PT1856257E - Processos utilizando um oligonucleótido de especificidade dual e oligonucleótido de especificidade dual utilizado - Google Patents

Processos utilizando um oligonucleótido de especificidade dual e oligonucleótido de especificidade dual utilizado Download PDF

Info

Publication number
PT1856257E
PT1856257E PT06716196T PT06716196T PT1856257E PT 1856257 E PT1856257 E PT 1856257E PT 06716196 T PT06716196 T PT 06716196T PT 06716196 T PT06716196 T PT 06716196T PT 1856257 E PT1856257 E PT 1856257E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
quot
specificity
nucleic acid
primers
low
Prior art date
Application number
PT06716196T
Other languages
English (en)
Inventor
Jong-Yoon Chun
Original Assignee
Seegene Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/KR2005/001206 external-priority patent/WO2006095941A1/en
Application filed by Seegene Inc filed Critical Seegene Inc
Publication of PT1856257E publication Critical patent/PT1856257E/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/117—Modifications characterised by incorporating modified base
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/161—Modifications characterised by incorporating target specific and non-target specific sites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/107—Temperature of melting, i.e. Tm
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2535/00—Reactions characterised by the assay type for determining the identity of a nucleotide base or a sequence of oligonucleotides
    • C12Q2535/125—Allele specific primer extension

Description

1
DESCRIÇÃO "PROCESSOS UTILIZANDO UM OLIGONUCLEÓTIDO DE ESPECIFICIDADE DUAL E OLIGONUCLEÓTIDO DE ESPECIFICIDADE DUAL UTILIZADO"
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO DOMÍNIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a vários processos utilizando um oligonucleótido de especificidade dual, e a um oligonucleótido de especificidade dual para aqueles. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a vários processos conduzidos por uma reação de extensão dependente do modelo utilizando um oligonucleótido de especificidade dual, e a um oligonucleótido de especificidade dual para aqueles.
DESCRIÇÃO DA ÁREA RELACIONADA A amplificação de ácidos nucleicos é um processo essencial para uma grande variedade de métodos em biologia molecular, de modo que foram propostos vários métodos de amplificação. Por exemplo, Miller, Η. I. et al. (WO 89/06700) amplificaram uma sequência de ácido nucleico com base na hibridização de uma sequência promotora/"primer" com um DNA de filamentação simples ("ssDNA") alvo, seguida de transcrição de muitas cópias de RNA da sequência. Outros procedimentos conhecidos de amplificação de ácidos
nucleicos incluem sistemas de amplificação com base na transcrição (Kwoh, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 8_6: 1173 (1989); e Gingeras T.R. et al., WO 88/10315) . 0 processo mais importante para a amplificação de ácidos nucleicos, conhecido como reação em cadeia de polimerase 2 (daqui em diante referido como "PCR"), baseia-se em ciclos repetidos de desnaturação de DNA de filamentação dupla, seguido de emparelhamento de "primers" oligonucleotidicos com o modelo de DNA e extensão de "primers" por uma DNA polimerase (Mullis et ai. Patentes U.S. N°s 4,683,195, 4,683,202, e 4,800,159/ Saiki et al., (1985) Science 230, 1350-1354). Os "primers" oligonucleotidicos utilizados em PCR são concebidos para emparelharem com filamentos opostos do modelo de DNA. Os "primers" são estendidos por DNA polimerase, de onde o produto de um "primer" pode servir de filamento modelo para o outro "primer" em reações subsequentes. O processo de amplificação por PCR dá origem ao aumento exponencial de fragmentos discretos de DNA cujo comprimento é definido pelas extremidades 5' dos "primers" oligonucleotidicos. 0 sucesso de amplificações de ácidos nucleicos, em particular amplificação por PCR, baseia-se na especificidade com a qual um "primer" emparelha apenas com as suas sequências alvo (e não não-alvo); em consequência, é importante otimizar esta interação molecular. 0 facto de um "primer" poder emparelhar somente com o seu complemento perfeito ou também com sequências que têm um ou mais emparelhamentos defeituosos depende criticamente da temperatura de emparelhamento. Em geral, uma temperatura de emparelhamento mais elevada irá conduzir a um emparelhamento mais especifico do "primer" com o seu modelo perfeitamente emparelhado, o que, por sua vez, aumenta a probabilidade de amplificar apenas a sequência alvo. Por outro lado, mais emparelhamentos defeituosos entre o modelo e o "primer" podem ser tolerados a temperaturas de emparelhamento mais baixas. Considerando esse fenómeno, o ajustamento da temperatura de emparelhamento pode alterar a 3 especificidade do emparelhamento do modelo e "primer". Por exemplo, se não houver nenhum produto, a temperatura pode ser demasiado elevada para emparelhamento. Se houver vários produtos de diferentes tamanhos onde está presente apenas um "primer", isto indica que o "primer" único emparelha com mais do que uma região do modelo. Neste caso, a temperatura de emparelhamento deve ser aumentada.
Para além da temperatura de emparelhamento, vários "parâmetros de busca de "primers"", como comprimento do "primer", teor de GC e comprimento do produto de PCR, devem ser considerados para a especificidade de emparelhamento de "primers". Um "primer" que satisfaça todos estes parâmetros originará um aumento significativo da especificidade de emparelhamento do "primer" durante a amplificação de DNA alvo, simultaneamente resolvendo os problemas de fundos e produtos inespecíficos provenientes de "primers" utilizados nas experiências. É habitual que "primers" bem concebidos possam ajudar a evitar emparelhamento inespecifico e fundos, bem como distinguir entre cDNAs ou modelos genómicos em RNA-PCR. Têm sido desenvolvidas muitas abordagens para melhorar a especificidade do emparelhamento de "primers" e, assim, obter a amplificação do produto desejado. Exemplos são PCR "touchdown" (Don et al., (1991) "Touchdown PCR to circumvent spurious priming during gene amplification". Nucleic Acids Res., 1_9, 4008), PCR de inicio a quente (DAquila et al., (1991) "Maximizing sensitivity and specificity of PCR by pre-amplification heating". Nucleic Acids Res., 1_9, 3749), PCR encaixada (Mullis e Faloona, (1987) "Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction". Methods Enzymol. 155, 4 335-350), e PCR de reforço (Ruano et al., (1989) "Biphasic amplification of very dilute DNA samples via booster PCR". Nucleíc Acids Res. 11_, 540) . Também têm sido relatadas outras abordagens alternativas segundo as quais vários compostos "intensificadores" podem melhorar a especificidade da PCR. Os compostos intensificadores incluem químicos que aumentam a temperatura de emparelhamento efetivo da reação, proteínas de ligação de DNA e reagentes disponíveis no mercado. No entanto, não há nenhum aditivo "mágico" que assegure o êxito em cada PCR, e é muito fastidioso testar diferentes aditivos em condições diferentes, como temperatura de emparelhamento. Apesar de estas abordagens terem contribuído para a melhoria da especificidade do emparelhamento de "primers" nalguns casos, não chegaram de modo fundamental a uma solução para os problemas decorrentes de "primers" utilizados na amplificação por PCR, como produtos inespecíficos e elevados fundos.
As técnicas baseadas em PCR têm sido amplamente utilizadas não só para amplificação de uma sequência de DNA alvo mas também para aplicações ou métodos científicos nas áreas da investigação biológica e médica, como PCR com transcriptase reversa (RT-PCR), PCR de expressão diferencial (DD-PCR) , clonagem de genes conhecidos ou desconhecidos por PCR, amplificação rápida de extremidades de cDNA (RACE), PCR de iniciação arbitrária (AP-PCR), PCR multiplex, tipagem genómica de SNPs e análise genómica baseada em PCR (McPherson e Moller, (2000) "PCR". BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag Nova Iorque Berlim Heidelberga, NY) . 5
Como descrito acima, todos estes métodos e técnicas envolvendo amplificação de ácidos nucleicos, principalmente amplificação por PCR, não estão completamente libertos das limitações e problemas resultantes da falta de especificidade dos "primers" utilizados em cada método, como positivos falsos, baixa reprodutibilidade, fundos elevados, apesar de terem sido continuamente introduzidas abordagens aperfeiçoadas para cada método. Em consequência, continuam a ser necessários novos "primers" e métodos para melhorar a especificidade do emparelhamento que possam dar origem a verdadeiros resultados de amplificação.
Entretanto, a hibridização de DNA é um processo fundamental em biologia molecular e é afetada pela força iónica, composição de bases, comprimento do fragmento ao qual foi reduzido o ácido nucleico, o grau de emparelhamentos defeituosos e a presença de agentes desnaturantes. As tecnologias baseadas em hibridização de DNA são uma ferramenta muito útil na determinação de sequências de ácidos nucleicos especificas, e claramente têm valor em diagnóstico clinico, investigação genética e análise laboratorial forense. Por exemplo, Wallace e colaboradores mostraram que diferenças em sequências tão subtis quanto a alteração de uma única base são suficientes para permitir a distinção de oligómeros pequenos (por exemplo, 14-meros), e demonstraram como isto pode ser aplicado em análise molecular de mutações pontuais no gene da β-globina (Wallace, B.R., et al., (1981) "The use of synthetic oligonucleotides as hybridization probes. Hybridization of oligonucleotides of mixed sequence to rabbit β-globin DNA". Nucleic Acids Res. 9, 879-894; e Conner, B.J., et al. (1983) "Detection of sickle cell β-globin allele by 6 hybridization with synthetic oligonucleotides". Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_0, 278-282).
Apesar do poder da hibridização com oligonucleótidos para identificar corretamente um filamento complementar, os investigadores ainda enfrentam limitações. Híbridos contendo oligonucleótidos são muito menos estáveis do que híbridos de ácidos nucleicos longos. Isto reflete-se numa menor temperatura de fusão. A instabilidade dos híbridos é um dos fatores mais importantes a ser considerado ao conceber hibridização com oligonucleótidos. A diferença de estabilidade entre um complemento perfeitamente emparelhado e um complemento com um emparelhamento defeituoso apenas numa base pode ser bastante pequena, correspondendo a uma diferença tão pequena quanto 0,5°C nas suas TfS (temperatura de fusão das hélices duplas). Quanto menor for o oligómero de interesse (permitindo a identificação de um filamento complementar numa mistura mais complexa), mais forte será o efeito de um emparelhamento defeituoso de uma única base na estabilidade global da hélice dupla. No entanto, a desvantagem de utilizar esses oligonucleótidos curtos é o facto de hibridizarem de modo fraco, mesmo com uma sequência perfeitamente complementar, e, assim, ser necessário serem utilizados nas condições de restrição reduzida, que origina um decréscimo grave da especificidade da hibridização. Têm sido empreendidos muitos esforços para melhorar a especificidade da hibridização com oligonucleótidos. Foi proposto um método para modificar quimicamente bases de DNA para hibridização com alta sensibilidade (Azhikina et ai., (1993) Proc. Natl. Acad. Sei., USA, _90q 11460-11462) e um método no qual a lavagem após a hibridização é conduzida a 7 baixas temperaturas durante um longo período de tempo, para aumentar a capacidade de distinção do emparelhamento defeituoso (Drmanac et al., (1990) DNA and Cell Biology, 9: 527-534). Recentemente foi introduzido outro método para aumentar o poder de resolução de polimorfismos de um único nucleótido (SNPs) em hibridização de DNA através de emparelhamentos defeituosos artificiais (Guo et al., (1997) Nature Biotechnology, R5: 331-5). Adicionalmente, muitas Patentes U.S., incluindo as Patentes U.S. N°s 6,077,668, 6, 329, 144, 6, 140, 054, 6, 350, 580, 6, 309, 824, 6, 342,355 e 6,268,128, divulgam a sonda para hibridização e suas aplicações. O documento US 2003/170711 Al diz respeito a oligonucleótidos com 3-nitropirrolo justaposto como base universal para amplificar uma sequência de ácido nucleico alvo. Apesar de terem sido continuamente introduzidas as abordagens aperfeiçoadas para cada método, não foi possível libertar completamente todos estes métodos e técnicas, envolvendo hibridização com oligonucleótidos, das limitações e problemas provenientes da falta de especificidade da hibridização com oligonucleótidos. Há ainda uma possibilidade de fatores artificiais, como as falhas da disposição em manchas e imobilização do oligonucleótido no substrato e estabelecimento de condições ótimas de hibridização, afetarem os dados negativos da hibridização; o efeito de resultados erróneos é mais vulnerável aos resultados gerados de um método de rastreio de alto rendimento. Esses fatores artificiais, inerentes à disposição de manchas e hibridização, são grandes desvantagens práticas em microsséries de DNA baseadas em oligonucleótidos.
Além disso, o desenvolvimento de técnicas de determinação de sequências de DNA com velocidade, sensibilidade e rendimento aumentados é da maior importância para o estudo de sistemas biológicos. A técnica convencional de sequenciação de DNA, originalmente desenvolvida há mais de duas décadas (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei., 74: 5463-5467), enfrenta limitações quanto ao rendimento e custo para aplicações futuras. Em consequência, foram propostas várias técnicas novas. Três métodos muito promissores são sequenciação por hibridização (Brain e Smith, (1988) J. Theor. Biol., 135: 303-307); Drmanac et al., (1989) Genomics, 4_: 114-128); e Southern, E.M. (1989) Patente WO/10977), sequenciação por assinatura paralela com base em ligação e clivagem (Brenner et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sei., 9J_: 1665-1670), e pirossequenciação (Ronaghi et al., (1996) Anal. Biochem., 242: 84-89; e (1998) Science 281: 363-365). Para todas as técnicas acima mencionadas, o sucesso das reações de sequenciação depende absolutamente da especificidade de hibridização do "primer" de sequenciação para um ácido nucleico alvo. Considerando a especificidade de hibridização do "primer" de sequenciação, os métodos correntes estão sujeitos a limitação do comprimento de ácidos nucleicos modelo fornecidos para reações de sequenciação. Em geral, as reações de sequenciação são conduzidas utilizando ácidos nucleicos modelo com um comprimento preferivelmente menor do que algumas centenas de pares de bases, de modo que seja obtida, em certa extensão, a hibridização especifica do "primer" de sequenciação.
Todavia, para estudos avançados, as reações de sequenciação de DNA com velocidade, sensibilidade e rendimento aumentados não devem ser restringidas pelo tamanho de 9 ácidos nucleicos modelo. À luz do exposto, é permitida a sequenciação direta de um ácido nucleico alvo de uma população de ácidos nucleicos modelo desde que os "primers" de sequenciação hibridizem com os ácidos nucleicos alvo com elevada especificidade.
RESUMO DA INVENÇÃO
Para eliminar os problemas e desvantaqens desses oliqonucleótidos convencionais, utilizados como "primers" ou sondas, e vários métodos envolvendo hibridização de ácidos nucleicos, o presente inventor desenvolveu um oliqonucleótido de especificidade dual que permite que uma reação dependente de modelo decorra com especificidade muito mais elevada, e descobriu as suas excelentes aplicações para uma grande variedade de processos envolvendo hibridização ou emparelhamento com oligonucleótidos.
Em conformidade, um objetivo desta invenção é proporcionar um método para amplificar seletivamente uma sequência de ácido nucleico alvo a partir de um DNA ou de uma mistura de ácidos nucleicos de acordo com a reivindicação 1.
Outros objetivos e vantagens da presente invenção tornar-se-ão claros a partir da descrição pormenorizada a ser seguida em conjugação em as reivindicações e figuras adj untas.
DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS
As FIGs. IA e 1B representam esquematicamente o principio deste oligonucleótido de especificidade dual (DS) desta invenção numa reação de extensão dependente do modelo. A FIG. IA mostra elevada especificidade de hibridização do 10 oligonucleótido DS em condições de restrição elevada. A FIG. 1B mostra a tolerância a emparelhamentos defeituosos do oligonucleótido DS. A FIG. 2 mostra representações esquemáticas para amplificar seletivamente um ácido nucleico alvo de DNA de filamentação dupla utilizando "primers" oligonucleotidicos DS desta invenção. A FIG. 3 mostra representações esquemáticas para amplificar seletivamente um ácido nucleico alvo de mRNA utilizando "primers" oligonucleotidicos DS desta invenção. A FIG. 4 mostra representações esquemáticas para reações de extensão dependentes do modelo na determinação seletiva de um ácido nucleico alvo utilizando oligonucleótidos de especificidade dual em microsséries de oligonucleótidos. A FIG. 5 é uma fotografia de gel de agarose que mostra os resultados da amplificação por PCR para genes da família das citoquinas, IL-Ιβ e IL-19, utilizando um conjunto de "primers" convencionais (IL-lb-5'-0 e IL-lb-3'-0, via 1; IL-19-5'-0 e IL-19-3'-0, via 3) e os oligonucleótidos de especificidade dual (IL-lb-5' e IL-lb-3', via 2; IL-19-5' e IL-19-3' , via 4) . M é um marcador de tamanhos de 100 pares de bases gerado por Forever 100-bp Ladder Personalizer (Seegene, Inc. Seul, Coreia). sequência perfeitamente com A FIG. 6A é uma fotografia de gel de agarose que mostra os resultados da 3'-RACE (amplificação rápida de extremidades de cDNA) do gene DEG 10, demonstrando a especificidade para PCR do oligonucleótido de especificidade dual. A via 1 representa um "primer" 11 emparelhada, as vias 2-4 representam "primers" com um emparelhamento defeituoso de 3, 2 e 1 bases na sua porção 3' de especificidade de Tf baixa, respetivamente, e as vias 5-7 representam "primers" com um emparelhamento defeituoso de 5, 3 e 2 bases na sua porção 5' de especificidade de Tf elevada, respetivamente. M é um marcador de tamanhos de 100 pares de bases gerado por Forever 100-bp Ladder Personalizer. A FIG. 6B é uma fotografia de gel de agarose que mostra os resultados da 3'-RACE do gene DEG 10, demonstrando a tolerância a emparelhamentos defeituosos do oligonucleótido de especificidade dual em PCR. A via 1 representa um "primer" com sequência perfeitamente emparelhada, as vias 2-4 representam "primers" com um emparelhamento defeituoso de 3, 2 e 1 bases na sua porção 3' de especificidade de Tf baixa, respetivamente, e as vias 5-7 representam "primers" com um emparelhamento defeituoso de 5, 3 e 2 bases na sua porção 5' de especificidade de Tf elevada, respetivamente. M é um marcador de tamanhos de 100 pares de bases gerado por Forever 100-bp Ladder Personalizer. A FIG. 7A representa as sequências de "primers" 5' para 3'-RACE dos genes da família "homeobox" específicos de placenta de ratinho Psxl e Psx2. Psxl-5'-40 e Psx2-5'-40 são "primers" convencionais e Psxl-5'-41 e Psx2-5'-41 são "primers" concebidos de acordo com a presente invenção. A FIG. 7B é uma fotografia de gel de agarose que mostra os resultados da 3'-RACE de Psxl e Psx2. Via 1, 3'-RACE de Psxl utilizando o "primer" oligonucleotídico de especificidade dual Psxl-5'-41; Via 2, 3'-RACE de Psx2 utilizando o "primer" oligonucleotídico de especificidade 12 dual Psx2-5'-41; Via 3, 3'-RACE de Psxl utilizando o "primer" convencional Psxl-5'-40; e Via 4, 3'-RACE de Psx2 utilizando o "primer" convencional Psx2-5'-40. M é um marcador de tamanhos de 100 pares de bases gerado por Forever 100-bp Ladder Personalizer. A FIG. 8 mostra os resultados da sequenciação direta por aplicação de ciclos para os genes Psxl e Psx2 da reunião de cDNA da placenta de ratinho utilizando os "primers" oligonucleotidicos de especificidade dual Psxl-5'-41 (para Psxl) e Psx2-5'-41 (para Psx2) como "primer" de sequenciação. A FIG. 9 mostra os resultados de PCR multiplex utilizando 9 conjuntos de "primers" de especificidade dual específicos para genes da família das citoquinas. Via 1, PCR multiplex para 9 genes de citoquinas; Via 2, PCR monoplex para IL-3 (200 pares de bases); Via 3, PCR monoplex para IL-15 (250 pares de bases); Via 4, PCR monoplex para IL-18 (300 pares de bases); Via 5, PCR monoplex para IL-25 (350 pares de bases); Via 6, PCR monoplex para IL-2 (400 pares de bases); Via 7, PCR monoplex para IL-6 (450 pares de bases); Via 8, PCR monoplex para IL-19 (500 pares de bases); Via 9, PCR monoplex para IL-Ιβ (550 pares de bases); e Via 10, PCR monoplex para IL-10 (600 pares de bases) . M é um marcador de tamanhos de 100 pares de bases gerado por Forever 100-bp Ladder Personalizer.
A FIG. 10 mostra os resultados de amplificações por PCR do gene da glicoproteína de fusão (F) do metapneumovírus humano (hMPV) utilizando os "primers" oligonucleotidicos de especificidade dual. Via 1, PCR do alvo utilizando o conjunto de "primers" hMPV5'-585 e hMPV 3'-698; Via 2, PCR 13 do alvo utilizando os conjuntos de "primers" hMPV5'-585 e hMPV 3'-1007/ Via 3, PCR do alvo utilizando "primers" da β-actina humana; Via 4, PCR do alvo sem modelo; e Via 5, PCR do alvo sem modelo.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DESTA INVENÇÃO São divulgados aqui (a) uma grande variedade de processos utilizando um oligonucleótido de especificidade dual e (b) um oligonucleótido de especificidade dual para aqueles. O oligonucleótido de especificidade dual divulgado aqui (daqui em diante referido como "oligo DS) permite o emparelhamento do "primer" ou sonda com a sua sequência alvo com especificidade melhorada, de modo que a especificidade da amplificação de ácidos nucleicos (em particular PCR) e da reação de hibridização pode ser significativamente melhorada.
Oligonucleótido de Especificidade Dual (Oligo DS) É divulgado aqui um oligonucleótido de especificidade dual para sintetizar uma molécula de ácido nucleico por uma reação de extensão dependente do modelo, que é representado pela fórmula geral seguinte: 5 ' —Xp—Yq—Zr—3 ' em que Xp representa uma porção 5' de especificidade de Tf elevada possuindo uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente complementar a um sitio num ácido nucleico modelo para hibridizar com aquele, Yq representa uma porção de separação compreendendo pelo menos duas bases universais, Zr representa uma porção 3' de especificidade de Tf baixa possuindo uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente complementar a 14 um sitio no ácido nucleico modelo para hibridizar com aquele, p, q e r representam o número de nucleótidos, e X, Y e Z são desoxirribonucleótidos ou ribonucleótidos; a Tf da porção 5' de especificidade de Tf elevada é mais elevada do que a da porção 3' de especificidade de Tf baixa, a porção de separação tem a Tf mais baixa das três porções; a porção de separação forma uma estrutura em bolha sem emparelhamento de bases em condições tais que a porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa são emparelhadas com o ácido nucleico modelo, permitindo que a porção 5' de especificidade de Tf elevada seja separada da porção 3' de especificidade de Tf baixa em termos da especificidade de emparelhamento com o ácido nucleico modelo, de modo que a especificidade de emparelhamento do oligonucleótido é determinada de forma dual pela porção 5' de especificidade de Tf elevada e pela porção 3' de especificidade de Tf baixa, de modo que uma especificidade global do emparelhamento do oligonucleótido é aumentada. elevada e a porção 3' de
Pretende-se que o termo "especificidade dual", referindo-se ao oligonucleótido DS (daqui em diante referido como "oligo DS") desta invenção, usado aqui, descreva a sua caracteristica predominante que consiste no facto de a sua especificidade de emparelhamento com uma sequência alvo ser determinada de modo dual pelas suas duas porções separadas, isto é, a porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa. Em geral, a especificidade de emparelhamento de "primers" ou sondas é governada pela sua sequência consecutiva global. Em contraste, a especificidade de emparelhamento do oligo DS é determinada de forma dual pelas suas duas porções (a porção 5' de especificidade de Tf 15 especificidade de Tf baixa) separadas pela porção de separação, em que estas três porções estão localizadas numa sequência oligonucleotidica. Essa especificidade dual permite ao oligo DS servir de "primer" e sonda exibindo especificidade muito mais elevada, tornando a presente invenção nova e não óbvia relativamente à técnica anterior.
Entretanto, o presente inventor já desenvolveu o ACP ("primer" de controlo do emparelhamento) para melhorar a especificidade do emparelhamento, como divulgado em WO 03/050303. O oligo DS desta invenção é distintamente diferente do ACP à luz do seguinte: (i) o oligo DS tem duas porções de especificidade a serem hibridizadas com uma sequência alvo, ao passo que o ACP tem uma porção de especificidade; (ii) três porções no oligo DS estão distintamente diferenciadas considerando a Tf, ao passo que porções do ACP não estão; (iii) o "primer" DS é estendido para sintetizar uma molécula de ácido nucleico complementar ao modelo somente quando ocorre emparelhamento pela porção 5' de especificidade de Tf elevada e pela porção 3' de especificidade de Tf baixa, ao passo que o ACP é estendido mesmo quando ocorre emparelhamento pela porção da extremidade 3'; e (iv) assim, a especificidade de emparelhamento ou hibridização do oligo DS é determinada de forma dual pelas duas porções separadas, isto é, a porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa, ao passo que a do ACP é governada somente pela porção da extremidade 3' . Em conformidade, pode ser apreciado que a especificidade de emparelhamento ou hibridização do oligo DS com a sua sequência alvo é muito mais elevada do que a do ACP, abordando a questão de o oligo DS ser novo e não óbvio relativamente ao ACP. 16 A caracteristica notável do oligo DS é o facto de ter três porções diferentes com propriedades distintas numa molécula oligonucleotidica: porção 5' de especificidade de Tf elevada, porção 3' de especificidade de Tf baixa e porção de separação. 0 oligo DS é útil numa grande variedade de processos e análises envolvendo uma reação de extensão dependente do modelo. 0 termo usado aqui "uma reação de extensão dependente do modelo" significa uma reação para estender uma molécula oligonucleotidica hibridizada com uma sequência alvo por incorporação de nucleótidos sucessivos na sua fração terminal, na qual a sequência estendida é determinada por uma sequência modelo complementar.
Na Fig. IA está ilustrada uma representação esquemática dos princípios que governam a especificidade de hibridização (emparelhamento) do oligo DS. Referindo-nos à Fig. IA, o oligo DS será descrito mais pormenorizadamente.
Quando apenas a porção 5' de especificidade de Tf elevada do oligo DS é emparelhada com um modelo, não pode servir de sítio de iniciação para uma extensão dependente do modelo, não ocorrendo extensão.
Quando a porção 5' de especificidade de Tf elevada do oligo DS é emparelhada com uma sequência não alvo, é improvável que a porção 3' de especificidade de Tf baixa, com uma sequência mais curta, emparelhe com a sequência não alvo. Os motivos para isso consistem no facto de a porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa estarem separadas pela porção de 17 separação, em termos de eventos de emparelhamento. Por outras palavras, a porção 3' de especificidade de Tf baixa está envolvida em eventos de emparelhamento de um modo relativamente independente da porção 5' de especificidade de Tf elevada, e o emparelhamento da porção 3' de especificidade de Tf baixa é menos afetado pelo emparelhamento da porção 5' de especificidade de Tf elevada. A este respeito, a probabilidade de emparelhamento da porção 3f de especificidade de Tf baixa com uma sequência não alvo torna-se muito menor.
Quando apenas a porção 3' de especificidade de Tf baixa tiver uma sequência complementar a um sitio não alvo, não ocorre emparelhamento em certas condições de restrição elevada, por exemplo, condições restritas para emparelhamento da porção 5' de especificidade de Tf elevada. De acordo com uma forma de realização preferida, é vantajoso realizar reações de extensão dependente do modelo utilizando o oligo DS em condições restritas com temperatura de emparelhamento muito mais elevada do que a Tf da porção 3' de especificidade de Tf baixa.
Quando a porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa tiverem uma sequência substancialmente complementar a um modelo, o oligo DS pode ser emparelhado com o modelo e, assim, ocorre extensão bem-sucedida.
Sem pretender ficar restringido pela teoria, crê-se que a porção de separação torna a porção 3' de especificidade de Tf baixa mais sensível a condições de emparelhamento (por exemplo, temperatura e complementaridade de sequências). A este respeito, a incidência da hibridização inespecífica 18 entre a porção 3' de especificidade de Tf baixa e sequências não alvo torna-se muito mais baixa em certas condições de emparelhamento (ou restritas). Quando a porção 3' de especificidade de Tf baixa bem como a porção 5' de especificidade de Tf elevada emparelharem com a sua sequência alvo, é mais provável que a extremidade 3' da porção 3' de especificidade de Tf baixa gere um sitio extensível por DNA polimerases. 0 termo "oligonucleótido", como usado aqui, refere-se a um oligómero linear de monómeros ou ligações naturais ou modificados, incluindo desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos e afins, capaz de hibridizar especificamente com uma sequência de nucleótidos alvo, de ocorrência natural ou produzida de modo sintético. 0 oligonucleótido é preferivelmente de filamentação simples, para eficiência máxima da hibridização. Preferivelmente, o oligonucleótido é um oligodesoxirribonucleótido. 0 oligonucleótido desta invenção pode ser compreendido por dNMPs de ocorrência natural (isto é, dAMP, dGM, dCMP e dTMP), análogos nucleotídicos ou derivados nucleotídicos. 0 oligonucleótido também pode incluir ribonucleótidos. Por exemplo, o oligonucleótido desta invenção pode incluir nucleótidos com modificações na coluna vertebral, tais como ácido nucleico peptídico (PNA) (M. Egholnn et al., Nature, 365: 566-568 (1993)), fosforotioato DNA, fosforoditioato DNA, fosforamidato DNA, DNA ligado a amida, DNA ligado a MMI, 2'-0-metil RNA, alfa-DNA e metilfosfonato DNA, nucleótidos com modificações de açúcares, tais como 2'-0-metil RNA, 2'-fluoro RNA, 2'-amino RNA, 2'-0-alquil DNA, 2'-0-alil DNA, 2'-0alcinil DNA, hexose DNA, piranosil RNA e anidro-hexitol DNA, e nucleótidos com modificações de bases, tais como pirimidinas substituídas em C-5 19 (substituintes incluindo fluoro-, bromo-, cloro-, iodo-, metil-, etil-, vinil-, formil-, etinil-, propinil-, alcinil-, tiazolil-, imidazolil-, piridil-), 7-desazapurinas com substituintes C-7 (substituintes incluindo fluoro-, bromo-, cloro-, iodo-, metil-, etil-, vinil-, formil-, alcinil-, alcenil-, tiazolil-, imidazolil-, piridil-), inosina e diaminopurina. 0 termo "primer", como usado aqui, refere-se a um oligonucleótido que é capaz de atuar como ponto de iniciação da síntese quando colocado sob condições nas quais é induzida síntese do produto de extensão do "primer" que é complementar a um filamento (modelo) de ácido nucleico, isto é, na presença de nucleótidos e um agente para polimerização, como DNA polimerase, e a uma temperatura e pH adequados. 0 "primer" é preferivelmente de filamentação simples, para eficiência máxima da amplificação. Preferivelmente, o "primer" é um oligodesoxirribonucleótido. 0 "primer" desta invenção pode ser compreendido por dNMPs de ocorrência natural (isto é, cLAMP, dGM, dCMP e dTMP) , nucleótido modificado ou nucleótido não natural. 0 "primer" também pode incluir ribonucleótidos. 0 "primer" deve ser suficientemente longo para iniciar a síntese de produtos de extensão na presença do agente para polimerização. 0 comprimento exato dos "primers" irá depender de muitos fatores, incluindo temperatura, aplicação e fonte do "primer". 0 termo "emparelhamento" ou "iniciação", como usado aqui, refere-se à aposição de um oligodesoxinucleótido ou ácido nucleico com um ácido nucleico modelo, de modo que a aposição permite que a polimerase polimerize nucleótidos numa molécula de ácido nucleico que é complementar ao ácido nucleico modelo, ou uma porção do mesmo. 0 termo usado 20 "hibridização" usado aqui refere-se à formação de um ácido nucleico de filamentação dupla a partir de ácidos nucleicos de filamentação simples complementares. Não há nenhuma distinção pretendida entre os termos "emparelhamento" e "hibridização", e estes termos serão usados de forma intermutável. O termo usado aqui "sonda" refere-se a uma molécula de ácido nucleico de filamentação simples compreendendo uma porção ou porções que são substancialmente complementares a uma sequência de nucleótidos alvo. O termo "porção", usado aqui em conjunção com o oligo DS desta invenção, refere-se a uma sequência de nucleótidos separada pela porção de separação. O termo "porção 5' de especificidade de Tf elevada" ou "porção 3' de especificidade de Tf baixa" refere-se a uma sequência de nucleótidos na extremidade 5' ou extremidade 3' do oligo DS desta invenção, respetivamente, que está separada pela porção de separação. Pretende-se que o termo "porção 5' de especificidade de Tf elevada", em conjunção com o oligo DS, se refira a uma porção com a Tf mais elevada entre três porções e possuindo uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente complementar a um sitio do ácido nucleico modelo. O termo "porção 3' de especificidade de Tf baixa", com referência ao oligo DS, significa uma porção com uma Tf menor do que a da porção 5' de especificidade de Tf elevada mas Tf mais elevada do que a da porção de separação e possuindo uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente complementar a um sitio do ácido nucleico modelo. 21 0 termo "Tf" usado aqui refere-se à temperatura de fusão à qual metade das moléculas de uma hélice dupla de ácido nucleico tem filamentação simples. Pretende-se que os termos "Tf elevada" e "Tf baixa", em conjunção com porções do oligo DS, descrevam um valor de Tf relativo e não um valor de Tf absoluto. Isto é, apenas é requerido que a Tf da porção 5' de especificidade de Tf elevada seja elevada relativamente à da porção 3' de especificidade de Tf baixa. A porção 5' de especificidade de Tf elevada e porção 3' de especificidade de Tf baixa são concebidas para terem uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente complementar a um sitio num ácido nucleico modelo, para hibridizarem com o mesmo. 0 termo "substancialmente complementar", com referência ao oligo DS, é usado aqui para significar que a molécula oligonucleotidica é suficientemente complementar para hibridizar seletivamente com uma sequência de ácido nucleico modelo nas condições de emparelhamento designadas ou condições restritas, de modo que o oligonucleótido emparelhado pode ser estendido por uma polimerase para formar uma cópia complementar do modelo. Em consequência, este termo tem um significado diferente de "perfeitamente complementar" ou seus termos relacionados. Será apreciado que a porção 5' de especificidade de Tf elevada e porção 3' de especificidade de Tf baixa do oligo DS podem ter um ou mais sem emparelhamentos defeituosos com um modelo numa extensão tal que o oligo DS pode servir de "primer" ou sonda. Muito preferivelmente, a porção 5' de especificidade de Tf elevada e/ou porção 3' de especificidade de Tf baixa do oligo DS têm uma sequência de nucleótidos perfeitamente complementar a um sitio num modelo, isto é, emparelhamentos defeituosos. 22
Para o desempenho bem-sucedido do oligo DS, é essencial que a Tf da porção 5' de especificidade de Tf elevada seja mais elevada do que a da porção 3' de especificidade de Tf baixa. É preferido que a Tf da porção 5' de especificidade de Tf elevada varie desde 40°C até 80°C, mais preferivelmente 40°C até 75°C, ainda mais preferivelmente 50°C até 68°C, e muito preferivelmente 50°C até 65°C. É preferido que a Tf da porção 3' de especificidade de Tf baixa varie desde 10°C até 40°C, mais preferivelmente 15°C até 40°C e muito preferivelmente 20°C até 35°C. Preferivelmente, a Tf da porção 5' de especificidade de Tf elevada é mais elevada em pelo menos 5°C, mais preferivelmente pelo menos 10°C, ainda mais preferivelmente pelo menos 15°C e muito preferivelmente pelo menos 20°C do que a da porção 3' de especificidade de Tf baixa. Vantajosamente, a Tf da porção 5' de especificidade de Tf elevada é mais elevada 5-70°C, preferivelmente 10-70°C, mais preferivelmente 10-60°C, ainda mais preferivelmente 10-50°C, ainda mais preferivelmente 10-40°C e muito preferivelmente 20-40°C do que a da porção 3' de especificidade de Tf baixa.
De acordo com uma forma de realização preferida, a porção 5' de especificidade de Tf elevada é maior do que a porção 3' de especificidade de Tf baixa. 0 comprimento da porção 5' de especificidade de Tf elevada é preferivelmente 15 até 40 resíduos de nucleótidos, mais preferivelmente 15 até 30 resíduos de nucleótidos e muito preferivelmente 20 até 25 resíduos de nucleótidos. 0 comprimento da porção 3' de especificidade de Tf baixa é preferivelmente 3 até 15 resíduos de nucleótidos, mais preferivelmente 5 até 15 23 resíduos de nucleótidos e muito preferivelmente 6 até 12 resíduos de nucleótidos. A porção de separação compreendendo pelo menos duas bases universais é parcialmente responsável por vantagens e características do oligo DS. 0 termo "base universal", usado aqui, refere-se a uma base capaz de formar pares de bases com cada uma das bases de DNA/RNA naturais, com pouca distinção entre elas. É amplamente conhecido que nucleótidos nalgumas posições ambíguas de "primers" degenerados têm sido substituídos por bases universais, como desoxiinosina (Ohtsuka, E. et al., (1985) J. Bíol. Chem. 260, 2605-2608; e Sakanari, J.A. et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. 8_6, 4863-4867), l-(2'-desoxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitropirrolo (Nichols, R. et al., (1994) Nature 369, 492-493) e 5-nitroindolo (Loakes, D. et al., (1994) Nucleic Acids Res. 2_2, 4039-4043) para resolver os problemas de conceção associados aos "primers" degenerados, uma vez que essas bases universais são capazes de realizar emparelhamento inespecífico de bases com todas as quatro bases convencionais. No entanto, não surgiu nenhum relato indicando que estas bases universais permitem formar uma porção numa molécula oligonucleotídica para gerar uma estrutura em bolha durante o emparelhamento (hibridização) ou amplificação e depois separar duas sequências adjacentes opostas, levando ao aumento da especificidade de emparelhamento do "primer" ou sonda com uma sequência alvo por especificidade dual através de duas porções de especificidade (emparelhamento) separadas.
De acordo com uma forma de realização preferida, a base universal presente na porção de separação é selecionada do 24 grupo que consiste em desoxiinosina, inosina, 7-desaza-2'-desoxiinosina, 2-aza-2'-desoxiinosina, 2'-0Me inosina, 2'-F inosina, desoxi 3-nitropirrolo, 3-nitropirrolo, 2'-0Me 3-nitropirrolo, 2'-F 3-nitropirrolo, 1-(2'-desoxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitropirrolo, desoxi 5-nitroindolo, 5-nitroindolo, 2'-0Me 5-nitroindolo, 2'-F 5-nitroindolo, desoxi 4-nitrobenzimidazolo, 4-nitrobenzimidazolo, desoxi 4-aminobenzimidazolo, 4-aminobenzimidazolo, desoxi nebularina, 2'-F nebularina, 2'-F 4-nitrobenzimidazolo, ΡΝΑ-5-introindolo, PNA-nebularina, PNA-inosina, PNA-4-nitrobenzimidazolo, ΡΝΑ-3-nitropirrolo, morfolino-5-nitroindolo, morfolino-nebularina, morfolino-inosina, morfolino-4-nitrobenzimidazolo, morfolino-3-nitropirrolo, fosforamidato-5-nitroindolo, fosforamidato-nebularina, fosforamidato-inosina, fosforamidato-4-nitrobenzimidazolo, fosforamidato-3-nitropirrolo, 2'-O-metoxietil inosina, 2'0-metoxietil nebularina, 2'-O-metoxietil 5-nitroindolo, 2'-0-metoxietil 4-nitrobenzimidazolo, 2'-O-metoxietil 3-nitropirrolo, e combinações destas. Mais preferivelmente, a base universal ou análogo de base não discriminatório é desoxiinosina, 1-(2'-desoxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitropirrolo ou 5-nitroindolo, muito preferivelmente desoxiinosina.
Essas bases universais podem estar contidas na porção de separação de um modo contíguo ou modo interrompido com outros nucleótidos, como dNMPs. É preferível que a porção de separação compreenda nucleótidos contíguos possuindo bases universais, preferivelmente desoxiinosina. É crítico que a porção de separação no oligo DS tenha a menor Tf das três porções, para que a porção de separação forme uma estrutura em bolha sem emparelhamento de bases em 25 condições tais que a porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa sejam emparelhadas com o ácido nucleico modelo, permitindo que a porção 5' de especificidade de Tf elevada seja separada da porção 3' de especificidade de Tf baixa em termos de especificidade de emparelhamento com o ácido nucleico modelo, de modo que a especificidade do emparelhamento do oligonucleótido é determinado de forma dual pela porção 5' de especificidade de Tf elevada e pela porção 3' de especificidade de Tf baixa, de tal modo que a especificidade do emparelhamento global do oligonucleótido é aumentada de modo considerável. Preferivelmente, a Tf da porção de separação varia desde 3°C até 15°C, mais preferivelmente 4°C até 15°C e muito preferivelmente 5°C até 10°C.
De acordo com uma forma de realização preferida, a porção de separação entre a porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa contém pelo menos 3 bases universais, mais preferivelmente pelo menos 4 bases universais e muito preferivelmente pelo menos 5 bases universais. De acordo com uma forma de realização preferida, a porção de separação contém 2-10 bases universais, mais preferivelmente 3-10 bases universais, ainda mais preferivelmente 4-8 bases universais e muito preferivelmente 5-7 bases universais.
Quando for requerido um "primer" ou sonda com uma sequência mais longa, as vantagens do oligo DS são muito salientadas. Por exemplo, de acordo com uma técnica convencional, um "primer" com uma sequência de nucleótidos maior do que 35 pares de bases como sequência de hibridização é muito propenso a gerar produtos de amplificação inespecificos. Em 26 contraste, o oligo DS pode gerar produtos de amplificação específicos mesmo com sequências longas, uma vez que contém duas sequências de hibridização (isto é, a porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa) separadas entre si em termos da interação molecular com modelos (isto é, emparelhamento). Por exemplo, o oligo DS pode conter 35-45 pares de bases de uma sequência de hibridização complementar a uma sequência alvo. A este respeito, pode ser apreciado que a presente invenção permite a conceção de "primers" com sequências muito maiores, consideradas não praticáveis em estratégias convencionais de conceção de "primers".
De acordo com uma primeira forma de realização preferida, a porção 5' de especificidade de Tf elevada tem 15 até 25 nucleótidos de comprimento, a porção de separação tem 3 até 15 nucleótidos de comprimento e a porção 3' de especificidade de Tf baixa tem 3 até 15 nucleótidos de comprimento.
Mais preferivelmente, a porção 5' de especificidade de Tf elevada tem 15 até 25 nucleótidos de comprimento; a porção de separação tem 3 até 10 nucleótidos de comprimento; e a porção 3' de especificidade de Tf baixa tem 5 até 15 nucleótidos de comprimento. Muito preferivelmente, a porção 5' de especificidade de Tf elevada tem 15 até 25 nucleótidos de comprimento; a porção de separação tem 5 até 7 nucleótidos de comprimento; e a porção 3' de especificidade de Tf baixa tem 6 até 10 nucleótidos de comprimento. De acordo com o oligo DS exemplificativo e ilustrativo descrito nos Exemplos, a porção 5' de especificidade de Tf elevada tem cerca de 20 nucleótidos de comprimento; a porção de separação tem cerca de 5 27 nucleótidos de comprimento; e a porção 3' de especificidade de Tf baixa tem cerca de 8-10 nucleótidos de comprimento.
Na forma de realização mais preferida, o oligo DS é representado pela fórmula geral seguinte: 5'-Xp- (dl) q-Zr-3' (a definição e caracteristicas de Xp e Zr são as mesmas previamente descritas, dl representa desoxiinosina, (dl)q representa uma porção de separação compreendendo nucleótidos contíguos possuindo bases universais e q é um inteiro entre 5-7). É interessante notar que o presente oligo DS também tem tolerância a emparelhamentos defeituosos, nas condições restritas, suficiente para tolerar emparelhamentos defeituosos com a sua sequência alvo.
Está ilustrada na Fig. 1B uma representação esquemática dos princípios que governam a tolerância a emparelhamentos defeituosos do oligo DS. Um ou mais, preferivelmente um até três emparelhamentos defeituosos de bases na porção 5' de especificidade de Tf elevada podem ser tolerados na condição de que a porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa serem emparelhadas com o modelo. Um ou mais, preferivelmente um até dois emparelhamentos defeituosos de bases na porção 3' de especificidade de Tf baixa podem ser tolerados na condição de que a porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa serem emparelhadas com o modelo. Além disso, um ou mais, preferivelmente um até cinco emparelhamentos defeituosos de bases na porção 5' de especificidade de Tf elevada e na porção 3' de especificidade de Tf baixa podem ser tolerados na condição de que a porção 5' de especificidade de Tf 28 elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa serem emparelhadas com o modelo.
Para impor tolerância a emparelhamentos defeituosos no oligo DS, a condição de emparelhamento, notavelmente a temperatura de emparelhamento, é importante. 0 emparelhamento é efetuado em condições tais que não ocorre emparelhamento apenas pela porção 3' de especificidade de Tf baixa, mas ocorre emparelhamento por todas as porções quando a porção 5' de especificidade de Tf elevada e/ou a porção 3' de especificidade de Tf baixa tiverem uma ou mais, mas limitado, bases com emparelhamentos defeituosos com o seu sitio alvo. É requerido que os oligos DS possuindo tolerância a emparelhamentos defeituosos amplifiquem ou detetem uma sequência de nucleótidos com diversidade genética. Os oligos DS com tolerância a emparelhamentos defeituosos podem ser emparelhados com sequências alvo exibindo diversidade genética e originar amplificação e deteção bem-sucedidas de sequências de nucleótidos de interesse. Por outras palavras, o oligo DS desenvolvido originalmente para aumentar dramaticamente a especificidade do emparelhamento e hibridização também pode ser utilizado em processos que requerem tolerância a emparelhamentos defeituosos quando condições de emparelhamento ou restritas forem adequadamente ajustadas.
Também é divulgado aqui um método para permitir que uma especificidade de emparelhamento de um oligonucleótido seja determinada de forma dual através de uma estrutura do oligonucleótido, que compreende os passos seguintes: (a) selecionar uma sequência de ácido nucleico alvo; (b) conceber uma sequência de um oligonucleótido que possui (i) uma sequência de hibridização substancialmente complementar 29 ao ácido nucleico alvo e (ii) uma porção de separação compreendendo pelo menos duas bases universais, de modo que a porção de separação intervém na sequência de hibridização para formar três porções no oligonucleótido; e (c) determinar a posição da porção de separação no oligonucleótido para permitir que uma porção na direção 5' da porção de separação tenha uma Tf mais elevada do que uma porção na direção 3' da porção de separação, e para permitir que a porção de separação tenha a menor Tf das três porções, desse modo dando origem a um oligonucleótido possuindo três porções distintas com diferentes valores de Tf entre si, no qual (i) uma porção 5' de especificidade de Tf elevada do oligonucleótido tem uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente complementar ao ácido nucleico alvo, (ii) uma porção 3' de especificidade de Tf baixa do oligonucleótido tem uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente complementar ao ácido nucleico alvo, e (iii) a porção de separação do oligonucleótido entre a porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa compreende pelo menos duas bases universais; e a Tf da porção 5' de especificidade de Tf elevada é mais elevada do que a da porção 3' de especificidade de Tf baixa, e a porção de separação tem a Tf mais baixa das três porções, de modo que a especificidade de emparelhamento do oligonucleótido com o ácido nucleico alvo é determinada de forma dual pela porção 5' de especificidade de Tf elevada e pela porção 3' de especificidade de Tf baixa.
Com o presente método pretende-se proporcionar uma nova abordagem para aumentar dramaticamente a especificidade de emparelhamento de um oligonucleótido a ser hibridizado com 30 a sua sequência alvo. O presente método também é expresso como um método para melhorar uma especificidade de emparelhamento de um oligonucleótido. Além disso, o presente método é expresso como um método empregando uma porção de separação compreendendo pelo menos duas bases universais para melhorar a especificidade do emparelhamento de um oligonucleótido hibridizado com uma sequência alvo. O presente método é implementado para preparar o oligo DS aqui discutido acima. Em consequência, com o interesse de evitar redundâncias desnecessárias, as descrições comuns entre eles não estão a ser repetidas, mas são incorporadas nesta descrição do método tal como se fossem repetidas. A maior parte dos métodos convencionais para conceber "primers" ou sondas utiliza meramente uma sequência como estando apta a ser hibridizada com as suas sequências alvo, consoante o disponível. Além disso, para aumentar a especificidade do emparelhamento de oligonucleótidos, foi convencionalmente tentado ajustar condições de amplificação ou hibridização, como temperatura e concentração iónica.
Em contraste, o presente método proporciona uma nova estratégia para aumentar a especificidade do emparelhamento por introdução de características novas em sequências oligonucleotídicas per se. O termo "através de uma estrutura do oligonucleótido", usado aqui com referência à permissão da determinação dual da especificidade de emparelhamento de oligonucleótidos, significa que a estrutura dos oligonucleótidos contribui fortemente para o aumento da especificidade do emparelhamento de oligonucleótidos por imposição, nos oligonucleótidos, de 31 uma caracteristica nova a ser determinada de forma dual em termos da especificidade do emparelhamento.
No presente método é critico conceber uma sequência de um oligonucleótido possuindo (i) uma sequência de hibridização substancialmente complementar ao ácido nucleico alvo e (ii) uma porção de separação compreendendo pelo menos duas bases universais. Neste passo, o perfil estrutural do oligonucleótido é apresentado de modo a exibir uma porção 5'-terminal/porção de separação/porção 3'-terminal no oligonucleótido. As porções 5'-terminal e 3'-terminal contêm uma sequência de hibridização substancialmente complementar ao ácido nucleico alvo e estão separadas pela porção de separação. 0 passo mais critico do presente método consiste em determinar a posição da porção de separação no oligonucleótido, de modo a permitir que uma porção na direção 5' da porção de separação tenha uma Tf mais elevada do que uma porção na direção 3' da porção de separação, e permitir que a porção de separação tenha a Tf mais baixa das três porções, desse modo dando origem a um oligonucleótido possuindo três porções distintas com diferentes valores de Tf entre si.
As novas caracteristicas estruturais introduzidas em oligonucleótidos pelo presente método são (i) três porções distintas (porção 5' de especificidade de Tf elevada, porção de separação e porção 3' de especificidade de Tf baixa) em sequências oligonucleotidicas; (ii) diferentes valores de Tf das três porções entre si; (iii) porção de separação entre a porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa compreendendo 32 pelo menos duas bases universais; (iv) duas porções envolvidas na interação molecular com alvos no passo de emparelhamento, que estão separadas, em termos do evento de emparelhamento, pela porção de separação; (v) valores de Tf seguindo a ordem da porção 5' de especificidade de Tf elevada, porção 3' de especificidade de Tf baixa e porção de separação. Essas características estruturais asseguram que a especificidade de emparelhamento de oligonucleótidos, finalmente proporcionados pela presente invenção, seja determinada de forma dual pela porção 5' de especificidade de Tf elevada e pela porção 3' de especificidade de Tf baixa, permitindo o aumento dramático da especificidade de emparelhamento de oligonucleótidos com a sua sequência alvo.
Os oligonucleótidos concebidos e preparados de acordo com o presente método exibem especificidade de emparelhamento muito mais elevada do que aqueles que não têm essas três porções.
As características e vantagens do oligo DS serão descritas do modo seguinte: (a) a porção de separação do oligo DS compreende pelo menos duas bases universais que geram a região de menor Tf do oligo DS, de modo que forma uma estrutura em bolha sem emparelhamento de bases em condições tais que a porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa são emparelhadas com o ácido nucleico modelo. Essa estrutura em bolha sem emparelhamento de bases permite que a porção 5' de especificidade de Tf elevada seja separada da porção 3' de especificidade de Tf baixa em termos de especificidade do emparelhamento com o ácido nucleico modelo; 33 (b) a Tf da porção 5' de especificidade de Tf elevada é mais elevada do que a da porção 3' de especificidade de Tf baixa, e a porção de separação exibe a menor Tf, o que possibilita estabelecer condições restritas nas quais não ocorre emparelhamento apenas pela porção 3' de especificidade de Tf baixa; (c) assim, a especificidade de emparelhamento global do oligo DS é determinada de forma dual pela porção 5' de especificidade de Tf elevada e pela porção 3' de especificidade de Tf baixa; e (d) em consequência, a especificidade de emparelhamento global do oligo DS é dramaticamente melhorada.
Pode ser apreciado que o oligo DS divulgado aqui é muito útil numa variedade de (i) métodos de amplificação de ácidos nucleicos à base de "primers", como os métodos de Miller, H. L (WO 89/06700) e Davey, C. et al. (EP 329,822), Reação em Cadeia de Ligase (LCR, Wu, D.Y et al., Genomics 4_, 360 (1989)), Reação em Cadeia de Polimerase Ligase (Barany, PCR Methods and Applic., 1: 5-16(1991)), LCR de Hiato (WO 90/01069), Reação em Cadeia de Reparação (EP 439, 182), 3SR (Kwoh et al., PNAS, USA, _86: 1173(1989)) e NASBA (Patente U.S. N° 5,130,238), (ii) tecnologias à base de extensão de "primers", como sequenciação por ciclos (Kretz et al., (1994) "Cycle sequencing". PCR Methods Appl. 3: S107-S112) e pirossequenciação (Ronaghi et al., (1996) Anal. Biochem., 242: 84-89; e (1998) Science 281: 363-365), e (iii) tecnologias à base de hibridização, como a deteção de uma sequência de nucleótidos alvo utilizando microsséries de oligonucleótidos. 34 0 oligo DS divulgado aqui pode ser aplicado a uma variedade de tecnologias à base de amplificação, sequenciação e hibridização de ácidos nucleicos. Exemplos representativos para demonstrar o efeito do oligo DS são os seguintes. I. Aplicação à Síntese de uma Molécula de Ácido Nucleico É divulgado aqui um método de síntese de uma molécula de ácido nucleico utilizando um oligonucleótido de especificidade dual através de uma reação de extensão dependente do modelo, que compreende os passos seguintes: (a) emparelhamento do oligonucleótido de especificidade dual com uma molécula de ácido nucleico modelo, em que o oligonucleótido de especificidade dual tem três porções nas quais uma porção 5' de especificidade de Tf elevada tem uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente complementar a um sítio do ácido nucleico modelo para hibridizar com aquele, uma porção de separação compreende pelo menos duas bases universais e uma porção 3' de especificidade de Tf baixa tem uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente complementar a um sítio do ácido nucleico modelo para hibridizar com aquele, a Tf da porção 5' de especificidade de Tf elevada é mais elevada do que a da porção 3' de especificidade de Tf baixa, a porção de separação tem a Tf mais baixa das três porções; a porção de separação forma uma estrutura em bolha sem emparelhamento de bases em condições tais que a porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa são emparelhadas com o ácido nucleico modelo, em que o emparelhamento ocorre em condições tais que não ocorre emparelhamento apenas pela porção 3' de especificidade de Tf baixa; e 35 (b) extensão do oligonucleótido de especificidade dual para sintetizar uma molécula de ácido nucleico complementar ao ácido nucleico modelo.
Uma vez que o método de síntese emprega o oligo DS divulgado aqui, as descrições comuns entre eles são omitidas para evitar que a complexidade desta especificação conduza a multiplicidade indesejada.
Esta aplicação utilizando o oligo DS como divulgado aqui pode proporcionar um método melhorado para sintetizar de modo seletivo uma sequência de ácido nucleico complementar a uma sequência alvo através de uma reação de extensão dependente do modelo, envolvendo passos de emparelhamento e extensão. Em particular, uma sequência de ácido nucleico complementar a uma sequência alvo pode ser sintetizada repetindo o processo da reação de extensão dependente do modelo, em que os passos de emparelhamento e extensão são seguidos de um passo de desnaturação. 0 método divulgado aqui pode ser utilizado para sintetizar uma molécula de ácido nucleico complementar a qualquer molécula de ácido nucleico modelo. Essa molécula pode ser DNA ou RNA. A molécula pode estar na forma de filamentação dupla ou filamentação simples. Quando o material de partida de ácido nucleico tem filamentação dupla, é preferido transformar os dois filamentos numa forma de filamentação simples ou parcialmente de filamentação simples. Métodos conhecidos para separar filamentos incluem mas não estão limitados a tratamento por aquecimento, alcali, formamida, ureia e glioxal, métodos enzimáticos (por exemplo, ação de helicases) e proteínas de ligação. Por exemplo, pode efetuar-se separação de filamentos por aquecimento a uma 36 temperatura variando desde 80°C até 105°C. Métodos gerais para efetuar este tratamento são apresentados por Joseph Sambrook, et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
Quando for empregue um mRNA como material de partida, é necessário um passo de transcrição reversa antes da realização do passo de emparelhamento, cujos pormenores se encontram em Joseph Sambrook, et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y (2001); e Noonan, K. F. et al., Nuclelc Aclds Res. 16: 10366 (1988)). Para a transcrição reversa emprega-se um "primer" oligonucleotidico dT apto a hibridizar com a cauda poli A de mRNA. O "primer" dT oligonucleotidico é compreendido por dTMPs, um ou mais dos quais podem ser substituídos por outros dNMPs desde que o "primer" dT possa servir de "primer". A transcrição reversa pode ser realizada com transcriptase reversa que tenha atividade de RNase H. Se for utilizada uma enzima com atividade de RNase H, pode ser possível omitir um passo separado de digestão com RNase H ao escolher cuidadosamente as condições reacionais.
Os presentes métodos não requerem que as moléculas de ácido nucleico modelo tenham qualquer sequência ou comprimento particular. Em particular, as moléculas incluem qualquer ácido nucleico de ocorrência natural procariótico, eucariótico (por exemplo, protozoários e parasitas, fungos, levedura, plantas superiores, animais inferiores e superiores, incluindo mamíferos e humanos), virai (por exemplo, vírus Herpes, HIV, vírus influenza, vírus Epstein-Barr, vírus da hepatite, vírus polio, etc.) ou viroide. A 37 molécula de ácido nucleico também pode ser qualquer molécula de ácido nucleico que tenha sido ou que possa ser sintetizada quimicamente. Assim, a sequência de ácido nucleico pode ou não ser encontrada na natureza. 0 oligo DS utilizado aqui é hibridizado ou emparelhado com um sitio do modelo de modo que se forma uma estrutura de filamentação dupla. Condições adequadas de emparelhamento de ácidos nucleicos para a formação dessas estruturas de filamentação dupla são descritas por Joseph Sambrook, et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y (2001) e
Haymes, B. D., et al., "Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach" , IRL Press, Washington, D.C. (1985 ) · Não é necessário que as sequências da porção 5' de especificidade de Tf elevada e da porção 3' de especificidade de Tf baixa do oligo DS exibam complementaridade precisa, apenas é necessário que as sequências sejam substancialmente complementares de modo a serem capazes de formar uma estrutura de filamentação dupla estável. Assim, afastamentos da complementaridade completa são permissiveis desde que esses afastamentos não sejam suficientes para impedir completamente a hibridização para formar uma estrutura de filamentação dupla. O emparelhamento do oligo DS com um sitio do ácido nucleico modelo é um pré-requisito para a sua polimerização, dependente do modelo, com polimerases. Fatores (ver Joseph Sambrook, et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y (2001); e Haymes, B.D., et. al., "Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach", IRL Press, Washington, D.C. (1985)) que afetam o emparelhamento de bases do oligo DS com os seus ácidos nucleicos 38 complementares afetam subsequentemente a eficiência da iniciação. A composição de nucleótidos do oligo DS pode afetar a temperatura à qual o emparelhamento é ótimo e, em consequência, pode afetar a sua eficiência de iniciação. A porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa do oligo DS durante o passo de emparelhamento desempenham um papel de porção de hibridização ou de sitio determinante da especificidade (isto é, sitio determinante de especificidade dual), ao passo que a porção de separação não serve de sitio de hibridização e não interage com o modelo para o emparelhamento de bases.
Uma variedade de DNA polimerases pode ser utilizada no passo de extensão dos presentes métodos, incluindo o fragmento "Klenow" da DNA polimerase I de E. coli, uma DNA polimerase termicamente estável e DNA polimerase do bacteriófago T7. Preferivelmente, a polimerase é uma DNA polimerase estável termicamente que pode ser obtida de uma variedade de espécies bacterianas, incluindo Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth) , Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis e Pyrococcus furiosus (Pfu). Quando estiver a ser conduzida uma reação de polimerização, é preferido proporcionar em excesso os componentes requeridos para essa reação no reator. Excesso, relativamente a componentes da reação de extensão, refere-se a uma quantidade de cada componente de tal modo que a capacidade para se obter a extensão desejada não seja substancialmente limitada pela concentração desse componente. É desejável adicionar à mistura reacional uma quantidade de cofatores requeridos, tais como Mg2+, dATP, 39 dCTP, dGTP e dTTP, em quantidade suficiente para suportar o grau de extensão desejado. 0 emparelhamento ou hibridização, no presente método, é realizado em condições restritas que permitem a ligação especifica entre o oligo DS e o ácido nucleico modelo. Essas condições restritas para o emparelhamento dependerão das sequências e irão variar dependendo de parâmetros ambientais. No presente método, o passo de emparelhamento é geralmente realizado em condições de restrição elevada. No entanto, se o presente método for aplicado a processos que requerem tolerância a emparelhamentos defeituosos, é preferível que o passo de emparelhamento seja realizado em condições restritas de tal modo que a porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa sejam emparelhadas com o modelo apesar da presença de um ou mais, se bem que limitados, emparelhamentos defeituosos de pares de bases. Essa tolerância a emparelhamentos defeituosos é muito útil na amplificação ou deteção de um gene com diversidade genética. Condições restritas podem ser facilmente determinadas pelo conhecimento comum da área. É vantajoso realizar o passo de emparelhamento a uma temperatura de emparelhamento mais elevada do que a Tf da porção 3' de especificidade de Tf baixa, assegurando que não ocorre emparelhamento apenas pela porção 3' de especificidade de Tf baixa. Preferivelmente, a temperatura de emparelhamento é mais elevada em pelo menos 5°C, mais preferivelmente pelo menos 10°C, ainda mais preferivelmente pelo menos 15°C e muito preferivelmente pelo menos 20°C do que a Tf da porção 3' de especificidade de Tf baixa. 40
Numa forma de realização preferida, a temperatura de emparelhamento varia desde cerca de 40°C até 75°C, mais preferivelmente 45°C até 72°C, ainda mais preferivelmente 50°C até 68°C e muito preferivelmente 55°C até 65°C. Temperaturas de emparelhamento adequadas no presente método podem ser determinadas considerando independentemente os valores de Tf da porção 5' de especificidade de Tf elevada e da porção 3' de especificidade de Tf baixa. Por outras palavras, temperaturas de emparelhamento no presente método não devem ser determinadas pelo comprimento total e composições de nucleótidos da porção 5' de especificidade de Tf elevada e da porção 3' de especificidade de Tf baixa, mas sim pelo comprimento individual e composição de nucleótidos da porção 5' de especificidade de Tf elevada e/ou da porção 3' de especificidade de Tf baixa. Habitualmente, a temperatura de emparelhamento determinada considerando apenas a Tf da porção 5' de especificidade de Tf elevada pode ser muito maior do que a Tf da porção 3' de especificidade de Tf baixa e tornar-se ótima.
Se for requerida tolerância a emparelhamentos defeituosos no passo de emparelhamento, é preferido que a temperatura de emparelhamento seja ajustada para se tornar menor do que as indicadas acima. O presente método pode ser combinado com muitos outros processos conhecidos na área para se atingir um objetivo especifico. Por exemplo, o isolamento (ou purificação) do produto sintetizado pode seguir-se à reação de extensão. Isto pode ser efetuado por eletroforese em gel, cromatografia em coluna, cromatografia de afinidade ou hibridização. Adicionalmente, o produto sintetizado desta invenção pode ser inserido num veiculo adequado para 41 clonagem. Além disso, o produto sintetizado divulgado aqui pode ser expresso num vetor de expressão albergando um hospedeiro adequado. II. Aplicação à Amplificação de uma Sequência de Ácido Nucleico Alvo
Ainda noutro aspeto é divulgado um método para amplificar seletivamente uma sequência de ácido nucleico alvo a partir de um DNA ou de uma mistura de ácidos nucleicos, que compreende amplificar a sequência de ácido nucleico alvo por realização de pelo menos dois ciclos de emparelhamento de "primers", extensão de "primers" e desnaturação, utilizando como "primer" um par de oligonucleótidos de especificidade dual; em que o oligonucleótido de especificidade dual tem três porções nas quais uma porção 5' de especificidade de Tf elevada tem uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente complementar a um sítio do ácido nucleico alvo para hibridizar com aquele, uma porção de separação compreende pelo menos duas bases universais e uma porção 3' de especificidade de Tf baixa tem uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente complementar a um sítio do ácido nucleico alvo para hibridizar com aquele, a Tf da porção 5' de especificidade de Tf elevada é mais elevada do que a da porção 3' de especificidade de Tf baixa, a porção de separação tem a menor Tf das três porções; a porção de separação forma uma estrutura em bolha sem emparelhamento de bases em condições tais que a porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa são emparelhadas com o ácido nucleico alvo; em que o emparelhamento na reação de amplificação é realizado em condições tais que não ocorre 42 emparelhamento apenas pela porção 3' de especificidade de Tf baixa.
Uma vez que o método de amplificação emprega o oligo DS divulgado aqui, as descrições comuns entre eles são omitidas para evitar que a complexidade desta especificação conduza a multiplicidade indesejada. Adicionalmente, uma vez que este método envolve processos de emparelhamento e extensão, as descrições quanto aos dois processos são omitidas para evitar que a complexidade desta especificação conduza a multiplicidade indesejada. Por exemplo, a composição e estrutura do oligo DS utilizado e as condições para emparelhamento e extensão são comuns entre este processo e o método previamente descrito de síntese de moléculas de ácidos nucleicos.
Esta aplicação utilizando o oligo DS divulgado aqui pode proporcionar um método melhorado para amplificar seletivamente uma sequência de ácido nucleico alvo a partir de um ácido nucleico ou de uma mistura de ácidos nucleicos (DNA ou mRNA) por realização de amplificações de ácidos nucleicos, preferivelmente PCR (reação em cadeia de polimerase).
Está ilustrada na Fig. 2 uma representação esquemática para amplificar seletivamente um ácido nucleico alvo de DNA de filamentação dupla utilizando o oligo DS descrito acima. Como mostrado na Fig. 2, um par dos oligos DS é emparelhado com um modelo de DNA de filamentação dupla desnaturado. A porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa durante o emparelhamento desempenham um papel de uma porção de hibridização ou de um sítio determinante de especificidade (isto é, sítio 43 determinante de especificidade dual) , ao passo que a porção de separação não serve de sitio de hibridização e não interage com o modelo para o emparelhamento de bases. Nesta altura, a porção de separação forma uma estrutura em bolha no oligo DS de modo que duas porções terminais, isto é, a porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa, possam estar espacialmente separadas para determinarem de modo dual a especificidade global do oligo DS. Pormenores de reações subsequentes são semelhantes aos de amplificações convencionais de ácidos nucleicos à base de "primers" conhecidas na área e aqui descritas acima. 0 presente método para amplificar uma sequência de ácido nucleico pode ser realizado de acordo com várias amplificações de ácidos nucleicos à base de "primers" conhecidas na área. Preferivelmente, os métodos são realizados de acordo com o processo de PCR divulgado nas Patentes U .S. N°s 4,683,195, 4,683, 202 e 4, 800,159, mais preferivelmente, método de PCR de inicio a quente. A Fig. 3 ilustra uma representação esquemática para amplificar seletivamente um ácido nucleico alvo de mRNA utilizando o oligo DS. No primeiro passo, mRNA obtido de várias amostras biológicas é transcrito de forma reversa utilizando o "primer" oligo dT apto a hibridizar com a cauda poli A de mRNA e transcriptase reversa. Pormenores da transcrição reversa encontram-se em Joseph Sambrook, et ai., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); e Noonan, K. F. et ai., Nucleic Acids Res. 1_6: 10366 (1988)). A descrição de reações subsequentes é semelhante à de 44 amplificações convencionais de ácidos nucleicos à base de "primers" conhecidas na área e discutidas previamente. III. Aplicação à Amplificação de DNA Multiplex
Noutro aspeto, é divulgado um método para amplificar simultaneamente duas ou mais sequências de nucleótidos alvo utilizando dois ou mais pares de "primers" na mesma reação, que compreende amplificar as sequências de nucleótidos alvo por realização de pelo menos dois ciclos de emparelhamento de "primers", extensão de "primers" e desnaturação, utilizando como "primer" dois ou mais pares de oligonucleótidos de especificidade dual, caracterizado por os oligonucleótidos de especificidade dual terem três porções nas quais uma porção 5' de especificidade de Tf elevada tem uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente complementar a um sitio na sequência de nucleótidos alvo para hibridizar com aquele, uma porção de separação compreende pelo menos duas bases universais e uma porção 3' de especificidade de Tf baixa tem uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente complementar a um sitio na sequência de nucleótidos alvo para hibridizar com aquele, a Tf da porção 5' de especificidade de Tf elevada é maior do que a da porção 3' de especificidade de Tf baixa, a porção de separação tem a menor Tf das três porções; a porção de separação forma uma estrutura em bolha sem emparelhamento de bases em condições tais que a porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa são emparelhadas com a sequência de nucleótidos alvo; em que o emparelhamento na reação de amplificação é realizado em condições tais que não ocorre emparelhamento apenas pela porção 3' de especificidade de Tf baixa. 45
Esta aplicação utilizando o oligo DS divulgado aqui também pode proporcionar um método melhorado para amplificar mais do que uma sequência alvo utilizando mais do que um par de "primers" na mesma reação. Em geral, é extremamente difícil estabelecer condições de PCR multiplex para amplificar mais do que 10 sequências alvo em paralelo, uma vez que é requerido que uma reação de PCR ótima amplifique mesmo um locus específico sem quaisquer produtos secundários inespecíficos. Uma vez que é necessário que o emparelhamento ocorra a uma temperatura suficientemente elevada para permitir a ocorrência de emparelhamentos perfeitos DNA-DNA na reação, o oligo DS da presente invenção é ideal na otimização da amplificação de DNA multiplex, devido à sua função de melhoramento da especificidade da amplificação. "PCR Multiplex", como usado aqui, refere-se à amplificação simultânea de alvos de DNA multiplex numa única mistura de reação em cadeia de polimerase (PCR).
Numa forma de realização específica, este processo de multiplex compreende realizar uma reação de amplificação compreendendo pelo menos dois ciclos de emparelhamento de "primers", extensão de "primers" e desnaturação, utilizando os pares de "primers" do oligo DS, caracterizado por os "primers" consistirem num oligonucleótido de especificidade dual possuindo três porções nas quais uma porção 5' de especificidade de Tf elevada tem uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente complementar a um sítio da sequência de nucleótidos alvo para hibridizar com aquele, uma porção de separação compreende pelo menos duas bases universais e uma porção 3' de especificidade de Tf baixa tem uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente complementar a um sítio da sequência de 46 nucleótidos alvo para hibridizar com aquele, a Tf da porção 5' de especificidade de Tf elevada é maior do que a da porção 3' de especificidade de Tf baixa, a porção de separação tem a menor Tf das três porções; a porção forma uma estrutura em bolha sem emparelhamento de bases em condições tais que a porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa são emparelhadas com a sequência de nucleótidos alvo; em que o emparelhamento na reação de amplificação é realizado em condições tais que não ocorre emparelhamento apenas pela porção 3' de especificidade de Tf baixa.
Uma vez que esta aplicação utilizando o oligo DS divulgado aqui é realizada de acordo com o presente método para a amplificação de sequências de ácidos nucleicos previamente discutido, excetuando a utilização de mais do que uma sequência de nucleótidos alvo e pares de "primers", as descrições comuns entre eles são omitidas para evitar que a complexidade desta especificação conduza a multiplicidade indesejada. Por exemplo, a composição e estrutura do oligo DS utilizado e as condições para amplificação são comuns entre este processo e os presentes métodos para amplificação de sequências de ácidos nucleicos previamente discutidos.
De acordo com uma forma de realização preferida, a temperatura de emparelhamento varia desde cerca de 40°C até 70°C, mais preferivelmente 45°C até 68°C, ainda mais preferivelmente 50°C até 65°C e muito preferivelmente 55°C até 65°C.
Numa forma de realização preferida, os comprimentos dos produtos amplificados de cada uma das sequências de 47 nucleótidos alvo são diferentes para análise subsequente. De acordo com uma forma de realização preferida, os produtos de amplificação de sequências de nucleótidos alvo multiplex podem ser analisados por separação de tamanhos. A comparação por separação de tamanhos é efetuada utilizando uma variedade de métodos conhecidos na área, como eletroforese numa matriz de gel de poliacrilamida ou matriz de gel de agarose, e sequenciação de nucleótidos. A sequenciação de nucleótidos pode ser rapidamente efetuada com um sequenciador automático disponibilizado por vários fabricantes.
Como exemplificado no Exemplo em baixo, o multiplex desta invenção permite que os produtos amplificados finais não tenham os problemas relacionados com o fundo, bem como ausência de especificidade proveniente de processos multiplex convencionais conhecidos na área. A vantagem da amplificação multiplex reside no facto de numerosas doenças ou alterações de sequências de nucleótidos especificas (por exemplo, polimorfismo de um único nucleótido ou mutação pontual) poderem ser avaliadas na mesma reação. 0 número de análises que podem ser efetuadas simultaneamente é ilimitado; todavia, o limite superior é provavelmente cerca de 20 e é provável que dependa da diferença de tamanhos requerida para resolução e métodos que estão disponíveis para resolver o produto amplificado. O método divulgado pode ser aplicado ao diagnóstico de doenças genéticas e infeciosas, determinação de género, análise de ligação genética e estudos forenses. 48
IV. Aplicação à Sequenciação de DNA A especificidade melhorada permite a utilização do oligo DS em sequenciação direta como "primer" de sequenciação em fase de solução (em particular, sequenciação por ciclos) ou como sonda de sequenciação em fase sólida (em particular, sequenciação com "chip" de oligonucleótidos) utilizando o principio da extensão dependente do modelo do oligo DS.
Ainda noutro aspeto, é divulgado um método de sequenciação de uma molécula de ácido nucleico alvo utilizando um oligonucleótido de especificidade dual a partir de um DNA ou de uma mistura de ácidos nucleicos, que compreende os passos seguintes: (a) sintetizar uma molécula de ácido nucleico complementar à molécula de ácido nucleico alvo a ser sequenciada por realização de pelo menos dois ciclos de emparelhamento de "primers", extensão de "primers" e desnaturação, utilizando como "primer" de sequenciação o oligonucleótido de especificidade dual; em que o oligonucleótido de especificidade dual tem três porções nas quais uma porção 5' de especificidade de Tf elevada tem uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente complementar a um sitio da molécula de ácido nucleico alvo para hibridizar com aquele, uma porção de separação compreende pelo menos duas bases universais e uma porção 3' de especificidade de Tf baixa tem uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente complementar a um sitio da molécula de ácido nucleico alvo para hibridizar com aquele, a Tf da porção 5' de especificidade de Tf elevada é maior do que a da porção 3' de especificidade de Tf baixa, a porção de separação tem a menor Tf das três porções; a porção de separação forma uma estrutura em bolha 49 sem emparelhamento de bases em condições tais que a porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa são emparelhadas com a molécula de ácido nucleico alvo; em que o emparelhamento na reação de síntese é realizado em condições tais que não ocorre emparelhamento apenas pela porção 3' de especificidade de Tf baixa; e (b) determinar uma sequência de nucleótidos da molécula de ácido nucleico complementar sintetizada.
Em geral, a sequenciação de DNA tem sido realizada por várias metodologias, tais como sequenciação de Maxam-Gilbert, sequenciação de Sanger, pirossequenciação e sequenciação por digestão com exonucleases. Pretende-se que o presente método de sequenciação melhore a pirossequenciação, bem como a sequenciação por ciclos térmicos. 0 presente método pode ser implementado de acordo com variações do método de didesoxi de Sanger. A sequenciação por ciclos térmicos da presente invenção pode ser efetuada em modelos de ácidos nucleicos amplificados por PCR. Adicionalmente, a sequenciação por ciclos térmicos será realizada num modelo de ácido nucleico que não foi amplificado por PCR imediatamente antes da sequenciação.
Em resumo, a sequenciação de Sanger baseia-se no princípio de que DNA polimerase irá incorporar 2',3'-didesoxi-nucleótidos em cadeias de ácidos nucleicos, dando origem a terminação das cadeias (Sanger et ai., (1977) PNAS. USA 74: 5463). 0 método desenvolvido por Sanger é referido como método de terminação de cadeias com didesoxi. Na versão mais tradicional deste método, um segmento de DNA para o 50 qual se deseja a sequência é clonado num fago de DNA de filamentação simples, como M13. Estes DNAs fágicos podem servir de modelos para a síntese iniciada do filamento complementar pelo fragmento Klenow da DNA polimerase L. O "primer" é um oligonucleótido sintético destinado a hibridizar especificamente com uma região do vetor M13 perto da extremidade 3' da inserção clonada. Em cada uma de quatro reações de sequenciação, a síntese iniciada é efetuada na presença de um análogo didesoxi suficiente de um dos quatro desoxinucleótidos possíveis, para que as cadeias em crescimento sejam aleatoriamente terminadas pela incorporação destes nucleótidos sem saída. A concentração relativa entre formas didesoxi e desoxi é ajustada para dar origem a um espalhamento de eventos de terminação correspondentes a todos os possíveis comprimentos de cadeia que podem ser resolvidos por eletroforese em gel. Marcadores incorporados nas cadeias em crescimento são utilizados para desenvolver uma imagem de autorradiograma do padrão do DNA em cada pista de eletroforese. A sequência dos desoxinucleótidos no modelo de ácido nucleico clonado é determinada a partir de um exame do padrão de bandas nas quatro vias.
Como variação do método de Sanger, o método de sequenciação por ciclos térmicos envolve normalmente a utilização de soluções contendo um "primer" de sequenciação de ácidos nucleicos, desoxinucleósido trifosfatos, um ou mais didesoxinucleósido trifosfatos (ddNTPs), uma solução tampão adequada, uma DNA polimerase termicamente estável (por exemplo, Taq polimerase) e o modelo de ácido nucleico a ser sequenciado. Os pormenores da sequenciação por ciclos térmicos podem ser encontrados nas Patentes U.S. N°s 5, 432, 065, 5, 723, 298, 5, 756, 285, 5, 817,797 e 5, 831, 065. Os 51 processos do método são geralmente realizados sob condições de aplicação de ciclos térmicos semelhantes à PCR comum.
Depois de uma reação de sequenciação ter sido realizada num modelo de ácido nucleico, a determinação da sequência da molécula requer a identificação dos produtos reacionais. É conhecido na área um número considerável de métodos de deteção. Estes métodos envolvem geralmente a deteção de marcadores, incluindo etiquetas de nucleótidos radioativos, fluorescentes, de infravermelhos e quimioluminescentes, como descrito em Ausubel, F. M. et ai., "Current Protocols in Molecular Biology", (1993) John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, N.Y. As etiquetas podem ser marcadas com "primers" ou ddNTP, preferivelmente ddNTP. A etiqueta mais preferida é uma etiqueta fluorescente incluindo corantes de 6-carboxifluoresceína, 6-carboxi-X-rodamina, 3-(ε-carboxi-pentil)-3'-etil-5,5'-dimetiloxacarbocianina, 6-carboxi-X-rodamina, derivados do ácido 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-propiónico e 4,7-diclororrodamina.
Preferivelmente, a temperatura de emparelhamento varia desde cerca de 40°C até 70°C, mais preferivelmente 45°C até 68°C e muito preferivelmente 50°C até 65°C. 0 presente método exibe sequenciação altamente especifica de uma molécula de ácido nucleico alvo, como demonstrado no Exemplo apresentado aqui em baixo. Mais especificamente, os genes da família "homeobox" específicos da placenta de ratinho, Psxl e Psx2, podem ser diferencialmente sequenciados utilizando o seu "primer" de sequenciação concebido para ter uma estrutura única do oligo DS. Essa sequenciação diferencial é sublinhada no sentido de que as sequências globais dos "primers" de sequenciação são 52 diferentes apenas numa base na porção 3' de especificidade de Tf baixa.
Surpreendentemente, o presente método permite que uma molécula de ácido nucleico alvo, contida num DNA genómico ou numa população de cDNAs, seja diretamente sequenciada sem purificação ou isolamento. 0 êxito da sequenciação direta de uma molécula de ácido nucleico alvo num DNA genómico ou numa população de cDNAs ainda não foi relatado. Quando o presente método de sequenciação for empregue para sequenciar diretamente uma molécula de ácido nucleico alvo contida numa população de cDNAs de um RNA total, este método compreende os passos seguintes: (a) contactar uma população de mRNAs com um "primer" dT oligonucleotidico que é hibridizado com a cauda poliA dos mRNAs em condições suficientes para a ocorrência de síntese enzimática de ácidos desoxirribonucleicos conduzida pelo modelo; (b) transcrever de forma reversa os mRNAs com os quais o "primer" dT oligonucleotidico hibridiza, para produzir uma população de primeiros filamentos de cDNAs que são complementares aos mRNAs com os quais o "primer" dT oligonucleotidico hibridiza; (c) sintetizar uma molécula de ácido nucleico complementar ao primeiro filamento de cDNA a ser sequenciado por realização de pelo menos dois ciclos de emparelhamento de "primers", extensão de "primers" e desnaturação, utilizando como "primer" de sequenciação o oligonucleótido de especificidade dual; em que o oligonucleótido de especificidade dual tem três porções nas quais uma porção 5' de especificidade de Tf elevada tem uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente 53 complementar a um sitio do primeiro filamento de cDNA para hibridizar com aquele, uma porção de separação compreende pelo menos duas bases universais e uma porção 3' de especificidade de Tf baixa tem uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente complementar a um sitio do primeiro filamento de cDNA para hibridizar com aquele, a Tf da porção 5' de especificidade de Tf elevada é maior do que a da porção 3' de especificidade de Tf baixa, a porção de separação tem a menor Tf das três porções; a porção de separação forma uma estrutura em bolha sem emparelhamento de bases em condições tais que a porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa são emparelhadas com o primeiro filamento de cDNA; em que o emparelhamento na reação de síntese é realizado em condições tais que não ocorre emparelhamento apenas pela porção 3' de especificidade de Tf baixa; e (d) determinar uma sequência de nucleótidos do primeiro filamento de cDNA sintetizado. V. Aplicação à Deteção de Moléculas de Ácidos Nucleicos com Diversidade Genética
Noutro aspeto é divulgado um método de deteção de uma molécula de ácido nucleico com diversidade genética através de uma reação de extensão dependente do modelo de um oligonucleótido de especificidade dual, que compreende os passos seguintes: (a) emparelhar o oligonucleótido de especificidade dual com uma molécula de ácido nucleico modelo, em que o oligonucleótido de especificidade dual tem três porções nas quais uma porção 5' de especificidade de Tf elevada tem uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente 54 complementar a um sitio do ácido nucleico modelo para hibridizar com aquele, uma porção de separação compreende pelo menos duas bases universais e uma porção 3' de especificidade de Tf baixa tem uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente complementar a um sitio do ácido nucleico modelo para hibridizar com aquele, a Tf da porção 5' de especificidade de Tf elevada é maior do que a da porção 3' de especificidade de Tf baixa, a porção de separação tem a menor Tf das três porções; a porção de separação forma uma estrutura em bolha sem emparelhamento de bases em condições tais que a porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa são emparelhadas com o ácido nucleico modelo; em que o emparelhamento é realizado em condições tais que não ocorre emparelhamento apenas pela porção 3' de especificidade de Tf baixa e ocorre emparelhamento quando a porção 5' de especificidade de Tf elevada e/ou a porção 3' de especificidade de Tf baixa têm uma ou mais bases com emparelhamentos defeituosos com o seu sitio alvo; e (b) estender o oligonucleótido de especificidade dual para sintetizar a molécula de ácido nucleico complementar ao modelo; (c) detetar a ocorrência da extensão dependente do modelo do oligonucleótido de especificidade dual.
Uma vez que esta aplicação utilizando o oligo DS divulgado aqui é realizada de acordo com os presentes métodos para a síntese de sequências de ácidos nucleicos previamente discutidos, as descrições comuns entre eles são omitidas para evitar que a complexidade desta especificação conduza a multiplicidade indesejada. 55
Esta aplicação utilizando o oligo DS divulgado aqui pode proporcionar um método melhorado para detetar seletivamente uma sequência de ácido nucleico com diversidade genética por uma reação de extensão dependente do modelo envolvendo passos de emparelhamento e extensão. Em particular, pode detetar-se uma sequência de ácido nucleico alvo com diversidade genética repetindo o processo da reação de extensão dependente do modelo, no qual os passos de emparelhamento e extensão são seguidos de um passo de desnaturação. 0 presente método baseia-se na tolerância a emparelhamentos defeituosos do oligo DS.
Foi relatada diversidade genética para vários genomas. Este fenómeno tem sido considerado um obstáculo à deteção sem falhas de um gene ou genoma de interesse. A presente invenção é dirigida à provisão de uma abordagem para ultrapassar esses problemas convencionais por utilização do oligo DS com tolerância a emparelhamentos defeituosos. 0 oligo DS com uma sequência definida pode ser emparelhado com várias sequências alvo exibindo diversidade genética e levar à amplificação e deteção bem-sucedidas de sequências de nucleótidos de interesse. Por outras palavras, o oligo DS originalmente desenvolvido para aumentar dramaticamente a especificidade do emparelhamento e hibridização também pode ser utilizado em processos que requerem tolerância a emparelhamentos defeituosos quando condições de emparelhamento ou restritas são adequadamente ajustadas.
Para proporcionar o oligo DS exibindo tolerância a emparelhamentos defeituosos, deve ser concebido com base numa região conservada de moléculas de ácidos nucleicos 56 geradas por alinhamento de todas as sequências de nucleótidos disponíveis. 0 termo "região conservada", como usado aqui, refere-se a um segmento de uma sequência de nucleótidos de um gene, ou sequência de aminoácidos de uma proteína, que é significativamente semelhante entre várias sequências de nucleótidos diferentes de um gene. Este termo é usado de forma intermutável com o termo "sequência conservada".
Numa forma de realização preferida, a sequência mais conservada na região conservada está localizada na porção da extremidade 3' do oligo DS, e a sequência menos conservada está localizada na porção de separação. A porção 5' de especificidade de Tf elevada e/ou a porção 3' de especificidade de Tf baixa, preferivelmente a porção 5' de especificidade de Tf elevada, podem ter uma ou mais, preferivelmente uma até três, mais preferivelmente uma ou duas bases com emparelhamentos defeituosos com o seu sítio alvo, devido à tolerância a emparelhamentos defeituosos do oligo DS.
Para impor ao oligo DS tolerância a emparelhamentos defeituosos, a condição de emparelhamento, em particular a temperatura de emparelhamento, é importante. 0 emparelhamento é efetuado em condições tais que não ocorre emparelhamento apenas pela porção 3' de especificidade de Tf baixa, mas ocorre emparelhamento por todas as porções quando a porção 5' de especificidade de Tf elevada e/ou a porção 3' de especificidade de Tf baixa têm uma ou mais bases com emparelhamentos defeituosos com o seu sítio alvo. 57
Preferivelmente, a temperatura de emparelhamento varia desde cerca de 40°C até 70°C, mais preferivelmente 45°C até 68°C e muito preferivelmente 50°C até 65°C.
De acordo com uma forma de realização preferida, o presente método é realizado de acordo com a reação em cadeia de polimerase (PCR). 0 passo de deteção do presente método pode ser realizado por uma pluralidade de técnicas convencionais. Por exemplo, a deteção do produto da extensão dependente do modelo pode ser facilmente realizada por eletroforese em gel convencional se o presente método for executado de um modo repetido para gerar produtos suficientes para serem detetados num gel. Se forem empregues materiais etiquetados, incluindo os detetáveis por medição espetroscópica, medição fotoquimica, medição bioquímica, medição bioeletrónica, medição imunoquímica, medição eletrónica e medição química, pode ser efetuada uma medição adequada para detetar a ocorrência da extensão dependente do modelo. A diversidade genética é mais frequentemente encontrada e gerada no genoma virai (Nathalie B. et al., (2004) Journal of Clinicai Microbiology, 42_, 3532; Tersa C. et al., (2002) Journal of Infectious Diseases, 185, 1660; Takashi E. et al., (2004) Journal of Clinicai Microbiology, 42_, 126; e Elizabeth R. et al., (2001) Clinicai Infectious Diseases, 32, 1227) . A este respeito, é preferido que a molécula de ácido nucleico com diversidade genética a ser detetada seja um ácido nucleico de um vírus exibindo diversidade genética. Por exemplo, quando a presente invenção for aplicada à deteção de metapneumovírus humanos exibindo 58 diversidade genética por PCR, o conjunto de "primers" mais preferíveis concebidos para terem a estrutura do oligo DS está apresentado nas SEQ ID NOs: 39 (para o "primer" 5') e 40 (para o "primer" 3') ou SEQ ID NOs: 39 e 41 (para o "primer" 3'). VI. Aplicação à Deteção de Sequências de Nucleótidos Alvo Utilizando Oligos DS Imobilizados numa Microssérie
Esta aplicação é um processo novo para detetar sequências de nucleótidos alvo por repetição da reação dependente do modelo numa microssérie imobilizada de oligos DS.
Noutro aspeto é proporcionado um método para a deteção de uma sequência de nucleótidos alvo numa amostra de ácido nucleico por uma reação de extensão dependente do modelo, que compreende os passos seguintes: a Tf da porção 5 (a) estender um oligonucleótido de especificidade dual, como sonda, imobilizado num substrato, compreendendo pelo menos um ciclo de uma hibridização, uma extensão dependente do modelo e uma desnaturação, em que a hibridização é realizada contactando o oligonucleótido de especificidade dual com a amostra de ácido nucleico, em que o oligonucleótido de especificidade dual tem três porções nas quais uma porção 5' de especificidade de Tf elevada tem uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente complementar a um sítio da sequência de nucleótidos alvo para hibridizar com aquele, uma porção de separação compreende pelo menos duas bases universais e uma porção 3' de especificidade de Tf baixa tem uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente complementar a um sítio da sequência de nucleótidos alvo para hibridizar com aquele, a Tf da porção 5' de 59 especificidade de Tf elevada é maior do que a da porção 3' de especificidade de Tf baixa, a porção de separação tem a menor Tf das três porções; a porção de separação forma uma estrutura em bolha sem emparelhamento de bases em condições tais que a porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa são emparelhadas com a sequência de nucleótidos alvo, em que a hibridização é realizada em condições tais que não ocorre hibridização apenas pela porção 3' de especificidade de Tf baixa; e (b) analisar a ocorrência da extensão dependente do modelo.
Está ilustrada na Fig. 4 uma representação esquemática para detetar uma sequência de nucleótidos alvo numa amostra de ácido nucleico utilizando a microssérie imobilizada de oligos DS.
Este processo empregando os oligos DS pode ser realizado em condições de hibridização adequadas, determinadas de forma rotineira por procedimentos de otimização. Condições, tais como temperatura, concentração de componentes, tempos de hibridização e lavagem, componentes do tampão e seu pH e força iónica, podem ser variadas dependendo de vários fatores, incluindo o comprimento e teor de GC do oligonucleótido e sequência de nucleótidos alvo. Por exemplo, quando for utilizado um oligonucleótido relativamente pequeno, é preferível adotar condições de baixa restrição. As condições pormenorizadas para a hibridização podem ser encontradas em Joseph Sambrook, et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); e M.L.M. Anderson, "Nucleic Acid Hybridization", Springer-Verlag Nova Iorque Inc. N.Y. (1999). 60
Os oligos DS são imobilizados num substrato. Um substrato preferível inclui suportes sólidos ou semissólidos adequados, como uma membrana, filtro, "chip", lâmina, hóstia, fibra, esférula magnética ou não magnética, gel, tubagem, placa, macromolécula, micropartícuia e tubo capilar. Essa imobilização pode ocorrer por ligação química ou ligação covalente por radiação ultravioleta. Numa forma de realização desta invenção, os oligos DS são ligados a uma superfície de vidro modificada para conter compostos epoxi ou grupos aldeído, ou a uma superfície revestida com polilisina. Além disso, os oligos DS são ligados a um substrato através de agentes de ligação (por exemplo, oligómero de etilenoglicol e diamina). Oligos DS imobilizados podem ser fabricados de modo a produzirem uma série ou séries para uma dada aplicação por tecnologias convencionais de fabrico, como fotolitografia, impressão por jato de tinta, microformação mecânica de manchas e derivados destes.
De acordo com o presente método, dNTPs utilizados no passo de extensão são preferivelmente etiquetados. Para a etiquetagem empregam-se materiais detetáveis por medição espetroscópica, medição fotoquímica, medição bioquímica, medição bioeletrónica, medição imunoquímica, medição eletrónica ou medição química. Por exemplo, as etiquetas incluem mas não estão limitadas a isótopos radioativos, como P32 e S35, compostos quimioluminescentes, marcadores espetroscópicos, como marcadores de fluorescência e corantes, e etiquetas magnéticas. Os corantes, por exemplo, incluem mas não estão limitados a corante de quinolina, corante de triarilmetano, ftaleína, corante azo e corante cianina. Os marcadores de fluorescência incluem mas não 61 estão limitados a fluoresceina, ficoeritrina, rodamina, lissamina, Cy3 e Cy5 (Pharmacia). A etiquetagem é realizada de acordo com vários métodos conhecidos na área.
Sequências de nucleótidos alvo numa amostra de ácido nucleico são hibridizadas com os oligos DS, como sondas, imobilizados num substrato, preferivelmente um suporte sólido, e, por sua vez, os oligos DS hibridizados com sequências de nucleótidos alvo são estendidos utilizando dNTPs, preferivelmente dNTPs etiquetados de modo fluorescente, e DNA polimerase de um modo dependente do modelo. 0 passo (a) é preferivelmente repetido para realizar reações de hibridização de modo que todos ou a maior parte dos oligos DS sejam hibridizados com sequências de nucleótidos alvo, tornando os resultados da análise de hibridização mais reprodutíveis. A ocorrência de hibridização é verificada com vários métodos conhecidos na área, dependendo dos tipos de etiquetas utilizadas. Por exemplo, microscópio de fluorescência, preferivelmente microscópio de fluorescência confocal, é utilizado para etiquetas de fluorescência, e a intensidade do sinal detetado com esses instrumentos aumenta proporcionalmente à extensão da hibridização. Os microscópios de fluorescência, em geral, estão equipados com um dispositivo de varrimento que constrói uma imagem bidimensional quantitativa da intensidade da hibridização. A intensidade do sinal detetado com esses instrumentos aumenta proporcionalmente à extensão da hibridização e, depois, à extensão de uma extensão dependente do modelo.
Estes A presente invenção será agora descrita mais pormenorizadamente por intermédio de exemplos. 62 exemplos são ilustrativos, e o âmbito da presente invenção está apresentado nas reivindicações adjuntas. EXEMPLO 1: Especificidade de PCR utilizando
Oligonucleótidos de Especificidade Dual (DS)
Os oligonucleótidos DS desenvolvidos pela presente invenção foram aplicados como "primers" para amplificar sequências de nucleótidos alvo de genes da família das citoquinas de ratinho IL-19 e IL-lbeta. Descrevem-se aqui o processo e resultados da amplificação das sequências de nucleótidos alvo de IL-19 e IL-lbeta utilizando "primers" DS.
As seguintes sequências de "primers" convencionais foram escolhidas e utilizadas para comparação com oligonucleótidos DS quanto à especificidade de PCR.
Os "primers" convencionais específicos para IL-19 utilizados no Exemplo (500 pares de bases) são: !L1S-5'-0 5^TCn'€ATCrrGCTGDCCTrÂAGTCTCTAGG«SÂACT-3> (SEQO NO:1); ILím'-® ^-CÃTAGGCCTOGMGMQCCGCTTIACMIMGTOG-J CSEQ10 m:2).
Os "primers" convencionais específicos para IL-lbeta utilizados no Exemplo (550 pares de bases) são: ILIfe-S -S S^GAGAGTGTGGATCXC^U^CMmGCCMAGÂAGrB5 (SIEQ JD MO:3); e ft1b-3*-S 5,-AGACCΪCAGΪGCAI3G:CI«GÃCCÂATTCÃTOϋC-S, (SE.Q O NO:4).
Os oligonucleótidos DS da presente invenção foram aplicados a estas sequências de "primers" convencionais para demonstrar se os oligonucleótidos DS conseguem ultrapassar os problemas principais decorrentes destas sequências de 63 "primers" convencionais, como a geração de fundo e produtos inespecificos.
Os seguintes "primers" DS compreendem sequências idênticas aos "primers" convencionais acima com a exceção de a porção de separação ter um agente de ligação polidesoxiinosina (poli(dl)) entre a porção 5' e a porção 3'. Os "primers" DS são concebidos de modo a compreenderem uma porção 5' de especificidade de Tf elevada e uma porção 3' de especificidade de Tf baixa de um modo tal que a Tf da porção 5' de especificidade de Tf elevada é maior do que a da porção 3' de especificidade de Tf baixa, ao passo que a porção de separação tem a menor Tf entre as três porções.
Os "primers" DS para IL-19 utilizados no Exemplo (500 pares de bases) são: e .18-6’ S'-:GTCTDÃTCTGCTGGCOTTAAl 18-3* 5':-CAIÃ.GGCCTGGÂÃ:GÂÃGCCGl fHÂGôÃGAÂCT-ST (SEQ IO ICMTMGITMÍ-S’ (SEQ IO NG:S), em que I é desoxiinosina.
Os "primers" DS para IL-lbeta utilizados no Exemplo (550 pares de bases) são: IL1 h-5’ ff-GGÂGÂGTGTGGÂTGCCÂÂGC! WÊCG*MGM&& (SEQ 10 MOG): e IL.1 b-G5'-ACÃCXTCí^GTGGÃGGCTÂTGÍIllimGÂTCOC-3s fSEQ ID ND:;8), em que I é desoxiinosina. A amplificação por PCR do alvo foi conduzida no volume final de 2 0 pL contendo 2 pL (50 ng) do DNA genómico isolado de tecidos da placenta da estirpe de ratinho ICR, 2 pL de 10 x tampão de reação de PCR contendo 15 mM MgCl2 (Roche) , 2 pL de dNTP (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e
dTTP) , 1 pL de "primer" 5' DS ou convencional (10 pM), 1 pL 64 de "primer" 3' DS ou convencional (10 μΜ) e 0,5 pL de Taq polimerase (5 unidades/pL; Roche)/ o tubo contendo a mistura reacional foi colocado num aparato de aplicação de ciclos térmicos pré-aquecido (94°C); as amostras foram desnaturadas durante 5 minutos a 94 °C e sujeitas a 30 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 60°C e 1 minuto a 72°C, seguido de uma incubação durante 7 minutos a 72°C.
Os produtos amplificados foram analisados por eletroforese num gel de 2% agarose e foram detetados por coloração com brometo de etidio. Os produtos de PCR resultantes também puderam ser detetados num gel de poliacrilamida desnaturante por autorradiografia ou métodos de deteção não radioativos, como coloração com prata (Gottschlich et al., (1997) Res. Commun. Mol. Path. Pharm. 9J_, 237-240; Kociok, N., et al. (1998) Mol. Biotechnol. 9_, 25-33), ou utilizando oligonucleótidos etiquetados de modo fluorescente (Bauer D., et al., (1993) Nuclelc Acids Res. 21, 4272-4280; Ito, T. et al., (1994) FEBS Lett. 351, 231-236. Luehrsen, K.R. et al., (1997) BioTechniques 2_2, 168-174; Smith, N.R. et al., (1997) BioTechniques 2_3, 274-279), e a utilização de "primers" biotinilados (Korn, B. et al., (1992) Hum. Mol. Genet. JL, 235-242; Tagle, D.A. et al., (1993) Nature 3 61. 751-753; Rosok, O. et al., (1996) BioTechniques 2_1, 114-121) .
Como mostrado na FIG. 5, as amplificações por PCR dos alvos para genes da família das citoquinas IL-lb e IL-19, utilizando cada conjunto de "primers" de ILlb-5' e ILlb-3', e IL19-5' e IL19-3', geram uma única banda que corresponde à dimensão esperada de 550 pares de bases para IL-lbeta (via 2) e a dimensão esperada de 500 pares de bases para IL-19 (via 4), respetivamente. A clonagem e análise de 65 sequências subsequentes confirmaram que as bandas são fragmentos de IL-lbeta e IL-19. Em contraste, os conjuntos de "primers" convencionais (IL19-5'-0 e IL19-3'-0; ILlb-5'-0 e ILlb-3'-0), que não contêm o [poli(dl)], produziram produtos inespecificos (FIG. 5, vias 1 e 3) . Estes resultados indicam que os "primers" DS concebidos para terem três porções de Tf diferentes (porção 5' de especificidade de Tf elevada, porção 3' de especificidade de Tf baixa e porção de separação) podem ultrapassar os problemas principais que surgem das sequências de "primers" convencionais, como fundo e produtos inespecificos, e aumentam de modo notável a especificidade da PCR. EXEMPLO 2: Avaliação da Especificidade de PCR utilizando Oligonucleótidos de Especificidade Dual (DS)
Os oligonucleótidos de especificidade dual são caracterizados por elevada especificidade de hibridização e tolerância a emparelhamentos defeituosos provenientes da sua estrutura única, dependendo da restrição da hibridização. Obtém-se elevada especificidade de hibridização dos oligonucleótidos DS em condições de restrição elevada, de modo que ambas as porções 5' e 3' são emparelhadas com o modelo. Entretanto, obtém-se tolerância a emparelhamentos defeituosos dos oligonucleótidos DS em condições de restrição tais que ambas as porções 5' e 3' são emparelhadas com o modelo apesar da presença de um ou mais, se bem que limitados, emparelhamentos defeituosos de pares de bases. A especificidade dual dos oligonucleótidos DS desenvolvidos de acordo com a presente invenção foi avaliada, em termos da especificidade da hibridização e tolerância a emparelhamentos defeituosos, pela 3'-RACE de um novo gene, 66 DEG10, que foi identificado como sendo expresso em placenta de ratinho (Kim, Y.J. et al., (2004) "Annealing control primer system for Identification of differentially expressed genes on agarose gels". BioTechniques 3_6: 424-434; XM_129567). Para esta avaliação, alguns nucleótidos em ambas as porções foram substituídos por outros nucleótidos de modo a ficarem emparelhados de modo defeituoso com a sequência do modelo alvo.
Os "primers' Exemplo são: DS específicos para 5'-DEG10 utilizados no
OEG10-^-l08:: 5S-FGIAGTTTIGI3GJTTCCTCCIIIIICTC0€^IG-3V PEQ ID DE01Ο-δΜ01; S-fGmOTTriGGOTITCCTCClHC OEC10^-102: ^-fGTAGTTTTOGGTTTCCTCOil IIC OEG10-5M01:: ^-ΙΟΙΑΟΤΠΤΟΟΟΤΓΤΟϋΤΟΟΙ! IIC -3'{SEQ IDNOrlOfc {SE® ID UQ:í 1¾ •T€CXATG-S’ |SED ID NQ:12fc DEG10-6-1S8:: §!-fGl^GTl^TG^TAICGTOCIII!ICTOCGAJG-3’ (SEQ ID miU); DEG1CHSM3& §'-TG:TÃGTTTTGCGTTTCG:TCCI()lCTCCGÂTG-3í (SEQ IO NO:1#, e DEG10-5M2E: W-JQJmTÍMQGQJÂTO(XGmm€T€CQ&m-W (SEQ !D ^IO:15k em que os nucleótidos substituídos estão sublinhados e a cheio e I é desoxiinosina. A. Aumento da especificidade da PCR sob restrição elevada RNAs totais de tecidos da placenta 17.5-dpc (E17.5) da estirpe ICR de ratinho foram isolados e utilizados para a síntese de primeiros filamentos de cDNAs por transcriptase reversa, como previamente descrito (Hwang, I.T., et al., (2003) "Annealing control primer system for improving specificity of PCR amplification". BioTechniques 3_5: 1180- 1184). A reação de transcrição reversa foi efetuada utilizando os RNAs totais durante 1,5 horas a 42°C num volume reacional de 20 pL composto pelos seguintes: 3 pg de RNA total, 4 pL de 5 x tampão reacional (Promega, E.U.A.), 5 pL de dNTPs (cada 2 mM) , 2 pL de 10 pM "primer" de síntese de cDNA (oligo (dT) 2o-Adaptador) , 0,5 pL de 67 inibidor de RNase (40 unidades/pL, Promega) e 1 pL de transcriptase reversa (200 unidades/pL, Promega). Os primeiros filamentos de cDNAs foram diluídos por adição de 180 pL de H20 ultrapurif içada. O "primer" de síntese de cDNA oligo (dT) ιβ-ACPl é: S^TGTQMTGCTGOGACTACGAlliliClliig-S; em que I é desoxiinosina. A 3'-RACE de DEG10 foi conduzida num volume final de 20 pL contendo 2 pL (30 ng) do primeiro filamento de cDNA diluído, 2 pL de 10 x tampão reacional de PCR contendo 15 mM MgCl2 (Roche) , 2 pL de dNTP (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP) , 1 pL de um dos "primers" DS específicos para DEG10 (10 pM) , 1 pL de oligo (dT)15-ACP2 (10 pM) e 0,5 pL de Taq polimerase (5 unidades/pL; Roche); o tubo contendo a mistura reacional foi colocado num aparato de aplicação de ciclos térmicos pré-aquecido (94°C); as amostras foram desnaturadas durante 5 minutos a 94°C e sujeitas a 30 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 68°C e 1 minuto a
72°C, seguido de uma incubação durante 7 minutos a 72°C. O oligo (dT) 15-ACP2 é: Q w ^ ‘'****>ι^em que I é desoxiinosina.
B. Tolerância a emparelhamentos defeituosos de oligonucleótidos DS
Empregaram-se os "primers" DS de amostra, modelo e condições de PCR para a 3'-RACE de DEG10 utilizados no Exemplo 2a, excetuando a temperatura de emparelhamento. A amplificação por PCR foi conduzida nas condições seguintes: um ciclo de 94°C durante 5 minutos, 60°C durante 3 minutos e 72°C durante 3 minutos; seguido de 29 ciclos de 94°C durante 40 s, 65°C durante 1 minuto e 72°C durante 40 s, e um ciclo de extensão final durante 7 minutos a 72°C. 68
Em resultado, a FIG. 6A mostra a elevada especificidade de hibridização de "primers" oligonucleotídicos DS pela 3'-RACE do DEG10. O "primer" DS específico para 5'-DEG10 (DEG10-5'-108) intacto gerou um produto esperado de 677 pares de bases da 3'-RACE do DEG10 (via 1) . Em contraste, os outros "primers" (DEG10-5'-103, DEG10-5'-102, DEG10-5'-101, DEG10-5'-158, DEG10-5'-138 e DEG10-5'-128), com sequências com emparelhamentos defeituosos na porção 5’ ou na porção 3', não geraram nenhum produto: o emparelhamento defeituoso de três (via 2), duas (via 3) ou uma (via 4) base(s) na porção 3'; o emparelhamento defeituoso de cinco (via 5), três (via 6) ou duas (via 7) base(s) na porção 5'.
Estes resultados demonstram que a especificidade dual dos "primers" DS consegue distinguir as bases com emparelhamentos defeituosos não só na extremidade 3' mas também na extremidade 5' nessas condições de restrição elevada.
Em geral, a região de "primers" que deve ser perfeitamente complementar ao modelo é a extremidade 3', pois esta extremidade é a região estendida pela DNA polimerase e, em consequência, é a mais importante para assegurar a ocorrência de emparelhamento com a sequência alvo correta. Entretanto, a extremidade 5' dos "primers" é menos importante na determinação da especificidade do emparelhamento com a sequência alvo, e pode ser modificada para conter sequências adicionais, como sítios de restrição e sequências promotoras que não são complementares ao modelo (McPherson, M.J., Moller, S.G. (2000) "PCR". BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag Nova Iorque Berlim Heidelberga, N.Y) . Em contraste com estes, a vantagem 69 excecional dos "primers" DS é demonstrada pela especificidade dual devido à sua estrutura única, permitindo a distinção de bases com emparelhamentos defeituosos na extremidade 5', bem como na extremidade 3'. A FIG. 6B mostra um exemplo da tolerância a emparelhamentos defeituosos de "primers" oligonucleotidicos DS pela 3'-RACE do DEG10. Apesar de os "primers" DS (DEG10-5'-108, DEG10-5'-101, DEG10-5'-128 e DEG10-5'-138), possuindo nenhuns ou alguns nucleótidos com emparelhamentos defeituosos nas suas porções 5' ou 3'-terminais, ainda terem gerado um produto esperado de 677 pares de bases da 3'-RACE do DEG10 (vias 1, 4, 6 e 7). Em contraste, os outros "primers" (DEG10-5'-103, DEG10-5'-102 e DEG10-5'-158) , com mais nucleótidos com emparelhamentos defeituosos nas suas porções 5' ou 3', não geraram nenhum produto (vias 2, 3 e 5) . Estes resultados indicam que os "primers" DS também podem ser aplicados a amplificações de sequências de nucleótidos diversas requerendo tolerância a emparelhamentos defeituosos.
Em resumo, estes resultados suportam os seguintes princípios de "primers" DS: 1) só quando ocorre emparelhamento pela porção 5' de especificidade de Tf elevada e pela porção 3' de especificidade de Tf baixa, o "primer" DS é estendido para sintetizar uma molécula de ácido nucleico complementar ao modelo (via 1); no entanto, 2) quando ocorre emparelhamento apenas pela porção 5' de especificidade de Tf elevada e não pela porção 3' de especificidade de Tf baixa, o "primer" DS não é estendido para sintetizar uma molécula de ácido nucleico complementar ao modelo (vias 2-4); e 70 3) mesmo que a sequência da porção 3' de especificidade de Tf baixa tenha um emparelhamento perfeito com o modelo, não ocorre emparelhamento apenas pela porção 3' de especificidade de Tf baixa em condições altamente restritas (vias 5-7) . No que se refere à porção de emparelhamento, o "primer" DS é distintamente diferente do "primer" de controlo do emparelhamento (ACP), que é estendido apenas pelo emparelhamento da porção 3'-terminal num passo inicial de PCR (Hwang, I.T., et al., (2003) "Annealing control "primer" system for improving specificity of PCR amplification" . BioTechniques 3J5: 1180-1184). EXEMPLO 3: Distinção de Bases Únicas Utilizando Oligonucleótidos de Especificidade Dual (DS)
Para demonstrar a especificidade dual de oligonucleótidos DS quanto à distinção de bases únicas, os cDNAs dos genes da família "homeobox" específicos de placenta de ratinho Psxl e Psx2 foram amplificados com "primers" convencionais ou "primers" DS. A identidade de sequências global entre os dois cDNAs de Psx foi 91% ao nível dos nucleótidos (Han, Y.J., et al., (2000) "Identification and characterization of Psx2, a novel member of the Psx (placenta-specific homeobox) family". Gene 241: 149-155) Os "primers" 5' foram concebidos para distinguirem Psxl e Psx2 por distinção de uma ou duas bases (FIG 7A) . No entanto, o "primer" 3' foi concebido para ter uma sequência conservada para ambos os cDNAs de Psx. As sequências dos "primers" convencionais e DS específicos para Psxl e Psx2 são as seguintes: 71 iPsxl--5-10: 5:-áAOG^AfíÃCâTS€IGGTGAJGS^GCIIC:mGC1>^ (SEQ IO NCH6); Psx2-§-10: 5-AAâGAAGAOAT@CFGGTGATSGfGCTTC1OO(^-3f (SEQ 10 NO: 17): Pssel-S-ll : 5:-M;GGAAGÃI^T©CIGGIGâTl!ill]7TCmGCT-:3f (SEQ: S) !MO:1S|: Psx2-5 -11' ^-AASGMGAC^TSOIGGICMJIIlITTOmQCG-^ {SEQ ÊD N0:1§>; :Psx.1^-4D: O^TCTTGCÃCGATOGATGGGTGTGGATGMPGTGÀ-J {SEQ 10 NO:.20k PsxS-S^O: 5-TOTGmCQAJQGATGGGTGTCGATGâAllTGA-35 (SEQ !0 iNG;21fc Psx1-§-4tr G-TCITGCÃCGáJGGÂJGGGIGllGAAIGl^GA-S' (fsEQ1D ND^; IPsx2-5-41:. S-TCWGCÂCGâTGGATOGGTGI!MGAAKIGA-? (SEQ © »23|:; e Psx-32-2: S-ffOÂJCCÂCAGCCÂTDCAIOlli^CMrCCCT-^ (SEQ JD N0:24)t. em que os nucleótidos específicos para Psxl ou Psx2 estão sublinhados e a cheio.
A. Síntese do Primeiro Filamento de cDNA 0 primeiro filamento de cDNA da placenta de ratinho sintetizado no Exemplo 2 foi utilizado como material de partida para 3'-RACE e um PCR do alvo de cDNA de Psx. B. 3'-RACE de Psxl e Psx2 utilizando "primers" DS Específicos para Psxl e Psx2
As 3'-RACE de Psxl e Psx2 foram conduzidas num volume final de 2 0 gel contendo 2 pL (30 ng) do primeiro filamento de cDNA diluído, 2 pL de 10 x tampão reacional de PCR contendo 15 mM MgCl2 (Roche), 2 pL de dNTP (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 1 pL de um dos "primers" DS ou convencionais específicos para 5'-Psxl ou 5'-Psx2 (10 pM) , 1 pL de oligo (dT)i5-ACP2 (10 pM) e 0,5 pL de Taq polimerase (5 unidades/pL; Roche); o tubo contendo a mistura reacional foi colocado num aparato de aplicação de ciclos térmicos pré-aquecido (94°C); as amostras foram desnaturadas durante 5 minutos a 94°C e sujeitas a 30 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 60-65°C e 1 minuto a 72°C, seguido de uma incubação durante 7 minutos a 72°C. 72 C. Amplificação de Ácidos Nucleicos Alvo de Psxl e Psx2 utilizando "primers" DS Específicos para Psxl e Psx2 A amplificação por PCR do alvo de Psxl e Psx2 foi conduzida num volume final de 20 pL contendo 2 pL (30 ng) do primeiro filamento de cDNA diluído, 2 pL de 10 x tampão reacional de PCR contendo 15 mM MgCl2 (Roche) , 2 pL de dNTP (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP) , 1 pL de um dos "primers" DS ou convencionais específicos para 5'-Psxl ou 5'-Psx2 (10 pM), 1 pL de Psx-3'-2 (10 pM) e 0,5 pL de Taq polimerase (5 unidades/pL; Roche); o tubo contendo a mistura reacional foi colocado num aparato de aplicação de ciclos térmicos pré-aquecido (94°C); as amostras foram desnaturadas durante 5 minutos a 94°C e sujeitas a 30 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 60-65°C e 1 minuto a 72°C, seguido de uma incubação durante 7 minutos a 72°C.
Em resultado, a FIG 7B mostra os produtos da 3'-RACE e PCR alvo gerados por "primers" específicos para 5'-Psxl ou 5’-Psx2. Uma vez que os cDNAs dos dois Psx diferem entre si por uma deleção ou inserção de 29 pares de bases na direção da sua extremidade 3', é esperado que os produtos de tamanho diferente em 29 pares de bases sejam amplificados pela sua 3'-RACE. Cada uma das 3'-RACE de cDNA de Psxl utilizando os "primers" DS específicos para Psxl ou Psx2 Psxl-5'-41 e Psx2-5'-41 gerou uma única banda que corresponde à dimensão esperada de 311 pares de bases (via 1) e 282 pares de bases (via 2), respetivamente. A análise de sequências subsequente dos produtos gerados pela 3'-RACE confirmou que os "primers" específicos para 5'-Psxl e 5'-Psx2 amplificaram cDNAs de Psxl e Psx2, respetivamente. Em contraste, os "primers" convencionais (Psxl-5'-40 e Psx2-5'-40), que não seguem os princípios dos oligonucleótidos DS, não distinguiram os cDNAs dos dois Psx (vias 3 e 4). 73
Estes resultados indicam que os "primers" DS de acordo com a presente invenção conseguem distinguir um emparelhamento defeituoso de uma única base. Em consequência, os oligonucleótidos DS podem ser aplicados à identificação de mutações pontuais ou genotipagem de polimorfismos de um único nucleótido. EXEMPLO 4: Sequenciação Direta de um cDNA Alvo a partir de uma Reunião de cDNA Utilizando Oligonucleótidos de Especificidade Dual (DS) A maior parte das tentativas para identificar e isolar um novo cDNA levou à aquisição de clones que representam apenas uma parte da sequência do mRNA. Depois de identificada a sequência parcial, o restante do transcrito pode ser frequentemente obtido por rastreio de bibliotecas de cDNA tipicas ou métodos à base de PCR, como RACE (amplificação rápida de extremidades de cDNA), seguido de sequenciação do cDNA obtido. Assim, todos os métodos correntes têm um passo de condição prévia para obter a informação de sequência do restante do transcrito. Se a informação de sequência em falta for obtida diretamente de uma população de cDNAs gerada a partir de uma célula alvo, estes passos de condição prévia demorados podem ser completamente ultrapassados, e a sequência do cDNA alvo pode ser determinada diretamente a partir de uma amostra biológica em bruto.
Os oligonucleótidos DS da presente invenção foram aplicados como "primers" para sequenciar diretamente cDNAs de Psx de genes "homeobox" específicos da placenta de ratinho utilizando uma reunião de primeiros filamentos de cDNA de placenta. Descrevem-se aqui o processo e resultados da 74 sequenciação direta dos cDNAs de genes específicos da placenta a partir da reunião de cDNA da placenta. Utilizaram-se os mesmos "primers" DS específicos de 5' Psx utilizados no Exemplo 3. São Psxl-5'-ll, Psx2-5'-ll, Psxl-5'-41 e Pyx2-5'-41.
A. Síntese do Primeiro Filamento de cDNA 0 primeiro filamento de cDNA da placenta de ratinho sintetizado no Exemplo 2 foi utilizado como modelo para a sequenciação direta de cDNAs de Psx. B. Sequenciação Direta de cDNA de Psx a partir da Reunião de cDNA da Placenta utilizando "Primers" DS com Especificidade para Psx
As reações de sequenciação por ciclos foram conduzidas num volume final de 20 pL contendo 13 pL (150 ng) do primeiro filamento de cDNA diluído, 2 pL de Mistura Reacional ABI PRISM Big Dye Terminator (Applied Biosystems, E.U.A.), 3 pL de 5 x tampão reacional de sequências (Applied Biosystems) e 1,6 pL de um dos "primers" DS específicos para 5'-Psxl ou 5'-Psx2 (1 pM) ; o tubo contendo a mistura reacional foi colocado num aparato de aplicação de ciclos térmicos pré-aquecido (94°C); as amostras foram desnaturadas durante 5 minutos a 94°C e sujeitas a 40-50 ciclos de 10 s a 94°C, 3 minutos a 50-60°C e 4 minutos a 60-65°C. Os produtos de sequenciação foram purificados do modo seguinte: 1) adicionar 2 pL de 3 M acetato de sódio (pH 4,6) e 50 pL de 100% EtOH gelado fresco, 2) manter a -75°C durante 30 minutos, 3) centrifugar durante 15-30 minutos a 13 000 g e remover o sobrenadante, 4) lavar com 200 pL de 70% EtOH, 5) centrifugar durante 15-30 minutos a 13 000 g e remover o sobrenadante cuidadosamente, e secar. O grânulo foi ressuspenso em 10 pL de HiDi Formamida imediatamente antes 75 do processamento do produto de sequenciação no Analisador Genético ABI PRISM 3100.
Surpreendentemente, os "primers" DS para Psx sequenciaram de modo preciso os seus cDNAs de Psx específicos. Por outras palavras, o "primer" DS específico para Psxl (Psxl-5'-41) sequenciou apenas cDNA de Psxl e o "primer" DS específico para Psx2 (Psx2-5'-41) sequenciou somente cDNA de Psx2 (FIG. 8). A região de deleção de 29 pares de bases no Psx2 está apresentada por uma barra preta. Em contraste, os "primers" convencionais (Psxl-5'-40 e Psx2-5'-40), que não seguem os princípios dos oligonucleótidos DS, não distinguiram os cDNAs dos dois Psx.
Estes resultados indicam que os "primers" DS conseguem distinguir um emparelhamento defeituoso de uma única base mesmo em sequenciação por ciclos, bem como em amplificação por PCR. EXEMPLO 5: PCR Multiplex utilizando Oligonucleótidos de Especificidade Dual (DS)
Para demonstrar a aplicação de "primers" oligonucleotídicos DS a PCR multiplex, nove genes diferentes da família das citoquinas foram amplificados com "primers" DS. Descrevem-se aqui o processo e resultados da amplificação por PCR multiplex utilizando "primers" DS. Os "primers" DS específicos para genes da família das citoquinas foram concebidos para gerarem um marcador de tamanho escalonado de 50 pares de bases utilizando a sequência de exão mais longa de cada gene de citoquina.
Os "primers" DS para IL-3 utilizados no Exemplo (200 pares de bases) são: 76 ils-s5 s^cTecoMMSQoicTOmoiiiifCToeáJOA-r {mz ίο mm}; e 113-3* δ’-ΟΟΟΟΑΤΟΑα^ΑΑΟΑΤΤΟ^ΑΙΙΙΟβΤΟΟΤΟΤ^ fSEQ 10 ΝΟ:2β>.
Os "primers" DS para IL-15 utilizados no Exemplo (250 pares de bases) são: IL1S-5' StÃTSTASC^GÂÂTCTOS0TGOllATGTSA^3-r (SEQ !D NO:27); e 1115-3’ SWGTOÃTCCÂÃSTOOCTCÂTliaCGTTGTI^Q-S·’ CSEQ ID NO:28).
Os "primers" DS para IL-18 utilizados no Exemplo (300 pares de bases) são: ilis-5’ 5'-AO<ãAMiQaÂiccM)GimAiiirroâJG^mm-3’ {seq io mtmn e IL1S-3’ SWGGMATÃCMSGGGÂGGIOiilÃÂGGCGCÃ-^ (SEQ IO NG3G).
Os "primers" DS para IL-25 utilizados no Exemplo (350 pares de bases) são: IL2S-5' S-ÂGCICTCO-AAGCTGGTGAJCIPyiGÂÂOSCGG-S' (SEQ 10 NO=31e (L25-3’ 5'-GAG€TGCCCTGGÃTGGGGTT!ÍliGTGGTCCT-3s (SEQ ID ΝΟ:32).
Os "primers" DS para IL-2 utilizados no Exemplo (400 pares de bases) são: 112-5’ 5-CTCTGACAACACATTTGA.GTGCIII1CGÂTGATGÂ.G-3’ (SEQ SO NO: 33); e IL2-35 S-GTGCTGTCCTAMMJGÂCAGâJIlíGAGCTIÂTTT- J (SEQ ID iNO:34),
Os "primers" DS para IL-6 utilizados no Exemplo (450 pares de bases) são: mw csed m e
Os "primers" DS para IL-19 utilizados no Exemplo (500 pares de bases) são: mm* iseqid nq& e ILIM’ '5 ICMTAÂGTTÂCS-f: (iiO © ICfcSi 77
Os "primers" DS para IL-lbeta utilizados no Exemplo (550 pares de bases) são: ÍLIMf 5ÍD NÓ:?!;: e m® so mm<·
Os "primers" DS para IL-10 utilizados no Exemplo (600 pares de bases) são: mm iseo m mm « mm* gee m mm.
A. PCR Monoplex utilizando vim conjunto de "primers" DS específicos para genes da família das citoquinas
A amplificação por PCR de alvo único para cada gene da família das citoquinas foi conduzida num volume final de 20 pL contendo 2 pL (50 ng) do DNA genómico de ratinho, 2 pL de 10 x tampão reacional de PCR contendo 15 mM MgCl2 (Roche) , 2 pL de dNTP (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 pL de cada "primer" DS 5' específico para genes da família das citoquinas (10 pM), 1 pL de cada "primer" DS 3' específico para genes da família das citoquinas (10 pM) e 0,5 pL de Taq polimerase (5 unidades/pL; Roche); o tubo contendo a mistura reacional foi colocado num aparato de aplicação de ciclos térmicos pré-aquecido (94°C); as amostras foram desnaturadas durante 5 minutos a 94 °C e sujeitas a 30 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 60-65°C e 1 minuto a 72°C, seguido de uma incubação durante 7 minutos a 72°C.
B. PCR Multiplex utilizando 9 conjuntos de "primers" DS específicos para genes da família das citoquinas A amplificação por PCR multiplex foi conduzida num único tubo utilizando 9 conjuntos de "primers" DS específicos para genes da família das citoquinas; a mistura reacional 78 no volume final de 50 pL continha 100 ng de DNA genómico de ratinho, 5 pL de 10 x tampão reacional de PCR contendo 15 mM MgCl2 (Roche) , 5 pL de dNTP (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP) , 1 pL de cada "primer" DS 5' especifico para genes da família das citoquinas (0,2-5 μΜ) , 1 pL cada "primer" DS 3' específico para genes da família das citoquinas (0,5-5 pL) e 0,5 pL de Taq polimerase (5 unidades/pL; Roche); o tubo contendo a mistura reacional foi colocado num aparato de aplicação de ciclos térmicos pré-aquecido (94°C); as condições de PCR são um ciclo de 94°C durante 5 minutos, 50°C durante 3 minutos e 72°C durante 3 minutos; seguido de 29 ciclos de 94°C durante 40 s, 60°C durante 1 minuto e 72°C durante 40 s, e um ciclo de extensão final de 5 minutos a 72°C.
Como mostrado na FIG. 9, a amplificação por PCR multiplex gera múltiplas bandas que correspondem aos tamanhos esperados desde 200 pares de bases até 600 pares de bases para 9 produtos de genes de citoquinas diferentes (FIG. 4, via 1). Cada amplificação por PCR monoplex gerou uma única banda que corresponde ao tamanho esperado de 200 pares de bases para IL-3 (FIG. 4, via 2), 250 pares de bases para IL-15 (FIG. 4, via 3), 300 pares de bases para IL-18 (FIG. 4, via 4), 350 pares de bases para IL-25 (FIG. 4, via 5), 400 pares de bases para IL-2 (FIG. 4, via 6), 450 pares de bases para IL-6 (FIG. 4, via 7), 500 pares de bases para IL-19 (FIG. 4, via 8), 550 pares de bases para IL-lbeta (FIG. 4, via 9) e 600 pares de bases para IL-10 (FIG. 4, via 10), respetivamente.
Em conformidade, pode ser apreciado que os "primers" DS desenvolvidos pela presente invenção podem ser aplicados com êxito a PCR multiplex. A estrutura única dos 79 oligonucleótidos DS permite ultrapassar o problema comum de qualquer PCR multiplex convencional, nomeadamente a interferência de "primers" e formação de dimeros. EXEMPLO 6: Deteção de Metapneumovirus Humano utilizando Tolerância a Emparelhamentos Defeituosos de Oligonucleótidos de Especificidade Dual (DS)
Para demonstrar a aplicação de "primers" oligonucleotidicos DS à tolerância a emparelhamentos defeituosos, aplicaram-se "primers" DS para detetar o metapneumovirus humano (hMPV) em amostras clinicas. Descrevem-se aqui o processo e resultados da deteção do metapneumovirus humano utilizando "primers" DS. Este Exemplo não deve ser considerado limitador das aplicações da invenção à deteção do vírus específico.
Os "primers" DS foram concebidos com base na região conservada do gene da glicoproteína de fusão (F) gerada por alinhamento de sequências de todos os isolados do hMPV disponíveis (ver Tabela 1). Para tolerarem a diversidade genética destes isolados, os "primers" foram concebidos com base nos critérios seguintes: (a) as regiões conservadas devem ter pelo menos 30 nucleótidos de comprimento, apesar da presença de um ou mais, se bem que limitados, emparelhamentos defeituosos de pares de bases (Tabela 1) ; (b) a maior parte das sequências com emparelhamentos defeituosos nas regiões conservadas está preferivelmente localizada na porção de separação do "primer" DS (por exemplo, hMPV 5'-585, hMPV 3'-698 e hMPV 3'-1007); (c) de outro modo, os nucleótidos com emparelhamentos defeituosos estão localizados na porção da extremidade 5', alguns dos quais podendo ser substituídos por bases universais, como desoxiinosinas (por exemplo, hMPV 3'-698 e hMPV 3'-1007); e 80 (d) um ou dois nucleótido(s) com emparelhamento(s) defeituoso(s) na porção da extremidade 3' pode(m) ser substituído(s) por oligonucleótido(s) degenerado(s) ou base(s) universal(universais) (por exemplo, hMPV 3'-1007).
Tabela 1. "Primers" Oligonucleotidicos DS Específicos para hMPV com Base na Região Conservada do Gene da Glicoproteína de Fusão (F) de Todos os Isolados de hMPV Disponíveis "Primer"
Sequência H° de Isolados I 3
Sequências do TÍrns "Primer" 5' (585): - 1ÃSCTTCAGf QTTG“1 1“ •'•-‘AtCTTCAGTCRATTCAACAÇÃAQATTÇÇfAíiATQTrp—1v ~A(sm a&?G»&rs cmcMM&mzwTMmmm-z 1 4 1 9 14
Sequências do vírus f ......mCATCAST-TTÍA^GfCCtGCAGAÍQÍÍTGGCATGT - 1 -! > “- 1- - 4 "Primer" 3' (698): ♦1·-· ^cATc&GTTTTATCTGTecTGtãaaíRSiítGGCATeí...... ”.....AACA^CAAÍÍTTA^T^GTCCfGCASAWST?GGCATSTH 1" 1- ........AAeATCx^TTfmTTyGTCP^íXAGAÍPatTGGCAf GX' ”«« - --^^1«^ΤΓΓΤΑ5^^^®ίΟβΛ»βΤΚ^»Τ©Ρ2' "· 5! “i^CATCAITTTTATXfGfCCf«αΑΙΙΙΙΙΤϋαϋΑΤβ’ί’-31
3 12 t 3 3 S 2 Ί
Sequências do vírus < "Primer" 3' V. (1007): - f^SA^GCíCÂGCmCAf ^TOUTCCC®GCAGCTGTGT C...... 8 - '-ITGAllGCÍCAGCgACAf TGaTÇCGfGCTGCf STS1!C'1"1' 1 ......^rGApatimst^CA^T^ÇOC^CfGCiSÍGTC-1 “ “ I “> -'TfQ&ITSgíCAGCp.eAf XÍMflQ^CTgCTG^GTC1'' -- 9 - -‘-TTGATTGCTaaGCAACAf tMTfCCgGCTeCTGTGfC"' "<1 2 5 1 “ STGAlf GÇTCAQCmCATTgRTllXliqSfGCTeTGTC- S' 1 A diversidade genética entre isolados do hMPV está mostrada na forma 2 de nucleótidos sublinhados. 81
Os "primers" DS específicos para o gene F do hMPV utilizados no Exemplo são: hMPV 5--S8& ^GCfTCAGTCAATTCÂÂCAGÂÂIilIICTAMIGTTG-^ pEQ: ÍO NO:3Sfc hMPV 3^98 5:-AÂCÂTCAITTTTÂT:!TGTCCTGCÃJhlTSG:CÂTGT-3: f$EQ §0 NO;40fe e hMPV 3-100? δ''-TTC4AJTδCTCAδCÍ:M;ÂUGÃIilflCWGCIGTGT€'-3, {SEG iO em que W pode ser A ou T, e I é desoxiinosina.
RNA total virai foi extraído utilizando o método de RNAzol B de acordo com o protocolo do fabricante (RNAzol LS; Tel-Test, Inc.). Conduziu-se uma reação de transcrição reversa para sintetizar cDNA utilizando o RNA virai durante 1,5 horas a 42 °C num volume reacional de 20 pL composto pelo seguinte: 5 pL de RNA total (aproximadamente 100 ng), 4 pL de 5 x tampão reacional (Invitrogen, E.U.A.), 5 pL de dNTPs (cada 5 mM) , 2 pL de 10 pM hexadesoxinucleótidos aleatórios, 0,5 pL de inibidor de RNase (40 unidades/pL, Promega) e 1 pL de transcriptase reversa do vírus da leucemia murina de Moloney (200 unidades/pL, Promega). A amplificação por PCR do alvo do gene F do hMPV F foi conduzida num volume final de 20 pL contendo 2 pL (30 ng) do primeiro filamento de cDNA, 2 pL de 10 x tampão reacional de PCR contendo 15 mM MgCl2 (Roche) , 2 pL de dNTP (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 1 pL de "primer" DS 5' específico para o hMPV (hMPV 5'-585; 10 pM) , 1 pL de "primer" DS 3' específico para o hMPV (hMPV 3'-698 ou hMPV 3'-1007; 10 pM) e 0,5 pL de Taq polimerase (5 unidades/pL; Roche); o tubo contendo a mistura reacional foi colocado num aparato de aplicação de ciclos térmicos pré-aquecido (94°C); as amostras foram desnaturadas durante 5 minutos a 94°C e sujeitas a 30 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 60-65°C e 1 minuto a 72°C, seguido de uma incubação durante 7 minutos a 72°C. 82
Como mostrado na FIG. 10B, cada par de "primers" DS específicos para o hMPV (hMPV 5'-585 e hMPV 3'-698, e hMPV 5'-585 e hMPV 3'-1007) gera uma única banda que corresponde aos tamanhos esperados de 150 pares de bases e 459 pares de bases, respetivamente (vias 1 e 2). A análise de sequências subsequente dos produtos confirmou que são as sequências parciais do gene da glicoproteína de fusão (F) do hMPV. Em contraste, estes "primers" não geram nenhum produto numa PCR de controlo negativo sem o modelo (vias 4 e 5) . Como controlo positivo utilizou-se o conjunto de "primers" específicos para a beta-actina humana (via 3).
Estes resultados indicam que os "primers" DS podem ser aplicados à deteção de hMPVs de pacientes com infeções respiratórias. Assim, pode perceber-se que os oligonucleótidos DS podem ser adaptados, como "primers" em amplificação por PCR ou sondas em "chips" de oligonucleótidos, a todas as situações potenciais encontradas na área.
EXEMPLO 7: Deteção de Sequências de Nucleótidos Alvo Utilizando uma Microssérie Imobilizada de Oligos DS
Os oligos DS complementares a uma região de uma molécula de ácido nucleico alvo são sintetizados empregando um sintetizador de DNA (Sistema de Síntese de Ácidos Nucleicos Expedite 8900, Applied Biosystems (ABI)) de acordo com um protocolo padrão. Os oligos DS sintetizados são imobilizados numa lâmina de vidro para a preparação da microssérie. Em seguida adiciona-se à microssérie uma mistura de reação de extensão dependente do modelo contendo 50-200 ng de amostra de DNA, 5 pL de 10 x tampão reacional de PCR (Promega) , 5 pL de 15 mM MgCl2, 5 pL de dNTP 83 etiquetado de modo fluorescente (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP) e 0,5 pL de Taq polimerase (5 unidades/pL; Promega), após o que a microssérie é colocada num aparato de aplicação de ciclos térmicos pré-aquecido (94°C). A reação de extensão dependente do modelo é conduzida de acordo com o seguinte ciclo térmico: desnaturação durante 5 minutos a 94°C, e 15-50 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1-3 minutos a 50-65°C e 1-4 minutos a 60-72°C, seguido de uma extensão durante 5 minutos a 72°C. Após a reação de extensão dependente do modelo, os oligos DS estendidos são lavados e detetados pelas suas imagens fluorescentes num aparato de varrimento de microsséries, seguido de análise das imagens.
EXEMPLO 8: Genotipagem de SNP (Polimorfismo de vim Único Nucleótido) Utilizando Oligonucleótidos DS
Os oligos DS são sintetizados empregando um sintetizador de DNA (Sistema de Síntese de Ácidos Nucleicos Expedite 8900, Applied Biosystems (ABI)) de acordo com um protocolo comum, colocando uma base polimórfica (sítio de interrogação) no centro da porção 3' de especificidade de Tf baixa. Os oligonucleótidos sintetizados são imobilizados numa lâmina de vidro para a preparação da microssérie. Em seguida adiciona-se à microssérie uma mistura de reação de extensão dependente do modelo contendo 50-200 ng de amostra de DNA, 5 pL de 10 x tampão reacional de PCR (Promega), 5 pL de 15 mM MgCl2, 5 pL de dNTP etiquetado de modo fluorescente (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP) e 0,5 pL de Taq polimerase (5 unidades/pL; Promega), após o que a microssérie é colocada num aparato de aplicação de ciclos térmicos pré-aquecido (94°C). A reação de extensão dependente do modelo é conduzida de acordo com o seguinte ciclo térmico: desnaturação durante 5 minutos a 94°C, e 15- 84 50 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1-3 minutos a 50-65°C e 1-4 minutos a 60-72°C, seguido de uma extensão durante 5 minutos a 72°C. Após a reação de extensão dependente do modelo, os oligos DS estendidos são lavados e detetados pelas suas imagens fluorescentes num aparato de varrimento de microsséries, seguido de análise das imagens. <110> SEEGENE, INC.
<120> PROCESSOS UTILIZANDO UM OLIGONUCLEÓTIDO COM ESPECIFICIDADE DUAL E OLIGONUCLEÓTIDO COM ESPECIFICIDADE DUAL UTILIZADO <130> P36413 <140> EP 06716196.8 <141> 2006-03-03 <150> KR10-2005-0018419 <151> 2005-03-05 <150> PCT/KR2005/001206 <151> 2005-04-26 <160> 41 <170> Kopatentln 1.71
<210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> IL19-5'-0 <400> 1 35 gtctcatctg ctgcccttaa gtctctagga gaact 85 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> IL19-3'-0 <400> 2 cataggcctg gaagaagccg ctttacaata agttag 36
<210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> ILlb-5'-0 <400> 3 ggagagtgtg gatcccaagc aatacccaaa gaag 34
<210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> ILlb-3'-0 <400> 4 agacctcagt gcaggctatg accaattcat ccc 33
<210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> 86 <223> IL19-5' <22 0> <221> caracteristica mista <222> (21) .. (25) <223> desoxiinosina <400> 5 gtctcatctg ctgcccttaa nnnnntagga gaact 35 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> IL19-3' <22 0> <221> caracteristica mista <222> (21) . . (25) <223> desoxiinosina <400> 6 cataggcctg gaagaagccg nnnnncaata agttag 36 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> ILlb-5' <22 0> <221> caracteristica mista <222> (21) . . (25) <223> desoxiinosina 87 <400> 7 ggagagtgtg gatcccaagc nnnnnccaaa gaag 34 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> ILlb-3' <22 0> <221> caracteristica mista <222> (21) . . (25) <223> desoxiinosina <400> 8 agacctcagt gcaggctatg nnnnnttcat ccc 33 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> DEG10-5'-108 <22 0> <221> caracteristica mista <222> (21) .. (25) <223> desoxiinosina <400> 9 tgtagttttg ggtttcctcc nnnnnctccg atg 33 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> DEG10-5'-103 <22 0> <221> caracteristica mista <222> (21)..(25) <223> desoxiinosina <400> 10 tgtagttttg ggtttcctcc nnnnnctgcc ate 33
<210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> DEG10-5'-102 <22 0> <221> caracteristica mista <222> (21)..(25) <223> desoxiinosina <400> 11 tgtagttttg ggtttcctcc nnnnnctccc ate 33
<210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> DEG10-5'-101 <22 0> <221> caracteristica mista <222> (21)..(25) 89 <223> desoxiinosina <400> 12 tgtagttttg ggtttcctcc nnnnnctccc atg 33
<210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> DEG10-5'-158 <22 0> <221> característica mista <222> (21)..(25) <223> desoxiinosina <400> 13 tgtacttatg cgtatcgtcc nnnnnctccg atg 33
<210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> DEG10-5'-138 <22 0> <221> caracteristica mista <222> (21)..(25) <223> desoxiinosina <400> 14 tgtacttttg cgtttcgtcc nnnnnctccg atg 33 <210> 15 <211> 33 90
<212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> DEG10-5'-128 <22 0> <221> caracteristica mista <222> (21)..(25) <223> desoxiinosina <400> 15 tgtagttatg ggtatcctcc nnnnnctccg atg 33
<210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Psxl-5'-10 <400> 16 aaggaagaca tgctggtgat ggtgcttcta gct 33
<210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Psx2-5'-10 <4 0 0> 17 aaggaagaca tgctggtgat ggtgcttctg gcc 33 <210> 18 <211> 33
<212> DNA 91 <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Psxl-5'-11 <22 0> <221> caracteristica mista <222> (21) . . (25) <223> desoxiinosina <400> 18 aaggaagaca tgctggtgat nnnnnttcta gct 33 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Psx2-5'-11 <22 0> <221> caracteristica mista <222> (21) . . (25) <223> desoxiinosina <400> 19 aaggaagaca tgctggtgat nnnnnttctg gcc 33 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Psxl-5'-40 <400> 20 tcttgcacga tggatgggtg tggatgaatg tga 33 92 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Psx2-5'-40 <400> 21 tcttgcacga tggatgggtg tggatgaatc tga 33 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Psxl-5'-41 <22 0> <221> caracteristica mista <222> (21) . . (25) <223> desoxiinosina <22 0> <221> caracteristica mista <222> (29) <223> desoxiinosina <22 0> <221> caracteristica mista <222> (31) <223> desoxiinosina <400> 22 tcttgcacga tggatgggtg nnnnngaang nga 33 <210> 23 <211> 33 93 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Psx2-5'-41 <22 0> <221> caracteristica mista <222> (21) . . (25) <223> desoxiinosina <22 0> <221> caracteristica mista <222> (29) <223> desoxiinosina <22 0> <221> caracteristica mista <222> (31) <223> desoxiinosina <400> 23 tcttgcacga tggatgggtg nnnnngaanc nga 33 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Psx-3'-2 <22 0> <221> caracteristica mista <222> (21) . . (25) <223> desoxiinosina <400> 24 94 ttcatccaca cccatccatc nnnnnagatc cct 33 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> IL3-5' <22 0> <221> caracteristica mista <222> (21) . . (25) <223> desoxiinosina <400> 25 gctgccaggg gtcttcattc nnnnnctgga tga 33 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> IL3-3' <22 0> <221> caracteristica mista <222> (21) . . (25) <223> desoxiinosina <400> 26 ggccatgagg aacattcaga nnnnnggtgc tct 33 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial 95 <22 0> <223> IL15-5' <22 0> <221> característica mista <222> (21) . . (25) <223> desoxiinosina <400> 27 atgtagcaga atctggctgc nnnnnatgtg agg 33 <210> 28 <211> 35 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> IL15-3' <22 0> <221> caracteristica mista <222> (21) . . (25) <223> desoxiinosina <400> 28 atgtgatcca agtggctcat nnnnnccttg ttagg 35 <210> 29 <211> 35 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> IL18-5' <22 0> <221> caracteristica mista <222> (21) . . (25) <223> desoxiinosina 96 <400> 29 aggaaatgga tccacctgaa nnnnntgatg atata 35 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> IL18-3' <22 0> <221> caracteristica mista <222> (21) .. (25) <223> desoxiinosina <400> 30 atggaaatac aggcgaggtc nnnnnaaggc gca 33 <210> 31 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> IL25-5' <22 0> <221> caracteristica mista <222> (21) . . (25) <223> desoxiinosina <400> 31 agctctccaa gctggtgatc nnnnncaagg cgg 33 <210> 32 <211> 33
<212> DNA 97 <213> Sequência Artificial <22 0> <223> IL25-3' <22 0> <221> caracteristica mista <222> (21) . . (25) <223> desoxiinosina <400> 32 gagctgccct ggatggggtt nnnnngtggt cct 33 <210> 33 <211> 37 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> IL2-5' <22 0> <221> caracteristica mista <222> (23) . . (27) <223> desoxiinosina <400> 33 ctctgacaac acatttgagt gcnnnnncga tgatgag 37 <210> 34 <211> 37 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> IL2-3' <22 0> <221> caracteristica mista 98 <222> (23) . . (27) <223> desoxiinosina <400> 34 gtgctgtcct aaaaatgaca gannnnngag cttattt 37 <210> 35 <211> 37 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> IL6-5' <22 0> <221> caracteristica mista <222> (23) . . (27) <223> desoxiinosina <400> 35 ccaatgctct cctaacagat aannnnnagt cacagaa 37 <210> 36 <211> 38 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> IL6-3' <22 0> <221> caracteristica mista <222> (26) . . (30) <223> desoxiinosina <400> 36 aggtaaactt atacattcca agaaannnnn tggctagg 38 <210> 37 99 <211> 35 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> IL10-5' <22 0> <221> caracteristica mista <222> (21) .. (25) <223> desoxiinosina <400> 37 aaggccatga atgaatttga nnnnntcatc aactg 35 <210> 38 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> IL10-3' <22 0> <221> caracteristica mista <222> (21) .. (25) <223> desoxiinosina <400> 38 tgacagtagg ggaaccctct nnnnngctgc agg 33 <210> 39 <211> 37 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> hMPV 5'-585 100 <22 0> <221> caracteristica mista <222> (23) . . (27) <223> desoxiinosina <400> 39 agcttcagtc aattcaacag aannnnncta aatgttg 37 <210> 40 <211> 37 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> hMPV 3'-698 <22 0> <221> caracteristica mista <222> (8) <223> desoxiinosina <22 0> <221> caracteristica mista <222> (15) <223> desoxiinosina <22 0> <221> caracteristica mista <222> (25) . . (29) <223> desoxiinosina <400> 40 aacatcantt ttatntgtcc tgcannnnnt ggcatgt 37 <210> 41 <211> 37 <212> DNA <213> Sequência Artificial 101 <22 0> <223> hMPV 3'-1007 <22 0> <221> característica mista <222> (5) <223> desoxiinosina <22 0> <221> característica mista <222> (14) <223> desoxiinosina <22 0> <221> característica mista <222> (23) . . (27) <223> desoxiinosina <400> 41 ttgantgctc agcnacattg atnnnnncwg ctgtgtc 37
Lisboa, 13 de Dezembro de 2011

Claims (13)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para amplificar seletivamente uma sequência de ácido nucleico alvo a partir de um DNA ou de uma mistura de ácidos nucleicos, que compreende amplificar a sequência de ácido nucleico alvo por realização de pelo menos dois ciclos de emparelhamento de "primers", extensão de "primers" e desnaturação, utilizando um conjunto de "primers" compreendendo um par de oligonucleótidos de especificidade dual com especificidade de emparelhamento aumentada, em que cada oligonucleótido de especificidade dual é representado pela fórmula geral seguinte: 5 ' -Xp-Yq-Zr—3 ' em que Xp representa uma porção 5' de especificidade de Tf elevada possuindo uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente complementar a um sitio num ácido nucleico modelo para hibridizar com aquele, Yq representa uma porção de separação compreendendo pelo menos três bases universais contíguas, Zr representa uma porção 3' de especificidade de Tf baixa possuindo uma sequência de nucleótidos de hibridização substancialmente complementar a um sítio no ácido nucleico modelo para hibridizar com aquele, p, q e r representam o número de nucleótidos e p representa um inteiro de pelo menos 15, q representa um inteiro de pelo menos 3 e r representa um inteiro de pelo menos 3; e X, Y e Z são um desoxirribonucleótido ou ribonucleótido; a Tf da porção 5' de especificidade de Tf elevada é maior do que a da porção 3' de especificidade de Tf baixa, a porção de separação tem a 2 Tf mais baixa das três porções; a porção 5' de especificidade de Tf elevada é mais longa do que a porção 3' de especificidade de Tf baixa; a porção de separação forma uma ausência de emparelhamento de bases que não serve de sitio de hibridização e não interage com o modelo para emparelhamento de bases, em condições tais que a porção 5' de especificidade de Tf elevada e a porção 3' de especificidade de Tf baixa são emparelhadas com o ácido nucleico modelo, permitindo que a porção 5' de especificidade de Tf elevada seja separada da porção 3' de especificidade de Tf baixa em termos da especificidade de emparelhamento com o ácido nucleico modelo, de modo que a especificidade de emparelhamento do oligonucleótido é determinada de forma dual pela porção 5' de especificidade de Tf elevada e pela porção 3' de especificidade de Tf baixa, de modo que a especificidade global do emparelhamento do oligonucleótido é aumentada; em que o emparelhamento na reação de amplificação é realizado em condições tais que não ocorre emparelhamento apenas pela porção 3' de especificidade de Tf baixa; em que um primeiro ciclo e um segundo ciclo da reação de amplificação envolvem emparelhamento da porção 5' de especificidade de Tf elevada e da porção 3' de especificidade de Tf baixa do oligonucleótido de especificidade dual com a sequência de ácido nucleico alvo, e os ciclos subsequentes da reação de amplificação envolvem emparelhamento da porção 5' de especificidade de Tf elevada e da porção 3' de especificidade de Tf baixa do oligonucleótido de especificidade dual com uma sequência derivada do oligonucleótido de especificidade dual incorporada no produto amplificado; em que a base universal contida na porção de separação é desoxiinosina ou inosina. 3
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o emparelhamento é efetuado a uma temperatura que varia desde 45°C até 68°C.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a reação de amplificação é uma reação em cadeia de polimerase.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a porção 3' de especificidade de Tf baixa tem a sequência de nucleótidos de hibridização perfeitamente complementar ao sitio do ácido nucleico modelo para hibridizar com aquele.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que p representa um inteiro de 15 até 40.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que p representa um inteiro de 15 até 25.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que q representa um inteiro de 3 até 10.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que r representa um inteiro de 3 até 15.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que p é um inteiro de 15 até 25, q é um inteiro de 3 até 10 e r é um inteiro de 3 até 15.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a Tf da porção 5' de especificidade de Tf elevada varia desde 4 0 °C até 8 0 0C. 4
11. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a Tf da porção 3' de especificidade de Tf baixa varia desde 10°C até 40°C.
12. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a Tf da porção de separação varia desde 3°C até 15°C.
13. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de ácido nucleico alvo compreende duas ou mais sequências de ácidos nucleicos alvos e o conjunto de "primers" compreende dois ou mais conjuntos de "primers" para amplificação multiplex. Lisboa, 13 de Dezembro de 2011
PT06716196T 2005-03-05 2006-03-03 Processos utilizando um oligonucleótido de especificidade dual e oligonucleótido de especificidade dual utilizado PT1856257E (pt)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20050018419 2005-03-05
PCT/KR2005/001206 WO2006095941A1 (en) 2005-03-05 2005-04-26 Processes using dual specificity oligonucleotide and dual specificity oligonucleotide

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT1856257E true PT1856257E (pt) 2012-01-02

Family

ID=36953549

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT06716196T PT1856257E (pt) 2005-03-05 2006-03-03 Processos utilizando um oligonucleótido de especificidade dual e oligonucleótido de especificidade dual utilizado

Country Status (7)

Country Link
EP (2) EP2365079A1 (pt)
JP (1) JP5619702B2 (pt)
KR (4) KR100977186B1 (pt)
PL (1) PL1856257T3 (pt)
PT (1) PT1856257E (pt)
RU (1) RU2400538C2 (pt)
WO (1) WO2006095981A1 (pt)

Families Citing this family (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8871469B1 (en) * 2004-11-13 2014-10-28 Steven Albert Benner Self-avoiding molecular recognition systems in DNA priming
ES2400805T3 (es) * 2006-05-04 2013-04-12 Seegene, Inc. Método para amplificar una secuencia de ADN desconocida adyacente a una secuencia conocida
US8399194B2 (en) 2006-12-26 2013-03-19 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Heteropolynucleotide duplexes with purine—purine base pairing
JP5822726B2 (ja) 2008-09-03 2015-11-24 クワンタムディーエックス・グループ・リミテッド 電荷量タグを含む合成ヌクレオチドのデザイン、合成及び使用
US10759824B2 (en) 2008-09-03 2020-09-01 Quantumdx Group Limited Design, synthesis and use of synthetic nucleotides comprising charge mass tags
WO2017120148A1 (en) 2016-01-04 2017-07-13 Quantumdx Group Limited Design, synthesis and use of synthetic nucleotides comprising charge mass tags
WO2010026488A2 (en) 2008-09-03 2010-03-11 Quantumdx Group Limited Methods and kits for nucleic acid sequencing
ES2574137T3 (es) * 2008-09-03 2016-06-15 Quantumdx Group Limited Estrategias y métodos de detección de ácidos nucleicos mediante biosensores
US10512910B2 (en) 2008-09-23 2019-12-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based analysis method
WO2011120006A1 (en) 2010-03-25 2011-09-29 Auantalife, Inc. A Delaware Corporation Detection system for droplet-based assays
US9598725B2 (en) 2010-03-02 2017-03-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Emulsion chemistry for encapsulated droplets
US9417190B2 (en) 2008-09-23 2016-08-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Calibrations and controls for droplet-based assays
US8709762B2 (en) 2010-03-02 2014-04-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for hot-start amplification via a multiple emulsion
US9764322B2 (en) 2008-09-23 2017-09-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for generating droplets with pressure monitoring
US11130128B2 (en) 2008-09-23 2021-09-28 Bio-Rad Laboratories, Inc. Detection method for a target nucleic acid
US9492797B2 (en) 2008-09-23 2016-11-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for detection of spaced droplets
US9132394B2 (en) 2008-09-23 2015-09-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for detection of spaced droplets
US8663920B2 (en) 2011-07-29 2014-03-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Library characterization by digital assay
US8951939B2 (en) 2011-07-12 2015-02-10 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital assays with multiplexed detection of two or more targets in the same optical channel
US9399215B2 (en) 2012-04-13 2016-07-26 Bio-Rad Laboratories, Inc. Sample holder with a well having a wicking promoter
US8633015B2 (en) 2008-09-23 2014-01-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Flow-based thermocycling system with thermoelectric cooler
US9156010B2 (en) 2008-09-23 2015-10-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based assay system
JP6155418B2 (ja) 2009-09-02 2017-07-05 バイオ−ラッド・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド 多重エマルジョンの合体による、流体を混合するためのシステム
WO2011027966A2 (en) 2009-09-03 2011-03-10 Seegene, Inc. Td probe and its uses
KR20110050327A (ko) * 2009-11-07 2011-05-13 주식회사 씨젠 Ｔｈｄ 프라이머 타겟 검출
CN102762744B (zh) 2009-12-21 2017-07-25 Seegene株式会社 利用靶信号产生引物进行的靶检测
EP2516678A4 (en) * 2009-12-24 2013-06-19 Seegene Inc REAL TIME MULTIPLEX DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACID SEQUENCES WITH FALSE SIGNAL REMOVAL
WO2011087928A1 (en) 2010-01-12 2011-07-21 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Oligonucleotides and methods for detecting kras and pik3ca mutations
CA2767182C (en) 2010-03-25 2020-03-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet generation for droplet-based assays
CA2767114A1 (en) 2010-03-25 2011-09-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet transport system for detection
KR20120042100A (ko) 2010-10-22 2012-05-03 주식회사 씨젠 이중표지 고정화 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출
CA3024250C (en) 2010-11-01 2022-01-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for forming emulsions
MX2017015093A (es) 2011-01-11 2023-03-10 Seegene Inc Detección de secuencias de ácido nucleico objetivo mediante ensayo de escisión y extensión del pto.
CN103534360A (zh) 2011-03-18 2014-01-22 伯乐生命医学产品有限公司 借助对信号的组合使用进行的多重数字分析
WO2012134195A2 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequence by pto cleavage and extension-dependent cleavage
EP3789498A1 (en) 2011-04-25 2021-03-10 Bio-rad Laboratories, Inc. Methods for nucleic acid analysis
WO2012150749A1 (en) 2011-05-04 2012-11-08 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequences by po cleavage and hybridization
CN102559661B (zh) * 2012-01-18 2014-06-04 厦门基科生物科技有限公司 一种新型连接酶反应介导的扩增方法及用途
DK2817421T3 (en) * 2012-02-20 2018-03-05 Speedx Pty Ltd DETECTION OF NUCLEIC ACIDS
CN104388426B (zh) * 2012-02-28 2017-08-08 盛司潼 一种Oligo dT引物及构建cDNA文库的方法
AU2013228226B2 (en) 2012-03-05 2016-06-02 Seegene, Inc. Detection of nucleotide variation on target nucleic acid sequence by PTO cleavage and extension assay
KR102351434B1 (ko) 2013-02-07 2022-01-17 러트거즈,더스테이트유니버시티오브뉴저지 고도로 선택적인 핵산 증폭 프라이머
EP2770065B1 (en) 2013-02-25 2017-12-13 Seegene, Inc. Detection of nucleotide variation on target nucleic acid sequence
EP2971115B1 (en) 2013-03-13 2022-07-27 Seegene, Inc. Quantification of target nucleic acid using melting peak analysis
US20160244816A1 (en) 2013-07-15 2016-08-25 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequence by pto cleavage and extension-dependent immobilized oligonucleotide hybridization
US11447814B2 (en) 2013-10-18 2022-09-20 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequence on solid phase by PTO cleavage and extension using HCTO assay
EP3230474A4 (en) * 2014-12-09 2018-04-25 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequences using different detection temperatures and reference values
KR102019506B1 (ko) 2014-12-09 2019-09-19 주식회사 씨젠 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 구별
KR101742681B1 (ko) * 2015-01-30 2017-06-01 에스디 바이오센서 주식회사 상보적 염기서열 내지는 미스-매치된 염기를 포함하는 상보적인 염기서열과 연결된 pcr 프라이머 및 이를 이용한 핵산 증폭 방법
US20180073082A1 (en) * 2015-02-25 2018-03-15 Diogene Co., Ltd Dumbbell-structure oligonucleotide, nucleic acid amplification primer comprising same, and nucleic acid amplification method using same
WO2017209575A1 (en) * 2016-06-03 2017-12-07 Seegene, Inc. Evaluation of specificity of oligonucleotides
KR101785687B1 (ko) * 2016-07-20 2017-10-17 (주)다이오진 다중 증폭 이중 시그널 증폭에 의한 타겟 핵산 서열의 검출 방법
CN111742056B (zh) * 2017-06-23 2023-09-01 荣研化学株式会社 核酸检测方法、核酸检测用引物以及核酸检测用试剂盒
WO2019066461A2 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Seegene, Inc. DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACID SEQUENCES BY CLEAVAGE ANALYSIS AND EXTENSION OF PTO
WO2024054924A1 (en) * 2022-09-08 2024-03-14 Gen-Probe Incorporated Method of detecting nucleic acid analytes using dual-specificity primers

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
IL86724A (en) 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
AU624601B2 (en) 1988-01-21 1992-06-18 Genentech Inc. Amplification and detection of nucleic acid sequences
CA1340807C (en) 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
US5817797A (en) 1988-06-01 1998-10-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Sequencing DNA; a modification of the polymerase chain reaction
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
EP0425563B1 (en) 1988-07-20 1996-05-15 David Segev Process for amplifying and detecting nucleic acid sequences
WO1990010716A1 (en) 1989-03-10 1990-09-20 Gene-Trak Systems Immobilized oligonucleotide probes and uses therefor
KR950013953B1 (ko) 1990-01-26 1995-11-18 애보트 래보라토리즈 리가제 연쇄 반응에 적용가능한 표적 핵산의 증폭 방법
US5756285A (en) 1991-09-27 1998-05-26 Amersham Life Science, Inc. DNA cycle sequencing
US5432065A (en) 1993-03-30 1995-07-11 United States Biochemical Corporation Cycle sequencing with non-thermostable DNA polymerases
US6077668A (en) 1993-04-15 2000-06-20 University Of Rochester Highly sensitive multimeric nucleic acid probes
US5831065A (en) 1994-04-04 1998-11-03 Lynx Therapeutics, Inc. Kits for DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage
SE506700C2 (sv) 1996-05-31 1998-02-02 Mikael Kubista Sond och förfaranden för analys av nukleinsyra
US5723298A (en) 1996-09-16 1998-03-03 Li-Cor, Inc. Cycle labeling and sequencing with thermostable polymerases
US6309824B1 (en) 1997-01-16 2001-10-30 Hyseq, Inc. Methods for analyzing a target nucleic acid using immobilized heterogeneous mixtures of oligonucleotide probes
US20030165888A1 (en) * 2001-07-18 2003-09-04 Brown Bob D. Oligonucleotide probes and primers comprising universal bases for diagnostic purposes
US6013449A (en) 1997-11-26 2000-01-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Probe-based analysis of heterozygous mutations using two-color labelling
US6140054A (en) 1998-09-30 2000-10-31 University Of Utah Research Foundation Multiplex genotyping using fluorescent hybridization probes
US6350580B1 (en) 2000-10-11 2002-02-26 Stratagene Methods for detection of a target nucleic acid using a probe comprising secondary structure
WO2003093509A1 (en) 2002-05-01 2003-11-13 Seegene, Inc. Methods and compositions for improving specificity of pcr amplication
WO2003050305A1 (en) 2001-12-08 2003-06-19 Seegene, Inc. Annealing control primer and its uses
CA2469923A1 (en) 2001-12-12 2003-06-19 Genset S.A. Biallelic markers of d-amino acid oxidase and uses thereof
EP1520040A2 (en) * 2002-06-20 2005-04-06 Nuevolution A/S Microarrays displaying encoded molecules
EP3299463B1 (en) * 2002-10-30 2020-10-21 Nuevolution A/S Enzymatic encoding
WO2004074429A2 (en) * 2003-02-21 2004-09-02 Nuevolution A/S Method for producing second-generation library
FR2933490B1 (fr) 2008-07-02 2010-08-27 Commissariat Energie Atomique Procede de mesure du debit d'un liquide en ecoulement dans un canal fluidique et dispositif de mise en oeuvre

Also Published As

Publication number Publication date
KR100977186B1 (ko) 2010-08-23
WO2006095981A1 (en) 2006-09-14
RU2400538C2 (ru) 2010-09-27
KR20100099333A (ko) 2010-09-10
KR101032750B1 (ko) 2011-05-06
JP2012065655A (ja) 2012-04-05
RU2007132657A (ru) 2009-04-10
EP1856257B1 (en) 2011-10-19
PL1856257T3 (pl) 2012-03-30
KR20070111543A (ko) 2007-11-21
JP5619702B2 (ja) 2014-11-05
KR20090094388A (ko) 2009-09-04
KR101243266B1 (ko) 2013-03-25
EP1856257A4 (en) 2009-02-18
EP2365079A1 (en) 2011-09-14
KR20110122231A (ko) 2011-11-09
EP1856257A1 (en) 2007-11-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10870675B2 (en) Process using dual specificity oligonucleotide and dual specificity oligonucleotide
PT1856257E (pt) Processos utilizando um oligonucleótido de especificidade dual e oligonucleótido de especificidade dual utilizado
US11208688B2 (en) Small RNA capture, detection and quantification