PT1471926E - Composições e métodos para a utilização terapêutica de uma sequência associada a atonal - Google Patents
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Description
ΕΡ 1 471 926/ΡΤ DESCRIÇÃO "Composições e métodos para a utilização terapêutica de uma sequência associada a atonal"
CAMPO DO INVENTO 0 presente invento refere-se em geral ao campo de diagnóstico e terapêutica genética e, mais particularmente, à caracterização e utilização de uma sequência de ácido nucleico ou de aminoácidos associada a atonal, ou seus homólogos, como um agente terapêutico.
ANTECEDENTES DO INVENTO
Um modelo complexo de interacções nas e entre as células dirige o desenvolvimento sequencial dos neurónios desde a divisão das células progenitoras neuroepiteliais. Múltiplos sinais extracelulares e intracelulares moderam este processo. Entre os sinais intracelulares-chave estão os factores de transcrição, que induzem a expressão de uma cascata de genes. Uma subclasse de factores de transcrição, pertencendo à família de proteínas hélice-laçada-hélice básica (bHLH), é expressa inicialmente quando é tomada a decisão de proliferar ou diferenciar. Esta função é particularmente crucial uma vez que mutações nestes genes em desenvolvimento inicial podem eliminar estruturas neuronais completas.
Em Drosophila, o gene atonal (ato), que é homólogo a Mathl, Math2, Hathl e Hath2, codifica uma proteína bHLH essencial para o desenvolvimento de orgãos cordotonais (orgãos sensitivos que se encontram na parede corporal, articulações e antena que funciona na propriocepção, equilíbrio e audição) (Eberl, 1999; Mclver, 1985; van Staaden e Rõmer, 1998). As CHOs povoam o sistema nervoso periférico (SNP) na parede do corpo e articulações (tórax, abdómen, esterno, asas, pernas) e antenas (Moulins, 1976), proporcionando â mosca informação sensorial tal como o tacto e mecanorreceptores em vertebrados (Mclver, 1985; Moulins, 1976). Boyan (Boyan, 1993) propôs que, no decorrer da evolução, diferentes CHOs tornam-se especializadas para a audição em insectos diferentes. Esta hipótese foi 2 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ recentemente confirmada por van Staaden e Rõmer (1998). Na Drosophila, as CHOs no orgão Johnston, localizado no segundo segmento da antena, funciona na audição em campo próximo (Dreller e Kirschner, 1993; Eberl, 1999) e geotactismo negativo.
Durante o desenvolvimento o ato é expresso num aglomerado de células progenitoras a partir do qual são seleccionadas as células criadoras de CHO (Jarman et al., 1993) . Este provavelmente funciona por regulação da expressão dos genes necessários para a especificação e desenvolvimento da linhagem CHO; uma vez que codifica uma proteína hélice-laçada-hélice básica (bHLH) que dimeriza com a proteína Daughterless e liga às sequências E-box, activando assim os genes (Jarman et al., 1993). A especificidade de CHO é codificada pelo domínio básico ato, que é necessário para a ligação do ADN nas proteínas bHLH (Chien et al., 1996; Davis et al., 1990; Jarman e Ahmed, 1998; Vaessin et al., 1990). ato é simultaneamente necessário e suficiente para a produção de CHOs na mosca: a perda da função ato conduz à perda de CHOs, enquanto que a expressão ectópica de ato causa formação ectópica de CHO (Jarman et al., 1993). As moscas adultas que carecem da função atonal são descoordenadas, não voam e são deficientes na audição. A sobre-expressão do gene atonal da mosca pode produzir novos neurónios cordotonais, o que indica que atonal é simultaneamente essencial e suficiente para o desenvolvimento desta população neuronal.
Nos vertebrados, durante a miogénese e neurogénese, a especificação de destino das células requer factores de transcrição de hélice-laçada-hélice básicos (bHLH). Mathl (para homólogo atonal de ratinho-1 (mouse atonal homolog-1)) é um de tais factores e é expresso no cérebro posterior, medula espinal dorsal, camada germinal externa do cerebelo, intestino, articulações, ouvido e células de Merkel da pele (que funcionam como mecanorreceptores) (Akazawa et al., 1995; Ben-Arie et al., 1996; Ben-Arie et al., 1997). Os ratinhos heterozigóticos para uma deleção alvo de Mathl (Mathl+/~) são viáveis e parecem normais, no entanto os ratinhos nulos a Mathl (MathT/_) morrem logo após o nascimento e carecem de neurónios nos grânulos cerebrais. 3 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ
Mathl é um dos homólogos conhecidos mais próximos de ato, com 82% de similaridade de aminoácidos no domínio bHLH e 100% de conservação do domínio básico que determina a especificidade de reconhecimento alvo (Ben-Arie et ai., 1996; Chien et al., 1996). Mathl é transitoriamente expresso no SNC que começa no embriónico dia 9 (E9) na porção dorsal do tubo neural. Mathl é também expresso no lábio rômbico do quarto ventrículo do cérebro, onde nascem os precursores de células granulares cerebrais em E13-15 (Alder et al., 1996). Após proliferação e diferenciação, estas células progenitoras migram para formar a camada granular externa (EGL) da primordia cerebelar (Hatten e Heintz, 1995). A proliferação de células EGL continua a expressar Mathl durante as primeiras três semanas pós-natal, até pouco antes de migrarem para o seu destino adulto final para produzir a camada granular interna (IGL) do cerebelo (Akazawa et al., 1995; Ben-Arie et al., 1996). Um outro grupo de células, uma pequena população de precursores neuronais na medula espinal dorsal, expressa Mathl durante E10-E14 (Akazawa et al., 1995; Ben-Arie et al., 1996). Estas células precursoras expressam também as proteínas de homeodomínio LIM (LH2A e LH2B), marcadores da classe Dl de interneurónios comissurais (Lee et al., 1998). Helms e Johnson (1998) descreveram que a expressão de lacz sob o controlo de elementos reguladores de Mathl reproduziu os modelos de expressão de Mathl no desenvolvimento do cerebelo e medula espinal, e demonstraram que Mathl é expresso nos precursores o que dá origem a uma subpopulação de interneurónios comissurais dorsais.
Para determinar a função In vivo de Mathl, os inventores produziram ratinhos (MathT/~) sem a proteína MATH1. Esta mutação nula causa anomalias cerebrais major: ausência de proliferação de células granulares e migração a partir do lábio rômbico em E14.5, e ausência de EGL completa no nascimento (Ben-Arie et al., 1997). Não é evidente que a agenése de neurónios granulares cerebrais seja devida a insuficiência da especificação progenitora ou à incapacidade da célula para proliferar e/ou diferenciar. Os recém-nascidos não podem respirar e morrem logo após o nascimento, no entanto não há defeitos graves em quaisquer nervos cranianos ou núcleos do tronco cerebral que possam explicar a insuficiência respiratória. 4 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ Ο facto de Mathl ser expresso no ouvido interno sugere que a expressão de Mathl é necessária para o desenvolvimento de órgãos auditivos ou órgãos do equilíbrio. 0 ouvido interno forma-se inicialmente como um espessamento da ectoderme, denominado placode ótico, entre os rombómeros 5 e 6 no rombencéfalo. 0 placode ótico dá origem aos neurónios do VIIIo nervo craneano e invagina para se tornar o otocisto, a partir do qual se desenvolve o ouvido interno. 0 ouvido interno de mamífero maduro compreende um órgão auditivo, a cóclea e cinco órgãos vestibulares: o utrículo, o sáculo e três canais semicirculares. 0 epitélio sensitivo destes orgãos consiste em células ciliares mecanorreceptoras, que suportam células e extremidades nervosas. As células ciliares servem como mecanorreceptores para transdução de ondas sonoras e movimento da cabeça em informação auditiva e posicionai. As células ciliares e as células de suporte formam-se ambas a partir de uma célula progenitora comum e proliferam e diferenciam-se no epitélio sensitivo, com mitoses de pico entre o dia embriónico 13 e 18 (E13-18) em ratinhos. Embora tenham sido implicados vários genes no desenvolvimento do ouvido interno, tal como int2 (Mansour et al., 1993); pax2 (Torres et al., 1996); e Hmx3 (Wang et al., 1998), nenhum mostrou ser necessário, especificamente, para a génese da célula ciliar. A lesão das células ciliares é uma causa comum de surdez e disfunção vestibular, que são elas mesmas doenças prevalentes. Cerca de 28 milhões de Americanos têm insuficiência auditiva; as perturbações vestibulares afectam cerca de um quarto da população geral e metade dos nossos idosos. As células ciliares delicadas são vulneráveis à doença, idade e traumatismos ambientais (i.e., antibióticos, toxinas, ruído alto persistente). Quando estas células são destruídas, elas não se regeneram em mamíferos. Por conseguinte, existe a necessidade de resolver os problemas dos doentes com insuficiência e perda auditiva degenerativa congénita, crónica ou adquirida ou problemas de equilíbrio, e proporcionar composições, métodos e reagentes para utilização no tratamento da perda de audição e função vestibular. 5 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ
Para suporte aos ensinamentos do presente invento, outros demonstraram que Mathl, após sobre-expressão, induz a produção significativa de células ciliares extra nos ouvidos internos de ratos pós-natal (Zheng e Gao, 2000) . Em resumo, embora a determinação do destino seja normalmente completada até ao nascimento para as células ciliares cocleares de mamíferos, a sobre-expressão de Mathl em culturas de explantes cocleares de rato pós-natal resulta em células ciliares do ouvido adicionais que derivam das células epiteliais colunares localizadas fora do epitélio sensitivo na cristã epitelial principal. Além disso, a conversão de células de suporte utricular pós-natal em células ciliares é facilitada pela expressão de Mathl. A capacidade de Mathl para permitir a produção de células ciliares no ouvido é uma forte evidência de suporte ao invento reivindicado.
SUMÁRIO DO INVENTO O invento proporciona uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácido nucleico associada a atonal para promoção terapêutica do crescimento de células mecanorreceptoras do ouvido interno num animal, em que a referida sequência de aminoácidos associada a atonal tem ou a referida sequência de ácido nucleico associada a atonal codifica um polipéptido que tem, pelo menos, 80% de identidade para a sequência AANARERRRMHGLNHAFDQLR. 0 invento proporciona uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácido nucleico associada a atonal para produção terapêutica de células ciliares do ouvido interno, em que a referida sequência de aminoácidos associada a atonal tem ou a referida sequência de ácido nucleico associada a atonal codifica um polipéptido que tem, pelo menos, 80% de identidade para a sequência AANARERRRMHGLNHAFDQLR. 0 invento proporciona uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácido nucleico associada a atonal para tratamento de um animal quanto à insuficiência auditiva, em que a referida sequência de aminoácidos associada a atonal tem ou a referida sequência de ácido nucleico associada a atonal codifica um polipéptido que tem, pelo menos, 80% de identidade para a sequência AANARERRRMHGLNHAFDQLR. 6 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ Ο invento proporciona uma sequência de aminoácidos ou sequência de ácido nucleico associada a atonal para tratamento de um animal quanto a uma perturbação do equilíbrio, em que a referida sequência de aminoácidos associada a atonal tem ou a referida sequência de ácido nucleico associada a atonal codifica um polipéptido que tem, pelo menos, 80% de identidade para a sequência AANARERRRMHGLNHAFDQLR. O presente invento proporciona uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácido nucleico associada a atonal para tratamento de um animal quanto a uma doença articular, em que a referida sequência de aminoácidos associada a atonal tem ou a referida sequência de ácido nucleico associada a atonal codifica um polipéptido que tem, pelo menos, 80% de identidade para a sequência AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
Em concretizações específicas a administração da sequência de aminoácidos ou ácido nucleico é por um vector seleccionado a partir de um vector adenoviral, um vector retroviral, um vector adeno-associado, um plasmídeo ou um qualquer outro vector à base de ácido nucleico, um lipossoma, um ácido nucleico, um péptido, um lípido, um hidrato de carbono e uma combinação dos referidos vectores. Numa concretização específica o referido vector é um vector não virai ou um vector virai. Numa outra concretização específica o referido vector é uma célula. Numa concretização preferida o referido vector é um vector de adenovírus compreendendo uma sequência promotora de citomegalovírus IE e uma sequência de sinal de poliadenilação precoce SV40. Numa outra concretização específica a referida célula é uma célula humana. Numa concretização específica adicional a referida doença articular é osteoartrite. Numa outra concretização específica a célula contém uma alteração numa sequência de ácido nucleico ou de aminoácidos associada a atonal.
Numa outra concretização, o presente invento proporciona uma composição compreendendo uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácido nucleico associada a atonal em combinação com um vector virai como veículo de distribuição, 7 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ em que ο referido veículo de distribuição resulta na distribuição de uma quantidade terapeuticamente eficaz da referida sequência de aminoácidos associada a atonal ou da referida sequência de ácido nucleico associada a atonal numa célula, e em que a referida sequência de aminoácidos associada a atonal é ou a referida sequência de ácido nucleico associada a atonal codifica um polipéptido que compreende, pelo menos, 80% de identidade para a sequência AANARERRRMHGLNHAFDQLR. Em concretizações específicas, o referido veículo é o domínio de ligação a receptor da toxina bacteriana ou qualquer molécula de fusão ou é um domínio de transdução proteica. Numa concretização específica, o referido domínio de transdução proteica é do péptido TAT de VIH. A composição pode ser utilizada para tratar um organismo quanto à insuficiência auditiva, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa concretização específica, o defeito é uma mutação ou alteração da referida sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa outra concretização específica, o defeito afecta a sequência reguladora da referida sequência de ácido nucleico associada a atonal. A composição pode ser utilizada para tratar um organismo quanto à insuficiência auditiva, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de ácido nucleico que está associada à regulação de uma sequência de ácido nucleico associada a atonal. A composição pode ser utilizada para tratar um organismo quanto â insuficiência auditiva, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de aminoácidos que está associada à regulação de uma sequência de ácido nucleico associada a atonal. A composição pode ser utilizada para tratar um organismo quanto ao desequilíbrio, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa concretização específica, o defeito é uma mutação ou alteração da referida sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa outra concretização específica, o defeito afecta uma sequência reguladora da referida sequência de ácido nucleico associada a atonal. A composição pode ser utilizada para tratar um organismo quanto 8 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ ao desequilíbrio, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de ácido nucleico que está associada à regulação de uma sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa concretização adicional do presente invento, há uma composição para tratar um organismo quanto ao desequilíbrio, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de aminoácidos que está associada à regulação de uma sequência de ácido nucleico associada a atonal. A composição pode ser utilizada para tratar um organismo quanto â osteoartrite, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa concretização específica, o defeito é uma mutação ou alteração da referida sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa outra concretização específica, o defeito afecta a sequência reguladora da referida sequência de ácido nucleico associada a atonal. A composição pode ser utilizada para tratar um organismo quanto à osteoartrite, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de ácido nucleico que está associada a regulação de uma sequência de ácido nucleico associada a atonal. A composição pode ser utilizada para tratar um organismo quanto à osteoartrite, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de aminoácidos que está associada à regulação de uma sequência de ácido nucleico associada a atonal. A composição pode ser utilizada para tratar um organismo quanto a uma doença articular, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa concretização específica, o defeito é uma mutação ou alteração da referida sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa outra concretização específica, o defeito afecta uma sequência reguladora da referida sequência de ácido nucleico associada a atonal. A composição pode ser utilizada para tratar um organismo quanto a uma doença articular, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de ácido nucleico que está associada à regulação de uma sequência de ácido nucleico associada a atonal. A composição pode ser utilizada para tratar um organismo quanto a uma doença articular, em que o 9 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ referido organismo compreende uma defeito numa sequência de aminoácidos que está associada à regulação de uma sequência de ácido nucleico associada a atonal.
Serão evidentes e eventualmente mais rapidamente compreendidos, outros e mais objectivos, características e vantagens, por leitura da descrição seguinte e por referência ao desenho acompanhante que faz parte desta descrição ou a quaisquer exemplos das concretizações do invento presentemente preferidas que são dados com a finalidade de descrição.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura IA e 1B demonstram a coloração (azul) por β-Gal do ouvido interno de embriões heterozigóticos Mathl, como acima descrito. A Figura IA mostra a vesícula ótica (OV) a E12.5 e a Figura 1B o ouvido interno em E14.5 de embriões Mathl+/íi~Gal. Os epitélios sensitivos coraram positivamente na cóclea (C) , sácula (S) , utrículo (U) e ampola do canal semicircular (SCA). Um diagrama esquemático do ouvido interno é desenhado ao longo da coloração para referência, indicando o azul a localização do epitélio sensitivo. As amplificações originais das imagens tiradas ao microscópio foram de xlOO para a Figura IA e x50 para a Figura 1B.
As Figuras 2A a 2F são microfotografias electrónicas de varrimento do epitélio sensitivo do ouvido interno a E18,5 em ratinhos de tipo selvagem e Mathlli~Gal/l}~Gal. Os epitélios de ratinhos de tipo selvagem são mostrados nas Figuras 2A, 2C e 2E e os epitélios de ratinhos nulos nas Figuras 2B, 2D e 2F. 0 orgão de Corti da clóclea é mostrado e indicado nas Figuras 2A e 2B. No ratinho de tipo selvagem há três camadas de células ciliares externas (1, 2, 3), uma camada de células ciliares interna (I), todas com feixes ciliados (HB). Pode-se observar no fundo, a membrana tectorial (TM), uma estrutura acessória da cóclea. Acima do epitélio sensitivo estão as células escamosas (SQ) com quinocílios rudimentares (RK). Em ratinhos nulos (Figura 2B) , há apenas células escamosas. As cristãs ampulares de um canal semicircular vertical estão representadas nas Figuras 2C e 2D. A cristã de ratinhos nulos é similar à de tipo selvagem na forma geral, incluindo o 10 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ septo (eminência) cruciato (EC), mas é mais pequena. A mácula do utrículo é o centro da Figura 2E e 2F. De novo, a mácula do ratinho nulo é mais pequena do que a de tipo selvagem. A escala de barras é a seguinte: 10 μπι nas Figuras 2A e 2B, 50 μιτι nas Figuras 2C e 2D e 100 μιτι nas Figuras 2E e 2F.
As Figuras 3A a 3F são microfotograf ias de luz de secções transversas semi-finas do epitélio sensitivo do ouvido interno em ratinhos de tipo selvagem (Figuras 3A, 3C e 3E) e MathlP~Gal/P~Gal (Figuras 3B, 3D e 3F) , todos os ratinhos foram observados a E18.5. Como observado na cóclea de ratinhos de tipo selvagem, Figura 3A, estão presentes três células ciliares externas (1, 2, 3) e uma célula ciliar interna (I). Por contrário, a cóclea de ratinhos nulos (Figura 3B) tem apenas células escamosas (SQ) na mesma região. As células ciliares (HC) e as células de suporte (SC) estão presentes na cristã ampular (Figura 3C) e mácula utricular (Figura 3E) de ratinhos de tipo selvagem, no entanto, apenas estão presentes células de suporte em ratinhos nulos (Figura 3D e 3F) . A cristã foi cortada obliquamente, sendo responsável pelas camadas múltiplas de células ciliares na Figura 3C. A membrana otolítica (OM), uma estrutura acessória do utrículo, está presente quer em ratinhos de tipo selvagem (Figura 3E) quer em ratinhos nulos (Figura 3F) . A escala de barras iguala 10 0 μπι (Figuras 3A e 3B) ; 50 μπι (Figuras 3C e 3D) ; e 25 μπι (Figuras 3E e 3F) .
As Figuras 4A e 4B são microfotografias electrónicas de transmissão de mácula utricular E18.5 em ratinhos de tipo selvagem e ratinhos Mathlfí~Gal/l3~Gal. A Figura 4A mostra que as células ciliares (HC) e as células de suporte (SC) estão presentes na mácula utricular de tipo selvagem. Por contrário, apenas estão presentes células de suporte em ratinhos nulos (Figura 4B) . As células ciliares têm feixes ciliados (HB) e as células de suporte têm microvilosidades (MV). As células ciliares são menos electronicamente densas e têm mais núcleos apicais do que as células de suporte, no entanto, apenas as últimas têm grânulos secretores (SG). São evidentes algumas células ciliares imaturas (IM) nos ratinhos de tipo selvagem, mas não nos ratinhos nulos. A escala de barras em todas as figuras iguala 10 μιη. 11 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ
As Figuras 5Α a 5F mostram o modelo de coloração com Calretinina do epitélio sensitivo do ouvido interno. As secções através do utrículo de ninhadas E16.5 de tipo selvagem (Figuras A5 e 5C) e Mathl^~Gal/^Gal (Figuras 5B e 5D) foram contra-coradas com iodeto de propídio (vermelho) para microscopia confocal. As secções foram cortadas através da cristã ampular de tipo selvagem E18.5 (Figura 5E) e Mathlβ~ Gai/fi-Gai (pigura ςρ) foram contra-coradas com DAPI (azul) para microscopia imunofluorescente. A cristã é cortada num ângulo oblíquo, que é responsável pelas múltiplas camadas de células ciliares (Figura 5E). A imunocoloração de Calretinina (verde, setas) é evidente nas células ciliares de ratinhos de tipo selvagem (Figuras 5A, 5C e 5E) mas não de ratinhos nulos (Figuras 5B, 5D e 5F). As áreas em caixas nas Figuras 5A e 5B indicam as regiões amplificadas nas Figuras 5C e 5D. A escala de barras iguala 100 pm (Figuras 5A e 5B), 15 pm (Figuras 5C e 5D) e uma amplificação original de x200 (Figuras 5E e 5F). A Figura 6A e 6B mostra o modelo de expressão de Mathl na cartilagem articular de ratinho utilizando o heterozigoto Mathl+/^Gal. A Figura 6A mostra o modelo de coloração de um membro anterior de ratinho P14 e demonstra a expressão em todas as articulações. A Figura 6B é uma amplificação (20x) de uma articulação do cotovelo do mesmo ratinho que demonstra que Mathl é exclusivamente expresso nos condrócitos articulares não ossifiçados. A Figura 7A a 7C mostra a substituição da região de codificação Mathl pelo gene lacZ. A Figura 7A, Topo, tem um mapa do lócus genómico de Mathl. A região de codificação é mostrada como uma caixa negra. Os sítios das sondas utilizadas para detectar os alelos de tipo selvagem e mutante são mostrados como barras a negro. 0 vector alvo está no meio com locais para recombinação homóloga indicados por Xs grandes. No lócus alvo mostrado no fundo, lacZ é traduzido sob o controlo de elementos reguladores de Mathl. A Figura 7B demonstra análise de mancha Southern de células germinativas embrionárias utilizando a sonda externa 3'. A banda superior representa o alelo wt e a banda inferior o alelo mutante alvo (mut) em clones alvo. A Figura 7C demonstra a análise de mancha Southern do ADN da descendência de ratinhos heterozigóticos que demonstra a presença do alelo alvo e a 12 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ ausência do alelo de tipo selvagem em ratinhos Mathl^gal/^~gal (asteriscos) . As abreviaturas são como se segue: (A) Apal; (H) HindiII; (RI) EcoRI; (S) Sall; e (X) Xbal.
As Figuras 8A a 8H mostram a expressão de Mathl/lacZ e o fenótipo cerebral em ratinhos Mathl+/Íi~gal e Mathl®~gal/®~gal. a Figura 8A mostra a expressão de Mathl/lacZ no tubo neural dorsal a E9.5 e E10.5 (Figura 8B). A Figura 8C indica que uma secção através do cérebro posterior em E10.5 tem expressão de Mathl/lacZ na porção dorsal (setas). A Figura 8D demonstra que numa secção de medula espinal de embrião E12.5, as células dorsais migram ventralmente (setas). A Figura 8E mostra que a expressão de E14.5 é observada nos progenitores EGL no lábio rômbico e nas células migrantes que vão povoar EGL. A Figura 8F demonstra que em ratinhos Mathl,}~9al/^gal, a expressão de Mathl/lacZ está limitada a algumas células no lábio rômbico, que é significativamente reduzido em tamanho. A Figura 8G mostra que em PO Mathl/lacZ é expresso nas EGL. A Figura 8H demonstra que EGL está ausente em ratinhos nulos. A amplificação original para as Figuras 8C a 8H foi de lOOx. A Figura 9A a 9G mostra a expressão de Mathl/lacZ no ouvido interno e no tronco cerebral e a análise histológica do núcleo pontino ventral. Coloração por X-gal da cristã utricular de E18.5 Mathl+/^gal (Figura 9A) e do epitélio sensitivo do ouvido interno de Mathl+/Íi~gal (Figura 9B) e Mathlfi~gal/fi~gal (Figura 9C) . A expressão de Mathl/lacZ na camada de células ciliares superiores do epitélio sensitivo (Figuras 9A e 9B) e a característica de aspecto de cálice (ponta de seta). Nos ratinhos nulos, a coloração por X-gal de células epiteliais é não específica na ausência de células ciliares (Figura 9C) . É demonstrada a coloração por X-gal do cérebro completo de Mathl+/p~gal (Figura 9D) e Mathl^gal/^gal (Figura 9E) a E18.5. Há coloração positiva do núcleo pontino (ponta de seta) e do cerebelo (seta) em ratinhos Mathl+/p~gal, que está ausente ou muito reduzida em mutantes nulos quer no cerebelo quer no núcleo pontino (inserido). As Figuras 9F e 9G mostram a coloração com hematoxilina e eosina de secções sagitais através das pontes (pontes de Varólio) de um tipo selvagem e mutante nulo (Figuras 9F e 9G, respectivamente), o que mostra a perda do núcleo pontino ventral em mutantes nulos. As 13 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ amplificações originais foram as seguintes: (A) 400x (B & C) lOOOx, (D & E) 8x, inserido em D & E lOOx, (F & G) lOx.
As Figuras 10A a 10E demonstram que Mathl/lacZ é expresso em condrócitos das articulações. A coloração por X-gal dos embriões completos em E12.5 (Figura 10A) e E16.5 (Figura 10B) ilustra que Mathl/lacZ é expresso em todas as articulações (Figura 10C). A secção horizontal através da articulação do cotovelo de ratinhos MatM+//3~9aI E18.5 mostra que é expresso nos restantes condrócitos (seta). A Figura 10D mostra uma secção horizontal através de uma articulação húmero-radial a PIO que tem expressão nos condrócitos articulares (ponta de seta) e nos restantes condrócitos (seta). A Figura 10E mostra uma amplificação alta de uma secção através de uma articulação do pulso que indica que Mathl/lacZ é expresso em condrócitos articulares. A amplificação original é como se segue: (C) lOx; (D) 20x; e (E) 40x.
As Figuras 11A a 11L mostram a expressão de Mathl/lacZ em células de Merkel. Para identificar as estruturas coradas na pele ciliada e não ciliada, os embriões da ninhada E16.5 foram corados como montes completos, seccionados e microscopicamente examinados. São mostradas secções através das vibrissas (Figura 11A), almofada da pata em baixo (Figura 11B) e amplificação alta da região marcada por uma seta em B (Figura 11C), e pele ciliada (Figura 11D). Em todas as secções, a localização das células coradas foi a esperada a partir de células de Merkel. Para se procurarem defeitos macroscópicos em ratinhos nulos, tiraram-se fotografias de grande plano através de um estereomicroscópio de ratinhos de ninhada Mathl+/(i~gal (controlo, quadros E-H) e Mathlíi~gal/^gal (nulo, quadros I-L). A coloração em ratinhos nulos parecia mais forte devido a um efeito de dosagem nas vibrissas (E, I), articulações dos membros (F, J) e almofadas das patas (G, K). Por contrário, a intensidade de coloração de ratinhos nulos (J, L) foi marcadamente mais fraca do que a de ratinhos heterozigóticos (F, H) em cúpulas de tacto associadas â pele ciliada. As amplificações originais foram as seguintes: A x200 ; B x50; C x400; D x500; E-G-H-I-K-L x32; F-J xl6. 14 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ
As Figuras 12Α a 12E mostram a ausência de cúpulas de tacto coradas com lacZ em ratinhos Tabby. As fêmeas
Tabby/Tabby foram cruzadas com machos Mathl+/Ii gal, e a sua descendência foi corada com X-gal e determinado o sexo a E16.5. A coloração à volta das vibrissas primárias no focinho foi detectada quer em embriões fêmea heterozigóticos para a mutação Tabby (Figura 12A) quer em embriões macho hemizigóticos para a mutação (Figura 12B). As vibrissas secundárias, que são conhecidas por variarem em número nos mutantes Tabby (setas a preto), foram também coradas. A coloração das cúpulas de tacto foi menos intensa nas fêmeas Tabby/X (Figura 12D) do que em embriões Mathl+/0~gal (wt para Tabby) (Figura 12C), uma vez que Tabby é uma mutação semidominante. No entanto, foram detectados fragmentos de cúpulas de tacto coradas num embrião fêmea que possuíam um alelo de tipo selvagem no lócus Tabby (Figura 12A, seta vermelha, e 12D). Por contrário, um macho hemizigótico carecia completamente quer de coloração quer de cúpulas de tacto, devido à perda dos folículos ciliares que extinguem o desenvolvimento de células de Merkel (Figuras 12B e 12E).
As Figuras 13A a 13F demonstram a análise de marcadores de células de Merkel em ratinhos de tipo selvagem e nulos Mathl. As secções de pele de Mathl+/+ e Mathl^gal/Íi~gal reagiram com anticorpos contra MATH1 (Figuras 13A e 13B), citoqueratina 18 (Figuras 13C e 13D) e cromogranina A (Figuras 13E e 13F). Os anticorpos policlonais para MATH1 identificam núcleos basais múltiplos em folículos ciliares abdominais raros de ratinhos de tipo selvagem (Figura 13A) mas não de ratinhos mutantes (Figura 13B). Os anticorpos monoclonais para citoqueratina 18 e cromogranina A identificam células de Merkel quer em ratinhos de tipo selvagem (Figuras 13C e 13E) quer em mutantes (Figuras 13D e 13F). A amplificação original foi de lOOx.
As Figuras 14A a 14G mostram que Mathl auxilia a falta de neurónios cordotonais em embriões mutantes de Drosophila ato. A Figura 14A mostra uma vista dorsal do tórax de uma mosca de tipo selvagem. É de observar que há filas de pêlos regulares ou macroquetas. A Figura 14B mostra uma vista similar de uma mosca transgénica na qual Mathl foi sobrexpresso utilizando o sistema UAS/GAL4 (Brand e Perrimon, 15 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ 1993). Esta expressão ectópica conduz a numerosos pêlos extra que são órgãos sensitivos externos (um outro tipo de mecanorreceptor), não CHOs. As CHOs ectópicas foram produzidas em muitas outras regiões. A Figura 14C mostra uma vista lateral de dois aglomerados abdominais contendo 6 CHOs adicionalmente aos orgãos sensitivos externos, revelados por um anticorpo específico neuronal (Mab 22C10). As 5 CHOs laterais formam um aglomerado e a sexta é dorsal ao aglomerado. A Figura 14D mostra uma vista similar de um embrião mutante ato que apresenta falta de CHOs. A Figura 14E demonstra que a expressão ubíqua de Mathl induz novos neurónios CHO em embriões mutantes ato na localização adequada. A Figura 14F mostra a hibridização in situ de todo o cérebro de terceiro instar utilizando ADNc ato como uma sonda. É de observar a expressão nos lobos ópticos em desenvolvimento (modelos de expressão "ferradura") e dois aglomerados pontuados de células no meio dos lobos cerebrais (ponta das setas). A Figura 14G mostra que a expressão de Mathl em Drosophila induz a formação de CHO em localizações normais e ectópicas. 0 ( + ) indica a presença de CHOs e o (-) indica a sua ausência. 0 número de (+) na primeira coluna é utilizado para quantificar o aumento relativo no número de CHOs observadas quando o Mathl é expresso.
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO 0 termo "alteração" como aqui utilizado é definido como um qualquer tipo de alteração ou modificação no ácido nucleico ou no aminoácido. A referida alteração ou modificação inclui uma qualquer mutação, deleção, rearranjo, adição num ácido nucleico. Isto inclui o processamento pós-transcricional tal como a adição de um cap 5', processamento de intrão e poliadenilação. As mutações podem ser sem sentido, sentido errado, mudança de estrutura ou podem conduzir a um aminoácido truncado ou podem alterar a conformação do aminoácido. A alteração num aminoácido pode estar presente em sequências reguladoras ou pode afectar factores de trans-actuação. Podem também estar presentes alterações múltiplas. A referida alteração ou modificação inclui também uma qualquer alteração num aminoácido incluindo metilação, miristilação, acetilação, glicosilação ou uma alteração nos sinais associados ao processamento do referido 16 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ aminoácido, incluindo sinais de localização intracelulares ou intercelulares e clivagem de aminoácidos estranhos. A referida alteração pode também afectar a degradação ou o dobramento da referida proteína. A sequência de aminoácidos "associada a atonal" tem ou a sequência de ácido nucleico "associada a atonal" codifica um polipéptido que tem, pelo menos, 8 0% de identidade para a sequência AANARERRRMHGLNHAFDQLR. 0 termo "defeito" como aqui utilizado é definido como uma alteração, mutação, imperfeição ou perda de expressão de uma sequência associada a atonal. Um executante perito sabe que a perda de expressão diz respeito a níveis de expressão de uma sequência associada a atonal que não são significativos ou detectáveis por meios padrão na arte. Um executante perito sabe que a perda, ou ausência, de níveis de expressão num organismo adulto, tal como um humano, ocorre naturalmente e conduz a insuficiência de audição ao longo do tempo. Assim, "defeito" como aqui utilizado inclui a redução natural ou perda de expressão de uma sequência associada a atonal. 0 termo "distribuição" como aqui utilizado é definido como trazer para um destino e inclui a administração, como para um fim terapêutico. 0 termo "veículo de distribuição" como aqui utilizado é definido como uma entidade que está associada à transferência de uma outra entidade. 0 referido veículo de distribuição que é seleccionado a partir do grupo constituído por um vector adenoviral, um vector retroviral, um vector adeno-associado, um plasmídeo, um lipossoma, um ácido nucleico, um péptido, um lípido, um hidrato de carbono e uma sua combinação. 0 termo "condição detectável" como aqui utilizado é definido como um qualquer estado de saúde ou estado de um animal, órgão ou tecido, caracterizado por sintomas de desenvolvimento ou patológicos específicos. Exemplos incluem mas não estão limitados a perda de células ciliares, deficiência de neurónios granulares cerebrais, insuficiência 17 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ auditiva, desequilíbrio, doença articular, osteoartrite e proliferação anormal de células. 0 termo "heterólogo" como aqui utilizado é definido como sequência de ácido nucleico que é de ou referente à sequência de ácido nucleico que não ocorre naturalmente num lócus particular. Numa concretização alternativa, a sequência de ácido nucleico heteróloga ocorre naturalmente num lócus particular, e contém uma alteração molecular comparada ao lócus que ocorre naturalmente. Por exemplo, um lócus de tipo selvagem de uma sequência associada a atonal pode ser utilizado para substituir uma cópia defeituosa da mesma sequência. 0 termo "perturbação do equilíbrio" como aqui utilizado é definido como uma condição médica na qual um organismo tem equilíbrio insuficiente. Numa concretização específica a insuficiência é devida a um defeito de origem vestibular. Numa outra concretização específica, a perturbação é uma perturbação vestibular de percepção do equilíbrio incluindo mas não limitada a doença de Meniére, vertigem e labirintite. 0 termo "inactivado" como aqui utilizado é definido como um estado no qual a expressão de uma sequência de ácido nucleico é reduzida ou completamente eliminada. A referida inactivação pode ocorrer por transferência ou inserção de uma outra sequência de ácido nucleico ou por um qualquer meio padrão na arte para afectar os níveis de expressão de uma sequência de ácido nucleico. 0 termo "precursores" como aqui utilizado é definido como células progenitoras a partir das quais outras células derivam a sua origem e/ou propriedades. 0 termo "sequência descritora regulável" como aqui utilizado é definido como uma qualquer sequência que dirige a transcrição de uma outra sequência e que ela mesma está sob controlo regulador por um factor ou estado extrínseco. Exemplos de factores ou estados extrínsecos incluem mas não estão limitados â exposição a químicos, ácidos nucleicos, proteínas, péptidos, lípidos, hidratos de carbono, açúcares, luz, som, hormonas, tacto ou meio específico de tecido. 18 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ
Exemplos de sequências descritoras reguláveis incluem a sequência promotora GAL e a sequência promotora/transactivadora da tetraciclina. 0 termo "sequência reguladora" como aqui utilizado é definido como uma qualquer sequência que controla directa ou indirectamente a transcrição de uma outra sequência. 0 referido controlo pode ser relativo à iniciação ou cessação da transcrição ou relativo â quantidade ou distribuição pelos tecidos da transcrição. 0 termo "sequência descritora" como aqui utilizado é definido como uma qualquer sequência que demonstra expressão por uma sequência reguladora. A referida sequência descritora pode ser utilizada como um marcador na forma de um ARN ou de uma proteína. Exemplos de sequências descritoras são β-galactosidase, proteína fluorescente verde (GFP) , proteína fluorescente azul (BFP), neomicina, canamicina, luciferase, β-glucuronidase e cloranfenicol-transferase (CAT). Num aspecto específico do presente invento, a presença e quantidade do produto de sequência descritora, quer seja um ácido nucleico quer seja um aminoácido, reflecte o nível de transcrição pela sequência promotora que o regula. 0 termo "terapeuticamente eficaz" como aqui utilizado é definido como a quantidade de um composto necessária para melhorar algum sintoma associado a uma doença. Por exemplo, no tratamento da insuficiência auditiva, um composto que melhore a audição num qualquer grau ou pare qualquer sintoma de insuficiência auditiva podia ser terapeuticamente eficaz. No tratamento de uma doença articular, um composto que melhore a saúde e movimento de uma articulação num qualquer grau ou pare um qualquer sintoma de uma doença articular podia ser terapeuticamente eficaz. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto não é necessária para curar uma doença mas vai proporcionar um tratamento para a doença. 0 termo "vector" como aqui utilizado é definido como um veículo biológico para distribuição de uma entidade específica. Numa concretização específica, a entidade é um ácido nucleico associado a atonal. 19 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ Ο invento refere-se à utilização de uma sequência de ácido nucleico ou de aminoácidos associada a atonal para a utilização terapêutica de condições detectáveis tais como perda de células ciliares, insuficiência auditiva, perturbação do equilíbrio, doença articular e osteoartrite.
As sequências aqui proporcionadas e os correspondentes números de Acesso ao GenBank são indicadas parenteticamente como se segue: SEQ ID N0:1 (NM-005172) ; SEQ ID NO: 2 (NP_ 005163.1) ; SEQ ID NO: 3 (AW413228); SEQ ID NO: 4 (NM_009719);
SEQ ID NO: 5 (NP_033849.1) ; SEQ ID NO: 6 (NM_009718); SEQ ID NO: 7 (NP-033848.1) SEQ ID NO:8 (NM_009717); SEQ ID NO:9 (NP_ 033847.1) ; SEQ ID NO:10 (NM_007500); SEQ ID NO:ll (NP_ 031526.1) ; SEQ ID NO:12 (NM_007501); SEQ ID NO:13 (AW280518); SEQ ID NO: 14 (AW236965 ); SEQ ID NO: 15 (AW163683 ); SEQ ID NO:16 (AF134869); SEQ ID NO:17 AAD31451.1) ; SEQ ID NO: 18 (AJO 12660); SEQ ID NO: 19 (CAA10106.1); SEQ ID NO: 20 (AJO 12659); SEQ ID NO: 21 (CAA10105.1); SEQ ID NO: 22 (AF071223) ; SEQ ID NO : 23 (AAC68868.1); SEQ ID NO: 24 (U76208); SEQ ID NO: 25 (AAC53029 .1); SEQ ID NO:26 (U76210) ; SEQ ID NO:27 (AAC53033.1); SEQ ID NO: 28 (U76209); ? SEQ ID NO: 29 (AAC53032.1); SEQ ID NO: 30 (U76207); SEQ ID NO: 31 (AAC53028.1); SEQ ID NO: 32 (AF036257); SEQ ID NO: 33 (AAC15969.1); SEQ ID NO: 34 (AF034778); SEQ ID NO: 35 (AJO01178) ; SEQ ID NO : 3 6 (CAA04572.1); SEQ ID NO: 37 (Y07621); SEQ ID NO: 38 (CAA68900. D ; SEQ ID NO:39 (AF024536); SEQ ID NO:4 0 (AAB82272.1) ; SEQ ID NO: 41 (D85188); ; SEQ ID NO: 42 (BAA12738.1); SEQ ID NO: 43 (D44480); SEQ ID NO:44(BAA07923.1); SEQ ID NO:45 (D43694); SEQ ID NO: 46 (BAA07791.1); SEQ ID NO: 47 (D85845); SEQ ID NO: 48 (BAA12880.1); SEQ ID NO: 49 (U93171); SEQ ID NO: 50 (AAB58669.1); SEQ ID NO: 51 (U93170); SEQ ID NO: 52 (AAB58668.1); SEQ ID NO: 53 (U61152); SEQ ID NO: 54 (AAB41307.1); SEQ ID NO: 55 (U61151); SEQ ID NO: 56 (AAB41306.1); SEQ ID NO: 57 (U61148); SEQ ID NO: 58 (AAB41305.1); SEQ ID NO: 59 (U61149); SEQ ID NO: 60 (AAB41304.1); SEQ ID NO: 61 (U61150); SEQ ID NO: 62 (AAB41303.1); SEQ ID NO: 63 (L36646); SEQ ID NO: 64 (AAA21879.1); SEQIDNO:69 (AA625732). O invento refere-se ao tratamento de um animal, incluindo um humano, para promoção do crescimento de células 20 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ mecanorreceptoras do ouvido interno, para produção de células ciliares do ouvido interno, para tratamento da insuficiência ou perturbação auditiva e para tratamento de uma doença articular. Administra-se uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma sequência de ácido nucleico ou de aminoácidos associada a atonal. Em concretizações específicas a referida administração é por um vector seleccionado a partir de um vector virai (incluindo bacteriófago, vírus de animal e planta), um plasmídeo, cosmídeo ou um qualquer outro vector à base de ácido nucleico, um lipossoma, um ácido nucleico, um péptido, um lípido, um hidrato de carbono e uma combinação dos referidos vectores. Numa concretização específica o referido vector virai é um vector de adenovírus, um vector de retrovírus ou um vector adeno-associado, incluindo um vector lentivírus, vector de vírus Herpes, vector de alfa-vírus, etc. Assim, o vector pode ser virai ou não virai. Numa concretização preferida o referido vector é um vector de adenovírus compreendendo uma sequência promotora de citomegalovírus IE e uma sequência de sinal de poliadenilação precoce SV40. Numa outra concretização específica, a referida célula é uma célula humana. Numa concretização específica adicional, a referida doença articular é osteoartrite. Numa concretização específica adicional, a célula contém uma alteração numa sequência de aminoácidos associada a atonal, em que a referida sequência de aminoácidos tem, pelo menos, 80% de identidade a cerca de 20 resíduos de aminoácidos contíguos de SEQ ID NO:58. 0 invento refere-se ao tratamento de um animal em necessidade de tratamento para uma insuficiência auditiva, uma perturbação do equilíbrio, uma doença articular, ou em necessidade de promoção do crescimento celular mecanorreceptor. Distribui-se numa célula do animal, um factor de transcrição tendo um aminoácido com pelo menos, 80% de identidade, e mais preferivelmente, pelo menos, cerca de 90% de identidade para a sequência AANARERRRMHGLNHAFDQLR. Nalgumas concretizações, a célula do animal está localizada no ouvido interno do animal. De preferência, o factor de transcrição compete com atonal para ligação à proteína Daughterless (Jarman et al., 1993) ou compete para ligação com Math-1 à proteína E47 (Akazawa et al., 1995). 21 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ
Numa concretização preferida do presente invento há composições para tratar um organismo quanto a várias condições médicas, aqui discutidas, compreendendo uma sequência de ácido nucleico ou uma sequência de aminoácidos associada a atonal em combinação com um veículo de distribuição, em que o referido organismo compreende um defeito na sequência de ácido nucleico associada a atonal. Um executante perito sabe que um organismo adulto, tal como um humano adulto, não expressa naturalmente atonal em níveis significativos ou detectáveis, mas por contrário expressa atonal numa fase embrionária de desenvolvimento (ver os Exemplos). Assim, numa concretização preferida, as composições para tratar um organismo como aqui discutido, incluem composições para tratar organismos que não contêm uma mutação numa sequência de ácido nucleico ou de aminoácidos atonal, mas que têm naturalmente atonal já não expresso em níveis significativos ou detectáveis.
Numa outra concretização do presente invento está uma composição compreendendo uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácido nucleico associada a atonal em combinação com um veículo de distribuição, em que o referido veículo distribui uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma sequência de ácido nucleico ou uma sequência de aminoácidos associada a atonal numa célula. Em concretizações específicas, o referido veículo é o domínio de ligação de receptor de uma toxina bacteriana ou uma qualquer molécula de fusão ou é um domínio de transdução proteica. Numa concretização específica, o referido domínio de transdução proteica é do péptido TAT de VIH.
Numa outra concretização do presente invento está uma composição para tratar um organismo quanto â perda de células ciliares, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa concretização específica, o defeito é uma mutação ou alteração da referida sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa outra concretização específica, o defeito afecta uma sequência reguladora da referida sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa concretização adicional do presente invento, está uma composição para tratar um organismo quanto à perda de células ciliares, em que o 22 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ referido organismo compreende um defeito numa sequência de ácido nucleico que está associado à regulação de uma sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa concretização adicional do presente invento está uma composição para tratar um organismo quanto à perda de células ciliares, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de aminoácidos que está associado à regulação de uma sequência de ácido nucleico associada a atonal.
Numa outra concretização do presente invento está uma composição para tratar um organismo quanto à insuficiência auditiva, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa concretização específica, o defeito é uma mutação ou alteração da referida sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa outra concretização específica, o defeito afecta uma sequência reguladora da referida sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa concretização adicional do presente invento está uma composição para tratar um organismo quanto â insuficiência auditiva, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de ácido nucleico que está associado à regulação de uma sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa concretização adicional do presente invento está uma composição para tratar um organismo quanto à insuficiência auditiva, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de aminoácidos que está associado à regulação de uma sequência de ácido nucleico associada a atonal.
Numa outra concretização do presente invento está uma composição para tratar um organismo quanto a uma perturbação do equilíbrio, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa concretização específica, o defeito é uma mutação ou alteração da referida sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa outra concretização específica, o defeito afecta uma sequência reguladora da referida sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa concretização adicional do presente invento está uma composição para tratar um organismo quanto a uma perturbação do equilíbrio, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de ácido nucleico que está associado à regulação de uma sequência de 23 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ ácido nucleico associada a atonal. Numa concretização adicional do presente invento está uma composição para tratar um organismo quanto a desequilíbrio, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de aminoácidos que está associado à regulação de uma sequência de ácido nucleico associada a atonal.
Numa outra concretização do presente invento está uma composição para tratar um organismo quanto à osteoartrite, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa concretização específica, o defeito é uma mutação ou alteração da referida sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa outra concretização específica, o defeito afecta uma sequência reguladora da referida sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa concretização adicional do presente invento está uma composição para tratar um organismo quanto à osteoartrite, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de ácido nucleico que está associado à regulação de uma sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa concretização adicional do presente invento está uma composição para tratar um organismo quanto à osteoartrite, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de aminoácidos que está associado à regulação de uma sequência de ácido nucleico associada a atonal.
Numa outra concretização do presente invento está uma composição para tratar um organismo quanto a uma doença articular, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa concretização específica, o defeito é uma mutação ou alteração da referida sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa outra concretização específica, o defeito afecta uma sequência reguladora da referida sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa concretização adicional do presente invento está uma composição para tratar um organismo quanto a uma doença articular, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de ácido nucleico que está associado à regulação de uma sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa concretização adicional do presente invento está uma composição para tratar um organismo quanto a 24 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ uma doença articular, em que o referido organismo compreende um defeito numa sequência de aminoácidos que está associado à regulação de uma sequência de ácido nucleico associada a atonal. SISTEMAS DE EXPRESSÃO À BASE DE ÁCIDO NUCLEICO 1. Vectores
Um perito na arte estará bem equipado para construir um vector através de técnicas recombinantes padrão, que estão descritas em Sambrook et al., 1989 e Ausubel et al., 1994, ambos aqui incorporados por referência. 0 termo "vector de expressão" refere-se a um vector contendo uma sequência de ácido nucleico que codifica, pelo menos, parte de um produto genético capaz de ser transcrito. Nalguns casos, as moléculas de ARN são depois traduzidas numa proteína, polipéptido ou péptido. Noutros casos, estas sequências não são traduzidas, por exemplo, na produção de moléculas anti-sentido ou ribozimas. Os vectores de expressão podem conter uma variedade de "sequências de controlo", as quais se referem a sequências de ácido nucleico necessárias para a transcrição e possivelmente tradução de uma sequência de codificação operativamente ligada num organismo hospedeiro particular. Adicionalmente às sequências de controlo que governam a transcrição e tradução, os vectores e vectores de expressão podem conter sequências de ácido nucleico que também prestam outras funções e são descritos infra. a. Promotores e Intensificadores
Um "promotor" é uma sequência de controlo isto é, uma região de uma sequência de ácido nucleico na qual são controlados o início e a velocidade de transcrição. Ele pode conter elementos genéticos aos quais se podem ligar proteínas e moléculas reguladoras tais como ARN-polimerase e outros factores de transcrição. Um promotor pode ou não ser utilizado em conjunto com um "intensificador", o qual se refere a uma sequência reguladora que actua em cis envolvida na activação transcricional de uma sequência de ácido nucleico. 25 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ
Naturalmente, será importante utilizar um promotor e/ou intensificador que dirija eficazmente a expressão do segmento de ADN no tipo de célula, organelo e organismo escolhido para expressão. Aqueles peritos na arte de biologia molecular conhecem geralmente a utilização de promotores, intensificadores e associações de tipos de células para expressão de proteínas, por exemplo, ver Sambrook et al. (1989), aqui incorporado por referência. Os promotores utilizados podem ser constitutivos, específicos de tecidos, induzíveis e/ou úteis sob condições adequadas para dirigir a expressão de alto nível do segmento de ADN introduzido, tal como é vantajoso na produção a larga escala de proteínas e/ou péptidos recombinantes. 0 promotor pode ser heterólogo ou endógeno. A identidade dos promotores ou elementos específicos de tecido, assim como os testes para caracterizar a sua actividade, são bem conhecidos daqueles peritos na arte. Exemplos de tais regiões incluem o gene LIMK2 humano (Nomoto et al. 1999), o gene de receptor 2 de somatostatina (Kraus et al., 1998), o gene de ligação a ácido retinóico epididimal de murino (Lareyre et al., 1999), CD4 humano (Zhao-Emonet et al., 1998), alfa2-colagénio (XI) de ratinho (Tsumaki, et al., 1998), gene receptor da dopamina DIA (Lee, et al., 1997), factor II de crescimento semelhante a insulina (Wu et al., 1997), molécula-1 de adesão a células endoteliais de plaquetas humanas (Almendro et al., 1996). b. Sinais de Iniciação e Sítios de Ligação de Ribossomas Internos
Um sinal de iniciação específico pode também ser necessário para tradução eficaz das sequências de codificação. Estes sinais incluem o codão de iniciação ATG ou sequências adjacentes. Os sinais de controlo traducional exógenos, incluindo o codão de iniciação ATG podem ter que ser fornecidos. Um perito na arte será rapidamente capaz de determinar isto e proporcionar os sinais necessários. Sabe-se bem que o codão de iniciação deve estar "em-linha" com a estrutura de leitura da sequência de codificação desejada para assegurar a tradução do inserido completo. Os sinais de controlo traducional exógenos e os codões de iniciação podem 26 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ ser naturais ou sintéticos. A eficiência de expressão pode ser aumentada pela inclusão de elementos intensificadores de transcrição adequados.
Em certas concretizações do invento, a utilização de elementos de sítios de entrada de ribossomas internos (IRES) é utilizada para criar mensagens multigene ou policistrónicas. Os elementos IRES podem ser ligados a estruturas de leitura aberta heterólogas. Podem ser transcritas em conjunto múltiplas estruturas de leitura aberta, cada uma separada por um IRES, o que cria mensagens policistrónicas. Devido ao elemento IRES, cada estrutura de leitura aberta é acessível aos ribossomas para tradução eficaz. Podem ser eficazmente expressos genes múltiplos utilizando um único promotor/intensificador para transcrever uma única mensagem (ver Patentes U.S. Nos. 5925565 e 5935819, aqui incorporadas por referência). c. Sítios de Clonagem Múltipla
Os vectores podem incluir um sítio de clonagem múltipla (MCS), que é uma região de ácido nucleico que contém múltiplos sítios de enzima de restrição, qualquer um dos quais pode ser utilizado em conjunto com a tecnologia recombinante padrão para digerir o vector. (Ver Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, e Cocea, 1997, aqui incorporados por referência.) d. Sítios de Corte A maioria das moléculas de ARN eucariótico traduzidas vai sofrer cortes do ARN para remover intrões a partir dos transcritos primários. Os vectores contendo sequências eucarióticas genómicas podem necessitar de sítios de corte dador e/ou aceitador para assegurar o processamento adequado do transcrito para expressão da proteína. (Ver Chandler et al., 1997, aqui incorporado por referência.) e. Sinais de Poliadenilação
Aquando da expressão, vai ser tipicamente incluído um sinal de poliadenilação para efectuar a poliadenilação adequada do transcrito. Concretizações específicas incluem o sinal de poliadenilação SV40 e/ou o sinal de poliadenilação 27 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ de hormona do crescimento de bovino, adequado e/ou conhecido por funcionar bem em várias células alvo. f. Origens de Replicação
De modo a propagar um vector numa célula hospedeira, ele pode conter uma ou mais origens de sítios de replicação (frequentemente denominados "ori"), que são uma sequência de ácido nucleico específica na qual se inicia a replicação. g. Marcadores Seleccionáveis e Analisáveis
Em certas concretizações do invento, as células contêm a construção de ácido nucleico do presente invento, e a célula pode ser identificada in vitro ou in vivo por inclusão de um marcador no vector de expressão. Tais marcadores vão conferir uma alteração identificável à célula permitindo a fácil identificação de células contendo o vector de expressão. Geralmente, um marcador seleccionável é aquele que confere uma propriedade que permite a selecção. Um marcador seleccionável positivo é aquele no qual a presença do marcador permite a sua selecção, enquanto que um marcador seleccionável negativo é aquele no qual a sua presença impede a sua selecção. Um exemplo de um marcador seleccionável positivo é um marcador de resistência a fármaco.
Normalmente, a inclusão de um marcador de selecção de fármaco ajuda na clonagem e identificação de transformantes, por exemplo, os genes que conferem resistência à neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol são marcadores seleccionáveis úteis. Adicionalmente, aos marcadores que conferem um fenotipo que permite a discriminação de transformantes baseada na implementação de condições, são também contemplados outros tipos de marcadores incluindo marcadores analisáveis tais como GFP ou GFP intensificado, cuja base é a análise colorimétrica. Alternativamente, podem ser utilizadas enzimas analisáveis tais como timidina-quinase (tk) de vírus herpes simplex ou cloranfenicol-acetiltransferase (CAT). Um perito na arte saberá também como utilizar marcadores imunológicos, possivelmente em conjunto com a análise FACS. Outros exemplos de marcadores seleccionáveis e analisáveis são bem conhecidos de um perito na arte. 28 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ 2. Sistemas de Expressão
Existem numerosos sistemas de expressão que compreendem, pelo menos, uma parte ou todas as composições acima discutidas. Os sistemas à base de procariotas e/ou eucariotas podem ser utilizados com o presente invento para produzir sequências de ácido nucleico ou seus polipéptidos, proteínas e péptidos cognatos. Muitos destes sistemas estão comercial e amplamente disponíveis. 0 sistema de célula de insecto/baculovírus pode produzir um nível elevado de expressão de proteína de um segmento de ácido nucleico heterólogo, tal como descrito nas Patentes U.S. Nos. 5871986, 4879236, ambas aqui incorporadas por referência, e que pode ser comprado, por exemplo, sob o nome MAXBAC® 2.0 de INVITROGEN® e BACPACK™ BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM de CLONTECH®. São bem conhecidos na arte outros exemplos de sistemas de expressão.
Detecção de Acido Nucleico
Adicionalmente à sua utilização na direcção da expressão de proteínas, polipéptidos e/ou péptidos associados a atonal, as sequências de ácido nucleico aqui descritas têm uma variedade de outras utilizações. Por exemplo, elas têm utilidade como sondas ou iniciadores ou em qualquer um dos métodos das concretizações que envolvem hibridização de ácido nucleico, amplificação de sequências de ácido nucleico, detecção de ácidos nucleicos e outros testes. Um executante perito tem conhecimento das patentes seguintes relativas aos detalhes destes métodos: Patente U.S. No. 5840873; Patente U.S. No. 5843640; Patente U.S. No. 5843650; Patente U.S. No. 5843651; Patente U.S. No. 5843663; Patente U.S. No. 5846708; Patente U.S. No. 5846709; Patente U.S. No. 5846717; Patente 5846729; Patente U.S. No. Patente U.S. No. 5849483; U.S. No. 5846726; Patente U.S. No. 5846783; Patente U.S. No. 5849481;
Patente U.S. No. 5849486; Patente U.S. No. 5849487; Patente U.S. No. 5849497; Patente U.S. No. 5849546; Patente U.S. No. 5849547; Patente U.S. No. 5851770; Patente U.S. No. 5851772; Patente U.S. No. 5853990; Patente U.S. No. 5853993; Patente U.S. No. 5853992; Patente U.S. No. 5856092; Patente U.S. No. 5858652; Patente U.S. No. 5861244; Patente U.S. No. 5863732; Patente U.S. No. 5863753; Patente U.S. No. 5866331; Patente 29 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ U.S. Νο. 5866336; Patente U.S. Νο. 5866337; Patente U.S. Νο. 5900481; Patente U.S. Νο. 5905024; Νο. Patente U.S. Νο. 5910407; Patente U.S. Νο. 5912124; Patente U.S. Νο. 5912145;
Patente U.S. Νο. 5912148; Patente U.S. Νο. 5916776; Patente U.S. Νο. 5916779; Patente U.S. Νο. 5919626; Patente U.S. Νο. 5919630; Patente U.S. Νο. 5922574; Patente U.S. Νο. 5925517;
Patente U.S. Νο. 5925525; Patente U.S. Νο. 5928862; Patente U.S. Νο. 5928869; Patente U.S. Νο. 5928870; Patente U.S. Νο. 5928905; Patente U.S. Νο. 5928906; Patente U.S. Νο. 5929227;
Patente U.S. Νο. 5932413; Patente U.S. Νο. 5932451; Patente U.S. Νο. 5935791; Patente U.S. Νο. 5935825; Patente U.S. Νο. 5939291; Patente U.S. Νο. 5942391; Pedido de Patente Europeia No. 320 308; Pedido de Patente Europeia. 329 822; Pedido GB No. 2 202 328; Pedido PCT No. PCT/US87/00880; Pedido PCT No. PCT/US89/01025; Pedido PCT WO 88/10315; Pedido PCT WO 89/06700; e Pedido PCT WO 90/07641.
Estojos (Kits)
Todos os materiais e/ou reagentes essenciais necessários para a detecção de uma sequência seleccionada a partir de SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:66, numa amostra, podem ser reunidos num estojo. Este geralmente compreende uma sonda ou iniciadores concebidos para hibridar especificamente nos ácidos nucleicos individuais de interesse na prática do presente invento, tais como as sequências de ácidos nucleicos em SEQ ID NO:l a SEQ ID NO:66. Podem também ser incluídas enzimas adequadas para amplificação de ácidos nucleicos, incluindo várias polimerases (transcriptase inversa, Taq, etc.), desoxinucleótidos e tampões para proporcionar a mistura reaccional necessária para amplificação. Tais estojos podem também incluir enzimas e outros reagentes adequados para detecção de ácidos nucleicos ou produtos de amplificação específicos. Tais estojos compreendem geralmente, em meio adequado, recipientes distintos para cada reagente ou enzima individuais, assim como para cada par de sonda ou iniciador. Ácidos Nucleicos Associados a Atonal A. Ácidos Nucleicos e Suas Utilizações O termo "ácido nucleico" refere-se geralmente a, pelo menos, uma molécula ou cadeia de ADN, ARN ou seu derivado ou imitação, compreendendo, pelo menos, uma nucleobase tal como, 30 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ por exemplo, uma base purina ou pirimidina que ocorre naturalmente encontrada em ADN (por exemplo, adenina "A", guanina "G", timidina "T" e citosina "C") ou ARN (por exemplo, A, G, uracilo "U" e C) . O termo "ácido nucleico" abrange os termos "oligonucleótido" e "polinucleótido". 0 termo "oligonucleótido" refere-se a, pelo menos, uma molécula de entre cerca de 3 a cerca de 100 nucleobases de comprimento. 0 termo "polinucleótido" refere-se a, pelo menos, uma molécula maior do que cerca de 100 nucleobases de comprimento. Estas definições referem-se geralmente a, pelo menos, uma molécula de cadeia simples, mas em concretizações específicas vai também abranger, pelo menos, uma cadeia adicional que é parcial, substancial ou totalmente complementar, pelo menos, à molécula de cadeia simples. Assim, um ácido nucleico pode abranger, pelo menos, uma molécula de cadeia dupla ou, pelo menos, uma molécula de cadeia tripla que compreende uma ou mais cadeia(s) complementar(es) ou "complemento(s)" de uma sequência particular compreendendo uma cadeia da molécula. Como aqui utilizado, um ácido nucleico de cadeia simples pode ser indicado pelo prefixo "ss", um ácido nucleico de cadeia dupla pelo prefixo "ds" e um ácido nucleico de cadeia tripla pelo prefixo "ts".
Os investigadores descrevem, pelo menos, um ácido nucleico que é complementar de um ácido nucleico associado a atonal, por exemplo, pelo menos, um ácido nucleico ou segmento de ácido nucleico complementar às sequências de ácido nucleico descritas em SEQ ID N0:1 a SEQ ID NO:66, das que são sequências de ácido nucleico. 0(s) ácido(s) nucleico(s) que é(são) "complementar(es)" ou "complemento(s)" é(são) aquele (s) que são capazes de emparelhar uma base de acordo com as regras de complementaridade de ligação de Watson-Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen inversa. Como aqui utilizado, o termo "complementar" ou "complemento(s)" refere-se também a ácido(s) nucleico(s) que é(são) substancialmente complementar(es), como se pode avaliar pela mesma comparação de nucleótidos acima descrita. 0 termo "substancialmente complementar" refere-se a um ácido nucleico compreendendo, pelo menos, uma sequência de nucleobases consecutivas ou nucleobases semiconsecutivas se uma ou mais porções nucleobase não estiverem presentes na molécula, que é capaz 31 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ de hibridar em, pelo menos, uma cadeia ou duplex de ácidos nucleicos mesmo se menos do que todas as nucleobases não emparelharem com a nucleobase duplicada.
Em certas concretizações aqui, um "gene" refere-se a um ácido nucleico que é transcrito. Como aqui utilizado, um "segmento genético" é um segmento de ácido nucleico de um gene. Em certos aspectos, o gene inclui sequências reguladoras envolvidas na transcrição ou produção ou composição de mensagens. Em concretizações particulares, o gene compreende sequências transcritas que codificam uma proteína, polipéptido ou péptido. Noutros aspectos particulares, o gene compreende um ácido nucleico associado a atonal e/ou codifica sequências que codificam polipéptido ou péptido associados a atonal. Mantendo a terminologia aqui descrita, um "gene isolado" pode compreender ácido(s) nucleico(s) transcrito(s), sequências reguladoras, sequências de codificação ou semelhantes, substancialmente isoladas de outras sequências, tais como outros genes, sequências reguladoras, sequências de codificação de polipéptido ou péptido que ocorrem naturalmente, etc. A este respeito, o termo "gene" é utilizado por simplicidade para se referir a um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é transcrita e ao seu complemento. Em aspectos particulares, a sequência nucleotídica transcrita compreende, pelo menos, uma unidade de codificação de proteína, polipéptido e/ou péptido, funcional. Como será compreendido por aqueles na arte, este termo de função "gene" inclui quer sequências genómicas, sequências de ARN ou ADNc, quer segmentos de ácidos nucleicos concebidos mais pequenos, incluindo segmentos de ácidos nucleicos de uma parte não transcrita de um gene, incluindo mas não limitados às regiões promotora ou intensificadora não transcritas de um gene. Os segmentos de ácido nucleico de gene concebidos mais pequenos podem expressar ou podem ser adaptados para expressar utilizando a tecnologia de manipulação de ácidos nucleicos, proteínas, polipéptidos, domínios, péptidos, proteínas de fusão, mutantes e/ou semelhantes.
Em certas concretizações, a sequência de ácido nucleico é um ácido nucleico ou um segmento de ácido nucleico. Como aqui utilizado, o termo "segmento de ácido nucleico" são 32 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ fragmentos mais pequenos de um ácido nucleico, tal como por exemplo não-limitante, aqueles que codificam apenas parte da sequência de péptidos ou polipéptidos associados a atonal. Assim, um "segmento de ácido nucleico pode compreender uma qualquer parte da(s) sequência(s) genética(s) associada(s) a atonal, de cerca de 2 nucleótidos até ao comprimento total da região de codificação de péptidos ou polipéptidos associados a atonal. Em certas concretizações, o "segmento de ácido nucleico" abrange a sequência genética associada a atonal de comprimento total. Em concretizações particulares, o ácido nucleico compreende uma qualquer parte da SEQ ID N0:1 a SEQ ID NO:66, de cerca de 2 nucleótidos ao comprimento total da sequência descrita em SEQ ID N0:1 a SEQ ID NO:66.
Em certas concretizações, o segmento de ácido nucleico pode ser uma sonda ou iniciador. Como aqui utilizado, o termo "sonda" é um ácido nucleico utilizado para detecção de um outro ácido nucleico e é geralmente de, pelo menos, cerca de 10 nucleótidos de comprimento. Como aqui utilizado, um "iniciador" é um ácido nucleico utilizado para polimerização de um outro ácido nucleico e que tem geralmente, pelo menos, cerca de 10 nucleótidos de comprimento. Um exemplo não-limitante disto podia ser a criação de segmentos de ácido nucleico de vários comprimentos, e a composição da sequência para sondas e iniciadores com base nas sequências descritas em SEQ ID N0:1 a SEQ ID NO: 66, dos que são sequências de ácido nucleico. 0(s) ácido(s) nucleico(s) do presente invento, independentemente do comprimento da sua sequência, pode(m) ser combinado(s) com outras sequências de ácido nucleico, incluindo mas não limitadas a, promotores, intensificadores, sinais de poliadenilação, sítios de enzima de restrição, sítios de clonagem múltipla, segmentos de codificação e semelhantes, para criar uma ou mais construções de ácido nucleico. Como aqui utilizado, uma "construção de ácido nucleico" é uma molécula recombinante compreendendo, pelo menos, dois segmentos de diferente sequência de ácido nucleico. 0 comprimento total pode variar consideravelmente entre as construções de ácido nucleico. Assim, pode-se utilizar um segmento de ácido nucleico de quase qualquer comprimento, sendo o comprimento total, de preferência, 33 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ limitado pela facilidade de preparação ou utilização no protocolo de ácido nucleico recombinante pretendido.
Em certas concretizações, a construção de ácido nucleico é um vector recombinante. Como aqui utilizado, um "vector recombinante" é um ácido nucleico contendo múltiplos segmentos de ácidos nucleicos utilizado como um veículo para uma sequência de ácido nucleico de interesse. Em certos aspectos, o vector recombinante é uma cassete de expressão. Como aqui utilizado, uma cassete de expressão é um segmento de ácido nucleico que compreende um gene de interesse que pode ser transferido entre diferentes vectores recombinantes por meios bem conhecidos na arte.
Os investigadores descrevem um ou mais vector(es) recombinante(s) comprendendo sequências de ácido nucleico que codifica(m) uma proteína, polipéptido ou péptido associados a atonal que inclui(em) na sua sequência de aminoácidos uma sequência de aminoácidos contígua de acordo com, ou essencialmente como descrito em, SEQ ID NO:2 a SEQ ID NO:66, sequências que são sequências de aminoácidos, correspondendo à sequência associada a atonal de Homo sapiens ou Mus musculus. Os investigadores descrevem vector(es) recombinante(s) compreendendo sequências de ácido nucleico de outras espécies que codificam uma proteína, polipéptido ou péptido associados a atonal que inclui(em) na sua sequência de aminoácidos uma sequência de aminoácidos contígua de acordo com, ou essencialmente como descrito em SEQ ID NO:2 a SEQ ID NO:66, sequências que são sequências de aminoácidos. Em aspectos particulares, os vectores recombinantes são vectores de ADN.
Dever-se-á compreender que as sequências de aminoácidos ou as sequências de ácido nucleico podem incluir resíduos adicionais, tais como aminoácidos N- ou C-terminais ou sequências 5' ou 3', adicionais ou suas combinações variadas, e serem ainda essencialmente como descrito numa das sequências aqui descritas, desde que a sequência cumpra os critérios acima descritos, incluindo a manutenção da actividade biológica de proteína, polipéptido ou péptido onde está relacionada a expressão de uma composição proteinácea. A adição de sequências terminais aplica-se particularmente às 34 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ sequências de ácido nucleico que podem, por exemplo, incluir várias sequências de não codificação que flaqueiam ou as porções 5' e/ou as porções 3' da região de codificação ou podem incluir várias sequências internas, i.e., intrões, que se sabe ocorrerem nos genes.
Por conseguinte, os vectores recombinantes e os segmentos de ácido nucleico podem diversamente incluir estas mesmas regiões de codificação, regiões de codificação que comportam alterações ou modificações seleccionadas na região de codificação básica, e podem codificar polipéptidos ou péptidos maiores que, no entanto, incluem tais regiões de codificação ou podem codificar proteínas, polipéptidos ou péptidos equivalentes biologicamente funcionais que têm sequências de aminoácidos variantes.
Os investigadores descrevem proteínas, polipéptidos ou péptidos associados a atonal equivalentes, biologicamente funcionais ou proteínas, polipéptidos ou péptidos associados a atonal. Tais sequências podem surgir como consequência de redundância de codão ou equivalência funcional que são conhecidos por ocorrerem naturalmente nas sequências de ácido nucleico ou nas proteínas, polipéptidos ou péptidos assim codificados. Alternativamente, as proteínas, polipéptidos ou péptidos funcionalmente equivalentes podem ser criados através da aplicação de tecnologia de ADN recombinante, em que as alterações na estrutura da proteína, polipéptido ou péptido podem ser concebidas, com base nas considerações das propriedades dos aminoácidos a serem alterados. Podem ser introduzidas alterações concebidas pelo homem, por exemplo, através da aplicação de técnicas de mutagénese dirigida ao sítio como aqui discutido abaixo, por exemplo, para introduzir melhorias ou alterações na antigenicidade da proteína, polipéptido ou péptido, ou para testar mutantes de forma a examinar a actividade da proteína, polipéptido ou péptido associados a atonal ao nível molecular.
As proteínas, polipéptidos ou péptidos de fusão podem ser preparados, por exemplo, quando as regiões de codificação associadas a atonal estão alinhadas na mesma unidade de expressão com outras proteínas, polipéptidos ou péptidos tendo funções desejadas. Exemplos não limitantes de tais 35 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ funções de sequências de expressão desejadas incluem os fins de purificação ou imunodetecção para as sequências de expressão adicionadas, por exemplo, composições proteináceas que podem ser purificadas por cromatografia de afinidade ou marcação de enzima de regiões de codificação, respectivamente na EP 266032, ou através de intermediários desoxinucleósido-H-fosfonato como descrito por Froehler et al., Nucl. Acids Res., 14:5399-5407, 1986.
Como aqui utilizado, um "organismo" pode ser um procariota, eucariota, vírus e semelhante. Como aqui utilizado, o termo "sequência" abrange os termos "ácido nucleico" e "proteináceo" ou "composição proteinácea". Como aqui utilizado, o termo "composição proteinácea" abrange os termos "proteína", "polipéptido" e "péptido". Como aqui utilizado, "sequência artificial" refere-se a uma sequência de um ácido nucleico não derivada da sequência que ocorre naturalmente num lócus genético, assim como a sequência de quaisquer proteínas, polipéptidos ou péptidos codificados por um tal ácido nucleico. Uma "sequência sintética", refere-se a um ácido nucleico ou composição proteinácea produzidos por síntese química in vitro, em vez de por produção enzimática in vitro (i.e. uma sequência "enzimaticamente produzida") ou por produção biológica in vivo (i.e. uma sequência "biologicamente produzida").
Dosagem e Formulação
As sequências de ácidos nucleicos e as sequências de aminoácidos (ingredientes activos) deste invento podem ser formuladas e administradas para tratar uma variedade de estados de doença por um qualquer meio que produza contacto do ingrediente activo com o local de acção do agente no corpo de um animal. Elas podem ser administradas por um qualquer meio convencional disponível para utilização em conjunto com produtos farmacêuticos, quer como ingredientes activos terapêuticos individuais quer numa combinação de ingredientes activos terapêuticos. Elas podem ser administradas isoladamente ou com um veículo farmaceuticamente aceitável seleccionado com base na via de administração escolhida e prática farmacêutica padrão. 36 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ A dosagem administrada será uma quantidade terapeuticamente eficaz do ingrediente activo e vai, evidentemente, variar dependendo de factores conhecidos tais como as características farmacodinâmicas do ingrediente activo particular e seu modo e via de administração; idade, sexo, saúde e peso do receptor; natureza e extensão dos sintomas; tipo de tratamento concorrente, frequência do tratamento e do efeito desejado. 0 ingrediente activo pode ser oralmente administrado em formas farmacêuticas sólidas tais como cápsulas, comprimidos e pós, ou em formas farmacêuticas líquidas tais como elixires, xaropes, emulsões e suspensões. 0 ingrediente activo pode também ser formulado para administração parentérica por injecção, perfusão rápida, absorção nasofaríngea ou dermoabsorção. 0 agente pode ser intramuscular ou intravenosamente administrado ou administrado como um supositório. Adicionalmente, as soluções parentéricas podem conter conservantes tais como cloreto de benzalcónio, metil ou propilparabeno e clorobutanol. Os veículos farmacêuticos adequados são descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences, um texto de referência padrão neste campo.
Adicionalmente, podem ser utilizados métodos farmacêuticos padrão para controlar a duração de acção. Estes são bem conhecidos na arte e incluem preparações de libertação controlada e podem incluir macromoléculas adequadas, por exemplo, polímeros, poliésteres, poliaminoácidos, polivinilo, pirrolidona, etilenovinilacetato, metilcelulose, carboximetilcelulose ou sulfato de protamina. A concentração de macromoléculas assim como os métodos de incorporação podem ser ajustados de modo a controlar a libertação. Adicionalmente, o agente pode ser incorporado em partículas de materiais poliméricos tais como poliésteres, poliaminoácidos, hidrogeis, copolímeros de poli(ácido láctico) ou etilenovinilacetato. Adicionalmente a serem incorporados, estes agentes podem também ser utilizados para reter os compostos em microcápsulas. 37 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ
As formas de dosagem farmacêutica úteis para administração dos compostos deste invento podem ser ilustradas como se segue. Cápsulas: As cápsulas são preparadas por enchimento padrão de duas partes de cápsulas de gelatina dura cada uma com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ingrediente activo em pó, 175 miligramas de lactose, 24 miligramas de talco e 6 miligramas de estearato de magnésio. Cápsulas de Gelatina Mole: Uma mistura de ingrediente activo em rebento de soja é preparada e injectada por meio de uma bomba de deslocação positiva em gelatina para formar cápsulas de gelatina mole contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do ingrediente activo. As cápsulas são então lavadas e secas.
Comprimidos: Os comprimidos são preparados por procedimentos convencionais de modo a que a unidade de dosagem seja uma quantidade terapeuticamente activa de ingrediente activo. 0,2 miligramas de dióxido de silício coloidal, 5 miligramas de estearato de magnésio, 275 miligramas de celulose microcristalina, 11 miligramas de amido de milho e 98,8 miligramas de lactose. Podem ser aplicados revestimentos adequados para aumentar a palatabilidade ou atrasar a absorção.
Injectável: Uma composição parentérica adequada para administração por injecção é preparada por agitação de 1,5% em peso de ingredientes activos em 10% em volume de propilenoglicol e água. A solução é tornada isotónica com cloreto de sódio e esterilizada.
Suspensão: Uma suspensão aquosa é preparada para administração oral de modo a que cada 5 mililitros contenham uma quantidade terapeuticamente eficaz de ingrediente activo finamente dividido, 200 miligramas de carboximetilcelulose sódica, 5 miligramas de benzoato de sódio, 1,0 gramas de solução de sorbitol U.S.P. e 0,025 milímetros de vanilina.
Por conseguinte, a composição farmacêutica do presente invento pode ser distribuída através de várias vias e em 38 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ vários sítios num corpo de um animal para alcançar um efeito particular (ver, por exemplo, Rosenfeld et al. (1991), supra; Rosenfeld et al., Clin. Res., 39(2), 311A (1991a); Jaffe et al., supra; Berkner, supra). Um perito na arte vai reconhecer que embora possa ser utilizada para administração mais do que uma via, uma via particular pode proporcionar uma reacção mais imediata e mais eficaz do que uma outra via. A distribuição local ou sistémica pode ser realizada por administração compreendendo a aplicação ou instilação da formulação em cavidades corporais, inalação ou insuflação de um aerosol, ou por introdução parentérica, compreendendo intramuscular, intravenosa, peritoneal, subcutânea, intradérmica, assim como administração cutânea. A composição do presente invento pode ser proporcionada em forma de dose unitária na qual cada unidade de dosagem, por exemplo, uma colher de chá cheia, comprimido, solução ou supositório, contém uma quantidade pré-determinada da composição, isolada ou em combinação adequada com outros agentes activos. 0 termo "forma de dose unitária" como aqui utilizado refere-se a unidades fisicamente descontínuas adequadas como dosagens unitárias para sujeitos humanos e animais, contendo cada unidade uma quantidade pré-determinada das composições do presente invento, isolada ou em combinação com outros agentes activos, calculada numa quantidade suficiente para produzir o efeito desejado, em associação com um diluente, transportador ou veículo farmaceuticamente aceitável, quando adequado. As especificações para as formas de dose unitária do presente invento dependem do efeito particular a ser alcançado e da farmacodinâmica particular associada à composição farmacêutica no hospedeiro particular.
Estes métodos aqui descritos não têm em todo o caso tudo incluído, sendo evidentes para um executante perito comum métodos adicionais que satisfazem o pedido de patente específico. Além disso, a quantidade eficaz das composições pode ser adicionalmente aproximada através de analogia aos compostos conhecidos por exercerem o efeito desejado.
Os exemplos seguintes são dados com a finalidade de exemplo, não se destinando a limitar o âmbito do invento de qualquer forma. 39 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ EXEMPLO 1
Homólogo atonal de Ratinho 1 (Mathl)
Verificou-se que os presentes métodos para o tratamento da insuficiência auditiva falharam a resolução directa do problema, isto é, a regeneração de populações de células ciliares auditivas. 0 presente invento numa concretização preferida está direccionado para um membro da família bHLH, o gene Mathl ou uma outra sequência de ácido nucleico associada a atonal, e ao seu requisito para produção de neurónios granulares cerebrais e células ciliares do ouvido interno. Esta descoberta tem amplas ramificações não só para a compreensão do neurodesenvolvimento como também para terapêuticas para uma variedade de perturbações prevalentes, como descrito abaixo. 0 homólogo 1 atonal de ratinho (Mathl) é expresso nos precursores dos neurónios granulares cerebrais; algumas células da porção dorsal da medula espinal em desenvolvimento; no ouvido interno; em células de Merkel (receptores de tacto na pele); e articulações. 0 Mathl que sobre-expressa numa célula de outro modo diferenciada pode induzir a formação ou diferenciação numa célula tipo célula ciliar do ouvido interno progenitora ou madura. A expressão de Mathl nos precursores dos neurónios granulares cerebrais sugere que é necessário para o funcionamento do cerebelo e cérebro. 0 cerebelo é essencial para boa coordenação motora e postura e a sua disfunção quebra o equilíbio, a fala e os movimentos dos membros. 0 desenvolvimento cerebral começa tipicamente próximo do dia embrionário 9.5 (E9.5) quando um pequeno grupo de células no cérebro posterior prolifera e migra frontalmente para formar a camada granular externa, tronco cerebral e neurónios pontino. Esta população de progenitores neuronais, que continua a expressar Mathl, prolifera e migra ainda internamente para formar os neurónios granulares cerebrais que são a população neuronal predominante no cerebelo e cérebro. Os ratinhos que não expressam Mathl carecem completamente de neurónios granulares cerebrais e seus precursores. Mathl é assim essencial para a produção destes neurónios e dota a população muito escassa de neurónios em 40 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ Ε9.5 com a capacidade de proliferar em biliões e depois diferenciar (Ben-Arie et al., 1997). Estas duas funções são de grande significância médica. Para compreender a proliferação normal é necessário compreender a proliferação anormal, observada no cancro. Os tumores cerebrais do tipo neuroectodérmico primitivo (por exemplo, meduloblastoma) são a malignidade sólida mais comum nas crianças. As células que expressam Mathl contribuem significativamente para estes tumores.
Mathl é expresso na cartilagem da articulação não ossificada (ver Figura 6) que degenera tipicamente em osteoartrite. Esta é a forma mais prevalente de artrite, com 90% de pessoas em 40 a mostrarem algum grau de osteoartrite numa ou mais articulações. Dadas as propriedades de Mathl na produção e proliferação celular, a sua expressão artificial em articulações afectadas pode permitir a regeneração das células que constituem a cartilagem não ossifiçada. São aqui descritas composições e métodos para a utilização do gene Mathl, seu homólogo humano (Hathl) ou qualquer um dos seus homólogos, ortólogos, proteínas de fusão quimérica ou derivados de qualquer sequência de ácido nucleico associada a atonal, adequada ou qualquer outra sequência de ácido nucleico associada a atonal. Para estudar as funções do Mathl em mamíferos, o gene Mathl foi delecionado a partir de um ratinho utilizando uma estratégia que permitiu a detecção de células que expressam Mathl. Descreve-se a criação e caracterização de ratinhos que podem ser utilizados para analisar os compostos que podem ser utilizados para diminuir ou aumentar a expressão de Mathl nas células ciliares do ouvido interno e noutras células nas quais está associada a expressão de Mathl.
Os métodos são também descritos para o estudo, caracterização e tratamento da proliferação neoplásica de origem neuroectodérmica uma vez que a expressão de Mathl é essencial para a produção e proliferação de neurónios granulares cerebrais. Descobriu-se também que Mathl desempenha um papel no desenvolvimento de células que produzem cartilagem das articulações não ossificada, que são associadas ao desenvolvimento de osteoartrite. Estas 41 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ descobertas conduziram a um método de análise de compostos que pode ser útil para o tratamento da perda de células ciliares do ouvido interno e outras doenças que ocorrem devido à perda funcional de Mathl, tal como osteoartrite.
Mais particularmente, o presente invento proporciona um animal heterozigótico por inactivação de gene Mathl ou de uma outra sequência de ácido nucleico associada a atonal, na qual, pelo menos um alelo Mathl ou uma outra sequência de ácido nucleico associada a atonal foram substituídos por inserção de uma sequência de ácido nucleico heteróloga, em que a inactivação do Mathl ou sequência associada a atonal impede a expressão do Mathl ou alelo associado a atonal. 0 ratinho pode ser adicionalmente utilizado para produzir ratinhos homozigóticos para inactivação de gene Mathl ou de uma outra sequência de ácido nucleico associada a atonal e pode adicionalmente incluir uma segunda sequência de ácido nucleico heteróloga, na qual, pelo menos um dos genes heterólogos seja utilizado para detectar a expressão guiada por elementos reguladores de Mathl ou de sequência associada a atonal. A inactivação completa ou parcial do Mathl funcional ou sequência associada a atonal pode ser detectada, por exemplo, em células proprioreceptoras, neurónios granulares e suas células progenitoras ou células de cartilagem não ossifiçadas.
Exemplos de sequências de ácido nucleico heterólogas são as sequências descritoras tais como b-galactosidase, proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente azul (BFP), neomicina, canamicina, luciferase, b-glucuronidase e cloranfenicol-transferase (CAT). 0 Mathl ou a sequência associada a atonal podem também ser substituídos sob o controlo de sequências promotoras reguláveis ou podem ser sequências promotoras específicas de tecidos. As referidas sequências promotoras podem ser parciais ou podem conter o promotor completo. 0 presente invento pode também ser utilizado como, ou como parte de, um método de análise para um composto, em que a administração do composto afecta uma condição de desenvolvimento e/ou patológica em que a referida condição é o resultado da redução da expressão do Mathl ou da sequência 42 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ associada a atonal, incluindo o método, a administração do composto a um ratinho transgénico que é homozigótico para inactivação de Mathl ou de sequência associada a atonal, em que pelo menos um Mathl ou alelo associado a atonal são inactivados por inserção de uma sequência de ácido nucleico heteróloga, em que a inactivação do Mathl ou sequência associada a atonal previne a expressão do Mathl ou gene associado a atonal e monitorização do ratinho quanto à alteração no desenvolvimento e/ou condição patológica. Os tipos de condições patológicas que podem ser examinados incluem, mas não estão limitados a perda de células ciliares, perda de neurónios granulares cerebrais ou seus precursores, ausência de proliferação de células granulares ou migração, ausência de células das camadas de grânulos externos cerebrais, insuficiência auditiva, perturbação do equilíbrio, doença articular, proliferação anormal de células neuroectodérmicas neoplásicas e formação de meduloblastoma. Como aqui utilizado, a análise proporciona um composto que por regulação positiva (upregulating) da expressão de uma sequência de ácido nucleico heteróloga é um efector positivo e um composto que por regulação negativa (downregulating) da expressão de uma sequência de ácido nucleico heteróloga é um efector negativo.
Ainda uma outra concretização do presente invento é um método de promoção do crescimento de células mecanorreceptoras, que inclui o contacto de uma célula com Mathl ou uma proteína ou gene associada a atonal numa quantidade eficaz para fazer com que a referida célula expresse um marcador de células ciliares do ouvido interno. Um exemplo de um marcador de células ciliares para utilização com o método é a calretinina. A célula pode ser posta em contacto com um vector que expresse um Mathl ou uma sequência de ácido nucleico ou sequência de aminoácidos associadas a atonal. Os vectores recombinantes que expressam Mathl ou uma sequência de ácido nucleico associada a atonal podem incluir um vector adenoviral, um vector retroviral, um vector adeno-associado, um plasmídeo, um lipossoma, uma proteína, um lípido, um hidrato de carbono e uma combinação dos referidos vectores. Mathl ou a sequência associada a atonal podem estar sob o controlo de, por exemplo, uma sequência promotora de citomegalovírus IE ou a sequência promotora de 43 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ citomegalovírus ΙΕ e uma sequência de sinal de poliadenilação precoce SV40, ou uma qualquer combinação das sequências promotoras adequadas, sequência intensificadora e poliadenilação.
Adicionalmente, é descrito um método para o tratamento da insuficiência auditiva ou de uma perturbação do equilíbrio que inclui a administração a um animal, incluindo humano, com perda de audição ou perturbação do equilíbrio de uma quantidade terapeuticamente eficaz de Mathl ou sequência de aminoácidos ou sequência de ácido nucleico associada a atonal. A insuficiência auditiva ou de equilíbrio pode ser completa ou parcial e pode afectar um dos ouvidos ou os dois ouvidos. Numa concretização preferida, há uma insuficiência substancial da audição. A perturbação da audição e do equilíbrio podem ser separada ou concomitantemente afectadas num animal a ser tratado e a referida perturbação da audição e/ou do equilíbrio podiam ser um resultado de trauma, doença, condição relacionada com a idade ou podiam ser devidas a perda de células ciliares por uma qualquer razão. 0 presente invento é também dirigido a uma composição que inclui Mathl ou uma proteína ou gene associados a atonal em combinação com um veículo de distribuição, em que o veículo de distribuição causa uma quantidade terapeuticamente eficaz de Mathl ou sequência associada a atonal a ser distribuída numa célula. 0 veículo de distribuição pode ser adicionalmente definido como um vector que compreende um Mathl ou sequência de aminoácidos ou sequência de ácido nucleico associada a atonal numa célula animal. 0 vector pode ser um vector retroviral ou um vector adenoviral ou um qualquer outro vector à base de ácido nucleico que possa ser uniformemente disperso numa formulação farmacologicamente aceitável e utilizado para administração intralesional. A composição pode ainda ser uma proteína parcial ou completamente purificada que é distribuída utilizando um lipossoma, uma proteína, um lípido ou um hidrato de carbono que promova a entrada de um Mathl ou proteína associada a atonal numa célula. Exemplos de proteínas que podem ser utilizadas como veículos de distribuição incluem os domínios de ligação a receptor (as regiões não catalíticas) de toxinas bacterianas, tais como, por exemplo, Exotoxina A, toxina da 44 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ cólera e toxina de Rícino ou domínios de transdução proteica, tal como da proteína TAT de VIH (Schwarze et al., 1999) (ver Exemplo 22). A composição para distribuição de Mathl pode ser uma proteína de fusão.
Um executante perito sabe que os métodos para tratar animais descritos no invento podem ser ou in utero ou após o nascimento. 0 tratamento pode ser dado a um embrião e pode ocorrer ou ex vivo ou in vivo. EXEMPLO 2
Modelo Animal para Organogénese
Um modelo animal eficaz para deficiência num gene que controla a organogénese vai frequentemente ter os dois alelos estavelmente inactivados de modo a que, ao longo da embriogénese, um ou mais tecidos não possam reverter para um alelo de tipo selvagem funcional. Um método de produção de animais com um genótipo alterado é o alvo de genes (Mansour et al., 1993), no qual a recombinação homóloga da sequência de ADN recentemente introduzida (i.e., a sequência ou construção alvo) e uma sequência de ADN alvo específica que reside no cromossoma resulta na inserção de uma porção da sequência de ADN recentemente introduzida na sequência de ADN cromossomal alvo. Este método é capaz de produzir animais de qualquer genótipo desejado e é especialmente útil para rompimento de genes (i.e., para "knock out") numa sequência genética cromossómica específica por inserção de um marcador seleccionável no gene ou remoção completa do gene com uma outra sequência nucleotídica.
Para knock out de uma sequência genómica, deve estar disponível um fragmento clonado e os limites intão-exão no fragmento definido (Mansour et al., 1993). Tipicamente, a construção alvo contém um marcador seleccionável tal como Neo (resistência à neomicina, ver Mansour et al., 1993) flanqueado por sequências homólogas ao ADN alvo cromossomal e para além de uma destas sequências de flanqueamento o gene timidina-quinase de vírus herpes simplex (HSV-TK, ver em geral, McKnight et al., 1980). A construção alvo é introduzida, por exemplo, por electroporação, em células germinais derivadas de embrião (ES) onde a recombinação 45 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ homóloga resulta na inserção do marcador de resistência à Neomicina (Neo) , mas não o gene HSV-TK, na sequência de ADN cromossomal alvo. As células ES alteradas são resistentes à neomicina e HSV-TK' e assim são capazes de crescer na presença dos antibióticos G418 e ganciclovir. As inserções aleatórias contêm o gene HSV-TK sendo assim sensíveis ao ganciclovir (Mansour, et al.) . Os clones ES positivos são então microinjectados em blastócitos para produzir ratinhos quiméricos de linha germinativa, que são então criados para obter descendência que é homozigótica para o gene knock out. Tais métodos gerais de produção de animais knock out têm sido demonstrados utilizando ratinhos. Os genes noutros animais tais como ratos, cobaias, gerbilos, hamsters e coelhos podem também ser utilizados desde que estejam disponíveis dados de sequência de ADN suficientes para preparar uma construção alvo adequada para knock out do gene de interesse.
Embora ato e Mathl partilhem um grau elevado de conservação de sequência, há uma discrepância evidente entre os seus modelos de expressão e as consequências da sua perda de função. Enquanto que o ato é expresso principalmente no SNP da mosca a sua ausência causa a perda de quase todas as CHOs (Jarman et al., 1993), Mathl é expresso no SNC e a sua perda conduz â ausência de neurónios granulares cerebrais, a maior população neuronal no SNC (Ben-Arie et al., 1997). Para melhor compreender as relações funcionais entre ato e Mathl, o presente invento descreve a produção de um segundo alelo nulo a Mathl em ratinhos (Mathl13"391713"391) por substituição da região de codificação de Mathl com um gene β-galactosidase (lacZ) e realização de uma subsequente pesquisa quanto à expressão no SNC de ato na mosca da fruta. Os Exemplos descrevem uma ligação funcional entre ato e Mathl: ato ê expresso no cérebro da mosca e a expressão de LacZ sob o controlo de elementos reguladores de Mathl {Mathl/lacZ) não só replicou o modelo de expressão conhecido no SNC (i.e., o tubo neural, medula espinal e cerebelo), como apareceu em muitas outras células do SNP de murino. A sobre-expressão de Mathl em Drosophila causou a formação ectópica de CHO, provando mais evidência de que ato e Mathl estão funcionalmente conservados. 46 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ
As ligações e consistência da relação entre atonal em Drosophila e Mathl no ratinho sugerem que é justificada a sua utilização como sistemas de modelo na arte. Uma família de homólogos foi clonada e analisada no ratinho incluindo MATH1, 2, 3, 4A, 4B, 4C e 5 (Azakawa et al., 1995; Bartholoma e Nave, 1994; Ben-Arie et al., 1997; Ben-Arie et al., 1996, Fode et al., 1998; Ma et al., 1998; McCormick et al., 1996; Shimizu et al., 1995; Takebayashi et al., 1997). Um homólogo atonal de Xenopus, Xathl tem sido ectopicamente expresso em Drosophila e mostrou comportar-se similarmente a ato (Kim et al., 1997). Adicionalmente, a capacidade de Mathl para induzir a formação ectópica de CHO e restaurar as CHOs nos embriões mutantes ato (ver Exemplo 13) é uma forte evidência de que Mathl, e particularmente o seu domínio básico, codifica a informação de identidade de linhagem não diferente da codificada por ato e que as células de mamíferos que expressam Mathl são funcionalmente similares e talvez evolucionalmente relacionadas às células de Drosophila que requerem ato. Assim, as similaridades entre atonal em Drosophila, Xathl em Xenopus e Mathl no ratinho indicam que estes animais são comparáveis aos sistemas de modelos de animais. Adicionalmente, a ampla utilização de ratinhos em particular como um sistema de modelo para humanos também sugere que permitiria similarmente a utilização do invento em humanos.
Com os avanços na genética molecular agora padrão na arte, as sequências de humanos e outras espécies podem ser alternadamente utilizadas numa variedade de organismos. Por exemplo, o gene hsp70 induzível de rato foi utilizado para produzir ratinhos transgénicos que sobre-expressavam hsp70 induzível, permitindo que os órgãos de ratinhos transgénicos fossem protegidos da lesão isquémica (Marber et al. J. Clin. Invest. 95:1446-1456 (1995)) devido ao aumento em hsp70 de rato. As sequências noutros animais têm sido alternadas incluindo entre humanos e roedores para desenvolver modelos de roedores para estudar a doença humana, i.e. doenças neurodegenerativas. Um destes exemplos é a expressão do gene SCA1 humano, que codifica ataxina-1, em ratinhos (Burright, E. N. et al. Cell 82:937-948 (1995)). Os ratinhos transgénicos foram produzidos expressando o gene SCAl humano com um tracto CAG normal ou expandido. Os dados ilustraram 47 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ que as repetições CAG expandidas eram expressas em quantidades suficientes nas células de Purkinje para produzir degeneração e ataxia. Este exemplo ilustra que pode ser estabelecido um modelo de ratinho para estudar a ataxia espinocerebelar de tipo 1, que é uma perturbação neurológica hereditária dominante autossómica. Adicionalmente ao desenvolvimento de modelos de ratinhos, a Drosophila é um sistema modelo de contraste no campo. Warrick et al. (1999) produziram moscas transgénicas que co-expressaram hsp70 humano e uma poliglutamina mutante humana (MJDtr-Q78) . A expressão da poliglutamina mutante humana MJDtr-Q78 isolada nas moscas resultou na formação de grandes agregados nos neurónios. No entanto, a co-expressão com hsp 70 humano resultou em agregação suprimida. Estes exemplos ilustram que a permutabilidade de genes é uma rotina no campo da genética molecular e os sistemas de modelos proporcionam ferramentas poderosas para caracterizar a função genética. EXEMPLO 3
Produção de Ratinhos Mathl Transgénicos
Para detectar modelos de expressão Mathl subtis não identificados por hibridização in situ de ARN, e assim esclarecer mais este papel do gene durante o desenvolvimento embrionário, foram produzidos alelos nulos a Mathl (Mathlβ~ Gai/fi-Gaij p0r sukstítuição da região de codificação de Mathl com β-galactosidase (β-Gal). A construção alvo, contendo uma cassete LacZ e uma cassete PGK-neo (Fig. 7A) , foi utilizada para substituir a região de codificação de Mathl. Para delecionar a região de codificação completa de Mathl, foi produzida uma construção alvo que continha os fragmentos de flanqueamento genómicos 5' e 3' como previamente descrito (Ben-Arie et al., 1997) flanqueando uma cassete pSAPgal/PGK-neo (Friedrich e Soriano, 1991). A construção é concebida de modo a que a expressão de lacZ seja guiada por elementos de controlo Mathl endógenos, embora um promotor PGK independente guie a expressão do marcador seleccionável neo. A construção foi electroporada em células ES e a selecção para neo foi alcançada com G418. Catorze em 76 (18%) 48 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ dos clones sofreram recombinação homóloga. A genotipificação de células ES, saco vitelino e ADN de cauda foi realizada utilizando a análise Southern de ADN digerido com EcoR I e sondas previamente descritas (Ben-Arie et al., 1997). A construção alvo foi electroporada em células germinais embrionárias (ES). 14/76 (18%) dos clones exibiram recombinação homóloga correcta no lócus Mathl (FIG. 7B) .
Três linhas de células ES que transportam o alelo Mathl+/^qal foram injectadas em blastócitos hospedeiros para produzir ratinhos quiméricos. Os ratinhos Mathl+/^~gal foram identificados e intercruzados para produzir homozigotos (Fig. 7C) . A deleção de Mathl foi confirmada por análise Southern utilizando sondas de flanqueamento e sondas internas (Fig. 7A) .
Os ratinhos Mathl,i~Gal/^Gal mostraram todas as características fenotípicas descritas nos ratinhos Mathl~/~ (Ben-Arie et al., 1997; 2000). EXEMPLO 4
Análises de coloração por x-gal, histológica e imuno- histoquímica
Os embriões foram organizados por tampão vaginal (vaginal Plug), com o início do tampão designado por E0.5. Os embriões foram dissecados do útero, separados das membranas extraembrionárias e colocados em solução salina tamponada com fosfato (PBS) fria. Os embriões foram então fixados em paraformaldeído (PFA) a 4% em PBS durante 30 minutos e lavados em PBS fria. Os sacos vitelinos ou caudas foram recolhidos antes da fixação para extracção do ADN e genotipificação. O equilíbrio para melhorar a penetrabilidade dos reagentes de coloração foi realizado em NP40 a 0,02%, desoxicolato de sódio a 0,01% em PBS durante 10 minutos à temperatura ambiente. A coloração de toda a porção com X-gal (Bonnerot e Nicolas, 1993) foi realizada durante 16-24 horas a 30°C com agitação no mesmo tampão de equilíbrio, que também continha ferricianeto de potássio a 5mM, ferrocianeto de potássio a 5mM e X-gal a 40 mg/ml (dissolvida em DMSO). Quando se alcançou a intensidade de coloração desejada, 49 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ normalmente em 18 horas, os embriões foram lavados em PBS, pós-fixados durante 30 minutos em formalina tamponada, desidratados em série em etanol a 25, 50 e 70%, e armazenados a 4 ° C.
Para análise histológica os embriões foram posteriormente desidratados em etanol a 80, 90 e 100%, tratados em Histoclear (National Diagnostics) e embebidos em Paraplast (Oxford Labware) . Sete das secções de 2 0 μιτι foram cortadas utilizando um micrótomo (Microme). A contracoloração foi realizada utilizando vermelho rápido nuclear (Vector Laboratories). A imuno-histoquímica foi realizada como previamente detalhado (Ben-Arie et al., 1997). Anticorpos: Anti-citoqueratina 18 (DAKO) 1:20; Anti-Cromogranina A humana (DAKO) 1:100; Anti-MATHl (ver abaixo) 1:200. EXEMPLO 5
Modelos de Expressão em Ratinhos Mathl Transgénicos
Como esperado, a expressão de β-Gal no cerebelo e medula espinal dorsal é idêntica à de Mathl, e interessantemente, β-Gal é também expresso ao longo do epitélio da vesícula ótica em E12.5 e no epitélio sensitivo do utrículo, sácula canais semicirculares e cóclea em E14.5 e E15.5 (Figuras IA e 1B) . Os utrículos foram obtidos a partir de ratinhos C57BL/129SVEV. A análise morfológica total do ouvido interno de ratinhos Mathl,i~Gal/^Gal em E18.5, um dia antes da gestação completa, não revelou defeitos óbvios na estrutura global e tamanho quando comparados com as ninhadas de tipo selvagem (wt) . Os ramos do VIIIo nervo craniano estavam presentes e alcançavam o epitélio, mas degeneraram devido à ausência das células ciliares.
Os epitélios sensitivos foram examinados em detalhe. Os utrículos e cócleas de ratinhos Mathl+/íi~Gal e Mathlíi~Gal/^~Gal, de tipo selvagem foram excisados para permitir a visualização do epitélio sensitivo com lentes Nomarski. Estavam presentes feixes ciliares nos dois orgãos de tipo selvagem e de heterozigotos, no entanto, estavam completamente ausentes em ninhadas nulas a Mathl. A microscopia electrónica de 50 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ varrimento (SEM) da cóclea e orgãos vestibulares confirmou a ausência de feixes ciliares em ratinhos nulos (Figuras 2A a 2F). Para se determinar se a ausência de feixes ciliares reflecte a ausência de células ciliares, examinaram-se secções do epitélio sensitivo de todos os órgãos do ouvido interno utilizando quer microscopia de luz quer microscopia electrónica de transmissão (LM e TEM, respectivamente) (Figuras 3A a 3F). LM e TEM foram realizadas como previamente descrito (Lysakowski e Goldberg, 1997). A preparação de tecidos para SEM consistiu na osmicação (0s04 a 1% em tampão de cacodilato), desidratação, secagem de ponto crítico, revestimento por pulverização catódica com ouro e exame num microscópio electrónico JEOL 35S. A microscopia de luz revelou que os epitélios sensitivos em ratinhos nulos eram consideravelmente mais finos, careciam da estratificação normal de núcleos de células e coravam uniformemente, o que é consistente com a ausência de células ciliares. TEM distingue claramente células ciliares e células de suporte em utrículos normais: as células ciliares têm feixes ciliares, menos citoplasma denso aos electrões, mais núcleos apicais e nenhuns grânulos secretores (Figuras 4A e 4B) . Os epitélios sensitivos dos mutantes nulos carecem completamente de células ciliares mas não têm células de suporte com aspecto normal (Rusch et al., 1998), incluindo citoplasma denso aos electrões, núcleos basais e grânulos secretores. No entanto os ratinhos heterozigóticos Mathl+/fi~Gal retêm as células ciliares. EXEMPLO 6
Expressão de um Marcador Específico de Células Ciliares em Ratinhos Mathl Transgénicos A ausência de células ciliares em E18.5 pode ser devida a (1) ausência de progenitores de células sensitivas, (2) à incapacidade dos progenitores para diferenciar em células ciliares, ou (3) â incapacidade das células ciliares para manter os estados diferenciais, como tem sido observado na ausência do factor de transcrição de domínio POU Brn3c. A primeira possibilidade é pouco provável porque os progenitores dão origem quer a células ciliares quer a 51 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ células de suporte. Para avaliar as possibilidades restantes, examinou-se a expressão do marcador específico de células ciliares, calretinina e miosina VI. A calretinina é um membro da família de proteínas de ligação a cálcio e é expressa em células ciliares em diferenciação (antes da formação dos feixes ciliares) e células do ouvido interno maduro e células ciliares auditivas, mas não em células de suporte. A expressão de calretinina em Mathl^Gal/,i^Gal e ratinhos de tipo selvagem foi estudada por imunofluorescência em secções coronais de embriões E15.5, E16.5 e E18.5 (Figuras 5A a 5F).
Para imunofluorescência, os embriões foram fixados durante 1,5 horas em paraformaldeído/PBS a 4%, a 4°C, imersos em sacarose/PBS a 15% durante 5 horas, depois sacarose/PBS a 30% durante a noite e congelados rapidamente num banho de gelo seco e 2-metilbutano. Foram cortadas num crióstato secções de 14 μιη e montadas em lâminas revestidas com gelatina. As secções foram fixadas em lâminas por imersão durante 10 minutos em fixante de tecidos Streck (Streck laboratories) e secagem ao ar. As secções foram bloqueadas em soro de cabra normal a 30% e triton X-100 a 0,3% em PBS durante 1 h â temperatura ambiente (RT). 0 anticorpo policlonal anti-calretinina de coelho (Chemicon laboratories) foi diluído a 1:200 em solução de bloqueio e incubado durante a noite sobre as secções a 4°C. As secções foram lavadas 3 vezes (20 minutos cada) em Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) à RT. O anticorpo secundário, anticorpo anti-coelho, Alexa 488 (Molecular Probes), foi diluído a 1:400 em solução de bloqueio e utilizado para detectar a calretinina. As secções foram cobertas e incubadas â RT durante 2 horas antes da lavagem e montagem em Vectashield contendo DAPI (Vector). Para microscopia confocal, as secções foram tratadas com ARNase a 25 ug/ml antes da contra-coloração com 50 μg/ml de iodeto de propídio e montadas em Vectashield sem DAPI. As secções coradas foram observadas sob microscópio confocal Bio-Rad 1024.
As células positivas a calretinina eram claramente visíveis nos epitélios sensitivos dos canais semicirculares e utrículos de ratinhos de tipo selvagem, no entanto os embriões Mathl^Gal/^Gal carecem da expressão de calretinina em todos os três estados. Utilizando o modelo de ratinho aqui 52 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ descrito, os presentes inventores demonstraram que as células ciliares nunca desenvolvem nos epitélios sensitivos de ratinhos Mathl^Gal/^Gal. A presença das membranas tectoriais e otolíticas (segregadas em parte pelas células de suporte), em conjunto com os resultados TEM, sugerem que as células remanescentes nos epitélios sensitivos dos ratinhos Mathlβ~ Gai/p-Gai sg0 céiuias de suporte funcionais. EXEMPLO 7 A expressão de Mathl/lacZ mimetiza a expressão de Mathl no SNC em desenvolvimento 0 cerebelo em desenvolvimento em E14.5 e no dia 0 pós-natal (PO) em ratinhos Mathl+/^gal e Mathl^gal/^gal foi analisado por análise de hibridização in situ de ARN. A análise mostrou que o modelo de expressão do gene lacZ reproduzia fielmente o modelo de expressão de Mathl observado pela análise de hibridização in situ de ARN previamente mostrada (Akazawa et al., 1995; Ben-Arie et al., 1996) (Fig. 2A, B, E, G). Adicionalmente, o fenótipo cerebral em ratinhos Mâthlri~9al/ri~9al (Fig. 8F e 8H) era idêntico ao observado em ratinhos nulos a Mathl (Ben-Arie et al., 1997). A E14.5, os precursores da EGL estão presentes no lábio rômbico a partir do qual migram ao longo do primórdio cerebral para povoar a EGL (Fig. 8E) . Os ratinhos mutantes apresentaram bastante menos destas células do que os ratinhos heterozigóticos (Fig. 8F). A PO, os neurónios da camada granular externa (EGL) estavam completamente ausentes (Fig. 8H). A expressão de Mathl/lacZ no desenvolvimento do cérebro posterior e medula espinal reproduziu similarmente o modelo de expressão de Mathl (Fig. 8C, 8D) . A única diferença notável entre os modelos de expressão estabelecidos por hibridização in situ e coloração de lacZ é a de que a expressão de β-galactosidase persiste nas células da medula espinal em diferenciação ou migração devido a estabilidade da proteína β-GAL (Fig. 8D). Em resumo, o modelo de expressão de tecido neural e o fenótipo cerebral associado â substituição da região de codificação de Mathl por lacZ são compatíveis com os dados previamente publicados sobre a expressão de 53 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ
Mathl (Akazawa et al., 1995; Ben-Arie et al., 1997; Ben-Arie et al., 1996; Helms e Johnson, 1998), o que demonstra que os elementos de controlo endógenos não foram quebrados por inserção do gene lacZ. Além disso, muitos aglomerados previamente não detectados de células que expressam lacZ tornam-se evidentes após coloração de X-gal dos embriões completos e de secções em ratinhos Mathl+/^gal (ver abaixo) . É provável que limitações na resolução espacial de técnicas de hibridização de ARN in situ utilizadas para detectar o transcrito em estudos anteriores, impessam estes sítios de expressão de serem discernidos (Akazawa et al., 1995; Ben-Arie et al., 1996). Alternativamente, a estabilidade do produto de gene de lacZ e a sensibilidade aumentada devida â amplificação de sinal permitiram identificar sítios de níveis de expressão relativamente baixos. EXEMPLO 8
Mathl/lacZ é expresso no epitélio sensitivo do ouvido interno
Os órgãos sensitivos do ouvido interno estavam entre os sítios recentemente identificados de expressão de Mathl/lacZ, demonstrados utilizando os métodos descritos no Exemplo 2. A expressão na vesícula ótica foi primeiramente detectada a E12.5 e continuou até E18.5 ao longo da maior parte do epitélio sensitivo (Bermingham et al., 1999) (Figura 9A, 9B). Os mutantes nulos apresentaram expressão de Mathl/lacZ no ouvido interno durante a embriogénese (Fig. 9C). Os mutantes nulos a Mathl carecem de células ciliares em todos os orgãos sensitivos (Bermingham et al., 1999), mas mantém as células de suporte, as outras células derivadas de epitélio sensitivo (Fig. 9C) . Estas células de suporte parecem ser funcionais, com base na sua morfologia e presença de membranas sobrepostas segregadas em parte por estas células. Embora a expressão de Mathl no epitélio sensitivo do ouvido interno não fosse demonstrada pela análise de hibridização de ARN in situ, a completa ausência de células ciliares no ouvido interno em mutantes nulos deixa pouca dúvida relativamente a autenticidade do modelo de expressão de Mathl/lacZ.
Mathl é nitidamente essencial para o desenvolvimento de células ciliares no ouvido interno. 0 seu modelo de expressão e a função in vivo são idênticos com as do homólogo pré- 54 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ neural de Mathl, atonal (ato) (A. P. Jarman, Y. Grau, L. Y. Jan, Y. N. Jan, Cell 73, 1307-21 (1994)). ato é expresso num anel de células epiteliais no disco antenal de Drosophila. Algumas destas células epiteliais vão subsequentemente desenvolver em mecanorreceptores no orgão de Johnston, que é necessário para a audição e geotaxia negativa. É interessante observar que as células progenitoras mecanorreceptoras estão ausentes em mutantes ato, ao passo que apenas os mecanorreceptores, e não os seus progenitores, estão ausentes em ratinhos nulos a Mathl.
Com base nas observações aqui realizadas, os presentes inventores reconheceram que Mathl é necessário para a especificação de células ciliares do ouvido interno. Em certo sentido, Mathl actua como um "gene de células pró-ciliares" no desenvolvimento do epitélio sensitivo. Em conjunto com dois estudos recentes, os presentes inventores reconheceram que os resultados aqui fornecidos proporcionam evidência que suporta um modelo de inibição lateral para a determinação de células ciliares e de células de suporte (Haddon et al., 1998; Adam, et al., 1998), nas quais a acção combinada de Delta, Notch e Serratel resulta na selecção de células ciliares individuais a partir de aglomerados de células competentes. Um tal modelo implica que o epitélio sensitivo expresse um "gene de células pró-ciliares" cuja função é essencial para a especificação do destino de células ciliares. A expressão ectópica de ato na mosca da fruta e do seu homólogo Xathl em Xenopus (Kim et al., 1997) pode recrutar células epiteliais para destinos neuronais específicos e a expressão de Mathl no epitélio do ouvido interno sugere fortemente perda de um gene Mathl funcional que é provavelmente uma causa comum de surdez e disfunção vestibular. EXEMPLO 9
Mathl/lacZ é expresso nos núcleos do tronco cerebral
No tronco cerebral a coloração de Mathl/lacZ apareceu a E18.5 até P7 nas pontes ventrais nas regiões correspondentes aos núcleos pontinos (Fig. 9D e inserido). Esta descoberta é 55 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ compatível com a hipótese de Akazawa e colegas de que as células positivas a Mathl no cérebro posterior em desenvolvimento são precursores dos neurónios bulbo-pontinos (Akazawa et al., 1995). Nenhuma desta coloração apareceu nos mutantes nulos (Fig. 9E e inserido). Estes dados levantam a possibilidade de que a ausência de coloração de lacz em núcleos pontino possa ser devida â incapacidade dos seus precursores para migrar, proliferar e/ou diferenciar. Os núcleos pontino ventrais foram examinados após coloração com hematoxilina e eosina das secções e mostraram estar ausentes do tronco cerebral de ratinhos nulos (Fig. 9F, G) . Além disso, a incapacidade dos recém-nascidos de ratinhos nulos para respirar pode ser devida a ausência destes neurónios do tronco cerebral. EXEMPLO 10
Mathl/lacZ é expresso em condrócitos
Os heterozigotos Mathl+/íi~Gal exibiram expressão de Mathl na cartilagem articular (Figuras 6A e 6B) . A Figura 6A demonstra expressão em todas as articulações de um membro anterior. Após exame minucioso de uma articulação do cotovelo, observa-se que Mathl é expresso exclusivamente nos condrócitos articulares não ossifiçados. A expressão de Mathl/lacZ foi detectada nas articulações proximais em desenvolvimento, tais como aquelas da anca e do ombro, tão precocemente quanto em E12.5 (Fig. 10A). Foi detectada coloração positiva a X-gal nas fases de desenvolvimento subsequentes num modelo proximal-distai progressivo que comparou o desenvolvimento normal das articulações (Figura 10B). Nas articulações, a expressão de Mathl/lacZ segue imediatamente a condensação mesenquimal, que começa em Eli.5. As células de mesênquima condensadas diferenciam-se em condrócitos (Bi et al., 1999; Horton et al., 1993; Karsenty, 1998).
Os condrócitos diferenciam-se em três fases principais durante a formação de osso: repouso, proliferação e hipertróficos. Os condrócitos de repouso que povoam a cartilagem articular são referidos como condrócitos articulares (Buckwalter e Mankin, 1998; Poole, 1997). Antes 56 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ do nascimento, os condrócitos de repouso constituem a população completa de condrócitos nas articulações. Para estabelecer que células expressaram Mathl/lacZ, secções de ratinhos Mathl+/(i~gal E18.5 e P7 foram coradas com X-gal. Mathl/lacZ é expresso nos condrócitos em repouso de todas as articulações analisadas em E18.5; os condrócitos de repouso na articulação do cotovelo são mostrados na Figura 10C, e a Fig. 10D mostra os condrócitos de repouso, de proliferação e articulares de um ratinho P7.
As articulações de embriões E18.5 foram examinadas com anticorpo anti-MATHl preparado pelos métodos seguintes. Um fragmento EcoR I-Hind III que codifica os 156 aminoácidos N-terminais da estrutura de leitura aberta de Mathl (MathlO) foi clonado no vector de expressão pET 28a+ (Novagen) . 0 fragmento MathlO foi expresso como proteína de fusão His tag. A proteína MATH1D solúvel foi purificada de acordo com as especificações de estojo de His-tag (Novagen) e 2 mg de proteína foram utilizados para imunizar Galinhas (Cocalico Biologicals Inc.).
Observou-se expressão em condrócitos de repouso, ao passo que não se observou qualquer expressão em embriões nulos. Deve-se observar que nem todas as células da cartilagem articular expressam Mathl/lacZ (Fig. 10E). A expressão de Mathl/lacZ em mutantes nulos a Mathl é similar à de ratinhos heterozigóticos a E18.5, o que sugere que Mathl não é necessário para o desenvolvimento de condrócitos de repouso. EXEMPLO 11
Mathl/lacZ é expresso em células de Merkel
Em E14.5 as células positivas a Mathl/lacZ foram evidentes à volta das vibrissas e na pele de grande parte do corpo (Fig. 10B). No tronco, as células coradas foram arranjadas num modelo com riscas definido pelas cristãs epidérmicas. Esta coloração foi evidente apenas na pele peluda, não na desprovida de pêlos. Todas as vibrissas primárias (místicas), incluindo as nasais laterais, maxilares e os quatro grandes pêlos, foram positivas para Mathl/lacZ. A coloração foi também detectada nas vibrissas secundárias, 57 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ incluindo as vibrissas labial, submental, rinal e vibrissas orbitais isoladas (supra-, infra- e pós-orbitais) (Yamakado e Yohro, 1979). Em E15.5 a coloração apareceu nos aglomerados de células nas almofadas das patas (Fig. 10B).
Para identificar as células positivas a Mathl/lacZ nas vibrissas, almofada das patas e pele peluda, os investigadores examinaram secções histológicas de ratinhos Mathl+/ii~gal (Fig. 11A-D) . As secções através das vibrissas mostraram que as células coradas estavam localizadas na metade mais apical da haste do pêlo, mas não no próprio pêlo. As secções através das almofadas das patas ilustraram a coloração de aglomerados de células na camada epidérmica (Fig. 11B, C). Como mostrado na Fig. 11D, as secções através da pele do tronco identificaram aglomerados de células coradas com Mathl/lacZ. As células coradas foram arranjadas num modelo em forma de ferradura centrado numa estrutura tipo botão elevado na pele peluda. Estas estruturas tipo botão são identificadas como cúpulas de tacto ou Haarscheiben (Pinkus, 1905), as quais são caracterizadas por uma epiderme mais fina e uma papila dérmica elevada com uma rede capilar. As cúpulas de tacto estão associadas a pêlos de protecção grandes dispersos entre outros tipos de pêlos no pêlo de animais. A distribuição espacial de células coradas com Mathl/lacZ, o tempo do seu aparecimento a E14.5 e a sua localização nas almofadas místicas das vibrissas e cúpulas de tacto na pele peluda sugerem que estas células correspondem âs células de Merkel, células especializadas na epiderme que formam complexos mecanorreceptores de adaptação lenta Tipo I com neurites (Munger, 1991).
Os resultados da análise comparativa do modelo de expressão de Mathl/lacZ em animais E16.5 heterozigóticos e homozigóticos são mostrados na Figura 11E-L. Os embriões Mathll}~gal/I}~gal apresentaram um modelo de coloração similar ao das crias Mathl+/I3~gal nas vibrissas e almofadas das patas (Fig. 11E-G, I-K). Por contrário, a coloração nas cúpulas de tacto da pele peluda era fracamente detectável em embriões Mathlfi~ gai/p-gai hh, l) . a redução da coloração em animais nulos foi também óbvia a E18.5. 58 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ
Para adicionalmente definir células positivas a Mathl/lacZ na pele, os ratinhos Mathl+/^gal foram acasalados com ratinhos Tahby. Tabby (Ta) é uma mutação ligada a X espontânea que apresenta um fenótipo similar em machos hemizigóticos e fêmeas homozigóticas (Ferguson et al., 1997). Os mutantes Tabby carecem de folículos pilosos (tilotricos), um subconjunto de células de Merkel que está associado às cúpulas de tacto na pele peluda do tronco (Vielkind et al., 1995), e de algumas das cinco vibrissas secundárias na cabeça (Gruneberg, 1971). Por conseguinte, num cruzamento de fêmeas Ta/Ta com um macho Mathl+/I}~9al heterozigótico, 50% da descendência masculina é Ta/Y :Mathl+/li~gal, o que permite avaliar se as células positivas a Mathl/lacZ correspondem a células de Merkel.
As fêmeas Ta/Ta foram acasaladas com machos Mathl+/Íi~9al e os embriões foram colhidos a E16.5. 0 sexo de cada cria foi determinado por PCR no ADN da cauda, utilizando iniciadores (5' -TGAAGCTTTTGGCTTTGAG-3 ' anteriores; SEQ ID NO: 67, e 5'-CCGCTGCCAAATTCTTTGG-3' inversos; SEQ ID NO:68) que renderam um produto de 320 pb de cromossoma X, e um produto de 300 pb de cromossoma Y (Liu et al., 1999). As condições de amplificação foram: 92°C/l min, 55°C/l min, 72°C/l min durante 32 ciclos, com um passo de desnaturação inicial de 94°C/7 min e o último passo de extensão de 72°C/7 min. Os produtos de amplificação foram separados em gel de agarose a 2%. Os embriões corados com X-gal foram independentemente registados por 2 indivíduos, e apenas então foram os resultados correspondidos com o sexo determinado.
Quer as fêmeas quer os machos Tabby que possuem o alelo Mathl+/^gal apresentaram coloração X-gal nas vibrissas e almofadas das patas (Fig. 12A, B) . 0 efeito da mutação Tabby no número de vibrissas secundárias foi bastante nítido: os machos hemizigóticos careciam completamente de células positivas a Mathl/lacZ nas vibrissas secundárias (carecendo tipicamente em mutantes Ta) e no tronco (Fig. 12E). As fêmeas que são heterozigóticas para Tabby mostraram coloração desigual nas cúpulas de tacto (embora menos do que nas de wt) , tal como devia ser previsto em transportadores fêmeas de uma mutação num gene que sofre inactivação aleatória do cromossoma X (Fig. 12C, D) . A localização e distribuição das 59 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ células positivas, assim como a sua ausência nas vibrissas seleccionadas e no tronco de machos Tabby, indicam fortemente que Mathl é expresso nas células de Merkel associadas a folículos de protecção nas cúpulas de tacto da pele peluda.
Para verificar se o modelo de coloração com Mathl/lacZ reflecte o modelo de expressão normal de Mathl, realizou-se a análise imuno-histoquímica de MATH1 em secções de pele abdominal (ver Exemplo 2). Como observado na Fig. 13A e B, as células positivas a MATH1 foram detectadas à volta dos folículos pilosos de ratinhos Mathl+/+ mas não de ratinhos Mathl^gal/Ii~gal. Os anticorpos contra os dois marcadores de células de Merkel foram escolhidos para análise posterior: anti-citoqueratina 18, expressa no epitélio simples, e cromogranina, localizada nos grânulos secretores de tecidos neuroendócrinos, endócrinos e neuronais. Quer a citoqueratina 18 (Fig. 13C, D) quer a cromogranina A (Fig. 13E, F) confirmaram a identidade das células positivas a Mathl/lacZ como células de Merkel, mas não revelaram anomalias de coloração em ratinhos Mathl^gal/Íi^gal. Assim, Mathl não parece ser essencial para a génese das células de Merkel neuroendócrinas, em contraste com os tipos de células neuronais puros tal como EGL cerebral e núcleos pontino. Como os mutantes nulos a Mathl morrem à nascença, não se pode avaliar se é formado o aglomerado completo de células de Merkel ou se a integridade funcional das células de Merkel nestes mutantes é afectada. EXEMPLO 12
Mathl recupera parcialmente Células de Ovário de Hamster Chinês em moscas deleccionadas para ato
Este Exemplo demonstra que os genes associados a atonal podem induzir o desenvolvimento de células do SNC em animais deficientes num gene ou produto genético associado a atonal nativo. Este Exemplo demonstra também que os genes associados a atonal podem funcionar terapeuticamente em espécies nas quais eles não são nativamente expressos.
Dada a similaridade marcada nos modelos de expressão de ato e Mathl, e os seus domínios básicos idênticos, Mathl foi 60 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ testado para ver se podia mimetizar os efeitos da sobre-expressão de ato por produção de órgãos cordotonais ectópicos como descrito pelos métodos seguintes. As moscas de tipo selvagem, também conhecidas como moscas yw, foram transformadas com uma construção UAS-Mathl como descrito (Brand e Perrimon, 1993). Para sobre-expressar Mathl em moscas de tipo selvagem, yw; as moscas UAS-Mathl foram acasaladas com moscas HS-Gal4. A descendência foi chocada com calor como previamente descrito (Jarman et ai., 1993). Para recuperar a perda de orgãos cordotonais em moscas mutantes ato, w, as moscas UAS-Mathl/UAS-Mathl;atol/TM6 foram cruzadas com moscas w;HS-Gal4/CyO;atol/TM6. Os embriões foram colhidos durante 3 h, envelhecidos durante 3 h, chocados com calor durante 30 min. a 37°C e deixados desenvolver durante as 12-15 h seguintes. Os embriões foram fixados em formaldeído a 4% em PBS com heptano a 50%. Os embriões foram lavados com etanol a 100%, transferidos para PBT e corados com mAb 22C10 como previamente descrito (Kania et al., 1995) para detectar neurónios SNP. Os neurónios cordotonais foram identificados pela sua morfologia e posição distintas. A expressão de Mathl durante o desenvolvimento de pupa por choque com calor utilizando o sistema UAS-Gal4 (Brand e Perrimon, 1993) resultou em orgãos dos sentidos externos supranumerários no noto (notum) (Fig. 14 A, B) e lâmina da asa, como descrito para ato (Jarman et ai., 1993) e os genes do complexo Achaete-Scute (AS-C) (Brand e Perrimon, 1993; Rodriguez et al., 1990). Expressão de Mathl em moscas, tal como ato, produziu orgãos cordotonais ectópicos (Fig. 8G) , embora com menos eficácia. No entanto, a sobre-expressão dos genes AS-C não resulta em órgãos cordotonais ectópicos (Jarman et ai., 1993). Mathl tem assim uma especificidade funcional similar a ato.
Uma vez que vários dos intensif icadores ato são dependentes de ato (Sun et al., 1998), eles podem ser activados por Mathl, o que iria então conduzir à especificação de CHO ectópico. Para determinar se Mathl pode substituir a função ato na mosca, e para excluir a possibilidade de que a produção de CHOs por Mathl seja devida a activação de ato, Mathl foi expresso em embriões mutantes ato. Os mutantes careciam de todos os neurónios cordotonais 61 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ (Fig. 14C), no entanto a sobre-expressão de Mathl recupera parcialmente a perda destes neurónios (Fig. 14D) de uma maneira similar a ato (Chien et al., 1996). EXEMPLO 13
Significância de atonal e Mathl no SNC e SNP
Ao longo dos últimos anos tem sido feito um progresso significativo no esclarecimento dos papéis das proteínas bHLH na neurogenése dos vertebrados. Os genes que codificam bHLH de vertebrados neurais foram isolados e caracterizados porque os homólogos da Drosophila tais como ato ou os genes AS-C tinham mostrado previamente ser necessários para a neurogénese (Anderson, 1995; Guillemot, 1046 1995; Lee, 1997; Takebayashi et al., 1997). De facto, vários genes mostraram ser proneurais porque a sua ausência causou uma insuficiência na especificação do neuroblasto ou precursor de orgão sensitivo (SOP), ao passo que a sua sobre-expressão conduziu ao recrutamento de precursores neuronais supranumerários (Ghysen e Dambly-Chaudiere, 1989) . Com excepção da neurogenina (Ngn) 1 e 2 (Fode et al., 1998; Ma et al., 1998), permanece incerto quais dos homólogos vertebrados desempenham papéis similares aos seus duplicados de Drosophila e que papel preciso as diferentes proteínas bHLH desempenham no desenvolvimento neural. Em Drosophila, o ato é necessário para o desenvolvimento de um subconjunto específico de órgãos dos sentidos, os órgãos cordotonais (Jarman et al., 1993). As CHOs são mecanossensores internos do SNP (Mclver, 1985) . Assim, ato e as CHOs proporcionam um excelente sistema para averiguar não só o relacionamento molecular e de desenvolvimento entre a neurogénese de invertebrados e vertebrados frente à função dos genes proneurais, mas também a conservação evolutiva da função e especificação de orgão sensitivo. Sete homólogos ato foram clonados e analisados no ratinho: Homólogos Atonal de Ratinho (MATH) 1, 2, 3, 4A (também conhecido como Ngn2) , 4B (Ngn3), 4C (Ngnl), e 5 (Akazawa et al., 1995; Bartholomã e Nave, 1994; Ben-Arie et al., 1997, 1996; Fode et al., 1998; Ma et al. , 1998; McCormick et al., 1996; Shimizu et al., 1995; Takebayashi et al., 1997). A maioria é expressa durante a neurogénese quer no SNC quer no SNP. Estes homólogos variam no grau da sua conservação de sequência e podem ser divididos em três 62 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ grupos. 0 grupo mais remotamente relacionado, as neurogeninas, inclui Ngn 1, 2 e 3. Estes produtos genéticos partilham, em média, 53% de identidade no domínio bHLH com ATO. Eles são amplamente expressos no SNC mitótico e células progenitoras de gânglios sensitivos. Trabalhos recentes sugeriram que estes genes podem desempenhar um papel na determinação do neuroblasto e podem, por conseguinte, ser verdadeiros genes proneurais (Fode et al., 1998; Ma et al., 1998). 0 segundo grupo inclui MATH2 e MATH3, que partilha 57% de identidade no domínio bHLH com ATO. Estas proteínas têm sido postuladas funcionarem em células neurais pós-mitóticas (Bartholomã e Nave, 1994; Shimizu et al., 1995). A expressão de Math2 está confinada ao SNC, ao passo que Math3 é expresso quer no SNC quer nos gânglios trigeminais e de raiz dorsal. 0 terceiro grupo inclui MATH1 e MATH5, que partilham 67% e 71% de identidade com o domínio bHLH de ATO, respectivamente. É de realçar que os dois genes codificam um domínio básico idêntico ao de ATO. De modo interessante, o domínio básico de ATO mostrou ser suficiente, no contexto de uma outra proteína proneural (SCUTE), para substituir a perda da função ato (Chien et al., 1996). Mathl mostrou inicialmente ser expresso nos precursores das EGL cerebrais e na medula espinal dorsal (Ben-Arie et al., 1997, 1996). Math5 é expresso nos progenitores em divisão na retina em desenvolvimento e no gânglio vagai (Brown et al., 1998). Com excepção da expressão de Mathõ na retina neural, estas observações colocam um paradoxo: nenhum dos homólogos vertebrados parece ser expresso nos órgãos periféricos ou tecidos similares àqueles onde ato é expresso. Jarman et al. (1993) descreveram que ato é expresso no SNC. Nos exemplos aqui descritos mostra-se que, adicionalmente ao centro de proliferação interno do lobo óptico, ato é expresso num pequeno pedaço de células anteriomediano em cada lobo cerebral (Fig. 8F). No entanto, e porque permanece confuso, qual o papel preciso que ato desempenha no desenvolvimento do SNC de Drosophila, tem sido difícil de argumentar que o ato e os seus homólogos vertebrados apresentam conservação de função. As nossas experiências revelaram sítios de expressão de Mathl previamente não caracterizados. Como esperado, descobriu-se que a expressão de Mathl/lacZ no SNC corresponde à de Mathl, no entanto, também se descobriu que Mathl é expresso na pele, nas articulações e no ouvido interno, em paralelo notável com 63 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ a expressão de ato na mosca. Adicionalmente, a expressão no ouvido (epitélio sensitivo) e na pele (células de Merkel) está restringida às estruturas sensitivas cuja função é converter estímulos mecânicos em sinais electroquímicos neuronais. É importante realçar que na Drosophila, o ato parece desempenhar dois papéis em simultâneo. É necessário não só seleccionar os precursores das CHOs (papel proneural), como também especificar estes precursores como precursores CHO (papel de identidade de linhagem) (Jarman e Ahmed, 1998; Jarman et al., 1993). A especificidade da expressão de Mathl na periferia torna tentadora a especulação que ele também pode dotar células específicas com identidades de linhagem muito específicas para as distinguir funcionalmente de outras estruturas sensitivas. A capacidade de Mathl para induzir a formação de CHO ectópica e restabelecer as CHOs para embriões mutantes ato suporta a noção de que Mathl, e particularmente o seu domínio básico, codifica a informação de identidade de linhagem diferente daquela codificada por ato. Isto sugere que as células de mamíferos que expressam Mathl, pelo menos no ouvido e na pele, são funcionalmente similares e talvez evolutivamente relacionadas com as células de Drosophila que requerem ato. Adicionalmente, a expressão de Math5 na retina neural sugere que as funções de atonal na mosca são realizadas por dois genes no ratinho: o desenvolvimento de alguns mecanorreceptores está sob o controlo de Mathl e o desenvolvimento da retina está possivelmente sob o controlo de Math5. É interessante observar que no nemátodo completamente sequenciado C. elegans, apenas foi identificado um homólogo de atonal, lin-32 (Zhao e Emmons, 1995). Os mutantes com o alelo u282 de lin-32 são insensíveis ao toque, o que fortalece o argumento de conservação evolutiva da função atonal na mecanorrecepção. 0 modelo de expressão de Mathl/lacZ em núcleos pontino sugeriu que esta região devia ser cuidadosamente avaliada em mutantes nulos. Embora não tenham sido originalmente detectados quaisquer defeitos nas pontes de ratinhos nulos a Mathl (Ben-Arie et al., 1997), uma análise mais rigorosa revelou a ausência de núcleos pontino neste sítio. Estes neurónios derivam do lábio rômbico (Altman e Bayer, 1996) assim como os neurónios EGL, que estão também em falta em ratinhos nulos a Mathl. Embora seja possível desenhar um paralelo entre a expressão de Mathl e de ato na pele e ouvido, não é evidente que tal seja o caso para as 64 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ articulações. A expressão de ato nas articulações da mosca é necessária para a formação de CHOs da perna. Por contrário, Mathl é expresso nos condrócitos em repouso e articulares que não têm descrita qualquer função neural e para os quais não existe paralelo na mosca. Pode ser que a expressão de Mathl na cartilagem indique um novo papel para um gene mecanossensitivo, ou isto pode simplesmente reflectir similaridade nos acontecimentos moleculares subjacentes ao desenvolvimento dos vários tipos de células que expressam Mathl. Alternativamente, as CHOs podem também funcionar como elementos estruturais das articulações na mosca ou a cartilagem articular pode ter uma capacidade mecanorreceptora ou transductora ainda por descrever. Não há qualquer evidência neste momento que suporte uma ou outra destas possibilidades. A análise das funções de ato e Mathl vai aumentar o conhecimento do desenvolvimento neural e da conservação evolutiva da função sensitiva. Os sítios e a especificidade da expressão de Mathl podem torná-lo adequado como uma ferramenta de terapêutica genética ou abordagens de activação de genes para doenças tais como perda de audição e osteoartrite que sejam devidas a lesão relacionada com a idade ou ambiente. EXEMPLO 14
Distribuição de Ácido Nucleico Associada a Atonal Utilizando
Adenovirus
Os adenovirus humanos são vírus de tumor de ADN de cadeia dupla com tamanhos de genoma de aproximadamente 36kb. Como sistema de modelo para a expressão de genes eucarióticos, os adenovirus têm sido amplamente estudados e bem caracterizados, o que os torna um sistema atractivo para desenvolvimento de adenovirus como um sistema de transferência de genes. Este grupo de vírus é fácil de deixar crescer e manipular e exibe uma ampla gama de hospedeiros in vitro e in vivo. Em células liticamente infectadas, os adenovirus são capazes de desligar a síntese de proteínas hospedeiras, direccionando a maquinaria celular para sintetizar grandes quantidades de proteínas virais e produzir quantidades copiosas de vírus. 65 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ A região EI do genoma inclui EIA e E1B, que codificam proteínas responsáveis pela regulação da transcrição do genoma virai, assim como poucos genes celulares. A expressão de E2, incluindo E2A e E2B, permite a síntese de funções replicativas virais, por exemplo, proteína de ligação a ADN, ADN-polimerase e uma proteína terminal que inicia a replicação. Os produtos genéticos E3 previnem a citolise por células T citotóxicas e factor de necrose de tumor e parecem ser importantes para propagação virai. As funções associadas às proteínas E4 incluem replicação do ADN, expressão tardia de genes e a exclusão de células hospedeiras. Os produtos genéticos tardios incluem a maioria das proteínas da cápside de virião, sendo estas expressas apenas após ter ocorrido a maior parte do processamento de um transcrito primário único a partir de um promotor tardio principal. 0 promotor tardio principal (MLP) exibe elevada eficiência durante a fase tardia da infecção.
Como apenas uma pequena porção do genoma virai parece ser necessário em eis, os vectores derivados de adenovírus oferecem um excelente potencial para a substituição de fragmentos de ADN grandes quando utilizados em conjunto com linhas de células tais como células 293. Têm sido desenvolvidas linhas de células de rim embrionário humano transformadas com Ad5 para proporcionar as proteínas virais essenciais em trans. Os inventores concluíram assim que as características dos adenovírus os tornam bons candidatos para utilização em células deficientes em Mathl alvo, in vivo. Numa outra concretização, estas construções incluem um Hathl ou uma qualquer sequência de ácido nucleico associada a atonal.
As vantagens particulares de um sistema de adenovírus para distribuição de proteínas estranhas a uma célula incluem: (i) a capacidade de substituir pedaços relativamente grandes de ADN virai por ADN estranho; (ii) a estabilidade estrutural dos adenovírus recombinantes; (iii) a segurança da administração adenoviral a humanos; (iv) a ausência de qualquer associação conhecida de infecção adenoviral ao cancro ou malignidades; (v) a capacidade de obter elevados títulos de vírus recombinantes; e (vi) a elevada infecciosidade do Adenovírus. 66 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ
Uma vantagem dos vectores de adenovírus sobre os retrovírus é um nível mais elevado de expressão genética. Adicionalmente, a replicação de adenovírus é independente da replicação do gene hospedeiro, contrariamente às sequências retrovirais. Uma vez que os genes transformantes de adenovírus na região EI podem ser rapidamente delecionados mantendo ainda a expressão eficaz de vectores, o risco oncogénico dos vectores de adenovírus é considerado negligenciável.
Em geral, os sistemas de transferência de genes de adenovírus são baseados em adenovírus concebidos, recombinantes, que tornam a replicação incompetente por deleção de uma porção do seu genoma, tal como El, retendo ainda a sua competência para infecção. As proteínas estranhas relativamente grandes podem ser expressas quando são feitas deleções adicionais no genoma de adenovírus. Por exmplo, os adenovírus delecionados nas duas regiões El e E3 são capazes de transportar até 10 Kb de ADN estranho e podem ser deixados crescer para títulos elevados em 293. Surpreendentemente, é possível a expressão persistente de transgenes após infecção adenoviral. A utilização do sistema de transferência de genes de adenovírus pode ser mais útil na distribuição de Mathl a células na cartilagem nascente ou danificada das articulações. Em particular, os adenovírus Mathl podem ser utilizados para distribuir Mathl e conferir expressão de gene Mathl na cartilagem das articulações não ossificadas que tenha sido danificada em consequência de osteoartrite. EXEMPLO 15
Construções de Adenovírus Mathl
Os viriões recombinantes para a expressão controlada de Mathl podem ser construídos para explorar as vantagens dos vectores adenovirais, tais como elevado título, ampla gama alvo, transdução eficaz e não integração em células alvo para a transformação das células em células ciliares. Numa concretização estas construções incluem um Hathl ou uma qualquer sequência de ácido nucleico associada a atonal. Numa concretização do invento, é criado um adenovírus independente auxiliar, deficiente na replicação que expressa sequências 67 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ
Mathl de tipo selvagem sob o controlo do promotor de citomegalovírus humano ou do promotor de metalotionina.
As funções de controlo dos vectores de expressão são frequentemente proporcionadas a partir de vírus quando a expressão é desejada em células de mamíferos. Por exemplo, os promotores geralmente utilizados são derivados de polioma, adenovírus 2 e vírus de símio 40 (SV40). Os promotores precoces e tardios de vírus SV40 são particularmente úteis porque são ambos facilmente obtidos a partir dos vírus como um fragmento que também contém a origem de replicação virai SV40. Podem também ser utilizados fragmentos de SV40 menores ou maiores desde que seja incluída a sequência de aproximadamente 250 pb que se estende do sítio HindIII ao sítio BglI localizado na origem de replicação virai. Além disso, é também possível, e frequentemente desejável, utilizar sequências promotoras ou de controlo normalmente associadas à sequência de gene Mathl, nomeadamente o promotor Mathl, desde que tais sequências de controlo sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras ou a célula alvo. Uma tal célula alvo está localizada no ouvido interno de um doente humano em necessidade de células ciliares do ouvido interno.
Uma origem de replicação pode ser proporcionada por construção do vector para incluir uma origem exógena, tal como pode ser derivado de SV40 ou outra fonte virai (por exemplo, polioma, adeno, VSV, BPV) ou pode ser proporcionada pelo mecanismo de replicação cromossómica de células hospedeiras. Se o vector for integrado no cromossoma da célula hospedeira, o último é frequentemente suficiente. EXEMPLO 16
Distribuição de Ácido Nucleico Associada a Atonal utilizando
Retrovírus
Uma outra abordagem para distribuição de genes tira proveito da capacidade natural dos vírus para entrar nas células, levando o seu próprio material genético com eles. Os retrovírus têm prometido como vectores de distribuição de genes devido â sua capacidade para integrar os seus genes no 68 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ genoma do hospedeiro, transferindo uma grande quantidade de material genético estranho, infectando um amplo espectro de espécies e tipos de células e porque eles são facilmente encapsidados em linhas de células especiais. Os retrovírus podem ser particularmente úteis para distribuição de Mathl nas células ciliares do ouvido interno que têm reduzida expressão de Mathl ou que estão em necessidade de sobre-expressão de Mathl. EXEMPLO 17
Construções Retrovirais de Mathl A estrutura de leitura aberta (ORF) de Mathl foi excisada a partir de pBluescript por um digerido EcoRI-Xbal. 0 fragmento foi purificado em gel, e as extremidades tornadas rombas utilizando ADN-polimerase Klenow. 0 vector retroviral pLNCX (adquirido a partir de CLONTECH) foi linearizado com Hpal e ligado ao fragmento de ORF de Mathl. A ligação foi transformada em células E. colí competentes para transformação. As colónias resistentes a antibiótico resultantes foram analisadas quanto à presença da construção correcta. A clonagem, reprodução e propagação de vectores de expressão retrovirais é bem conhecida daqueles peritos na arte. Um exemplo de uma transferência de gene retroviral e sistema de expressão que tenham sido utilizados para expressar Mathl são os vectores de expressão CLONTECH pLNCX, pLXSN e LAPSN. Para propagação destes vectores podem-se utilizar linhas de células de encapsidação PT67 e EcoPack. Para mais informação referente à cultura de células de mamíferos, podem ser utilizadas as referências gerais seguintes: Culture of Animal Cells, Terceira Edição, edição de R. I. Freshney (Wiley-Liss, 1993); e Current Protocols in Molecular Biology, ed. de F. M. Ausubel, et al., (Greene Publishing Associates and Wiley & Sons, 1994), sendo partes relevantes aqui incorporadas por referência.
Numa outra concretização estas construções devem ser construídas com um Hathl ou uma qualquer sequência de ácido nucleico associada a atonal. 69 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ EXEMPLO 18
Manutenção de Linhas de Células de Encapsidação É resumidamente descrita a manutenção de linhas de células de encapsidação, tais como as linhas de células de encapsidação 293 e PT67. Um frasco de células congeladas é transferido de N2 liquido para um banho de água a 37°C apenas até descongelar. De modo a evitar o choque osmótico das células e a maximizar a sobrevivência das células, adiciona-se ao tubo 1 ml de DMEM (Meio de Eagle Modificado por Dulbecco) e a mistura é transferida para um tubo de 15 ml. Adicionam-se mais 5 ml de DMEM e as células são misturadas. Após repetição destes passos o volume final no tubo deve ser de cerca de 12 ml. Em seguida, as células são centrifugadas a 500xg durante 10 min. Finalmente, o sobrenadante é removido e as células são ressuspensas em meio de manutenção como descrito no passo seguinte. Em geral, as células são mantidas em DMEM (glucose elevada: 4,5 g/L) contendo Soro de Bovino Fetal (FBS) a 10% e L-glutamina 4mM. Se desejado ou necessário, adiciona-se penicilina a 100 U/ml/estreptomicina a 100 μg/ml. Recomenda-se que sejam plaqueadas a 3-5xl05 por placa de 10 0 mm e divididas a cada 2 a 3 dias, quando alcançam 70-80% de confluência (a confluência é de 3-4xl06 por placa de 100 mm) . Por exemplo, a linha de células PT67 tem um tempo de duplicação muito curto (<16h) e deve ser dividida antes de se tornar confluente. O tempo de duplicação para células EcoPack-293 é de 24-36 h.
As células são divididas por remoção do meio e lavagem das células uma vez com PBS. Após tratamento com 1-2 ml de solução de tripsina-EDTA durante 0,5-1 min, adicionam-se 5 a 10 ml de meio e soro para parar a tripsinização. As células são cuidadosa, mas completamente, dispersas por pipetagem sendo ressuspensas. Alternativamente, uma proção pré-determinada das células é replaqueada numa placa de 100 mm em 10 ml de meio, seguida por rotação ou agitação da placa para distribuir as células uniformemente. É comum uma relação até 1:20 para células PT67 ou EcoPack-293.
Em geral, a percentagem de células PT67 ou EcoPack-293 capazes de encapsidar vectores retrovirais diminui lentamente com a passagem continua da linha de células. Por conseguinte, 70 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ a encapsidação de células deve ser re-seleccionada após 2 meses de crescimento em cultura. Alternativamente, podem ser adquiridas novas células de elevado título a partir de, por exemplo, CLONTECH, ou podem ser congelados, armazenados e descongelados armazenamentos (stocks) de baixo número de passagens para aumentar o rendimento virai. EXEMPLO 19 Métodos de Utilização de um Vector Retroviral
Utiliza-se o protocolo seguinte para transfectar o vector retroviral para produção de vírus, infecção de células alvo e selecção de clones estáveis. Podem também ser utilizados outros métodos e vectores com o presente invento para expressar Mathl, tais como aqueles descritos em Retroviruses, ed. por J. M. Coffin & Η. E. Varmus (1996, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) e Current Protocols in Molecular Biology, ed. por F. M. Ausubel et al. (1994, Greene Publishing Associates and Wiley & Sons), aqui incorporados por referência.
Em resumo, a transfecção do vector retroviral em células PT67 foi como se segue. Mathl foi clonado em pLNX como acima descrito. As células de encapsidação foram plaqueadas até uma densidade de 5-7xl05 células por placa de 100 mm, 12-24 horas antes da transfecção. 1-2 horas antes da transfecção, o meio foi substituído por meio recente. Pode-se adicionar cloroquina a 25 μΜ imediatamente antes da transfecção. A cloroquina aumenta a eficácia de transfecção em 2-3 vezes. Uma solução de armazenamento a 25 mM pode ser preparada em água destilada e esterilizada por filtração. A cada placa de 100 mm, 10-15 g de ADN de plasmídeo são transfectados utilizando o método desejado, por exemplo, procedimentos de fosfato de cálcio padrão (CalPhos Mammalian Transfection Kit, #K2050-1). O volume final de mistura de transfecção não deve exceder 1 ml. A solução de transfecção é adicionada ao meio e a placa é rodada para assegurar distribuição uniforme. Cerca de 8 horas após transfecção, foi realizado um tratamento de choque com glicerol para aumentar a absorção de ADN. Após 10 a 24 horas pós-transfecção, o meio foi removido e as células foram lavadas duas vezes com PBS, 71 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ antes da adição de 5 ml de DMEM contendo FBS a 10%. A cultura foi incubada durante 12-48 horas adicionais para permitir o aumento do título de vírus. 0 título de virus alcança um máximo - 48 horas após transfecção e é, geralmente, pelo menos 30% do máximo entre 24 a 72 horas pós-transfecção.
Alternativamente, podem também ser seleccionadas linhas de células produtoras de vírus, estáveis. Para obter linhas de células produtoras de vírus, estáveis, as células de encapsidação transfectadas são plaqueadas num meio de selecção 2-3 dias após transfecção. Para selecção de G418 de resistência à neomicina, as células são seleccionadas na presença de G418 ("activo" a 0,5 mg/ml) durante uma semana. Os vectores que transportam outros marcadores seleccionáveis tais como Puro, Bleo ou Hyg, podem ser utilizados para obter também populações de células produtoras de vírus, estáveis. São comuns as populações de células produtoras de viriões que produzem títulos de 105-106 partículas de vírus recombinante por ml. Em geral, 105-106 partículas de vírus recombinante por ml são adequados para a maioria das finalidades. Nalguns estudos, podem ser necessários clones de título mais elevado. Neste caso, após a selecção de antibióticos, os clones individuais são seleccionados utilizando, por exemplo, cilindros de clone ou diluição limitante antes da propagação. 0 título virai pode ser determinado numa grande variedade ou forma, sendo um de tais métodos como aqui descrito. O título virai produzido pelas linhas de células de encapsidação transitoriamente transfectadas ou produtoras de vírus, estáveis, é determinado como se segue, as células NIH/3T3 são plaqueadas um dia antes do início do procedimento de título. As células são plaqueadas em placas de 6 cavidades numa densidade de 5xl04-lxl05 células por cavidade e adicionam-se 4 ml de meio por cavidade. 0 meio contendo virus é seleccionado a partir das células de encapsidação e adiciona-se polibreno a uma concentração final de 4 μg/ml. O meio é esterilizado por filtração através de um filtro de 0,45 μιτι. 0 polibreno é um policatião que reduz a repulsa de cargas entre o vírus e a membrana celular. 0 filtro deve ser acetato de celulose ou polisulfónico (de baixa ligação a proteína) mas não nitrocelulose. A nitrocelulose liga proteínas na membrana retroviral e consequentemente destrói o vírus. As diluições em série são preparadas como se segue: seis diluições em 72 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ série de 10 vezes são normalmente suficientes. Para diluir o virus, utilizar meio recente contendo 4 μg/ml de polibreno. Em seguida, as células alvo NIH/3T3 são infectadas por adição de meio contendo vírus âs cavidades. Após 4 8 horas, as células NIH/3T3 são coradas. O título de vírus corresponde ao número de colónias presentes na diluição mais elevada que contém colónias, multiplicada pelo factor de diluição. Por exemplo, a presença de quatro colónias na diluição a 105 vai representar um título virai de 4xl05.
Para a infecção das células, seguiu-se o procedimento seguinte. As células alvo foram plaqueadas 12-18 horas antes da infecção a uma densidade de células de 3-5xl05 por placa de 100 mm. Para a infecção das células que podem ser utilizadas num teste biologico, as células de controlo podem ser tratadas com um vírus isento de inserido produzido sob condições idênticas. Metade da infecção maxima ocorre geralmente após 5-6 horas da exposição de células a vírus, com uma infecção máxima a ocorrer aproximadamente após 24 horas de exposição. A transcrição inversa real e a integração do retrovirus ocorre 24-36 horas após infecção, dependendo das cinéticas de crescimento das células. A expressão pode ser observada a 24 horas e alcança um máximo a aproximadamente 48 horas. Alternativamente, as infecções podem ser realizadas sequencialmente, com cerca de 12 horas de diferença. A infecção sequencial aumenta geralmente a eficácia de infecção e aumenta também o número de cópias virais. Recomenda-se um mínimo de 12 horas entre cada infecção de modo a assegurar que os receptores celulares não vão ser ocupados pelo invólucro virai. EXEMPLO 20 Testes de Análise
Finalmente, o presente invento proporciona também métodos de análise de substância candidata que são baseados nos testes de células completas, análise in vivo e linhas de células transformadas ou imortais nas quais se utiliza um gene descritor para conferir aos seus hospedeiros recombinantes um fenótipo rapidamente detectável que emerge apenas sob condições nas quais o Mathl vai ser expresso, é sub-expresso ou é sobre-expresso. Em geral, os genes 73 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ descritores codificam um polipéptido não de outro modo produzido pela célula hospedeira que é detectável por análise, por exemplo, por análise cromogénica, fluorométrica, radioisotópica ou espectrofotométrica. No presente invento, o gene Mathl foi substituído por β-galactosidase num ratinho.
Um exemplo de um teste de análise do presente invento é aqui apresentado. As células que expressam Mathl são deixadas crescer em placas de microtitulação, seguida por adição de proporções molares em série da molécula pequena condidata a uma série de cavidades e determinação do nível de sinal, após um período de incubação que é suficiente para demonstrar, por exemplo, a expressão de calretinina nos controlos incubados exclusivamente com o veículo utilizado para ressuspender ou dissolver o composto. As cavidades contendo proporções variadas de candidatos são então avaliadas quanto a activação do sinal. Os candidatos que demonstram intensificação relacionada com a dose de transcrição ou expressão de gene descritor são então seleccionados para posterior avaliação como agentes terapêuticos clínicos. A estimulação da transcrição pode ser observada na ausência de Mathl expresso, caso em que o composto candidato podia ser um estimulador positivo da diferenciação de células ciliares. Alternativamente, o composto candidato podia dar apenas uma estimulação na presença de baixos níveis de Mathl, o que poderia sugerir que funcionasse para estabilizar a formação dos dímeros de Mathl ou a interacção de Mathl com um ou mais factores transcricionais. Os compostos candidatos de qualquer classe podiam ser agentes terapêuticos úteis que iriam estimular a produção de células ciliares do ouvido interno e, por conseguinte, endereçar a necessidade de doentes com perda de audição e perturbações de controlo do equilíbrio. EXEMPLO 21
Transfecção de Células com Vectores Retrovirais Mathl 0 presente invento proporciona células hospedeiras recombinantes transformadas ou transfectadas com um polinucleótido que codifica Mathl, assim como células transgénicas derivadas das células transformadas ou transfectadas. Numa outra concretização estas construções podiam ser construídas com um Hathl ou uma qualquer sequência 74 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ de ácido nucleico associada a atonal. Uma célula hospedeira recombinante do presente invento é transfectada com um polinucleótido contendo uma sequência de ácido nucleico Mathl funcional ou um gene Mathl quimérico. Os métodos de transformação ou transfecção de células com polinucleótidos exógenos, tais como moléculas de ADN, são bem conhecidos na arte e incluem técnicas tais como transfecção mediada por fosfato de cálcio ou mediada por DEAE-dextrano, fusão de protoplasto, electroporação, transfecção mediada por lipossomas, microinjecção directa e infecção por adenovírus. A expressão de Mathl, utilizando construções recombinantes, pode ser utilizada para atingir a distribuição de Mathl a células em sua necessidade. Podem ser escolhidas diferentes combinações promotor-vector por uma pessoa perita nestas artes para conduzir a expressão de Mathl em diferentes tipos de células. Nalguns casos, o destino desejado não pode ser proteína, mas ARN, e os vectores recombinantes incluem aqueles com inseridos presentes nas suas orientações anteriores ou inversas. Adicionalmente, alguns vectores, por exemplo, retrovírus ou sistemas de recombinação artificial, podem ser desenhados para incorporar sequências com um genoma celular ou virai de forma a alcançar a expressão constitutiva ou induzível da proteína ou ARN.
Muitos dos vectores e hospedeiros estão comercialmente disponíveis e têm características específicas que facilitam a expressão ou subsequente purificação. Por exemplo, as sequências de ADN a serem expressas como proteínas aparecem frequentemente como fusão com sequências não relacionadas que codificam tags poli-histidina, ou HA, FLAG, myc e outros tags de epítopo para purificação e detecção imunoquímica, ou sítios de fosforilação ou sítios de reconhecimento de protease ou domínios de proteína adicionais tais como glutationa-S-transferase (GST), proteína de ligação a maltose (MBP) (New England Biolabs), etc. que facilitam a purificação. Os vectores podem também ser desenhados para conter elementos para poliadenilação, corte e terminação, de modo a que a incorporação de sequências de ADN genómico que ocorre naturalmente que contêm intrões e exões possa ser produzida e processada ou de modo a que os intrões não relacionados e outros sinais reguladores necessitem de 75 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ processamento de ARN antes da produção de ARNs traduzíveis, maduros. As proteínas produzidas nos sistemas acima descritos são submetidas a uma variedade de modificações pós-traducionais, tais como glicosilação, fosforilação, proteólise ou processamento não específico ou específico. EXEMPLO 22
Distribuição de Mathl como uma Sequência de Aminoácidos
Um péptido (11 aminoácidos) derivado de VIH foi recententemente descrito, o qual quando fundido a proteínas de comprimento total e injectado em ratinhos permitiu uma dispersão rápida no núcleo de todas as células do corpo (Schwarze et al., 1999). Schwarze et al. prepararam proteínas de fusão a Tat com dimensões no intervalo de 15 a 120 kDa. Eles documentaram uma absorção rápida das proteínas de fusão nos núcleos das células ao longo do animal mantendo-se a actividade funcional das referidas proteínas.
Numa concretização do presente invento, há construções contendo a sequência de ácido nucleico Tat ou Tat-HA operativamente ligada a uma sequência de ácido nucleico Mathl. Numa outra concretização, estas construções incluem um Hathl ou uma qualquer sequência de ácido nucleico associada a atonal. Os vectores são expressos em culturas bacterianas sendo a proteína de fusão purificada. Esta proteína Tat-Mathl purificada ou proteína Tat-Hathl é injectada no animal para determinar a eficácia do sistema de distribuição Tat no ouvido interno, pele, cerebelo, tronco cerebral, medula espinal e articulações. A análise é realizada para determinar o potencial da proteína Tat-Mathl/Tat-Hathl na regeneração de células ciliares e neuronal. Esta é uma abordagem terapêutica viável quer por si só quer em associação com outros métodos ou genes.
Deve-se compreender que os métodos para analisar os compostos que afectam a expressão de Mathl aqui descritos são úteis embora não sejam encontrados candidatos eficazes, uma vez que é de utilidade prática saber qual o efector a montante que é necessário para transcrição de Mathl. 76 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ
PUBLICAÇÕES
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Patentes
Patente U.S. No. 5840873, requerida a 24 Nov. 1998 Patente U.S. No. 5843640, requerida a 1 Dez. 1998 Patente U.S. No. 5843650, requerida a 1 Dez. 1998 Patente U.S. No. 5843651, requerida a 1 Dez. 1998 Patente U.S. No. 5843663 , requerida 1 Dez. 1998 Patente U.S. No. 5846708, requerida a 8 Dez. 1998 Patente U.S. No. 5846709, requerida a 8 Dez. 1998 Patente U.S. No. 5846717, requerida a 8 Dez. 1998 Patente U.S. No. 5846726, requerida a 8 Dez. 1998 Patente U.S. No. 5846729, requerida a 8 Dez. 1998 Patente U.S. No. 5846783, requerida a 8 Dez. 1998 Patente U.S. No. 5849481, requerida a 15 Dez. 1998 Patente U.S. No. 5849483 , requerida a 15 Dez. 1998 Patente U.S. No. 5849486, requerida a 15 Dez. 1998 Patente U.S. No. 5849487, requerida a 15 Dez. 1998 Patente U.S. No. 5849497, requerida a 15 Dez. 1998 Patente U.S. No. 5849546, requerida a 15 Dez. 1998 Patente U.S. No. 5849547, requerida a 15 Dez. 1998 Patente U.S. No. 5851770, requerida a 22 Dez. 1998 Patente U.S. No. 5851772, requerida a 22 Dez. 1988 Patente U.S. No. 5853990, requerida a 29 Dez. 1998
Patente U.S. No. 5853993, requerida a 29 Dez. 1998 83 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ
Patente U.S Patente U.S Patente U.S Patente U.S Patente U.S Patente U.S Patente U.S Patente U.S Patente U.S Patente U.S Patente U.S Patente U.S Patente U.S Patente U.S Patente U.S Patente U.S Patente U.S Patente U.S Patente U.S Patente U.S Patente U.S Patente U.S Patente U.S Patente U.S Νο. 5853992, Νο. 5856092, Νο. 5858652, Νο. 5861244, Νο. 5863732, Νο. 5863753, Νο. 5866331, Νο. 5866336, Νο. 5866337, Νο. 5900481, Νο. 5905024, Νο. 5910407, Νο. 5912124, Νο. 5912145, Νο. 5912148, Νο. 5916776, Νο. 5916779, Νο. 5919626, Νο. 5919630, Νο. 5922574, Νο. 5925517, Νο. 5925525, Νο. 5928862, Νο. 5928869, requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a 29 Dez. 1998 5 Jan. 1999 12 Jan. 1999 19 Jan. 1999 26 Jan. 1999 26 Jan. 1999 2 Fev. 1999 2 Fev. 1999 2 Fev. 1999 4 Maio 1999 18 Maio 1999 8 Jun. 1999 15 Jun. 1999 15 Jun. 1999 15 Jun. 1999 29 Jun. 1999 29 Jun. 1999 6 Jul. 1999 6 Jul. 1999 13 Jul. 1999 20 Jul.1999 20 Jul. 1999 27 Jul. 1999 27 Jul. 1999
Patente U.S. No. 5928870, requerida a 27 Jul. 1999 84 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ Patente U.S. No. Patente U.S. No. Patente U.S. No. Patente U.S. No. Patente U.S. No. Patente U.S. No. Patente U.S. No. Patente U.S. No. Patente U.S. No. Pedido de Patente Pedido de Patente Pedido de Patente Pedido de Patente Pedido de Patente Pedido de Patente Pedido de Patente Pedido de Patente 5928905, 5928906, 5929227, 5932413, 5932451, 5935791, 5935825, 5939291, 5942391, requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a requerida a 27 Jul. 1999 27 Jul. 1999 27 Jul. 1999 3 Ago. 1999 3 Ago. 1999 10 Ago. 1999 10 Ago. 1999 17 Ago. 1999 24 Ago. 1999
Europeia No. 320 308 Europeia No. 329 822 GB No. 2 202 328 PCT No. PCT/US87/00880 PCT No. PCT/US89/01025 PCT WO 88/10315 PCT WO 89/06700 PCT WO 90/07641
Um perito na arte avalia rapidamente que o presente invento está bem adaptado para realizar os objectivos e obter as finalidades mensionadas assim como aqueles aqui inerentes. As sequências, mutações, complexos, métodos, tratamentos, composições farmacêuticas, procedimentos e técnicas aqui descritos são actualmente representativos das concretizações preferidas e destinam-se a ser exemplificativos mas não se destinam a limitar o âmbito.
Lisboa, 2011-03-03
Claims (26)
- ΕΡ 1 471 926/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Sequência de aminoácidos ou sequência de ácido nucleico associada a atonal para promoção terapêutica do crescimento de células mecanorreceptoras do ouvido interno num animal, em que a referida sequência de aminoácidos associada a atonal tem ou a referida sequência de ácido nucleico associada a atonal codifica um polipéptido que tem, pelo menos, 80% de identidade para a sequência AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
- 2. Sequência de aminoácidos ou sequência de ácido nucleico associada a atonal para produção terapêutica de células ciliadas do ouvido interno, em que a referida sequência de aminoácidos associada a atonal tem ou a referida sequência de ácido nucleico associada a atonal codifica um polipéptido que tem, pelo menos, 8 0% de identidade para a sequência AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
- 3. Sequência de aminoácidos ou sequência de ácido nucleico associada a atonal para tratamento de um animal quanto à insuficiência auditiva, em que a referida sequência de aminoácidos associada a atonal tem ou a referida sequência de ácido nucleico associada a atonal codifica um polipéptido que tem, pelo menos, 80% de identidade para a sequência AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
- 4. Sequência de aminoácidos ou ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2 ou 3, que é formulada para injecção no ouvido interno do referido animal.
- 5. Sequência de aminoácidos ou sequência de ácido nucleico associada a atonal para tratamento de um animal quanto a uma perturbação do equilíbrio, em que a referida sequência de aminoácidos associada a atonal tem ou a referida sequência de ácido nucleico associada a atonal codifica um polipéptido que tem, pelo menos, 8 0% de identidade para a sequência AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
- 6. Sequência de aminoácidos ou sequência de ácido nucleico associada a atonal para tratamento de um animal quanto a uma doença articular, em que a referida sequência de ΕΡ 1 471 926/ΡΤ 2/5 aminoácidos associada a atonal tem ou a referida sequência de ácido nucleico associada a atonal codifica um polipéptido que tem, pelo menos, 80% de identidade para a sequência AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
- 7. Sequência de aminoácidos ou ácido nucleico de acordo com a reivindicação 6, em que a referida doença articular é osteoartrite.
- 8. Sequência de aminoácidos ou ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, que é formulada para administração através de um veículo de distribuição.
- 9. Sequência de aminoácidos ou ácido nucleico de acordo com a reivindicação 8, em que o referido veículo de distribuição é seleccionado a partir de um vector adenoviral, um vector retroviral, um vector virai adeno-associado, um plasmídeo, um lipossoma, um ácido nucleico, um péptido, um lípido, um hidrato de carbono e uma sua combinação.
- 10. Sequência de aminoácidos ou ácido nucleico de acordo com a reivindicação 8, em que o referido veículo de distribuição é um vector virai ou um vector não-viral.
- 11. Sequência de aminoácidos ou ácido nucleico de acordo com a reivindicação 8, em que o referido veículo de distribuição é uma célula.
- 12. Sequência de aminoácidos ou ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, que é a sequência de aminoácidos ou a sequência de ácido nucleico Mathl ou Hathl.
- 13. Sequência de aminoácidos ou ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o referido animal é um humano.
- 14. Sequência de aminoácidos ou ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 que se destina a administração após, prévia ou em simultâneo com a administração de uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica um outro produto de gene terapêutico. ΕΡ 1 471 926/ΡΤ 3/5
- 15. Composição compreendendo uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácido nucleico associada a atonal em combinação com um vector virai como veículo de distribuição, em que o referido veículo de distribuição resulta na distribuição de uma quantidade terapeuticamente eficaz da referida sequência de aminoácidos associada a atonal ou da referida sequência de ácido nucleico associada a atonal numa célula, e em que a referida sequência de aminoácidos associada a atonal é ou a referida sequência de ácido nucleico associada a atonal codifica um polipéptido que compreende, pelo menos, 80% de identidade para a sequência AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
- 16. Composição de acordo com a reivindicação 15, na qual o referido veículo de distribuição é seleccionado a partir de um vector adenoviral, um vector retroviral, um vector adeno-associado ou uma sua combinação.
- 17. Composição compreendendo: (a) uma sequência de aminoácidos associada a atonal em combinação com um veículo de distribuição, compreendendo o referido veículo de distribuição um domínio de ligação a receptor de uma toxina bacteriana ou um domínio de transdução proteica, e em que o referido veículo de distribuição resulta na distribuição de uma quantidade terapeuticamente eficaz da referida sequência de aminoácidos associada a atonal numa célula, e em que a referida sequência de aminoácidos associada a atonal é um polipéptido que compreende, pelo menos, 80% de identidade para a sequência AANARERRRMHGLNHAFDQLR; ou (b) uma sequência de ácido nucleico que codifica a referida sequência de aminoácidos associada a atonal e o referido veículo de distribuição.
- 18. Composição de acordo com a reivindicação 17, na qual uma sequência de ácido nucleico que codifica a referida sequência de aminoácidos associada a atonal está operativamente ligada a uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio de ligação a receptor de uma toxina bacteriana. ΕΡ 1 471 926/ΡΤ 4/5
- 19. Composição de acordo com a reivindicação 17, na qual uma sequência de ácido nucleico que codifica a referida sequência de aminoácidos associada a atonal está operativamente ligada a uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio de transdução proteica.
- 20. Proteína de fusão compreendendo uma sequência de aminoácidos associada a atonal ou um seu fragmento e uma sequência de aminoácidos desejada em que a referida sequência de aminoácidos associada a atonal é uma sequência de aminoácidos que tem, pelo menos, 8 0% de identidade para a sequência AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
- 21. Sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de fusão da reivindicação 20.
- 22. Utilização de uma sequência de aminoácidos ou sequência de ácido nucleico associada a atonal no fabrico de um medicamento para promoção terapêutica do crescimento de células mecanorreceptoras do ouvido interno num animal, em que a referida sequência de aminoácidos associada a atonal tem ou a referida sequência de ácido nucleico associada a atonal codifica um polipéptido que tem, pelo menos, 80% de identidade para a sequência AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
- 23. Utilização de uma sequência de aminoácidos ou sequência de ácido nucleico associada a atonal no fabrico de um medicamento para produção terapêutica de células ciliadas do ouvido interno, em que a referida sequência de aminoácidos associada a atonal tem ou a referida sequência de ácido nucleico associada a atonal codifica um polipéptido que tem, pelo menos, 80% de identidade para a sequência AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
- 24. Utilização de uma sequência de aminoácidos ou sequência de ácido nucleico associada a atonal no fabrico de um medicamento para tratamento de um animal quanto à insuficiência auditiva, em que a referida sequência de aminoácidos associada a atonal tem ou a referida sequência de ácido nucleico associada a atonal codifica um polipéptido que ΕΡ 1 471 926/ΡΤ 5/5 tem, pelo menos, 80% de identidade para a sequência AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
- 25. Utilização de uma sequência de aminoácidos ou sequência de ácido nucleico associada a atonal no fabrico de um medicamento para tratamento de um animal quanto a uma perturbação do equilíbrio, em que a referida sequência de aminoácidos associada a atonal tem ou a referida sequência de ácido nucleico associada a atonal codifica um polipéptido que tem, pelo menos, 80% de identidade para a sequência AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
- 26. Utilização de uma sequência de aminoácidos ou sequência de ácido nucleico associada a atonal no fabrico de um medicamento para tratamento de um animal quanto a uma doença articular, em que a referida sequência de aminoácidos associada a atonal tem ou a referida sequência de ácido nucleico associada a atonal codifica um polipéptido que tem, pelo menos, 80% de identidade para a sequência AANARERRRMHGLNHAFDQLR. Lisboa, 2011-03-03 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ 1/14Figura 1 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ 2/14Figura 2 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ 3/14Figura 3 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ 4/14Figura 4 ΕΡ 1 471 926/PT 5/14Figura 5 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ 6/14ΕΡ 1 471 926/PT 7/14ι Figura 7 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ 8/14Figura 8 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ 9/14Figura 9 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ 10/14Figura 10 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ 11/14Figura 11 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ 12/14Figura 12 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ 13/14Figura 13 ΕΡ 1 471 926/ΡΤ 14/14'"'á í>' • X) v) j-,-s *>* í w «i ; ^ ‘v ί~ί , Γί5 g κ' ν«-· 4¾ Wí
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