ES2355490T3 - Composiciones y métodos para la utilización terapéutica de una secuencia asociada con el gen atonal. - Google Patents
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Abstract
Una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico asociada con atonal para estimular el crecimiento terapéutico de las células mecanorreceptoras del oído interno en un animal, donde dicha secuencia de aminoácidos asociada con atonal tiene, o dicha secuencia de ácido nucleico asociada con atonal codifica, un polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
Description
Composiciones y métodos para la utilización
terapéutica de una secuencia asociada con el gen atonal.
La presente invención se refiere de manera
general al campo del diagnóstico genético y de la terapia génica y,
más particularmente, a la caracterización y utilización de una
secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos asociada a
atonal.
Un intrincado patrón de interacciones en y entre
las células dirige el desarrollo secuencial de las neuronas desde
la división de las células progenitoras neuroepiteliales. Múltiples
señales extracelular e intracelulares modelan este proceso. Entre
las señales intracelulares clave están los factores de
transcripción, los cuales inducen la expresión de una cascada de
genes. Una subclase de factores de transcripción, perteneciente a la
familia de proteínas con un motivo
hélice-bucle-hélice básico (bHLH),
es expresada muy temprano cuando se toma la decisión de proliferar
o de diferenciarse. Esta función es particularmente crucial, ya que
mutaciones en estos genes al principio del desarrollo pueden
eliminar estructuras neurales completas.
En Drosophila, el gen atonal
(ato), que es homólogo a Math1, Math2, Hath1 y Hath2,
codifica una proteína bHLH esencial para el desarrollo de los
órganos cordotonales (órganos sensoriales encontrados en la pared
corporal, en las articulaciones y en las antenas que funcionan en la
propriocepción, en el equilibrio y en la audición) (Eberl, 1999;
McIver, 1985; van Staaden y Römer, 1998). Los CHOs pueblan el
sistema nervioso periférico (SNP) de la pared corporal y las
articulaciones (tórax, abdomen, esternón, alas, patas) y de las
antenas (Moulins, 1976), proporcionando a la mosca una información
sensorial muy similar a la que proporcionan el tacto y los
mecanorreceptores en los vertebrados (McIver, 1985; Moulins, 1976).
Boyan (Boyan, 1993) propuso que, en el curso de la evolución,
diferentes CHOs se especializan para oír en diferentes insectos.
Esta hipótesis fue confirmada recientemente por van Staaden y Römer
(1998). En Drosophila, los CHOs del órgano de Johnston,
situados en el segundo segmento de las antenas, funcionan en la
audición de campo cercano (Dreller y Kirschner, 1993; Eberl, 1999)
y en la geotaxis negativa.
Durante el desarrollo, ato se expresa en
un grupo de células progenitoras a partir de las cuales son
seleccionadas las células fundadoras de los CHO (Jarman y col.,
1993). Probablemente el mismo funciona regulando la expresión de
los genes necesarios para la especificación y el desarrollo del
linaje de los CHO, ya que codifica una proteína con un motivo
hélice-bucle-hélice básico (bHLH)
que forma dímeros con la proteína "Daughterless" y se une a
secuencias "E-box", activando de este modo los
genes (Jarman y col., 1993). La especificidad de los CHO está
codificada por el dominio básico de ato, el cual se requiere
para la unión al ADN en las proteínas con bHLH (Chien y col., 1996;
Davis y col., 1990; Jarman y Ahmed, 1998; Vaessin y col., 1990). El
ato es necesario y suficiente para la generación de CHOs en
la mosca: la pérdida de la función ato da lugar a la pérdida
de CHOs, mientras que la expresión ectópica de ato produce la
formación de CHOs ectópicos (Jarman y col., 1993). Las moscas
adultas que carecen de la función atonal no coordinan, no
vuelan y tienen una audición deficiente. La sobreexpresión del gen
atonal de la mosca puede generar nuevas neuronas
cordotonales, indicando que el gen atonal es esencial y
suficiente para el desarrollo de esta población neuronal.
En los vertebrados, durante la miogénesis y la
neurogénesis, la especificación del destino celular requiere
factores de transcripción con un motivo
hélice-bucle-hélice básico (bHLH).
Math1 (homólogo 1 del atonal de ratón,
" mouse atonal
homolog-1") es uno de tales factores,
y se expresa en el cerebro posterior, en la médula espinal dorsal,
en la capa germinal externa del cerebelo, en el intestino, en las
articulaciones, en el oído y en las células de Merkel de la piel
(que funcionan como mecanorreceptores) (Akazawa y col., 1995;
Ben-Arie y col., 1996; Ben-Arie y
col., 1997). Los ratones heterozigotos para una deleción dirigida de
Math1 (Math^{+/-}) son viables y tienen un aspecto
normal, pero los ratones carentes (nulos) de Math1
(Math^{-/-}) mueren poco después de nacer y carecen de
neuronas granulares cerebelosas.
Math1 es uno de los homólogos de
ato más próximo conocidos, con un 82% de similitud de
aminoácidos en el dominio bHLH y un 100% de conservación del
dominio básico que determina la especificidad de reconocimiento de
la diana (Ben-Arie y col., 1996; Chien y col.,
1996). Math1 se expresa de manera transitoria en el SNC
comenzando el día 9 embrionario (E9) en la porción dorsal del tubo
neural. Math1 se expresa también en el labio rómbico del
cuarto ventrículo del cerebro, donde nacen los precursores de las
células granulares cerebelosas en E13-15 (Alder y
col., 1996). Después de la proliferación y la diferenciación, estas
células progenitoras migran para formar la capa granular externa
(EGL) del primordio cerebeloso (Hatten y Heintz, 1995). Las células
de la EGL proliferantes continúan expresando Math1 durante
las tres primeras semanas post-natales, hasta poco
antes de migrar a su destino adulto final para generar la capa
granular interna (IGL) del cerebelo (Akazawa y col., 1995;
Ben-Arie y col., 1996). Otro grupo de células, una
pequeña población de precursores neuronales de la médula espinal
dorsal, expresan Math1 durante E10-E14
(Akazawa y col., 1995; Ben-Arie y col., 1996).
Estas células precursoras expresan también las proteínas con el
homeodominio LIM (LH2A y LH2B), marcadores de la clase D1 de las
interneuronas comisurales (Lee y col., 1998). Helms y Johnson (1998)
informaron que la expresión de lacZ bajo el control de
elementos reguladores de Math1 reproducía los patrones de
expresión de Math1 en el cerebelo y en la médula espinal en
desarrollo, y demostraron que Math1 se expresaba en
precursores que dan lugar a una subpoblación de interneuronas
comisurales dorsales.
Con el fin de determinar la función in
vivo de Math1, los inventores generaron ratones
(Math1^{-/-}) que carecían de la proteína MATH1. Esta
mutación anulativa produce anormalidades cerebelosas importantes:
la falta de proliferación y migración de las células granulares
desde el labio rómbico en E14,5, y la ausencia de la EGL completa
al nacimiento (Ben-Arie y col., 1997). No está claro
si la agénesis de las neuronas granulares cerebelosas es debida un
fallo de la especificación de los progenitores o a la incapacidad de
las células para proliferar y/o diferenciarse. Los neonatos no
pueden respirar y mueren poco después del nacimiento, pero no
existen defectos macroscópicos en ninguno de los nervios craneales
ni en los núcleos del tronco cerebral que puedan explicar el fallo
respiratorio.
El hecho de que Math1 se exprese en el
oído interno sugiere que la expresión de Math1 es necesaria
para el desarrollo de los órganos auditivos o del equilibrio. El
oído interno se forma inicialmente como un engrosamiento del
ectodermo, denominado placoda ótica, entre los rombómeros 5 y 6 del
cerebro posterior. La placoda ótica da lugar a neuronas del VIIIº
nervio craneal y se invagina para dar lugar al otocisto, a partir
del cual se desarrollará el oído interno. El oído interno maduro de
los mamíferos contiene un órgano auditivo, la cóclea, y cinco
órganos vestibulares: el utrículo, el sáculo y tres canales
semicirculares. Los epitelios sensoriales de estos órganos constan
de células pilosas mecanorreceptoras, células de soporte y
terminaciones nerviosas. Las células pilosas sirven como
mecanorreceptores para transformar las ondas sonoras y el movimiento
de la cabeza en información auditiva y posicional. Las células
pilosas y las células de soporte proceden ambas de una célula
progenitora común y proliferan y se diferencian dentro del epitelio
sensorial, con un número máximo de mitosis entre los días
embrionarios 13 y 18 (E13-18) en los ratones. Aunque
varios genes han sido implicados en el desarrollo del oído interno,
tales como int2 (Mansour y col., 1993), pax2 (Torres
y col., 1996) y Hmx3 (Wang y col., 1998), no se ha demostrado
que se requiera ninguno de ellos específicamente para la génesis de
las células pilosas.
El daño de las células pilosas es una causa
común de la sordera y de la disfunción vestibular, que son en sí
mismas enfermedades muy extendidas. Más de 28 millones de americanos
tienen deterioro auditivo; los trastornos vestibulares afectan a la
cuarta parte de la población general y a la mitad de nuestros
ancianos, aproximadamente. Las delicadas células pilosas son
vulnerables a la enfermedad, al envejecimiento y a los traumas
medioambientales (esto es, a los antibióticos, las toxinas, el
ruido elevado persistente). En los mamíferos, una vez que estas
células han sido destruidas no pueden regenerarse. Por tanto, existe
la necesidad de solucionar los problemas de los pacientes con
discapacidad y pérdida auditiva degenerativa congénita, crónica o
adquirida o con problemas de equilibrio, y de proporcionar
composiciones, métodos y reactivos para ser utilizados en el
tratamiento de la pérdida auditiva y de la función vestibular.
Como apoyo de las descripciones de la presente
invención, otros autores han demostrado que Math1, después
de una sobreexpresión, induce la producción significativa de células
pilosas extra en el oído interno de ratas después del nacimiento
(Zheng y Gao, 2000). Brevemente, aunque la determinación del destino
se completa normalmente hacia el nacimiento en el caso de las
células pilosas cocleares de los mamíferos, la sobreexpresión de
Math1 en cultivos de explantes cocleares de ratas
postnatales tiene como resultado células pilosas del oído
adicionales que derivan de células epiteliales columnares situadas
fuera del epitelio sensorial en la cresta epitelial mayor. Además,
la conversión de células de soporte utriculares postnatales en
células pilosas es facilitada por la expresión de Math1. La
capacidad de Math1 para permitir la producción de células
pilosas en el oído es una firme evidencia en apoyo de la invención
reivindicada.
La invención proporciona una secuencia de
aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal para estimular el crecimiento terapéutico de células
mecanorreceptoras del oído interno en un animal, donde dicha
secuencia de aminoácidos asociada con atonal tiene, o dicha
secuencia de ácido nucleico asociada con atonal codifica, un
polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia
AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
La invención proporciona una secuencia de
aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal para generar terapéuticamente células pilosas del
oído interno, donde dicha secuencia de aminoácidos asociada con
atonal tiene, o dicha secuencia de ácido nucleico asociada
con atonal codifica, un polipéptido que tiene al menos un
80% de identidad con la secuencia AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
La invención proporciona una secuencia de
aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal para el tratamiento de un animal con deterioro
auditivo, donde dicha secuencia de aminoácidos asociada con
atonal tiene, o dicha secuencia de ácido nucleico asociada
con atonal codifica, un polipéptido que tiene al menos un
80% de identidad con la secuencia AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
La invención proporciona una secuencia de
aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal para el tratamiento de un animal con trastornos del
equilibrio, donde dicha secuencia de aminoácidos asociada con
atonal tiene, o dicha secuencia de ácido nucleico asociada
con atonal codifica, un polipéptido que tiene al menos un
80% de identidad con la secuencia AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
La invención proporciona una secuencia de
aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal para el tratamiento de un animal con una enfermedad
de las articulaciones, donde dicha secuencia de aminoácidos
asociada con atonal tiene, o dicha secuencia de ácido
nucleico asociada con atonal codifica, un polipéptido que
tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia
AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
En realizaciones específicas, la administración
de la secuencia de aminoácidos o de la secuencia de ácido nucleico
es a través de un vector seleccionado de entre un vector
adenovírico, un vector retrovírico, un vector adenoasociado, un
plásmido o cualquier otro vector basado en ácidos nucleicos, un
liposoma, un ácido nucleico, un péptido, un lípido, un carbohidrato
y una combinación de dichos vectores. En una realización específica,
dicho vector es un vector no vírico o un vector vírico. En otra
realización específica dicho vector es una célula. En una
realización preferida dicho vector es un vector adenovírico que
contiene una secuencia promotora de IE de citomegalovirus y una
secuencia señal de poliadenilación temprana de SV40. En otra
realización específica, dicha célula es una célula humana. En una
realización específica adicional dicha enfermedad de las
articulaciones es osteoartritis. En otra realización específica, la
célula contiene una alteración en una secuencia de ácido nucleico o
de aminoácidos asociada con
atonal.
atonal.
En otra realización, la presente invención
proporciona una composición que contiene una secuencia de
aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal en combinación con un vector vírico como vehículo
para la administración, donde dicho vehículo para la administración
tiene como resultado el suministro de una cantidad terapéuticamente
eficaz de dicha secuencia de aminoácidos asociada con atonal
o de dicha secuencia de ácido nucleico asociada con atonal a
una célula, y donde dicha secuencia de aminoácidos asociada con
atonal o dicha secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal codifica un polipéptido que contiene al menos un 80%
de identidad con la secuencia AANARERRRMHGLNHAFDQLR. En
realizaciones específicas, dicho vehículo es el dominio de unión al
receptor de una toxina bacteriana o cualquier molécula de fusión, o
es un dominio de transducción de una proteína. En una realización
específica, dicho dominio de transducción de una proteína procede
del péptido TAT del
VIH.
VIH.
La composición puede ser utilizada para tratar a
un organismo de un deterioro auditivo, donde dicho organismo tiene
un defecto en una secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal. En una realización específica, el defecto es una
mutación o una alteración de dicha secuencia de ácido nucleico
asociada con atonal. En otra realización específica, el
defecto afecta a una secuencia reguladora de dicha secuencia de
ácido nucleico asociada con atonal. La composición puede ser
utilizada para tratar a un organismo del deterioro auditivo, donde
dicho organismo contiene un defecto en una secuencia de ácido
nucleico que está asociada con la regulación de una secuencia de
ácido nucleico asociada con atonal. La composición puede ser
utilizada para tratar a un organismo del deterioro auditivo, donde
dicho organismo tiene un defecto en una secuencia de aminoácidos
que está asociada con la regulación de una secuencia de ácido
nucleico asociada con atonal.
La composición puede ser utilizada para tratar a
un organismo del desequilibrio, donde dicho organismo contiene un
defecto en una secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal. En una realización específica, el defecto es una
mutación o una alteración de dicha secuencia de ácido nucleico
asociada con atonal. En otra realización específica, el
defecto afecta a una secuencia reguladora de dicha secuencia de
ácido nucleico asociada con atonal. La composición puede ser
utilizada para tratar a un organismo del desequilibrio, donde dicho
organismo contiene un defecto en una secuencia de ácido nucleico
que está asociada con la regulación de una secuencia de ácido
nucleico asociada con atonal. En una realización adicional de
la presente invención, hay una composición para tratar a un
organismo del desequilibrio, donde dicho organismo contiene un
defecto en una secuencia de aminoácidos que está asociada con la
regulación de una secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal.
La composición puede ser utilizada para tratar a
un organismo de la osteoartritis, donde dicho organismo contiene un
defecto en una secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal. En una realización específica, el defecto es una
mutación o una alteración de dicha secuencia de ácido nucleico
asociada con atonal. En otra realización específica, el
defecto afecta a una secuencia reguladora de dicha secuencia de
ácido nucleico asociada con atonal. La composición puede ser
utilizada para tratar a un organismo de la osteoartritis, donde
dicho organismo contiene un defecto en una secuencia de ácido
nucleico que está asociada con la regulación de una secuencia de
ácido nucleico asociada con atonal. La composición puede ser
utilizada para tratar a un organismo de la osteoartritis, donde
dicho organismo contiene un defecto en una secuencia de aminoácidos
que está asociada con la regulación de una secuencia de ácido
nucleico asociada con atonal.
La composición puede ser utilizada para tratar a
un organismo de una enfermedad de las articulaciones, donde dicho
organismo contiene un defecto en una secuencia de ácido nucleico
asociada con atonal. En una realización específica, el
defecto es una mutación o una alteración de dicha secuencia de ácido
nucleico asociada con atonal. En otra realización
específica, el defecto afecta a una secuencia reguladora de dicha
secuencia de ácido nucleico asociada con atonal. La
composición puede ser utilizada para tratar a un organismo de una
enfermedad de las articulaciones, donde dicho organismo contiene un
defecto en una secuencia de ácido nucleico que está asociada con la
regulación de una secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal. La composición puede ser utilizada para tratar a un
organismo de una enfermedad de las articulaciones, donde dicho
organismo contiene un defecto en una secuencia de aminoácidos que
está asociada con la regulación de una secuencia de ácido nucleico
asociada con atonal.
Otros objetos, características y ventajas
adicionales serán obvios y finalmente más fácilmente comprendidos
mediante la lectura de la siguiente especificación y mediante
referencia a las figuras acompañantes que forman una parte de la
misma, o a cualquiera de los ejemplos de las realizaciones
actualmente preferidas de la invención que se presentan con fines
descriptivos.
Las Figuras 1A y 1B demuestran la tinción con
\beta-Gal (azul) del oído interno de embriones
heterozigotos para Math1 según se describió anteriormente en
la presente. La Figura 1A muestra la vesícula ótica (OV) en E12,5 y
la Figura 1B el oído interno en E14,5 de embriones
Math1^{+/\beta-Gal}. Los epitelios
sensoriales se teñían positivamente en la cóclea (C), en el sáculo
(S), en el utrículo (U) y en las ampollas del canal semicircular
(SCA). Un diagrama esquemático del oído interno está representado al
lado de la tinción como referencia, indicando el azul la
localización de los epitelios sensoriales. Los aumentos originales
de las imágenes tomadas bajo el microscopio fueron de x100 para la
Figura 1A y de x50 para la Figura 1B.
Las Figuras 2A a 2F son micrografías
electrónicas con barrido de los epitelios sensoriales del oído
interno en E18,5 de ratones de tipo salvaje y de ratones
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal}.
Los epitelios de los ratones de tipo salvaje estás mostrados en las
Figuras 2A, 2C y 2E y los epitelios de los ratones nulos para el
gen en las Figuras 2B, 2D y 2F. El órgano de Corti de la cóclea está
mostrado e indicado en las Figuras 2A y 2B. En los ratones de tipo
salvaje hay tres filas de células pilosas externas (1, 2, 3), una
fila de células pilosas internas (I), todas con haces pilosos (HB).
La membrana tectorial (TM), una estructura accesoria de la cóclea,
puede observarse en la parte inferior. Por encima del epitelio
sensorial están las células escamosas (SQ) con quinocilios
rudimentarios (RK). En los ratones nulos para el gen (Figura 2B),
hay solamente células escamosas. La crista ampullaris de un
canal semicircular vertical está representada en las Figuras 2C y
2D. La crista de los ratones nulos para el gen es similar a
la de los ratones de tipo salvaje en cuanto a forma global,
incluyendo el septum (eminencia) cruciatum (EC), pero
es más pequeña. La mácula del utrículo es el foco de las Figuras 2E
y 2F. De nuevo la mácula de los ratones nulos para el gen es más
pequeña que la de los ratones de tipo salvaje. Las barras de escala
son según sigue: 10 \mum en las Figuras 2A y 2B, 50 \mum en las
Figuras 2C y 2D y 100 \mum en las Figuras 2E y 2F.
Las Figuras 3A a 3F son micrografías ópticas de
secciones transversales semifinas de los epitelios sensoriales del
oído interno de ratones de tipo salvaje (Figuras 3A, 3C y 3E) y de
ratones
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal}
(Figuras 3B, 3D y 3F); todos los ratones fueron observados en
E18,5. Según se observó en la cóclea de los ratones de tipo
salvaje, Figura 3A, están presentes tres células pilosas externas
(1, 2, 3) y una célula pilosa interna (I). Por el contrario, la
cóclea de los ratones nulos para el gen (Figura 3B) tiene solamente
células escamosas (SQ) en la misma región. Células pilosas (HC) y
células de soporte (SC) están presentes en la crista
ampullaris (Figura 3C) y en la mácula utricular (Figura 3E) de
los ratones de tipo salvaje, pero en los ratones nulos para el gen
están presentes únicamente las células de soporte (Figuras 3D y 3F).
La crista fue cortada oblicuamente, lo que explica las
múltiples capas de células pilosas de la Figura 3C. La membrana
otolítica (OM), una estructura accesoria del utrículo, está presente
en los ratones de tipo salvaje (Figura 3E) y en los ratones nulos
para el gen (Figura 3F). Las barras de escala son igual a 100 \mum
(Figuras 3A y 3B); 50 \mum (Figuras 3C y 3D) y 25 \mum (Figuras
3E y 3F).
Las Figuras 4A y 4B son micrografías
electrónicas de transmisión de la mácula utricular de ratones de
tipo salvaje y de ratones
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal}
en el E18,5. La Figura 4A muestra que las células pilosas (HC) y
las células de soporte (SC) están presentes en la mácula utricular
de los ratones de tipo salvaje. En contraste, en los ratones nulos
para el gen están presentes únicamente las células de soporte
(Figura 4B). Las células pilosas tienen haces pilosos (HB) y las
células de soporte tienen microvilli (MV). Las células
pilosas son menos densas a los electrones y tienen más núcleos
apicales que las células de soporte, pero solamente estas últimas
tienen gránulos secretores (SG). Algunas células pilosas inmaduras
(IM) son evidentes en los ratones de tipo salvaje pero no en los
ratones nulos para el gen. La barra de escala es igual a 10 \mum
en todas las figuras.
La Figuras 5A a 5F muestran el patrón de tinción
de la Calretinina en los epitelios sensoriales del oído interno.
Secciones del utrículo de individuos de la misma camada de tipo
salvaje (Figuras 5A y 5C) y
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal}
(Figuras 5B y 5D) en el E16,5 fueron contrateñidas con yoduro de
propidio (rojo) para microscopía confocal. Se cortaron secciones de
la crista ampullaris de ratones de tipo salvaje (Figura 5E) y
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal}
(Figura 5F) en el E18,5 y fueron contrateñidas con DAPI (azul) para
microscopía de inmunofluorescencia. La crista está cortada
en un ángulo oblicuo, lo cual explica las múltiples capas de células
pilosas (Figura 5E). La inmunotinción de la Calretinina (verde,
flechas) es evidente en las células pilosas de los ratones de tipo
salvaje (Figuras 5A, 5C y 5E), pero no en los ratones nulos para el
gen (Figuras 5B, 5D y 5F). Las áreas dentro de un recuadro de las
Figuras 5A y 5B indican las regiones ampliadas en las Figuras 5C y
5D. La barra de escala es igual a 100 \mum (Figuras 5A y 5B), 15
\mum (Figuras 5C y 5D) y un aumento original de x200 (Figuras 5E
y 5F).
Las Figuras 6A y 6B muestran el patrón de
expresión de Math1 en el cartílago articular de ratón
utilizando el heterozigoto
Math1^{+/\beta-Gal}. La Figura 6A muestra
el patrón de tinción de una extremidad anterior de ratón P14 y
demuestra la expresión en todas las articulaciones. La Figura 6B es
un aumento (20x) de la articulación del codo del mismo ratón, que
demuestra que Math1 se expresa exclusivamente en los
condrocitos articulares no osificados.
Las Figuras 7A a 7C muestran la sustitución de
la región codificadora de Math1 por el gen lacZ. La
Figura 7A, parte superior, tiene un mapa del locus genómico de
Math1. La región codificadora está mostrada como un recuadro
negro. Los sitios de las sondas utilizadas para detectar los alelos
de tipo salvaje y mutantes están mostrados como barras negras. El
vector vectorizante está en el medio, con los sitios para
recombinación homóloga indicados por Xs más grandes. En el locus
diana mostrado en la parte inferior, lacZ es traducido bajo
el control de elementos reguladores de Math1. La Figura 7B
muestra un análisis de transferencia Southern de células madre
embrionarias utilizando la sonda externa 3'. La banda superior
representa el alelo wt y la banda inferior el alelo mutante diana
(mut) en los clones diana. La Figura 7C muestra un análisis de
transferencia Southern de ADN procedente de la progenie de los
ratones heterozigotos, demostrando la presencia del alelo diana y
la ausencia del alelo de tipo salvaje en ratones
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal}
(asteriscos). Las abreviaturas son según sigue: (A) ApaI;
(H) HindIII; (RI) EcoRI; (S) SalI y (X)
XbaI.
Las Figuras 8A a 8H muestran la expresión de
Math1/lacZ y el fenotipo cerebeloso en ratones
Math1^{+/\beta-Gal} y
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal}.
La Figura 8A muestra la expresión de Math1/lacZ en el tubo
neural dorsal en E9,5 y (Figura 8B) E10,5. La Figura 8C indica una
sección del cerebro posterior en E10,5 que tiene expresión de
Math1/lacZ en la porción dorsal (flechas). La Figura 8D
muestra que en una sección de la médula espinal de un embrión
E12,5, las células dorsales migran ventralmente (flechas). La Figura
8E muestra que la expresión en E14,5 se observa en los progenitores
de la EGL en el labio rómbico y en las células migratorias que
poblarán la EGL. La Figura 8F demuestra que en los ratones
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal},
la expresión de Math1/lacZ está limitada a unas cuantas
células del labio rómbico, que está reducido significativamente de
tamaño. La Figura 8G muestra que en P0 se expresa Math1/lacZ
en la EGL. La Figura 8H demuestra que la EGL está ausente en los
ratones nulos para el gen. El aumento original de las Figuras 8C a
8H era de 100x.
Las Figuras 9A a 9G muestran la expresión de
Math1/lacZ en el oído interno y en el tronco cerebral y el
análisis histológico del núcleo pontino ventral. La tinción con
X-gal de la cresta utricular de
Math1^{+/\beta-Gal} (Figura 9A), de los
epitelios sensoriales del oído interno de
Math1^{+/\beta-Gal} (Figura 9B) y de
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal}
(Figura 9C) en E18,5. La expresión de Math1/lacZ en la capa
superior de células pilosas de los epitelios sensoriales (Figuras 9A
y 9B) y el aspecto de cáliz característico (punta de flecha). En
los ratones nulos para el gen la tinción con X-gal
de las células epiteliales no es específica en ausencia de células
pilosas (Figura 9C). Se demuestra la tinción con
X-gal del cerebro completo de
Math1^{+/\beta-Gal} (Figura 9D) y de
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal}
(Figura 9E) en E18,5. Hay tinción positiva del núcleo pontino
(punta de flecha) y del cerebelo (flecha) en los ratones
Math1^{+/\beta-Gal}, la cual está ausente o
enormemente reducida en los mutantes nulos para el gen en el
cerebelo y en el núcleo pontino (recuadro). Las Figuras 9F y 9G
muestran la tinción con hematoxilina y eosina de secciones
sagitales del puente de un ratón de tipo salvaje y de un mutante
nulo para el gen (Figuras 9F y 9G, respectivamente), mostrando la
pérdida del núcleo pontino ventral en los mutantes nulos para el
gen. Los aumentos originales fueron según sigue: (A) 400x; (B y C)
1000x; (D y E) 8x; recuadro en D y E 100x; (F y G) 10x.
Las Figuras 10A a 10E demuestran que
Math1/lacZ se expresa en los condrocitos de las
articulaciones. La tinción con X-gal de embriones
enteros en E12,5 (Figura 10A) y en E16,5 (Figura 10B) ilustra que
Math1/lacZ se expresa en todas las articulaciones (Figura
10C). La sección horizontal a través de la articulación del codo de
ratones Math1^{+/\beta-Gal} en E18,5
muestra que se expresa en condrocitos en reposo (flecha). La Figura
10D muestra una sección horizontal de la articulación
húmero-radial en P10 que tiene expresión en los
condrocitos articulares (punta de flecha) y en los condrocitos en
reposo (flecha). La Figura 10E muestra un gran aumento de una
sección de la articulación de la muñeca que indica que
Math1/lacZ se expresa en los condrocitos articulares. El
aumento original fue según sigue: (C) 10x; (D) 20x y (E) 40x.
Las Figuras 11A a 11L muestran la expresión de
Math1/lacZ en células de Merkel. Con el fin de identificar
las estructuras teñidas en la piel con pelo y sin pelo, embriones de
la misma camada E16,5 fueron teñidos como montajes completos,
seccionados y examinados microscópicamente. Se muestran secciones de
las vibrisas (Figura 11A), de la almohadilla subplantar a bajo
aumento (Figura 11B) y a alto aumento de la región marcada por una
flecha en B (Figura 11C) y de piel con pelo (Figura 11D). En todas
las secciones, la localización de las células teñidas fue según se
esperaba de las células de Merkel. Con el fin de buscar defectos
macroscópicos en los ratones nulos para el gen, se tomaron
fotografías de primeros planos a través de un estereomicroscopio de
ratones de la misma camada
Math1^{+/\beta-Gal} (control, paneles
E-H) y
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal}
(nulos para el gen, paneles I-L). La tinción en los
ratones nulos para el gen parecía más potente debido a un efecto de
la dosis en las vibrisas (E, I), en las articulaciones de los
miembros (F, J) y en las almohadillas subplantares (G, K). En
contraste, la intensidad de la tinción de los ratones nulos para el
gen (J, L) era notablemente más débil que la de los ratones
heterozigotos (F, H) en las cúpulas del tacto asociadas con la piel
con pelo. Los aumentos originales fueron según sigue: (A) x200; (B)
x50; (C) x400; (D) x500; (E)-(G)-(H)-(I)-(K)-(L) x32; (F)-(J)
x16.
Las Figuras 12A a 12E muestran la ausencia de
cúpulas del tacto teñidas para lacZ en ratones Tabby.
Hembras Tabby/Tabby fueron cruzadas con machos
Math1^{+/\beta-Gal} y su progenie fue
teñida con X-gal y se determinó su género en el
E16,5. Se detectó tinción alrededor de las vibrisas primarias del
hocico en los embriones hembra heterozigotos para la mutación
Tabby (Figura 12A) y en los embriones macho hemizigotos para
la mutación (Figura 12B). Las vibrisas secundarias, que se sabe que
varían en número en los mutantes Tabby (flechas negras),
fueron también teñidas. La tinción de las cúpulas del tacto fue
menos intensa en los embriones hembra Tabby/X (Figura 12D),
que en los embriones Math1^{+/\beta-Gal}
(wt para Tabby) (Figura 12C), ya que Tabby es una
mutación semidominante. Sin embargo, se detectaron placas de
cúpulas del tacto teñidas en un embrión hembra que llevaba un alelo
de tipo salvaje en el locus de Tabby (Figuras 12A, flecha
roja, y 12D). En contraste, un macho hemizigoto carecía
completamente de tinción y de cúpulas del tacto, debido a la
pérdida de los folículos pilosos que suprime el desarrollo de las
células de Merkel (Figuras 12B y 12E).
Las Figuras 13A a 13F demuestran el análisis con
marcadores de células de Merkel en ratones de tipo salvaje y en
ratones nulos para Math1. Secciones de piel de ratones
Math1^{+/+} y de ratones
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal}
reaccionaron con anticuerpos contra MATH1 (Figuras 13A y 13B),
citoqueratina 18 (Figuras 13C y 13D) y cromogranina A (Figuras 13E
y 13F). Anticuerpos policlonales hacia MATH1 identificaron múltiples
núcleos basales en los pocos folículos pilosos abdominales de los
ratones de tipo salvaje (Figura 13A) pero no de los ratones mutantes
(Figura 13B). Anticuerpos monoclonales hacia citoqueratina 18 y
hacia cromogranina A identificaron células de Merkel en los ratones
de tipo salvaje (Figuras 13C y 13E) y en los ratones mutantes
(Figuras 13D y 13F). El aumento original fue de 100x.
Las Figuras 14A a 14G muestran que Math1
rescata la falta de neuronas cordotonales en embriones mutantes
para ato de Drosophila. La Figura 14A muestra una
vista dorsal del tórax de una mosca de tipo salvaje. Observar que
existe una disposición regular de las cerdas o macroquetas. La
Figura 14B muestra una vista similar de una mosca transgénica en la
cual se sobreexpresó Math1 utilizando el sistema UAS/GAL4
(Brand y Perrimon, 1993). Esta expresión ectópica da lugar a
numerosas cerdas extra que son órganos sensoriales externos (otro
tipo de mecanorreceptores), no CHOs. CHOs ectópicos fueron
producidos en muchas otras regiones. La Figura 14C muestra una
vista lateral de dos agrupaciones abdominales que contienen 6 CHOs
además de los órganos sensoriales externos, revelados por un
anticuerpo específico neuronal (Mab 22C10). Los 5 CHOs laterales
forman un grupo y el sexto está situado dorsalmente respecto al
grupo. La Figura 14D presenta una vista similar de un embrión
mutante para ato que muestra la ausencia de los CHOs. La
Figura 14E demuestra que la expresión ubicua de Math1 induce
nuevas neuronas de CHO en embriones mutantes para ato en la
localización correcta. La Figura 14F muestra la hibridación in
situ en un cerebro del tercer estadio ("instar") larvario
en un montaje completo utilizando como sonda el ADNc de ato.
Observar la expresión en los lóbulos ópticos en desarrollo
(patrones de expresión "en herradura") y dos grupos punteados
de células en el medio de los lóbulos cerebrales (puntas de
flecha). La Figura 14G muestra que la expresión de Math1 en
Drosophila induce la formación de CHOs en posiciones
normales y ectópicas. El (+) indica la presencia de CHOs y (-)
indica su ausencia. El número de (+) de la primera columna es
utilizado para cuantificar el incremento relativo del número de
CHOs observados cuando se expresa Math1.
El término "alteración", según se utiliza
en la presente, se define como cualquier tipo de cambio o
modificación en un ácido nucleico o en un aminoácido. Dicho cambio
o modificación incluye cualquier mutación, deleción, reordenación,
adición, en un ácido nucleico. Esto incluye el procesamiento
post-transcripcional tal como la adición de un
casquete 5', el procesamiento de intrones y la poliadenilación. Las
mutaciones pueden ser mutaciones sin sentido, mutaciones con un
sentido erróneo, desplazamiento del marco, o pueden dar lugar a un
aminoácido truncado o pueden alterar la conformación del
aminoácido. La alteración de un ácido nucleico puede estar presente
en secuencias reguladoras o puede afectar a factores que actúan en
trans. Pueden estar presentes también múltiples
alteraciones. Dicho cambio o modificación incluye también cualquier
cambio en un aminoácido incluyendo metilación, miristilación,
acetilación, glucosilación, o un cambio en las señales asociadas con
el procesamiento de dicho aminoácido, incluyendo señales de
localización intracelular o intercelular y el corte de aminoácidos
extraños. Dicha alteración puede afectar también a la degradación o
al plegamiento de dicha proteína.
La secuencia de aminoácidos "asociada con
atonal" tiene, o la secuencia de ácido nucleico
"asociada con atonal" codifica, un polipéptido que
tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia
AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
El término "defecto", según se utiliza en
la presente, se define como una alteración, mutación, tara o pérdida
de la expresión de una secuencia asociada con atonal. Un
técnico experto es consciente de que la pérdida de expresión afecta
a los niveles de expresión de una secuencia asociada con
atonal que no son significativos o detectables mediante los
medios estándar de la técnica. Un técnico experto es también
consciente de que la pérdida, o ausencia, de los niveles de
expresión en un organismo adulto, tal como un ser humano, tiene
lugar de forma natural y da lugar a un deterioro de la audición con
el paso del tiempo. Por tanto, el término "defecto", según se
utiliza en la presente, incluye la reducción o la pérdida de
expresión natural de una secuencia asociada con atonal.
El término "administrar", según se utiliza
en la presente, se define como llevar a un destino e incluye la
administración con fines terapéuticos.
El término "vehículo para la
administración", según se utiliza en la presente, se define como
cualquier entidad que está asociada con la transferencia de otra
entidad. Dicho vehículo para la administración es seleccionado del
grupo que consta de un vector adenovírico, un vector retrovírico, un
vector adenoasociado, un plásmido, un liposoma, un ácido nucleico,
un péptido, un lípido, un carbohidrato y una combinación de los
mismos.
El término "condición detectable", según se
utiliza en la presente, se define como cualquier estado de salud o
cualquier estatus de un animal, órgano o tejido caracterizado por
síntomas específicos del desarrollo o patológicos. Ejemplos
incluyen, pero no se limitan a, la pérdida de células pilosas,
deficiencias en las neuronas granulares del cerebelo, deterioro de
la audición, falta de equilibrio, enfermedad de las articulaciones,
osteoartritis y proliferación anormal de células.
El término "heteróloga", según se utiliza
en la presente, se define como una secuencia de ácido nucleico que
es, o que está relacionada con, una secuencia de ácido nucleico que
no existe de forma natural en un locus particular. En una
realización alternativa, la secuencia de ácido nucleico heteróloga
existe de forma natural en un locus particular, pero contiene una
alteración molecular en comparación con el locus existente de forma
natural. Por ejemplo, puede utilizarse un locus de tipo salvaje de
una secuencia asociada con atonal para sustituir una copia
defectuosa de la misma secuencia.
El término "trastorno del equilibrio",
según se utiliza en la presente, se define como una condición médica
en la que un organismo tiene deteriorado el equilibrio. En una
realización específica, el deterioro es debido a un defecto de
origen vestibular. En otra realización específica, el trastorno es
un trastorno vestibular de percepción del equilibrio incluyendo,
pero sin limitarse a, la enfermedad de Meniere, vértigo y
laberintitis.
El término "inactivado", según se utiliza
en la presente, se define como un estado en el cual se ha reducido
o se ha eliminado completamente la expresión de una secuencia de
ácido nucleico. Dicha inactivación puede tener lugar mediante la
transferencia o la inserción de otra secuencia de ácido nucleico o
mediante cualquier medio estándar en la técnica para influir sobre
los niveles de expresión de una secuencia de ácido nucleico.
El término "precursoras", según se utiliza
en la presente, se define como células progenitoras de las cuales
deriva el origen y/o las propiedades de otras células.
El término "secuencia informadora
regulable", según se utiliza en la presente, se define como
cualquier secuencia que dirige la transcripción de otra secuencia y
que ella misma está bajo el control regulador de un factor o estado
extrínseco. Ejemplos de factores o estados extrínsecos incluyen,
pero no se limitan a, la exposición a productos químicos, ácidos
nucleicos, proteínas, péptidos, lípidos, carbohidratos, azúcares,
luz, sonido, hormonas, tacto o un medio específico de un tejido.
Ejemplos de secuencias informadoras regulables incluyen la
secuencia promotora de GAL y la secuencia promotora/transactivadora
de tetraciclina.
El término "secuencia reguladora", según se
utiliza en la presente, se define como cualquier secuencia que
controla directamente o indirectamente la transcripción de otra
secuencia. Dicho control puede tener que ver con el inicio o con el
cese de la transcripción o bien puede tener que ver con la cantidad
o con la distribución tisular de la transcripción.
El término "secuencia informadora", según
se utiliza en la presente, se define como cualquier secuencia que
muestra expresión por una secuencia reguladora. Dicha secuencia
informadora puede ser utilizada como un marcador en forma de ARN o
de una proteína. Ejemplos de secuencias informadoras son la
\beta-galactosidasa, la proteína fluorescente
verde (GFP), la proteína fluorescente azul (BFP), neomicina,
kanamicina, luciferasa, \beta-glucuronidasa y
cloranfenicol transferasa (CAT). En un aspecto específico de la
presente invención, la presencia y la cantidad del producto de la
secuencia informadora, ya sea un ácido nucleico o un aminoácido,
refleja el nivel de transcripción por la secuencia promotora que
regula la misma.
El término "terapéuticamente eficaz", según
se utiliza en la presente, se define como la cantidad requerida de
un compuesto para mejorar algún síntoma asociado con una enfermedad.
Por ejemplo, en el tratamiento del deterioro auditivo, un compuesto
que mejore la audición en cualquier grado o que detenga cualquier
síntoma del deterioro auditivo sería terapéuticamente eficaz. En el
tratamiento de una enfermedad de las articulaciones, un compuesto
que mejore la salud o el movimiento de una articulación en cualquier
grado o que detenga cualquier síntoma de la enfermedad de las
articulaciones, sería terapéuticamente eficaz. No se requiere una
cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto para curar la
enfermedad, pero proporcionará un tratamiento para la
enfermedad.
El término "vector", según se utiliza en la
presente, se define como un vehículo biológico para la
administración de una entidad específica. En una realización
específica la entidad es un ácido nucleico asociado con
atonal.
La invención se refiere a la utilización de una
secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos asociada con
atonal para el uso terapéutico de condiciones detectables
tales como la pérdida de células pilosas, el deterioro auditivo, un
trastorno del equilibrio, una enfermedad de las articulaciones y
osteoartritis.
Las secuencias proporcionadas en la presente y
los números de Acceso del GenBank correspondientes están listados
entre paréntesis según sigue: SEC ID Nº:1 (NM_005172); SEC ID Nº:2
(NP_005163.1); SEC ID Nº:3 (AW413228); SEC ID Nº:4 (NM_009719);
SEC ID Nº:5 (NP_033849.1); SEC ID Nº:6 (NM_009718); SEC ID Nº:7
(NP_033848.1); SEC ID Nº:8 (NM_009717); SEC ID Nº:9 (NP_033847.1);
SEC ID Nº:10 (NM_007500); SEC ID Nº:11 (NP_031526.1); SEC ID Nº:12
(NM_007501); SEC ID Nº:13 (AW280518); SEC ID Nº:14 (AW236965); SEC
ID Nº:15 (AW163683); SEC ID Nº:16 (AF134869); SEC ID Nº:17
(AAD31451.1); SEC ID Nº:18 (AJ012660); SEC ID Nº:19 (CAA10106.1);
SEC ID Nº:20 (AJ012659); SEC ID Nº:21 (CAA10105.1); SEC ID Nº:22
(AF071223); SEC ID Nº:23 (AAC68868.1); SEC ID Nº:24 (U76208); SEC
ID Nº:25 (AAC53029.1); SEC ID Nº:26 (U76210); SEC ID Nº:27
(AAC53033.1); SEC ID Nº:28 (U76209); SEC ID Nº:29 (AAC53032.1); SEC
ID Nº:30 (U76207); SEC ID Nº:31 (AAC53028.1); SEC ID Nº:32
(AF036257); SEC ID Nº:33 (AAC15969.1); SEC ID Nº:34 (AF034778); SEC
ID Nº:35 (AJ001178); SEC ID Nº:36 (CAA04572.1); SEC ID Nº:37
(Y07621); SEC ID Nº:38 (CAA68900.1); SEC ID Nº:39 (AF024536); SEC
ID Nº:40 (AAB82272.1); SEC ID Nº:41 (D85188); SEC ID Nº:42
(BAA12738.1); SEC ID Nº:43 (D44480); SEC ID Nº:44 (BAA07923.1); SEC
ID Nº:45 (D43694); SEC ID Nº:46 (BAA07791.1); SEC ID Nº:47
(D85845); SEC ID Nº:48 (BAA12880.1); SEC ID Nº:49 (U93171); SEC ID
Nº:50 (AAB58669.1); SEC ID Nº:51 (U93170); SEC ID Nº:52
(AAB58668.1); SEC ID Nº:53 (U61152); SEC ID Nº:54 (AAB41307.1); SEC
ID Nº:55 (U61151); SEC ID Nº:56 (AAB41306.1); SEC ID Nº:57
(U61148); SEC ID Nº:58 (AAB41305.1); SEC ID Nº:59 (U61149); SEC ID
Nº:60 (AAB41304.1); SEC ID Nº:61 (U61150); SEC ID Nº:62
(AAB41303.1); SEC ID Nº:63 (L36646); SEC ID Nº:64 (AAA21879.1); SEC
ID Nº:69 (AA625732).
La invención se refiere al tratamiento de un
animal, incluyendo un ser humano, para estimular el crecimiento de
las células mecanorreceptoras del oído interno, para generar células
pilosas del oído interno, para tratar el deterioro auditivo o la
falta de equilibrio y para tratar una enfermedad de las
articulaciones. Se administra una cantidad terapéuticamente eficaz
de una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos asociada con
atonal. En realizaciones específicas, dicha administración
es mediante un vector seleccionado de un vector vírico (incluyendo
bacteriófagos, virus animales y vegetales), un plásmido, un cósmido
o cualquier otro vector basado en ácidos nucleicos, un liposoma, un
ácido nucleico, un péptido, un lípido, un carbohidrato y una
combinación de dichos vectores. En una realización específica,
dicho vector vírico es un vector adenovírico, un vector retrovírico
o un vector adenoasociado, incluyendo un vector lentivirus, un
vector virus Herpes, un vector virus alfa, etc. Por tanto, el
vector puede ser vírico o no vírico. En una realización preferida,
dicho vector es un vector adenovírico que comprende una secuencia
promotora de IE de citomegalovirus y una secuencia señal de
poliadenilación temprana de SV40. En otra realización específica,
dicha célula es una célula humana. En una realización específica
adicional, dicha enfermedad de las articulaciones es osteoartritis.
En una realización específica adicional, la célula contiene una
alteración en una secuencia de aminoácidos asociada con
atonal, donde dicha secuencia de aminoácidos tiene al menos
un 80% de identidad con 20 residuos de aminoácidos contiguos
aproximadamente de la SEC ID Nº:58.
La invención se refiere al tratamiento de un
animal con necesidad de tratamiento de un deterioro auditivo, un
trastorno del equilibrio, una enfermedad de las articulaciones, o
con necesidad de estimulación del crecimiento de células
mecanorreceptoras. Un factor de transcripción con una secuencia de
aminoácidos con al menos un 80% de identidad, y más preferiblemente
con al menos un 90% de identidad aproximadamente, con la secuencia
AANARERRRMHGLNHAFDQLR es suministrado a una célula del animal. En
algunas realizaciones, la célula del animal está situada en el oído
interno del animal. Preferiblemente, el factor de transcripción
compite con atonal para unirse a la proteína
"Daughterless" (Jarman y col., 1993) o compite con
Math-1 para unirse a la proteína E47
(Akazawa y col. 1995).
En una realización preferida de la presente
invención, hay composiciones para tratar a un organismo de varias
condiciones médicas, discutidas en la presente, que contienen una
secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos asociada
con atonal en combinación con un vehículo para la
administración, donde dicho organismo contiene un defecto en una
secuencia de ácido nucleico asociada con atonal. Un técnico
experto es consciente de que un organismo adulto, tal como un
adulto humano, no expresa de forma natural atonal a niveles
significativos o detectables, sino que expresa atonal en una
etapa embrionaria del desarrollo (ver los Ejemplos). Por tanto, en
una realización preferida, las composiciones para tratar a un
organismo según se discute en la presente, incluyen composiciones
para tratar a organismos que no contienen una mutación en una
secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos de atonal pero
en los cuales ya no se expresa atonal de forma natural a
niveles significativos o detectables.
En otra realización de la presente invención,
hay una composición que contiene una secuencia de aminoácidos o una
secuencia de ácido nucleico asociada con atonal en
combinación con un vehículo para la administración, donde dicho
vehículo suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una
secuencia de ácido nucleico o de una secuencia de aminoácidos
asociada con atonal a una célula. En realizaciones
específicas, dicho vehículo es el dominio de unión al receptor de
una toxina bacteriana o cualquier molécula de fusión, o es un
dominio de transducción de una proteína. En una realización
específica, dicho dominio de transducción de una proteína procede
del péptido TAT del VIH.
En otra realización de la presente invención,
hay una composición para tratar a un organismo de la pérdida de
células pilosas, donde dicho organismo contiene un defecto en una
secuencia de ácido nucleico asociada con atonal. En una
realización específica, el defecto es una mutación o una alteración
de dicha secuencia de ácido nucleico asociada con atonal. En
otra realización específica, el defecto afecta a una secuencia
reguladora de dicha secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal. En una realización adicional de la presente
invención, hay una composición para tratar a un organismo de la
pérdida de células pilosas, donde dicho organismo contiene un
defecto en una secuencia de ácido nucleico que está asociada con la
regulación de una secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal. En una realización adicional de la presente
invención, hay una composición para tratar a un organismo de la
pérdida de células pilosas, donde dicho organismo contiene un
defecto en una secuencia de aminoácidos que está asociada con la
regulación de una secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal.
En otra realización de la presente invención,
hay una composición para tratar a un organismo del deterioro
auditivo, donde dicho organismo contiene un defecto en una secuencia
de ácido nucleico asociada con atonal. En una realización
específica, el defecto es una mutación o una alteración de dicha
secuencia de ácido nucleico asociada con atonal. En otra
realización específica, el defecto afecta a una secuencia reguladora
de dicha secuencia de ácido nucleico asociada con atonal. En
una realización adicional de la presente invención, hay una
composición para tratar a un organismo del deterioro auditivo, donde
dicho organismo contiene un defecto en una secuencia de ácido
nucleico que está asociada con la regulación de una secuencia de
ácido nucleico asociada con atonal. En una realización
adicional de la presente invención, hay una composición para tratar
a un organismo del deterioro auditivo, donde dicho organismo
contiene un defecto en una secuencia de aminoácidos que está
asociada con la regulación de una secuencia de ácido nucleico
asociada con atonal.
En otra realización de la presente invención,
hay una composición para tratar a un organismo de un trastorno del
equilibrio, donde dicho organismo contiene un defecto en una
secuencia de ácido nucleico asociada con atonal. En una
realización específica, el defecto es una mutación o una alteración
de dicha secuencia de ácido nucleico asociada con atonal. En
otra realización específica, el defecto afecta a una secuencia
reguladora de dicha secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal. En una realización adicional de la presente
invención, hay una composición para tratar a un organismo de un
trastorno del equilibrio, donde dicho organismo contiene un defecto
en una secuencia de ácido nucleico que está asociada con la
regulación de una secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal. En una realización adicional de la presente
invención, hay una composición para tratar a un organismo de un
trastorno del equilibrio, donde dicho organismo contiene un defecto
en una secuencia de aminoácidos que está asociada con la regulación
de una secuencia de ácido nucleico asociada con atonal.
En otra realización de la presente invención,
hay una composición para tratar a un organismo de osteoartritis,
donde dicho organismo contiene un defecto en una secuencia de ácido
nucleico asociada con atonal. En una realización específica,
el defecto es una mutación o una alteración de dicha secuencia de
ácido nucleico asociada con atonal. En otra realización
específica, el defecto afecta a una secuencia reguladora de dicha
secuencia de ácido nucleico asociada con atonal. En una
realización adicional de la presente invención, hay una composición
para tratar a un organismo de osteoartritis, donde dicho organismo
contiene un defecto en una secuencia de ácido nucleico que está
asociada con la regulación de una secuencia de ácido nucleico
asociada con atonal. En una realización adicional de la
presente invención, hay una composición para tratar a un organismo
de osteoartritis, donde dicho organismo contiene un defecto en una
secuencia de aminoácidos que está asociada con la regulación de una
secuencia de ácido nucleico asociada con atonal.
En otra realización de la presente invención,
hay una composición para tratar a un organismo de una enfermedad de
las articulaciones, donde dicho organismo contiene un defecto en una
secuencia de ácido nucleico asociada con atonal. En una
realización específica, el defecto es una mutación o una alteración
de dicha secuencia de ácido nucleico asociada con atonal. En
otra realización específica, el defecto afecta a una secuencia
reguladora de dicha secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal. En una realización adicional de la presente
invención, hay una composición para tratar a un organismo de una
enfermedad de las articulaciones, donde dicho organismo contiene un
defecto en una secuencia de ácido nucleico que está asociada con la
regulación de una secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal. En una realización adicional de la presente
invención, hay una composición para tratar a un organismo de una
enfermedad de las articulaciones, donde dicho organismo contiene un
defecto en una secuencia de aminoácidos que está asociada con la
regulación de una secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal.
Una persona con experiencia en la técnica estará
bien equipada para construir un vector mediante técnicas
recombinantes estándar, que están descritas en Sambrook y col., 1989
y Ausubel y col., 1994, incorporadas ambas a la presente por
referencia.
El término "vector de expresión" se refiere
a un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que
codifica al menos parte de un producto génico capaz de ser
transcrito. En algunos casos, las moléculas de ARN son
posteriormente traducidas para dar una proteína, un polipéptido o
un péptido. En otros casos, estas secuencias no son traducidas, por
ejemplo en la producción de moléculas antisentido o ribozimas. Los
vectores de expresión pueden contener una variedad de "secuencias
control", las cuales se refieren a secuencias de ácido nucleico
necesarias para la transcripción y posiblemente la traducción de
una secuencia codificadora unida operativamente en un organismo
huésped particular. Además de las secuencias control que gobiernan
la transcripción y la traducción, los vectores y los vectores de
expresión pueden contener secuencias de ácido nucleico que tienen
también otras funciones y que están descritas infra.
Un "promotor" es una secuencia control que
es una región de una secuencia de ácido nucleico en la cual están
controlados el inicio y la velocidad de la transcripción. Puede
contener elementos genéticos a los cuales pueden unirse proteínas y
moléculas reguladoras tales como la ARN polimerasa y otros factores
de transcripción. Un promotor puede ser o no utilizado junto con un
"intensificador", que se refiere a una secuencia reguladora
que actúa en cis implicada en la activación transcripcional
de una secuencia de ácido nucleico.
Naturalmente, será importante emplear un
promotor y/o un intensificador que dirija eficazmente la expresión
del segmento de ADN en el tipo celular, en el orgánulo y en el
organismo seleccionado para la expresión. Aquellas personas con
experiencia en la técnica de la biología molecular conocen
generalmente la utilización de promotores, intensificadores y de
combinaciones de tipos celulares para la expresión de proteínas; por
ejemplo, ver Sambrook y col. (1989), que se incorpora a la presente
por referencia. Los promotores empleados pueden ser constitutivos,
específicos de un tejido, inducibles y/o útiles bajo las condiciones
apropiadas para dirigir un nivel de expresión elevado del segmento
de ADN introducido, tal como es ventajoso en la producción a gran
escala de proteínas y/o péptidos recombinantes. El promotor puede
ser heterólogo o endógeno.
La identidad de los promotores o elementos
específicos de un tejido, así como los ensayos para caracterizar su
actividad, son bien conocidos por las personas expertas en la
técnica. Ejemplos de tales regiones incluyen el gen LIMK2 humano
(Nomoto y col., 1999), el gen del receptor 2 de somatostatina (Kraus
y col., 1998), el gen de unión al ácido retinoico del epidídimo
murino (Lareyre y col., 1999), CD4 humano
(Zhao-Emonet y col., 1998), colágeno alfa 2 (XI) de
ratón (Tsumaki y col., 1998), gen del receptor de dopamina D1A (Lee
y col., 1997), factor de crecimiento similar a insulina II (Wu y
col., 1997), molécula de adhesión celular
plaquetaria-endotelial 1 humana (Almendro y col.,
1996).
Puede requerirse también una señal de inicio
específica para la traducción eficaz de secuencias codificadoras.
Estas señales incluyen el codon de inicio ATG o secuencias
adyacentes. Puede necesitarse la provisión de señales exógenas para
el control de la traducción, incluyendo el codon de inicio ATG. Una
persona con experiencia habitual en la técnica será capaz
fácilmente de determinar esto y de proporcionar las señales
necesarias. Es bien conocido que el codon de inicio debe estar
"en marco" con el marco de lectura de la secuencia codificadora
deseada para asegurar la traducción del inserto completo. Las
señales exógenas para el control de la traducción y los codones de
inicio pueden ser naturales o sintéticos. La eficacia de la
expresión puede ser incrementada mediante la inclusión de elementos
intensificadores de la transcripción apropiados.
En ciertas realizaciones de la invención, se
utilizan elementos como los sitios internos de entrada de ribosomas
(IRES) para crear mensajes multigénicos o policistrónicos. Los
elementos IRES pueden estar ligados a marcos de lectura abiertos
heterólogos. Múltiples marcos de lectura abiertos pueden ser
transcritos juntos, cada uno de ellos separado por un IRES, creando
mensajes policistrónicos. En virtud del elemento IRES, cada marco
de lectura abierto es accesible a los ribosomas para una traducción
eficaz. Múltiples genes pueden ser expresados eficazmente
utilizando un único promotor/intensificador para transcribir un
único mensaje (ver las Patentes de EE.UU. 5.925.565 y 5.935.819,
incorporadas a la presente por referencia.
Los vectores pueden incluir un sitio de clonaje
múltiple (MCS), que es una región de ácido nucleico que contiene
múltiples sitios de enzimas de restricción, cualquiera de los cuales
puede ser utilizado junto con la tecnología recombinante estándar
para digerir el vector. (Ver Carbonelli y col., 1999, Levenson y
col., 1998 y Cocea, 1997, incorporadas a la presente por
referencia).
La mayoría de las moléculas de ARN eucariótico
transcritas experimentarán el ayuste del ARN para eliminar los
intrones de los transcritos primarios. Los vectores que contienen
secuencias genómicas eucarióticas pueden requerir sitios donantes
y/o aceptores de ayuste para asegurar el procesamiento apropiado del
transcrito para la expresión de la proteína. (Ver Chandler y col.,
1997, incorporada a la presente por referencia).
En la expresión, se incluirá típicamente una
señal de poliadenilación con el fin de efectuar una poliadenilación
apropiada del transcrito. Realizaciones específicas incluyen la
señal de poliadenilación de SV40 y/o la señal de poliadenilación de
la hormona de crecimiento bovina, que son útiles y/o se sabe que
funcionan bien en varias células diana.
Con el fin de propagar un vector en una célula
huésped, el mismo puede contener uno o más lugares origen de la
replicación (a menudo denominados "ori"), que son secuencias de
ácido nucleico específicas en las cuales se inicia la
replicación.
En ciertas realizaciones de la invención, las
células contienen una construcción de ácido nucleico de la presente
invención; una célula puede ser identificada in vitro o in
vivo mediante la inclusión en el vector de expresión de un
marcador. Tales marcadores conferirán a la célula un cambio
identificable, permitiendo una fácil identificación de las células
que contengan el vector de expresión. En general, un marcador
seleccionable es uno que confiere una propiedad que permite la
selección. Un marcador seleccionable positivo es aquel cuya
presencia permite su selección, mientras que un marcador
seleccionable negativo es aquel cuya presencia impide su selección.
Un ejemplo de un marcador seleccionable positivo es un marcador de
resistencia a un fármaco.
Normalmente, la inclusión de un marcador para la
selección con un fármaco facilita el clonaje y la identificación de
los transformantes; por ejemplo, los genes que confieren resistencia
a neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e
histidinol son marcadores seleccionables útiles. Además de los
marcadores que confieren un fenotipo que permite la discriminación
de los transformantes sobre la base de la implementación de
condiciones, se contemplan también otros tipos de marcadores
incluyendo los marcadores cribables tales como GFP o GFP
intensificada, cuya base es el análisis colorimétrico.
Alternativamente, pueden utilizarse enzimas cribables tales como la
timidina quinasa (tk) o la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) del
virus del herpes simple. Una persona experta en la técnica sabrá
también cómo emplear marcadores inmunológicos, posiblemente en
conjunción con el análisis mediante FACS. Ejemplos adicionales de
marcadores seleccionables y cribables son bien conocidos por las
personas expertas en la técnica.
Existen numerosos sistemas de expresión que
contienen al menos una parte de, o todas, las composiciones
discutidas anteriormente. Los sistemas basados en procariotas y/o
eucariotas pueden ser empleados para ser utilizados con la presente
invención con el fin de producir secuencias de ácidos nucleicos, o
sus polipéptidos, proteínas y péptidos cognados. Muchos de tales
sistemas están comercialmente y abiertamente disponibles.
El sistema de células de insecto/baculovirus
puede producir un nivel elevado de expresión proteica de un segmento
de ácido nucleico heterólogo, tal como está descrito en las
Patentes de EE.UU. N^{os} 5.871.986, 4.879.236, incorporadas
ambas a la presente por referencia, y que puede ser comprado, por
ejemplo, bajo el nombre de MAXBAC® 2.0 en INVITROGEN® y de
BACPACK^{TM} BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM en CLONTECH®.
Otros ejemplos de sistemas de expresión son bien
conocidos en la técnica.
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Además de su utilización para dirigir la
expresión de proteínas, polipéptidos y/o péptidos asociados con
atonal, las secuencias de ácido nucleico descritas en la
presente tienen otras muchas utilizaciones. Por ejemplo, son útiles
como sondas o cebadores o en cualquiera de los métodos para
realizaciones que implican hibridación de ácidos nucleicos,
amplificación de secuencias de ácidos nucleicos, detección de ácidos
nucleicos y otros ensayos. Un técnico experto es consciente de las
patentes siguientes en relación con los detalles de estos
métodos:
- Patente de EE.UU. Nº 5.840.873;
- Patente de EE.UU. Nº 5.843.640; Patente de EE.UU. Nº 5.843.650; Patente de EE.UU. Nº 5.843.651;
- Patente de EE.UU. Nº 5.843.633; Patente de EE.UU. Nº 5.846.708; Patente de EE.UU. Nº 5.846.709;
- Patente de EE.UU. Nº 5.846.717; Patente de EE.UU. Nº 5.846.726; Patente de EE.UU. Nº 5.846.729;
- Patente de EE.UU. Nº 5.846.783; Patente de EE.UU. Nº 5.849.481; Patente de EE.UU. Nº 5.849.483;
- Patente de EE.UU. Nº 5.849.486; Patente de EE.UU. Nº 5.849.487; Patente de EE.UU. Nº 5.849.497;
- Patente de EE.UU. Nº 5.849.546; Patente de EE.UU. Nº 5.849.547; Patente de EE.UU. Nº 5.851.770;
- Patente de EE.UU. Nº 5.851.772; Patente de EE.UU. Nº 5.853.990; Patente de EE.UU. Nº 5.853.993;
- Patente de EE.UU. Nº 5.853.992; Patente de EE.UU. Nº 5.856.092; Patente de EE.UU. Nº 5.858.652;
- Patente de EE.UU. Nº 5.861.244; Patente de EE.UU. Nº 5.863.732; Patente de EE.UU. Nº 5.863.753;
- Patente de EE.UU. Nº 5.866.331; Patente de EE.UU. Nº 5.866.336; Patente de EE.UU. Nº 5.866.337;
- Patente de EE.UU. Nº 5.900.481; Patente de EE.UU. Nº 5.905.024; Patente de EE.UU. Nº 5.910.407;
- Patente de EE.UU. Nº 5.912.124; Patente de EE.UU. Nº 5.912.145; Patente de EE.UU. Nº 5.912.148;
- Patente de EE.UU. Nº 5.916.776; Patente de EE.UU. Nº 5.916.779; Patente de EE.UU. Nº 5.919.626;
- Patente de EE.UU. Nº 5.919.630; Patente de EE.UU. Nº 5.922.574; Patente de EE.UU. Nº 5.925.517;
- Patente de EE.UU. Nº 5.925.525; Patente de EE.UU. Nº 5.928.862; Patente de EE.UU. Nº 5.928.869;
- Patente de EE.UU. Nº 5.928.870; Patente de EE.UU. Nº 5.928.905; Patente de EE.UU. Nº 5.928.906;
- Patente de EE.UU. Nº 5.929.227; Patente de EE.UU. Nº 5.932.413; Patente de EE.UU. Nº 5.932.451;
- Patente de EE.UU. Nº 5.935.791; Patente de EE.UU. Nº 5.935.825; Patente de EE.UU. Nº 5.939.291;
- Patente de EE.UU. Nº 5.942.391; Solicitud Europea Nº 320 308; Solicitud Europea Nº 329 822; Solicitud del R.U. Nº 2 202 328; Solicitud de PCT Nº PCT/US87/00880; Solicitud de PCT Nº PCT/US89/01025; Solicitud de PCT WO 88/10315; Solicitud de PCT WO 89/06700; y Solicitud de PCT WO 90/07641.
Todos los materiales y/o reactivos esenciales
requeridos para detectar en una muestra una secuencia seleccionada
de la SEC ID Nº:1 a la SEC ID Nº:66, pueden estar reunidos en un
kit. El mismo contendrá generalmente una sonda o cebadores
diseñados para hibridar específicamente con ácidos nucleicos
individuales de interés en la práctica de la presente invención,
tales como las secuencias de ácido nucleico de la SEC ID Nº:1 a la
SEC ID Nº:66. Pueden estar también incluidos enzimas adecuados para
amplificar ácidos nucleicos, incluyendo varias polimerasas
(transcriptasa inversa, Taq, etc.), desoxinucleótidos y tampones con
el fin de proporcionar la mezcla de reacción necesaria para la
amplificación. Tales kits pueden incluir también enzimas y otros
reactivos adecuados para la detección de ácidos nucleicos o
productos de amplificación específicos. Tales kits contendrán
generalmente, en medios adecuados, recipientes distintos para cada
reactivo o enzima individual así como para cada sonda o para cada
par de cebadores.
El término "ácido nucleico" se referirá en
general a al menos una molécula o una hebra de ADN, ARN o un
derivado o imitación de los mismos, que contiene al menos una
nucleobase tal como, por ejemplo, una base purínica o pirimidínica
existente de forma natural encontrada en el ADN (por ejemplo,
adenina "A", guanina "G", timina "T" y citosina
"C") o en el ARN (por ejemplo, A, G, uracilo "U" y C). El
término "ácido nucleico" incluye los términos
"oligonucleótido" y "polinucleótido". El término
"oligonucleótido" se refiere a al menos una molécula de entre
3 aproximadamente y 100 nucleobases de longitud aproximadamente. El
término "polinucleótido" se refiere a al menos una molécula
mayor de 100 nucleobases de longitud aproximadamente. Estas
definiciones se refieren en general a al menos una molécula
monocatenaria, pero en realizaciones específicas incluirá también
al menos una cadena adicional que sea parcialmente, sustancialmente
o totalmente complementaria a la al menos una molécula
monocatenaria. Por tanto, un ácido nucleico puede incluir al menos
una molécula bicatenaria o al menos una molécula tricatenaria que
contenga una o más cadena(s) complementaria(s) o
"complemento(s)" de una secuencia particular que
contenga una cadena de la molécula. Según se utiliza en la presente,
un ácido nucleico monocatenario puede ser designado por el prefijo
"ss", un ácido nucleico bicatenario por el prefijo "ds" y
un ácido nucleico tricatenario por el prefijo "ts". Nosotros
describimos al menos un ácido nucleico que es complementario a un
ácido nucleico asociado con atonal, por ejemplo al menos un
ácido nucleico o un segmento de un ácido nucleico complementario a
las secuencias de ácidos nucleicos mostradas en las SEC ID Nº:1
hasta la SEC ID Nº:66, de aquellas que son secuencias de ácidos
nucleicos. Ácido(s) nucleico(s) que es(son)
"complementario(s)" o "complemento(s)"
es(son) aquel(los) que es(son)
capaz(ces) de apareamiento de bases de acuerdo con las
reglas estándar de complementariedad de
Watson-Crick, Hoogsteen, o las reglas de
complementariedad de unión inversa de Hoogsteen. Según se utiliza en
la presente, el término "complementario(s)" o
"complemento(s)" se refiere también a ácido(s)
nucleico(s) que es(son) sustancialmente
complementario(s), según puede ser determinado por la misma
comparación de nucleótidos mostrada anteriormente. El término
"sustancialmente complementario" se refiere a un ácido
nucleico que contiene al menos una secuencia de nucleobases
consecutivas, o de nucleobases semiconsecutivas si uno más restos
de nucleobases no están presentes en la molécula, que es capaz de
hibridar con al menos una cadena o un dúplice de ácido nucleico
incluso si no todas las nucleobases forman pares de bases con su
nucleobase correspondiente.
En ciertas realizaciones de la presente, un
"gen" se refiere a un ácido nucleico que es transcrito. Según
se utiliza en la presente, un "segmento génico" es un segmento
de ácido nucleico de un gen. En ciertos aspectos, el gen incluye
secuencias reguladoras implicadas en la transcripción o en la
producción o composición del mensaje. En realizaciones
particulares, el gen comprende secuencias transcritas que codifican
una proteína, un polipéptido o un péptido. En otros aspectos
particulares, el gen comprende un ácido nucleico asociado con
atonal y/o codifica secuencias codificadoras de un
polipéptido o un péptido asociado con atonal. Manteniendo la
terminología descrita en la presente, un "gen aislado" puede
comprender ácido(s) nucleico(s) transcrito(s),
secuencias reguladoras, secuencias codificadoras, etcétera, aislados
sustancialmente de otras secuencias similares, tales como otros
genes, secuencias reguladoras, secuencias codificadoras de
polipéptidos o péptidos, etc., existentes de forma natural. A este
respecto, el término "gen" es utilizado por simplicidad para
hacer referencia a un ácido nucleico que contiene una secuencia de
nucleótidos que es transcrita y al complemento de la misma. En
aspectos particulares, la secuencia de nucleótidos transcrita
comprende al menos una unidad que codifica una proteína, un
polipéptido y/o un péptido funcional. Como comprenderán los expertos
en la técnica, este término de función "gen" incluye
secuencias genómicas, secuencias de ARN o de ADNc o segmentos de
ácido nucleico construidos más pequeños, incluyendo segmentos de
ácido nucleico de una parte no transcrita de un gen, incluyendo,
pero sin limitarse a, las regiones del promotor o del intensificador
no transcritas de un gen. Segmentos de ácido nucleico de un gen
construidos más pequeños pueden expresar, o pueden ser adaptados
para que expresen utilizando la tecnología de manipulación de
ácidos nucleicos, proteínas, polipéptidos, dominios, péptidos,
proteínas de fusión, mutantes y/o similares.
En ciertas realizaciones, la secuencia de ácido
nucleico es un ácido nucleico o un segmento de un ácido nucleico.
Según se utiliza en la presente, el término "segmento de ácido
nucleico", se refiere a fragmentos más pequeños de un ácido
nucleico, tal como por ejemplo no limitante, los que codifican
solamente parte de la secuencia del péptido o polipéptido asociada
con atonal. Por tanto, un "segmento de ácido nucleico"
puede comprender cualquier parte de
la(s) secuencia(s) génica(s) asociada(s) con atonal, desde 2 nucleótidos aproximadamente hasta la longitud completa de la región que codifica el péptido o el polipéptido asociado con atonal. En ciertas realizaciones, el "segmento de ácido nucleico" incluye la secuencia completa del(los) gen(es) asociado(s) con atonal. En realizaciones particulares, el ácido nucleico comprende cualquier parte de la SEC ID Nº:1 a la SEC ID Nº:66, o de 2 nucleótidos aproximadamente hasta la longitud completa de la secuencia descrita en la SEC ID Nº:1 a la SEC ID Nº:66.
la(s) secuencia(s) génica(s) asociada(s) con atonal, desde 2 nucleótidos aproximadamente hasta la longitud completa de la región que codifica el péptido o el polipéptido asociado con atonal. En ciertas realizaciones, el "segmento de ácido nucleico" incluye la secuencia completa del(los) gen(es) asociado(s) con atonal. En realizaciones particulares, el ácido nucleico comprende cualquier parte de la SEC ID Nº:1 a la SEC ID Nº:66, o de 2 nucleótidos aproximadamente hasta la longitud completa de la secuencia descrita en la SEC ID Nº:1 a la SEC ID Nº:66.
En ciertas realizaciones, el segmento de ácido
nucleico puede ser una sonda o un cebador. Según se utiliza en la
presente, una "sonda" es un ácido nucleico utilizado para la
detección de otro ácido nucleico y tiene generalmente al menos 10
nucleótidos de longitud aproximadamente. Según se utiliza en la
presente, un "cebador" es un ácido nucleico utilizado para la
polimerización de otro ácido nucleico y generalmente tiene al menos
10 nucleótidos de longitud aproximadamente. Un ejemplo no limitante
de esto sería la creación de segmentos de ácido nucleico de
diferentes longitudes y de diferente composición de secuencias para
sondas y cebadores basados en las secuencias descritas en la SEC ID
Nº:1 a la SEC ID Nº:66, de aquellas que son secuencias de ácidos
nucleicos.
El(los) ácido(s)
nucleico(s) de la presente invención, independientemente de
la longitud de la propia secuencia, puede(n) ser
combinado(s) con otras secuencias de ácido nucleico,
incluyendo, pero sin limitarse a, promotores, intensificadores,
señales de poliadenilación, sitios para enzimas de restricción,
sitios de clonaje múltiple, segmentos codificadores, etcétera, para
crear una o más construcciones de ácido nucleico. Según se utiliza
en la presente, una "construcción de ácido nucleico", es una
molécula recombinante que contiene al menos dos segmentos de
diferentes secuencias de ácido nucleico. La longitud total puede
variar considerablemente entre las construcciones de ácido
nucleico. Así, puede emplearse un segmento de ácido nucleico de casi
cualquier longitud, estando limitada preferiblemente la longitud
total por la facilidad de preparación o de utilización en el
protocolo de ácidos nucleicos recombinantes deseado.
En ciertas realizaciones, la construcción de
ácido nucleico es un vector recombinante. Según se utiliza en la
presente, un "vector recombinante" es un ácido nucleico que
contiene múltiples segmentos de ácidos nucleicos utilizado como
vehículo para una secuencia de ácido nucleico de interés. En ciertos
aspectos, el vector recombinante es un casete de expresión. Según
se utiliza en la presente, un casete de expresión es un segmento de
ácido nucleico que contiene un gen de interés que puede ser
transferido entre diferentes vectores recombinantes por medios bien
conocidos en la técnica.
Nosotros describimos uno o más vectores
recombinantes que contienen secuencias de ácido nucleico que
codifican una proteína, polipéptido o péptido asociado con
atonal que incluye dentro de su secuencia de aminoácidos una
secuencia de aminoácidos contigua de acuerdo con, o esencialmente
según está mostrado en, la SEC ID Nº:2 a la SEC ID Nº:66, de
aquellas secuencias que son secuencias de aminoácidos,
correspondientes a la secuencia asociada con atonal de
Homo sapiens o Mus musculus. Nosotros describimos
un(os) vector(es) recombinante(s) que
contiene(n) secuencias de ácido nucleico de otras especies
que codifican una proteína, un polipéptido o un péptido asociado
con atonal que incluye dentro de su secuencia de aminoácidos
una secuencia de aminoácidos contiguos de acuerdo con, o
esencialmente según está mostrado en, la SEC ID Nº:2 a la SEC ID
Nº:66, de aquellas secuencias que son secuencias de aminoácidos. En
aspectos particulares, los vectores recombinantes son vectores de
ADN.
Se comprenderá también que las secuencias de
aminoácidos o las secuencias de ácido nucleico pueden incluir
residuos adicionales, tales como aminoácidos N- o
C-terminales adicionales o secuencias 5' o 3'
adicionales, o varias combinaciones de los mismos, y seguir siendo
esencialmente como se describe en una de las secuencias reveladas
en la presente, siempre que la secuencia cumpla los criterios
expuestos anteriormente, incluyendo el mantenimiento de la
actividad biológica de la proteína, el polipéptido o el péptido
cuando concierne a la expresión de una composición proteinácea. La
adición de secuencias terminales aplica particularmente a
secuencias de ácido nucleico que pueden incluir, por ejemplo, varias
secuencias no codificadoras flanqueando las porciones 5' y/o 3' de
la región codificadora o que pueden incluir varias secuencias
internas, por ejemplo intrones, que se sabe que tienen lugar en los
genes.
Los vectores recombinantes y los segmentos de
ácido nucleico aislados pueden por tanto incluir de diversas
maneras estas propias regiones codificadoras, regiones codificadoras
portadoras de alteraciones o modificaciones seleccionadas en la
región codificadora básica, y pueden codificar polipéptidos o
péptidos más grandes que incluyen no obstante tales regiones
codificadoras o pueden codificar proteínas, polipéptidos o péptidos
equivalentes biológicamente funcionales que tengan secuencias de
aminoácidos variantes.
Nosotros describimos proteínas, polipéptidos o
péptidos asociados con atonal equivalentes biológicamente
funcionales o proteínas, polipéptidos o péptidos asociados con
atonal. Tales secuencias pueden producirse como consecuencia
de la redundancia de codones o de la equivalencia funcional que se
sabe tiene lugar de forma natural en las secuencias de ácido
nucleico o de las proteínas, polipéptidos o péptidos así
codificados. Alternativamente, pueden crearse proteínas,
polipéptidos o péptidos funcionalmente equivalentes mediante la
aplicación de la tecnología del ADN recombinante, en los cuales
pueden producirse cambios en la estructura de la proteína, el
polipéptido o el péptido, sobre la base de la consideración de las
propiedades de los aminoácidos que están siendo intercambiados. Los
cambios diseñados por el hombre pueden ser introducidos, por
ejemplo, mediante la aplicación de técnicas de mutagénesis dirigida
a un sitio según se discute más adelante en la presente, por
ejemplo para introducir mejoras o alteraciones de la antigenicidad
de la proteína, el polipéptido o el péptido, o para analizar
mutantes con el fin de examinar la actividad de la proteína, el
polipéptido o el péptido asociado con atonal a nivel
molecular.
Pueden prepararse proteínas, polipéptidos o
péptidos de fusión, por ejemplo, en los que las regiones
codificadoras asociadas con atonal estén alineadas dentro de
la misma unidad de expresión con otras proteínas, polipéptidos o
péptidos que tengan funciones deseadas. Ejemplos no limitantes de
tales funciones deseadas de las secuencias de expresión incluyen
los fines de purificación o inmunodetección para las secuencias de
expresión añadidas, por ejemplo composiciones proteináceas que
pueden ser purificadas mediante cromatografía de afinidad o el
marcaje enzimático de las regiones codificadoras, respectivamente,
EP 266.032, o a través de productos intermedios
H-fosfonatos de desoxinucleósidos según está
descrito por Froehler y col., Nucl. Acids Res., 14:
5399-5407, 1986.
Según se utiliza en la presente, un
"organismo" puede ser un procariota, un eucariota, un virus,
etcétera. Según se utiliza en la presente, el término
"secuencia" incluye los términos "ácido nucleico" y
"proteinácea" o "composición proteinácea". Según se
utiliza en la presente, el término "composición proteinácea"
incluye los términos "proteína", "polipéptido" y
"péptido". Según se utiliza en la presente, "secuencia
artificial" se refiere a una secuencia de un ácido nucleico no
derivada de la secuencia que existe de forma natural en un locus
genético, así como a las secuencias de proteínas, polipéptidos o
péptidos codificadas por tal ácido nucleico. Una "secuencia
sintética", se refiere a un ácido nucleico o a una composición
proteinácea producidos mediante síntesis química in vitro,
más que a la producción enzimática in vitro (esto es, una
secuencia "producida enzimáticamente") o mediante producción
biológica in vivo (esto es, una secuencia "producida
biológicamente").
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Las secuencias de ácido nucleico y las
secuencias de aminoácidos (ingredientes activos) de esta invención
pueden ser formuladas y administradas para tratar una variedad de
estados de enfermedad, mediante cualquier medio que produzca el
contacto del ingrediente activo con el lugar de acción del agente en
el organismo de un animal. Las mismas pueden ser administradas
mediante cualquier medio convencional disponible para ser utilizado
junto con productos farmacéuticos, ya sea como ingredientes
terapéuticos activos individuales o en combinación con ingredientes
terapéuticos activos. Pueden ser administradas solas o con un
vehículo farmacéuticamente aceptable seleccionado sobre la base de
la vía de administración elegida y de la práctica farmacéutica
estándar.
La dosificación administrada será una cantidad
terapéuticamente eficaz del ingrediente activo y, por supuesto,
variará dependiendo de factores conocidos tales como las
características farmacodinámicas del ingrediente activo particular
y de su modo y vía de administración; la edad, el sexo, la salud y
el peso del receptor; la naturaleza y el grado de los síntomas; el
tipo de tratamiento simultáneo, la frecuencia del tratamiento y el
efecto deseado.
El ingrediente activo puede ser administrado
oralmente en formas de dosificación sólidas tales como cápsulas,
tabletas o polvos, o en formas de dosificación líquidas tales como
elixires, jarabes, emulsiones y suspensiones. El ingrediente activo
puede ser también formulado para administración parenteral mediante
inyección, infusión rápida, absorción nasofaríngea o
dermoabsorción. El agente puede ser administrado intramuscularmente,
intravenosamente o como un supositorio. Además, las soluciones
parenterales pueden contener conservantes tales como cloruro de
benzalconio, metil- o propil-parabeno o
clorobutanol. Vehículos farmacéuticos adecuados están descritos en
Remington's Pharmaceuticals Sciences, un texto de referencia
estándar en este campo.
Adicionalmente, pueden emplearse métodos
farmacéuticos estándar para controlar la duración de la acción.
Éstos son bien conocidos en la técnica e incluyen preparaciones de
liberación controlada y pueden incluir macromoléculas apropiadas,
por ejemplo polímeros, poliésteres, poliaminoácidos, polivinilo,
pirrolidona, acetato de etilénvinilo, metil celulosa, carboximetil
celulosa o sulfato de protamina. La concentración de las
macromoléculas así como los métodos de incorporación, pueden ser
ajustados para controlar la liberación. Adicionalmente, el agente
puede ser incorporado a partículas de materiales poliméricos tales
como poliésteres, poliaminoácidos, hidrogeles, poli(ácido láctico)
o copolímeros de acetato de etilénvinilo. Además de ser
incorporados, estos agentes pueden ser utilizados también para
atrapar el compuesto en microcápsulas.
Las formas de dosificación farmacéutica útiles
para la administración de los compuestos de esta invención pueden
ser ilustradas según sigue.
Cápsulas: Las cápsulas son preparadas rellenando
cápsulas estándar de gelatina dura de dos piezas cada una con una
cantidad terapéuticamente eficaz de ingrediente activo en polvo, 175
miligramos de lactosa, 24 miligramos de talco y 6 miligramos de
estearato de magnesio.
Cápsulas de Gelatina Blanda: Se prepara una
mezcla de ingrediente activo en aceite de soja y se inyecta en
gelatina por medio de una bomba de desplazamiento positivo, para
formar cápsulas de gelatina blanda conteniendo una cantidad
terapéuticamente eficaz del ingrediente activo. Las cápsulas son
posteriormente lavadas y secadas.
Tabletas: Las tabletas son preparadas mediante
procedimientos convencionales de tal manera que la unidad de
dosificación sea una cantidad terapéuticamente eficaz del
ingrediente activo, 0,2 miligramos de dióxido de silicio coloidal,
5 miligramos de estearato de magnesio, 275 miligramos de celulosa
microcristalina, 11 miligramos de almidón de maíz y 98,8 miligramos
de lactosa. Pueden aplicarse recubrimientos apropiados con el fin de
incrementar la palatabilidad o de retrasar la absorción.
\newpage
Inyectable: Se prepara una composición
parenteral adecuada para ser administrada mediante inyección,
agitando un 1,5% en peso de los ingredientes activos en un 10% en
volumen de propilén glicol y agua. La solución se hace isotónica
con cloruro de sodio y se esteriliza.
Suspensión: Se prepara una suspensión acuosa
para administración oral de tal manera que cada 5 mililitros
contengan una cantidad terapéuticamente eficaz del ingrediente
activo finamente dividido, 200 miligramos de carboximetil celulosa
de sodio, 5 miligramos de benzoato de sodio, 1,0 gramo de solución
de sorbitol U.S.P. y 0,025 miligramos de vainillina.
Por consiguiente, la composición farmacéutica de
la presente invención puede ser administrada a través de varias
vías y a lugares diferentes de un organismo animal para conseguir un
efecto particular (ver, por ejemplo, Rosenfeld y col. (1991),
supra; Rosenfeld y col. Clin. Res., 39(2), 311A
(1991a); Jaffe y col., supra; Berkiner, supra). Una
persona experta en la técnica reconocerá que aunque puede utilizarse
más de una vía para la administración, una vía particular puede
proporcionar una reacción más inmediata y más eficaz que otra vía.
La administración local o sistémica puede ser llevada a cabo
mediante administración que comprende la aplicación o la
instilación de la formulación en las cavidades corporales, la
inhalación o insuflación de un aerosol, o mediante introducción
parenteral que comprende la administración intramuscular,
intravenosa, peritoneal, subcutánea, intradérmica, así como
tópica.
tópica.
La composición de la presente invención puede
ser proporcionada en forma de dosificación unidad, donde cada
unidad de dosificación, por ejemplo una cucharada, una tableta, una
solución o un supositorio, contiene una cantidad predeterminada de
la composición, sola o en combinación adecuada con otros agentes
activos. El término "forma de dosificación unidad", según se
utiliza en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas
adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y animales,
conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de las
composiciones de la presente invención, solas o en combinación con
otros agentes activos, calculada en una cantidad suficiente para
producir el efecto deseado, en asociación con un diluyente,
transportador o vehículo farmacéuticamente aceptable, cuando sea
apropiado. Las especificaciones para las formas de dosificación
unidad de la presente invención dependen del efecto particular que
vaya a ser conseguido y de la farmacodinámica particular asociada
con la composición farmacéutica en el huésped particular.
Estos métodos descritos en la presente no
incluyen de ninguna manera todos ellos, y métodos adicionales
adecuados para una aplicación específica serán obvios para el
técnico con experiencia habitual. Además, la cantidad eficaz de las
composiciones puede ser calculada adicionalmente por su analogía con
compuestos que se sabe que ejercen el efecto deseado.
Los ejemplos siguientes se ofrecen a manera de
ejemplo, y no tienen la intención de limitar de ninguna manera el
ámbito de la invención.
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Ejemplo
1
Se ha encontrado que los presentes métodos para
el tratamiento del deterioro auditivo no han solucionado el
problema directamente, esto es, la regeneración de las poblaciones
de células pilosas auditivas. La presente invención, en una
realización preferida, está dirigida a un miembro de la familia
bHLH, el gen Math1 u otra secuencia de ácido nucleico
asociada con atonal, y su requerimiento para la generación de
neuronas granulares cerebelosas y de células pilosas del oído
interno. Este descubrimiento tiene amplias ramificaciones no sólo
para comprender el neurodesarrollo, sino también para terapias
utilizables en una variedad de enfermedades muy extendidas según se
describe a continuación.
El homólogo 1 de atonal de ratón
(Math1) se expresa en los precursores de las neuronas
granulares cerebelosas; en unas cuantas células de la porción
dorsal de la médula espinal en desarrollo; en el oído interno; en
las células de Merkel (receptores del tacto de la piel) y en las
articulaciones. La sobreexpresión de Math1 en una célula por
lo demás diferenciada, puede inducir la formación de, o la
diferenciación en, una célula similar a las células pilosas del
oído interno progenitora o madura.
La expresión de Math1 en los precursores
de las neuronas granulares cerebelosas sugiere que el mismo es
requerido para la función del cerebelo y del cerebro. El cerebelo es
esencial para la coordinación motora fina y la postura, y su
disfunción altera el equilibrio, el lenguaje y el movimiento de los
miembros. El desarrollo del cerebelo comienza típicamente en el día
embrionario 9,5 (E9,5) aproximadamente, cuando un pequeño grupo de
células del cerebro posterior prolifera y migra en dirección rostral
para formar la capa granular externa, el tronco cerebral y las
neuronas pontinas. Esta población de progenitores neuronales, que
continúa expresando Math1, prolifera adicionalmente y migra
internamente para formar las neuronas granulares cerebelosas que
son la población neuronal predominante del cerebelo y del cerebro.
Los ratones que no expresan Math1 carecen completamente de
neuronas granulares cerebelosas y de sus precursores. Math1
es por tanto esencial para la generación de estas neuronas y
proporciona a la muy escasa población de neuronas en E9,5 la
capacidad de proliferar hasta billones y diferenciarse
posteriormente (Ben-Arie y col., 1997). Estas
funciones tienen ambas una gran importancia médica. El conocimiento
de la proliferación normal proporciona la percepción necesaria para
conocer la proliferación anormal, según se observa en el cáncer. Los
tumores cerebelosos de tipo neuroectodérmico primitivos (por
ejemplo, meduloblastoma) constituyen la enfermedad maligna sólida
más común en niños. Las células que expresan Math1
contribuyen significativamente a estos tumores.
Math1 se expresa en el cartílago
articular no osificado (ver la Figura 6) que degenera típicamente en
osteoartritis. Esta es la forma más extendida de la artritis, con
un 90% de personas por encima de los 40 años mostrando algún grado
de osteoartritis en una o más articulaciones. Dadas las propiedades
de Math1 en la generación y proliferación celular, su
expresión artificial en las articulaciones afectadas puede permitir
la regeneración de las células que constituyen el cartílago no
osificado.
En la presente se describen composiciones y
métodos para la utilización del gen Math1, de su homólogo
humano (Hath1) o de cualquiera de sus homólogos, ortólogos,
proteínas de fusión quiméricas o derivados de cualquier secuencia
de ácido nucleico asociada con atonal adecuada o de cualquier
otra secuencia de ácido nucleico asociada con atonal. Con el
fin de conocer las funciones de Math1 en mamíferos, el gen
Math1 fue eliminado de un ratón utilizando una estrategia que
permitía la detección de las células que expresaban Math1.
Se describe la creación y la caracterización de ratones que pueden
ser utilizados para someter a selección compuestos que podrían ser
utilizados para disminuir o aumentar la expresión de Math1
en las células pilosas del oído interno y en otras células en las
que está asociada la expresión de Math1.
Se describen también métodos para el estudio, la
caracterización y el tratamiento de la proliferación neoplásica de
origen neuroectodérmico, ya que la expresión de Math1 es
esencial para la generación y la proliferación de las neuronas
granulares cerebelosas. Además, se ha descubierto también que
Math1 desempeña una función en el desarrollo de las células
que producen el cartílago articular no osificado, que están
asociadas con el desarrollo de la osteoartritis. Estos
descubrimientos han dado lugar a un método para la selección de
compuestos que pueden ser de ayuda para el tratamiento de la
pérdida de células pilosas del oído interno y de otras enfermedades
que tienen lugar debido a la pérdida funcional de Math1,
tales como la osteoartritis.
Más particularmente, la presente invención
proporciona un animal heterozigoto para la inactivación del gen
Math1 o de otra secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal, en el cual al menos un alelo de Math1 o de
otra secuencia de ácido nucleico asociada con atonal ha sido
sustituido por la inserción de una secuencia de ácido nucleico
heteróloga, donde la inactivación de Math1 o de la secuencia
asociada con atonal impide la expresión del alelo de
Math1 o del alelo asociado con atonal. El ratón puede
ser utilizado posteriormente para generar ratones homozigotos para
la inactivación de Math1 o de otro gen con una secuencia
asociada con atonal y puede incluir además una segunda
secuencia de ácido nucleico heteróloga, donde al menos uno de los
genes heterólogos es utilizado para detectar la expresión dirigida
por los elementos reguladores de Math1 o de la secuencia
asociada con atonal. La inactivación completa o parcial de
Math1 funcional o de la secuencia asociada con atonal
puede ser detectada en, por ejemplo, células propriorreceptoras, en
neuronas granulares y en sus células progenitoras o en células de
cartílago no osificado.
Ejemplos de las secuencias de ácido nucleico
heterólogas son secuencias informadoras tales como
\beta-galactosidasa, proteína fluorescente verde
(GFP), proteína fluorescente azul (BFP), neomicina, kanamicina,
luciferasa, \beta-glucuronidasa y cloranfenicol
transferasa (CAT). Math1 o la secuencia asociada con
atonal pueden ser también sustituidos bajo el control de
secuencias promotoras regulables o pueden ser secuencias promotoras
específicas de tejido. Dichas secuencias promotoras pueden ser
parciales o pueden contener el promotor completo.
La presente invención puede ser utilizada
también como, o como parte de, un método para seleccionar un
compuesto, en el que la administración del compuesto afecta a una
condición del desarrollo y/o patológica, donde dicha condición es
el resultado de la reducción de la expresión de Math1 o de la
secuencia asociada con atonal, incluyendo el método la
administración del compuesto a un ratón transgénico que es
homozigoto para la inactivación de Math1 o de la secuencia
asociada con atonal, donde al menos un alelo de Math1
o asociado con atonal es inactivado por la inserción de una
secuencia de ácido nucleico heteróloga, donde la inactivación de
Math1 o de la secuencia asociada con atonal impide la
expresión del gen Math1 o del gen asociado con
atonal, y la monitorización del ratón para detectar un cambio
de la condición del desarrollo y/o patológica. Los tipos de
condiciones patológicas que pueden ser examinados incluyen, pero no
se limitan a, pérdida de células pilosas, pérdida de neuronas
granulares cerebelosas o de sus precursores, falta de proliferación
o de migración de las células granulares, falta de células de la
capa granular externa cerebelosa, deterioro auditivo, trastorno del
equilibrio, enfermedad de las articulaciones, osteoartritis,
proliferación anormal de las células neuroectodérmicas neoplásicas
y formación de meduloblastoma. Según se utiliza en la presente, la
selección proporciona un compuesto que, mediante el incremento
regulado de la expresión de una secuencia de ácido nucleico
heteróloga, es un efector positivo y un compuesto que, mediante la
disminución regulada de la expresión de una secuencia de ácido
nucleico heteróloga, es un efector negativo.
Otra realización más de la presente invención es
un método para estimular el crecimiento de las células
mecanorreceptoras, que incluye la puesta en contacto de una célula
con una proteína o un gen Math1 o con una proteína o un gen
asociados con atonal en una cantidad eficaz para hacer que
dicha célula exprese un marcador de las células pilosas del oído
interno. Un ejemplo de marcador de las células pilosas para ser
utilizado con el método es calretinina. La célula puede ser puesta
en contacto con un vector que exprese Math1 o una secuencia
de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos asociada con
atonal. Vectores recombinantes que expresen Math1 o
una secuencia de ácido nucleico asociada con atonal pueden
incluir un vector adenovírico, un vector retrovírico, un vector
adenoasociado, un plásmido, un liposoma, una proteína, un lípido, un
carbohidrato y una combinación de dichos vectores. Math1 o
la secuencia asociada con atonal puede estar bajo el control
de, por ejemplo, una secuencia promotora de IE de citomegalovirus o
de la secuencia promotora de IE de citomegalovirus y de una
secuencia señal de poliadenilación temprana de SV40, o de cualquier
otra combinación de secuencias promotoras, de secuencias
intensificadoras y de poliadenilación apropiadas.
Además, se describe un método para el
tratamiento del deterioro auditivo o de un trastorno del equilibrio
que incluye la administración a un animal, incluyendo humanos, que
tenga pérdida de audición o un trastorno del equilibrio, de una
cantidad terapéuticamente eficaz de una secuencia de aminoácidos o
de una secuencia de ácido nucleico de Math1 o asociada con
atonal. El deterioro auditivo o del equilibrio puede ser
completo o parcial y puede afectar a un oído o a ambos oídos. En una
realización preferida, existe una pérdida sustancial de audición.
Los trastornos auditivos y del equilibrio pueden ser afectados
separadamente o simultáneamente en el animal que va a ser tratado,
y dicho trastorno auditivo y/o del equilibrio puede ser el resultado
de un trauma, de una enfermedad, una condición relacionada con la
edad o puede ser debido a la pérdida de células pilosas por
cualquier razón.
La presente invención está dirigida también a
una composición que incluye una proteína o un gen Math1
asociados con atonal en combinación con un vehículo para la
administración, donde el vehículo para la administración hace que
una cantidad terapéuticamente eficaz de Math1 o de la
secuencia asociada con atonal sea administrada a una célula.
El vehículo para la administración puede ser definido adicionalmente
como un vector que contiene Math1 o una secuencia de
aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal en una célula animal. El vector puede ser un vector
retrovírico o un vector adenovírico o cualquier otro vector basado
en ácidos nucleicos que puede ser incluso dispersado en una
formulación farmacológicamente aceptable y utilizado para la
administración intralesional. La composición puede ser incluso una
proteína parcialmente o totalmente purificada que es suministrada
utilizando un liposoma, una proteína, un lípido o un carbohidrato
que estimule la entrada de la proteína de Math1 o asociada
con atonal en la célula. Ejemplos de proteínas que pueden
ser utilizadas como vehículos para la administración incluyen los
dominios de unión al receptor (las regiones no catalíticas) de
toxinas bacterianas tales como, por ejemplo, la Exotoxina A, la
toxina del cólera y la toxina del Ricino, o dominios de transducción
de proteínas tales como el de la proteína TAT del VIH (Schwarze y
col., 1999) (ver el Ejemplo 22). La composición para administrar
Math1 puede ser una proteína de fusión.
Un técnico experto es consciente de que los
métodos para tratar animales como los descritos en la invención
pueden ser in utero o después del nacimiento. El tratamiento
puede ser administrado a un embrión y puede tener lugar ex
vivo o in vivo.
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Ejemplo
2
Un modelo animal eficaz de deficiencia en un gen
que controle la organogénesis tendrá muy a menudo ambos alelos
inactivados de manera estable, de tal manera que, mediante la
embriogénesis, uno o más tejidos no puedan revertir a un alelo de
tipo salvaje funcional. Un método para generar animales con un
genotipo alterado es la vectorización de genes (Mansour y col.,
1993), en los cuales la recombinación homóloga de la secuencia de
ADN recién introducida (esto es, la secuencia o construcción
vectorizante) y una secuencia de ADN diana específica que reside en
el cromosoma, tiene como resultado la inserción de una porción de la
secuencia de ADN recién introducida en la secuencia de ADN
cromosómica diana. Este método es capaz de generar animales de
cualquier genotipo deseado, y es especialmente útil para la
alteración de genes (esto es, para "knock out") en una
secuencia génica cromosómica específica mediante la inserción de un
marcador seleccionable en el gen o la sustitución completa del gen
por otra secuencia de
nucleótidos.
nucleótidos.
Para suprimir ("knock out") una
secuencia genómica, debe estar disponible un fragmento clonado y
definidos los límites intrón-exón dentro del
fragmento (Mansour y col., 1993). Típicamente, la construcción
vectorizante contiene un marcador seleccionable tal como Neo
(resistencia a neomicina, ver Mansour y col., 1993) flanqueado por
secuencias homólogas al ADN cromosómico diana, y después de una de
estas secuencias flanqueantes el gen de la timidina quinasa del
virus del herpes simple (TK-VHS, ver en general,
McKnight y col., 1980). La construcción vectorizante es introducida
mediante, por ejemplo, electroporación, en células madre
embrionarias (ES) en las cuales la recombinación homóloga tiene
como resultado la inserción del marcador de resistencia a neomicina
(Neo), pero no del gen TK-VHS, en la secuencia de
ADN cromosómico diana. Las células ES alteradas son resistentes a
neomicina y TK-VHS^{-} y por tanto son capaces de
crecer en presencia de los antibióticos G418 y ganciclovir. Las
inserciones aleatorias contienen el gen TK-VHS y son
por tanto sensibles a ganciclovir (Mansour y col.). Los clones de
ES positivos son posteriormente microinyectados en blastocistos para
generar ratones quiméricos para la línea germinal, que
posteriormente son criados para obtener una progenie que es
homozigota para el gen suprimido ("knock out"). Tales
métodos generales para producir animales "knock out" han
sido demostrados utilizando ratones. Genes de otros animales tales
como ratas, cobayos, jerbos, hámsteres y conejos, pueden ser
también utilizados siempre que estén disponibles datos suficientes
de las secuencias de ADN para producir una construcción
vectorizante apropiada para suprimir ("knock out") el
gen de interés.
Aunque ato y Math1 comparten un
alto grado de conservación de secuencias, existía una discrepancia
aparente entre sus patrones de expresión y las consecuencias de la
pérdida de su función. Mientras que ato se expresa
principalmente en el SNP de la mosca y su ausencia produce la
pérdida de casi todos los CHOs (Jarman y col., 1993), Math1
se expresa en el SNC y su pérdida da lugar a la ausencia de neuronas
granulares cerebelosas, la mayor población neuronal del SNC
(Ben-Arie y col., 1997). Con el fin de comprender
mejor las relaciones funcionales entre ato y Math1,
la presente invención describe la generación de un segundo alelo
nulo para Math1 en ratones
(Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal})
mediante la sustitución de la región codificadora de Math1
por el gen de la \beta-galactosidasa (lacZ)
y la realización de la búsqueda posterior de la expresión de
ato en el SNC de la mosca de la fruta. Los ejemplos describen
una relación funcional entre ato y Math1: ato
se expresa en el cerebro de la mosca y la expresión de lacZ
bajo el control de los elementos reguladores de Math1
(Math1/lacZ) no sólo replicaba el patrón de expresión
conocido en el SNC (esto es, en el tubo neural, la médula espinal y
el cerebelo), sino que aparecía en muchas otras células del SNP
murino. La sobreexpresión de Math1 en Drosophila
producía la formación de CHOs ectópicos, proporcionando pruebas
adicionales de que ato y Math1 estaban conservados
funcionalmente.
Las conexiones y la consistencia de la relación
entre atonal de Drosophila y Math1 de ratón,
sugiere que su utilización como sistemas modelo en la técnica está
justificada. Se ha clonado y analizado una familia de homólogos en
el ratón incluyendo MATH1, 2, 3, 4A, 4B, 4C y 5 (Azakawa y col.,
1995; Bartholomä y Nave, 1994; Ben-Arie y col.,
1997; Ben-Arie y col., 1996; Fode y col., 1998; Ma y
col., 1998; McCormick y col., 1996; Shimizu y col., 1995;
Takebayashi y col., 1997). Un homólogo de atonal de
Xenopus, Xath1, ha sido expresado ectópicamente en
Drosophila y se ha demostrado que se comporta de manera
similar a ato (Kim y col., 1997). Además, la capacidad de
Math1 para inducir la formación de CHOs ectópicos y para
restaurar CHOs en los embriones mutantes para ato (ver el
Ejemplo 13), es una prueba potente de que Math1, y
particularmente su dominio básico, codifica una información de la
identidad del linaje que no es probable que esté codificada por
ato, y que las células de mamífero que expresan Math1
son funcionalmente similares y quizá estén relacionadas desde el
punto de vista evolutivo con las células de Drosophila que
requieren ato. Por tanto, las similitudes entre
atonal de Drosophila, Xath1 de Xenopus y
Math1 de ratón, indican que estos animales son sistemas de
modelos animales comparables. Además, la extendida utilización de
los ratones en particular como sistema modelo para humanos, sugiere
también que, de manera similar, permitiría la utilización de la
invención en humanos.
Con los avances de la genética molecular
actualmente estándar en la técnica, las secuencias de humanos y de
otras especies pueden ser utilizadas indistintamente en una variedad
de organismos. Por ejemplo, el gen inducible de la rata
hsp70 fue utilizado para producir ratones transgénicos que
sobreexpresaban hsp70 inducible, permitiendo que los órganos de los
ratones transgénicos fuera protegidos del daño isquémico (Marber y
col., J. Clin. Invest. 95:1446-1456 (1995)) debido
al incremento de hsp70 de rata. Secuencias de otros animales han
sido intercambiadas, incluyendo intercambios entre humanos y
roedores con el fin de desarrollar modelos en roedores para
estudiar enfermedades humanas, esto es, enfermedades
neurodegenerativas. Uno de tales ejemplos es la expresión del gen
SCA1 humano, que codifica ataxina-1, en
ratones (Burright, E.N. y col., Cell 82:937-948
(1995)). Se generaron ratones transgénicos que expresaban el gen
SCA1 humano con un tracto CAG normal o expandido. Los datos
ilustraban que las repeticiones de CAG expandidas se expresaban en
cantidad suficiente en las células de Purkinje para producir
degeneración y ataxia. Este ejemplo ilustra que puede establecerse
un modelo en ratón para estudiar la ataxia espinocerebelosa de tipo
1, que es una enfermedad neurológica autosómica dominante heredada.
Además del desarrollo de modelos en ratón, la Drosophila es
un sistema modelo clave en este campo. Warrick y col. (1999)
produjeron moscas transgénicas que coexpresaban hsp70 humana
y una poliglutamina mutante humana
(MJDtr-Q78). La expresión de la poliglutamina
mutante humana MJDtr-Q78 sola en las moscas
tenía como resultado la formación de grandes agregados en las
neuronas. Sin embargo, la coexpresión con hsp70 humana tuvo
como resultado la supresión de la agregación. Estos ejemplos
ilustran que el intercambio de genes es una rutina en el campo de
la genética molecular y los sistemas modelo proporcionan poderosas
herramientas para caracterizar la función génica.
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Ejemplo
3
Con el fin de detectar patrones de expresión de
Math1 sutiles no identificados por la hibridación in
situ de ARN, y para iluminar así adicionalmente la función de
este gen durante el desarrollo embrionario, se generaron alelos
nulos para Math1
(Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal})
sustituyendo la región codificadora de Math1 por
\beta-galactosidasa
(\beta-Gal).
La construcción vectorizante, conteniendo un
casete de lacZ y un casete de PGK-neo
(Fig. 7A), fue utilizada para sustituir la región codificadora de
Math1. Para eliminar la región codificadora completa de
Math1, se generó una construcción vectorizante que contenía
los fragmentos flanqueantes genómicos 5' y 3' según se describió
anteriormente (Ben-Arie y col., 1997) flanqueando un
casete de pSAbgal/PGK-neo (Friedrich y Soriano,
1991). La construcción es diseñada de tal manera que la expresión de
lacZ está dirigida por los elementos de control de
Math1 endógenos, mientras que un promotor de PGK
independiente dirige la expresión del marcador seleccionable
neo.
La construcción fue introducida por
electroporación en células ES y la selección por neo se llevó
a cabo con G418. Catorce de 76 clones (18%) experimentaron
recombinación homóloga. Se llevó a cabo el genotipado de las
células ES, del saco vitelino y de ADN de la cola utilizando
análisis Southern del ADN digerido con EcoRI y las sondas
descritas previamente (Ben-Arie y col., 1997). La
construcción vectorizante fue introducida por electroporación en
células madre embrionarias (ES); 14/76 clones (18%) mostraban una
recombinación homóloga correcta en el locus de Math1 (Fig.
7B).
Tres líneas celulares de ES portadoras del alelo
Math1^{+/\beta-Gal} fueron inyectadas en
blastocistos del huésped para generar ratones quiméricos. Los
ratones Math1^{+/\beta-Gal} fueron
identificados y cruzados entre sí para generar homozigotos (Fig.
7C). La deleción de Math1 fue confirmada mediante análisis
Southern utilizando sondas flanqueantes e internas (Fig. 7A).
Los ratones
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal}
mostraban todos ellos las características fenotípicas descritas en
los ratones Math1^{-/-} (Ben-Arie y col.,
1997; 2000).
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Ejemplo
4
Se determinó la etapa en la que estaban los
embriones por la presencia del tapón vaginal, designándose como
E0,5 la mañana en la apareció el tapón vaginal. Los embriones fueron
extraídos del útero mediante disección, separados de las membranas
extraembrionarias y colocados en solución salina tamponada con
fosfato (PBS) fría. Los embriones fueron posteriormente fijados en
paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS durante 30 minutos y lavados en
PBS frío. Se recogieron los sacos vitelinos o las colas antes de la
fijación para la extracción de ADN y el genotipado. Se llevó a cabo
un equilibrado para mejorar la penetrabilidad de los reactivos de
tinción en NP40 0,02%, desoxicolato de sodio 0,01% en PBS durante
10 minutos a temperatura ambiente. Se llevó a cabo la tinción con
X-gal del montaje completo (Bonnerot y Nicolas,
1993) durante 16-24 horas a 30ºC mientras se
agitaba en el mismo tampón de equilibrado, que contenía también
ferricianuro de potasio 5 mM, ferrocianuro de potasio 5 mM y 40
mg/ml de X-gal (disuelto en DMSO). Cuando se
consiguió la intensidad de tinción deseada, normalmente en 18
horas, los embriones fueron lavados en PBS,
post-fijados durante 30 minutos en formalina
tamponada, deshidratados de manera seriada en etanol al 25, 50 y
70%, y almacenados a 4ºC.
Para el análisis histológico, los embriones
fueron deshidratados adicionalmente en etanol al 80, 90 y 100%,
tratados con Histoclear (National Diagnostics) e incluidos en
Paraplast (Oxford Labware). Se cortaron secciones de 7 a 20 \mum
utilizando un microtomo (Microme). La contratinción se realizó
utilizando "Nuclear fast Red" (Vector Laboratories). La
inmunohistoquímica se realizó según ha sido detallado previamente
(Ben-Arie y col., 1997). Anticuerpos:
Anti-citoqueratina 18 (DAKO) 1:20;
Anti-Cromogranina A humana (DAKO) 1:100;
Anti-MATH1 (ver más adelante) 1:200.
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Ejemplo
5
Según se esperaba, la expresión de
\beta-Gal en el cerebelo y en la médula espinal
dorsal es idéntica a la de Math1, y lo que es más
interesante, \beta-Gal se expresaba también en
todo el epitelio de las vesículas óticas en E12,5 y en el epitelio
sensorial del utrículo, el sáculo, los canales semicirculares y la
cóclea en E14,5 y E15,5 (Figuras 1A y 1B). Los utrículos fueron
obtenidos de ratones C57BL/129SVEV.
El análisis morfológico macroscópico del oído
interno de los ratones
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal}
en E18,5, un día antes de la gestación completa, no reveló defectos
obvios en la estructura general y en el tamaño en comparación con
los individuos de la camada de tipo salvaje (wt). Las ramas del
VIIIº nervio craneal estaban presentes y alcanzaban el epitelio,
pero se habían degenerado debido a la ausencia de células
pilosas.
Se examinaron con detalle los epitelios
sensoriales. Se escindieron los utrículos y las cócleas de ratones
de tipo salvaje, Math1^{+/\beta-Gal} y
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal}
para permitir la visión de los epitelios sensoriales con la óptica
de Nomarski. Estaban presentes haces pilosos en los órganos de los
ratones de tipo salvaje y de los heterozigotos, pero estaban
completamente ausentes en los individuos de la camada nulos para
Math1. La microscopía de barrido electrónico (SEM) de la
cóclea y de los órganos vestibulares confirmó la ausencia de haces
pilosos en los ratones nulos para el gen (Figuras 2A a 2F). Con el
fin de determinar si la falta de haces pilosos reflejaba la ausencia
de células pilosas, se examinaron secciones transversales de los
epitelios sensoriales de todos los órganos del oído interno
utilizando microscopía óptica y microscopía de transmisión de
electrones (MO y MTE, respectivamente) (Figuras 3A a 3F). MO y MTE
se llevaron a cabo según se ha descrito previamente (Lysakowski y
Goldberg, 1997). La preparación de los tejidos para MTE constaba de
las etapas de tratamiento con osmio (1% de OsO_{4} en tampón
cacodilato), deshidratación, secado al punto crítico, revestimiento
con oro mediante bombardeo iónico y examen en un microscopio
electrónico JEOL 35S.
La microscopía óptica reveló que los epitelios
sensoriales de los ratones nulos para el gen eran considerablemente
más delgados, carecían de la estratificación normal de los núcleos
celulares y se teñían uniformemente, todo lo cual era consistente
con la ausencia de células pilosas. La MTE distingue claramente
entre las células pilosas y las células de soporte de los utrículos
normales: la células pilosas tienen haces pilosos, un citoplasma
menos denso a los electrones, núcleos más apicales y no tienen
gránulos secretores (Figuras 4A y 4B). Los epitelios sensoriales de
los mutantes nulos para el gen carecían totalmente de células
pilosas pero tenían células de soporte con aspecto normal (Rüsch y
col., 1998), incluyendo un citoplasma denso a los electrones,
núcleos basales y gránulos secretores. Sin embargo, los ratones
heterozigotos Math1^{+/\beta-Gal}
conservaban las células pilosas.
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Ejemplo
6
La falta de células pilosas en E18,5 puede ser
debida a (1) la falta de progenitores de las células sensoriales,
(2) la incapacidad de los progenitores para diferenciarse en células
pilosas o (3) la incapacidad de las células pilosas para mantener
los estados diferenciados, como se ha observado en ausencia del
dominio POU del factor de transcripción Brn3c. La primera
posibilidad es poco probable ya que los progenitores dan lugar a las
células pilosas y también a las células de soporte. Con el fin de
evaluar las posibilidades restantes, se examinó la expresión de los
marcadores específicos de células pilosas calretinina y miosina VI.
La calretinina es un miembro de la familia de proteínas que se unen
al calcio y se expresa en las células pilosas que se están
diferenciando (antes de la formación de los haces pilosos) y en las
células pilosas del oído interno maduras y auditivas, pero no en
las células de soporte. La expresión de calretinina en ratones
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal}
y en ratones de tipo salvaje fue estudiada mediante
inmunofluorescencia en secciones coronales de embriones E15,5,
E16,5 y E18,5 (Figuras 5A a 5F).
Para la inmunofluorescencia, los embriones
fueron fijados durante 1,5 horas en paraformaldehído al 4%/PBS a
4ºC, sumergidos en sacarosa al 15%/PBS durante 5 horas y
posteriormente en sacarosa al 30%/PBS durante una noche y
congelados de forma instantánea en un baño de hielo seco con
2-metilbutano. Se cortaron secciones de 14 \mum
en un criostato y se montaron sobre portaobjetos revestidos con
gelatina. Las secciones fueron fijadas en los portas mediante
inmersión durante 10 minutos en fijador de tejidos Streck (Streck
Laboratories) y secado al aire. Las secciones fueron bloqueadas en
un 30% de suero de cabra normal y un 0,3% de Triton
X-100 en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente
(RT). Un anticuerpo policlonal de conejo
anti-calretinina (Chemicon Laboratories) fue
diluido 1:200 en solución de bloqueo e incubado durante una noche
sobre las secciones a 4ºC. Las secciones fueron lavadas tres veces
(20 minutos cada vez) en solución salina tamponada con fosfato
(PBS) a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario,
anti-anticuerpo de conejo, Alexa 488 (Molecular
Probes), fue diluido 1:400 en solución de bloqueo y utilizado para
detectar calretinina. Las secciones fueron cubiertas e incubadas a
temperatura ambiente durante 2 horas antes de ser lavadas y montadas
en Vectashield conteniendo DAPI (Vector). Para la microscopía
confocal, las secciones fueron tratadas con 25 \mug/ml de ARNasa
antes de contrateñir con 50 \mug/ml de yoduro de propidio y
montadas en Vectalshield sin DAPI. Las secciones teñidas fueron
visualizadas bajo un microscopio confocal Bio-Rad
1024.
Las células positivas para calretinina eran
claramente visibles en los epitelios sensoriales de los canales
semicirculares y de los utrículos de los ratones de tipo salvaje,
pero los embriones
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal}
carecían de expresión de calretinina en los tres estados.
Utilizando el modelo de ratón aquí descrito, los presentes
inventores demostraron que las células pilosas no se desarrollan
nunca en los epitelios sensoriales de los ratones
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal}.
La presencia de las membranas tectorial y otolítica (secretadas en
parte por las células de soporte), junto con los resultados de la
MET, sugería que las células restantes de los epitelios sensoriales
de los ratones
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal},
eran células de soporte funcionales.
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Ejemplo
7
Se analizó el cerebelo en desarrollo en E14,5 y
en el día post-natal 0 (P0) de ratones
Math1^{+/\beta-Gal} y
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal}
mediante análisis de hibridación in situ de ARN.
Los análisis mostraron que el patrón de
expresión del gen lacZ reproducía fidedignamente el patrón de
expresión de Math1 observado mediante el análisis de
hibridación in situ de ARN mostrado previamente (Akazawa y
col., 1995; Ben-Arie y col., 1996) (Fig. 2A, B, E,
G). Además, el fenotipo del cerebelo de los ratones
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal}
(Fig. 8F y 8H) era idéntico al observado en los ratones nulos para
Math1 (Ben-Arie y col., 1997). En E14,5, los
precursores de la EGL están presentes en el labio rómbico desde el
cual migran sobre el primordio cerebeloso para poblar la EGL (Fig.
8E). Los ratones mutantes mostraban bastantes menos células de este
tipo que los ratones heterozigotos (Fig. 8F). En P0, las neuronas
de la capa granular externa (EGL) estaban completamente ausentes
(Fig. 8H).
La expresión de Math1/lacZ en el cerebro
posterior y en la médula espinal en desarrollo reproducía de manera
similar el patrón de expresión de Math1 (Fig. 8C, 8D). La
única diferencia notable entre los patrones de expresión
establecidos por la hibridación in situ y la tinción de
lacZ es que la expresión de
\beta-galactosidasa persiste en las células de la
médula espinal que se estaban diferenciando o migrando debido a la
estabilidad de la proteína \beta-GAL (Fig. 8D).
En resumen, el patrón de expresión en el tejido neural y el fenotipo
del cerebelo asociados con la sustitución de la región codificadora
de Math1 por lacZ, es consistente con los datos
previamente publicados sobre la expresión de Math1 (Akazawa y
col., 1995; Ben-Arie y col., 1997;
Ben-Arie y col., 1996; Helms y Johnson, 1998),
demostrando que los elementos de control endógenos no habían sido
alterados por la inserción del gen lacZ. Además, muchos de
los grupos de células que expresaban lacZ no detectados
previamente resultaron patentes tras la tinción con
X-gal de embriones completos y de secciones de
embriones de ratones Math1^{+/\beta-Gal}
(ver más adelante). Es probable que limitaciones en la resolución
espacial de las técnicas de hibridación in situ de ARN
utilizadas para detectar el transcrito en los estudios más
antiguos, impidieran que estos sitios de expresión fueran
distinguidos (Akazawa y col., 1995; Ben-Arie y
col., 1996). Alternativamente, la estabilidad del producto del gen
lacZ y la sensibilidad incrementada debido a la
amplificación de la señal, nos permitieron identificar lugares con
niveles de expresión relativamente bajos.
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Ejemplo
8
Los órganos sensoriales del oído interno estaban
entre los sitios de expresión de Math1/lacZ recién
identificados, demostrados utilizando los métodos descritos en el
Ejemplo 2. La expresión en la vesícula ótica fue detectada por
primera vez en E12,5 y continuó siendo detectada hasta E18,5 en gran
parte de los epitelios sensoriales (Bermingham y col., 1999)
(Figuras 9A, 9B). Los mutantes nulos para el gen mostraban expresión
de Math1/lacZ en el oído interno a lo largo de toda la
embriogénesis (Fig. 9C). Los mutantes nulos para Math1
carecían de células pilosas en todos los órganos sensoriales
(Bermingham y col., 1999), pero mantenían las células de soporte,
las otras células derivadas del epitelio sensorial (Fig. 9C). Estas
células de soporte parecían ser funcionales, sobre la base de su
morfología y de la presencia de membranas superpuestas secretadas en
parte por estas células. Aunque no se demostró la expresión de
Math1 en los epitelios sensoriales del oído interno mediante
el análisis de hibridación in situ del ARN, la completa
ausencia de células pilosas del oído interno en los mutantes nulos
para el gen deja poca duda sobre la autenticidad del patrón de
expresión de Math1/lacZ.
El Math1 es claramente esencial para el
desarrollo de las células pilosas en el oído interno. Su patrón de
expresión y su función in vivo son semejantes a los del
homólogo proneural de Math1, atonal (ato)
(A.P. Jarman, Y. Grau, L.Y. Jan, Y.N. Jan, Cell 73,
1307-21 (1994)). El ato se expresa en un
anillo de células epiteliales dentro del disco antenal de
Drosophila. Algunas de estas células epiteliales se
desarrollarán posteriormente a mecanorreceptores en el órgano de
Johnston, que es necesario para la audición y para la geotaxis
negativa. Es interesante indicar que las células progenitoras de los
mecanorreceptores están ausentes en los mutantes de ato,
mientras que solamente los mecanorreceptores, y no sus progenitores,
están ausentes en los ratones nulos para Math1.
Sobre la base de las observaciones aquí
realizadas, los presentes inventores han reconocido que se requiere
Math1 para la especificación de las células pilosas del oído
interno. En un sentido, Math1 actúa como un
"pro-gen de células pilosas" en los epitelios
sensoriales en desarrollo. Junto con dos estudios recientes, los
presentes inventores han reconocido que los resultados aquí
proporcionados proporcionan pruebas que apoyan un modelo de
inhibición lateral para la determinación de las células pilosas y de
las células de soporte (Haddon y col., 1998; Adam y col., 1998), en
el cual la interacción de Delta, Notch y Serrate1
tiene como resultado la selección de células pilosas individuales a
partir de agrupaciones de células competentes. Tal modelo supone
que los epitelios sensoriales expresan un "gen
pro-células pilosas" cuya función es esencial
para la especificación del destino de las células pilosas.
La expresión ectópica de ato en la mosca
de la fruta y de su homólogo Xath1 en Xenopus (Kim y
col., 1997) puede reclutar células epiteliales hacia destinos
neuronales específicos, y la expresión de Math1 en los
epitelios del oído interno sugiere firmemente que la pérdida de un
gen Math1 funcional es probablemente una causa común de la
sordera y de la disfunción vestibular.
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Ejemplo
9
En el tronco cerebral, la tinción de
Math1/lacZ aparecía desde E18,5 hasta P7 en el puente ventral
de las regiones correspondientes a los núcleos pontinos (Fig. 9D y
recuadro). Este hallazgo es consistente con la hipótesis de Akazawa
y colaboradores de que las células positivas para Math1 del
cerebro posterior en desarrollo son precursoras de las neuronas
bulbo-pontinas (Akazawa y col., 1995). Tal tinción
no aparecía en los mutante nulos para el gen (Fig. 9E y recuadro).
Estos datos generaban la posibilidad de que la ausencia de tinción
de lacZ en los núcleos pontinos podría ser debida a un fallo
de sus precursores para migrar, proliferar y/o diferenciarse. Los
núcleos pontinos ventrales fueron examinados tras la tinción con
hematoxilina y eosina de las secciones y se encontró que estaban
ausentes en el tronco cerebral de los ratones nulos para el gen
(Fig. 9F, G). Además, la incapacidad para respirar de los ratones
nulos para el gen recién nacidos podía ser debida a la ausencia de
estas neuronas en el tronco cerebral.
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Ejemplo
10
Los heterozigotos
Math1^{+/\beta-Gal} mostraban expresión de
Math1 en el cartílago articular (Figuras 6A y 6B). La Figura
6A demuestra la expresión en todas las articulaciones de un miembro
anterior. Tras un examen más exhaustivo de la articulación del
codo, se observó que Math1 se expresaba exclusivamente en
los condrocitos articulares no osificados.
La expresión de Math1/lacZ fue detectada
en las articulaciones proximales en desarrollo, tales como las de
la cadera y el hombro, tan pronto como en E12,5 (Fig. 10A). Se
detectó tinción positiva con X-gal en etapas
posteriores del desarrollo en un patrón
proximal-distal progresivo que era paralelo al
desarrollo normal de las articulaciones (Figura 10B). En las
articulaciones, la expresión de Math1/lacZ sigue
inmediatamente a la condensación mesenquimal, que comienza en
E11,5. Las células mesenquimales condensadas se diferencian a
condrocitos (Bi y col., 1999; Horton y col., 1993; Karsenty,
1998).
Los condrocitos se diferencian en tres fases
principales durante la formación del hueso: reposo, proliferación e
hipertrofia. Los condrocitos en reposo que pueblan el cartílago
articular son referidos como condrocitos articulares (Buckwalter y
Mankin, 1998; Poole, 1997). Antes del nacimiento, los condrocitos en
reposo constituyen la población total de condrocitos de las
articulaciones. Con el fin de establecer qué células expresaban
Math1/lacZ, se tiñeron secciones de ratones
Math1^{+/\beta-Gal} E18,5 y P7 con
X-gal. Math1/lacZ se expresaba en los
condrocitos en reposo de todas las articulaciones analizadas en
E18,5; la Figura 10C muestra condrocitos en reposo en la
articulación del codo y la Fig. 10D muestra los condrocitos en
reposo, en proliferación y articulares de un ratón P7.
Las articulaciones de embriones E18,5 fueron
examinadas con un anticuerpo anti-MATH1 preparado
mediante los métodos siguientes. Un fragmento de
EcoRI-HindIII que codificaba los 156 aminoácidos
N-terminales del marco de lectura abierto de
Math1 (Math1D) fue clonado en el vector de expresión
pET 28a+ (Novagen). El fragmento Math1D fue expresado como
una proteína de fusión con una marca de His
("His-tag"). La proteína MATH1D soluble fue
purificada de acuerdo con las especificaciones del kit
"His-tag" (Novagen) y se utilizaron 2 mg de
proteína para inmunizar pollos (Cocalico Biologicals Inc.).
Se encontró expresión en condrocitos en reposo,
mientras que no se observó expresión en los embriones nulos para el
gen. Debe indicarse que ninguna célula del cartílago articular
expresaba Math1/lacZ (Fig. 10E). La expresión de
Math1/lacZ en los mutantes nulos para Math1 es similar
a la de los ratones heterozigotos en E18,5, sugiriendo que no se
requiere Math1 para el desarrollo de los condrocitos en
reposo.
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Ejemplo
11
Hacia E14,5 células positivas para
Math1/lacZ eran manifiestas alrededor de las vibrisas y en la
piel de gran parte del cuerpo (Fig. 10B). En el tronco, las células
teñidas estaban dispuestas en un patrón rayado definido por las
crestas epidérmicas. Esta tinción era clara solamente en la piel con
pelo, no en la piel lampiña. Todas las vibrisas primarias
(mistaciales), incluyendo a las nasales laterales, las maxilares y
los cuatro pelos grandes, eran positivos para Math1/lacZ.
También se detectó tinción en las vibrisas secundarias, incluyendo
las vibrisas labiales, las submentonales, las rinovibrisas y las
vibrisas orbitales aisladas (supra-, infra- y
post-orbitales) (Yamakado y Yohro, 1979). Hacia el
E15,5 apareció tinción en grupos de células de las almohadillas
subplantares.
Con el fin de identificar las células positivas
para Math1/lacZ de las vibrisas, de la almohadilla subplantar
y de la piel con pelo, examinamos histológicamente secciones
procedentes de ratones Math1^{+/\beta-Gal}
(Fig. 11A-D). Las secciones de las vibrisas
mostraron que las células teñidas estaban localizadas hacia la
mitad más apical del tallo del pelo, pero no estaban en el propio
pelo. Secciones transversales de la almohadilla subplantar
ilustraban la tinción de grupos de células en la capa epidérmica
(Fig. 11B, C). Según se muestra en la Fig. 11D, las secciones de la
piel del tronco identificaron grupos de células teñidas para
Math1/lacZ. Las células teñidas estaban dispuestas en un
patrón con forma de herradura centradas en una estructura elevada
similar a un botón en la piel con pelo. Estas estructuras similares
a un botón fueron identificadas como cúpulas del tacto o
Haarscheiben (Pinkus, 1905), las cuales se caracterizan por una
epidermis engrosada y una papila dérmica elevada con una red de
capilares. Las cúpulas del tacto están asociadas con pelos
guardianes grandes dispersos entre otros tipos de pelo de la capa.
La distribución espacial de las células teñidas para
Math1/lacZ, el momento de su aparición en E14,5 y su
localización dentro de las almohadillas mistaciales de las vibrisas
y en las cúpulas del tacto de la piel con pelo, sugerían que estas
células corresponden a células de Merkel, células especializadas de
la epidermis que forman complejos de mecanorreceptores de tipo I de
adaptación lenta con neuritas (Munger, 1991).
Los resultados del análisis comparativo del
patrón de expresión de Math1/lacZ en animales heterozigotos
y homozigotos en E16,5, están mostrados en la Figura
11E-L. Los embriones
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal}
mostraban un patrón de tinción similar al de sus compañeros de
camada Math1^{+/\beta-Gal} en las vibrisas
y en las almohadillas subplantares (Fig. 11 E-G,
I-K). En contraste, la tinción en las cúpulas del
tacto de la piel con pelo apenas era detectable en los embriones
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal}
(Fig. 11H, L). La reducción de la tinción en los animales nulos para
el gen era también obvia en E18,5.
Con el fin de definir adicionalmente las células
positivas para Math1/lacZ en la piel, se aparearon
ratones
Math1^{+/\beta-Gal} con ratones Tabby. Tabby (Ta) es una mutación espontánea ligada a X que muestra un fenotipo similar en machos hemizigotos y en hembras homozigotas (Ferguson y col., 1997). Los mutantes Tabby carecen de folículos pilosos (tilótricos), de un subgrupo de células de Merkel que están asociadas con las cúpulas del tacto de la piel con pelo del tronco (Vielkind y col., 1995) y de algunas de las cinco vibrisas secundarias de la cabeza (Gruneberg, 1971). Por tanto, en un cruce de hembras Ta/Ta con un macho heterozigoto Math1^{+/\beta-Gal}, el 50% de la progenie masculina será Ta/Y:Math1^{+/\beta-Gal}, permitiéndonos determinar si las células positivas para Math1/lacZ corresponden a células de Merkel.
Math1^{+/\beta-Gal} con ratones Tabby. Tabby (Ta) es una mutación espontánea ligada a X que muestra un fenotipo similar en machos hemizigotos y en hembras homozigotas (Ferguson y col., 1997). Los mutantes Tabby carecen de folículos pilosos (tilótricos), de un subgrupo de células de Merkel que están asociadas con las cúpulas del tacto de la piel con pelo del tronco (Vielkind y col., 1995) y de algunas de las cinco vibrisas secundarias de la cabeza (Gruneberg, 1971). Por tanto, en un cruce de hembras Ta/Ta con un macho heterozigoto Math1^{+/\beta-Gal}, el 50% de la progenie masculina será Ta/Y:Math1^{+/\beta-Gal}, permitiéndonos determinar si las células positivas para Math1/lacZ corresponden a células de Merkel.
Hembras Ta/Ta fueron apareadas
gestacionalmente con machos
Math1^{+/\beta-Gal}, y los embriones
fueron recogidos en E16,5. Se determinó el género de cada cría
mediante PCR del ADN de la cola utilizando los cebadores (directo
5'-TGAAGCTTTTGGCTTTGAG-3'; SEC ID
Nº:67, e inverso
5'-CCGCTGCCAAATTCTTTGG-3'; SEC ID
Nº:68) lo cual dio lugar a un producto de 320 pb procedente del
cromosoma X y un producto de 300 pb procedente del cromosoma Y (Liu
y col, 1999). Las condiciones de la amplificación fueron: 92ºC/1
minuto, 55ºC/1 minuto, 72ºC/1 minuto durante 32 ciclos, con una
etapa inicial de desnaturalización de 94ºC/7 minutos y una etapa
final de extensión de 72ºC/7 minutos. Los productos de amplificación
fueron separados en geles de agarosa al 2%. Los embriones teñidos
con X-gal fueron valorados independientemente por 2
individuos y sólo entonces se consideró que los resultados
coincidían con el género determinado.
Los machos y las hembras Tabby portadores
del alelo Math1^{+/\beta-Gal} mostraban
ambos tinción con X-gal en las vibrisas y en las
almohadillas subplantares (Fig. 12A, B). El efecto de la mutación
Tabby sobre el número de vibrisas secundarias estaba
bastante claro: los machos hemizigotos carecían completamente de
células positivas para Math1/lacZ en las vibrisas secundarias
(típicamente ausentes en los mutantes Ta) y en el tronco
(Fig. 12E). Las hembras que eran heterozigotas para Tabby
mostraban una tinción poco uniforme en las cúpulas del tacto
(aunque menos que las wt), como podría anticiparse en las hembras
portadoras de una mutación en un gen que experimente inactivación
aleatoria del cromosoma X (Fig. 12C, D). La localización y
distribución de las células positivas, así como su ausencia en
vibrisas seleccionadas y en el tronco de los machos Tabby,
indicaban firmemente que Math1 se expresaba en las células de
Merkel asociadas con los folículos centinela de las cúpulas del
tacto de la piel con pelo.
Con el fin de determinar si el patrón de tinción
de Math1/lacZ reflejaba el patrón de expresión normal de
Math1, se llevó a cabo un análisis inmunohistoquímico de
MATH1 en secciones de piel abdominal (ver el Ejemplo 2). Como se
observa en las Figs. 13A y B, se detectaron células positivas para
MATH1 alrededor de los folículos pilosos de los ratones
Math1^{+/+} pero no de los ratones
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal}.
Se seleccionaron anticuerpos hacia dos marcadores de las células de
Merkel para un análisis posterior: un anticuerpo
anti-citoqueratina 18, que se expresa en los
epitelios simples, y un anticuerpo hacia la cromogranina, que se
localiza en los gránulos secretores de los tejidos neuroendocrinos,
endocrinos y neuronales. La citoqueratina 18 (Fig. 13C, D) y la
cromogranina A (Fig. 13E, F) confirmaron la identidad de las células
positivas para Math1/lacZ como células de Merkel, pero no
revelaron anormalidades de la tinción en los ratones
Math1^{\beta-Gal/\beta-Gal}.
Por tanto, Math1 no parece ser esencial para la génesis de
las células de Merkel neuroendocrinas, en contraste con los tipos
celulares neuronales puros como la EGL del cerebelo y los núcleos
pontinos. Como los mutantes nulos para Math1 morían al
nacer, no pudimos determinar si el grupo completo de células de
Merkel estaba formado o si estaba afectada la integridad funcional
de las células de Merkel en estos mutantes.
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Ejemplo
12
Este ejemplo demuestra que los genes asociados
con atonal pueden inducir el desarrollo de células del SNC
en animales deficientes en un gen o en un producto génico nativo
asociado con atonal. Este ejemplo demuestra también que los
genes asociados con atonal pueden funcionar terapéuticamente
en especies en las cuales no se expresan de forma nativa.
Dada la notable similitud entre en los patrones
de expresión de ato y Math1, y sus dominios básicos
idénticos, se analizó Math1 para ver si podría remedar los
efectos de la sobreexpresión de ato mediante la producción
de órganos cordotonales ectópicos según está descrito por los
siguientes métodos. Moscas de tipo salvaje, conocidas también como
moscas yw, fueron transformadas con una construcción
UAS-Math1 según ha sido descrito (Brand y
Perrimon, 1993). Para sobreexpresar Math1 en moscas de tipo
salvaje yw, moscas UAS-Math1 fueron
apareadas con moscas HS-Gal4. La progenie fue
sometida a un golpe de calor según ha sido descrito previamente
(Jarman y col., 1993). Para rescatar la pérdida de los órganos
cordotonales en las moscas mutantes para ato, w; moscas
UAS-Math1/UAS-Math1; ato1/TM6
fueron cruzadas con moscas w; HS-Gal4/Cyo;
ato1/TM6. Se recogieron embriones durante 3 horas, se
envejecieron durante 3 horas, se sometieron a un golpe de calor
durante 30 minutos a 37ºC y se dejaron desarrollar durante las
siguientes 12-15 horas. Los embriones fueron
fijados en formaldehído al 4% en PBS con un 50% de heptano. Los
embriones fueron lavados con etanol 100%, transferidos a PBT y
teñidos con el mAb 22C10 según ha sido descrito previamente (Kania
y col., 1995) para detectar neuronas del SNP. Las neuronas
cordotonales fueron identificadas por su morfología y su posición
características.
La expresión de Math1 durante el
desarrollo pupal mediante golpe de calor utilizando el sistema
UAS-Gal4 (Brand y Perrimon, 1993) tuvo como
resultado órganos sensoriales externos supernumerarios en el notum
(Fig. 14A, B) y en la lámina del ala, según se había descrito para
ato (Jarman y col., 1993) y para los genes del complejo
Achaete-Scute (AS-C)
(Brand y Perrimon, 1993; Rodriguez y col., 1980). La expresión de
Math1 en las moscas, igual que la de ato, producía
órganos cordotonales ectópicos (Fig. 8G), aunque con menor
eficacia. Sin embargo, la sobreexpresión de los genes
AS-C no tenía como resultado órganos
cordotonales ectópicos (Jarman y col., 1993). Math1 tiene
por tanto una especificidad funcional similar a la de
ato.
Como varios intensificadores de ato son
dependientes de ato (Sun y col., 1998), pueden ser activados
por Math1, lo cual daría lugar por tanto a la especificación
ectópica de los CHOs. Con el fin de determinar si Math1
podía sustituir la función de ato en las moscas, y para
excluir la posibilidad de que la producción de CHOs por
Math1 fuera debida a la activación de ato, se expresó
Math1 en embriones mutantes para ato. Los mutantes
carecían todos ellos de neuronas cordotonales (Fig. 14C), pero la
sobreexpresión de Math1 rescataba parcialmente la pérdida de
estas neuronas (Fig. 14D) de manera similar a ato (Chien y
col., 1996).
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Ejemplo
13
A lo largo de los últimos años se ha hecho un
progreso significativo para desvelar las funciones de las proteínas
bHLH en la neurogénesis de los vertebrados. Los genes que codifican
bHLH neural de los vertebrados fueron aislados y caracterizados ya
que se había demostrado previamente que se requerían para la
neurogénesis homólogos de Drosophila tales como los genes
ato o AS-C (Anderson, 1995; Guillemot,
1046 1995; Lee, 1997; Takebayashi y col., 1997). En efecto, se
demostró que varios genes eran proneurales debido a que su ausencia
producía un fallo en la especificación de los neuroblastos o
precursores de los órganos sensoriales (SOP), mientras que su
sobreexpresión daba lugar al reclutamiento de precursores neuronales
supernumerarios (Ghysen y Dambly-Chaudiere, 1989).
Con la excepción de neurogenina (Ngn) 1 y
2 (Fode y col., 1998; Ma y col., 1998), permanece incierto
cuál de los homólogos de vertebrados desempeña funciones similares a
las de sus equivalentes de Drosophila, y qué función precisa
desempeñan las diferentes proteínas bHLH en el desarrollo neural.
En Drosophila se requiere ato para el desarrollo de un
subgrupo específico de órganos sensoriales, los órganos
cordotonales (Jarman y col., 1993). Los CHOs son mecanosensores
internos del SNP (McIver, 1985). Por tanto, ato y los CHOs
proporcionan un excelente sistema en el que determinar no sólo la
relación molecular y relativa al desarrollo entre la neurogénesis de
invertebrados y vertebrados con respecto a la función de los genes
proneurales, sino también la conservación evolutiva de la función y
la especificación de los órganos sensoriales. En el ratón se han
clonado y analizado siete homólogos de ato: los Homólogos
de Atonal de Ratón (MATH) 1, 2, 3, 4A (conocido también
como Ngn2), 4B (Ngn3), 4C (Ngn1)
y 5 (Akazawa y col., 1995; Bartholomä y Nave, 1994;
Ben-Arie y col., 1997, 1996; Fode y col., 1998; Ma
y col., 1998; McCormick y col., 1996; Shimizu y col., 1995;
Takebayashi y col., 1997). La mayoría de ellos se expresan durante
la neurogénesis en el SNC y en el SNP. Estos homólogos varían en el
grado de conservación de sus secuencias y pueden ser divididos en
tres grupos. El grupo más distantemente relacionado, las
neurogeninas, incluye Ngn 1, 2 y 3. Estos productos
génicos comparten, de media, un 53% de identidad en el dominio bHLH
con ATO. Son expresados en su mayoría en células progenitoras de los
ganglios sensoriales y del SNC mitóticas. Un trabajo reciente
sugiere que estos genes pueden desempeñar una función en la
determinación de los neuroblastos y pueden por tanto ser auténticos
genes proneurales (Fode y col., 1998; Ma y col., 1998). El segundo
grupo incluye MATH2 y MATH3, que comparten un 57% de identidad en el
dominio bHLH con ATO. Se ha postulado que estas proteínas funcionan
en las células neurales post-mitóticas (Bartholomä y
Nave, 1994; Shimizu y col., 1995). La expresión de Math2
está limitada al SNC, mientras que Math3 se expresa en el SNC
y en los ganglios del trigémino y de la raíz dorsal. El tercer
grupo incluye MATH1 y MATH5, que comparten un 67% y un 71% de
identidad con el dominio bHLH de ATO, respectivamente. Es de
destacar que ambos genes codifican un dominio básico idéntico al de
ATO. Y lo que es más interesante, se demostró el que dominio básico
de ATO era suficiente, en el contexto de otra proteína proneural
(SCUTE), para sustituir la pérdida de la función de ato
(Chien y col., 1996). Inicialmente se demostró que Math1 se
expresaba en los precursores de la EGL del cerebelo y en la médula
espinal dorsal (Ben-Arie y col., 1997, 1996).
Math5 se expresaba en los progenitores en división de la
retina en desarrollo y en el ganglio vagal (Brown y col., 1998). Con
la excepción de la expresión de Math5 en la retina neural,
estas observaciones encierran una paradoja: ninguno de los
homólogos de vertebrados parecía expresarse en los órganos o tejidos
periféricos similares a aquellos en los que se expresaba
ato. Jarman y col. (1993) describieron que ato se
expresaba en el SNC. En los ejemplos descritos en la presente se
muestra que, además de en el centro de proliferación interno del
lóbulo óptico, ato se expresaba en una pequeña placa de
células anteriomedial en cada lóbulo del cerebro (Fig. 8F). Ya que
permanece incierto, sin embargo, qué función precisa desempeña
ato en el desarrollo del SNC de Drosophila, ha sido
difícil discutir que ato y sus homólogos de vertebrados
muestran una conservación funcional. Nuestros experimentos revelan
lugares de expresión de Math1 no caracterizados previamente.
Según se esperaba, encontramos que la expresión de Math1/lacZ
en el SNC correspondía a la de Math1, pero también
encontramos que Math1 se expresaba en la piel, en las
articulaciones y en el oído interno, en un paralelismo sorprendente
con la expresión de ato en la mosca. Además, la expresión en
el oído (epitelio sensorial) y en la piel (células de Merkel) está
limitada a estructuras sensoriales cuya función es convertir
estímulos mecánicos en señales electroquímicas neuronales. Es
importante señalar que en Drosophila, ato parece
desempeñar dos funciones simultáneamente. Se requiere no sólo para
seleccionar los precursores de los CHOs (función proneural), sino
también para especificar estos precursores como precursores de CHO
(función de identidad del linaje) (Jarman y Ahmed, 1998; Jarman y
col., 1993). La especificidad de la expresión de Math1 en la
periferia hace tentador especular que el mismo puede también dotar a
células específicas de identidades de linaje muy específicas para
distinguirlas funcionalmente de otras estructuras sensoriales. La
capacidad de Math1 para inducir la formación de CHOs
ectópicos y para restaurar CHOs en embriones mutantes para
ato, apoya la noción de que Math1, y particularmente
su dominio básico, codifica una información sobre la identidad del
linaje no diferente de la codificada por ato. Esto sugiere
que las células de mamífero que expresan Math1, al menos en
el oído y en la piel, son funcionalmente similares y quizá están
evolutivamente relacionadas con las células de Drosophila que
requieren ato. Además, la expresión de Math5 en la
retina neural sugiere que las funciones de atonal en la mosca
están llevadas a cabo por dos genes en el ratón: el desarrollo de
algunos mecanorreceptores está bajo el control de Math1 y el
desarrollo de la retina está posiblemente bajo el control de
Math5. Es interesante observar que en el nematodo C.
elegans totalmente secuenciado, se identificó solamente un
homólogo de atonal, lin-32 (Zhao y
Emmons, 1995). Mutantes con el alelo u282 de
lin-32 son insensibles al tacto, lo cual
refuerza el argumento de la conservación evolutiva de la función de
atonal en la mecanorrecepción. El patrón de expresión de
Math1/lacZ en los núcleos pontinos sugería que esta región
debe ser evaluada cuidadosamente en los mutantes nulos para el gen.
Aunque originalmente no se detectaron defectos en el puente de los
ratones nulos para Math1 (Ben-Arie y col.,
1997), un análisis más minucioso reveló la falta de núcleos pontinos
en este lugar. Estas neuronas derivan del labio rómbico (Altman y
Bayer, 1996) igual que las neuronas de la EGL, que están también
ausentes en los ratones nulos para Math1. Aunque es posible
deducir paralelismos entre la expresión de Math1 y
ato en la piel y en el oído, no está claro que este sea el
caso para las articulaciones. Se requiere la expresión de
ato en las articulaciones de la mosca para la formación de
los CHOs de las patas. En contraste, Math1 se expresa en
condrocitos en reposo y articulares que no tienen ninguna función
neural descrita, y para los cuales no existe paralelismo en la
mosca. Pudiera ser que la expresión de Math1 en el cartílago
indicara una nueva función para un gen mecanosensorial, o
simplemente podría reflejar similitudes en los acontecimientos
moleculares subyacentes al desarrollo de los diferentes tipos
celulares que expresan Math1. Alternativamente, los CHOs
podrían también funcionar como elementos estructurales de las
articulaciones de la mosca, o bien el cartílago articular podría
tener una capacidad mecanorreceptora o transductora no descrita
todavía. No existe ninguna evidencia en este punto para apoyar una
u otra de estas posibilidades. El análisis de las funciones de
ato y Math1 aumentará nuestro conocimiento del
desarrollo neural y de la conservación evolutiva de la función
sensorial. Los sitios y la especificidad de la expresión de
Math1 pueden hacer que el mismo sea adecuado como una
herramienta para terapia génica o para procedimientos de activación
génica en enfermedades tales como la pérdida auditiva y la
osteoartritis que son debidas a un daño relacionado con la edad o a
un daño medioambiental.
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Ejemplo
14
Los adenovirus humanos son virus tumorales de
ADN bicatenario con tamaños del genoma de 36 kb aproximadamente.
Los adenovirus han sido ampliamente estudiados y bien caracterizados
como sistema modelo para la expresión de genes eucarióticos, lo
cual hace que sean un sistema atractivo para el desarrollo de
adenovirus como sistema para la transferencia de genes. Este grupo
de virus es fácil de crecer y manipular y pueden presentar un amplio
rango de huéspedes in vitro e in vivo. En células
infectadas líticamente, los adenovirus son capaces de anular la
síntesis de proteínas del huésped, dirigiendo la maquinaria celular
para sintetizar grandes cantidades de proteínas víricas, y de
producir cantidades copiosas de virus.
La región E1 del genoma incluye E1A y E1B, que
codifican proteínas responsables de la regulación de la
transcripción del genoma del virus, además de unos cuantos genes
celulares. La expresión de E2, incluyendo E2A y E2B, permite la
síntesis de funciones replicativas del virus, por ejemplo de la
proteína de unión a ADN, de ADN polimerasa y de una proteína
terminal que estimula la replicación. Los productos del gen E3
impiden la citolisis por las células T citotóxicas y por el factor
de necrosis tumoral, y parecen ser importantes para la propagación
vírica. Las funciones asociadas con las proteínas E4 incluyen la
replicación de ADN, la expresión de genes tardíos y la inactivación
de la célula huésped. Los productos de los genes tardíos incluyen la
mayor parte de las proteínas de la cápside de los viriones, y éstos
son expresados solamente después de que haya tenido lugar la mayor
parte del procesamiento de un único transcrito primario a partir del
promotor tardío principal. El promotor tardío principal (MLP)
muestra una elevada eficacia durante la fase tardía de la
infección.
Como parece requerirse solamente una pequeña
porción del genoma vírico en cis, los vectores derivados de
adenovirus ofrecen un excelente potencial para la sustitución de
fragmentos grandes de ADN cuando se utilizan junto con líneas
celulares tales como las células 293. Se han desarrollado líneas
celulares de riñón embrionario humano transformadas con Ad5 para
proporcionar las proteínas víricas esenciales en trans. Los
inventores razonaron por tanto que las características de los
adenovirus los convertían en buenos candidatos para ser utilizados
en la vectorización hacia células deficientes en Math1 in
vivo. En otra realización, estas construcciones incluyen una
secuencia de ácido nucleico de Hath1 o cualquier secuencia de
ácido nucleico asociada con atonal.
Las ventajas particulares de un sistema de
adenovirus para administrar proteínas foráneas a una célula
incluyen: (i) la capacidad para sustituir fragmentos relativamente
grandes de ADN vírico por ADN foráneo; (ii) la estabilidad
estructural de los adenovirus recombinantes; (iii) la seguridad de
la administración de adenovirus a humanos; (iv) la falta de
cualquier asociación conocida de la infección adenovírica con el
cáncer o con enfermedades malignas; (v) la capacidad para obtener
títulos elevados del virus recombinante y (vi) la elevada
infectividad de los adenovirus.
Una ventaja de los vectores adenovíricos sobre
los retrovíricos es un nivel más elevado de expresión génica.
Adicionalmente, la replicación de los adenovirus es independiente de
la replicación de los genes del huésped, a diferencia de las
secuencias retrovíricas. Como los genes transformantes de la región
E1 de adenovirus pueden ser fácilmente eliminados y continúan
proporcionando vectores de expresión eficaces, se cree que el riesgo
oncogénico de los vectores adenovíricos es despreciable.
En general, los sistemas de transferencia de
genes adenovíricos están basados en adenovirus recombinantes:
adenovirus manipulados que son convertidos en incompetentes para la
replicación por la deleción de una porción de su genoma, tal como
E1, y que todavía conservan su competencia para la infección.
Proteínas foráneas relativamente grandes pueden ser expresadas
cuando se realizan deleciones adicionales en el genoma adenovírico.
Por ejemplo, adenovirus con deleciones en las regiones E1 y E3 son
capaces de llevar hasta 10 kb de ADN foráneo y pueden ser
cultivados hasta títulos elevados en células 293. Sorprendentemente,
es posible la expresión duradera de transgenes después de la
infección adenovírica. La utilización del sistema de transferencia
de genes adenovírico puede ser más útil para la administración de
Math1 a células del cartílago naciente o dañado de las
articulaciones. En particular, el adenovirus con Math1 puede
ser utilizado para suministrar Math1 a, y conferir la
expresión del gen Math1 a, cartílago articular no osificado
que haya sido dañado como consecuencia de la osteoartritis.
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Ejemplo
15
Pueden construirse viriones recombinantes para
la expresión controlada de Math1 con el fin de aprovechar
las ventajas de los vectores adenovíricos tales como un título
elevado, un amplio rango de dianas, una transducción eficaz y la no
integración en las células diana para la transformación de células
en células pilosas. En una realización, estas construcciones
incluyen una secuencia de ácido nucleico de Hath1 o cualquier
secuencia de ácido nucleico asociada con atonal. En una
realización de la invención, se crea un adenovirus independiente
del cooperador, defectuoso en replicación, que expresa secuencias de
Math1 de tipo salvaje bajo el control del promotor de
citomegalovirus humano o del promotor de metalotionina.
Las funciones de control sobre los vectores de
expresión son proporcionadas a menudo por virus cuando se desea la
expresión en células de mamífero. Por ejemplo, promotores comúnmente
utilizados derivan de polioma, adenovirus 2 y virus 40 de simio
(SV40). Los promotores temprano y tardío del virus SV40 son
particularmente útiles, ya que ambos son obtenidos fácilmente a
partir del virus como un fragmento que contiene también el origen
de replicación vírico de SV40. Pueden utilizarse también fragmentos
de SV40 más pequeños o más grandes siempre que esté incluida la
secuencia de 250 pb aproximadamente que se extiende desde el sitio
de HindIII hacia el sitio de BglI situado en el
origen de replicación vírico. Además, es también posible, y a menudo
deseable, utilizar secuencias promotoras o de control asociadas
normalmente con la secuencia del gen Math1, concretamente el
promotor de Math1, siempre que tales secuencias de control
sean compatibles con los sistemas de la célula huésped o de la
célula diana. Una de tales células diana está situada en el oído
interno de un paciente humano con necesidad de células pilosas del
oído
interno.
interno.
Un origen de replicación puede ser proporcionado
por la construcción del vector para que incluya un origen exógeno,
que puede derivar de SV40 o de otra fuente vírica (por ejemplo,
polioma, adeno, VSV, VPB), o puede ser proporcionado por el
mecanismo de replicación cromosómica de la célula huésped. Si el
vector está integrado en el cromosoma de la célula huésped, este
último es a menudo suficiente.
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Ejemplo
16
Otro procedimiento para la administración de
genes aprovecha la capacidad natural de los virus para penetrar en
las células, llevando con ellos su propio material genético. Los
retrovirus son prometedores como vectores para la administración de
genes debido a su capacidad para integrar sus genes en el genoma del
huésped, transfiriendo una gran cantidad de material genético
foráneo, infectando un amplio espectro de especies y tipos
celulares, y debido a que son fácilmente empaquetados en líneas
celulares especiales. Los retrovirus pueden ser particularmente
útiles para la administración de Math1 a las células pilosas
del oído interno que tengan una expresión reducida de Math1,
o que tengan necesidad de una sobreexpresión de Math1.
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Ejemplo
17
El marco de lectura abierto (ORF) de
Math1 fue cortado de pBluescript mediante digestión con
EcoRI-XbaI. El fragmento fue purifica en gel y se
hizo de extremos romos utilizando ADN polimerasa Klenow. El vector
retrovírico pLNCX (adquirido a CLONTECH) fue linealizado con
HpaI y ligado en el fragmento del ORF de Math1. La
ligadura fue transformada en células de E. coli competentes
para la transformación. Las colonias resistentes a antibiótico
resultantes fueron analizadas para determinar la presencia de la
construcción correcta.
El clonaje, la reproducción y la propagación de
vectores de expresión retrovíricos son conocidos por los expertos
en la técnica. Un ejemplo de transferencia génica y de un sistema de
expresión retrovíricos que ha sido utilizado para expresar
Math1 está constituido por los vectores de expresión pLNCX,
pLXSN y LAPSN de CLONTECH. Para la propagación de estos vectores
pueden utilizarse las líneas celulares de empaquetamiento PT67 y
EcoPack. Para más información sobre el cultivo de células de
mamífero, pueden utilizarse las referencias generales siguientes:
Culture of Animal Cells, Tercera Edición, editado por R.I. Freshney
(Wiley-Liss, 1993); y Current Protocols in
Molecular Biology, ed. por F.M. Ausubel y col. (Greene Publishing
Associates and Wiley & Sons, 1994), porciones relevantes de las
cuales son incorporadas a la presente por referencia.
En otra realización, estas construcciones
podrían ser construidas con una secuencia de ácido nucleico de
Hath1 o con cualquier secuencia de ácido nucleico asociada
con atonal.
\newpage
Ejemplo
18
Se describe brevemente el mantenimiento de
líneas celulares de empaquetamiento, tales como las líneas celulares
de empaquetamiento 293 y PT67. Un vial de células congeladas es
transferido desde N_{2} líquido a un baño de agua a 37ºC hasta
que se descongela. Con el fin de evitar el choque osmótico a las
células y para maximizar la supervivencia celular, se añade al tubo
1 ml de DMEM (Medio de Eagle Modificado de Dulbecco) y se transfiere
la mezcla a un tubo de 15 ml. Se añaden otros 5 ml de DMEM y se
mezclan las células. Después de repetir estas etapas, el volumen
final en el tubo debe ser de 12 ml aproximadamente. A continuación,
las células son centrifugadas a 500 x g durante 10 minutos.
Finalmente, el sobrenadante es retirado y las células son
resuspendidas en medio de mantenimiento según se describe en la
etapa siguiente. De forma general, las células son mantenidas en
DMEM (con alta concentración de glucosa: 4,5 g/l) conteniendo un 10%
de Suero Bovino Fetal (FBS) y L-glutamina 4 mM. Si
se desea, o si es necesario, pueden añadirse 100 U/ml de
penicilina/100 \mug/ml de estreptomicina. Se recomienda que sean
sembradas a 3-5 x 10^{5} por placa de 100 mm y
pasadas cada 2 ó 3 días, cuando alcanzan un 70-80%
de confluencia (la confluencia es de 3-4 x 10^{6}
por placa de 100 mm). La línea celular PT67, por ejemplo, tiene un
tiempo de duplicación muy corto (<16 horas) y debe ser pasada
antes de que las células sean confluentes. El tiempo de duplicación
de las células EcoPack-293 es de
24-36 horas.
Las células son pasadas eliminando el medio y
lavando las mismas una vez con PBS. Después del tratamiento con
1-2 ml de una solución de
tripsina-EDTA durante 0,5-1 minuto,
se añaden de 5 a 10 ml de medio y suero para detener la
tripsinización. Las células son dispersadas suavemente, pero
exhaustivamente, mediante pipeteo y son resuspendidas.
Alternativamente, una porción predeterminada de las células es
sembrada de nuevo en una placa de 100 mm en ml de medio, seguido
por rotación o agitación de la placa para distribuir las células
uniformemente. Es habitual una proporción de hasta 1:20 para las
células PT67 o EcoPack-293.
En general, el porcentaje de células PT67 o
EcoPack-293 capaz de empaquetar vectores
retrovíricos disminuye lentamente con los pases continuados de la
línea celular. Por tanto, las células de empaquetamiento deben ser
seleccionadas de nuevo después de 2 meses de crecimiento en cultivo.
Alternativamente, pueden adquirirse células nuevas con un título
elevado a, por ejemplo, CLONTECH, o soluciones madre con un bajo
número de pases pueden ser congeladas, almacenadas y descongeladas
para incrementar el rendimiento de virus.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
19
El protocolo siguiente es utilizado para
transfectar el vector retrovírico para la producción de virus, la
infección de células diana y la selección de clones estables. Otros
métodos y vectores pueden ser también utilizados con la presente
invención para expresar Math1, tales como los descritos en
Retroviruses, ed. por J.M. Coffin & H.E. Varmus (1996, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, NY) y Current Protocols in Molecular
Biology, ed. por F.M. Ausubel y col. (1994, Greene Publishing
Associates and Wiley & Sons), que se incorporan a la presente
por referencia.
Brevemente, la transfección del vector
retrovírico en células PT67 fue según sigue. Se clonó Math1
en pLNX según se describió anteriormente en la presente. Las
células de empaquetamiento fueron sembradas a una densidad de
5-7 x 10^{5} células por placa de 100 mm,
12-24 horas antes de la transfección.
Una-dos horas antes de la transfección, el medio
fue sustituido por medio nuevo. Puede añadirse cloroquina 25 \muM
justo antes de la transfección. La cloroquina aumenta la eficacia
de la transfección 2-3 veces. Puede prepararse una
solución madre de cloroquina 25 mM en agua destilada y esterilizarse
por filtración.
Cada placa de 100 mm es transfectada con
10-15 \mug de ADN plasmídico utilizando el método
deseado, empleando, por ejemplo, procedimientos estándar con
fosfato de calcio (Kit de transfección "CalPhos Mammalian
Transfection Kit", #K2050-1). El volumen final
de la mezcla de transfección no debe ser superior a 1 ml. La
solución de transfección es añadida al medio y la placa es rotada
para asegurar una distribución uniforme. Alrededor de 8 horas
después de la transfección, puede realizarse un tratamiento de
choque con glicerol para aumentar la captación de ADN. De 10 a 24
horas después de la transfección, el medio fue retirado y las
células fueron lavadas dos veces con PBS, antes de añadir 5 ml de
DMEM conteniendo un 10% de FBS. El cultivo fue incubado durante
12-48 horas adicionales para permitir el incremento
del título de virus. El título de virus alcanza un máximo de 48
horas después de la transfección y es generalmente al menos un 30%
del máximo entre las 24 y 72 horas después de la transfección.
Alternativamente, pueden seleccionarse también
líneas celulares productoras de virus estables. Para obtener líneas
celulares productoras de virus estables, las células de
empaquetamiento transfectadas son sembradas en un medio de
selección 2-3 días después de la transfección. Para
la selección con G418 de células resistentes a neomicina, las
células son seleccionadas en presencia de G418 (0,5 mg/ml
"activo") durante una semana. Pueden utilizarse también
vectores portadores de otros marcadores seleccionables, tales como
Puro, Bleo o Hyg, para obtener poblaciones de células productoras
de virus estables. Son comunes poblaciones celulares productoras de
viriones que producen títulos de 10^{5}-10^{6}
partículas de virus recombinantes por ml. En general,
10^{5}-10^{6} partículas de virus recombinantes
por ml son adecuadas para la mayoría de los fines. Para algunos
estudios pueden requerirse títulos de clones más elevados. En este
caso, después de la selección con el antibiótico, se seleccionan
clones individuales utilizando, por ejemplo, cilindros para clones o
la dilución limitante, antes de la propagación. El título vírico
puede ser determinado de una variedad de formas; uno de tales
métodos se describe en la presente a continuación. El título vírico
producido por líneas celulares de empaquetamiento productoras de
virus estables o transfectadas de manera transitoria es determinado
según sigue. Células NIH/3T3 son sembradas un día antes de comenzar
el procedimiento de titulación. Las células son sembradas en placas
de 6 pocillos a una densidad de 5 x 10^{4}-1 x
10^{5} células por pocillo y se añaden 4 ml de medio por pocillo.
El medio conteniendo virus es recogido de las células de
empaquetamiento y se añade polibreno a una concentración final de 4
\mug/ml. El medio es esterilizado por filtración a través de un
filtro de 0,45 \mum. El polibreno es un policatión que reduce la
repulsión de cargas entre el virus y la membrana celular. El filtro
debe ser de acetato de celulosa o polisulfónico (baja unión de
proteínas) pero no de nitrocelulosa. La nitrocelulosa se une a las
proteínas de la membrana retrovírica y por consiguiente destruye el
virus. Se preparan diluciones seriadas según sigue: normalmente son
suficientes seis diluciones seriadas de 10 veces. Para diluir el
virus, utilizar medio fresco conteniendo 4 \mug/ml de polibreno. A
continuación, las células diana NIH/3T3 son infectadas mediante la
adición a los pocillos de medio conteniendo virus. Después de 48
horas, las células NIH/3T3 son teñidas. El título de virus
corresponde al número de colonias presentes a la mayor dilución que
contiene colonias, multiplicado por el factor de dilución. Por
ejemplo, la presencia de cuatro colonias en la dilución 10^{5}
representaría un título vírico de 4 x 10^{5}.
Para la infección de las células, se siguió el
procedimiento siguiente. Las células diana fueron sembradas
12-18 horas antes de la infección a una densidad
celular de 3-5 x 10^{5} por placa de 100 mm. Para
la infección de células que pueden ser utilizadas en un ensayo
biológico, las células control pueden ser tratadas con un virus sin
inserto producido bajo condiciones idénticas. La infección
semimáxima tiene lugar generalmente después de 5-6
horas de exposición de las células al virus, teniendo lugar la
infección máxima después de 24 de exposición aproximadamente. La
transcripción inversa y la integración del retrovirus reales tienen
lugar en las 24-36 horas de infección, dependiendo
de la cinética de crecimiento de las células. Puede observarse
expresión a las 24 horas, y alcanza un máximo a las 48 horas
aproximadamente. Alternativamente, las infecciones pueden ser
llevadas a cabo de manera secuencial, separadas 12 horas
aproximadamente. La infección secuencial aumenta generalmente la
eficacia de la infección y también incrementa el número de copias de
virus. Se recomienda un mínimo de 12 horas entre cada infección con
el fin de asegurar que los receptores celulares no estén ocupados
por la envoltura del virus.
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Ejemplo
20
Finalmente, la presente invención proporciona
también métodos para la selección de sustancias candidato que están
basados en ensayos de células completas, en análisis in vivo
y en líneas celulares transformadas o inmortales en las cuales se
emplea un gen informador para conferir a sus huéspedes recombinantes
un fenotipo fácilmente detectable que aparezca únicamente bajo
condiciones en las cuales se expresaría, se subexpresaría o se
sobreexpresaría Math1. En general, los genes informadores
codifican un polipéptido no producido de otro modo por la célula
huésped que es detectable mediante análisis, por ejemplo mediante un
análisis cromogénico, flurométrico, radioisotópico o
espectrofotométrico. En la presente invención, el gen Math1
ha sido sustituido por \beta-galactosidasa en un
ratón.
Se presenta aquí un ejemplo de un ensayo de
selección de la presente invención. Células que expresan
Math1 son cultivadas en pocillos de microvaloración, seguido
por la adición de proporciones molares seriadas de la molécula
candidato pequeña a una serie de pocillos, y la determinación del
nivel de la señal después de un periodo de incubación que sea
suficiente para demostrar, por ejemplo, la expresión de calretinina
en controles incubados únicamente con el vehículo utilizado para
resuspender o disolver el compuesto. Los pocillos que contienen
proporciones variables del candidato son posteriormente evaluados
para detectar la activación de la señal. Los candidatos que
demuestren un incremento relacionado con la dosis de la
transcripción o de la expresión del gen informador, son
posteriormente seleccionados para una evaluación adicional como
agentes terapéuticos clínicos. Puede observarse estimulación de la
transcripción en ausencia de Math1 expresado, en cuyo caso
el compuesto candidato podría ser un estimulante positivo de la
diferenciación de las células pilosas. Alternativamente, el
compuesto candidato podría proporcionar estimulación únicamente en
presencia de bajos niveles de Math1, lo cual sugeriría que
el mismo funciona estabilizando la formación de dímeros de
Math1 o la interacción de Math1 con uno o más factores
de transcripción. Compuestos candidato de cualquiera de las clases
podrían ser agentes terapéuticos útiles que estimularían la
producción de células pilosas del oído interno y satisfarían de
este modo la necesidad de pacientes con pérdida auditiva o con
deterioro del control del equilibrio.
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Ejemplo
21
La presente invención proporciona células
huésped recombinantes transformadas o transfectadas con un
polinucleótido que codifica Math1, así como células
transgénicas derivadas de esas células transformadas o
transfectadas. En otra realización, estas construcciones podrían
ser construidas con una secuencia de ácido nucleico de Hath1
o con cualquier secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal. Una célula huésped recombinante de la presente
invención es transfectada con un polinucleótido que contiene una
secuencia de ácido nucleico de Math1 funcional o un gen
Math1 quimérico. Los métodos para transformar o transfectar
células con polinucleótidos exógenos, tales como moléculas de ADN,
son bien conocidos en el oficio e incluyen técnicas tales como la
transfección mediada por fosfato de calcio o por
DEAE-dextrano, la fusión de protoplastos, la
electroporación, la transfección mediada por liposomas, la
microinyección directa y la infección con adenovirus.
La expresión de Math1 utilizando
construcciones recombinantes puede ser utilizada para dirigir la
administración de Math1 a células que tengan necesidad de
ello. Una persona con experiencia en esta técnica puede elegir
diferentes combinaciones de promotor-vector para
dirigir la expresión de Math1 en diferentes tipos celulares.
En algunos casos, el resultado deseado podría no ser una proteína
sino ARN, y los vectores recombinantes incluirían aquéllos con
insertos presentes en orientación directa o inversa. Además, pueden
diseñarse algunos vectores, por ejemplo retrovirus o sistemas de
recombinación artificiales, con el fin de incorporar secuencias a un
genoma celular o vírico para conseguir la expresión constitutiva o
inducible de una proteína o de ARN.
Muchos de los vectores y huéspedes están
disponibles comercialmente y tienen características específicas que
facilitan la expresión o la purificación posterior. Por ejemplo,
secuencias de ADN que van a ser expresadas como proteínas aparecen
a menudo como una fusión con secuencias no relacionadas que
codifican marcas de polihistidina o HA, FLAG, myc y otras marcas
epitópicas para la purificación y la detección inmunoquímicas, o
sitios de fosforilación, o sitios de reconocimiento de proteasas o
dominios proteicos adicionales tales como glutation
S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa
(MBP) (New England Biolabs), etcétera, que facilitan la
purificación. Pueden diseñarse también vectores que contengan
elementos para poliadenilación, ayuste y terminación, de tal manera
que la incorporación de secuencias de ADN genómico existentes de
forma natural que contengan intrones y exones pueda ser producida y
procesada, o de tal manera que intrones y otras señales reguladoras
no relacionados requieran el procesamiento del ARN antes de la
producción de ARNs maduros, traducibles. Las proteínas producidas
en los sistemas anteriormente descritos son sometidas a una variedad
de modificaciones post-traduccionales tales como
glucosilación, fosforilación, proteolisis o procesamiento
específicos o no específicos.
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Ejemplo
22
Se ha descrito recientemente un péptido (11
aminoácidos) derivado del VIH que cuando es fusionado a proteínas
de longitud completa e inyectado a ratones, permite una dispersión
rápida hacia el núcleo de todas las células del organismo (Schwarze
y col., 1999). Schwarze y col. produjeron proteínas de fusión con
Tat que variaban en tamaño de 15 a 120 kDa. Ellos documentaron una
captación rápida de las proteínas de fusión por los núcleos de las
células de todo el animal y la conservación de la actividad
funcional de dichas proteínas.
En una realización de la presente invención, hay
construcciones que contienen la secuencia de ácido nucleico de
Tat o de Tat-HA unida operativamente a
la secuencia de ácido nucleico de Math1. En otra realización,
estas construcciones incluyen una secuencia de ácido nucleico de
Hath1 o cualquier secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal. Los vectores son expresados en cultivos bacterianos y
la proteína de fusión es purificada. Esta proteína
Tat-Math1 purificada o la proteína
Tat-Hath1 purificada es inyectada al animal para
determinar la eficacia del sistema de administración de Tat al oído
interno, la piel, el cerebelo, el tronco cerebral, la médula
espinal y las articulaciones. Se lleva a cabo un análisis para
determinar el potencial de la proteína
Tat-Math1/Tat-Hath1 en la
regeneración de las células pilosas y en la regeneración neuronal.
Éste es un procedimiento terapéutico viable, por derecho propio o en
asociación con otros métodos o genes.
Debe comprenderse que los métodos para la
selección de compuestos que afectan a la expresión de Math1
descritos en la presente, son útiles a pesar de que no puedan
encontrarse candidatos eficaces, ya que tiene utilidad práctica
para conocer qué efector corriente arriba es necesario para la
transcripción de Math1.
\vskip1.000000\baselineskip
Akazawa, C., Ishibashi, M.,
Shimizu, C., Nakanishi, S. y Kageyama, R.
(1995). A mammalian
helix-loop-helix factor
structurally related to the product of Drosophila proneural gene
atonal is a positive transcriptional regulator expressed in the
developing nervous system. J. Biol. Chem. 270,
8730-8.
Alder, J., Cho, N. y
Hatten, M. (1996). Embryonic precursor cells from the
rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity.
Neuron 17, 389-399.
Altman, J. y Bayer, S.A.
(1996). Development of the Cerebellar System: In Relation to
its Evolution, Structure, and Functions. Boca Raton, Florida:
CRC Press.
Anderson, D.J. (1995). Neural
development. Spinning skin into neurons. Curr. Biol. 5,
1235-8.
Bartholomä, A. y Nave, K.A.
(1994). NEX-1: a novel
brain-specific
helix-loop-helix protein with
autoregulation and sustained expression in mature cortical neurons.
Mech. Dev. 48, 217-28.
Ben-Arie, N.,
Hassan, B.A., Birmingham, N.A., Malicki, D.M.,
Armstrong, D., Matzuk, M., Bellen, H.J. y
Zoghbi, H.Y. (2000). Functional conservation of
atonal and Math 1 in the CNS and PNS. Development 127,
1039-1048.
Ben-Arie, N.,
Bellen, H.J., Armstrong, D.L., McCall, A.E.,
Gordadze, P.R., Guo, Q., Matzuk, M.M. y
Zoghbi, H.Y. (1997). Math 1 is essential for genesis
of cerebellar granule neurons. Nature 390,
169-172.
Ben-Arie, N.,
McCall, A.E., Berkman, S., Eichele, G.,
Bellen, H.J. y Zoghbi, H.Y. (1996).
Evolutionary conservation of sequence and expression of the bHLH
protein Atonal suggests a conserved role in neurogenesis. Human
Molecular Genetics 5, 1207-1216.
Bermingham, N.A., Hassan, B.A.,
Price, S.D., Vollrath, M.A.,
Ben-Arie, N., Eatock, R.A.,
Bellen, H.J., Lysakowski, A. y Zoghbi, H.Y.
(1999). Math 1: An essential gene for the generation of inner
ear hair cells. Science 284, 1837-41.
Bi, W., Deng, J.M., Zhang,
Z., Behringer, R.R. y de Crombrugghe, B.
(1999). Sox9 is required for cartilage formation. Nat.
Genet. 22, 85-9.
Bonnerot, C. y Nicolas, J.F.
(1993). Application of LacZ gene fusions to postimplantation
development. Methods Enzymol. 225,
451-69.
Boyan, G.S. (1993). Another look
at insect audition: the tympanic receptors as an evolutionary
specialization of the chordotonal system. J. Insect Physiol.
39, 187-200.
Brand, A.H. y Perrimon, N.
(1993). Targeted gene expression as a means of altering cell
fates and generating dominant phenotypes. Development 118,
401-15.
Brown, N.L., Kanekar, S.,
Vetter, M.L., Tucker, P.K., Gemza, D.L. y
Glaser, T. (1998), Math5 encodes a murine basic
helix-loop-helix transcription
factor expressed during early stages of retinal neurogenesis.
Development 125, 4821-4833.
Buckwalter, J.A. y Mankin, H.J.
(1998). Articular cartilage: tissue design and
chondrocyte-matrix interactions. Instr. Course
Lect. 47, 477-86.
Chien, C.T., Hsiao, C.D.,
Jan, L.Y. y Jan, Y.N. (1986). Neuronal type
information encoded in the
basic-helix-loop-helix
domain of proneural genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93,
13239-44.
Davis, R.L., Cheng, P.F.,
Lassar, A.B. y Weintraub, H. (1990). The MyoD
DNA binding domain contains a recognition code for
muscle-specific gene activation. Cell 60,
733-46.
Dreller, C. y Kirschner, W.H.
(1993). Hearing in honeybees: localization of the audiotory
sense organ. J. Comp. Physio. A 173,
275-279.
Eberl, D.F. (1999). Feeling the
vibes: chordotonal mechanisms in insect hearing. Curr. Opin.
Neurobiol. 9, 389-393.
Ferguson, B.M., Brockdorff, N.,
Formstone, E., Ngyuen, T., Kronmiller, J.E. y
Zonana, J. (1997). Cloning of Tabby, the murine
homolog of the human EDA gene: evidence for a
membrane-associated protein with a short collagenous
domain. Hum. Mol. Genet. 6, 1589-94.
Fode, C., Gradwohl, G.,
Morin, X., Dierich, A., LeMeur, M.,
Goridis, C. y Guillemot, F. (1998). The bHLH
protein NEUROGENIN 2 is a determination factor for epibranchial
placode-derived sensory neurons. Neuron. 20,
483-94.
Friedrich, G. y Soriano, P.
(1991). Promoter traps in embryonic stem cells: a genetic
screen to identify and mutate developmental genes in mice. Genes
Dev. 5, 1513-23.
Ghysen, A. y
Dambly-Chaudiere, C. (1989). Genesis
of the Drosophila peripheral nervous system. Trends Genet. 5,
251-5.
Gruneberg, H. (1971). The tabby
syndrome in the mouse. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 179,
139-156.
Guillemot, F. (1995). Analysis of
the role of
basic-helix-loop-helix
transcription factors in the development of neural lineages in the
mouse. Biol. Cell. 84, 227-241.
Hatten, M.E. y Heintz, N.
(1995). Mechanisms of neural patterning and specification in
the developing cerebellum. Ann. Rev. Neurosci. 18,
385-408.
Helms, A.W. y Johnson, J.E.
(1998). Progenitors of dorsal commissural interneurons are
defined by MATH1 expression. Development 125,
919-28.
Horton, W.A., Machado, M.A.,
Ellard, J., Campbell, D., Putnam, E.A.,
Aulthouse, A.L., Sun, X. y Sandell, L.J.
(1993). An experimental model of human chondrocyte differentiation.
Prog. Clin. Biol. Res. 383B, 533-40.
Jarman, A.P. y Ahmed, I.
(1998). The specificity of proneural genes in determining
Drosophila sense organ identity. Mech. Dev. 76,
117-25.
Jarman, A.P., Grau, Y.,
Jan, L.Y. and Jan, Y.N. (1993). Atonal is a
proneural gene that directs chordotonal organ formation in the
Drosophila peripheral nervous system. Cell 73,
1307-21.
Kania, A., Salzberg, A.,
Bhat, M., D'Evelyn, D., He, Y., Kiss, I.
y Bellen, H.J. (1995). P-element
mutations affecting embryonic peripheral nervous system development
in Drosophila melanogaster. Genetics 139,
1663-1678.
Karsenty, G. (1998). Genetics of
skeletogenesis. Dev. Genet. 22, 301-13.
Lee, J.E. (1997). Basic
helix-loop-helix genes in neural
development. Curr. Opin. Neurobiol. 7,
13-20.
Lee, K.J., Mendelsohn, M. y
Jessell, T.M. (1998). Neuronal patterning by BMPs: a
requirement for GDF7 in the generation of a discrete class of
commissural interneurons in the mouse spinal cord. Genes Dev.
12, 3394-407.
Liu, X.Y., Dangel, A.W.,
Kelley, R.I., Zhao, W., Denny, P.,
Botcherby, M., Cattanach, B., Peters, J.,
Hunsicker, P.R., Mallon, A.M., Strivens, M.A.,
Bate, R., Miller, W., Rhodes, M., Brown,
S.D. y Herman, G.E. (1999). The gene mutated in bare
patches and striated mice encodes a novel
3beta-hydroxysteroid dehydrogenase. Nat.
Genet. 22, 182-7.
Ma, Q., Chen, Z., Del Barco
Barrantes, I., de la Pompa, J.L. y Anderson, D.J.
(1998). Neurogenin1 is essential for the determination of
neuronal precursors for proximal cranial sensory ganglia.
Neuron. 20, 469-82.
McCormick, M.B., Tamimi, R.M.,
Snider, L., Asakura, A., Bergstrom, D. y
Tapscott, S.J. (1996). NeuroD2 and neuroD3: distinct
expression patterns and transcriptional activation potentials within
the neuroD gene family. Mol. Cell Biol. 16,
5792-800.
McIver, S.B. (1985).
Mechanoreception. In Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry,
and Pharmacology (G.A. Kerkut and L.I. Gilbert, Eds.), pp.
71-132. Oxford: Pergamon Press.
Moulins, M. (1976). Ultrastructure
of chordotonal organs. In Structure and Function of Proprioceptors
in the Invertebrates (P.J. Mill, Ed.), pp. 387-426.
London: Chapman and Hall.
Munger, B.L. (1991). The Biology
of Merkel Cells. In Physiology, Biochemistry, and Molecular Biology
of the Skin, segunda edición (L.A. Goldsmith, Ed.), pp.
836-856. Oxford, R.U.: Oxford University
Press.
Pinkus, F. (1905). Über
Hautsinnesorgane neben dem menschlichen Haar (Haarscheiben) und ihre
verglei chend-anatomische Bedeutung. Arch. mikr
Anat. 65, 121-179.
Poole, C.A. (1997). Articular
cartilage chondrons: form, function and failure. J. Anat.
191, 1-13.
Rodriguez, I., Hernandez, R.,
Modolell, J. y Ruiz-Gomez, M.
(1990). Competence to develop sensory organs is temporally
and spatialli regulated in Drosophila epidermal primordia. Embo
J. 9, 3583-92.
Sambrook, Fritsch,
Maniatis, En: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol. 1,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,
Capítulo 7, 7.19-17.29, 1989.
Schwarze, S.R., Ho, A.,
Vocero-Akbani, A. y Dowdy, S.F.
(1999). In vivo protein transduction: delivery of a
biologically active protein in the mouse. Science 285,
1569-72.
Shimizu, C., Akazawa, C.,
Nakanishi, S. y Kageyama, R. (1995).
MATH-2, a mammalian
helix-loop-helix factor
structurally related to the product of Drosophila proneural gene
atonal, is specifically expressed in the nervous system. Eur. J.
Biochem. 229, 239-48.
Sun, Y., Jan, L.Y. y Jan,
Y.N. (1998). Transcriptional regulation of atonal during
development of the Drosophila peripheral nervous system.
Development 125, 3731-40.
\newpage
Takebayashi, K., Takahashi, S.,
Yokota, C., Tsuda, H., Nakanishi, S.,
Asashima, M. y Kageyama, R. (1997). Conversion
of ectoderm into a neural fate by ATH-3, a
vertebrate basic helix-loop-helix
gene homologous to Drosophila proneural gene atonal. Embo J.
16, 384-95.
Tautz, D. y Pfeifle, C.
(1989). A nonradioactive in situ hybridization method for the
localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals
translation control of the segmentation gene hunchback.
Chromosoma 98, 81-85.
Vaessin, H., Caudy, M.,
Bier, E., Jan, L.Y. y Jan, Y.N. (1990).
Role of helix-loop-helix proteins in
Drosophila neurogenesis. Cold Spring Harb. Symp. Quant.
Biol. 55, 239-45.
van Staaden, M.J. y Römer, H.
(1998). Evolutionary transition from stretch to hearing
organs in ancient grasshoppers. Nature 384,
773-776.
Vielkind, U., Sebzda, M.K.,
Gibson, I.R. y Hardy, M.H. (1995). Dynamics of
Merkel cell patterns in developing hair follicles in the dorsal
skin of mice, demonstrated by a monoclonal antibody to mouse keratin
18. Acta Anat. 152, 93-109.
Yamakado, M. y Yohro, T.
(1979). Subdivision of mouse vibrissae on an embryological
basis, with descriptions of variations in the number and
arrangement of sinus hairs and cortical barrels in BALB/c (nu/+;
nude, nu/nu) and hairless (hr/hr) strains. Am. J. Anat. 155,
153-173.
Zhao, C. y Emmons, S.W.
(1995). A transcription factor controlling development of
peripheral sense organs in C. elegans. Nature 373,
74-78.
Patente de EE.UU. Nº 5.840.873, publicada el 24
de Noviembre de 1998.
Patente de EE.UU. Nº 5.843.640, publicada el 1
de Diciembre de 1998.
Patente de EE.UU. Nº 5.843.650, publicada el 1
de Diciembre de 1998.
Patente de EE.UU. Nº 5.843.651, publicada el 1
de Diciembre de 1998.
Patente de EE.UU. Nº 5.843.663, publicada el 1
de Diciembre de 1998.
Patente de EE.UU. Nº 5.846.708, publicada el 8
de Diciembre de 1998.
Patente de EE.UU. Nº 5.846.709, publicada el 8
de Diciembre de 1998.
Patente de EE.UU. Nº 5.846.717, publicada el 8
de Diciembre de 1998.
Patente de EE.UU. Nº 5.846.726, publicada el 8
de Diciembre de 1998.
Patente de EE.UU. Nº 5.846.729, publicada el 8
de Diciembre de 1998.
Patente de EE.UU. Nº 5.846.783, publicada el 8
de Diciembre de 1998.
Patente de EE.UU. Nº 5.849.481, publicada el 15
de Diciembre de 1998.
Patente de EE.UU. Nº 5.849.483, publicada el 15
de Diciembre de 1998.
Patente de EE.UU. Nº 5.849.486, publicada el 15
de Diciembre de 1998.
Patente de EE.UU. Nº 5.849.487, publicada el 15
de Diciembre de 1998.
Patente de EE.UU. Nº 5.849.497, publicada el 15
de Diciembre de 1998.
Patente de EE.UU. Nº 5.849.546, publicada el 15
de Diciembre de 1998.
Patente de EE.UU. Nº 5.849.547, publicada el 15
de Diciembre de 1998.
Patente de EE.UU. Nº 5.851.770, publicada el 22
de Diciembre de 1998.
Patente de EE.UU. Nº 5.851.772, publicada el 22
de Diciembre de 1998.
Patente de EE.UU. Nº 5.853.990, publicada el 29
de Diciembre de 1998.
Patente de EE.UU. Nº 5.853.993, publicada el 29
de Diciembre de 1998.
Patente de EE.UU. Nº 5.853.992, publicada el 29
de Diciembre de 1998.
Patente de EE.UU. Nº 5.856.092, publicada el 5
de Enero de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.858.652, publicada el 12
de Enero de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.861.244, publicada el 19
de Enero de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.863.732, publicada el 26
de Enero de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.863.753, publicada el 26
de Enero de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.866.331, publicada el 2
de Febrero de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.866.336, publicada el 2
de Febrero de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.866.337, publicada el 2
de Febrero de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.900.481, publicada el 4
de Mayo de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.905.024, publicada el 18
de Mayo de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.910.407, publicada el 8
de Junio de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.912.124, publicada el 15
de Junio de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.912.145, publicada el 15
de Junio de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.912.148, publicada el 15
de Junio de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.916.776, publicada el 29
de Junio de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.916.779, publicada el 29
de Junio de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.919.626, publicada el 6
de Julio de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.919.630, publicada el 6
de Julio de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.922.574, publicada el 13
de Julio de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.925.517, publicada el 20
de Julio de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.925.525, publicada el 20
de Julio de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.928.862, publicada el 27
de Julio de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.928.869, publicada el 27
de Julio de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.928.870, publicada el 27
de Julio de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.928.905, publicada el 27
de Julio de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.928.906, publicada el 27
de Julio de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.929.227, publicada el 27
de Julio de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.932.413, publicada el 3
de Agosto de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.932.451, publicada el 3
de Agosto de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.935.791, publicada el 10
de Agosto de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.935.825, publicada el 10
de Agosto de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.939.291, publicada el 17
de Agosto de 1999.
Patente de EE.UU. Nº 5.942.391, publicada el 24
de Agosto de 1999.
Solicitud Europea Nº 320 308.
Solicitud Europea Nº 329 822.
Solicitud del R.U. Nº 2 202 328.
Solicitud PCT Nº PCT/US87/00880.
Solicitud PCT Nº PCT/US89/01025.
Solicitud PCT WO 88/10315.
Solicitud PCT WO 89/06700.
Solicitud PCT WO 90/07641.
Una persona experta en la técnica apreciará
fácilmente que la presente invención está bien adaptada para llevar
a cabo los objetivos y obtener los fines y ventajas mencionados así
como aquéllos inherentes a la misma. Las secuencias, mutaciones,
complejos, métodos, tratamientos, composiciones farmacéuticas,
procedimientos y técnicas descritos en la presente son actualmente
representativos de las realizaciones preferidas y tienen la
intención de ser ejemplares y no están destinados a ser
limitaciones de su alcance.
Claims (26)
1. Una secuencia de aminoácidos o una secuencia
de ácido nucleico asociada con atonal para estimular el
crecimiento terapéutico de las células mecanorreceptoras del oído
interno en un animal, donde dicha secuencia de aminoácidos asociada
con atonal tiene, o dicha secuencia de ácido nucleico
asociada con atonal codifica, un polipéptido que tiene al
menos un 80% de identidad con la secuencia
AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
2. Una secuencia de aminoácidos o una secuencia
de ácido nucleico asociada con atonal para la generación
terapéutica de células pilosas del oído interno, donde dicha
secuencia de aminoácidos asociada con atonal tiene, o dicha
secuencia de ácido nucleico asociada con atonal codifica, un
polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia
AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
3. Una secuencia de aminoácidos o una secuencia
de ácido nucleico asociada con atonal para el tratamiento de
un animal con deterioro auditivo, donde dicha secuencia de
aminoácidos asociada con atonal tiene, o dicha secuencia de
ácido nucleico asociada con atonal codifica, un polipéptido
que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia
AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
4. La secuencia de aminoácidos o de ácido
nucleico de la reivindicación 2 ó 3 que es formulada para inyección
en el oído de dicho animal.
5. Una secuencia de aminoácidos o una secuencia
de ácido nucleico asociada con atonal para el tratamiento de
un animal con un trastorno del equilibrio, donde dicha secuencia de
aminoácidos asociada con atonal tiene, o dicha secuencia de
ácido nucleico asociada con atonal codifica, un polipéptido
que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia
AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
6. Una secuencia de aminoácidos o una secuencia
de ácido nucleico asociada con atonal para el tratamiento de
un animal con una enfermedad de las articulaciones, donde dicha
secuencia de aminoácidos asociada con atonal tiene, o dicha
secuencia de ácido nucleico asociada con atonal codifica, un
polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia
AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
7. La secuencia de aminoácidos o de ácido
nucleico de la reivindicación 6 en la que dicha enfermedad de las
articulaciones es osteoartritis.
8. La secuencia de aminoácidos o de ácido
nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que es
formulada para ser administrada mediante un vehículo para la
administración.
9. La secuencia de aminoácidos o de ácido
nucleico de la reivindicación 8, donde dicho vehículo para la
administración es seleccionado de un vector adenovírico, un vector
retrovírico, un vector vírico adenoasociado, un plásmido, un
liposoma, un ácido nucleico, un péptido, un lípido, un carbohidrato
y una combinación de los mismos.
10. La secuencia de aminoácidos o de ácido
nucleico de la reivindicación 8, en la que dicho vehículo para la
administración es un vector vírico o un vector no vírico.
11. La secuencia de aminoácidos o de ácido
nucleico de la reivindicación 8, en la que dicho vehículo para la
administración es una célula.
12. La secuencia de aminoácidos o de ácido
nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que es la
secuencia de aminoácidos o la secuencia de ácido nucleico de
Math1 o Hath1.
13. La secuencia de aminoácidos o de ácido
nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde dicho
animal es un humano.
14. La secuencia de aminoácidos o de ácido
nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, la cual está
destinada para ser administrada después, antes o al mismo tiempo que
la administración de una segunda secuencia de ácido nucleico que
codifica otro producto génico terapéutico.
15. Una composición que contiene una secuencia
de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico asociada con
atonal en combinación con un vector vírico como vehículo para
la administración, donde dicho vehículo para la administración
tiene como resultado la administración de una cantidad
terapéuticamente eficaz de dicha secuencia de aminoácidos asociada
con atonal o de dicha secuencia de ácido nucleico asociada
con atonal a una célula, y donde dicha secuencia de
aminoácidos asociada con atonal es, o dicha secuencia de
ácido nucleico asociada con atonal codifica, un polipéptido
que contiene al menos un 80% de identidad con la secuencia
AANARERRRMH-
GLNHAFDQLR.
GLNHAFDQLR.
16. La composición de la reivindicación 15, en
la que dicho vehículo para la administración es seleccionado de un
vector adenovírico, un vector retrovírico, un vector adenoasociado o
una combinación de los mismos.
\newpage
17. Una composición que contiene:
- (a)
- una secuencia de aminoácidos asociada con atonal en combinación con un vehículo para la administración, conteniendo dicho vehículo para la administración un dominio de unión al receptor de una toxina bacteriana o un dominio de transducción de una proteína, y donde dicho vehículo para la administración tiene como resultado la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha secuencia de aminoácidos asociada con atonal a una célula, y donde dicha secuencia de aminoácidos asociada con atonal es un polipéptido que contiene al menos un 80% de identidad con la secuencia AANARERRRMHGLNHAFDQLR; o
- (b)
- una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha secuencia de aminoácidos asociada con atonal y dicho vehículo para la administración.
18. La composición de la reivindicación 17, en
la que una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha secuencia
de aminoácidos asociada con atonal está unida operativamente
a una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de unión
al receptor de una toxina bacteriana.
19. La composición de la reivindicación 17, en
la que una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha secuencia
de aminoácidos asociada con atonal está unida operativamente
a una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de
transducción de una proteína.
20. Una proteína de fusión que comprende una
secuencia de aminoácidos asociada con atonal o un fragmento
de la misma y una secuencia de aminoácidos deseada, donde dicha
secuencia de aminoácidos asociada con atonal es una
secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad con
la secuencia AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
21. Una secuencia de ácido nucleico que codifica
la proteína de fusión de la reivindicación 20.
22. Utilización de una secuencia de aminoácidos
o de una secuencia de ácido nucleico asociada con atonal
para la fabricación de un medicamento para estimular el crecimiento
terapéutico de las células mecanorreceptoras del oído interno de un
animal, donde dicha secuencia de aminoácidos asociada con
atonal tiene, o dicha secuencia de ácido nucleico asociada
con atonal codifica, un polipéptido que tiene al menos un 80%
de identidad con la secuencia AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
23. Utilización de una secuencia de aminoácidos
o de una secuencia de ácido nucleico asociada con atonal
para la fabricación de un medicamento para la generación terapéutica
de células pilosas del oído interno, donde dicha secuencia de
aminoácidos asociada con atonal tiene, o dicha secuencia de
ácido nucleico asociada con atonal codifica, un polipéptido
que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia
AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
24. Utilización de una secuencia de aminoácidos
o de una secuencia de ácido nucleico asociada con atonal
para la fabricación de un medicamento para tratar a un animal del
deterioro auditivo, donde dicha secuencia de aminoácidos asociada
con atonal tiene, o dicha secuencia de ácido nucleico
asociada con atonal codifica, un polipéptido que tiene al
menos un 80% de identidad con la secuencia
AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
25. Utilización de una secuencia de aminoácidos
o de una secuencia de ácido nucleico asociada con atonal
para la fabricación de un medicamento para tratar a un animal de un
trastorno del equilibrio, donde dicha secuencia de aminoácidos
asociada con atonal tiene, o dicha secuencia de ácido
nucleico asociada con atonal codifica, un polipéptido que
tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia
AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
26. Utilización de una secuencia de aminoácidos
o de una secuencia de ácido nucleico asociada con atonal
para la fabricación de un medicamento para tratar a un animal de una
enfermedad de las articulaciones, donde dicha secuencia de
aminoácidos asociada con atonal tiene, o dicha secuencia de
ácido nucleico asociada con atonal codifica, un polipéptido
que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia
AANARERRRMHGLNHAFDQLR.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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- 2000-06-01 SI SI200031065T patent/SI1471926T1/sl unknown
- 2000-06-01 ES ES00941220T patent/ES2355490T3/es not_active Expired - Lifetime
Also Published As
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