CN111836823B - β修饰磷酸化合物前体、β修饰磷酸化合物、反应阻碍剂和包含这些化合物的医药品以及反应阻碍方法 - Google Patents

β修饰磷酸化合物前体、β修饰磷酸化合物、反应阻碍剂和包含这些化合物的医药品以及反应阻碍方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种式β修饰磷酸化合物前体，在分子内含有用式1A表示的部分结构，以及一种含有该β修饰磷酸化合物前体的反应阻碍剂以及医药品。
Figure DDA0002668909660000011
(其中，A1表示－SR1、－S－S－R1、－SeR1或－X(其中，X是指从氟、氯、溴以及碘中选择的卤素)，R1是氢、碳数1～20的烷基等。L1表示氢、碳数1～20的烷基等，L2表示碳数1～20的烷基等。L1与L2可以相互连接形成4～6元的环结构。L1以及L2可以分别具有取代基。＊是受到磷酸化而与磷酸基键合的键)。

Description

β修饰磷酸化合物前体、β修饰磷酸化合物、反应阻碍剂和包含 这些化合物的医药品以及反应阻碍方法
技术领域
本发明涉及一种β修饰磷酸化合物前体、β修饰磷酸化合物、反应阻碍剂和包含这些化合物的医药品，以及一种反应阻碍方法，特别地，涉及一种在伴随磷酸化的反应中阻碍磷酸化后的反应的进行的β修饰磷酸化合物前体、β修饰磷酸化合物、反应阻碍剂和包含这些化合物的医药品以及反应阻碍方法。
背景技术
磷酸化，是生物体反应的重要过程，在生物体内进行着伴随磷酸化的各种各样的反应。例如，在DNA的复制中，DNA聚合酶进行着与DNA的磷酸化伴随的反应。DNA聚合酶，以引物序列为起点，以单链DNA为模板，通过将与其互补的脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)依次键合在3’末端侧，从而在3’→5’方向上延伸互补链DNA。在该反应中，在DNA聚合酶的作用下，dNTP的三磷酸的2个磷酸基被脱磷酸化而残留的1个磷酸基键合于3’末端侧的糖(脱氧核糖)的3位氢氧基(羟基)。其结果是，3’末端侧的糖被磷酸化，互补链DNA伸长。聚合酶，参与DNA的复制、转录，并且在治疗癌症、病毒等引起的疾病的药物中是重要的靶蛋白质。
另外，甲羟戊酸，是参与类萜、类固醇的合成的化合物。甲羟戊酸，以ATP为底物被甲羟戊酸激酶磷酸化而成为5－磷酸甲羟戊酸，通过之后的过程转化成胆固醇等。已知甲羟戊酸是高脂血症等的治疗药中的重要的靶物质。
像这样，在生物体反应中磷酸化是重要的过程，如果能够特异性地且高效地阻碍磷酸化之后的反应，那么隐藏有提供各种疾病的治疗方法的可能性。然而，在现有的技术中，选择性地且高效地阻碍由磷酸化反应引起的生物体反应，仍然不充分。
例如，在专利文献1中公开了作为DNA聚合酶的阻碍剂的阿昔洛韦。阿昔洛韦，受到病毒的一磷酸化和宿主(人类)的三磷酸化，在DNA聚合酶反应中，键合于伸长链的3’末端侧，从而与病毒DNA聚合酶进行拮抗阻碍。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平09－136842号公报(权利要求1等)
发明内容
发明要解决的技术问题
然而，阿昔洛韦之类的化合物，不过是阻碍DNA的伸长而已，需要更高效且强烈地阻碍反应的阻碍剂。
本发明的目的在于，提供一种在伴随磷酸化的反应中能够特异性地阻碍磷酸化后的反应的进行的β修饰磷酸化合物前体、β修饰磷酸化合物、反应阻碍剂和含有这些化合物的医药品以及一种反应阻碍方法。
解决技术问题的方法
本发明者为了解决上述技术问题反复深入研究。结果发现，对于具有羟基键合在碳―碳键中的一个碳(α位)上，并且特定的修饰基键合在另一个碳(β位)上的部分结构的化合物，起因于于羟基被磷酸化而会生成具有高反应性的活性种。进一步发现，通过该活性种，可特异性地阻碍磷酸化后的生物体分子的反应，从而完成本发明。
即，本发明，是一种可被磷酸化反应所磷酸化的β修饰磷酸化合物前体，其特征在于，在分子内具有下式1A所示的部分结构。
Figure GDA0002668909730000021
(其中，A1表示－SR1、－S－S－R1、－SeR1或－X(其中，X是指从氟、氯、溴、以及碘中选择的卤素)，R1表示氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基。L1表示氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基，L2表示碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基。L1与L2可以相互连接形成4～6元的环结构，环结构由从碳、氮、氧以及硫中选择的1种以上的元素构成。
L1以及L2，分别可以具有从羟基、羧基、氨基、烷基、芳基、含有1个以上的碳数15～30的饱和脂肪酸和/或不饱和脂肪酸的磷脂质、单磷酸基、二磷酸基、三磷酸基、以及碱基(其中，碱基是指腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、N－甲基腺嘌呤、N－苯甲酰腺嘌呤、2－甲基硫代腺嘌呤、2－氨基腺嘌呤、7－甲基鸟嘌呤、N－异丁酰鸟嘌呤、5－氟胞嘧啶、5－溴胞嘧啶、5－甲基胞嘧啶、4－N－甲基胞嘧啶、4－N,N－二甲基胞嘧啶、5－氟尿嘧啶、5－溴尿嘧啶、5－氯尿嘧啶或者5,6－二氢尿嘧啶)中选择的1个或2个以上的取代基。＊是受到磷酸化而与磷酸基键合的键，在磷酸化前与氢或除磷酸基以外的取代基键合。)
在这种情况下，优选为用下式2A表示的核苷衍生物或者在3’末端具有该核苷衍生物的核酸。
Figure GDA0002668909730000022
(其中，A1表示－SR1、－S－S－R1、－SeR1或－X(其中，X是指从氟、氯、溴、碘中选择的卤素)，R1表示氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基。L3是氢，或者是用下式2D表示的单磷酸基、二磷酸基或三磷酸基。
Figure GDA0002668909730000031
(其中，n表示1～3的整数。Z1是羟基，或者是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸和脯氨酸中的任一者的甲酯、乙酯、异丙酯、正丁酯、苄酯或苯基酯。Z2是氢、碳数1～4的烷基、卤素或苯基。在n为2以上的情况下，各个Z1可相同或不同。)
B是从腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、N－甲基腺嘌呤、N－苯甲酰腺嘌呤、2－甲基硫代腺嘌呤、2－氨基腺嘌呤、7－甲基鸟嘌呤、N－异丁酰鸟嘌呤、5－氟胞嘧啶、5－溴胞嘧啶、5－甲基胞嘧啶、4－N－甲基胞嘧啶、4－N,N－二甲基胞嘧啶、5－氟尿嘧啶、5－溴尿嘧啶、5－氯尿嘧啶以及5,6－二氢尿嘧啶中选择的碱基。＊是指受到磷酸化而与磷酸基键合的键，在磷酸化前与氢或除磷酸基以外的取代基键合。)
或者，在上述的情况下，优选为用下式3A表示的甲羟戊酸衍生物。
Figure GDA0002668909730000032
(其中，A1表示－SR1、－S－S－R1、－SeR1或－X(其中，X是指从氟、氯、溴、碘中选择的卤素)，R1是氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基。)
或者，在上述的情况下，是如权利要求1所述的β修饰磷酸化合物前体，其特征在于，是用下式4A表示的磷脂酰肌醇衍生物。
Figure GDA0002668909730000033
(其中，A1表示－SR1、－S－S－R1、－SeR1或－X(其中，X是指从氟、氯、溴、碘中选择的卤素)，R1表示氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或者碳数1～20的烯基。R3是从花生四烯酸、亚油酸以及亚麻酸中选择的不饱和脂肪酸，R4是从硬脂酸、棕榈酸中选择的饱和脂肪酸。)
本发明的β修饰磷酸化合物的特征在于，在分子内具有用下式1B表示的部分结构。
Figure GDA0002668909730000041
(其中，A1表示－SR1、－S－S－R1、－SeR1或－X(其中，X是指从氟、氯、溴以及碘中选择的卤素)，R1从氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基、碳数1～20的烯基中选择。L1表示氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基，L2表示碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基。L1与L2可以相互连接形成4～6元的环结构，环结构由从碳、氮、氧以及硫中选择的1种以上的元素构成。L1以及L2，可以分别具有从羟基、羧基、氨基、烷基、芳基、包含1个以上的碳数15～30的饱和脂肪酸和/或不饱和脂肪酸的磷脂质、单磷酸基、二磷酸基、三磷酸基以及碱基(其中，碱基是指腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、N－甲基腺嘌呤、N－苯甲酰腺嘌呤、2－甲基硫代腺嘌呤、2－氨基腺嘌呤、7－甲基鸟嘌呤、N－异丁酰鸟嘌呤、5－氟胞嘧啶、5－溴胞嘧啶、5－甲基胞嘧啶、4－N－甲基胞嘧啶、4－N,N－二甲基胞嘧啶、5－氟尿嘧啶、5－溴尿嘧啶、5－氯尿嘧啶或5,6－二氢尿嘧啶)中选择的1个或2个以上的取代基。)
在这种情况下，优选为用下式2B表示的核苷衍生物或者在3’末端具有该核苷衍生物的核酸。
Figure GDA0002668909730000042
(其中，A1表示－SR1、－S－S－R1、－SeR1或－X(其中，X是指从氟、氯、溴、碘中选择的卤素)，R1表示氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基。L3是氢，或者是用下式2D表示的单磷酸基、二磷酸基或三磷酸基。
Figure GDA0002668909730000051
(其中，n表示1～3的整数。Z1是羟基，或者是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸和脯氨酸中的任一者的甲酯、乙酯、异丙酯、正丁酯、苄酯或苯基酯。Z2是氢、碳数1～4的烷基、卤素或苯基。在n为2以上的情况下，各个Z1可相同或不同。)
B是从腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、N－甲基腺嘌呤、N－苯甲酰腺嘌呤、2－甲基硫代腺嘌呤、2－氨基腺嘌呤、7－甲基鸟嘌呤、N－异丁酰鸟嘌呤、5－氟胞嘧啶、5－溴胞嘧啶、5－甲基胞嘧啶、4－N－甲基胞嘧啶、4－N,N－二甲基胞嘧啶、5－氟尿嘧啶、5－溴尿嘧啶、5－氯尿嘧啶以及5,6－二氢尿嘧啶中选择的碱基。)
本发明是一种在伴随着磷酸化的反应中阻碍磷酸化后的反应的进行的反应阻碍剂，其特征在于，含有上述任一项所述的β修饰磷酸化合物前体。
在这种情况下，β修饰磷酸化合物前体优选为用上述式2A表示的核苷衍生物或者在3’末端具有该核苷衍生物的核酸，以阻碍DNA聚合酶的反应。
另外，本发明是一种医药品，其特征在于含有上述的反应阻碍剂。
本发明是一种反应阻碍方法，其特征在于，通过上述任一项所述的反应阻碍剂在伴随磷酸化的反应中阻碍磷酸化后的反应的进行的，所述方法包括：准备如上述式1A所述的β修饰磷酸化合物前体的步骤；将所述β修饰磷酸化合物前体进行磷酸化并生成如上述式1B所述的β修饰磷酸化合物，并且使得所述β修饰磷酸化合物部分开裂而形成用下式1C表示的活性种的步骤。
Figure GDA0002668909730000052
(其中，A2表示－S－、－S+(R1)－、－S+(S－R1)－、－Se+(R1)－或－X+－(其中，X是指从氟、氯、溴以及碘中选择的卤素)，R1是氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基。L1表示氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基，L2表示碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基。L1与L2可以相互连接形成4～6元的环结构，环结构由从碳、氮、氧以及硫中选择的1种以上的元素构成。L1以及L2，可以分别具有从羟基、羧基、氨基、烷基、芳基、包含1个以上的碳数15～30的饱和脂肪酸和/或不饱和脂肪酸的磷脂质、单磷酸基、二磷酸基、三磷酸基以及碱基(其中，碱基是指腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、N－甲基腺嘌呤、N－苯甲酰腺嘌呤、2－甲基硫代腺嘌呤、2－氨基腺嘌呤、7－甲基鸟嘌呤、N－异丁酰鸟嘌呤、5－氟胞嘧啶、5－溴胞嘧啶、5－甲基胞嘧啶、4－N－甲基胞嘧啶、4－N,N－二甲基胞嘧啶、5－氟尿嘧啶、5－溴尿嘧啶、5－氯尿嘧啶或5,6－二氢尿嘧啶)中选择的1个或2个以上的取代基。)
在这种情况下，所述β修饰磷酸化合物前体优选是用上述式2A表示的化合物，所述β修饰磷酸化合物优选是用上述式2B表示的化合物，所述活性种优选是用下式2C表示的化合物。
Figure GDA0002668909730000061
(其中，A2表示－S－、－S+(R1)－、－S+(S－R1)－、－Se+(R1)－或－X+－(其中，X是指从氟、氯、溴以及碘中选择的卤素)，R1是氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基。L3是氢，或者是用下式2D表示的单磷酸基、二磷酸基或三磷酸基。
Figure GDA0002668909730000062
(其中，n表示1～3的整数。Z1是羟基，或者是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸和脯氨酸中的任一者的甲酯、乙酯、异丙酯、正丁酯、苄酯或苯基酯。Z2是氢、碳数1～4的烷基、卤素或苯基。在n为2以上的情况下，各个Z1可相同或不同。)
B是从腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、N－甲基腺嘌呤、N－苯甲酰腺嘌呤、2－甲基硫代腺嘌呤、2－氨基腺嘌呤、7－甲基鸟嘌呤、N－异丁酰鸟嘌呤、5－氟胞嘧啶、5－溴胞嘧啶、5－甲基胞嘧啶、4－N－甲基胞嘧啶、4－N,N－二甲基胞嘧啶、5－氟尿嘧啶、5－溴尿嘧啶、5－氯尿嘧啶或5,6－二氢尿嘧啶中选择的碱基。)
发明的效果
根据本发明，能够提供一种通过反应性高的活性种从而能够在伴随磷酸化的反应中阻碍磷酸化后的反应的进行的β修饰磷酸化合物前体、β修饰磷酸化合物、反应阻碍剂和含有这些化合物的医药品以及一种反应阻碍方法。
附图说明
图1是示出β修饰磷酸化合物前体的反应阻碍结构的说明图。
图2是示出实施例中的磷酸部分的切断实验的结果的NMR频谱图。
图3是示出实施例中的B型肝炎病毒的繁殖抑制效果的图表。
图4是示出实施例中的不可逆阻碍实验的结果的图表。
图5是示出实施例中的抗HBV活性评价的结果的图表。
具体实施方式
1.部分结构
(1)β修饰磷酸化合物前体
以下，对本发明的β修饰磷酸化合物前体进行说明。本发明的β修饰磷酸化合物前体，是能够通过磷酸化反应而被磷酸化的β修饰磷酸化合物前体，在分子内具有下式1A的部分结构。
Figure GDA0002668909730000071
(其中，A1表示－SR1、－S－S－R1、－SeR1或－X(其中，X是指从氟、氯、溴以及碘中选择的卤素)，R1是氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基。L1表示氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或者碳数1～20的烯基，L2表示碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或者碳数1～20的烯基。L1与L2可以相互连接形成4～6元的环结构，环结构由从碳、氮、氧以及硫中选择的1种以上的元素构成。L1以及L2，可以分别具有从羟基、羧基、氨基、烷基、芳基、包含1个以上的碳数15～30的饱和脂肪酸和/或不饱和脂肪酸的磷脂质、单磷酸基、二磷酸基、三磷酸基以及碱基(其中，碱基是指腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、N－甲基腺嘌呤、N－苯甲酰腺嘌呤、2－甲基硫代腺嘌呤、2－氨基腺嘌呤、7－甲基鸟嘌呤、N－异丁酰鸟嘌呤、5－氟胞嘧啶、5－溴胞嘧啶、5－甲基胞嘧啶、4－N－甲基胞嘧啶、4－N,N－二甲基胞嘧啶、5－氟尿嘧啶、5－溴尿嘧啶、5－氯尿嘧啶或5,6－二氢尿嘧啶)中选择的1个或2个以上的取代基。＊是指受到磷酸化而与磷酸基键合的键，在磷酸化前与氢或除磷酸基以外的取代基键合。)
其中，R1优选从氢、碳数1～10的烷基、碳数1～10的芳基、碳数1～10的烯基中选择，特别优选从氢、碳数1～6的烷基、碳数1～6的芳基、碳数1～6的烯基中选择。
作为碳数1～10的烷基，可列举甲基、乙基、丙基、异丙基、2－丙烯基、丁基、戊基、己基、2－乙基己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。作为碳数1～10的芳基，能够列举苯基、邻甲苯基、对甲苯基、2,3－二甲基苯基、2,4－二甲基苯基、2,5－二甲基苯基、2,6－二甲基苯基、三甲苯基、邻枯烯基等。作为碳数1～6的烯基，能够列举乙烯基、1－丙烯基、2－丙烯基、1－己烯基等。在下文的说明中同样如此。
另外，L1、L2可以彼此相同或不同，分别优选从氢、碳数1～10的烷基、碳数1～10的芳基以及碳数1～10的烯基中选择，特别优选从氢、碳数1～6的烷基、碳数1～6的芳基、碳数1～6的烯基中选择。
在L1与L2相互连接形成环结构的情况下，能够列举环己烷、苯、五单糖、六单糖等。L1以及L2，分别可以具有取代基，取代基可以从羟基、羧基、氨基、烷基、芳基、含有1个以上的碳数15～30的饱和脂肪酸和/或不饱和脂肪酸的磷脂质以及碱基中选择。例如，在L1以及L2为核糖或脱氧核糖的情况下，如果碱基作为取代基键合在1’位，则会成为核苷衍生物。
作为碱基，可以是天然的核酸碱基，也可以是非天然的(合成的)核酸碱基。作为天然的核酸碱基，能够列举腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶。作为非天然的核酸碱基，能够列举：N－甲基腺嘌呤、N－苯甲酰腺嘌呤、2－甲基硫代腺嘌呤、2－氨基腺嘌呤、7－甲基鸟嘌呤、N－异丁酰鸟嘌呤、5－氟胞嘧啶、5－溴胞嘧啶、5－甲基胞嘧啶、4－N－甲基胞嘧啶、4－N,N－二甲基胞嘧啶、5－氟尿嘧啶、5－溴尿嘧啶、5－氯尿嘧啶、5,6－二氢尿嘧啶等。
＊是指键，在磷酸化前与氢或除磷酸基以外的取代基进行键合。在磷酸化前，特别优选与氢键合(即，＊－O是羟基)。
用上式1A表示的β修饰磷酸化合物前体是，在被磷酸化的化合物中，相对于与会被磷酸化的氧键合的α位的碳，相邻的β位的碳被上述A1进行了修饰的化合物。磷酸化，可以是生物体内的反应和生物体外的反应中的任一种，但是作为医药品用途的β修饰磷酸化合物前体，优选是在生物体内被磷酸化的生物体化合物的类似体。作为在生物体内被磷酸化的生物体化合物，可列举如下文所述的核苷、核苷酸、核酸等基因相关物质，以及下文所述的甲羟戊酸、肌醇磷酸等代谢相关物质等。
(2)β修饰磷酸化合物
接着，对β修饰磷酸化合物进行说明。本发明的β修饰磷酸化合物，是在式1A的β修饰磷酸化合物前体中，与α位的碳键合的氧被磷酸化得到的化合物。具体地，是具有用下式1B表示的部分结构的β修饰磷酸化合物。
Figure GDA0002668909730000081
(其中，A1表示－SR1、－S－S－R1、－SeR1或－X(其中，X是指从氟、氯、溴以及碘中选择的卤素)，R1从氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基、碳数1～20的烯基中选择。L1表示氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基，L2表示碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基。L1与L2可以相互连接形成4～6元的环结构，环结构由从碳、氮、氧以及硫中选择的1种以上的元素构成。L1以及L2，可以分别具有从羟基、羧基、氨基、烷基、芳基、包含1个以上的碳数15～30的饱和脂肪酸和/或不饱和脂肪酸的磷脂质、单磷酸基、二磷酸基、三磷酸基以及碱基(其中，碱基是指腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、N－甲基腺嘌呤、N－苯甲酰腺嘌呤、2－甲基硫代腺嘌呤、2－氨基腺嘌呤、7－甲基鸟嘌呤、N－异丁酰鸟嘌呤、5－氟胞嘧啶、5－溴胞嘧啶、5－甲基胞嘧啶、4－N－甲基胞嘧啶、4－N,N－二甲基胞嘧啶、5－氟尿嘧啶、5－溴尿嘧啶、5－氯尿嘧啶或5,6－二氢尿嘧啶)中选择的1个或2个以上的取代基。)
(3)反应阻碍剂以及反应阻碍方法
接着，对反应阻碍剂以及反应阻碍方法进行说明。本发明的反应阻碍剂，是在伴随磷酸化的反应中阻碍磷酸化后的反应的进行的反应阻碍剂，其含有在分子内具有用上述式1A表示的部分结构的β修饰磷酸化合物前体。并且，上述式1A的β修饰磷酸化化合物前体被磷酸化而生成上述式1B的β修饰磷酸化化合物。该β修饰磷酸化化合物，通过以下的反应机理，阻碍磷酸化后的反应。
以下，对本发明的反应阻碍方法(反应机理)进行说明。在使用上述的反应阻碍剂的反应阻碍方法中，首先，准备在分子内具有用上述式1A表示的部分结构的β修饰磷酸化合物前体(步骤1)。
接着，将该β修饰磷酸化合物前体磷酸化，生成在分子内具有用式1B表示的部分结构的β修饰磷酸化合物(步骤2)。此时生成的式1B的化合物，结构不稳定，部分开裂而生成用下式1C表示的活性种。
Figure GDA0002668909730000091
(其中，A2表示－S－、－S+R1－、－S+－S－R1－、－Se+R1－或－X+－(其中，X是指从氟、氯、溴以及碘中选择的卤素)，R1是氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基。L1表示氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基，L2表示碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基。L1与L2可以相互连接形成4～6元的环结构，环结构由从碳、氮、氧以及硫中选择的1种以上的元素构成。L1以及L2，可以分别具有从羟基、羧基、氨基、烷基、芳基、包含1个以上的碳数15～30的饱和脂肪酸和/或不饱和脂肪酸的磷脂质、单磷酸基、二磷酸基、三磷酸基以及碱基(其中，碱基是指腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、N－甲基腺嘌呤、N－苯甲酰腺嘌呤、2－甲基硫代腺嘌呤、2－氨基腺嘌呤、7－甲基鸟嘌呤、N－异丁酰鸟嘌呤、5－氟胞嘧啶、5－溴胞嘧啶、5－甲基胞嘧啶、4－N－甲基胞嘧啶、4－N,N－二甲基胞嘧啶、5－氟尿嘧啶、5－溴尿嘧啶、5－氯尿嘧啶或5,6－二氢尿嘧啶)中选择的1个或2个以上的取代基。)
该活性种，反应性高，具有容易对其他的化合物进行亲核攻击而形成共价键的性质。例如在A2为－S－的情况下，α、β碳与硫原子在分子内形成环硫乙烷(thiirane)环。该环硫乙烷环，容易与氨基、硫醇基、羟基、咪唑基等官能团进行反应形成共价键，因此，在蛋白质中的分子内容易与赖氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、色氨酸等氨基酸的侧链的部分进行共价键合。可推测，由于活性种与蛋白质不可逆地进行共价键合，因而之后的反应停止进行，发挥了反应阻碍作用。
作为β修饰磷酸化合物前体所阻碍的反应，能够列举伴随着磷酸化的各种反应。特别地，能够高效地阻碍在生物体内的反应。与活性种键合的分子，不限于蛋白质，能够键合于各种分子而阻碍反应。
这样，在本发明中，通过使用β修饰磷酸化合物前体，通过磷酸化生成活性种并进行共价键合，能够不可逆地阻碍反应。另外，由于能够特定在被磷酸化的反应中阻碍反应，因此难以产生副作用。进一步，基于式1A的部分结构，还具有能够设计以特定的反应为靶的反应阻碍剂的化合物的优点。
(4)医药品
本发明的反应阻碍剂，如上所述阻碍磷酸化后的反应，因此可用作医药品、农药等药剂中的有效成分，特别优选用于医药品用途。作为医药品的种类，可列举：片剂、胶囊、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、凝胶剂、液剂等。
上述的药剂，除了本发明的反应阻碍剂以外，在不损害本发明的反应阻碍效果的范围内，还可以含有溶剂、赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、稳定剂、悬浊化剂等添加物。作为制药用溶剂，例如能够列举：水、乙醇、甘油等。作为赋形剂，例如可列举：乳糖，白糖、葡萄糖，甘露糖醇，山梨糖醇，玉米淀粉，马铃薯淀粉，α－淀粉，糊精，羧甲基淀粉，结晶纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素，羧甲基纤维素钙，阿拉伯树胶，葡聚糖，普鲁兰多糖，轻质无水硅酸、合成硅酸铝、偏硅酸铝酸镁之类的硅酸盐类；磷酸钙，碳酸钙，硫酸钙等。作为结合剂，例如能够列举：明胶，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇等。作为崩解剂，例如能够列举：交联羧甲基纤维素钠，羧甲基淀粉钠，交联聚乙烯吡咯烷酮等。作为润滑剂，例如能够列举：滑石，硬脂酸，硬脂酸钙，硬脂酸镁，胶体二氧化硅，蜂胶，蜂蜡，鲸蜡，硼酸，甘醇，富马酸，己二酸，苯甲酸钠，硫酸钠，亮氨酸，月桂基硫酸钠，月桂基硫酸镁，硅酸酐，硅酸水合物等。作为稳定剂，例如能够列举：对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，氯丁醇，苯甲醇，苯乙醇，氯化苯甲烃铵，苯酚，甲酚，硫柳汞，醋酸酐，山梨酸等。作为悬浊化剂，例如能够列举：聚山梨酯80，羧甲基纤维素钠等。
(5)β修饰磷酸化合物前体的制造方法
接下来，对β修饰磷酸化合物前体的制造方法进行说明。式1A的β修饰磷酸化合物前体，能够通过下式的方案合成。具体地，将羟基等键合在β位的碳上的化合物用作起始物质，并在除了该羟基以外的羟基上键合保护基以进行保护。接着，将键合在β碳上的羟基用A1取代，最后使得保护基脱离，从而能够合成式1A的化合物。起始物质和保护基的种类、反应条件(浓度、温度等)等，因合成的β修饰磷酸化合物前体而异。
Figure GDA0002668909730000111
作为β修饰磷酸化合物前体，能够列举各种各样的具体的化合物。以下，对核苷衍生物、甲羟戊酸衍生物、磷脂酰肌醇衍生物分别进行详细说明。
2.核苷衍生物
(1)β修饰磷酸化合物前体
作为β修饰磷酸化合物前体，能够列举用下式2A表示的核苷衍生物。
Figure GDA0002668909730000112
(其中，A1表示－SR1、－S－S－R1、－SeR1或－X(其中，X是指从氟、氯、溴、碘中选择的卤素)，R1表示氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基。L3是氢，或者是用下式2D表示的单磷酸基、二磷酸基或三磷酸基。
Figure GDA0002668909730000113
(其中，n表示1～3的整数。Z1是羟基，或者是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸和脯氨酸中的任一者的甲酯、乙酯、异丙酯、正丁酯、苄酯或苯基酯。Z2是氢、碳数1～4的烷基、卤素或苯基。在n为2以上的情况下，各个Z1可相同或不同。)
(B是从腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、N－甲基腺嘌呤、N－苯甲酰腺嘌呤、2－甲基硫代腺嘌呤、2－氨基腺嘌呤、7－甲基鸟嘌呤、N－异丁酰鸟嘌呤、5－氟胞嘧啶、5－溴胞嘧啶、5－甲基胞嘧啶、4－N－甲基胞嘧啶、4－N,N－二甲基胞嘧啶、5－氟尿嘧啶、5－溴尿嘧啶、5－氯尿嘧啶以及5,6－二氢尿嘧啶中选择的碱基。＊是受到磷酸化而与磷酸基键合的键，在磷酸化前与氢或除磷酸基以外的取代基键合。)
这里，作为核苷衍生物，具体地，能够列举如下所示的化合物，但不限于此。
作为碱基为腺嘌呤的腺苷衍生物，能够示例出下式(2A－1A)～(2A－12A)的化合物。
Figure GDA0002668909730000121
作为碱基为鸟嘌呤的鸟苷衍生物，能够示例出下式(2A－1G)～(2A－12G)的化合物。
Figure GDA0002668909730000131
作为碱基为胞嘧啶的胞苷衍生物，能够示例出下式(2A－1C)～(2A－12C)的化合物。
Figure GDA0002668909730000141
作为碱基为胸腺嘧啶的胸苷衍生物，能够示例出下式(2A－1T)～(2A－12T)的化合物。
Figure GDA0002668909730000151
作为碱基为尿嘧啶的尿苷衍生物，能够示例出下式(2A－1U)～(2A－12U)的化合物。
Figure GDA0002668909730000161
本发明的核苷衍生物，包含核苷酸或其衍生物(在L3为单磷酸基、二磷酸基或三磷酸基，又或它们的衍生物的情况下)。作为核苷酸或其衍生物，能够列举L3为上述式2D的化合物。这里，在核苷衍生物为核苷酸的情况下，相当于在式2D中，Z1为羟基、Z2为氢的情况。另外，在核苷衍生物为核苷酸衍生物的情况下，相当于在式2D中，Z1为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸和脯氨酸中的任一者的甲酯、乙酯、异丙酯、正丁酯、苄酯或苯基酯，并且Z2为碳数1～4的烷基、卤素或苯基的情况。在这种情况下，Z1优选为：丙氨酸异丙酯，丙氨酸环己基酯，丙氨酸新戊酯，缬氨酸异丙酯，或者亮氨酸异丙酯。这些酯类，通过来自于甘氨酸等氨基酸的氮与磷键合。另外，Z2优选为苯基。
进一步，作为β修饰磷酸化合物前体，能够列举在3’末端具有上述式2A的核苷衍生物的核酸。这里，作为核酸，可以是脱氧核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)中的任一种，另外在为DNA的情况下可以是双链DNA、单链DNA中的任一种。核酸的构成单位数量，没有特别限制，通常在1～100碱基(在双链DNA的情况下为碱基对)的范围内，优选在1～50碱基(碱基对)的范围内，更优选在1～10碱基(碱基对)的范围内。
(2)β修饰磷酸化合物
作为用上述式2A表示的核苷衍生物受到磷酸化后的β修饰磷酸化合物，能够列举具有用下式2B表示的部分结构的β修饰磷酸化合物。
Figure GDA0002668909730000171
(其中，A1表示－SR1、－S－S－R1、－SeR1或－X(其中，X是指从氟、氯、溴、碘中选择的卤素)，R1表示氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基。L3是氢，或者是用上述式2D表示的单磷酸基、二磷酸基或三磷酸基。B是从腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、N－甲基腺嘌呤、N－苯甲酰腺嘌呤、2－甲基硫代腺嘌呤、2－氨基腺嘌呤、7－甲基鸟嘌呤、N－异丁酰鸟嘌呤、5－氟胞嘧啶、5－溴胞嘧啶、5－甲基胞嘧啶、4－N－甲基胞嘧啶、4－N,N－二甲基胞嘧啶、5－氟尿嘧啶、5－溴尿嘧啶、5－氯尿嘧啶或5,6－二氢尿嘧啶中选择的碱基。)
进一步，作为β修饰磷酸化合物，能够列举在3’末端具有上述式2B的核苷衍生物的核酸。这里，作为核酸，可以是脱氧核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)中的任一种，另外，在为DNA的情况下，可以是双链DNA、单链DNA中的任一种。核酸的构成单位数量，没有特别限制，通常在1～100碱基(在双链DNA的情况下为碱基对)的范围内，优选在1～50碱基(碱基对)的范围内，更优选在1～10碱基(碱基对)的范围内。
(3)反应阻碍剂以及反应阻碍方法
在β修饰磷酸化合物前体是用式2A表示的核苷衍生物，且β修饰磷酸化合物是用上述
式2B表示的核苷衍生物的情况下，作为中间体的活性种，生成了用下式2C表示的化合物。
Figure GDA0002668909730000172
(其中，A2表示－S－、－S+(R1)－、－S+(S－R1)－、－Se+(R1)－或－X+－(其中，X是指从氟、氯、溴以及碘中选择的卤素)，R1是氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基。L3是氢、单磷酸基、二磷酸基或三磷酸基。B是从腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、N－甲基腺嘌呤、N－苯甲酰腺嘌呤、2－甲基硫代腺嘌呤、2－氨基腺嘌呤、7－甲基鸟嘌呤、N－异丁酰鸟嘌呤、5－氟胞嘧啶、5－溴胞嘧啶、5－甲基胞嘧啶、4－N－甲基胞嘧啶、4－N,N－二甲基胞嘧啶、5－氟尿嘧啶、5－溴尿嘧啶、5－氯尿嘧啶以及5,6－二氢尿嘧啶中选择的碱基。)
在β修饰磷酸化合物为用式2A表示的核苷衍生物的情况下，尤其可高效地阻碍聚合酶反应。虽然聚合酶反应，包括DNA聚合酶和RNA聚合酶这两类，但是式2A的核苷衍生物尤其适合阻碍DNA聚合酶。以下，参照附图，对DNA聚合酶阻碍作用进行说明。
图1是式2A的核苷衍生物的一个例子，是示出A1为－SR1(硫代烷基)的情况下的DNA聚合酶阻碍作用的示意图。当将核苷衍生物给药至生物体内(细胞内)时，在激酶的作用下核苷衍生物的5’羟基被磷酸化，成为核苷三磷酸衍生物。其成为DNA聚合酶反应的底物，在DNA聚合酶的作用下键合在伸长中的单链DNA的3’末端侧。接着，在该核苷衍生物的3’羟基上键合下一个核苷的5’磷酸基(图的下段左侧)。在该状态的反应中间体中，在2’的硫代烷基的亲核攻击的作用下，3’的磷酸基脱离，并且2’位的碳、3’位的碳、硫代烷基的硫这三者形成环硫乙烷环(图的下段中央)。可推测，该环硫乙烷环的反应性高，并且与构成DNA聚合酶的特定的氨基酸的侧链进行反应并共价键合(图的下段右侧)。该反应是不可逆的，在此之后聚合酶反应不会进行。像这样，通过使用核苷衍生物，不同于使用现有的阿昔洛韦等的伸长阻碍反应，通过共价键合于聚合酶而阻碍反应的新颖的机理，能够高效地对反应进行阻碍。
为了阻碍聚合酶反应，首先，将式2A的核苷衍生物添加到作为靶的生物体试料(细胞、病毒等)中。核苷衍生物，溶解在缓冲液等合适的溶剂中进行添加。添加时的核苷衍生物的浓度，能够根据成为靶的反应的特性等进行适当设置。例如，在下文所述的B型肝炎病毒的情况下，核苷衍生物的浓度，通常在1μM～1mM的范围内，优选在10μM～500μM的范围内，特别优选在50～200μM的范围内。反应时间也能够适当设置，例如在B型肝炎病毒的情况下，通常在1～30天的范围内，更优选在5～10天的范围内。
通过β修饰磷酸化合物前体，在伴随着磷酸化的反应中，磷酸化之后的反应被阻碍。β修饰磷酸化合物前体的反应阻碍活性，能够通过对因磷酸化而生成的化合物(在聚合酶反应的情况下为DNA、RNA)，以及对细胞、病毒等生物体试料本身进行定量，由此进行评价。
(4)医药品
核苷衍生物，是聚合酶阻碍剂，可以阻碍DNA的复制和RNA的转录反应，因此可抑制细胞、病毒的繁殖等。因此，式2A所示的核苷衍生物，是繁殖阻碍剂，能够作为病毒性疾患、癌等的治疗药品发挥作用。
(5)核苷衍生物前体的制造方法
以下，对核苷衍生物的制造方法进行说明。具体的反应条件等，在下文所述的实施例中详细说明，因此在这里，对于若干个核苷衍生物，说明合成方法(制造方法)的概略。
(a)式(2A－1A)的化合物的合成(※A1为－SH的化合物)
按照下述的合成方案进行说明。在下文说明的合成方案中，数字表示化合物的编号。首先，将核苷(在下述方案中为腺苷)用作起始物质，并且使得1,3－二氯－1,1,3,3－四异丙基二硅氧烷(TPDSCl2)在吡啶等溶剂中进行反应。由此，在核糖的3’羟基与5’羟基之间形成硅氧烷键的环状结构，以保护3’位与5’位的羟基(化合物1)。接着，添加N－苯基三氟甲烷磺酰亚胺，使得N,N－二甲基－4－氨基吡啶(DMAP)等亲核剂在二氯甲烷(DCM)等溶剂中进行反应，使得核糖的2’位成为三氟磺酸基(化合物2)。接下来，在N,N－二甲基甲酰胺(DMF)等的存在下，与具有硫代乙酸钾等硫醇基的化合物进行反应，在核糖的2’位形成硫酯(化合物3)。进一步，在氨水/甲醇溶液中使其反应从而将硫酯基转化成硫醇基(化合物4)。接着，添加三乙胺三氢氟酸盐(3HF－Et3N)和四氢呋喃(THF)，使得核糖的3’位和5’位的保护基脱离而得到羟基。
Figure GDA0002668909730000191
(b)式(2A－6A)的化合物的合成(※A1为－S－S－C3H5的化合物)
到化合物4为止的合成方案，与上述式(2A－1A)的化合物的合成的情况相同。接下来，在四氢呋喃(THF)与偶氮二羧酸二异丙酯(DIAD)的混合溶剂等溶剂中，使得与1－丙硫醇等硫代烷基化合物进行反应而将核糖的2’位转化成二硫化烷基(化合物5)。接着，在溶剂中使其与苯甲酰氯(BzCl)反应，用苯甲酰基保护碱基的氨基。接下来，添加三乙胺三氢氟酸盐(3HF－Et3N)和THF使得核糖的3’位和5’位的保护基脱离而得到羟基(化合物11)。
Figure GDA0002668909730000201
(c)式(2A－8A)的化合物的合成(※A1为－Se－CH3的化合物)
到化合物2为止的合成方案，与上述式(2A－1A)的化合物的合成的情况相同。接下来，在二甲基二硒化物、硼氢化钠、乃至在THF等的溶剂中进行反应(化合物12)。进一步，添加四正丁基氟化铵(TBAF)、THF等，使得核糖的3’位和5’位的保护基脱离而得到羟基(化合物13)。
Figure GDA0002668909730000202
(d)式(2A－10A)～(2A－12A)的化合物的合成(※A1为卤素的化合物)
接下来，对卤素化合物的合成方案进行说明。到化合物2为止的合成方案，与上述式(2A－1A)的化合物的合成的情况相同。接着，添加卤化锂并进行加热以引入卤素。作为卤化锂，能够列举氟化锂、氯化锂、溴化锂、碘化锂。接下来，添加三乙胺三氢氟酸盐(3HF－Et3N)和THF使得核糖的3’位和5’位的保护基脱离而得到羟基。
Figure GDA0002668909730000211
3.甲羟戊酸衍生物
(1)β修饰磷酸化合物前体
作为β修饰磷酸化合物前体，能够列举下式3A所示的甲羟戊酸衍生物。
Figure GDA0002668909730000212
(其中，A1表示－SR1、－S－S－R1、－SeR1或－X(其中，X是指从氟、氯、溴、碘中选择的卤素)，R1是氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基。)特别地，优选A1为－SH、－SCH3、－S－C2H5、－S－C3H7、－S－SH、－S－S－CH3、－S－S－C2H5、－S－S－C3H7等的化合物。
(2)β修饰磷酸化合物
另外，作为用上述式3A表示的甲羟戊酸衍生物被磷酸化后的β修饰磷酸化合物，能够列举具有用下式3B表示的部分结构的β修饰磷酸化合物。
Figure GDA0002668909730000213
(其中，A1表示－SR1、－S－S－R1、－SeR1或－X(其中，X是指从氟、氯、溴、碘中选择的卤素)，R1是氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基。)
(3)反应阻碍剂以及反应阻碍方法
特别地，在β修饰磷酸化合物前体为式3A所示的甲羟戊酸衍生物，且β修饰磷酸化合物为上述式3B所示的甲羟戊酸衍生物的情况下，生成了用下式3C表示的化合物作为中间体的活性种。
Figure GDA0002668909730000221
(其中，A2表示－S－、－S+(R1)－、－S+(S－R1)－、－Se+(R1)－或－X+－(其中，X是指从氟、氯、溴以及碘中选择的卤素)，R1是氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基。)
以下，示出具体例(A1为－SH的化合物)以说明用3A表示的甲羟戊酸衍生物的活性种生成反应。下式所示的甲羟戊酸衍生物，通过磷酸化从而A1的硫与骨架的碳―碳键形成环硫乙烷环。该环结构非常不稳定，具有容易与其他的化合物进行共价键合的性质。
Figure GDA0002668909730000222
在β修饰磷酸化合物为式3A所示的甲羟戊酸衍生物的情况下，尤其可高效地阻碍甲羟戊酸激酶和5－磷酸甲羟戊酸激酶。甲羟戊酸，是参与合成萜烯的甲羟戊酸途径的物质，在甲羟戊酸激酶的作用下由甲羟戊酸与ATP生成5－磷酸甲羟戊酸，进一步在5－磷酸甲羟戊酸激酶的作用下由5－磷酸甲羟戊酸与ATP生成5－三磷酸甲羟戊酸。式3A所示的甲羟戊酸衍生物，作为该甲羟戊酸的类似物，成为甲羟戊酸途径的高效的反应阻碍剂。即，可推测，式3A所示的甲羟戊酸衍生物被磷酸化而经由式3B的化合物生成式3C的活性种，其与甲羟戊酸激酶、5－磷酸甲羟戊酸激酶等进行共价键合，因此阻碍了磷酸化后的反应。
(4)医药品
式3A所示的甲羟戊酸衍生物，对甲羟戊酸途径进行阻碍，因此可抑制胆固醇的生成。因此，式3A所示的甲羟戊酸衍生物，是胆固醇生成阻碍剂，可作为高脂血症、高胆固醇血症等的治疗药品发挥作用。
4.磷脂酰肌醇衍生物
(1)β修饰磷酸化合物前体
作为β修饰磷酸化合物前体，能够列举用下式4A表示的磷脂酰肌醇衍生物。
Figure GDA0002668909730000231
(其中，A1表示－SR1、－S－S－R1、－SeR1或－X(其中，X是指从氟、氯、溴、碘中选择的卤素)，R1表示氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基。R3是从花生四烯酸、亚油酸以及亚麻酸中选择的不饱和脂肪酸，R4是从硬脂酸、棕榈酸中选择的饱和脂肪酸。)
特别地，优选A1为－SH、－SCH3、－S－C2H5、－S－C3H7、－S－SH、－S－S－CH3、－S－S－C2H5、－S－S－C3H7等的化合物。
(3)反应阻碍剂以及反应阻碍方法
特别地，在β修饰磷酸化合物前体为式4A所示的磷脂酰肌醇衍生物，且β修饰磷酸化合物为上述式4B所示的磷脂酰肌醇衍生物的情况下，作为中间体即活性种，生成用下式4C表示的化合物。
Figure GDA0002668909730000232
(其中，A2表示－S－、－S+(R1)－、－S+(S－R1)－、－Se+(R1)－或－X+－(其中，X是指从氟、氯、溴以及碘中选择的卤素)，R1是氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基。R3是从花生四烯酸、亚油酸以及亚麻酸中选择的不饱和脂肪酸，R4是从硬脂酸、棕榈酸中选择的饱和脂肪酸。)
以下，示出具体例(A1为－SCH3的化合物)以说明4A所示的磷脂酰肌醇的活性种生成反应。下式所示的磷脂酰肌醇，通过磷酸化从而A1的硫与肌醇骨架的碳―碳键形成环结构。该环结构的硫带有正电荷。该环结构也非常不稳定，具有容易与其他的化合物进行共价键合的性质。
Figure GDA0002668909730000241
在β修饰磷酸化合物为式4A所示的磷脂酰肌醇的情况下，尤其可高效地阻碍磷酸肌醇－3－激酶(PI3K)的反应。PI3K，通过肌醇磷脂质被磷酸化，而生成磷脂酰肌醇3,4,5－三磷酸。这些化合物，是参与PI3K/Akt途径的物质，Akt也是癌基因产物。式4A所示的磷脂酰肌醇被磷酸化而经由式4B的化合物生成式4C的活性种，可推测其与PI3K共价键合从而阻碍反应。
(4)医药品
式4A所示的磷脂酰肌醇，是PI3K活性阻碍剂，可作为作癌、恶性淋巴瘤、白血病、风湿病等的治疗药品发挥作用。
(5)磷脂酰肌醇的制造方法
式4A所示的磷脂酰肌醇的制造方法，能够通过与式2A所示的核苷衍生物相同的方法进行制造。即，式4A的磷脂酰肌醇，能够通过以下的步骤合成。首先，将硅氧烷类用作保护基对肌醇的2’以外的羟基进行保护。接着，在2’位引入三氟磺酸基之后，从硫酯转化成硫醇基。最后使得保护基从肌醇脱离。
实施例
以下，基于实施例具体说明本发明，但是这些实施例不对本发明的目的产生任何限制。另外，在以下的实施例中，只要没有特别否定，则「％」表示质量基准(质量百分比)。
以下的实施例中的核苷衍生物的合成方案整体如下所示。以下，按照该合成方案对核苷衍生物的合成方法进行说明(需要说明的是，合成方案中的编号与化合物的编号一致)。另外，「％」的数字是指收获率。
Figure GDA0002668909730000251
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Figure GDA0002668909730000261
1.核苷衍生物的合成
(1)化合物1的合成
在氩气(Ar)气氛下，在吡啶(pyridine)(65mL)中溶解腺苷(adenosine)(3.01g，10.1mmol，1.0eq.)，并添加TPDSCl2(3.2mL，10.1mmol，1.0eq.)，在室温下搅拌46小时。在减压下蒸馏除去溶剂，用醋酸乙酯和水(0.1M HCl aq.，H2O，sat.NaHCO3 aq.，盐水(brine))进行分液。添加无水硫酸钠进行干燥后，进行棉塞过滤，并在减压下蒸馏除去溶剂。通过中性快速柱层析法(CHCl3(MeOH 0－4％))进行精制，得到化合物1(4.14g，80％)。得到的化合物的1H－NMR信息如下所述。
1H－NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.06－1.13(m，28H)，3.31(s，1H)，4.01－4.16(m，3H)，4.56(d，J＝5.6Hz，1H)，5.07－5.11(m，1H)，5.79(s，2H)，5.97(d，J＝1.2Hz，1H)，7.97(s，1H)，8.28(s，1H)。
(2)化合物2的合成
在Ar气氛下，在冰冷却下将化合物1(1.00g，1.83mmol，1.0eq.)和DMAP(650mg，5.5mmol，3eq.)溶解在脱水DCM(17mL)中，并添加N－苯基三氟甲烷磺酰亚胺(N－Phenyltrifluoromethanesulfonimide)(803mg，2.2mmol，1.2eq.)搅拌2小时。用冰冷却后的二氯甲烷和水(0.1M AcOH aq.，sat.NaHCO3 aq.，盐水(brine))进行分液。添加无水硫酸钠进行干燥后，进行棉塞过滤，并在减压下蒸馏除去溶剂。通过中性快速柱层析法(己烷/醋酸乙酯＝1/1)进行精制，得到化合物2(946mg，81％)。得到的化合物的1H－NMR信息如下所述。
1H－NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.06－1.11(m，28H，)，4.02－4.20(m，3H)，5.26－5.29(m，1H)，5.72(s，2H)，5.78(d，J＝4.8Hz，1H)，6.10(s，1H)，7.96(s，1H)，8.26(s，1H)。
(3)化合物3的合成
在Ar气氛下将化合物2(2.80g，4.36mmol，1.0eq.)以及使用脱水乙腈进行共沸后的硫代乙酸钾(1.06g，9.28mmol，2.1eq.)溶解在脱水DMF(9mL)中，并搅拌14.5小时。在减压下蒸馏除去溶剂，用己烷/醋酸乙酯＝1/5混合溶剂和水(sat.NaHCO3 aq.，盐水(brine))进行分液。添加无水硫酸钠进行干燥后，进行棉塞过滤，并在减压下蒸馏除去溶剂。通过中性快速柱层析法(己烷/醋酸乙酯＝2/3)进行精制，得到化合物3(1.72g，67％)。得到的化合物的1H－NMR信息如下所述。
1H－NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.01－1.18(m，28H)，2.15(s，3H)，3.97－4.03(m，2H)，4.23－4.27(m，1H)，4.54－4.58(m，1H)，5.01－5.06(m，1H)，6.12(s，1H)，6.40(d，J＝7.6Hz，1H)，7.90(s，1H)，8.23(s，1H)。
(4)化合物4的合成
在Ar气氛下，在冰冷却下将化合物3(1.42g，2.50mmol)溶解在7M NH3－MeOH(25mL)中并搅拌1小时。在减压下蒸馏除去溶剂，用醋酸乙酯和水(sat.NaHCO3 aq.，盐水(brine))进行分液。添加无水硫酸钠进行干燥后，进行棉塞过滤，在减压下蒸馏除去溶剂，得到化合物4(1.75g，quant.)。得到的化合物的1H－NMR信息如下所述。
1H－NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.00－1.18(m，28H)，1.44(d，J＝8.4Hz，1H)，3.81－3.91(m，2H)，4.03－4.07(m，1H)，4.20－4.24(m，1H)，4.58－4.63(m，1H)，5.76(s，1H)，6.40(d，J＝7.6Hz，1H)，8.11(s，1H)，8.33(s，1H)。
(5)化合物5的合成
将化合物4(304mg，0.571mmol，1.0eq.)溶解在THF(1.9mL，0.3M to化合物4)中，添加DIAD(124μL，0.628mmol，1.1eq.)，搅拌18小时。添加1－丙硫醇(1－propanethiol)(3.1mL，33.7mmol，59eq.)，加热至80℃并搅拌29小时，放置冷却到室温。在减压下蒸馏除去溶剂，通过中性快速柱层析法(己烷/醋酸乙酯＝1/1)进行精制，得到化合物5(230mg，67％)。得到的化合物的1H－NMR信息如下所述。
1H－NMR(400MHz，CDCl3)：δ0.88－0.92(m，3H)，1.06－1.17(m，28H)，1.53－1.58(m，2H)，2.53(t，J＝14.4Hz，2H)，3.88－3.94(m，2H)，4.01－4.05(m，1H)，4.15－4.20(m，1H)，4.74(t，J＝9.2Hz，1H)，5.68(s，1H)，6.49(d，J＝7.2Hz，1H)，7.97(s，1H)，8.32(s，1H)。
(6)化合物6的合成
在Ar气氛下，在冰冷却下将化合物5(314mg，0.523mmol，1.0eq.)溶解在吡啶(pyridine)(2.1mL，0.25M to化合物5)中，在其中添加BzCl(91μL，0.785mmol，1.5eq.)并搅拌3小时30分钟。添加BzCl(60μL，0.523mmol 1.0eq.)，再搅拌1小时。添加BzCl(30μL，0.262mmol 0.5eq.)，进一步搅拌40分钟。添加BzCl(60μL，0.523mmol 1.0eq.)，又搅拌40分钟。添加4mL的水，并搅拌5分钟后，添加28％氨水水溶液8mL并搅拌15分钟。使用醋酸乙酯和水(sat.NaHCO3 aq.，盐水(brine))进行分液。添加无水硫酸钠并干燥后，进行棉塞过滤，在减压下蒸馏除去溶剂。通过中性快速柱层析法(己烷/醋酸乙酯＝1/1)进行精制，得到化合物6(183mg，50％)。得到的化合物的1H－NMR的信息如下所述。
1H－NMR(400MHz，CDCl3)：δ0.88－0.92(m，3H)，1.01－1.18(m，28H)，1.55－1.61(m，2H)，2.57(t，J＝15.2Hz，2H)，3.91－3.97(m，2H)，4.03－4.07(m，1H)，4.18－4.22(m，1H)，4.74(t，J＝9.2Hz，1H)，6.57(d，J＝7.2Hz，1H)，7.52(t，J＝8.0Hz，2H)，7.61(t，J＝7.2Hz，2H)，8.02(d，J＝7.2Hz，1H)，8.16(s，1H)，8.80(s，1H)，9.08(s，1H)；13C－NMR(100MHz，CDCl3)：δ12.5，12.9，13.0，13.1，13.6，17.1，17.4，17.5，22.1，41.3，61.7，63.3，73.9，83.9，84.8，123.0，127.9，128.9，132.8，133.9，142.0，149.6，151.6，152.6，164.7；HRMS(ESI+)计算的质量电荷比(calc.m/z)704.28(M+H+)，726.26(M+Na+)，呈现的质量电荷比(found m/z)704.2821(M+H+)，726.2623(M+Na+)。
(7)化合物7的合成
在Ar气氛下，将化合物6(241mg，0.342mmol,1.0eq.)溶解在THF(3.4mL)中，添加3HF－Et3N(139μL，0.855mmol，2.5eq.)并搅拌2小时20分钟。在减压下蒸馏除去溶剂，通过中性快速柱层析法(CHCl3(MeOH 0－5％))进行分离，得到化合物7(154mg，98％)。得到的化合物的1H－NMR的信息如下所述。
1H－NMR(400MHz，CD3SOCD3)：δ0.78－0.81(m，3H)，1.40－1.45(m，2H)，2.49－2.55(m，2H)，3.66－3.77(m，2H)，3.82－3.84(m，1H)，3.96－3.99(m，1H)，4.41－4.45(m，1H)，5.14(t，J＝3.6Hz，1H)，5.92(d，J＝4.4Hz，1H)，6.66(d，J＝4.8Hz，1H)，7.55(t，J＝8.0Hz，1H)，7.64(t，J＝7.6Hz，1H)，8.03(d，J＝7.2Hz，1H)，8.64(s，1H)，8.74(s，1H)，11.21(br，1H)；13C－NMR(100MHz，CD3OD)：δ13.1，22.9，41.9，61.2，63.2，72.8，86.0，86.4，124.6，129.4，129.7，133.8，134.9，144.8，151.0，153.1，153.3，168.0；HRMS(ESI+)计算的质量电荷比(calc.m/z)462.13(M+H+)，484.11(M+Na+)，呈现的质量电荷比(found m/z)462.1288(M+H+)，484.1121(M+Na+)。
(8)化合物8的合成
在氩气气氛下，在0℃下将SM(154mg，0.344mmol，1.0eq.)溶解到吡啶(pyridine)(3.4ml，0.1M to化合物7)中，一边进行搅拌，一边添加BzCl(46μl，0.401mmol，1.2eq.)。一边通过TLC对反应进行追踪，一边在从搅拌开始分别到2h、4h、7h、10h后逐次添加0.6eq.、0.6eq.、1.2eq.、1.2eq.的BzCl，从反应开始的11h后添加MeOH(5ml)并搅拌10分钟。对溶剂进行减压蒸馏除去后，通过EtOAc－水(sat.NaHCO3 aq.,brine)进行分液。进行芒硝干燥后蒸馏除去溶剂，通过中性快速柱(H/A＝1/1)进行精制得到化合物8(133mg，68％)。得到的化合物的1H－NMR的信息如下所述。
1H－NMR(400MHz，CDCl3)：δ0.738(t，J＝7.2Hz，3H)，1.38(m，2H)，2.42(m，2H)，3.96(t，J＝7.6Hz，1H)，4.30(m，1H)，4.70－4.72(m，2H)，4.82(t，J＝7.6Hz，1H)，5.44(brs，1H)，6.59(d，J＝7.2Hz，1H)，7.37－7.50(m，6H)，7.97－8.00(m，4H)，8.15(s，1H)，8.71(s，1H)，9.51(brs，1H)；13C－NMR(100MHz，CDCl3)：δ12.8，14.2，21.1，21.9，41.1，60.5，61.3，63.8，74.4，82.3，85.5，122.7，128.0，128.5，128.8，129.4，129.7，129.8，132.8，133.4，133.6，142.2，149.5，151.3，152.6，165.0，166.5，171.3；HRMS(ESI+)计算的质量电荷比(calc.m/z)566.15(M+H+)，588.14(M+Na+)，604.11(M+K+)，呈现的质量电荷比(found m/z)544.1461(M+H+)，588.1327(M+Na+)，604.1017(M+K+)。
(9)化合物9(β修饰磷酸化合物)的合成
在Ar气氛下，在0℃下添加苯基二氯磷酸酯(phenylphosphorodichloride)(9μl，0.06mmol，1.5eq.in 150μl THF)、脱水TEA(28μl，0.2mmol，5.0eq.in 150μl THF)、化合物8(23mg，0.04mmol，1.0eq.in 200μl THF和28μl TEA)，并搅拌1.5h后，使得反应系统回到室温，搅拌2.5h。之后，添加150μl的MQ，搅拌过夜后，通过HPLC进行精制。反应收获率使用HPLC计算，为62％。HRMS(ESI-)计算的质量电荷比(calc.m/z)720.14(M-)，呈现的质量电荷比(found m/z)719.7807(M-)，HRMS(ESI+)计算的质量电荷比(calc.m/z)722.15(M+H+)，呈现的质量电荷比(found m/z)722.1443(M+H+)。
(10)化合物10(β修饰磷酸化合物前体A－1)的合成
在Ar气氛下，将化合物4(549mg，1.04mmol，1.0eq.)溶解在THF(10mL)中，添加3HF－Et3N(424μL，2.6mmol，2.5eq.)并搅拌2小时40分钟。在减压下蒸馏除去溶剂，用DCM进行吸引过滤、清洗，得到化合物10(266mg，89％)。得到的化合物的1H－NMR的信息如下所述。
1H－NMR(400MHz，CD3SOCD3)：δ3.31－3.39(m，2H)，3.73－3.76(m，4H)，4.24－4.29(m，1H)，5.78(d，J＝6.0Hz，1H)，6.36(d，J＝7.6Hz，1H)，7.29(s，2H)，8.12(s，1H)，8.30(s，1H)。
(11)化合物11(β修饰磷酸化合物前体A－2)的合成
在Ar气氛下，将化合物5(553mg，0.920mmol，1.0eq.)溶解在THF(9.2mL)中，添加3HF－Et3N(375μL，2.30mmol，2.5eq.)并搅拌2小时。在减压下蒸馏除去溶剂，通过中性快速柱层析法(CHCl3(MeOH 0－5％))进行分离，得到化合物11(337mg，quant.)。得到的化合物的1H－NMR的信息如下所述。
1H－NMR(400MHz，CD3OD)：δ0.74－0.78(m，3H)，1.36－1.43(m，2H)，2.44－2.47(m，2H)，3.84－3.91(m，4H)，4.51(t，J＝8.8Hz，1H)，6.54(d，J＝7.2Hz，1H)，8.16(s，1H)，8.32(s，1H)。
(12)Pro A的合成
在－78℃下，在无水DCM(4.2ml)中的氯化磷酰(130μl，1.4mmol，1.0eq.)的溶液中，添加苯酚(132mg，1.4mmol，1.0eq.)以及三乙胺(132mg)的溶液。并滴下无水DCM(1.4ml)中的195μl，1.4mmol，1.0eq.)。在相同温度下搅拌3小时搅拌后，将反应混合物用L－丙氨酸异丙酯盐酸盐(235mg，1.4mmol，1.0eq.)处理一次，接着滴下三乙胺(390μl，2.8mmol，2.0eq.)。将其在－78℃下进一步搅拌1小时，接下来经过1小时加温到室温。冷却到0℃后，将上述混合物，在无水DCM(1.4ml)中的化合物11(94.2mg，0.280mmol，0.2当量)以及NMI(111μl，1.4mmol，1.0当量)的溶液中进一步处理，在0℃下搅拌16小时。将反应混合物用H2O(7.0ml)进行处理，并用DCM提取。将有机层用0.5M的稀HCl以及食盐水依次进行清洗。使用无水Na2SO4干燥后，将其浓缩，接着，使用硅胶柱层析法(DCM/MeOH＝－10/1)以及HPLC进行精制得到所需的生成物Pro A(48mg，38％)。得到的化合物的NMR的信息如下所述。
1H－NMR(400MHz，DMSO)：δ－0.06(t，J＝7.6Hz，3H)，0.18(d，J＝6.4Hz，2H)，0.23－0.27(m，4H)，0.30(d，J＝6.8Hz，3H)，0.49－0.59(m，2H)，1.64－1.66(m，2H)，2.78－2.91(m，1H)，3.06－3.13(m，2H)，3.36－3.50(m，2H)，3.64－3.70(m，1H)，3.83－3.89(m，1H)，5.08－5.21(m，2H)，5.68(d，J＝8.0Hz，1H)，6.29－6.33(m，3H)，6.45－6.49(m，4H)，7.28(s，1H)，7.35(s，1H)；13C－NMR(100MHz，DMSO)：δ12.5，19.6，21.2，21.3，49.7，62.4，67.8，72.6，83.6，118.8，120.0，120.1，124.4，129.5，140.0，149.0，150.7，152.5，156.0，172.5；31P－NMR(162MHz，CDCl3)：δ4.27(P(R))，4.67(P(S))；HRMS(ESI+)计算的质量电荷比(calc.m/z)627.18(M+H+)，649.16(M+Na+)，665.14(M+K+)，呈现的质量电荷比(found m/z)627.1786(M+H+)，649.1611(M+Na+)，665.1328(M+K+)。
(13)化合物12(β修饰磷酸化合物前体(硒))的合成
在冰冷却下在溶解有二甲基二硒化物(300μL，3.17mmol)的乙醇(5mL)中添加硼氢化钠(289mg，7.64mmol)。将化合物2(3.36g，5.30mmol)溶解在THF(20mL)中，并添加在反应溶液中，在70℃下搅拌3.5小时。添加二甲基二硒化物(100μL，1.06mmol)和硼氢化钠(62.3mg，1.64mmol)，并在60℃下搅拌2.5小时。用1M盐酸中和后，蒸馏除去溶剂。将残渣溶解在醋酸乙酯(50mL)中，并用水清洗3次、用饱和食盐水清洗1次，用芒硝干燥有机层。蒸馏除去溶剂后，通过中性快速柱层析法(己烷/醋酸乙酯＝1/1→9/1→醋酸乙酯/甲醇＝9/1)进行精制，得到化合物12(1.90g，61％)。本反应中，使用耐圧容器。得到的化合物的1H－NMR的信息如下所述。
1H－NMR(400MHz，CDCl3)：δ0.89－1.22(m，28H)，1.95(s，3H)，3.72－3.90(m，2H)，4.04－4.23(m，2H)，4.73(dd，J＝8.4Hz，10.4Hz，1H)，5.64(br，s，2H)，6.49(d，J＝7.6Hz，1H)，8.26(s，1H)；13C－NMR(100MHz，DMSO)：δ5.801，12.70，13.15，13.16，13.86，17.13，17.21，17.25，17.27，17.48，17.51，17.57，17.64，49.87，61.23，74.94，84.23，84.58，119.56，139.32，149.93，152.754；HRMS(ESI+)计算的质量电荷比(calc.m/z)588.19(M+H+)，610.18(M+Na+)，呈现的质量电荷比(found m/z)588.1945(M+H+)，610.1768(M+Na+)。
(14)化合物13(SelenoA：β修饰磷酸化合物前体(硒))的合成
在冰冷却下将化合物12(1.83g，3.12mmol)溶解在THF(18mL)中，添加TBAF(1M inTHF，7.8mL，7.80mmol)，搅拌17.5小时。蒸馏除去溶剂，通过中性快速柱层析法(二氯甲烷/甲醇＝95/5→85/15)进行精制，得到化合物13(1.04g，97％)。得到的化合物的1H－NMR的信息如下所述。
1H－NMR(400MHz，DMSO－d6)：δ1.85(s，3H)，3.64－3.83(m，4H)，4.43(m，1H)，5.73(dd，J＝4.0Hz，6.0Hz，1H)，6.45(dd，J＝3.6Hz，7.6Hz，1H)，7.28(s，2H)，8.28(s，1H)；13C－NMR(100MHz，DMSO)：δ4.17，49.1，59.8，73.3，84.1，85.0，118.3，139.3，149.2，152.5，156.0；HRMS(ESI+)计算的质量电荷比(calc.m/z)346.04(M+H+)，368.02(M+Na+)，呈现的质量电荷比(found m/z)346.0402(M+H+)，368.0214(M+Na+)。
(15)Pro SelenoA的合成
将POCl3(134μL，1.50mmol)溶解在二氯甲烷(4.5mL)中，在－78℃下进行搅拌。将苯酚(132.6mg，1.46mmol)和三乙胺(201uL，1.50mmol)溶解在二氯甲烷(1.5mL)中，进行滴下，并搅拌3小时。添加L－异丙基丙氨酸盐酸盐(248.4mg，1.54mmol)和三乙胺(201uL，3.00mmol)，再搅拌1小时，升温到室温。在二氯甲烷(1.5mL)中溶解并滴下化合物13(94.2mg，0.27mmol)和NMI(114uL，1.50mmol)。在0℃下搅拌20.5小时后，用水进行冷浸(quench)。通过RP－HPLC(MiliQ/ACN＝20/80→50/50)进行精制，得到Pro SelenoA(33.5mg，19％)。得到的化合物的NMR的信息如下所述。
1H－NMR(400MHz，CD2Cl2)：δ1.01－1.25(m，9H)，1.88(s，3H)，3.64－3.89(m，3H)，4.20－4.83(4m，H)，5.82－6.04(m，2H)，6.45(d，1H)，7.05－7.43(m，7H)，8.13(d，2H)；13C－NMR(100MHz，CD2Cl2)：δ4.95，20.24，21.84，48.93，50.26，66.50，79.71，83.39，84.81，119.2，120.7，125.0，130.1，140.1，149.5，151.2，153.0，156.6，173.1；HRMS(ESI+)计算的质量电荷比(calc.m/z)615.11(M+H+)，呈现的质量电荷比(found m/z)615.1244(M+H+)；
(16)dASeTP的合成
在磷酸三甲酯(84.1mg)中添加硒代腺苷(化合物13：101mg，0.30mmol)和三丁胺(643μL，2.70mmol)，在－30℃下一边搅拌，一边滴下氯化磷酰(84μL，0.90mmol)，并搅拌16小时。在乙腈(1.6mL)中添加双(三丁基铵)焦磷酸盐(993.5mg，1.51mmol)和三丁胺(600μL)，并搅拌24小时。添加1M TEAB(5mL)，并冷冻干燥。通过HPLC(DEAE－2SW，1M甲酸铵/MQ＝0/100→50/50)分析反应的进行，使用HPLC(C18 Hydrosphere，50mM TEAB/ACN＝100/0→70/30)进行精制，得到三磷酸体的三乙基铵盐。添加0.1M高氯酸钠的丙酮溶液，通过吸引过滤得到三磷酸体的钠盐(93.9mg，43％)。得到的化合物的NMR的信息如下所述。
1H－NMR(400MHz，D2O)：δ8.28(s，1H)，8.03(s，1H)，6.40(d，J＝8MHz，1H)，4.42(t，J＝10MHz，1H)，4.23(d，J＝1.6MHz，2H)，3.98(m，1H)，3，74(q，J＝7.2MHz，1H)，1.64(s，3H)；13C－NMR(100MHz，D2O)：δ4.26，48.19，63.43，71.78，82.69，85.85，118.1，140.6，148.6，152.7，155.6；31P－NMR(160MHz，D2O)：δ－5.39(br，1P)，－10.28(d，J＝17MHz，1P)，－20.81(br，1P)；HRMS(ESI－)计算的质量电荷比(calc.m/z)583.92(M－H)－，呈现的质量电荷比(found m/z)583.9202(M－H)－；
2.链切断反应(Chain cleavage reaction)
添加化合物9的溶液(MeCN：H2O＝2：1，35mM，100uL)，HEPES缓冲剂(Buffer)(50uL，pH＝9.0，500mM)、H2O(332.5uL)、DTT水溶液(1M，17.5uL)并进行混合后，在25℃下培养(incubate)20小时。通过HPLC(条件如下所记载)进行分析，峰的确定通过HRMS(ESI)进行。其结果的图表在图2中示出。
＜HPLC条件(condition)＞
层析柱(Column)：Hydrosphere C18 250×4.6mm S－5μm 12nm
洗脱液(Eluent)：A)50mM TEAA缓冲液(buffer)，5％ACN
B)ACN
梯度(Gradient)：B conc.0－10％(0－10min)，10－100％(10－22.5min)，100％(22.5－30min)
流速(Flow rate)：1mL/min检测(Detection)：260nm
根据图2的HPLC的结果，可确认到核苷衍生物的峰(化合物compound A)和磷酸苯酯的峰(化合物compound B)。由此能够确认，在核糖的3’位被磷酸化的状态下，若通过DTT对2’位的二硫基进行脱保护，则通过以下的反应3’位的磷酸部被切断，并且被分解成具有环硫乙烷结构的活性化后的核苷衍生物与磷酸苯酯。
Figure GDA0002668909730000331
3.B型肝炎病毒(HBV)的繁殖抑制效果
以人类肝癌细胞HuH－7为来源将HBV基因组(基因型C)不断进行复制的细胞株EB－HBCe播种在24孔板上，将化合物A－1(化合物10)以及A－2(化合物11)添加到最终浓度为10或者100μM并培养9天。在此之间，每3天更换培养基并且添加同浓度的化合物。从培养的细胞中通过TRI Reagent(Molecular Research Center公司)提取出total RNA，进行DNaseI以及RNase阻碍剂的处理。通过SuperScript VILO cDNA合成套件(Invitrogen公司)合成cDNA，并通过使用SYBR qPCR Mix Kit(东洋纺公司)的定量PCR对作为HBV复制中间体的病毒RNA(pgRNA)进行定量。其结果在图3中示出。从左侧的图表依次为：参照组，添加10μM的化合物A－1，添加100μM的化合物A－1，添加10μM的化合物A－2，添加100μM的化合物A－2的结果。另外，最右侧的图表，是添加10μM的作为肝炎的治疗药品的ETV(恩替卡韦)的结果。
根据该图可观察到，在化合物A－1和化合物A－2均添加100μM的情况下，病毒RNA减少。由此可知，任一种化合均能够抑制B型肝炎病毒的繁殖。特别地，将浓度100μM下的化合物A－1与化合物A－2的结果进行比较时，与化合物A－1相比，化合物A－2的情况下的病毒RNA的量略微更少。由此可知，如果是相同浓度，那么化合物A－2比化合物A－1的病毒繁殖抑制效果更高。
4.不可逆阻碍实验
在包含下述的模板RNA(0.2μM，最终浓度，以下同样)、下述的引物DNA(0.2μM)、dCTP、dGTP、dTTP(各100μM)、Tris－HCl(pH8.3，5mM)、KCl(5mM)、DTT(0.2mM)、MgCl2(0.5mM)的溶液中，添加0.25μL的AMV逆转录酶(20U/μL)，并添加dATP或ddATP或dASeTP(100μM)，在42℃下培养3小时。使用Microcon 100K，进行3次超过滤后，使用Amicon 3K对蛋白溶液进行浓缩。使用蛋白溶液，再次进行链伸长反应(模板RNA 0.2μM，引物DNA 0.2μM，各种dNTP 100μM，Tris－HCl(pH8.3)2.5mM，KCl 5mM，DTT 0.2mM，0.5mM MgCl2，AMV逆转录酶0.1U/μL)。
在反应时间为5分钟、30分钟、60分钟时各取出10μL的样品，添加2×改性缓冲液，将反应停止。使用20％dPAGE(7.5M Urea，1×TBE，7.5％甲酰胺(formamide)，20mA恒电流(const.))对各样品进行电泳，通过荧光发光定量检测出伸长核酸。其结果在图4中示出。
引物DNA：5’－(FAM)－GGTGGACTTTCGC－3’
模板RNA：5’－ACGACGUGCGAAAGUCCACC－3’
根据该图可知，dASeTP阻碍了逆转录酶引起的核酸伸长反应。
5.抗HBV活性
以人类肝癌细胞HuH－7为来源将HBV基因组(基因型C)不断进行复制的细胞株EB－HBCe播种在24孔板上，以各种最终浓度添加各种化合物并且培养9天。在此期间，每3天更换培养基并且添加同浓度的化合物。
回收培养上清并添加PNE溶液(8.45％PEG6000，0.445M NaCl，13mM EDTA)从而使得病毒粒子沉淀后，使用DNase I(タカラバイオ公司(Takara Bio Inc.))以及RNase A(タカラバイオ公司)在37℃下进行1小时处理，从而除去粒子外的核酸。进一步，通过蛋白酶K(Proteinase K)处理一晚后，对DNA进行苯酚/氯仿提取并进行乙醇沉淀。对沉淀物进行可溶化之后，使用SYBR qPCR Mix Kit(东洋纺公司)进行HBV DNA的定量测量。其结果在图5中示出。图中的「SelenoA」表示添加化合物13的结果，「entecavir」表示添加恩替卡韦的结果。
根据该图可知，SelenoA(化合物13)、Pro SelenoA、Pro A中的任一个均示出了抗HBV活性，添加浓度越高则活性越高。特别地，Pro SelenoA在添加浓度为10μM时，在这3种之中示出了最高的抗HBV活性。
7.抗HIV活性
(1)抗HIV活性测量
使用在达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s Medium(DMEM))(SIGMA/Cat.No.D5796)中，添加有最终浓度为10％的胎牛血清(fetal bovineserum)(Japan Bio Serum社)的培养基，在37℃、5％CO2的条件下培养TZM－bl细胞。将TZM－bl细胞播种在96坑微板(96well microplate)上(1.3×104cells/100μL DMEM+10％FBS)。翌日，在培养液中依次添加药剂溶液和HIV－1(NL4－3，10ng)。2天后，将培养上清液除去200μL，添加100μL的1×Steady Glo(Promega/Cat.No.E2510)，将搅拌后的80μL的细胞破碎液使用专用的板(Coster/Cat.No3912)IESEL，VERITAS微板发光计(MicroplateLuminometer)(Promega)对及荧光素酶(Luciferase)进行定量，并计算出药剂的抗HIV－1活性(EC50)。使用不同类型的病毒，对于多种化合物进行实验。其结果在下表(A)中示出。表中，「AZT」是指叠氮胸苷，「Lamivudine」是指拉米夫定，「Didanosine」是指去羟肌苷。
(2)细胞毒性评价
MTT测定(MTT assay)，使用Celltiter 96非放射性细胞繁殖化验(Non－radioactive Cell Proliferation Assay)(Promega)。以MOI＝0.001使得MT－4细胞感染HIV－1NL4－3。在(37℃，1－1.5小时)的条件下将感染或未感染HIV－1的MT－4细胞(2.5×105/ml，100μL)分别注到96坑微板上(最终DMSO浓度；0.5％)，并在37℃、5％CO2下开始培养。在培养的第5天除去培养上清液(100μL)，并且在各个坑中添加染料溶液(dye solution)(MTT试剂)15μL，在CO2恒温箱内培养1小时。接着将100μL的增溶溶液/终止混合物(solubilization solution/stop mix)添加到各坑中，充分混和并在4℃下静置一晩。在使得板回到室温后，用分光光度计(BIO-TEK ELx808)对DD570/690进行测量(CC50)。其结果在下表(B)中示出。
【表1】
(A)EC50for HIV(HIV的50％有效浓度)
Figure GDA0002668909730000351
(B)CC50(50％阻碍浓度)
Figure GDA0002668909730000352
在表中，根据(A)的结果可知，与拉米夫定(Lamivudine)、去羟肌苷(Didanosine)相比，Pro SelenoA示出了更高的抗HIV活性。另外，对于HIV类型M41L/T69SSG/T215Y，示出了比AZT更优良的抗HIV活性。另外，根据(B)的结果可知，与AZT相比Pro SelenoA的毒性更低。

Claims (2)

1.一种反应阻碍方法，其特征在于，在伴随磷酸化的DNA聚合酶参与的核酸伸长反应中阻碍磷酸化后的核酸伸长反应的进行，所述方法包括：
准备β修饰磷酸化合物前体的步骤，所述β修饰磷酸化合物前体是用下式2A表示的核苷衍生物或者在3’末端具有该核苷衍生物的核酸；
将所述β修饰磷酸化合物前体磷酸化以生成β修饰磷酸化合物的步骤，所述β修饰磷酸化合物是在分子内具有用下式2B表示的核苷衍生物或者具有该核苷衍生物的核酸，
Figure FDA0004208819640000011
其中，A1表示－SR1、－S－S－R1、－SeR1或－X，这里，X是指从氟、氯、溴、碘中选择的卤素；R1表示氢、碳数1～20的烷基、碳数1～20的芳基或碳数1～20的烯基；B是从腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、N－甲基腺嘌呤、N－苯甲酰腺嘌呤、2－甲基硫代腺嘌呤、2－氨基腺嘌呤、7－甲基鸟嘌呤、N－异丁酰鸟嘌呤、5－氟胞嘧啶、5－溴胞嘧啶、5－甲基胞嘧啶、4－N－甲基胞嘧啶、4－N,N－二甲基胞嘧啶、5－氟尿嘧啶、5－溴尿嘧啶、5－氯尿嘧啶以及5,6－二氢尿嘧啶中选择的碱基；＊是指受到磷酸化而与磷酸基键合的键，在磷酸化前与氢或除磷酸基以外的取代基键合；L3是氢，或者是用下式2D表示的单磷酸基、二磷酸基或三磷酸基；
Figure FDA0004208819640000012
其中，n表示1～3的整数；Z1是羟基，或者是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸和脯氨酸中的任一者的甲酯、乙酯、异丙酯、正丁酯、苄酯或苯基酯；Z2是氢、碳数1～4的烷基、卤素或苯基；在n为2以上的情况下，各个Z1可相同或不同。
2.如权利要求1所述的反应阻碍方法，其特征在于，所述A1选自－SH、－S－S－C3H5以及－Se－CH3所构成的群组；所述Z1选自由羟基以及丙氨酸的异丙酯所构成的群组，所述Z2选自由氢和苯基所构成的群组；所述B选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶以及尿嘧啶所构成的群组。
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