본 발명은 (a) 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 이용한 다양한 방법 및 (b) 상기 방법에 이용되는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(이하 “DS oligo” 라 한다)는 개선된 특이성으로 프라이머 또는 프로브가 타깃 핵산에 어닐링되도록 하여, 핵산 증폭(특히, PCR)의 특이성 및 혼성화 반응을 크게 개선할 수 있도록 한다.
이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(
DS
Oligo
)
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 일반식으로 표현되며 주형-의존적 연장 반응에 의한 핵산 분자를 합성하기 위한 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 제공한다:
5‘-Xp-Yq-Zr-3'
Xp는 혼성화 되는 주형 핵산의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지는 5’-고 Tm 특이성 부위를 나타내며, Yq는 최소 두개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위를 나타내고, Zr는 혼성화되는 주형 핵산의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지는 3’-저 Tm 특이성 부위를 나타내며, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수이고, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고; 상기 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 상기 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 3개의 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고; 상기 분할 부위는 상기 5’-고 Tm 특이성 부위와 3’-저 Tm 특이성 부위가 상기 주형 핵산에 어닐링되는 조건 하에서 비염기쌍 버블 구조를 형성하여, 상기 주형 핵산에 대한 어닐링 특이성 측면에서 상기 5’-고 Tm 특이성 부위가 3’-저 Tm 특이성 부위로부터 분리되도록 하며, 상기 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 특이성은 5’-고 Tm 특이성 부위 및 3’-저 Tm 특이성 부위 둘 모두에 의해 결정되어 상기 올리고뉴클레오타이드의 전체 어닐링 특이성이 증가된다.
DS 올리뉴클레오타이드(이하 "DS oligo" 라 한다)를 언급하면서 사용되는 용어“이중 특이성(dual specificity)”은 DS 올리뉴클레오타이드의 특징을 표현하기 위한 조어로서, 타깃 서열에 대한 DS 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 특이성이, 분리된 두 부위, 즉 5‘-고 Tm 특이성 부위 및 3‘-저 Tm 특이성 부위에 의해 이중으로 결정되는 것을 의미한다. 일반적으로, 프라이머 또는 프로브의 어닐링 특이성은 그 연속되는 전체 서열에 의해 지배된다. 반대로, DS oligo의 어닐링 특이성은 분할 부위에 의해 분리된 두 부위(5‘-고 Tm 특이성 부위 및 3‘-저 Tm 특이성 부위)에 의해 이중으로 결정되며, 상기 세 부위는 하나의 올리고뉴클레오타이드 서열 내에 위치한다. 이러한 이중 특이성은 DS oligo가 프라이머 및 프로브로서 더욱 높은 특이성을 나타내도록 하며, 이는 종래기술에 대하여 본 발명이 신규성 및 진보성을 갖도록 한다.
한편, 본 발명자는 WO 03/050303에 개시된 것처럼 어닐링 특이성을 증가시키기 위해 ACP(annealing control primer)를 이미 개발한 바가 있으며, 상기 특허 문전의 교시 내용은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 본 발명의 DS oligo는 다음의 측면에 있어 ACP와 명확히 다르다: (ⅰ) DS oligo는 타깃 서열과 혼성화 되도록 두개의 특이성 부위를 가지지만 ACP는 하나의 특이성 부위를 가지며; (ⅱ) DS oligo에서의 세 부위는 Tm 측면에서서 명확히 구별되는 반면에 ACP에서의 부위들은 그러하지 않으며; (ⅲ) DS 프라이머는 5’-고 Tm 특이성 부위 및 3’-저 Tm 특이성 부위 모두에서 어닐링이 발생할 때만 주형에 상보적인 핵산 분자를 합성하기 위하여 연장되는 반면에 ACP는 3’-말단 부위에 어닐링이 발생하는 경우에도 연장되고; (ⅳ) 따라서 DS oligo의 연장 또는 혼성화 특이성은 두개의 분할된 부위, 즉 5’-고 Tm 특이성 부위 및 3’-저 Tm 특이성 부위 의해 이중으로 결정되나, 반면에 ACP 경우는 단지 3’-말단 부위만에 의해 지배된다. 따라서, DS oligo의 타깃 서열에 대한 어닐링 또는 혼성화 특이성은 APC보다 훨씬 크며, 이는 DS oligo가 ACP 에 대하여 신규하고 진보적임을 나타내는 것이다.
DS oligo의 두드러진 특징은 하나의 올리고뉴클레오타이드 분자내에 구분되는 특징을 가진 세 개의 다른 부위를 가진다는 것이다: 5’-고 Tm 특이성 부위, 3’-저 Tm 특이성 부위 및 분할 부위.
DS oligo는 주형-의존적 연장반응을 포함하는 다양한 방법과 분석에 유용하다. 본 명세서에서 사용된 용어“주형-의존적 연장 반응(template-dependent extension reaction)”은 타깃 서열에 혼성화 된 올리고뉴클레오타이드 분자를 연장하는 반응을 의미하며, 이는 올리고뉴클레오타이드의 말단에 연속적인 뉴클레오타이드를 결합시켜 이루어지고, 이 경우 연장된 서열은 상보적인 주형 서열에 의해 결정된다.
DS oligo의 혼성화(어닐링) 특이성을 설명하는 원리의 대표적인 예는 도 1a에 도시되어 있다. 도 1a를 참조하면, DS oligo가 보다 상세히 설명될 것이다.
DS oligo의 5’-고 Tm 특이성 부위만이 주형에 어닐링 되는 경우, 상기 부위는 주형-의존적 연장을 위한 프라이밍 위치로 작용할 수 없으며, 결국 연장 반응이 발생하지 않는다.
DS oligo의 5'-고 Tm 특이성 부위는 비-타깃 서열에 어닐링 되는 반면에, 보다 짧은 서열을 가지는 3'-저 Tm 특이성 부위는 비-타깃 서열에 어닐링 하지 않는 다. 그 이유는 5'-고 Tm 특이성 부위 및 3'-저 Tm 특이성 부위는 어닐링 측면에서 분할 부위에 의해 분리되기 때문이다. 즉, 3'-저 Tm 특이성 부위는 5'-고 Tm 특이성 부위와는 상대적으로 독립적인 방식으로 어닐링에 관여하고, 3'-저 Tm 특이성 부위의 어닐링은 5'-고 Tm 특이성 부위의 어닐링에 의해 덜 영향 받는다. 이러한 맥락에서, 3'-저 Tm 특이성 부위가 비-타깃 서열에 어닐링 할 가능성은 매우 낮다.
3'-저 Tm 특이성 부위만이 비-타깃 위치에 상보적인 서열을 가지는 경우에는, 특정 높은 엄격조건 예컨대 5'-고 Tm 특이성 부위의 어닐링을 위한 엄격 조건에서는 어닐링이 일어나지 않는다. 바람직한 구현예에 따르면, 3'-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높은 어닐링 온도를 갖는 엄격 조건하에서 DS oligo를 사용하여 주형-의존적 연장반응을 실시하는 것이 유리하다.
5'-고 Tm 특이성 부위 및 3'-저 Tm 특이성 부위 모두가 주형에 실질적으로 상보적인 서열을 갖는 경우, DS oligo는 그 주형에 어닐링 될 수 있고, 따라서 성공적인 연장 반응이 발생한다.
이론에 구속되지 않으면서 판단하건대, 분할 부위는 3'-저 Tm 특이성 부위를 어닐링 조건(예, 온도 및 서열 상보성)에 더 민감하게 만드는 것으로 판단된다. 따라서, 3'-저 Tm 특이성 부위와 비-타깃 서열 사이에 비-특이적 혼성화가 생길 가능성은 특정 어닐링(또는 엄격) 조건하에서 더욱 낮아진다. 5'-고 Tm 특이성 부위뿐만 아니라 3'-저 Tm 특이성 부위가 그 타깃 서열에 어닐링 되는 경우, 3'-저 Tm 특이성 부위의 3’-말단은 DNA 중합효소에 의해 연장되는 위치를 만든다.
본 명세서에서 사용하는 용어 “올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성되는 것이다. 올리고뉴클레오타이드는 혼성화에 있어 최대 효율을 위하여 바람직하게는 단일쇄이다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오타이드는 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA)(M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 증폭의 최대 효율을 위하여, 바람직하게는 프라이머는 단일쇄이다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치 (apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다. 본 명세서 용어 “혼성화(hybridization)" 는 상보적인 단일쇄 핵산으로부터 이중쇄 핵산을 형성함을 의미한다. 용어“어닐링”과 “혼성화”는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
본 명세서에서 사용된 용어 “프로브(probe)"는 타깃 뉴클레오타이드 서열에 실질적으로 부위를 포함하는 단일쇄 핵산 분자이다.
본 명세서에서 본 발명의 DS oligo를 언급하면서 사용하는 용어 “부위(portion)"는 분할 부위에 의해 분리되는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 용어 “5'-고 Tm 특이성 부위(5'-high Tm specificity portion)" 또는 용어 “3'-저 Tm 특이성 부위(3'-low Tm specificity portion)"는 각각 본 발명의 DS oligo의 5’-말단과 3’-말단에서의 뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 이는 분할 부위에 의해 분리된다. DS oligo를 언급하면서 사용하는 용어 5'-고 Tm 특이성 부위"는 세 부위 중에서 가장 높은 Tm을 가지고, 주형 핵산의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지는 부위를 의미한다. DS oligo와 관련하여 “3'-저 Tm 특이성 부위(3'-low Tm specificity portion)"는 5'-고 Tm 특이성 부위보다는 낮은 Tm을 갖지만, 분할 부위보다는 높은 Tm를 가지고, 주형 핵산의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지는 부위를 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 “Tm”는 핵산 이중쇄 분자중 반이 단일쇄가 되는 용융 온도(melting temperature)를 의미한다. DS oligo 의 부위를 언급하면서 사용되는 용어 "고 Tm(high Tm)” 및 "저 Tm (low Tm)”은 절대 Tm 값이 아니라 상대 Tm 값을 의미한다. 즉, 5'-고 Tm 특이성 부위의 Tm이 3'-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 상대적으로 높다는 것만이 요구될 뿐이다.
상기 5’-고 Tm 특이성 부위와 3'-저 Tm 특이성 부위는 혼성화 되는 주형 핵산의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지도록 디자인 된다. DS oligo와 관련하여 용어 “실질적으로 상보적인(substantially complementary)”는 올리고뉴클레오타이드가 충분히 상보적이어서 지정된 어닐링 조건 또는 엄격 조건하에서 선택적으로 주형 핵산 서열에 혼성화 될 수 있어, 어닐링 된 올리고뉴클레오타이드가 중합효소에 의해 연장되어 주형에 상보적인 복사본을 형성할 수 있음을 의미한다. 따라서, 이 용어는 “완전하게 상보적인” 또는 이와 관련된 용어와는 다른 의미를 갖는다. DS oligo의 5'-고 Tm 특이성 부위 및 3'-저 Tm 특이성 부위는, 상기 DS oligo가 프라이머 또는 프라브로서 작용할 수 있는 범위 내에서, 주형에 대하여 하나 이상의 미스매치를 가질 수 있다. 가장 바람직하게는, DS oligo의 5'-고 Tm 특이성 부위 및/또는 3'-저 Tm 특이성 부위는 주형의 한 위치에 대하여 완전하게 상보적인 즉, 미스매치가 없는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
DS oligo의 성공적인 실시를 위해 5'-고 Tm 특이성 부위의 Tm이 3'-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높아야 함은 필수적이다. 바람직하게는 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm는 40-80℃, 보다 바람직하게는, 40-75℃, 보다 더 바람직하게는 50-68℃, 그리고 가장 바람직하게는 50-65℃이다. 바람직하게는 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm는 10-40℃, 보다 바람직하게는, 15-40℃, 그리고 가장 바람직하게는 20-35℃이다. 바람직하게는, 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm는 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm 보다 최소 3℃ 높으며, 보다 바람직하게는 최소 10℃, 보다 더 바람직하게는 최소 15℃, 그리고 가장 바람직하게는 최소 20℃ 높다. 유리하게는, 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm는 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm 보다 5-70℃ 높으며, 바람직하게는 10-70℃, 보다 바람직하게는 10-60℃, 보다 더 바람직하게는 10-50℃, 보다 더욱 더 바람직하게는 10-40℃ 그리고 가장 바람직하게는 20-40℃ 높다.
바람직한 구현예에 따르면, 5’-고 Tm 특이성 부위는 3’-저 Tm 특이성 부위보다 길다. 5’-고 Tm 특이성 부위는 바람직하게는, 15 내지 40 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 보다 바람직하게는 15 내지 30 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는, 20 내지 25 뉴클레오타이드 길이를 가진다. 3’-저 Tm 특이성 부위는 바람직하게는, 3 내지 15 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 보다 바람직하게는 5 내지 15 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는, 6 내지 12 뉴클레오타이드 길이를 가진다.
최소 두 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위는 DS oligo의 이점과 특징을 결정하는 한 요소이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “유니버설 염기(universal base)"는 자연의 DNA/RNA 염기들에 대하여 구별 없이 자연의 DNA/RNA 염기들의 각각과 염기쌍을 형성할 수 있는 염기를 의미한다.
축퇴성 프라이머에서 불확실한 위치의 뉴클레오타이드가 유니버설 염기에 의해 치환되는 것은 공지된 사실이며, 상기 유니버설 염기는 디옥시이노신(Ohtsuka et al, (1985) J. Biol . Chem. 260, 2605-2608; Sakanari et al., (1989) Proc . Natl. Acad . Sci. 86, 4863-4867), 1-(2‘-디옥시-베타D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 (Nichols et al.,(1994) Nature 369, 492-493) 및 5-니트로인돌(Loakes and Brown, (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4039-4043)을 포함하며, 상기 염기들은 4종의 종래 염기들과 비특이적으로 염기쌍을 이루기 때문에 축퇴성 프라이머의 디자인과 관련된 문제점을 해결하는 데 이용된다. 그러나, 이러한 유니버설 염기들이 어닐링(혼성화) 또는 증폭 동안에 버블 구조를 생성하고 그 때 두 반대 인접한 서열을 분리하도록 올리고뉴클레오타이드 분자에서 하나의 부위를 형성하여, 결국 두 분할 특이성 (어닐링) 부분을 통해 이중 특이성에 의해 타깃 서열에 프라이머 또는 프로브의 어닐링 특이성을 증가시킬 수 있다는 연구는 아직까지 없다.
바람직한 구현예에 따르면, 분할 부위의 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2‘-디옥시이노신(7-deaza-2‘-deoxyinosine), 2-아자-2’-디옥시이노신, 2‘-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2’-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린(deoxy nebularine), 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤,포스포라미데이트-5-니트로인돌(phosphoramidate-5-nitroindole), 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸 이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는 상기 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체는 디옥시이노신, 1-(2‘-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌이며, 가장 바람직하게는 디옥시이노신이다.
분할 부위에서 상기 유니버설 염기는 연속적인 방식으로 포함될 수 있고 또는 dNMPs와 같은 다른 뉴클레오타이드와 함께 간헐적으로 포함될 수 있다. 바람직하게는, 상기 분할 부위는 유니버설 염기, 바람직하게는 디옥시이노신을 갖는 뉴클레오타이드의 연속서열을 포함한다.
DS oligo에서 분할 부위는 3개의 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 갖는 것이 필수적이며, 이에 의해 5’-고 Tm 특이성 부위와 3’-저 Tm 특이성 부위가 주형 핵산에 어닐링되는 조건 하에서 분할 부위는 비염기쌍 버블 구조를 형성하며, 주형 핵산에 대한 어닐링 특이성 측면에서 5'-고 Tm 특이성 부위는 3'-저 Tm 특이성 부위로부터 분리 되고, 결국 상기 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 특이성은 5'-고 Tm 특이성 부위 및 3'-저 Tm 특이성 부위에 의해 이중으로 결정되어 올리고뉴클레오타이드의 전체 어닐링 특이성이 상당히 개선된다. 바람직하게는 분할 부위의 Tm는 3-15℃ 이며, 보다 바람직하게는 4-15℃이며, 가장 바람직하게는 5-10℃이다.
바람직한 구현예에 따르면, 5'-고 Tm 특이성 부위와 3'-저 Tm 특이성 부위 사이의 분할 부위는 최소 3개의 유니버설 염기를 포함하고, 보다 바람직하게는 최소 4개의 유니버설 염기를, 그리고 가장 바람직하게는 최소 5개의 유니버설 염기를 포함한다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분할 부위는 2-10개의 유니버설 염기를 포함 하고, 보다 바람직하게는 3-10개 유니버설 염기를, 더욱 더 바람직하게는 4-8 유니버설 염기를, 그리고 가장 바람직하게는 5-7 유니버설 염기를 포함한다.
보다 긴 서열을 갖는 프라이머 또는 프로브가 필요한 경우, DS oligo의 이점은 가장 두드러진다. 예컨대, 종래 기술에 따르면 혼성화 서열로서 35 bp 이상의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 프라이머는 비-특이적 증폭물(amplicon)을 생성하기 쉽다. 반대로 DS oligo는 긴 서열을 갖는 경우에도 특이적 증폭물만을 생성하는 데, 그 이유는 DS oligo가 주형과의 상호작용(즉, 어닐링) 측면에서 각각 분리된 두개의 혼성화 서열(즉, 5'-고 Tm 특이성 부위 및 3'-저 Tm 특이성 부위)을 가지기 때문이다. 예컨대, DS oligo은 타깃 서열에 상보적인 35-45 bp의 혼성화 서열을 포함할 수 있다. 이런 관점에서, 본 발명은 종래 프라이머 디자인 전략에서는 비-실용적인 것으로 간주되는 보다 긴 서열을 갖는 프라이머를 디자인 할 수 있도록 한다는 것을 알 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위는 15 내지 25 뉴클레오타이드 길이, 상기 분할 부위는 3 내지 10 뉴클레오타이드 길이 그리고 상기 3’-저 Tm 특이성 부위는 3 내지 15 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.
보다 바람직하게는, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위는 15 내지 25 뉴클레오타이드 길이, 상기 분할 부위는 3 내지 10 뉴클레오타이드 길이 및 상기 3’-저 Tm 특이성 부위는 5 내지 15 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 가장 바람직하게는, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위는 15 내지 25 뉴클레오타이드 길이, 상기 분할 부위는 5 내지 7 뉴클레오타이드 길이; 그리고 상기 3’-저 Tm 특이성 부위는 6 내지 10 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 실시예에 설명된 전형적이고 예시적인 DS oligo에 따르면, 5'-고 Tm 특이성 부위는 약 20 뉴클레오타이드 길이이고; 분할 부위는 약 5 뉴클레오타이드 길이이며; 3'-저 Tm 특이성 부위는 약 8-10 뉴클레오타이드 길이이다.
가장 바람직한 구현예에서, DS oligo는 다음 일반식으로 나타낸다: 5‘-Xp-(dI)q-Zr-3' (Xp 및 Zr의 정의 및 특징은 상술한 바와 같으며, dI는 디옥시이노신을, (dI)q은 유니버설 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 연속서열을 포함하는 분할 부위를 나타내고 q는 5-7의 정수이다).
흥미롭게도, 타깃 서열에 대한 미스매치를 허용(tolerate)하는 엄격 조건하에서 본 발명의 DS oligo는 미스매치 허용성을 갖는다는 것이다.
DS oligo의 미스매치 허용성을 지배하는 원리에 대한 구조적 대표예는 도 1b에 도시되어 있다. 5'-고 Tm 특이성 부위와 3'-저 Tm 특이성 부위 모두가 주형에 어닐링 되는 조건하에서, 5'-고 Tm 특이성 부위에서는 하나 이상, 바람직하게는 한 개 내지 세 개의 염기 미스매치가 허용된다. 3'-저 Tm 특이성 부위에서는 하나 이상, 바람직하게는 한 개 내지 두 개의 염기 미스매치가, 5'-고 Tm 특이성 부위와 3'-저 Tm 특이성 부위 모두가 주형에 어닐링 되는 조건하에서 허용될 수 있다. 또한, 5'-고 Tm 특이성 부위및 3'-저 Tm 특이성 부위 모두가 주형에 어닐링 되는 조건하에서 5'-고 Tm 특이성 부위 및 3'-저 Tm 특이성 부위에서는 하나 이상, 바람직하게는 한 개 내지 다섯 개의 염기 미스매치가 허용될 수 있다.
DS oligo에 미스매치 허용성을 부과하기 위하여, 어닐링 조건, 특히 어닐링 온도가 중요하다. 3'-저 Tm 특이성 부위 단독에 의해서는 어닐링이 발생하지 않는 조건에서 어닐링이 실시되며, 5'-고 Tm 특이성 부위 및/또는 3'-저 Tm 특이성 부위가 타깃 위치에 대하여 하나 이상(그러나 제한된 개수)의 미스매치 염기를 가지는 경우, 모든 부위들에 의한 어닐링이 발생한다. 미스매치 허용성을 가지는 DS oligo는 유전적 다변성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 증폭하거나 검출하는데 요구된다. 미스매치 허용성을 갖는 DS oligo는 유전적 다변성을 나타내는 타깃 서열에 어닐링 될 수 있고, 결국 성공적인 증폭과 목적의 뉴클레오타이를 검출 하도록 한다. 즉, 본래 어닐링과 혼성화의 특이성을 극적으로 증가시키기 위해 개발된 DS oligo는, 어닐링 또는 엄격 조건이 적합하게 조절되는 조건 하에서 미스매치 허용을 요구하는 방법에서도 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 특이성을 올리고 뉴클레오타이드의 구조에 의해 이중적으로 결정되도록 하는 방법이 제공 된다: (a) 타깃 핵산 서열을 선택하는 단계; (b) (ⅰ) 상기 타깃 핵산에 실질적으로 상보적인 혼성화 서열과 (ⅱ) 적어도 두 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위를 갖는 올리고뉴클레오타이드의 서열을 디자인 하여 상기 분할 부위가 상기 혼성화 서열 사이에 끼여 들어가(intervene) 상기 올리고뉴클레오타이드에서 세 개의 부위를 형성하도록 하는 단계; 그리고 (c) 상기 분할 부위의 5’-방향쪽의 부위는 분할 부위의 3’-방향쪽 부위보다 높은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 상기 세 부위에서 가장 낮은 Tm을 가지도록 상기 올리고뉴클레오타이드에서 상기 분할 부위의 위치를 결정하는 단계로서, 이에 의해 (ⅰ) 상기 올리고뉴클레오타이드의 5’-고 Tm 특이성 부위는 상기 타깃 핵산에 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지며, (ⅱ) 상기 올리고뉴클레오타이드의 3’-저 Tm 특이성 부위는 상기 타깃 핵산에 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지고; 그리고 (ⅲ) 상기 5’-고 Tm 특이성 부위와 3’-저 Tm 특이성 부위 사이의 상기 분할 부위는 적어도 두 유니버설 염기를 포함하며; 그리고 상기 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 상기 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높고 상기 분할 부위는 3개의 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가져, 서로 간에 다른 Tm 값을 지닌 세 개의 구분된 부위를 가지는 올리고뉴클레오타이드를 제공하며, 상기한 구성에 의해 상기 올리고뉴클레오타이드의 타깃 핵산에 대한 어닐링 특이성은 상기 5’-고 Tm 특이성 부위 및 3’-저 Tm 특이성 부위에 의해 이중으로 결정된다.
본 방법은 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 특이성을 극적으로 증가시켜 타깃 서열과 혼성화 되도록 하는 새로운 접근을 제공한다. 또한 본 방법은 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 특이성을 개선하기 위한 방법으로 표현될 수도 있다. 게다가 본 발명은 타깃 서열에 혼성화 되는 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 특이성을 개선하기 위하여 최소 두개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위를 사용하는 방법으로 표현될 수 있다.
본 발명은 상술한 DS oligo를 제조하는데 이용된다. 따라서 불필요한 반복기재를 피하기 위하여, 이들 사이의 공통된 내용은 반복기재하지 않지만, 공통 내용은 본 발명의 방법의 상세한 설명에 삽입된다.
프라이머나 프로브를 디자인하기 위해 종래 대부분의 방법들은 타깃 서열에 혼성화할 수 있는 서열만을 사용한다. 또한, 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 특이성을 증가시키기 위하여 종래에는 온도와 이온 농도와 같은 증폭 또는 혼성화 조건을 조절하였다.
반대로, 본 발명의 방법은 올리고뉴클레오타이드 자체에 새로운 특징을 도입함으로써 어닐링 특이성을 증가시키는 새로운 전략을 제공한다. 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 특이성이 이중으로 결정될 수 있는 것과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 용어 “올리고뉴클레오타이드 구조에 의해(through a structure of the oligonucleotide"는 어닐링 특이성이 이중적으로 결정되도록 하는 새로운 특징을 올리고뉴클레오타이드에 부여함으로써 올리고뉴클레오타이드의 구조가 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 특이성에 크게 기여하는 것을 의미한다.
본 발명의 방법에 있어서, (ⅰ) 타깃 핵산에 실질적으로 상보적인 혼성화 서열 및 (ⅱ) 최소 두 개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위를 가지는 올리고뉴클레오타이드의 서열을 디지인하는 것이 중요하다. 이 단계에서, 상기 올리고뉴클레오타이드의 구조 윤곽은 5’-말단 부위/분할 부위/3’-말단 부위로 나타난다. 5’-말단 및 3’-말단 두 부분은 타깃 핵산에 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지고 분할 부위가 그 사이에 끼어 들어간다(intervene).
본 발명에서 가장 중요한 단계는 분할 부위의 5’-방향 쪽의 부위가 분할 부위의 3’-방향쪽 부위보다 높은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 상기 세 부위에서 가장 낮은 Tm을 가지도록 상기 올리고뉴클레오타이드에서 상기 분할 부위의 위치를 결정하는 단계이며, 이에 의해 다른 Tm 값을 갖는 세 개의 구분된 부위를 가지는 올리고뉴클레오타이드가 제공된다.
본 방법에 의해 올리고뉴클레오타이드 내에 삽입된 새로운 구조적 특징들은 다음과 같다 : (ⅰ) 올리고뉴클레오타이드 서열내의 세 개의 구분된 부위(5’-고 Tm 특이성 부위, 분할 부위 및 3’-저 Tm 특이성 부위); (ⅱ) 세 개 부위의 서로 다른 Tm 값; (ⅲ) 5’-고 Tm 특이성 부위 와 3’-저 Tm 특이성 부위 사이에 있으며 최소 두 개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위; (ⅳ) 분할 부위에 의해 어닐링 측면에서 분리되며, 어닐링 단계에서 타깃과 상호작용하는 두 부위; (ⅴ) 5’-고 Tm 특이성 부위, 3’-저 Tm 특이성 부위 및 분할 부위 순의 Tm 값. 이러한 구조적 특징은, 본 발명에 의해 최종적으로 제공되는 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 특이성이 5’-고 Tm 특이성 부위 및 3’-저 Tm 특이성 부위 두 부분에 의해 이중적으로 결정되도록 하며, 이는 타깃 서열에 대한 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 특이성을 크게 증가되도록 한다.
본 발명의 방법에 따라 디자인 되고 제조된 올리고뉴클레오타이드는 상술한 세 부위를 가지지 않는 것보다 매우 높은 어닐링 특이성을 보인다.
DS oligo의 특징과 이점은 다음과 같이 설명될 수 있다:
(a) DS oligo의 분할 부위는 최소 두 개의 유니버설 염기를 포함하며, 이는 DS oligo에서 가장 낮은 Tm을 생성하도록 하여, 5’-고 Tm 특이성 부위와 3’-저 Tm 특이성 부위가 주형 핵산에 어닐링되는 조건 하에서 비염기쌍 버블 구조를 형성하도록 한다. 이러한 비염기쌍 버블 구조는 어닐링 특이성 측면에서 5’-고 Tm 특이성 부위가 3’-저 Tm 특이성 부위로부터 분리되도록 하며;
(b) 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm이 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높고, 분할 부위는 가장 낮은 Tm을 가지며, 이 특징은 3’-저 Tm 특이성 부위 단독에 의한 어닐링이 발생되지 않는 엄격 조건을 설정하는 것을 가능하도록 하며;
(c) 따라서, DS oligo의 전체적 어닐링 특이성은 5’-고 Tm 특이성 부위 및 3’-저 Tm 특이성 부위 모두에 의해 이중으로 결정되고;
(d) 결국, DS oligo의 전체 어닐링 특이성은 크게 증가된다.
본 발명의 DS oligo는, 다양한 분야 즉 (ⅰ) Miller, H. I. 방법(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등 (EP 329,822), 라이가제 연쇄 반응(LCR, Wu, D.Y. et al., Genomics 4:560 (1989)), 중합효소 라이가제 연쇄 반응(Barany, PCR Methods and Applic., 1:5-16(1991)), 갭-LCR (WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(EP 439,182), 3SR (Kwoh et al., PNAS, USA, 86:1173(1989)) 및 NASBA(U.S. Pat. No. 5,130,238) 등과 같은 프라이머-관련 핵산 증폭 방법들과, (ⅱ) 사이클 시퀀싱 (Kretz et al., (1994) Cycle sequencing. PCR Methods Appl. 3:S107-S112) 및 파이로시퀀싱(Ronaghi et al., (1996) Anal . Biochem ., 242:84-89; 및 (1998) Science 281:363-365) 등과 같은 프라이머 연장-관련 기술들, 및 (iii) 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이를 사용한 타깃 뉴클레오타이드 서열의 탐지와 같은 혼성화-관련 기술들에서 매우 유용하다.
본 발명의 DS oligo는 다양한 핵산 증폭, 시퀀싱 및 혼성화-관련 기술에 적용할 수 있다. DS oligo의 응용성을 입증하는 대표적인 예는 다음과 같다:
Ⅰ. 핵산 분자 제조에 응용
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 주형-의존적 연장 반응에 의해 핵산분자를 제조하는 방법이 제공된다:
(a) 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 주형 핵산 분자에 어닐링시키는 단계로서, 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드는 5’-고 Tm 특이성 부위(5’-high Tm specificity portion), 3’-저 Tm 특이성 부위(5’-low Tm specificity portion) 및 분할 부위(separation portion), 세개의 부위를 포함하며, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위는 혼성화되는 상기 주형 핵산의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 분할 부위는 최소 두개의 유니버설 염기를 포함하고, 상기 3’-저 Tm 특이성 부위는 상기 주형 핵산의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지고; 상기 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 상기 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 3개의 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고; 상기 분할 부위는 상기 5’-고 Tm 특이성 부위와 3’-저 Tm 특이성 부위가 상기 주형 핵산에 어닐링되는 조건 하에서 비염기쌍 버블 구조를 형성하며, 상기 어닐링은 3’-저 Tm 특이성 부위 단독에 의한 어닐링이 발생되지 않는 조건 하에서 실시되고; 그리고
(b) 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 연장하여 상기 주형 핵산 분자에 상보적인 핵산 분자를 제조하는 단계.
본 발명의 제조 방법은 본 발명의 DS oligo를 이용하기 때문에, 과도한 반복성을 초래하는 본 명세서의 복잡성을 피하기 위하여 공통된 내용은 그 기재를 생략한다.
DS oligo를 사용하는 본 발명의 응용은 어닐링과 연장 단계를 포함하는 주형-의존적 연장 반응에 의하여 타깃 서열에 상보적인 핵산 서열을 선택적으로 제조하는 개선된 방법을 제공한다. 특히 타깃서열에 상보적인 핵산 서열의 제조는 어닐링, 연장 및 변성과정을 포함하는 주형-의존적 연장 반응의 과정을 반복함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명의 방법은 주형 핵산 분자에 상보적인 핵산 분자를 제조하는데 사용될 수 있다. 그러한 분자는 DNA 또는 RNA 이다. 상기 분자는 이중쇄 또는 단일쇄 형태일 수 있다. 출발 물질로서의 핵산이 이중쇄인 경우, 두 쇄를 단일쇄로, 또는 부분적인 단일쇄 형태로 만드는 것이 바람직하다. 쇄를 분리하는 방법은 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 쇄 분리는 80-105℃의 온도로 열 처리하여 달성될 수 있다. 상술한 처리를 이루기 위한 일반적인 방법들은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에서 제공된다.
mRNA가 출발물질로 이용되는 경우, 역전사 단계가 어닐링 단계를 실시하기 전에 필요하며, 역전사 단계의 상세한 내용은 Joseph Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res . 16:10366 (1988))에 개시되어 있다. 역전사를 위해서, mRNA의 폴리 A 테일에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머가 이용된다. 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머는 dTMPs로 이루어져 있고, dT 프라이머가 프라이머로서 작용할 수 있는 한 그 중 하나 또는 그 이상은 다른 dNMPs로 대체될 수 있다. 역전사 단계는 RNase H 활성을 갖는 역전사 효소를 가지고 행해질 수 있다. RNase H 활성을 갖는 효소를 이용하는 경우, 반응조건을 주의하여 선택하면 개별적인 RNase H 절단 단계를 생략할 수 있다.
본 발명의 방법은, 주형 핵산 분자가 특정 서열 또는 길이를 가질 것을 요구하지 않는다. 특히, 상기 분자들은 자연의 원핵세포 핵산, 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물) 핵산, 바이러스(예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 또는 비로이드 핵산을 포함한다. 또한 상기 핵산 분자는 화학적으로 합성되었거나 또는 합성될 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 따라서, 상기 핵산 서열은 자연에서 발견되거나 또는 발견되지 않는 것이다.
본 발명을 위해 사용되는 DS oligo는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 어닐링 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 설명되어 있다.
DS oligo의 5’-고 Tm 특이성 부위 및 3’-저 Tm 특이성 부위의 서열은 엄격한 상보성을 가질 필요는 없고, 단지 서열에 실질적으로 상보적이어서 안정적인 이중쇄 구조를 형성할 수 있으면 된다. 따라서, 이중쇄 구조를 형성할 수 있는 범위 내에서 완전한 상보성으로부터 이탈이 허용된다. 주형 핵산의 한 위치에 대한 DS oligo의 어닐링은 중합효소에 의한 주형-의존적 중합반응을 위한 전제조건이다. DS oligo가 상보적인 핵산에 염기쌍을 형성한 요소들(참조 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985))은 실질적으로 프라이밍 효율에 영향을 준다. DS oligo의 뉴클레오타이드 조성은 어닐링이 최적화 되는 온도에 영향을 주며 결국 프라이밍 효율에 영향을 줄 수 있다.
어닐링 단계 동안에 DS oligo의 5’-고 Tm 특이성 부위와 3’-저 Tm 특이성 부위는 혼성화 부위 또는 특이성 결정 위치(즉, 이중 특이성 결정 위치)로서 중요한 역할을 하나, 반면에 분할 부위는 혼성화 위치로서 역할을 하지 않고 주형과 결합하지 않는다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 방법의 연장 단계에 사용될 수 있으며, 이는 E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다. 중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다.
본 방법에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 DS oligo와 주형 핵산 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 본 방법에서 어닐링 단계는 일반적으로 높은 엄격조건하에서 실시된다. 그러나 만약 본 방법이 미스매치 허용을 요구하는 방법에 적용된다면, 하나 이상(그러나, 제한된 개수)의 미스매치에도 불구하고 5’-고 Tm 특이성 부위와 3’-저 Tm 특이성 부위가 주형에 어닐링 하는 엄격 조건하에서 어닐링 단계를 수행하는 것이 바람직하다. 그러한 미스매치 허용은 유전적 다변성을 가진 유전자의 증폭 또는 검출에 있어 매우 유용하다. 엄격 조건은 공지된 기준으로부터 쉽게 결정될 수 있다.
어닐링 단계는 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높은 어닐링 온도에서 실시하여 3'-저 Tm 특이성 부위 만에 의한 어닐링이 발생하지 않도록 하는 것이 유리하다. 바람직하게는 어닐링 온도는 3'-저 Tm 특이성 부위의 Tm 보다 최소 5℃, 보다 바람직하게는 최소 10℃, 보다 더 바람직하게는 최소 15℃ 및 가장 바람직하게는 최소 20℃ 높다.
바람직한 구현예에서, 어닐링 온도는 40-75℃, 보다 바람직하게는 45-72℃,보다 더 바람직하게는 50-68℃, 및 가장 바람직하게는 55-65℃이다. 본 방법에 적합한 어닐링 온도는 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm 값과 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm 값을 독립적으로 고려함으로써 결정될 수 있다. 즉 본 방법의 어닐링 온도는 5’-고 Tm 특이성 부위 및 3’-저 Tm 특이성 부위 모두의 전체 길이와 전체 뉴클레오타이드 조성에 의해 결정되는 것이 아니라, 5’-고 Tm 특이성 부위 및/또는 3’-저 Tm 특이성 부위의 개별적 길이와 뉴클레오타이드 조성에 의해 결정된다. 보통 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm 값만을 고려하여 어닐링 온도를 결정하게 되며, 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm 값 보다 매우 높으며 이것이 최적의 것이 된다.
어닐링 단계에서 미스매치 허용이 요구된다면 어닐링 온도가 위에서 제시된 것보다 낮도록 조정하는 것이 바람직하다.
본 방법은 특정 목적을 달성하기 위해 공지의 다른 과정과 결합될 수 있다. 예를 들어, 제조된 산물의 분리(또는 정제)는 연장과정에 후속될 수 있다. 상기 과정은 겔 전기영동, 컬럼 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 또는 혼성화에 의해 실시될 수 있다. 또한, 본 발명의 증폭 산물은 적합한 클로닝 벡터에 삽입될 수 있다. 또한, 본 발명의 제조 산물은 발현 벡터를 가지는 적합한 숙주에서 발현될 수 있다.
Ⅱ. 타깃 핵산 서열 증폭에 응용
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 프라이머로서 한쌍의 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여, 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성 과정을 적어도 두 사이클을 실시하여 타깃 핵산 서열을 증폭시키는 단계를 포함하고; 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드는 5’-고 Tm 특이성 부위, 3’-저 Tm 특이성 부위 및 분할 부위 세 개의 부위를 포함하며, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위는 혼성화되는 상기 타깃 핵산의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 분할 부위는 최소 두개의 유니버설 염기를 포함하고, 상기 3’-저 Tm 특이성 부위는 상기 타깃 핵산의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지고; 상기 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 상기 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 3개의 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고; 상기 분할 부위는 상기 5’-고 Tm 특이성 부위와 3’-저 Tm 특이성 부위가 상기 타깃 핵산에 어닐링되는 조건 하에서 비염기쌍 버블 구조를 형성하며; 상기 증폭 반응에서의 어닐링은 상기 3’-저 Tm 특이성 부위 단독에 의한 어닐링이 발생되지 않는 조건 하에서 실시되는 것을 특징으로 하는 DNA 또는 핵산 혼합물에서 타깃 핵산 서열을 선택적으로 증폭하는 방법을 제공한다.
본 발명의 증폭 방법은 본 발명의 DS oligo를 이용하기 때문에, 과도한 반복성을 초래하는 본 명세서의 복잡성을 피하기 위하여 공통된 내용은 그 기재를 생략한다. 또한 본 방법은 어닐링과 연장 과정을 포함하게 때문에 과도한 반복성을 초래하는 본 명세서의 복잡성을 피하기 위하여 두 방법에서의 공통된 내용은 그 기재를 생략한다. 예컨대, 사용된 DS oligo의 조성과 구조 및 어닐링과 연장을 위한 조건들은, 본 방법과 앞서 설명한 핵산분자를 제조하기 위한 방법 사이에서 공통된다.
본 발명의 DS oligo를 사용하는 본 응용은 핵산 증폭, 바람직하게는 PCR(중합효소 연쇄 반응)을 실시함으로써 하나의 핵산 또는 핵산 혼합물(DNA 또는 mRNA)에서 타깃 핵산 서열을 선택적으로 증폭하는 개선된 방법을 제공할 수 있다.
위에서 설명한대로 DS oligo를 사용하여 이중쇄 DNA의 타깃 핵산을 선택적으로 증폭하는 도시적 그림은 도 2에 묘사되었다. 도 2에서 보여 진 것처럼, DS oligo의 한 쌍은 변성된 이중쇄 DNA 주형에 어닐링 된다.
어닐링 동안에 5’-고 Tm 특이성 부위와 3’-저 Tm 특이성 부위는 혼성화 부위 또는 특이성 결정 위치(즉, 이중 특이성 결정 위치)로서 중요한 역할을 하나, 반면에 분할 부위는 혼성화 위치로서 역할을 하지 않으며 주형과 결합하지 않는다. 이 때 분할 부위는 두 말단 부위, 즉 5’-고 Tm 특이성 부위와 3’-저 Tm 특이성 부위를 공간적으로 분리시켜 DS oligo의 전체 특이성이 이중적으로 결정되도록 DS oligo에서 버블 구조를 형성한다. 후속의 반응의 상세 내용은, 상술한 당업계의 공지된 종래 프라이머-관련 핵산 증폭과 유사하다.
핵산 서열을 증폭하기 위한 본 방법은 공지된 다양한 프라이머-관련 핵산 증폭에 따라 수행될 수 있다. 바람직하게는 그 방법은 U.S. 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,15호에 개시된 PCR 공정, 보다 바람직하게는 핫 스타트 PCR 방법에 따라 수행될 수 있다.
도 3은 DS oligo를 사용하여 mRNA의 타깃 핵산을 선택적으로 증폭하는 것을 보여준다. 첫 번째 단계에서, 다양한 생물 시료에서 얻어진 mRNA는 mRNA의 폴리 A 테일에 혼성화 가능한 올리고 dT 프라이머 및 역전사효소를 사용하여 역전사된다. 역전사의 상세한 기작은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985))에서 찾을 수 있다. 후속의 반응의 상세한 내용은 상술한 공지의 종래 프라이머-관련 핵산 증폭의 것과 유사하다.
Ⅲ. 멀티플렉스
DNA
증폭에 응용
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 프라이머로서 둘 이상의 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드 쌍을 이용하여 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성 과정을 적어도 두 사이클을 실시하여 타깃 뉴클레오타이드 서열들을 증폭시키는 단계를 포함하며, 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드는 5’-고 Tm 특이성 부위, 3’-저 Tm 특이성 부위 및 분할 부위, 세 개의 부위를 포함하며, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위는 혼성화되는 상기 뉴클레오타이드 서열의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 분할 부위는 최소 두개의 유니버설 염기를 포함하고, 상기 3’-저 Tm 특이성 부위는 상기 타깃 뉴클레오타이드 서열의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지고, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 상기 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 3개의 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고; 상기 분할 부위는 상기 5’-고 Tm 특이성 부위와 3’-저 Tm 특이성 부위가 상기 타깃 뉴클레오타이드 서열에 어닐링되는 조건 하에서 비염기쌍 버블 구조를 형성하며; 증폭 반응에서의 어닐링은 3’-저 Tm 특이성 부위 단독에 의한 어닐링이 발생되지 않는 조건 하에서 실시되는 것을 특징으로 하는, 동일한 반응에서 동시에 두개 이상의 프라이머 쌍을 사용하여 두개 이상의 타깃 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 방법을 제공한다.
본 발명의 DS oligo를 사용한 본 응용은 동일한 반응에서 한 쌍 이상의 프라이머를 사용하여 한 개 이상의 타깃 서열을 증폭하는 개선된 방법을 제공한다. 일반적으로, 10개 이상의 타깃 서열을 동시에 증폭시키도록 멀티플렉스 PCR 조건을 설계하는 것은 상당히 어려운데, 그 이유는 하나의 특정 부위(locus)라도 비특이적 부산물 없이 증폭될 수 있도록 최적의 PCR 반응이 요구되기 때문이다. 반응에서 완벽한 DNA-DNA 매치가 발생하도록 하기 위해서는 충분히 높은 온도에서 어닐링이 이뤄지도록 할 필요가 있기 때문에, 본 발명의 DS oligo은 증폭의 특이성을 개선시키는 그의 기능 때문에 멀티플렉스 DNA 증폭의 최적화에 이상적이다. 본 명세서에서 사용된 “멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR)”은 하나의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 혼합물에서 멀티플렉스 DNA 타깃을 동시에 증폭하는 것을 의미한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 멀티플렉싱 공정은 상기 DS oligo의 프라이머쌍을 사용하여 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성 과정을 최소 두 사이클을 실시하는 단계를 포함하는 증폭 반응을 실시하는 단계를 포함하며, 상기 프라이머는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드로서 5’-고 Tm 특이성 부위, 3’-저 Tm 특이성 부위 및 분할 부위, 세 개의 부위를 포함하며, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위는 혼성화되는 상기 뉴클레오타이드 서열의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 분할 부위는 최소 두개의 유니버설 염기를 포함하고, 상기 3’-저 Tm 특이성 부위는 상기 타깃 뉴클레오타이드 서열의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지고, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 상기 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 3개의 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고; 상기 분할 부위는 상기 5’-고 Tm 특이성 부위와 3’-저 Tm 특이성 부위가 상기 타깃 뉴클레오타이드 서열에 어닐링되는 조건 하에서 비염기쌍 버블 구조를 형성하며; 증폭 반응에서의 어닐링은 3’-저 Tm 특이성 부위 단독에 의한 어닐링이 발생되지 않는 조건 하에서 실시되는 것을 특징으로 한다.
본 발명인 DS oligo를 사용한 본 응용은 하나 이상의 타깃 뉴클레오타이드 서열 및 프라이머 쌍을 사용하는 것을 제외 하고는, 앞서 설명한 핵산 서열의 증폭방법에 따라 실시되기 때문에, 과도한 반복성을 초래하는 본 명세서의 복잡성을 피하기 위하여 그들 간의 동일한 내용은 그 기재를 생략한다. 예컨대, 사용된 DS oligo의 조성 및 구조 그리고 증폭을 위한 조건 등은 앞서 설명한 핵산분자의 증폭방법과 공통된다.
바람직한 구현예에 따르면, 어닐링 온도는 약 40-70℃이고, 보다 바람직하게는 45-68℃, 보다 더 바람직하게는 50-65℃ 및 가장 바람직하게는 55-65℃이다.
바람직한 구현예에서, 타깃 뉴클레오타이드 서열 각각으로부터 증폭된 산물들은 추후 분석을 위해 크기가 다르다. 바람직한 구현예에 따르면, 멀티플렉스 타깃 뉴클레오타이드 서열의 증폭 산물은 크기분별을 통해 분석될 수 있다. 크기 분별 비교는 공지된 다양한 방법 즉, 폴리아크릴아미드 겔 매트릭스 또는 아가로스 겔 매트릭스를 통한 전기연동 및 뉴클레오타이드 시퀀싱을 통해 실시된다. 뉴클레오타이드 시퀀싱은 다양한 제조사로부터 구입가능한 자동화 서열기를 가지고 신속하게 실시될 수 있다.
아래 실시예에서 예시된 것처럼, 본 발명의 멀티플렉싱은, 공지된 종래 멀티플렉스 방법의 비-특이성 문제뿐만 아니라 백그라운드 문제를 제거한다.
멀티플렉스 증폭의 이점은 수많은 질병 또는 특이적 뉴클레오타이드 서열 변이(예, 단일 뉴클레오타이드다형성 또는 점 돌연변이)를 같은 반응에서 분석할 수 있다는데 있다. 동시에 분석할 있는 분석물의 수는 무제한이다; 그러나, 상한 제한은 약 20 개이며, 이는 분석을 위해서 요구되는 크기 차이 및 증폭된 산물을 분석할 수 있는 방법 등에 의존하는 것으로 판단된다.
본 발명의 방법은 유전적 및 전염성 질병의 진단, 성 결정, 유전적 연관 분석 및 범죄 과학 연구 등에 적용될 수 있다.
Ⅳ.
DNA
시퀀싱에 응용
상술한 개선된 특이성은, 용액-상(solution-phase) 시퀀싱(특히, 사이클링 시퀀싱)의 프라이머로서 또는 고상 시퀀싱(특히, 올리고뉴클레오타이드 칩 시퀀싱)의 프로브로서 DS oligo가 직접 시퀀싱(direct sequencing)에 사용되도록 한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 DNA 또는 핵산 혼합물에서 타깃 핵산분자를 시퀀싱하는 방법이 제공한다:
(a) 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 시퀀싱 프라이머로 이용하여 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성 과정을 적어도 두 사이클을 실시하여 시퀀싱할 상기 핵산분자에 상보적인 핵산분자를 제조하는 단계로서; 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드는 5’-고 Tm 특이성 부위, 3’-저 Tm 특이성 부위 및 분할 부위 세개의 부위를 포함하며, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위는 혼성화되는 상기 타깃 핵산 분자의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 분할 부위는 최소 두개의 유니버설 염기를 포함하고, 상기 3’-저 Tm 특이성 부위는 상기 타깃 핵산 분자의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지고; 상기 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 상기 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 3개의 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고; 상기 분할 부위는 상기 5’-고 Tm 특이성 부위와 3’-저 Tm 특이성 부위가 상기 타깃 핵산분자에 어닐링되는 조건 하에서 비염기쌍 버블 구조를 형성하며; 제조 반응에서의 어닐링은 3’-저 Tm 특이성 부위 단독에 의한 어닐링이 발생되지 않는 조건 하에서 실시되고; 그리고
(b) 상기 제조된 상보적인 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계.
일반적으로, DNA 시퀀싱은 막삼-길버트 시퀀싱, 생거 시퀀싱, 파이로시퀀싱 및 엑소뉴클레아제 절단 시퀀싱 같은 다양한 방법에 의해 실시되어 왔다. 본 발명의 시퀀싱 방법은 열 사이클 시퀀싱뿐만 아니라 파이로시퀀싱을 개선한다.
본 방법은 생거 다이디옥시 방법의 다양한 변형된 방법에 따라 실시될 수 있다. 본 발명의 열 사이클 시퀀싱은 PCR 증폭된 핵산 주형에 대하여 실시될 수 있다. 또한 본 발명에 따르면, 열 사이클 시퀀싱은 시퀀싱 전에 PCR 증폭되지 않은 핵산 주형에 대하여 실시될 수 있다.
간략하게, 생거 시퀀싱은, DNA 중합효소가 2’,3’-다이디옥시뉴클레오타이드를 핵산 연쇄에 삽입하여 연쇄 반응을 종결시키는 것에 근거한다(Sanger et al., (1977) PNAS . USA 74:5463). 생거에 의해 발명된 상기 방법은 다이디옥시 연쇄 종결 방법을 의미한다. 이 방법의 가장 전통적인 과정에서, 시퀀싱 대상의 DNA 절편은 M13과 같은 단일쇄 DNA 파아지에 클로닝 된다. DNA 중합효소Ⅰ의 클레나우 단편에 의하여 상보적 가닥이 프라이밍 합성될 때, 상기 파아지 DNA는 주형으로 이용된다. 상기 프라이머는 클로닝 된 인서트의 3’말단 가까운 곳의 M13 벡터 구역과 특이적으로 혼성화하기 위해 제조된 올리고뉴클레오타이드이다. 네 개의 시퀀싱 반응 각각에서, 4종의 디옥시뉴클레오타이드 중 1종에 대한 다이디옥시 유사체의 충분한 양이 존재하는 하에서, 프라이머밍 합성이 실시되며, 이에 의해 상기 종결-말단 뉴클레오타이드의 삽입에 의해 무작위적으로 연장 반응이 종결된다. 다이디옥시의 디옥시 형태에 대한 상대적인 농도는, 겔 전기연동을 통해 분석될 수 있는 모든 가능한 연쇄 길이에 해당하는 일련의 종결 반응이 이루어지도록 조절된다. 합성되는 연쇄에서 삽입되는 표지(tag)는, 전기연동 각 트랙에서 DNA 패턴의 오토라디오그램 이미지를 얻는데 사용된다. 클로닝 된 핵산 주형에서 디옥시뉴클레오타이드의 서열은 4개의 레인에서 밴드의 패턴을 조사함으로써 결정된다.
생거 방법의 변형으로서, 열 사이클 시퀀싱 방법은 일반적으로 핵산 시퀀싱 프라이머, 디옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트, 하나 이상의 다이디옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트(ddNTPs), 적절한 완충액, 열 안정 DNA 중합효소(예, Taq 중합효소) 및 시퀀싱 될 핵산 주형을 포함하는 용액의 사용을 포함한다. 열 사이클 시퀀싱의 상세한 내용은 U.S. Pat. Nos. 5,432,065, 5,723,298, 5,756,285, 5,817,797 and 5,831,06에서 찾을 수 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 상기 방법의 공정은 일반적으로 일반적인 PCR과 유사한 열 사이클링 조건하에서 실시된다.
핵산 주형에 대하여 시퀀싱 반응을 실시하고, 이어 반응 산물들을 분석하여 서열을 결정한다. 상당한 수의 검출 방법들이 공지되었다. 이러한 방법들은 Ausubel, F. M. 등, Current Protocols in Molecular Biology, (1993) John Wiley & Sons, Inc., New York에서 설명된 것처럼 일반적으로 라디오뉴클레오타이드, 형광, 적외선 및 화학발광 레이블 등을 포함하는 표지의 검출을 포함한다.
레이블은 프라이머 또는 ddNTP, 바람직하게는 ddNTP로 표지될 수 있다. 가장 바람직한 레이블은 6-카르복시플루오리세인, 6-카르복시-X-로다민, 3-(ε-카르복시페틸)-3'-에틸-5,5'-디메틸옥사카르보시아닌, 6-카르복시-X-로다민, 4,4-디플루오로-4-보라-3α,4α-디아자-s-인다세네-3-프로피온산 유도체 및 4,7-디클로로로다민 염색제 등을 포함하는 형광물질이다.
바람직하게는 어닐링 온도는 40-70℃, 보다 바람직하게는 45-68℃ 및 가장 바람직하게는 50-65℃이다.
본 방법은 아래의 실시예에서 보여지는 것처럼 타깃 핵산 분자의 높은 특이적 시퀀싱을 나타낸다. 보다 상세하게는, 마우스 태반-특이적 호메오박스 패밀리 유전자인 Psx1 및 Psx2는 DS oligo의 독특한 구조를 가지도록 디자인된 시퀀싱 프라이머를 사용하여 분별적으로 시퀀싱 될 수 있다. 시퀀싱 프라이머의 전체 서열들이 3'-저 Tm 특이성 부위에서 단지 하나의 염기가 차이가 있다는 점을 고려한다면, 상술한 분별적 시퀀싱을 보다 명확하게 파악할 수 있다.
놀랍게도, 본 발명은 지노믹 DNA 또는 cDNA 파풀레이션 내에 포함된 타깃 핵산 분자가 정제 또는 분리 없이도 직접 시퀀싱 되도록 한다. 지노믹 DNA 또는 cDNA 파풀레이션 내에 있는 타깃 핵산 분자를 성공적으로 직접 시퀀싱 했다는 보고는 아직까지 없다. 본 발명의 시퀀싱 방법이 총 RNA로부터 얻은 cDNA 파풀레이션 내에 포함된 타깃 핵산 분자를 직접적으로 시퀀싱 하도록 적용되는 경우, 본 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 주형 유도의 효소적 디옥시리보뉴클레오익 산 합성이 발생하기에 충분한 조건에서 mRNAs의 파풀레이션을 mRNA의 폴리 A 말단에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머와 접촉시키는 단계;
(b) 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머가 혼성환 된 상기 mRNA를 역전사하는 단계로서, 상기 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머가 혼성화된 mRNA에 상보적인 제 1차 cDNA쇄를 생성하는 단계;
(c) 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 시퀀싱 프라이머로 이용하여 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성 과정을 최소 두 사이클을 실시하여 시퀀싱할 제1차 cDNA쇄에 상보적인 핵산분자를 합성하는 단계로서; 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드는 5’-고 Tm 특이성 부위, 3’-저 Tm 특이성 부위 및 분할 부위 세개의 부위를 포함하며, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위는 혼성화되는 상기 타깃 핵산 분자의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 분할 부위는 최소 두개의 유니버설 염기를 포함하고, 상기 3’-저 Tm 특이성 부위는 상기 타깃 핵산 분자의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지고; 상기 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 상기 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 3개의 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고; 상기 분할 부위는 상기 5’-고 Tm 특이성 부위와 3’-저 Tm 특이성 부위가 상기 타깃 핵산분자에 어닐링되는 조건 하에서 비염기쌍 버블 구조를 형성하며; 상기 합성 반응에서의 어닐링은 3’-저 Tm 특이성 부위 단독에 의한 어닐링이 발생되지 않는 조건 하에서 실시되고; 그리고
(d) 상기 제조된 제1차 cDNA쇄의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계.
Ⅴ.
유전적 다변성을 가진 핵산분자의 검출에 응용
본 발명의 다른 태양에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드의 주형-의존적 연장반응에 의해 유전적 다변성을 가진 핵산분자를 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 주형 핵산 분자에 어닐링시키는 단계로서, 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드는 5’-고 Tm 특이성 부위, 3’-저 Tm 특이성 부위 및 분할 부위 세 개의 부위를 포함하며, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위는 혼성화 되는 상기 주형 핵산의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 분할 부위는 최소 두개의 유니버설 염기를 포함하고, 상기 3’-저 Tm 특이성 부위는 상기 주형 핵산의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지고; 상기 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 상기 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 3개의 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고; 상기 분할 부위는 상기 5’-고 Tm 특이성 부위와 3’-저 Tm 특이성 부위가 상기 주형 핵산에 어닐링되는 조건 하에서 비염기쌍 버블 구조를 형성하며, 상기 어닐링은 3’-저 Tm 특이성 부위 단독에 의한 어닐링이 발생되지 않고, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위 및/또는 상기 3’-저 Tm 특이성 부위가 그 타깃 위치에 대하여 하나 이상의 미스매치 염기를 가질 경우 발생하는 조건에서 어닐링이 발생하고; 그리고
(b) 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 연장하여 상기 주형에 상보적인 상기 핵산 분자를 제조하는 단계;
(c) 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드의 상기 주형-의존적 연장 반응의 발생 여부를 검출하는 단계.
본 발명의 DS oligo를 사용한 본 응용은 앞서 설명한 핵산 서열을 제조하기 위한 방법에 따라 실시되기 때문에, 과도한 반복성을 초래하는 본 명세서의 복잡성을 피하기 위하여 공통된 내용은 그 기재를 생략한다.
본 발명의 DS oligo를 사용하는 본 응용은, 어닐링과 연장 단계를 포함하는 주형-의존적 연장 반응에 의하여 유전적 다변성을 가진 핵산 서열을 선택적으로 검출하는 개선된 방법을 제공 할 수 있다. 특히 유전적 다변성을 가진 타깃 핵산 서열의 검출은 어닐링, 연장 및 변성 단계을 포함하는 주형-의존적 연장 반응의 과정을 반복함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명은 DS oligo의 미스매치 허용성(tolerance)에 기초한다.
유전적 다변성은 다양한 지놈에서 보고 되어있다. 이러한 현상은 관심 대상의 유전자 또는 지놈을 실패 없이 검출하는데 방해물로 간주되어 왔다. 본 발명은 미스매치 허용성을 가진 DS oligo을 사용하여 그러한 종래 문제를 해결하는 방법을 제공한다. 일정한 서열을 가진 DS oligo는 유전적 다변성을 보이는 여러 타깃 서열들에 어닐링될 수 있고, 결국 목적의 뉴클레오타이드 서열을 성공적으로 증폭하고 검출할 수 있다. 즉, 어닐링과 혼성화 특이성을 급격하게 향상시킬 목적으로 처음에 발명된 DS oligo는, 어닐링 또는 엄격 조건이 적절하게 조절되는 조건 하에서 미스매치 허용성을 요구하는 방법에도 사용될 수 있다.
*미스매치 허용성을 나타내는 DS oligo를 제공하기 위하여, 얻을 수 있는 모든 뉴클레오타이드 서열들을 정렬하여 파악된 핵산 분자의 보존 구역에 기초하여 DS oligo를 디자인 하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 사용된 용어“보존 구역(conserved region)"은 다양한 여러 뉴클레오타이드 서열 간에 상당히 유사한, 유전자의 뉴클레오타이드 서열 또는 단백질의 아미노산 서열의 단편을 의미한다. 이 용어는 용어“보존 서열(conserved sequence)”과 혼용된다.
바람직한 구현예에서, 보존 구역내의 가장 보존된 서열은 DS oligo의 3'-말단 부위에 위치하고, 가장 낮게 보존된 서열은 분할 부위에 위치한다. 5’-고 Tm 특이성 부위 및/또는 3’-저 Tm 특이성 부위, 바람직하게는 5'-고 Tm 특이성 부위는 DS oligo의 미스매치 허용성 때문에 타깃 위치에 하나 이상, 바람직하게는 하나 내지 세 개, 보다 바람직하게는 하나 또는 두개의 미스매치 염기를 갖는다. DS oligo에 미스매치 허용성을 부과하기 위해, 어닐링 조건, 특히 어닐링 온도는 중요하다. 상기 어닐링은 5'-고 Tm 특이성 부위 및/또는 3'-저 Tm 특이성 부위가 하나 이상의 미스매치 염기를 가지는 경우, 3’-저 Tm 특이성 부위 단독에 의한 어닐링이 발생되지 않으나 모든 부위에 의한 어닐링이 발생하는 조건하에서 실시된다.
바람직하게는 어닐링 온도는 약 40-70℃, 보다 바람직하게는 45-68℃, 그리고 가장 바람직하게는 50-65℃이다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 따라 실시된다.
본 방법의 검출 단계는 다수의 종래 기술에 의해 실시될 수 있다. 예컨대, 겔 상에서 검출하기 충분한 산물을 생성하도록 본 발명의 방법이 반복하여 실시되는 경우, 주형-의존 연장 산물의 검출은 종래의 겔 전기연동에 의해 용이하게 실시될 수 있다. 분광학적 측정, 광화학적 측정, 생화학적 측정, 생전자적 측정, 면역화학적 측정, 전자적 측정 및 화학적 측정에 의해 검출가능 한 레이블을 포함하는 경우, 주형-의존적 연장 반응의 발생여부를 검출하기 위하여 적당한 측정이 실시될 수 있다.
유전적 다변성은 바이러스 지놈에서 가장 빈번히 발견되고 발생한다(Nathalie B. et al., (2004) Journal of Clinical Microbiology, 42, 3532; Tersa C.등, (2002) Journal of Infectious Diseases, 185, 1660; Takashi E. 등., (2004) Journal of Clinical Microbiology, 42, 126; and Elizabeth R. 등, (2001) Clinical Infectious Diseases, 32, 1227). 따라서 본 발명에 따라 검출될 유전적 다변성을 지닌 핵산 분자는, 유전적 다변성을 나타내는 바이러스의 핵산이 바람직하다. 예컨대, 유전적 다변성을 보이는 인간 메타뉴모바이러스를 PCR에 의해 검출하는데에 본 발명이 적용되는 경우, DS oligo 구조를 가지도록 디자인된 가장 바람직한 프라이머 세트는 제39서열 (5' 프라이머) 및 제40서열 (3' 프라이머) 또는 제39서열 및 제41서열 (3' 프라이머)에 기재되어 있다.
Ⅵ. 마이크로어레이에 고정된 DS oligo 을 사용하여 타깃 뉴클레오타이드 서열의 검 출에 응용
본 응용은 DS oligo-고정된 마이크로어레이 상에서 주형-의존적 반응을 반복실시 하여 타깃 뉴클레오타이드 서열을 검출하는 신규한 방법이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드의 주형-의존적 연장반응에 의해 핵산 시료에서 타깃 뉴클레오타이드 서열을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 혼성화, 주형-의존적 연장 및 변성 과정을 적어도 한 사이클 포함하는, 기질 상에 고정된 프로브로서의 이중 특이성 올리고 뉴클레오타이드를 연장하는 단계로서, 상기 혼성화는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 핵산 시료에 접촉시킴으로써 실시되고, 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드는 5’-고 Tm 특이성 부위(5’-high Tm specificity portion), 3’-저 Tm 특이성 부위(5’-low Tm specificity portion) 및 분할 부위(separation portion), 세 개의 부위를 포함하며, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위는 혼성화되는 상기 타깃 뉴클레오타이드 서열의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 분할 부위는 최소 두 개의 유니버설 염기를 포함하고, 상기 3’-저 Tm 특이성 부위는 상기 타깃 핵산의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지고; 상기 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 상기 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 3개의 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고; 상기 분할 부위는 상기 5’-고 Tm 특이성 부위와 3’-저 Tm 특이성 부위가 상기 타깃 뉴클레오타이드 서열에 어닐링 되는 조건 하에서 비 염기쌍 버블 구조를 형성하며, 증폭 반응에서의 어닐링은 3’-저 Tm 특이성 부위 단독에 의한 어닐링이 발생되지 않는 조건 하에서 실시되고; 그리고
(b) 주형-의존적 연장 반응의 발생여부를 분석하는 단계.
DS oligo-고정 마이크로어레이를 사용하여 핵산 시료에서 타깃 뉴클레오타이드 서열을 검출하기 위한 도시적 그림은 도 4에 나타나 있다.
DS oligo를 사용하는 본 방법은 최적화 절차에 의하여 결정되는 적합한 혼성화 조건 하에서 실시될 수 있다. 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 GC 양 그리고 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 예를 들어, 상대적으로 짧은 올리고뉴클레오타이드가 사용되는 경우 낮은 엄격조건이 바람직하다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인 할 수 있다.
DS oligo는 기질 상에 고정된다. 바람직한 기질은 막, 필터, 칩, 슬라이드, 물, 피버, 자기 또는 비자기 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 거대분자, 미세입자 및 모세관 튜브와 같은 적합한 고체 또는 반-고체 지지체를 포함한다. 고정화는 화학 반응 또는 자외선에 의한 공유결합에 의해 이루어진다. 본 발명의 구현예에서, DS oligo는 에폭시 화합물 또는 알데하이드 그룹을 포함하도록 변형된 유리 표면 또는 폴리리신-코팅된 표면에 결합된다. 또한 DS oligo는 연결자(예, 에틸렌 글리콜 올리고모 및 디아민)을 통해 기질에 결합된다. 포토리토그래피, 잉크제팅, 기계적 마이크로스팟팅 및 이의 유사 방법과 같은 종래 제조 기술에 의하여, DS oligo는 어레이 또는 어레이들로 제작될 수 있다.
본 방법에 따르면, 연장 단계에서 사용되는 dNTPs는 바람직하게는 레이블 된다. 레이블링을 위하여 분광학적 측정, 광화학적 측정, 생화학적 측정, 생전자적 측정, 면역화학적 측정, 전자적 측정 및 화학적 측정에 의해 검출 가능한 물질들이 사용된다. 예컨대 레이블에는 P32 및 S35 같은 방사능동위원소, 화학발광 화합물, 형광 마커와 염료 같은 분광학적 마커, 그리고 자기 레이블 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 염료에는 퀴노린 염료, 트리아릴메탄 염료, 프탈레인, 아조 염료 및 시아닌 염료 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 형광 마커에는 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine) 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 레이블링은 공지된 다양한 방법에 따라 실시된다.
기질에, 바람직하게는 고체 지지체에 고정화된 프로브로서의 DS oligo와 핵산 시료의 타깃 뉴클레오타이드 서열이 혼성화 된 다음, 타깃 뉴클레오타이드 서열과 혼성화된 DS oligo는 주형-의존적 단계에서 dNTPs, 바람직하게는 형광-레이블된 dNTPs 및 DNA 중합효소를 사용하여 연장된다. (a) 단계를 반복적으로 실시하여 DS oligo 모두 또는 대부분이 타깃 뉴클레오타이드 서열과 혼성화 되도록 하여, 보다 재현성 있는 혼성화 분석 결과를 얻을 수 있도록 하는 것이 바람직하다.
혼성화의 발생은 사용된 레이블 타입에 따라 공지된 다양한 방법들로 확인된다. 예컨대, 형광 현미경, 바람직하게는 콘포칼 형광 현미경이 형광 레이블을 검출하기 위하여 사용되고, 그러한 장치로 검출된 신호의 세기는 혼성화 정도에 비례하여 증가한다. 일반적으로 형광 현미경에는 혼성화 세기의 정량적인 이차원 이미지를 형성하는 스캐닝 장치가 부착된다. 그러한 장치로 검출되는 신호의 세기는 혼성화 정도와 주형-의존적 연장의 정도에 비례한다.