WO2016122135A1 - 상보적 염기서열 내지는 미스-매치된 염기를 포함하는 상보적인 염기서열과 연결된 pcr 프라이머 및 이를 이용한 핵산 증폭 방법 - Google Patents

상보적 염기서열 내지는 미스-매치된 염기를 포함하는 상보적인 염기서열과 연결된 pcr 프라이머 및 이를 이용한 핵산 증폭 방법 Download PDF

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박해준
이선영
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Definitions

  • the present invention provides a nucleic acid amplification reaction comprising a mis-matched nucleotide sequence directly or complementarily to the 5 'position of a primer or a linker linkage (Nucleic acid polymerase chain reaction, hereinafter referred to as "PCR").
  • PCR Nucleic acid polymerase chain reaction
  • the primer and the use of the primer, and more specifically, using the Inosine directly or as a linker using a complementary base sequence containing a complementary or mis-matched base sequence at the 5 'end of the forward or reverse primer It relates to a PCR method and a complementary primer (Complementary primer, CP) and its use comprising the step of performing a PCR for the mixture after mixing the nucleic acid template to the PCR primer and the PCR composition comprising the primer.
  • Complementary primer, CP complementary primer
  • PCR components essential for molecular or nucleic acid diagnostics require DNA polymerase, primer pairs, dNTP, Mg ++ and other buffers. The widespread use of this reaction requires the amplification of highly specific and accurate target genes of interest.
  • primer & probe design In general, to proceed with PCR, information on the target gene to be detected is obtained and primer & probe design is performed. Although the designed primer sequence and length are designed to hybridize well to template DNA / RNA only at annealing temperature, off-target amplification often occurs. The cause is thought to be due to low temperature conditions during PCR master-mix preparation or thermal cycler ramping to initial denaturation temperatures (Chou, Q et al. Nucleic Acids Res., 1992, 20: 1717-1723). . Under these conditions, the primer is present at a higher concentration than the target, and partially complementary sites or primers undergo nonspecific reactions. These non-specific primer complexes competitively react to the desired target site reactions, inhibit the sensitivity and act as a cause of high background. In particular, primer dimers may produce complex mixtures of primer artifacts during PCR.
  • This technique is a method of increasing the temperature to maintain the specificity of the primer / target hybridization reaction, thereby preventing the DNA polymerase from interfering with the premature extension when preparing the pre-PCR mixture (Alexandre VL et al.Lebedev AV et.al., Nucleic Acids). Res., 2008, 36: e131.).
  • Another method is to physically separate the reaction components so that a PCR reaction does not occur (Quin chou et al., Nucleic Acids Res., 1992, 20: 1717-1723), and use of accessary proteins (Clark (DR et al. US Pat. No. 2006057617), a method using an antibody against DNA polymerase, and a Mg ++-pyrophosphate complex to prevent non-specific reactions at low temperatures (Bioneer) are also used.
  • the present invention solves the above problems and the object of the present invention is to provide a primer to increase the sensitivity and increase the non-specific reaction caused by the increase in amplification products in the PCR reaction.
  • Another object of the present invention is to provide a method for increasing sensitivity and decreasing non-specifically occurring reactions due to an increase in amplification products in a PCR reaction.
  • the present invention includes a mis-matching nucleotide linking an inosine linker or directly to the 5 'end of a primer for a corresponding gene sequence amplification.
  • the primers are complementary to the corresponding nucleotide sequences X a and X a of the corresponding sequences for amplifying a specific gene, and include mis-matched nucleotide sequences X ' a , wherein X a and X' a are universal bases or non- It is preferably a primer linked to the nucleotide sequence Y a of a non-discriminatory base.
  • the primer is preferably a primer in which the bubble structure of the mis-matched nucleotides is connected by at least one double stranded sequence, and the primer is one to four double strands in which the bubble structure of the mis-matched nucleotides is one. More preferred primers linked by sequence are not limited thereto.
  • a primer having a structure in which at least one bubble is contained in the double strand of X ' a and X a of the primer is preferable, and the double strand of X' a and X a of the primer More preferred primer having a structure containing one to three bubbles is not limited thereto.
  • the primer is preferably a primer comprising at least one base sequence number of mis-matched nucleotides in the complementary base sequence (X'a), the primer is a complementary base sequence More preferred are primers in which the number of mis-matched nucleotides in (X'a) comprises 3 to 12 nucleotide sequences.
  • a primer having a bubble structure including at least zero or more universal bases or non-differential bases in Ya of the primer is preferred, and 0 to 9 universal in Ya of the primer. More preferred primers having a bubble structure comprising a base or a non- discriminatory base are not limited thereto.
  • the primer is preferably at least one primer selected from the group consisting of the primers set forth in SEQ ID NO: 3 to 15, SEQ ID NO: 18 to 19, and SEQ ID NO: 22 to 29, but is not limited thereto.
  • the primers are preferably used in the forward position, reverse (Reverse) position for gene amplification or used together.
  • cDNA is synthesized by reverse transcriptase for reverse transcription using the primer of the present invention in the process of amplifying a specific gene sequence from RNA, and the cDNA is used as a template by using the primer of the present invention. It provides a method for amplifying a gene.
  • the method is preferably carried out in reverse transcription of the RNA template using the primer of the present invention, the specific gene amplification reaction is preferably performed in one step.
  • the present invention provides a composition for amplifying genes used in polymerase chain reaction method, real-time polymerase chain reaction method or isothermal amplification method for gene amplification for DNA and RNA containing the primer of the present invention as an active ingredient. .
  • the composition is Ta 'polymerase (5' ⁇ 3 'exonuclease) activity (polymerase), HotStart Taq polymerase, PFU polymerase and 5' ⁇ 3 'exonuclease (-), It is preferable to further include one or more polymerase selected from the group consisting of Klenow polymerase having 3 ' ⁇ 5' exonuclease (-) activity, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a kit for amplifying a specific gene for DNA and RNA of an infectious disease, hereditary disease, drug resistance, drug resistance and susceptible samples comprising the primer of the present invention as an active ingredient.
  • the primer according to the present invention may also include a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added to the base sequence of the primer and the primer set, respectively.
  • Primers and primer sets according to the present invention may include additional features that do not change the basic properties. That is, the nucleotide sequence can be modified using many means known in the art. Examples of such modifications include methylation, capping, substitution of one or more homologs of nucleotides and uncharged linkages, such as phosphonates, phosphoresteres, phosphoramidates or carbamates, or phosphorothioates or phosphorodithioates. Modification of the nucleotides to charged linkers, etc. is possible.
  • the nucleic acid may be one or more of nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, proteins such as poly Llysine, insertion agents such as acridine or psoralen, chelating agents such as metals, radioactive metals, iron oxidizing metals, and alkylating agents. It may have additional covalently linked residues.
  • the base sequence of the primer and primer set according to the present invention can be modified using a label that can provide a detectable signal directly or indirectly.
  • the primers and primer sets can include labels that can be detected using spectroscopy, photochemistry, biochemistry, immunochemistry or chemical means.
  • Useful labels include 32 P, fluorescent dyes, electron dense reagents, enzymes (generally used in ELISAS), biotin or hapten and proteins for which antiserum or monoclonal antibodies are available.
  • Primers and primer sets according to the present invention are suitable for cloning and restriction enzyme digestion of appropriate sequences and for phosphoester ester methods such as Narang (1979, Meth, Enzymol. 68: 90-99), Bocage et al. Chemically synthesized using any other well known methods including direct chemical synthesis, such as the ethylphosphoramidite method (1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), and the solid support method of US Pat. No. 44,58066. Can be.
  • Primer for PCR of the present invention by including a mis-matched nucleotide sequence in the complementary or complementary nucleotide sequence directly or linking the linker at the 5 'position is increased sensitivity and non-specificity caused by the increase in amplification products in the PCR reaction The purpose is to reduce the response.
  • the present invention relates to a PCR primer comprising a mis-matched nucleotide sequence in a complementary or complementary nucleotide sequence directly or linking a linker to the 5 'position of the primer, and more specifically, 5' of the forward or reverse primer.
  • the nucleic acid template was mixed with a PCR primer and a PCR composition comprising the primer using Inosine base, either directly or as a linker, using a complementary nucleotide sequence comprising terminally complementary or mis-matched nucleotide sequences. It relates to a PCR method comprising the step of performing a PCR.
  • PCR primer of the present invention has the advantage that it can reduce the non-specific reactions generated in the amplification reaction by including some mis-matched base sequence in the base sequence complementary or complementary to the base sequence.
  • the present invention provides a PCR primer in which a complementary nucleotide sequence including complementary nucleotide sequence or mis-matched nucleotide sequence to 5 ′ portion of a forward or reverse primer is directly or linked with a linker.
  • complementary base refers to a base having a sequence complementary to the base sequence of the forward or reverse primer, the direction of the base is located in the 5 'terminal direction of the forward or reverse primer.
  • the “mis-matched base sequence” included in the complementary base refers to a sequence that is mis-matched with a forward or reverse primer sequence.
  • the DNA base may be any of adenine, guanine, cytosine, thymine, and uridine. There is no When the number of mis-matched bases in the complementary primers is absent, the Tm value for the annealing of the primers is increased, and thus the amplification reaction is not performed because the nucleotide sequence of the template DNA is not well annealed.
  • the primer (CP) of the present invention generates bubbles according to the number of mis-matched bases, and the melting Tm decreases as the number of mis-matched bases increases. This results in one to three bubbles being formed at mis-matched base sites in the complementary sequence that is the bubble site.
  • the linking of the primer and the complementary primer may be directly linked, but also using a linker.
  • the base used is Inosine, and the number of Inosine bases is not particularly limited but is preferably in the range of 1 to 9.
  • the present invention also provides a composition for amplifying a PCR comprising DNA polymerase, dNTPs, a reaction buffer, and the PCR primer.
  • a conventional PCR buffer containing components such as Tris-HCl, KCl, (NH 4 ) 2 SO 4 , and MgCl 2 may be appropriately modified.
  • the dNTPs mean dATP, dTTP, dUTP, dGTP, and dCTP, and DNA polymerases that can be used are not limited to specific enzymes or hot start effects.
  • Taq DNA polymerase (5 '->3'exo +
  • Hot start Taq DNA polymerase (5'->3'exo +)
  • Vent DNA polymerase (5 '->3'exo- PCR was performed using Pfu DNA polymerase (3 '->5'exo +).
  • the PCR amplification primers can be used in a concentration range of 0.2 ⁇ 1uM, the appropriate primer concentration can be easily determined by those skilled in the art.
  • the present invention provides a PCR composition comprising the primer by using a PCR primer comprising a mis-matched nucleotide sequence in a complementary nucleotide sequence or a complementary nucleotide sequence directly or linked to a 5 'terminal portion of a primer to be amplified. It relates to a PCR amplification method comprising the step of performing a PCR on the mixture after mixing the nucleic acid template.
  • the PCR is performed by repeating denaturation, annealing and extension steps, and this PCR principle is clear to the party.
  • the denaturation, annealing and stretching temperatures are preferably carried out for 1 to 60 seconds at 85 to 95 °C, 1 to 60 seconds at 40 to 70 °C and 1 to 60 seconds at 50 to 75 °C, the temperature range and time is reaction It can adjust suitably according to conditions.
  • the melting temperature (hereinafter referred to as "Tm") is lowered by about 5 to 10 ° C, and 4 to 6 In the case of substitution, the melting temperature (hereinafter referred to as “Tm”) is lowered by about 10 to 20 ° C, and in the case of 7 to 12 substitutions, the melting temperature (hereinafter referred to as "Tm”) is lowered by about 20 to 30 ° C.
  • the temperature change of the Tm may vary somewhat depending on the type of DNA polymerase used, the length of the primer, the type of base in the primer, and the reaction conditions.
  • results of the following examples can be used to establish primer fabrication conditions that impart temperature equivalence in primer design for primer positions, and Tm, which can be generated by introducing linker and mis-matched bases at the appropriate positions in complementary base sequences. It is possible to produce a nucleotide sequence with a minimum difference of the value, thereby increasing the specificity of the PCR reaction. In addition, the specificity and sensitivity of PCR can be maintained regardless of exonulease (5 '-> 3, 3'-> 5 ') function of DNA polymerase.
  • the sensitivity is improved by increasing the amplification product in the nucleic acid amplification reaction using DNA or RNA as a template by including a complementary sequence or a Mis-matched sequence directly or at the 5 'position of a primer or an Inosine linker. It is effective in reducing the specific reactions that occur. These effects all work regardless of the type of DNA polymerase.
  • Figure 1 shows a sequence of amplifying double-stranded DNA using the primer (CP) of the present invention.
  • Figure 2 shows a sequence of amplifying single-stranded RNA using the primer (CP) of the present invention.
  • Figure 3 is one of the two primers required for nucleic acid amplification of the deoxyinosine contained in the bubble region 1 located at the target region 5'-end of the primer (CP) of the present invention by the method using the primer (CP) of the present invention The result depends on the number.
  • 4 and 5 are the results according to the number of nucleotides mis-matched (0, 3, 7, 12) to the bubble region 2 located in the complementary region of the primer (CP) of the present invention. 4 and 5 are the results of the method using the primer (CP) of the present invention one of two primers required for nucleic acid amplification.
  • Figure 6 is a method using one of the two primers required for nucleic acid amplification by using the primer (CP) of the present invention, including the bubble region 1 and bubble region 2 of the primer (CP) of the present invention 2, 3 4 results of the primer (CP) of the present invention.
  • FIG. 7 to 10 is one of two primers required for nucleic acid amplification using a primer (CP) of the present invention
  • Figure 7 Taq DNA polymerase, Figure 8 HotStart Taq DNA polymerase, Figure 9 Pfu DNA polymerization Enzyme, Figure 10 is the result of using Vent DNA polymerase.
  • 11 shows two primers required for nucleic acid amplification of the beta-actin gene in human gDNA using a forward primer and a reverse primer, respectively, as a primer (CP) of the present invention and both primers of the present invention (CP) This is the result of the amplification reaction.
  • 12 shows the results of amplification of two primers required for nucleic acid amplification of the GAPD gene in Rat gDNA using the primer (CP) of the present invention.
  • 13 to 15 show RT-PCR results according to cDNA synthesis temperature depending on the number of nucleotides mis-matched to bubble site 2 located at the complementary site of primer (CP) of the present invention.
  • HIV tat plasmid DNA was prepared by synthesizing HIV-1 isolate 10BR_PE064 (GI: 672918720, 5281-5700 bp) into plasmid DNA.
  • the primer (CP) of the present invention designed the forward and reverse primers for the HIV tat gene of the conventional method (Nucleic Acids Research, 36:20, 2008) as a target site, and the complementary sequence was located at the 5'-end. Complementary sequences contained 7 to 8 mis-matched sequences.
  • Inosine linkers were designed as shown in SEQ ID NOs: 3 to 10 in the bubble region 1 between the target region and the complementary sequence.
  • SEQ ID NO: 3 is a primer that does not include a linker in the bubble region 1
  • SEQ ID NO: 4 to 10 is the Inosine linker 1 (Ix1a, Ix1b, Ix1c), 3 (Ix3), 5 (Ix5), 7 (Ix7), 9 ( Ix9) dogs were designed.
  • the prepared primers use SEQ ID NO: 1 as the forward primer, using a mixture using SEQ ID NO: 2 as the reverse primer as a control, the test group forward the primer (CP) of the present invention for SEQ ID NO: 3 ⁇ 10 It was used as a primer, and a mixture using SEQ ID NO: 2 as a reverse primer was prepared.
  • a mixture for nucleic acid amplification reaction using the primers prepared a reaction mixture comprising 3.0 mM MgCl 2, 0.2 mM dNTPs (NEB), 1.75 U Taq DNA polymerase, 10 ng Human genomic DNA, 0.5 uM primer set.
  • the primer (CP) of the present invention (Ix9, Ix7, Ix5, Ix3, compared to the conventional primer (line 3 of Con) in the third line where the template concentration was reacted with 345 fg.
  • Amplification products of Ix1a, Ix1b, Ix1c, and Ix0 line 3) increased.
  • the conventional primer (line 2 of Con) in the line 2 of the template concentration 34 fg of the primer (CP) of the present invention (line 2 of Ix7, Ix5, Ix3, Ix1a, Ix1b, Ix1c, Ix0)
  • the amplification product increased.
  • HIV tat plasmid DNA was used as a template, and the primer (CP) of the present invention included one inosine in bubble region 1, and included 0, 3, 8, and 12 mis-matched sequences in bubble region 2, 11, 12, 4, 13 were produced.
  • the prepared primer is used as a forward primer, using a mixture using SEQ ID NO: 1 as a reverse primer as a control, the test group is the primer of the present invention for SEQ ID NO: 11, 12, 4, 13 ( CP) was used as a forward primer, and a mixture using SEQ ID NO: 2 as a reverse primer was prepared.
  • a mixture for nucleic acid amplification using the primers prepared a reaction mixture comprising 3.0 mM MgCl 2, 0.2 mM dNTPs, 1.75 U Taq DNA polymerase, 10 ng Human genomic DNA, 0.5 uM primer set.
  • M0 did not generate an amplification product as a result of using SEQ ID NO. 11, which does not include a mis-matched sequence, as a forward primer.
  • M3 is SEQ ID NO. 12 containing three mis-matched sequences.
  • the conventional primer (SEQ ID NO: 1) amplifies line 3 of M3 than line 3 of Con on lines 3 where 345 fg of the template DNA was reacted. Product increased. However, in lines 2, which reacted with 34.5 fg, no amplification product was identified in line 2 of M3.
  • M8 is SEQ ID NO: 4 including 8 mis-matched sequences
  • M12 is SEQ ID NO: 13 including 12 mis-matched sequences, which reacts 3.45 fg of the template DNA to the conventional primer (SEQ ID NO: 1).
  • the amplification products were confirmed in the first line, and in particular, it was confirmed that the amplification products increased the most in M8.
  • Example 3 effect analysis according to the number of bubbles of the primer (CP) of the present invention
  • the primer (CP) of the present invention includes Inosine in bubble region 1 and a mis-matched sequence in bubble region 2. Bubble region 1 produces one bubble and bubble region 2 produces one to three bubbles.
  • SEQ ID NO: 13 generates two bubbles, one in bubble region 1 and one in bubble region 2, and SEQ ID NO: 14 generates two bubbles in bubble region 1 and bubble region 2.
  • SEQ ID NO: 15 creates one bubble at bubble site 1 and three bubbles at bubble site 2.
  • CP primer of the present invention
  • SEQ ID NO: 2 a reverse primer mixture for nucleic acid amplification reaction
  • SEQ ID NO: 2 a reverse primer mixture for nucleic acid amplification reaction
  • SEQ ID NO: 2 a reverse primer mixture for nucleic acid amplification reaction
  • SEQ ID NO: 2 a reverse primer mixture for nucleic acid amplification reaction
  • SEQ ID NO: 2 a reverse primer mixture for nucleic acid amplification reaction
  • a reaction mixture was prepared comprising a 0.5 uM primer set.
  • the number of bubbles in A lines is 2
  • the number of bubbles in B lines is 3
  • the number of bubbles in C lines is 4, and the number of bubbles 2 to 4 is 2 as a result of using the primer (CP) of the present invention.
  • the amplification reaction was confirmed by the template DNA of 34.5 fg, and the amplification product was increased in line 3 using 345 fg than line 3 of Con.
  • the primer (CP) of the present invention In order to confirm the amplification reaction of the primer (CP) of the present invention according to the DNA polymerase used for nucleic acid amplification reaction, the primer (CP) of the present invention of SEQ ID NO: 4 is used as the forward primer and the reverse primer is used of SEQ ID NO: 2
  • the amplification reaction was analyzed by Taq DNA polymerase, HotStart Taq DNA polymerase, Vent DNA polymerase, and Pfu DNA polymerase.
  • Nucleic acid amplification reaction of Figure 7 is a mixture for the nucleic acid amplification reaction of the Taq DNA polymerase is a reaction mixture comprising 3.0mM MgCl2, 0.2mM dNTPs, 1.75U Taq DNA polymerase, 10ng Human genomic DNA, 0.5uM primer set Prepared.
  • the nucleic acid amplification reaction of Figure 8 is a mixture of the nucleic acid amplification reaction of the HotStart Taq DNA polymerase reaction containing 3.0mM MgCl2, 0.2mM dNTPs, 1.75U HotStart Taq DNA polymerase, 10ng Human genomic DNA, 0.5uM primer set A mixture was prepared.
  • the nucleic acid amplification reaction of Figure 9 is a mixture for the nucleic acid amplification reaction of the Pfu DNA polymerase is a reaction mixture comprising 2.0 mM MgSO4, 0.2 mM dNTPs, 1.75 U Pfu DNA polymerase, 10ng Human genomic DNA, 0.5uM primer set Prepared.
  • the nucleic acid amplification reaction of Figure 10 is a mixture for the nucleic acid amplification reaction of the Vent DNA polymerase is 1x buffer (20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4) 2 SO 4, 10 mM KCl, 2 mM MgSO 4, 0.01% TritonX-100, pH 8.8), 0.2 mM dNTPs, 1.75 U Vent DNA polymerase, 10 ng Human genomic DNA, 0.5 uM primer set were prepared.
  • the amplification product was not identified in line 1 of Con using the template DNA 3.45 fg, but the amplification product was identified in line 1 of the primer (CP) of the present invention.
  • the amplification product was not identified in line 2 of Con using template DNA 34.5 fg, but the amplification product was identified in line 2 of the primer (CP) of the present invention.
  • Line 1 of Con using the template DNA 3.45 fg a large number of amplification products of 100 bp or more were detected, but the line 1 of the primer (CP) of the present invention could not identify the amplification products of 100 bp or more.
  • the amplification products of Line 3 of Con using the template DNA 345 fg and Line 3 of the primer (CP) of the present invention showed similar band thicknesses as shown in FIG. 10.
  • the drag phenomenon is shown, and in the case of lines 1, 2, and 3 of the primer (CP) of the present invention, it was confirmed that there is no drag phenomenon.
  • Figure 11 is a primer of the conventional method (Nucleic Acids Research, 36:20, 2008) to amplify the beta actin gene of human genomic DNA Con line is SEQ ID NO: 16 as the forward primer, SEQ ID NO: 17 reverse nucleic acid amplification The reaction was carried out.
  • the primer (CP) of the present invention includes one inosine in the bubble region 1 and four mis-matched sequences in the bubble region 2, so that SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 for SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 Primer (CP) was prepared.
  • the A_F line of FIG. 11 uses the primer (CP) of the present invention of SEQ ID NO: 18 as a forward primer, and the reverse primer performs the nucleic acid amplification reaction with the conventional SEQ ID NO: 17 primer.
  • the A_R line used a conventional primer of SEQ ID NO: 16, and the reverse primer used a primer (CP) of the present invention of SEQ ID NO: 19.
  • A_F & R line used the primer of the present invention (CP) having the forward and reverse primers SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19.
  • the mixture of nucleic acid amplification reactions for the primer set produced a reaction mixture comprising 2.5 mM MgCl 2, 0.2 mM dNTPs, 1.25 U Taq DNA polymerase, 0.5 uM primer set.
  • the reaction mixture and human genomic DNA 100, 10, 1 ng each added a total of 50ul of reactants at 94 °C 2 minutes initial denaturation step, 94 °C 30 seconds denaturation step, 60 °C 30 seconds annealing step,
  • the nucleic acid amplification reaction was carried out by repeating the extension step of 72 ° C. 45 sec for 40 cycles, performing the final extension step of 72 ° C. for 7 minutes, and electrophoresis was performed on 2% agarose gel containing Gel green dye. .
  • the A_F, A_R, A_F & R lines using the primer (CP) of the present invention showed a single band amplification product, and the Con line using the conventional primer amplification products for three or more bands. This was confirmed.
  • the amplification product for the beta actin gene is a single amplification product corresponding to 653bp and the results according to the primer (CP) of the present invention of Figure 11 was confirmed that the specificity is higher than the conventional primer, primer (CP) of the present invention When only one of the forward and reverse primers were applied, the specificity was confirmed to increase.
  • the amplification product was increased by applying only one of two primers to the primer (CP) of the present invention, and the amplification product was increased by using a pair.
  • SEQ ID NO. 20 was used as a forward primer to SEQ ID NO. 20, which is a conventional primer (Nucleic Acids Research, 36:20, 2008) to amplify the GAPD gene of Rat genomic DNA, and a reverse primer.
  • CP uses SEQ ID NO. 22 with 6 mis-matched sequences and SEQ ID NO. 24 with 10 mis-matched sequences as the forward primer in the bubble region 2, and reverse primers SEQ ID NO. 23 and mis with the mis-matched sequence 8 SEQ ID NO: 25 with 10 -matched sequences was used.
  • the mixture of nucleic acid amplification reactions for the primer set produced a reaction mixture comprising 2.0 mM MgCl 2, 0.2 mM dNTPs, 1 U Taq DNA polymerase, 0.5 uM primer set.
  • the reaction mixture and rat genomic DNA (Clontech, Cat. No. 636404) were added in 1000, 100, 10, and 1 pg at a total of 25 ul of the reactant at 94 ° C for 5 minutes, at 94 ° C for 30 seconds, and at 55 ° C for 30 seconds.
  • the nucleic acid amplification reaction was carried out by repeating the annealing step at 30 ° C. for 30 seconds and the extension step at 72 ° C. for 30 seconds, followed by a final extension step at 72 ° C. for 7 minutes. Electrophoretic analysis was performed.
  • Line 1 of FIG. 12 is an amplification product of nucleic acid amplification reaction using 1 pg of rat genomic DNA, in which 6 and 8 mis-matched sequences of bubble region 2 of primer (CP) of the present invention were applied as compared to Con 1 line.
  • Line 1 of M6 & M8 for SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23 and bubble region 2 of the primer (CP) of the present invention mismatched 10 and 10 sequences of SEQ ID NO: 24 and 1 of M10 & M10 for SEQ ID NO: 25 Burn lines were found to increase amplification products.
  • RT-PCR was performed using a conventional primer (Nucleic Acids Research, 36:20, 2008) and the primer (CP) of the present invention.
  • SEQ ID NO. 17 corresponding to the reverse primer of the conventional primer set was used, and the primer (CP) of the present invention contained four mis-matched sequences at the bubble region 2.
  • SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 27 with mis-matched sequences, and SEQ ID NO: 29 with 8 mis-matched sequences were used for cDNA synthesis.
  • the reaction was performed at 45, 55, and 65 ° C. for 60 minutes, and then M-MLV RTase was inactivated at 94 ° C. for 5 minutes.
  • the reaction solution synthesized in SEQ ID NO: 17 using the cDNA reaction solution as a template was synthesized in SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17, and the reaction solution synthesized in SEQ ID NO: 19 was synthesized in SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 27.
  • the reaction solution was synthesized in SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27, and SEQ ID NO: 29 was subjected to nucleic acid amplification reaction using SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29 as a primer set.
  • the mixture of nucleic acid amplification reactions for the primer set produced a reaction mixture comprising 2.5 mM MgCl 2, 0.2 mM dNTPs, 1.25 U Taq DNA polymerase, 0.5 uM primer set.
  • FIG. 13 shows the results of the cDNA synthesis reaction at 65 ° C. as a result of A, 4, 6, and 8 mis-matched sequences, respectively, in the bubble region 2 of the primer (CP) of the present invention compared to the conventional primer Con line. It was confirmed that the amplification products of lines B and C were increased.
  • Figure 14 shows that the amplification product was increased in the primer (CP) of the present invention compared to the conventional primer as a result of performing the cDNA synthesis reaction at 55 °C, line 1 of C mis-matched sequence of 8 Con and A, It was confirmed that the amplification product was increased compared to the first line of B.

Abstract

본 발명은 Forward 혹은 Reverse 프라이머의 5'말단에 상보적인 염기서열 내지는 mis-matched 염기서열을 포함하는 상보적인 염기서열을 직접 또는 linker로서 Inosine을 사용하여 PCR용 프라이머 및 상기 프라이머를 포함하는 PCR 조성물에 핵산 주형을 혼합한 후 상기 혼합물에 대해 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 PCR 방법에 관한 것이다. 본 발명의 PCR용 프라이머는 5'위치에 직접 혹은 linker를 연결한 상보적인 염기서열 내지는 상보적인 염기서열 내에 mis-matched 염기서열을 포함시킴으로써 PCR 반응에서 증폭산물 증가에 따른 민감도 증가 및 비특이적으로 발생되는 반응을 낮출 수 있다는 장점이 있다.

Description

상보적 염기서열 내지는 미스-매치된 염기를 포함하는 상보적인 염기서열과 연결된 PCR 프라이머 및 이를 이용한 핵산 증폭 방법
본 발명은 프라이머의 5‘위치에 직접 혹은 linker를 연결한 상보적인 염기서열 내지는 상보적인 염기서열 내에 mis-matched 염기서열을 포함하는 핵산 증폭반응(Nucleic acid polymerase chain reaction, 이하 "PCR"이라 함)용 프라이머 및 그 프라이머의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 Forward 혹은 Reverse 프라이머의 5’말단에 상보적인 염기서열 내지는 mis-matched 염기서열을 포함하는 상보적인 염기서열을 직접 또는 linker로서 Inosine을 사용하여 PCR용 프라이머 및 상기 프라이머를 포함하는 PCR 조성물에 핵산 주형을 혼합한 후 상기 혼합물에 대해 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 PCR 방법과 상보적인 프라이머(Complementary primer, CP) 및 그 용도에 관한 것이다.
분자진단검사 또는 핵산진단검사에 필수적인 PCR 구성요소에는 DNA 중합효소, 프라이머 쌍, dNTP, Mg++ 및 기타 buffer 들이 필요하다. 이러한 반응이 널리 사용되기 위해서는 고도로 특이적이고 정확성을 가진 관심 있는 목표 유전자의 증폭이 요구된다.
Robust PCR performance를 위해서는 single-copy DNA 분자 검출(Wabuyele, M.B et al.Single Mol., 2001, 2:13-21) 혹은 혈액 매개 감염(Elnifro, E.M. et al. Clin. Microbiol. Rev., 2000, 13:559-570) 등과 같은 고도로 민감한 분석적인 PCR이 요구된다.
일반적으로 PCR 진행을 위해서는 검출하고자 하는 target 유전자에 대한 정보를 확보하고 프라이머 & 프로브 design을 하게 된다. 이 때 design되는 프라이머 sequence 및 길이는 annealing 온도에서 template DNA/RNA에만 잘 교잡하도록 고안됨에도 불구하고 흔히 off-target amplification이 발생한다. 그 원인으로는 PCR master-mix 준비나 초기 변성 온도로의 thermal cycler ramping시의 낮은 온도 조건에 기인하는 것으로 생각되고 있다(Chou,Q et al.Nucleic Acids Res., 1992, 20:1717-1723). 이러한 조건에서의 프라이머는 target보다 많은 농도로 존재하고 있으며 부분적으로 상보적인 부위나 프라이머끼리 비특이적인 반응을 하게 된다. 이들 비특이프라이머 complex들은 원하는 target부위 반응에 경쟁적으로 반응을 하여 민감도를 저해시키게 되며 높은 background를 보이는 원인으로 작용한다. 특히프라이머 dimer 경우 PCR 중에 프라이머 artifacts로 complex mixture를 만들기도 한다.
PCR의 특이도를 높이는 널리 사용되는 방법은 여러 가지가 있는데 그 중 한 가지 방법은 Hot Start 기술을 적용하는 것이다. 이 기술은 온도를 높여 프라이머/target 교잡 반응을 특이도가 유지되도록 하여 pre-PCR mixture 준비시 DNA 중합효소가 premature extension을 방해하는 방법이다(Alexandre V.L. et al.Lebedev A.V. et. al., Nucleic Acids Res., 2008, 36:e131.). 다른 방법으로는 반응 구성물을 물리적으로 구분하여 PCR 반응이 일어나게 하지 않는 방법이 사용되며(Quin chou et al., Nucleic Acids Res., 1992, 20:1717-1723), accessary 단백질을 사용하는 방법(Clark,D.R. et al.U.S. Pat. No. 2006057617), DNA 중합 효소에 대한 항체를 사용하는 방법, Mg++-pyrophosphate complex를 만들어 낮은 온도에서의 비특이 반응을 막는 방법(Bioneer) 등도 사용되고 있다.
반응 구성 물질을 조절하여 특이도를 높이는 방법 외에 프라이머를 변형시켜 특이도를 높이려는 여러 방법들이 보고되었다. 그 중에는 competitor sequence를 넣어 사용하는 방법, 프라이머의 2차 구조를 이용하는 방법, hybridization selectivity를 증가시키는 방법 및 2종의 프라이머를 붙여 사용하는 Dual priming oligo 방법(씨젠)이 있다. 또한 3‘-modification 방법으로서 3’->5‘exonuclease가 제거할 때까지 프라이머 extension을 block하는 방법, UV 조사에 의해 제거되는 blocking 방법 및 thermal deprotection 방법들이 보고되었다.
이들 방법은 비특이 반응을 감소시키는 효과는 있으나 추가적인 효소를 사용하는 문제, 별도의 활성화 조건 추가, specific nucleoside 변형, 구조적으로 복잡한프라이머 design에 따른 해당 target gene의 변종에 대한 coverage 어려움, 민감도 감소 등의 단점들을 가지고 있다.
[선행 특허 문헌]
대한민국 특허공개번호 제1020040005426호
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 PCR 반응에서 증폭산물 증가에 따른 민감도 증가 및 비특이적으로 발생하는 반응을 감소시키는 프라이머를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 PCR 반응에서 증폭산물 증가에 따른 민감도 증가 및 비특이적으로 발생하는 반응을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 특정 유전자서열 증폭을 위한 해당서열에 대한 프라이머의 5‘말단에 직접 혹은 이노신(inosine) 링커(linker)를 연결한 미스(매칭(mis-matching) 뉴클레오타이드를 포함하여 버블 구조를 이루는 상보적인 이중가닥의 뉴클레오타이드가 포함된 하기 구조식 1의 유전자 증폭용 프라이머를 제공한다:
Figure PCTKR2016000151-appb-I000001
[구조식 1]
본 발명에서 상기 프라이머는 특정 유전자서열 증폭을 위한 해당서열의 상보적인 뉴클레오타이드 서열 Xa와 Xa에 상보적이고 미스-매칭 뉴클레오타이드 서열 X’a가 포함되며 Xa와 X’a를 유니버셜 염기 또는 비-구별성 염기(non-discriminatory base)의 뉴클레오타이드 서열 Ya로 연결된 프라이머인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 프라이머는 미스-매칭 뉴클레오타이드의 버블 구조가 최소 하나 이상의 이중 가닥 서열로 연결된 프라이머가 바람직하고, 상기 프라이머는 미스-매칭 뉴클레오타이드의 버블 구조가 하나에서 네 개의 이중 가닥 서열로 연결된 프라이머가 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현 예에 있어서, 상기 프라이머의 X’a와 Xa의 이중 가닥에 최소 하나 이상의 버블이 포함되는 구조를 갖는 프라이머가 바람직하고, 상기 프라이머의 X’a와 Xa의 이중 가닥에 하나 내지 세 개의 버블이 포함되는 구조를 갖는 프라이머가 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 있어서, 상기 프라이머는 상보적인 염기서열(X'a) 내의 미스-매칭 뉴클레오타이드의 수가 최소 1 개 이상의 염기서열을 포함하는 프라이머가 바람직하고, 상기 프라이머는 상보적인 염기서열(X'a) 내의 미스-매칭 뉴클레오타이드의 수가 3 개 내지 12개의 염기서열을 포함하는 프라이머가 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 있어서, 상기 프라이머의 Ya에도 최소 0개 이상의 유니버셜 염기 또는 비-구별성 염기를 포함하는 버블 구조를 갖는 프라이머가 바람직하고, 상기 프라이머의 Ya에도 0개 내지 9개의 유니버셜 염기 또는 비-구별성 염기를 포함하는 버블 구조를 갖는 프라이머가 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 3 내지 15, 서열번호 18 내지 19, 및 서열번호 22 내지 29에 기재된 프라이머로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 있어서, 상기 프라이머는 유전자 증폭을 위한 포워드(Forward), 리버스(Reverse) 위치에 각각 사용되거나 함께 사용되는 것이 바람직하다.
또 본 발명은 RNA로부터 특정 유전자 서열을 증폭하는 과정에서, 상기 본 발명의 프라이머를 이용하여 역전사반응을 위한 역전사 중합효소로 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 주형으로 상기 본 발명의 프라이머를 사용하여 특정 유전자를 증폭하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 방법은 상기 본 발명의 프라이머를 사용하여 RNA 주형을 역전사반응을 수행한 후 특정 유전자 증폭반응이 원스텝으로 수행하는 것이 바람직하다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 프라이머를 유효성분으로 포함하는 DNA 및 RNA에 대한 유전자 증폭을 위한 중합효소연쇄반응법, 실시간 중합효소연쇄반응법 또는 등온증폭법에 사용되는 유전자 증폭용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 조성물은 5'→3' 엑소뉴크레이즈(exonuclease) 활성을 갖는 Taq 중합효소(polymerase), HotStart Taq 중합효소, PFU 중합효소 및 5'→3' 엑소뉴크레이즈(-), 3'→5' 엑소뉴크레이즈(-) 활성을 갖는 Klenow 중합효소로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 중합효소를 추가로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 프라이머를 유효성분으로 포함하는 감염성 질환, 유전성 질환, 약제내성, 약물저항성 및 감수성 검체의 DNA 및 RNA에 대한 특정 유전자를 증폭하는 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머는 상기 각각 프라이머 및 프라이머 세트의 염기서열에 대하여 1개 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기서열도 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머 및 프라이머 세트는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 포함할 수 있다. 즉, 염기서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한 본 발명에 따른 프라이머 및 프라이머 세트의 염기서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머 및 프라이머 세트는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISAS 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일 클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
본 발명에 따른 프라이머 및 프라이머 세트는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법 (1979, Meth, Enzymol.68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명의 PCR용 프라이머는 5‘위치에 직접 혹은 linker를 연결한 상보적인 염기서열 내지는 상보적인 염기서열 내에 mis-matched 염기서열을 포함시킴으로써 PCR 반응에서 증폭산물 증가에 따른 민감도 증가 및 비특이적으로 발생하는 반응을 감소시키는데 목적이 있다.
본 발명은 프라이머의 5‘위치에 직접 혹은 linker를 연결한 상보적인 염기서열 내지는 상보적인 염기서열 내에 mis-matched 염기서열을 포함하는 PCR 프라이머에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 Forward 혹은 Reverse 프라이머의 5’말단에 상보적인 염기서열 내지는 mis-matched 염기서열을 포함하는 상보적인 염기서열을 직접 또는 linker로서 Inosine 염기를 사용하여 PCR 프라이머 및 상기 프라이머를 포함하는 PCR 조성물에 핵산 주형을 혼합한 후 상기 혼합물에 대해 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 PCR 방법에 관한 것이다. 본 발명의 PCR 프라이머는 염기서열과 상보적인 혹은 상보적인 염기서열 내에 일부 mis-matched 염기서열을 포함시킴으로써 증폭반응에서 발생하는 비특이 반응을 낮출 수 있다는 장점이 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 Forward 혹은 Reverse 프라이머의 5‘ 부위에 상보적인 염기서열 내지는 mis-matched 염기서열을 포함하는 상보적인 염기서열 부위를 직접 혹은 linker로 연결시킨 PCR 프라이머를 제공한다.
본 명세서에 있어서, "상보적 염기"는 Forward 혹은 Reverse 프라이머의 염기서열에 상보적인 서열을 가진 염기를 말하는 것으로서, 해당 염기의 방향은 Forward 혹은 Reverse 프라이머의 5‘ 말단 방향에 위치한다. 상보적 염기에 포함되어 있는 “mis-matched 염기서열”은 Forward 혹은 Reverse 프라이머 염기서열과 mis-matched 되는 염기서열을 지칭하며 DNA 염기로는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 유리딘 중 어느 것이어도 상관이 없다. 상보적인 프라이머에 mis-matched 염기의 수가 없게 되면 프라이머의 풀림현상에 대한 Tm 값이 높아지게 되어 주형 DNA의 염기서열에 어닐링이 잘 되지 않아 증폭반응이 수행되지 않는다. 또한 상보적인 프라이머에 mis-matched 염기의 수가 13 개를 초과하게 되면 프라이머의 Tm 값이 현저하게 낮아지게 되고 mis-matched 염기 수가 많아져 PCR 수행 동안 비특이반응이 초래될 수 있다. 따라서 본 발명의 프라이머(CP)는 mis-matched 염기의 수에 따라서 버블이 발생되며 mis-matched 염기의 수가 많아질수록 melting Tm이 낮아지는 역할을 한다. 이에 따라 버블 부위인 상보적인 서열내에 mis-matched 염기 부위에서는 하나 내지 3개의 버블이 형성된다.
프라이머와 상보적 프라이머의 연결은 직접 연결되기도 하지만 linker를 사용하기도 하며, 이 때 사용되는 염기는 Inosine을 사용하며 Inosine 염기의 수는 특별히 한정되는 것은 아니지만 1 내지 9개 범위인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명은 DNA 중합효소, dNTPs, 반응용 완충용액 및 상기 PCR 프라이머를 포함하는 PCR 증폭용 조성물을 제공한다.
상기 반응용 완충용액으로는 Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4, MgCl2 등의 성분을 포함하는 통상의 PCR 완충용액을 적절히 변형하여 사용할 수 있다. 상기 dNTPs는 dATP, dTTP, dUTP, dGTP 및 dCTP를 의미하며, 사용할 수 있는 DNA 중합효소 또한 특정한 효소나 Hot start 효과에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 Taq DNA 중합효소(5‘->3’exo+), Hot start Taq DNA 중합효소(5‘->3’exo+), Vent DNA 중합효소(5’->3’exo-), Pfu DNA 중합효소(3‘->5’exo+)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 또한, 상기 PCR 증폭용 프라이머는 0.2 ~ 1uM 범위의 농도로 사용할 수 있으며, 적절한 프라이머 농도는 당업자가 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명은 증폭하고자 하는 프라이머의 5‘ 말단 부위에 직접 혹은 linker로 연결시킨 상보적인 염기서열 내지는 상보적인 염기서열 내에 mis-matched 염기서열을 포함하는 PCR 프라이머를 이용하여 상기 프라이머를 포함하는 PCR 조성물에 핵산 주형을 혼합한 후 상기 혼합물에 대해 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 PCR 증폭 방법에 관한 것이다.
상기 PCR은 변성, 어닐링 및 연장 단계를 반복함으로써 수행되며, 이러한 PCR 원리는 당사자에게 있어 명확하다. 상기 변성, 어닐링 및 신장 온도는 각각 85 내지 95℃에서 1 내지 60초, 40 내지 70℃에서 1 내지 60초 및 50 내지 75℃에서 1 내지 60초간 수행하는 것이 바람직하며, 온도 범위 및 시간은 반응 조건에 따라 적절하게 조절할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 바람직한 실시 예에 따르면, 프라이머 내에 mis-matched 염기가 2-3개 치환되는 경우에는 멜팅 온도(이하, "Tm"이라 함)가 약 5~10℃ 낮아지고, 4~6개 치환되는 경우에는 멜팅 온도(이하, "Tm"이라 함)가 약 10~20℃ 낮아지며 7~12개 치환되는 경우에는 멜팅 온도(이하, "Tm"이라 함)가 약 20~30℃ 낮아진다. 이러한 Tm의 온도 변화는 사용하는 DNA 중합효소의 종류, 프라이머의 길이, 프라이머내 염기의 종류, 반응 조건 등에 따라 다소 변화될 수 있다. 상기와 같은 Tm 변화 정도를 토대로 상보적 염기서열 내에 mis-matched 염기 부위를 포함하는 프라이머를 디자인할 때 온도 동등성을 부여하는 프라이머 제작 조건을 확립할 수 있게 되고, 적절한 숫자의 mis-matched 염기를 도입함으로써 PCR의 특이성을 증가시킬 수 있게 된다.
하기 실시 예 결과를 이용함으로써 프라이머 위치에 대한 프라이머 디자인시에 온도 동등성을 부여하는 프라이머 제작조건을 확립할 수 있고, 상보적인 염기서열에 linker 와 mis-matched 염기를 적절한 위치에 도입함으로써 발생할 수 있는 Tm 값의 현저한 차이를 최소화한 염기서열을 제작할 수 있게 되며, 이로 인한 PCR 반응의 특이성을 증가시킬 수 있게 된다. 또한 사용하는 DNA 중합효소의 exonulease(5’->3, 3’->5’)기능 유무에 상관없이 PCR의 특이도 및 민감도를 유지할 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 프라이머의 5‘위치에 직접 혹은 Inosine linker를 연결한 상보적인 염기서열 내지는 Mis-matched 염기서열을 포함시킴으로써 DNA, RNA를 주형으로하는 핵산증폭반응에서 증폭산물을 증가시켜 민감도 개선에 효과적이며, 발생하는 비특이 반응을 감소시킬 수 있다. 이러한 효과는 DNA polymerase 종류에 관계없이 모두 작용되고 있다.
도 1은 본 발명의 프라이머(CP)를 이용하여 이중가닥 DNA를 증폭하는 방법을 순차적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 프라이머(CP)를 이용하여 단일가닥 RNA를 증폭하는 방법을 순차적으로 나타낸 것이다.
도 3은 핵산증폭을 위해 필요한 두 개의 프라이머 중 하나를 본 발명의 프라이머(CP)를 이용한 방법으로 본 발명의 프라이머(CP)의 타겟 부위 5‘-말단에 위치한 버블 부위 1에 포함되는 디옥시이노신 수에 따른 결과이다.
도 4와 5는 본 발명의 프라이머(CP)의 상보적인 부위에 위치한 버블 부위 2에 mis-matched 뉴클레오타이드의 수(0, 3, 7, 12)에 따른 결과이다. 도 4 및 5는 핵산증폭을 위해 필요한 두 개의 프라이머 중 하나를 본 발명의 프라이머(CP)를 이용한 방법에 따른 결과이다.
도 6은 핵산증폭을 위해 필요한 두 개의 프라이머 중 하나를 본 발명의 프라이머(CP)를 이용한 방법으로 본 발명의 프라이머(CP)의 버블 부위 1과 버블 부위 2를 포함하여 총 버블수가 각각 2, 3, 4개인 본 발명의 프라이머(CP)를 이용한 결과이다.
도 7 내지 10은 핵산증폭을 위해 필요한 두 개의 프라이머 중 하나를 본 발명의 프라이머(CP)를 이용한 방법으로 도 7은 Taq DNA 중합효소, 도 8은 HotStart Taq DNA 중합효소, 도 9는 Pfu DNA 중합효소, 도 10은 Vent DNA 중합효소를 사용한 결과이다.
도 11은 Human gDNA에서 beta-actin 유전자를 핵산증폭하기 위해 필요한 두 개의 프라이머를 본 발명의 프라이머(CP)로 forward 프라이머와 reverse 프라이머로 각각 이용한 반응과 두 개의 프라이머를 모두 본 발명의 프라이머(CP)로 이용한 증폭반응에 대한 결과이다. 도 12는 Rat gDNA에서 GAPD 유전자를 핵산증폭하기 위해 필요한 두 개의 프라이머를 본 발명의 프라이머(CP)를 이용하여 증폭 반응한 결과이다.
도 13 내지 도 15는 본 발명의 프라이머(CP)의 상보적인 부위에 위치한 버블 부위 2에 mis-matched 뉴클레오타이드의 수에 따라 cDNA 합성 온도에 따른 RT-PCR 결과를 나타낸다.
이하, 실시 예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 본 발명의 프라이머(CP)의 버블 부위 1의 linker에 따른 효과 분석
HIV tat 증폭을 위한 주형 DNA는 HIV-1 isolate 10BR_PE064(GI:672918720, 5281-5700 bp)를 plasmid DNA 에 유전자합성을 통해 HIV tat plasmid DNA를 제작하였다.
본 발명의 프라이머(CP)는 종래방법(Nucleic Acids Research, 36:20, 2008)의 HIV tat 유전자에 대한 forward, reverse 프라이머를 타겟 부위로 설계하고, 이에 상보적인 서열을 5‘-말단에 위치시켰으며, 상보적인 서열에는 mis-matched 서열을 7 ~ 8개 포함시켰다. 타켓부위와 상보적인 서열 사이인 버블 부위 1에 Inosine linker를 서열번호 3 ~ 10과 같이 설계하였다. 서열번호 3는 버블 부위 1에 linker가 포함되지 않는 프라이머이고 서열번호 4 ~ 10은 Inosine linker를 1(Ix1a, Ix1b, Ix1c), 3(Ix3), 5(Ix5), 7(Ix7), 9(Ix9) 개를 포함시켜 설계하였다.
상기 제작된 프라이머는 서열번호 1를 forward 프라이머로 사용하고, 서열번호 2을 reverse 프라이머로 사용하는 혼합물을 대조군으로 사용하고, 시험군은 서열번호 3 ~ 10에 대한 본 발명의 프라이머(CP)를 forward 프라이머로 사용하며, 서열번호 2을 reverse 프라이머로 사용하는 혼합물을 제조하였다.
상기 프라이머를 사용하는 핵산증폭반응에 대한 혼합물은 3.0mM MgCl2, 0.2mM dNTPs(NEB), 1.75U Taq DNA 중합효소, 10ng Human genomic DNA, 0.5uM 프라이머 세트를 포함하는 반응 혼합물을 제조하였다.
상기 반응 혼합물 45ul와 상기 주형 DNA 69, 6.9, 0.69 fg/ul를 각각 5ul씩 첨가하여 94℃에서 10분 초기 변성단계(Initial denaturation step), 그리고 94℃ 30초 변성단계(Denaturation step), 55℃ 30초 어닐링단계(Annealing step), 72℃ 2분 연장단계(Extension step)을 40 사이클 진행하고, 72℃ 7분간 최종 연장단계(Final extenstion step)를 거쳐 핵산증폭반응을 수행하였으며, 증폭산물 5ul를 Gel green dye가 포함된 2% 아가로즈겔에 전기영동분석을 수행하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 주형농도가 345 fg을 반응시킨 3번 라인들에서 종래의 프라이머(Con의 3번 라인)에 비해 본 발명의 프라이머(CP)(Ix9, Ix7, Ix5, Ix3, Ix1a, Ix1b, Ix1c, Ix0의 3번라인)의 증폭산물이 증가하여 나타났다. 주형농도가 34 fg인 2번 라인들에서 종래의 프라이머(Con의 2번 라인)에 비해 본 발명의 프라이머(CP)(Ix7, Ix5, Ix3, Ix1a, Ix1b, Ix1c, Ix0의 2번 라인)의 증폭산물이 증가하여 나타났다.
상기 반응에 대한 결과에서 본 발명의 프라이머(CP) 중에서 Ix1, Ix3, Ix5, Ix7은 Ix0에 비해 증폭산물이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라 본 발명의 프라이머(CP)의 버블 부위 1에 Inosine이 포함됨에 따라 핵산증폭반응의 증폭산물이 증가되는 것을 확인하였다.
실시예 2 : 본 발명의 프라이머(CP)의 버블 부위 2에 mis-matched 개수에 따른 효과 분석
HIV tat plasmid DNA를 주형으로 사용하였으며, 본 발명의 프라이머(CP)는 버블 부위 1에 Inosine을 하나 포함시킨 후, 버블 부위 2에 mis-matched 서열을 0, 3, 8, 12개 포함시켜 서열번호 11, 12, 4, 13를 제작하였다.
상기 제작된 프라이머는 서열번호 1를 forward 프라이머로 사용하고, 서열번호 2을 reverse 프라이머로 사용하는 혼합물을 대조군으로 사용하고, 시험군은 서열번호 11, 12, 4, 13에 대한 본 발명의 프라이머(CP)를 forward 프라이머로 사용하며, 서열번호 2을 reverse 프라이머로 사용하는 혼합물을 제조하였다.
상기 프라이머를 사용하는 핵산증폭반응에 대한 혼합물은 3.0mM MgCl2, 0.2mM dNTPs, 1.75U Taq DNA 중합효소, 10ng Human genomic DNA, 0.5uM 프라이머 세트를 포함하는 반응 혼합물을 제조하였다.
상기 반응 혼합물 45ul와 상기 주형 DNA 69, 6.9, 0.69 fg/ul를 각각 5ul씩 첨가하여 94℃에서 10분 초기 변성단계(Initial denaturation step), 그리고 94℃ 30초 변성단계(Denaturation step), 55℃ 30초 어닐링단계(Annealing step), 72℃ 2분 연장단계(Extension step)을 40 사이클 진행하고, 72℃ 7분간 최종 연장단계(Final extenstion step)를 거쳐 핵산증폭반응을 수행하였으며, 증폭산물 5ul를 Gel green dye가 포함된 2% 아가로즈겔에 전기영동분석을 수행하였다.
도 4의 M0은 mis-matched 서열이 포함되지 않은 서열번호 11을 forward 프라이머로 사용한 결과로 증폭산물이 생성되지 않았다. M3는 mis-matched 서열이 3개 포함된 서열번호 12로 종래의 프라이머(서열번호 1)는 주형 DNA를 345 fg을 반응시킨 3번 라인들에서 Con의 3번 라인 보다 M3의 3번 라인의 증폭산물이 증가하였다. 하지만 34.5 fg을 반응시킨 2번 라인들에서는 M3의 2번 라인에서 증폭산물이 확인되지 않았다.
도 5의 M8은 mis-matched 서열이 8개 포함된 서열번호 4이고, M12는 mis-matched 서열이 12개 포함된 서열번호 13으로 종래의 프라이머(서열번호 1)보다 주형 DNA를 3.45 fg을 반응시킨 1번 라인들에서 증폭산물을 확인하였으며, 특히 M8에서 증폭산물이 가장 많이 증가한 것을 확인하였다.
상기의 결과로 본 발명의 프라이머(CP)의 버블 부위 2에 mis-matched 수에 따라 증폭산물의 증가 및 민감도 상승에 대한 영향을 확인하였다.
실시예 3 : 본 발명의 프라이머(CP)의 버블 개수에 따른 효과 분석
본 발명의 프라이머(CP)는 버블 부위 1에 Inosine을 포함하고, 버블 부위 2에 mis-matched 서열이 포함된다. 버블 부위 1은 버블 하나를 생성하고, 버블 부위 2는 하나에서 3개의 버블을 생성한다.
서열번호 13은 버블 부위 1에 하나, 버블 부위 2에 하나로 총 2개의 버블을 생성하고, 서열번호 14는 버블 부위 1에 하나, 버블 부위 2에 두 개의 버블을 생성한다. 서열 15는 버블 부위 1에 하나, 버블 부위 2에 세 개의 버블을 생성한다.
상기 본 발명의 프라이머(CP)를 forward 프라이머로 사용하고, 서열번호 2를 reverse 프라이머로 이용하여 핵산증폭반응에 대한 혼합물은 3.0mM MgCl2, 0.2mM dNTPs, 1.75U Taq DNA 중합효소, 10ng Human genomic DNA, 0.5uM 프라이머 세트를 포함하는 반응 혼합물을 제조하였다.
상기 반응 혼합물 45ul와 상기 주형 DNA 69, 6.9, 0.69 fg/ul를 각각 5ul씩 첨가하여 94℃에서 10분 초기 변성단계(Initial denaturation step), 그리고 94℃ 30초 변성단계(Denaturation step), 45℃ 30초 어닐링단계(Annealing step), 72℃ 2분 연장단계(Extension step)을 40 사이클 진행하고, 72℃ 7분간 최종 연장단계(Final extenstion step)를 거쳐 핵산증폭반응을 수행하였으며, 증폭산물 5ul를 Gel green dye가 포함된 2% 아가로즈겔에 전기영동분석을 수행하였다.
도 6의 A 라인들은 버블 개수가 2개이고, B 라인들의 버블 개수는 3개, C 라인들의 버블 개수는 4개의 본 발명의 프라이머(CP)를 이용한 결과로 버블 개수 2 ~ 4 개는 2번 라인들의 주형 DNA로 34.5 fg까지 증폭반응이 확인되었으며, 345 fg을 사용한 3번 라인들에서는 Con의 3번 라인보다 증폭산물이 증가한 것을 확인하였다.
실시예 4 : DNA 중합효소 종류별 본 발명의 프라이머(CP)의 증폭반응 분석
핵산증폭반응에 사용되는 DNA 중합효소에 따른 본 발명의 프라이머(CP)의 증폭반응을 확인하기 위해서 서열번호 4의 본 발명의 프라이머(CP)를 forward 프라이머로 이용하고 reverse 프라이머를 서열번호 2를 이용하여 Taq DNA 중합효소, HotStart Taq DNA 중합효소, Vent DNA 중합효소, Pfu DNA 중합효소에 따른 증폭 반응을 분석하였다.
도 7의 핵산증폭반응은 상기 Taq DNA 중합효소의 핵산증폭반응에 대한 혼합물은 3.0mM MgCl2, 0.2mM dNTPs, 1.75U Taq DNA 중합효소, 10ng Human genomic DNA, 0.5uM 프라이머 세트를 포함하는 반응 혼합물을 제조하였다.
도 8의 핵산증폭반응은 상기 HotStart Taq DNA 중합효소의 핵산증폭반응에 대한 혼합물은 3.0mM MgCl2, 0.2mM dNTPs, 1.75U HotStart Taq DNA 중합효소, 10ng Human genomic DNA, 0.5uM 프라이머 세트를 포함하는 반응 혼합물을 제조하였다.
도 9의 핵산증폭반응은 상기 Pfu DNA 중합효소의 핵산증폭반응에 대한 혼합물은 2.0 mM MgSO4, 0.2mM dNTPs, 1.75U Pfu DNA 중합효소, 10ng Human genomic DNA, 0.5uM 프라이머 세트를 포함하는 반응 혼합물을 제조하였다.
도 10의 핵산증폭반응은 상기 Vent DNA 중합효소의 핵산증폭반응에 대한 혼합물은 1x 버퍼(20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0.01% TritonX-100, pH 8.8), 0.2mM dNTPs, 1.75U Vent DNA 중합효소, 10ng Human genomic DNA, 0.5uM 프라이머 세트를 포함하는 반응 혼합물을 제조하였다.
상기 반응 혼합물 45ul와 상기 주형 DNA 69, 6.9, 0.69 fg/ul를 각각 5ul씩 첨가하여 94℃에서 10분 초기 변성단계(Initial denaturation step), 그리고 94℃ 30초 변성단계(Denaturation step), 45℃ 30초 어닐링단계(Annealing step), 72℃ 2분 연장단계(Extension step)을 40 사이클 진행하고, 72℃ 7분간 최종 연장단계(Final extenstion step)를 거쳐 핵산증폭반응을 수행하였으며, 증폭산물 5ul를 Gel green dye가 포함된 2% 아가로즈겔에 전기영동분석을 수행하였다.
상기 Taq DNA 중합효소에 따른 결과는 도 7로 주형 DNA 3.45 fg을 사용한 Con의 1번 라인은 증폭산물이 확인되지 않았으나 본 발명의 프라이머(CP)의 1번 라인에서는 증폭산물을 확인하였다.
상기 Hotstart Taq DNA 중합효소에 따른 결과는 도 8로 주형 DNA 34.5 fg을 사용한 Con의 2번 라인에 비해 본 발명의 프라이머(CP)의 2번 라인에서 증폭산물이 증가한 것을 확인하였다.
상기 Pfu DNA 중합효소에 따른 결과는 도 9로 주형 DNA 34.5 fg을 사용한 Con의 2번 라인은 증폭산물이 확인되지 않았으나 본 발명의 프라이머(CP)의 2번 라인에서는 증폭산물을 확인할 수 있었다. 주형 DNA 3.45 fg을 사용한 Con의 1번 라인의 경우는 100bp 이상의 증폭산물들이 다수 검출되었으나 본 발명의 프라이머(CP)의 1번 라인은 100bp 이상의 증폭산물을 확인할 수 없었다.
상기 Vent DNA 중합효소에 따른 결과는 도 10으로 주형 DNA 345 fg을 사용한 Con의 3번 라인과 본 발명의 프라이머(CP)의 3번 라인의 증폭산물이 유사한 밴드 두께를 보이나 Con의 1, 2, 3번 라인은 모두 끌림 현상이 나타나고 있으며, 본 발명의 프라이머(CP)의 1, 2, 3번 라인의 경우는 끌림 현상이 없는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5 : 본 발명의 프라이머(CP) Forward, reverse 프라이머 각각 또는 한 쌍을 적용한 경우에 따른 증폭반응 분석
도 11은 Human genomic DNA의 beta actin 유전자를 증폭하기 위해 종래방법(Nucleic Acids Research, 36:20, 2008)의 프라이머인 Con 라인은 서열번호 16을 forward 프라이머로, 서열번호 17을 reverse 프라이머로 핵산증폭반응을 수행하였다.
본 발명의 프라이머(CP)는 버블 부위 1에 Inosine 하나를 포함시키고, 버블부위 2에 mis-matched 서열을 4개 포함시켜 서열번호 16과 서열번호 17에 대한 서열번호 18과 서열번호 19인 본 발명의 프라이머(CP)를 제작하였다.
상기 본 발명의 프라이머(CP)를 이용하여 도 11의 A_F 라인은 서열번호 18인 본 발명의 프라이머(CP)를 forward 프라이머로 사용하고 reverse 프라이머는 종래의 서열번호 17번 프라이머로 핵산증폭반응을 수행하였으며, A_R 라인은 서열번호 16인 종래의 프라이머를 사용하고, reverse 프라이머는 서열번호 19인 본 발명의 프라이머(CP)를 사용하였다. A_F&R 라인은 forward와 reverse 프라이머를 서열번호 18과 서열번호 19인 본 발명의 프라이머(CP)를 사용하였다.
상기 프라이머 세트에 대한 핵산증폭반응의 혼합물은 2.5mM MgCl2, 0.2mM dNTPs, 1.25U Taq DNA 중합효소, 0.5uM 프라이머 세트를 포함하는 반응 혼합물을 제조하였다.
상기 반응 혼합물과 Human genomic DNA(Promega, G3041) 100, 10, 1 ng씩 첨가하여 총 50ul의 반응물을 94℃에서 2분 초기 변성단계, 그리고 94℃ 30초 변성단계, 60℃ 30초 어닐링단계, 72℃ 45초 연장단계를 40 사이클 반복하고, 72℃ 7분간 최종 연장단계를 거쳐 핵산증폭반응을 수행하였으며, 증폭산물 5ul를 Gel green dye가 포함된 2% 아가로즈겔에 전기영동분석을 수행하였다.
상기 핵산증폭반응에 따른 결과는 본 발명의 프라이머(CP)를 사용한 A_F,A_R, A_F&R 라인은 단일 밴드의 증폭산물이 나타났으며, 종래의 프라이머를 사용한 Con 라인은 3개 이상의 밴드에 대한 증폭산물이 확인되었다. Beta actin 유전자에 대한 증폭산물은 653bp에 해당하는 단일 증폭산물이며 도 11의 본 발명의 프라이머(CP)에 따른 결과는 종래의 프라이머보다 특이도가 높다는 것을 확인할 수 있었으며, 본 발명의 프라이머(CP)를 forward와 reverse 프라이머 중 하나만 적용시켜도 특이도가 높아지는 것을 확인하였다. 증폭산물의 증가효과는 본 발명의 프라이머(CP)를 두 개 프라이머 중 하나만 적용시켜도 증폭산물이 증가하였으며, 한 쌍을 이용하여도 증폭산물의 증가를 확인하였다.
도 12는 Rat genomic DNA의 GAPD 유전자를 증폭하기 위해 종래의 프라이머(Nucleic Acids Research, 36:20, 2008)인 서열번호 20을 forward 프라이머로 서열번호 21을 reverse 프라이머로 이용하였으며, 본 발명의 프라이머(CP)는 버블 부위 2에 mis-matched 서열이 6개인 서열번호 22와 mis-matched 서열이 10개인 서열번호 24를 forward 프라이머로 사용하고, reverse 프라이머는 mis-matched 서열이 8인 서열번호 23과 mis-matched 서열이 10개인 서열번호 25를 사용하였다.
상기 프라이머 세트에 대한 핵산증폭반응의 혼합물은 2.0mM MgCl2, 0.2mM dNTPs, 1U Taq DNA 중합효소, 0.5uM 프라이머 세트를 포함하는 반응 혼합물을 제조하였다.
상기 반응 혼합물과 Rat genomic DNA(Clontech, Cat.No. 636404) 1000, 100, 10, 1 pg씩 첨가하여 총 25ul의 반응물을 94℃에서 5분 초기 변성단계, 그리고 94℃ 30초 변성단계, 55℃ 30초 어닐링단계, 72℃ 30초 연장단계를 35 사이클 반복하고, 72℃ 7분간 최종 연장단계를 거쳐 핵산증폭반응을 수행하였으며, 증폭산물 5ul를 Gel green dye가 포함된 2% 아가로즈겔에 전기영동분석을 수행하였다.
도 12의 1번 라인은 Rat genomic DNA를 1pg 사용한 핵산증폭반응의 증폭산물로 Con의 1번 라인에 비해 본 발명의 프라이머(CP)의 버블 부위 2를 mis-matched 서열을 6개와 8개를 적용한 서열번호 22와 서열번호 23에 대한 M6&M8의 1번 라인과 본 발명의 프라이머(CP)의 버블 부위 2를 mis-matched 서열을 10개와 10개를 적용한 서열번호 24와 서열번호 25에 대한 M10&M10의 1번 라인들이 증폭산물이 증가된 것을 확인하였다.
상기 11과 12의 결과로 핵산증폭반응에 대한 프라이머 쌍 중 하나만 또는 두개를 본 발명의 프라이머(CP)로 적용한 결과에서 특이도 및 증폭산물의 증가를 확인할 수 있었다. 본 발명의 프라이머(CP)의 mis-matched 서열개수가 다른 두 쌍의 본 발명의 프라이머(CP) 조합에서도 증폭산물의 증가를 확인하였다.
실시예 6 : 본 발명의 프라이머(CP)를 이용한 RT-PCR의 증폭 유효성 검증
Human total RNA(Stratagene, Cat.No. 750500)에서 beta actin 유전자를 증폭하기 위해 종래 프라이머(Nucleic Acids Research, 36:20, 2008)와 본 발명의 프라이머(CP)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR의 첫 단계인 RNA를 cDNA로 합성하기 위해 종래 프라이머 세트의 reverse 프라이머에 해당하는 서열번호 17을 이용하였으며, 본 발명의 프라이머(CP)는 버블 부위 2에 mis-matched 서열을 4개 포함시킨 서열번호 19와 mis-matched 서열 6개인 서열번호 27, 그리고, mis-matched 서열이 8개인 서열번호 29를 각각 이용하여 cDNA에 합성에 이용하였다.
cDNA 합성을 위해 1x buffer(50mM Tris-HCl, pH 8.3, 3mM MgCl2, 10mM DTT, 75mM KCl), 2mM dNTPs, 1uM 프라이머, 200U M-MLV RTase, Human total RNA 40, 4, 0.4 ng을 포함하는 혼합물을 제조하였다.
상기 혼합물의 cDNA 합성 반응을 위해 45, 55, 65℃에서 각각 60분간 반응한 후 94℃에서 5분간 M-MLV RTase를 불활성화하였다.
상기 cDNA 반응액을 주형으로 서열번호 17로 합성된 반응액은 서열번호 16번과 서열번호 17로, 서열번호 19로 합성된 반응액은 서열번호 18과 서열번호 19로, 서열번호 27로 합성된 반응액은 서열번호 26과 서열번호 27로, 서열번호 29로 합성된 반응액은 서열번호 28과 서열번호 29를 프라이머 세트로 하여 핵산증폭반응을 수행하였다.
상기 프라이머 세트에 대한 핵산증폭반응의 혼합물은 2.5mM MgCl2, 0.2mM dNTPs, 1.25U Taq DNA 중합효소, 0.5uM 프라이머 세트를 포함하는 반응 혼합물을 제조하였다.
상기 반응 혼합물과 Human total RNA에 대한 각 프라이머별 cDNA 반응액(2, 0.2, 0.02ng)을 5ul씩 첨가하여 총 50ul의 반응물을 94℃에서 2분 초기 변성단계, 그리고 94℃ 30초 변성단계, 60℃ 30초 어닐링단계, 72℃ 45초 연장단계를 40 사이클 반복하고, 72℃ 7분간 최종 연장단계를 거쳐 핵산증폭반응을 수행하였으며, 증폭산물 5ul를 Gel green dye가 포함된 2% 아가로즈겔에 전기영동분석을 수행하였다.
도 13은 상기 cDNA 합성 반응을 65℃로 수행한 결과로 종래 프라이머인 Con 라인에 비해 본 발명의 프라이머(CP)의 버블 부위 2에 mis-matched 서열이 각각 4, 6, 8개 포함된 A, B, C 라인의 증폭산물이 증가된 것을 확인하였다. 도 14는 상기 cDNA 합성 반응을 55℃로 수행한 결과로 종래 프라이머에 비해 본 발명의 프라이머(CP)에서 증폭산물이 증가되었으며, mis-matched 서열이 8개인 C의 1번 라인이 Con과 A, B의 1번 라인에 비해 증폭산물이 증가된 것을 확인하였다. 도 15는 상기 cDNA 합성 반응을 45℃로 수행한 결과로 종래 프라이머에 비해 본 발명의 프라이머(CP)에서 증폭산물이 증가되었으며, mis-matched 서열이 6, 8개인 C의 1번 라인이 Con과 A의 1번 라인에 비해 증폭산물이 증가된 것을 확인하였다.
상기 결과로 본 발명의 프라이머(CP)를 이용하여 cDNA 합성시 온도범위에 따라서 종래 프라이머 세트에 비해 반응성이 증가되는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 프라이머(CP)를 사용하여 단일 가닥의 RNA에서 RT-PCR 반응으로 특정 유전자의 증폭반응에 대한 유용성을 확인하였다.

Claims (16)

  1. 특정 유전자서열 증폭을 위한 해당서열에 대한 프라이머의 5‘말단에 직접 혹은 이노신(inosine) 링커(linker)를 연결한 미스-매칭(mis-matching) 뉴클레오타이드를 포함하여 버블 구조를 이루는 상보적인 이중가닥의 뉴클레오타이드가 포함된 하기 구조식 1의 유전자 증폭용 프라이머:
    Figure PCTKR2016000151-appb-I000002
    [구조식 1]
    상기 프라이머는 특정 유전자서열 증폭을 위한 해당서열의 상보적인 뉴클레오타이드 서열 Xa와 Xa에 상보적이고 미스-매칭 뉴클레오타이드 서열 X’a가 포함되며 Xa와 X’a를 유니버셜 염기 또는 비-구별성 염기의 뉴클레오타이드 서열 Ya로 연결된 프라이머.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 프라이머는 미스-매칭 뉴클레오타이드의 버블 구조가 최소 하나 이상의 이중 가닥 서열로 연결된 프라이머.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 프라이머는 미스-매칭 뉴클레오타이드의 버블 구조가 하나에서 네 개의 이중 가닥 서열로 연결된 프라이머.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 프라이머의 X’a와 Xa의 이중 가닥에 최소 하나 이상의 버블이 포함되는 구조를 갖는 프라이머.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 프라이머의 X’a와 Xa의 이중 가닥에 하나 내지 세 개의 버블이 포함되는 구조를 갖는 프라이머.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 프라이머는 상보적인 염기서열(X'a) 내의 미스-매칭 뉴클레오타이드의 수가 최소 1 개 이상의 염기서열을 포함하는 프라이머.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 프라이머는 상보적인 염기서열(X'a) 내의 미스-매칭 뉴클레오타이드의 수가 3 개 내지 12개의 염기서열을 포함하는 프라이머.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 프라이머의 Ya에도 최소 0개 이상의 유니버셜 염기 또는 비-구별성 염기를 포함하는 버블 구조를 갖는 프라이머.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 프라이머의 Ya에도 0개 내지 9개의 유니버셜 염기 또는 비-구별성 염기를 포함하는 버블 구조를 갖는 프라이머.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 3 내지 15, 서열번호 18 내지 19, 및 서열번호 22 내지 29에 기재된 프라이머로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머인 것을 특징으로 하는 프라이머.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 프라이머는 유전자 증폭을 위한 포워드(Forward), 리버스(Reverse) 위치에 각각 사용되거나 함께 사용되는 것을 특징으로 하는 프라이머.
  12. RNA로부터 특정 유전자 서열을 증폭하는 과정에서, 상기 제1항의 프라이머를 이용하여 역전사반응을 위한 역전사 중합효소로 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 주형으로 상기 제1항의 프라이머를 사용하여 특정 유전자를 증폭하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 방법은 상기 제1항의 프라이머를 사용하여 RNA 주형을 역전사반응을 수행한 후 특정 유전자 증폭반응이 원스텝으로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항의 프라이머를 유효성분으로 포함하는 DNA 및 RNA에 대한 유전자 증폭을 위한 중합효소연쇄반응법, 실시간 중합효소연쇄반응법 또는 등온증폭법에 사용되는 유전자 증폭용 조성물.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 조성물은 5'→3' 엑소뉴크레이즈(exonuclease) 활성을 갖는 Taq 중합효소(polymerase), HotStart Taq 중합효소, PFU 중합효소 및 5'→3' 엑소뉴크레이즈(-), 3'→5' 엑소뉴크레이즈(-) 활성을 갖는 Klenow 중합효소로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 중합효소를 추가로 포함하는 조성물.
  16. 제1항의 프라이머를 유효성분으로 포함하는 감염성 질환, 유전성 질환, 약제내성, 약물저항성 및 감수성 검체의 DNA 및 RNA에 대한 특정 유전자를 증폭하는 키트.
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