DE69913705T2

DE69913705T2 - Neue cofaktoren für methyltransferasen

Info

Publication number: DE69913705T2
Application number: DE69913705T
Authority: DE
Inventors: Marc Pignot; Elmar Weinhold
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1998-07-29
Filing date: 1999-07-28
Publication date: 2004-09-30
Anticipated expiration: 2019-07-29
Also published as: CA2338721C; CA2338721A1; EP1102781A1; US6875750B1; DE69913705D1; DK1102781T3; WO2000006587A1; ES2211138T3; PT1102781E; JP2002521488A; ATE256696T1; EP1102781B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Aziridinderivate, welche als Cofaktoren für Methyltransferasen verwendet werden können, Komplexe und Zusammensetzungen, welche diese Verbindungen enthalten, und deren Verwendung zur Modifizierung eines Ziel-Moleküls.
Nicht-radioaktiv gelabelte Nucleinsäuren sind in der Molekularbiologie von beträchtlichem Interesse, da sie ohne die potentiellen Gesundheitsgefahren von radioaktivem Material beim Sequenzieren von DNA verwendet werden können und als Proben für Southern/Northern-Blots, in situ Hybridisierungen und Kolonie/Plaque-Screenings dienen können. Mehrere Verfahren von kovalentem Modifizieren von DNA und RNA sind gegenwärtig auf dem Fachgebiet bekannt (berichtet von C. Kessler in Nonisotopic DNA Probe Techniques, L. J. Kricka (Herausg.), Academic Press, San Diego, 1992, Seiten 29 bis 92). Zum Beispiel können modifizierte Oligonucleotide durch Festphasen- DNA- oder RNA-Synthese erhalten werden und die so modifizierten Oligodesoxynucleotide können als Primer für eine DNA-Polymerase verwendet werden (P. Richterich, G. M. Church, Methods Enzym. 1993, 218, 187 bis 222). Wenn die Modifizierung nicht den bei der Festphasensynthese verwendeten Reaktionsbedingungen standhalten kann, ist eine Einbringung von Amin- oder Thiol-Gruppen und eine Markierung der erhaltenen Oligonucleotide mit reaktiven Amin- oder Thiol-Proben nach der Synthese möglich (D. M. Jameson, W. H. Sawyer, Methods Enzym. 1995, 246, 283 bis 300). Zudem können mehrere Markierungen an terminale Phosphat- oder Thiophosphat-Reste in Oligonucleotiden gekoppelt werden (J. -L. Mergny et al., Nucleic Acids Res. 1994, 22, 920 bis 928).
Ein anderes auf dem Fachgebiet beschriebenes Verfahren ist die Einbringung von modifizierten Desoxynucleosidtriphosphaten in DNA mit DNA-Polymerasen (A. Waggoner, Methods Enzym. 1995, 246, 362 bis 373) oder mit terminaler Desoxynucleotidyltransferase (L. K. Riley, M. E. Marshall, M. S. Coleman, DNA 1986, 5, 333 bis 338; G. L. Trainor, M. A. Jensen, Nucleic Acids Res. 1988, 16, 11846).
Darüber hinaus können mehrere Modifizierungen direkt in die DNA oder RNA eingebracht werden. Zum Beispiel können Cytosin-Reste über Aktivierung mit Bisulfit, gefolgt von Koppeln mit aliphatischen Aminen modifiziert werden (R. P. Viscidi, Methods Enzym. 1990, 184, 600 bis 607; D. E. Draper, L. Gold, Biochemistry 1980, 19, 1774 bis 1781). Außerdem sind andere chemische Reagenzien zum Markieren von DNA und RNA im Handel erhältlich (FastTag, Vector, Burlingame, CA; Mirus Label IT, Pan Vera Corporation, Madison, WI). Die letzteren Verfahren führen jedoch nicht zu quantitativen und sequenz-spezifischen Modifizierungen und folglich werden komplexe Gemische erhalten.
Nicht-radioaktives Markieren von Proteinen ist einfach, da sich ihre Cystein- und Lysin-Reste in einfacher Weise mit einer großen Vielfalt an Markierungs-Reagenzien umsetzen (M. Brinkley, Bioconjugate Chem. 1992, 3, 2 bis 13; R. P. Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 1996, Molecular Probes Inc., Eugene, OR). Proteine enthalten jedoch im Allgemeinen viele Lysin- oder Cystein-Reste und das Markieren führt oft zu komplexen Gemischen, welche schwierig zu analysieren sind. Folglich ist die spezielle Modifizierung von Proteinen sogar schwieriger, als die von DNA und RNA. Eine Strategie, speziell markierte Proteine zu erhalten, ist, ein Protein mit einem einzelnen Cystein-Rest mittels einer Mutagenese aufzubauen; darauffolgend wird dieser Cystein-Rest zum Beispiel mit einer fluoreszierenden Gruppe modifiziert (G. Haran, E. Haas, B. K. Szpikowska, M. T. Mas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 11764 bis 11768).
Darüber hinaus können nicht-natürliche Aminosäuren über in vitro Translation in Proteine eingebracht werden (V. W. Cornish, D. Mendel, P. G. Schultz, Angew. Chem. 1995, 107, 677 bis 690; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 620 bis 630). Jedoch kann dieses Verfahren nicht in einfacher Weise durchgeführt werden und es führt nur zu einer kleinen Menge an modifiziertem Protein.
Eine andere Möglichkeit ist die Herstellung von modifizierten Proteinen über chemische Peptid-Synthese (T. W. Muir, S. B. H. Kent, Current Opinion in Biotechnology 1993, 4, 420 bis 427); dies ist jedoch im Allgemeinen auf die Herstellung von relativ kurzen Protein-Ketten beschränkt. Tetrahedr. Lett. 28 (1987), 2468 bis 72 offenbart die Synthese und Vernetzungseigenschaften eines Desoxyoligonucleotids, welches N⁶,N⁶-Ethanodesoxyadenosin enthält.
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Nachteile der bekannten Verfahren zu überwinden und neue Verbindungen bereitzustellen, welche eine Modifizierung von Biomolekülen (zum Beispiel Markierung) in einer einfachen und wirksamen Weise durch die Verwendung einer Methyltransferase ermöglichen.
Diese Aufgabe wird durch Aziridinderivate der Formel (I) gelöst
wobei X die Bedeutung N oder CH hat, Y die Bedeutung N oder -CR³ hat, R¹ und R³ unabhängig voneinander die Bedeutung H, ³H, -NH(CH₂)_nNHR⁴ oder NH(C₂H₅O)_nC₂H₅NHR⁴ haben, wobei R⁴ ausgewählt ist aus Fluorophoren, Affinitätsmarkierungen, Vernetzungsmitteln, Chromophoren, Proteinen, Peptiden, Aminosäuren, welche gegebenenfalls modifiziert sein können, Nucleotiden, Nucleosiden, Nucleinsäuren, Kohlenhydraten, Lipiden, PEG, Transfektionsreagenzien, Beads und interkalierenden Mitteln, und n eine ganze Zahl von 1 bis 5000 ist, und R² ausgewählt ist aus H, ³H oder -CH₂CH(COOH)(NH₂).
1 zeigt die Anionen-Austauschchromatographie der Enzymreaktion mit M·TaqI von Beispiel 1 nach verschiedenen Inkubationszeiten.
2A zeigt das RP-HPLC/ESI-Massenspektrum des Produkts Doppelstrang-Oligodesoxynucleotid 5·4 von Beispiel 1, welches nach 14,6 Min. eluiert wurde.
2B zeigt das ESI-Massenspektrum des Produkts 5·4 von Beispiel 1, welches über direktes Einfließenlassen erhalten wurde.
3 zeigt die Anionen-Austauschchromatographie der Enzymreaktion mit M·HhaI von Beispiel 1 nach verschiedenen Inkubationszeiten.
4 zeigt das RP-HPLC/ESI-Massenspektrum des Produkts Doppelstrang-Oligodesoxynucleotid 8·7 von Beispiel 1.
5 zeigt die Anionen-Austauschchromatographie (UV- und Fluoreszenz-Detektion) der Enzymreaktion mit M·TaqI von Beispiel 2.
6 zeigt das Chromatogramm von markierter Plasmid-DNA (Beispiel 2, Markierung 3.1 mit M·TaqI) der Anionen-Austauschchromatographie nach verschiedenen Inkubationszeiten (6A: UV-Detektion bei 260 nm; 6B: Fluoreszenz-Detektion).
7 zeigt die Chromatogramme (7A: UV-Detektion bei 260 nm; 7B: Fluoreszenz-Detektion), welche für nicht-markiertes pUC19 (Beispiel 2, Markierung 3.1 ohne M·TaqI) aus Vergleichsgründen erhalten wurden.
8 zeigt die Chromatogramme (8A: UV-Detektion bei 260 nm; 8B: Fluoreszenz-Detektion) von makiertem und nicht-markiertem pUC19 (Beispiel 2, Labeln 3.2 mit und ohne M·HhaI).
Die vorliegende Erfindung wird nun genauer beschrieben.
S-Adenosyl-L-methionin abhängige Methyltransferasen (SAM-abhängige Methyltransferasen) sind eine biologisch wichtige Klasse von Enzymen. Sie stellen etwa 3% der Enzyme dar, welche in der letzten Version von Enzyme Nomenclature, E. C. Webb, Academic Press, San Diego, 1992 aufgeführt sind. Sie katalysieren die Übertragung der aktivierten Methyl-Gruppe vom Cofaktor S-Adenosyl-L-methionin auf Schwefel-, Stickstoff-, Sauerstoff- und Kohlenstoff-Nucleophile von kleinen Molekülen, Phospholipiden, Proteinen, RNA und DNA. Zum Beispiel katalysieren DNA-Methyltransferasen die Methylierung der Position N6 von Adenin und der Positionen C5 oder N4 von Cytosin in speziellen DNA-Sequenzen. Da Restriktions-Endonucleasen gegenüber DNA-Methylierung empfindlich sind, können DNA-Methyltransferasen zur Verringerung der Anzahl an Restriktionsstellen in DNA verwendet werden (M. Nelson, I. Schildkraut, Methods Enzymol. 1987, 155, 41 bis 48).
Die Umsetzung, von welcher bekannt ist, dass sie durch SAM-abhängige Methyltransferasen katalysiert wird, ist schematisch in Reaktionsschema 1 gezeigt, wobei die Verbindung 1 der Cofaktor S-Adenosyl-L-methionin (SAM) ist.
Reaktionsschema 1
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung fanden nun, dass die nachstehenden Aziridinderivate der Formel I als Cofaktoren für SAM-abhängige Methyltransferasen dienen und auf diese Weise die Übertragung von Resten ermöglichen, welche größer als Methyl sind.
Die Aziridinderivate der vorliegenden Erfindung werden durch Formel (I) dargestellt
wobei X die Bedeutung N oder CH hat, Y die Bedeutung N oder -CR³ hat, R¹ und R³ unabhängig voneinander die Bedeutung H, ³H, -NH(CH₂)_nNHR⁴ oder -NH(C₂H₅O)_nC₂H₅NHR⁴ haben, wobei R⁴ ausgewählt ist aus Fluorophoren, Affinitätsmarkierungen, Vernetzungsmitteln, Chromophoren, Proteinen, Peptiden, Aminosäuren, welche gegebenenfalls modifiziert sein können, Nucleotiden, Nucleosiden, Nucleinsäuren, Kohlenhydraten, Lipiden, PEG, Transfektionsreagenzien, Beads und interkalierenden Mitteln, und n eine ganze Zahl von 1 bis 5000 ist, und R² ausgewählt ist aus H, ³H oder -CH₂CH(COOH)(NH₂).
Es ist bevorzugt, dass nur einer der Reste von R¹, R³ die Bedeutung -NH(CH₂)_nNHR⁴ oder -NH(C₂H₅O)_nC₂H₅NHR⁴ hat. In bevorzugten Verbindungen hat X und/oder Y die Bedeutung N; besonders bevorzugt sind Verbindungen, wobei sowohl X als auch Y die Bedeutung N haben.
Im Rest -NH(CH₂)_nNHR⁴ ist n bevorzugt eine ganze Zahl von 2 bis 20, besonders bevorzugt ist es, wenn n gleich 3, 4 oder 5 ist.
Im Rest -NH(C₂H₅O)_nC₂H₅NHR⁴ ist n bevorzugt eine ganze Zahl von 1 bis 250; stärker bevorzugt ist es, wenn n eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist.
Der Ausdruck Fluorophor, so wie er hier verwendet wird, ist eine chemische Einheit, in welcher die Elektronen mit Licht einer bestimmten Energie angeregt werden können und Photonen mit niedrigerer Energie danach emittiert werden.
In bevorzugten Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind R¹ und R² jeweils H oder ³H und X hat die Bedeutung N.
Wenn mindestens ein Rest von R¹, R³ die Bedeutung -NH(CH₂)_nNHR⁴ oder -NH(C₂H₅O)_nC₂H₅NHR⁴ hat, ist R⁴ ausgewählt aus Fluorophoren, Affinitätsmarkierungen, Vernetzungsmitteln, Chromophoren, Proteinen (einschließlich Antikörpern und Enzymen), Peptiden, Aminosäuren, modifizierten Aminosäuren, Nucleotiden, Nucleosiden, Nucleinsäuren, Kohlenhydraten, Lipiden, PEG, Transfektionsreagenzien (einschließlich Polyethylenimin, Makromolekülen, Dendrimeren), Beads (z. B. jenen, welche aus Agarose, Kieselsäure, Nitrocellulose, Cellulose, Acrylamid, Latex, Polystyrol, Polyacrylat, Polymethacrylat, Polyethylen-Polymeren, Glasteilchen, Silicaten, Metalloxiden oder Kombinationen davon bestehen), interkalierenden Mitteln (einschließlich Ethidiumbromid, Psoralen und Derivaten davon). Bevorzugte Fluorophore sind BODIPY, Cumarin, Dansyl, Fluorescein, Mansyl, Pyren, Rhodamin, Texas Rot, TNS und Cyanin-Fluorophore, wie Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 und Cy7; Derivate von diesen Fluorophoren können auch verwendet werden. Eine besonders bevorzugte Bedeutung von R⁴ ist Dansyl.
Wenn R⁴ eine Affinitätsmarkierung ist, ist sie bevorzugt eine Peptid-Markierung, Biotin, Digoxygenin oder Dinitrophenol; nützliche Peptid-Markierungen sind zum Beispiel eine His-Markierung oder irgendeine andere Markierung mit Metall-chelatisierenden Eigenschaften, welche in IMAC (engl. „Immobilized Metal Affinity Chromatography") verwendet werden kann, Strep-Markierung, Flag-Markierung, c-myc-Markierung, Epitope oder Glutathion. Nützliche Vernetzungsmittel sind zum Beispiel Maleimid, Iodacetamid, Derivate davon, Aldehydderivate und Photovernetzungsmittel. Beispiele von Photovernetzungsmitteln sind Arylazid, Diazo-Verbindungen und Benzophenon-Verbindungen.
N-Adenosylaziridin (Verbindung 2) kann zum Beispiel in einer Einstufen-Reaktion über nucleophile Substitution der Tosylat-Gruppe von 5'-Tosyladenosin mit Aziridin synthetisiert werden (siehe nachstehend Reaktionsschema 2).
Reaktionsschema 2
Reaktionsschema 3 zeigt die durch eine Methyltransferase (MTase) katalysierte Umsetzung unter Verwendung des natürlichen Cofaktors 1 und auf der anderen Seite unter Verwendung des neuen Cofaktors 2 gemäß der vorliegenden Erfindung.
Reaktionsschema 3
In Reaktionsschema 4, unten, ist die Modifizierung eines kurzen Doppelstrang-Oligodesoxynucleotids (3·4), welches aus einem Plus-Strang-Oligodesoxynucleotid (5'-GCCGCTCGATGCCG-3', 3) und einem komplementären Minus-Strang-Oligodesoxyvucleotid (5'-CGGCATCGA^MeGCGGC-3', 4) besteht, mit dem protonierten Cofaktor-Analogon 2, welches Aziridin enthält, unter Verwendung der Adenin-spezifischen DNA-Methyltransferase von Thermus aquaticus (M·TaqI) gezeigt. Das komplementäre Minus-Strang-Oligodesoxynucleotid 4 wurde gewählt, da es N6-Methyladenin-1-β-D-2'-desoxynucleosid (A^Me) enthält, welches nicht weiter durch M·TaqI methyliert werden kann. M·TaqI katalysiert normalerweise die Methylgruppen-Übertragung vom natürlichen Cofaktor 1 auf die exocyclische Amino-Gruppe von Adenin in der doppelsträngigen DNA-Sequenz 5'-TCGA-3' (Schema 4, oben)(M. McClelland, Nucleic Acids Res. 1981, 9, 6795 bis 6804).
Die Struktur des Reaktionsprodukts 5·4 kann zum Beispiel über mit Umkehrphasen-HPLC gekoppelter Elektronensprayionisations-Massenspektrometrie (RP-HPLC/ESI-MS) bestätigt werden.
Reaktionsschema 4
Experimentelle Ergebnisse beweisen, dass mit dem nicht-natürlichen Cofaktor 2 der nicht methylierte Plus-Strang 3, welcher ein Adenin an der Ziel-Position in der Erkennungssequenz 5'-TCGA-3' von M·TaqI enthält, quantitativ modifiziert wird. Unsere Beobachtung, dass Strang 4, welcher N6-Methyladenin an der anderen Ziel-Position und ein Adenin außerhalb der Erkennungssequenz enthält, nicht modifiziert wird, zeigt, dass die Sequenzspezifität von M·TaqI mit dem neuen Cofaktor 2 nicht verändert wird. Außerdem führte eine enzymatische Fragmentierung des Produkt-Doppelstrangs 5·4, gefolgt von Umkehrphasen-HPLC-Analyse, zu einer zusätzlichen Verbindung neben den natürlichen Nucleosiden dC, dA, dG, T und dA^Me. Diese zusätzliche Verbindung wurde isoliert und über Elektronensprayionisations-Massenspektrometrie als positiv geladenes Ion bei einem m/z von 544,6 detektiert. Die beobachtete Masse ist identisch mit der berechneten Molekularmasse eines protonierten, mit N-Adenosylaziridin modifizierten 2'-Desoxyadenosins. Dieses Ergebnis zeigt, dass nur das Ziel-Adenin im Plus-Strang 3 modifiziert wird. Folglich ist das durch M·TaqI katalysierte Koppeln des neuen Cofaktors 2 mit DNA quantitativ, sequenz- und basenspezifisch.
Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf M·TaqI einschränkt, sondern die für C5-Cytosin spezifische DNA-Methyltransferase Haemophilus haemolyticus (M·HhaI) und andere Methyltransferasen, welche normalerweise S-Adenosyl-L-methionin (SAM) als Cofaktor verwenden, können auch verwendet werden. Dies wird in einfacher Weise über die Modifizierung des Doppelstrang-Oligodesoxynucleotids 6·7 unter Verwendung von M·HhaI gezeigt. Von Natur aus katalysiert M·HhaI die Übertragung des aktivierten Methyls von SAM auf das Kohlenstoffatom an der Position 5 des ersten Cytosins in der doppelsträngigen DNA-Sequenz 5'-GCGC-3' (Schema 5, oben). Experimentelle Ergebnisse beweisen, dass M·HhaI auch den neuen Cofaktor 2 akzeptiert und dessen Kopplung an das Doppelstrang-Oligodesoxynucleotid 6·7 katalysiert (Schema 5, unten). Wie die durch M·TaqI katalysierte Umsetzung verläuft die durch M·HhaI katalysierte Kopplung quantitativ.
Reaktionsschema 5
Diese Anmeldung beschreibt zum ersten Mal die Übertragung einer Gruppe, die größer als eine Methyl-Gruppe ist, welche durch zwei verschiedene von S-Adenosyl-L-methionin abhängige Methyltransferasen katalysiert wird. Da die Übertragung von zum Beispiel Verbindung 2 eine einzigartige sekundäre Amino-Gruppe in die DNA einführt, sollten darauffolgende Markierungs-Reaktionen mit Amin-reaktiven Proben durchführbar sein. Folglich ist eine Stellen-spezifische Einführung von fluoreszierenden, chemolumineszierenden oder anderen „Reporter-Gruppen" möglich.
Alternativ kann der neue fluoreszierende Cofaktor 9, wobei R¹ die Bedeutung -NH(CH₂)₄NHR⁴ hat, R² die Bedeutung H hat, Y die Bedeutung N hat und R⁴ die fluoreszierende Dansyl-Gruppe ist, verwendet werden, um direkt Sequenz-spezifisch markierte DNA zu erhalten. Dieses fluoreszierende N-Adenosylaziridin-Derivat enthält die reaktive Aziridin-Gruppe in der Position 5', die Adenosyl-Einheit, welche als der molekulare Anker für das Cofaktor-Binden von Methyltransferasen dient, und die fluoreszierende Dansyl-Gruppe (Markierung), welche an der Position 8 über einen flexiblen Linker angebracht ist. Die Synthese dieses neuen fluoreszierenden Cofaktors 9 ist in Schema 6 veranschaulicht. Eine Umsetzung von 8-Brom-2',3'-O-isopropylidenadenosin mit 1,4-Diaminobutan führt zum geschützten Adenosin-Derivat 10 mit einem Amino-Linker an der Position 8. Vorübergehendes Schützen der 5'-Hydroxy-Gruppe mit Trimethylchlorsilan, Koppeln von Dansylchlorid mit dem primären Amin und Entfernen der 5'-Hydroxyl-Schutzgruppe führt zum geschützten fluoreszierenden Adenosin-Derivat 11. Umsetzung von 11 mit Mesylchlorid führt zum Mesylat 12. Eine Entfernung der Isopropyliden-Gruppe von 12 unter sauren Bedingungen führt zum fluoreszierenden Adenosin-Derivat 13, welches mit Aziridin umgesetzt wird, um den neuen fluoreszierenden Cofaktor 9 zu erhalten.
Reaktionsschema 6
Dem durch M·TaqI katalysierten Koppeln des neuen fluoreszierenden Cofaktors 9 mit dem Doppelstrang-Oligodesoxynucleotid 3·4 (Schema 7) folgte Anionen-Austauschchromatographie. Nach der proteolytischen Fragmentierung des gebildeten M·TaqI-DNA-Komplexes wird das fluoreszierend markierte Doppelstrang-Oligodesoxynucleotid 144 gebildet. Die Struktur des Produkts 144 wurde durch enzymatische Fragmentierung, gefolgt von Umkehrphasen-HPLC bestätigt. Die Analyse enthüllte neben den natürlichen Nucleosiden dC, dA, dG, T und dA^Me eine zusätzliche fluoreszierende Verbindung, welche bei einer viel höheren Retentionszeit als die natürlichen Nucleoside eluierte, wodurch deren hydrophobe Beschaffenheit angezeigt wurde. Diese zusätzliche fluoreszierende Verbindung wurde isoliert und über Elektronensprayionisations-Massenspektrometrie als positiv geladenes Ion bei einem m/z von 863,1 detektiert. Die beobachtete Masse ist in guter Übereinstimmung mit der berechneten Molekularmasse von 863,4 für ein protoniertes, mit 9 modifiziertes 2'-Desoxyadenosin. Folglich ist die durch M·TaqI katalysierte Kopplungsreaktion des neuen fluoreszierenden Cofaktors 9 mit DNA quantitativ und basenspezifisch.
Reaktionsschema 7
Die vorliegende Erfindung kann auch zum Markieren von größeren DNA-Molekülen verwendet werden. Dies wird durch das Markieren des Plasmids pUC19 (2.686 Basenpaare) mit dem neuen fluoreszierenden Cofaktor 9 und M·TaqI bewiesen. Die Markierungs-Reaktion wurde über Anionen-Austauschchromatographie nach unterschiedlichen Inkubationszeiten analysiert. Während sich die Chromatogramme unter Verwendung von UV-Detektion nicht wesentlich veränderten, zeigten die Chromatogramme unter Verwendung von Fluoreszenz-Detektion eindeutig einen Anstieg des Fluoreszenzsignals mit der Inkubationszeit. Das UV-Signal und das Fluoreszenzsignal liegen übereinander und zeigen, dass das Ausgangsmaterial pUC19 (nur UV-Absorption) und das fluoreszierend markierte pUCl9 (UV-Absorption und Fluoreszenz) mit der gleichen Retentionszeit eluieren. In einem parallel durchgeführten Kontrollexperiment ohne M·TaqI wurde kein Fluoreszenzsignal, welches dem fluoreszierend markierten pUC19 entspricht, beobachtet. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Markierungs-Reaktion wirklich durch M·TaqI katalysiert wird. Interessanterweise fungiert das fluoreszierende Nucleosid 9 auch als ein Cofaktor für M·HhaI. Eine Analyse der durch M·HhaI katalysierten Kopplungsreaktion zwischen fluoreszierendem Nucleosid 9 und pUC19 durch Anionen-Austauschchromatographie zeigt, dass auch fluoreszierend markiertes pUC 19 hergestellt wird und dass ohne M·HhaI keine Markierung stattfindet.
Die dreidimensionalen Strukturen von mehreren Methyltransferasen im Komplex mit dem natürlichen Cofaktor zeigen (N6-Adenin DNA-Methyltransferase M·TaqI: J. Labahn, J. Granzin, G. Schluckebier, D. P. Robinson, W. E. Jack, I. Schildkraut, W. Saenger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 10957 bis 10961; N6-Adenin DNA-Methyltransferase DpnM: P. H. Tran, Z. R. Korszun, S. Cerritelli, S. S. Springhorn, S. A. Lacks, Structure 1998, 6, 1563 bis 1575; C5-Cytosin DNA-Methyltransferase M·HhaI: S. Klimasauskas, S. Kumar, R. J. Roberts, X. Cheng, Cell 1994, 76, 357 bis 369; N4-Cytosin DNA-Methyltransferase M·Pvull: W. Gong, M. O'Gara, R. M. Blumenthal, X. Cheng, Nucleic Acids Res. 1997, 25, 2702 bis 2715; N6-Adenin RNA-Methyltransferase ErmC': D. E. Bussiere, S. W. Muchmore, C. G. Dealwis, G. Schluckebier, V. L. Nienaber, R. P. Edalji, K. A. Walter, U. S. Ladror, T. F. Holzman, C. Abad-Zapatero, Biochemistry 1998, 37, 7103 bis 7112; 2'-O-Nucleosid mRNA-Methyltransferase VP39: A. E. Hodel, P. D. Gershorn, X. Shi, F. A. Quiocho, Cell 1996, 85, 247 bis 256; Protein-Methyltransferase CheR: S. Djordjevic, A. M. Stock, Structure 1997, 5, 545 bis 558), dass die Position 8 des Adenin-Rings des natürlichen Cofaktors mindestens teilweise für das Lösungsmittel zugänglich ist, und folglich für das Anfügen einer zusätzlichen Gruppe ohne starke Beeinträchtigung des Cofaktor-Bindens von diesen Methyltransferasen geeignet ist. In manchen Methyltransferasen ist die Position 7 des Adenin-Rings des natürlichen Cofaktors sogar stärker dem Lösungsmittel ausgesetzt und deshalb kann diese die bevorzugte Position der Wahl für das Anfügen von zusätzlichen Gruppen (Y in Formel I) bei diesen Methyltransferasen sein. Zudem zeigt die dreidimensionale Struktur der Catechol-O-Methyltransferase COMT im Komplex mit dem natürlichen Cofaktor (J. Vidgren, L. A. Svensson, A. Liljas, Nature 1994, 368, 354 bis 358), dass der Adenin-Ring des natürlichen Cofaktors in der Bindungstasche des Cofaktors abgeschirmt ist. Hier scheint das Anfügen einer zusätzlichen Gruppe am 5'-Aziridin-Ring (R² in Formel I) am stärksten vereinbar mit dem Cofaktor-Binden dieser Methyltransferase zu sein. Folglich können die neuen Cofaktoren mit Modifizierungen an der Position 8 des Adenin-Rings (R¹ in Formel I), an der Position 7 des Adenin-Rings (Y in Formel I) oder am 5'-Aziridin-Ring (R² in Formel I) verwendet werden, um eine große Vielfalt an Stellenspezifisch markierten Biomolekülen zu erhalten.
Die in der vorliegenden Erfindung nützlichen Methyltransferasen übertragen normalerweise die Methyl-Gruppe von SAM auf ein Nucleinsäure-Molekül, wie DNA oder RNA, auf ein Polypeptid, ein Protein, ein Enzym oder ein kleines Molekül. Ein Überblick über SAM-abhängige Methyltransferasen ist zum Beispiel von R. M. Kagan und S. Clarke in Archives of Biochemistry and Biophysics 1994, 310, 417 bis 427 gegeben. Dieser Aufsatz umfasst auch eine Auflistung von O-Methyltransferasen für ein kleines Molekül und N-Methyltransferasen für ein kleines Molekül, welche zum Beispiel Catechol-O-Methyltransferase und Glycin-N-Methyltransferase einschließen.
Besonders bevorzugt zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind Methyltransferasen, welche DNA methylieren, insbesondere jene, welche Teil eines Restriktions-Modifikations-Systems eines Bakteriums sind und Methyltransferasen, welche Proteine an bestimmten Aminosäuren methylieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft nicht nur die Aziridin-Derivate selbst, sondern auch den Komplex eines solchen Derivats und einer Methyltransferase, sowie pharmazeutische und diagnostische Zusammensetzungen, welche ein Azirin-Derivat der vorliegenden Erfindung oder einen Komplex davon mit einer Methyltransferase umfassen.
Die Aziridin-Derivate der vorliegenden Erfindung können zur Modifizierung eines Ziel-Moleküls (z. B. DNA oder Fragmente davon, RNA oder Fragmente davon, Hybride von DNA und RNA, Polypeptide, zum Beispiel Proteine und Fusionsproteine, die eine Methylierungsstelle umfassen, synthetische Polymere und kleine Moleküle, wie Lipide) verwendet werden. Dies kann mittels einer Methyltransferase durch Übertragen eines Aziridin-Derivats der vorliegenden Erfindung oder eines Teiles davon auf das Ziel-Molekül geschehen.
Die vorliegende Erfindung wird nun weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiel 1
1. Synthese von N-Adenosylaziridin, Verbindung 2 (Schema 2).
Trockenes Aziridin (S. Gabriel, Chem. Ber. 1888, 21, 2664 bis 2669; S. Gabriel, R. Stelzner, Chem. Ber. 1895, 28, 2929 bis 2938)(360 μl, 7,2 mmol) wurde langsam zu einer Suspension von 5'-Tosyladenosin (100 mg, 0,24 mmol, Aldrich) in N-Ethyldiisopropylamin (125 μl, 0,7 mmol) unter einer Argon-Atmosphäre gegeben und die so erhaltene Lösung wurde bei Raumtemperatur für drei Tage gerührt. Jedwedes zurückbleibende Aziridin wurde unter verringertem Druck entfernt und das Reaktionsrohprodukt wurde in Wasser (1 ml) gelöst und mit Essigsäure (1 M) neutralisiert. Die Lösung (100 μl pro Zeitpunkt) wurde auf eine Umkehrphasen-HPLC-Säule (Hypersil-ODS, 5 μm, 120 Å, 250 × 10 mm, Bischoff, Leonberg, Deutschland) gespritzt und das Produkt wurde mit einem linearen Gradienten von Acetonitril (7 bis 10% in 30 Min., 2 ml/Min.) in Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (0,1 M, pH-Wert 8,4) eluiert. Fraktionen, die Produkt enthielten (Retentionszeit 11,3 Min., UV-Detektion bei 259 nm), wurden vereinigt, durch Gefriertrocknen auf 5,5 ml aufkonzentriert (10,5 mM, unter Verwendung von λ = 260, ε = 15.400 für Adenosin) und bei –80°C gelagert. Ausbeute: 0,058 mmol (24%). Zur weiteren Charakterisierung wurde ein Aliquot vollständig gefriergetrocknet, wobei Verbindung 2 als ein weißer Feststoff erhalten wurde.
¹H-NMR (500 MHz, D₂O): δ = 1,49 bis 1,40 (m, 2H; Aziridin-H), 1,85 bis 1,74 (m, 2H; Aziridin-H), 2,74 und 2,68 (AB-Teil von ABX-Spektrum, ³J = 4,3, 6,6 Hz, ²J = 13,3 Hz, 2H; 5'-H_a, 5'-H_b), 4,35 (ddd = dt, ³J = 4,6, 4,6, 6,7 Hz, 1H; 4'-H), 4,46 (dd = t, ³J = 5,1 Hz, 1H; 3'-H), 4,84 (dd = t, ³J = 5,3 Hz, 1H; 2'-H), 6,13 (d, ³J = 5,0 Hz, 1H; 1'-H), 8,30 (s, 1H; 8-H), 8,36 (s, 1H; 2-H).
FAB-MS (Thioglycolsäure): m/z (%): 293 (100)[M⁺ + H], 250 (4)[M⁺ – C₂H₄N], 178 (11) [B⁺ + C₂H₄O], 167 (34), 165 (5), 164 (5)[B⁺ + CH₂O], 158 (36)[M⁺ – B], 149 (78), 136 (91) [BH₂ ⁺], 102 (23); B = deprotoniertes Adenin.
2. Synthese und Reinigung von Oligodesoxynucleotiden.
Die Oligodesoxynucleotide 3, 4, 6 und 7 wurden mit einer Applied Biosystems 392 DNA/RNA-Synthesevorrichtung unter Verwendung der Standardchemie von β-Cyanoethylphosphoramidit synthetisiert. Die Synthesen wurden „mit Trityl" durchgeführt und die Oligodesoxynucleotide wurden über Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Nach der Abspaltung der Trityl-Gruppen mit Essigsäure (80%) wurden die Oligodesoxynucleotide zudem über Umkehrphasen-HPLC („ohne Trityl") gereinigt und über Gelfiltration entsalzt. Die Doppelstrang-Oligodesoxynucleotide 3·4 und 6·7 wurden über Inkubieren von äquimolaren Mengen der komplementären Stränge in Puffer (20 mM Tris-Acetat, 50 mM Kaliumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, pH-Wert 7,9 für 3·4 und 10 mM Tris-Chlorid, 50 mM Natriumchlorid, 0,5 mM EDTA, pH-Wert 7,4 für 6·7) bei 95°C (2 Min.), gefolgt von langsamen Abkühlen (2 Std.) auf Raumtemperatur, gebildet.
3. Enzymreaktionen
3.1 Enzymreaktion mit der N6-Adenin DNA-Methyltransferase M·TaqI.
Die DNA-Methyltransferase M·TaqI, welche frei von Cofaktor ist, wurde wie vorher beschrieben hergestellt (B. Holz, S. Klimasauskas, S. Serva, E. Weinhold, Nucleic Acids Res. 1998, 26, 1076 bis 1083). Die durch Enzym katalysierte Umsetzung wurde in einem Gemisch (500 μl) von M·TaqI (5 nmol, 10 μM), Doppelstrang-Oligodesoxynucleotid 3·4 (5 nmol, 10 μM), Verbindung 2 (500 nmol, 1 mM), Tris-Acetat (20 mM, pH-Wert 6,0), Kaliumacetat (50 mM), Magnesiumacetat (10 mM) und Triton X-100 (0,01%) bei 37°C durchgeführt. Das Fortschreiten der Umsetzung wurde über Anionen-Austauschchromatographie beobachtet. Aliquote (50 μl) des Reaktionsgemisches wurden nach verschiedenen Inkubationszeiten entnommen, mit einer Harnstoff-Lösung (100 μl, 6 M) gemischt und auf eine Anionenaustausch- Säule (Poros 10 HQ, 10 μm, 4,6 × 100 mm, PerSeptive Biosystems, Deutschland) gespritzt. Die Verbindungen wurden mit wässrigem Kaliumchlorid (0,5 M für 5 Min., gefolgt von einem linearen Gradienten auf 1 M in 30 Min., 4 ml/Min.) in Tris-Chlorid-Puffer (10 mM, pH-Wert 7,6) eluiert. Die Chromatogramme der Anionen-Austauschchromatographie nach verschiedenen Inkubationszeiten sind in 1 gezeigt.
Die Analyse des Produkts Doppelstrang-Oligodesoxynucleotid 5·4 über mit Umkehrphasen-HPLC gekoppelter Elektronensprayionisations-Massenspektrometrie: RP-HPLC/ESI-MS wurde mit einem IT-Massenspektrometer (IT, engl. „ion-trap", Ionenfalle)(LCQ, Finnigan MAT, Deutschland), welches mit einem Mikro-HPLC-System (M480 und M300, Gynkotek, Deutschland) ausgestattet war, durchgeführt. Das Produkt Doppelstrang-Oligodesoxynucleotid 5·4 wurde über Anionen-Austauschchromatographie (siehe vorstehend) gereinigt und über wiederholte Zugabe von Wasser und Ultrafiltration (Microsep 3K, Pall Filtron, Northborough, MA, USA) entsalzt. Eine Lösung von gereinigtem und entsalztem 5·4 wurde auf eine Kapillarsäule (Hypersil-ODS, 3 μm, 150 × 0,3 mm, LC Packings, Amsterdam, Niederlande) gespritzt und mit einem linearen Gradienten von Acetonitril (7 bis 10% in 10 Min., gefolgt von 10 bis 70% in 30 Min., 150 μl/Min.) in Triethylammoniumacetat-Puffer (0,1 M, pH-Wert 7,0) eluiert. Das in 2A gezeigte RP-HPLC/ESI-Massenspektrum wurde unter Verwendung von Standardbedingungen im Negativionen-Modus erhalten. Das durch Beobachten des Gesamtionenstroms erhaltene Chromatogramm ist im Nebenbild von 2A aufgeführt.
Analyse des Produkts Doppelstrang-Oligodesoxynucleotid 5·4 über Elektronensprayionisations-Massenspektrometrie unter Verwendung von direktem Einfließenlassen: Das in 2B gezeigte ESI-Massenspektrum wurde unter Verwendung eines doppelfokussierenden Sektorfeld-Massenspektrometers MAT 90 (Finnigan MAT, Deutschland), welches mit einer ESI II-Elektronenspray-Ionenquelle ausgestattet war, im Negativionen-Modus aufgenommen. Entsalztes 5·4 (wässrige Lösung) und ein flüssiger „Ummantelungsstrom" (2-Propanol) wurden unter Verwendung einer Harvard-Injektionsspritzenpumpe (Harvard Apparatus, USA) zugeführt. Das Nebenbild in 2B zeigt eine Aufspreizung des Signals für das Ion [5-6H]^6– mit Isotopenauflösung.
Die Molekulargewichte der Oligodesoxynucleotide, welche in den Elektronenspray-Massenspektren von 2A und 2B beobachtet werden, sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Außerdem sind die beobachteten Molekulargewichte der Edukt-Oligodesoxynucleotide angegeben.
Tabelle 1
Analyse des Produkts Doppelstrang-Oligodesoxynucleotid 5·4 über enzymatische Fragmentierung: Gereinigtes und entsalztes 5·4 (0,25 OD bei 260 nm) wurde in Kaliumphosphat-Puffer (10 mM, pH-Wert 7,0, 100 μl), welcher Magnesiumchlorid (10 mM), DNase I (1,2 U), Phosphodiesterase von Crotalus durissus (0,018 U), Phosphodiesterase aus Kalbsmilz (0,024 U) und alkalische Phosphatase (6 U) enthielt, gelöst und für 24 Std. bei 37°C inkubiert. Ein Aliquot (50 μl) wurde auf eine Umkehrphasen-HPLC-Säule (Hypersil-ODS, 5 μm, 120 Å, 250 × 4,6 mm, Bischoff, Leonberg, Deutschland) gespritzt und die Produkte wurden mit einem linearen Gradienten von Acetonitril (0 bis 10,5% in 30 Min., 1 ml/Min.) in Triethylammoniumacetat-Puffer (0,1 M, pH-Wert 7,0) eluiert. Die RP-HPLC-Analyse des Verdaus enthüllte neben dC, dA, dG, T und dA^Me eine zusätzliche Verbindung, welche zwischen T und dA^Me eluierte. Diese zusätzliche Verbindung wurde isoliert und über ESI-MS (LCQ, verbunden mit einer Nano-Elektronenspray-Ionenquelle, Finnigan MAT, Deutschland) als positiv geladenes Ion bei einem m/z von 544,6 detektiert. Die beobachtete Masse ist identisch mit der berechneten Molekularmasse eines protonierten, mit N-Adenosylaziridin modifizierten 2'-Desoxyadenosins.
3.2. Enzymreaktion mit der C5-Cytosin DNA-Methyltransferase M·HhaI.
Die DNA-Methyltransferase M·HhaI, welche frei von Cofaktor ist, wurde wie vorher beschrieben hergestellt (B. Holz, S. Klimasauskas, S. Serva, E. Weinhold, Nucleic Acids Res. 1998, 26, 1076 bis 1083). Die durch Enzym katalysierte Umsetzung wurde in einem Gemisch (500 μl) von M·HhaI (5 nmol, 10 μM), Doppelstrang-Oligodesoxynucleotid 6·7 (5 nmol, 10 μM), Verbindung 2 (500 nmol, 1 mM), Tris-Chlorid (10 mM, pH-Wert 7,4), Natriumchlorid (50 mM), EDTA (0,5 mM) und Triton X-100 (0,01%) bei 25°C durchgeführt. Das Fortschreiten der Umsetzung wurde über Anionen-Austauschchromatographie beobachtet. Aliquote (50 μl) des Reaktionsgemisches wurden nach verschiedenen Inkubationszeiten entnommen und auf eine Anionenaustausch-Säule (Poros 10 HQ, 10 μm, 4,6 × 100 mm, PerSeptive Biosystems, Deutschland) gespritzt. Die Verbindungen wurden mit wässrigem Kaliumchlorid (0 M für 5 Min., gefolgt von einem linearen Gradienten auf 0,5 M in 5 Min. und auf 1 M in 30 Min., 4 ml/Min.) in Tris-Chlorid-Puffer (20 mM, pH-Wert 7,6) eluiert. Die Chromatogramme der Anionen-Austauschchromatographie nach verschiedenen Inkubationszeiten sind in 3 gezeigt.
Analyse des Produkts Doppelstrang-Oligodesoxynucleotid 8·7 über mit Umkehrphasen-HPLC gekoppelter Elektronensprayionisations-Massenspektrometrie: RP-HPLC/ESI-MS wurde wie vorstehend für die Analyse von 5·4 beschrieben (siehe Beispiel 1, 3.1) durchgeführt. Das erhaltene RP-HPLC/ESI-Massenspektrum ist in 4 gezeigt und die beobachteten Molekulargewichte der Oligodesoxynucleotide sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 2
Analyse des Produkts Doppelstrang-Oligodesoxynucleotid 8·7 über enzymatische Fragmentierung: Die enzymatische Fragmentierung von 8·7 wurde wie vorstehend für 5·4 beschrieben (siehe Beispiel 1, 3.1) durchgeführt. Die RP-HPLC-Analyse des Verdaus enthüllte neben dC, dC^Me, dA, dG, T eine zusätzliche Verbindung, welche vor dC eluiert.
Beispiel 2
1. Synthese eines fluoreszierenden N-Adenosylaziridin-Derivats, Verbindung 9 (Schema 6)
1.1 8-Amino[1''-(4''-aminobutyl)]-2',3'-O-isopropylidenadenosin, Verbindung 10.
Zu einer Lösung von 8-Brom-2',3'-O-isopropylenadenosin (M. Ikehara, H. Tada, M. Kaneko, Tetrahedron 1968, 24, 3489 bis 3498)(628 mg, 1,6 mmol) in trockenem DMSO (10 ml) unter einer Argon-Atmosphäre wurden trockenes Triethylamin (2,26 ml, 16,3 mmol) und 1,4-Diaminobutan (0,82 ml, 8,1 mmol) gegeben. Die Lösung wurde bei 110°C gerührt und das Fortschreiten der Umsetzung wurde über TLC beobachtet. Nach 4 Std. wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Wasser (50 ml) gelöst und der pH-Wert wurde mit Essigsäure (0,1 M) auf 5,3 eingestellt. Das Rohprodukt wurde über Kationen-Austauschchromatographie (Dowex 50 × 4 in H⁺-Form, 100 g, Elution mit 600 ml Wasser und darauffolgend mit 1000 ml 1 M Kaliumhydroxid) gereinigt. Fraktionen, welche das Produkt enthielten, wurden mit Chloroform extrahiert und das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt. Ausbeute: 639 mg (100%).
R_f = 0,44 (Butanol/Essigsäure/Wasser 3 : 0,75 : 1,25).
¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃): δ = 1,33 (s, 3H; Acetonid-H), 1,48 bis 1,55 (m, 2H; Linker-H), 1,61 (s, 3H; Acetonid-H), 1,64 bis 1,70 (m, 2H; Linker-H), 2,66 bis 2,73 (m, 2H; Linker-H), 3,33 bis 3,42 (m, 2H; Linker-H), 3,77 bis 3,91 (m, 2H; 5'-H), 4,28 bis 4,30 (m, 1H; 4'-H), 4,99 (dd, ³J = 2,7, 6,3 Hz, 1H; 3'-H), 5,08 (dd, ³J = 4,8, 6,3 Hz, 1H; 2'-H), 5,39 (s, br., 2H; 6-NH₂), 6,15 (d, ³J = 4,5 Hz, 1H; 1'-H), 6,55 bis 6,60 (m, 1H; 8-NH), 8,10 (s, 1H; 2-H).
¹³C-NMR (125,7 MHz, CDCl₃): δ = 25,30 (q; Acetonid-CH₃), 25,73 (t; Linker-C), 27,42 (q; Acetonid-CH₃), 29,60 (t; Linker-C), 40,46 (t; Linker-C), 42,69 (t; Linker-C), 61,17 (t; 5'-C), 80,59 (d; 3'-C), 82,19 (d; 2'-C), 84,48 (d; 4'-C), 89,21 (d; 1'-C), 114,50 (s; Acetonid-C(CH₃)₂), 117,68 (s; 5-C), 149,49 (d; 2-C), 149,95 (s; 8-C), 151,68 (s; 4-C), 151,72 (s; 6-C).
ESI-MS: m/z (%): 394,3 (25) [M + H]⁺, 222,3 (100)[Adenin + Aminobutyl + H]⁺.
1.2 8-Amino[1''-(N''-dansyl)-4''-aminobutyl]-2',3'-O-isopropylidenadenosin, Verbindung 11
Zu einer Lösung von 10 (104 mg, 0,26 mmol) in trockenem Pyridin (7 ml) unter einer Argon-Atmosphäre wurde Trimethylchlorsilan (0,07 ml, 0,53 mmol) langsam bei 0°C gegeben und die so erhaltene Lösung wurde bei Raumtemperatur für 1 Std. gerührt. Darauffolgend wurde Dansylchlorid (103,8 mg, 0,37 mmol, in 3 ml Pyridin) zugegeben und die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 4 Std. gerührt. Das Fortschreiten der Umsetzung wurde über TLC beobachtet und nach der vollständigen Umwandlung wurde die Lösung bei 0°C mit Wasser (5 ml) behandelt. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt und das Rohprodukt wurde über Säulenchromatographie (Kieselsäuregel, 40 g, Elution mit Methylenchlorid/Methanol 19 : 1) gereinigt. Ausbeute: 50 mg (30%).
R_f = 0,54 (Methylenchlorid/Methanol 9 : 1).
¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆): δ = 1,29 (s, 3H; Acetonid-H), 1,39 bis 1,43 (m, 2H; Linker-H), 1,47 bis 1,50 (m, 2H; Linker-H), 1,53 (s, 3H; Acetonid-H), 2,78 bis 2,82 (m, 8H; Linker-H und N(CH₃)₂), 3,16 bis 3,24 (m, 2H; Linker-H), 3,50 bis 3,58 (m, 2H; 5'-H), 4,12 bis 4,14 (m, 1H; 4'-H), 4,94 (dd, ³J = 2,7, 6,1 Hz, 1H; 3'-H), 5,33 (dd, ³J = 3,7, 6,1 Hz, 1H; 2'-H), 5,41 bis 5,44 (m, 1H; 5'-OH), 6,01 (d, ³J = 3,5 Hz, 1H; 1'-H), 6,49 (s, br., 2H; 6-NH₂), 6,85 (t, ³J = 5,0 Hz, 1H; 8-NH), 7,22 (d, ³J = 7,5 Hz, 1H; Arom.-H), 7,54 bis 7,61 (m, 2H; Arom.-H), 7,87 bis 7,90 (m, 1H; NHSO₂), 7,90 (s, 1H; 2-H), 8,08 (d, ³J = 7,2 Hz, 1H; Arom.-H), 8,30 (d, ³J = 8,5 Hz, 1H; Arom.-H), 8,43 (d, ³J = 8,5 Hz, 1H; Arom.-H).
¹³C-NMR (125,7 MHz; DMSO-d₆): δ = 25,42 (q; Acetonid-CH₃), 26,00 (t; Linker-C), 26,96 (t; Linker-C), 27,33 (q; Acetonid-CH₃), 41,92 (t; Linker-C), 42,43 (t; Linker-C), 45,21 (q; N(CH₃)₂), 61,40 (t; 5'-C), 81,14 (d; 3'-C), 81,50 (d; 2'-C), 85,29 (d; 4'-C), 87,85 (d; 1'-C), 113,38 (s), 115,24 (d; Arom.-C), 117,24 (s), 119,29 (d; Arom.-C), 123,72 (d; Arom.-C), 127,92 (d; Arom.-C), 128,31 (d; Arom.-C), 129,26 (s), 129,48 (d; Arom.-C), 136,27 (s), 148,89 (d; 2-C), 149,30 (s), 151,20 (s), 151,50 (s), 152,58 (s).
ESI-MS: m/z (%): 627,1 (100)[M + H]⁺, 455,2 (8)[Adenin + Linker + Dansyl + H]⁺.
1.3 8-Amino[1''-(N''-dansyl)-4''-aminobutyl]-2',3'-O-isopropyliden-5'-O-mesyladenosin, Verbindung 12
Zu einer Lösung von 11 (181 mg, 0,32 mmol) und Dimethylaminopyridin (40 mg, 0,32 mmol) in trockenem Methylenchlorid (20 ml) unter einer Argon-Atmosphäre wurde trockenes Triethylamin (1,1 ml, 8,0 mmol) gegeben und die so erhaltene Lösung wurde auf 0°C gekühlt. Mesylchlorid (200 μl, 2,6 mmol) wurde zugegeben und die Lösung wurde für 30 Min. gerührt. Die Umsetzung wurde mit einer kalten, gesättigten Natriumhydrogencarbonat-Lösung (5 ml) abgestoppt. Die Lösung wurde dreimal mit kaltem Chloroform (10 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden kombiniert und das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde über Säulenchromatographie gereinigt (Kieselsäuregel, 40 g, Elution mit Methylenchlorid/Methanol 97 : 3). Ausbeute: 96 mg (43%).
R_f = 0,55 (Methylenchlorid/Methanol 9 : 1).
¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃): δ = 1,37 (s, 3H; Acetonid-H), 1,45 bis 1,48 (m, 2H; Linker-H), 1,59 bis 1,61 (m, 5H; Linker-H und Acetonid-H), 2,85 (s, 6H; N(CH₃)₂), 2,96 (s, 3H; SO₂CH₃), 2,98 bis 3,02 (m, 2H; Linker-H), 3,32 bis 3,36 (m, 2H; Linker-H), 4,33 bis 4,43 (m, 3H; 5'-H und 4'-H), 5,03 (dd, ³J = 9,8, 6,1 Hz, 1H; 3'-H), 5,52 (dd, ³J = 2,5, 6,5 Hz, 1H; 2'-H), 6,04 (d, ³J = 2,5 Hz, 1H; 1'-H), 6,13 (s, br., 2H; 6-NH₂), 6,91 (t, ³J = 5,8 Hz, 1H; 8-NH), 7,13 (d, ³J = 7,3 Hz, 1H; Arom.-H), 7,43 (t, ³J = 8,2 Hz, 1H; Arom.-H), 7,50 (t, ³J = 7,9 Hz, 1H; Arom.-H), 8,10 (s, 1H; 2-H), 8,23 (d, ³J = 7,0 Hz, 1H; Arom.-H), 8,37 (d, ³J = 8,5 Hz, 1H; Arom.-H), 8,51 (d, ³J = 8,6 Hz, 1H; Arom.-H).
¹³C-NMR (125,7 MHz, CDCl₃): δ = 24,62 (q; Acetonid-CH₃), 25,30 (t; Linker-C), 26,89 (t; Linker-C), 27,04 (q; Acetonid-CH₃), 37,50 (q; SO₂CH₃), 41,58 (t; Linker-C), 42,70 (t; Linker-C), 45,44 (q; N(CH₃)₂), 68,38 (t; 5'-C), 80,10 (d; 3'-C), 82,11 (d; 2'-C), 83,29 (d; 4'-C), 88,63 (d; 1'-C), 115,16 (d; Arom.-C), 118,94 (d; Arom.-C), 123,23 (d; Arom.-C), 128,20 (d; Arom.-C), 129,70 (d; Arom.-C), 130,37 (d; Arom.-C), 149,78 (d; 2-C), 151,84 (s), 152,41 (s).
ESI-MS: m/z (%): 705,3 (70) [M + H]⁺, 609,7 (100)[Cyclonucleosid + H]⁺.
1.4 8-Amino[1''-(N''-dansyl)-4''-aminobutyl]-5'-O-mesyladenosin, Verbindung 13
Nucleosid 12 (96,2 mg, 0, 14 mmol) wurde in wässriger Ameisensäure (50%, 10 ml) gelöst und die so erhaltene Lösung wurde bei Raumtemperatur für 4 Tage gerührt. Nach vollständiger Umwandlung wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt und das verbleibende Lösungsmittel wurde mit einem Gemisch an Wasser und Methanol (1 : 1, 5 ml) gemeinsam abgedampft. Das Rohprodukt wurde über Säulenchromatographie (Kieselsäuregel, 15 g, Elution mit Methylenchlorid/Methanol 9 : 1) gereinigt. Ausbeute: 49,2 mg (55%).
R_f = 0,23 (Methylenchlorid/Methanol 9 : 1).
¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆): δ = 1,36 bis 1,42 (m, 2H; Linker-H), 1,47 bis 1,53 (m, 2H; -Linker-H), 2,77 bis 2,79 (m, 2H; Linker-H), 2,81 (s, 6H; N(CH₃)₂), 3,07 (s, 3H; SO₂CH₃), 3,17 bis 3,20 (m, 2H; Linker-H), 4,01 bis 4,04 (m, 1H; 4'-H), 4,33 bis 4,47 (m, 3H; 5'-H und 3'-H), 5,08 (ddd = q, ³J = 5,5 Hz, 1H; 2'-H), 5,37 (d, ³J = 5,5 Hz, 1H; OH), 5,44 (d, ³J = 5,5 Hz, 1H; OH), 5,72 (d, ³J = 5,1 Hz, 1H; 1'-H), 6,48 (s, br., 2H; 6-NH₂), 6,78 (t, ³J = 5,3 Hz, 1H; 8-NH), 7,24 (d, ³J = 7,8 Hz, 1H; Arom.-H), 7,57 (t, ³J = 8,3 Hz, 1H; Arom.-H), 7,61 (t, ³J = 7,8 Hz, 1H; Arom.-H), 7,88 (s, 1H; 2-H), 7,95 (t, ³J = 5,7 Hz, 1H; NHSO₂), 8,08 (d, ³J = 6,9 Hz, 1H; Arom.-H), 8,28 (d, ³J = 8,7 Hz, 1H; Arom.-H), 8,44 (d, ³J = 8,7 Hz, 1H; Arom.-H).
¹³C-NMR (125,7 MHz, DMSO-d₆): δ = 27,24 (t; Linker-C), 28,06 (t; Linker-C), 37,91 (q; SO₂CH₃), 43,07 (t; Linker-C), 43,58 (t; Linker-C), 46,41 (q; N(CH₃)₂), 71,21 (t; 5'-C), 71,45 (d; 3'-C), 71,61 (d; 2'-C), 82,20 (d; 4'-C), 88,63 (d; 1'-C), 116,44 (d; Arom.-C), 118,76 (s), 120,46 (d; Arom.-C), 124,98 (d; Arom.-C), 129,16 (d; Arom.-C), 129,54 (d; Arom.-C), 130,34 (s), 130,39 (d; Arom.-C), 130,68 (s), 137,35 (s), 149,95 (d; 2-C), 150,78 (s), 152,66 (s), 153,06 (s), 153,73 (s).
ESI-MS: m/z (%): 665,6 (85)[M + H]⁺, 687,4 (100)[M + Na]⁺.
1.5 Synthese von 8-Amino[1''-(N''-dansyl)-4''-aminobutyl]-5'-(1-aziridinyl)-5'-desoxyadenosin, Verbindung 9
Nucleosid 13 (20 mg, 30 μmol) wurde in trockenem Aziridin (S. Gabriel, Chem. Ber. 1888, 21, 2664 bis 2669; S. Gabriel, R. Stelzner, Chem. Ber. 1895, 28, 2929 bis 2938)(1 ml) und N-Ethyldiisopropylamin (350 μl) unter einer Argon-Atmosphäre gelöst und bei Raumtemperatur für 3 Tage gerührt. Die Umsetzung wurde über analytische Umkehrphasen-HPLC (Hypersil-ODS, 5 μm, 120 Å, 250 × 4,6 mm, Bischoff, Leonberg, Deutschland) beobachtet. Verbindungen wurden mit Acetonitril (0% für 5 Min., gefolgt von einem linearen Gradienten auf 35% in 30 Min. und auf 70% in 10 Min., 1 ml/Min.) in Triethylammoniumacetat-Puffer (0,1 M, pH-Wert = 7,0) eluiert. Das Lösungsmittel wurde nach Vollendung der Umsetzung unter verringertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde über Säulenchromatographie (Kieselsäuregel, 2 g, Elution mit Methylenchlorid/Methanol 9 : 1) gereinigt. Ausbeute: 6,7 mg (36%).
R_f = 0,23 (Methylenchlorid/Methanol 9 : 1).
¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆): δ = 1,19 bis 1,22 (m, 2H; Aziridin-H), 1,32 bis 1,34 (m, 2H; Linker-H), 1,37 bis 1,39 (m, 2H; Linker-H), 1,59 bis 1,61 (m, 2H; Aziridin-H), 1,94 (dd, ³J = 3,2 Hz, ²J = 13,5 Hz, 1H; 5'-H_a), 2,74 bis 2,79 (m, 2H; Linker-H), 2,81 (s, 6H; N(CH₃)₂), 2,91 bis 2,95 (m, 1H; 5'-H_b), 3,07 bis 3,16 (m, 2H; Linker-H), 3,94 bis 3,96 (m, 1H; 4'-H), 4,19 bis 4,21 (m, 1H; 3'-H), 4,63 bis 4,67 (m, 1H; 2'-H), 5,20 (d, ³J = 4,1 Hz, 1H; OH), 5,30 (d, ³J = 6,8 Hz, 1H; OH), 5,90 (d, ³J = 7,2 Hz, 1H; 1'-H), 6,42 (s, br., 2H; 6-NH₂), 7,23 (d, ³J = 7,2 Hz, 1H; Arom.-H), 7,55 bis 7,61 (m, 3H; Arom.-H und 8-NH), 7,87 (s, 1H; 2-H), 7,95 (t, ³J = 5,6 Hz, 1H; NHSO₂), 8,08 (d, ³J = 7,2 Hz, 1H; Arom.-H), 8,28 (d, ³J = 8,6 Hz, 1H; Arom.-H), 8,43 (d, ³J = 8,6 Hz, 1H; Arom.-H).
¹³C-NMR (125,7 MHz, DMSO-d₆): δ = 26,92 (t; Aziridin-C), 27,43 (t; Linker-C), 28,01 (t; Linker-C), 30,02 (t; Aziridin-C), 43,02 (t; Linker-C), 43,65 (t; Linker-C), 46,41 (q; N(CH₃)₂), 62,96 (t; 5'-C), 71,14 (d; 2'-C), 72,29 (d; 3'-C), 85,31 (d; 4'-C), 87,11 (d; 1'-C), 116,45 (d; Arom.-C), 118,20 (s), 120,45 (d; Arom.-C), 124,96 (d; Arom.-C), 129,16 (d; Arom.-C), 129,57 (d; Arom.-C), 130,00 (s), 130,36 (d; Arom.-C), 130,68 (s), 137,37 (s), 149,86 (d; 2-C), 151,49 (s), 152,42 (s), 152,66 (s), 153,43 (s).
ESI-MS: m/z (%): 612,7 (100)[M + H]⁺.
2. Enzymreaktion mit der N6-Adenin DNA-Methyltransferase M·TaqI. (Schema 7)
Die durch Enzym katalysierte Umsetzung wurde in einem Gemisch (500 μl) von Cofaktor freiem M·TaqI (5 nmol, 10 μM), Doppelstrang-Oligodesoxynucleotid 3·4 (5 nmol, 10 μM), Verbindung 9 (10 nmol, 20 μM), Tris-Acetat (20 mM, pH-Wert 6,0), Kaliumacetat (50 mM), Magnesiumacetat (10 mM) und Triton X-100 (0,01%) bei 37°C durchgeführt. Das Fortschreiten der Umsetzung wurde über Anionen-Austauschchromatographie beobachtet (Poros 10 HQ, 10 μm, 4,6 × 10 mm, PerSeptive Biosystems, Deutschland). Verbindungen wurden mit wässrigem Kaliumchlorid (0,2 M für 5 Min., gefolgt von einem linearen Gradienten auf 0,5 M in 5 Min. und auf 1 M in 30 Min.) in Tris-Chlorid-Puffer (10 mM, pH-Wert 7,0) eluiert. Eine vollständige Umwandlung zu einem neuen Produkt (welches DNA und Protein enthielt) mit einer Retentionszeit von 7,9 Min. wurde nach 15 Std. beobachtet. (In einem parallel durchgeführten Kontrollexperiment wurde ohne M·TaqI keine Umwandlung des Doppelstrang-Oligodesoxynucleotids 3·4 beobachtet.) Für die Fragmentierung des erhaltenen Protein-DNA-Komplexes wurde die Reaktionslösung mit einer Kaliumhydroxid-Lösung (10 M) behandelt, um den pH-Wert auf 8,0 einzustellen. Dann wurde eine Lösung (4 μl) von Proteinase K (31 mg/ml), Tris-Chlorid (50 mM, pH-Wert 8,0) und Calciumchlorid (1 mM) zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei 37°C für 1 Std. inkubiert. Die proteolytische Fragmentierung wurde über Anionen-Austauschchromatographie beobachtet, wie vorstehend beschrieben. Die fluoreszierende Spezies mit einer Retentionszeit von 7,9 Min. verschwand und die neue fluoreszierende Verbindung 144 mit einer Retentionszeit von 29,2 Min. wurde gebildet ( 5). Für eine weitere Charakterisierung wurde das Produkt 144 über Umkehrphasen-Chromatographie isoliert (Säule: Hypersil-ODS, 5 μm, 120 Å, 250 × 4,6 mm, Bischoff, Leonberg, Deutschland; Elution: Triethylammoniumacetat-Puffer, 0,1 M, pH-Wert 7,0 für 5 Min., gefolgt von einem linearen Acetonitril-Gradienten auf 35% in 30 Min., 1 ml/Min.).
Analyse des Produkts Doppelstrang-Oligodesoxynucleotid 144 durch enzymatische Fragmentierung: Gereinigtes 144 (0,57 OD bei 260 nm) wurde in Kaliumphosphat-Puffer (10 mM, pH-Wert 7,0, 228 μl), welcher Magnesiumchlorid (10 mM), DNase I (2,7 U), Phosphodiesterase von Crotalus durissus (0,041 U), Phosphodiesterase aus Kalbsmilz (0,055 U) und alkalische Phosphatase (13,7 U) enthielt, gelöst und für 20 Std. bei 37°C inkubiert. Ein Aliquot (100 μl) wurde auf eine Umkehrphasen-HPLC-Säule (Hypersil-ODS, 5 μm, 120 Å, 250 × 4,6 mm, Bischoff, Leonberg, Deutschland) gespritzt und die Produkte wurden mit einem Gradienten von Acetonitril (0 bis 10,5% in 30 Min., gefolgt von 10,5 bis 28% in 10 Min. und 28 bis 70% in 15 Min., 1 ml/Min.) in Triethylammoniumacetat-Puffer (0,1 M, pH-Wert 7,0) eluiert. Neben den Deoxynucleosiden dC, dA, dG, 7 und dA^Me wurde eine neue fluoreszente Verbindung, welche nach 49 Min. eluierte, gefunden. Diese neue Verbindung wurde isoliert und über ESI-MS (LCQ, verbunden mit einer Nano-Elektronenspray-Ionenquelle, Finnigan MAT, Deutschland) als positiv geladenes Ion bei einem m/z von 863,1 detektiert. Die beobachtete Masse ist in guter Übereinstimmung mit der. berechneten Molekularmasse (863,4) eines protonierten, mit 9 modifizierten 2'-Desoxyadenosins.
3. Fluoreszenz-Markieren
3.1 Fluoreszenz-Markieren von Plasmid-DNA unter Verwendung der N6-Adenin DNA-Methyltransferase M·TaqI
Die durch Enzym katalysierte Markierungs-Reaktion wurde in einem Gemisch (500 μl) von Cofaktor freiem M·TaqI (133 nM), pUCl9 DNA (28 nM, 4 Erkennungsstellen für M·TaqI), Verbindung 9 (20 μM), Tris-Acetat (20 mM, pH-Wert 6,0), Kaliumacetat (50 mM), Magnesiumacetat (10 mM) und Triton X-100 (0,01%) bei 65°C durchgeführt. Das Fortschreiten der Umsetzung wurde über Anionen-Austauschchromatographie beobachtet (NUCLEOGEN DEAE 4000-7, 7 μm, 125 × 6,2 mm, Machery-Nagel, Düren, Deutschland). Verbindungen wurden mit wässrigem Kaliumchlorid (0,2 M für 5 Min., gefolgt von einem linearen Gradienten auf 1 M in 30 Min.) in Tris-Chlorid-Puffer (10 mM, pH-Wert 7,0), welcher Acetonitril (20%) enthielt, eluiert. Die Chromatogramme der Anionen-Austauschchromatographie nach unterschiedlichen Inkubationszeiten sind in 6 gezeigt (A: UV-Detektion bei 260 nm; B: Fluoreszenz-Detektion). Die Verzögerung zwischen der beobachteten UV-Absorption und der Fluoreszenz kommt aufgrund der räumlichen Trennung des UV-Detektors und des Fluoreszenz-Detektors zustande. Die Markierungs-Reaktion, welche zu fluoreszierendem pUC 19 führte, war nach 8 Std. abgeschlossen. In einem parallel durchgeführten Kontrollexperiment ohne M·TaqI wurde kein fluoreszierend markiertes pUC19 beobachtet (7A und 7B).
3.2 Fluoreszenz-Markieren von Plasmid-DNA unter Verwendung der C5-Cytosin DNA-Methyltransferase M·HhaI
Die durch Enzym katalysierte Markierungs-Reaktion wurde in einem Gemisch (100 μl) von M·HhaI (730 nM), pUC19 DNA (40 nM, 17 Erkennungsstellen für M·HhaI), Verbindung 9 (20 μM), Tris-Chlorid (10 mM, pH-Wert 6,85), Natriumchlorid (50 mM), EDTA (0,5 mM) und β-Mercaptoethanol (2 mM) bei 37°C durchgeführt. Ein parallel durchgeführtes Kontrollexperiment wurde ohne M·HhaI durchgeführt. Aliquote von beiden Inkubationen wurden nach 20 Stunden Reaktionszeit über Anionen-Austauschchromatographie analysiert, wie vorstehend beschrieben (siehe Beispiel 2, 3.1). Die erhaltenen Chromatogramme sind in 8 gezeigt (A: UV-Detektion bei 260 nm; B: Fluoreszenz-Detektion). In Abwesenheit von M·HhaI wurde kein Fluoreszenz-Markieren beobachtet.

Claims

Aziridinderivat der Formel (I)
wobei X die Bedeutung N oder CH hat, Y die Bedeutung N oder -CR³ hat, R¹ und R³ unabhängig voneinander die Bedeutung H, ³H, -NH(CH₂)_nNHR⁴ oder -NH(C₂H₅O)_nC₂N₅NNR⁴ haben, wobei R⁴ ausgewählt ist aus Fluorophoren, Affinitätsmarkierungen, Vernetzungsmitteln, Chromophoren, Proteinen, Peptiden, Aminosäuren, welche gegebenenfalls modifiziert sein können, Nucleotiden, Nucleosiden, Nucleinsäuren, Kohlenhydraten, Lipiden, PEG, Transfektionsreagenzien, Beads und interkalierenden Mitteln, und n eine ganze Zahl von 1 bis 5000 ist, und R² ausgewählt ist aus N, ³H oder -CH₂CH(COOH)(NH₂).
Aziridinderivat gemäß Anspruch 1, wobei X und Y beide die Bedeutung N haben.
Aziridinderivat gemäß Anspruch 1, wobei nur ein Rest von R¹ und R³ die Bedeutung -NH(CH₂)_nNHR⁴ oder -NH(C₂H₅O)_nC₂H₅NHR⁴ hat, und der andere Rest die Bedeutung H hat.
Aziridinderivat gemäß Anspruch 1, wobei das Fluorophor ausgewählt ist aus BODIPY, Cumarin, Dansyl, Fluorescein, Mansyl, Pyren, Rhodamin, Texas Rot, TNS, den Cyanin-Fluorophoren Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7 und Derivaten davon.
Aziridinderivat gemäß Anspruch 1, wobei die Affinitätsmarkierung eine Peptid-Markierung, Biotin, Digoxygenin oder Dinitrophenol ist.
Aziridinderivat gemäß Anspruch 5, wobei die Peptid-Markierung eine His-Markierung oder irgendeine andere Markierung mit Metall-chelatisierenden Eigenschaften, welche in IMAC verwendet werden kann, Strep-Markierung, Flag-Markierung, c-myc-Markierung, Epitope oder Glutathion ist.
Aziridinderivat gemäß Anspurch 1, wobei das Vernetzungsmittel Maleimid, Iodacetamid, ein Derivat davon oder ein Aldehydderivat, oder ein Photovernetzungsmittel ist.
Aziridinderivat gemäß Anspruch 7, wobei das Photovernetzungsmittel ein Arylazid, eine Diazo-Verbindung oder eine Benzophenon-Verbindung ist.
Komplex aus der Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 und einer Methyltransferase, welche normalerweise S-Adenoyl-L-methionin (SAM) als einen Cofaktor benutzt.
Komplex gemäß Anspruch 9, wobei die Methyltransferase normalerweise die Methylgruppe von SAM auf ein Nucleinsäuremolekül, ein Polypeptid, ein Protein, ein Enzym oder ein kleines Molekül überträgt.
Komplex gemäß Anspruch 10, wobei die Methyltransferase DNA methyliert.
Komplex gemäß Anspruch 11, wobei die Methyltransferase Teil eines Restriktions-Modifikations-Systems eines Bakteriums ist.
Komplex gemäß Anspruch 10, wobei die Methyltransferase Proteine an bestimmten Aminosäuren methyliert.
Komplex gemäß Anspruch 12, wobei die Methyltransferase ausgewählt ist aus den DNA-Methyltransferasen M·TaqI und M·HhaI.
Kit umfassend die Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 und weiterhin umfassend eine Methyltransferase wie in einem der Ansprüche 9 bis 14 definiert.
Diagnostische Zusammensetzung umfassend die Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 oder den Komplex gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14.
Verwendung der Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 als Cofaktor einer Methyltransferase.
Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei das Ziel-Molekül der Methyltransferase ein Nucleinsäuremolekül, ein Polypeptid, ein synthetisches Polymer oder ein kleines Molekül ist.
Verwendung gemäß Anspruch 18, wobei das Nucleinsäuremolekül DNA oder RNA oder Hybride davon ist.
Verwendung gemäß Anspruch 18, wobei das kleine Molekül ein Lipid ist.
Verwendung gemäß Anspruch 18, wobei das Polypeptid ein Protein oder ein Fusionsprotein umfassend eine Methylierungsstelle ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 21, wobei die Methyltransferase eine wie in einem der Ansprüche 9 bis 14 definierte Methyltransferase ist.
Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Ziel-Moleküls umfassend die Inkubation des Ziel-Moleküls mit der Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 in der Gegenwart einer Methyltransferase, welche die Verbindung als einen Cofaktor verwenden kann, unter Bedingungen, welche den Transfer der Verbindung oder eines Teils davon auf das Ziel-Molekül erlaubt.
Verfahren gemäß Anspruch 23, wobei die Methyltransferase eine wie in einem der Ansprüche 9 bis 14 definierte Methyltransferase ist.
Verfahren gemäß Anspruch 23 oder 24, wobei das Ziel-Molekül wie in einem der Ansprüche 18 bis 21 definiert ist.