JPH06209799A - 鳥型結核菌、ミコバクテリウム・イントラセルレアおよびパラ結核菌に対するプローブ - Google Patents
鳥型結核菌、ミコバクテリウム・イントラセルレアおよびパラ結核菌に対するプローブInfo
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- JPH06209799A JPH06209799A JP5278622A JP27862293A JPH06209799A JP H06209799 A JPH06209799 A JP H06209799A JP 5278622 A JP5278622 A JP 5278622A JP 27862293 A JP27862293 A JP 27862293A JP H06209799 A JPH06209799 A JP H06209799A
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- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、鳥型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、ミコバクテリウム・イントラ
セルレア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒｅ）およびパラ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｕｃｕｌｏｓｉｓ）
の配列を検出し、増幅し、そして単離するための方法お
よび核酸プローブを提供する。 【構成】 本発明のプローブは、鳥型結核菌か、Ｍ．イ
ントラセルレアか若しくはパラ結核菌かまたはそれらの
任意の組合わせに位置することができる。本発明のプロ
ーブは独特であるので、他の微生物からの核酸に対する
クロスハイブリダイセーションは存在しない。
ｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、ミコバクテリウム・イントラ
セルレア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒｅ）およびパラ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｕｃｕｌｏｓｉｓ）
の配列を検出し、増幅し、そして単離するための方法お
よび核酸プローブを提供する。 【構成】 本発明のプローブは、鳥型結核菌か、Ｍ．イ
ントラセルレアか若しくはパラ結核菌かまたはそれらの
任意の組合わせに位置することができる。本発明のプロ
ーブは独特であるので、他の微生物からの核酸に対する
クロスハイブリダイセーションは存在しない。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、分子生物学の分野に関
する。詳しくは、本発明は、核酸プローブを必要とする
診断に関する。更に詳しくは、本発明は、鳥型結核菌、
ミコバクテリウム・イントラセルレアおよびパラ結核菌
を検出し、増幅し、そして単離するための核酸プローブ
に関する。
する。詳しくは、本発明は、核酸プローブを必要とする
診断に関する。更に詳しくは、本発明は、鳥型結核菌、
ミコバクテリウム・イントラセルレアおよびパラ結核菌
を検出し、増幅し、そして単離するための核酸プローブ
に関する。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】健康管理提供者は、ミ
コバクテリア感染の症例が有意に増大していることに遭
遇している。これらの新規の症例の多くはエイズ（ＡＩ
ＤＳ）の流行に関係している。医師は、ミコバクテリア
感染を診断する場合に彼等を助ける臨床微生物学者を信
頼している。このような感染の診断は、しかしながら、
微生物の抗酸性染色および培養に続く生化学的検定に大
きく依存している。これらは時間のかかる方法である。
したがって、ミコバクテリア感染を診断する新規の、特
に迅速な方法に対する要求が引続き存在している。
コバクテリア感染の症例が有意に増大していることに遭
遇している。これらの新規の症例の多くはエイズ（ＡＩ
ＤＳ）の流行に関係している。医師は、ミコバクテリア
感染を診断する場合に彼等を助ける臨床微生物学者を信
頼している。このような感染の診断は、しかしながら、
微生物の抗酸性染色および培養に続く生化学的検定に大
きく依存している。これらは時間のかかる方法である。
したがって、ミコバクテリア感染を診断する新規の、特
に迅速な方法に対する要求が引続き存在している。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明は、鳥型結核菌、
ミコバクテリウム・イントラセルレアおよびパラ結核菌
を検出し、増幅し、そして単離するための決定的で迅速
且つ原価効率のよい核酸プローブ並びに方法を提供す
る。本発明は、更に、鳥型結核菌、Ｍ．イントラセルレ
アおよびパラ結核菌の配列を単離する方法を提供する。
更に、本発明のプローブは、それらがハイブリッド形成
する配列の増幅に有用である。
ミコバクテリウム・イントラセルレアおよびパラ結核菌
を検出し、増幅し、そして単離するための決定的で迅速
且つ原価効率のよい核酸プローブ並びに方法を提供す
る。本発明は、更に、鳥型結核菌、Ｍ．イントラセルレ
アおよびパラ結核菌の配列を単離する方法を提供する。
更に、本発明のプローブは、それらがハイブリッド形成
する配列の増幅に有用である。
【０００４】本発明のプローブは、更に、それらがコー
ドするアミノ酸配列および該配列を認識するのに生じた
抗体を構築するのに用いることができる。
ドするアミノ酸配列および該配列を認識するのに生じた
抗体を構築するのに用いることができる。
【０００５】本発明のプローブは、配列番号１〜１５の
核酸配列から本質的に成る。プローブは、鳥型結核菌
か、Ｍ．イントラセルレアか若しくはパラ結核菌かまた
はそれらの任意の組合わせに位置することができる。本
発明のプローブは独特であるので、他の微生物からの核
酸に対するクロスハイブリダイセーションは存在しな
い。
核酸配列から本質的に成る。プローブは、鳥型結核菌
か、Ｍ．イントラセルレアか若しくはパラ結核菌かまた
はそれらの任意の組合わせに位置することができる。本
発明のプローブは独特であるので、他の微生物からの核
酸に対するクロスハイブリダイセーションは存在しな
い。
【０００６】本発明において記載したプローブ配列は、
フリーズ（Ｆｒｉｅｓ）ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ Ｐ
ｒｏｂｅｓ ４：８７（１９９０）によって最初に定義
されたプラスミドｐＭａｖ２９由来である。プラスミド
ｐＭａｖ２９は、Ｍ．イントラセルレアおよび鳥型結核
菌に対して交差反応性であったが、ウシ型結核菌（Ｍ．
ｂｏｖｉｓ）に対する交差反応性は更に強く、そしてヒ
ト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に対する
交差反応性は更に弱かった。本発明において記載したプ
ローブは、Ｍ．イントラセルレア、鳥型結核菌およびパ
ラ結核菌に対してのみ特異的交差反応性が観察されるの
で、フリーズらによって記載されたものにまさる実質的
な改良を提供する。結果として、これらのプローブは、
現在のところミコバクテリア学研究室における病原性単
離物の約２０％を含むＭ．イントラセルレアおよび鳥型
結核菌複合感染の臨床的診断に有用である（グッド（Ｇ
ｏｏｄ），Ｒ．Ｅ．ら（１９８２）Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄ
ｉｓ．１４６：８２９〜３３）。診断は、推定上３０〜
５０％がＭ．イントラセルレアまたは鳥型結核菌同時感
染を発現するＨＩＶ感染の処置において重要になってい
る（モリス（Ｍｏｒｒｉｓ），Ｓ．Ｃ．ら（１９９１）
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：２７１５〜
１９）。本発明のプローブは、更に、クローン病に関与
し（ウェイン（Ｗａｙｎｅ），Ｌ．Ｇ．ら（１９９２）
Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５：１〜２
５）且つヨーネ病（獣医学）の病因物質として同定され
た（バークレイ（Ｂａｒｃｌａｙ）ら（１９８５）Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｇｙ １６４：８９６〜９０３）パ
ラ結核菌感染の診断に有用である。
フリーズ（Ｆｒｉｅｓ）ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ Ｐ
ｒｏｂｅｓ ４：８７（１９９０）によって最初に定義
されたプラスミドｐＭａｖ２９由来である。プラスミド
ｐＭａｖ２９は、Ｍ．イントラセルレアおよび鳥型結核
菌に対して交差反応性であったが、ウシ型結核菌（Ｍ．
ｂｏｖｉｓ）に対する交差反応性は更に強く、そしてヒ
ト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に対する
交差反応性は更に弱かった。本発明において記載したプ
ローブは、Ｍ．イントラセルレア、鳥型結核菌およびパ
ラ結核菌に対してのみ特異的交差反応性が観察されるの
で、フリーズらによって記載されたものにまさる実質的
な改良を提供する。結果として、これらのプローブは、
現在のところミコバクテリア学研究室における病原性単
離物の約２０％を含むＭ．イントラセルレアおよび鳥型
結核菌複合感染の臨床的診断に有用である（グッド（Ｇ
ｏｏｄ），Ｒ．Ｅ．ら（１９８２）Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄ
ｉｓ．１４６：８２９〜３３）。診断は、推定上３０〜
５０％がＭ．イントラセルレアまたは鳥型結核菌同時感
染を発現するＨＩＶ感染の処置において重要になってい
る（モリス（Ｍｏｒｒｉｓ），Ｓ．Ｃ．ら（１９９１）
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：２７１５〜
１９）。本発明のプローブは、更に、クローン病に関与
し（ウェイン（Ｗａｙｎｅ），Ｌ．Ｇ．ら（１９９２）
Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５：１〜２
５）且つヨーネ病（獣医学）の病因物質として同定され
た（バークレイ（Ｂａｒｃｌａｙ）ら（１９８５）Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｇｙ １６４：８９６〜９０３）パ
ラ結核菌感染の診断に有用である。
【０００７】本発明は、配列番号１〜１５並びにそれら
の修飾主鎖（修飾糖およびリン酸基（例えば、チオホス
フェート）を含む）、修飾ヌクレオチド、標識型および
リボ核酸型から本質的に成る配列を有するプローブを提
供する。
の修飾主鎖（修飾糖およびリン酸基（例えば、チオホス
フェート）を含む）、修飾ヌクレオチド、標識型および
リボ核酸型から本質的に成る配列を有するプローブを提
供する。
【０００８】配列番号１〜１５およびそれらのリボ核酸
型から本質的に成る配列より選択される１種類またはそ
れ以上の核酸配列の使用を含む、鳥型結核菌、ミコバク
テリウム・イントラセルレアおよびパラ結核菌を増幅す
る方法を更に提供する。
型から本質的に成る配列より選択される１種類またはそ
れ以上の核酸配列の使用を含む、鳥型結核菌、ミコバク
テリウム・イントラセルレアおよびパラ結核菌を増幅す
る方法を更に提供する。
【０００９】更に、配列番号１〜１５並びにそれらの修
飾主鎖、修飾ヌクレオチド、標識型およびリボ核酸型か
ら本質的に成る配列より選択される１種類またはそれ以
上の配列の使用を含む、鳥型結核菌、ミコバクテリウム
・イントラセルレアおよびパラ結核菌を増幅し且つ該増
幅生成物を検出する方法を提供する。
飾主鎖、修飾ヌクレオチド、標識型およびリボ核酸型か
ら本質的に成る配列より選択される１種類またはそれ以
上の配列の使用を含む、鳥型結核菌、ミコバクテリウム
・イントラセルレアおよびパラ結核菌を増幅し且つ該増
幅生成物を検出する方法を提供する。
【００１０】配列番号１〜１５並びにそれらの修飾主
鎖、修飾ヌクレオチド、標識型およびリボ核酸型から本
質的に成る配列より選択される核酸配列を含むキットを
更に提供する。
鎖、修飾ヌクレオチド、標識型およびリボ核酸型から本
質的に成る配列より選択される核酸配列を含むキットを
更に提供する。
【００１１】表１に本発明のプローブを示すが、そこで
それらはＭｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ４：８
７（１９９２）で同定されたクローンｐＭａｖ２９の領
域に対してハイブリッド形成する（左から右へ５′から
３′である）。
それらはＭｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ４：８
７（１９９２）で同定されたクローンｐＭａｖ２９の領
域に対してハイブリッド形成する（左から右へ５′から
３′である）。
【００１２】
【表１】 本発明のプローブは、該プローブに対してハイブリッド
形成する核酸配列を増幅するのに有用である。次に、こ
れらの核酸配列をクローン化し且つ用いて該核酸配列に
基づくタンパク質若しくはアミノ酸配列を発現すること
ができると考えられるしまたは化学的に合成することが
できる。次に、このアミノ酸配列を免疫原として用いて
抗体を生産することができる。遺伝コードの縮重（多数
のアミノ酸が２個以上のコドンによって選択される）の
ために、プローブ配列の変化は同一抗の体特異性を結果
として生じる。このような抗体は多クローン性抗体また
は単クローン性抗体でありうる。
形成する核酸配列を増幅するのに有用である。次に、こ
れらの核酸配列をクローン化し且つ用いて該核酸配列に
基づくタンパク質若しくはアミノ酸配列を発現すること
ができると考えられるしまたは化学的に合成することが
できる。次に、このアミノ酸配列を免疫原として用いて
抗体を生産することができる。遺伝コードの縮重（多数
のアミノ酸が２個以上のコドンによって選択される）の
ために、プローブ配列の変化は同一抗の体特異性を結果
として生じる。このような抗体は多クローン性抗体また
は単クローン性抗体でありうる。
【００１３】本発明のプローブはデオキシリボ核酸（Ｄ
ＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）でありうる。ＤＮＡは
プリン（アデニンおよびグアニン）およびピリミジン
（シトシンおよびチミン）に基づくヌクレオチドから成
り、アデニンはチミンに対して塩基対になり（相補的）
且つグアニンはシトシンに対して塩基対になる。ＲＮＡ
は、糖の相違（デオキシリボースの代わりにリボース）
およびチミンの代わりに存在する塩基ウラシルを除き、
ＤＮＡと同様である。更に、修飾ヌクレオチドを本発明
のプローブを構築するのに用いることができる。典型的
に、修飾ヌクレオチドは、一層の緊縮ハイブリダイセー
ション条件に耐えうる、より容易に検出しうる等のプロ
ーブを得るのに用いられる。好ましくは、プローブはＤ
ＮＡである。
ＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）でありうる。ＤＮＡは
プリン（アデニンおよびグアニン）およびピリミジン
（シトシンおよびチミン）に基づくヌクレオチドから成
り、アデニンはチミンに対して塩基対になり（相補的）
且つグアニンはシトシンに対して塩基対になる。ＲＮＡ
は、糖の相違（デオキシリボースの代わりにリボース）
およびチミンの代わりに存在する塩基ウラシルを除き、
ＤＮＡと同様である。更に、修飾ヌクレオチドを本発明
のプローブを構築するのに用いることができる。典型的
に、修飾ヌクレオチドは、一層の緊縮ハイブリダイセー
ション条件に耐えうる、より容易に検出しうる等のプロ
ーブを得るのに用いられる。好ましくは、プローブはＤ
ＮＡである。
【００１４】本発明は、種々の試料中における鳥型結核
菌、Ｍ．イントラセルレア、パラ結核菌、３種類全部ま
たはそれらの任意の組合わせの存在を検出することがで
きる。試料としては、臨床検体、例えば、洗浄、掻爬ま
たは生検などの標準的な技法によって得られた糞便材
料、血液、喀痰、唾液、尿、血小板試料、組織試料、固
定組織および組織培養単層を挙げることができる。ミコ
バクテリウム属の位置または形態は本発明にとって重要
ではなく、鳥型結核菌、Ｍ．イントラセルレア、パラ結
核菌またはそれらの組合わせを特異的に検出し、増幅し
または単離する能力が本発明にとって重要である。
菌、Ｍ．イントラセルレア、パラ結核菌、３種類全部ま
たはそれらの任意の組合わせの存在を検出することがで
きる。試料としては、臨床検体、例えば、洗浄、掻爬ま
たは生検などの標準的な技法によって得られた糞便材
料、血液、喀痰、唾液、尿、血小板試料、組織試料、固
定組織および組織培養単層を挙げることができる。ミコ
バクテリウム属の位置または形態は本発明にとって重要
ではなく、鳥型結核菌、Ｍ．イントラセルレア、パラ結
核菌またはそれらの組合わせを特異的に検出し、増幅し
または単離する能力が本発明にとって重要である。
【００１５】本発明のプローブと一緒に用いるために得
られた試料は、直接的に用いるかまたは本発明のプロー
ブを用いる前に増幅することができる。種々の増幅方法
が利用可能である。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈ．Ａ．エー
リッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）監修（ストックトン・プレス
（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク，Ｎ
Ｙ，１９８９）、転写に基づく増幅システム（ＴＡ
Ｓ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ．８６：１１７３（１９８９）、連結増幅反応（ＬＡ
Ｒ）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４：５６０（１９８９）、リガ
ーゼに基づく増幅システム（ＬＡＳ）、Ｇｅｎｅ ８
９：１１７（１９９０）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：３
９２（１９９２）およびＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，２０：７（１９９２）並びにＱＢレプリカー
ゼ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６２：１３（１９９
０）。いずれの試料標本も、その目的は偽陽性を排除し
且つ感受性を改良することである。このような目的は、
試料が調製される方法および試料が調製される培地また
は物質の選択を考慮することによって達成される。
られた試料は、直接的に用いるかまたは本発明のプロー
ブを用いる前に増幅することができる。種々の増幅方法
が利用可能である。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈ．Ａ．エー
リッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）監修（ストックトン・プレス
（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク，Ｎ
Ｙ，１９８９）、転写に基づく増幅システム（ＴＡ
Ｓ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ．８６：１１７３（１９８９）、連結増幅反応（ＬＡ
Ｒ）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４：５６０（１９８９）、リガ
ーゼに基づく増幅システム（ＬＡＳ）、Ｇｅｎｅ ８
９：１１７（１９９０）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：３
９２（１９９２）およびＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，２０：７（１９９２）並びにＱＢレプリカー
ゼ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６２：１３（１９９
０）。いずれの試料標本も、その目的は偽陽性を排除し
且つ感受性を改良することである。このような目的は、
試料が調製される方法および試料が調製される培地また
は物質の選択を考慮することによって達成される。
【００１６】本発明のプローブは、様々な方法で製造す
ることができ、したがって、いずれの特定の製造手段に
も制限されない。本発明のプローブを製造するのに適当
な手段は、複製ベクターを用い且つライブラリーとして
プローブをクローン化した後に適当なスクリーニング操
作を行ない、そして適当な宿主中でベクターを増殖させ
ることを含む。精製および単離の結果として、選択制限
酵素によってベクターから分離されたプローブを生じ
る。好ましくは、プローブは商業的に入手可能な方法お
よび装置を用いて合成される。例えば、固相ホスホルア
ミダイト法を用いて本発明のプローブを製造することが
できる。Ｃ．カルサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）ら、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｓｙｍｐ．Ｑ
ｕａｎｔ．ｂｉｏｌ．，４７：４１１〜４１８（１９８
２）およびアダムス（Ａｄａｍｓ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．，１０５：６０１（１９８３）。
ることができ、したがって、いずれの特定の製造手段に
も制限されない。本発明のプローブを製造するのに適当
な手段は、複製ベクターを用い且つライブラリーとして
プローブをクローン化した後に適当なスクリーニング操
作を行ない、そして適当な宿主中でベクターを増殖させ
ることを含む。精製および単離の結果として、選択制限
酵素によってベクターから分離されたプローブを生じ
る。好ましくは、プローブは商業的に入手可能な方法お
よび装置を用いて合成される。例えば、固相ホスホルア
ミダイト法を用いて本発明のプローブを製造することが
できる。Ｃ．カルサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）ら、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｓｙｍｐ．Ｑ
ｕａｎｔ．ｂｉｏｌ．，４７：４１１〜４１８（１９８
２）およびアダムス（Ａｄａｍｓ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．，１０５：６０１（１９８３）。
【００１７】典型的に、核酸プローブの合成は、合成用
に適当に保護されているホスホルアミダイト誘導体を用
いる。Ｓ．Ｐ．アダムスら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．，１０５：６６１（１９８３）、Ｌ．Ｊ．マクブラ
イド（ＭｃＢｒｉｄｅ）およびＭ．Ｈ．カルサーズ（Ｃ
ａｒｕｔｈｅｒｓ）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ
ｔ．，２４：２４５（１９８３）並びにＮ．Ｄ．シンハ
（Ｓｉｎｈａ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，１２：４５３９（１９８４）を参照されたい。ホ
スホルアミダイトを核酸鎖中に組み込む方法としては、
概して、フレーラー（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ）ら、Ｎｕｃ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４：５３９９（１９８６）、
ナラング（Ｎａｒａｎｇ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎ
ｚ．，６８：９０（１９７９）およびオーグルビー（Ｏ
ｇｉｌｖｉｅ），Ｋ．Ｋ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：５７６４（１９
８８）によって例示されたような固相、液相、トリエス
テルおよびＨ−リン酸中間体の使用がある。
に適当に保護されているホスホルアミダイト誘導体を用
いる。Ｓ．Ｐ．アダムスら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．，１０５：６６１（１９８３）、Ｌ．Ｊ．マクブラ
イド（ＭｃＢｒｉｄｅ）およびＭ．Ｈ．カルサーズ（Ｃ
ａｒｕｔｈｅｒｓ）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ
ｔ．，２４：２４５（１９８３）並びにＮ．Ｄ．シンハ
（Ｓｉｎｈａ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，１２：４５３９（１９８４）を参照されたい。ホ
スホルアミダイトを核酸鎖中に組み込む方法としては、
概して、フレーラー（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ）ら、Ｎｕｃ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４：５３９９（１９８６）、
ナラング（Ｎａｒａｎｇ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎ
ｚ．，６８：９０（１９７９）およびオーグルビー（Ｏ
ｇｉｌｖｉｅ），Ｋ．Ｋ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：５７６４（１９
８８）によって例示されたような固相、液相、トリエス
テルおよびＨ−リン酸中間体の使用がある。
【００１８】本発明のプローブは、修正ホスホトリエス
テル法により、完全に保護されたデオキシリボヌクレオ
チドビルディングブロックを用いて慣用的に合成するこ
とができる。このような合成法は、イタクラ（Ｉｔａｋ
ｕｒａ）ら、（１９７７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８：
１０５６およびクレア（Ｃｒｅａ）ら、（１９７８），
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，
７５：５７５、シュング（Ｈｓｉｕｎｇ）ら、（１９８
３），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，
１１：３２２７並びにナラングら、（１９８０），Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８：９０
の方法に実質的にしたがって実施することができる。手
動方法の他に、プローブは自動合成機、例えば、システ
ク（Ｓｙｓｔｅｃ）１４５０ＡまたはＡＢＩ ３８０Ａ
シンセサイザー（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒｓ）を用いて
合成することができる。
テル法により、完全に保護されたデオキシリボヌクレオ
チドビルディングブロックを用いて慣用的に合成するこ
とができる。このような合成法は、イタクラ（Ｉｔａｋ
ｕｒａ）ら、（１９７７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８：
１０５６およびクレア（Ｃｒｅａ）ら、（１９７８），
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，
７５：５７５、シュング（Ｈｓｉｕｎｇ）ら、（１９８
３），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，
１１：３２２７並びにナラングら、（１９８０），Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８：９０
の方法に実質的にしたがって実施することができる。手
動方法の他に、プローブは自動合成機、例えば、システ
ク（Ｓｙｓｔｅｃ）１４５０ＡまたはＡＢＩ ３８０Ａ
シンセサイザー（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒｓ）を用いて
合成することができる。
【００１９】本発明のプローブは、天然に存在する糖−
リン酸主鎖並びにホスホロチオエート、ジチオネート、
アルキルホスホネートおよびアルファ−ヌクレオチドを
含む修飾主鎖と一緒に用いることができる。修飾糖−リ
ン酸主鎖は、概して、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）およびツ
ォー（Ｔ′ｓｏ）、Ａｎｎ．Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．
Ｃｈｅｍ．，２３：２９５（１９８８）並びにモラン
（Ｍｏｒａｎ）ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１
４：５０１９（１９８７）によって例示されている。
リン酸主鎖並びにホスホロチオエート、ジチオネート、
アルキルホスホネートおよびアルファ−ヌクレオチドを
含む修飾主鎖と一緒に用いることができる。修飾糖−リ
ン酸主鎖は、概して、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）およびツ
ォー（Ｔ′ｓｏ）、Ａｎｎ．Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．
Ｃｈｅｍ．，２３：２９５（１９８８）並びにモラン
（Ｍｏｒａｎ）ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１
４：５０１９（１９８７）によって例示されている。
【００２０】検出法におけるプローブの使用としては、
ノザンブロット（ＲＮＡ検出）、サザンブロット（ＤＮ
Ａ検出）、ウェスタンブロット（タンパク質検出）、ド
ットブロット（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質検出）
およびスロットブロット（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパ
ク質）がある。他の検出法としては、ディプスティック
装置等上にプローブを含むキットがある。
ノザンブロット（ＲＮＡ検出）、サザンブロット（ＤＮ
Ａ検出）、ウェスタンブロット（タンパク質検出）、ド
ットブロット（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質検出）
およびスロットブロット（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパ
ク質）がある。他の検出法としては、ディプスティック
装置等上にプローブを含むキットがある。
【００２１】本発明のプローブを用いることにより形成
されたハイブリッド分子を検出するには、典型的に、検
出可能なマーカーをプローブの一つに対して加える。プ
ローブはいくつかの方法によって標識することができ
る。プローブは放射性標識し且つオートラジオグラフィ
ーによって検出することができる。オートラジオグラフ
ィー用のこの種の標識としては、３Ｈ、１２５Ｉ、３５
Ｓ、１４Ｃおよび３２Ｐがある。典型的に、放射性同位
体の選択は、合成の容易さ、安定性および同位体の半減
期に関与する研究上の選択に依る。他の検出可能マーカ
ーとしては、リガンド、発蛍光団、化学発光物質、電気
化学標識、経時分解（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ）発
蛍光団、酵素および抗体がある。本発明のプローブと一
緒に用いるための他の検出可能マーカーとしては、ビオ
チン、放射性ヌクレオチド、酵素阻害剤、補酵素、ルシ
フェリン、常磁性金属、スピン標識および単クローン性
抗体がある。標識の選択は、プローブに対して標識を結
合させる方法を指定する。
されたハイブリッド分子を検出するには、典型的に、検
出可能なマーカーをプローブの一つに対して加える。プ
ローブはいくつかの方法によって標識することができ
る。プローブは放射性標識し且つオートラジオグラフィ
ーによって検出することができる。オートラジオグラフ
ィー用のこの種の標識としては、３Ｈ、１２５Ｉ、３５
Ｓ、１４Ｃおよび３２Ｐがある。典型的に、放射性同位
体の選択は、合成の容易さ、安定性および同位体の半減
期に関与する研究上の選択に依る。他の検出可能マーカ
ーとしては、リガンド、発蛍光団、化学発光物質、電気
化学標識、経時分解（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ）発
蛍光団、酵素および抗体がある。本発明のプローブと一
緒に用いるための他の検出可能マーカーとしては、ビオ
チン、放射性ヌクレオチド、酵素阻害剤、補酵素、ルシ
フェリン、常磁性金属、スピン標識および単クローン性
抗体がある。標識の選択は、プローブに対して標識を結
合させる方法を指定する。
【００２２】放射性ヌクレオチドはいくつかの手段によ
って本発明のプローブ中に組み込むことができる。この
ような手段としては、二本鎖プローブのニックトランス
レーション、放射性ｄＮＴＰ存在下において大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼＩまたは他のこ
の種のＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを用
いる特異的インサートを有する一本鎖プラスミドＭ１３
の複写、放射性ｄＮＴＰ存在下において逆転写酵素を用
いるＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡの転写、放射性ｒＮＴＰ
存在下においてＳＰ６またはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ
を用いるＳＰ６プロモーターまたはＴ７プロモーターな
どの強力プロモーターを含むベクターからのＲＮＡの転
写、ターミナルトランスフェラーゼを用いる放射性ヌク
レオチドを有するプローブの３′末端のテーリング並び
にガンマ３２Ｐ ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナー
ゼを用いるプローブの５′末端のリン酸化がある。
って本発明のプローブ中に組み込むことができる。この
ような手段としては、二本鎖プローブのニックトランス
レーション、放射性ｄＮＴＰ存在下において大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼＩまたは他のこ
の種のＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを用
いる特異的インサートを有する一本鎖プラスミドＭ１３
の複写、放射性ｄＮＴＰ存在下において逆転写酵素を用
いるＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡの転写、放射性ｒＮＴＰ
存在下においてＳＰ６またはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ
を用いるＳＰ６プロモーターまたはＴ７プロモーターな
どの強力プロモーターを含むベクターからのＲＮＡの転
写、ターミナルトランスフェラーゼを用いる放射性ヌク
レオチドを有するプローブの３′末端のテーリング並び
にガンマ３２Ｐ ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナー
ゼを用いるプローブの５′末端のリン酸化がある。
【００２３】本発明の非放射性プローブは、間接的手段
によって標識することができる。例えば、リガンド分子
を本発明のプローブに対して共有結合することができ
る。次に、そのリガンドを、本質的に検出可能であるか
または検出可能酵素、蛍光化合物若しくは化学発光化合
物などのシグナルシステムに対して共有結合している抗
リガンド分子に対して結合することができる。
によって標識することができる。例えば、リガンド分子
を本発明のプローブに対して共有結合することができ
る。次に、そのリガンドを、本質的に検出可能であるか
または検出可能酵素、蛍光化合物若しくは化学発光化合
物などのシグナルシステムに対して共有結合している抗
リガンド分子に対して結合することができる。
【００２４】本発明のプローブは、更に、酵素との結合
のような手段によってシグナル発生化合物に対して直接
的に結合することができる。標識に適当な酵素として
は、加水分解酵素、具体的には、ホスファターゼ、エス
テラーゼ、グリコシダーゼおよび酸化還元酵素、例え
ば、ペルオキシダーゼがある。蛍光化合物としては、フ
ルオレセインおよびその誘導体、ロダミンおよびその誘
導体、ダンシル、ウンベリフェロン等がある。
のような手段によってシグナル発生化合物に対して直接
的に結合することができる。標識に適当な酵素として
は、加水分解酵素、具体的には、ホスファターゼ、エス
テラーゼ、グリコシダーゼおよび酸化還元酵素、例え
ば、ペルオキシダーゼがある。蛍光化合物としては、フ
ルオレセインおよびその誘導体、ロダミンおよびその誘
導体、ダンシル、ウンベリフェロン等がある。
【００２５】本発明のプローブを用いる場合、種々のハ
イブリダイセーション条件を用いることができる。具体
的なハイブリダイセーション技術は本発明に対して不可
欠ではない。概して、ハイブリダイセーション技術は、
「核酸ハイブリダイセーション、実践アプローチ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，
Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、ハネ
ス（Ｈａｎｅｓ），Ｂ．Ｄ．およびヒギンズ（Ｈｉｇｇ
ｉｎｓ），Ｓ．Ｊ．監修，ＩＲＬプレス（Ｐｒｅｓ
ｓ），１９８５、ガル（Ｇａｌｌ）およびパデュー（Ｐ
ａｒｄｕｅ）（１９６９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６３：３７８〜３８３、ジョ
ーン・バーンスタイル（Ｊｏｈｎ Ｂｕｒｎｓｔｅｉ
ｌ）およびジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）（１９６９）Ｎａ
ｔｕｒｅ ２２３：５８２〜５８７並びにサザン（Ｓｏ
ｕｔｈｅｒｎ），Ｅ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９
８：５０３（１９７５）に記載されている。日常的な実
験により、納得のいくハイブリダイセーションを可能に
する条件は容易に得られる。
イブリダイセーション条件を用いることができる。具体
的なハイブリダイセーション技術は本発明に対して不可
欠ではない。概して、ハイブリダイセーション技術は、
「核酸ハイブリダイセーション、実践アプローチ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，
Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、ハネ
ス（Ｈａｎｅｓ），Ｂ．Ｄ．およびヒギンズ（Ｈｉｇｇ
ｉｎｓ），Ｓ．Ｊ．監修，ＩＲＬプレス（Ｐｒｅｓ
ｓ），１９８５、ガル（Ｇａｌｌ）およびパデュー（Ｐ
ａｒｄｕｅ）（１９６９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６３：３７８〜３８３、ジョ
ーン・バーンスタイル（Ｊｏｈｎ Ｂｕｒｎｓｔｅｉ
ｌ）およびジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）（１９６９）Ｎａ
ｔｕｒｅ ２２３：５８２〜５８７並びにサザン（Ｓｏ
ｕｔｈｅｒｎ），Ｅ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９
８：５０３（１９７５）に記載されている。日常的な実
験により、納得のいくハイブリダイセーションを可能に
する条件は容易に得られる。
【００２６】正しいハイブリダイセーション複合体は、
プローブと一緒に用いた標識によって検出することがで
きる。したがって、標識の選択は検出方法の選択を導く
ものである。例えば、標識がハプテンまたは抗原である
場合、ハイブリダイセーション複合体は抗体を用いて検
出することができる。典型的に、抗体を、検出しうる蛍
光または酵素分子に対して結合させる。テュッセン（Ｔ
ｉｊｓｓｅｎ），Ｐ．、「酵素免疫検定の理論の実践、
生化学および分子生物学における実験室技術（Ｐｒａｃ
ｔｉｃｅ ｉｎ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ
Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，バ
ードン（Ｂｕｒｄｏｎ），Ｒ．Ｈ．，ファン・クニッペ
ンベルグ（Ｖａｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ），Ｐ．
Ｈ．監修、エルセビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ），１９８
５，９〜２０頁。標識が放射性である場合、ハイブリダ
イセーション複合体はＸ線フィルムに露出される。標識
が蛍光性である場合、試料は特定の波長の光の照射によ
って検出される。酵素標識は適当な基質とのインキュベ
ーションによって検出される。
プローブと一緒に用いた標識によって検出することがで
きる。したがって、標識の選択は検出方法の選択を導く
ものである。例えば、標識がハプテンまたは抗原である
場合、ハイブリダイセーション複合体は抗体を用いて検
出することができる。典型的に、抗体を、検出しうる蛍
光または酵素分子に対して結合させる。テュッセン（Ｔ
ｉｊｓｓｅｎ），Ｐ．、「酵素免疫検定の理論の実践、
生化学および分子生物学における実験室技術（Ｐｒａｃ
ｔｉｃｅ ｉｎ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ
Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，バ
ードン（Ｂｕｒｄｏｎ），Ｒ．Ｈ．，ファン・クニッペ
ンベルグ（Ｖａｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ），Ｐ．
Ｈ．監修、エルセビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ），１９８
５，９〜２０頁。標識が放射性である場合、ハイブリダ
イセーション複合体はＸ線フィルムに露出される。標識
が蛍光性である場合、試料は特定の波長の光の照射によ
って検出される。酵素標識は適当な基質とのインキュベ
ーションによって検出される。
【００２７】ミコバクテリアの配列を検出するのに本発
明のプローブを用いることに加えて、本発明のプローブ
はミコバクテリアの配列を単離するのに用いることがで
きる。多数の診断用途においては、試料中にミコバクテ
リアの配列が存在するのを検出することだけが望まれる
全てである。しかしながら、ミコバクテリアの配列を単
離することが望ましい状況が存在する。例えば、ある配
列を予備段階として単離して外来ＤＮＡを分離した後、
特定の単離されたＤＮＡ配列をＤＮＡ増幅技術を用いて
増幅させることができる。
明のプローブを用いることに加えて、本発明のプローブ
はミコバクテリアの配列を単離するのに用いることがで
きる。多数の診断用途においては、試料中にミコバクテ
リアの配列が存在するのを検出することだけが望まれる
全てである。しかしながら、ミコバクテリアの配列を単
離することが望ましい状況が存在する。例えば、ある配
列を予備段階として単離して外来ＤＮＡを分離した後、
特定の単離されたＤＮＡ配列をＤＮＡ増幅技術を用いて
増幅させることができる。
【００２８】更に、本発明のプローブは、ミコバクテリ
ア配列の増幅に有用である。例えば、本発明のプローブ
は種々の増幅プロトコル、例えば、ポリメラーゼ連鎖反
応、転写に基づく増幅システム、連結増幅反応、リガー
ゼに基づく増幅システムおよびＱＢレプリカーゼ（上記
で論及した）においてプライマーとして用いることがで
きる。
ア配列の増幅に有用である。例えば、本発明のプローブ
は種々の増幅プロトコル、例えば、ポリメラーゼ連鎖反
応、転写に基づく増幅システム、連結増幅反応、リガー
ゼに基づく増幅システムおよびＱＢレプリカーゼ（上記
で論及した）においてプライマーとして用いることがで
きる。
【００２９】本発明のプローブは、キットの形で好都合
に提供することができる。キットは、更に、検出が特異
的でもありうるプローブを含むことができ、例えば、該
プローブは蛍光、放射性および化学発光検出用に設計す
ることができる。
に提供することができる。キットは、更に、検出が特異
的でもありうるプローブを含むことができ、例えば、該
プローブは蛍光、放射性および化学発光検出用に設計す
ることができる。
【００３０】以下の実施例は、本明細書中に記載した本
発明の具体的な実施態様を例証する。当業者に明らかで
あるように、種々の変更および修正は可能であり且つ記
載された本発明の範囲内であると考えられる。
発明の具体的な実施態様を例証する。当業者に明らかで
あるように、種々の変更および修正は可能であり且つ記
載された本発明の範囲内であると考えられる。
【００３１】
【実施例】材料および方法 捕捉オリゴデオキシヌクレオチドプローブの製造 オリゴデオキシヌクレオチド捕捉プローブを以下に記載
したように合成した。最初に、捕捉オリゴマーを、ＤＮ
Ａ合成機（３８０Ｂ型、アプライド・バイオシステムズ
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フォスタ
ー・シティー、ＣＡ）およびビオチン・オン（Ｂｉｏｔ
ｉｎ Ｏｎ）ＴＭ試薬（クローンテク（Ｃｌｏｎｅｔｅ
ｃｈ）、パロ・アルト、ＣＡ）を用いて、３個のビオチ
ン分子（ＢＢＢ）がオリゴデオキシヌクレオチドの５′
末端に存在するように製造した。精製は、逆相高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ブラウンリー・ラブ・
アクアポア（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ Ｌａｂ Ａｑｕａｐｏ
ｒｅ）ＲＰ３００カラム−２２０ｘ４．６ｍｍ，Ｃ８カ
ラム７粒子，３００Ａ細孔度）により、２５４ｎｍでの
ＵＶモニター並びに１４〜４４％バッファーＢの１時間
にわたる勾配（バッファーＢ：５０％アセトニトリル含
有の０．１Ｍトリエチルアミン−アセテートｐＨ７；バ
ッファーＡ：０．１Ｍトリエチルアミン−アセテート、
ｐＨ７）および流速１ｍｌ／分を用いて達成された。
したように合成した。最初に、捕捉オリゴマーを、ＤＮ
Ａ合成機（３８０Ｂ型、アプライド・バイオシステムズ
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フォスタ
ー・シティー、ＣＡ）およびビオチン・オン（Ｂｉｏｔ
ｉｎ Ｏｎ）ＴＭ試薬（クローンテク（Ｃｌｏｎｅｔｅ
ｃｈ）、パロ・アルト、ＣＡ）を用いて、３個のビオチ
ン分子（ＢＢＢ）がオリゴデオキシヌクレオチドの５′
末端に存在するように製造した。精製は、逆相高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ブラウンリー・ラブ・
アクアポア（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ Ｌａｂ Ａｑｕａｐｏ
ｒｅ）ＲＰ３００カラム−２２０ｘ４．６ｍｍ，Ｃ８カ
ラム７粒子，３００Ａ細孔度）により、２５４ｎｍでの
ＵＶモニター並びに１４〜４４％バッファーＢの１時間
にわたる勾配（バッファーＢ：５０％アセトニトリル含
有の０．１Ｍトリエチルアミン−アセテートｐＨ７；バ
ッファーＡ：０．１Ｍトリエチルアミン−アセテート、
ｐＨ７）および流速１ｍｌ／分を用いて達成された。
【００３２】オリゴデオキシヌクレオチド検出器プロー
ブを、ＤＮＡ合成機（３８０Ｂ型、アプライド・バイオ
システムズ、フォスター・シティー、ＣＡ）および３′
−アミノ−修飾用カラム（グレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ
ｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、スターリング、ＶＡ）を用い
て合成した。これにより、引続きのアルカリ性ホスファ
ターゼとの結合に必要な３′アミン末端を有するオリゴ
デオキシヌクレオチドを生成した。ウシ腸アルカリ性ホ
スファターゼ（ＡＰ、酵素免疫検定等級、ベーリンガー
・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ）、インディアナポリス、ＩＮ）を５０ｍＭリン酸カ
リウムｐＨ７．５に対して４℃で一晩中透析した後、遠
心分離して凝集体を除去した。ＡＰ（４ｍＬ、１０ｍｇ
／ｍＬ）を、Ｎ，Ｎ′−ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、ミルウォーキ
ー、ＷＩ）中に溶解したスクシンイミジル−４−（ｐ−
マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ、ピアス
（Ｐｉｅｒｃｅ）、ロックフォード、ＭＤから入手し
た、５０ｍＭ）の溶液（４０ｕＬ）と混合し且つ暗所中
において室温で３０分間反応させた。誘導されたＡＰ
を、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５（脱気し且つＮ
２でパージした）で予め平衡にしたＮＡＰ−２５カラム
（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ピスカタウェ
イ、ＮＪ）を用いて精製した。ＮＡＰ−２５カラム画分
の吸光度を、吸光係数０．７５ｍｌ／マイクロモルｃｍ
−１を用いて２６０および２８０ｎｍで読み取った。典
型的に、誘導されたＡＰ約１７０ナノモルを得、そして
誘導されたオリゴデオキシヌクレオチドとの結合まで氷
上で貯蔵した（２時間未満）。
ブを、ＤＮＡ合成機（３８０Ｂ型、アプライド・バイオ
システムズ、フォスター・シティー、ＣＡ）および３′
−アミノ−修飾用カラム（グレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ
ｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、スターリング、ＶＡ）を用い
て合成した。これにより、引続きのアルカリ性ホスファ
ターゼとの結合に必要な３′アミン末端を有するオリゴ
デオキシヌクレオチドを生成した。ウシ腸アルカリ性ホ
スファターゼ（ＡＰ、酵素免疫検定等級、ベーリンガー
・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ）、インディアナポリス、ＩＮ）を５０ｍＭリン酸カ
リウムｐＨ７．５に対して４℃で一晩中透析した後、遠
心分離して凝集体を除去した。ＡＰ（４ｍＬ、１０ｍｇ
／ｍＬ）を、Ｎ，Ｎ′−ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、ミルウォーキ
ー、ＷＩ）中に溶解したスクシンイミジル−４−（ｐ−
マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ、ピアス
（Ｐｉｅｒｃｅ）、ロックフォード、ＭＤから入手し
た、５０ｍＭ）の溶液（４０ｕＬ）と混合し且つ暗所中
において室温で３０分間反応させた。誘導されたＡＰ
を、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５（脱気し且つＮ
２でパージした）で予め平衡にしたＮＡＰ−２５カラム
（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ピスカタウェ
イ、ＮＪ）を用いて精製した。ＮＡＰ−２５カラム画分
の吸光度を、吸光係数０．７５ｍｌ／マイクロモルｃｍ
−１を用いて２６０および２８０ｎｍで読み取った。典
型的に、誘導されたＡＰ約１７０ナノモルを得、そして
誘導されたオリゴデオキシヌクレオチドとの結合まで氷
上で貯蔵した（２時間未満）。
【００３３】３′アミノ−オリゴデオキシヌクレオチド
（５０８．２ｕＭの９８．４ｕｌ、５０ナノモル）を１
Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．２）１３．４ｕｌ中で希釈
し、そしてＤＭＦ中で希釈したｎ−スクシンイミジル−
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（５０ｍ
Ｍ、ＳＰＤＰ、ピアス、ロックフォード、ＩＬ）の溶液
２７ｕｌと混合した。この混合物を暗所中において室温
で１時間インキュベートした。ジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ、１Ｍ）の５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）
中溶液を、オリゴデオキシヌクレオチド／ＤＭＦ混合物
に対して０．１ＭＤＴＴの最終濃度まで加え、そして室
温で１５分間インキュベートした。過剰のＤＴＴおよび
ＳＰＤＰを、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）を
用いるＮＡＰ−２５カラムを介する溶離によって、誘導
されたオリゴデオキシヌクレオチドから分離した。精製
の１０分以内に、還元オリゴデオキシヌクレオチドをＳ
ＭＰＢで誘導されたＡＰと混合した。還元オリゴマーお
よびＳＭＰＢで誘導されたＡＰの迅速な混合は、チオー
ル化オリゴマーの再酸化を防止するのに必要である。得
られた溶液を室温で２〜４時間、続いて４℃で一晩中イ
ンキュベートし、そして５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ
７．５）中の５０ｍＭベータ−メルカプトエタノールを
元の容量の１／１００加えることによって急冷した。粗
製結合体を、セントリプレプ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）
３０ＴＭ遠心濃縮器（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）、ダン
バーズ、ＭＡ）を用いて約２ｍｌまで濃縮した。この材
料をＨＰＬＣによって，ＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（７．
５ｍｍｘ７．５ｃｍ）、０〜６６％バッファーＢの勾配
（バッファーＢ：２０ｍＭトリス、１Ｍ ＮａＣｌ ｐ
Ｈ７．５、バッファーＡ：２０ｍＭトリス ｐＨ７．
５）および流速１ｍｌ／分を用いて更に精製した。吸光
度を２５４ｎｍで監視した。Ａ２６０／Ａ２８０が１で
ある画分が結合体に対応し、それを集めた。次に、結合
したオリゴデオキシヌクレオチドのタンパク質濃度を決
定した（ＢＣＡプロテイン・アッセイ・キット（Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）、ピアス、ロックフォ
ード、ＩＬ）。
（５０８．２ｕＭの９８．４ｕｌ、５０ナノモル）を１
Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．２）１３．４ｕｌ中で希釈
し、そしてＤＭＦ中で希釈したｎ−スクシンイミジル−
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（５０ｍ
Ｍ、ＳＰＤＰ、ピアス、ロックフォード、ＩＬ）の溶液
２７ｕｌと混合した。この混合物を暗所中において室温
で１時間インキュベートした。ジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ、１Ｍ）の５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）
中溶液を、オリゴデオキシヌクレオチド／ＤＭＦ混合物
に対して０．１ＭＤＴＴの最終濃度まで加え、そして室
温で１５分間インキュベートした。過剰のＤＴＴおよび
ＳＰＤＰを、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）を
用いるＮＡＰ−２５カラムを介する溶離によって、誘導
されたオリゴデオキシヌクレオチドから分離した。精製
の１０分以内に、還元オリゴデオキシヌクレオチドをＳ
ＭＰＢで誘導されたＡＰと混合した。還元オリゴマーお
よびＳＭＰＢで誘導されたＡＰの迅速な混合は、チオー
ル化オリゴマーの再酸化を防止するのに必要である。得
られた溶液を室温で２〜４時間、続いて４℃で一晩中イ
ンキュベートし、そして５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ
７．５）中の５０ｍＭベータ−メルカプトエタノールを
元の容量の１／１００加えることによって急冷した。粗
製結合体を、セントリプレプ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）
３０ＴＭ遠心濃縮器（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）、ダン
バーズ、ＭＡ）を用いて約２ｍｌまで濃縮した。この材
料をＨＰＬＣによって，ＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（７．
５ｍｍｘ７．５ｃｍ）、０〜６６％バッファーＢの勾配
（バッファーＢ：２０ｍＭトリス、１Ｍ ＮａＣｌ ｐ
Ｈ７．５、バッファーＡ：２０ｍＭトリス ｐＨ７．
５）および流速１ｍｌ／分を用いて更に精製した。吸光
度を２５４ｎｍで監視した。Ａ２６０／Ａ２８０が１で
ある画分が結合体に対応し、それを集めた。次に、結合
したオリゴデオキシヌクレオチドのタンパク質濃度を決
定した（ＢＣＡプロテイン・アッセイ・キット（Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）、ピアス、ロックフォ
ード、ＩＬ）。
【００３４】アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）検出器
オリゴデオキシヌクレオチドプローブの活性を以下のよ
うに決定した。結合体を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０
０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ、ｐＨ７．５中で５ｕｇ／ｍｌまで希釈した。
基質である４−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰ
Ｐ、５ｍＭ）を１Ｍジエタノールアミン、１ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２、ｐＨ９．８中に溶解した。ＡＰ活性を以下のよ
うに２５℃で検定した。結合体（５ｕｌ）を基質溶液２
ｍｌ中で希釈し、そして吸光度の変化をヒューレット・
パッカード（Ｈｅｗｌｅｔ Ｐａｃｋａｒｄ）８４５２
分光光度計を用いて４０５ｎｍで監視した。
オリゴデオキシヌクレオチドプローブの活性を以下のよ
うに決定した。結合体を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０
０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ、ｐＨ７．５中で５ｕｇ／ｍｌまで希釈した。
基質である４−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰ
Ｐ、５ｍＭ）を１Ｍジエタノールアミン、１ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２、ｐＨ９．８中に溶解した。ＡＰ活性を以下のよ
うに２５℃で検定した。結合体（５ｕｌ）を基質溶液２
ｍｌ中で希釈し、そして吸光度の変化をヒューレット・
パッカード（Ｈｅｗｌｅｔ Ｐａｃｋａｒｄ）８４５２
分光光度計を用いて４０５ｎｍで監視した。
【００３５】反応速度を、ｐ−ニトロフェノールの４０
５ｎｍでの吸光係数（１８５００Ｍ−１ｃｍ−１）を用
いて反応速度プロットの直線範囲から計算した。ＡＰ検
出器オリゴデオキシヌクレオチドプローブの比活性は８
５０〜１３００マイクロモル／分／ｍｇであると決定さ
れた。
５ｎｍでの吸光係数（１８５００Ｍ−１ｃｍ−１）を用
いて反応速度プロットの直線範囲から計算した。ＡＰ検
出器オリゴデオキシヌクレオチドプローブの比活性は８
５０〜１３００マイクロモル／分／ｍｇであると決定さ
れた。
【００３６】精製ＡＰ検出器オリゴデオキシヌクレオチ
ドプローブを、２０ｍＭトリス、１Ｍ ＮａＣｌ、０．
０５％アジ化ナトリウム、超音波処理済みサケ精子ＤＮ
Ａ５０ｕｇ／ｍｌ，ｐＨ７．５中で２ｕＭまで希釈した
後、４℃で貯蔵した。
ドプローブを、２０ｍＭトリス、１Ｍ ＮａＣｌ、０．
０５％アジ化ナトリウム、超音波処理済みサケ精子ＤＮ
Ａ５０ｕｇ／ｍｌ，ｐＨ７．５中で２ｕＭまで希釈した
後、４℃で貯蔵した。
【００３７】実施例１ 鎖置換増幅用の鳥型結核菌／ミコバクテリウム・イント
ラセルレアプローブ配列の発現 本発明の標的配列を、フリーズ（Ｆｒｉｅｓ），Ｊ．
Ｍ．Ｗ．ら（１９９０）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏ
ｂｅｓ ４：８７〜１０５によって開示されたようにク
ローンｐＭａｖ２９から誘導した。このクローンの特異
性を、サザンブロット分析（サザン，Ｅ．Ｍ．（１９７
５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３〜５１７）を
用いて多数のミコバクテリア由来のゲノムＤＮＡ（制限
エンドヌクレアーゼＰｓｔＩによって前消化された）に
対して試験した。クローンｐＭａｖ２９は鳥型結核菌お
よびＭ．イントラセルレア双方に対して交差反応性であ
って、ヒト型結核菌およびウシ型結核菌に対する交差反
応性は小さかった。同様のクローンｐＭａｖ２２は主と
して鳥型結核菌に対してハイブリッド形成し、Ｍ．カン
サシイ（ｋａｎｓａｓｉｉ）およびＭ．イントラセルレ
アに対する交差反応性は小さいことが分った。フリーズ
らはｐＭａｖ２２で研究を続け、そして鳥型結核菌に特
異的なプローブ配列を発現させた。
ラセルレアプローブ配列の発現 本発明の標的配列を、フリーズ（Ｆｒｉｅｓ），Ｊ．
Ｍ．Ｗ．ら（１９９０）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏ
ｂｅｓ ４：８７〜１０５によって開示されたようにク
ローンｐＭａｖ２９から誘導した。このクローンの特異
性を、サザンブロット分析（サザン，Ｅ．Ｍ．（１９７
５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３〜５１７）を
用いて多数のミコバクテリア由来のゲノムＤＮＡ（制限
エンドヌクレアーゼＰｓｔＩによって前消化された）に
対して試験した。クローンｐＭａｖ２９は鳥型結核菌お
よびＭ．イントラセルレア双方に対して交差反応性であ
って、ヒト型結核菌およびウシ型結核菌に対する交差反
応性は小さかった。同様のクローンｐＭａｖ２２は主と
して鳥型結核菌に対してハイブリッド形成し、Ｍ．カン
サシイ（ｋａｎｓａｓｉｉ）およびＭ．イントラセルレ
アに対する交差反応性は小さいことが分った。フリーズ
らはｐＭａｖ２２で研究を続け、そして鳥型結核菌に特
異的なプローブ配列を発現させた。
【００３８】鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレアの
みに特異的なｐＭａｖ２９の一部分を識別するために、
４種類の５０マーのオリゴデオキシヌクレオチドを、ｐ
Ｍａｖ２９の最初の１５０塩基および比較的低ＧＣ／Ｇ
ＣＡＴ含量の位置２８１〜３２０からの一部分にわたっ
て合成した。オリゴマーを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いて５′−３２Ｐ標識し且つ用いて種々のゲノ
ムＤＮＡ標品のＰｓｔＩ消化物のサザンブロットをプロ
ーブした（表２）。ブロットを、Ｘ線フィルムを用いる
オートラジオグラフイーによって可視化した。フィルム
をブロットの隣に置いた後、標準法を用いて現像した。
ブロット上のゲノムＤＮＡの各標品の位置が分っている
ので、５′−３２Ｐ標識オリゴマーの交差反応性をオー
トラジオグラム上の１個または複数の暗スポットの位置
によって決定することは可能である。すなわち、スポッ
トは、５′−３２Ｐ標識オリゴマーの膜結合ゲノムＤＮ
Ａに対する特異的ハイブリダイセーションが引起こされ
たところのみを現す。結果を表３に示す。
みに特異的なｐＭａｖ２９の一部分を識別するために、
４種類の５０マーのオリゴデオキシヌクレオチドを、ｐ
Ｍａｖ２９の最初の１５０塩基および比較的低ＧＣ／Ｇ
ＣＡＴ含量の位置２８１〜３２０からの一部分にわたっ
て合成した。オリゴマーを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いて５′−３２Ｐ標識し且つ用いて種々のゲノ
ムＤＮＡ標品のＰｓｔＩ消化物のサザンブロットをプロ
ーブした（表２）。ブロットを、Ｘ線フィルムを用いる
オートラジオグラフイーによって可視化した。フィルム
をブロットの隣に置いた後、標準法を用いて現像した。
ブロット上のゲノムＤＮＡの各標品の位置が分っている
ので、５′−３２Ｐ標識オリゴマーの交差反応性をオー
トラジオグラム上の１個または複数の暗スポットの位置
によって決定することは可能である。すなわち、スポッ
トは、５′−３２Ｐ標識オリゴマーの膜結合ゲノムＤＮ
Ａに対する特異的ハイブリダイセーションが引起こされ
たところのみを現す。結果を表３に示す。
【００３９】
【表２】
【表３】 初期の鎖置換増幅（ＳＤＡ）実験は、ｐＭａｖ２９の領
域７２〜１６７が増幅に従うことを示した。この領域の
特異性は、鳥型結核菌ゲノムＤＮＡ由来のポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）増幅生成物（位置７２〜１６７）を
クローニング／配列決定することによって決定された。
配列は、ｐＭａｖ２９の位置９３および９４間のシトシ
ン（Ｃ）インサートを除いては、フリーズらによって公
表されたものに一致する。Ｃインサートを有するクロー
ンの特異性は、前記に記載されたようにＰｓｔＩ消化ミ
コバクテリアＤＮＡに対するサザンブロットハイブリダ
イセーションにおいて再度チェックされた。この領域
（７２〜１６８、９７ｂｐ）は、他の種に対する無視し
うる交差反応性を有する鳥型結核菌およびＭ．イントラ
セルレアに関するｐＭａｖ２９（位置７２〜１６７）の
元の特異性を保存している（表３）。
域７２〜１６７が増幅に従うことを示した。この領域の
特異性は、鳥型結核菌ゲノムＤＮＡ由来のポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）増幅生成物（位置７２〜１６７）を
クローニング／配列決定することによって決定された。
配列は、ｐＭａｖ２９の位置９３および９４間のシトシ
ン（Ｃ）インサートを除いては、フリーズらによって公
表されたものに一致する。Ｃインサートを有するクロー
ンの特異性は、前記に記載されたようにＰｓｔＩ消化ミ
コバクテリアＤＮＡに対するサザンブロットハイブリダ
イセーションにおいて再度チェックされた。この領域
（７２〜１６８、９７ｂｐ）は、他の種に対する無視し
うる交差反応性を有する鳥型結核菌およびＭ．イントラ
セルレアに関するｐＭａｖ２９（位置７２〜１６７）の
元の特異性を保存している（表３）。
【００４０】実施例２ 鳥型結核菌−ミコバクテリウム・イントラセルレア複合
体の鎖置換増幅 前記のように、ｐＭａｖ２９のサザンブロット分析は、
ヒト型結核菌、Ｍ．カンサシイおよびウシ型結核菌並び
に鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレアに対する交差
反応性を示した（表３、実施例１）。
体の鎖置換増幅 前記のように、ｐＭａｖ２９のサザンブロット分析は、
ヒト型結核菌、Ｍ．カンサシイおよびウシ型結核菌並び
に鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレアに対する交差
反応性を示した（表３、実施例１）。
【００４１】クローンｐＭａｖ２９による結果のサザン
ブロット分析は、鳥型結核菌およびミコバクテリウム・
イントラセルレアの特異性の領域を示した。この情報に
基づいて、いくつかの他の因子が考えられ、（１）Ｇ＋
Ｃ含量は５０％に近くあるべきであり、（２）二次構造
は最小限であるべきであり、（３）標的領域は検出器お
よび捕捉プローブを適応させるのに十分に大きくあるべ
きである。
ブロット分析は、鳥型結核菌およびミコバクテリウム・
イントラセルレアの特異性の領域を示した。この情報に
基づいて、いくつかの他の因子が考えられ、（１）Ｇ＋
Ｃ含量は５０％に近くあるべきであり、（２）二次構造
は最小限であるべきであり、（３）標的領域は検出器お
よび捕捉プローブを適応させるのに十分に大きくあるべ
きである。
【００４２】サザンブロット分析に基づく特異性のいく
つかの領域のＧ＋Ｃ含量を評価した。塩基１〜５０は鳥
型結核菌およびＭ．イントラセルレアに対して特異性を
有するが、Ｇ＋Ｃ含量は７４％である。塩基１０５〜１
５３（４９マー）および塩基９５〜１４１（４７マー）
のＧ＋Ｃ含量はそれぞれ５５％および５３％であって、
これは許容しうる範囲に近い。
つかの領域のＧ＋Ｃ含量を評価した。塩基１〜５０は鳥
型結核菌およびＭ．イントラセルレアに対して特異性を
有するが、Ｇ＋Ｃ含量は７４％である。塩基１０５〜１
５３（４９マー）および塩基９５〜１４１（４７マー）
のＧ＋Ｃ含量はそれぞれ５５％および５３％であって、
これは許容しうる範囲に近い。
【００４３】これら２種類の可能な標的配列の二次構造
のコンピューター分析を実施した。この分析から、４９
マー標的配列に関して、パリンドローム配列ゆえのヘア
ピンは塩基１４４および１５１間に形成しうることが分
った。４７マー標的配列は明らかな二次構造を示さなか
った。しかしながら、４７マー標的の一つの潜在的な欠
点は、下記の実施例３で論及されるように、検出器およ
び捕捉プローブの結合に利用可能なヌクレオチド数が比
較的少ないことであった。これに留意して、ＳＤＡプラ
イマーオリゴを４７マー標的の増幅用に製造した。
のコンピューター分析を実施した。この分析から、４９
マー標的配列に関して、パリンドローム配列ゆえのヘア
ピンは塩基１４４および１５１間に形成しうることが分
った。４７マー標的配列は明らかな二次構造を示さなか
った。しかしながら、４７マー標的の一つの潜在的な欠
点は、下記の実施例３で論及されるように、検出器およ
び捕捉プローブの結合に利用可能なヌクレオチド数が比
較的少ないことであった。これに留意して、ＳＤＡプラ
イマーオリゴを４７マー標的の増幅用に製造した。
【００４４】いくつかのプライマーセットおよび組合わ
せを合成し且つ感受性を試験した。最もよいプライマー
セットを選択し且つ種々の条件下で試験した。評価され
た条件として、グリセロールまたは１−メチル−２−ピ
ロリジノンの添加があった。検定の感受性はグリセロー
ルの添加によって増大した。検定感受性は、５〜１０％
グリセロールの代わりに３％１−メチル−２−ピロリジ
ノンを用いることによってより一層増大した。組合わさ
れた反応条件として以下がある。
せを合成し且つ感受性を試験した。最もよいプライマー
セットを選択し且つ種々の条件下で試験した。評価され
た条件として、グリセロールまたは１−メチル−２−ピ
ロリジノンの添加があった。検定の感受性はグリセロー
ルの添加によって増大した。検定感受性は、５〜１０％
グリセロールの代わりに３％１−メチル−２−ピロリジ
ノンを用いることによってより一層増大した。組合わさ
れた反応条件として以下がある。
【００４５】反応ミックス ５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６ ウシ血清アルブミン１００ｕｇ／ｍｌ １ｍＭジチオトレイトール １ｍＭ ｄＣＴＰ １ｍＭ ｄＧＴＰ １ｍＭ ｄＡＴＰアルファチオ １ｍＭ ｄＴＴＰ ６ｍＭ塩化マグネシウム ３％（ｖ／ｖ）１−メチル−２−ピロリジノン酵素 エキソヌクレアーゼ不含クレノウ５単位（ユナイテッド
・ステーツ・バイオケミカルズ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａ
ｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、クリーヴラン
ド、ＯＨ） ＨｉｎｃＩＩ １５０単位プライマーミックス ０．０５ｕＭ ５′ＴＴＧＡＡＴＡＧＴＣＧＧＴＴＡ
ＣＴＴＧＴＴＧＡＣＴＣＣＴＣＧＧＧＣＴＣＣＡ３′
（配列番号２） ０．０５ｕＭ ５′ＴＴＧＡＡＧＴＡＡＣＣＧＡＣＴ
ＡＴＴＧＴＴＧＡＣＴＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＴＧ３′
（配列番号３） ０．０５ｕＭ ５′ＴＴＧＡＡＴＡＧＴＡＧＧＴＡＡ
ＧＴＴＧＴＴＧＡＣＡＣＴＴＧＴＡＡＧＡＧＣＣ３′
（配列番号４） ０．０５ｕＭ ５′ＴＴＧＡＡＧＴＡＡＣＣＧＡＣＴ
ＡＴＴＧＴＴＧＡＣＴＧＣＧＡＧＴＧＧＧＡＡＣ３′
（配列番号５） ２種類のＳＤＡプライマー（配列番号２および４）はア
ンチコード鎖に対して結合し、そして２種類のＳＤＡプ
ライマー（配列番号３および５）は標的ゲノムＤＮＡ配
列（配列番号１）のコード鎖に対して結合する。
・ステーツ・バイオケミカルズ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａ
ｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、クリーヴラン
ド、ＯＨ） ＨｉｎｃＩＩ １５０単位プライマーミックス ０．０５ｕＭ ５′ＴＴＧＡＡＴＡＧＴＣＧＧＴＴＡ
ＣＴＴＧＴＴＧＡＣＴＣＣＴＣＧＧＧＣＴＣＣＡ３′
（配列番号２） ０．０５ｕＭ ５′ＴＴＧＡＡＧＴＡＡＣＣＧＡＣＴ
ＡＴＴＧＴＴＧＡＣＴＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＴＧ３′
（配列番号３） ０．０５ｕＭ ５′ＴＴＧＡＡＴＡＧＴＡＧＧＴＡＡ
ＧＴＴＧＴＴＧＡＣＡＣＴＴＧＴＡＡＧＡＧＣＣ３′
（配列番号４） ０．０５ｕＭ ５′ＴＴＧＡＡＧＴＡＡＣＣＧＡＣＴ
ＡＴＴＧＴＴＧＡＣＴＧＣＧＡＧＴＧＧＧＡＡＣ３′
（配列番号５） ２種類のＳＤＡプライマー（配列番号２および４）はア
ンチコード鎖に対して結合し、そして２種類のＳＤＡプ
ライマー（配列番号３および５）は標的ゲノムＤＮＡ配
列（配列番号１）のコード鎖に対して結合する。
【００４６】濃度はいずれも、試料容量５０ｕｌ中の最
終試薬濃度である。標的ＤＮＡは、鳥型結核菌および
Ｍ．イントラセルレアの死滅細菌細胞から単離された。
一連の標的鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレアＤＮ
Ａ原液をヒトＤＮＡ０．０２ｕｇ／ｕＬの存在下の希釈
によって集めた。
終試薬濃度である。標的ＤＮＡは、鳥型結核菌および
Ｍ．イントラセルレアの死滅細菌細胞から単離された。
一連の標的鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレアＤＮ
Ａ原液をヒトＤＮＡ０．０２ｕｇ／ｕＬの存在下の希釈
によって集めた。
【００４７】ＳＤＡ検定法は、以下、すなわち、反応ミ
ックスをプライマーミックスおよび標的に対して加え、
９５℃で２分間加熱し、３７℃で５分間冷却し、酵素を
加え且つ３７℃で２時間インキュベートし、９５℃で３
分間加熱することによって反応を停止し、増幅した生成
物を検出する工程から成る。
ックスをプライマーミックスおよび標的に対して加え、
９５℃で２分間加熱し、３７℃で５分間冷却し、酵素を
加え且つ３７℃で２時間インキュベートし、９５℃で３
分間加熱することによって反応を停止し、増幅した生成
物を検出する工程から成る。
【００４８】この方法の結果として、鳥型結核菌かまた
はＭ．イントラセルレアの１０個程度の少数のゲノムが
検出される。
はＭ．イントラセルレアの１０個程度の少数のゲノムが
検出される。
【００４９】実施例３ 下記の方法を提供して、鳥型結核菌およびミコバクテリ
ウム・イントラセルレアＤＮＡの検定検出用にオリゴー
マを同定した方法を例証する。最初に、配列ｐＭＡＶ−
２９を前記のようにサザンブロットハイブリダイセーシ
ョンにおいて鳥型結核菌／Ｍ．イントラセルレアに対す
る適当な特異性を決定するようにスクリーンした。第二
に、ＳＤＡ（前記にも記載した）を用いる標的ＤＮＡの
増幅を可能にする条件を生じさせた。ＳＤＡを用いる増
幅がいったん達成されると、増幅された標的の中心部分
が検定オリゴマーの結合用に存在する。これらのオリゴ
マーは、ＳＤＡプライマーとの競合を最小限にするよう
に設計すべきである。更に、これらのオリゴマーの二次
構造は最小限であるべきであり、ホモ二量体化およびヘ
テロ二量体化がある。最後に、融解温度（Ｔｍ）を調整
して、標的−オリゴマー二重らせんに高特異性を与える
が予想されたハイブリダイセーション条件下での検出の
感受性を低減しないようにすべきである。当該技術分野
においてオリゴマーハイブリダイセーションの評価（二
次構造、二量体化、Ｔｍ）に関する多数の方法が周知で
ある。特に有用なのは、ソフトウェアハパッケージ、例
えば、オリゴ（Ｏｌｉｇｏ）ＴＭ（ナショナル・バイオ
サイエンシズ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ）、プリマス、ＭＮ）またはＰＣ−ジーン（Ｇｅｎ
ｅ）ＴＭ（インテリジェネティクス。インコーポレーテ
ッド（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、
ジュネーブ、スイス）である。
ウム・イントラセルレアＤＮＡの検定検出用にオリゴー
マを同定した方法を例証する。最初に、配列ｐＭＡＶ−
２９を前記のようにサザンブロットハイブリダイセーシ
ョンにおいて鳥型結核菌／Ｍ．イントラセルレアに対す
る適当な特異性を決定するようにスクリーンした。第二
に、ＳＤＡ（前記にも記載した）を用いる標的ＤＮＡの
増幅を可能にする条件を生じさせた。ＳＤＡを用いる増
幅がいったん達成されると、増幅された標的の中心部分
が検定オリゴマーの結合用に存在する。これらのオリゴ
マーは、ＳＤＡプライマーとの競合を最小限にするよう
に設計すべきである。更に、これらのオリゴマーの二次
構造は最小限であるべきであり、ホモ二量体化およびヘ
テロ二量体化がある。最後に、融解温度（Ｔｍ）を調整
して、標的−オリゴマー二重らせんに高特異性を与える
が予想されたハイブリダイセーション条件下での検出の
感受性を低減しないようにすべきである。当該技術分野
においてオリゴマーハイブリダイセーションの評価（二
次構造、二量体化、Ｔｍ）に関する多数の方法が周知で
ある。特に有用なのは、ソフトウェアハパッケージ、例
えば、オリゴ（Ｏｌｉｇｏ）ＴＭ（ナショナル・バイオ
サイエンシズ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ）、プリマス、ＭＮ）またはＰＣ−ジーン（Ｇｅｎ
ｅ）ＴＭ（インテリジェネティクス。インコーポレーテ
ッド（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、
ジュネーブ、スイス）である。
【００５０】鳥型結核菌／Ｍ．イントラセルレアＳＤＡ
生成物の検出用オリゴマーの設計は上述の計画にしたが
った。検出用に用いるためのＳＤＡ生成物の内部領域は
２１ヌクレオチド長さであった。検定においてオリゴマ
ーに必要な特異性およびＴｍを満足させるには、検出オ
リゴマーがＳＤＡオリゴマーと重複する必要があった。
競合は、ハイブリダイセーションに対する必要条件が満
たされている間最小限に保たれた。検出オリゴマーは長
さが１３〜１５ヌクレオチドから成るように設計され
た。ホモ二量体化は２〜８塩基間で保持され、理想的な
条件は６〜８塩基またはそれ未満であった。ヘテロ二量
体化は２〜６塩基間で保持され、理想的には３〜５塩基
またはそれ未満であった。いずれの二次構造も（すなわ
ち、ヘアピンループ）、計算されたギブズの自由エネル
ギーが−２．０ｋｃａｌ／モルより大であった場合、許
容された。これらの実験において、計算法によって決定
される（オリゴまたはＰＣジーンソフトウェア）最も適
当な二次構造に関するギブズの自由エネルギーは、概し
て、−２〜３ｋｃａｌ／モルであった。融解温度は、オ
リゴマー濃度、オリゴマーのＧＣ％並びに塩化ナトリウ
ム（ＮａＣｌ）濃度およびオリゴマー長さによって指定
された。オリゴマー濃度は１〜４０ｎＭであってよく、
理想的には５〜２０ｎＭである。ＮａＣｌ濃度は１〜１
０００ｍＭであってよく、理想的には５〜５００ｍＭ
ＮａＣｌである。ＧＣ％（Ｇ＋Ｃ／Ｇ＋Ｃ＋Ａ＋Ｔ）は
４０〜８０％であってよく、好ましいのは４５〜７０％
である。上記因子は、計算された融解温度が２０〜７０
℃、最も好ましくは２５℃より大であるように調整する
ことができる。
生成物の検出用オリゴマーの設計は上述の計画にしたが
った。検出用に用いるためのＳＤＡ生成物の内部領域は
２１ヌクレオチド長さであった。検定においてオリゴマ
ーに必要な特異性およびＴｍを満足させるには、検出オ
リゴマーがＳＤＡオリゴマーと重複する必要があった。
競合は、ハイブリダイセーションに対する必要条件が満
たされている間最小限に保たれた。検出オリゴマーは長
さが１３〜１５ヌクレオチドから成るように設計され
た。ホモ二量体化は２〜８塩基間で保持され、理想的な
条件は６〜８塩基またはそれ未満であった。ヘテロ二量
体化は２〜６塩基間で保持され、理想的には３〜５塩基
またはそれ未満であった。いずれの二次構造も（すなわ
ち、ヘアピンループ）、計算されたギブズの自由エネル
ギーが−２．０ｋｃａｌ／モルより大であった場合、許
容された。これらの実験において、計算法によって決定
される（オリゴまたはＰＣジーンソフトウェア）最も適
当な二次構造に関するギブズの自由エネルギーは、概し
て、−２〜３ｋｃａｌ／モルであった。融解温度は、オ
リゴマー濃度、オリゴマーのＧＣ％並びに塩化ナトリウ
ム（ＮａＣｌ）濃度およびオリゴマー長さによって指定
された。オリゴマー濃度は１〜４０ｎＭであってよく、
理想的には５〜２０ｎＭである。ＮａＣｌ濃度は１〜１
０００ｍＭであってよく、理想的には５〜５００ｍＭ
ＮａＣｌである。ＧＣ％（Ｇ＋Ｃ／Ｇ＋Ｃ＋Ａ＋Ｔ）は
４０〜８０％であってよく、好ましいのは４５〜７０％
である。上記因子は、計算された融解温度が２０〜７０
℃、最も好ましくは２５℃より大であるように調整する
ことができる。
【００５１】実施例４ 被覆微量滴定プレートの製造 ビオチニル化ウシ血清アルブミン（ビオチン＊ＢＳＡ）
（ピアス、ロックフォード、ＩＬ）を０．３Ｍグリシン
ｐＨ９．６（ＢＲＬ、ベセスダ、ＭＤ、オートクレーブ
処理された水を用いて製造された）中で１ｕｇ／ウェル
まで希釈し、そして各ウェル（２００ｕｌ／ウェル）
（ダイナテク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）、シャンティリー、
ＶＡ）中にピペットで移し、そして４℃で一晩中インキ
ュベートした。プレートを，オートクレーブ処理された
水を用いて製造されたＦＴＡ血球凝集反応用緩衝液（ベ
クトン・ディキンソン・ミクロバイオロジー・システム
ズ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、コッカイスビレ、Ｍ
Ｄ）ｐＨ７．２を用いて２回（３７５ｕｌ／洗浄）洗浄
した。血球凝集反応用緩衝液中のストレプトアビジン
（５ｕｇ／ウェル）をビオチン＊ＢＳＡ被覆微量滴定ウ
ェル（１００ｕｌ／ウェル）に対して加えた。プレート
に蓋をして３７℃で１時間インキュベートした。非結合
ストレプトアビジンを倒置によって捨て、そして阻止用
緩衝液（３００ｕｌ／ウェル）（血球凝集反応用緩衝液
ｐＨ７．２、０．０５％ｗ／ｖウシ血清アルブミン、シ
グマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ．）、セント・ルイス、Ｍｏ）を加えた。
プレートに蓋をしてインキュベートし（３７℃３０分
間）、そして阻止用緩衝液を倒置によって捨てた。プレ
ートを血球凝集反応用緩衝液（３７５ｕｌ／ウェル）で
２回、続いて２％ｗ／ｖトレハロース含有血球凝集反応
用緩衝液（３７５ｕｌ／ウェル）（フルカ（Ｆｌｕｋ
ａ）、ロンコンコマ、Ｎ．Ｙ．）を用いて１回洗浄し
た。プレートを０．５トル未満の真空下において２５℃
で約４時間乾燥させ、マイラーパウチ中に乾燥剤と一緒
に密封し、そして使用前に室温で一晩中貯蔵した。その
後、プレートを２〜８℃で貯蔵した。
（ピアス、ロックフォード、ＩＬ）を０．３Ｍグリシン
ｐＨ９．６（ＢＲＬ、ベセスダ、ＭＤ、オートクレーブ
処理された水を用いて製造された）中で１ｕｇ／ウェル
まで希釈し、そして各ウェル（２００ｕｌ／ウェル）
（ダイナテク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）、シャンティリー、
ＶＡ）中にピペットで移し、そして４℃で一晩中インキ
ュベートした。プレートを，オートクレーブ処理された
水を用いて製造されたＦＴＡ血球凝集反応用緩衝液（ベ
クトン・ディキンソン・ミクロバイオロジー・システム
ズ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、コッカイスビレ、Ｍ
Ｄ）ｐＨ７．２を用いて２回（３７５ｕｌ／洗浄）洗浄
した。血球凝集反応用緩衝液中のストレプトアビジン
（５ｕｇ／ウェル）をビオチン＊ＢＳＡ被覆微量滴定ウ
ェル（１００ｕｌ／ウェル）に対して加えた。プレート
に蓋をして３７℃で１時間インキュベートした。非結合
ストレプトアビジンを倒置によって捨て、そして阻止用
緩衝液（３００ｕｌ／ウェル）（血球凝集反応用緩衝液
ｐＨ７．２、０．０５％ｗ／ｖウシ血清アルブミン、シ
グマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ．）、セント・ルイス、Ｍｏ）を加えた。
プレートに蓋をしてインキュベートし（３７℃３０分
間）、そして阻止用緩衝液を倒置によって捨てた。プレ
ートを血球凝集反応用緩衝液（３７５ｕｌ／ウェル）で
２回、続いて２％ｗ／ｖトレハロース含有血球凝集反応
用緩衝液（３７５ｕｌ／ウェル）（フルカ（Ｆｌｕｋ
ａ）、ロンコンコマ、Ｎ．Ｙ．）を用いて１回洗浄し
た。プレートを０．５トル未満の真空下において２５℃
で約４時間乾燥させ、マイラーパウチ中に乾燥剤と一緒
に密封し、そして使用前に室温で一晩中貯蔵した。その
後、プレートを２〜８℃で貯蔵した。
【００５２】検定は、ＳＤＡで増幅した標的ＤＮＡの検
出用に２個のオリゴマー（プローブ）を用いる。微量滴
定プレート上の標的ＤＮＡおよびストレプトアビジンに
対して結合するためのビオチニル化（ＢＢＢ）捕捉プロ
ーブ。第二検出プローブをアルカリ性ホスファターゼ
（ＡＰ）と結合し、そして標的ＤＮＡに対して結合す
る。ＡＰは、比色分析、蛍光定量法または化学発光によ
る検出の機会を与える。この検定は、ＳＤＡによって増
幅された特異的鳥型結核菌およびミコバクテリウム・イ
ントラセルレアＤＮＡの検出用の下記のプローブである
プローブセット３を用いた。
出用に２個のオリゴマー（プローブ）を用いる。微量滴
定プレート上の標的ＤＮＡおよびストレプトアビジンに
対して結合するためのビオチニル化（ＢＢＢ）捕捉プロ
ーブ。第二検出プローブをアルカリ性ホスファターゼ
（ＡＰ）と結合し、そして標的ＤＮＡに対して結合す
る。ＡＰは、比色分析、蛍光定量法または化学発光によ
る検出の機会を与える。この検定は、ＳＤＡによって増
幅された特異的鳥型結核菌およびミコバクテリウム・イ
ントラセルレアＤＮＡの検出用の下記のプローブである
プローブセット３を用いた。
【００５３】５′ＢＢＢ−Ａ ＡＣＣ ＧＧＴ ＧＡＣ
ＴＣＣ Ａ ３′（配列番号１０） ５′ＡＡＡ ＡＣＣ ＴＴＧ ＣＧＧ Ｃ−ＡＰ ３′
（配列番号９） Ｂ：ビオチン ＡＰ：アルカリ性ホスファターゼ 微量滴定プレート検定法 ゲノムコピー１０００個、１００個、１０個、１個、０
個／１０ｕｌを含むＳＤＡ反応物（５０ｕｌ）を以下の
ように製造した。すなわち、ＳＤＡ反応物３５ｕｌ＋Ｓ
ＤＡ希釈用緩衝液（６．２５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ＢＳ
Ａ１２．５ｕｇ／ｍｌ、０．７５ｍＭ ＭｇＣｌ２、
０．１２５ｍＭ ＤＴＴ、０．３７５％グリセロール、
０．３７５％ ＮＭＰ ｐＨ７．６）１４０ｕｌ＋剪断
されたサケ精子ＤＮＡ（シグマ）１２５ｕｇ／ｍｌを滅
菌シリコーン化試験管に加えた。希釈ＳＤＡ反応物を９
５℃まで２分間加熱してＤＮＡを変性させた。試験管を
室温で５分間冷却した後、変性ＳＤＡ反応物５０ｕｌを
各ウェルに対して加えた。その直後にハイブリダイセー
ションミックス（１Ｍリン酸ナトリウム、０．２％ＢＳ
Ａ、４０ｎＭ捕捉プローブ、１０ｎＭ検出プローブ）５
０ｕｌ／ウェルを加えた。プレートに蓋をして３７℃で
４５分間インキュベートした。３種類の緊縮洗浄（３０
０ｕｌ／ウェル）（１０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ
７、０．１％ｗ／ｖウシ血清アルブミン、０．０５％ｖ
／ｖノニデト（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０）を室温で行
なった。各洗浄を除去する前に微量滴定ウェル中で１分
間そのままにした。基質であるルミホス（Ｌｕｍｉｐｈ
ｏｓ）ＴＭ５３０（１００ｕｌ／ウェル、ルミジェン・
インコーポレーテッド（Ｌｕｍｉｇｅｎ Ｉｎｃ．）、
デトロイト、ＭＩ）を加え、そしてプレートに蓋をして
３７℃で３０分間インキュベートした。ルミネセンス
を、組込み時間２秒間／ウェルを用いて微量滴定プレー
トルミノメーター（ラブシステムズ・リサーチ・トライ
アングル（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｔｒｉａｎｇｌｅ）、パーク、ＮＣ）上において３７℃
で読み取った。
ＴＣＣ Ａ ３′（配列番号１０） ５′ＡＡＡ ＡＣＣ ＴＴＧ ＣＧＧ Ｃ−ＡＰ ３′
（配列番号９） Ｂ：ビオチン ＡＰ：アルカリ性ホスファターゼ 微量滴定プレート検定法 ゲノムコピー１０００個、１００個、１０個、１個、０
個／１０ｕｌを含むＳＤＡ反応物（５０ｕｌ）を以下の
ように製造した。すなわち、ＳＤＡ反応物３５ｕｌ＋Ｓ
ＤＡ希釈用緩衝液（６．２５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ＢＳ
Ａ１２．５ｕｇ／ｍｌ、０．７５ｍＭ ＭｇＣｌ２、
０．１２５ｍＭ ＤＴＴ、０．３７５％グリセロール、
０．３７５％ ＮＭＰ ｐＨ７．６）１４０ｕｌ＋剪断
されたサケ精子ＤＮＡ（シグマ）１２５ｕｇ／ｍｌを滅
菌シリコーン化試験管に加えた。希釈ＳＤＡ反応物を９
５℃まで２分間加熱してＤＮＡを変性させた。試験管を
室温で５分間冷却した後、変性ＳＤＡ反応物５０ｕｌを
各ウェルに対して加えた。その直後にハイブリダイセー
ションミックス（１Ｍリン酸ナトリウム、０．２％ＢＳ
Ａ、４０ｎＭ捕捉プローブ、１０ｎＭ検出プローブ）５
０ｕｌ／ウェルを加えた。プレートに蓋をして３７℃で
４５分間インキュベートした。３種類の緊縮洗浄（３０
０ｕｌ／ウェル）（１０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ
７、０．１％ｗ／ｖウシ血清アルブミン、０．０５％ｖ
／ｖノニデト（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０）を室温で行
なった。各洗浄を除去する前に微量滴定ウェル中で１分
間そのままにした。基質であるルミホス（Ｌｕｍｉｐｈ
ｏｓ）ＴＭ５３０（１００ｕｌ／ウェル、ルミジェン・
インコーポレーテッド（Ｌｕｍｉｇｅｎ Ｉｎｃ．）、
デトロイト、ＭＩ）を加え、そしてプレートに蓋をして
３７℃で３０分間インキュベートした。ルミネセンス
を、組込み時間２秒間／ウェルを用いて微量滴定プレー
トルミノメーター（ラブシステムズ・リサーチ・トライ
アングル（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｔｒｉａｎｇｌｅ）、パーク、ＮＣ）上において３７℃
で読み取った。
【００５４】結果 上記方法を用いて、検定は鳥型結核菌またはＭ．イント
ラセルレアＤＮＡの１〜１０ゲノムコピーを検出した
（表４および表５を参照されたい）。
ラセルレアＤＮＡの１〜１０ゲノムコピーを検出した
（表４および表５を参照されたい）。
【００５５】
【表４】 実施例５ 上記実施例の方法を用いて、ＳＤＡプライマーと更に多
量に競合するプローブを前述の捕捉および検出用プロー
ブと比較した。更に別のプローブの配列は下記、すなわ
ち、プローブセット１であった。
量に競合するプローブを前述の捕捉および検出用プロー
ブと比較した。更に別のプローブの配列は下記、すなわ
ち、プローブセット１であった。
【００５６】５′ＢＢＢ−Ｇ ＧＧＡ ＡＣＣ ＧＧＴ
ＧＡＣ ＴＣ ３′（配列番号６） ５′ＣＡＡ ＡＡＡ ＣＣＴ ＴＧＣ ＧＧＣ−ＡＰ
３′（配列番号７） Ｂ：ビオチン ＡＰ：アルカリ性ホスファターゼ結果 結果は検定の実施上の競合の有意性を示す。プローブセ
ット３および１の双方の最小の検出可能水準は鳥型結核
菌の１〜１０ゲノムコピーであったが、プローブセット
１を用いる検定の感受性がプローブセット３を用いて得
られた場合に関して低減することにより、競合作用は見
られなかった（表５）。すなわち、プローブセット１
は、ＳＤＡプライマーオリゴデオキシヌクレオチドとの
増大した競合ゆえに低減した感受性を示す。増大した感
受性は増幅された標的および増大した検出限界の優れた
定量に与えられる。
ＧＡＣ ＴＣ ３′（配列番号６） ５′ＣＡＡ ＡＡＡ ＣＣＴ ＴＧＣ ＧＧＣ−ＡＰ
３′（配列番号７） Ｂ：ビオチン ＡＰ：アルカリ性ホスファターゼ結果 結果は検定の実施上の競合の有意性を示す。プローブセ
ット３および１の双方の最小の検出可能水準は鳥型結核
菌の１〜１０ゲノムコピーであったが、プローブセット
１を用いる検定の感受性がプローブセット３を用いて得
られた場合に関して低減することにより、競合作用は見
られなかった（表５）。すなわち、プローブセット１
は、ＳＤＡプライマーオリゴデオキシヌクレオチドとの
増大した競合ゆえに低減した感受性を示す。増大した感
受性は増幅された標的および増大した検出限界の優れた
定量に与えられる。
【００５７】
【表５】 要約 １０コピー未満の鳥型結核菌／Ｍ．イントラセルレアか
らのＳＤＡで増幅されたＤＮＡ検出用のオリゴヌクレオ
チド試薬をどのように設計するかを示す方法を提示す
る。
らのＳＤＡで増幅されたＤＮＡ検出用のオリゴヌクレオ
チド試薬をどのように設計するかを示す方法を提示す
る。
【００５８】本発明を具体的な修正に関して記載してき
たが、様々な同等物、変更および修正を本発明の精神お
よび範囲を逸脱することなく用いることができることは
明らかであるので、その詳細を制限と解釈すべきではな
く、そしてこのような同等の実施態様は本発明中に包含
されるものであることは理解される。
たが、様々な同等物、変更および修正を本発明の精神お
よび範囲を逸脱することなく用いることができることは
明らかであるので、その詳細を制限と解釈すべきではな
く、そしてこのような同等の実施態様は本発明中に包含
されるものであることは理解される。
【００５９】実施例６ ゲノムＤＮＡを、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ブラウン大学（Ｂｒｏ
ｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、トルドー・ミクロバイ
オロジカル・コレクション（ｔｈｅ Ｔｒｕｄｅａｕ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ）、ラボラトリーズ・センター・ディスィーズ・コン
トロール（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｅｎｔｅｒ
Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）（カナダ）およびロ
ーリー・ヴェテランズ・アドミニストレーション・ホス
ピタル（ｔｈｅ Ｒａｌｅｉｇｈ Ｖｅｔｅｒａｎｓ
Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）か
ら入手した。次に、これらのＤＮＡ検体を、１０6コピ
ーの精製ゲノムＤＮＡのアリコートを用いてスクリーン
し、そして上記の実施例２および４に実質的にしたがっ
て記載されたようにＳＤＡおよびマイクロウェル検定を
行なった。結果は、合成された標的ＤＮＡに関する検定
結果を用いて計算され、そして見掛けのゲノムコピー数
を各検体に関して推定した。Ｍ．イントラセルレア、鳥
型結核菌およびパラ結核菌の場合、コピー数は約１００
０であると推定された。これは検定方法の上限より大き
い。他の結果はいずれも、１０6より大きい相対的特異
性（加えられたゲノムコピー／推定のゲノムコピー）を
示す推定コピー１７未満であった（表６）。これらの結
果は、Ｍ．イントラセルレア、鳥型結核菌およびパラ結
核菌に対する高い特異性を示している。
レクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ブラウン大学（Ｂｒｏ
ｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、トルドー・ミクロバイ
オロジカル・コレクション（ｔｈｅ Ｔｒｕｄｅａｕ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ）、ラボラトリーズ・センター・ディスィーズ・コン
トロール（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｅｎｔｅｒ
Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）（カナダ）およびロ
ーリー・ヴェテランズ・アドミニストレーション・ホス
ピタル（ｔｈｅ Ｒａｌｅｉｇｈ Ｖｅｔｅｒａｎｓ
Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）か
ら入手した。次に、これらのＤＮＡ検体を、１０6コピ
ーの精製ゲノムＤＮＡのアリコートを用いてスクリーン
し、そして上記の実施例２および４に実質的にしたがっ
て記載されたようにＳＤＡおよびマイクロウェル検定を
行なった。結果は、合成された標的ＤＮＡに関する検定
結果を用いて計算され、そして見掛けのゲノムコピー数
を各検体に関して推定した。Ｍ．イントラセルレア、鳥
型結核菌およびパラ結核菌の場合、コピー数は約１００
０であると推定された。これは検定方法の上限より大き
い。他の結果はいずれも、１０6より大きい相対的特異
性（加えられたゲノムコピー／推定のゲノムコピー）を
示す推定コピー１７未満であった（表６）。これらの結
果は、Ｍ．イントラセルレア、鳥型結核菌およびパラ結
核菌に対する高い特異性を示している。
【００６０】
【表６】
【００６１】
配列番号：１ 配列の長さ：９７ 配列の型：核酸 鎖の型：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 TGGCCAAACT GTGGGCGCAG GCCTGCGAGT GGGAACCGGT GACTCCAAAA 50 ACCTTGCGGC TCTTACAAGT CGGTGGCGCC AAGCTGGAGC CCGAGGA 97 配列番号：２ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の型：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 TTGAATAGTC GGTTACTTGT TGACTCCTCG GGCTCCA 37 配列番号：３ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の型：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 TTGAAGTAAC CGACTATTGT TGACTGGCCA AACTGTG 37 配列番号：４ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の型：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 TTGAATAGTA GGTAAGTTGT TGACACTTGT AAGAGCC 37 配列番号：５ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の型：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 TTGAAGTAAC CGACTATTGT TGACTGCGAG TGGGAAC 37 配列番号：６ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の型：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 GGGAACCGGT GACTC 15 配列番号：７ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の型：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 CAAAAACCTT GCGGC 15 配列番号：８ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の型：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 AACCGGTGAC TCCA 14 配列番号：９ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の型：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 AAAACCTTGC GGC 13 配列番号：１０ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の型：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 AACCGGTGAC TCCA 14 配列番号：１１ 配列の長さ：４７ 配列の型：核酸 鎖の型：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 GCGAGTGGGA ACCGGTGACT CCAAAAACCT TGCGGCTCTT ACAAGTC 47 配列番号：１２ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 鎖の型：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 AACCGGTGAC TCCAAAAACC TTGCGGCTCT TACAAGTCGG TGGCGCCAAG 50 配列番号：１３ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 鎖の型：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 GATCCCAGCC CCGAGGCGGC CTTCGCCAGT CGACCGCCAT GGCGTCACGG 50 配列番号：１４ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 鎖の型：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 GGGAACCGGT GACTCCAAAA ACCTTGCGGC TCTTACAAGT CGGTGGCGCC 50 配列番号：１５ 配列の長さ：１０７ 配列の型：核酸 鎖の型：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 GGCCAAACTG TGGGCGCAGG CCTGCGAGTG GGAACCGGTG ACTCCAAAAA 50 CCTTGCGGCT CTTACAAGTC GGTGGCGCCA AGCTGGAGCC CGAGGACGCC 100 CCGCCTG 107
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジェームズ・リー・スクラム アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27545，ナイトデール，ドゥエリング・プ レース 102 (72)発明者 ダリル・ディー・シャンク アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27712，ダーラム，ドノフィル・ドライブ 1108 (72)発明者 グレン・フィランダー・ヴォンク アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27526，ファクェイ−ヴァリナ，ピニー・ グローヴ・ウィルボーン・ロード 2717
Claims (10)
- 【請求項１】 配列番号１、配列番号２、配列番号３、
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配
列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列
番号１５並びにその修飾主鎖、修飾ヌクレオチド、標識
型およびリボ核酸型から本質的に成る配列を有するプロ
ーブ。 - 【請求項２】 リボ核酸型である請求項１に記載のプロ
ーブ。 - 【請求項３】 鳥型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ａｖｉｕｍ）、ミコバクテリウム・イントラセルレ
ア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌ
ｕｌａｒｅ）またはパラ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｕｃｕｌｏｓｉｓ）を、配
列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列
番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番
号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配
列番号１３、配列番号１４または配列番号１５並びにそ
の修飾主鎖、修飾ヌクレオチド、標識型およびリボ核酸
型から本質的に成る配列より選択される１種類またはそ
れ以上の核酸配列の使用によって増幅する方法。 - 【請求項４】 核酸配列がそのデオキシリボ核酸型であ
る請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 配列番号１、配列番号２、配列番号３、
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配
列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列
番号１５並びにその修飾主鎖、修飾ヌクレオチド、標識
型およびリボ核酸型から本質的に成る配列より選択され
る１種類またはそれ以上の核酸配列の使用を含む、鳥型
結核菌、ミコバクテリウム・イントラセルレアまたはパ
ラ結核菌を検出する方法。 - 【請求項６】 核酸配列がそのデオキシリボ核酸型であ
る請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 配列番号１、配列番号２、配列番号３、
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配
列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列
番号１５並びにその修飾主鎖、修飾ヌクレオチド、標識
型およびリボ核酸型から本質的に成る配列より選択され
る１種類またはそれ以上の配列の使用を含む、鳥型結核
菌、ミコバクテリウム・イントラセルレアまたはパラ結
核菌を増幅し且つ該増幅生成物を検出する方法。 - 【請求項８】 核酸配列がそのデオキシリボ核酸型であ
る請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 配列番号１、配列番号２、配列番号３、
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配
列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列
番号１５並びにその修飾主鎖、修飾ヌクレオチド、標識
型およびリボ核酸型から本質的に成る配列より選択され
る核酸配列を含むキット。 - 【請求項１０】 核酸配列がそのデオキシリボ核酸型で
ある請求項９に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/973,342 US5314801A (en) | 1992-11-06 | 1992-11-06 | Probes to Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, and Mycobacterium paratuberculosis |
| US973342 | 1992-11-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06209799A true JPH06209799A (ja) | 1994-08-02 |
| JP2547517B2 JP2547517B2 (ja) | 1996-10-23 |
Family
ID=25520783
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5278622A Expired - Fee Related JP2547517B2 (ja) | 1992-11-06 | 1993-11-08 | 鳥型結核菌、ミコバクテリウム・イントラセルレアおよびパラ結核菌に対するプローブ |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5314801A (ja) |
| EP (1) | EP0596445B1 (ja) |
| JP (1) | JP2547517B2 (ja) |
| AU (1) | AU675080B2 (ja) |
| CA (1) | CA2102136A1 (ja) |
| DE (1) | DE69323267T2 (ja) |
| MY (1) | MY118636A (ja) |
| SG (1) | SG44678A1 (ja) |
| TW (1) | TW286326B (ja) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2683227B1 (fr) * | 1991-10-31 | 1994-03-04 | Pasteur Institut | Sequences nucleotidiques hybridant avec les souches bacteriennes du complexe mycobacterium avium-intracellulare, leur utilisation comme amorces oligonucleotidiques et sondes nucleiques. |
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