JPH11290099A - Ｈｉｖ検出用プライマー及びプローブ - Google Patents
Ｈｉｖ検出用プライマー及びプローブInfo
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- JPH11290099A JPH11290099A JP10102671A JP10267198A JPH11290099A JP H11290099 A JPH11290099 A JP H11290099A JP 10102671 A JP10102671 A JP 10102671A JP 10267198 A JP10267198 A JP 10267198A JP H11290099 A JPH11290099 A JP H11290099A
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- Japan
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- hiv
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- oligonucleotide
- nucleic acid
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Abstract
(57)【要約】
【課題】従来可能であったより多くのＨＩＶ−１のサブ
タイプを検出できる試薬及び方法を提供すること。 【解決手段】ＨＩＶ−１のｇａｇ遺伝子のヌクレオチド
位置９００から３’末端までの範囲から選ばれる配列を
含むＨＩＶ−１特異的オリゴヌクレオチド、少なくとも
２個の異なる前記オリゴヌクレオチドを含むことを特徴
とするＨＩＶ−１核酸の増幅用プライマーセット、少な
くとも５つのサブタイプのＨＩＶ−１の核酸を検出及び
増幅することを特徴とする、プライマーセットを用いる
ＨＩＶ−１核酸の特異的増幅方法並びに前記プライマー
セットを用いて増幅が行なわれることを特徴とする、Ｈ
ＩＶ−１の核酸配列の増幅及び増幅産物の検出によるＨ
ＩＶ−１の検出方法。
タイプを検出できる試薬及び方法を提供すること。 【解決手段】ＨＩＶ−１のｇａｇ遺伝子のヌクレオチド
位置９００から３’末端までの範囲から選ばれる配列を
含むＨＩＶ−１特異的オリゴヌクレオチド、少なくとも
２個の異なる前記オリゴヌクレオチドを含むことを特徴
とするＨＩＶ−１核酸の増幅用プライマーセット、少な
くとも５つのサブタイプのＨＩＶ−１の核酸を検出及び
増幅することを特徴とする、プライマーセットを用いる
ＨＩＶ−１核酸の特異的増幅方法並びに前記プライマー
セットを用いて増幅が行なわれることを特徴とする、Ｈ
ＩＶ−１の核酸配列の増幅及び増幅産物の検出によるＨ
ＩＶ−１の検出方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、オリゴヌクレオチ
ドに関する。より詳細には、ＨＩＶ検出用プライマー及
びプローブ、さらにこれらのプライマー及びプローブを
用いるＨＩＶの検出方法に関する。
ドに関する。より詳細には、ＨＩＶ検出用プライマー及
びプローブ、さらにこれらのプライマー及びプローブを
用いるＨＩＶの検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の検出
は、分析診断学上の最も偉大な挑戦の１つである。この
手法のために、ＨＩＶ抗原若しくはＨＩＶにより誘導さ
れる抗体の免疫学的検出、ＨＩＶ固有の逆転写酵素等の
ＨＩＶ固有の酵素又はＨＩＶ特異的核酸のいずれかに基
づく多くの方法がすでに利用可能である。原因剤及びそ
れに付随する核酸がヒトの体液に非常に低濃度で存在し
ているので、従って、検出方法の感度は、その利用可能
性に対して決定的な因子である。例えば、欧州特許ＥＰ
−Ｂ−０ ２００ ３６２号明細書及び欧州特許ＥＰ−
Ｂ−０ ２０１１８４号明細書に記載のポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）は、ＨＩＶの直接検出に対して、現時
点で最も高感度の方法である。ＰＣＲを用いると、感染
者由来の血液試料から、疾患の経過及び治療のモニター
に関する重要な情報を得ることができる。ＨＩＶ核酸の
部分増幅に依らない検出方法又はＨＩＶ核酸が検出され
るプローブとのハイブリダイゼーションのみを含む検出
方法は、ＰＣＲほど感度がよくない。
は、分析診断学上の最も偉大な挑戦の１つである。この
手法のために、ＨＩＶ抗原若しくはＨＩＶにより誘導さ
れる抗体の免疫学的検出、ＨＩＶ固有の逆転写酵素等の
ＨＩＶ固有の酵素又はＨＩＶ特異的核酸のいずれかに基
づく多くの方法がすでに利用可能である。原因剤及びそ
れに付随する核酸がヒトの体液に非常に低濃度で存在し
ているので、従って、検出方法の感度は、その利用可能
性に対して決定的な因子である。例えば、欧州特許ＥＰ
−Ｂ−０ ２００ ３６２号明細書及び欧州特許ＥＰ−
Ｂ−０ ２０１１８４号明細書に記載のポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）は、ＨＩＶの直接検出に対して、現時
点で最も高感度の方法である。ＰＣＲを用いると、感染
者由来の血液試料から、疾患の経過及び治療のモニター
に関する重要な情報を得ることができる。ＨＩＶ核酸の
部分増幅に依らない検出方法又はＨＩＶ核酸が検出され
るプローブとのハイブリダイゼーションのみを含む検出
方法は、ＰＣＲほど感度がよくない。
【０００３】ＨＩＶ−１の発見以来、異なる起源を有す
るＨＩＶ−１の核酸配列が互いに異なることが決定され
た。異なる型のＨＩＶ−１を、通常サブタイプと称す
る。現時点で、少なくとも９個のサブタイプが知られ、
サブタイプＡ〜Ｈ及びＯと同定されている（例えば、Hu
man Retroviruses and AIDS, Los Alamos Natl. Labora
tory, Los Alamos, New Mexico, 1994; G. Myersら編、
I-A-2 〜I-A-49) 。これまでに記載された方法は、５個
以上のこれらのサブタイプを検出できず、特に他のサブ
タイプとともに存在するサブタイプＡ及びＧが検出でき
ない。
るＨＩＶ−１の核酸配列が互いに異なることが決定され
た。異なる型のＨＩＶ−１を、通常サブタイプと称す
る。現時点で、少なくとも９個のサブタイプが知られ、
サブタイプＡ〜Ｈ及びＯと同定されている（例えば、Hu
man Retroviruses and AIDS, Los Alamos Natl. Labora
tory, Los Alamos, New Mexico, 1994; G. Myersら編、
I-A-2 〜I-A-49) 。これまでに記載された方法は、５個
以上のこれらのサブタイプを検出できず、特に他のサブ
タイプとともに存在するサブタイプＡ及びＧが検出でき
ない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、前
記従来技術に鑑みてなされたものであり、本発明の目的
は、従来可能であったより多くのＨＩＶ−１のサブタイ
プを検出できる試薬及び方法を提供することにある。
記従来技術に鑑みてなされたものであり、本発明の目的
は、従来可能であったより多くのＨＩＶ−１のサブタイ
プを検出できる試薬及び方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明の要旨
は、（１） ＨＩＶ−１のｇａｇ遺伝子のヌクレオチド
位置９００から３’末端までの範囲から選ばれる配列を
含むＨＩＶ−１特異的オリゴヌクレオチド、（２） 該
配列が、ＨＩＶ−１サブタイプＢのｇａｇ遺伝子のヌク
レオチド位置９００から３’末端までの範囲から選ばれ
ることを特徴とする前記（１）記載のオリゴヌクレオチ
ド、（３） 該配列が、配列番号：１の１０を越える連
続した塩基の塩基配列と８０％を越えるホモロジー又は
８０％を越える相補性を有することを特徴とする前記
（１）又は（２）記載のオリゴヌクレオチド、（４）
非ＨＩＶ特異的標識をさらに含むことを特徴とする前記
（１）〜（３）いずれか記載のオリゴヌクレオチド、
（５） 前記（１）〜（３）いずれか記載の少なくとも
２個の異なるオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とす
る、ＨＩＶ−１核酸の増幅用プライマーセット、（６）
少なくとも５つのサブタイプのＨＩＶ−１の核酸を検
出及び増幅することを特徴とする、プライマーセットを
用いるＨＩＶ−１核酸の特異的増幅方法、（７） 前記
（５）記載のセットをプライマーセットとして用いるこ
とを特徴とする、前記（６）記載の特異的増幅方法、
（８） 前記（５）記載のプライマーセットを用いて増
幅が行なわれることを特徴とする、ＨＩＶ−１の核酸配
列の増幅及び増幅産物の検出によるＨＩＶ−１の検出方
法、（９） 前記（４）記載のオリゴヌクレオチドを核
酸プローブとして用いて、検出が行なわれることを特徴
とする、前記（８）記載の検出方法、に関する。
は、（１） ＨＩＶ−１のｇａｇ遺伝子のヌクレオチド
位置９００から３’末端までの範囲から選ばれる配列を
含むＨＩＶ−１特異的オリゴヌクレオチド、（２） 該
配列が、ＨＩＶ−１サブタイプＢのｇａｇ遺伝子のヌク
レオチド位置９００から３’末端までの範囲から選ばれ
ることを特徴とする前記（１）記載のオリゴヌクレオチ
ド、（３） 該配列が、配列番号：１の１０を越える連
続した塩基の塩基配列と８０％を越えるホモロジー又は
８０％を越える相補性を有することを特徴とする前記
（１）又は（２）記載のオリゴヌクレオチド、（４）
非ＨＩＶ特異的標識をさらに含むことを特徴とする前記
（１）〜（３）いずれか記載のオリゴヌクレオチド、
（５） 前記（１）〜（３）いずれか記載の少なくとも
２個の異なるオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とす
る、ＨＩＶ−１核酸の増幅用プライマーセット、（６）
少なくとも５つのサブタイプのＨＩＶ−１の核酸を検
出及び増幅することを特徴とする、プライマーセットを
用いるＨＩＶ−１核酸の特異的増幅方法、（７） 前記
（５）記載のセットをプライマーセットとして用いるこ
とを特徴とする、前記（６）記載の特異的増幅方法、
（８） 前記（５）記載のプライマーセットを用いて増
幅が行なわれることを特徴とする、ＨＩＶ−１の核酸配
列の増幅及び増幅産物の検出によるＨＩＶ−１の検出方
法、（９） 前記（４）記載のオリゴヌクレオチドを核
酸プローブとして用いて、検出が行なわれることを特徴
とする、前記（８）記載の検出方法、に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明の主題は、配列が、ＨＩＶ
−１のｇａｇ遺伝子のヌクレオチド位置９００から３’
末端までの領域から選ばれることを特徴とするＨＩＶ−
１特異的オリゴヌクレオチドである。
−１のｇａｇ遺伝子のヌクレオチド位置９００から３’
末端までの領域から選ばれることを特徴とするＨＩＶ−
１特異的オリゴヌクレオチドである。
【０００７】オリゴヌクレオチドとは、一定の間隔で主
として同一のモノマーユニットからなるバックボーン上
に塩基配列を有する分子であると解される。該塩基は、
該オリゴヌクレオチドの塩基と相補的な塩基配列を有す
る核酸との結合に加わることができるように、該バック
ボーン上で配置される。最も通常のオリゴヌクレオチド
は、糖リン酸ユニットのバックボーンを有する。２’ユ
ニットでヒドロキシル基を有しないオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドと、この位置でヒドロキシル基を有するオ
リゴリボヌクレオチドとの識別がなされる。しかしなが
ら、オリゴリボヌクレオチドは、ヒドロキシル基の水素
原子がアリル基等の有機基で置換している化合物も含
む。この性質の化合物は、当業者にとって全く公知であ
る。最近、通常のオリゴヌクレオチドの糖リン酸バック
ボーンがペプチドバックボーンに置換されている分子も
記載されている。この性質の化合物の特に好ましい群
は、国際公開第９２／２０７０２号パンフレットに記載
され、ＰＮＡと称される。これらの化合物及びオリゴヌ
クレオチドの両方とも、相補的な塩基と水素結合化合物
を形成可能な塩基をバックボーン上に有する。これらの
塩基は、天然の塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ及びＵ並びにデアザ
Ｇ等の人工塩基を含む。
として同一のモノマーユニットからなるバックボーン上
に塩基配列を有する分子であると解される。該塩基は、
該オリゴヌクレオチドの塩基と相補的な塩基配列を有す
る核酸との結合に加わることができるように、該バック
ボーン上で配置される。最も通常のオリゴヌクレオチド
は、糖リン酸ユニットのバックボーンを有する。２’ユ
ニットでヒドロキシル基を有しないオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドと、この位置でヒドロキシル基を有するオ
リゴリボヌクレオチドとの識別がなされる。しかしなが
ら、オリゴリボヌクレオチドは、ヒドロキシル基の水素
原子がアリル基等の有機基で置換している化合物も含
む。この性質の化合物は、当業者にとって全く公知であ
る。最近、通常のオリゴヌクレオチドの糖リン酸バック
ボーンがペプチドバックボーンに置換されている分子も
記載されている。この性質の化合物の特に好ましい群
は、国際公開第９２／２０７０２号パンフレットに記載
され、ＰＮＡと称される。これらの化合物及びオリゴヌ
クレオチドの両方とも、相補的な塩基と水素結合化合物
を形成可能な塩基をバックボーン上に有する。これらの
塩基は、天然の塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ及びＵ並びにデアザ
Ｇ等の人工塩基を含む。
【０００８】本発明のオリゴヌクレオチドは、１０〜１
００塩基長が好ましい。これらの塩基の少なくとも１０
〜３０塩基の連続した塩基のホモロジー又は相補性は、
前記ヌクレオチドの位置の領域とは８０％、好ましくは
９０％、特に好ましくは１００％である。利用できるな
らば、残りの塩基（配列の１つの末端又は両末端等）
は、通常ＨＩＶ−１に対するハイブリダイゼーションが
起こり得ないような、試験対象の試料中に含まれるＨＩ
Ｖ−１又は他の核酸と類似しない配列を有することがで
きる。本発明のオリゴヌクレオチドのＨＩＶ−１特異的
領域は、１３〜２５ヌクレオチド長であることが特に好
ましい。
００塩基長が好ましい。これらの塩基の少なくとも１０
〜３０塩基の連続した塩基のホモロジー又は相補性は、
前記ヌクレオチドの位置の領域とは８０％、好ましくは
９０％、特に好ましくは１００％である。利用できるな
らば、残りの塩基（配列の１つの末端又は両末端等）
は、通常ＨＩＶ−１に対するハイブリダイゼーションが
起こり得ないような、試験対象の試料中に含まれるＨＩ
Ｖ−１又は他の核酸と類似しない配列を有することがで
きる。本発明のオリゴヌクレオチドのＨＩＶ−１特異的
領域は、１３〜２５ヌクレオチド長であることが特に好
ましい。
【０００９】第１の配列の連続した塩基が、第２のヌク
レオチド配列の連続した塩基のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃ
ｋ則に従うならば、第１の配列は、本発明によれば第２
のヌクレオチド配列と１００％相補的であると記載され
る。しかしながら、置換対象の塩基と相補的な塩基との
相互作用と類似の特異的相互作用を有する塩基、特に人
工塩基を天然の塩基の代わりに用いた場合、置換が可能
である。本発明において解されるところの第２の配列と
のホモロジーとは、同じ長さの連続した塩基の第２のヌ
クレオチド配列と全く同様に、連続した塩基を有する第
３の核酸に相補的な塩基の連続した元の配列をいう。
レオチド配列の連続した塩基のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃ
ｋ則に従うならば、第１の配列は、本発明によれば第２
のヌクレオチド配列と１００％相補的であると記載され
る。しかしながら、置換対象の塩基と相補的な塩基との
相互作用と類似の特異的相互作用を有する塩基、特に人
工塩基を天然の塩基の代わりに用いた場合、置換が可能
である。本発明において解されるところの第２の配列と
のホモロジーとは、同じ長さの連続した塩基の第２のヌ
クレオチド配列と全く同様に、連続した塩基を有する第
３の核酸に相補的な塩基の連続した元の配列をいう。
【００１０】ＨＩＶ−１の核酸とは、ＨＩＶウイルスに
属するウイルスのゲノムＲＮＡをいう。現時点で、ＨＩ
Ｖ−１のサブタイプＡ〜Ｈ及びＯ間の識別がなされてい
る。これらの核酸の相補性を有するものを、相補的配列
という。
属するウイルスのゲノムＲＮＡをいう。現時点で、ＨＩ
Ｖ−１のサブタイプＡ〜Ｈ及びＯ間の識別がなされてい
る。これらの核酸の相補性を有するものを、相補的配列
という。
【００１１】プライマーとは、モノデオキシリボヌクレ
オシド三リン酸及びマトリックスとして用いる核酸を使
用するＤＮＡポリメラーゼで伸長できるオリゴヌクレオ
チドをいう。このプライマーは、マトリックスとハイブ
リダイズするときに、マトリックス核酸の５’末端に面
する末端に３’−ヒドロキシル基を有することが好まし
い。
オシド三リン酸及びマトリックスとして用いる核酸を使
用するＤＮＡポリメラーゼで伸長できるオリゴヌクレオ
チドをいう。このプライマーは、マトリックスとハイブ
リダイズするときに、マトリックス核酸の５’末端に面
する末端に３’−ヒドロキシル基を有することが好まし
い。
【００１２】プライマーセットとは、少なくとも２つの
型のプライマーの組み合わせ又は混合物をいい、第２の
プライマーが第１のプライマーの伸長可能な末端の３’
方向に位置する伸長産物の領域で、この伸長産物とハイ
ブリダイズでき、かつ、第２のプライマーの伸長可能な
末端が、第１のプライマーの伸長産物の５’方向に位置
するような方法で、伸長産物が生成される間、その第１
のプライマーが、マトリックス核酸を用いて伸長可能で
ある。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行なうために
好適な、この定義に合致するプライマーは、欧州特許Ｅ
Ｐ−Ｂ−０ ２０１ １８４号明細書に記載されてい
る。
型のプライマーの組み合わせ又は混合物をいい、第２の
プライマーが第１のプライマーの伸長可能な末端の３’
方向に位置する伸長産物の領域で、この伸長産物とハイ
ブリダイズでき、かつ、第２のプライマーの伸長可能な
末端が、第１のプライマーの伸長産物の５’方向に位置
するような方法で、伸長産物が生成される間、その第１
のプライマーが、マトリックス核酸を用いて伸長可能で
ある。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行なうために
好適な、この定義に合致するプライマーは、欧州特許Ｅ
Ｐ−Ｂ−０ ２０１ １８４号明細書に記載されてい
る。
【００１３】核酸の増幅とは、核酸又はこれらの核酸の
サブ領域の増幅をいう。例えば、適当なプライマー配列
を選択し、ＰＣＲを用いることにより、１００〜３００
塩基長の一部の核酸を増幅できることが好ましい。
サブ領域の増幅をいう。例えば、適当なプライマー配列
を選択し、ＰＣＲを用いることにより、１００〜３００
塩基長の一部の核酸を増幅できることが好ましい。
【００１４】増幅という用語は、ＲＮＡからＤＮＡへの
転写を含むことも意味する。
転写を含むことも意味する。
【００１５】ＨＩＶ−１のｇａｇ遺伝子とは、例えば、
ｐ２４（カプシド蛋白質）、ｐ１７（マトリックス蛋白
質）及びｐ６をコードする遺伝子をいう。この遺伝子
は、保存領域及び相対的に可変な配列領域を含む。本発
明の中核は、この遺伝子のヌクレオチド位置９００から
３’末端までの範囲内の連続した塩基配列と相補的な又
はホモロジーを有するいずれかの配列の使用である。Ｈ
ＩＶ−１、サブタイプＢ、ＨＩＶ−ＲＦ株のｇａｇ遺伝
子のヌクレオチド位置９００から３’末端までの領域
（配列番号：１、Human Retroviruses and AIDS 1994,
I-A-2 〜I-A-49, Los Alamos National Laboratory, Lo
s Alamos, New Mexico 87545, USA,編者 G.Myers ら)
が、特に好ましい。
ｐ２４（カプシド蛋白質）、ｐ１７（マトリックス蛋白
質）及びｐ６をコードする遺伝子をいう。この遺伝子
は、保存領域及び相対的に可変な配列領域を含む。本発
明の中核は、この遺伝子のヌクレオチド位置９００から
３’末端までの範囲内の連続した塩基配列と相補的な又
はホモロジーを有するいずれかの配列の使用である。Ｈ
ＩＶ−１、サブタイプＢ、ＨＩＶ−ＲＦ株のｇａｇ遺伝
子のヌクレオチド位置９００から３’末端までの領域
（配列番号：１、Human Retroviruses and AIDS 1994,
I-A-2 〜I-A-49, Los Alamos National Laboratory, Lo
s Alamos, New Mexico 87545, USA,編者 G.Myers ら)
が、特に好ましい。
【００１６】ＨＩＶ−１特異性とは、ＨＩＶ−１を除く
付属ヌクレオチド配列が、通常、ＨＩＶ−１の存在を試
験する試料に含まれる核酸には存在しないという特性を
いう。付属ヌクレオチド配列は、完全にユニークである
こと、すなわち、他の試料には全く見出されないことが
特に好ましい。特異的増幅又は特異的検出とは、ＨＩＶ
−１のみが増幅又は検出されるが、該試料中に存在して
もよい他の生物又は核酸が検出されない方法をいう。し
かしながら、本発明において解されるところの配列のＨ
ＩＶ−１特異性とは、該配列が、ＨＩＶ−１の少なくと
も５つのサブタイプを同定し、増幅し、かつ検出する程
度に非特異的であることも意味する。
付属ヌクレオチド配列が、通常、ＨＩＶ−１の存在を試
験する試料に含まれる核酸には存在しないという特性を
いう。付属ヌクレオチド配列は、完全にユニークである
こと、すなわち、他の試料には全く見出されないことが
特に好ましい。特異的増幅又は特異的検出とは、ＨＩＶ
−１のみが増幅又は検出されるが、該試料中に存在して
もよい他の生物又は核酸が検出されない方法をいう。し
かしながら、本発明において解されるところの配列のＨ
ＩＶ−１特異性とは、該配列が、ＨＩＶ−１の少なくと
も５つのサブタイプを同定し、増幅し、かつ検出する程
度に非特異的であることも意味する。
【００１７】本発明のオリゴヌクレオチドは、記載され
た位置の範囲内で特異的な好ましい方法を使用して同定
することができる。本発明の方法は、ＨＩＶ−１のサブ
タイプのある１つの株、好ましくはサブタイプＢの株、
特に好ましくはＲＦ株由来の付属配列に基づくものであ
る。本発明の方法において、ＧＣ含有量が５０〜６０％
の２０〜３０塩基長の部分配列、３’末端の非自己相補
性及び３’末端のＣＧランがないこと又はパリンドロー
ムを、該配列においてコンピュータープログラムを用い
て検索することが好ましい。例えば、前述の「Human Re
troviruses andAIDS 」、1994年のテキストを使用し
て、該株のこの配列に属するサブタイプのコンセンサス
配列を決定する。コンセンサス配列とは、所定の位置の
すべての株で最も優勢な塩基を含む配列である。残りの
サブタイプ、好ましくはサブタイプＡ及びＣないしＨの
同じ位置のコンセンサス配列と２個以下のミスマッチを
有するコンセンサス配列のみを、さらに処理した。これ
らの配列がそれらの３’末端で１つの株とミスマッチを
有するならば、これらのヌクレオチド（該末端から１〜
２ヌクレオチド離れたもの）は、これらの配列には含ま
れない。
た位置の範囲内で特異的な好ましい方法を使用して同定
することができる。本発明の方法は、ＨＩＶ−１のサブ
タイプのある１つの株、好ましくはサブタイプＢの株、
特に好ましくはＲＦ株由来の付属配列に基づくものであ
る。本発明の方法において、ＧＣ含有量が５０〜６０％
の２０〜３０塩基長の部分配列、３’末端の非自己相補
性及び３’末端のＣＧランがないこと又はパリンドロー
ムを、該配列においてコンピュータープログラムを用い
て検索することが好ましい。例えば、前述の「Human Re
troviruses andAIDS 」、1994年のテキストを使用し
て、該株のこの配列に属するサブタイプのコンセンサス
配列を決定する。コンセンサス配列とは、所定の位置の
すべての株で最も優勢な塩基を含む配列である。残りの
サブタイプ、好ましくはサブタイプＡ及びＣないしＨの
同じ位置のコンセンサス配列と２個以下のミスマッチを
有するコンセンサス配列のみを、さらに処理した。これ
らの配列がそれらの３’末端で１つの株とミスマッチを
有するならば、これらのヌクレオチド（該末端から１〜
２ヌクレオチド離れたもの）は、これらの配列には含ま
れない。
【００１８】プライマー配列の選択において、かかる方
法で見出されたオリゴヌクレオチド配列を、プライマー
の５’末端が互いに１５０〜４００塩基離れた位置にな
るような方法で、それぞれが異なる配列を有する２個の
プライマーセットに組み合わせる。
法で見出されたオリゴヌクレオチド配列を、プライマー
の５’末端が互いに１５０〜４００塩基離れた位置にな
るような方法で、それぞれが異なる配列を有する２個の
プライマーセットに組み合わせる。
【００１９】特に好ましいプライマーセットは、別のＨ
ＩＶ−１特異的配列がこの範囲内に位置するものであ
る。この配列は、増幅産物の検出用プローブとして使用
できることが最も好ましい。
ＩＶ−１特異的配列がこの範囲内に位置するものであ
る。この配列は、増幅産物の検出用プローブとして使用
できることが最も好ましい。
【００２０】本発明の方法を用いて、以下の配列が特に
好ましいオリゴヌクレオチドであることがわかった： ＧＡＧ１０３７： TGATGACAGC ATGTCAGGGA GTGG 配列番号：２ ＧＡＧ１２２８： TCCACATTTC CAACACCCCT TTTT 配列番号：３ ＧＡＧ１１７７： TTCAATTGTG GCAAAGAAGG G 配列番号：４ ＧＡＧ１０７５： AAAGCAAGAA TTTTGGCTGA AG 配列番号：５。
好ましいオリゴヌクレオチドであることがわかった： ＧＡＧ１０３７： TGATGACAGC ATGTCAGGGA GTGG 配列番号：２ ＧＡＧ１２２８： TCCACATTTC CAACACCCCT TTTT 配列番号：３ ＧＡＧ１１７７： TTCAATTGTG GCAAAGAAGG G 配列番号：４ ＧＡＧ１０７５： AAAGCAAGAA TTTTGGCTGA AG 配列番号：５。
【００２１】ＧＡＧ１０３７／１２２８の組み合わせ
が、プライマー対として特に好ましいことがわかった。
オリゴヌクレオチドプローブのうちで、ＧＡＧ１１７７
が特に好ましいことがわかった。
が、プライマー対として特に好ましいことがわかった。
オリゴヌクレオチドプローブのうちで、ＧＡＧ１１７７
が特に好ましいことがわかった。
【００２２】ＰＣＲ法を記載している欧州特許ＥＰ−Ｂ
−０ ２００ ３６２号明細書及び欧州特許ＥＰ−Ｂ−
０ ２０１ １８４号明細書、ＰＮＡ分子を記載してい
る国際公開第９２／２０７０２号パンフレット並びにＮ
ＡＳＢＡ法を記載している欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０
３２９ ８２２号明細書は、その全体が参照により本明
細書に合体される。
−０ ２００ ３６２号明細書及び欧州特許ＥＰ−Ｂ−
０ ２０１ １８４号明細書、ＰＮＡ分子を記載してい
る国際公開第９２／２０７０２号パンフレット並びにＮ
ＡＳＢＡ法を記載している欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０
３２９ ８２２号明細書は、その全体が参照により本明
細書に合体される。
【００２３】また、本発明のオリゴヌクレオチドを使用
するためには、ＰＣＲ法又はＮＡＳＢＡ法のいずれかに
利用されるとき、配列番号：１の１０個の連続した塩基
断片と８０％を越える相補性又は８０％を越えるホモロ
ジーを有する配列から得られる、ＨＩＶ−１の５つのサ
ブタイプを認識可能なオリゴヌクレオチドが期待され
る。かかる配列は、配列番号：１の１０個の塩基断片と
少なくとも９０〜１００％の相補性又はホモロジーを有
することがより好ましい。本発明のかかる配列は、５０
〜６０％のＧＣ含有量、該配列の３’末端において自己
相補性及びＣＧランがないこと、該配列内にいかなるパ
リンドロームもないこと、並びに１０個の連続した配列
とＨＩＶ−１のサブタイプＡ〜Ｃ及びＨの同じ位置の対
応するコンセンサス配列との間の２個を越えないミスマ
ッチを含め、前記列挙した特性をも有するものである。
するためには、ＰＣＲ法又はＮＡＳＢＡ法のいずれかに
利用されるとき、配列番号：１の１０個の連続した塩基
断片と８０％を越える相補性又は８０％を越えるホモロ
ジーを有する配列から得られる、ＨＩＶ−１の５つのサ
ブタイプを認識可能なオリゴヌクレオチドが期待され
る。かかる配列は、配列番号：１の１０個の塩基断片と
少なくとも９０〜１００％の相補性又はホモロジーを有
することがより好ましい。本発明のかかる配列は、５０
〜６０％のＧＣ含有量、該配列の３’末端において自己
相補性及びＣＧランがないこと、該配列内にいかなるパ
リンドロームもないこと、並びに１０個の連続した配列
とＨＩＶ−１のサブタイプＡ〜Ｃ及びＨの同じ位置の対
応するコンセンサス配列との間の２個を越えないミスマ
ッチを含め、前記列挙した特性をも有するものである。
【００２４】本発明によりＨＩＶ−１を検出する対象の
「生物学的試料」は、例えば、血清、精液、粘液又はそ
の他の体からの排出物が挙げられる。ＨＩＶ−１特異性
とは、例えば、組織、他のウイルス、核酸又はＨＩＶ−
１試験に用いられるかかる試料に見出される可能性のあ
る混入物を検出から除外することを意味する。
「生物学的試料」は、例えば、血清、精液、粘液又はそ
の他の体からの排出物が挙げられる。ＨＩＶ−１特異性
とは、例えば、組織、他のウイルス、核酸又はＨＩＶ−
１試験に用いられるかかる試料に見出される可能性のあ
る混入物を検出から除外することを意味する。
【００２５】配列番号：２〜５の単独又は組み合わせの
いずれかを用いてＰＣＲ法又はＮＡＳＢＡ法により同定
されるものと同一のＨＩＶ−１のサブタイプを同定する
のに十分なホモロジーであって、配列番号：２〜５のい
ずれかと９０〜１００％のホモロジーを有するオリゴヌ
クレオチドホモログも、本発明に属するものである。例
えば、得られたホモログ又はホモログ対が少なくとも５
つのサブタイプの同定をいまだ可能にする限り、前記４
つのオリゴヌクレオチドのいずれか１つ又は対の配列内
の１塩基置換が挙げられる。
いずれかを用いてＰＣＲ法又はＮＡＳＢＡ法により同定
されるものと同一のＨＩＶ−１のサブタイプを同定する
のに十分なホモロジーであって、配列番号：２〜５のい
ずれかと９０〜１００％のホモロジーを有するオリゴヌ
クレオチドホモログも、本発明に属するものである。例
えば、得られたホモログ又はホモログ対が少なくとも５
つのサブタイプの同定をいまだ可能にする限り、前記４
つのオリゴヌクレオチドのいずれか１つ又は対の配列内
の１塩基置換が挙げられる。
【００２６】さらに、ＨＩＶ−１検出用キットは、本発
明のプライマー及びＰＣＲを行なうための個別包装され
た試薬からなる。かかるキットは、標識オリゴヌクレオ
チドが、該プライマーにより増幅される領域内のＨＩＶ
−１を検出する、ＨＩＶ−１非特異的標識を有する少な
くとも１つの標識オリゴヌクレオチドを含むことが好ま
しい。キットのプライマーは、配列番号：２、配列番
号：３、配列番号：４及び配列番号：５からなる群より
選ばれてもよく、配列番号：２及び配列番号：３から選
ばれることが好ましい。好ましいキットにおいて、標識
オリゴヌクレオチドは、配列番号：４からなる。
明のプライマー及びＰＣＲを行なうための個別包装され
た試薬からなる。かかるキットは、標識オリゴヌクレオ
チドが、該プライマーにより増幅される領域内のＨＩＶ
−１を検出する、ＨＩＶ−１非特異的標識を有する少な
くとも１つの標識オリゴヌクレオチドを含むことが好ま
しい。キットのプライマーは、配列番号：２、配列番
号：３、配列番号：４及び配列番号：５からなる群より
選ばれてもよく、配列番号：２及び配列番号：３から選
ばれることが好ましい。好ましいキットにおいて、標識
オリゴヌクレオチドは、配列番号：４からなる。
【００２７】本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロ
アミダイトを用いる固相合成等の公知の方法を用いて製
造することができる。好適な自動合成装置が、この手法
を行なうために利用できる。
アミダイトを用いる固相合成等の公知の方法を用いて製
造することができる。好適な自動合成装置が、この手法
を行なうために利用できる。
【００２８】本発明のオリゴヌクレオチドは、プライマ
ー又はプローブとして使用可能である。プローブとして
用いた場合、オリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ特異的配列
に付加した非ＨＩＶ特異的標識を含むことが好ましい。
該標識は、非ＨＩＶ特異的核酸配列、蛍光基（フルオレ
ッセンイソチオシアネートを用いる公知の方法で挿入可
能なもの）若しくは欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０ ３２４
４７４号明細書に記載のジゴキシゲニン等の検出可能
な分子又は（例えば、オリゴヌクレオチドがストレプト
アビジン被覆表面に結合できるような）ビオチン等の固
定可能な分子等、いかなるタイプの区別を生じる標識で
あってもよい。
ー又はプローブとして使用可能である。プローブとして
用いた場合、オリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ特異的配列
に付加した非ＨＩＶ特異的標識を含むことが好ましい。
該標識は、非ＨＩＶ特異的核酸配列、蛍光基（フルオレ
ッセンイソチオシアネートを用いる公知の方法で挿入可
能なもの）若しくは欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０ ３２４
４７４号明細書に記載のジゴキシゲニン等の検出可能
な分子又は（例えば、オリゴヌクレオチドがストレプト
アビジン被覆表面に結合できるような）ビオチン等の固
定可能な分子等、いかなるタイプの区別を生じる標識で
あってもよい。
【００２９】従って、本発明の主題は、前記定義による
少なくとも２個の異なるオリゴヌクレオチドを含むこと
を特徴とするＨＩＶ核酸の増幅用プライマーセットでも
ある。これらのプライマーセットは、ポリメラーゼ連鎖
反応又は欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０ ３２９ ８２２号
明細書に記載のＮＡＳＢＡを用いる増幅手段で使用でき
ることが好ましい。熟練者であれば、これらの方法の基
本的原理に精通している。
少なくとも２個の異なるオリゴヌクレオチドを含むこと
を特徴とするＨＩＶ核酸の増幅用プライマーセットでも
ある。これらのプライマーセットは、ポリメラーゼ連鎖
反応又は欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０ ３２９ ８２２号
明細書に記載のＮＡＳＢＡを用いる増幅手段で使用でき
ることが好ましい。熟練者であれば、これらの方法の基
本的原理に精通している。
【００３０】また、本発明の主題は、少なくとも５つの
サブタイプのＨＩＶ−１の核酸を検出・増幅するプライ
マーセットを用いるＨＩＶ−１核酸の特異的増幅方法で
ある。サブタイプＢが検出対象のサブタイプの１つであ
ることが特に好ましく、特にサブタイプＡ、Ｃ、Ｄ、
Ｅ、Ｆ及びＧの１以上と組み合わせることが特に好まし
い。
サブタイプのＨＩＶ−１の核酸を検出・増幅するプライ
マーセットを用いるＨＩＶ−１核酸の特異的増幅方法で
ある。サブタイプＢが検出対象のサブタイプの１つであ
ることが特に好ましく、特にサブタイプＡ、Ｃ、Ｄ、
Ｅ、Ｆ及びＧの１以上と組み合わせることが特に好まし
い。
【００３１】さらに、本発明の主題は、ＨＩＶ−１核酸
配列の増幅及び増幅産物の検出を使用し、そうすること
により、前記タイプのプライマーセットで増幅が行なわ
れるＨＩＶ−１の検出方法である。前記オリゴヌクレオ
チドの定義に適合し、増幅産物中のプライマーハイブリ
ダイゼーション部位内に結合する核酸プローブを用い
て、生成した増幅産物を検出する検出手段が特に好まし
い。
配列の増幅及び増幅産物の検出を使用し、そうすること
により、前記タイプのプライマーセットで増幅が行なわ
れるＨＩＶ−１の検出方法である。前記オリゴヌクレオ
チドの定義に適合し、増幅産物中のプライマーハイブリ
ダイゼーション部位内に結合する核酸プローブを用い
て、生成した増幅産物を検出する検出手段が特に好まし
い。
【００３２】本発明の有利な点は、本発明が以前に可能
であったよりも多くのＨＩＶ−１のサブタイプを検出す
るために用いることができることである。
であったよりも多くのＨＩＶ−１のサブタイプを検出す
るために用いることができることである。
【００３３】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定さ
れるものではない。
明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定さ
れるものではない。
【００３４】実施例１ Ａ．試料の調製 用いた血液試料を、ＱＩＡａｍｐ ＨＣＶ Ｋｉｔ（Qi
agen カタログ番号29504 ) で前処理してＲＮＡを単離
した。
agen カタログ番号29504 ) で前処理してＲＮＡを単離
した。
【００３５】Ｂ．逆転写 得られた１０μｌの溶液を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ
９６００サーマルサイクラーで、ＰＣＲチューブ中、
１０μｌのＲＴ混合液（以下の組成）で処理した（４２
℃で３０分、９４℃で５分、冷却して４℃で保存）：
９６００サーマルサイクラーで、ＰＣＲチューブ中、
１０μｌのＲＴ混合液（以下の組成）で処理した（４２
℃で３０分、９４℃で５分、冷却して４℃で保存）：
【００３６】
【表１】
【００３７】 説明： ｄＮＴＰ混合物： ＰＣＲヌクレオチド混合物（ベーリンガーマンハイムGmbH 、カタログ番号１５８１２９５）、 ＲＮａｓｉｎ： ＲＮアーゼ阻害剤（ベーリンガーマンハイムGmbH、カタロ グ番号１２７７０８１）、 Ｍ．ＭｕＬＶ−ＲＴ，ＲＴ緩衝液： 逆転写酵素（ベーリンガーマンハイムGmbH 、カタログ番号１０６２６０３）、 ＤＥＰＣ−Ｈ2 Ｏ： 滅菌、再蒸留水、 ヘキサマー： すべての可能な配列を有するヘキサデオキシリボヌクレオ チド混合物（ランダムヘキサマー、ベーリンガーマンハイ ムGmbH、カタログ番号１２７７０８１）。
【００３８】Ｃ．ＰＣＲ ８０μｌのＰＣＲ混合液を、２０μｌのＲＴ混合物に添
加した：
加した：
【００３９】
【表２】
【００４０】 説明： １０ｘＰＣＲ，ＤＩＧ−ｄＮＴＰｓ： ＰＣＲ Ｄｉｇ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｍｉｘ（ベーリンガーマンハイムGmbH、 カタログ番号１５８５５５０）、 ５’プライマー： 配列番号：２等、 ３’プライマー： 配列番号：３等、 Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ： （ベーリンガーマンハイムGmbH、カタログ番号 １１４６１６５）。
【００４１】 該混合液を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ サーマルサイクラー（ＰＥ９６００ ）で、以下のように処理した： ９４℃ ３分、 次いで４０サイクルの ９４℃ ３０秒、 ５０℃ ３０秒、 ７２℃ １分、 次いで、 ４℃。
【００４２】増幅産物は、４℃で保存可能であり、長期
間に対しては、−２０℃で保存できる。
間に対しては、−２０℃で保存できる。
【００４３】Ｄ．検出 ＥＳ３００（ベーリンガーマンハイムGmbH）でＥｎｚｙ
ｍｕｎ ＤＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ（ベー
リンガーマンハイムGmbH、カタログ番号１４４７７７
７）を用いて、増幅産物を検出した。
ｍｕｎ ＤＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ（ベー
リンガーマンハイムGmbH、カタログ番号１４４７７７
７）を用いて、増幅産物を検出した。
【００４４】本方法において、例えば、配列番号：４又
は配列番号：５等の、その配列が増幅領域内に位置し、
ビオチン−アミダイトリンク（ＡＢＩ、カタログ番号４
０１３９６）を用いてビオチン化したオリゴヌクレオチ
ドを、捕捉プローブとして使用した。ハイブリッドをス
トレプトアビジンチューブ（ベーリンガーマンハイムGm
bH）に結合させ、抗ＤＩＧ抗体で検出した。この工程に
対しては、ＰＣＲ産物を、変性溶液で１：１０の比に希
釈した。捕捉プローブの濃度は、７５ｎｇ／ｍｌのハイ
ブリダイゼーション緩衝液であった。その他の手法は、
パッケージ内の説明書に従って行なった。
は配列番号：５等の、その配列が増幅領域内に位置し、
ビオチン−アミダイトリンク（ＡＢＩ、カタログ番号４
０１３９６）を用いてビオチン化したオリゴヌクレオチ
ドを、捕捉プローブとして使用した。ハイブリッドをス
トレプトアビジンチューブ（ベーリンガーマンハイムGm
bH）に結合させ、抗ＤＩＧ抗体で検出した。この工程に
対しては、ＰＣＲ産物を、変性溶液で１：１０の比に希
釈した。捕捉プローブの濃度は、７５ｎｇ／ｍｌのハイ
ブリダイゼーション緩衝液であった。その他の手法は、
パッケージ内の説明書に従って行なった。
【００４５】
【発明の効果】本発明により、従来可能であったより多
くのＨＩＶ−１のサブタイプを検出できるオリゴヌクレ
オチドを含むＨＩＶ検出用プライマー及びプローブ、並
びにこれらのプライマー及びプローブを用いるＨＩＶの
検出方法が提供される。本発明により、ＨＩＶ−１の検
出の信頼度が改良される。
くのＨＩＶ−１のサブタイプを検出できるオリゴヌクレ
オチドを含むＨＩＶ検出用プライマー及びプローブ、並
びにこれらのプライマー及びプローブを用いるＨＩＶの
検出方法が提供される。本発明により、ＨＩＶ−１の検
出の信頼度が改良される。
【００４６】
配列番号：１ 配列の長さ：607 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＲＮＡ(genomic) 配列 CTATAAAACT CTAAGAGCCG AGCAAGCTTC ACAGGATGTA AAAAATTGGA TGACAGAAAC 60 CTTCCTGGTC CAAAATGCGA ACCCAGATTG TAAAACTATT TTAAAAGCAT TGGGACCAGC 120 AGCTACACTA GAAGAAATGA TGACAGCATG TCAGGGAGTA GGGGGACCCA GCCATAAAGC 180 AAGAATTTTG GCTGAAGCAA TGAGCCAAGT AACAAATTCA GCTACCATAA TGCTGCAGAA 240 AGGTAATTTT AGGGACCAAA GAAAAATTGT TAAGTGTTTC AACTGTGGCA AAGTAGGGCA 300 CATAGCCAAA AATTGCAGGG CCCCTAGGAA AAAGGGCTGT TGGAAATGTG GAAAGGAAGG 360 ACACCAAATG AAAGATTGCA CTAATGAGGG ACGACAGGCT AATTTTTTAG GGAAAATCTG 420 GCCTTCCCAC AAGGGAAGGC CAGGGAACTT TCTTCAGAGC AGACCAGAGC CAACAGCCCC 480 ACCAGAAGAG AGCTTCAGGT TTGGGGAAGA GACAACTCCC TCTCAGAAGC AGGAGAAGAT 540 AGACAAGGAA CTGTATCCTT TAGCTTCCCT CAAATCACTC TTTGGCAACG ACCCATCGTC 600 ACAGTAA 607
【００４７】配列番号：２ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（オリゴヌクレオチド） 配列 TGATGACAGC ATGTCAGGGA GTGG 24
【００４８】配列番号：３ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（オリゴヌクレオチド） 配列 TCCACATTTC CAACACCCCT TTTT 24
【００４９】配列番号：４ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（オリゴヌクレオチド） 配列 TTCAATTGTG GCAAAGAAGG G 21
【００５０】配列番号：５ 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（オリゴヌクレオチド） 配列 AAAGCAAGAA TTTTGGCTGA AG 22
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:92）
Claims (9)
- 【請求項１】 ＨＩＶ−１のｇａｇ遺伝子のヌクレオチ
ド位置９００から３’末端までの範囲から選ばれる配列
を含むＨＩＶ−１特異的オリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 該配列が、ＨＩＶ−１サブタイプＢのｇ
ａｇ遺伝子のヌクレオチド位置９００から３’末端まで
の範囲から選ばれることを特徴とする請求項１記載のオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 該配列が、配列番号：１の１０を越える
連続した塩基の塩基配列と８０％を越えるホモロジー又
は８０％を越える相補性を有することを特徴とする請求
項１又は２記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４】 非ＨＩＶ特異的標識をさらに含むことを
特徴とする請求項１〜３いずれか記載のオリゴヌクレオ
チド。 - 【請求項５】 請求項１〜３いずれか記載の少なくとも
２個の異なるオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とす
る、ＨＩＶ−１核酸の増幅用プライマーセット。 - 【請求項６】 少なくとも５つのサブタイプのＨＩＶ−
１の核酸を検出及び増幅することを特徴とする、プライ
マーセットを用いるＨＩＶ−１核酸の特異的増幅方法。 - 【請求項７】 請求項５記載のセットをプライマーセッ
トとして用いることを特徴とする、請求項６記載の特異
的増幅方法。 - 【請求項８】 請求項５記載のプライマーセットを用い
て増幅が行なわれることを特徴とする、ＨＩＶ−１の核
酸配列の増幅及び増幅産物の検出によるＨＩＶ−１の検
出方法。 - 【請求項９】 請求項４記載のオリゴヌクレオチドを核
酸プローブとして用いて、検出が行なわれることを特徴
とする、請求項８記載の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10102671A JPH11290099A (ja) | 1998-04-14 | 1998-04-14 | Ｈｉｖ検出用プライマー及びプローブ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10102671A JPH11290099A (ja) | 1998-04-14 | 1998-04-14 | Ｈｉｖ検出用プライマー及びプローブ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11290099A true JPH11290099A (ja) | 1999-10-26 |
Family
ID=14333707
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10102671A Pending JPH11290099A (ja) | 1998-04-14 | 1998-04-14 | Ｈｉｖ検出用プライマー及びプローブ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11290099A (ja) |
-
1998
- 1998-04-14 JP JP10102671A patent/JPH11290099A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050413 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080123 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080725 |