DE60126762T2 - Kombinatorische Herstellung von Nukleotid- und Nukleosid- (XITP) Analogen - Google Patents

Kombinatorische Herstellung von Nukleotid- und Nukleosid- (XITP) Analogen Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Nukleotid-Analoga mit einer reaktiven Hydrazidfunktion (Formel II), die als Ausgangssynthone für die Herstellung von Verbindungen (Formel I) dienen, die Mutationen induzieren können oder fähig sind, eine DNA-Polymerase oder eine Kinase zu inhibieren. Ferner bezieht sich die Erfindung auf Nukleinsäuren, die diese Nukleosid- und Nukleotid-Analoga aufweisen.
  • Die derzeit verfügbaren nukleotidischen Inhibitoren (Aciclovir, Ganciclovir, AZT, ddC, d4T, 3TC) weisen bei Langzeitbehandlung und wiederholter Verabreichung unerwünschte Nebenwirkungen auf. Einerseits ist die intrinsische Toxizität dieser Nukleotid-Analoga insbesondere dadurch bedingt, dass sie im Vergleich zu einer Polymerase oder einer bestimmten reversen Transkriptase eine geringe Spezifität aufweisen können. Andererseits werden die Viren nach einer gewissen Zeit gegenüber diesen Inhibitoren resistent, selbst wenn man die Dosen erhöht.
  • Anderen Nukleotid-Analoga wird in der Literatur eine antivirale Wirkung (Witkowski, J. T. et al., 1972, J. Med. Chem., 15(11): 1150–1154) oder eine antitumorale Wirkung (Nedorezova, T. P. et al., 1986, Khim-Farm. Zh. 20(11): 1299–1302) nachgesagt. Es wurden verschiedene Wege der Synthese von Nukleotid-Analoga beschrieben (Garcia Lopez, M. T. et al., 1982, J. Heterocyclic. Chem., 19: 233–235), (Shingarova, I. D. et al., 1987, Khim, Geterotsikl. Soedin. (2): 231–235), (Shingarova, I. D. et al., 1987, Khim. Geterotsikh Soedin. (7): 937–940). Die zuletzt genannten erlauben jedoch nicht, eine große Vielfalt von Verbindungen zu erzeugen, welche die Inhibition von Polymerasen oder Kinasen induzieren können.
  • Die Synthese von neuen Nukleotid-Inhibitoren stellt eine große Herausforderung dar, um die Behandlungsmethoden von Virusinfektionen wie zum Beispiel HIV, CMV und HSV zu erneuern. Hutchinson, 1990 zeigt, dass die Synthese von umfangreichen Sammlungen modifizierter Nukleotide mit zahlreichen Schwierigkeiten verbunden ist. So erscheint es zum Beispiel erforderlich, die reaktiven Funktionen der Basen oder der Ribosen bei jeder Hinzufügung bzw. Modifikation von Gruppen zu schützen.
  • Die Erfindung erlaubt es, diese Schwierigkeiten dank eines Basissynthons zu beseitigen, mit dessen Hilfe man in einem einzigen Schritt eine Bibliothek von Nukleotid- oder Nukleosidanaloga erhält. Dank dieser Bibliotheken kann man zum Beispiel Inhibitoren mit hoher Spezifität der reversen Transkriptase des HIV aussieben.
  • Ebenso notwendig für die Perfektionierung der Mutageneseverfahren ist die Herstellung von neuen Nukleotiden mit mehrdeutigen Paarungen, das heißt, die fähig sind, sich als passendes Gegenüber zu mehr als einer der vier Basen A, C, G, T im Matrizenstrang in den Primerstrang einzufügen (Sala et al., 1996; Zaccolo et al., 1996; Pochet et al., 1997). Der ultimative mutagene Wirkstoff bestände aus einem Monomer der DNA, das sich im Stadium des Einbaus als Triphosphat und dann bei seiner Kopie als Matrize mit den vier kanonischen Basen paaren könnte. Das Desoxynukleosid-Triphosphat einer solchen mehrdeutigen Base würde erlauben, bei der Replikation durch eine DNA-Polymerase eine beliebige kanonische Base durch irgendeine der drei anderen Basen zu substituieren. Außerdem würde ein Hypermutageneseverfahren in vivo mittels des Einbaus der mehrdeutigen Base die Protokolle der Evolution, die von den Genen gesteuert wird, die von den Plasmiden getragen werden, vereinfachen und beschleunigen, ohne dabei auf die kostspieligen Manipulationen der fehlerhaften Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zurückgreifen zu müssen. Eine Zusammenfassung, welche die Verwendung von mehrdeutigen Basen in anderen Anwendungen rechtfertigt, ist in den Referenzen Bergstrom et al., 1995; Loakes et al., 1995; Hill et al., 1998 zu finden.
  • Außerdem ermöglicht die Entdeckung von chemischen Strukturen, die zwar vereinfacht sind, jedoch genauso wie jede der vier Basen der DNA zur eindeutigen Paarung fähig sind, mit anderen Worten Substitute von A, C, G, T, die Herstellung von neuen Sonden oder Nukleinprimer, die in verschiedenen Techniken zur Amplifikation und zur Detektion von Zielnukleinsäuren verwendet werden können.
  • Außerdem ist es möglich, dem Ausgangssynthon der Formel II (siehe unten) reaktive Moleküle, zum Beispiel aus der Familie der Aminosäuren, hinzuzufügen, und somit die DNA zu funktionalisieren.
  • In Pochet et al., 1998, wurden Desoxynukleoside beschrieben, die in einem einfachen Imidazolkern, der an den Positionen 4 und 5 unterschiedlich substituiert ist, ein vereinfachtes Purin trägt. Diese Nukleoside sind intrinsisch fähig, durch Rotation um die glykosidische Verbindung (syn- und anti-Konformation) und die Carboxamid-Verbindung („A-like" und „G-like") Wasserstoffbindungen mit den vier kanonischen Basen zu bilden (Pochet et al., 1995; Pochet et al., 1998). Der Einbau dieser Nukleoside durch die DNA-Polymerasen (LeBec et al., 1997) und die mutagenen Wirkungen ihrer Paarungen sind in Sala et al., 1996; Pochet et al., 1997 beschrieben.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können dem im Folgenden mit X0 bezeichnetem Monomer der vereinfachten DNA mittels einer Carbohydrazid-Gruppe laterale variable Gruppierungen hinzugefügt werden. Dieses Ausgangssynthon erlaubt es, in einem Schritt mehrere Substrate der DNA-Polymerasen herzustellen. Die Carbohydrazid-Gruppe stellt eine sehr reaktive Funktion dar, die fähig ist, mit jedem Aldehyd oder Keton zu kondensieren. Genau so viele Hydrazon-Derivate, nachstehend X1 genannt, können also aus X0 gebildet werden. Genau so viele Hydrazin-Derivate, nachstehend X2 genannt, können durch Reduktion von X1 gewonnen werden.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich also auf Verbindungen der allgemeinen Formel I:
    Figure 00040001
    wobei
    • – die Gruppe R1 für ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe steht, die aus den Gruppen Phosphat, Diphosphat oder Triphosphat und aus den Schutzgruppen wie DMT ausgewählt ist.
    • – R2 und R2' unabhängig voneinander aus H, OH, Phosphoramidit und dessen Derivaten, H-Phosphonat, und einem Elongationsterminator T ausgewählt sind,
    • – R3 aus H, OH, den Halogenen (F, Br, Cl, I), einer linearen oder verzweigten Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und einer Gruppe O-R5 ausgewählt ist, wobei R5 für eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen steht,
    • – R3' aus OH, den Halogenen (F, Br, Cl, I), einer linearen oder verzweigten Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und einer Gruppe O-R5 ausgewählt ist, wobei R5 für eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen steht,
    • – R4 für einen Heterozyklus steht, der mit einer Gruppe der folgenden Formel substituiert ist:
      Figure 00040002
      wobei die Gruppe an den Heterozyklus gebunden ist, entweder direkt oder über einen Abstandhalter E, der aus einer gesättigten oder ungesättigten Kohlenstoffkette von 1 bis 20 Atomen aufgebaut ist, die Heteroatome und/oder R4 enthält oder nicht enthält, wobei der genannte Heterozyklus ausgewählt ist aus:
    • a) substituierten Heterozyklen mit 5 Atomen der Formel:
      Figure 00050001
      in der E ein Abstandhalter wie vorstehend definiert ist oder E nicht existiert, in der X unabhängig voneinander steht für
    • – eine Gruppe CH,
    • – eine Gruppe C-R6, wobei R6 aus den Halogenen (F, Br, Cl, I), einer linearen oder verzweigten Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist,
    • – eine Gruppe O-R7 oder S-R7, wobei R7 für ein Wasserstoffatom oder eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen steht, oder
    • – N, wobei dann die Heterozyklen aus den folgenden ausgewählt sind:
      Figure 00050002
      wobei R4 bevorzugt
      Figure 00060001
      sind
    • b) Zyklen mit 6 Atomen, insbesondere Pyrimidinen der Formel:
      Figure 00060002
      in der E ein Abstandhalter wie vorstehend definiert ist oder E nicht existiert,
    • c) Purinanaloga der Formel:
      Figure 00060003
      worin:
    • – E ein Abstandhalter wie vorstehend definiert ist oder nicht existiert, Y1 für NH2 (bezeichnet mit Synthon X0) oder eine Gruppe steht:
      Figure 00060004
    • – Y2 und Y3 unabhängig voneinander aus H, OH, O, NH2, den Halogenen (F, Br, Cl, I), SCH3, SH, einer über das Stickstoffatom gebundenen Amidfunktion, oder einer linearen oder verzweigten Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ausgewählt sind, Z1 und Z2 unabhängig voneinander aus H und einer organischen Gruppe ausgewählt sind.
  • Was die Begriffe "Purine" und "Pyrimidine" anbelangt, so sei auf die Definition im Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford Press, 1997 verwiesen. Auf den Seiten 546 und 547 dieses Schriftstücks sind Beispiele für Wege der Synthese dieser Verbindungen beschrieben.
  • Was die Verbindungen B anbelangt, gilt das in 2 dargestellte Synthesebeispiel für die Nukleoside in der Ribo- und Dexoxy-Reihe und für phosphorylierte Derivate. Wenn X CONHNH2 ist, erhält man ein erfindungsgemäßes Synthon X0 mit einem Abstandhalter CH=CHCONH(CH2)n, mit n = 6 in diesem Beispiel.
  • Unter den Synthonen X0, X1 und X2 betrifft die Erfindung insbesondere Nukleosidanaloga und Nukleotidtriphosphat-Analoga, die mit X0TP, X1TP und X2TP bezeichnet werden. Die erfindungsgemäßen Nukleotidanaloga werden vorzugsweise verwendet, wenn das Ziel ihren Einbau in eine Nukleinsäure voraussetzt. Ein erfindungsgemäßes Nukleosidanalogon wird man vorzugsweise verwenden, um eine Polymerase in situ in einer Zelle zu inhibieren, insbesondere für die Herstellung eines Medikaments.
  • In den Verbindungen der Formel I steht die Gruppe R1 vorzugsweise für eine Triphosphatgruppe oder für ein Wasserstoffatom, je nach dem oben genannten Ziel.
  • Ebenso kann gemäß dem angestrebten Ziel zumindest eine der Gruppen R2 und R2' für eine Gruppe OH stehen, was erlaubt, die Elongation mittels einer Polymerase zu verfolgen, oder, in dem Falle, wo man Inhibitoren der Polymerasen erhalten möchte, für eine Terminatorgruppe T stehen. Zumindest eine der Gruppen R2 und R2' kann also für die Gruppe T, die vorzugsweise aus F, Br, Cl, I, N3 ausgewählt ist, und für eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen stehen. Selbstverständlich ist jegliche äquivalente Gruppe, die als Elongationsterminator fungiert, für die Herstellung von Verbindungen, welche die reversen Transkriptasen des Retrovirus inhibieren, bestimmt.
  • Wenn Y1 NH2 ist, hat die Erfindung vorteilhafterweise Ausgangssynthone der allgemeinen Formel II zum Ziel (Synthon X0):
    Figure 00080001
    in der R1, R2, R2', R3, R3' und E den Gruppen der Formel I entsprechen.
  • Unter solchen Verbindungen betrifft die Erfindung insbesondere die sogenannte Verbindung dX0TP, in der R1 eine Triphosphatgruppe ist und R3 und R3' für H stehen.
  • Die vorstehend explizierten Verbindungen der Formel II können als Ausgangssynthon für die Herstellung einer Bibliothek von Nukleotid- und/oder Nukleosidanaloga verwendet werden. Ihre Carbohydrazidgruppe erlaubt nämlich, diese Verbindungen in einem einzigen Schritt mit jeglichem Molekül, das eine Aldehyd- oder Ketonfunktion aufweist, zu konjugieren, was nach der Kondensation die Synthone X1 und nach der Reduktion die Synthone X2 ergibt.
  • Durch Kondensation der Verbindungen der Formel II (Synthone X0 und X0TP) mit jeglichem Molekül, das eine Aldehyd- oder Ketonfunktion aufweist, erhält man eine Verbindung der Formel I, in der die Gruppe Y1 für die folgende allgemeine Formel steht:
    Figure 00090001
    wobei Z1 und Z2 unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom oder eine organische Gruppe stehen. Diese Verbindungen werden mit X1TP (Nukleotidtriphosphat-Analoga) oder X1 (Nukleosidanaloga) bezeichnet.
  • Man kann solche Verbindungen reduzieren und Verbindungen der Formel I erhalten (Synthone X2 und X2TP), in der die Gruppe Y1 für die folgende allgemeine Formel steht:
    Figure 00090002
  • Man kann zum Beispiel die Verbindungen anführen, in denen mindestens eine der Gruppen Z1 und Z2 aus den aromatischen Gruppen ausgewählt ist, insbesondere aus Gruppen der Formel:
    Figure 00090003
  • Mindestens eine der Gruppen Z1 und Z2 kann auch aus den Gruppen Thiol, Alkyl, Carbonyl, Amin, Alkohol, Aryl und Aminosäure ausgewählt sein.
  • In einem anderen Aspekt können die Verbindungen der Erfindung dadurch gekennzeichnet sein, dass Z1 oder Z2 mit Y3 einen Ring bildet.
  • In einer besonderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die vorstehend genannten Verbindungen, in denen Z1 oder Z2 einen fluoreszierenden oder phosphoreszierenden Marker umfasst, insbesondere Fluorescamin oder Fluorescein. Man kann zum Beispiel Fluorescamin reagieren lassen, um die Verbindung zu markieren oder ihr Vorhandensein in einer Nukleinsäure nachzuweisen.
  • Man kann also Verbindungen mit einem Abstandhalter und einem Marker herstellen, zum Beispiel eine Verbindung der Formel:
    Figure 00100001
  • Vorteilhafterweise sind die vorstehend genannten Verbindungen Substrate einer Polymerase und können mit den natürlichen Basen Paarungen bilden, einer reversen Transkriptase und/oder einer Nukleotidkinase.
  • Außerdem können diese Verbindungen Mutationen in eine Nukleinsäure einführen oder die DNA- oder RNA-Synthese hemmen, insbesondere mittels DNA-Polymerasen, reversen Transkriptasen des Retrovirus und Kinasen. Mit Kinasen ist jede Kinase gemeint, die fähig ist, die Mono- oder Diphosphatnukleotide in vivo oder in vitro zu phosphorylieren. Insbesondere kann man die Desoxycytidinkinasen anführen, speziell die in US 5,914,258 beschriebene humane DCK2, die Desoxyguanosinkinasen und die Thymidinkinasen.
  • Man kann also eine erfindungsgemäße Verbindung, in der Y1 NH2 ist, als Ausgangssynthon für die Herstellung von Bibliotheken von Nukleotid- und/oder Nukleosidanaloga verwenden und unter diesen Analoga jene identifizieren, die Mutationen induzieren und/oder die DNA- oder RNA-Synthese hemmen können.
  • Ferner bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von vorstehend beschriebenen Verbindungen der allgemeinen Formel II, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:
    • a) Herstellung eines Nukleosids, das als Heterozyklus einen Imidazolheterozyklus der folgenden Formel enthält:
      Figure 00110001
      worin X unabhängig voneinander eine Gruppe CH, C-R6, oder N darstellt, wobei R6 aus den Halogenen (F, Br, Cl, I) ausgewählt ist, eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und eine Gruppe O-R7 oder S-R7, wobei R7 für ein Wasserstoffatom oder eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen steht,
    • b) Schutz des 5' Alkohols und Umwandlung der Ethylesterfunktion in eine Carbohydrazidfunktion unter Einwirkung von Hydrazin,
    • c) Schutz der Aminfunktion der Carbohydrazidgruppe mit einer Schutzgruppe wie zum Beispiel die Benzyloxycarbonylgruppe, Acetylierung des 3' Alkohols,
    • d) Phosphorylierung nach Entschützung des 5' Alkohols,
    • e) und Hydrogenolyse der Benzyloxycarbonylgruppe.
  • Schritt a) wird im Fall von Desoxyribose vorzugsweise mittels einer trans-N-Desoxyribosylase ausgeführt, und Schritt d) besteht aus der Phosphorylierung des Nukleosids mittels Cyanoethylphosphats in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid; gleichzeitige Freisetzung des 3' Alkohols und der Cyanoethylgruppe des 5' Phosphats in basischem Milieu; anschließende Kondensation des Pyrophosphats mit aktiviertem 5' Phosphat, das als Morpholidat vorliegt.
  • Aus den Verbindungen der allgemeinen Formeln II kann man durch Kondensation einer Verbindung der allgemeinen Formel II mit einem Aldehyd oder einem Keton, möglicherweise gefolgt von einer Reduktion, eine Verbindung der vorstehend beschriebenen allgemeinen Formel I herstellen. Es ist möglich, eine oder mehrere Verbindung(en) der allgemeinen Formel II mit einer Bibliothek von Aldehyden und/oder Ketonen reagieren zu lassen, möglicherweise gefolgt von einer Reduktion, so dass man eine Bibliothek von Verbindungen der Formel I erhält.
  • Der in 1 beschriebene Weg der Synthese zeigt eine besondere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Der Ethylester der Imidazol-4-Carbonsäure wurde unter Einwirkung der trans-N-Desoxyribosylase, die ohne Reinigung in Form eines Proteinextrakts aus Lactobacillus leichmannii verwendet wurde, in sein Desoxynukleosid umgewandelt, wobei man Thymidin als Quelle von Desoxyribose nahm. Nach dem Schutz des 5' Alkohols durch eine Dimethoxytritylgruppe wurde das Nukleosid seinerseits, das die Ethylesterfunktion trug, unter Einwirkung von Hydrazin in sein Carbohydrazidderivat umgewandelt. Anschließend wurde die Aminfunktion der Carbohydrazidgruppe durch Kondensation einer Benzyloxycarbonylgruppe geschützt. Nach der Acetylierung des 3' Alkohols und der Freisetzung des 5' Alkohols unterlief das erhaltene Synthon die folgenden Phosphorylierungsschritte, nämlich: Phosphorylierung durch Cyanoethylphosphat in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid; gleichzeitige Freisetzung des 3' Alkohols und des 5' Phosphats in basischem Milieu; Kondensation des Pyrophosphats mit aktiviertem 5' Phosphat, das als Morpholidat vorlag. Die Herstellung des reaktiven Synthons Desoxynukleosid-Triphosphat des Carbohydrazids dX0TP endete mit der Hydrogenolyse der Benzyloxycarbonylgruppe.
  • Die Kondensation des Carbohydrazids dX0TP mit Z1-CHO und Z1-CO-Z2 führt zu Hydrazonderivaten dX1TP, dann zu Verbindungen dX2TP nach der Reduktion.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf die Verbindungen, die man mittels der vorstehend explizierten Verfahren erhalten kann und auf die Bibliotheken von Verbindungen der allgemeinen Formel I, die man erhalten kann, wenn man eine oder mehrere Verbindungen der allgemeinen Formel II mit einer Bibliothek von Aldehyden und/oder Ketonen reagieren lässt.
  • Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die fähig sind, eine Mutation in eine Nukleinsäure einzuführen, welches die folgenden Schritte umfasst: i) Einbau einer Verbindung der Formel I, in der Y1 NH2 ist, in ein synthetisches Oligonukleotid, ii) Durchführen einer Reaktion der Verbindung durch Kondensation mit mindestens einem Aldehyd und/oder einem Keton, möglicherweise gefolgt von einer Reduktion, iii) Replikation des Oligonukleotids mit Hilfe einer Polymerase und Bestimmen, ob eine Mutation in den neu synthetisierten Strang eingeführt wurde.
  • In einer weiteren Ausführungsform bezieht sich die Erfindung also auf ein Verfahren zur Punktmutation einer Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass man i) ein synthetisches Oligonukleotid herstellt, das mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung umfasst, ii) das Oligonukleotid mit Hilfe einer Polymerase repliziert.
  • In einer anderen Alternative betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Zufallsmutation einer Nukleinsäure, das Schritte umfasst, die darin bestehen, eine Reaktionsmischung, die mindestens eine vorstehend genannte Verbindung umfasst, für die Amplifizierung einer Nukleinsäure zu verwenden.
  • Ein solches Verfahren zur Zufallsmutagenese ist besonders nützlich, um die Aktivität eines vorliegenden Polypeptids zu modifizieren.
  • Für die Elongation, die Replikation und die Amplifizierung kann man eine exo-DNA-Polmerase verwenden, wie zum Beispiel die Taq-Polymerase, das Klenow-Fragment und die Vent-Polymerase.
  • Im Falle, dass man erfindungsgemäße Verbindungen aussieben möchte, die gegenüber der Exonukleaseaktivität resistent wären, ist es jedoch möglich, exo+ DNA-Polymerasen zu verwenden. Solche Verbindungen sind insbesondere in Verfahren zum Nachweis von Mutationen nützlich.
  • Ein zusätzlicher Aspekt betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die fähig sind, ein Enzym zu inhibieren, das aus Polymerase, insbesondere eine reverse Transkriptase, und/oder einer Kinase ausgewählt ist, insbesondere jegliche Kinase, die fähig ist, in vivo oder in vitro Mono- oder Diphosphatnukleotide zu phosphorylieren (Desoxycytidinkinasen, Desoxyguanosinkinasen und Thymidinkinasen), dadurch gekennzeichnet, dass man in Gegenwart von mindestens einer erfindungsgemäßen Verbindung die Aktivität des Enzyms untersucht.
  • In diesem Verfahren kann man die Wirkung von mindestens einer der Verbindungen auf Zellen untersuchen, die mit einem Retrovirus infiziert sind, wobei die Verbindung in Form eines Nukleosidanalogons vorliegt. Die Nukleoside können nämlich die Membran der Zellen durchdringen, was bei Nukleotiden aufgrund der negativen Ladung der Phosphatgruppen nicht der Fall ist. Man kann also ein Aussieben in großem Umfang ausführen, indem man eine erfindungsgemäße Bibliothek benutzt, und mittels eines iterativen Verfahrens mit den Fraktionen der Bibliothek erreicht man durch Routineerfahrungen die Identifizierung von einem oder mehreren Verbindung(en), welche die Replikation des Virus hemmt bzw. hemmen.
  • Die Erfindung betrifft Verbindungen, die man mittels des vorstehend genannten Verfahrens erhalten kann.
  • Außerdem können die erfindungsgemäßen Verbindungen in Primer oder Sonden für die Amplifizierung und/oder für den Nachweis einer Zielnukleinsäure verwendet werden.
  • Eine "Sonde" oder ein "Primer" ist im Sinne der Erfindung als ein Nukleotidfragment definiert, das zum Beispiel 10 bis 100, insbesondere 15 bis 35 natürliche oder modifizierte Nukleotide umfasst, mindestens eine Verbindung umfasst, die der vorstehend beschriebenen Formel I entspricht, und unter vorherbestimmten Konditionen eine Hybridisierungsspezifität aufweist, um mit einer Zielnukleinsäure einen Hybridisierungskomplex zu bilden. Die erfindungsgemäßen Sonden, egal ob spezifisch oder nicht spezifisch, können direkt oder indirekt auf einem soliden Träger immobilisiert werden. Man spricht dann von einer "Fangsonde". Außerdem können die Sonden ein Markiermittel tragen, das ihren Nachweis erlaubt. Man spricht dann von einer "Detektionssonde".
  • Eine "Fangsonde" ist mit Hilfe eines beliebigen geeigneten Mittels auf einem soliden Träger immobilisiert bzw. immobilisierbar, zum Beispiel durch eine kovalente Bindung, durch Adsorption oder durch direkte Synthese auf einem soliden Träger. Diese Techniken werden insbesondere in der Patentanmeldung WO 92/10092 beschrieben. Das allgemeinste Verfahren besteht darin, die aus Zellen von unterschiedlichem Gewebe oder aus Zellkulturen gewonnene Nukleinsäure auf einem Träger zu immobilisieren (zum Beispiel Nitrozellulose, NylonTM, Polystyrol) und die immobilisierte Zielnukleinsäure mit der Sonde unter genau definierten Konditionen zu inkubieren. Nach der Hybridisierung wird überschüssige Sonde beseitigt, und die entstandenen Hybridmoleküle werden mittels eines geeigneten Verfahrens nachgewiesen (Radioaktivitätsmethode, Fluoreszenzmethode oder Nachweis durch sondenbedingte enzymatische Aktivität).
  • Eine "Detektionssonde" kann mittels eines Markers markiert sein, der zum Beispiel aus radioaktiven Isotopen, Enzymen, insbesondere Enzyme, die fähig sind, auf ein chromogenes, fluorigenes oder lumineszierendes Substrat zu wirken (insbesondere eine Peroxidase oder eine alkalische Phosphatase), chemischen Chromophorbindungen, chromogenen, fluorigenen oder lumineszierenden Verbindungen, Basis-Nukleotidanaloga und Liganden wie zum Beispiel Biotin, ausgewählt ist. Das Markieren von erfindungsgemäß erhaltenen Primer oder Sonden erfolgt mittels radioaktiver Elemente oder nicht radioaktiver Moleküle. Die nicht radioaktiven Einheiten sind aus Liganden wie zum Beispiel Biotin, Avidin, Streptavidin, Digoxigenin, Haptenen, Farbstoffen, lumineszierenden Substanzen wie zum Beispiel radiolumineszente, chemilumineszente, biolumineszente, fluoreszierende (Fluoreszeinisothiocyanat FITC, R-Phycoerythrin PE, Quantum RedTM, SIGMA, und Fluorescamine, Molecular Bioprobes) und phosphoreszierende Substanzen ausgewählt.
  • In einer besonderen Ausführungsform betrifft die Erfindung markierte Verbindungen der Formel I. Wie vorstehend erklärt, kann man eine Verbindung der Formel II mit einem Molekül, das eine Aldehyd- oder Ketonfunktion hat, kondensieren. In diesem Fall tragen die Moleküle einen Marker des Typs Chromophor, chromogene, fluorigene oder lumineszierende Verbindungen oder Liganden wie zum Beispiel Biotin.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die mindestens eine Verbindung der Formel I aufweisen. Sie können in den Techniken des Typs PCR (Erlich, 1989; Innis et al., 1990, et Rolfs et al., 1991) implementiert werden. Diese Technik erfordert das Auswählen von Oligonukleotidprimerpaaren, die das Fragment, das amplifiziert werden muss, umrahmen. Man kann sich zum Beispiel auf die in dem US-amerikanischen Patent 4,683,202 beschriebene Technik berufen. Andere Amplifizierungstechniken können mit Hilfe von erfindungsgemäßen Primerpaaren als Alternative zur PCR (PCR-like) vorteilhaft eingesetzt werden. Mit PCR-like sind alle Methoden gemeint, die direkte oder indirekte Reproduktionen der Nukleinsäuresequenzen ausführen, oder in denen die Markiersysteme amplifiziert wurden. Diese Techniken sind dem Fachmann wohl bekannt.
  • Ferner betrifft die Erfindung ein Kit zur Amplifizierung und/oder zur Detektion einer Zielnukleinsäure und eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine erfindungsgemäße Verbindung oder eine erfindungsgemäße Nukleinsäure umfasst. Ferner betrifft sie die Verwendung einer vorstehend beschriebenen Nukleinsäure als Ribozym. Unter "Ribozym" versteht man im Sinne der Erfindung eine Nukleinsäure, ein Nukleinsäurederivat oder ein chemisches Hybrid zwischen Nukleinsäure und Peptid, das katalytische Eigenschaften aufweist und die Aktivität oder die Expression eines Proteins, eines Polypeptids, eines Peptids oder eines Gens modulieren kann. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann also durch ein Enzym substituiert werden.
  • In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung Antisense-Oligonukleotide, die mindestens eine Verbindung der Formel I enthalten. Mit Antisense bezeichnet man ein komplementäres Oligonukleotid einer Ziel-DNA oder -RNA, das die Transkriptase oder die Übersetzung hemmt. Anwendungsbeispiele werden insbesondere in WO9954463, WO9838204, WO9829448, WO9735960, WO9710840 und WO9625497 gegeben.
  • Infolgedessen ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure als Medikament und bei Behandlungsmethoden nützlich.
  • Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung einer vorstehend beschriebenen Verbindung für die Herstellung eines Medikaments, insbesondere für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von retroviralen Infektionen und von Krebs.
  • Beispiel 1: Verfahren zur Herstellung von bevorzugten Verbindungen gemäß der Erfindung (1).
  • Die Synthese des Triphosphats 1 setzt die Einführung einer temporären Schutzgruppe für die Hydrazinfunktion voraus, die unter neutralen Bedingungen freigesetzt werden kann. Zu diesem Zweck wählte man die Benzyloxycarbonylgruppe aus. Die Triphosphatkette wurde in 3 Schritten eingeführt, entsprechend der von Tener und Moffatt beschriebenen Verfahren. Das Nukleosid 3 erhielt man aus der Verbindung 2 durch enzymatische Transglycosylierung unter Verwendung der N-Desoxyribosyltransferase, wie vorstehend von Pochet et al. 1995 beschrieben.
  • Die 5'-Dimethoxytritylierung der Verbindung 3 in Pyridin erlaubte, die Verbindung 4 mit einer Ausbeute von 73% zu erhalten. Die Behandlung der Verbindung 4 mit einer exzessiven Menge von Hydrazinhydrat bei 60°C ergab eine Verbindung 5, die in den folgenden Schritten ohne zusätzliche Reinigung verwendet werden kann.
  • Die Benzyloxycarbonylgruppe wurde eingeführt, indem man die Verbindung 5 mit Benzyloxycarbonylsuccinimidat reagieren ließ, was die Verbindung 6 mit einer Ausbeute von 81% ergab. Die Acylierung mit Essigsäureanhydrid in Pyridin ergab eine Mischung aus zwei Hauptverbindungen, die der 3'-O-acetylierten Verbindung 7 (24%) und der 3'-O, N-diacetylierten Verbindung 8 (38%) entspricht. Die vollständige Acetylierung erhielt man schnell in Acetonitril unter Verwendung von Essigsäureanhydrid (2,2 eq.) in Gegenwart von DMAP-katalysiertem Triethylamin, was erlaubte, die Verbindung 8 mit einer Ausbeute von 80% zu erhalten. Nach der Detritylation der Verbindung 8, der Kondensation der Verbindung 9 mit Cyanoethylphosphat in Pyridin in Gegenwart von DCC, gefolgt von einer Behandlung mit einer Lösung aus 2% Natriummethylat in Methanol, führte das Verfahren zu einer 5'-Monophosphat-Verbindung 11 (52%). Die Triphosphatverbindung 13 erhielt man in zwei Schritten über die Morpholidatverbindung 12 mit einer Ausbeute von 50%. Die Beseitigung der Schutzgruppe Benzyloxycarbonyl erfolgte durch Hydrogenolyse an Pd/C in Gegenwart von H2. Die Behandlung der Verbindungen 11 und 13 erlaubte also, die Monophosphatderivate 14 und die Triphosphatderivate 1 zu erhalten.
  • Beispiel 2: Kondensation der Verbindung 1 mit Aldehyden.
  • Die Derivatisierung der Hydrazinfunktion erfolgte unter Verwendung der aromatischen und aliphatischen Aldehyde: Zunächst wurde die Monophosphatverbindung 14 mit 3-Methylthiopropionaldehyd und Benzaldehyd in H2O/Methanol behandelt, um die Verbindungen 15a und 15b zu erhalten. Diese Produkte wurden mittels HPLC mit umgekehrter Phase isoliert und mittels der Verfahren Massenspektrometrie und RMN-Spektrographie charakterisiert. Auf die gleiche Weise wurde die Verbindung 1 in TEAA-Puffer (pH 7,5) bei 4°C mit einem Überschuss an Aldehyden in Methanol behandelt, um die Verbindungen 16a und 16b zu erhalten. Die Struktur der Triphosphatderivate wurde mittels Massenspektrometrie bestätigt.
  • Der Verbindung 1 wurde in 0,2 ml 0,1 M TEAA ein Aldehyd (25 μL in 0,1 mL Methanol) zugesetzt. Nach 2 Stunden wurde die Lösung konzentriert und mittels HPLC mit λ = 230 nm gereinigt (0 bis 25% Acetronitril in 10 mM TEAA). Die das reine Produkt enthaltende Fraktionen wurden gefriergetrocknet und über eine Kationen-Austauschsäule (Dowex) geführt, um die Triphosphate in Form von Natriumsalzen zu erhalten.
  • Beispiel 3: Einbau der Analoga dX0TP und dX1TP in die Nukleinsäuren.
  • An den Analoga (dX0TP, dX1TP(a) und dX1TP(b)) wurden Primerelongationsexperimente durchgeführt, die mittels des Klenow Fragments exo-katalysiert wurden. Ein Primer wurde an seinem 5'-Ende mittels Reaktion von [γ–32P]ATP unter Verwendung von T4 Polynukleotidkinase markiert. Die geeigneten Matrizen und die markierten Primer wurden bei 75°C für 15 Minuten inkubiert und anschließend für 1 Stunde bei Raumtemperatur langsam abgekühlt. In anderen Reaktionsmischungen hat man die Primerelongation mit einer DNA-Polymerase in Gegenwart der gegebenen dX1TP durchgeführt. Anschließend denaturierte man die Proben und trug dann ein Polyacrylamidgel (20% 7 M Harnstoff) auf. Nach der Elektrophorese wurden die Gele mittels Audioradiographie oder mit Hilfe von PhosphorImagerTM visualisiert.
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Claims (39)

  1. Verbindungen der allgemeinen Formel I:
    Figure 00200001
    wobei – die Gruppe R1 für eine Gruppe steht, die ausgewählt ist aus den Gruppen Phosphat, Diphosphat oder Triphosphat und Schutzgruppen wie DMT. – R2 und R2' unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H, OH, Phosphoramidit und dessen Derivaten, H-Phosphonat, und einem Elongationsterminator T, – R3 ausgewählt ist aus H, OH, den Halogenen (F, Br, Cl, I), einer linearen oder verzweigten Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und einer Gruppe O-R5, wobei R5 für eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen steht, – R3' ausgewählt ist aus OH, den Halogenen (F, Br, Cl, I), einer linearen oder verzweigten Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und einer Gruppe O-R5, wobei R5 für eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen steht, – R4 für einen Heterozyklus steht, der substituiert ist mit einer Gruppe der Formel
    Figure 00200002
    wobei die genannte Gruppe an den Heterozyklus gebunden ist, entweder direkt oder über einen Abstandhalter E, der aus einer gesättigten oder ungesättigten Kohlenstoffkette von 1 bis 20 Atomen aufgebaut ist, die Heteroatome enthält oder nicht enthält und/oder möglicherweise substituiert ist; wobei der genannte Heterozyklus ausgewählt ist aus: wobei R4 ausgewählt ist aus: a) substituierten Heterozyklen mit 5 Atomen der Formel:
    Figure 00210001
    in der E ein Abstandhalter wie vorstehend definiert ist oder E nicht existiert, in der X unabhängig voneinander stehen für – eine Gruppe CH, – eine Gruppe C-R6, wobei R6 ausgewählt ist aus den Halogenen (F, Br, Cl, I), einer linearen oder verzweigten Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, – einer Gruppe O-R7 oder S-R7, wobei R7 für ein Wasserstoffatom oder eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen steht, oder – N, den Heterozyklen ausgewählt aus den folgenden:
    Figure 00210002
    wobei R4 bevorzugt ist
    Figure 00210003
    b) Ringen mit 6 Atomen, insbesondere Pyrimidinen der Formel:
    Figure 00220001
    worin E ein Abstandhalter wie vorstehend definiert ist oder nicht existiert, c) Purinanaloga der Formel:
    Figure 00220002
    worin: – E ein Abstandhalter wie vorstehend definiert ist oder nicht existiert, – Y1 NH2 (bezeichnet mit Synthon X0) oder eine Gruppe:
    Figure 00220003
    darstellt – Y2 und Y3 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H, OH, O, NH2, den Halogenen (F, Br, Cl, I), SCH3, SH, einer über das Stickstoffatom gebundenen Amidfunktion, oder einer linearen oder verzweigten Alkoxygruppe, mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Z1 und Z2 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H und einer organischen Gruppe.
  2. Die Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Gruppe R1 eine Triphosphatgruppe ist.
  3. Die Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Gruppe R2 und R2' eine OH-Gruppe darstellt.
  4. Die Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass T vorzugsweise ausgewählt ist aus F, Br, Cl, I, N3, und einer linearen oder verzweigten Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
  5. Die Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Y1 für NH2 steht, dem entsprechen die Synthone der allgemeinen Formel II (Synthon X0):
    Figure 00230001
    in der R1, R2, R2', R3, R3' und E den Gruppen der Formel I entsprechen.
  6. Die Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Y1 eine Gruppe ausgewählt aus der Gruppe darstellt:
    Figure 00230002
    wobei Z1 und Z2 unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom oder eine organische Gruppe (Synthone X1 und X1TP) stehen.
  7. Die Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Y1 eine Gruppe ausgewählt aus der folgenden Gruppe darstellt:
    Figure 00230003
    wobei Z1 und Z2 unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom oder eine organische Gruppe (Synthone X2 und X2TP) stehen.
  8. Die Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der Gruppen Z1 und Z2 ausgewählt ist aus aromatischen Gruppen, insbesondere aus Gruppen der Formel:
    Figure 00240001
  9. Die Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der Gruppen Z1 und Z2 ausgewählt ist aus den Gruppen Thiol, Alkyl, Carbonyl, Amin, Alkohol, Aryl und Aminosäure.
  10. Die Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass Z1 oder Z2 mit Y3 einen Ring bilden.
  11. Die Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass Z1 oder Z2 einen fluoreszierenden oder phosphoreszierenden Marker umfassen, insbesondere Fluorescamin.
  12. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 als Substrat einer Polymerase, einer Reversen Transcriptase und/oder einer Nucleotidkinase.
  13. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, um Paarungen mit natürlichen Basen zu bilden.
  14. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, um eine Polymerase zu inhibieren, insbesondere eine Reverse Transcriptase eines Retrovirus und/oder eine Kinase.
  15. Ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel II gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Herstellung eines Nucleosids, das als Heterozyklus einen Imidazolheterozyklus der Formel enthält:
    Figure 00250001
    worin X unabhängig voneinander eine Gruppe CH, C-R6, oder N, darstellen, R6 ausgewählt ist aus Halogenen (F, Br, Cl, I), einer linearen oder verzweigten Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und einer Gruppe O-R7 oder S-R7, wobei R7 für ein Wasserstoffatom oder eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen steht, b) Schützen des 5' Alkohols und Umwandlung der Ethylesterfunktion in eine Carbohydrazidfunktion unter Einwirkung von Hydrazin, c) Schützen der Aminfunktion der Carbohydrazidgruppe mit einer Schutzgruppe, wie der Benzyloxycarbonylgruppe, Acetylieren des 3' Alkohols, d) Phosphorylierung nach Entschützen des 5' Alkohols, e) und Hydrogenolyse der Benzyloxycarbonylgruppe.
  16. Das Herstellungsverfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt a) mittels einer trans-N-Desoxyribosylase realisiert wird.
  17. Das Herstellungsverfahren gemäß einem der Ansprüche 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt d) in der Phosphorylierung des Nucleosids durch Cyanoethylphosphat in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid besteht; gleichzeitige Freisetzung des 3' Alkohols und der Cyanoethylgruppe des 5' Phosphats in basischem Milieu; anschließende Kondensation des Pyrophosphats mit aktiviertem 5' Phosphat, das als Morpholidat vorliegt.
  18. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel I gemäß einem der Ansprüche 6 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel II gemäß Anspruch 5 mit einem Aldehyd oder einem Keton kondensiert wird.
  19. Das Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass man eine oder mehrere Verbindungen der allgemeinen Formel II gemäß Anspruch 5 mit einer Bibliothek von Aldehyden und/oder Ketonen reagieren lässt, möglicherweise gefolgt von einer Reduktion.
  20. Ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die fähig sind eine Mutation in eine Nukleinsäure einzuführen, welches die folgenden Schritte umfasst: i) Einbau einer Verbindung gemäß Anspruch 1, in der Y1 eine NH2 Gruppe ist, in ein synthetisches Oligonukleotid, ii) Durchführen einer Reaktion der genannten Verbindung gemäß einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18 oder 19, möglicherweise gefolgt von einer Reduktion, iii) Replikation des genannten Oligonukleotids mit Hilfe einer Polymerase und Bestimmen, ob eine Mutation in den neu synthetisierten Strang eingeführt wurde.
  21. Verfahren zur Punktmutagenese einer Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass i) ein synthetisches Oligonukleotid hergestellt wird, welches mindestens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 umfasst, ii) das genannte Oligonukleotid mittels einer Polymerase repliziert wird.
  22. Verfahren zur Zufallsmutagenese einer Nukleinsäure, welches Schritte umfasst, die darin bestehen eine Reaktionsmischung zur Amplifizierung einer Nukleinsäure zu verwenden, die mindestens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 umfasst.
  23. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass man eine exo-DNA-Polymerase benutzt.
  24. Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die zur Inhibition eines Enzyms ausgewählt aus einer Polymerase, insbesondere einer Reversen Transkriptase, und einer Kinase befähigt ist, dadurch gekennzeichnet, dass man die Aktivität des genannten Enzyms in Anwesenheit von mindestens einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 testet.
  25. Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die zur Inhibition einer Reversen Transkriptase eines Retrovirus befähigt ist, dadurch gekennzeichnet, dass man den Effekt von mindestens einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 auf durch das Retrovirus infizierte Zellen testet, wobei die Verbindung in Form eines Nukleosidanalogons vorliegt.
  26. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Bibliothek von Verbindungen der allgemeinen Formel I gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 verwendet, die durch ein Verfahren gemäß Anspruch 19 erhältlich ist.
  27. Nukleinsäure, die mindestens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 enthält.
  28. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 in einem Verfahren der Zufallsmutagenese.
  29. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 als mehrdeutige Base.
  30. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 in einem Primer oder einer Sonde zur Amplifikation und/oder Detektion einer Zielnukleinsäure.
  31. Die Verwendung gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Verbindung markiert ist.
  32. Kit zur Amplifizierung und/oder Detektion einer Zielnukleinsäure umfassend eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 oder eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 27.
  33. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 27 zur Herstellung eines Medikaments.
  34. Die Verwendung gemäß Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Nukleinsäure als Ribozym verwendet wird.
  35. Die Verwendung gemäß Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Nukleinsäure als Antisense verwendet wird.
  36. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, in der Y1 NH2 ist als Ausgangssynthon zur Herstellung einer Bibliothek von Nukleotid- und/oder Nukleosidanaloga.
  37. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Medikaments.
  38. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von retroviralen Infektionen.
  39. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs.
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