プライマーお
よび第二のプライマー、通常、０．０８μＭ最終濃度）に懸濁し、そして不活性
油の層（２００μｌ）で覆い、蒸発を防いだ。混合物を４２℃で５分間インキュ
ベーションし、そしてその後、２５μｌの酵素試薬（５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１
ｍＭＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ^TMＸ−１００、１２０ｍＭＫ
Ｃｌ、２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む緩衝液中に、反応あたり２８００Ｕ
のＭＭＬＶ逆転写酵素および２０００ＵのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含む）を
添加した。混合物を穏やかに震蘯し、そしてさらに、４２℃で１時間インキュベ
ーションした。陰性対照は、すべて同一の試薬からなったが、標的核酸をまった
く含まない等体積の水または緩衝液を代用した。

【００３５】増幅されたマイコバクテリウム属配列は、ある場合では、実質的に先に記載さ
れるように（米国特許第５，６５８，７３７号、第２５欄、２７−４６行；Ｎ
ｅｌｓｏｎら，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：８４２９−８４３８の
８４３２）、適切な発光測定装置（例えばＬＥＡＤＥＲ^TM発光測定装置、Ｇｅｎ
−ＰｒｏｂｅＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）中
での化学発光によって検出されるアクリジニウムエステル（ＡＥ）標識化プロー
ブを用いて検出し、そして相対光単位（ＲＬＵ）で表した。一般的に、複製アッ
セイで検出されたＲＬＵの平均を報告する。プローブは：ヒト型結核菌検出では
、配列番号３９（ＧＴＣＴＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＧＣＴＴＴＡＧ）、鳥型
結核菌検出では、配列番号４０（ＧＧＡＣＣＴＣＡＡＧＡＣＧＣＡＴＧＴＣ）、
Ｍ・ゼノパイ検出では、配列番号４１（ＴＡＧＧＡＣＣＡＴＴＣＴＧＣＧＣＡＴ
ＧＴＧ）、そしてＭ・ガストリおよびＭ・カンサシでは、配列番号４２（ＴＡＧ
ＧＡＣＣＡＣＴＴＧＧＣＧＣＡＴＧＣＣ）であった。

【００３６】他の場合では、増幅された配列は、先に詳細に記載されるように（Ａ．Ｔｒ
ｏｅｓｃｈら，１９９９，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７
（１）：４９−５５）、マイコバクテリウム属配列の検出に特異的なＤＮＡプロ
ーブの固定化アレイ上で検出した。解析は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ^TM機器系（Ａｆｆ
ｙｍｅｔｒｉｘ、カリフォルニア州サンタクララ）上で行い、ハイブリダイゼー
ションアレイ上の蛍光シグナル（相対蛍光単位またはＲＦＵとして表す）の強度
およびパターンを検出した。この系は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ^TM流体光学ステーショ
ンおよびＧｅｎｅＡｒｒａｙ^TMスキャナー（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、
カリフォルニア州パロアルト）、およびヌクレオチド・ベースコーリング（ｂａ
ｓｅｃａｌｌｉｎｇ）を決定し、そして増幅された核酸に存在する核酸配列を
決定するアルゴリズムであるＧｅｎｅＣｈｉｐ^TM解析ソフトウェアを含む。該系
は、存在する可能性が最も高いマイコバクテリウム属種の報告を作成する。

【００３７】以下の限定されない実施例は、本発明の好ましい態様の側面を明らかにする。

【００３８】

【実施例】実施例１異なるプライマーの組み合わせを用いたヒト型結核菌ｒＲＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ増幅上述の増幅および標識化プローブ検出を用いて、転写仲介増幅の効率を、Ｔ７
プロモーター・プライマーおよび第二のプライマーの異なる組み合わせを用いて
試験した。これらのアッセイの標的配列は、ｉｎｖｉｔｒｏ増幅反応あたり、
１０²、１０³または１０⁶コピーで提供される、ヒト型結核菌ｒＲＮＡ配列の合
成転写物であった。増幅は、検出されたＲＬＵに基づいて評価した。表１は、提
供される標的コピー量に関して、増幅オリゴヌクレオチドのこれらの組み合わせ
で得られる結果を示し、標的コピー量は、示される各ＲＬＵ結果に関して括弧内
に示される。各結果は、単一アッセイに相当する。

【００３９】表１ヒト型結核菌ｒＲＮＡ（１０²、１０³または１０⁶コピー／反応）増幅後に検
出されたＲＬＵ

【００４０】

【表１】

【００４１】５ｘ１０⁴以上のＲＬＵシグナルは陽性とみなす。したがって、これらの結果
は、反応に存在する標的が１０²コピーと同程度に少なくても、プロモーター・
プライマーおよびプライマーの試験した組み合わせがすべて、標的マイコバクテ
リウム属配列を増幅したことを示す。

【００４２】実施例２プライマーの組み合わせを用いたマイコバクテリウム属種のｉｎｖｉｔｒｏ増幅上述および実施例１と同様の増幅および検出法を用いて、多様な組み合わせの
Ｔ７プロモーター・プライマーおよび非Ｔ７の第二のプライマーを、多様なマイ
コバクテリウム属種（ヒト型結核菌、ウシ型結核菌、鳥型結核菌、Ｍ・ガストリ
、Ｍ・イントラセルラレ、Ｍ・スクロフラセウム、Ｍ・ゼノパイおよびＭ・カン
サシ）から単離された標的１６ＳｒＲＮＡを用いて試験した。細菌は、アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）
または「ＤＳＭ」カルチャー・コレクションから得て（寄託番号に関しては、表
２を参照されたい）、そして標準的微生物学法を用いて、ｉｎｖｉｔｒｏで増
殖させた。

【００４３】実験の一組では、反応あたり約１０⁴の溶解細菌（反応あたり約１０⁷コピーの
ｒＲＮＡと均等）を用いて、標的捕捉および増幅反応を行った。増幅反応は、配
列番号１１のＴ７プロモーター・プライマーおよび配列番号１６の非Ｔ７の第二
のプライマーを用いた。各種の標的の増幅産物に関して得られたＲＬＵ結果を表
２に示す。これらの結果は、２つのプライマー配列の単一の組み合わせが、マイ
コバクテリウム属の多くの種（各種の供給源参考文献番号を括弧内に示す）から
１６ＳｒＲＮＡ標的配列を増幅することが可能であることを示す。５ｘ１０⁴
以上のＲＬＵ結果を陽性とみなす。

【００４４】表２配列番号１１および配列番号１６を用いて増幅されるマイコバクテリウム属種標的配列に関して検出されたＲＬＵ

【００４５】

【表２】

【００４６】本発明のプライマーが、ｉｎｖｉｔｒｏの増幅に関して種限定でないことを
さらに立証するため、Ｔ７プロモーター・プライマーおよび非Ｔ７の第二のプラ
イマーのさらなる組み合わせを、同様に、しかし反応あたり、異なる量の標的を
用いて試験した。これらのアッセイでは、Ｔ７プロモーター・プライマーは、配
列番号１１の配列を有し、そして配列番号１３、配列番号１７、配列番号１８、
配列番号１９または配列番号２０の配列を有する第二のプライマーと組み合わせ
た。結果を表３に示す。これらの結果は、異なる組み合わせのプロモーター・プ
ライマーおよび第二のプライマーもまた、多様なマイコバクテリウム属種から１
６ＳｒＲＮＡ配列を増幅することが可能であることを示す。

【００４７】表３配列番号１１および異なる第二のプライマーを用いて増幅されたマイコバクテリウム属種標的配列に関して検出されたＲＬＵ

【００４８】

【表３】

【００４９】実施例３異なる非Ｔ７の第二のプライマーを用いたマイコバクテリウム属種のｉｎｖｉｔｒｏ増幅およびプローブアレイを用いた種の検出本実施例は、配列番号１１の配列を有するＴ７プロモーター・プライマーと組
み合わせて用いた、他の非Ｔ７の第二のプライマーもまた、多様なマイコバクテ
リウム属種由来の１６ＳｒＲＮＡ配列を増幅することが可能であることを示す
。これらの実験において、増幅効率は、実施例１および２におけるように、ＡＥ
標識化プローブを用いることによって測定した。さらに、実質的にＰＣＴ国際特
許出願第ＰＣＴ／ＦＲ９９／０１４６９号に記載されるような方法を用いて、こ
れらの増幅反応から増幅された核酸を切断し、そしてｉｎｖｉｔｒｏで蛍光標
識した。その後、実質的に上述のように（Ｔｒｏｅｓｃｈら，１９９９，Ｊ
．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７９１）：４９−５５）、マイコバ
クテリウム属１６ＳｒＲＮＡに存在する配列に結合する配列特異的プローブの
アレイを含むＧｅｎｅＣｈｉｐ^TM（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に、増幅され標識さ
れた核酸を接触させた。プローブアレイ上のハイブリダイズした標識化断片を洗
浄し、非ハイブリダイズ核酸および混入物質を除去し、そしてハイブリダイズし
た核酸を、アレイ上のプローブ配列に対応するパターンの蛍光シグナルとして検
出し、このシグナルを「ベースコーリング」と称した。この方法を用いて、増幅
された核酸に表されるマイコバクテリウム属の種を同定した。これらのアッセイ
において、提供される標的ｒＲＮＡの供給源は既知であるため、標的種に関する
正しいベースコーリングの割合を、増幅された核酸の増幅および検出の正確さの
測定値として報告した。

【００５０】これらの試験の累積結果を表４に示す。これらの結果は、プライマーのさらな
る組み合わせが、異なるマイコバクテリウム属種から得た１６ＳｒＲＮＡ標的
を増幅することが可能であり、そしてその後、ハイブリダイゼーション複合体の
累積パターンが、標的配列の供給源を決定するように、プローブアレイ上の増幅
された核酸を検出することによって同定することが可能であることを示す。

【００５１】表４

【００５２】

【表４】

【００５３】別個の実験において、ＴＭＡによる増幅を、標的（０、１０、１００および１
０００コピーのヒト型結核菌１６ＳｒＲＮＡ標的配列）および増幅混合物中で
用いられる酵素の量（１５００ＵのＲＴに加えた２０００ＵのＴ７ＲＮＡポリ
メラーゼまたは各２０００ＵのＲＴおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ）を変化さ
せることによって試験した。増幅効率は、上述のように、ＡＥ標識化プローブの
結合を検出することによって監視した。これらの条件下で、陰性対照（単位複製
配列０コピー）は、バックグラウンドレベルのシグナル（約２０００−３０００
ＲＬＵ）を生じ、一方、標的含有増幅混合物はすべて、有意により高いシグナル
（４ｘ１０⁵から５ｘ１０⁶ＲＬＵ）を生じた。わずか１０コピーの標的配列しか
含まない試料では、各２０００ＵのＲＴおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含む
反応混合物は、１５００ＵのＲＴに加えて２０００ＵのＴ７ＲＮＡポリメラー
ゼを含む反応混合物で見られる（４ｘ１０⁵ＲＬＵ）より、幾分高い検出可能レ
ベルの増幅された産物（１．３ｘ１０⁶ＲＬＵ、５反応の平均）を提供した。標
的配列１００または１０００コピーを含む試料では、増幅された産物の検出可能
レベルは、試験した酵素濃度のどちらの濃度に関しても、実質的に均等であった
（４−５ｘ１０⁶ＲＬＵ）。

【００５４】実施例４修飾プライマーを用いたマイコバクテリウム属１６ＳｒＲＮＡの増幅Ｍ・ゼノパイ由来の１６ＳｒＲＮＡ標的配列のｉｎｖｉｔｒｏ核酸増幅の
効率を改善するため、非Ｔ７の第二の増幅プライマーを修飾し、修飾「Ｋ塩基」
（Ｌｉｎ＆Ｂｒｏｗｎ，１９９２，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅ
ｓ．２０：５１４９−５１５２）を含むようにした。最初に、用いた修飾プラ
イマーは、２５番目の残基がＫ塩基であるように修飾された配列番号１６のもの
（配列番号３８）であり、そして標的は、ヒト型結核菌１６ＳｒＲＮＡであっ
た。この修飾された非Ｔ７プライマー・オリゴヌクレオチドは、表５の結果によ
って示されるように、反応中に１０⁶コピーの１６ＳｒＲＮＡ標的配列が存在
する場合、Ｍ・ゼノパイ標的の増幅において有意な改善を生じた。表５は、ＡＥ
標識化プローブを用いて、上述のように検出される増幅産物に関して検出される
平均ＲＬＵを示す。増幅反応は、配列番号８および配列番号１６または配列番号
８および配列番号３８のプライマーの組み合わせを用いて、異なる標的配列各々
に関し、実質的に上述のように行い、後者は、上述のＫ塩基修飾を含むプライマ
ーであった。結果は、ヒト型結核菌標的配列（反応あたり１０³コピー）では４
つの増幅反応の平均であり、そしてＭ・ゼノパイ標的配列（反応あたり１０⁶コ
ピー）では６つの増幅反応の平均である。陰性対照は、標的核酸の代わりに水を
含んだ。

【００５５】表５の結果は、修飾Ｋ塩基残基を含むプライマーが、修飾塩基を含まない同様
のプライマー配列に比較した際、標的配列のｉｎｖｉｔｒｏ増幅効率を増加さ
せることが可能であることを示す。

【００５６】表５修飾または非修飾プライマーを用いて、異なる標的に関して検出された単位複製配列（平均ＲＬＵ）

【００５７】

【表５】

【００５８】実施例５マイコバクテリウム属特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅本実施例は、ＰＣＲ増幅および固定化プローブのアレイ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ^TM ）を有する固体支持体上の増幅されたＤＮＡの検出に用いられる際の、本発明の
プライマーの特異性を示す。標的調製のため、ヒト型結核菌（ＡＴＣＣ２７２
９４）およびＭ・ゼノパイ（ＡＴＣＣ１９２５０）株を、標準的微生物学法を
用いてｉｎｖｉｔｒｏで増殖させた。細菌ストック懸濁物を水中で作成し、そ
して１ｍｌあたり約６ｘ１０⁸細菌の濃度に調整し、そして水中の連続希釈を作
成して１μｌあたり１０⁴細菌の溶液（１μｌあたり１０⁴コピーの細菌ＤＮＡと
均等）を産生し、これをその後、９５℃で１５分間加熱した。増幅用に、陰性対
照として滅菌水を用いた。

【００５９】５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭＭｇＣ
ｌ２、０．００１％（重量／体積）ゼラチン、５％（体積／体積）ジメチルスル
ホキシド、反応あたりのプライマー対での各０．３３μＭのプライマー、各２０
０μＭのｄＮＴＰ、および０．７５ＵのＴａｑポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ ^TM ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、コネティカット州ノーウォーク）を含む個々の
４５μｌ反応を用いて、マイクロタイター９６ウェルプレート中で、ＰＣＲ増幅
を行った。熱周期は、９４℃５分間の最初の変性工程、その後、９４℃１分間、
５５℃１分間および７２℃１分間の３０周期、並びに７２℃１０分間の最終周期
で、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ９６００^TMサーマルサイクラー中で行った。

【００６０】ＰＣＲ増幅後、増幅された産物をアガロースゲル電気泳動によって解析し、大
きさ約３００ｎｔのＤＮＡバンドの存在または非存在を検出した。プライマーの
いずれの組み合わせでも、陰性対照（標的ＤＮＡの代わりに水）のゲル上には、
バンドは見られなかった。配列番号１１および配列番号１６を有するプライマー
の組み合わせでは、ヒト型結核菌が標的であるとき、増幅されたＤＮＡのバンド
が見られたが、Ｍ・ゼノパイが提供される標的ＤＮＡであるとき、バンドは見ら
れなかった。対照的に、配列番号１１および配列番号３７、または配列番号１１
および配列番号３０を有するプライマーを用いると、ヒト型結核菌が標的である
とき、増幅されたＤＮＡのバンドは見られなかったが、Ｍ・ゼノパイが提供され
る標的ＤＮＡであるとき、期待されるバンドが見られた。

【００６１】次に、実質的に先に記載されるように（Ｔｒｏｅｓｃｈら，１９９９，Ｊ
．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７（１）：４９−５５，１９９
９）、二次元アレイ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ^TM）において、付着する配列特異的プロ
ーブを有する固体支持体上で、ＰＣＲ反応の増幅産物を検出した。検出のため、
各々、およそ５０ｎｇのＰＣＲ産物；２０ＵのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）；４０ｍＭＴｒｉｓアセテート（ｐＨ８．１）；１００ｍＭＭ
ｇ（アセテート）₂；１０ｍＭジチオスレイトール；各１．２５ｍＭのＡＴＰ
、ＣＴＰ、およびＧＴＰ；０．５ｍＭＵＴＰ；並びに０．２５ｍＭフルオレ
セイン−ＵＴＰを含むｉｎｖｉｔｒｏ転写反応（２０μｌ）によって標識化一
本鎖ＲＮＡ標的を生成するのに、プロモーター−タグ化ＰＣＲ単位複製配列を用
いた。転写反応を、３７℃で１時間インキュベーションし、そしてその後、標識
化ＲＮＡをプローブアレイにハイブリダイズさせ、そして記載されるように（Ｔ
ｒｏｅｓｃｈら、上記）、解析した。

【００６２】ハイブリダイゼーションのため、５μｌの標識化ＲＮＡ標的を７００μｌのハ
イブリダイゼーション緩衝液（０．９０ＭＮａＣｌ、６０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄ 、６ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、および０．０５％（体積／体積）Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ−１００）中で希釈し、プローブアレイに適用し、そして４５℃で３０分
間インキュベーションした。その後、プローブアレイを３ｘＳＳＰＥ（０．４５
ＭＮａＣｌ、３０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、３ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）およ
び０．００５％（体積／体積）Ｔｒｉｔｏｎ^TMＸ−１００中、３０℃で２回洗浄
し、そしてアレイに結合した標識化ＲＮＡによって放出される蛍光シグナルを検
出した。検出されたシグナル強度（平均、中央値および最大ＲＦＵ）、ヌクレオ
チド・ベースコーリング（ベースコーリング％）および配列決定は、アルゴリズ
ム（ＧｅｎｅＣｈｉｐ^TMソフトウェア、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて生成し
た。候補選択指標は、実験で得られた配列およびアレイ上に存在する参照配列間
の相同性パーセントによって決定した。結果を表６に示す。

【００６３】表６

【００６４】

【表６】

【００６５】これらの結果は、増幅プライマーが、意図される標的ＤＮＡを効率的にそして
特異的に増幅したことを示す。さらに、増幅された配列は、プローブハイブリダ
イゼーションアッセイに用いて、単位複製配列が産生される核酸の供給源を検出
してそして同定することが可能であった。

【００６６】実施例６プライマーの組み合わせを用いた、多くのマイコバクテリウム属種１６ＳｒＲＮＡ配列の増幅本実施例は、ＴＭＡ増幅および多数の固定化配列特異的プローブのアレイ（Ｇ
ｅｎｅＣｈｉｐ^TM）を有する固体支持体上の検出に用いた際の、本発明のプライ
マーの特異性を示す。試料調製のための条件は、標的捕捉溶液が、５ｐｍｏｌの
配列番号３５を含み、粒子洗浄緩衝液が、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１ｍＭＥＤ
ＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌおよび０．１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウム
、ｐＨ７．５であったのを除き、典型的なアッセイに関して上述されるのと実質
的に同一であった。洗浄された粒子を、２５μｌの滅菌水に再懸濁した。

【００６７】増幅条件は以下のとおりであった。水中の粒子に５０μｌの増幅試薬溶液（１
．６ｍＭｒＵＴＰ、４ｍＭｒＣＴＰ、６ｍＭｒＡＴＰ、１０ｍＭｒＧＴ
Ｐ、各１ｍＭのｄＮＴＰ、８０ｍＭＴｒｉｓ、３５ｍＭＫＣｌおよび２５．
６ｍＭＭｇＣｌ₂）および反応あたり各々０．０８μＭの濃度の３つのプライ
マー（配列番号１１、配列番号１６、配列番号３７）を添加した。溶液を混合し
、そして２００μｌの不活性油で覆い、蒸発を防いだ。増幅混合物を６０℃で１
０分間、その後４２℃で５分間インキュベーションし、そして２５μｌの酵素試
薬を添加した（２０００Ｕの逆転写酵素および２０００ＵのＴ７ポリメラーゼ）
。混合物を穏やかに震蘯し、そして４２℃で１時間、さらにインキュベーション
した。

【００６８】増幅されたマイコバクテリウム属配列を切断し、そして実施例３に記載される
ように蛍光標識し、そして実施例６に記載されるようなＤＮＡプローブアレイ上
で検出した。多くのマイコバクテリウム属種に関する結果を表７に要約する（ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、米国バージニア州マ
ナサス）供給源番号は、種名の後の括弧内に示す）。試験した各種に関し、結果
は、ＤＮＡプローブチップ上のベースコーリング（すなわち特定の種に関する正
しいベースコーリング％）に基づいて同定された種として示され、そして検出さ
れたシグナルの平均シグナル強度（平均相対蛍光単位またはＲＦＵ）を示す。

【００６９】表７プライマーの単一の組み合わせを用いた、多くのマイコバクテリウム属種の増幅および検出

【００７０】

【表７】

【００７１】

【００７２】これらの結果は、単一の組み合わせのプライマーが、多くのマイコバクテリウ
ム属種由来の１６ＳｒＲＮＡ配列を効果的に増幅し、単一のアッセイを用いて
、多くの異なる種の存在を検出するのに用いられる、比較的単純な方法を可能に
することを示す。ＧｅｎｅＣｈｉｐ^TM上に存在するＤＮＡプローブアレイなどの
、多くの種に特異的なプローブを使用する検出法と組み合わせると、該アッセイ
を用いて、生物学的試料に存在する多くの異なる種を同定することが可能である
。

【００７３】本発明の範囲は、本明細書中の請求項およびその均等物すべてによって定義さ
れる。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ジュッカー，マーカス・ティーアメリカ合衆国カリフォルニア州92064，ポーウェイ，ロス・オリヴォス・アヴェニュー 13514 (72)発明者デルガド，フランシスコ・ディーアメリカ合衆国カリフォルニア州92024，エンチニタス，ワンダリング・ロード 2147 (72)発明者クレウズィアット，フィリップフランス国エフ−69003 リヨン，リュー・ドゥ・レスペラーンス 16 (72)発明者ロドリーグ，マルクフランス国エフ−69570 ダルデリー，シュマン・ドゥ・ガルガンテュアＦターム(参考） 4B024 AA13 CA02 CA09 CA12 CA20 HA11 HA13 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ06 QQ50 QQ54 QR08 QR32 QR35 QR39 QR42 QR56 QR62 QR82 QR84 QS12 QS16 QS25 QS34 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】生物学的試料に存在するマイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種を検出する方法であって：マイコバクテリウム属１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）またはマイコバク
テリウム属１６ＳリボソームｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含む、少なくとも１
つのマイコバクテリウム属種由来の核酸を含む生物学的試料を提供し；少なくとも１つのポリメラーゼ活性、並びに配列番号１から配列番号３４、配
列番号３７および配列番号３８からなる群より選択される配列を有する、少なく
とも２つのプライマーを含む、ｉｎｖｉｔｒｏ核酸増幅混合物中で、マイコバ
クテリウム属１６ＳｒＲＮＡまたはＤＮＡを増幅して、増幅されたマイコバク
テリウム属核酸を産生し；そして増幅されたマイコバクテリウム属核酸と関連する標識を検出することによって
、増幅されたマイコバクテリウム属核酸を検出する工程を含む、前記方法。
【請求項２】増幅工程前に：ハイブリダイゼーション条件下で、マイコバクテリウム属１６ＳｒＲＮＡに
特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチド、および
捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする固定化核酸を、生物学的試料に添
加して、ハイブリダイゼーション複合体を産生し；そして生物学的試料の他の構成要素から、ハイブリダイゼーション複合体を分離する
工程をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】増幅工程が、ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓ）またはヒト型結核菌以外のマイコバクテリウム属（ＭＯＴＴ）種の１６ＳｒＲＮＡまたはＤＮＡを増幅する、請求項１または請求項２の方法。
【請求項４】増幅工程が、カメ結核菌（Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、
アフリカ菌（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、Ｍ・アシアティクム（Ｍ．ａｓｉ
ａｔｉｃｕｍ）、鳥型結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏ
ｖｉｓ）、Ｍ・セラツム（Ｍ．ｃｅｌａｔｕｍ）、Ｍ・ケロネ（Ｍ．ｃｈｅ
ｌｏｎａｅ）、Ｍ・フラベセンス（Ｍ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、Ｍ・フォル
ツイツム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、Ｍ・ガストリ（Ｍ．ｇａｓｔｒｉ）
、Ｍ・ゴルドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｍ・ヘモフィルム（Ｍ．ｈａｅ
ｍｏｐｈｉｌｕｍ）、Ｍ・イントラセルラレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａ
ｒｅ）、Ｍ・インテルジェクツム（Ｍ．ｉｎｔｅｒｊｅｃｔｕｍ）、Ｍ・イン
テルメディウム（Ｍ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）、Ｍ・カンサシ（Ｍ．ｋａ
ｎｓａｓｉｉ）、Ｍ・マルモエンセ（Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ）、Ｍ・マリヌ
ム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）、Ｍ・ノンクロモジェニクム（Ｍ．ｎｏｎ−ｃｈ
ｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ）、パラ結核菌（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓ）、チモテ菌（Ｍ．ｐｈｌｅｉ）、Ｍ・スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒ
ｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、Ｍ・シモデイ（Ｍ．ｓｈｉｍｏｄｅｉ）、Ｍ・シミエ
（Ｍ．ｓｉｍｉａｅ）、スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、Ｍ・ツル
ガイ（Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ）、Ｍ・テレ（Ｍ．ｔｅｒｒａｅ）、Ｍ・トリビ
アレ（Ｍ．ｔｒｉｖｉａｌｅ）、ヒト型結核菌、Ｍ・ウルセランス（Ｍ．ｕ
ｌｃｅｒａｎｓ）またはＭ・ゼノパイ（Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ）の１６ＳｒＲＮ
ＡまたはＤＮＡを増幅する、請求項１の方法。
【請求項５】検出工程が、増幅されたマイコバクテリウム属核酸に特異
的にハイブリダイズする、少なくとも１つのプローブを用いる、請求項１の方法
。
【請求項６】検出工程が、増幅されたマイコバクテリウム属核酸に特異
的にハイブリダイズする、少なくとも１つの標識化プローブを用いる、請求項５
の方法。
【請求項７】検出工程が、増幅されたマイコバクテリウム属核酸に特異
的にハイブリダイズする、複数のプローブを用いる、請求項５の方法。
【請求項８】増幅工程が、少なくとも、第一のプライマーおよび第二の
プライマーの組み合わせを用い、第一のプライマーが、配列番号１から配列番号
１２からなる群より選択され、そして第二のプライマーが、配列番号１３から配
列番号３４、配列番号３７および配列番号３８からなる群より選択される、請求
項１の方法。
【請求項９】増幅工程が、少なくとも、第一のプライマーおよび第二の
プライマーの組み合わせを用い、第一のプライマーが、配列番号７から配列番号
１２からなる群より選択され、そして第二のプライマーが、配列番号１３から配
列番号３４、配列番号３７および配列番号３８からなる群より選択される、請求
項８の方法。
【請求項１０】増幅工程が、少なくとも、第一のプライマーおよび第二
のプライマーの組み合わせを用い第一のプライマーが配列番号７の配列を有し、そして第二のプライマーが配列
番号１３の配列を有するか；第一のプライマーが配列番号７の配列を有し、そして第二のプライマーが配列
番号１４の配列を有するか；第一のプライマーが配列番号７の配列を有し、そして第二のプライマーが配列
番号１５の配列を有するか；第一のプライマーが配列番号７の配列を有し、そして第二のプライマーが配列
番号１６の配列を有するか；第一のプライマーが配列番号８の配列を有し、そして第二のプライマーが配列
番号１３の配列を有するか；第一のプライマーが配列番号８の配列を有し、そして第二のプライマーが配列
番号１４の配列を有するか；第一のプライマーが配列番号８の配列を有し、そして第二のプライマーが配列
番号１５の配列を有するか；第一のプライマーが配列番号９の配列を有し、そして第二のプライマーが配列
番号１３の配列を有するか；第一のプライマーが配列番号９の配列を有し、そして第二のプライマーが配列
番号１４の配列を有するか；第一のプライマーが配列番号９の配列を有し、そして第二のプライマーが配列
番号１５の配列を有するか；第一のプライマーが配列番号１０の配列を有し、そして第二のプライマーが配
列番号１６の配列を有するか；第一のプライマーが配列番号１１の配列を有し、そして第二のプライマーが配
列番号１３の配列を有するか；第一のプライマーが配列番号１１の配列を有し、そして第二のプライマーが配
列番号１６の配列を有するか；第一のプライマーが配列番号１１の配列を有し、そして第二のプライマーが配
列番号１７の配列を有するか；第一のプライマーが配列番号１１の配列を有し、そして第二のプライマーが配
列番号１８の配列を有するか；第一のプライマーが配列番号１１の配列を有し、そして第二のプライマーが配
列番号１９の配列を有するか；第一のプライマーが配列番号１１の配列を有し、そして第二のプライマーが配
列番号２０の配列を有するか；または第一のプライマーが配列番号１２の配列を有し、そして第二のプライマーが配
列番号１５の配列を有する請求項８の方法。
【請求項１１】増幅工程が、少なくとも、第一のプライマーおよび第二
のプライマーの組み合わせを用い、第一のプライマーが配列番号１１の配列を有
し、そして第二のプライマーが配列番号１６、配列番号３０または配列番号３７
の配列を有する、請求項８の方法。
【請求項１２】増幅工程が、配列番号１１の配列を有する第一のプライ
マー、および２つの第二のプライマーの組み合わせを用い、一方の第二のプライ
マーが配列番号１６の配列を有し、そして他方の第二のプライマーが配列番号３
７の配列を有する、請求項８の方法。
【請求項１３】ｉｎｖｉｔｒｏ増幅反応において、マイコバクテリウ
ム属１６ＳｒＲＮＡ配列またはマイコバクテリウム属１６ＳｒＲＮＡをコー
ドするＤＮＡを増幅するための組成物であって、配列番号１から配列番号３４、
配列番号３７および配列番号３８からなる群より選択される塩基配列を有する１
以上のオリゴヌクレオチドを含む、前記組成物。
【請求項１４】請求項１３の組成物であって：配列番号１から配列番号１２のいずれか１つの配列を含む、少なくとも１つの
第一のオリゴヌクレオチド、および配列番号１３から配列番号３４、配列番号３７または配列番号３８のいずれか
１つの配列を含む、少なくとも１つの第二のオリゴヌクレオチドを含む、前記組成物。
【請求項１５】請求項１３の組成物であって：配列番号７から配列番号１２のいずれか１つの配列を含む、少なくとも１つの
第一のオリゴヌクレオチド、および配列番号１３から配列番号３４、配列番号３７または配列番号３８のいずれか
１つの配列を含む、少なくとも１つの第二のオリゴヌクレオチドを含む、前記組成物。
【請求項１６】請求項１３から１５のいずれか１つに記載のオリゴヌク
レオチドのいずれかを含む、キット。