CN102559661B

CN102559661B - 一种新型连接酶反应介导的扩增方法及用途

Info

Publication number: CN102559661B
Application number: CN201210015431.6A
Authority: CN
Inventors: 王小波
Original assignee: XIAMEN GENEX BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Xiamen Daqi Bioscience Co ltd
Priority date: 2012-01-18
Filing date: 2012-01-18
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2032-01-18
Also published as: WO2013107287A1; US20150004606A1; US9850533B2; CN102559661A

Abstract

本发明涉及一种新型连接酶反应介导的扩增方法及用途，通过三条连接探针的连接酶反应实现下游的通用扩增及检测。通过将检测标签序列、上游引物标签序列和下游引物结合标签序列分别填入三条不同的连接探针中达到消除非特异信号干扰的效果。其中含检测标签序列的探针杂交于目标序列时形成囊状结构且囊状结构两侧的特异杂交序列形成“杂交共同体”。三条连接探针杂交于目标序列相邻的位置上，在连接酶的作用下最终形成一条包含三个“标签”序列的完整探针链，连接产物最终由通用PCR系统实现扩增。本发明还包含三条连接探针的试剂盒和芯片，及其用途，特别是基因序列分型检测中的用途。该技术实现了降低反应背景、增强性噪比、避免假阳性的目的。

Description

一种新型连接酶反应介导的扩增方法及用途

技术领域

本发明涉及一种扩增方法，尤其涉及一种连接酶反应介导的扩增方法。

背景技术

核酸检测技术已被广泛应用于分子遗传学、免疫学、肿瘤学及微生物学等方面的临床诊断。随着分子生物学的飞速发展，一些新的核酸检测方法也不断涌现，其中，连接酶依赖的检测技术就是其中的一类。连接酶是一种封闭DNA或RNA 链上缺口(Nick)的酶，借助NAD⁺或ATP水解提供的能量催化2条核酸单链的3`端羟基和5`端磷酸基团反应形成磷酸二酯键。连接酶依赖的检测技术主要是通过核酸杂交原理及其在缺口连接处的保真性实现的。1988年，Landegren首先发明了连接酶体外突变检测技术OLA，并利用该技术鉴定了编码导致地中海镰刀型细胞贫血症的β球蛋白的突变等位基因β^S和野生型等位基因β^A之间的单碱基差异。1991年，Barany提取出耐热连接酶并发展了连接酶检测反应(Ligase detection reaction, LDR)和连接酶链式反应(Ligase chain reaction, LCR)技术。这两项技术的提出对连接酶依赖的体外检测技术的发展及应用具有深远的意义，但是都存在非特异信号干扰、易用性差等问题。其后，连接酶反应技术结合PCR技术, 衍生出了一系列新的检测技术。如LDR/PCR、MLPA、PLP(Padlock probe)、MIP(Molecular inversion probe)等，这些技术主要通过连接酶反应实现目的基因的“特异转化”，再由PCR系统扩增转化后的特异产物实现检测。该类技术都表现出较高的检测通量，甚至能够实现>10000重的基因分型（MIP技术），但是都存在非特异信号的干扰较严重，容易出现假阳性的问题。这类技术的非特异信号主要来源于：1.非特异连接酶反应；2.非特异的PCR扩增。LDR/PCR、MLPA技术由于受到这两种非特异的影响，故检测的灵敏度有限，且非特异信号能被检测出，存在假阳性的风险。PLP及MIP技术采用了外切酶消化未连接杂交探针的方法，在一定程度上消除了杂交探针在PCR反应中的非特异扩增，但是当检测重数较高时，仍然会受到非特异连接的影响，假阳性的出现仍不可避免。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种克服连接酶反应及PCR的非特异信号干扰的扩增方法。该技术实现了降低反应背景、增强性噪比、避免假阳性等目的。

为解决上述问题，本发明提供一种新型连接酶反应介导的扩增方法，通过三条连接探针的连接酶反应实现下游的通用扩增及检测，其特征在于：每条连接探针由特异杂交序列及填入的标签序列组成，具体为：目标序列7从3’端到5’端分别分为A段，B段，C段和D段，连接探针a为A段的反向互补序列2加上一段上游引物标签序列1组成，即2－1；连接探针b为C段的反向互补序列3’，加上B段和C段之间的检测标签序列4和B段的反向互补序列3组成，即3’-4-3；连接探针c为一段下游引物结合标签序列6加上D段的反向互补序列5组成，即6－5；所述的序列1、4、6为不与目标序列杂交的序列。

所述的上游引物标签序列1、下游引物结合标签序列6和检测标签序列4的设计原则分别为：GC含量适中，Tm值为55-70℃，长度为18-35bp，与目标基因组无较高同源性。此处的无较高同源性是指同源性低于50%。

所述的序列2、3、3’、5为 GC含量适中，Tm值为50-70℃，与目标序列特异杂交。

所述的连接探针a、b和c的序列中除去序列1、4、6外均为特异杂交序列。。

本发明还提供一个试剂盒，包含上述的连接探针a、b和c，及试剂盒的用途。

本发明还提供一种芯片，包含上述的连接探针a、b和c，及芯片的用途。

所述目标序列的A、B、C和D段相互之间无间隔。

目标序列的GC含量适中，无重复序列或同源性较高的序列出现，连接探针特异杂交的位置最好不要有SNP或突变位点的出现，除非是SNP或突变检测实验中，SNP或突变位点最好位于连接探针的3’端。

本发明还涉及一种连接酶反应介导的扩增方法用途。

所述试剂盒、芯片和连接酶反应介导的扩增方法在进行基因序列分型、定量等检测中的用途。

本发明检测的是已知目标序列，可检测突变位点、SNP位点、各物种目标基因（如细菌及病毒的目标DNA）的定性及定量反应等。

本发明提供一种新型连接酶依赖的扩增方法——欧米伽探针技术（Omega probe technology），该方法是：在连接酶反应中，通过将检测标签序列、上游引物标签序列和下游引物结合标签序列分别填入三条不同的连接探针中达到消除非特异信号干扰的效果。中间连接探针形似“Ω”，我们形象地称之为欧米伽探针，所以称该方法为欧米伽探针技术。

欧米伽探针技术的关键组成是三条连接探针，每条连接探针由特异杂交序列及填入的标签序列组成，三条连接探针的标签序列分别为连接探针a的上游引物标签序列、连接探针b的检测标签序列、连接探针c的下游引物结合标签序列（如图1）。本发明技术方案是通过三条连接探针杂交于目标序列相邻的位置上，其中，连接探针b杂交于目标基因序列时形成囊状结构（即为填入的检测标签序列4），囊状结构两侧的特异杂交序列形成“杂交共同体”。三条连接探针在连接酶的作用下最终形成一条包含三个“标签”序列的完整探针链，该完整探针链即连接产物最终由通用PCR系统实现扩增。

本发明的方法和步骤为：基因组DNA模板经高温（98℃，5-10分钟）充分变性后，三条连接探针与待检基因位点DNA序列进行特异杂交（杂交于DNA序列上相邻的位置），杂交后经耐热连接酶（如Ampligase (Epicentre)、Taq DNA ligase (NEB)等）连接反应，形成一条完整的连接探针。该步反应旨在将目标DNA转化为连接后的完整探针。第二步是用一对通用引物同时扩增这些已连接的完整探针，未连接的探针不能被正常扩增，会出现线性扩增（右侧连接探针出现线性扩增）或非特异扩增（左侧或右侧探针与引物非特异结合扩增出非特异产物），而引导检测反应的欧米伽探针两端无引物标签序列和引物结合标签序列，不会出现非特异扩增，体系中检测不到非特异信号，故无非特异信号的干扰。

上游引物标签序列和下游引物结合标签序列来源于通用引物序列。本发明一个实施例中的上游通用引物F是序列: TGGAGCGACGATACGAAGATA（SEQ ID NO:11）；下游通用引物R是序列: GCTCCAAGATCCTATCTAGA（SEQ ID NO:12）。

本发明是一种新型的连接酶反应介导的扩增方法，不同于传统的依赖连接反应的扩增方法（如：LDR/PCR、MLPA、PLP及MIP等），该技术具有如下优点：

1. 针对一个待检测的基因序列设计三条连接探针，保证检测反应极高的特异性。尤其适用于同源性较高序列的分辨检测;

2. 消除非特异连接信号的干扰：本技术中的非特异连接产物在PCR中要么是线性扩增、要么存在少量的指数扩增，而这些产物均不会被检测出;

3. 避免非特异扩增信号的干扰：连接探针b不会出现非特异性扩增，而连接探针a和c与PCR引物间的少量非特异扩增则不会被检测出;

4. 三条连接探针中均加入标签序列，可在相同的扩增体系和检测体系下实现不同目标序列的高效扩增和检测;

5. 实验流程及操作时间短，检测系统开放，可通过实时PCR系统、芯片系统等实现检测;

6. 连接探针的长度较短（约35-60nt），易于设计和化学合成。

附图说明

附图1为本新型连接酶反应介导的扩增方法的检测原理。其中7为目标序列，目标序列从3’段到5’段，依次分为A、B、C、D。1为上游引物标签序列，2 为A段的反向互补序列，3 为B段的反向互补序列，3’为C段的反向互补序列，4为B段和C段之间的检测标签序列，5为D段的反向互补序列，6为下游引物结合标签序列。

附图2A、2B和2C均为普通及囊状结构杂交序列熔解曲线图，其中8 为连接探针2熔解曲线，9 为连接探针1熔解曲线，10为连接探针3熔解曲线，11为连接探针4熔解曲线，12为连接探针2熔解曲线，13为连接探针4熔解曲线，14为连接探针5熔解曲线。

附图3A为梯度稀释DNA的扩增曲线，3B为梯度稀释DNA的标准曲线；其中15为梯度稀释模板（加样量分别为1.0X10⁷、1.0X10⁶、1.0X10⁵、1.0X10⁴、1.0X10³、1.0X10²拷贝，从左至右依次排列）扩增曲线，16为阴性对照扩增曲线。

附图4A、4B、4C分别为三份人基因组DNA样本SNP基因分型检测结果，其中17为 FAM通道信号，对应基因型A；18 为HEX通道信号，对应基因型G。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例中使用仪器：实时荧光PCR仪（Rotor-gene 6000，德国QIAGEN公司），紫外可见分光光度计（ND-1000，美国NanoDrop 公司），台式微量离心机（德国Eppendorf公司），本技术方案实施例中所有序列合成均来自生工生物工程（上海）有限公司。连接酶为AmpligaseDNA Ligase Kit (5U/μL, 1000U, Epicentre)，所使用的基因组DNA样本来源于正常人的外周血提取，均采用Qiagen公司的DNeasy?Blood Kit并遵照其说明书的提取方式提取获得。外周血样品由厦门市妇幼保健院提供。标本的使用均获得当事人或其监护人的许可。

实施例1：多条连接探针的熔解曲线比较：

目标序列: CTGCAGGGAAATGTCTAGATTGGATCTTGC （SEQ ID NO:1）

连接探针1（与目标序列完全互补杂交）:

GCAAGATCCAATCTAGACATTTCCCTGCAG （SEQ ID NO:2）

连接探针2（与目标序列杂交形成囊状结构的杂交共同体，囊状结构位于其正中间，虚线位置的碱基组成囊状结构）:

GCAAGATCCAATCTAGGAATCTGGATTCAAAATCTTGACATTTCCCTGCAG

（SEQ ID NO:3）

连接探针3（与目标序列杂交形成囊状结构的杂交共同体，虚线位置的碱基组成囊状结构）:

GCAAGATCCAATCTAGACATTTGGAATCTGGATTCAAAATCTTCCCTGCAG

（SEQ ID NO:4）

连接探针4（与目标序列杂交形成囊状结构的杂交共同体，虚线位置的碱基组成囊状结构）:

GCAAGATCCAATCTAGACAGGAATCTGGATTCAAAATCTTTTTCCCTGCAG

（SEQ ID NO:5）

连接探针5: GCAAGATCCAATCTAGACA （SEQ ID NO:6）

通过Sybrgreen染料考察以上连接探针与目标序列的熔解过程。

25μL熔解体系为：75 mmol/L Tris-HCl pH 9.0，20 mmol/L（NH₄）₂SO₄ , 0.01℅ Tween 20, 50 mmol/L KCl,4 mmol/L Mg²⁺, 0.4 μmol/L连接探针。0.2 μmol/L目标序列，0.2μL Sybrgreen荧光染料。熔解分析程序为：95℃ 1分钟；40℃ 1分钟；40℃升温至90℃，整个升温过程采集相应的荧光信号。

结果显示：1、见普通及囊状结构杂交序列熔解曲线图2A，其中8 为连接探针2熔解曲线，9 为连接探针1熔解曲线，连接探针1、2与目标序列杂交后的熔解曲线图显示：囊状结构探针的熔解与普通探针的熔解一样，是一个独立的熔解过程，而不是囊状结构两侧分别熔解的过程，其熔解峰为独立的单峰。囊状结构探针的Tm值比相同探针的正常探针的Tm值低8℃左右。2、见普通及囊状结构探针熔解曲线图2B，其中10为连接探针3熔解曲线，11为连接探针4熔解曲线，12为连接探针2熔解曲线，连接探针2、3、4与目标序列杂交后的熔解曲线图显示：囊状结构在探针中的位置影响杂交Tm值，其位于探针的中间位置时对应的“杂交共同体”的Tm值最小。3、见普通及囊状结构探针熔解曲线图2C，其中13为连接探针4熔解曲线，14为连接探针5熔解曲线，连接探针4、5与目标序列杂交后的熔解曲线图显示囊状结构的杂交Tm值大于单独一侧的Tm值，进一步说明囊状结构探针的整体熔解现象。

实施例2：定量检测目标序列

选择一段人工合成的DNA序列为考察对象，针对该序列设计三条连接探针分别杂交于目标序列相邻的位置上，具体序列如下：

目标序列：

CTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGCTACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGA （SEQ ID NO:7）

连接探针a：

TGGAGCGACGATACGAAGATATCATATTCCTCAACATGTCTGC （SEQ ID NO:8）

连接探针b：

PO4-TATACTGCTTAAATTTAACTTCGGTCCTTCATCGCTGGTAGCATCATATTGC

（SEQ ID NO:9）

连接探针c：

PO4-CCAGGTACAGGAGACTGTGTAGTCTAGATAGGATCTTGGAGC

（SEQ ID NO:10）

其中，连接探针a的上游引物标签序列为通用引物F序列，连接探针c的下游引物结合标签序列为通用引物R的反向互补序列：

通用引物F: TGGAGCGACGATACGAAGATA （SEQ ID NO:11）

通用引物R: GCTCCAAGATCCTATCTAGA （SEQ ID NO:12）

中间连接探针的检测标签序列为FAM标记的Taqman探针序列（FAM-AACTTCGGTCCTTCATCGCT-BHQ，序列部分为SEQ ID NO:13），三条连接探针杂交于目标序列相邻位置上，连接酶反应后经PCR扩增实现定量检测的目的。

目标序列十倍梯度稀释获取浓度分别为1.0′10⁷、1.0′10⁶、1.0′10⁵、1.0′10⁴、1.0′10³、1.0′10²拷贝的DNA，选择此梯度DNA为定量检测模板。

实验体系：1.连接反应：10μL反应体系中含1μL杂交连接缓冲液、25fmol的每条连接探针、1U的连接酶，5μL的DNA模板；连接反应程序为：95℃ 1分钟，60℃ 10分钟，55℃ 10分钟，50℃ 10分钟；2.PCR反应：25μL 反应体系内含2μL第一步连接产物，75 mmol/L Tris-HCl pH 9.0，20 mmol/L（NH₄）₂SO₄ ，0.01℅ Tween 20，50 mmol/L KCl，1 U Taq酶，3 mmol/L Mg²⁺，0.2 μmol/L Taqman探针，0.4μmol/L通用引物F和0.4μmol/L通用引物R；PCR反应程序为：95℃ 3分钟；95℃ 15秒，58℃ 30秒 50个循环；58℃退火延伸阶段采集FAM荧光信号。

梯度稀释模板的扩增曲线为：FAM通道均出现扩增信号且扩增曲线呈现梯度，随模板拷贝数的降低，扩增曲线Ct值（PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时对应的循环数）逐渐增加。阴性对照（NTC）无扩增信号出现（图3A）。梯度稀释模板标准曲线为：其Ct值与起始DNA拷贝数线的对数呈良好的线性关系（R²=0.99），体现该方法较佳的定量能力(图3B)。

实施例3：三份人基因组DNA样本SNP基因分型检测

选择SNP位点（rs740598）为研究对象，设计四条连接探针如下：

连接探针a：

TGGAGCGACGATACGAAGATACCAAATATTTTTCGTAAGTATTTCAAAT

（SEQ ID NO:14）

连接探针b－1：

PO4-AGCAATGGCTCGTCCATCTCTAAGGCAAGGCTCTATGGTTAGTCTCA

（SEQ ID NO:15）

连接探针b－2：

PO4-AGCAATGGCTCGTCACCTTCCGTCTGTACTCGTTATGGTTAGTCTCG

（SEQ ID NO:16）

连接探针c：

PO4-CAGCCACATTCTCAGAACTGCTCTAGATAGGATCTTGGAGC （SEQ ID NO:17）

其中，连接探针a、c的标签序列同实施例二，连接探针b－1的检测标签序列为FAM标记Taqman探针序列（FAM-CATCTCTAAGGCAAGGCTC-BHQ,序列部分为SEQ ID NO:18），对应杂交于基因型为A的模板，连接探针b－2的检测标签序列为TET标记的Taqman探针序列（TET-ACCTTCCGTCTGTACTCGT-BHQ，序列部分为SEQ ID NO:19），对应杂交于基因型为G的模板。连接探针a、c分别杂交于连接探针b的相邻两侧位置，连接酶反应后经PCR扩增实现分型检测的目的。

选择三份已知基因型的人基因组样本（浓度均为10ng/μL）为验证对象，样本A的基因型为AA，样本B的基因型为GG，样本C的基因型为AG。

实验体系：1.基因组DNA变性：取基因组DNA各5μL（总量50ng）于98℃温浴5分钟，随即降至25℃保存；2.连接反应：10μL反应体系中含1μL杂交连接缓冲液、25fmol的每条连接探针、1U的连接酶，5μL第一步已变性的基因组模板；连接反应程序为：95℃ 1分钟，60℃ 10分钟，55℃ 10分钟，50℃ 10分钟；3.PCR反应：25μL 反应体系内含2μL第二步连接产物，75 mmol/L Tris-HCl pH 9.0，20 mmol/L（NH₄）₂SO₄ ，0.01℅ Tween 20，50 mmol/L KCl，1 U Taq酶，3 mmol/L Mg²⁺，0.15 μmol/L各Taqman探针，0.4μmol/L通用引物F和0.4μmol/L通用引物R。PCR反应程序为：95℃ 3分钟；95℃ 15秒，58℃ 30秒 50个循环；58℃退火延伸阶段采集FAM和TET双色荧光信号。

见A样本SNP基因分型检测结果图4A：样本A的扩增曲线情况为： FAM（Green）通道（即17）出现扩增信号，TET（Yellow）通道（即18）未出现扩增信号，故验证其对应SNP位点为AA型；见B样本SNP基因分型检测结果图4B：样本B的扩增曲线情况为：FAM（Green）通道未出现扩增信号，TET（Yellow）通道出现扩增信号，故验证其对应SNP位点为GG型；见C样本SNP基因分型检测结果图4C：样本C的扩增曲线情况为：FAM（Green）通道出现扩增信号，TET（Yellow）通道也出现扩增信号，故验证其对应SNP位点为AG型。

SEQUENCE LISTING

<110> 厦门基科生物科技有限公司

<120> 一种新型连接酶反应介导的扩增方法及用途

<130> P5907

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ctgcagggaa atgtctagat tggatcttgc 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gcaagatcca atctagacat ttccctgcag 30

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gcaagatcca atctaggaat ctggattcaa aatcttgaca tttccctgca g 51

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gcaagatcca atctagacat ttggaatctg gattcaaaat cttccctgca g 51

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gcaagatcca atctagacag gaatctggat tcaaaatctt tttccctgca g 51

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gcaagatcca atctagaca 19

<210> 7

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg atgctaccaa atttaagcag tatagcagac 60

atgttgagga atatga 76

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

tggagcgacg atacgaagat atcatattcc tcaacatgtc tgc 43

<210> 9

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

tatactgctt aaatttaact tcggtccttc atcgctggta gcatcatatt gc 52

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

ccaggtacag gagactgtgt agtctagata ggatcttgga gc 42

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

tggagcgacg atacgaagat a 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

gctccaagat cctatctaga 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

aacttcggtc cttcatcgct 20

<210> 14

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

tggagcgacg atacgaagat accaaatatt tttcgtaagt atttcaaat 49

<210> 15

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

agcaatggct cgtccatctc taaggcaagg ctctatggtt agtctca 47

<210> 16

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

agcaatggct cgtcaccttc cgtctgtact cgttatggtt agtctcg 47

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

cagccacatt ctcagaactg ctctagatag gatcttggag c 41

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

catctctaag gcaaggctc 19

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

accttccgtc tgtactcgt 19

Claims

1.一种连接酶反应介导的扩增方法，采用连接探针a、b、c介导扩增，其特征在于：每条连接探针由特异杂交序列及填入的标签序列组成，具体为：目标序列7从3’端到5’端分别分为A段，B段，C段和D段且仅由A，B，C和D段组成，所述A、B、C和D段相互之间无间隔；连接探针a为A段的反向互补序列2加上一段上游引物标签序列1组成，即2－1，反向互补序列2和上游引物标签序列1之间直接相连，没有间隔；连接探针b为C段的反向互补序列3’，加上B段和C段之间的检测标签序列4和B段的反向互补序列3组成，即3’-4-3；连接探针c为一段下游引物结合标签序列6加上D段的反向互补序列5组成，即6－5；所述的序列1、4、6为不与目标序列杂交的序列；所述的上游引物标签序列1、下游引物结合标签序列6和检测标签序列4的设计原则分别为：GC含量适中，Tm值为55-70℃，长度为18-35nt，与目标基因组无较高同源性，所述无较高同源性是指同源性低于50%；所述的序列2、3、3’、5为 GC含量适中，Tm值为50-70℃，与目标序列特异杂交；所述的连接探针a、b和c的序列中除去上游引物标签序列1、检测标签序列4、下游引物结合标签序列6外均为特异杂交序列；所述a、b、c三条连接探针杂交于所述目标序列相邻的位置上，三条连接探针在连接酶的作用下最终形成一条包含三个标签序列的完整探针链；其中连接探针b 杂交于目标基因序列时形成囊状结构，囊状结构两侧的特异杂交序列形成杂交共同体；所述扩增方法为基因组DNA模板经高温充分变性后，所述三条连接探针a、b、c与待检基因位点DNA序列进行特异杂交经耐热连接酶连接反应，形成一条完整的连接探针；再用一对通用引物同时扩增已连接的完整探针即可。

2.一个试剂盒，包含权利要求1所述的连接探针a、b和c。

3.权利要求1的连接酶反应介导的扩增方法及权利要求2的试剂盒的用途，所述用途是指在进行基因序列分型、各物种目标基因定量检测中的用途。

4.权利要求1的连接酶反应介导的扩增方法所用连接探针a、b和c的制备方法，其步骤为，选定模板的目标序列7，将其从3’端到5’端分别分为相互不间隔的A、B、C、D段且仅由A，B，C和D段组成，A的反向互补序列为序列2，B的反向互补序列为序列3，C的反向互补序列为序列3’，D的反向互补序列为序列5，其中连接探针a即为序列2加上上游引物标签序列1，连接探针b为序列3加上检测标签序列4加上序列3’，连接探针c为下游引物结合标签序列6加上序列5，其中上游引物标签序列1、检测标签序列4、下游引物结合标签序列6为GC含量适中，Tm值为55-70℃，长度为18-35bp，与目标基因组无较高同源性的序列，所述无较高同源性是指同源性低于50%；其中的序列2、3、3’、5的GC含量适中，Tm值为50-70℃，按照连接探针a、b、c的序列，化学合成即可；所述a、b、c三条连接探针杂交于所述目标序列相邻的位置上，三条连接探针在连接酶的作用下最终形成一条包含三个标签序列的完整探针链；其中连接探针b 杂交于目标基因序列时形成囊状结构，囊状结构两侧的特异杂交序列形成杂交共同体。