JP2002521488A - 新規のメチルトランスフェラーゼ補因子 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【化１】
Description
【０００１】 本発明は、メチルトランスフェラーゼの補因子として用いることができるアジ
リジン誘導体、これらの化合物を含む複合体および組成、およびこれらを標的分
子を修飾するために使用することに関する。
リジン誘導体、これらの化合物を含む複合体および組成、およびこれらを標的分
子を修飾するために使用することに関する。
【０００２】 非放射能標識された核酸は、放射性物質による健康への危険性を伴わずに、DN
Aシークエンシングに用いることができ、またサザン/ノーザンブロット、in sit
uハイブリダイゼーションおよびコロニー/プラークスクリーニングのプローブと
して用いることができるので、分子生物学において大きな関心を集めている。DN
AおよびRNAを共有結合により修飾する技術に関して、現在いくつかの方法が知ら
れている(C. Kessler著、「非アイソトープDNAプローブ技術」(Nonisotopic DNA
Probe Techniques)、L. J. Kricka編、 Academic Press, San Diego、1992、pp
.29-92に概説が記載されている)。たとえば、固相DNAまたはRNA合成によって修
飾されたオリゴヌクレオチドが得られ、同様にして修飾されたオリゴデオキシヌ
クレオチドをDNAポリメラーゼのプライマーとして用いることができる(P. Richt
erich, G. M. Church, Methods Enzym. 1993, 218, 187-222)。上記の修飾が固
相合成に用いる反応条件に耐えられない場合には、アミンまたはチオール基を組
み入れ、得られたオリゴヌクレオチドをアミンまたはチオール反応性プローブに
より合成後に標識化することが可能である(D. M. Jameson, W. H. Sawyer, Meth
ods Enzym. 1995, 246, 283-300)。さらに、いくつかの標識は、オリゴヌクレオ
チドの末端のリン酸またはチオリン酸残基に結合することができる(J.-L. Mergn
yら、Nucleic Acids Res. 1994, 22, 920-928)。 当技術分野で開示されている別の方法は、DNAポリメラーゼ(A. Waggoner, Met
hods Enzym. 1995, 246, 362-373)または末端デオキシヌクレオチジルトラン
スフェラーゼ(L. K. Riley, M. E. Marshall, M. S. Coleman, DNA 1986, 5
, 333-338;G. L. Trainor, M. A. Jensen, Nueleic Acids Res. 1988, 16,
11846)を用いたDNAへの修飾されたデオキシヌクレオシド三リン酸の組込みであ
る
Aシークエンシングに用いることができ、またサザン/ノーザンブロット、in sit
uハイブリダイゼーションおよびコロニー/プラークスクリーニングのプローブと
して用いることができるので、分子生物学において大きな関心を集めている。DN
AおよびRNAを共有結合により修飾する技術に関して、現在いくつかの方法が知ら
れている(C. Kessler著、「非アイソトープDNAプローブ技術」(Nonisotopic DNA
Probe Techniques)、L. J. Kricka編、 Academic Press, San Diego、1992、pp
.29-92に概説が記載されている)。たとえば、固相DNAまたはRNA合成によって修
飾されたオリゴヌクレオチドが得られ、同様にして修飾されたオリゴデオキシヌ
クレオチドをDNAポリメラーゼのプライマーとして用いることができる(P. Richt
erich, G. M. Church, Methods Enzym. 1993, 218, 187-222)。上記の修飾が固
相合成に用いる反応条件に耐えられない場合には、アミンまたはチオール基を組
み入れ、得られたオリゴヌクレオチドをアミンまたはチオール反応性プローブに
より合成後に標識化することが可能である(D. M. Jameson, W. H. Sawyer, Meth
ods Enzym. 1995, 246, 283-300)。さらに、いくつかの標識は、オリゴヌクレオ
チドの末端のリン酸またはチオリン酸残基に結合することができる(J.-L. Mergn
yら、Nucleic Acids Res. 1994, 22, 920-928)。 当技術分野で開示されている別の方法は、DNAポリメラーゼ(A. Waggoner, Met
hods Enzym. 1995, 246, 362-373)または末端デオキシヌクレオチジルトラン
スフェラーゼ(L. K. Riley, M. E. Marshall, M. S. Coleman, DNA 1986, 5
, 333-338;G. L. Trainor, M. A. Jensen, Nueleic Acids Res. 1988, 16,
11846)を用いたDNAへの修飾されたデオキシヌクレオシド三リン酸の組込みであ
る
【０００３】 さらに、いくつかの修飾を直接DNAまたはRNAに組み込んでもよい。たとえば、
シトシン残基を、亜硫酸水素塩によって活性化した後、脂肪族アミンとのカップ
リングにより修飾することができる(R. P. Viscidi, Methods Enzym. 1990, 184
, 600-607; D. E. Draper, L. Gold, Biochemistry 1980, 19, 1774-1781)。ま
た、DNAおよびRNAの標識化のための他の化学試薬も販売されている(FastTag, Ve
ctor, Burlingame, CA; Mirus Label IT, Pan Vera Corporation, Madison, WI)
。けれども、これらの最近の方法は、定量的で配列特異的な修飾ができず、その
ため複合体混合物が得られる。
シトシン残基を、亜硫酸水素塩によって活性化した後、脂肪族アミンとのカップ
リングにより修飾することができる(R. P. Viscidi, Methods Enzym. 1990, 184
, 600-607; D. E. Draper, L. Gold, Biochemistry 1980, 19, 1774-1781)。ま
た、DNAおよびRNAの標識化のための他の化学試薬も販売されている(FastTag, Ve
ctor, Burlingame, CA; Mirus Label IT, Pan Vera Corporation, Madison, WI)
。けれども、これらの最近の方法は、定量的で配列特異的な修飾ができず、その
ため複合体混合物が得られる。
【０００４】 タンパク質の非放射能標識化は、そのシステインおよびリシン残基がさまざま
な標識試薬と容易に反応するので、簡単におこなうことができる(M.Brinkley, B
ioconjugate Chem. 1992, 3, 2-13; R. P. Haugland, Handbook of Fluorescent
Probes and Research Chemicals 1996, Molecular Probes Inc., Eugene, OR)
。けれども、一般的にタンパク質は多くのリシンまたはシステイン残基を含み、
標識化をおこなうとしばしば分析が困難な複合体混合物が得られる。このように
、タンパク質の特異的修飾は、DNAおよびRNAよりもさらに困難である。特異的に
標識されたタンパク質を得るための１つの戦略は、突然変異誘発によって１つの
システイン残基を有するタンパク質を工学的に作り、その後、このシステイン残
基をたとえば蛍光基によって修飾することである(G. Haran, E. Haas, B. K. Sz
pikowska, M. T. Mas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 11764-11768)。
な標識試薬と容易に反応するので、簡単におこなうことができる(M.Brinkley, B
ioconjugate Chem. 1992, 3, 2-13; R. P. Haugland, Handbook of Fluorescent
Probes and Research Chemicals 1996, Molecular Probes Inc., Eugene, OR)
。けれども、一般的にタンパク質は多くのリシンまたはシステイン残基を含み、
標識化をおこなうとしばしば分析が困難な複合体混合物が得られる。このように
、タンパク質の特異的修飾は、DNAおよびRNAよりもさらに困難である。特異的に
標識されたタンパク質を得るための１つの戦略は、突然変異誘発によって１つの
システイン残基を有するタンパク質を工学的に作り、その後、このシステイン残
基をたとえば蛍光基によって修飾することである(G. Haran, E. Haas, B. K. Sz
pikowska, M. T. Mas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 11764-11768)。
【０００５】 さらに、in vitroでの翻訳によって天然と異なるアミノ酸をタンパク質に組み
入れてもよい(V. W. Cornish, D. Mendel, P. G. Schultz, Angew. Chem. 1995,
107, 677-690; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 620-630)。けれども
、この方法は容易に実施することができず、また少量の修飾されたタンパク質し
か得られない。
入れてもよい(V. W. Cornish, D. Mendel, P. G. Schultz, Angew. Chem. 1995,
107, 677-690; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 620-630)。けれども
、この方法は容易に実施することができず、また少量の修飾されたタンパク質し
か得られない。
【０００６】 他の可能性としては、化学的ペプチド合成による修飾されたタンパク質の製造
があるが(T. W. Muir, S. B. H. Kent, Current Opinion in Biotechnology 199
3, 4. 420-427)、この方法は一般的に比較的短いタンパク質鎖の製造に限定され
る。
があるが(T. W. Muir, S. B. H. Kent, Current Opinion in Biotechnology 199
3, 4. 420-427)、この方法は一般的に比較的短いタンパク質鎖の製造に限定され
る。
【０００７】 以上の公知の方法の欠点を克服し、メチルトランスフェラーゼを使用すること
により単純で効果的な方法で生体分子の修飾（たとえば、標識化）を可能にする
新規化合物を提供することが本出願の目的である。
により単純で効果的な方法で生体分子の修飾（たとえば、標識化）を可能にする
新規化合物を提供することが本出願の目的である。
【０００８】 この目的は、一般式(I)で表されるアジリジン誘導体によって達成される。
【０００９】
【化２】 （式中、 XはNまたはCH、YはNまたは-CR3、R1およびR3はそれぞれ独立して、H、 3 H、-NH(CH2)nNHR4または-NH(C2H5O)nC2H5NHR4であって、R4が、フルオロフォア
（fluorophores）、アフィニティータグ（affinity tags）、架橋剤、発色団、
タンパク質、ペプチド、必要に応じて修飾されていてもよいアミノ酸、ヌクレオ
チド、ヌクレオシド、核酸、炭水化物、脂質、PEG、トランスフェクション試薬
、ビーズおよびインターカレート剤から選択され、nは1〜5000までの整数であり
、R2は、H、3H、-N(CH2)nNHR4、-NH(C2H5O)nC2H5NHR4から選択され、R4およびn
は上で定義したとおりであるもの、-CH2CH(COOH)(NH2)または電子吸引基である
。） 本発明を以下により詳細に記載する。
（fluorophores）、アフィニティータグ（affinity tags）、架橋剤、発色団、
タンパク質、ペプチド、必要に応じて修飾されていてもよいアミノ酸、ヌクレオ
チド、ヌクレオシド、核酸、炭水化物、脂質、PEG、トランスフェクション試薬
、ビーズおよびインターカレート剤から選択され、nは1〜5000までの整数であり
、R2は、H、3H、-N(CH2)nNHR4、-NH(C2H5O)nC2H5NHR4から選択され、R4およびn
は上で定義したとおりであるもの、-CH2CH(COOH)(NH2)または電子吸引基である
。） 本発明を以下により詳細に記載する。
【００１０】 S-アデノシル-L-メチオニン依存メチルトランスフェラーゼ（SAM依存メチルト
ランスフェラーゼ）は生物学的に重要な酵素のクラスである。これらは、「酵素
命名法」(Enzyme Nomenclature)（E. C. Webb, Academic Press, San Diego, 19
92）の最新版に列挙された酵素の約3%を占めている。これらは、補因子S-アデノ
シル-L-メチオニンから、小分子、リン脂質、タンパク質、RNAおよびDNA のイオ
ウ、窒素、酸素および炭素求核試薬への活性化されたメチル基の転移を触媒する
。たとえば、DNAメチルトランスフェラーゼは、特定のDNA配列内のアデニンのN6
位およびシトシンのC5またはN4位のメチル化を触媒する。制限エンドヌクレアー
ゼはDNAのメチル化に感受性があるので、DNAメチルトランスフェラーゼは、DNA
における制限部位の数を減らすために用いることができる(M. Nelson, I. Schil
dkraut, Methods Enzymol. 1987, 155, 41-48)。
ランスフェラーゼ）は生物学的に重要な酵素のクラスである。これらは、「酵素
命名法」(Enzyme Nomenclature)（E. C. Webb, Academic Press, San Diego, 19
92）の最新版に列挙された酵素の約3%を占めている。これらは、補因子S-アデノ
シル-L-メチオニンから、小分子、リン脂質、タンパク質、RNAおよびDNA のイオ
ウ、窒素、酸素および炭素求核試薬への活性化されたメチル基の転移を触媒する
。たとえば、DNAメチルトランスフェラーゼは、特定のDNA配列内のアデニンのN6
位およびシトシンのC5またはN4位のメチル化を触媒する。制限エンドヌクレアー
ゼはDNAのメチル化に感受性があるので、DNAメチルトランスフェラーゼは、DNA
における制限部位の数を減らすために用いることができる(M. Nelson, I. Schil
dkraut, Methods Enzymol. 1987, 155, 41-48)。
【００１１】 SAM依存メチルトランスフェラーゼによって触媒されることが知られている反
応を、反応スキーム１に図式的に示したが、ここで、化合物１は補因子S-アデノ
シル-L-メチオニン(SAM)である。
応を、反応スキーム１に図式的に示したが、ここで、化合物１は補因子S-アデノ
シル-L-メチオニン(SAM)である。
【００１２】
【化３】 反応スキーム１ 本出願の発明者らは、今回、下記の一般式Iのアジリジン誘導体がSAM依存メチ
ルトランスフェラーゼの補因子として働くこと、およびそれによってメチルより
も大きい基の転移を可能にすることを見いだした。
ルトランスフェラーゼの補因子として働くこと、およびそれによってメチルより
も大きい基の転移を可能にすることを見いだした。
【００１３】 本発明のアジリジン誘導体は一般式(I)によって表される。
【００１４】
【化４】 （式中、 XはNまたはCH、YはNまたは-CR3、R1およびR3はそれぞれ独立して、H、 3 H、-NH(CH2)nNHR4または-NH(C2H5O)nC2H5NHR4であって、R4が、フルオロフォア
（fluorophores）、アフィニティータグ（affinity tags）、架橋剤、発色団、
タンパク質、ペプチド、必要に応じて修飾されていてもよいアミノ酸、ヌクレオ
チド、ヌクレオシド、核酸、炭水化物、脂質、PEG、トランスフェクション試薬
、ビーズおよびインターカレート剤から選択され、nは1〜5000までの整数であり
、R2は、H、3H、-N(CH2)nNHR4、-NH(C2H5O)nC2H5NHR4から選択され、R4およびn
は上で定義したとおりであるもの、-CH2CH(COOH)(NH2)または電子吸引基である
。） 好ましい電子吸引基は、-CH3-pR5 p（ここで、p=1,2または３であり、それぞれ
のR5は独立して、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素、好ましくはフッ素および塩
素より選択される）、-CN（シアノ基）および-C(O)R6（ここで、R6はアルコキシ
基、C1-C10アルキルまたはC6-C10アリールによって一または二置換されていても
よい、ヒドロキシ基またはアミノ基である）である。
（fluorophores）、アフィニティータグ（affinity tags）、架橋剤、発色団、
タンパク質、ペプチド、必要に応じて修飾されていてもよいアミノ酸、ヌクレオ
チド、ヌクレオシド、核酸、炭水化物、脂質、PEG、トランスフェクション試薬
、ビーズおよびインターカレート剤から選択され、nは1〜5000までの整数であり
、R2は、H、3H、-N(CH2)nNHR4、-NH(C2H5O)nC2H5NHR4から選択され、R4およびn
は上で定義したとおりであるもの、-CH2CH(COOH)(NH2)または電子吸引基である
。） 好ましい電子吸引基は、-CH3-pR5 p（ここで、p=1,2または３であり、それぞれ
のR5は独立して、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素、好ましくはフッ素および塩
素より選択される）、-CN（シアノ基）および-C(O)R6（ここで、R6はアルコキシ
基、C1-C10アルキルまたはC6-C10アリールによって一または二置換されていても
よい、ヒドロキシ基またはアミノ基である）である。
【００１５】 R1、R2およびR3のうち１つのみが、-NH(CH2)nNHR4または-NH(C2H5O)nC2H5NHR4 であることが好ましい。好ましい化合物において、Xおよび/またはYはNであり、
特に好ましいものはXおよびYがどちらもNである化合物である。
特に好ましいものはXおよびYがどちらもNである化合物である。
【００１６】 -NH(CH2)nNHR4基において、nは好ましくは2から20の整数であり、特にn=3、4
または5が好ましい。
または5が好ましい。
【００１７】 -NH(C2H5O)n C2H5NHR4基において、nは好ましくは1から250の整数であり、よ
り好ましくは、nは1から20の整数である。
り好ましくは、nは1から20の整数である。
【００１８】 本明細書において、フルオロフォア(fluorophore)という用語は、あるエネル
ギーの光によって電子が励起された後、より低いエネルギーの光子が放射される
ような化学物質をさす。
ギーの光によって電子が励起された後、より低いエネルギーの光子が放射される
ような化学物質をさす。
【００１９】 本発明の好ましい化合物において、R1およびR2はそれぞれHまたは3Hで、XはN
である。
である。
【００２０】 R1、R2およびR3のうち少なくとも１つが-NH(CH2)nNHR4または-NH(C2H5O)nC2H5 NHR4である場合、R4は、フルオロフォア、アフィニティータグ、架橋剤、発色団
、タンパク質（抗体および酵素を含む）、ペプチド、アミノ酸、修飾されたアミ
ノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸、炭水化物、脂質、PEG、トランスフ
ェクション試薬（ポリエチレンイミン、巨大分子、デンドリマーを含む）、ビー
ズ（たとえば、アガロース、シリカ、ニトロセルロース、セルロース、アクリル
アミド、ラテックス、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル
酸エステル、ポリエチレンポリマー、ガラス粒子、ケイ酸塩、金属酸化物または
これらの組み合わせからなるもの）、インターカレート剤（臭化エチジウム、プ
ソラレンおよびその誘導体を含む）より選択される。好ましいフルオロフォアは
、BODIPY、クマリン、ダンシル、フルオレセイン、マンシル(mansyl)、ピレン、
ローダミン、テキサスレッド、TNSおよびCy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5およびCy
7のようなシアニンフルオロフォアである。これらのフルオロフォアの誘導体も
また用いることができる。R4として特に好ましいものはダンシルである。
、タンパク質（抗体および酵素を含む）、ペプチド、アミノ酸、修飾されたアミ
ノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸、炭水化物、脂質、PEG、トランスフ
ェクション試薬（ポリエチレンイミン、巨大分子、デンドリマーを含む）、ビー
ズ（たとえば、アガロース、シリカ、ニトロセルロース、セルロース、アクリル
アミド、ラテックス、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル
酸エステル、ポリエチレンポリマー、ガラス粒子、ケイ酸塩、金属酸化物または
これらの組み合わせからなるもの）、インターカレート剤（臭化エチジウム、プ
ソラレンおよびその誘導体を含む）より選択される。好ましいフルオロフォアは
、BODIPY、クマリン、ダンシル、フルオレセイン、マンシル(mansyl)、ピレン、
ローダミン、テキサスレッド、TNSおよびCy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5およびCy
7のようなシアニンフルオロフォアである。これらのフルオロフォアの誘導体も
また用いることができる。R4として特に好ましいものはダンシルである。
【００２１】 R4がアフィニティータグである場合、R4は、好ましくはペプチドタグ、ビオチ
ン、ジゴキシゲニン（digoxygenin）またはジニトロフェノールである。有用な
ペプチドタグはたとえば、his-タグまたはIMAC（固定化金属アフィニティークロ
マトグラフィー）に用いることができる金属キレート能を有するすべてのタグ、
連鎖球菌タグ(strep-tag)、フラッグタグ、c-myc-タグ、エピトープ、またはグ
ルタチオンである。
ン、ジゴキシゲニン（digoxygenin）またはジニトロフェノールである。有用な
ペプチドタグはたとえば、his-タグまたはIMAC（固定化金属アフィニティークロ
マトグラフィー）に用いることができる金属キレート能を有するすべてのタグ、
連鎖球菌タグ(strep-tag)、フラッグタグ、c-myc-タグ、エピトープ、またはグ
ルタチオンである。
【００２２】 有用な架橋剤は、たとえば、マレイミド、ヨードアセトアミド、その誘導体、
アルデヒド誘導体および光架橋剤である。光架橋剤の例は、アリールアジド、ジ
アゾ化合物およびベンゾフェノン化合物である。
アルデヒド誘導体および光架橋剤である。光架橋剤の例は、アリールアジド、ジ
アゾ化合物およびベンゾフェノン化合物である。
【００２３】 N-アデノシルアジリジン（化合物２）は、たとえば、アジリジンによる5'-ト
シルアデノシンのトシル基の求核置換による１段階の反応で合成することができ
る（下記の反応スキーム２を参照されたい）。
シルアデノシンのトシル基の求核置換による１段階の反応で合成することができ
る（下記の反応スキーム２を参照されたい）。
【００２４】
【化５】 反応スキーム２ 反応スキーム３は、一方には天然の補因子１を用いた、他方には本発明による
新規の補因子２を用いた、メチルトランスフェラーゼ(MTase)により触媒される
反応を示す。
新規の補因子２を用いた、メチルトランスフェラーゼ(MTase)により触媒される
反応を示す。
【００２５】
【化６】 反応スキーム３ 下記の反応スキーム４に、Thermus aquaticusから得たアデニン特異的DNAメチ
ルトランスフェラーゼ(M・Taql)を用いた、プラス鎖オリゴデオキシヌクレオチ
ド(5'-GCCGCTCGATGCCG-3'、3)および相補マイナス鎖オリゴデオキシヌクレオチ
ド(5'-CGGCATCGAMeGCGGC-3'、4)からなる短い二重(duplex)オリゴデオキシヌク
レオチド(3・4)の、アジリジンを含むプロトン化補因子類似体２による修飾を示
す。相補マイナス鎖オリゴデオキシヌクレオチド４は、M・Taqlによってそれ以
上メチル化され得ない、N6-メチルアデニン-1-β-D-2'-デオキシヌクレオシド(A Me )を含むように選択された。M・Taqlは通常、天然の補因子１から二本鎖5'-TCG
A-3' DNA配列内のアデニンの環外アミノ基へのメチル基の転移を触媒する（反応
スキーム４、上）(M.McClelland, Nucleic Acids Res. 1981, 9, 6795-6804)。
ルトランスフェラーゼ(M・Taql)を用いた、プラス鎖オリゴデオキシヌクレオチ
ド(5'-GCCGCTCGATGCCG-3'、3)および相補マイナス鎖オリゴデオキシヌクレオチ
ド(5'-CGGCATCGAMeGCGGC-3'、4)からなる短い二重(duplex)オリゴデオキシヌク
レオチド(3・4)の、アジリジンを含むプロトン化補因子類似体２による修飾を示
す。相補マイナス鎖オリゴデオキシヌクレオチド４は、M・Taqlによってそれ以
上メチル化され得ない、N6-メチルアデニン-1-β-D-2'-デオキシヌクレオシド(A Me )を含むように選択された。M・Taqlは通常、天然の補因子１から二本鎖5'-TCG
A-3' DNA配列内のアデニンの環外アミノ基へのメチル基の転移を触媒する（反応
スキーム４、上）(M.McClelland, Nucleic Acids Res. 1981, 9, 6795-6804)。
【００２６】 反応生成物5・4の構造は、たとえば、逆相HPLCと組み合わせた電子スプレーイ
オン化質量分析(RP-HPLC/ESI-MS)によって証明することができる。
オン化質量分析(RP-HPLC/ESI-MS)によって証明することができる。
【００２７】
【化７】 反応スキーム４ 実験結果により、非天然の補因子２により、M・Taqlの5'-TCGA-3'認識配列内
の標的位置にアデニンを含むメチル化されていないプラス鎖３が定量的に修飾さ
れることが証明された。他の標的位置にN6-メチルアデニンを含む、および認識
配列の外にアデニンを含む鎖４は修飾されないという我々の観察結果は、新規の
補因子２によってM・Taqlの配列特異性は変化しないことを証明している。さら
に、二重5・4生成物の酵素による断片化とそれに続く逆相HPLC分析によって、天
然のヌクレオシドdC、dA、dG、T、およびdAMeの他に別の化合物が得られた。こ
の別の化合物を単離し、電子スプレーイオン化質量分析によって、m/z 544.6に
おける正に荷電したイオンとして検出した。この質量の実測値は、プロトン化さ
れた、N-アデノシルアジリジンで修飾された2'-デオキシアデノシンの分子量の
計算値と一致している。この結果は、プラス鎖３の中の標的アデニンのみが修飾
されることを示している。このように、 M・Taqlに触媒される新規の補因子２の
DNAへのカップリングは、定量的で、配列および塩基特異的である。
の標的位置にアデニンを含むメチル化されていないプラス鎖３が定量的に修飾さ
れることが証明された。他の標的位置にN6-メチルアデニンを含む、および認識
配列の外にアデニンを含む鎖４は修飾されないという我々の観察結果は、新規の
補因子２によってM・Taqlの配列特異性は変化しないことを証明している。さら
に、二重5・4生成物の酵素による断片化とそれに続く逆相HPLC分析によって、天
然のヌクレオシドdC、dA、dG、T、およびdAMeの他に別の化合物が得られた。こ
の別の化合物を単離し、電子スプレーイオン化質量分析によって、m/z 544.6に
おける正に荷電したイオンとして検出した。この質量の実測値は、プロトン化さ
れた、N-アデノシルアジリジンで修飾された2'-デオキシアデノシンの分子量の
計算値と一致している。この結果は、プラス鎖３の中の標的アデニンのみが修飾
されることを示している。このように、 M・Taqlに触媒される新規の補因子２の
DNAへのカップリングは、定量的で、配列および塩基特異的である。
【００２８】 けれども、本発明はM・Taqlに限定されるものではなく、C5-シトシン特異的DN
AメチルトランスフェラーゼHaemophilus haemolyticus(M・Hhal)、および普通は
S-アデノシル-L-メチオニン(SAM)を補因子として用いる他のメチルトランスフェ
ラーゼもまた使用できる。これは、 M・Hhalを用いて二重オリゴデオキシヌクレ
オチド6・7を修飾することによって容易に証明される。天然では、M・HhalはSAM
から二本鎖5'-GCGC-3' DNA配列内の第１のシトシンの５位の炭素原子への活性化
されたメチルの転移を触媒する（反応スキーム５、上）。実験結果により、M・H
halもまた新規の補因子２を受容し、その二重オリゴデオキシヌクレオチド6・7
へのカップリングを触媒することが証明された（反応スキーム５、下）。M・Taq
lに触媒される反応と同様に、M・Hhalに触媒されるカップリングは定量的である
。
AメチルトランスフェラーゼHaemophilus haemolyticus(M・Hhal)、および普通は
S-アデノシル-L-メチオニン(SAM)を補因子として用いる他のメチルトランスフェ
ラーゼもまた使用できる。これは、 M・Hhalを用いて二重オリゴデオキシヌクレ
オチド6・7を修飾することによって容易に証明される。天然では、M・HhalはSAM
から二本鎖5'-GCGC-3' DNA配列内の第１のシトシンの５位の炭素原子への活性化
されたメチルの転移を触媒する（反応スキーム５、上）。実験結果により、M・H
halもまた新規の補因子２を受容し、その二重オリゴデオキシヌクレオチド6・7
へのカップリングを触媒することが証明された（反応スキーム５、下）。M・Taq
lに触媒される反応と同様に、M・Hhalに触媒されるカップリングは定量的である
。
【００２９】
【化８】 反応スキーム５ 本願ははじめて、2個の相異なるS-アデノシル-L-メチオニン依存メチルトラン
スフェラーゼにより触媒される、メチル基より大きい基の転移について述べるも
のである。例えば、化合物2の転移によって非反復(unique)2級アミノ基がDNAに
導入されるので、次のアミン反応性プローブによる標識反応を実行することが必
要である。従って、蛍光性、化学発光性またはその他リポーター基を部位特異的
に導入することが可能となる。
スフェラーゼにより触媒される、メチル基より大きい基の転移について述べるも
のである。例えば、化合物2の転移によって非反復(unique)2級アミノ基がDNAに
導入されるので、次のアミン反応性プローブによる標識反応を実行することが必
要である。従って、蛍光性、化学発光性またはその他リポーター基を部位特異的
に導入することが可能となる。
【００３０】 あるいは、新規蛍光性補因子(補因子)9(式中R1は-NH(CH2)4NHR4であり、R2はH
であり、YはNであり、そしてR4は蛍光性ダンシル基である)を用いて配列特異的
に標識されたDNAを直接に得ることができる。この蛍光性N-アデノシルアジリジ
ン誘導体は、5'位、メチルトランスフェラーゼの補因子結合に対する分子アンカ
ーとして作用するアデノシル部分に反応性アジリジン基を、及びフレキシブルリ
ンカーにより8位に結合している蛍光性ダンシル基(標識)を含んでいる。この新
規蛍光性補因子9の合成を反応スキーム6に示す。8-ブロモ-2',3'-O-イソプロピ
リデンアデノシンを1,4-ジアミノブタンと反応させると8位にアミノリンカーを
もつ保護されたアデノシン誘導体が得られる。5'ヒドロキシ基をトリメチルクロ
ロシランで一時的に保護し、ダンシルクロリドと1級アミンとのカップリング反
応を行い、5'ヒドロキシ保護基を除去すると、保護された蛍光性アデノシン誘導
体11が得られる。11をメシルクロリドと反応させるとメシル化物12が得られる。
酸性条件下12のイソプロピリデン基を除去すると蛍光性アデノシン誘導体13が得
られ、これをアジリジンと反応させると新規蛍光性補因子9が得られる。
であり、YはNであり、そしてR4は蛍光性ダンシル基である)を用いて配列特異的
に標識されたDNAを直接に得ることができる。この蛍光性N-アデノシルアジリジ
ン誘導体は、5'位、メチルトランスフェラーゼの補因子結合に対する分子アンカ
ーとして作用するアデノシル部分に反応性アジリジン基を、及びフレキシブルリ
ンカーにより8位に結合している蛍光性ダンシル基(標識)を含んでいる。この新
規蛍光性補因子9の合成を反応スキーム6に示す。8-ブロモ-2',3'-O-イソプロピ
リデンアデノシンを1,4-ジアミノブタンと反応させると8位にアミノリンカーを
もつ保護されたアデノシン誘導体が得られる。5'ヒドロキシ基をトリメチルクロ
ロシランで一時的に保護し、ダンシルクロリドと1級アミンとのカップリング反
応を行い、5'ヒドロキシ保護基を除去すると、保護された蛍光性アデノシン誘導
体11が得られる。11をメシルクロリドと反応させるとメシル化物12が得られる。
酸性条件下12のイソプロピリデン基を除去すると蛍光性アデノシン誘導体13が得
られ、これをアジリジンと反応させると新規蛍光性補因子9が得られる。
【００３１】
【化９】 反応スキーム6 M・Taqlにより触媒される新規蛍光性補因子9と二重オリゴデオキシヌクレオチ
ド3・4(スキーム7)とをカップリングさせた後、陰イオン交換クロマトグラフィ
を行った。得られたM・Taql-DNA複合体のタンパク分解断片化を行うと、蛍光標
識二重オリゴデオキシヌクレオチド14・4が生成する。生成物14・4の構造は酵素
断片化後逆相HPLCを行って確認した。この分析から、天然のヌクレオシドである
dC、dA、dG、T及びdAMeの他に、さらに天然のヌクレオシドよりもはるかに高い
保持時間で溶出する、疎水性を示す蛍光化合物があることが分かった。この追加
の蛍光性化合物は、分離してエレクトロスプレーイオン化質量分析(electrospra
y ionization mass spectrometry)によりm/z 863.1における陽電荷として検出し
た。実測質量は、プロトン化された9改変2'-デオキシアデノシンの理論分子質量
863・4とよく一致する。従って、新規蛍光性補因子9とDNAとのM・Taqlにより触
媒されるカップリング反応は定量的であり、かつ、塩基特異的である。
ド3・4(スキーム7)とをカップリングさせた後、陰イオン交換クロマトグラフィ
を行った。得られたM・Taql-DNA複合体のタンパク分解断片化を行うと、蛍光標
識二重オリゴデオキシヌクレオチド14・4が生成する。生成物14・4の構造は酵素
断片化後逆相HPLCを行って確認した。この分析から、天然のヌクレオシドである
dC、dA、dG、T及びdAMeの他に、さらに天然のヌクレオシドよりもはるかに高い
保持時間で溶出する、疎水性を示す蛍光化合物があることが分かった。この追加
の蛍光性化合物は、分離してエレクトロスプレーイオン化質量分析(electrospra
y ionization mass spectrometry)によりm/z 863.1における陽電荷として検出し
た。実測質量は、プロトン化された9改変2'-デオキシアデノシンの理論分子質量
863・4とよく一致する。従って、新規蛍光性補因子9とDNAとのM・Taqlにより触
媒されるカップリング反応は定量的であり、かつ、塩基特異的である。
【００３２】
【化１０】 反応スキーム7 本発明はまたより大きいDNA分子を標識するのにも使用することができる。こ
れは、新規蛍光性補因子9及びM・TaqlによるプラスミドpUC19(2,686塩基対)の標
識により証明される。標識反応は異なるインキュベーション時間後陰イオン交換
クロマトグラフィにより分析した。UV検出を用いるクロマトグラムには有意な変
化はなかったが、蛍光検出を用いるクロマトグラムは明らかにインキュベーショ
ン時間による蛍光シグナルの増加を示した。UVシグナルと蛍光シグナルは重なっ
ており、出発物質pUC19(UV吸収のみ)と蛍光標識したpUC19(UV吸収及び蛍光)が同
じ保持時間で溶出することを示している。M・Taqlなしの対応実験によれば、蛍
光標識したpUC19に相当する蛍光シグナルは観察されなかった。この結果は、標
識反応が事実上M・Taqlにより触媒されることを示している。興味深いことであ
るが、蛍光性ヌクレオシド9もまたM・Hhalの補因子として機能する。M・Hhalに
より触媒される蛍光性ヌクレオシド9とpUC19のカップリング反応を陰イオン交換
クロマトグラフィにより分析したところ、蛍光標識したpUC19も生成し、M・Hhal
がない場合には標識がおこらないことがわかる。
れは、新規蛍光性補因子9及びM・TaqlによるプラスミドpUC19(2,686塩基対)の標
識により証明される。標識反応は異なるインキュベーション時間後陰イオン交換
クロマトグラフィにより分析した。UV検出を用いるクロマトグラムには有意な変
化はなかったが、蛍光検出を用いるクロマトグラムは明らかにインキュベーショ
ン時間による蛍光シグナルの増加を示した。UVシグナルと蛍光シグナルは重なっ
ており、出発物質pUC19(UV吸収のみ)と蛍光標識したpUC19(UV吸収及び蛍光)が同
じ保持時間で溶出することを示している。M・Taqlなしの対応実験によれば、蛍
光標識したpUC19に相当する蛍光シグナルは観察されなかった。この結果は、標
識反応が事実上M・Taqlにより触媒されることを示している。興味深いことであ
るが、蛍光性ヌクレオシド9もまたM・Hhalの補因子として機能する。M・Hhalに
より触媒される蛍光性ヌクレオシド9とpUC19のカップリング反応を陰イオン交換
クロマトグラフィにより分析したところ、蛍光標識したpUC19も生成し、M・Hhal
がない場合には標識がおこらないことがわかる。
【００３３】 ナチュラル補因子と複合体を形成しているいくつかのメチルトランスフェラー
ゼの3次元構造(N6-アデニンメチルトランスフェラーゼM・Taql：J. Labahn, J.
Granzin, G. Schluckebier, D. P. Robinson, W. E. Jack, I. Schildkraut, W.
Saenger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 10957-10961; N6-アデニン
DNAメチルトランスフェラーゼDpnM: P. H. Tran, Z. R. Korszun, S. Cerritell
i, S.S. Springhorn, S. A. Lacks, Structure 1998, 6, 1563-1575; C5-シトシ
ンDNAメチルトランスフェラーゼM・Hhal: S. Klimasauskas, S. Kumar, R. J. R
oberts, X. Cheng, Cell 1994, 76, 357-369; N4-シトシンDNAメチルトランスフ
ェラーゼM・Pvull; W. Gong, M. O'Gara, R. M. Blumenthal, X. Cheng, Nuclei
c Acids Res. 1997, 25, 2702-2715; N6-アデニンRNAメチルトランスフェラーゼ
ErmC': D. E. Bussiere, S. W. Muchmore, C. G. Dealwis, G. Schluckebier, V
. L. Nienaber, R. P. Edalji, K. A. Walter, U.S. Ladror, T. F. Holzman, C
. Abad-Zapatero, Biochemistry 1998, 37, 7103-7112; mRNA 2'-O-ヌクレオシ
ドメチルトランスフェラーゼVP39: A. E. Hodel, P. D. Gershorn, X. Shi, F.
A. Quiocho, Cell 1996, 85, 247-256; タンパク質のメチルトランスフェラーゼ
CheR: S. Djordjevic, A. M. Stock, Structure 1997, 5, 545-558)は、ナチュ
ラル補因子のアデニン環の8位が少なくとも一部溶媒に親和性がある。従って、
これらメチルトランスフェラーゼの補因子結合により強い干渉を受けることなく
追加の基を結合するのに適している。あるメチルトランスフェラーゼでは、ナチ
ュラル補因子のアデニン環の7位はさらに強く溶媒に曝されるため、これらのメ
チルトランスフェラーゼに対して追加の基(式I中Y)を結合させるには好ましい選
択位置となる。さらに、ナチュラル補因子との複合体中のカテコールO-メチルト
ランスフェラーゼの3次元構造(J. Vidgren, L. A. Svensson, A. Liljas, Natur
e 1994, 368, 354-358)は、ナチュラル補因子のアデニン環が補因子結合ポケッ
ト内に埋もれていることを示している。ここで、5位アジリジン環(式I中R2)に追
加の基を結合させるとこのメチルトランスフェラーゼの補因子結合と最も適合す
る(compatible)ようである。従って、アデニン環の8位(式I中R1)、アデニン環の
7位(式I中Y)または5'アジリジン環(式I中R2)において改変された新規補因子を用
いて種々の部位特異的に標識されたバイオ分子を得ることができる。
ゼの3次元構造(N6-アデニンメチルトランスフェラーゼM・Taql：J. Labahn, J.
Granzin, G. Schluckebier, D. P. Robinson, W. E. Jack, I. Schildkraut, W.
Saenger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 10957-10961; N6-アデニン
DNAメチルトランスフェラーゼDpnM: P. H. Tran, Z. R. Korszun, S. Cerritell
i, S.S. Springhorn, S. A. Lacks, Structure 1998, 6, 1563-1575; C5-シトシ
ンDNAメチルトランスフェラーゼM・Hhal: S. Klimasauskas, S. Kumar, R. J. R
oberts, X. Cheng, Cell 1994, 76, 357-369; N4-シトシンDNAメチルトランスフ
ェラーゼM・Pvull; W. Gong, M. O'Gara, R. M. Blumenthal, X. Cheng, Nuclei
c Acids Res. 1997, 25, 2702-2715; N6-アデニンRNAメチルトランスフェラーゼ
ErmC': D. E. Bussiere, S. W. Muchmore, C. G. Dealwis, G. Schluckebier, V
. L. Nienaber, R. P. Edalji, K. A. Walter, U.S. Ladror, T. F. Holzman, C
. Abad-Zapatero, Biochemistry 1998, 37, 7103-7112; mRNA 2'-O-ヌクレオシ
ドメチルトランスフェラーゼVP39: A. E. Hodel, P. D. Gershorn, X. Shi, F.
A. Quiocho, Cell 1996, 85, 247-256; タンパク質のメチルトランスフェラーゼ
CheR: S. Djordjevic, A. M. Stock, Structure 1997, 5, 545-558)は、ナチュ
ラル補因子のアデニン環の8位が少なくとも一部溶媒に親和性がある。従って、
これらメチルトランスフェラーゼの補因子結合により強い干渉を受けることなく
追加の基を結合するのに適している。あるメチルトランスフェラーゼでは、ナチ
ュラル補因子のアデニン環の7位はさらに強く溶媒に曝されるため、これらのメ
チルトランスフェラーゼに対して追加の基(式I中Y)を結合させるには好ましい選
択位置となる。さらに、ナチュラル補因子との複合体中のカテコールO-メチルト
ランスフェラーゼの3次元構造(J. Vidgren, L. A. Svensson, A. Liljas, Natur
e 1994, 368, 354-358)は、ナチュラル補因子のアデニン環が補因子結合ポケッ
ト内に埋もれていることを示している。ここで、5位アジリジン環(式I中R2)に追
加の基を結合させるとこのメチルトランスフェラーゼの補因子結合と最も適合す
る(compatible)ようである。従って、アデニン環の8位(式I中R1)、アデニン環の
7位(式I中Y)または5'アジリジン環(式I中R2)において改変された新規補因子を用
いて種々の部位特異的に標識されたバイオ分子を得ることができる。
【００３４】 本発明に有用なメチルトランスフェラーゼは通常、DNAやRNAのような核酸分子
にあるSAMのメチル基をポリペプチド、タンパク質、酵素または小分子へ転移さ
せる。SAM依存メチルトランスフェラーゼの総説は例えば、R. M. Kagan及びS. C
larkeのArchives of Biochemistry and Biophysics 1994, 310, 417-427にまと
められている。この論文はまた小分子O-メチルトランスフェラーゼ類及び小分子
N-メチルトランスフェラーゼ類のリストを掲げており、この中には例えば、カテ
コールO-メチルトランスフェラーゼやグリシンN-メチルトランスフェラーゼが含
まれる。
にあるSAMのメチル基をポリペプチド、タンパク質、酵素または小分子へ転移さ
せる。SAM依存メチルトランスフェラーゼの総説は例えば、R. M. Kagan及びS. C
larkeのArchives of Biochemistry and Biophysics 1994, 310, 417-427にまと
められている。この論文はまた小分子O-メチルトランスフェラーゼ類及び小分子
N-メチルトランスフェラーゼ類のリストを掲げており、この中には例えば、カテ
コールO-メチルトランスフェラーゼやグリシンN-メチルトランスフェラーゼが含
まれる。
【００３５】 本発明において特に好ましく用いられるのは、DNAをメチル化するメチルトラ
ンスフェラーゼ、特にバクテリアの制限改変系の一部であるメチルトランスフェ
ラーゼと異なるアミノ酸のタンパク質をメチル化するメチルトランスフェラーゼ
である。
ンスフェラーゼ、特にバクテリアの制限改変系の一部であるメチルトランスフェ
ラーゼと異なるアミノ酸のタンパク質をメチル化するメチルトランスフェラーゼ
である。
【００３６】 本発明はアジリジン誘導体そのものに関するだけでなく、そのような誘導体と
メチルトランスフェラーゼとの複合体、並びに、本発明のアジリジン誘導体また
はその複合体とメチルトランスフェラーゼとを含有する医薬及び診断薬組成物に
関する。
メチルトランスフェラーゼとの複合体、並びに、本発明のアジリジン誘導体また
はその複合体とメチルトランスフェラーゼとを含有する医薬及び診断薬組成物に
関する。
【００３７】 本発明のアジリジン誘導体は、標的分子(例えば、DNAまたはその断片、RNAま
たはその断片、DNA及びRNAのハイブリッド、ポリペプチド、例えば、メチル化部
位を含む融合タンパク質のタンパク質、合成ポリマー及び脂質のような小分子)
を改変するのに用いることができる。これは、メチルトランスフェラーゼを用い
て、本発明のアジリジン誘導体またはその一部を標的分子に転移させることによ
り行われる。
たはその断片、DNA及びRNAのハイブリッド、ポリペプチド、例えば、メチル化部
位を含む融合タンパク質のタンパク質、合成ポリマー及び脂質のような小分子)
を改変するのに用いることができる。これは、メチルトランスフェラーゼを用い
て、本発明のアジリジン誘導体またはその一部を標的分子に転移させることによ
り行われる。
【００３８】 本発明をさらに以下の実施例によりさらに説明する。
【００３９】実施例1 1. N-アデノシルアジリジン、化合物2の合成(スキーム2) アルゴン雰囲気下5'-トシルアデノシン(100ミリグラム、0.24ミリモル、Aldri
ch)のN-エチルジイソプロピルアミン(125μl、0.7ミリモル)懸濁液に、乾燥アジ
リジン(S. Gabriel, Chem. Ber. 1888, 21, 2664-2669; S. Gabriel, R. Stelzn
er, Chem. Ber. 1895, 28, 2929-2938)(360μl、7.2ミリモル)を徐々に添加した
。そして得られた溶液を室温で3日間撹拌した。残留しているアジリジンはすべ
て減圧留去し、粗反応生成物を水(1ミリリットル)に溶解して酢酸(1 M)で中和し
た。この溶液(1回に100μl)を逆相HPLCカラム(Hypersil-ODS, 5μm、120オング
ストローム、250 x 10 mm, Bischoff, Leonberg, Germany)に入れ、炭酸水素ト
リエチルアンモニウム緩衝液(0.1 M、pH 8.4)中アセトニトリルの直線勾配(30分
で7-10%、2 ミリリットル/分)により生成物を溶出した。生成物を含むフラクシ
ョン(保持時間11.3分、259 nmでUV検出)を合わせ、凍結乾燥により5.5ミリリッ
トルまで濃縮(10.5 mM,アデノシンのλ=260、ε=15400を使用)した後、-80℃で
保存した。収率、0.058ミリモル(24%)。さらなるキャラクタリゼーションのため
、アリコートを完全に凍結乾燥し白色固体として化合物2を得た。
ch)のN-エチルジイソプロピルアミン(125μl、0.7ミリモル)懸濁液に、乾燥アジ
リジン(S. Gabriel, Chem. Ber. 1888, 21, 2664-2669; S. Gabriel, R. Stelzn
er, Chem. Ber. 1895, 28, 2929-2938)(360μl、7.2ミリモル)を徐々に添加した
。そして得られた溶液を室温で3日間撹拌した。残留しているアジリジンはすべ
て減圧留去し、粗反応生成物を水(1ミリリットル)に溶解して酢酸(1 M)で中和し
た。この溶液(1回に100μl)を逆相HPLCカラム(Hypersil-ODS, 5μm、120オング
ストローム、250 x 10 mm, Bischoff, Leonberg, Germany)に入れ、炭酸水素ト
リエチルアンモニウム緩衝液(0.1 M、pH 8.4)中アセトニトリルの直線勾配(30分
で7-10%、2 ミリリットル/分)により生成物を溶出した。生成物を含むフラクシ
ョン(保持時間11.3分、259 nmでUV検出)を合わせ、凍結乾燥により5.5ミリリッ
トルまで濃縮(10.5 mM,アデノシンのλ=260、ε=15400を使用)した後、-80℃で
保存した。収率、0.058ミリモル(24%)。さらなるキャラクタリゼーションのため
、アリコートを完全に凍結乾燥し白色固体として化合物2を得た。
【００４０】 2. オリゴデオキシヌクレオチド類の合成及び精製 標準β-シアノエチルホスホロアミダイト化学法を用い、アプライドバイオシ
ステムズ社の392 DNA/RNAシンセサイザーで、オリゴデオキシヌクレオチド3、4
、6及び7を合成した。合成は「トリチルオン(trityl on)」により行い、オリゴ
デオキシヌクレオチドは逆相HPLCで精製した。酢酸(80%)で脱トリチル化した後
、オリゴデオキシヌクレオチドは逆相HPLCでさらに精製し(「トリチルオフ(trit
yl off)」)、ゲルろ過により脱塩した。95℃(2分間)で、緩衝液(3・4に対しては
20 mMトリス酢酸、50 mM酢酸カリウム、10 mM酢酸マグネシウム、pH 9.7、6・7
に対しては10 mMトリス塩酸、50 mM塩化ナトリウム、0.5 mM EDTA、pH 7.4)中、
等モル量の相補鎖とインキュベートした後、室温に徐冷する(2時間)ことにより
二重オリゴデオキシヌクレオチド3・4及び6・7を作った。
ステムズ社の392 DNA/RNAシンセサイザーで、オリゴデオキシヌクレオチド3、4
、6及び7を合成した。合成は「トリチルオン(trityl on)」により行い、オリゴ
デオキシヌクレオチドは逆相HPLCで精製した。酢酸(80%)で脱トリチル化した後
、オリゴデオキシヌクレオチドは逆相HPLCでさらに精製し(「トリチルオフ(trit
yl off)」)、ゲルろ過により脱塩した。95℃(2分間)で、緩衝液(3・4に対しては
20 mMトリス酢酸、50 mM酢酸カリウム、10 mM酢酸マグネシウム、pH 9.7、6・7
に対しては10 mMトリス塩酸、50 mM塩化ナトリウム、0.5 mM EDTA、pH 7.4)中、
等モル量の相補鎖とインキュベートした後、室温に徐冷する(2時間)ことにより
二重オリゴデオキシヌクレオチド3・4及び6・7を作った。
【００４１】3. 酵素反応 3.1 N6-アデニンDNAメチルトランスフェラーゼM・Taqlによる酵素反応 前記のようにして補因子をもたないDNAメチルトランスフェラーゼM・Taqlを作
った(B. Holz, S. Klimasauskas, S. Serva, E. Weinhold, Nucleic Acids Res.
1998, 26, 1076-1083)。M・Taql(5 nmol, 10μM)、二重オリゴデオキシヌクレ
オチド3・4 (5 nmol, 10μM)、化合物2(500 nmol, 1 mM)、トリス酢酸(20 mM, p
H 6.0)、酢酸カリウム(50 mM)、酢酸マグネシウム(10 mM)及びトリトンX-100(0.
01%)の混合物(500μl)中37℃で酵素による触媒反応を行った。反応の進行は陰イ
オン交換クロマトグラフィでモニターした。異なるインキュベーション時間毎に
反応混合物のアリコート(50μl)を取り出し、尿素溶液(100μl、6 M)と混合した
後、陰イオン交換カラム(Poros 10 HQ, 10μm, 4.6 x 100 mm, PerSeptive Bios
ystems, Germany)に入れた。化合物は、トリス塩酸緩衝液(10 mM, pH 7.6)中塩
化カリウム水溶液で溶出した(5分間で0.5 M、その後30分間で1 Mまでの直線勾配
、4 ミリリットル/分)。異なるインキュベーション時間後の陰イオン交換クロマ
トグラフィのクロマトグラムを図1に示す。
った(B. Holz, S. Klimasauskas, S. Serva, E. Weinhold, Nucleic Acids Res.
1998, 26, 1076-1083)。M・Taql(5 nmol, 10μM)、二重オリゴデオキシヌクレ
オチド3・4 (5 nmol, 10μM)、化合物2(500 nmol, 1 mM)、トリス酢酸(20 mM, p
H 6.0)、酢酸カリウム(50 mM)、酢酸マグネシウム(10 mM)及びトリトンX-100(0.
01%)の混合物(500μl)中37℃で酵素による触媒反応を行った。反応の進行は陰イ
オン交換クロマトグラフィでモニターした。異なるインキュベーション時間毎に
反応混合物のアリコート(50μl)を取り出し、尿素溶液(100μl、6 M)と混合した
後、陰イオン交換カラム(Poros 10 HQ, 10μm, 4.6 x 100 mm, PerSeptive Bios
ystems, Germany)に入れた。化合物は、トリス塩酸緩衝液(10 mM, pH 7.6)中塩
化カリウム水溶液で溶出した(5分間で0.5 M、その後30分間で1 Mまでの直線勾配
、4 ミリリットル/分)。異なるインキュベーション時間後の陰イオン交換クロマ
トグラフィのクロマトグラムを図1に示す。
【００４２】 逆相HPLCと組み合わせたエレクトロスプレーイオン化質量分析による生成物二
重オリゴデオキシヌクレオチド5・4の分析：マイクロHPLCシステムを備えたイオ
ントラップ質量分析器(LCQ, Finnigan MAT, Germany)によりRP-HPLC/ESI-MSを行
った。陰イオン交換クロマトグラフィにより生成物二重オリゴデオキシヌクレオ
チド5・4を分析し(上記参照)、何度も水を加えて脱塩後限外濾過を行った(Micro
sep 3K, Pall Filtron, Northborough, MA, USA)。精製脱塩した5・4の溶液をキ
ャピラリーカラム(Hypersil-ODS, 3μm、150 x 0.3 mm, LC Packings, Amsterda
m, Netherlands)にいれ、酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液(0.1 M, pH 7.0)中
、アセトニトリルの直線勾配で溶出した(10分間で7-10%、その後30分間で10-70%
、150 μl/min)。標準条件を用いる陰イオンモードで図2Aに示すRP-HPLC/ESI質
量スペクトルが得られた。総イオン流を観察して得られたクロマトグラムを図2A
中の図に示す。
重オリゴデオキシヌクレオチド5・4の分析：マイクロHPLCシステムを備えたイオ
ントラップ質量分析器(LCQ, Finnigan MAT, Germany)によりRP-HPLC/ESI-MSを行
った。陰イオン交換クロマトグラフィにより生成物二重オリゴデオキシヌクレオ
チド5・4を分析し(上記参照)、何度も水を加えて脱塩後限外濾過を行った(Micro
sep 3K, Pall Filtron, Northborough, MA, USA)。精製脱塩した5・4の溶液をキ
ャピラリーカラム(Hypersil-ODS, 3μm、150 x 0.3 mm, LC Packings, Amsterda
m, Netherlands)にいれ、酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液(0.1 M, pH 7.0)中
、アセトニトリルの直線勾配で溶出した(10分間で7-10%、その後30分間で10-70%
、150 μl/min)。標準条件を用いる陰イオンモードで図2Aに示すRP-HPLC/ESI質
量スペクトルが得られた。総イオン流を観察して得られたクロマトグラムを図2A
中の図に示す。
【００４３】 直接インフュージョン(infusion)を用いるエレクトロスプレーイオン化質量分
析による生成物二重オリゴデオキシヌクレオチド5・4の分析：陰イオンモードで
ESI IIエレクトロスプレーイオンソースをもつダブルフォーカスセクターフィー
ルド質量分析器MAT 90 (Finnigan MAT, Germany)を用いて図2Bに示すESI質量ス
ペクトルが得られた。ハーバード注入ポンプ(Harvard Apparatus, USA)を用いて
、脱塩した5・4(水溶液)及び液体シース(sheath)フロー(2-プロパノール)を得た
。図2B中の図は、同位元素分析により[5-6H]6イオン]のシグナルの増強を示す。
析による生成物二重オリゴデオキシヌクレオチド5・4の分析：陰イオンモードで
ESI IIエレクトロスプレーイオンソースをもつダブルフォーカスセクターフィー
ルド質量分析器MAT 90 (Finnigan MAT, Germany)を用いて図2Bに示すESI質量ス
ペクトルが得られた。ハーバード注入ポンプ(Harvard Apparatus, USA)を用いて
、脱塩した5・4(水溶液)及び液体シース(sheath)フロー(2-プロパノール)を得た
。図2B中の図は、同位元素分析により[5-6H]6イオン]のシグナルの増強を示す。
【００４４】 図2A及び2Bのエレクトロスプレー質量分析で観察されたオリゴデオキシヌクレ
オチドの分子量を表1にまとめた。さらに、溶出物(educt)オリゴデオキシヌクレ
オチドの実測分子量を示す。
オチドの分子量を表1にまとめた。さらに、溶出物(educt)オリゴデオキシヌクレ
オチドの実測分子量を示す。
【００４５】
【表１】 酵素断片化による生成物二重オリゴデオキシヌクレオチド5・4の分析：塩化マ
グネシウム(10 mM)、DNase I (1.2 U)、Crotalus durissusから得られたホスホ
ジエステラーゼ(0.018 U)、ウシ脾臓から得られたホスホジエステラーゼ(0.024
U)及びアルカリホスファターゼ(6 U)を含有するリン酸カリウム緩衝液(10 mM, p
H 7.0, 100μl)に、精製脱塩した5・4 (260 nmで0.25 OD)を溶解し、37℃で24時
間インキュベートした。アリコート(50μl)を逆相HPLCカラム(Hypersil-ODS, 5
μm、120オングストローム、250 x 4.6 mm, Bischoff, Leonberg, Germany)に入
れて、酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液(0.1 M, pH 7.0)中アセトニトリルの
直線勾配(30分で0-10.5%、1 ミリリットル/分)により生成物を溶出した。分解物
をRP-HPLCにより分析したところ、dC、dA、dG、T及びdAMeの他に、T及びdAMe間
に溶出する追加の化合物があることがわかった。この追加化合物を分離し、ESI-
MS (ナノエレクトロスプレーイオンソースと連動するLCQ、Finnigan MAT, Germa
ny)によりm/z 544.6で陽イオンとして検出した。実測質量は、プロトン化したN-
アデノシルアジリジン改変2'-デオキシアデノシンの理論分子質量と一致する。
グネシウム(10 mM)、DNase I (1.2 U)、Crotalus durissusから得られたホスホ
ジエステラーゼ(0.018 U)、ウシ脾臓から得られたホスホジエステラーゼ(0.024
U)及びアルカリホスファターゼ(6 U)を含有するリン酸カリウム緩衝液(10 mM, p
H 7.0, 100μl)に、精製脱塩した5・4 (260 nmで0.25 OD)を溶解し、37℃で24時
間インキュベートした。アリコート(50μl)を逆相HPLCカラム(Hypersil-ODS, 5
μm、120オングストローム、250 x 4.6 mm, Bischoff, Leonberg, Germany)に入
れて、酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液(0.1 M, pH 7.0)中アセトニトリルの
直線勾配(30分で0-10.5%、1 ミリリットル/分)により生成物を溶出した。分解物
をRP-HPLCにより分析したところ、dC、dA、dG、T及びdAMeの他に、T及びdAMe間
に溶出する追加の化合物があることがわかった。この追加化合物を分離し、ESI-
MS (ナノエレクトロスプレーイオンソースと連動するLCQ、Finnigan MAT, Germa
ny)によりm/z 544.6で陽イオンとして検出した。実測質量は、プロトン化したN-
アデノシルアジリジン改変2'-デオキシアデノシンの理論分子質量と一致する。
【００４６】 3.2 C5-シトシンDNAメチルトランスフェラーゼM・Hhalを用いる酵素反応 前記のようにして補因子をもたないDNAメチルトランスフェラーゼM・Hhalを作
った(B. Holz, S. Klimasauskas, S. Serva, E. Weinhold, Nucleic Acids Res.
1998, 26, 1076-1083)。M・Hhal(5 nmol, 10μM)、二重オリゴデオキシヌクレ
オチド6・7 (5 nmol, 10μM)、化合物2(500 nmol, 1 mM)、トリス塩酸(10 mM, p
H 7.4)、塩化ナトリウム(50 mM)、EDTA(0.5 mM)及びトリトンX-100(0.01%)の混
合物(500μl)中25℃で酵素による触媒反応を行った。反応の進行は陰イオン交換
クロマトグラフィでモニターした。異なるインキュベーション時間毎に反応混合
物のアリコート(50μl)を抜き取り、陰イオン交換カラム(Poros 10 HQ, 10μm,
4.6 x 100 mm, PerSeptive Biosystems, Germany)に入れた。化合物は、トリス
塩酸緩衝液(20 mM, pH 7.6)中塩化カリウム水溶液で溶出した(5分間で0 M、その
後5分間で0.5 M、30分間で1 Mまでの直線勾配、4 ミリリットル/分)。異なるイ
ンキュベーション時間後の陰イオン交換クロマトグラフィのクロマトグラムを図
3に示す。
った(B. Holz, S. Klimasauskas, S. Serva, E. Weinhold, Nucleic Acids Res.
1998, 26, 1076-1083)。M・Hhal(5 nmol, 10μM)、二重オリゴデオキシヌクレ
オチド6・7 (5 nmol, 10μM)、化合物2(500 nmol, 1 mM)、トリス塩酸(10 mM, p
H 7.4)、塩化ナトリウム(50 mM)、EDTA(0.5 mM)及びトリトンX-100(0.01%)の混
合物(500μl)中25℃で酵素による触媒反応を行った。反応の進行は陰イオン交換
クロマトグラフィでモニターした。異なるインキュベーション時間毎に反応混合
物のアリコート(50μl)を抜き取り、陰イオン交換カラム(Poros 10 HQ, 10μm,
4.6 x 100 mm, PerSeptive Biosystems, Germany)に入れた。化合物は、トリス
塩酸緩衝液(20 mM, pH 7.6)中塩化カリウム水溶液で溶出した(5分間で0 M、その
後5分間で0.5 M、30分間で1 Mまでの直線勾配、4 ミリリットル/分)。異なるイ
ンキュベーション時間後の陰イオン交換クロマトグラフィのクロマトグラムを図
3に示す。
【００４７】 逆相HPLCと組み合わせたエレクトロスプレーイオン化質量分析による生成物二
重オリゴデオキシヌクレオチド8・7の分析：5・4の分析について前記したように
(実施例1、3.1参照)、RP-HPLC/ESI-MSを行った。得られたRP-HPLC/ESI質量スペ
クトルを図4に示し、オリゴデオキシヌクレオチドの実測分子量を表2にまとめて
示す。
重オリゴデオキシヌクレオチド8・7の分析：5・4の分析について前記したように
(実施例1、3.1参照)、RP-HPLC/ESI-MSを行った。得られたRP-HPLC/ESI質量スペ
クトルを図4に示し、オリゴデオキシヌクレオチドの実測分子量を表2にまとめて
示す。
【００４８】
【表２】 酵素断片化による生成物二重オリゴデオキシヌクレオチド8・7の分析：8・7の
酵素断片化は5・4について前記したように(実施例1、3.1参照)行った。分解物の
RP-HPLC分析を行ったところ、dC、dCMe、dA、dG、Tの他に、dCの前に溶出する追
加の化合物があることがわかった。
酵素断片化は5・4について前記したように(実施例1、3.1参照)行った。分解物の
RP-HPLC分析を行ったところ、dC、dCMe、dA、dG、Tの他に、dCの前に溶出する追
加の化合物があることがわかった。
【００４９】実施例2 1. 蛍光性N-アデノシルアジリジン誘導体、化合物9の合成(スキーム6) 1.1 8-アミノ[1"-(4"-アミノブチル)]-2',3'-O-イソプロピリデンアデノシン、
化合物10 アルゴン雰囲気下8-ブロモ-2',3'-O-イソプロピレンアデノシン(M. Ikehara,
H. Tada, M. Kaneko, Tetrahedron 1968, 24, 3489-3498) (628 ミリグラム、1.
6 ミリモル)の乾燥DMSO (10 ミリリットル)溶液に、乾燥トリエチルアミン(2.26
ミリリットル、16.3 ミリモル)及び1,4-ジアミノブタン(0.82 ミリリットル、8
.1 ミリモル)を加えた。溶液を110℃で撹拌した。反応の進行はTLCでモニターし
た。4時間後、溶媒を減圧留去した。残渣を水(50ミリリットル)に溶かし、酢酸(
0.1 M)でpHを5.3に調整した。粗生成物は陽イオン交換クロマトグラフィ(H+型Do
wex 50 x 4, 100 g、水600 ミリリットルで溶出した後1 M水酸化カリウム1000
ミリリットルで溶出）により精製した。生成物を含むフラクションをクロロホル
ムで抽出し、溶媒は減圧留去した。収率、639 ミリグラム(100%)。
化合物10 アルゴン雰囲気下8-ブロモ-2',3'-O-イソプロピレンアデノシン(M. Ikehara,
H. Tada, M. Kaneko, Tetrahedron 1968, 24, 3489-3498) (628 ミリグラム、1.
6 ミリモル)の乾燥DMSO (10 ミリリットル)溶液に、乾燥トリエチルアミン(2.26
ミリリットル、16.3 ミリモル)及び1,4-ジアミノブタン(0.82 ミリリットル、8
.1 ミリモル)を加えた。溶液を110℃で撹拌した。反応の進行はTLCでモニターし
た。4時間後、溶媒を減圧留去した。残渣を水(50ミリリットル)に溶かし、酢酸(
0.1 M)でpHを5.3に調整した。粗生成物は陽イオン交換クロマトグラフィ(H+型Do
wex 50 x 4, 100 g、水600 ミリリットルで溶出した後1 M水酸化カリウム1000
ミリリットルで溶出）により精製した。生成物を含むフラクションをクロロホル
ムで抽出し、溶媒は減圧留去した。収率、639 ミリグラム(100%)。
【００５０】 Rf = 0.44 (ブタノール/酢酸/水 3:0.75:1.25) ESI-MS: m/z (%): 394.3 (25)[M+H]+, 222.3 (100)[アデニン+アミノブチル+H]+
1.2 8-アミノ[1"-(N"-ダンシル)-4"-アミノブチル]-2',3'-O-イソプロピリデン
アデノシン、化合物11 アルゴン雰囲気下化合物10(104 ミリグラム、0.26 ミリモル)の乾燥ピリジン(
7 ミリリットル)溶液に、0℃でトリメチルクロロシラン(0.07 ミリリットル、0.
53 ミリモル)を徐々に加えた。得られた溶液を室温で1時間撹拌した。次に、ダ
ンシルクロリド(103.8 ミリグラム、0.37 ミリモル、3 ミリリットルピリジン中
)を加え、溶液を室温で4時間撹拌した。反応の進行はTLCでモニターした。転換
完了後、溶液は0℃において水(5 ミリリットル)で処理した。溶媒を減圧留去し
、粗生成物はカラムクロマトグラフィ(シリカゲル、40グラム、メチレンクロリ
ド/メタノール 19:1で溶出）により精製した。収率、50 ミリグラム(30%)。
1.2 8-アミノ[1"-(N"-ダンシル)-4"-アミノブチル]-2',3'-O-イソプロピリデン
アデノシン、化合物11 アルゴン雰囲気下化合物10(104 ミリグラム、0.26 ミリモル)の乾燥ピリジン(
7 ミリリットル)溶液に、0℃でトリメチルクロロシラン(0.07 ミリリットル、0.
53 ミリモル)を徐々に加えた。得られた溶液を室温で1時間撹拌した。次に、ダ
ンシルクロリド(103.8 ミリグラム、0.37 ミリモル、3 ミリリットルピリジン中
)を加え、溶液を室温で4時間撹拌した。反応の進行はTLCでモニターした。転換
完了後、溶液は0℃において水(5 ミリリットル)で処理した。溶媒を減圧留去し
、粗生成物はカラムクロマトグラフィ(シリカゲル、40グラム、メチレンクロリ
ド/メタノール 19:1で溶出）により精製した。収率、50 ミリグラム(30%)。
【００５１】 Rf = 0.54 (メチレンクロリド/メタノール 9:1) ESI-MS: m/z (%): 627.1 (100)[M+H]+, 455.2 (8)[アデニン+リンカー+ダンシル
+H]+ 1.3 8-アミノ[1"-(N"-ダンシル)-4"-アミノブチル]-2',3'-O-イソプロピリデン
-5'-O-メシルアデノシン、化合物12 アルゴン雰囲気下、化合物11(181 ミリグラム、0.32 ミリモル)及びジメチル
アミノピリジン(40ミリグラム、0.32ミリモル)の乾燥メチレンクロリド(20 ミリ
リットル)溶液に、乾燥トリエチルアミン(1.1 ミリリットル、8.0 ミリモル)を
加えた後、得られた溶液を0℃に冷却した。メシルクロリド(200μl、2.6ミリモ
ル)を加え、溶液を30分間撹拌した。冷飽和炭酸水素ナトリウム塩溶液(5ミリリ
ットル)で反応を停止した。溶液は3回冷クロロホルム(10 ミリリットル)で抽出
した。有機層を合わせ、溶媒は減圧留去した。粗生成物はカラムクロマトグラフ
ィ(シリカゲル、40グラム、メチレンクロリド/メタノール 97:3で溶出）により
精製した。収率、96 ミリグラム(43%)。
+H]+ 1.3 8-アミノ[1"-(N"-ダンシル)-4"-アミノブチル]-2',3'-O-イソプロピリデン
-5'-O-メシルアデノシン、化合物12 アルゴン雰囲気下、化合物11(181 ミリグラム、0.32 ミリモル)及びジメチル
アミノピリジン(40ミリグラム、0.32ミリモル)の乾燥メチレンクロリド(20 ミリ
リットル)溶液に、乾燥トリエチルアミン(1.1 ミリリットル、8.0 ミリモル)を
加えた後、得られた溶液を0℃に冷却した。メシルクロリド(200μl、2.6ミリモ
ル)を加え、溶液を30分間撹拌した。冷飽和炭酸水素ナトリウム塩溶液(5ミリリ
ットル)で反応を停止した。溶液は3回冷クロロホルム(10 ミリリットル)で抽出
した。有機層を合わせ、溶媒は減圧留去した。粗生成物はカラムクロマトグラフ
ィ(シリカゲル、40グラム、メチレンクロリド/メタノール 97:3で溶出）により
精製した。収率、96 ミリグラム(43%)。
【００５２】 Rf = 0.55 (メチレンクロリド/メタノール 9:1) ESI-MS: m/z (%): 705.3 (70)[M+H]+, 609.7 (100)[シクロヌクレオシド+H]+ 1.4 8-アミノ[1"-(N"-ダンシル)-4"-アミノブチル]-5'-O-メシルアデノシン、
化合物13 ギ酸水溶液(50%、10 ミリリットル)に、ヌクレオシド12(96.2ミリグラム、0.1
4ミリモル)を溶解し、得られた溶液を室温で4日間撹拌した。転換完了後、溶媒
を減圧留去した。残留溶媒は水及びメタノール(1：1、5ミリリットル)の混合物
で共沸させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィ(シリカゲル、15グラム、メ
チレンクロリド/メタノール 9:1で溶出）により精製した。収率、49.2 ミリグラ
ム(55%)。
化合物13 ギ酸水溶液(50%、10 ミリリットル)に、ヌクレオシド12(96.2ミリグラム、0.1
4ミリモル)を溶解し、得られた溶液を室温で4日間撹拌した。転換完了後、溶媒
を減圧留去した。残留溶媒は水及びメタノール(1：1、5ミリリットル)の混合物
で共沸させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィ(シリカゲル、15グラム、メ
チレンクロリド/メタノール 9:1で溶出）により精製した。収率、49.2 ミリグラ
ム(55%)。
【００５３】 Rf = 0.23 (メチレンクロリド/メタノール 9:1) 1.5 8-アミノ[1"-(N"-ダンシル)-4"-アミノブチル]-5'-(1-アジリジニル)-5'-
デオキシアデノシン、化合物9 アルゴン雰囲気下、乾燥アジリジン(S. Gabriel, Chem. Ber. 1888, 21, 2664
-2669; S. Gabriel, R. Stelzner, Chem. Ber. 1895, 28, 2929-2938)(1ミリモ
ル)及びN-エチルジイソプロピルアミン(350μl)にヌクレオシド13(20ミリグラム
、30μmol)を溶解し、室温で3日間撹拌した。反応は分析用逆相HPLC(Hypersil-O
DS, 5μm、120オングストローム、250 x 4.6 mm, Bischoff, Leonberg, Germany
)でモニターした。酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液(0.1 M, pH 7.0)中アセト
ニトリルの直線勾配(5分間は0%、その後30分間で35%、10分間で70%、1 ミリリッ
トル/分)により化合物を溶出した。反応完了後、溶媒を減圧留去した。粗生成物
をカラムクロマトグラフィ(シリカゲル、2グラム、メチレンクロリド/メタノー
ル9:1で溶出）により精製した。収率、6・7 ミリグラム(36%)。
デオキシアデノシン、化合物9 アルゴン雰囲気下、乾燥アジリジン(S. Gabriel, Chem. Ber. 1888, 21, 2664
-2669; S. Gabriel, R. Stelzner, Chem. Ber. 1895, 28, 2929-2938)(1ミリモ
ル)及びN-エチルジイソプロピルアミン(350μl)にヌクレオシド13(20ミリグラム
、30μmol)を溶解し、室温で3日間撹拌した。反応は分析用逆相HPLC(Hypersil-O
DS, 5μm、120オングストローム、250 x 4.6 mm, Bischoff, Leonberg, Germany
)でモニターした。酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液(0.1 M, pH 7.0)中アセト
ニトリルの直線勾配(5分間は0%、その後30分間で35%、10分間で70%、1 ミリリッ
トル/分)により化合物を溶出した。反応完了後、溶媒を減圧留去した。粗生成物
をカラムクロマトグラフィ(シリカゲル、2グラム、メチレンクロリド/メタノー
ル9:1で溶出）により精製した。収率、6・7 ミリグラム(36%)。
【００５４】 Rf = 0.23 (メチレンクロリド/メタノール 9:1) 2. N6-アデニンDNAメチルトランスフェラーゼM・Taqlによる酵素反応(スキーム
7) 補因子を含まないM・Taql(5 nmol, 10μM)、二重オリゴデオキシヌクレオチド
3・4 (5 nmol, 10μM)、化合物9(10 nmol, 20μM)、トリス酢酸(20 mM、pH 6.0)
、酢酸カリウム(50 mM)、酢酸マグネシウム(10 mM)及びトリトンX-100(0.01%)の
混合物(500μl)中37℃で酵素による触媒反応を行った。反応の進行は陰イオン交
換クロマトグラフィ(Poros 10 HQ, 10μm, 4.6 x 100 mm, PerSeptive Biosyste
ms, Germany)でモニターした。化合物は、トリス塩酸緩衝液(10 mM、pH 7.0)中
塩化カリウム水溶液で溶出した(5分間で0.2 M、その後5分間で0.5 M、30分間で1
Mまでの直線勾配)。保持時間7.9分をもつ新規生成物(DNA及びタンパク質含有)
へ完全に転換したのを観察したのは15時間後であった(M・Taqlなしで行った対応
対照実験では二重オリゴデオキシヌクレオチド3・4の転換は観察されなかった)
。得られたタンパク質-DNA複合体を断片化するため、反応溶液を水酸化カリウム
溶液(10 M)で処理し、pHを8.0に調整した。その後、プロテイナーゼK(31ミリグ
ラム/ミリリットル)、トリス塩酸(50 mM、pH 8.0)及び塩化カルシウム(1 mM)の
溶液(4μl)を加え、反応混合物を37℃で1時間インキュベートした。タンパク分
解断片化は前記したように陰イオン交換クロマトグラフィでモニターした。保持
時間7.9分を示す蛍光性種は消失し、保持時間29.2分をもつ新しい蛍光性化合物1
4・4が生成した(図5)。さらなるキャラクタリゼーションのため、化合物14・4を
逆相HPLCクロマトグラフィにより単離した(カラム：Hypersil-ODS, 5μm、120オ
ングストローム、250 x 4.6 mm, Bischoff, Leonberg, Germany；溶出：酢酸ト
リエチルアンモニウム緩衝液、5分間で0.1 M、pH 7.0、その後30分間で35%まで
の直線勾配、1 ミリリットル/分)。
7) 補因子を含まないM・Taql(5 nmol, 10μM)、二重オリゴデオキシヌクレオチド
3・4 (5 nmol, 10μM)、化合物9(10 nmol, 20μM)、トリス酢酸(20 mM、pH 6.0)
、酢酸カリウム(50 mM)、酢酸マグネシウム(10 mM)及びトリトンX-100(0.01%)の
混合物(500μl)中37℃で酵素による触媒反応を行った。反応の進行は陰イオン交
換クロマトグラフィ(Poros 10 HQ, 10μm, 4.6 x 100 mm, PerSeptive Biosyste
ms, Germany)でモニターした。化合物は、トリス塩酸緩衝液(10 mM、pH 7.0)中
塩化カリウム水溶液で溶出した(5分間で0.2 M、その後5分間で0.5 M、30分間で1
Mまでの直線勾配)。保持時間7.9分をもつ新規生成物(DNA及びタンパク質含有)
へ完全に転換したのを観察したのは15時間後であった(M・Taqlなしで行った対応
対照実験では二重オリゴデオキシヌクレオチド3・4の転換は観察されなかった)
。得られたタンパク質-DNA複合体を断片化するため、反応溶液を水酸化カリウム
溶液(10 M)で処理し、pHを8.0に調整した。その後、プロテイナーゼK(31ミリグ
ラム/ミリリットル)、トリス塩酸(50 mM、pH 8.0)及び塩化カルシウム(1 mM)の
溶液(4μl)を加え、反応混合物を37℃で1時間インキュベートした。タンパク分
解断片化は前記したように陰イオン交換クロマトグラフィでモニターした。保持
時間7.9分を示す蛍光性種は消失し、保持時間29.2分をもつ新しい蛍光性化合物1
4・4が生成した(図5)。さらなるキャラクタリゼーションのため、化合物14・4を
逆相HPLCクロマトグラフィにより単離した(カラム：Hypersil-ODS, 5μm、120オ
ングストローム、250 x 4.6 mm, Bischoff, Leonberg, Germany；溶出：酢酸ト
リエチルアンモニウム緩衝液、5分間で0.1 M、pH 7.0、その後30分間で35%まで
の直線勾配、1 ミリリットル/分)。
【００５５】 酵素断片化による生成物二重オリゴデオキシヌクレオチド14・4の分析：塩化
マグネシウム(10 mM)、DNase I (2.7 U)、Crotalus durissusから得られたホス
ホジエステラーゼ(0.041 U)、ウシ脾臓から得られたホスホジエステラーゼ(0.05
5 U)及びアルカリホスファターゼ(13.7 U)を含有するリン酸カリウム緩衝液(10
mM, pH 7.0, 228μl)に、精製した14・4 (260 nmで0.57 OD)を溶解し、37℃で20
時間インキュベートした。アリコート(100μl)を逆相HPLCカラム(Hypersil-ODS,
5μm、120オングストローム、250 x 4.6 mm, Bischoff, Leonberg, Germany)に
入れて、酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液(0.1 M、pH 7.0)中アセトニトリル
の直線勾配(30分間で0-10.5%、その後10分間で10.5-28%、15分間で28-70%、1 ミ
リリットル/分)により複数の生成物を溶出した。デオキシヌクレオチドdC、dA、
dG、T及びdAMeの他に、49分後に溶出する新しい蛍光化合物があることがわかっ
た。この新化合物は、単離してESI-MS (ナノエレクトロスプレーイオンソースと
連動するLCQ、Finnigan MAT, Germany)を行い、m/z 863.1における陽電荷として
検出した。実測質量は、プロトン化した9改変2'-デオキシアデノシンの理論分子
質量(863・4)とよく一致する。
マグネシウム(10 mM)、DNase I (2.7 U)、Crotalus durissusから得られたホス
ホジエステラーゼ(0.041 U)、ウシ脾臓から得られたホスホジエステラーゼ(0.05
5 U)及びアルカリホスファターゼ(13.7 U)を含有するリン酸カリウム緩衝液(10
mM, pH 7.0, 228μl)に、精製した14・4 (260 nmで0.57 OD)を溶解し、37℃で20
時間インキュベートした。アリコート(100μl)を逆相HPLCカラム(Hypersil-ODS,
5μm、120オングストローム、250 x 4.6 mm, Bischoff, Leonberg, Germany)に
入れて、酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液(0.1 M、pH 7.0)中アセトニトリル
の直線勾配(30分間で0-10.5%、その後10分間で10.5-28%、15分間で28-70%、1 ミ
リリットル/分)により複数の生成物を溶出した。デオキシヌクレオチドdC、dA、
dG、T及びdAMeの他に、49分後に溶出する新しい蛍光化合物があることがわかっ
た。この新化合物は、単離してESI-MS (ナノエレクトロスプレーイオンソースと
連動するLCQ、Finnigan MAT, Germany)を行い、m/z 863.1における陽電荷として
検出した。実測質量は、プロトン化した9改変2'-デオキシアデノシンの理論分子
質量(863・4)とよく一致する。
【００５６】3. 蛍光標識 3.1 N6-アデニンDNAメチルトランスフェラーゼM・Taqlを用いるプラスミドDNA
の蛍光標識 補因子を含まないM・Taql(133 nM)、pUC19 DNA(28 nM、M・Taqlを認識する4個
の認識部位)、化合物9 (20 μM)、トリス酢酸(20 mM, pH 6.0)、酢酸カリウム(5
0 mM)、酢酸マグネシウム(10 mM)及びトリトンX-100(0.01%)の混合物(500μl)中
65℃で酵素による触媒反応を行った。反応の進行は陰イオン交換クロマトグラフ
ィ(NUCLEOGEN DEAE 4000-7、7μm、125 x 6.2 mm、Machery-Nagel, Duren, Germ
any)でモニターした。化合物は、アセトニトリル(20%)含有トリス塩酸緩衝液(10
mM, pH 7.0)中塩化カリウム水溶液(5分間で0.2 M、その後30分間で1 Mまでの直
線勾配)で溶出した。異なるインキュベーション時間後の陰イオン交換クロマト
グラフィのクロマトグラムを図6に示す(図中A：260 nmにおけるUV検出；B：蛍光
検出)。実測UV吸収と蛍光間の遅れはUV検出器と蛍光検出器間が空間的に離れて
いるためである。蛍光pUC19を得る標識反応は8時間後に完了した。M・Taqlなし
で行った対応対照実験では蛍光標識pUC19は観察されなかった(図7A及び7B)。
の蛍光標識 補因子を含まないM・Taql(133 nM)、pUC19 DNA(28 nM、M・Taqlを認識する4個
の認識部位)、化合物9 (20 μM)、トリス酢酸(20 mM, pH 6.0)、酢酸カリウム(5
0 mM)、酢酸マグネシウム(10 mM)及びトリトンX-100(0.01%)の混合物(500μl)中
65℃で酵素による触媒反応を行った。反応の進行は陰イオン交換クロマトグラフ
ィ(NUCLEOGEN DEAE 4000-7、7μm、125 x 6.2 mm、Machery-Nagel, Duren, Germ
any)でモニターした。化合物は、アセトニトリル(20%)含有トリス塩酸緩衝液(10
mM, pH 7.0)中塩化カリウム水溶液(5分間で0.2 M、その後30分間で1 Mまでの直
線勾配)で溶出した。異なるインキュベーション時間後の陰イオン交換クロマト
グラフィのクロマトグラムを図6に示す(図中A：260 nmにおけるUV検出；B：蛍光
検出)。実測UV吸収と蛍光間の遅れはUV検出器と蛍光検出器間が空間的に離れて
いるためである。蛍光pUC19を得る標識反応は8時間後に完了した。M・Taqlなし
で行った対応対照実験では蛍光標識pUC19は観察されなかった(図7A及び7B)。
【００５７】3.2 C5-シトシンDNAメチルトランスフェラーゼM・Hhalを用いるプラスミドDNA
の蛍光標識 M・Hhal(730 nM)、pUC19 DNA(40 nM、M・Hhalを認識する17個の認識部位)、化
合物9 (20 μM)、トリス塩酸(10 mM, pH 6.85)、塩化ナトリウム(50 mM)、EDTA(
0.5 mM)及びβ-メルカプトエタノール(2 mM)の混合物中37℃で酵素による触媒反
応を行った。M・Hhalを含まない対応対照実験も行った。反応20時間後両インキ
ュベーションのアリコートは、前記のようにして(実施例2、3.1参照)陰イオン交
換クロマトグラフィにより分析した。得られたクロマトグラムを図8に示す(図中
A：260 nmにおけるUV検出；B：蛍光検出)。M・Hhalの不存在下では蛍光標識は観
察されなかった。
の蛍光標識 M・Hhal(730 nM)、pUC19 DNA(40 nM、M・Hhalを認識する17個の認識部位)、化
合物9 (20 μM)、トリス塩酸(10 mM, pH 6.85)、塩化ナトリウム(50 mM)、EDTA(
0.5 mM)及びβ-メルカプトエタノール(2 mM)の混合物中37℃で酵素による触媒反
応を行った。M・Hhalを含まない対応対照実験も行った。反応20時間後両インキ
ュベーションのアリコートは、前記のようにして(実施例2、3.1参照)陰イオン交
換クロマトグラフィにより分析した。得られたクロマトグラムを図8に示す(図中
A：260 nmにおけるUV検出；B：蛍光検出)。M・Hhalの不存在下では蛍光標識は観
察されなかった。
【図１】 図１は、実施例１のM・Taqlを用いた、さまざまなインキュベーション時間後
の酵素反応の陰イオン交換クロマトグラフィーを示す。
の酵素反応の陰イオン交換クロマトグラフィーを示す。
【図２】 図2Aは、14.6分後に溶出した実施例１の生成物の二重オリゴデオキシヌクレオ
チド5・4のRP-HPLC/ESI質量スペクトルを示す。 図2Bは、直接注入によって得られた実施例１の生成物5・4のESI質量スペクト
ルを示す。
チド5・4のRP-HPLC/ESI質量スペクトルを示す。 図2Bは、直接注入によって得られた実施例１の生成物5・4のESI質量スペクト
ルを示す。
【図３】 図３は、実施例１のM・Hhalを用いた、さまざまなインキュベーション時間後
の酵素反応の陰イオン交換クロマトグラフィーを示す。
の酵素反応の陰イオン交換クロマトグラフィーを示す。
【図４】 図４は、実施例１の生成物の二重オリゴデオキシヌクレオチド8・7のRP-HPLC/
ESI質量スペクトルを示す。
ESI質量スペクトルを示す。
【図５】 図５は、実施例２のM・Taqlを用いた酵素反応の陰イオン交換クロマトグラフ
ィー（UVおよび蛍光検出）を示す。
ィー（UVおよび蛍光検出）を示す。
【図６】 図６は、さまざまなインキュベーション時間後の標識化されたプラスミドDNA
（実施例２、M・Taqlを用いて3.1標識化）の陰イオン交換クロマトグラフィーに
よるクロマトグラムを示す（6A：260nmでUV検出；6B：蛍光検出）。
（実施例２、M・Taqlを用いて3.1標識化）の陰イオン交換クロマトグラフィーに
よるクロマトグラムを示す（6A：260nmでUV検出；6B：蛍光検出）。
【図７】 図７は、比較の目的で、標識化されていないpUC19（実施例２、M・Taqlを用い
ずに3.1標識化）について得られたクロマトグラム（7A：260nmでUV検出；7B：蛍
光検出）を示す。
ずに3.1標識化）について得られたクロマトグラム（7A：260nmでUV検出；7B：蛍
光検出）を示す。
【図８】 図８は、標識化されたおよび標識化されていないpUC19（実施例２、M・Hhalを
用いて、および用いずに3.2標識化）のクロマトグラム（8A：260nmでUV検出；8B
：蛍光検出）を示す。
用いて、および用いずに3.2標識化）のクロマトグラム（8A：260nmでUV検出；8B
：蛍光検出）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 19/34 Ｃ１２Ｐ 19/34 Ａ Ｆターム(参考） 4B050 CC07 DD02 GG02 LL03 4B064 AF27 CA21 CB30 CD13 DA13 4C057 AA18 CC03 DD03 LL29 4C086 AA01 AA02 AA03 EA18 MA01 MA02 MA04 NA14 ZC02 4H045 AA50 BA54 EA50 FA70
Claims (30)
- 【請求項１】 一般式(I)： 【化１】 （式中、 XはNまたはCH、YはNまたは-CR3、R1およびR3はそれぞれ独立して、H、 3 H、-NH(CH2)nNHR4または-NH(C2H5O)nC2H5NHR4であって、R4が、フルオロフォア
、アフィニティータグ、架橋剤、発色団、タンパク質、ペプチド、必要に応じて
修飾されていてもよいアミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸、炭水化物
、脂質、PEG、トランスフェクション試薬、ビーズおよびインターカレート剤か
ら選択され、nは1〜5000までの整数であり、R2は、H、3H、-N(CH2)nNHR4、-NH(C 2 H5O)nC2H5NHR4から選択され、R4およびnは上で定義したとおりであるもの、-CH 2 CH(COOH)(NH2)または電子吸引基である。）で表されるアジリジン誘導体。 - 【請求項２】 XおよびYがともにNである、請求項１記載のアジリジン誘導
体。 - 【請求項３】 R1、R2およびR3のうち１つのみが-NH(CH2)nNHR4または-NH(C 2 H5O)nC2H5NHR4であって、それ以外はHである、請求項１記載のアジリジン誘導
体。 - 【請求項４】 前記フルオロフォアが、BODIPY、クマリン、ダンシル、フル
オレセイン、マンシル、ピレン、ローダミン、テキサスレッド、TNS、シアニン
フルオロフォアCy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5およびCy7、並びにそれらの誘導体
より選択される、請求項１記載のアジリジン誘導体。 - 【請求項５】 前記アフィニティータグが、ペプチドタグ、ビオチン、ジゴ
キシゲニンまたはジニトロフェノールである、請求項１記載のアジリジン誘導体
。 - 【請求項６】 前記ペプチドタグが、his-タグまたはIMACに用いることがで
きる金属キレート能を有する任意のタグ、連鎖球菌タグ(strep-tag)、フラッグ
タグ、c-myc-タグ、エピトープまたはグルタチオンである、請求項５記載のアジ
リジン誘導体。 - 【請求項７】 前記架橋剤が、マレイミド、ヨードアセトアミド、それらの
誘導体若しくはアルデヒド誘導体、または光架橋剤である、請求項１記載のアジ
リジン誘導体。 - 【請求項８】 前記光架橋剤が、アリールアジド、ジアゾ化合物またはベン
ゾフェノン化合物である、請求項７記載のアジリジン誘導体。 - 【請求項９】 請求項１から８のいずれか１項記載の化合物と、補因子とし
てS-アデノイル(adenoyl)-L-メチオニン(SAM)を通常用いるメチルトランスフェ
ラーゼの複合体。 - 【請求項１０】 前記メチルトランスフェラーゼが、普通はSAMのメチル基
を、核酸分子、ポリペプチド、タンパク質、酵素または小分子上に転移させる、
請求項９記載の複合体。 - 【請求項１１】 前記メチルトランスフェラーゼがDNAをメチル化する、請
求項１０記載の複合体。 - 【請求項１２】 前記メチルトランスフェラーゼが細菌の制限修飾システム
の一部である、請求項１１記載の複合体。 - 【請求項１３】 前記メチルトランスフェラーゼが、タンパク質を識別可能
な(distinct)アミノ酸においてメチル化する、請求項１０記載の複合体。 - 【請求項１４】 前記メチルトランスフェラーゼが、DNAメチルトランスフ
ェラーゼM・TaqlおよびM・Hhalから選択される、請求項１２記載の複合体。 - 【請求項１５】 請求項１から８のいずれか１項記載の化合物を含むキット
。 - 【請求項１６】 請求項９から１４のいずれか１項に定義したメチルトラン
スフェラーゼをさらに含む、請求項15記載のキット。 - 【請求項１７】 請求項９から１４のいずれか１項記載の複合体を含むキッ
ト。 - 【請求項１８】 請求項1から８のいずれか１項記載の化合物または請求項
９から１４のいずれか１項記載の複合体、および必要に応じて薬学的に許容され
る担体を含む医薬組成物。 - 【請求項１９】 請求項1から８のいずれか１項記載の化合物または請求項
９から１４のいずれか１項記載の複合体を含む診断用組成物。 - 【請求項２０】 請求項1から８のいずれか１項記載の化合物の標的分子の
修飾のための使用。 - 【請求項２１】 標的分子の修飾が、請求項1から8のいずれか１項記載の化
合物を、前記化合物または前記化合物の一部を標的分子上に転移させるメチルト
ランスフェラーゼの補因子として用いることによって達成される、請求項２０記
載の使用。 - 【請求項２２】 標的分子が核酸分子、ポリペプチド、合成ポリマーまたは
小分子である、請求項２０または２１記載の使用。 - 【請求項２３】 核酸分子がDNA若しくはRNAまたはそれらのハイブリッドで
ある、請求項２２記載の使用。 - 【請求項２４】 小分子が脂質である、請求項２２記載の使用。
- 【請求項２５】 ポリペプチドが、メチル化部位を含むタンパク質または融
合タンパク質である、請求項２２記載の使用。 - 【請求項２６】 メチルトランスフェラーゼが請求項９から１４のいずれか
１項に定義されたメチルトランスフェラーゼである、請求項２１から２５のいず
れか１項記載の使用。 - 【請求項２７】 標的分子を、請求項１から８のいずれか１項記載の化合物
と共に、該化合物を補因子として用いることができるメチルトランスフェラーゼ
の存在下、および該化合物またはその一部を標的分子上に転移させることができ
る条件下でインキュベーションすることを含む、修飾された標的分子の製造方法
。 - 【請求項２８】 メチルトランスフェラーゼが請求項９から１４のいずれか
１項に定義されたメチルトランスフェラーゼである、請求項２７記載の方法。 - 【請求項２９】 標的分子が請求項２２から２５のいずれか１項に定義され
たものである、請求項２７または２８記載の方法。 - 【請求項３０】 請求項２７から２９のいずれか１項記載の方法によって得
ることができる修飾された標的分子。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP98114201 | 1998-07-29 | ||
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