KR20070111543A - 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 사용한 방법 및 이중특이성 올리고뉴클레오타이드 - Google Patents
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Abstract
Description
Claims (59)
- 다음의 단계를 포함하는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 주형-의존적 연장 반응에 의해 핵산분자를 제조하는 방법:(a) 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 주형 핵산 분자에 어닐링시키는 단계로서, 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드는 5’-고 Tm 특이성 부위(5’-high Tm specificity portion), 3’-저 Tm 특이성 부위(5’-low Tm specificity portion) 및 분할 부위(separation portion), 세개의 부위를 포함하며, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위는 혼성화되는 상기 주형 핵산의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 분할 부위는 최소 두 개의 유니버설 염기를 포함하고, 상기 3’-저 Tm 특이성 부위는 상기 주형 핵산의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지고; 상기 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 상기 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 3개의 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고; 상기 분할 부위는 상기 5’-고 Tm 특이성 부위와 3’-저 Tm 특이성 부위가 상기 주형 핵산에 어닐링되는 조건 하에서 비염기쌍 버블 구조를 형성하며, 상기 어닐링은 3’-저 Tm 특이성 부위 단독에 의한 어닐링이 발생되지 않는 조건 하에서 실시되고; 그리고(b) 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 연장하여 상기 주형 핵산 분 자에 상보적인 핵산 분자를 제조하는 단계.
- 적어도 하나의 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 프라이머 세트를 이용하여, 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성 과정을 적어도 두 사이클을 실시하여 상기 타깃 핵산 서열을 증폭시키는 단계를 포함하고; 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드는 5’-고 Tm 특이성 부위, 3’-저 Tm 특이성 부위 및 분할 부위 세 개의 부위를 포함하며, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위는 혼성화 되는 상기 타깃 핵산의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 분할 부위는 최소 두 개의 유니버설 염기를 포함하고, 상기 3’-저 Tm 특이성 부위는 상기 타깃 핵산의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지고; 상기 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 상기 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 3개의 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고; 상기 분할 부위는 상기 5’-고 Tm 특이성 부위와 3’-저 Tm 특이성 부위가 상기 타깃 핵산에 어닐링되는 조건 하에서 비염기쌍 버블 구조를 형성하며; 상기 증폭 반응에서의 어닐링은 상기 3’-저 Tm 특이성 부위 단독에 의한 어닐링이 발생되지 않는 조건 하에서 실시되는 것을 특징으로 하는 DNA 또는 핵산 혼합물에서 타깃 핵산 서열을 선택적으로 증폭하는 방법.
- 프라이머 쌍 중 적어도 하나의 프라이머는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드인 둘 이상의 프라이머 쌍을 이용하여 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성 과정을 적어도 두 사이클을 실시하여 타깃 뉴클레오타이드 서열들을 증폭시키는 단계를 포함하며, 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드는 5’-고 Tm 특이성 부위, 3’-저 Tm 특이성 부위 및 분할 부위, 세 개의 부위를 포함하며, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위는 혼성화되는 상기 뉴클레오타이드 서열의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 분할 부위는 최소 두 개의 유니버설 염기를 포함하고, 상기 3’-저 Tm 특이성 부위는 상기 타깃 뉴클레오타이드 서열의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지고, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 상기 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 3개의 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고; 상기 분할 부위는 상기 5’-고 Tm 특이성 부위와 3’-저 Tm 특이성 부위가 상기 타깃 뉴클레오타이드 서열에 어닐링 되는 조건 하에서 비염기쌍 버블 구조를 형성하며; 증폭 반응에서의 어닐링은 3’-저 Tm 특이성 부위 단독에 의한 어닐링이 발생 되지 않는 조건 하에서 실시되는 것을 특징으로 하는, 동일한 반응에서 동시에 두 개 이상의 프라이머 쌍을 사용하여 두 개 이상의 타깃 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 방법.
- 다음의 단계를 포함하는, 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 DNA 또는 핵산 혼합물에서 타깃 핵산분자를 시퀀싱하는 방법:(a) 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 시퀀싱 프라이머로 이용하여 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성 과정을 적어도 두 사이클을 실시하여 시퀀싱할 상기 핵산분자에 상보적인 핵산분자를 제조하는 단계로서; 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드는 5’-고 Tm 특이성 부위, 3’-저 Tm 특이성 부위 및 분할 부위 세 개의 부위를 포함하며, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위는 혼성화되는 상기 타깃 핵산 분자의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 분할 부위는 최소 두 개의 유니버설 염기를 포함하고, 상기 3’-저 Tm 특이성 부위는 상기 타깃 핵산 분자의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지고; 상기 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 상기 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 3개의 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고; 상기 분할 부위는 상기 5’-고 Tm 특이성 부위와 3’-저 Tm 특이성 부위가 상기 타깃 핵산분자에 어닐링되는 조건 하에서 비염기쌍 버블 구조를 형성하며; 제조 반응에서의 어닐링은 3’-저 Tm 특이성 부위 단독에 의한 어닐링이 발생되지 않는 조건 하에서 실시되고; 그리고(b) 상기 제조된 상보적인 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계.
- 다음의 단계를 포함하는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드의 주형-의존적 연장반응에 의해 유전적 다변성을 가진 핵산분자를 검출하는 방법:(a) 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 주형 핵산 분자에 어닐링시키는 단계로서, 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드는 5’-고 Tm 특이성 부위, 3’-저 Tm 특이성 부위 및 분할 부위 세 개의 부위를 포함하며, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위는 혼성화 되는 상기 주형 핵산의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 분할 부위는 최소 두 개의 유니버설 염기를 포함하고, 상기 3’-저 Tm 특이성 부위는 상기 주형 핵산의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지고; 상기 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 상기 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 3개의 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고; 상기 분할 부위는 상기 5’-고 Tm 특이성 부위와 3’-저 Tm 특이성 부위가 상기 주형 핵산에 어닐링되는 조건 하에서 비염기쌍 버블 구조를 형성하며, 상기 어닐링은 3’-저 Tm 특이성 부위 단독에 의한 어닐링이 발생되지 않고, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위 및/또는 상기 3’-저 Tm 특이성 부위가 그 타깃 위치에 대하여 하나 이상의 미스매치 염기를 가질 경우 발생하는 조건에서 어닐링이 발생하고;(b) 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 연장하여 상기 주형에 상보적인 상기 핵산 분자를 제조하는 단계; 그리고(c) 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드의 상기 주형-의존적 연장 반응의 발생 여부를 검출하는 단계.
- 다음의 단계를 포함하는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드의 주형-의존적 연장반응에 의해 핵산 시료에서 타깃 뉴클레오타이드 서열을 검출하는 방법:(a) 혼성화, 주형-의존적 연장 및 변성 과정을 적어도 한 사이클 포함하는, 기질 상에 고정된 프로브로서의 이중 특이성 올리고 뉴클레오타이드를 연장하는 단계로서, 상기 혼성화는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 핵산 시료에 접촉시킴으로써 실시되고, 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드는 5’-고 Tm 특이성 부위(5’-high Tm specificity portion), 3’-저 Tm 특이성 부위(5’-low Tm specificity portion) 및 분할 부위(separation portion), 세 개의 부위를 포함하며, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위는 혼성화되는 상기 타깃 뉴클레오타이드 서열의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 상기 분할 부위는 최소 두개의 유니버설 염기를 포함하고, 상기 3’-저 Tm 특이성 부위는 상기 타깃 핵산의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지고; 상기 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 상기 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 3개의 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고; 상기 분할 부위는 상기 5’-고 Tm 특이성 부위와 3’-저 Tm 특이성 부위가 상기 타깃 뉴클레오타이드 서열에 어닐링 되는 조건 하에서 비 염기쌍 버블 구조를 형성하며, 증폭 반응에서의 어닐링은 3’-저 Tm 특이성 부위 단독에 의한 어닐링이 발생되지 않는 조건 하에서 실시되고; 그리고(b) 주형-의존적 연장 반응의 발생 여부를 분석하는 단계.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분할 부위내의 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2‘-디옥시이노신, 2-아자-2’-디옥시이노신, 2‘-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2’-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트 로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, 상기 유니버설 염기는 디옥시이노신, 1-(2’-디옥시 베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 8 항에 있어서, 상기 유니버설 염기는 디옥시이노신인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분할 부위는 유니버설 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 연속서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위는 3’-저 Tm 특이성 부위보다 길이가 긴 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3’-저 Tm 특이성 부위는 혼성화되는 상기 주형 핵산의 상기 위치에 대하여 완벽하게 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위는 15 내지 40 뉴클레오타이드 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 13 항에 있어서, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위는 15 내지 25 뉴클레오타이드 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분할 부위는 적어도 3 뉴클레오타이드 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분할 부위는 3 내지 10 뉴클레오타이드 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3’-저 Tm 특이성 부위는 3 내지 15 뉴클레오타이드 길이를 지니는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위는 15 내지 25 뉴클레오타이드 길이, 상기 분할 부위는 3 내지 10 뉴클레오타이드 길이 및 상기 3’-저 Tm 특이성 부위는 3 내지 15 뉴클레오타이드 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm는 40℃-80℃인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm는 10℃-40℃인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분할 부위의 Tm는 3℃-15℃ 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 어닐링은 45℃-68℃ 범위의 온도에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 타깃 핵산 서열의 제조는, 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드 어닐링, 연장 및 변성과정을 포함하는 주형-의존적 연장 반응의 과정을 반복함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 증폭반응은 중합효소 연쇄반응에 따라 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 시퀀싱할 타깃 핵산 분자는 지놈 DNA 또는 cDNA 파퓰레이션 내에 포함된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 상기 유전적 다변성을 지닌 핵산 분자는 유전적 다변성을 갖는 바이러스의 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
- 다음의 일반식으로 나타내는 주형-의존적 연장 반응에 의하여 핵산 분자를 제조하기 위한 이중 특이성 올리고뉴클레노타이드:5’-Xp-Yq-Zr-3'Xp는 혼성화 되는 주형 핵산의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성 화 뉴클레오타이드 서열을 가지는 5’-고 Tm 특이성 부위를 나타내며, Yq는 최소 두개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위를 나타내고, Zr는 주형 핵산의 한 위치에 대하여 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지는 3’-저 Tm 특이성 부위를 나타내며, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수이고, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고; 상기 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 상기 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 3개의 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고; 상기 분할 부위는 상기 5’-고 Tm 특이성 부위와 3’-저 Tm 특이성 부위가 상기 주형 핵산에 어닐링되는 조건 하에서 비염기쌍 버블 구조를 형성하여, 상기 주형 핵산에 대한 어닐링 특이성 측면에서 상기 5’-고 Tm 특이성 부위가 3’-저 Tm 특이성 부위로부터 분리되도록 하며, 상기 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 특이성은 5’-고 Tm 특이성 부위 및 3’-저 Tm 특이성 부위 둘 모두에 의해 결정되어 상기 올리고뉴클레오타이드의 전체 어닐링 특이성이 증가된다.
- 제 27 항에 있어서, 상기 분할 부위의 상기 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2‘-디옥시이노신, 2-아자-2’-디옥시이노신, 2‘-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3- 니트로피롤, 1-(2’-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드.
- 제 28 항에 있어서, 상기 유니버설 염기는 디옥시이노신, 1-(2’-디옥시 베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌인 것을 특징으로 하는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드.
- 제 29 항에 있어서, 상기 유니버설 염기는 디옥시이노신인 것을 특징으로 하 는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드.
- 제 27 항에 있어서, 상기 분할 부위는 유니버설 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 연속서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드.
- 제 27 항에 있어서, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위는 3’-저 Tm 특이성 부위보다 길이가 긴 것을 특징으로 하는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드.
- 제 27 항에 있어서, 상기 3’-저 Tm 특이성 부위는 혼성화되는 상기 주형 핵산의 상기 위치에 대하여 완벽하게 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드.
- 제 27 항에 있어서, 상기 p는 15 내지 40의 정수인 것을 특징으로 하는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드.
- 제 34 항에 있어서, 상기 p는 15 내지 25의 정수인 것을 특징으로 하는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드.
- 제 27 항에 있어서, 상기 q는 최소 3인 것을 특징으로 하는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드.
- 제 27 항에 있어서, 상기 q는 3 내지 10의 정수인 것을 특징으로 하는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드.
- 제 27 항에 있어서, 상기 r은 3 내지 15의 정수인 것을 특징으로 하는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드.
- 제 27 항에 있어서, 상기 p는 15 내지 25의 정수, 상기 q는 3 내지 10의 정수 및 상기 r은 3 내지 15의 정수인 것을 특징으로 하는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드.
- 제 27 항에 있어서, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm는 40℃-80℃인 것을 특징으로 하는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드.
- 제 27 항에 있어서, 상기 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm은 10℃-40℃인 것을 특징으로 하는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드.
- 제 27 항에 있어서, 상기 분할 부위의 상기 분할 부위의 Tm는 3℃-15℃ 인 것을 특징으로 하는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드.
- 다음의 단계를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 특이성을 올리고 뉴클레오타이드의 구조에 의해 이중적으로 결정되도록 하는 방법:(a) 타깃 핵산 서열을 선택하는 단계;(b) (ⅰ) 상기 타깃 핵산에 실질적으로 상보적인 혼성화 서열과 (ⅱ) 적어도 두 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위를 갖는 올리고뉴클레오타이드의 서열을 디 자인 하여 상기 분할 부위가 상기 혼성화 서열 사이에 끼여 들어가(intervene) 상기 올리고뉴클레오타이드에서 세 개의 부위를 형성하도록 하는 단계; 그리고(c) 상기 분할 부위의 5’-방향쪽의 부위는 분할 부위의 3’-방향쪽 부위보다 높은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 상기 세 부위에서 가장 낮은 Tm을 가지도록 상기 올리고뉴클레오타이드에서 상기 분할 부위의 위치를 결정하는 단계로서, 이에 의해 (ⅰ) 상기 올리고뉴클레오타이드의 5’-고 Tm 특이성 부위는 상기 타깃 핵산에 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지며, (ⅱ) 상기 올리고뉴클레오타이드의 3’-저 Tm 특이성 부위는 상기 타깃 핵산에 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지고; 그리고 (ⅲ) 상기 5’-고 Tm 특이성 부위와 3’-저 Tm 특이성 부위 사이의 상기 분할 부위는 적어도 두 유니버설 염기를 포함하며; 그리고 상기 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 상기 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높고 상기 분할 부위는 3개의 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가져, 서로 간에 다른 Tm 값을 지닌 세 개의 구분된 부위를 가지는 올리고뉴클레오타이드를 제공하며,상기한 구성에 의해 상기 올리고뉴클레오타이드의 타깃 핵산에 대한 어닐링 특이성은 상기 5’-고 Tm 특이성 부위 및 3’-저 Tm 특이성 부위에 의해 이중으로 결정된다.
- 제 43 항에 있어서, 상기 분할 부위의 상기 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2‘-디옥시이노신, 2-아자-2’-디옥시이노신, 2‘-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2’-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 44 항에 있어서, 상기 유니버설 염기는 디옥시이노신, 1-(2’-디옥시 베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 45 항에 있어서, 상기 유니버설 염기는 디옥시이노신인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 43 항에 있어서, 상기 분할 부위는 유니버설 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 연속서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 43 항에 있어서, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위는 3’-저 Tm 특이성 부위보다 길이가 긴 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 43 항에 있어서, 상기 3’-저 Tm 특이성 부위는 혼성화되는 상기 주형 핵산의 상기 위치에 대하여 완벽하게 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 43 항에 있어서, 상기 p는 15 내지 40의 정수인 것을 특징으로 하는 방 법.
- 제 50 항에 있어서, 상기 p는 15 내지 25의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 43 항에 있어서, 상기 q는 최소 3인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 43 항에 있어서, 상기 q는 3 내지 10의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 43 항에 있어서, 상기 r은 3 내지 15의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 43 항에 있어서, 상기 p는 15 내지 25의 정수, 상기 q는 3 내지 10의 정수 및 상기 r은 3 내지 15의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 43 항에 있어서, 상기 5’-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 40℃-80℃인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 43 항에 있어서, 상기 3’-저 Tm 특이성 부위의 Tm은 10℃-40℃인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 43 항에 있어서, 상기 분할 부위의 Tm은 3℃-15℃ 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 43 항에 있어서, 상기 주형-의존적 연장 반응은 중합효소 연쇄반응인 것을 특징으로 하는 방법.
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