CN101400806A - 突变基因的检测方法 - Google Patents
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Abstract
公开了核酸序列突变的检测方法,其特征在于,使用从3’末端开始的第2位的核苷酸为带有能够阻止核酸合成反应的修饰的核苷酸的寡核苷酸或其盐作为引物,以样品中的核酸作为模板进行核酸扩增反应,然后检测反应产物;还公开了用于该方法的试剂盒。由于根据本发明能够完全抑制判定的假阳性,另外,由于通过1次PCR反应可以对应多种的突变模式,所以通过多重PCR,组成可一次检测多个可能的基因突变的耐药性判定系统成为可能。
Description
技术领域
本发明涉及基因序列中突变的特异性检测方法以及方法中使用的试剂盒。
背景技术
例如人,易患病、药物易见效、易出副作用等个体间不同的原因之一有时与基因的突变(基因的碱基多态性)有关。因此着眼于这样的基因序列的差异,正在探讨适合体质的治疗法的研究。另外,基因的碱基多态性也可成为很多疾病的遗传标志。因此这些碱基多态性的阐明在临床上很重要,期待确立能够检测各种各样的突变型基因的核酸序列分析法以及这些碱基多态性的鉴定法。
另外,在感染症的诊断领域中,有时感染起因菌通过基因突变而获得耐药性。因此为了判定自患者检出的菌是否获得了对该药物的耐性,对从患者检出的菌的基因突变进行检测,这在诊断法上以及选择治疗法上特别重要。
例如,已阐明人型结核菌(结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis))的利福平耐性的获得与编码分枝杆菌(Mycobacterium)属的RNA聚合酶B亚基的rpoB基因(RNA polymerase B subunit)的突变有关,在约95%利福平耐性结核菌中观察到rpoB基因中的突变。因此如果检测该基因并判定有无基因突变,就可以判断该结核菌是否有利福平耐性。
另外,对于与结核菌的利福平耐性相关的rpoB基因上的突变,已报告了多个模式(VIVEK KAPUR等人,J.Clin.Microbiol.,1994,p1095-1098))。因此如果能够同时检测多个突变基因,预期可以提高诊断的准确度和通量(在一定期间能够处理的信息的量)。
对于结核菌还研究了其它的与耐药性有关的基因的突变,各种各样的突变的样式正变得明朗。
作为有效检测突变的其它例子,如MRSA的检测。即,由于二甲氧基苯青霉素耐性葡萄球菌(MRSA)带有mec基因,所以如果检测mec基因,就了解了它的耐性(能够检测MRSA)。
然而为了检测点突变或单碱基多态性等突变基因的存在,由于必须要检测庞大的基因组碱基序列中仅有的一个碱基的差别,所以要求非常高的特异性。
作为现有的一般性的核酸序列分析技术,已知例如核酸序列确定法(测序法)、TaqManTM探针法(Genome Res.,第6卷,第986页,1996)、RFLP(限制酶酶切片段长度多态性)法(J.Clin.Invest.,第72卷,第1262页,1983)、ASP(等位基因特异的引物)法(WO01/42498号)、ASO(等位基因特异的寡探针(oligoprobe))法(Nature,第324卷,第163页,1986)、单碱基延伸法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第94卷,第10756页,1997)、焦磷酸测序法(Analytical Biochemistry,第244卷,第367页,1997)、InvaderTM法(Nature Biotech.,第17卷,第292页,1999)等。
这些方法中,核酸序列确定法、TaqManTM探针法、RFLP法、ASO法、单碱基延伸法、焦磷酸测序法等是预先要利用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)等核酸扩增技术对含有突变或多态性的区域扩增之后进行检测的方法。因此,首先获得特异的扩增产物对于降低背景、获得鲜明的信号非常重要。
另外,InvaderTM法从原理上讲是即使不进行扩增反应也能检测突变或多态性的方法。然而,即使不进行扩增反应进行检测,往往是灵敏度不够,实际上与别的方法同样,预先对要检测的测定对象的核苷酸进行特异的扩增是重要的。
进一步地,ASP法是使用由约20碱基组成的对突变DNA特异的寡核苷酸和成为模板的DNA进行PCR,对突变等位基因进行特异扩增后,进行凝胶电泳,检测突变等位基因带存在的方法。该方法是适于有效检查多个检体的方法。
然而,包括ASP法在内的上述那样的现有利用PCR的方法中,即使在引物中存在错配,有时也可得到引物延伸产物,由于难于得到特异的扩增产物,所以存在着检测的严密性问题。
另外,基于在自3’末端开始的第2位具有SNP部位的多态性特异引物可正确区分多态性的见解而对ASP法进行了改变的方法中,有使用自3’末端开始的第2位带有并不与对象基因互补的碱基的核苷酸,在3’末端设定希望检测的多态性部分的引物的方法。据报告,该方法与使用自3’末端开始的第2位带有与对象基因互补的碱基的核苷酸的引物的情况相比,可改善3’末端存在的多态性部位的检测(非专利文献1)。然而在使用该方法的场合,即使在引物的3’末端存在错配,有时也可得到引物延伸产物,所以存在着检测准确度的问题。
进一步地,将寡核苷酸的核苷酸序列的3’末端配置为多态性部位,作为从3’末端开始的第3位核苷酸使用2’-0,4’-C-亚乙基核苷酸单元的寡核苷酸作为引物使用的方法也有报道(专利文献1)。
在该文献中,使用从3’末端开始的第3位核苷酸是2’-0,4’-C-亚乙基核苷酸单元的与野生型序列互补的引物(专利文献1的实施例1)、和同样从3’末端开始的第3位核苷酸是2’-0,4’-C-亚乙基核苷酸单元的与突变型序列互补的引物(专利文献1的实施例2),以野生型样品为模板进行PCR(专利文献1的试验例1)。此时对于使用与来自野生型DNA序列互补的引物的情况,确认了基因被扩增,而对于使用与突变型序列互补的引物的情况,不能确认基因被扩增。由此可以说根据该文献,通过该方法可以选择性地扩增基因。
然而,仅就上述那样的结果来说,还不能断定与野生型序列互补的该引物对野生型的检测是特异的。即,使用与野生型序列互补的引物,以来自野生型的DNA样品作为模板进行PCR时,可得到引物延伸产物,而使用同样的引物,以来自突变型的DNA样品为模板进行PCR时不能得到引物延伸产物,如果不是这一结果,则不能证明该引物能够特异地检测野生型。
实际上,在该方法中使用“扩增突变型的引物”对野生型基因的样品进行PCR时,存在着可得到引物延伸产物(假阳性的出现)的问题。即,使用该引物对于是野生型还是突变型不明的样品进行PCR,即使得到引物延伸产物,也存在着不能判定该样品是野生型还是突变型的问题。
出现上述问题的原因认为出自以下的理由。即,PCR中使用的耐热性DNA聚合酶既具有5’→3’聚合酶活性,又具有3’→5’外切核酸酶活性。因此当扩增突变型的引物与含有野生型基因的样品结合时,与配置在引物的3’末端的突变核苷酸基因相同或与它互补的核苷酸碱基在PCR阶段被耐热性DNA聚合酶所具有的3’→5’外切核酸酶活性切断了。因此,这个引物的3’末端完全识别本来不应当识别的野生型样品的基因序列,由于DNA聚合酶的作用开始进行从引物序列开始的延伸反应。其结果是,尽管的确使用了扩增突变型的引物,但由于以含有野生型基因的样品作为模板进行了PCR、得到了引物延伸产物这样的可以认为是产生非特异扩增的原因。
另外,一般所谓的特异性被定义为将阴性判定为阴性的能力。因此,作为在利用核酸扩增反应的突变或多态性的解析中使特异性提高的方法,可考虑抑制非特异的扩增(假阳性出现)的方法。作为用于此目的的手段,可考虑扩增条件(提高退火温度、减少循环数、减少酶量、变更酶的种类、减少dNTP浓度、减少Mg浓度、减少模板DNA浓度等)的最适化、引物设计的变更、利用抗体或适配子的热启动法的利用、作为特异性提高的修饰寡核苷酸(PNA和LNA等)的利用等。然而这些手段虽然有时对非特异扩增的抑制有效,但存在着效果不明显,往往连特异的扩增都被抑制等各种各样的缺点。
由以上事实可看到现在处于希望确立排除假阳性的特异性高的检测核酸序列突变的方法的现状。
【专利文献1】特开2005-323583号公报
【专利文献2】特开平5-271224号公报
【非专利文献1】Bloorganic&Medical Chemistrv,2003年,第11卷,p.2211-2226
【非专利文献2】VIVEK KAPUR等人,J.Clin.Microbiol.,第32卷,第4期,1994,p1095-1098
【非专利文献3】Koji Morita等人,Bioorganic & MedicinalChemistry Letters,第12卷,2002,p.73-76
发明内容
发明要解决的课题
本发明以提供特异性提高的基因序列中的突变的检测方法和基因多态性检测用试剂盒为课题。
用于解决课题的手段
本发明正是以解决上述课题为目的而做成的,包含下述(I)和(II)的组成。
(I)核酸序列突变的检测方法,其特征在于,以使用下述(a)~(d)中任一项所述的寡核苷酸或其盐作为引物,以样品中的核酸作为模板进行核酸扩增反应,检测反应产物,
(a)i)在3’末端部位具有与对象基因的突变核苷酸相同的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列相同,具有与可能存在上述突变核苷酸的上述对象基因上的位置5’侧的对象基因的核苷酸序列相同的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐,
(b)i)在3’末端部位具有与对象基因的突变核苷酸互补的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列互补,具有与可能存在上述突变核苷酸的上述对象基因上的位置3’侧的对象基因的核苷酸序列互补的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐,
(c)i)在3’末端部位具有与对象基因的基准核苷酸相同的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列相同,具有与上述基准核苷酸在上述对象基因上的位置5’侧的对象基因的核苷酸序列相同的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐,
(d)i)在3’末端部位具有与对象基因的基准核苷酸互补的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列互补,具有与上述基准核苷酸在上述对象基因上的位置3’侧的对象基因的核苷酸序列互补的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐。
(II)核酸序列突变的检测用试剂盒,其包含下述(a)~(d)中任一项所述的寡核苷酸或其盐作为引物
(a)i)在3’末端部位具有与对象基因的突变核苷酸相同的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列相同,具有与可能存在上述突变核苷酸的上述对象基因上的位置5’侧的对象基因的核苷酸序列相同的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐,
(b)i)在3’末端部位具有与对象基因的突变核苷酸互补的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列互补,具有与可能存在上述突变核苷酸的上述对象基因上的位置3’侧的对象基因的核苷酸序列互补的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐,
(c)i)在3’末端部位具有与对象基因的基准核苷酸相同的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列相同,具有与上述基准核苷酸在上述对象基因上的位置5’侧的对象基因的核苷酸序列相同的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐、(d)i)在3’末端部位具有与对象基因的基准核苷酸互补的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列互补,具有与上述基准核苷酸在上述对象基因上的位置3’侧的对象基因的核苷酸序列互补的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐。
本发明者进行了有关基因突变的检测方法的要解决如上述那样的现有问题的研究。研究结果表明通过在3’末端设计基因突变位点,再于自3’末端开始的第2位设计配置了带有能够阻止核酸合成反应的修饰的核苷酸(有时也称为核苷酸类似物)的寡核苷酸。然后当使用该寡核苷酸作为PCR引物时,可以完全解决如上所述的例如由于PCR使用的DNA聚合酶的3’→5’外切核酸酶活性引起的1碱基缺失发生时导致模板的误读等问题,抑制成为假阳性的引物延伸产物的出现,使得高准确度的基因突变检测成为可能,从而完成了本发明。
发明的效果
本发明的检测方法可以在例如结核症诊断(治疗)中认为必须进行的菌的耐性研究的药物感受性试验中利用。特别是通过利用在线(in-Line)(芯片上(On chip)PCR系统)的分离检测法,在1个试管(1个系统)内作为基因诊断项目可以同时进行结核菌和非结核性抗酸菌症的基因诊断与耐药性判定方面有很大的效果。
特别是在结核菌中,90~95%的利福平耐性菌中存在rpoB的突变。因此如果实施本发明的检测方法,可以在短时间内检测出患者结核菌的突变。如果那样操作的话,对于患者是否感染利福平耐性菌可以迅速进行判定、处理。另外通过本发明可以一次对利福平耐性菌中rpoB基因上的多个突变的可能性进行检测、判定。
附图的简单说明
【图1】是实施例1得到的使用引物rpoB_2、以含有突变型rpoB基因序列_2的质粒DNA作为模板通过使用嵌入剂法进行的实时PCR的结果为基础得到的熔解曲线分析的结果。
【图2】是实施例1得到的使用引物rpoB_2、以含有野生型rpoB基因序列的质粒DNA作为模板通过使用嵌入剂法进行的实时PCR的结果为基础得到的熔解曲线分析的结果。
【图3】是比较例1得到的使用引物rpoB_2_n3、以含有突变型rpoB基因序列2的质粒DNA作为模板通过使用嵌入剂法进行的实时PCR的结果为基础得到的熔解曲线分析的结果。
【图4】是比较例1得到的使用引物rpoB_2_n3、以含有野生型rpoB基因序列的质粒DNA作为模板通过使用嵌入剂法进行的实时PCR的结果为基础得到的熔解曲线分析的结果。
【图5】是实施例2得到的使用引物rpoB_6、以含有突变型rpoB基因序列_6的质粒DNA作为模板通过使用嵌入剂法进行的实时PCR的结果为基础得到的熔解曲线分析的结果。
【图6】是实施例2得到的使用引物rpoB_6、以含有野生型rpoB基因序列的质粒DNA作为模板通过使用嵌入剂法进行的实时PCR的结果为基础得到的熔解曲线分析的结果。
【图7】是实施例3得到的使用引物rpoB_2、引物rpoB_3和引物rpoB_4的混合引物、以含有突变型rpoB基因序列_2的质粒DNA作为模板通过使用嵌入剂法进行的实时PCR的结果为基础得到的熔解曲线分析的结果。
【图8】是实施例3得到的使用引物rpoB_2、引物rpoB_3和引物rpoB_4的混合引物、以含有突变型rpoB基因序列3的质粒DNA作为模板通过使用嵌入剂法进行的实时PCR的结果为基础得到的熔解曲线分析的结果。
【图9】是实施例3得到的使用引物rpoB_2、引物rpoB_3和引物rpoB_4的混合引物、以含有突变型rpoB基因序列4的质粒DNA作为模板通过使用嵌入剂法进行的实时PCR的结果为基础得到的熔解曲线分析的结果。
【图10】是比较例2得到的使用引物rpoB_2、引物rpoB_3和引物rpoB_4的混合引物、以含有野生型rpoB基因序列的质粒DNA作为模板通过使用嵌入剂法进行的实时PCR的结果为基础得到的熔解曲线分析的结果。
用于实施发明的最佳方式
本发明所涉及的核酸序列突变的检测方法是这样的核酸序列突变的检测方法,其特征在于,以使用下述(a)~(d)中任一项所述的寡核苷酸或其盐作为引物,以样品中的核酸作为模板进行核酸扩增反应,检测反应产物,
(a)i)在3’末端部位具有与对象基因的突变核苷酸相同的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列相同,具有与可能存在上述突变核苷酸的上述对象基因上的位置5’侧的对象基因的核苷酸序列相同的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐,
(b)i)在3’末端部位具有与对象基因的突变核苷酸互补的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列互补,具有与可能存在上述突变核苷酸的上述对象基因上的位置3’侧的对象基因的核苷酸序列互补的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐,
(c)i)在3’末端部位具有与对象基因的基准核苷酸相同的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列相同,具有与上述基准核苷酸在上述对象基因上的位置5’侧的对象基因的核苷酸序列相同的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐、
(d)i)在3’末端部位具有与对象基因的基准核苷酸互补的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列互补,具有与上述基准核苷酸在上述对象基因上的位置3’侧的对象基因的核苷酸序列互补的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐。
本发明中,作为“核酸序列突变”可列举例如“基因多态性”。所谓“基因多态性”,以该领域中所使用的通常的意义使用,也称为SNP(单核苷酸多态性:single nucleotide polymorphism)。
具体来说,例如在某个基因中,可以列举其中的1个碱基置换为其它碱基的单碱基置换、1个碱基缺失的单碱基缺失、1个碱基插入的单碱基插入等。
另外,在本发明中,所谓突变和碱基多态性指的是具有与野生型不同的核酸序列。一般将频率不到1%的称为突变、1%以上的称为多态性,这里并不试图严格区分使用。
作为本发明所涉及的“对象基因”,是成为检测核酸序列突变的对象的基因,可以列举其核苷酸序列中的至少一部分已知,而且存在其核苷酸序列的突变的基因。具体来说,可以列举例如人型结核菌的rpoB基因(非专利文献2)、细胞色素P4501A2、细胞色素P4502A6、细胞色素P4502C9、细胞色素P4502C19、细胞色素P4502D6、细胞色素P4502E1、硫代嘌呤转甲基酶、N-乙酰转移酶、UDP-葡糖醛酸基转移酶、谷胱甘肽S转移酶、HLA、TCRα、APOE4、多巴胺D3受体、色氨酸羟化酶、血管紧张肽前体、血液凝固因子VII、瘦蛋白(leptin)等基因。
另外,对基因中的突变数没有特别限定。
在本发明中,将没引起突变(置换)、缺失、插入等本发明中的“核酸序列突变”的核苷酸序列(例如,野生型菌的基因的核苷酸序列等)称为“基准序列”。而该基准序列中的可能引起突变的部位的核苷酸称为“基准核苷酸”。而所谓“突变核苷酸”指的是相对于基准序列引起了突变的序列中突变部分的核苷酸。
本发明中所谓“互补的核苷酸”以通常在该领域中使用的意思来使用。即,指的是构成该核苷酸的核酸碱基与成为对象的核苷酸的碱基互补的核苷酸。
另外,在本发明中有时将构成核苷酸的核酸碱基以在本发明的领域中通常使用的缩略号表示(腺嘌呤表示为“A”、鸟嘌呤表示为“G”、胞嘧啶表示为“C”、胸腺嘧啶表示为“T”)。
作为本发明所涉及的“寡核苷酸或其盐”中的“盐”,例如与钠、钾、锂等碱金属形成的盐;与钙、镁等碱土类金属形成的盐;与铝、铁、锌、铜、镍、钴等金属形成的盐;铵盐等无机盐;与叔辛胺、二苄胺、吗啉、乙二胺、N-甲基葡糖胺、胍、二乙胺、三乙胺、二环己胺、N,N’-二苄基乙二胺、氯代普鲁卡因、普鲁卡因、二乙醇胺、N-苄基-苯乙胺、哌嗪、四甲基铵、三羟甲基氨基甲烷等胺形成的盐等有机酸盐;以及与甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸形成的盐等。
在本发明中涉及的“带有能够阻止核酸合成反应的修饰的核苷酸”中,所谓“带有能够阻止核酸合成反应的修饰”指的是例如代替构成核苷酸的通常的2-脱氧-D-核糖,而使用“能够阻止核酸合成反应的”构造的例如核糖衍生物或氧杂环丁烷衍生物。并且,当使用3’末端结合有这样的修饰的核苷酸或其盐的寡核苷酸作为引物,进行下面的核酸扩增反应时,所述修饰的核苷酸或其盐能够阻止核酸合成反应,从而不能得到复制物(扩增产物)。
作为本发明所涉及的“带有能够阻止核酸合成反应的修饰的核苷酸”的具体例子,可以列举例如用下式[I]
(式中,B表示核酸碱基,R1表示氧原子、-NH-基或低级亚烷基,R2表示氢原子或低级亚烷基。)
或下式[II]
(式中,B代表核酸碱基,R3代表氧原子、氮原子、-NH-基、或低级亚烷基。)
表示的核苷酸衍生物。
在上述式[I]和式[II]中,作为以R1、R2和R3表示的低级亚烷基,可以列举亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基(可以是直链状、分支状或环状中的任一种)。
本发明所涉及的以式[I]表示的带有能够阻止核酸合成反应的修饰的核苷酸的具体例子如下述表1所示。
【表1】
另外,本发明所涉及的以式[II]表示的带有能够阻止核酸合成反应的修饰的核苷酸的具体例子如下述表2所示。
【表2】
本发明所涉及的以式[I]表示的“带有能够阻止核酸合成反应的修饰的核苷酸”可以根据例如Koji Morita等人,Bioorganic & MedicinalChemistry Letters,第12卷,2002,p.73-76(非专利文献3)所述的合成方法,使用适当的材料进行合成。另外,2′-O,4′-C-亚乙基桥接的核酸(ENA)还有市售品,也可以使用市售品。
另外本发明所涉及的以式[II]表示的“带有能够阻止核酸合成反应的修饰的核苷酸”可以根据例如特开平5-271224号公报(专利文献2)所述的含有氧杂环丁烷环的核苷酸衍生物的合成方法,用适当的材料合成。
另外,本发明所涉及的“带有能够阻止核酸合成反应的修饰的核苷酸”只要是具有上述那样性质的核苷酸,无论那种都可以使用,并不限定于上述表1和表2表示的核苷酸。
作为本发明所涉及的引物,可以列举
(a)i)在3’末端部位具有与对象基因的突变核苷酸相同的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列相同,具有与可能存在上述突变核苷酸的上述对象基因上的位置5’侧的对象基因的核苷酸序列相同的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐(以下有时称为“引物a”。),
(b)i)在3’末端部位具有与对象基因的突变核苷酸互补的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列互补,具有与可能存在上述突变核苷酸的上述对象基因上的位置3’侧的对象基因的核苷酸序列互补的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐(以下有时称为“引物b”。),
(c)i)在3’末端部位具有与对象基因的基准核苷酸相同的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列相同,具有与上述基准核苷酸在上述对象基因上的位置5’侧的对象基因的核苷酸序列相同的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐(以下有时称为“引物c”。),或
(d)i)在3’末端部位具有与对象基因的基准核苷酸互补的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列互补,具有与上述基准核苷酸的上述对象基因上的位置3’侧的对象基因的核苷酸序列互补的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的寡核苷酸或其盐(以下有时称为“引物d”。)。
本发明所涉及的引物,例如如果以设计引物a的情况为例,可以设计除了使与检测对象的基因突变(例如基因多态性)有关的突变核苷酸配置在3’末端,作为从3’末端开始的第2位核苷酸配置如上所述的带有能够阻止核酸合成反应的修饰的核苷酸以外,寡核苷酸包含与检测对象的突变核苷酸存在的上述对象基因上的位置5’侧的上述对象基因的核苷酸序列相同的核酸序列的部分或全部,在考虑了解离温度(Tm值)等之后,设计适当区域的适当长度的序列。
当设计引物b时,与检测对象的基因(例如基因多态性)的突变核苷酸互补的核苷酸配置在3’末端,除此以外的寡核苷酸部分是含有与检测对象的突变核苷酸可能存在的上述对象基因上的位置3’侧的上述对象基因的核苷酸序列互补的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸,其从3’末端开始的第2位核苷酸为如上所述带有能够阻止核酸合成反应的修饰的核苷酸的该寡核苷酸中,在考虑到解离温度(Tm值)等因素之后,设计适当区域的适当长度的核苷酸序列。
另外当设计引物c时,使与“对象基因上的可引起突变的部位的基准核苷酸”相同的核苷酸配置在3’末端部位,3’末端部位以外的部位作为与对象基因的核苷酸序列(基准序列)相同的序列,具有与上述对象基因上的基准核苷酸的某个位置5’侧的对象基因的核苷酸序列相同的序列,并且从3’末端开始的第2位核苷酸是带有能够阻止核酸合成反应的修饰的寡核苷酸中,在考虑了解离温度(Tm值)等之后,设计适当区域的适当长度的核苷酸序列。
另外,当设计引物d时,使与“对象基因上的可引起突变的部位的基准核苷酸”互补的核苷酸配置在3’末端部位,3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列(基准序列)互补,具有与上述基准核苷酸在上述对象基因上的位置3’侧的对象基因的核苷酸序列互补的序列,并且从3’末端开始的第2位核苷酸为带有能够阻止核酸合成反应的修饰的寡核苷酸中,在考虑了解离温度(Tm值)等之后,设计适当区域的适当长度的核苷酸序列。
作为本发明所涉及的引物的长度,考虑到用于维持作为引物序列的特异性必需的碱基数,优选具有10碱基以上、更优选具有20碱基以上长度的引物序列。例如包含15~30碱基的引物序列。
为了获得本发明所涉及的引物,有望通过使用用上述方法得到的本发明所涉及的带有能够阻止核酸合成反应的修饰的核苷酸和通常的核苷酸,运用本身公知的化学合成法进行制备。通过该方法可以容易、大量而且低成本地获得恒定品质的寡核苷酸。
例如,通过使用在DNA的合成中通常应用的DNA合成仪、运用通常的亚磷酰胺法合成寡核苷酸,按照使用阴离子交换柱层析的常规方法进行纯化,可以得到目的的本发明寡核苷酸。
另外,带有本发明所涉及的“带有能够阻止核酸合成反应的修饰的核苷酸”的寡核苷酸可以利用专门从事核酸合成的卖主的客户服务获得。
以下对本发明所涉及的核酸序列突变的检测方法的原理进行说明。
<原理1>当使用本发明所涉及的引物a或引物b时
例如当希望检测单碱基突变的核酸序列突变时,使上述引物a或引物b、以及与该引物配对,能够在核酸扩增反应中扩增目的序列部分的寡核苷酸引物,在反应液中与样品(含有要检测的核酸序列突变的核苷酸序列的核酸)发生核酸扩增反应。这样一来,当引物a或引物b的3’末端一致(碱基是互补的)时,即当存在单碱基突变时,发生核酸扩增反应。然而当3’末端不一致(碱基不互补)时,即当不存在单碱基置换时,就不发生核酸扩增反应。
<原理2>当使用本发明所涉及的引物c或引物d时
例如当希望检测单碱基突变的核酸序列突变时,使上述引物c或引物d、以及与该引物配对,能够在核酸扩增反应中扩增目的序列部分的寡核苷酸引物在反应液中与样品(含有要检测的核酸序列突变的核苷酸序列的核酸)发生核酸扩增反应。这样一来,当引物c或引物d的3’末端一致(碱基互补)时,即,当是与检测对象的基准核苷酸相同的碱基时,发生核酸扩增反应。然而当3’末端不一致(碱基不互补)时,即存在单碱基突变时,就不发生核酸扩增反应.
例如作为要检测的基因多态性,当着眼于人型结核菌的rpoB基因的突变时,根据上述<原理1>进行检测时使用的引物a可以像以下那样设定。
即,对于要检测的rpoB基因突变,(i)与带有突变的碱基的突变核苷酸相同的核苷酸出现在引物的3’末端,并且(ii)引物的3’末端部位以外的部位具有与上述突变核苷酸存在的上述rpoB基因上的位置5’侧的rpoB基因的核苷酸序列相同的序列,而且(iii)从引物的3’末端开始的第2位核苷酸为带有能够阻止核酸合成反应的修饰的寡核苷酸或其盐那样进行设计。
另外,作为例如要检测的基因多态性,当着眼于人型结核菌的rpoB基因的突变,根据上述<原理2>进行检测时的引物c可以像以下那样设定。
即,按照(i)在3’末端部位具有与rpoB基因的基准核苷酸相同的核苷酸,(ii)引物的3’末端部位以外的部位与rpoB基因的核苷酸序列相同,具有与上述基准核苷酸在上述rpoB基因上的位置5’侧的rpoB基因的核苷酸序列相同的序列,而且(iii)从引物的3’末端开始的第2位核苷酸为带有能够阻止核酸合成反应的修饰的寡核苷酸或其盐那样进行设计。
作为设计本发明所涉及的引物的方法,以下对用于用例如<原理1>的方法检测rpoB基因的突变的引物a进行设计的具体例子进行说明。
人型结核菌rpoB基因及其利福平耐性(RFP耐性)的突变的种类和其基因上的位置由于VIVEK KAPUR等人,J.Clin.Microbiol.,第32卷,4期,1994,p1095-1098(非专利文献2)的图1有报道,所以参考该图1所述,首先设定含有单碱基突变的序列。
例如,就野生型的人型结核菌的rpoB基因来说,有时在编码第511~533位的氨基酸的69碱基对的寡核苷酸部分中存在突变。
野生型的人型结核菌中的69碱基对的寡核苷酸序列(作为“野生型的rpoB基因高突变区的序列”)如下所示。
5’-CTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGG-3’(序列号1)
而作为这部分的突变之一,在野生型的rpoB基因高突变区序列中存在着从上述序列号1的序列的5’末端开始的第46位的碱基“C”(胞嘧啶)变为“T”(胸腺嘧啶)的突变。因此可以设计成该突变出现在3’末端(即3’末端变成“T”那样),而其它部位的序列与野生型的rpoB基因高突变区的序列上的上述第46位碱基5’侧的野生型的rpoB基因的核苷酸序列相同,而且作为引物发挥功能的长度的以下序列的寡核苷酸。画出下划线的碱基对应于突变的碱基。
5’-GCTGTCGGGGTTGACCT-3’(序列号7)
然后将从上述序列的3’末端开始的第2位的碱基“C”设计成为带有“本发明所涉及的能够阻止核酸合成反应的修饰”的“C”。以下将该经修饰的引物定为“引物rpoB_2”。
如果使用该引物进行核酸扩增反应(PCR),可以检测野生型的rpoB基因高突变区的序列的第46位碱基有无“C”→“T”的突变。
另外,作为另一个突变的例子,对于序列号1的寡核苷酸,在野生型的rpoB基因中存在着从该基因的5’末端开始的第68位的碱基“T”变为“C”的突变。因此可以设计成该突变出现在3’末端(即3’末端变成“C”那样)、而其它部位的序列与野生型的rpoB基因高突变区的序列上的上述第68位碱基5’侧的野生型的rpoB基因的核苷酸序列相同,而且作为引物发挥功能的长度的以下序列的寡核苷酸。画出下划线的碱基对应于突变的碱基。
5’-CCGACTGTCGGCGCC-3’(序列号8)
然后将从上述序列的3’末端开始的第2位的碱基“C”设计成为带有“本发明所涉及的能够阻止核酸合成反应的修饰”的“C”。以下将该经修饰的引物定为“引物rpoB_6”。
如果使用该引物进行核酸扩增反应(PCR),可以检测野生型的rpoB基因高突变区的序列的第68位碱基有无“T”→“C”的突变。
另外作为另一个突变的例子,对于序列号1的寡核苷酸,在野生型的rpoB基因高突变区的序列中存在着从该基因的5’末端开始的第46位的碱基“C”变为“G”(鸟嘌呤)的突变。因此可以设计成该突变出现在3’末端(即3’末端变成“G”那样)、而其它部位的序列与野生型的rpoB基因高突变区的序列上的上述第46位碱基5’侧的野生型的rpoB基因的核苷酸序列相同,而且作为引物发挥功能的长度的以下序列的寡核苷酸。画出下划线的碱基对应于突变的碱基。
5’-GCTGTCGGGGTTGACCG-3’(序列号9)
然后将从上述序列的3’末端开始的第2位的碱基“C”设计成为带有“本发明所涉及的能够阻止核酸合成反应的修饰”的“C”。以下将该经修饰的引物定为“引物rpoB_3”。
如果使用该引物进行核酸扩增反应(PCR),可以检测野生型的rpoB基因高突变区的序列的第46位碱基有无“C”→“G”的突变。
另外作为另一个突变的例子,对于序列号1的寡核苷酸,在野生型的rpoB基因高突变区的序列中存在着从该基因的5’末端开始的第47位的碱基“A”(腺嘌呤)变为“T”的突变。因此可以设计成该突变出现在3’末端(即3’末端变成“T”那样)、而其它部位的序列与野生型的rpoB基因高突变区的序列上的上述第47位碱基5’侧的野生型的rpoB基因的核苷酸序列相同,而且作为引物发挥功能的长度的下列序列的寡核苷酸。画出下划线的碱基对应于突变的碱基。
5’-CTGTCGGGGTTGACCCT-3’(序列号10)
然后将从上述序列的3’末端开始的第2位的碱基“C”设计成为带有“本发明所涉及的能够阻止核酸合成反应的修饰”的“C”。以下将该经修饰的引物定为“引物rpoB_4”。
如果使用该引物进行核酸扩增反应(PCR),可以检测野生型的rpoB基因高突变区的序列的第47位碱基有无“A”→“T”的突变。
上述不过是设计本发明所涉及的引物的方法的一个例子,在检测其它的突变时,也可以设计如上所述结构的本发明所涉及的(a)~(d)的寡核苷酸或其盐。
另外,本发明所涉及的引物也可以用标记物质标记。
作为用于用标记物质标记本发明所涉及的引物的标记物质,只要是放射性同位素或酶、荧光物质、发光物质、生物素等公知标记物质,可以使用任一种。
例如,作为放射性同位素如32P、33P、35S等,作为酶如碱性磷酸酶、西洋辣根过氧化物酶等,作为荧光物质如花菁染料(Cyanine Dye)体系的Cy3、Cy5(Amersham Bioscience有限公司)、荧光素等,作为发光物质如含有吖啶酯的化学发光试剂等。
当用放射性同位素对本发明所涉及的引物进行标记,在合成引物时,如通过整合入被放射性同位素标记的核苷酸来标记引物的方法、和合成引物后用放射性同位素进行标记的方法等。具体来说,如一般常用的随机引物法、切口平移法、通过T4多核苷酸激酶进行的5’-末端标记法、使用末端脱氧核苷酸转移酶的3’-末端标记法、RNA标记法等。
当用酶标记本发明所涉及的引物时可以使用使碱性磷酸酶、西洋辣根过氧化物酶等酶分子直接与待标记的引物共价结合等作为该领域中的常规方法的直接标记法。
当用荧光物质对本发明所涉及的引物进行标记时可以通过该领域中的常规方法的标记手法使例如荧光素标记的核苷酸整合到引物中。另外,也可以用将带有连接臂的核苷酸作为序列的寡核苷酸中的一员进行置换的方法(参照例如Nucleic Acids Res.,1986年,第14卷,p.6115)用荧光物质对核苷酸进行标记。此时通过特开昭60-50017号公报公开的合成法由脱氧尿苷化学合成在5位带有连接臂的尿苷,在上述寡核苷酸链中导入荧光物质的方法。
用发光物质标记本发明所涉及的引物的方法以及用生物素标记的方法可以根据通常在该领域内对核苷酸进行发光标记或生物素标记的常规方法进行。
与上述那样的本发明所涉及的引物配对,并通过核酸扩增反应能够对目的序列部分扩增的寡核苷酸引物是能够扩增可能含有检测对象的公知基因序列中的目的突变序列部分的序列(目的序列部分)的适当的寡核苷酸。
对本发明所涉及的“使用本发明所涉及的寡核苷酸作为引物进行核酸扩增反应时,与该寡核苷酸引物配对,通过核酸扩增反应能够对目的序列部分扩增的寡核苷酸引物”进行设计的方法、以及作为获得该引物的方法,有例如利用Primer3(Whitehead Institute for Biomedical Research)等引物预测软件,设法防止与本发明所涉及的引物发生干涉反应而进行设计的方法。
另外,在可使用的情况下,可以使用上述具有“使用本发明所涉及的寡核苷酸作为引物进行核酸扩增反应时,与该寡核苷酸引物配对,通过核酸扩增反应能够对目的序列部分扩增的”性质的寡核苷酸引物和通常在该领域使用的引物。各种引物由于有销售(例如M13正向引物,Takara-Bio公司制等),也可以使用这些引物。
作为本发明的“特征为使用引物,以样品中的核酸作为模板进行核酸扩增反应,检测反应产物的核酸序列突变的检测方法”涉及到的“核酸扩增反应”,如在该领域中通常进行的,例如使用本发明所涉及的引物,使引物与样品中的核酸杂交,利用DNA聚合酶等进行核酸扩增[例如PCR(特开昭60-281号)、LAMP(环介导的等温扩增)法(Tsugunori Notomi等人,Nucleic Acid Res.,28,e63,2000)、ICAN(等温的和嵌合引物起始的核酸扩增)法(临床病理,51(11),1061-1067,2003年11月)、LCR(连接酶链反应)法(特开平4-211399号)、SDA(链置换扩增)法(特开平8-19394号)]使引物延伸的常规方法。包括PCR在内的核酸扩增反应的条件、操作法等可以依据该领域通常的常规方法进行。
作为本发明所涉及的“对通过核酸扩增反应得到的反应产物进行检测的方法”,例如嵌入剂法、TaqManTM实时PCR法(参照例如美国专利第5538848号所述)、MGB Eclipse探针系统法(参照例如美国专利第5,801,155号所述)、分子信标探针技术(Molecular Beacons Probe Technology)法(参照例如美国专利第5925517号所述)、LUX荧光引物(FluorogenicPrimer)法(Invitrogen Corporation)、猝灭探针PCR(Quenchingprobe-PCR;QP)法(参照例如美国专利第6,492,121号所述),进行核酸扩增反应后,对得到的引物延伸产物进行电泳,根据其结果进行检测的方法,对使用标记引物进行核酸扩增反应得到的引物延伸产物的标记进行测定的方法等各种各样的检测法。
有关对通过核酸扩增反应得到的扩增产物(引物延伸产物)进行测定的方法,以以下4种方法为例,就各个方法进行说明,不用说并不限定于这些例子。
(1)嵌入剂法、
(2)TaqManTM实时PCR法、
(3)进行核酸扩增反应后,对得到的引物延伸产物进行电泳,根据其结果进行检测的方法、
(4)对使用标记引物进行核酸扩增反应得到的引物延伸产物的标记进行测定的方法。
(1)嵌入剂法
可以利用使用公知嵌入剂进行实时PCR的通常的嵌入剂法。
例如,使用本发明所涉及的引物以及与该引物配对的通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸引物和嵌入剂,利用通常的嵌入剂法进行实时PCR的方法。
嵌入剂是特异结合双链DNA后发荧光的试剂,如果照射激发光就发荧光。通过PCR反复进行扩增使DNA增加,嵌入剂被掺入该DNA。即,嵌入剂被掺入到DNA的量由于与扩增产物的生成量成比例,通过检测来自于嵌入剂的荧光强度,可以知道引物延伸产物的量。
由于嵌入剂与所有的双链DNA结合,因此可以以得到的荧光强度的测定结果为基础进行熔解曲线分析。即,PCR后,一边将得到的含有扩增产物的PCR反应液的温度慢慢地升高,一边测定嵌入剂的荧光强度。最初由于扩增产物形成双链,所以发荧光。然而,当PCR反应液的温度达到某个特定的温度,扩增产物解离为单链,嵌入剂的荧光急剧下降。此时的温度是熔解温度(Tm值),是引物延伸产物的序列的固有值。可以由该Tm值判定特异产物(目的产物)与非特异产物的峰。
由于该嵌入剂法在实时PCR后不需要进行电泳,所以在临床检查(诊断)那样的需要迅速判定突变时是有效的方法。
作为本发明中使用的嵌入剂,只要是通常该领域中使用的嵌入剂,无论那种都可以用,例如SYBRTM Green I(Molecular Probe公司的商品名)、溴乙锭、芴等。
以下对本发明所涉及的“利用嵌入剂法的核酸序列突变的检测方法”的例子进行说明。
<方法(1)-1>
使用本发明所涉及的引物a或引物b以及与该引物配对的通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸引物和作为嵌入剂的SYBRTMGreen I,使用从要检测突变的样品纯化的纯化DNA样品作为模板,使用Taq DNA聚合酶进行实时PCR。然后测定嵌入到扩增产物的SYBRTMGreen I的荧光强度。
为了检测突变,可以进行例如扩增产物的熔解曲线分析。即,做成以横轴为扩增产物(双链DNA)的解离温度、纵轴为荧光强度的一次微分(变化量)的熔解曲线,进行峰的检测。当被检测的引物延伸产物的峰的Tm值与预测到的通过使用上述引物组合的实时PCR被扩增的引物延伸产物的Tm值相同时,判定该纯化DNA样品中存在目的的核酸序列突变、即检测对象的核酸序列突变。
另外,也可以使用这样的方法,首先对于作为模板使用的纯化DNA样品溶液的稀释系列样品分别扩增的产物做成以横轴为扩增产物(双链DNA)的解离温度,纵轴为荧光强度的一次微分(变化量)的熔解曲线,进行峰的检测。当各稀释系列的各引物延伸产物的峰的Tm值相同时,判定纯化DNA样品中存在目的的核酸序列突变。
另外,除了替代从要检测突变的样品中纯化的纯化DNA样品,以来自野生型的纯化DNA样品作为模板以外,通过与上述同样的方法进行实时PCR,同样测定SYBRTM Green I的荧光强度,也可以进行熔解曲线分析的对照实验。此时由于样品中不存在核酸序列突变,所以没有检测到荧光,当然在熔解曲线分析中也不会出现峰。为了更确实核酸序列突变的判定,希望一起进行这样的对照实验。
<方法(1)-2>
使用本发明所涉及的引物c或引物d以及与该引物配对的通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸引物和嵌入剂SYBRTM Green I,使用从要检测突变的样品纯化的纯化DNA样品作为模板,使用Taq DNA聚合酶进行实时PCR。然后测定嵌入到扩增产物的SYBRTM Green I的荧光强度。
为了检测突变,可以进行例如扩增产物的熔解曲线分析。即,做成以横轴为扩增产物(双链DNA)的解离温度,纵轴为荧光强度的一次微分(变化量)的熔解曲线,进行峰的检测。当被检测的引物延伸产物的峰的Tm值与预测到的通过使用上述引物组合的实时PCR被扩增的引物延伸产物的Tm值相同时,判定该纯化DNA样品中不存在目的的核酸序列突变。而当Tm值不同时,判定该纯化DNA样品中存在目的的核酸序列突变。
另外,也可以使用这样的方法,首先对于作为模板使用的纯化DNA样品溶液的稀释系列样品分别扩增的产物,做成以横轴为扩增产物(双链DNA)的解离温度、纵轴为荧光强度的一次微分(变化量)的熔解曲线,进行峰的检测。当各稀释系列的各引物延伸产物的峰的Tm值相同时,判定纯化DNA样品中不存在目的的核酸序列突变。而当Tm值不同时,判定该纯化DNA样品中存在目的的核酸序列突变。
作为通过使用本发明所涉及的嵌入剂进行实时PCR检测体系的核酸序列突变的检测方法的一个例子,以使用上述的“引物rpoB_2”(相当于本发明所涉及的引物a),当检测人型结核菌的proB基因的单碱基突变时(对上述的野生型的rpoB基因高突变区的序列中,从5’末端开始的第46位碱基“C”突变为“T”的突变进行检测时。)(<方法(1)-1>)为例进行说明。
首先通过公知方法从要检测的核酸序列突变的样品中中获得纯化DNA样品。
然后使用引物rpoB_2和与引物rpoB_2配对的能够通过核酸扩增反应扩增目的序列部分的寡核苷酸引物,进行例如像下述那样的实时PCR。
即,制备含有各50~2000nM的引物rpoB_2和与引物rpoB_2配对的能够通过核酸扩增反应扩增目的序列部分的寡核苷酸引物、原液约5000~100000倍稀释(最终浓度)的SYBRTM Green I(Molecular Probe公司商品名)、1.0~4.0mM MgCl2、80mM KCl、500μg/mL BSA、0.1%胆酸钠、0.005~0.2% TritonX-100、各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP、10~80单位/mL的Taq DNA聚合酶的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.9),作为PCR用反应液。向20μL该PCR用反应液中加入从要检测突变的样品中纯化的纯化DNA样品1ng,作为PCR用DNA样品。将该样品加到96孔反应板的孔中,使用适当的实时PCR检测装置等进行实时PCR。反应反复进行30~50次循环,每1循环都测定相对于扩增产物嵌入的SYBRTMGreen I的荧光强度。
然后,做成以横轴为扩增产物(双链DNA)的解离温度、纵轴为荧光强度的一次微分(变化量)的熔解曲线,进行峰的检测。
此时,当被检测的引物延伸产物的峰的Tm值与预测到的通过使用上述引物组合的实时PCR被扩增的引物延伸产物的Tm值相同时,判定该纯化DNA样品中存在检测对象rpoB基因的突变。
也可以使用当经熔解曲线分析得到的各稀释系列的各引物延伸产物的峰的Tm值相同时,判定在纯化DNA样品中存在rpoB基因的突变的方法。
另外,作为对照,可通过常规方法合成含有野生型的人型结核菌DNA的rpoB基因的寡核苷酸,或通过常规方法从野生型的人型结核菌提取、纯化含有rpoB基因的寡核苷酸。然后,除了替代“从要检测突变的样品中纯化的纯化DNA样品”,以此纯化的样品作为模板以外,通过与上述同样的方法进行实时PCR,同样测定SYBRTM Green I的荧光强度,也可以进行熔解曲线分析。此时由于样品中不存在核酸序列突变,所以没有检测到来自引物延伸产物的荧光,当然在熔解曲线分析中也不会出现峰。为了更确实核酸序列突变的判定,希望一起进行这样的对照实验。
另外,作为使用本发明所涉及的引物c或引物d,通过上述<方法(1)-2>检测人型结核菌的rpoB基因的单碱基突变的方法,可列举例如以下的方法。
即,使用以野生型的人型结核菌的上述proB基因高突变区的序列为基础设计的本发明所涉及的引物c或引物d和与该引物配对的通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸引物以及嵌入剂,作为模板使用从要检测突变的样品纯化的纯化DNA,与上述<方法(1)-1>同样利用公知嵌入剂法进行实时PCR法,同样进行熔解曲线分析。
此时当通过熔解曲线分析检测的引物延伸产物的峰的Tm值与预测到的通过使用上述引物组合的实时PCR被扩增的引物延伸产物的Tm值相同时,判定在该纯化DNA样品中不存在目的的rpoB基因的突变。而当没有得到同一的Tm值峰时,判定在该纯化DNA样品中存在目的的rpoB基因的突变。
另外,当经熔解曲线分析得到的纯化DNA样品溶液的各稀释系列的各引物延伸产物的峰的Tm值相同时,判定在该纯化DNA样品中不存在rpoB基因的突变。另外,也可以使用当峰的Tm值不同时,判定在该纯化DNA样品中存在rpoB基因的突变的方法。
另外,也可以使用本发明所涉及的引物a、b、c或d中的一种进行实时PCR,也可以同时使用多种本发明所涉及的引物,同样进行实时PCR。当样品DNA中存在某种突变时,在使用一种引物时只能判定样品DNA存在该一种突变。与此相反,当同时使用多种引物时,由于通过使用的多种引物一次可判定样品DNA中能够检测的究竟是哪种突变,在要求判定迅速的临床检查的领域中非常有效。
作为使用多种本发明所涉及的引物时的例子,可以列举例如使用多种引物a的情形、使用多种引物b的情形、使用引物a(多种)和引物b(多种)适当组合的情形。
例如,当检测结核菌的proB基因突变,使用引物rpoB_2进行实时PCR时,用引物rpoB_2能够检测的突变,即野生型的rpoB基因高突变区的序列中,只能判定是否存在第46位碱基“C”→“T”的突变,但当存在其它突变时不能判定存在突变。与此相反,如果同时使用例如引物rpoB_2、引物rpoB_2_n3、引物rpoB_6和引物rpoB_3同样进行实时PCR,如果在样品DNA存在第46位碱基“C”→“T”、第68位的碱基“T”→“C”、第46位的碱基“C”→“G”、第47位的碱基“A”→“T”中的任一种突变,由于通过熔解曲线分析可得到峰,所以可以判定该样品存在上述4种突变中的哪种rpoB基因的突变。另外通过对峰出现位置进行解析,也可以判断4种突变中具体是何种突变。
(2)TaqManTM实时PCR法
本发明的核酸序列突变的检测方法也可以使用TaqManTM实时扩增检测法(参照例如美国专利第5210015号、美国专利第5538848号所述)。
所谓TaqManTM实时扩增检测法(TaqManTM实时PCR法),更具体来说,是通过使用5’末端用例如FAM等荧光色素(报道)标记,3’末端用例如TAMRA等淬灭色素标记的探针的实时PCR法(参照例如美国专利第5538848号所述)能够高灵敏度、而且定量地检测目的的微量DNA的方法。
以下对TaqManTM实时PCR法的原理进行说明。
即,使用5’末端用荧光色素(报道分子)标记,3’末端用淬灭色素标记的与目的基因的特定区域杂交的寡核苷酸探针。该探针在通常状态下,报道分子的荧光被淬灭色素抑制。在使该荧光探针完全与目的基因完全杂交的状态下,自其外侧使用DNA聚合酶进行PCR。通过DNA聚合酶使得延伸反应进行,通过其外切核酸酶活性将荧光探针从5’端水解掉,使报道色素游离,发出荧光。在TaqManTM实时PCR法中,通过对该荧光强度进行实时监测可以正确对模板DNA的初期量进行定量。
作为在本发明所涉及的TaqManTM实时PCR检测法中使用的、5’末端用荧光色素(报道分子)、3’末端用淬灭色素标记的探针中使用的探针,可以使用具有用所选择的正向引物和反向引物组合进行实时PCR时得到的(预测被扩增)引物延伸产物的碱基序列的探针、或具有再由该序列设计的碱基序列的探针。
另外,作为对5’末端进行标记的报道荧光物质,如羧基荧光素(FAM)、六氯荧光素(HEX)、四氯荧光素(TET)、Cy5(Amersham Bioscience有限公司)等,其中优选FAM。作为对3’末端进行标记的淬灭色素,如羧基四甲基罗丹明(TAMRA)等荧光物质、Black Hole Quencher色素(例如BHQ2),4-((4-(二甲基氨基)苯基)偶氮)苯甲酸(DABCYL)等非荧光物质,其中优选TAMRA。
TaqManTM实时PCR法中使用的其它的脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、DNA聚合酶等试剂可以使用通常的实时PCR中使用的试剂。TaqManTM实时PCR的方法除了使用本发明所涉及的引物和探针以外,可按照TaqManTM实时PCR的一般程序进行。
以下对本发明所涉及的“运用TaqManTM实时PCR检测法进行的核酸序列突变的检测方法”的例子进行说明。
<方法(2)-1>
使用本发明所涉及的引物a或引物b以及与该引物配对的通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸引物,另外,由预测到通过使用该引物的组合进行PCR被扩增的引物延伸产物的核酸序列设计具有适当长度的寡核苷酸,用常规方法进行合成。使用该寡核苷酸的5’末端用报道色素标记,3’末端用淬灭色素标记的产物作为标记探针,以从要检测突变的样品纯化的纯化DNA样品作为模板,进行TaqManTM实时PCR。当测定到来自报道色素的荧光时,可判定该纯化DNA样品中存在目的的核酸序列突变。
在实施方法<(2)-1>时,与嵌入剂法的情况同样,希望一起进行使用来自野生型的纯化DNA样品作为模板的对照实验。
<方法(2)-2>
使用本发明所涉及的引物c或引物d以及与该引物配对的通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸引物,另外,由通过使用该引物的组合的PCR而预测被扩增的引物延伸产物的核酸序列设计具有适当长度的寡核苷酸,通过常规方法进行合成。使用该寡核苷酸的5’末端用报道色素标记,3’末端用淬灭色素标记的产物作为标记探针,以从要检测突变的样品纯化的纯化DNA样品作为模板,进行TaqManTM实时PCR。在测定到来自报道色素的荧光时,可判定该纯化DNA样品中不存在目的的核酸序列突变。而当没有测定到荧光时,可判定在该纯化DNA样品中存在目的的核酸序列突变。
也可以使用本发明所涉及的多种引物进行TaqManTM实时PCR,从而同时判定多个突变,这与运用上述嵌入法的情况相同。
作为本发明所涉及的运用TaqManTM实时PCR检测法检测核酸序列突变的检测方法的一个例子,以使用上述“引物rpoB_2”,检测人型结核菌的proB基因的单碱基突变的情况(对于上述的野生型的rpoB基因高突变区的序列中,从5’末端开始的第46位碱基“C”突变为“T”的突变进行检测时。)(<方法(2)-1>)为例说明如下。
首先通过公知方法由要检测核酸序列突变的样品中得到纯化DNA样品。
然后,由预测到的通过使用引物rpoB_2和与引物rpoB_2配对的通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸引物的组合进行PCR而被扩增的引物延伸产物的核酸序列设计具有适当长度的寡核苷酸,用常规方法进行合成。通过常规方法在该寡核苷酸的5’末端结合报道色素FAM,3’末端结合淬灭色素(报道消光体)的TAMRA,得到标记探针。
然后使用引物rpoB_2和与引物rpoB_2配对的通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸引物以及上述得到的标记探针,例如像下述那样进行TaqManTM实时PCR。
即,制备含有各1μM的引物rpoB_2和与引物rpoB_2配对的通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸引物、100~1000nM的标记探针、1.0~4.0mM MgCl2、80mM KCl、500μg/mL BSA、0.1%胆酸钠、0.005~0.2% TritonX-100、各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP、10~80单位/mL的Taq DNA聚合酶的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.9),作为PCR用反应液。向20μL的PCR用反应液中加入1ng的从要检测突变的样品纯化的纯化DNA样品,作为PCR用DNA样品。然后将样品加到96孔反应板的孔中,使用适当的实时PCR检测装置等进行实时PCR。反应反复进行30~50次循环,每1循环都测定来自报道色素的荧光强度。
此时当测定到来自报道色素的荧光时,可判定纯化DNA样品中存在目的的rpoB基因突变。
另外如上所述那样,希望一起进行使用含有野生型的人型结核菌rpoB基因的纯化DNA样品作为模板的对照实验。
作为使用本发明所涉及的引物c或引物d,运用上述<方法(2)-2>检测人型结核菌的rpoB基因的单碱基置换的方法,可以列举例如以下的方法。
即,运用以野生型的人型结核菌的上述proB基因高突变区序列为基础设计的本发明所涉及的引物c或引物d以及与该引物配对的通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸引物和用与上述方法<方法(2)-1>同样的方法制备的标记探针,与上述<方法(2)-1>同样地进行TaqManTM实时PCR。
此时,对于测定到来自报道色素的荧光的情形,可判定为在该纯化DNA样品中不存在目的的rpoB基因的突变。而当没有测定到荧光时可判定为在该纯化DNA样品中存在目的的rpoB基因的突变。
另外,至于本发明的检测方法中的核酸扩增工程,除了实时PCR之外,可以适用利用RNA转录产物的检测法。例如NASBA(基于核酸序列的扩增)法(日本专利第2650159号)、3SR(自我维持的序列复制)法(特公平7-114718号)、TAS(基于转录的扩增系统)法(特表平2-500565号:国际公开WO88/10315号)、TMA(转录介导的扩增)法(特开平11-46778号)等,其中利用逆转录酶和RNA聚合酶的协同作用(在逆转录酶和RNA聚合酶协同作用那样的条件下进行反应)的恒定温度核酸扩增法适于使测定系统自动化。
(3)进行核酸扩增反应后,对得到的引物延伸产物进行电泳,根据电泳结果进行的方法
作为该方法,可以列举例如
“以包括下述步骤为特征的核酸序列突变的检测方法:
(i)使用从本发明所涉及的引物a、引物b、引物c或引物d选择的引物和与该引物配对的通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸引物,以样品中的核酸为模板进行核酸扩增反应(PCR),
(ii)对上述(i)得到的引物延伸产物进行电泳,根据电泳结果对核酸序列突变进行检测”。
作为进行电泳,根据电泳结果检测核酸序列突变的方法,例如
(3-1)通过确认目的大小(碱基对数)的引物延伸产物部分进行检测的方法、
(3-2)通过使用标记探针的杂交进行检测的方法
等。
电泳法的条件、操作方法等可以依据该领域中通常使用的常规方法。
(3-1)通过确认目的大小(碱基对数)的引物延伸产物部分进行检测的方法
作为通过确认目的大小(碱基对数)的引物延伸产物部分进行检测的方法,例如,首先进行PCR,然后对得到的引物延伸产物进行电泳。预先对预测到通过利用本发明所涉及的引物、以及与该引物配对的通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸引物的组合进行PCR被扩增的扩增产物的大小(碱基对数)进行预测。然后通过常规方法确认得到的部分的大小是否与预测的扩增产物的大小相当。例如,通过用溴乙锭等对得到的部分染色,进行可视化的方法来根据该扩增产物的特征性大小进行检测(确认)等方法。
以下对本发明所涉及的“通过确认目的大小(碱基对数)的引物延伸产物部分进行检测的方法”的例子进行说明。
<方法(3-1)-1>
选择本发明所涉及的引物a或引物b以及与该引物配对的通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸引物。预先对预测到使用该引物组合进行PCR而被扩增的扩增产物的大小(碱基对数)进行预测。使用该引物的组合,使用从要检测突变的样品纯化的纯化DNA样品作为模板进行PCR,对得到的引物延伸产物进行电泳。然后可以通过常规方法确认得到的部分的大小是否与预测的扩增产物的大小相当。例如,通过将得到的部分用溴乙锭等染色进行可视化的方法来根据该扩增产物的特征的大小进行检测,当确认得到的部分的大小与预测的扩增产物的大小相当时,判定在该纯化DNA样品中存在目的的核酸序列突变。
<方法(3-1)-2>
选择本发明所涉及的引物c或引物d以及与该引物配对的通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸引物。预先对预测到使用该引物组合进行PCR而被扩增的扩增产物的大小(碱基对数)进行预测。使用该引物的组合,使用从要检测突变的样品纯化的纯化DNA样品作为模板进行PCR,对得到的引物延伸产物进行电泳。然后可以通过常规方法确认得到的部分的大小是否与预测的扩增产物的大小相当。例如,通过将得到的部分用溴乙锭等染色进行视觉化的方法来根据该扩增产物的特征的大小进行检测,当确认得到的部分的大小与预测的扩增产物的大小相当时,判定在该纯化DNA样品中不存在目的的核酸序列突变。而当不能确认那样的部分时,可判定在该纯化DNA样品中存在目的的核酸序列突变。
使用多种本发明所涉及的引物如上所述进行PCR和电泳,也可以同时对多个突变进行判定,这与运用上述嵌入法的情况相同。
作为运用本发明所涉及的(3-1)的方法检测核酸序列突变的检测方法的一个例子,以使用上述的“引物rpoB_2”,对人型结核菌的proB基因的单碱基突变进行检测的情况(上述的野生型的rpoB基因高突变区的序列中,对从5’末端开始的第46位碱基“C”突变为“T”的突变进行检测时。)(<方法(3-1)-1>)为例说明如下。
首先运用公知方法从要检测核酸序列突变的样品中得到纯化DNA样品。
然后,使用引物rpoB_2以及与该引物rpoB_2配对的通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸引物,使用从要检测突变的样品纯化的纯化DNA样品作为模板进行PCR。然后对得到的引物延伸产物进行电泳。预先对预测到使用该引物组合进行PCR而被扩增的扩增产物的大小(碱基对数)进行预测。然后可以通过常规方法确认得到的部分的大小是否与预测的扩增产物的大小相当。当确认得到的部分的大小与预测的扩增产物的大小相当时,可判定在该纯化DNA样品中存在目的的rpoB基因的突变。
另外,作为使用本发明所涉及的引物c或引物d,运用上述<方法(3-1)-2>检测人型结核菌的proB基因的单碱基突变的方法,可列举如下的方法。
即,使用以野生型的人型结核菌的上述rpoB基因高突变区序列为基础设计的引物c或引物d以及与该引物配对的通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸引物,以从要检测突变的样品纯化的纯化DNA样品作为模板,与上述方法<方法(3-1)-1>同样地进行PCR。然后对得到的引物延伸产物进行电泳。预先对预测到使用该引物组合进行PCR而被扩增的扩增产物的大小(碱基对数)进行预测。然后可以通过常规方法确认得到的部分的大小是否与预测的扩增产物的大小相当。当确认得到的部分的大小与预测的扩增产物的大小相当时,可判定在该纯化DNA样品中不存在目的的rpoB基因的突变。而当不能确认那样的部分时,可判定在该纯化DNA样品中存在目的的rpoB基因的突变。
(3-2)通过使用标记探针的杂交进行判定的方法
作为通过使用标记探针的杂交进行判定的方法,例如以下的方法。首先对PCR扩增产物进行电泳。然后使用用标记物质标记的含有要检测的序列的寡核苷酸作为标记探针,将得到的部分与该标记探针进行杂交。然后通过对该标记探针的标记进行检测,确认有无与该标记探针杂交的部分存在,检测核酸序列突变的存在。
作为该方法中使用的“含有要检测的序列的寡核苷酸”,如具有预测通过使用该引物组合进行PCR而被扩增的扩增产物的碱基序列的寡核苷酸,或进一步由该序列设计的具有适当长度的寡核苷酸。
对该方法中使用的探针进行标记的标记物质的具体例子、以及探针的标记方法与上述的标记引物中使用的标记物质和引物的标记方法相同。
对本发明所涉及的“通过使用标记探针的杂交进行判定的方法”的例子说明如下。
<方法(3-2)-1>
使用本发明所涉及的引物a或引物b以及与该引物配对的通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸引物,使用从要检测突变的样品纯化的纯化DNA样品作为模板进行PCR,对得到的引物延伸产物进行电泳。预先制备用标记物质对含有要检测序列的寡核苷酸进行了标记的标记探针。将得到的部分与该标记探针进行杂交。然后通过对该标记探针的标记进行检测,当确认与该标记探针杂交的部分存在时,可判定在该纯化DNA样品中存在目的的核酸序列突变。
<方法(3-2)-2>
使用本发明所涉及的引物c或引物d以及与该引物配对的通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸引物,使用从要检测突变的样品纯化的纯化DNA样品作为模板进行PCR。对得到的引物延伸产物进行电泳。预先制备用标记物质对含有要检测序列的寡核苷酸进行了标记的标记探针。将得到的部分与该标记探针进行杂交。然后通过对该标记探针的标记进行检测,当确认与该标记探针杂交的部分存在时,判定在该纯化DNA样品中不存在目的的核酸序列突变。另外,当不能确认这样的部分时,判定在该纯化DNA样品中存在目的的核酸序列突变。
也可以使用本发明所涉及的多种引物如上所述进行PCR和电泳,同时判定多个突变,这与运用上述嵌入法的情况相同。
作为本发明所涉及的运用(3-2)的方法检测核酸序列突变的检测方法的一个例子,以使用上述的“引物rpoB_2”,检测人型结核菌的proB基因的单碱基突变的情况(对于上述的野生型的rpoB基因高突变区的序列中,从5’末端开始的第46位碱基“C”突变为“T”的突变进行检测时。)(<方法(3-2)-1>)为例说明如下。
首先通过公知方法由要检测核酸序列突变的样品中得到纯化DNA样品。
然后,通过使用引物rpoB_2和与引物rpoB_2配对的通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸引物,使用从要检测突变的样品纯化的纯化DNA样品作为模板进行PCR。然后对得到的引物延伸产物进行电泳。预先根据通过使用该引物组合的PCR预测到被扩增的扩增产物的核酸序列设计用作探针的具有适当长度的序列,通过常规方法合成该序列的寡核苷酸。用标记物质标记该寡核苷酸后预先制作标记探针。得到的部分与该标记探针进行杂交。通过对该标记探针的标记进行检测,当确认与该标记探针杂交的部分存在时,则判定在该纯化DNA样品中存在目的的rpoB基因的突变。
另外,作为使用本发明所涉及的引物c或引物d,运用上述<方法(3-2)-2>检测人型结核菌的rpoB基因的单碱基突变的方法,可以列举例如以下的方法。
即,使用以野生型的人型结核菌的上述rpoB基因高突变区序列为基础设计的引物c或引物d以及与该引物配对的通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸引物,用从要检测突变的样品纯化的纯化DNA样品作为模板,与上述<方法(3-2)-1>同样进行PCR和电泳。根据预先预测到通过使用该引物组合进行PCR而被扩增的扩增产物的核酸序列设计用作探针的具有适当长度的序列,通过常规方法合成该序列的寡核苷酸。用标记物质标记该寡核苷酸后,事先制备标记探针。得到的部分与该标记探针进行杂交。通过对该标记探针的标记进行检测,当确认与该标记探针杂交的部分存在时,可判定在该纯化DNA样品中不存在rpoB基因的突变。而当不能确认那样的部分时,判定在该纯化DNA样品中存在目的的rpoB基因的突变。
(4)对使用标记引物进行核酸扩增反应得到的引物延伸产物的标记进行测定的方法
作为这样的方法,可以列举使用用上述方法对本发明所涉及的引物进行了标记的标记引物和与该标记引物配对的能够进行核酸扩增反应的寡核苷酸引物(没有标记),用样品中的核酸作为模板进行PCR,对得到的引物延伸产物的标记进行测定的方法。
对该例说明如下。
<方法(4)-1>
使用标记的引物a或标记的引物b以及与该标记引物配对的能够进行核酸扩增反应的寡核苷酸引物(没有标记),用从要检测突变的样品纯化的纯化DNA样品作为模板进行PCR。然后除去游离的标记引物,测定引物延伸产物的标记。当能够检测标记时,判定在该纯化DNA样品中存在目的的核酸序列突变。
<方法(4)-2>
使用标记的引物c或标记的引物d以及与该标记引物配对的能够进行核酸扩增反应的寡核苷酸引物(没有标记),用从要检测突变的样品纯化的纯化DNA样品作为模板进行PCR。然后除去游离的标记引物,测定引物延伸产物的标记。当能够检测标记时,可判定在该纯化DNA样品中不存在目的的核酸序列突变。而当不能检测标记时判定为在该纯化DNA样品中存在目的的核酸序列突变。
作为在上述方法除去游离的标记引物的方法,如通过使核酸沉淀的常规方法(乙醇沉淀法、使用异丙醇的沉淀法等)使进行PCR后得到的反应物中的引物延伸产物沉淀后,除去含有未沉淀的游离标记引物的上清的方法等。
另外,还可以列举将进行PCR得到的反应物在适当条件下经凝胶层析处理后,将引物延伸产物与游离的标记引物分离的方法以及通过电泳法进行分离的方法等。
另外,至于本发明的核酸序列突变的检测方法中使用的试剂,可以使用通常在该领域中使用的试剂类,例如缓冲剂、稳定剂、防腐剂等,且其不妨碍共存的试剂等的稳定性,不抑制PCR或杂交反应。而试剂的浓度可以从通常该领域中通常使用的浓度范围适宜选择。
缓冲液的具体例子,例如Tris缓冲液、磷酸缓冲液、佛罗那缓冲液、硼酸缓冲液、Good缓冲液等通常在实施PCR或杂交反应时使用的缓冲液,其pH也没有特别限定,通常优选5~9的范围。
另外,根据需要可以使用核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等)、酶相应的底物(dNTP、rNTP等)、以及双链嵌入剂(溴乙锭、SYBRTM Green等)或FAM和TAMRA等标记检测物质等。
作为本发明所涉及的核酸序列突变的检测用试剂盒,如
“含有下述(a)~(d)任一项所述的寡核苷酸或其盐作为引物的核酸序列突变的检测用试剂盒,
(a)i)在3’末端部位具有与对象基因的突变核苷酸相同的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列相同,具有与可能存在上述突变核苷酸的上述对象基因上的位置5’侧的对象基因的核苷酸序列相同的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐,
(b)i)在3’末端部位具有与对象基因的突变核苷酸互补的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列互补,具有与可能存在上述突变核苷酸的上述对象基因上的位置3’侧的对象基因的核苷酸序列互补的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐,
(c)i)在3’末端部位具有与对象基因的基准核苷酸相同的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列相同,具有与上述基准核苷酸在上述对象基因上的位置5’侧的对象基因的核苷酸序列相同的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐,或
(d)i)在3’末端部位具有与对象基因的基准核苷酸互补的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列互补,具有与上述基准核苷酸在上述对象基因上的位置3’侧的对象基因的核苷酸序列互补的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐”。
构成这些试剂盒的构成试剂的优选方式和具体例子如上所述。
另外在上述的试剂盒中,如还可含有
“1)核苷三磷酸、2)核酸合成酶、3)与该寡核苷酸配对的通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸、以及4)PCR缓冲液”的试剂盒。
作为上述2)的核酸合成酶,例如DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等。
作为上述4)的PCR缓冲液而使用的缓冲液的具体例子,例如Tris缓冲液、磷酸缓冲液、佛罗那缓冲液、硼酸缓冲液、Good缓冲液等通常实施PCR或杂交反应时使用的所有缓冲液,其pH也没有特别限定,通常优选5~9的范围。
另外在本发明的核酸序列突变的检测用试剂盒中根据需要还可以含有对应于酶的底物(dNTP、rNTP等)、以及例如SYBRTM Green I(MolecularProbe公司商品名,溴乙锭、芴等双链嵌入剂、FAM和TAMRA等标记检测物质等。另外还可以含有稳定剂、防腐剂等,例如不妨碍共存的试剂等的稳定性、不抑制PCR或杂交反应的稳定剂、防腐剂。而这些试剂的浓度也可以从通常该领域中使用的浓度范围适宜选择。
作为本发明所涉及的核酸序列的检测中使用的材料,如从检体采取的血浆、血清、髓液、各种生体组织的成分提取液、组织切片、粪便、尿等来自生物体的样品。又如来自上述各种组织的细胞等。
作为例如人型结核菌的突变的检测中使用的材料,如喀痰、经支气管采取物、咽喉粘液、胃液、支气管清洗液、胸水等穿刺液等各种临床材料。
作为本发明所涉及的核酸序列突变的检测中使用的样品,如含有核酸的样品。也可以是从上述材料分离、纯化的核酸、或通过核酸扩增检测体系等扩增的核酸。
以下举出实施例和比较例,对本发明进行更具体的说明,但本发明并不限定于这些实施例。
另外,在实施例和比较例中,作为核酸碱基表示的“A”表示腺嘌呤,“G”表示鸟嘌呤,“C”表示胞嘧啶,“T”表示胸腺嘧啶。
实施例
实施例1.耐药性结核菌的模型检测实验1
(1)质粒DNA的构建
1)含有突变型rpoB基因序列_2的质粒DNA的构建
参考VIVEKKAPUR等人报告的rpoB基因高突变区的序列(非专利文献2:J.Clin.Microbiol.,第32卷,4期,1994.p1095-1098,图1),通过以下的方法按照基因工程原理制备“具有结核菌rpoB基因上的1碱基突变的序列的质粒DNA”。而该rpoB基因高突变区的碱基序列在人型结核菌(结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis))和牛型结核菌(牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis))中是相同的。
首先以从牛分枝杆菌BCG(牛型结核菌,菌株编号RIMD1314006,日本细菌学会)提取、纯化的基因组DNA作为起始材料,根据生物化学实验法47PCR实验手册驹野徹编著所述的公知PCR法进行部位特异的突变导入法,对处于结核菌基因组DNA中的rpoB基因高突变区部分的序列(序列号1)的5’末端开始的第46位碱基(在野生型中为“C”),进行使它突变为“T”的突变导入。
将导入了突变的DNA片段使用QIAGEN公司生产的柱子进行纯化后,插入克隆载体(Invitrogen公司生产)。然后使用QIAprepTM SpinMiniprep Kit(QIAGEN公司生产),对含有目的序列的质粒DNA进行纯化、回收。
用上述方法得到的质粒DNA含有下述序列号3的碱基序列。以下将该序列号3表示的碱基序列记为“突变型rpoB基因序列_2”。在“突变型rpoB基因序列_2”的序列中,从该5’端开始的第64位用下划线表示的碱基对应于从rpoB基因高突变区的序列的5’末端开始的第46位碱基。而在野生型的rpoB基因中该部分的碱基是“C”,而在“突变型rpoB基因序列_2”中突变为“T”。
序列号3:
5′-TTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCTACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGG-3′(突变型rpoB基因序列_2)
2)含有野生型rpoB基因序列的质粒DNA的构建
除了不导入碱基突变以外用与上述同样的方法可得到含有野生型的rpoB基因序列的质粒DNA。即,该质粒DNA含有用下述序列号2表示的碱基序列。
序列号2:
5′-TTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGG-3′
(2)突变型rpoB基因检测用引物(引物rpoB_2)的构建
以突变型rpoB基因序列_2为基础用下述方法设计引物。
首先,(i)将突变型rpoB基因序列_2的导入突变的位点,即从其5’末端开始的第64位碱基“T”配置为相当于引物的3’末端,(ii)引物的其它序列配置为与突变型rpoB基因序列_2的5’末端的第64位碱基“T”5’侧的16个碱基序列相同,而且(iii)按照从引物的3’末端开始的第2位碱基“C”变成用2′-O,4′-C-亚乙基桥接的核酸修饰的“C”那样设计突变型rpoB基因检测用引物序列。将这样设计的寡核苷酸记为“引物rpoB_2”。“引物rpoB_2”的碱基序列如以下序列号7所示。
即,在下述序列号7的碱基序列中带有下划线的核苷酸的3’末端(野生型为“C”)突变为“T”的部分。而从3’末端开始的第2位的碱基“C”是用2′-O,4′-C-亚乙基桥接的核酸修饰的“C”。
序列号7:5′-GCTGTCGGGGTTGACCT-3′
设计的“引物rpoB_2”可以利用Sigma Genosys公司的客户服务(custom service)获得。
(3)通过实时PCR检测进行突变型rpoB基因的检测和假阳性出现的判定
1)PCR用DNA样品的制备
通过测定上述(1)得到的含有突变型rpoB基因序列_2的质粒DNA样品的吸光度,测定质粒DNA样品中的DNA量。然后制备使用10mMTris-HCl缓冲液(pH8.9)将质粒DNA样品稀释为105,104,103,102个拷贝/μL的稀释系列的样品,作为PCR用DNA样品。
2)PCR用反应液的制备
制备含有上述(2)得到的引物rpoB_2和通用引物(M13正向引物、Takara-Bio公司)各300nM、原液30倍稀释(最终30000倍稀释)的发色试剂SYBRTM Green I(Molecular Probe公司商品名)、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/mL BSA、0.1%胆酸钠、0.1%TritonX-100、dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.2mM、和Taq DNA聚合酶(Nippongene生产)40单位/mL的10mM Tris-HCl(pH8.9),作为PCR用反应液。
而此次作为与引物rpoB_2组合的引物,使用M13正向引物,这是由于此次PCR用DNA样品使用了含有突变型rpoB基因序列2的质粒DNA的缘故(以下同)。
3)实时PCR
作为模板DNA(扩增靶)使用上述(1)1)制备的含有突变型rpoB基因序列_2的质粒DNA进行实时PCR。而在以下方法中运用嵌入法进行定量监测,进行实时PCR的结果的研究、评价。
即,将上述(3)1)制备的各稀释系列的PCR用DNA样品1μL、以及上述(3)2)制备的PCR用反应液19μL加入到96孔反应板(MicroAmpoptical 96孔反应板,Applied Biosystem的日本公司制)的孔中,使用TaqManTMPCR专用热循环仪检测器(ABI7500,Applied Biosystem的日本公司制)进行实时PCR。即,于95℃保温10分钟后,反复进行40次循环的于95℃ 15秒钟、60℃ 1分钟的反应。然后测定相对于扩增产物嵌入的SYBRTM Green I的荧光强度。
另外,作为模板DNA使用上述(1)2)制备的含有野生型的rpoB基因序列的质粒DNA,除此之外用与上述(3)同样的方法进行PCR用DNA样品的制备、PCR用反应液的制备和实时PCR。
(4)熔解曲线分析
对于对应于PCR用DNA样品的稀释系列的各个扩增产物,做成以横轴为扩增产物(双链DNA)的解离温度、纵轴为荧光强度的一次微分(变化量)的熔解曲线,进行峰的检测。
(5)结果
图1和图2给出了以使用各DNA样品作为模板进行实时PCR得到的结果为基础做成的熔解曲线。
图1是使用本发明所涉及的引物rpoB_2、以含有突变型rpoB基因序列2的质粒DNA为模板的实时PCR的结果。
而图2是使用本发明所涉及的引物rpoB_2、以含有野生型rpoB基因序列的质粒DNA为模板的实时PCR的结果。
就象图1表明的那样,当使用本发明所涉及的引物rpoB_2、以含有突变型rpoB基因序列_2的质粒DNA为模板进行实时PCR时,可确认DNA的扩增。另外,105,104,103,102个拷贝的DNA样品的熔解曲线的峰位置一致。即Tm值一致。
而与此相反,就象图2表明的那样,当使用本发明所涉及的引物rpoB_2、以含有野生型rpoB基因序列的质粒DNA为模板,同样地进行实时PCR时,却没有出现峰,没有得到DNA的引物延伸产物。
由以上的现象判断,通过使用本发明的在3’末端具有1碱基置换部位,在从3’末端开始的第2位配置带有能够阻止核酸合成反应的修饰的核苷酸的引物进行实时PCR,能够完全抑制检测的假阳性出现,特异而且高准确度地只检测到带有突变序列的靶,即带有突变序列的DNA样品。
比较例1.
(1)含有突变型rpoB基因序列的质粒DNA
使用实施例1(1)得到的“突变型rpoB基因序列_2”。
(2)突变型rpoB基因检测用引物(引物rpoB_2_n3的构建)
设计带有与实施例1(2)得到的引物rpoB_2相同的用序列号7表示的碱基序列,但从引物的3’末端开始的第3位的“C”被用核苷酸类似体(2′-O,4′-C-亚乙基桥接的核酸)修饰,而从3’末端开始的第2位的“C”没有被2′-O,4′-C-亚乙基桥接的核酸修饰的引物。将该引物记为“引物rpoB_2_n3”。
设计的“引物rpoB_2_n3”可以利用Sigma Genosys公司的客户服务获得。
(3)通过实时PCR检测进行突变型rpoB基因的检测和假阳性出现的判定
1)PCR用DNA样品
使用与实施例1(3)1)制备的样品同样的样品(含有突变型rpoB基因序列_2的质粒DNA样品的稀释系列)。
2)PCR用反应液的制备
制备含有上述(2)得到的引物rpoB_2_n3和通用引物(M13正向引物,Takara-Bio公司)各300nM、原液30倍稀释(最终30000倍稀释)的发色试剂SYBRTM Green I(Molecular Probe公司商品名)、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/mL BSA、0.1%胆酸钠、0.1%TritonX-100、dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.2mM、和Taq DNA聚合酶(Nippongene生产)40单位/mL的10mM Tris-HCl(pH8.9),作为PCR用反应液。
3)实时PCR
另外除了作为DNA样品(模板DNA)使用实施例(1)2)制备的含有野生型的rpoB基因序列的质粒DNA以外,用同样的方法进行PCR用DNA样品的制备、反应液的制备和实时PCR。
(4)熔解曲线分析
对于对应于DNA样品的稀释系列的各个扩增产物,做成以横轴为扩增产物(双链DNA)的解离温度、纵轴为荧光强度的一次微分(变化量)的熔解曲线,进行峰的检测。
(5)结果
图3和图4给出了以使用各DNA样品作为模板进行实时PCR得到的结果为基础做成的熔解曲线。
图3是使用引物rpoB_2_n3、以含有突变型rpoB基因序列_2的质粒DNA为模板的实时PCR的结果。
而图4是使用引物rpoB_2_n3、以含有野生型rpoB基因序列的质粒DNA为模板的实时PCR的结果。
就象图3表明的那样,当使用引物rpoB_2_n3、以含有突变型rpoB基因序列_2的质粒DNA为模板进行实时PCR时,可确认DNA的扩增。
然而,就象图4表明的那样,当使用引物rpoB_2_n3、以含有野生型rpoB基因序列的质粒DNA为模板,同样进行实时PCR时,也确认DNA的扩增。即确认有假阳性的峰出现。
由以上的现象判断,使用从3’末端开始的第3位配置带有能够阻止核酸合成反应的修饰的核苷酸的寡核苷酸作为引物进行实时PCR时,不能进行突变型的正确判定。
实施例2.耐药性结核菌的模型检测实验2
(1)含有突变型rpoB基因序列_6的质粒DNA的构建
使用与实施例1(1)1)同样的方法,从rpoB基因高突变区部分的序列的5’末端开始的第68位碱基(野生型为“T”)进行使“T”突变为“C”的突变导入。
将导入了突变的DNA片段使用QIAGEN公司生产的柱子进行纯化后,插入克隆载体(Invitrogen公司生产)。然后使用QIAprepTM SpinMiniprep Kit(QIAGEN公司生产),对含有目的序列的质粒DNA进行纯化、回收。
用上述方法得到的质粒DNA含有下述序列号4的碱基序列。以下将该序列号4表示的碱基序列记为“突变型rpoB基因序列_6”。在“突变型rpoB基因序列_6”的序列中,从其5’端开始的第86位用下划线表示的碱基对应于从rpoB基因高突变区的序列的5’末端开始的第68位碱基。在野生型的rpoB基因中该部分的碱基是“T”,而在“突变型rpoB基因序列_6”中突变为“C”。
序列号4:
5′-TTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCTACAAGCGCCGACTGTCGGCGCCGGGG-3′(突变型rpoB基因序列_6)
(2)突变型rpoB基因检测用引物(引物rpoB_6)的构建
以突变型rpoB基因序列_6为基础,用下述方法设计引物。
首先,(i)将突变型rpoB基因序列_6的导入突变的位点,即从其5’末端开始的第86位碱基“C”配置为相当于引物的3’末端,(ii)引物的其它序列配置为与突变型rpoB基因序列_6的5’末端的第86位碱基“C”5’侧的14个碱基序列相同,而且(iii)按照从引物的3’端开始的第2位碱基“C”是用2′-O,4′-C-亚乙基桥接的核酸修饰的“C”那样设计突变型rpoB基因检测用引物序列。将这样设计的寡核苷酸记为“引物rpoB_6”。“引物rpoB_6”的碱基序列如以下序列号8所示。
即,在下述序列号8的碱基序列中带有下划线的核苷酸的3’末端(野生型为“T”)是突变为“C”的部分。而从3’末端开始的第2位的碱基“C”是用2′-O,4′-C-亚乙基桥接的核酸修饰的“C”。
序列号8:5′-CCGACTGTCGGCGCC-3′
设计的“引物rpoB_6”可以利用Sigma Genosys公司的客户服务获得。
(3)通过实时PCR检测进行突变型rpoB基因的检测和假阳性出现的判定
1)PCR用DNA样品的制备
通过测定上述(1)得到的含有突变型rpoB基因序列_6的质粒DNA样品的吸光度,测定质粒DNA样品中的DNA量。然后制备使用10mMTris-HCl缓冲液(pH8.9)将质粒DNA样品稀释为105,104,103,102个拷贝/μL的稀释系列的样品,作为PCR用DNA样品。
2)PCR用反应液的制备
制备含有上述(2)得到的引物rpoB_6、以及通用引物(M13正向引物、Takara-Bio公司)各300nM、原液稀释30倍(最终30000倍稀释)的发色试剂SYBRTM Green I(Molecular Probe公司商品名)、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/mL BSA、0.1%胆酸钠、0.1%TritonX-100、dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.2mM、和Taq DNA聚合酶(Nippongene生产)40单位/mL的10mM Tris-HCl(pH8.9),作为PCR用反应液。
3)实时PCR
作为模板DNA(扩增靶)使用上述(1)制备的含有突变型rpoB基因序列_6的质粒DNA进行实时PCR。另外,在以下方法中运用嵌入法进行定量监测,进行实时PCR的结果的研究、评价。
即,将上述(3)1)制备的各稀释系列的PCR用DNA样品1μL、以及上述(3)2)制备的PCR用反应液19μL加入到96孔反应板(MicroAmpoptical 96孔反应板,Applied Biosystem的日本公司制)的孔中,使用TaqManTMPCR专用热循环仪·检测器(ABI7500,Applied Biosystem的日本公司制)进行实时PCR。即于95℃保温10分钟后,反复进行40次循环的95℃ 15秒钟、60℃ 1分钟的反应。然后测定扩增产物中嵌入的SYBRTM Green I的荧光强度。
另外除了作为模板DNA使用实施例(1)2)制备的含有野生型的rpoB基因序列的质粒DNA以外,用与实施例2(3)同样的方法进行PCR用DNA样品的制备、PCR用反应液的制备和实时PCR。
(4)熔解曲线分析
对于对应于PCR用DNA样品的稀释系列的各个扩增产物,做成以横轴为扩增产物(双链DNA)的解离温度、纵轴为荧光强度的一次微分(变化量)的熔解曲线,进行峰的检测。
(5)结果
图5和图6给出了以使用各DNA样品作为模板进行实时PCR得到的结果为基础做成的熔解曲线。
图5是使用本发明所涉及的引物rpoB_6、以含有突变型rpoB基因序列_6的质粒DNA为模板的实时PCR的结果。
而图6是使用本发明所涉及的引物rpoB_6、以含有野生型rpoB基因序列的质粒DNA为模板的实时PCR的结果。
就象图5表明的那样,当使用本发明所涉及的引物rpoB_6、以含有突变型rpoB基因序列_6的质粒DNA为模板进行实时PCR时,可确认DNA的扩增。另外105,104,103,102个拷贝的DNA样品的熔解曲线的峰位置一致。即Tm值一致。
与此相反,就象图6表明的那样,当使用本发明所涉及的引物rpoB_6、以含有野生型rpoB基因序列的质粒DNA为模板进行实时PCR时,没有出现峰,没有得到DNA的引物延伸产物。
由以上的现象判断出通过使用在本发明的3’末端具有1碱基置换部位,在从3’末端开始的第2位配置带有能够阻止核酸合成反应的修饰的核苷酸的引物进行实时PCR,能够完全抑制检测的假阳性出现,特异而且高准确度地只检测带有突变序列的靶。
实施例3.多个突变基因的同时检测
(1)含有突变型rpoB基因序列的质粒DNA的构建
1)含有突变型rpoB基因序列_3的质粒的构建
使用与实施例1(1)1)同样的方法,对从rpoB基因高突变区部分的序列的5’末端开始的第46位碱基(野生型为“C”),进行使“C”突变为“G”的突变导入。
将导入了突变的DNA片段使用QIAGEN公司生产的柱子进行纯化后,插入克隆载体(Invitrogen公司生产)。然后使用QIAprepTM SpinMiniprep Kit(QIAGEN公司生产),对含有目的序列的质粒DNA进行纯化、回收。
用上述方法得到的质粒DNA含有下述序列号5的碱基序列。以下将该序列号5表示的碱基序列记为“突变型rpoB基因序列_3”。在“突变型rpoB基因序列_3”的序列中,从其5’末端开始的第64位用下划线表示的碱基对应于从rpoB基因高突变区的序列的5’末端开始的第46位碱基。因此,在野生型的rpoB基因中该部分的碱基是“C”,但在“突变型rpoB基因序列_3”中突变为“G”。
序列号5:
5′-TTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCGACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGG-3′(突变型rpoB基因序列_3)
2)含有突变型rpoB基因序列_4的质粒的构建
使用与实施例1(1)1)同样的方法,从rpoB基因高突变区部分的序列的5’末端开始的第47位碱基(野生型为“A”),进行使“A”突变为“T”的突变导入。
将导入了突变的DNA片段使用QIAGEN公司生产的柱子进行纯化后,插入克隆载体(Invitrogen公司生产)。然后使用QIAprepTM SpinMiniprep Kit(QIAGEN公司生产),对含有目的序列的质粒DNA进行纯化、回收。
用上述方法得到的质粒DNA含有下述序列号6的碱基序列。以下将该序列号6表示的碱基序列记为“突变型rpoB基因序列_4”。在“突变型rpoB基因序列_4”的序列中,从其5’末端开始的第65位用下划线表示的碱基对应于从rpoB基因高突变区的序列的5’末端开始的第47位碱基。因此在野生型的rpoB基因中该部分的碱基是“A”,但在“突变型rpoB基因序列_4”中突变为“T”。
序列号6:
5′-TTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCTCAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGG-3′(突变型rpoB基因序列_4)
(2)突变型rpoB基因检测用引物的构建
1)“引物rpoB_3”的构建
以突变型rpoB基因序列_3为基础用下述方法设计引物。
首先,(i)将突变型rpoB基因序列_3的导入突变的位点,即从其5’末端开始的第64位碱基“G”配置为相当于引物的3’末端,(ii)引物的其它序列配置为与突变型rpoB基因序列_3的5’末端的第64位碱基“G”5’侧的16个碱基序列相同,而且(iii)按照从引物的3’末端开始的第2位碱基“C”变成用2′-O,4′-C-亚乙基桥接的核酸修饰的“C”那样设计突变型rpoB基因检测用引物序列。将这样设计的寡核苷酸记为“引物rpoB_3”。“引物rpoB_3”的碱基序列如以下序列号9所示。
即,在下述序列号9的碱基序列中带有下划线的核苷酸的3’末端(野生型为“C”)是突变为“G”的部分。而从3’末端开始的第2位的碱基“C”是用2′-O,4′-C-亚乙基桥接的核酸修饰的“C”。
序列号9:5′-GCTGTCGGGGTTGACCG-3′
设计的“引物rpoB_3”可以利用Sigma Genosys公司的客户服务获得。
2)“引物rpoB_4”的构建
以突变型rpoB基因序列_4为基础,用下述方法设计引物。
首先,(i)将突变型rpoB基因序列_4的导入突变的位点,即从其5’末端开始的第47位碱基“T”配置为相当于引物的3’末端,(ii)引物的其它序列配置为与突变型rpoB基因序列_4的5’末端的第47位碱基“T”5’侧的16个碱基碱基序列相同,而且(iii)按照从引物的3’末端开始的第2位碱基“C”变成用2′-O,4′-C-亚乙基桥接的核酸修饰的“C”那样设计突变型rpoB基因检测用引物序列。将这样设计的寡核苷酸记为“引物rpoB_4”。“引物rpoB_4”的碱基序列如以下序列号10所示。
即,在下述序列号10的碱基序列中带有下划线的核苷酸的3’末端(野生型为“A”)是突变为“T”的部分。而从3’末端开始的第2位的碱基“C”是用2′-O,4′-C-亚乙基桥接的核酸修饰的“C”。
序列号10:5′-CTGTCGGGGTTGACCCT-3′
设计的“引物rpoB_4”可以利用Sigma Genosys公司的客户服务获得。
(3)通过实时PCR检测进行突变型rpoB基因的检测和假阳性出现的判定
1)PCR用DNA样品的制备
通过测定上述(1)1)得到的含有突变型rpoB基因序列_3的质粒DNA样品、上述(1)2)得到的含有突变型rpoB基因序列_4的质粒DNA样品的吸光度,测定各个质粒DNA样品中的DNA量。
然后制备使用10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.9)分别将实施例1(1)1)得到的含有突变型rpoB基因序列_2的质粒DNA样品、上述(1)1)得到的含有突变型rpoB基因序列_3的质粒DNA样品、上述(1)2)得到的含有突变型rpoB基因序列_4的质粒DNA样品稀释成105,104,103,102个拷贝/μL的稀释系列的样品,分别作为PCR用DNA样品。
2)PCR用反应液的制备
制备含有实施例1(2)得到的引物rpoB_2、上述(2)得到的引物rpoB_3以及引物rpoB_4和通用引物(M13正向引物、Takara-Bio公司)各300nM、原液稀释30倍(最终30000倍稀释)的发色试剂SYBRTM Green I(MolecularProbe公司商品名)、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/mL BSA、0.1%胆酸钠、0.1%TritonX-100、dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.2mM、和Taq DNA聚合酶(Nippongene制)40单位/mL的10mM Tris-HCl(pH8.9),作为PCR用反应液。即,该反应液含有引物rpoB_2、引物rpoB_3和引物rpoB_4这3种突变型rpoB基因检测用引物。
2)实时PCR
作为模板DNA(扩增靶)使用实施例1(1)1)制备的含有突变型rpoB基因序列_2的质粒DNA,上述(1)1)制备的含有突变型rpoB基因序列_3的质粒DNA,或上述(1)2)制备的含有突变型rpoB基因序列_4的质粒DNA进行实时PCR。另外,在以下方法中运用嵌入法进行定量监测,对实时PCR的结果进行研究和评价。
即,将上述(3)1)制备的各稀释系列的PCR用DNA样品1μL、以及上述(3)2)制备的PCR用反应液19μL加入到96孔反应板(MicroAmpoptical 96孔反应板,Applied Biosystem的日本公司制)的孔中,使用TaqManTMPCR专用热循环仪检测器(ABI7500,Applied Biosystem的日本公司制)进行实时PCR。即于95℃保温10分钟后,反复进行40次循环于95℃ 15秒钟、60℃ 1分钟的反应。然后测定扩增产物中嵌入的SYBRTMGreen I的荧光强度。
(4)熔解曲线分析
对于对应于PCR用DNA样品的稀释系列的各个扩增产物,做成以横轴为扩增产物(双链DNA)的解离温度、纵轴为荧光强度的一次微分(变化量)的熔解曲线,进行峰的检测。
(5)结果
图7~图9给出了以使用各DNA样品作为模板,使用引物rpoB_2、引物rpoB_3和引物rpoB_4的混合引物进行实时PCR得到的结果为基础做成的熔解曲线。
图7是使用含有突变型rpoB基因序列_2的质粒DNA为模板进行实时PCR的结果。
图8是使用含有突变型rpoB基因序列_3的质粒DNA为模板进行实时PCR的结果。
图9是使用含有突变型rpoB基因序列_4的质粒DNA为模板进行实时PCR的结果。
比较例2.
除了作为模板DNA使用实施例1(1)2)得到的含有野生型rpoB基因序列的质粒DNA以外,用与实施例3(3)同样的方法进行PCR用DNA样品的制备、PCR用反应液的制备以及使用引物rpoB_2、引物rpoB_3、引物rpoB_4和M13正向引物进行实时PCR,测定扩增产物中嵌入的SYBRTMGreen I的荧光强度。
然后对于对应于PCR用DNA样品的稀释系列的各个扩增产物,做成以横轴为扩增产物(双链DNA)的解离温度、纵轴为荧光强度的一次微分(变化量)的熔解曲线,进行峰的检测。
图10给出了以各DNA样品作为模板进行实时PCR得到的结果为基础做成的熔解曲线。
就象图10表明的那样,使用多种本发明所涉及的引物、以具有野生型的序列的质粒DNA作为模板进行实时PCR时,没有出现引物延伸产物的峰。与此相反,就象图7~9表明的那样当使用多种本发明所涉及的引物,分别以具有突变型rpoB基因序列_2、突变型rpoB基因序列_3或突变型rpoB基因序列_4的质粒DNA作为模板进行实时PCR时,无论那种情况都能得到引物延伸产物。即,通过一次使用3种本发明所涉及的引物,可以检测3种基因突变。
由以上现象判断出在使用多个本发明所涉及的引物进行实时PCR时,也能够完全抑制假阳性,而且由于通过一次反应的PCR对应多种突变模式,所以组成利用多重PCR(multiplex PCR)的耐药性判定系统成为可能。
产业上利用的可能性
对于在例如结核症诊断(治疗)中认为必须要进行的菌的耐性研究的药剂敏感性试验,作为基因诊断项目利用在线(in-Line)(芯片上(Onchip)PCR系统)的分离检测,并与结核菌和非结核性抗酸菌症的基因诊断联用,可以在一个试管(1个系统)内进行耐药性判定。
特别是通过本发明由于能够完全抑制判定的假阳性,而且通过1次PCR反应对应于多种类的突变模式,所以有可能组成通过多重PCR一次检测多个可能的基因突变的耐药性判定系统。
序列表
<110>和光纯药工业株式会社
<120>突变基因的检测方法
<130>F1689WAKOPAT
<150>JP 2006-067495
<151>2006-03-13
<160>10
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>72
<212>DNA
<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400>1
<210>2
<211>90
<212>DNA
<213>结核分枝杆菌
<400>2
<210>3
<211>90
<212>DNA
<213>结核分枝杆菌
<220>
<221>rpoB
<222>(64)..(64)
<223>突变
<220>
<221>突变
<222>(64)..(64)
<223>rpoB
<400>3
<210>4
<211>90
<212>DNA
<213>结核分枝杆菌
<220>
<221>突变
<222>(86)..(86)
<223>rpoB
<400>4
<210>5
<211>90
<212>DNA
<213>结核分枝杆菌
<220>
<221>突变
<222>(64)..(64)
<223>rpoB
<400>5
<210>6
<211>90
<212>DNA
<213>结核分枝杆菌
<220>
<221>突变
<222>(65)..(65)
<223>rpoB
<400>6
<210>7
<211>17
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>7
<210>8
<211>15
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>8
<210>9
<211>17
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>9
<210>10
<211>17
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>10
Claims (12)
1.核酸序列突变的检测方法,其特征在于,使用如下(a)~(d)中任一项所述的寡核苷酸或其盐作为引物,以样品中的核酸作为模板进行核酸扩增反应,检测反应产物,
(a)i)在3’末端部位具有与对象基因的突变核苷酸相同的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列相同,具有与可能存在上述突变核苷酸的上述对象基因上的位置5’侧的对象基因的核苷酸序列相同的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐,
(b)i)在3’末端部位具有与对象基因的突变核苷酸互补的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列互补,具有与可能存在上述突变核苷酸的上述对象基因上的位置3’侧的对象基因的核苷酸序列互补的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐,
(c)i)在3’末端部位具有与对象基因的基准核苷酸相同的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列相同,具有与上述基准核苷酸在上述对象基因上的位置5’侧的对象基因的核苷酸序列相同的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐,
(d)i)在3’末端部位具有与对象基因的基准核苷酸互补的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列互补,具有与上述基准核苷酸在上述对象基因上的位置3’侧的对象基因的核苷酸序列互补的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐。
2.权利要求1所述的检测方法,其中作为引物还含有与权利要求1中作为引物使用的寡核苷酸配对的、通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸。
3.权利要求1或2所述的检测方法,其中组成引物的碱基为15~30个。
4.权利要求1所述的检测方法,其中通过使用引物的组合,特异地检测核酸的突变型,所述引物的组合为在3’末端部位具有与对象基因的突变核苷酸相同的核苷酸;3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列相同,具有与可能存在上述突变核苷酸的上述对象基因上的位置5’侧的对象基因的核苷酸序列相同的序列;并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的寡核苷酸或其盐和与该寡核苷酸配对的通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸的组合,当所述组合的引物以样品中的核酸作为模板进行核酸扩增反应时,若该样品中的核酸为突变型的情形时,能够得到目的的反应产物,若该样品中的核酸为野生型的情形时,不能得到目的的反应产物。
5.权利要求1所述的检测方法,其中核酸序列突变是基因多态性。
6.权利要求5所述的检测方法,其中基因多态性是单碱基置换、单碱基缺失或单碱基插入。
8.权利要求1所述的检测方法,其中结合了阻止核酸合成反应的修饰的核苷酸是结合了2’-O,4’-C-亚乙基桥接的核酸(ENA)的核苷酸。
9.权利要求1所述的检测方法,其中核酸扩增反应是聚合酶链反应(PCR)。
10.核酸序列突变的检测用试剂盒,其包含下述(a)~(d)中任一项所述的寡核苷酸或其盐作为引物:
(a)i)在3’末端部位具有与对象基因的突变核苷酸相同的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列相同,具有与可能存在上述突变核苷酸的上述对象基因上的位置5’侧的对象基因的核苷酸序列相同的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐,
(b)i)在3’末端部位具有与对象基因的突变核苷酸互补的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列互补,具有与可能存在上述突变核苷酸的上述对象基因上的位置3’侧的对象基因的核苷酸序列互补的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐,
(c)i)在3’末端部位具有与对象基因的基准核苷酸相同的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列相同,具有与上述基准核苷酸在上述对象基因上的位置5’侧的对象基因的核苷酸序列相同的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐,或
(d)i)在3’末端部位具有与对象基因的基准核苷酸互补的核苷酸,
ii)3’末端部位以外的部位与对象基因的核苷酸序列互补,具有与上述基准核苷酸在上述对象基因上的位置3’侧的对象基因的核苷酸序列互补的序列,
iii)并且从3’末端开始的第2位核苷酸带有能够阻止核酸合成反应的修饰的
寡核苷酸或其盐。
11.权利要求10所述的试剂盒,其中还含有与该寡核苷酸配对的、通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸作为引物。
12.权利要求11所述的试剂盒,其中还含有
1)核苷三磷酸、
2)核酸合成酶、
3)与该寡核苷酸配对的、通过核酸扩增反应能够扩增目的序列部分的寡核苷酸、和
4)PCR缓冲液。
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