WO2019151757A1 - 삼중접합구조 기반 등온 핵산 증폭 기술을 이용한 표적핵산 검출 방법 - Google Patents

삼중접합구조 기반 등온 핵산 증폭 기술을 이용한 표적핵산 검출 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention is a triple-junction structure based isothermal nucleic acid amplification technology (Th ree-way junction structure-induced Is othermal Amp lification, ThIsAmp) relates to a detecting method of using the target nucleic acid, more specifically ThIsAmp template;
  • the present invention relates to an isothermal nucleic acid amplification technique based on a triple junction structure in which a ThIsAmp primer and a target nucleic acid are formed by a hybridization reaction.
  • Figure 3 shows the target nucleic acid detection sensitivity test results of the ThIsAmp technology of the present invention (Tthreshold: time of arrival of the threshold fluorescent signal value of the sample).
  • the "ThISAmp template” used in the present invention is a template in which the nucleotide sequence complementary to the target nucleic acid, the ThIsAmp primer and the complementary nucleotide sequence, the cleavage recognition sequence and the trigger complement nucleotide sequence are sequentially linked, and the "ThIsAmp primer” is the target.

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Abstract

본 발명은 ThIsAmp 템플릿; ThIsAmp 프라이머 및 표적핵산이 혼성화 반응에 의해 결합되어 형성되는 삼중접합구조를 기반으로 한 등온 핵산증폭기술에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 기존의 EXPAR 기술의 한계점이었던 길이가 짧고 3'-OH 말단을 갖는 표적핵산의 검출에만 사용 가능하다는 제한적인 활용 범위를 벗어나, 표적핵산의 종류에 제한 없이 우수한 효율로 표적핵산을 검출할 수 있다.

Description

삼중접합구조 기반 등온 핵산 증폭 기술을 이용한 표적핵산 검출 방법
본 발명은 삼중접합구조 기반 등온 핵산 증폭 기술 (Three-way junction structure-induced Isothermal Amplification, ThIsAmp)을 이용한 표적핵산의 검출 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 ThIsAmp 템플릿; ThIsAmp 프라이머 및 표적핵산이 혼성화 반응에 의해 결합되어 형성되는 삼중접합구조를 기반으로 한 등온 핵산증폭기술에 관한 것이다.
핵산은 생물체의 유전 정보를 저장하고, 유전 물질의 암호화(coding), 해독(decoding), 조절(regulation) 및 발현(expression)을 통해 생물체의 모든 대사 활동을 조절하는 역할을 수행한다. 특히, 특정 유전자 또는 돌연변이 유무가, 당뇨, 암, 병원체 감염에 의한 전염병 등의 여러 질환 발병과 직간접적으로 연관되어 있기 때문에, 핵산은 질병의 진단에 있어서 중요한 바이오 마커로 사용되어 왔다. 하지만, 핵산은 생체 내에서 극소량으로 존재하기 때문에, 핵산을 이용한 질병 진단을 위해서는 표적핵산의 증폭이 불가피하였고, 1985년, Kary B. Mullis에 의해 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, 이하 PCR)이 최초로 개발되었다.
PCR은 표적핵산과 상보적인 짧은 DNA 가닥인 프라이머 쌍 및 내열성 DNA 중합효소를 이용하고, 온도 조절을 기반으로 한 표적핵산의 분리(denaturation), 결합(annealing) 및 합성(extension)의 연쇄 반응을 통해 특정 표적핵산을 지수함수적으로 증폭시키는 핵산 증폭 기술이다. 하지만, 상기 PCR 반응을 위한 온도 조절을 구현하기 위해서는 값비싼 온도 조절 장치가 필수적으로 요구되기 때문에, 대형 병원이나 전문 진단 센터 등 설비가 갖추어진 곳에서만 한정적으로 사용 가능하다는 단점이 있다. 최근 현장검사 (point-of-care testing, POCT) 기술 개발에 대한 수요가 증대되면서, 온도 조절 장치를 필요로 하는 PCR 기술의 단점을 해결하여 소형화를 구현할 수 있는 대체 기술에 대한 관심이 높아지고 있다.
이러한 기술 흐름에 발맞추어, 1990년대 초부터 온도 조절 과정 없이 일정한 온도에서 핵산 증폭이 가능한 등온 핵산 증폭 기술들(nucleic acid sequence-based amplification (NASBA); helicase-dependent amplification (HDA); recombinase polymerase amplification (RPA); strand displacement amplification (SDA); loop-mediated isothermal amplification (LAMP); rolling circle amplification (RCA); exponential amplification reaction (EXPAR))이 활발히 개발되어왔다. 상기의 여러 등온 핵산 증폭 기술 중에서도 EXPAR 기술은 약 30분의 짧은 반응 시간 내 최대 108 배의 표적핵산 증폭 효율을 구현함으로써, POCT 기술로서의 높은 활용 가능성을 보유한 기술로 간주되어 왔다(Jeffrey Van Ness et al., Proc Natl Acad Sci USA, 100:4504, 2003). 구체적으로, EXPAR 기술은 제한효소 인식 염기서열(템플릿의 중심)과 표적핵산에 상보적인 염기서열(템플릿의 양 말단)이 수식된 템플릿과 표적핵산의 혼성화 반응 후, 제한효소와 DNA 중합효소의 작용으로 인해 이중가닥 DNA 산물이 지수함수적으로 증폭되는 기술이다. 하지만, EXPAR 기술은 표적핵산을 프라이머로 사용하여 템플릿을 증폭시키기 때문에, 길이가 짧고 3'-OH 말단을 갖는 표적핵산만을 검출 가능하다는 단점이 있으며, 이로 인해, EXPAR 기술의 표적 물질은 주로 microRNA에 한정되어 사용되어 왔다.
이에, 본 발명자들은 표적핵산에 제약이 없는 POCT 기술을 개발하기 위하여, 예의 노력한 결과, 이중 프로브 기반 표적핵산 인식 반응에 의해 유도되는 삼중접합구조 생성 시스템을 도입함으로써, 절단효소 및 DNA 중합효소의 작용을 통한 이중가닥 DNA 산물의 지수함수적 증폭 반응을 구현하는 경우, 기존 EXPAR 기술의 문제점인 표적핵산의 길이 및 3' 말단 작용기를 가져야 한다는 제약 없이, 우수한 증폭효율을 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 표적핵산에 대한 길이나 3' 말단 작용기를 가져야 한다는 제약없이 표적핵산을 등온에서 증폭하여 검출할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) (i) 표적핵산에 상보적인 염기서열, ThIsAmp 프라이머와 상보적인 염기서열, 절단효소 인식 염기서열 및 트리거 상보 염기서열이 차례로 연결되어 있는 ThIsAmp 템플릿; (ii) 표적핵산에 상보적인 염기서열 및 ThISAmp 템플릿에 상보적인 염기서열을 가지는 ThIsAmp 프라이머; (iii) 표적핵산; (iv) DNA 중합효소; 및 (v) dNTP를 함유하는 조성물을 반응시켜 이중가닥 DNA를 생성시키는 단계; 및 (b) 생성된 이중가닥 DNA 산물을 검출하는 단계를 포함하는 표적핵산의 검출 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) (i) 표적핵산에 상보적인 염기서열, ThIsAmp 프라이머와 상보적인 염기서열, 절단효소 인식 염기서열 및 트리거 상보 염기서열이 차례로 연결되어 있는 ThIsAmp 템플릿; (ii) 표적핵산에 상보적인 염기서열 및 ThISAmp 템플릿에 상보적인 염기서열을 가지는 ThIsAmp 프라이머; (iii) 표적핵산; (iv) DNA 중합효소; (v) dNTP; 및 (vi) 절단효소를 함유하는 조성물을 반응시켜 이중가닥 DNA를 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 이중가닥 DNA를 검출하는 단계를 포함하는 표적핵산의 검출 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 표적핵산에 상보적인 염기서열, ThIsAmp 프라이머와 상보적인 염기서열, 절단효소 인식 염기서열 및 트리거 상보 염기서열이 차례로 연결되어 있는 ThIsAmp 템플릿; (ii) 표적핵산에 상보적인 염기서열 및 ThISAmp 템플릿에 상보적인 염기서열을 가지는 ThIsAmp 프라이머; (iii) 표적핵산; (iv) DNA 중합효소; 및 (v) dNTP를 함유하는 핵산등온증폭용 조성물을 제공한다.
도 1은 본 발명의 ThIsAmp 기술의 반응을 도식화한 것으로, A는 표적핵산이 존재하지 않을 경우, ThIsAmp 반응이 진행되지 않는 것을 나타낸 것이고, B는 표적핵산이 존재할 경우 생성되는 삼중접합구조, 그리고 이후의 절단효소 및 DNA 중합효소의 작용으로 인해 진행되는 표적핵산 및 ThIsAmp 프라이머 순환 작용 (Pathway 1)과 최종 이중가닥 DNA 산물이 지수함수적으로 증폭되는 반응 (Pathway 2)을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 ThIsAmp 기술의 유효성 실험 결과를 나타낸 것으로, 다양한 반응 조건 (a: 표적핵산; b: ThIsAmp 템플릿; c: ThIsAmp 프라이머; d: ThIsAmp 템플릿 + ThIsAmp 프라이머; e: 표적핵산 + ThIsAmp 프라이머; f: 표적핵산 + ThIsAmp 템플릿; g: 표적핵산 + ThIsAmp 템플릿 + ThIsAmp 프라이머)에 따른 형광 신호 발생 여부를 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다(M1: 표적핵산 (100nM); M2: ThIsAmp 템플릿 (100nM); M3: ThIsAmp 프라이머(100nM)).
도 3은 본 발명의 ThIsAmp 기술의 표적핵산 검출 민감도 실험 결과를 나타낸 것이다 (Tthreshold: 시료의 역치형광신호값 도달 시간).
도 4는 ThIsAmp 템플릿 내 표적핵산 상보 염기서열 길이에 따른 단일염기 부정합 (single-base mismatch) 구분 성능 실험 결과를 나타낸 것이다(Tthre,1bMM: 단일염기 부정합 핵산 (single-base mismatched nucleic acid)가 포함된 시료의 역치형광신호값 도달 시간 (threshold time); Tthre,PM: 표적핵산이 포함된 시료의 역치형광신호값 도달 시간).
도 5는 본 ThIsAmp 기술의 표적핵산 검출 특이도 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 ThIsAmp 프로브 두 쌍을 이용한 ThIsAmp 기술 반응을 도식화한 것으로, A는 표적핵산이 존재하지 않을 경우, ThIsAmp 반응이 진행되지 않는 것을 나타낸 것이고, B는 표적핵산이 존재할 경우 생성되는 두 개의 삼중접합구조, 그리고 이후의 절단효소 및 DNA 중합효소의 작용으로 인해 진행되는 표적핵산 및 ThIsAmp 프라이머 순환 작용 (Pathway 1)과 최종 이중가닥 DNA 산물이 지수함수적으로 증폭되는 반응 (Pathway 2)을 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 ThIsAmp 기술을 이용한 표적핵산 검출 방법은 종래의 EXPAR 기술이 가지고 있던 단점을 해결할 수 있는 진단 방법이다. 본 발명의 ThIsAmp 기술은 기존의 EXPAR 기술의 한계점이었던 길이가 짧고 3'-OH 말단을 갖는 표적핵산의 검출에만 사용 가능하다는 제한적인 활용 범위를 벗어나, 핵산의 길이 및 3' 말단의 작용기의 종류의 제한 없이 표적핵산의 검출이 가능하다는 점에서 유용한 기술이다. 또한, 본 발명의 ThIsAmp 기술에서 제공하는 표적핵산 및 ThIsAmp 프라이머 순환 작용으로 최종 이중가닥 DNA 증폭 효율을 향상시킴으로써, 본 기술의 초기 단계인 삼중접합구조 생성 단계로 인해 생길 수 있는 이후의 최종 이중가닥 DNA 산물 증폭 반응 지연 효과를 상쇄시키는 것을 특징으로 할 수 있으며, 결과적으로, 기존 EXPAR 기술과 대등한 증폭 효율과 높은 특이도를 구현하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) (i) 표적핵산에 상보적인 염기서열, ThIsAmp 프라이머와 상보적인 염기서열, 절단효소 인식 염기서열 및 트리거 상보 염기서열이 차례로 연결되어 있는 ThIsAmp 템플릿; (ii) 표적핵산에 상보적인 염기서열 및 ThISAmp 템플릿에 상보적인 염기서열을 가지는 ThIsAmp 프라이머; (iii) 표적핵산; (iv) DNA 중합효소; 및 (v) dNTP를 함유하는 조성물을 반응시켜 이중가닥 DNA를 생성시키는 단계; 및 (b) 생성된 이중가닥 DNA 산물을 검출하는 단계를 포함하는 표적핵산의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 검출방법에서 이중가닥 DNA는 하기 과정에서 생성되는 것을 특징으로 할 수 있다:
(a) (i) 표적핵산에 상보적인 염기서열, ThIsAmp 프라이머와 상보적인 염기서열, 절단효소 인식 염기서열 및 트리거 상보 염기서열이 차례로 연결되어 있는 ThIsAmp 템플릿; (ii) 표적핵산에 상보적인 염기서열 및 ThISAmp 템플릿에 상보적인 염기서열을 가지는 ThIsAmp 프라이머; 및 (iii) 표적핵산을 혼성화 반응에 의해 결합시켜 삼중접합구조 Ⅰ이 생성되고; (b) DNA 중합효소에 의해 상기 삼중접합구조 Ⅰ 내 ThIsAmp 프라이머가 연장되어 삼중접합구조 Ⅱ가 생성된다; (c) 절단효소 및 DNA 중합효소에 의하여, 상기 삼중접합구조 Ⅱ로부터 트리거가 생성되고; (d) 상기의 단계에서 생성된 트리거가 상기 삼중접합구조 Ⅱ의 ThIsAmp 템플릿의 트리거 상보 염기서열과 혼성화된다; (e) DNA 중합효소에 의해 상기 (a)의 트리거가 ThIsAmp 템플릿을 주형으로 연장됨에 따라 이중가닥 DNA 산물이 생성된다.
본 발명에서 사용하는 “ThISAmp 템플릿”은 표적핵산에 상보적인 염기서열, ThIsAmp 프라이머와 상보적인 염기서열, 절단효소 인식 염기서열 및 트리거 상보 염기서열이 차례로 연결되어 있는 템플릿이며, “ThIsAmp 프라이머”는 표적핵산에 상보적인 염기서열 및 ThISAmp 템플릿에 상보적인 염기서열을 가지는 프라이머이다.
본 발명에서 “트리거”는 새로운 DNA 합성 반응에 의해, 주형 가닥인 ThIsAmp 템플릿의 상류영역에 결합되어 있다가 분리되는 짧은 DNA 가닥 (트리거)을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 DNA 중합효소는 주형과 결합되어 있는 DNA를 밀어내는(strand displacement) 활성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, DNA 중합효소는 주형과 결합된 DNA를 밀어내는 활성 (strand displacement activity)을 가지는 DNA 중합효소라면 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 Klenow Fragment, Vent (exo-) DNA polymerase, Bst DNA polymerase, phi29 DNA polymerase 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 방법은 삼중접합구조를 기반으로 한 등온 핵산 증폭 반응을 통해, 기존 EXPAR 기술의 한계점을 극복하여 핵산의 길이 및 3' 말단 작용기 종류의 제한이 없는 표적핵산 검출 방법으로, 삼중접합구조 구성 가닥 및 EXPAR 템플릿으로서의 역할을 동시에 수행하는 ThIsAmp 템플릿을 도입하여, ThIsAmp 프라이머와 함께 표적핵산의 인식이 가능하고, 절단효소 및 DNA 중합효소의 작용에 의해 이중가닥 DNA 산물을 지수함수적으로 증폭시킴으로써, 핵산의 길이 및 3' 말단 작용기 종류의 제한 없이 표적핵산을 검출하는 기술적 방법이다(도 1).
본 발명의 ThIsAmp 기술은, 표적핵산을 프라이머로 사용하는 EXPAR 기술과는 달리, 표적핵산 존재 시 생성되는 트리거가 EXPAR 반응의 프라이머로 작용하므로 표적핵산의 길이 및 3' 말단 작용기 종류는 표적핵산의 인식에 문제가 되지 않는 것을 특징으로 할 수 있다. 표적핵산과 ThIsAmp 템플릿, 및 ThIsAmp 프라이머의 혼성화 반응에 의해 삼중접합구조 Ⅰ이 생성된 후, DNA 중합효소의 작용으로 인해 ThIsAmp 프라이머가 연장되면서 절단효소 인식 염기서열이 수식된 삼중접합구조 Ⅱ가 생성된다. 이와 같이 절단효소 인식 염기서열이 존재할 경우, 시료 내 존재하는 절단효소의 활성에 의해 이중가닥 DNA의 단일가닥이 절단된다. 상기의 반응에서 생성된 두 개의 절단된 가닥 중 표적핵산 및 ThIsAmp 템플릿과 삼중접합구조를 이루고 있는 가닥은 새로운 DNA 합성을 위한 프라이머로 사용되어, 시료 내 존재하는 DNA 중합효소의 활성에 의해 새로운 DNA 합성 반응이 진행된다.
본 반응에서 사용하는 DNA 중합효소는 DNA 합성 반응 시 주형가닥의 상류영역 (upstream)에 결합되어 있는 DNA 가닥을 밀어내는 활성 (이하 strand displacement activity)을 가지고 있다. 이에 따라, 상기의 새로운 DNA 합성 반응에 의해, 주형 가닥인 ThIsAmp 템플릿의 상류영역에 결합되어 있는 짧은 DNA 가닥 (트리거)이 떨어져 나온다. 따라서, 상기의 절단효소 및 DNA 중합효소의 복합적 작용으로 인해 핵산의 절단 및 중합 연쇄 반응을 구현함으로써, 다량의 트리거가 생성된다. ThIsAmp 템플릿의 하류영역 (downstream) 또한 상기의 생성된 트리거와 상보적 염기서열을 가지고 있으며, 이로 인해, ThIsAmp 반응은 서로 다른 두 가지 경로를 통해 진행된다.
우선, 트리거가 삼중접합구조 내 ThIsAmp 템플릿의 하류영역과 결합 후, DNA 중합효소의 DNA 합성과 strand displacement activity 작용으로 인해 이중가닥 DNA 산물이 생성됨과 동시에 표적핵산 및 연장된 ThIsAmp 프라이머가 떨어져 나온다. 상기의 떨어져 나온 표적핵산 및 연장된 ThIsAmp 프라이머는 자유 ThIsAmp 템플릿과 반응하여 새로운 삼중접합구조 Ⅱ를 생성한다 (Pathway 1). 또한, 트리거는 자유 ThIsAmp 템플릿의 하류영역과 결합 후, 절단효소 및 DNA 중합효소에 의한 절단 및 중합 연쇄 반응에 의해 이중가닥 DNA 산물이 지수함수적으로 증폭된다 (Pathway 2). 상기의 Pathway 1과 Pathway 2를 통해 이중가닥 DNA 산물의 지수함수적 증폭을 구현할 수 있다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, (a) (i) 표적핵산에 상보적인 염기서열, ThIsAmp 프라이머와 상보적인 염기서열, 절단효소 인식 염기서열 및 트리거 상보 염기서열이 차례로 연결되어 있는 ThIsAmp 템플릿; (ii) 표적핵산에 상보적인 염기서열 및 ThISAmp 템플릿에 상보적인 염기서열을 가지는 ThIsAmp 프라이머; (iii) 표적핵산; (iv) DNA 중합효소; (v) dNTP; 및 (vi) 절단효소를 함유하는 조성물을 반응시켜 이중가닥 DNA를 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 이중가닥 DNA를 검출하는 단계를 포함하는 표적핵산의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 검출방법에서 이중가닥 DNA는 하기 과정에서 생성되는 것을 특징으로 할 수 있다:
(a) (i) 표적핵산에 상보적인 염기서열, ThIsAmp 프라이머와 상보적인 염기서열, 절단효소 인식 염기서열 및 트리거 상보 염기서열이 차례로 연결되어 있는 ThIsAmp 템플릿; (ii) 표적핵산에 상보적인 염기서열 및 ThISAmp 템플릿에 상보적인 염기서열을 가지는 ThIsAmp 프라이머; 및 (iii) 표적핵산을 혼성화 반응에 의해 결합시켜 삼중접합구조 Ⅰ가 생성되는 단계; (b) DNA 중합효소에 의해 상기 삼중접합구조 Ⅰ 내 ThIsAmp 프라이머가 연장되어 삼중접합구조 Ⅱ가 생성되는 단계; (c) 절단효소 및 DNA 중합효소에 의하여, 상기 삼중접합구조 Ⅱ로부터 트리거가 생성되는 단계; (d) 상기의 단계에서 생성된 트리거가 상기 삼중접합구조 Ⅱ의 ThIsAmp 템플릿의 트리거 상보 염기서열과 혼성화하는 단계; (e) DNA 중합효소에 의해 상기 (a)의 트리거가 ThIsAmp 템플릿을 주형으로 연장됨에 따라 이중가닥 DNA 산물이 생성되는 단계; (f) 상기 (e)의 반응으로 인해 본래 ThIsAmp 템플릿과 결합하고 있던 표적핵산 및 연장된 ThIsAmp 프라이머가 떨어져 나오는 단계; (g) 상기 (f)의 떨어져 나온 표적핵산 및 연장된 ThIsAmp 프라이머가 자유 ThIsAmp 템플릿과 반응하여 삼중접합구조 Ⅱ가 생성되는 단계; 및 (h) 상기 생성된 트리거와 자유 ThIsAmp 템플릿의 혼성화 반응 후, DNA 중합효소의 활성에 의해 이중가닥 DNA가 생성되는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 절단효소에 의하여 (h)단계에서 생성된 이중가닥 DNA에서 트리거가 생성되는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 DNA 중합효소는 주형과 결합되어 있는 DNA를 밀어내는(strand displacement) 활성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, (i) 표적핵산에 상보적인 염기서열, ThIsAmp 프라이머와 상보적인 염기서열, 절단효소 인식 염기서열 및 트리거 상보 염기서열이 차례로 연결되어 있는 ThIsAmp 템플릿; (ii) 표적핵산에 상보적인 염기서열 및 ThISAmp 템플릿에 상보적인 염기서열을 가지는 ThIsAmp 프라이머; (iii) 표적핵산; (iv) DNA 중합효소; 및 (v) dNTP를 함유하는 핵산등온증폭용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 절단효소를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. ThIsAmp 기술 반응 조건 확립
ThIsAmp 반응 용액 제조 과정은 다음과 같으며, 이에 한정되지는 않는다. 본 실시예에서 사용한 반응용액 (최종 20μL)은 dNTPs (10mM each) 1.5μL, ThIsAmp 템플릿(1μM) 1μL, ThIsAmp 프라이머 (100nM) 1μL, SYBR Green I (20X) 1μL 및 표적핵산 2μL를 반응 완충 용액 혼합물 (buffer A + buffer B)에 첨가하여 제작하였으며, 상기 반응 완충용액 buffer A는 20mM Tris-HCl(pH 8.8), 10mM KCl, 10mM (NH4)2SO4, 2mM MgSO4, 0.1% TritonX-100을 포함하고, buffer B는 25mM Tris-HCl (pH 7.9), 50mM NaCl, 5mM MgCl2, 50μg/mL BSA를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기와 같이 제작된 반응 용액을 55℃에서 10분 동안 예열한다. 이후, 상기 반응 용액에 vent (exo-) DNA polymerase (0.5 unit/μL) 1.2μL 및 Nt.BstNBI (10 unit/μL) 0.4μL를 첨가한 후, 55℃에서 30 초 간격으로 SYBR Green I으로부터 발생하는 형광 세기를 측정함으로써, 최종 이중가닥 DNA 생성량을 분석하였다.
본 실시예에서 사용한 ThIsAmp 템플릿, ThIsAmp 프라이머, 표적핵산의 서열은 다음과 같다.
ThIsAmp 템플릿(서열번호 1): TGC TCA AGG TGT GTC TAT G T T AAT GAC TCT CAT AAT CAG CCG AAG CAG AGC GCA GGG TGC TCA AGG TGT GTC TAT GT
ThIsAmp 프라이머(서열번호 2): TGG ACG ACT TGA AAC AGC AGA GTT GAT TAT G
표적핵산(서열번호 3): AGG TCT AGG GTG CGC TCT GCT TCG GCT CTC TGC TGT TTC AAG TCG TCC AGC TCG TTC TT
(굵은 활자체: 트리거 상보 서열; 기울임체: Nt.BstNBI 제한효소 인식 서열; 밑줄: 표적핵산 상보 서열)
실시예 2. ThIsAmp 기술의 유효성 검증
표적핵산, ThIsAmp 템플릿, 및 ThIsAmp 프라이머를 제외하고, 실시예 1에서 언급된 동일한 반응 조건을 이용하여 하기 (a~g)의 다양한 반응조건에서 반응을 수행하여, 유효성 검증 실험을 진행하였다.
a: 표적핵산;
b: ThIsAmp 템플릿;
c: ThIsAmp 프라이머;
d: ThIsAmp 템플릿 + ThIsAmp 프라이머;
e: 표적핵산 + ThIsAmp 프라이머;
f: 표적핵산 + ThIsAmp 템플릿;
g: 표적핵산 + ThIsAmp 템플릿 + ThIsAmp 프라이머
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 표적핵산, ThIsAmp 템플릿, 및 ThIsAmp 프라이머를 모두 포함하는 반응 조건 (g)에서 월등히 높은 형광 신호가 발생하는 것을 확인하였다. 또한, 전기영동을 이용한 유효성 검증 실험을 통해, 반응 조건 g에서만 삼중접합구조와 다량의 이중가닥 DNA 산물이 생성됨을 확인하였다.
실시예 3. ThIsAmp 기술의 표적핵산 검출 민감도 검증
실시예 1에 기재된 반응 조건을 이용하여 본 발명의 ThIsAmp 기술의 민감도 검증 실험을 진행하였다.
다양한 농도 (1 fM ~ 1nM)의 표적핵산을 포함하는 분석 시료를 제조한 후, ThIsAmp 반응을 수행한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 본 기술의 표적핵산 검출 한계 (limit of detection, LOD)는 78.1 aM인 것을 확인하였다. 본 실험 결과를 통해, 본 발명에서 제안하는 ThIsAmp 기술이 기존 EXPAR 기술과 필적할 만한 성능을 보유하고 있음을 확인하였다.
실시예 4. ThIsAmp 기술의 표적핵산 검출 특이도 검증
본 발명의 TIsAmp 기술의 특이도를 검증하기 위하여, ThIsAmp 템플릿 내 표적핵산 상보 염기서열 길이 (17 mer, 14 mer, 8 mer, 4 mer)에 따른 단일염기 부정합 구분 능력 실험을 진행하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 8 mer의 표적핵산 상보 염기서열 길이를 가진 ThIsAmp 템플릿을 사용하였을 때, 단일염기 부정합 구분 능력이 가장 뛰어난 것을 확인하였다.
본 실시예에서 사용한 각각의 ThIsAmp 템플릿 (17 mer, 14 mer, 8 mer, 4 mer)의 염기서열은 다음과 같다.
17mer(서열번호 4): TGC TCA AGG TGT GTC TAT G T T AAT GAC TCT CAT AAT CAG CCG AAG CAG AGC GCA GGG TGC TCA AGG TGT GTC TAT GT
14mer(서열번호 5): TGC TCA AGG TGT GTC TAT G T T AAT GAC TCT CAT AAT CAG CCG AAG CAG AGC GGG TGC TCA AGG TGT GTC TAT GT
8mer(서열번호 6): TGC TCA AGG TGT GTC TAT G T T AAT GAC TCT CAT AAT CAG CCG AAG GGG TGC TCA AGG TGT GTC TAT GT
4mer(서열번호 7): TGC TCA AGG TGT GTC TAT G T T AAT GAC TCT CAT AAT CAG CC GGG TGC TCA AGG TGT GTC TAT GT
(굵은 활자체: 트리거 상보 서열; 기울임체: Nt.BstNBI 제한효소 인식 서열; 밑줄: 표적핵산 상보 서열)
상기의 채택된 ThIsAmp 템플릿을 이용하여 표적핵산 검출 특이도 실험을 수행한 결과, ThIsAmp 기술을 통해, 임의의 핵산 염기서열(random sequence)을 구분할 수 있을 뿐만 아니라 1~3 개의 염기 부정합까지 성공적으로 구분할 수 있음을 확인하였다.
표적핵산 검출 특이도 실험 결과는 도 5에 나타내었으며, D value는 표적핵산으로부터의 염기 부정합(mismatch) 구분 능력을 나타내는 지표이며, 다음의 관계식을 통해 정의되는 것을 특징으로 할 수 있다.
D value = (Tthre,X-Tthre,0)/(Tthre,P- Tthre,0)
(Tthre,X: 여러 종류의 핵산이 포함된 시료의 역치형광신호값 도달 시간; Tthre,0: 표적핵산이 포함되지 않은 시료의 역치형광신호값 도달 시간; Tthre,P: 표적핵산이 포함된 시료의 역치형광신호값 도달 시간)
상기 결과를 통해, 본 발명에서 제안하는 ThIsAmp 기술이 뛰어난 특이도를 보유하고 있음을 확인하였다.
본 발명에 따르면, 기존의 EXPAR 기술의 한계점이었던 길이가 짧고 3'-OH 말단을 갖는 표적핵산의 검출에만 사용 가능하다는 제한적인 활용 범위를 벗어나, 표적핵산의 종류에 제한 없이 우수한 효율로 표적핵산을 검출할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (6)

  1. 다음의 단계를 포함하는 표적핵산의 검출 방법:
    (a) (i) 표적핵산에 상보적인 염기서열, ThIsAmp 프라이머와 상보적인 염기서열, 절단효소 인식 염기서열 및 트리거 상보 염기서열이 차례로 연결되어 있는 ThIsAmp 템플릿; (ii) 표적핵산에 상보적인 염기서열 및 ThISAmp 템플릿에 상보적인 염기서열을 가지는 ThIsAmp 프라이머; (iii) 표적핵산; (iv) DNA 중합효소; 및 (v) dNTP를 함유하는 조성물을 반응시켜 이중가닥 DNA를 생성시키는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 이중가닥 DNA를 검출하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 DNA 중합효소는 주형과 결합되어 있는 DNA를 밀어내는(strand displacement) 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 다음의 단계를 포함하는 표적핵산 검출 방법:
    (a) (i) 표적핵산에 상보적인 염기서열, ThIsAmp 프라이머와 상보적인 염기서열, 절단효소 인식 염기서열 및 트리거 상보 염기서열이 차례로 연결되어 있는 ThIsAmp 템플릿; (ii) 표적핵산에 상보적인 염기서열 및 ThISAmp 템플릿에 상보적인 염기서열을 가지는 ThIsAmp 프라이머; (iii) 표적핵산; (iv) DNA 중합효소; (v) dNTP; 및 (vi) 절단효소를 함유하는 조성물을 반응시켜 이중가닥 DNA를 생성시키는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 이중가닥 DNA를 검출하는 단계.
  4. 제3항에 있어서, DNA 중합효소는 주형과 결합되어 있는 DNA를 밀어내는(strand displacement) 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. (i) 표적핵산에 상보적인 염기서열, ThIsAmp 프라이머와 상보적인 염기서열, 절단효소 인식 염기서열 및 트리거 상보 염기서열이 차례로 연결되어 있는 ThIsAmp 템플릿; (ii) 표적핵산에 상보적인 염기서열 및 ThISAmp 템플릿에 상보적인 염기서열을 가지는 ThIsAmp 프라이머; (iii) 표적핵산; (iv) DNA 중합효소; 및 (v) dNTP를 함유하는 핵산등온증폭용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 절단효소를 추가로 함유하는 조성물.
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