PT1290006E - Produção combinatória de análogos de nucleótidos e nucleósidos (xitp) - Google Patents
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Description
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DESCRIÇÃO "Produção combinatória de análogos de nucleótidos e nucleósidos (XiTP)" O presente invento refere-se a novos análogos de nucleótidos com uma função reactiva hidrazida (fórmula II) que servem de sintões de partida para a preparação de compostos (fórmula I) que podem induzir mutações ou que são capazes de inibir uma ADN-polimerase ou uma quinase. O invento também se refere aos ácidos nucleicos que têm os citados análogos de nucleósidos e nucleótidos.
Os inibidores nucleotidicos actualmente disponíveis (aciclovir, ganciclovir, AZT, ddC, d4T, 3TC) apresentam efeitos secundários indesejáveis aquando do tratamento de longa duração e administrações repetidas. Por um lado, a toxicidade intrínseca destes análogos de nucleótidos provém designadamente do facto de eles poderem ter falta de especificidade face a uma determinada polimerase ou transcritase inversa. Por outro lado, ao fim de um certo tempo, os vírus tornam-se resistentes a estes inibidores mesmo se aumentarmos as doses. São citados na literatura outros análogos de nucleótidos por terem efeitos antivirais (Witkowski, J.T. et al., 1972, J. Med. Chem., 15(11) : 1150-1154) ou antitumorais (Nedorezova, T.P. et al., 1986, Khim-Farm. Zh. 20(11):1299-1302). Foram descritas diferentes vias de síntese de análogos de nucleótidos (Garcia Lopez, M.T. et al., 1982, J. Heterocyclic Chem., 19 :233-235), (Shingarova, I.D. et al., 1987, Khim, Geterotsikl. Soedin. (2):231-235), (Shingarova, I.D. et al., 1987, Khim. Geterotsikl, Soedin. (7):937-940). Contudo, estas últimas não permitem produzir uma grande diversidade de compostos podendo induzir a inibição das polimerases ou das quinases . A síntese de novos inibidores nucleotidicos representa um começo importante para renovar os métodos de tratamento de infecções virais tais como HIV, CMV e HSV. Hutchinson, 1990, mostra que existem numerosas dificuldades ligadas à síntese de vastas colecções de nucleótidos modificados. Por exemplo, 2
ΕΡ 1 290 006 /PT parece necessário proteger as funções reactivas das bases ou das riboses com qualquer adição ou modificação de grupos. O invento permite minorar estas dificuldades graças a um sintão de base que permite a obtenção numa só etapa de uma biblioteca de análogos de nucleótidos ou de nucleósidos. Graças a estas bibliotecas, podemos, por exemplo, pesquisar inibidores altamente específicos da transcritase inversa do HIV. A preparação de novos nucleótidos com emparelhamentos ambíguos, isto é, capazes de se incorporarem na cadeia iniciadora em resposta a mais que uma entre as quatro bases A, C, G, T na cadeia molde, impõe-se igualmente para aperfeiçoar os processos de mutagénese (Sala et al., 1996; Zaccolo et al., 1996; Pochet et al., 1997). O agente mutagénio último consistiria num monómero do ADN que pudesse emparelhar com as quatro bases canónicas no estado de incorporação como trifosfato, seguido da sua cópia como molde. O desoxinucleósido-trifosfato de uma tal base ambígua permitiria substituir qualquer base canónica por qualquer uma das três outras bases aquando da replicação por uma ADN-polimerase. Por outro lado, um processo de hiper-mutagénese in vivo por incorporação da base ambígua simplificaria e aceleraria os protocolos de evolução dirigida dos genes transportados por plasmídeos, evitando o recurso às manipulações dispendiosas da PCR errónea. Um resumo justificando o emprego de bases ambíguas noutras aplicações encontra-se nas referências Bergstrom et al., 1995; Loakes et al., 1995; Hill et al., 1998.
Por outro lado, a identificação de estruturas químicas simplificadas mas dotadas das mesmas capacidades de emparelhamento unívoco que cada uma das quatro bases do ADN, por outras palavras, substitutos de A, C, G, T, torna possível a preparação de novas sondas ou iniciadores nucleicos que podem ser utilizados nas diversas técnicas de amplificação e de detecção de ácidos nucleicos alvo. Por outro lado, sobre o sintão de partida de fórmula II (ver adiante), é possível enxertar moléculas reactivas que se situam, por exemplo, na família dos aminoácidos, o que permite portanto funcionalizar O ADN. 3
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Foram descritos desoxinucleósidos possuindo uma purina simplificada num simples núcleo imidazole diferentemente substituído nas posições 4 e 5, em Pochet et al., 1998. Estes nucleósidos são intrinsecamente capazes de formar ligações de hidrogénio com as quatro bases canónicas por rotação em torno da ligação glicosídica (conformações sin e anti) e da ligação carboxamida ("A-like" e "G-like") (Pochet et al., ! 995; Pochet et al., 1998). A incorporação destes nucleósidos pelas ADN-polimerases (LeBec et al., 1997) e os efeitos mutagénios dos seus emparelhamentos são descritos em Sala et al., 1996; Pochet et al., 1997.
No quadro do presente invento, podem ser enxertados agrupamentos laterais variáveis no monómero do ADN simplificado, designado adiante por Xo, por via de um grupo carbo-hidrazida. Este sintão de partida permite preparar múltiplos substratos de ADN-polimerases numa etapa. O grupo carbo-hidrazida constitui uma função muito reactiva capaz de se condensar com qualquer aldeído ou cetona. Outros derivados de hidrazonas, adiante designados por Xi, podem, portanto, ser formados a partir de Xo. Outros derivados de hidrazinas, adiante designados por x2, podem ser obtidos por redução de Xi.
Assim, o presente invento refere-se a compostos de fórmula geral I:
R1-0-H7C
onde: - o grupo Rl representa um hidrogénio ou um grupo escolhido entre os grupos fosfato, difosfato ou trifosfato e os grupos protectores como DMT. - R2 e R2' são escolhidos, independentemente um do outro, entre H, OH, fosforamidito e seus derivados, H-fosfonato e um terminador de alongamento T, - R3 é escolhido entre H, OH, os halogéneos (F, Br, Cl, I), um grupo alquilo linear ou ramificado com 1 a 6 átomos de carbono e um grupo 0-R5, representando R5 um grupo alquilo linear ou ramificado com 1 a 6 átomos de carbono, 4
ΕΡ 1 290 006 /PT - R3 é escolhido entre OH, os halogéneos (F, Br, Cl, I), um grupo alquilo linear ou ramificado com 1 a 6 átomos de carbono e um grupo 0-R5, representando R5 um grupo alquilo linear ou ramificado com 1 a 6 átomos de carbono - R4 representa um heterociclo substituído com um grupo de fórmula
estando o referido grupo ligado ao heterociclo, seja directamente, seja por intermédio de um braço espaçador E constituído por uma cadeia carbonada de 1 a 20 átomos de carbono, saturada ou não, compreendendo ou não heteroátomos e/ou eventualmente substituída; sendo R4 seleccionado entre: a) os heterociclos substituídos com 5 átomos de fórmula:
na qual E é um braço espaçador como definido anteriormente, ou que não existe, na qual X representam, independentemente uns dos outros, - um grupo CH, - um grupo C-R6, sendo R6 escolhido entre os halogéneos (F, Br, Cl, I), um grupo alquilo linear ou ramificado com 1 a 6 átomos de carbono, - um grupo 0-R7 ou S-R7, representando R7 um hidrogénio ou um grupo alquilo linear ou ramificado com 1 a 6 átomos de carbono, ou - N, sendo os heterociclos então escolhidos entre os seguintes:
plrazolo Imidazolo tetrazolo, 5
ΕΡ 1 290 006 /PT sendo R4, de preferência
compostos A b) os ciclos com 6 átomos, designadamente as pirimidinas de fórmula:
na qual E é um braço espaçador como definido anteriormente ou que não existe, c) os análogos de purinas de fórmula
compostos C na qual: - E é um braço espaçador como definido acima, ou não existe, - Yl representa NH2 (designado pelo sintão X0) ou um grupo: Z1 /21 N=C sintao Xi ou NH—CH sintão X2 ^22 ^Z2 - Y2 e Y3 são escolhidos, independentemente um do outro, entre H, OH, O, N2, os halogéneos (F, Br, Cl, I), SCH3, SH, uma função amida ligada pelo átomo de azoto ou um alcoxi linear ou ramificado com 1 a 6 átomos de carbono, sendo Z1 e Z2 escolhidos, independentemente um do outro, entre H e um grupo orgânico. 6
ΕΡ 1 290 006 /PT A respeito dos termos «purinas» e «pirimidinas», referiremos a definição dada em Oxford Dictionary of
Biochemistry and Molecular Biology, Oxford Press, 1997. Exemplos de vias de síntese destes compostos estão descritos nas páginas 546 e 547 deste documento. Considerando os compostos B, o exemplo de síntese apresentado na figura 2 é válido para os nucleósidos da série ribo, desoxi e para os derivados fosforilados. Quando X é CONHNH2, obtém-se um sintão Xo de acordo com o invento compreendendo um braço espaçador CH=CHCONH (CH2) n, onde é n=6 neste exemplo.
Entre os sintões X0, Xi e X2, o invento visa designadamente análogos de nucleósidos e análogos de nucleótido-trifosfatos que serão designados por XoTP, XiTP e X2TP. Os análogos de nucleótidos de acordo com o invento serão de preferência utilizados quando o objectivo implica a sua incorporação num ácido nucleico. Utilizaremos de preferência um análogo de nucleósido de acordo com o invento para inibir uma polimerase in situ numa célula, designadamente para o fabrico de um medicamento.
Nos compostos de fórmula I, o grupo Rl representa de preferência um grupo trifosfato ou um hidrogénio conforme o objectivo evocado acima. Também segundo o objectivo pretendido, pelo menos um dos grupos R2 e R2’ pode representar um grupo OH, o que permite o seguimento do alongamento através de uma polimerase ou um grupo terminal T no caso em que se pretende obter inibidores de polimerases. Assim, pelo menos um dos grupos R2 e R2’ pode representar o grupo T que é seleccionado, de preferência, entre F, Br, Cl, I, N3 e um grupo alquilo linear ou ramificado com 1 a 6 átomos de carbono. Bem entendido, qualquer grupo equivalente que funcione como um terminador do alongamento é considerado para a preparação do composto que inibe as transcritases inversas de retrovírus.
Vantajosamente, quando Yl é NH2, o invento tem por objectivo os sintões de partida de fórmula geral II (sintão X0) :
7 ΕΡ 1 290 006 /PT Ο
II
Ε ΝΗ
I ΝΗ2 nos quais Rl, R2, R2', R3, R3' e E correspondem aos grupos de fórmula I. Entre estes compostos, o invento visa designadamente o composto denominado dXoTP onde Rl é um grupo trifosfato e R3 e R3' representam H.
Os compostos de fórmula II explicitados acima podem ser utilizados como sintão de partida para a preparação de uma biblioteca de análogos de nucleótidos e/ou de nucleósidos. O seu grupo carbo-hidrazida permite, com efeito, conjugar numa só etapa estes compostos com qualquer molécula que tenha uma função aldeido ou cetona originando os sintões Xi após condensação ou X2 após redução.
Por condensação dos compostos de fórmula II (sintões X0 e X0TP) com qualquer molécula que tenha uma função aldeido ou cetona, obtém-se um composto de fórmula I na qual o grupo Yl apresenta a fórmula geral: /Z1
N-C em que Zl e Z2 representam, independentemente um do outro, um hidrogénio ou um grupo orgânico. Estes compostos serão designados por ΧχΤΡ (análogos de nucleótido-trifosfato) ou XI (análogos de nucleósidos). Podemos reduzir estes compostos e obter os compostos de fórmula I (sintões X2 e X2TP) na qual o grupo Yl apresenta a fórmula geral:
NH-CH /Z1 XZ2
Podem-se citar, por exemplo, os compostos em que pelo menos um dos grupos Zl e Z2 é seleccionado entre os grupos aromáticos, designadamente entre os grupos de fórmula: 8
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Pelo menos um dos grupos Zl e Z2 pode igualmente ser seleccionado entre os grupos tiol, alquilo, carbonilo, amina, álcool, arilo e aminoácido.
Num outro aspecto, os compostos do invento podem ser caracterizados por Zl ou Z2 formarem um ciclo com Y3.
Numa concretização particular, o invento refere-se aos compostos pré-citados nos quais Zl e Z2 compreendem um marcador fluorescente ou fosforescente, designadamente a fluorescamina ou a fluoresceina. Por exemplo, pode fazer-se reagir a fluorescamina para marcar o composto ou então para detectar a sua presença no seio de um ácido nucleico
Podem-se portanto preparar compostos com um braço espaçador e um marcador, por exemplo, um composto de fórmula o
R1-0-HS
Marcador
Vantajosamente, os compostos pré-citados são substratos de uma polimerase e podem formar emparelhamentos com as bases naturais, de uma transcritase inversa e/ou de uma nucleótido-quinase. Além disso, os citados compostos podem introduzir mutações num ácido nucleico ou bloquear a síntese de ADN ou de ARN, designadamente pelas ADN-polimerases, as transcritases inversas de retrovírus e as quinases. Entre as quinases, designa-se qualquer quinase capaz de fosforilar os nucleótidos mono ou di-fosfato in vivo ou in vitro. Pode-se citar mais particularmente as desoxicitidina-quinases, designadamente a 9
ΕΡ 1 290 006 /PT DCK2 humana descrita em US 5 914 258, as desoxiguanosina-quinases e as timidina-quinases.
Assim, pode-se utilizar um composto de acordo com o invento no qual Yl é NH2 como sintão de partida para a preparação de bibliotecas de análogos de nucleótidos e/ou de nucleósidos e identificar entre os citados análogos aqueles que podem induzir mutações e/ou bloquear a sintese de ADN ou de ARN. O invento refere-se igualmente a um processo de preparação de compostos de fórmula geral II descritos anteriormente caracterizado por compreender as etapas seguintes: a) preparação do nucleósido que tem por heterociclo um heterociclo imidazolo de fórmula:
na qual X representa, independentemente uns dos outros, um grupo CH, C-R6 ou N, sendo R6 escolhido entre os halogéneos (F, Br, Cl, I), um grupo alquilo linear ou ramificado com 1 a 6 átomos de carbono e um grupo 0-R7 ou S-R7, representando R7 um hidrogénio ou um grupo alquilo linear ou ramificado com 1 a 6 átomos de carbono, b) protecção do álcool em 5' e transformação da função éster etílico em função carbo-hidrazida por acção da hidrazina, c) protecção da função amina do grupo carbo-hidrazida por um grupo protector como o grupo benziloxicarbonilo, acetilação do álcool em 3', d) fosforilação após desprotecção do álcool em 5', e) e hidrogenólise do grupo benziloxicarbonilo.
De preferência, a etapa a) é realizada por meio de uma N-transdesoxirribosilase no caso da desoxirribose e a etapa d) consiste na fosforilação do nucleósido pelo cianoetil-fosfato em presença de diciclo-hexilcarbodiimida; libertação concomitante em meio básico do álcool 3' e do grupo cianoetilo 10
ΕΡ 1 290 006 /PT do 5'-fosfato; depois condensação de pirofosfato com o 5'-fosfato activado sob a forma de morfolidato. A partir dos compostos de fórmulas gerais II, pode preparar-se um composto de fórmula geral I descrito acima por condensação de um composto de fórmula geral II com um aldeído ou uma cetona, seguida eventualmente de uma redução. É possível fazer reagir um ou vários compostos de formula geral li com uma biblioteca de aldeídos e/ou de cetonas, seguindo-se, eventualmente, uma redução, de modo a obter uma biblioteca de compostos de fórmula I. A via de síntese descrita na figura 1 ilustra uma concretização particular do processo de acordo com o invento. O éster etílico do ácido imidazolo-4-carboxílico foi convertido no seu desoxinucleósido por acção da N-transdesoxirribosilase, utilizada sem purificação sob a forma de um extracto proteico de Lactobacillus leichmannii, tomando a timidina como fonte de desoxirribose. Após protecção do álcool em 5' por um grupo dimetoxitritilo, o nucleósido com a função éster etílico foi por sua vez convertido no seu derivado carbo-hidrazida por acção da hidrazina. A função amina do grupo carbo-hidrazida foi em seguida protegida por condensação de um grupo benziloxicarbonilo. Após acetilação do álcool em 3' e libertação do álcool em 5', o sintão obtido foi submetido às etapas de fosforilação seguintes, a saber: fosforilação pelo cianoetil-fosfato em presença da diciclo-hexilcarbodiimida; libertação concomitante em meio básico do álcool 3'e do 5'-fosfato; condensação de pirofosfato com 5'-fosfato activado sob a forma de morfolidato. A produção do sintão reactivo desoxinucleósido-trifosfato da carbo-hidrazida dX0TP foi concluída por hidrogenólise do grupo benziloxicarbonilo. A condensação da carbo-hidrazida dX0TP com Zl-CHO e Zl-CO-Z2 conduz aos derivados hidrazonas dXiTP, depois aos compostos dX2TP após redução.
Um outro aspecto do invento refere-se aos compostos susceptíveis de serem obtidos a partir dos processos explicitados acima e às bibliotecas de compostos de fórmula geral I susceptíveis de serem obtidas quando se faz reagir um 11
ΕΡ 1 290 006 /PT ou vários compostos de fórmula geral II com uma biblioteca de aldeídos e/ou de cetonas. O invento refere-se igualmente a um processo de identificação de compostos capazes de introduzir uma mutação num ácido nucleico que compreende as etapas que consistem em i) incorporar num oligonucleótido sintético um composto de fórmula I na qual Yl é NH2, ii) fazer reagir o citado composto por condensação com pelo menos um aldeido e/ou uma cetona, eventualmente seguida de uma redução, iii) replicar o citado oligonucleótido com o auxilio de uma polimerase e determinar se foi introduzida uma mutação na cadeia sintetizada de novo.
Assim, numa outra concretização, o invento refere-se a um processo de mutação pontual de um ácido nucleico caracterizado por i) se preparar um oligonucleótido sintético que compreende pelo menos um composto de acordo com o invento, ii) se replicar o citado oligonucleótido com o auxilio de uma polimerase.
Numa outra alternativa, o invento visa um processo de mutação aleatória de um ácido nucleico compreendendo as etapas que consistem em utilizar uma mistura reaccional que compreende pelo menos um composto pré-citado para a amplificação de um ácido nucleico. Um tal processo de mutagénese aleatória é particularmente útil para modificar a actividade de um polipéptido de interesse.
Para o alongamento, a replicação e a amplificação, pode-se utilizar uma ADN-polimerase exo- como por exemplo a polimerase Taq, o fragmento de Klenow e a polimerase Vent. Contudo, é possível utilizar ADN pol exo+ no caso de se desejar detectar compostos de acordo com o invento que seriam resistentes à actividade de exonuclease. Estes compostos são particularmente úteis nos processos de detecção de mutações.
Um aspecto suplementar refere-se a um processo de identificação de um composto capaz de inibir um enzima seleccionada entre uma polimerase, designadamente uma transcritase inversa e/ou uma quinase, designadamente qualquer quinase capaz de fosforilar nucleótidos mono- ou di-fosfato in vivo ou in vítro (desoxicitidina-quinases, desoxiguanosina- 12
ΕΡ 1 290 006 /PT quinases e timidina-quinases) caracterizado por se testar a actividade da citada enzima em presença de, pelo menos, um composto de acordo com o invento.
Neste processo, pode-se testar o efeito de pelo menos um dos citados compostos sobre células infectadas por um retrovirus, encontrando-se o citado composto sob a forma de um análogo de nucleósido. Com efeito, os nucleósidos podem atravessar a membrana das células, o que não é o caso dos nucleótidos por causa da carga negativa dos grupos fosfatos. Podemos, portanto, efectuar um rastreio em grande escala utilizando uma biblioteca de acordo com o invento e, por um processo iterativo com fracções da biblioteca, chega-se, por experiências de rotina, à identificação de um ou vários compostos que bloqueiam a replicação dos vírus. O invento visa os compostos susceptíveis de serem obtidos a partir do processo pré-citado.
Por outro lado, os compostos do invento podem ser utilizados em iniciadores ou sondas para a amplificação e/ou para a detecção de um ácido nucleico alvo. Uma «sonda» ou um «iniciador» definem-se, no sentido do invento, como sendo um fragmento nucleotídico que compreende, por exemplo, de 10 a 100, designadamente de 15 a 35 nucleótidos naturais ou modificados, compreendendo pelo menos um composto que corresponde à fórmula I descrita acima e que possui uma especificidade de hibridação nas condições determinadas para formar um complexo de hibridação com um ácido nucleico alvo. As sondas de acordo com o invento, quer sejam específicas ou não específicas, podem ser imobilizadas, directa ou indirectamente, sobre um suporte sólido; fala-se então de «sonda de captura». Por outro lado, as citadas sondas podem possuir um agente marcador que permite a sua detecção; fala-se então de «sonda de detecção».
Uma «sonda de captura» é imobilizada ou imobilizável sobre um suporte sólido por qualquer meio apropriado, por exemplo, por covalência, por adsorção ou por síntese directa sobre um suporte sólido. Estas técnicas são designadamente descritas no pedido de patente WO 92/10092. O método mais geral consiste em imobilizar o ácido nucleico extraído das células de diferentes tecidos ou de células em cultura sobre um suporte (como a 13
ΕΡ 1 290 006 /PT nitrocelulose, o nylon™, o poliestireno) e em incubar, em condições bem definidas, o ácido nucleico alvo imobilizado com a sonda. Após a hibridação, o excesso de sonda é eliminado e as moléculas híbridas formadas são detectadas pelo método apropriado (medição da radioactividade, da fluorescência ou da actividade enzimática ligada à sonda).
Uma «sonda de detecção» pode ser marcada por meio de um marcador escolhido, por exemplo, entre isótopos radioactivos, enzimas, em particular enzimas susceptíveis de actuar sobre um substrato cromogénico, fluorigénico ou luminescente (designadamente uma peroxidase ou uma fosfatase alcalina), compostos químicos cromóforos, compostos cromogénicos, fluorigénicos ou luminescentes, análogos de bases nucleotídicas, e ligandos como a biotina. A marcação de iniciadores ou de sondas obtidos de acordo com o invento é realizada através de elementos radioactivos ou de moléculas não radioactivas. As entidades não radioactivas são seleccionadas entre os ligandos como a biotina, a avidina, a estreptavidina, a dioxigenina, os haptenos, os corantes, os agentes luminescentes como os agentes radioluminescentes, quimioluminescentes, bioluminescentes, fluorescentes (isotiocianato de fluoresceína FITC, R-ficoeritrina PE, Quantum Red™, SIGMA e fluorescamina, Molecular Bioprobes) e fosforescentes.
Numa concretização particular, o invento refere-se a compostos de fórmula I marcados. Conforme indicado anteriormente, pode condensar-se um composto de fórmula II com uma molécula que tem uma função aldeído ou cetona. Neste caso, as citadas moléculas possuem um marcador do tipo cromóforo, compostos cromogénicos, fluorigénicos ou luminescentes ou ligandos como a biotina.
Os ácidos nucleicos compreendendo pelo menos um composto de fórmula I também são abrangidos pelo presente invento. Podem ser empregues nas técnicas do tipo PCR (Erlich, 1989; Innis et al., 1990, e Rolfs et al., 1991). Esta técnica necessita da escolha de pares de iniciadores oligonucleotídicos enquadrando o fragmento que deve ser amplificado. Pode-se referir, por exemplo, a técnica descrita na patente americana U.S. N.° 4 683 202. Outras técnicas de 14
ΕΡ 1 290 006 /PT amplificação podem ser empregues, vantajosamente, como alternativa à PCR (PCR-like) com o auxílio de pares de iniciadores segundo de acordo com o invento. Por PCR-like entendam-se todos os métodos que empregam reproduções directas ou indirectas das sequências de ácidos nucleicos, ou então aqueles em que os sistemas de marcação foram amplificados, sendo estas técnicas bem conhecidas dos peritos na especialidade. O invento refere-se igualmente a um "kit" para amplificação e/ou detecção de um ácido nucleico alvo e a uma composição farmacêutica que compreende um composto de acordo com o invento ou um ácido nucleico de acordo com o invento. Refere-se igualmente à utilização de um ácido nucleico descrito acima como ribozima. Entende-se por «ribozima», de acordo com o invento, um ácido nucleico, um derivado de ácido nucleico ou um híbrido químico entre ácido nucleico e péptido que apresentam propriedades catalíticas, de modulação da actividade ou da expressão de uma proteína, de um polipéptido, de um péptido ou de um gene. Um ácido nucleico de acordo com o invento pode portanto ser substituído por um enzima.
Num outro aspecto, o invento refere-se a oligonucleótidos anti-sentido que compreendem, pelo menos, um composto de fórmula I. Por anti-sentido entende-se designar um oligonucleótido complementar de um ADN ou ARN alvo que bloqueia a transcrição ou a tradução. Encontram-se exemplos de aplicação, designadamente, em W09954463, WO9838204, W09829448, WO9735960, W09710840 e W09625497. Portanto, o citado ácido nucleico, de acordo com o invento, é útil como medicamento e em métodos de tratamento. O invento refere-se também à utilização de um composto, descrito anteriormente, para o fabrico de um medicamento, designadamente para o fabrico de um medicamento destinado ao tratamento das infecções retrovirais e do cancro.
Exemplo 1: Processo de preparação de compostos preferidos de acordo com o invento (figura 1). A síntese do trifosfato 1 implica a introdução de um grupo temporário de protecção sobre a função hidrazina que pode ser libertada em condições neutras. Para este fim, 15
ΕΡ 1 290 006 /PT seleccionou-se o grupo benziloxicarbonilo. A cadeia trifosfato foi introduzida em 3 etapas, de acordo com os processos descritos por Tener e Moffatt. O nucleósido 3 foi obtido a partir do composto 2 por transglicosilação enzimática utilizando a N-desoxirribosiltransferase conforme descrito anteriormente por Pochet et al.r 1995. A 5'-dimetoxitritilação do composto 3 em piridina permitiu a obtenção do composto 4 com um rendimento de 73%. O tratamento do composto 4 com um grande excesso de hidrato de hidrazina a 60°C conduziu ao composto 5 que pode ser utilizado nas etapas seguintes sem purificação suplementar. O grupo benziloxicarbonilo foi introduzido fazendo reagir o composto 5 com o benziloxicarbonilsuccinimidato conduzindo ao composto 6 com um rendimento de 81%. A acilação com anidrido acético em piridina produz uma mistura de dois compostos principais que correspondem ao composto 3'-0-acetilado 7 (24%) e ao composto 3'-0,N-diacetilado 8 (38%). A acetilação completa foi rapidamente obtida em acetonitrilo utilizando o anidrido acético (2,2 eq.) em presença de trietilamina catalisada por DMAP permitindo obter o composto 8 com um rendimento de 80%. Após destritilação do composto 8, a condensação do composto 9 com o cianoetilfosfato em piridina na presença de DCC, seguida por um tratamento com uma solução de 2% de metilato de sódio em metanol, o processo conduziu ao composto 5'-monofosfato 11 (52%). O composto trifosfato 13 foi obtido em duas etapas passando pelo composto morfolidato 12 com um rendimento de 50%. A supressão do grupo protector benziloxicarbonilo foi efectuada por hidrogenólise sobre Pd/C em presença de H2. Assim, o tratamento dos compostos 11 e 13 permitiu obter os derivados monofosfato 14 e trifosfato 1.
Exemplo 2: Condensação do composto 1 com aldeídos. A derivação da função hidrazina foi efectuada utilizando aldeídos aromáticos e alifáticos: primeiro, o composto monofosfato 14 foi tratado com 3-metiltiopropionaldeído e benzaldeído em H20/metanol para dar os compostos 15a e 15b. Estes produtos foram isolados por HPLC em fase inversa e foram caracterizados pela técnica de espectrometria de massa e por RMN. Da mesma maneira, o composto 1 em tampão TEAA (pH 7,5) foi tratado, a 4°C, com um excesso de aldeídos em metanol para 16
ΕΡ 1 290 006 /PT dar os compostos 16a e 16b. A estrutura dos derivados trifosfatos foi confirmada por espectrometria de massa. Juntou-se ao composto 1 em 0,2 ml de TEAA 0,1M, um aldeído (25 μΐ em 0,1 ml de metanol). Após 2 horas, a solução foi concentrada e purificada por HPLC a λ=230 nm (0 a 25% de acetonitrilo em TEAA 10 mM) . As fracções contendo o produto puro foram liofilizadas e passadas através de uma coluna permutadora de catiões (Dowex) par dar os trifosfatos sob a forma de sais de sódio.
Exemplo 3: Incorporação dos análogos dX0TP e dXiTP nos ácidos nucleicos.
Os análogos (dX0TP, dXiTP (a) e dXiTP (b)) foram submetidos a experiências de alongamento de iniciadores catalisadas pelo fragmento de Klenow exo-. Um iniciador foi marcado na sua o n extremidade 5' por reacção de um [γ- P]ATP utilizando a polinucleótido-quinase de T4. As matrizes apropriadas e os iniciadores marcados foram incubados a 75°C durante 15 minutos, depois foram arrefecidos lentamente até à temperatura ambiente durante 1 hora. Em diferentes misturas reaccionais, realizou-se o alongamento do iniciador com uma ADN-polimerase em presença dos dXiTP dados. As amostras foram em seguida desnaturadas e depois carregadas sobre um gel de poliacrilamida (20% de ureia 7M) . Após electroforese, os géis foram visualizados por autorradiografia ou com o auxílio de um Phosporimager™.
Referencias
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Lisboa,
Claims (39)
- ΕΡ 1 290 006 /PT 1/9 REIVINDICAÇÕES 1. Compostos de fórmula geral I: R1-0-H2C[A R2 R2' R3* R3 na qual: o grupo Rl representa um grupo escolhido entre os grupos fosfato, difosfato ou trifosfato e os grupos protectores como DMT. R2 e R2' são escolhidos, independentemente um do outro, entre H, OH, fosforamidito e seus derivados, o H-fosfonato e um terminal do alongamento T, R3 é escolhido entre H, OH, os halogéneos (F, Br, Cl, I), um grupo alquilo linear ou ramificado com 1 a 6 átomos de carbono e um grupo 0-R5, onde R5 representa um grupo alquilo linear ou ramificado com 1 a 6 átomos de carbono, R3' é escolhido entre OH, os halogéneos (F, Cl, Br, I), um grupo alquilo linear ou ramificado com 1 a 6 átomos de carbono e um grupo 0-R5, onde R5 representa um grupo alquilo linear ou ramificado com 1 a 6 átomos de carbono, R4 representa um heterociclo substituído por um grupo de fórmulaY. onde o dito grupo está ligado ao heterociclo, quer directamente, quer por intermédio de um braço espaçador E constituído por uma cadeia carbonada de 1 a 20 átomos saturada ou não, compreendendo ou não heteroátomos e/ou eventualmente substituída; onde o dito heterociclo é escolhido entre: sendo R4 escolhido entre: ΕΡ 1 290 006 /PT 2/9 a) os heterociclos substituídos com 5 átomos, de fórmula:na qual E é um braço espaçador, como foi anteriormente definido, ou que não existe, na qual X representa, independentemente uns dos outros: - um grupo CH, - um grupo C-R6, onde R6 é escolhido entre os halogéneos (F, Br, Cl, I), um grupo alquilo linear ou ramificado, com 1 a 6 átomos de carbono, - um grupo 0-R7 ou S-R7, onde R7 representa um hidrogénio ou um grupo alquilo linear ou ramificado com 1 a 6 átomos de carbono, ou - N, sendo os heterociclos então escolhidos entre os seguintes:Pirazolo imidazolo tetrazolo 1 sendo R4 de preferênciaA N Y1 b) os ciclos de 6 átomos, nomeadamente as pirimidinas de fórmula:na qual E é um braço espaçador, como anteriormente definido ou que não existe, ΕΡ 1 290 006 /PT 3/9 c) os análogos de purinas de fórmula: ONH compostos C Y1 na qual: - E é um braço espaçador, como acima definido ou não existe, - Yl representa nh2 (designado pelo sintão Xo) ou um grupo:/Zi XZ2 sintão x2 - Y2 e Y3 são escolhidos, independentemente um do outro, entre H, OH, O, nh2, os halogéneos (F, Br, Cl, I), SCH3, SH uma função amida ligada pelo átomo de azoto ou um alcoxi linear ou ramificado com 1 a 6 átomos de carbono, - Zl e Z2 são escolhidos, independentemente um do outro, entre H e um grupo orgânico.
- 2. Compostos de acordo com a reivindicação 1 caracterizados por o grupo Rl ser um grupo trifosfato.
- 3. Compostos de acordo com uma das reivindicações 1 a 2 caracterizados por pelo menos um dos grupos R2 e R2' representar um grupo OH.
- 4. Compostos de acordo com uma das reivindicações 1 a 3 caracterizados por T ser escolhido de preferência entre F, Br, Cl, I, N3, e um grupo alquilo linear ou ramificado com 1 a 6 átomos de carbono.
- 5. Compostos de acordo com uma das reivindicações 1 a 4 caracterizados por Yl ser nh2 correspondendo aos sintões de fórmula geral II (sintão Xo): ΕΡ 1 290 006 /PT 4/9 Ο R1-0-H2I! nos quais Rl, R2, R2', R3, R3' e E correspondem aos grupos da fórmula I.
- 6. Compostos de acordo com uma das reivindicações 1 a 4 caracterizados por Yl representar um grupo escolhido entre o grupo:em que Z1 e Z2 representam, independentemente um do outro, um hidrogénio ou um grupo orgânico (sintões Xi e ΧχΤΡ).
- 7. Compostos de acordo com uma das reivindicações 1 a 4 caracterizados por Yl representar um grupo escolhido entre o grupo: /Z1 NH-ChL em que Zl e Z2 representam, independentemente um do outro, um hidrogénio ou um grupo orgânico (sintões X2 e X2TP) .
- 8. Compostos de acordo com uma das reivindicações 6 e 7 caracterizados por pelo menos um dos grupos Zl e Z2 ser escolhido entre os grupos aromáticos, nomeadamente entre os grupos de fórmula:ΕΡ 1 290 006 /PT 5/9
- 9. Compostos de acordo com uma das reivindicações 6 e 7 caracterizados por pelo menos um dos grupos Zl e Z2 ser escolhido entre os grupos tiol, alquilo, carbonilo, amina, álcool, arilo e aminoácido.
- 10. Compostos de acordo com uma das reivindicações 6 e 7 caracterizados por Zl ou Z2 formarem um ciclo com Y3.
- 11. Compostos de acordo com uma das reivindicações 6 e 7 caracterizados por Zl ou Z2 compreenderem um marcador fluorescente ou fosforescente, nomeadamente a fluorescamina.
- 12. Utilização de um composto de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11 como substrato de uma polimerase, de uma transcritase inversa e/ou de uma nucleótido-quinase.
- 13. Utilização de um composto de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11 para formar emparelhamentos com as bases naturais.
- 14. Utilização de um composto de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11 para inibir uma polimerase, nomeadamente uma transcritase inversa de retrovirus e/ou uma quinase.
- 15. Processo de preparação de compostos de fórmula geral II de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por compreender as etapas seguintes: a) preparação do nucleósido tendo por heterociclo um heterociclo imidazolo de fórmula:na qual X representam, independentemente uns dos outros, um grupo CH, C-R6 ou N, sendo R6 escolhido entre os halogéneos (F, Br, Cl, I), um grupo alquilo linear ou ramificado com 1 a 6 átomos de carbono e um grupo 0-R7 ou S-R7, onde R7 representa um hidrogénio ou um grupo alquilo linear ou ramificado, com 1 a 6 átomos de carbono, ΕΡ 1 290 006 /PT 6/9 b) protecção do álcool em 5' e transformação da função éster etílico na função carbo-hidrazida por acção da hidrazina, c) protecção da função amina do grupo carbo-hidrazida por um grupo protector como o grupo benziloxicarbonilo, acetilação do álcool em 3', d) fosforilação após desprotecção do álcool em 5', e) e hidrogenólise do grupo benziloxicarbonilo.
- 16. Processo de preparação de acordo com a reivindicação 15 caracterizado por a etapa a) ser realizada por meio de uma N-transdesoxirribosilase.
- 17. Processo de preparação de acordo com uma das reivindicações 15 e 16 caracterizado por a etapa d) consistir na fosforilação do nucleósido pelo cianoetilfosfato em presença da diciclo-hexilcarbodiimida; libertação concomitante em meio básico do álcool 3' e do grupo cianoetilo do 5'-fosfato; depois condensação do pirofosfato com 5'-fosfato activado sob a forma de morfolidato.
- 18. Processo de preparação de um composto de fórmula geral I de acordo com uma das reivindicações 6 a 11 caracterizado por um composto de fórmula geral II de acordo com a reivindicação 5 ser condensado com um aldeído ou uma cetona.
- 19. Processo de acordo com a reivindicação 18 caracterizado por se fazer reagir um ou mais compostos de fórmula geral II de acordo com a reivindicação 5, com uma biblioteca de aldeídos e/ou de cetonas, seguindo-se eventualmente uma redução.
- 20. Processo de identificação de compostos capazes de introduzir uma mutação num ácido nucleico compreendendo as etapas que consistem em: i) incorporar num oligonucleótido sintético um composto de acordo com a reivindicação 1 na qual Y1 é um grupo NH2, ii) fazer reagir o referido composto de acordo com o processo de acordo com a reivindicação 18 ou 19, seguindo-se eventualmente uma redução, iii) replicar o dito nucleótido por meio de uma polimerase e determinar se foi introduzida uma mutação na cadeia sintetizada de novo. ΕΡ 1 290 006 /PT 7/9
- 21. Processo de mutação pontual de um ácido nucleico caracterizado por: i) se preparar um oligonucleótido sintético compreendendo pelo menos um composto de acordo com as reivindicações 1 a 11, ii) se replicar o referido oligonucleótido por meio de uma polimerase.
- 22. Processo de mutação aleatória de um ácido nucleico compreendendo as etapas que consistem em utilizar uma mistura reaccional que compreende pelo menos um composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 11, para amplificação de um ácido nucleico.
- 23. Processo de acordo com uma das reivindicações 20 a 22 caracterizado por se utilizar uma ADN-polimerase exo-.
- 24. Processo de identificação de um composto capaz de inibir um enzima escolhida entre uma polimerase nomeadamente uma transcritase inversa e uma quinase, caracterizado por se testar a actividade da referida enzima em presença de pelo menos um composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 11.
- 25. Processo de identificação de um composto capaz de inibir uma transcritase inversa de um retrovírus, caracterizado por se testar o efeito de pelo menos um composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 11 sobre células infectadas por um retrovírus, encontrando-se o referido composto sob a forma de um análogo de nucleósido.
- 26. Processo de acordo com uma das reivindicações 21 a 25 caracterizado por se utilizar uma biblioteca de compostos de fórmula geral I de acordo com uma das reivindicações 1 a 11 susceptível de ser obtida a partir do processo de acordo com a reivindicação 19.
- 27. Ácido nucleico que contém pelo menos um composto de acordo com as reivindicações 1 a 11.
- 28. Utilização de um composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 11 num processo de mutagénese aleatória. ΕΡ 1 290 006 /PT 8/9
- 29. Utilização de um composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 11 como base ambígua.
- 30. Utilização de um composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 11 num iniciador ou numa sonda para amplificação e/ou detecção de um ácido nucleico alvo.
- 31. Utilização de acordo com a reivindicação 30 caracterizada por o referido composto estar marcado.
- 32. Kit para amplificação e/ou detecção de um ácido nucleico alvo compreendendo um composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 11 ou um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 27.
- 33. Utilização de um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 27 para o fabrico de um medicamento.
- 34. Utilização de acordo com a reivindicação 33 caracterizada por o referido ácido nucleico ser utilizado como ribozima.
- 35. Utilização de acordo com a reivindicação 33 caracterizada por o referido ácido nucleico ser utilizado como anti-sentido.
- 36. Utilização de um composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 5 onde Yl é NH2, como sintão de partida para a preparação de uma biblioteca de análogos de nucleótidos e/ou de nucleósidos.
- 37. Utilização de um composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 11 para o fabrico de um medicamento.
- 38. Utilização de um composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 11 para o fabrico de um medicamento destinado ao tratamento de infecções retrovirais. ΕΡ 1 290 006 /PT 9/9
- 39. Utilização de um composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 11 para o fabrico de um medicamento destinado ao tratamento do cancro. Lisboa,
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