ES2927955T3 - Composiciones de nucleótidos y nucleósidos y sus usos - Google Patents

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Abstract

Esta divulgación se refiere a composiciones terapéuticas de nucleótidos y nucleósidos y usos en el tratamiento de enfermedades infecciosas, infecciones virales y cáncer, donde la base del nucleótido o nucleósido contiene al menos un tiol, tiona o tioéter. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones de nucleótidos y nucleósidos y sus usos
Campo de la invención
La presente divulgación se refiere a composiciones terapéuticas de nucleótidos y nucleósidos y usos relacionados con las mismas. En determinados modos de realización, la divulgación se refiere a nucleósidos que contienen azufre opcionalmente conjugados con un óxido de fósforo o sales del mismo. En determinados modos de realización, la divulgación contempla composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos para usos en el tratamiento de enfermedades infecciosas, infecciones víricas y cáncer.
Antecedentes
Los fosfatos y fosfonatos de nucleósidos y nucleótidos son clínicamente útiles como agentes antivíricos. Dos ejemplos son el tenofovir disoproxil fumarato para el tratamiento de infecciones por el virus de la inmunodeficiencia humana y el adefovir dipivoxil para el tratamiento de infecciones por el virus de la hepatitis B. La administración de tres o más agentes antirretrovíricos en combinación, por ejemplo, el tratamiento antirretrovírico de gran actividad (TARGA), ha reducido significativamente la morbilidad y la mortalidad asociadas con la infección por VIH. Sin embargo, existe una necesidad creciente de nuevos agentes antivíricos para abordar los problemas críticos de la resistencia y la penetración en los santuarios víricos (comúnmente denominados compartimentos privilegiados). La permeabilidad en los compartimentos privilegiados puede ser parcialmente responsable de la actual incapacidad de la quimioterapia para eliminar totalmente la infección por VIH de un paciente y la aparición de resistencia.
Los agentes antivíricos que son nucleótidos y derivados de nucleótidos no fosforilados se deben fosforilar para inhibir activamente la replicación vírica. Los análogos de nucleósidos entran en una célula a través de dos tipos de transportadores de amplia especificidad, los transportadores concentrativos de nucleósidos (CNT) y los transportadores equilibrativos de nucleósidos (ENT). Una vez en su interior, utilizan la vía de rescate de nucleósidos del huésped para la fosforilación secuencial por desoxinucleósido cinasas (dNK), desoxinucleósido monofosfato cinasas (dNMPK) y nucleósido difosfato cinasa (NDPK). Sin embargo, la activación intracelular de estos compuestos a menudo se ve comprometida por la alta especificidad por el sustrato de las cinasas endógenas del huésped. Los estudios in vitro e in vivo han demostrado que la primera y/o la segunda fosforilación, catalizadas por dNK y dNMPK, a menudo representan las etapas limitantes de la velocidad en la activación de los análogos de nucleósidos. Por tanto, existe la necesidad de identificar análogos de nucleósidos antivíricos mejorados con rasgos característicos estructurales que estén suficientemente activados por cinasas celulares.
McGuigan et al., J Med Chem, 2005, 48(10), 3504-3515, informan de que el fosforamidato de fenilmetoxialaninilo de abacavir como profármaco da lugar a una potenciación de la potencia antivírica. Painter et al., Antimicrob Agents Chemother, 2007, 51(10), 3505-3509, informan de que promueven la disponibilidad oral de tenofovir con un profármaco de éster de hexadeciloxipropilo, denominado CMX157.
Los esfingolípidos desempeñan un papel en las interacciones célula-célula y célula-subestrato, y ayudan a regular el crecimiento y la diferenciación mediante una variedad de mecanismos, tales como la inhibición de las cinasas receptoras del factor de crecimiento y los efectos sobre numerosos sistemas de transducción de señales celulares. La patente de EE. UU. 6.610.835 divulga análogos de esfingosina. También divulga procedimientos para tratar infecciones y cáncer. Pruett et al., J. Lipid Res. 2008, 49(8), 1621-1639, informan sobre esfingosina y derivados. Bushnev et al., ARKIVOC, 2010, (viii):263-277, informan sobre un procedimiento sintético asimétrico para preparar derivados de esfingolípidos. Dougherty et al., Org. Lett. 2006, 8(4), 649-652, informan sobre la síntesis de derivados de 1-desoxiesfingosina. Wiseman et al., Org. Lett. 2005, 7(15), 3155-3157, informan sobre 1-desoxi-5-hidroxiesfingolípidos en antineoplásicos y síntesis estereoselectivas de 2-amino-3,5-dioles.
El documento WO 02/18404 divulga derivados de nucleósidos como inhibidores de la replicación del ARN del replicón del VHC.
El documento WO 2007/083173 divulga mononucleótidos de pirimidina y mononucleósidos de pirimidina tiolados y su uso como agentes terapéuticos. Más detalladamente, el documento WO 2007/083173 se refiere a aplicaciones terapéuticas de 4-tiouridina, sus análogos, derivados de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos y sus diversos derivados adicionales, y también a estos compuestos para su uso en las aplicaciones terapéuticas. El documento WO 2007/083173 también divulga el uso de estos compuestos y de preparaciones que contienen estos compuestos como agentes antiproliferativos y/o antivíricos.
El documento JP S4947379A divulga un procedimiento para producir 2-tiouridinas que tienen actividad antivírica.
El documento US 3975374A divulga la preparación de 1-(2- o 3-desoxi-beta-D-pentofuranosil)-2-t¡ourac¡los y 1-beta-D-pentofuranosil-2-tio-6-azaurac¡los. Además, el documento US 3975374 divulga que el compuesto nucleósido conocido, 1-beta-D-ribofuranosil-2-tiouracilo, es activo frente al virus del herpes y frente a la leucemia L-1210 en ratones. El documento US 3975374 también divulga un procedimiento mejorado para preparar los correspondientes intermedios 2-O-metiluracilo y 2-O-metil-6-azauracilo que conservan la configuración beta del nucleósido de partida.
Meneghesso et al. divulgan la síntesis y evaluación biológica de profármacos de nucleósido monofosfatos de pirimidina dirigidos contra el virus de la gripe.
El documento WO 01/90121 divulga un procedimiento y una composición para tratar a un huésped infectado por hepatitis C que comprende administrar una cantidad eficaz de un nucleósido modificado en 1', 2' o 3' descrito o una sal o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo para el tratamiento de la hepatitis C.
El documento WO 0192282 describe un procedimiento y una composición para tratar a un huésped infectado por flavivirus o pestivirus que comprende administrar una cantidad eficaz de un nucleósido modificado en 1', 2' o 3' descrito o una sal o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo para el tratamiento de la infección por flavivirus o pestivirus.
Reimer et al. divulgan la inhibición de la ADN polimerasa del virus de la hepatitis B por análogos de trifosfato de timidina in vitro.
Poopeiko et al. divulgan la síntesis, conformación y propiedades biológicas de la 2',3'-didesoxi-3'-fluoro-5-cloro-4-tiouridina, un agente anti-VIH potencial.
El documento GB 2 211 185A divulga derivados de 2',3'-didesoxi-4-tiouridina, procedimientos para su preparación, agentes antivíricos que se usan como ingredientes eficaces y procedimientos terapéuticos y fármacos terapéuticos para enfermedades víricas.
Ko et al. divulgan la síntesis y la potencia de novedosos nucleótidos de uracilo y derivados como agonistas de los receptores P2Y2 y P2Y6.
El documento US2004063651 divulga tratamientos contra la hepatitis C que contienen como ingredientes activos un derivado de 3'-desoxi-3'-fluorouridina y un derivado de 1-(3'-desoxi-fluoro-beta-L-ribofuranosil)uracilo.
El documento US2004063658 divulga compuestos, composiciones y procedimientos para tratar infecciones por el virus de la hepatitis C.
El documento US 2011286962 divulga compuestos, composiciones y procedimientos para el tratamiento de trastornos hepáticos, incluyendo infecciones por VHC y/o VHB.
El documento WO 2005/020885 divulga composiciones y procedimientos para tratar una infección por coronavirus, especialmente una infección por SARS CoV. Las composiciones comprenden un nucleósido antivírico o un mimético del mismo, o un agente antisentido antivírico, en una forma adecuada para administración pulmonar o nasal. Los procedimientos comprenden administrar a un paciente que lo necesite una cantidad antivíricamente eficaz de una composición de acuerdo con la presente invención, ya sea mediante instilación pulmonar o nasal.
Fox et al. divulgan 1-p-D-arabinofuranosil-S-fluorocitosina y arabinonucleósidos relacionados.
El documento US 3404144A divulga compuestos de 1-p-D-arabinofuranosil-5-fluorocitosina y un procedimiento e intermedios para sintetizarlos.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5. La presente invención también proporciona una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 9. La presente invención también proporciona un compuesto o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 10.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 ilustra determinados modos de realización de la divulgación que no se reivindican.
La figura 2 ilustra bases que contienen un grupo tio ejemplares para determinados modos de realización proporcionados en el presente documento. No se reivindican los compuestos que comprenden pirimidin-2,4-ditiona o 5-fluoropirimidin-2,4-d itiona.
La figura 3 ilustra el mecanismo de los profármacos de McGuigan in vivo. El mecanismo metabólico de estos profármacos comienza con una escisión del éster carboxílico catalizada por esterasa, seguida de varias etapas de reordenamiento químico que dan como resultado un fosforamidato de aminoácido. La escisión final la lleva a cabo una de varias fosforamidasas endógenas, una
que se ha identificado como la proteína de unión a nucleótidos de la tríada de histidina 1 (hINT 1).
La figura 4 ilustra tipos estructurales de mono y difosfato.
La figura 5 ilustra esquemas para la síntesis de conjugados.
La figura 6 es la estructura cristalina de rayos X de EIDD-02023.
Descripción detallada de la invención
La presente divulgación se refiere a composiciones terapéuticas de nucleótidos y nucleósidos y usos relacionados con las mismas. En determinados modos de realización, la divulgación se refiere a nucleósidos que contienen azufre opcionalmente conjugados con un óxido de fósforo o sales del mismo. En determinados modos de realización, la divulgación contempla composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos para usos en el tratamiento de enfermedades infecciosas, infecciones víricas y cáncer.
El nucleótido o nucleósido comprende un heterociclo que comprende dos o más heteroátomos de nitrógeno sustituido con al menos una tiona, tiol o tioéter, en el que el heterociclo sustituido está opcionalmente sustituido con uno o más alquilos, halógenos o cicloalquilos iguales o diferentes.
En determinados modos de realización, el heterociclo que comprende dos o más heteroátomos de nitrógeno sustituido con al menos una tiona, tiol o tioéter o seleccionado de pirimidin-2-ona-4-tiona, pirimidin-2-tiona-4-ona, 4-aminopirimidin-2-tiona, 5-fluoropirimidin-2-ona-4-tiona, 5-fluoropirimidin-2-tiona-4-ona o 4-amino-5-fluoropirimidin-2-tiona.
En determinados modos de realización, la divulgación contempla composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los compuestos reivindicados en el presente documento y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En determinados modos de realización, la composición farmacéutica está en forma de pastilla, cápsula, comprimido o tampón salino que comprende un sacárido. En determinados modos de realización, la composición puede contener un segundo agente activo tal como un analgésico, un agente antiinflamatorio, un agente antiinflamatorio no esteroideo, un agente antivírico, un antibiótico o un agente antineoplásico.
En determinados modos de realización, la divulgación encuentra utilidad en procedimientos para tratar o prevenir una infección que comprenden administrar una cantidad eficaz de un compuesto divulgado en el presente documento a un sujeto que lo necesite. Típicamente, al sujeto se le diagnostica una infección o riesgo de infección por un virus, una bacteria, un hongo, un protozoo o un parásito.
En determinados modos de realización, la divulgación encuentra utilidad en procedimientos para tratar una infección vírica que comprenden administrar una cantidad eficaz de una composición farmacéutica reivindicada en el presente documento a un sujeto que lo necesite. En determinados modos de realización, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un ser humano. En determinados modos de realización, al sujeto se le diagnostica una infección vírica crónica. En determinados modos de realización, la administración se realiza en condiciones tales que ya no se detecte la infección vírica. En determinados modos de realización, al sujeto se le diagnostica una infección por un virus de ARN, un virus de ADN o retrovirus. En determinados modos de realización, al sujeto se le diagnostica una infección por un virus que es un virus de ADN bicatenario, un virus de ADN monocatenario de sentido, un virus de ARN bicatenario, un virus de ARN monocatenario de sentido, un virus de ARN monocatenario de antisentido, un retrovirus de ARN monocatenario de sentido o un retrovirus de ADN bicatenario.
En determinados modos de realización, al sujeto se le diagnostica una infección por virus de la gripe A, incluyendo el subtipo H1N1, H3N2, H7N9 o H5N1, virus de la gripe B, virus de la gripe C, rotavirus A, rotavirus B, rotavirus C, rotavirus D, rotavirus E, coronavirus humano, coronavirus del SARS, coronavirus del MERS, tipos de adenovirus humanos (HAdV-1 a 55), papilomavirus humano (VPH) tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 y 59, parvovirus B19, virus del molusco contagioso, virus JC (JCV), virus BK, poliomavirus de células de Merkel, virus de Coxsackie A, norovirus, virus de la rubéola, virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), virus del Dengue, virus de chikungunya, virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus de la encefalitis equina occidental (WEEV), virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV), virus de la fiebre amarilla, virus del sarampión, virus de las paperas, virus respiratorio sincicial, virus de la peste bovina, virus de la encefalitis de California, hantavirus, virus de la rabia, virus del ébola, virus de Marburgo, virus del herpes simple 1 (HSV-1), virus del herpes simple 2 (HSV-2), virus de la varicela zóster (VZV), virus de Epstein-Barr (EBV), citomegalovirus (CMV), virus linfotrópico del herpes, roseolovirus o herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi, virus de la hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E o virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
En determinados modos de realización, al sujeto se le diagnostica una infección por virus de la gripe A, incluyendo los subtipos H1N1, H3N2, H7N9, H5N1 (ruta baja) y H5N1 (ruta alta), virus de la gripe B, virus de la gripe C, rotavirus A, rotavirus B, rotavirus C, rotavirus D, rotavirus E, coronavirus del SARS, MERS-CoV, tipos de adenovirus humanos (HAdV-1 a 55), papilomavirus humano (VPH) tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 y 59, parvovirus B19, virus del molusco contagioso, virus JC (JCV), virus BK, poliomavirus de células de Merkel, virus de Coxsackie A, norovirus, virus de la rubéola, virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), virus de la fiebre amarilla, virus del sarampión, virus de las paperas, virus respiratorio sincicial, virus paragripales 1 y 3, virus de la peste bovina, virus de chikungunya, virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV), virus de la encefalitis equina occidental (WEEV), virus de la encefalitis de California, virus de la encefalitis japonesa, virus de la fiebre del Valle del Rift (RVFV), hantavirus, virus del Dengue serotipos 1, 2, 3 y 4, virus del Nilo Occidental, virus Tacaribe, virus de Junín, virus de la rabia, virus del ébola, virus de Marburgo, adenovirus, virus del herpes simple 1 (HSV-1), virus del herpes simple 2 (HSV-2), virus de la varicela zóster (VZV), virus de Epstein-Barr (EBV), citomegalovirus (CMV), virus linfotrópico del herpes, roseolovirus o herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi, virus de hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E o virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
En determinados modos de realización, al sujeto se le diagnostica gastroenteritis, enfermedad respiratoria aguda, síndrome respiratorio agudo grave, síndrome de fatiga posvírica, fiebres hemorrágicas víricas, síndrome de inmunodeficiencia adquirida o hepatitis.
En determinados modos de realización, las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento encuentran uso cuando se administran en combinación con un segundo agente antivírico tal como abacavir, aciclovir, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir, ampligen, arbidol, atazanavir, atripla, boceprevir, cidofovir, combivir, darunavir, delavirdina, didanosina, docosanol, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtida, entecavir, famciclovir, fomivirsen, fosamprenavir, foscarnet, fosfonet, ganciclovir, ibacitabina, imunovir, idoxuridina, imiquimod, indinavir, inosina, interferón tipo III, interferón tipo II, interferón tipo I, lamivudina, ledipasvir, lopinavir, loviride, maraviroc, moroxidina, metisazona, nelfinavir, nevirapina, nexavir, oseltamivir, peginterferón alfa-2a, penciclovir, peramivir, pleconaril, podofilotoxina, raltegravir, ribavirina, rimantadina, ritonavir, piramidina, saquinavir, sofosbuvir, estavudina, telaprevir, tenofovir, tenofovir disoproxilo, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valaciclovir, valganciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidina, zalcitabina, zanamivir o zidovudina y combinaciones de los mismos.
En determinados modos de realización, la divulgación se refiere a procedimientos para tratar un cáncer que comprenden administrar una cantidad eficaz de una composición farmacéutica divulgada en el presente documento a un sujeto que la necesite. En determinados modos de realización, el cáncer se selecciona de cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de mama, melanoma, cáncer de colon y recto, linfoma no hodgkiniano, cáncer de endometrio, cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de próstata, leucemia, cáncer de tiroides y cáncer de cerebro.
En determinados modos de realización, las composiciones se administran en combinación con un segundo agente antineoplásico, tal como temozolamida, bevacizumab, procarbazina, lomustina, vincristina, gefitinib, erlotinib, docetaxel, cisplatino, 5-fluorouracilo, gemcitabina, tegafur, raltitrexed, metotrexato, arabinósido de citosina, hidroxiurea, adriamicina, bleomicina, doxorrubicina, daunomicina, epirrubicina, idarrubicina, mitomicina-C, dactinomicina y mitramicina, vinblastina, vindesina, vinorelbina, taxol, taxotere, etopósido, tenipósido, amsacrina, topotecán, camptotecina, bortezomib, anagrelida, tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno, yodoxifeno, fulvestrant, bicalutamida, flutamida, nilutamida, ciproterona, goserelina, leuprorelina, buserelina, megestrol, anastrozol, letrozol, vorazol, exemestano, finasterida, marimastat, trastuzumab, cetuximab, dasatinib, imatinib, combretastatina, talidomida y/o lenalidomida o combinaciones de los mismos.
En determinados modos de realización, la divulgación se refiere a derivados de los compuestos reivindicados en el presente documento.
Las ventajas adicionales de la divulgación se expondrán en parte en la descripción que sigue.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la presente divulgación. Aunque en la práctica o prueba de la presente divulgación también se puede usar cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, ahora se describen los procedimientos y materiales preferentes.
Cualquier procedimiento mencionado se puede llevar a cabo en el orden de los acontecimientos mencionados o en cualquier otro orden que resulte lógicamente posible.
Los modos de realización de la presente divulgación emplearán, a menos que se indique de otro modo, técnicas de medicina, química orgánica, bioquímica, biología molecular, farmacología y similares que se encuentran dentro de los conocimientos de la técnica. Dichas técnicas se explican en detalle en la literatura.
Se debe tener en cuenta que, como se usan en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones que siguen, se hará referencia a una serie de términos que se definirán para que tengan los siguientes significados a menos que sea evidente una intención contraria.
Antes de describir los diversos modos de realización, se proporcionan las siguientes definiciones, que se deben usar a menos que se indique de otro modo.
Como se usa en el presente documento, el término "óxido de fósforo" se refiere a cualquier variedad de restos químicos que contienen un enlace fósforo-oxígeno (P-O o P=O). Cuando se usan en el presente documento como grupos de enlace, las moléculas unidas se pueden unir al átomo de oxígeno o directamente al átomo de fósforo. El término pretende incluir, pero sin limitarse a, fosfatos, en los que el fósforo está típicamente unido a cuatro oxígenos, y fosfonatos, en los que el fósforo está típicamente unido a un carbono y tres oxígenos. Un "polifosfato" se refiere en general a fosfatos unidos entre sí por al menos un enlace fósforo-oxígeno-fósforo (P-O-P). Un "polifosfonato" se refiere a un polifosfato que contiene al menos un enlace fósforo-carbono (C-P-O-P). Además de contener un enlace fósforo-oxígeno, los óxidos de fósforo pueden contener un enlace fósforo-tiol (P-S o P=S) y/o un enlace fósforo-amina (P-N), denominados respectivamente fosforotioato o fosforoamidato. En los óxidos de fósforo, el átomo de oxígeno puede formar un enlace simple o doble con el fósforo o combinaciones, y el oxígeno se puede unir además a otros átomos, tales como carbono, o puede existir como un anión que se compensa con un catión, por ejemplo, metal o amina cuaternaria.
Como se usa en el presente documento, "alquilo" significa un hidrocarburo no cíclico, cíclico, lineal o ramificado, insaturado o saturado, tales como los que contienen de 1 a 22 átomos de carbono, e incluye específicamente metilo, etilo, propilo, isopropilo, ciclopropilo, butilo, isobutilo, t-butilo, pentilo, ciclopentilo, isopentilo, neopentilo, hexilo, isohexilo, ciclohexilo, ciclohexilmetilo, 3-metilpentilo, 2,2-dimetilbutilo y 2,3-dimetilbutilo. El término incluye grupos alquilo tanto sustituidos como no sustituidos. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más restos seleccionados de, por ejemplo, hidroxilo, amino, halo, deutero, alquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfónico, sulfato, ácido fosfónico, fosfato o fosfonato o cualquier otro grupo funcional viable que no inhiba la actividad farmacológica de este compuesto, ya sea desprotegido o protegido, según sea necesario, como saben los expertos en la técnica, por ejemplo, como se enseña en T. W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis," 3.a ed., John Wiley & Sons, 1999.
El término "alquilo inferior', como se usa en el presente documento, y a menos que se especifique de otro modo, se refiere a un grupo alquilo C1 a C4 saturado lineal, ramificado o, si corresponde, cíclico (por ejemplo, ciclopropilo), que incluye tanto las formas sustituidas como las no sustituidas. A menos que se indique específicamente de otro modo en la presente solicitud, cuando el alquilo es un resto adecuado, el alquilo inferior es preferente.
El término "halo" o "halógeno", como se usa en el presente documento, incluye cloro, bromo, yodo y flúor.
Los alquilos mono- o policíclicos no aromáticos se denominan en el presente documento "carbociclos" o grupos "carbociclilos" que contienen de 3 a 30 átomos de carbono. Los carbociclos saturados representativos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y similares; mientras que los carbociclos insaturados incluyen ciclopentenilo, ciclohexenilo y similares.
Los "heterocarbociclos" o grupos "heterocarbociclilos" son carbociclos que contienen de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno y azufre que pueden ser saturados o insaturados (pero no aromáticos), monocíclicos o policíclicos, y en los que los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados, y el heteroátomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado. Los heterocarbociclos incluyen morfolinilo, pirrolidinonilo, pirrolidinilo, piperidinilo, hidantoinilo, valerolactamilo, oxiranilo, oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, tetrahidropiridinilo, tetrahidroprimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo, tetrahidropirimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo y similares. "Arilo" significa un anillo monocíclico o policíclico carbocíclico aromático que contiene de 6 a 32 átomos de carbono, tal como fenilo o naftilo. Los sistemas de anillo policíclicos pueden contener uno o más anillos no aromáticos, pero no es obligatorio, siempre que uno de los anillos sea aromático.
Como se usa en el presente documento, "heteroarilo" se refiere a un heterocarbociclo aromático que tiene de 1 a 4 heteroátomos seleccionados de nitrógeno, oxígeno y azufre, y que contiene al menos 1 átomo de carbono, incluyendo los sistemas de anillo mono- y policíclicos. Los sistemas de anillo policíclicos pueden contener uno o más anillos no aromáticos, pero no es obligatorio, siempre que uno de los anillos sea aromático. Los heteroarilos representativos son furilo, benzofuranilo, tiofenilo, benzotiofenilo, pirrolilo, indolilo, isoindolilo, azaindolilo, piridilo, quinolinilo, isoquinolinilo, oxazolilo, isooxazolilo, benzoxazolilo, pirazolilo, imidazolilo, bencimidazolilo, tiazolilo, benzotiazolilo, isotiazolilo, piridacinilo, pirimidinilo, piracinilo, triacinilo, cinolinilo, ftalacinilo y quinazolinilo. Se contempla que el uso del término "heteroarilo" incluye derivados N-alquilados, tales como un sustituyente 1-metilimidazol-5-ilo.
Como se usa en el presente documento, "heterociclo" o "heterociclilo" se refiere a sistemas de anillo mono- y policíclicos que tienen de 1 a 4 heteroátomos seleccionados de nitrógeno, oxígeno y azufre, y que contienen al menos 1 átomo de carbono. Los sistemas de anillo mono- y policíclicos pueden ser aromáticos, no aromáticos o mezclas de anillos aromáticos y no aromáticos. Heterociclo incluye heterocarbociclos, heteroarilos y similares. "Alquiltio" se refiere a un grupo alquilo como se define anteriormente unido a través de un puente de azufre. Un ejemplo de un alquiltio es metiltio (es decir, -S-CH3).
"Alcoxi" se refiere a un grupo alquilo como se define anteriormente unido a través de un puente de oxígeno. Los ejemplos de alcoxi incluyen, pero no se limitan a, metoxi, etoxi, n-propoxi, i-propoxi, n-butoxi, s-butoxi, t-butoxi, npentoxi y s-pentoxi. Los grupos alcoxi preferentes son metoxi, etoxi, n-propoxi, i-propoxi, n-butoxi, s-butoxi y tbutoxi.
"Alquilamino" se refiere a un grupo alquilo como se define anteriormente unido a través de un puente amino. Un ejemplo de un alquilamino es metilamino (es decir, -NH-CH3).
"Alcanoílo" se refiere a un alquilo como se define anteriormente unido a través de un puente carbonilo (es decir, -(C=O)alquilo).
"Alquilsulfonilo" se refiere a un alquilo como se define anteriormente unido a través de un puente sulfonilo (es decir, -S(=O)2alquilo) tal como mesilo y similares, y "Arilsulfonilo" se refiere a un arilo unido a través de un puente sulfonilo (es decir, -S(=O)2arilo).
"Alquilsulfinilo" se refiere a un alquilo como se define anteriormente unido a través de un puente sulfinilo (es decir, -S(=O)alquilo).
El término "sustituido" se refiere a una molécula en la que al menos un átomo de hidrógeno se reemplaza por un sustituyente. Cuando están sustituidos, uno o más de los grupos son "sustituyentes". La molécula puede estar sustituida de forma múltiple. En el caso de un sustituyente oxo ("=O"), se reemplazan dos átomos de hidrógeno. Ejemplos de sustituyentes dentro de este contexto pueden incluir halógeno, hidroxi, alquilo, alcoxi, nitro, ciano, oxo, carbociclilo, carbocicloalquilo, heterocarbociclilo, heterocarbocicloalquilo, arilo, arilalquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, -NRaRb, -NRaC(=O)Rb, -NRaC(=O)NRaNRb, -NRaC(=O)ORb, -NRaSO2Rb, -C(=O)Ra, -C(=O)ORa, -C(=O)NRaRb, -OC(=O)NRaRb, -ORa, -SRa, -SORa, -S(=O)2Ra, -OS(=O)2Ra y -S(=O)2ORa. Ra y Rb en este contexto pueden ser iguales o diferentes e independientemente hidrógeno, halógeno, hidroxilo, alquilo, alcoxi, alquilo, amino, alquilamino, dialquilamino, carbociclilo, carbocicloalquilo, heterocarbociclilo, heterocarbocicloalquilo, arilo, arilalquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo.
El término "opcionalmente sustituido", como se usa en el presente documento, significa que la sustitución es opcional y, por lo tanto, es posible que el átomo designado no esté sustituido.
Como se usa en el presente documento, "sales" se refiere a derivados de los compuestos divulgados en los que el compuesto original se modifica preparando sales ácidas o básicas del mismo. Los ejemplos de sales incluyen, pero no se limitan a, sales de ácidos minerales u orgánicos de residuos básicos tales como aminas, alquilaminas o dialquilaminas; sales alcalinas u orgánicas de residuos ácidos tales como ácidos carboxílicos; y similares. En modos de realización típicos, las sales son sales farmacéuticamente aceptables no tóxicas convencionales que incluyen las sales de amonio cuaternario del compuesto original formado y ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos. Las sales preferentes incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos tales como clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, sulfámico, fosfórico, nítrico y similares; y las sales preparadas a partir de ácidos orgánicos tales como acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, pamoico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutámico, benzoico, salicílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzoico, fumárico, toluenosulfónico, metanosulfónico, etanodisulfónico, oxálico, isetiónico y similares.
"Sujeto" se refiere a cualquier animal, preferentemente un paciente humano, ganado, roedor, mono o mascota doméstica.
El término "profármaco" se refiere a un agente que se convierte en una forma biológicamente activa in vivo. Los profármacos suelen ser útiles porque, en algunas situaciones, pueden ser más fáciles de administrar que el compuesto original. Pueden, por ejemplo, estar biodisponibles por administración oral mientras que el compuesto original no lo está. El profármaco también puede tener una solubilidad mejorada en las composiciones farmacéuticas con respecto al fármaco original. Un profármaco se puede convertir en el fármaco original mediante diversos mecanismos, incluyendo procesos enzimáticos e hidrólisis metabólica.
Como se usa en el presente documento, el término "derivado" se refiere a un compuesto estructuralmente similar que retiene suficientes atributos funcionales del análogo identificado. El derivado puede ser estructuralmente similar porque carece de uno o más átomos, está sustituido con uno o más sustituyentes, es una sal, está en diferentes estados de hidratación/oxidación, por ejemplo, se sustituye un enlace simple o doble, se sustituye un grupo hidroxi por una cetona, o porque uno o más átomos de la molécula se cambian, tal como, pero sin limitarse a, se reemplaza un átomo de oxígeno por un átomo de azufre o nitrógeno o se reemplaza un grupo amino por un grupo hidroxilo o viceversa. En un derivado contemplado se reemplaza un carbono de un anillo aromático por un nitrógeno. El derivado puede ser un profármaco. Los derivados se pueden preparar mediante cualquier variedad de procedimientos sintéticos o adaptaciones apropiadas presentadas en la literatura química o en los libros de texto de química sintética u orgánica, tales como los que se proporcionan en "March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure", Wiley, 6.a edición (2007), Michael B. Smith o en "Domino Reactions in Organic Synthesis", Wiley (2006), Lutz F. Tietze.
Como se usan en el presente documento, los términos "prevenir" y "previniendo" incluyen la inhibición total o parcial de la recidiva, propagación o aparición de una enfermedad o afección patológica a la que se hace referencia. No se pretende que la presente divulgación se limite a la prevención completa. En algunos modos de realización, se retrasa la aparición o se reduce la gravedad de la enfermedad.
Como se usan en el presente documento, los términos "tratar" y "tratando" no se limitan al caso en el que se cura al sujeto (por ejemplo, el paciente) y se erradica la enfermedad. Más bien, los modos de realización de la presente divulgación también contemplan un tratamiento que simplemente reduzca los síntomas y/o retrase la progresión de la enfermedad.
Como se usa en el presente documento, el término "combinación con", cuando se usa para describir la administración con un tratamiento adicional, significa que el agente se puede administrar antes de, conjuntamente con o después del tratamiento adicional, o una combinación de los mismos.
Análogos de nucleósidos como agentes antivíricos
Los análogos de nucleósidos utilizan la vía de rescate de nucleósidos del huésped para la fosforilación secuencial por desoxinucleósido cinasas (dNK), desoxinucleósido monofosfato cinasas (dNMPK) y nucleósido difosfato cinasa (NDPK). Sin embargo, la activación intracelular de estos compuestos a menudo se ve comprometida por la alta especificidad por el sustrato de las cinasas endógenas del huésped. Los estudios in vitro e in vivo han demostrado que la primera y/o la segunda fosforilación, catalizadas por dNK y dNMPK, a menudo representan las etapas limitantes de la velocidad en la activación de los análogos de nucleósidos. Estos bloqueos significativos en la cascada de fosforilación de un análogo de nucleósido dado darán como resultado la ausencia de cualquier actividad observable en ensayos celulares. Para eludir estos bloqueos, se han desarrollado varias estrategias de derivación de cinasas. Por ejemplo, los fosforamidatos de McGuigan son conjugados químicos que se usan para la derivación de cinasas. Véase Serpi et al., J Med Chem, 2012, 55(l0):4629-4639. El metabolismo de estos profármacos comienza con una escisión del éster carboxílico catalizada por esterasa, seguida de varias etapas de reordenamiento químico que dan como resultado un fosforamidato de aminoácido. La escisión final la lleva a cabo una de varias fosforamidasas endógenas, una que se ha identificado como la proteína de unión a nucleótidos de la tríada de histidina 1 (hINT 1).
Una estrategia alternativa con profármacos para eludir estos bloqueos consiste en utilizar bases esfingoides para enmascarar fosfatos de análogos de nucleótidos. Las bases esfingoides ofrecen la posibilidad de administrar fosfatos de análogos de nucleótidos en tejidos críticos tales como el cerebro. El concepto de diseño que impulsa el uso de bases esfingoides para formar conjugados nucleósido-lípido se basa en las observaciones de que los análogos de bases esfingoides: (a) se absorben bien después de la administración oral, (b) son resistentes al catabolismo oxidativo en los enterocitos y (c) alcanzan altas concentraciones en el cerebro. En base a los datos de captación intestinal de conjugados de fármacos de fosfolípidos tradicionales en ratones y a nuestros datos de absorción oral de bases esfingoides en ratas, nuestros conjugados de bases esfingoides se deberían absorber bien y deberían resistir el metabolismo de primer paso. Después de la absorción, las bases esfingoides, incluyendo la esfingosina-1-fosfato, se transportan en la sangre por medio de lipoproteínas y de proteínas plasmáticas libres como la albúmina. Se ha demostrado que la captación activa de células epiteliales de los fosfatos de bases esfingoides se produce por medio del transportador ABC, CFTR, aunque también es posible el transporte pasivo de proteínas y la captación endocitótica; se cree que las células diana del sistema nervioso central (SNC) y del tejido linfoide asociado al intestino (GALT) procesarían de forma similar los conjugados de fármacos administrados extracelularmente. Los estudios farmacocinéticos de esfingolípidos en ratas mencionados anteriormente dieron como resultado concentraciones tisulares tras 24 horas que fueron de 10 a 300 veces superiores a las concentraciones plasmáticas Cmáx., con niveles pulmonares y cerebrales particularmente elevados y sin evidencia de toxicidad. Este enfoque tiene un potencial significativo para la administración de conjugados con altas concentraciones de fármacos a tejidos críticos.
Compuestos
En modos de realización ejemplares, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000009_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
En modos de realización ejemplares, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000009_0002
o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
En modos de realización ejemplares, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000009_0003
o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
En modos de realización ejemplares, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000010_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
En modos de realización ejemplares, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000010_0002
o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
En modos de realización ejemplares, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000011_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Enfermedades infecciosas
Los compuestos proporcionados en el presente documento se pueden usar para tratar enfermedades infecciosas víricas. Los ejemplos de infecciones víricas incluyen, pero no se limitan a, infecciones causadas por virus de ARN (incluyendo virus de ARN de hebra negativa, virus de ARN de hebra positiva, virus y retrovirus de ARN bicatenario) o virus de ADN. En el presente documento se contemplan todas las cepas, tipos y subtipos de virus de ARN y virus de ADN.
Los ejemplos de virus de ARN incluyen, pero no se limitan a, picornavirus, que incluyen aftovirus (por ejemplo, virus de la fiebre aftosa O, A, C, Asia 1, SAT1, SAT2 y SAT3), cardiovirus (por ejemplo, virus de la encefalomiocarditis y virus de la encefalomielitis murina de Theiller), enterovirus (por ejemplo, poliovirus 1, 2 y 3, enterovirus humanos A-D, enterovirus bovinos 1 y 2, coxsackievirus humanos A1-A22 y a 24, coxsackievirus humanos B1-B5, ecovirus humanos 1-7, 9, 11-12, 24, 27, 29-33, enterovirus humanos 68-71, enterovirus porcinos 8-10 y enterovirus de simios 1-18), erbovirus (por ejemplo, virus de la rinitis equina), hepatovirus (por ejemplo, virus de la hepatitis A humana y virus de la hepatitis A de simios), kobuvirus (por ejemplo, kobuvirus bovino y virus de Aichi), parechovirus (por ejemplo, parechovirus humano 1 y parechovirus humano 2), rinovirus (por ejemplo, rinovirus A, rinovirus B, rinovirus C, HRV16, HRV16 (VR-11757), HRV14 (VR-284) o HRV1A (VR-1559), rinovirus humano 1-100 y rinovirus bovino 1 -3) y teschovirus (por ejemplo, teschovirus porcino).
Ejemplos adicionales de virus de ARN incluyen calicivirus, que incluyen norovirus (por ejemplo, virus de Norwalk), sapovirus (por ejemplo, virus de Sapporo), lagovirus (por ejemplo, virus de la enfermedad hemorrágica del conejo y síndrome de la liebre parda europea) y vesivirus (por ejemplo, virus del exantema vesicular porcino y calicivirus felino). Otros virus de ARN incluyen astrovirus, que incluyen mamastorvirus y avastrovirus. Los togavirus también son virus de ARN. Los togavirus incluyen alfavirus (por ejemplo, virus de chicungunya, virus Sindbis, virus del bosque Semliki, virus de la encefalitis equina occidental, virus Getah oriental, virus de los Everglades, virus de la encefalitis equina venezolana y virus Aura) y virus de la rubéola. Ejemplos adicionales de virus de ARN incluyen los flavivirus (por ejemplo, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus Tyuleniy, virus Aroa, virus M (tipos 1 a 4), virus Kedougou, virus de la encefalitis japonesa (JEV), virus del Nilo Occidental (WNV), virus del Dengue (incluyendo los genotipos 1-4), virus Kokobera, virus Ntaya, virus Spondweni, virus de la fiebre amarilla, virus del murciélago de Entebbe, virus Modoc, virus del Río Bravo, virus del agente de fusión celular, pestivirus, virus GB A, virus similares a GBV-A, virus GB C, virus de la hepatitis G, hepacivirus (virus de la hepatitis C (VHC), los seis genotipos), virus de la diarrea vírica bovina (BVDV) tipos 1 y 2 y virus GB B).
Otros ejemplos de virus de ARN son los coronavirus, que incluyen coronavirus respiratorios humanos tales como SARS-CoV, HCoV-229E, HCoV-NL63 y HCoV-OC43. Los coronavirus también incluyen CoV similar al SARS de murciélago, coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), coronavirus del pavo, coronavirus del pollo, coronavirus felino y coronavirus canino. Virus de ARN adicionales incluyen arterivirus (por ejemplo, arterivirus equino, virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, virus que eleva la lactato deshidrogenasa de ratones y virus de la fiebre hemorrágica de los simios). Otros virus de ARN incluyen los rhabdovirus, que incluyen lisavirus (por ejemplo, virus de la rabia, virus del murciélago de Lagos, virus Mokola, virus de Duvenhage y lisavirus del murciélago europeo), vesiculovirus (por ejemplo, VSV-Indiana, VSV-New Jersey, VSV-Alagoas, virus Piry, virus Cocal, virus Maraba, virus Isfahan y virus Chandipura) y efemerovirus (por ejemplo, virus de la fiebre efímera bovina, virus del Adelaide River y virus Berrimah). Ejemplos adicionales de virus de ARN incluyen los filovirus. Estos incluyen los virus de Marburgo y del Ébola (por ejemplo, EBOV-Z, EBOV-S, EBOV-IC y EBOV-R).
Los paramixovirus también son virus de ARN. Ejemplos de estos virus son los rubulavirus (por ejemplo, virus de las paperas, virus paragripal 5, virus paragripal humano tipo 2, virus Mapuera y rubulavirus porcino), avulavirus (por ejemplo, virus de la enfermedad de Newcastle), respovirus (por ejemplo, virus Sendai, virus paragripal humano tipo 1 y tipo 3, virus paragripal bovino tipo 3), henipavirus (por ejemplo, virus Hendra y virus Nipah), morbillivirus (por ejemplo, virus del sarampión, morvillivirus cetáceo, virus del moquillo canino, virus de la peste de pequeños rumiantes, virus del moquillo de las focas y virus de la peste bovina), neumovirus (por ejemplo, virus respiratorio sincicial humano (RSV) A2, B1 y S2, virus respiratorio sincicial bovino y virus de la neumonía de ratones), metaneumovirus (por ejemplo, metaneumovirus humano y metaneumovirus aviar). Paramixovirus adicionales incluyen virus Fer-de-Lance, paramixovirus Tupaia, virus Menangle, virus Tioman, virus Beilong, virus J, virus Mossman, virus Salem y virus Nariva.
Virus de ARN adicionales incluyen los ortomixovirus. Estos virus incluyen virus y cepas de la gripe (p. ej., virus de gripe A, gripe A cepa A/Victoria/3/75, gripe A cepa A/Puerto Rico/8/34, gripe A H1N1 (incluyendo, pero sin limitarse a, A/WS/33, A/NWS/33 y A/California/04/2009), gripe B, gripe B cepa Lee y gripe C) H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3 y H10N7), así como gripe aviar (por ejemplo, cepas H5N1, H5N1 Duck/MN/1525/81, H5N2, H7N1, H7N7 y H9N2), thogotovirus e isavirus. Los orthobunyavirus (por ejemplo, virus Akabane, virus de la encefalitis de California, virus Cache Valley, virus de la liebre americana), nairovirus (por ejemplo, virus de la oveja de Nairobi, virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo y virus Hughes), flebovirus (por ejemplo, virus Candiru, Punta Toro, de la fiebre el Valle del Rift, de la fiebre del flebótomo, de Nápoles, de la Toscana, de Silicia y de Chagres) y hantavirus (por ejemplo, virus Hantaan, Dobrava, Seoul, Puumala, Sin Nombre, Bayou, Black Creek Canal, Andes y Thottapalayam) también son virus de ARN. Los arenavirus tales como virus de la coriomeningitis linfocítica, virus de Lujo, virus de la fiebre de Lassa, virus de la fiebre hemorrágica argentina, virus de la fiebre hemorrágica boliviana, virus de la fiebre hemorrágica venezolana, SABV y WWAV también son virus de ARN. El virus de la enfermedad de Borna también es un virus de ARN. El virus de la hepatitis D (Delta) y de la hepatitis E también son virus de ARN.
Virus de ARN adicionales incluyen reovirus, rotavirus, birnavirus, crisovirus, cistovirus, hipovirus, partitivirus y totovirus. Orbivirus tales como el virus de la peste equina africana, virus de la lengua azul, virus Changuinola, virus Chenuda, virus Chobar Gorge, virus Comparta, virus de la enfermedad hemorrágica epizoótica, virus de la encefalosis equina, virus Eubenangee, virus Ieri, virus Great Island, virus Lebombo, virus Orungo, virus Palyam, virus de la viruela equina peruana, virus del río St. Croix, virus Umatilla, virus Wad Medani, virus Wallal, virus Warrego y virus Wongorr también son virus de ARN. Los retrovirus incluyen alfarretrovirus (por ejemplo, virus del sarcoma de Rous y virus de la leucemia aviar), betarretrovirus (por ejemplo, virus del tumor mamario de ratón, virus del mono Mason-Pfizer y retrovirus de la oveja Jaagsiekte), gammarretrovirus (por ejemplo, virus de la leucemia murina y virus de la leucemia felina), deltrarretrovirus (por ejemplo, virus de la leucemia de linfocitos T humana (HTLV-1, HTLV-2), virus de la leucemia bovina, STLV-1 y STLV-2), epsilonrretrovirus (por ejemplo, virus del sarcoma cutáneo de los leucomas y virus de la hiperplasia epidérmica de los leucomas 1), virus de la reticuloendoteliosis (por ejemplo, virus sincicial del pollo, lentivirus (por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) tipo 1, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) tipo 2, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) tipo 3, virus de la inmunodeficiencia del simio, virus de la anemia infecciosa equina, virus de inmunodeficiencia felina, virus de artritis y encefalitis caprina y virus Visna maedi) y espumavirus (por ejemplo, virus espumoso humano y virus formador de sincicios felinos).
Los ejemplos de virus de ADN incluyen poliomavirus (por ejemplo, virus del simio 40, agente del simio 12, virus BK, virus JC, virus del polioma de células de Merkel, virus del polioma bovino y papovavirus linfotrófico), papilomavirus (por ejemplo, papilomavirus humano, papilomavirus bovino), adenovirus (por ejemplo, adenovirus A-F, adenovirus canino tipo I, adenovirus canino tipo 2), circovirus (por ejemplo, circovirus porcino y virus de la enfermedad del pico y las plumas (BFDV)), parvovirus (por ejemplo, parvovirus canino), eritrovirus (por ejemplo, dependoparvovirus tipos 1-8), betaparvovirus, amdovirus, densovirus, iteravirus, brevidensovirus, pefudensovirus, herpesvirus 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 (por ejemplo, virus del herpes simple 1, virus del herpes simple 2, virus de la varicela-zóster, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus, virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi, virus del herpes humano 6 variante A, virus del herpes humano 6 variante B y virus del herpes cercopithecine 1 (virus B)), poxvirus (por ejemplo, virus de la viruela, viruela bovina, viruela del mono, vaccinia, Uasin Gishu, viruela del camello, seudoviruela bovina, viruela de las palomas, viruela de los caballos, viruela aviar, viruela del pavo y viruela porcina) y hepadnavirus (por ejemplo, virus de la hepatitis B y virus similares a los de la hepatitis B). En el presente documento también se contemplan virus quiméricos que comprenden porciones de más de un genoma vírico.
En algunos modos de realización, la divulgación encuentra uso en el tratamiento o la prevención de una infección por virus, bacterias, hongos, protozoos y parásitos. En algunos modos de realización, la divulgación encuentra uso en procedimientos para tratar una infección vírica que comprende administrar un compuesto del presente documento a un sujeto al que se le diagnostica, se sospecha o presenta síntomas de una infección vírica.
Los virus son agentes infecciosos que típicamente se pueden replicar en el interior de las células vivas de los organismos. Las partículas de virus (viriones) consisten normalmente en ácidos nucleicos, una cubierta proteica y, en algunos casos, una envoltura de lípidos que rodea la cubierta proteica. Las conformaciones de los virus varían desde simples formas helicoidales e icosaédricas hasta estructuras más complejas. Las subunidades de proteínas codificadas por el virus se autoensamblarán para formar una cápside, lo que en general requiere la presencia del genoma del virus. Los virus complejos pueden codificar proteínas que ayudan en la construcción de su cápside. Las proteínas asociadas con ácido nucleico son conocidas como nucleoproteínas, y la asociación de las proteínas de la cápside vírica con el ácido nucleico vírico se denomina nucleocápside.
Los virus se transmiten por una variedad de procedimientos que incluyen el contacto directo o por fluidos corporales, por ejemplo, sangre, lágrimas, semen, fluido preseminal, saliva, leche, secreciones vaginales, lesiones; contacto por gotículas, contacto fecal-oral o como resultado de la mordedura o nacimiento de un animal. Un virus tiene genes de ADN o de ARN y se denomina virus de ADN o virus de ARN, respectivamente. Un genoma vírico es monocatenario o bicatenario. Algunos virus contienen un genoma que es parcialmente bicatenario y parcialmente monocatenario. Para los virus con ARN o con ADN monocatenario, se dice que las hebras son de sentido positivo (denominada hebra positiva) o de sentido negativo (denominada hebra negativa), dependiendo de si son complementarias al ARN mensajero (ARNm) vírico. El ARN vírico de sentido positivo es idéntico al ARNm vírico y, por tanto, la célula huésped puede traducirlo de inmediato. El ARN vírico de sentido negativo es complementario del ARNm y, por tanto, una ARN polimerasa debe convertirlo en ARN de sentido positivo antes de la traducción. La nomenclatura del ADN es similar a la nomenclatura del ARN, en cuanto a que la hebra codificante del ARNm vírico es complementaria (negativa) a ella y la hebra no codificante es una copia de ella (positiva).
Las variaciones antigénicas mayores o reordenación antigénica puede dar lugar a cepas novedosas. Los virus sufren alteraciones genéticas por varios mecanismos. Estos incluyen un proceso denominado deriva genética en el que las bases individuales del ADN o el ARN mutan a otras bases. Las variaciones antigénicas mayores se producen cuando existe un cambio importante en el genoma del virus. Esto puede ser el resultado de una recombinación o reordenación. Los virus de ARN a menudo existen como cuasiespecies o enjambres de virus de la misma especie pero con secuencias de nucleósidos del genoma ligeramente diferentes.
El material genético dentro de los virus y el procedimiento por el cual se replica el material varían entre los diferentes tipos de virus. La replicación del genoma de la mayoría de los virus de ADN tiene lugar en el núcleo de la célula. Si la célula tiene el receptor apropiado en su superficie, estos virus se introducen en la célula por fusión con la membrana celular o por endocitosis. La mayoría de los virus de ADN dependen completamente de la maquinaria de síntesis de a Dn y ARN del huésped y de la maquinaria de procesamiento de ARN. La replicación normalmente tiene lugar en el citoplasma. Los virus de ARN usan típicamente sus propias enzimas ARN replicasas para crear copias de sus genomas.
La clasificación de Baltimore de virus se basa en el mecanismo de producción de ARNm. Los virus deben generar ARNm a partir de sus genomas para producir proteínas y replicarse, pero se usan diferentes mecanismos para lograrlo. Los genomas víricos pueden ser ARN o ADN monocatenarios (mc) o bicatenarios (bc) y pueden o no usar retrotranscriptasa (RT). Adicionalmente, los virus de ARNmc pueden ser de sentido (positivo) o antisentido (negativo). Esta clasificación divide a los virus en siete grupos: I, virus de ADNbc (p. ej., adenovirus, herpesvirus, poxvirus); II, virus de ADNmc con ADN de sentido (positivo) (p. ej., parvovirus); III, virus de ARNbc (p. ej., reovirus); IV, virus de ARNmc con ARN de sentido (positivo) (p. ej., picornavirus, togavirus); V, virus de ARNmc(negativo) con ARN de sentido (negativo) (p. ej., ortomixovirus, rhabdovirus); VI, virus de ARNmc-RT con ARN de sentido (positivo) con ADN intermedio en el ciclo de vida (p. ej., retrovirus); y VII, virus de ADNbc-RT (p. ej., hepadnavirus).
El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un lentivirus (un miembro de la familia de los retrovirus) que causa el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Los lentivirus se transmiten como virus de ARN monocatenario de sentido positivo con envoltura. Tras la entrada en la célula diana, el genoma del ARN vírico se convierte en ADN bicatenario mediante una retrotranscriptasa codificada por el virus. Este ADN vírico se integra a continuación en el ADN celular mediante una integrasa codificada por el virus, junto con cofactores celulares del huésped. Existen dos especies de VIH. El VIH-1 a veces se denomina LAV o HTLV-III.
El VIH infecta principalmente las células vitales del sistema inmunitario humano, tales como los linfocitos T cooperadores (linfocitos T CD4+), los macrófagos y las células dendríticas. La infección por VIH da lugar a niveles bajos de linfocitos T CD4+. Cuando el número de linfocitos T CD4+ desciende por debajo de un nivel crítico, se pierde la inmunidad celular y el cuerpo se vuelve progresivamente más susceptible a otras infecciones víricas o bacterianas. Los sujetos con VIH típicamente desarrollan neoplasias malignas asociadas con un fallo progresivo del sistema inmunitario.
La envoltura vírica está compuesta por dos capas de fosfolípidos tomados de la membrana de una célula humana cuando una partícula de virus recién formada brota de la célula. Incrustadas en la envoltura vírica existen proteínas de la célula huésped y una proteína del VIH conocida como Env. La Env contiene glicoproteínas gp120 y gp41. El genoma de ARN consiste en de puntos de referencia estructurales (LTR, TAR, RRE, PE, SLIP, CRS e INS) y nueve genes (gag, pol y env, tat, rev, nef, vif, vpr, vpu y, a veces, un décimo tev, que es una fusión de tat env y rev) que codifican 19 proteínas. Tres de estos genes, gag, pol y env, contienen la información necesaria para fabricar las proteínas estructurales de las nuevas partículas de virus. El diagnóstico de VIH-1 se realiza típicamente con anticuerpos en ensayos ELISA, de inmunoelectrotransferencia o de inmunoafinidad o mediante pruebas de ácido nucleico (p. ej., amplificación de ARN o ADN vírico).
El VIH se trata típicamente con una combinación de agente antivírico, por ejemplo, dos inhibidores de la retrotranscripción análogos de nucleósidos y un inhibidor de la retrotranscripción no análogo de nucleósidos o un inhibidor de proteasa. La combinación de tres fármacos se conoce comúnmente como un cóctel triple. En determinados modos de realización, la divulgación se refiere al tratamiento de un sujeto al que se le ha diagnosticado VIH mediante la administración de una composición farmacéutica divulgada en el presente documento en combinación con dos inhibidores de la retrotranscripción análogos de nucleósidos y un inhibidor de la retrotranscripción no análogo de nucleósidos o un inhibidor de proteasa.
En determinados modos de realización, la divulgación se refiere al tratamiento de un sujeto mediante la administración de un compuesto divulgado en el presente documento, emtricitabina, tenofovir y efavirenz. En determinados modos de realización, la divulgación se refiere al tratamiento de un sujeto mediante la administración de un compuesto divulgado en el presente documento, emtricitabina, tenofovir y raltegravir. En determinados modos de realización, la divulgación se refiere al tratamiento de un sujeto mediante la administración de un compuesto divulgado en el presente documento, emtricitabina, tenofovir, ritonavir y darunavir. En determinados modos de realización, la divulgación se refiere al tratamiento de un sujeto mediante la administración de un compuesto divulgado en el presente documento, emtricitabina, tenofovir, ritonavir y atazanavir.
La lectina del plátano (BanLec o BanLec-1) es una de las proteínas predominantes en la pulpa de los plátanos maduros y tiene especificidad de unión por la manosa y los oligosacáridos que contienen manosa. BanLec se une a la proteína gp120 de la envoltura del VIH-1. En determinados modos de realización, la divulgación se refiere al tratamiento de infecciones víricas, tales como el VIH, mediante la administración de un compuesto divulgado en el presente documento en combinación con una lectina del plátano.
El virus de la hepatitis C es un virus de ARN monocatenario de sentido positivo. Es el único miembro conocido del género hepacivirus en la familia Flaviviridae. Existen seis genotipos principales del virus de la hepatitis C, que se indican numéricamente. La partícula del virus de la hepatitis C consiste en un núcleo de material genético (ARN), rodeado por una capa protectora icosaédrica y revestido además por una envoltura lipídica. Dos glicoproteínas de la envoltura vírica, E1 y E2, están incrustadas en la envoltura lipídica. El genoma consiste en un único marco de lectura abierto traducido para producir una única proteína. Esta gran preproteína se corta posteriormente por proteasas celulares y víricas en proteínas más pequeñas que permiten la replicación vírica dentro de la célula huésped, o se ensamblan en partículas víricas maduras, por ejemplo, E1, E2, NS2, NS3, NS4, NS4A, NS4B, NS5, NS5A y NS5B.
El VHC da lugar a inflamación del hígado y la infección crónica da lugar a cirrosis. La mayoría de las personas con infección por hepatitis C tienen la forma crónica. El diagnóstico de VHC se pueden producir por medio del análisis de ácido nucleico de la región no codificante 5'. Se puede realizar un ensayo ELISA para detectar anticuerpos contra la hepatitis C y ensayos de ARN para determinar la carga vírica. Los sujetos infectados por VHC pueden presentar síntomas de dolor abdominal, ascitis, orina oscura, fatiga, picazón generalizada, ictericia, fiebre, náuseas, heces pálidas o de color arcilloso y vómitos.
En algunos casos, los agentes terapéuticos pueden suprimir el virus durante un largo periodo de tiempo. Los medicamentos típicos son una combinación de interferón alfa y ribavirina. Los sujetos pueden recibir inyecciones de interferón alfa pegilado. Los genotipos 1 y 4 responden peor al tratamiento basado en interferón que los otros genotipos (2, 3, 5 y 6). En determinados modos de realización, la divulgación se refiere al tratamiento de un sujeto con VHC mediante la administración de un compuesto divulgado en el presente documento a un sujeto que presenta síntomas de o al que se le ha diagnosticado infección por VHC. En determinados modos de realización, el compuesto se administra en combinación con interferón alfa y otro agente antivírico tal como ribavirina y/o un inhibidor de proteasa tal como telaprevir o boceprevir. En determinados modos de realización, al sujeto se le diagnostica el genotipo 2, 3, 5 o 6. En otros modos de realización, al sujeto se le diagnostica el genotipo 1 o 4.
En determinados modos de realización, al sujeto se le diagnostica que está infectado por un virus mediante detección de ácido nucleico o detección de antígenos víricos. El citomegalovirus (CMV) pertenece a la subfamilia Betaherpesvirinae de los Herpesviridae. En humanos, se le conoce comúnmente como HCMV o herpesvirus humano tipo 5 (HHV-5). Típicamente, los herpesvirus comparten una capacidad característica para permanecer latentes en el cuerpo durante largos períodos. La infección por HCMV puede poner en peligro la vida de los pacientes inmunodeficientes. En determinados modos de realización, los compuestos de la divulgación encuentran uso en procedimientos para tratar a un sujeto al que se le ha diagnosticado infección por citomegalovirus o para prevenir una infección por citomegalovirus mediante la administración de un compuesto divulgado en el presente documento. En determinados modos de realización, el sujeto es inmunodeficiente. En modos de realización típicos, el sujeto es un receptor de trasplante de órganos, se está sometiendo a hemodiálisis, se le ha diagnosticado un cáncer, está recibiendo un fármaco inmunosupresor y/o se le ha diagnosticado una infección por VIH. En determinados modos de realización, al sujeto puede haber recibido un diagnóstico de hepatitis por citomegalovirus, la causa de insuficiencia hepática fulminante, retinitis por citomegalovirus (inflamación de la retina, se puede detectar mediante oftalmoscopia), colitis por citomegalovirus (inflamación del intestino grueso), neumonitis por citomegalovirus, esofagitis por citomegalovirus, mononucleosis por citomegalovirus, polirradiculopatía, mielitis transversa y encefalitis subaguda. En determinados modos de realización, un compuesto divulgado en el presente documento se administra en combinación con un agente antivírico tal como valganciclovir o ganciclovir. En determinados modos de realización, el sujeto se somete a un seguimiento serológico regular.
Las infecciones por HCMV en una mujer embarazada pueden dar lugar a anomalías congénitas. La infección congénita por HCMV se produce cuando la madre padece una infección primaria (o una reactivación) durante el embarazo. En determinados modos de realización, los compuestos de la divulgación encuentran uso en procedimientos para tratar a un sujeto embarazado al que se le ha diagnosticado una infección por citomegalovirus o para prevenir una infección por citomegalovirus en un sujeto con riesgo de embarazo, que intenta quedarse embarazada o que está actualmente embarazada mediante la administración del compuesto divulgado en el presente documento.
Típicamente, los sujetos que se han infectados por CMV desarrollan anticuerpos contra el virus. Se han desarrollado varias pruebas analíticas que detectan estos anticuerpos contra el CMV. El virus se puede cultivar a partir de muestras obtenidas de orina, frotis de garganta, lavados bronquiales y muestras de tejido para detectar una infección activa. Se puede realizar un seguimiento de la carga vírica de los sujetos infectados por CMV usando PCR. La prueba de antigenemia de CMV pp65 es un ensayo basado en inmunoafinidad para identificar la proteína pp65 del citomegalovirus en leucocitos de sangre periférica. Se debe sospechar la presencia de CMV si un paciente tiene síntomas de mononucleosis infecciosa pero se obtienen resultados negativos en las pruebas de mononucleosis y virus de Epstein-Barr, o si muestra signos de hepatitis, pero se obtienen resultados negativos en las pruebas de hepatitis A, B y C. Mientras el sujeto sea sintomático, se puede realizar un cultivo de virus en cualquier momento. Para determinar si un sujeto ya ha tenido una infección por CMV, se pueden realizar pruebas analíticas para detectar anticuerpos contra CMV.
El ensayo de inmunoadsorción enzimática (o ELISA) es la prueba serológica más comúnmente disponible para medir los anticuerpos contra el CMV. El resultado se puede usar para determinar si existe una infección aguda, una infección previa o anticuerpos maternos adquiridos pasivamente en un lactante. Otras pruebas incluyen diversos ensayos de fluorescencia, hemaglutinación indirecta (PCR) y aglutinación en látex. Está disponible una técnica ELISA para IgM específica de CMV.
El virus de la hepatitis B es un hepadnavirus. La partícula del virus (virión) consiste en una envoltura lipídica externa y un núcleo de nucleocápside icosaédrico compuesto de proteína. El genoma del VHB está formado por ADN circular, pero el ADN no es completamente bicatenario. Un extremo de la hebra está unido a la ADN polimerasa vírica. El virus se replica a través de una forma intermedia de ARN mediante retrotranscripción. Típicamente, la replicación tiene lugar en el hígado, donde causa inflamación (hepatitis). El virus se propaga a la sangre, donde se encuentran las proteínas específicas del virus y sus correspondientes anticuerpos en las personas infectadas. Los análisis de sangre para detectar estas proteínas y anticuerpos se usan para diagnosticar la infección.
El virus de la hepatitis B logra entrar en la célula mediante endocitosis. Debido a que el virus se multiplica a través del ARN producido por una enzima huésped, las chaperonas del huésped deben transferir el ADN genómico vírico al núcleo celular. A continuación, el ADN vírico parcialmente bicatenario se convierte en totalmente bicatenario y se transforma en ADN circular covalentemente cerrado (ADNccc) que sirve como molde para la transcripción de ARNm víricos. El virus se divide en cuatro serotipos principales (adr, adw, ayr, ayw) en base a los epítopos antigénicos presentados en las proteínas de su envoltura, y en ocho genotipos (A-H) de acuerdo con la variación global de la secuencia de nucleótidos del genoma.
Típicamente, el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) se usa para detectar la presencia de esta infección. Es el primer antígeno vírico detectable que aparece durante la infección. Sin embargo, este antígeno puede no estar presente en las fases iniciales de una infección y puede ser indetectable en fases posteriores la infección si el huésped lo elimina. El virión infeccioso contiene una "partícula central" interna que encierra el genoma vírico. La partícula central icosaédrica está hecha de proteína central, conocida de forma alternativa como antígeno central del virus de la hepatitis B o HBcAg. Los anticuerpos IgM contra el antígeno central de la hepatitis B (IgM anti-HBc) se pueden usar como marcador serológico. Puede aparecer el antígeno 'e' de la hepatitis B (HBeAg). La presencia de HBeAg en el suero del huésped se asocia con altas tasas de replicación vírica. Determinadas variantes del virus de la hepatitis B no producen el antígeno 'e',
Si el huésped puede eliminar la infección, típicamente el HBsAg se volverá indetectable e irá seguido de la aparición de anticuerpos IgG contra el antígeno de superficie y el antígeno central de la hepatitis B (IgG anti-HBs y anti-HBc). El tiempo que transcurre entre la eliminación del HBsAg y la aparición de anti-HBs se denomina periodo ventana. Una persona negativa para HBsAg pero positiva para anti-HBs ha eliminado una infección o se ha vacunado previamente. Los individuos que siguen siendo positivos para HBsAg durante al menos seis meses se consideran portadores de hepatitis B. Los portadores del virus pueden tener hepatitis B crónica, lo que se reflejaría en niveles séricos elevados de alanina aminotransferasa e inflamación del hígado que se podría identificar mediante una biopsia. Se han desarrollado pruebas de ácido nucleico (PCR) para detectar y medir la cantidad de ADN del VHB en muestras clínicas.
La infección aguda por el virus de la hepatitis B se asocia con hepatitis vírica aguda. La hepatitis vírica aguda comienza típicamente con síntomas de mala salud general, pérdida de apetito, náuseas, vómitos, dolores corporales, fiebre leve, orina oscura y, a continuación, progresa hasta desarrollar ictericia. La infección crónica por el virus de la hepatitis B puede ser asintomática o se puede asociar con una inflamación crónica del hígado (hepatitis crónica), posiblemente dando lugar a cirrosis. Tener una infección crónica por hepatitis B aumenta la incidencia de carcinoma hepatocelular (cáncer de hígado).
Durante la infección por VHB, la respuesta inmunitaria del huésped provoca tanto daño hepatocelular como eliminación del virus. La respuesta inmunitaria adaptativa, en particular los linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos del virus, contribuye a la mayor parte de la lesión hepática asociada con la infección por VHB. Al destruir las células infectadas y producir citocinas contra el virus capaces de eliminar el VHB de los hepatocitos viables, los CTL eliminan el virus. Aunque los CTL inician y median en el daño hepático, las células inflamatorias no específicas de antígeno pueden empeorar la inmunopatología inducida por CTL, y las plaquetas activadas en el sitio de la infección pueden facilitar la acumulación de CTL en el hígado.
Los agentes terapéuticos pueden detener la replicación del virus, minimizando por tanto el daño hepático. En determinados modos de realización, la divulgación se refiere a procedimientos para tratar a un sujeto al que se le ha diagnosticado infección por VHB mediante la administración de un compuesto divulgado en el presente documento. En determinados modos de realización, el sujeto es inmunodeficiente. En determinados modos de realización, el compuesto se administra en combinación con otro agente antivírico tal como lamivudina, adefovir, tenofovir, telbivudina y entecavir y/o moduladores del sistema inmunitario tales como interferón alfa-2a e interferón alfa-2a pegilado (Pegasys). En determinados modos de realización, la divulgación se refiere a la prevención de una infección por VHB en un sujeto inmunodeficiente con riesgo de infección mediante la administración de una composición farmacéutica divulgada en el presente documento y, opcionalmente, de uno o más agentes antivíricos. En determinados modos de realización, el sujeto presenta riesgo de una infección porque a la pareja sexual del sujeto se le diagnostica infección por VHB.
Los compuestos de la presente invención se pueden administrar en combinación con un segundo agente antivírico tal como abacavir, aciclovir, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir, ampligen, arbidol, atazanavir, atripla, boceprevir, cidofovir, combivir, darunavir, delavirdina, didanosina, docosanol, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtida, entecavir, famciclovir, fomivirsen, fosamprenavir, foscarnet, fosfonet, ganciclovir, ibacitabina, imunovir, idoxuridina, imiquimod, indinavir, inosina, interferón tipo III, interferón tipo II, interferón tipo I, lamivudina, ledipasvir, lopinavir, loviride, maraviroc, moroxidina, metisazona, nelfinavir, nevirapina, nexavir, oseltamivir, peginterferón alfa-2a, penciclovir, peramivir, pleconaril, podofilotoxina, raltegravir, ribavirina, rimantadina, ritonavir, piramidina, saquinavir, sofosbuvir, estavudina, telaprevir, tenofovir, tenofovir disoproxilo, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valaciclovir, valganciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidina, zalcitabina, zanamivir o zidovudina y combinaciones de los mismos.
También se proporcionan procedimientos para tratar la infección por VHC en un sujeto. Los procedimientos comprenden administrar los compuestos de la presente invención para proporcionar al menos dos agentes antivíricos de acción directa (DAA) con o sin ribavirina durante una duración no superior a doce semanas, o durante otra duración como se establece en el presente documento. En un modo de realización, la duración del tratamiento no supera las doce semanas. En otro modo de realización, la duración del tratamiento no supera las ocho semanas. Preferentemente, los dos o más agentes antivíricos de acción directa (DAA), con o sin ribavirina, se administran en cantidades eficaces para proporcionar una respuesta virológica sostenida (RVS) o lograr otra medida de eficacia deseada en un sujeto. Al sujeto no se le administra interferón durante el régimen de tratamiento. Dicho de otro modo, en un modo de realización, los procedimientos excluyen la administración de interferón al sujeto, evitando de este modo los efectos secundarios asociados con el interferón. En algunos modos de realización, los procedimientos comprenden además la administración de un inhibidor del citocromo P-450 (tal como ritonavir) al sujeto para mejorar la farmacocinética o la biodisponibilidad de uno o más de los DAA.
Como otro aspecto, se proporcionan procedimientos para tratar la infección por VHC en un sujeto. Los procedimientos comprenden administrar (a) inhibidor de proteasa, (b) al menos un inhibidor de polimerasa, en los que al menos uno es un inhibidor de polimerasa de la presente invención y combinaciones de los mismos, con o sin (c) ribavirina y/o (d) un inhibidor de citocromo P-450 al sujeto durante una duración no superior a doce semanas, o durante otra duración como se establece en el presente documento (p. ej., el régimen de tratamiento puede tener una duración no superior a 8 semanas). Preferentemente, los compuestos se administran en cantidades eficaces para proporcionar altas tasas de RVS u otra medida de eficacia en el sujeto. Como ejemplos no limitantes, los compuestos se pueden coformular y administrar una vez al día, y el régimen de tratamiento tiene preferentemente una duración de ocho semanas o seis semanas.
Todavía como otro aspecto, se proporcionan procedimientos para tratar a una población de sujetos que presentan infección por VHC. Los procedimientos comprenden administrar al menos dos DAA, en los que uno de los DAA es un compuesto de la presente invención, con o sin ribavirina, a los sujetos durante una duración no superior a 12 u 8 o 6 semanas. Preferentemente, los al menos dos DAA se administran a los sujetos en cantidades eficaces para dar como resultado una RVS u otra medida de eficacia en al menos aproximadamente el 70 % de la población, preferentemente al menos el 90 % de la población.
En los procedimientos anteriores, así como en los procedimientos que se describen a continuación en el presente documento, los DAA se pueden seleccionar del grupo que consiste en inhibidores de proteasa, inhibidores nucleosídicos o nucleotídicos de polimerasa (uno de los cuales se proporciona en el presente documento), inhibidores no nucleosídicos de polimerasa, inhibidores de NS3B, inhibidores de NS4A, inhibidores de NS5A, inhibidores de NS5B, inhibidores de ciclofilina y combinaciones de cualquiera de los anteriores. Por ejemplo, en algunos modos de realización, los DAA usados en los presentes procedimientos comprenden o consisten en al menos un inhibidor de proteasa del VHC y al menos un inhibidor de polimerasa del VHC proporcionado en el presente documento.
Al menos uno de los inhibidores de polimerasa del VHC es uno de los compuestos de la presente invención (descritos en el presente documento). A modo de ejemplo, los compuestos de la presente invención se pueden administrar en una dosis diaria total de desde aproximadamente 100 mg hasta aproximadamente 250 mg o administrar una vez al día en una dosis de desde aproximadamente 150 mg hasta aproximadamente 250 mg.
En algunos modos de realización, los al menos dos DAA comprenden al menos un inhibidor de polimerasa del VHC de la presente invención y al menos un inhibidor de NS5A. A modo de ejemplo, el inhibidor de polimerasa de la presente invención se puede administrar en una dosis diaria total de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 250 mg, y el inhibidor de NS5A se puede administrar en una dosis diaria total de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 200 mg. Se puede coadministrar ritonavir (u otro inhibidor del citocromo P-4503A4) para mejorar la farmacocinética y la biodisponibilidad de los compuestos.
En los procedimientos anteriores, así como en los procedimientos descritos en el presente documento, los DAA con o sin ribavirina se pueden administrar en cualquier esquema y/o frecuencia de dosificación eficaz, por ejemplo, cada uno se puede administrar diariamente. Cada DAA se puede administrar por separado o en combinación, y cada DAA se puede administrar al menos una vez al día, al menos dos veces al día o al menos tres veces al día. Asimismo, la ribavirina se puede administrar al menos una vez al día, al menos dos veces al día o al menos tres veces al día, ya sea por separado o en combinación con uno o más de los DAA. En algunos modos de realización preferentes, los compuestos se administran una vez al día.
En algunos aspectos, la presente tecnología proporciona un procedimiento para tratar la infección por VHC que comprende administrar a un sujeto que lo necesite al menos dos DAA con o sin ribavirina durante una duración no superior a doce u ocho o seis semanas, en el que al sujeto no se le administra interferón durante dicho periodo. En algunos aspectos, los al menos dos AAD con o sin ribavirina se administran en una cantidad eficaz para dar como resultado una RVS. Algunos procedimientos comprenden además la administración de un inhibidor del citocromo P450 al sujeto. En algunos aspectos, la duración no supera las ocho semanas.
Aún en otro aspecto, los al menos dos agentes antivíricos de acción directa comprenden una combinación de fármacos seleccionada del grupo que consiste en: un compuesto de la presente invención, con uno o más de ABT-450 y/o ABT-267, y/o ABT- 333; un compuesto novedoso de la presente invención con un compuesto divulgado en cualquiera de los documentos US 2010/0144608; US 61/339,964; US 2011/0312973; WO 2009/039127; US 2010/0317568; 2012/151158; US 2012/0172290; WO 2012/092411; WO 2012/087833; WO 2012/083170; WO 2009/039135; US 2012/0115918; WO 2012/051361; WO 2012/009699; WO 2011/156337; US 2011/0207699; WO 2010/075376; US 7.910.595; WO 2010/120935; WO 2010/111437; WO 2010/111436; US 2010/0168384 o US 2004/0167123; un compuesto de la presente invención con uno o más de Simeprevir y/o GSK805; un compuesto de la presente invención con uno o más de Asunaprevir y/o Daclastavir y/o BMS-325; un compuesto de la presente invención con uno o más de GS-9451 y/o Ledisasvir y/o Sofosbuvir y/o GS-9669; un compuesto de la presente invención con uno o más de ACH-2684 y/o ACH-3102 y/o ACH-3422; un compuesto de la presente invención con uno o más de Boceprevir y/o MK-8742; un compuesto de la presente invención con uno o más de Faldaprevir y/o Deleobuvir; un compuesto de la presente invención con PPI-668; un compuesto de la presente invención con uno o más de telaprevir y/o VX-135; un compuesto de la presente invención con uno o más de Samatasvir y/o IDX-437; un compuesto de la presente invención con PSI-7977 y/o PSI-938, un compuesto de la presente invención con BMS-790052 y/o BMS-650032; un compuesto de la presente invención con GS-5885 y/o GS-9451; un compuesto de la presente invención con GS-5885, GS-9190 y/o GS-9451; un compuesto de la presente invención en combinación con BI-201335 y/o BI-27127; un compuesto de la presente invención en combinación con telaprevir y/o VX-222; un compuesto de la presente invención en combinación con PSI-7977 y/o TMC-435; y un compuesto de la presente invención en combinación con danoprevir y/o R7128.
Aún en otro aspecto, los al menos dos agentes antivíricos de acción directa comprenden un compuesto de la presente invención en una combinación de PSI-7977 y/o BMS-790052 (daclatasvir). Aún en otro aspecto, los al menos dos agentes antivíricos de acción directa comprenden un compuesto de la presente invención en una combinación de PSI-7977 y/o BMS-650032 (asunaprevir). Todavía en otro aspecto, los al menos agentes antivíricos de acción directa comprenden un compuesto de la presente invención en combinación con PSI-7977, BMS-650032 (asunaprevir) y/o BMS-790052 (daclatasvir). Los compuestos de la presente invención se pueden añadir a estas combinaciones o usar para reemplazar la polimerasa enumerada.
En otro aspecto, la presente tecnología presenta una combinación de al menos dos DAA para su uso en el tratamiento de una infección por VHC, en la que la duración del régimen de tratamiento no supera las doce semanas (p. ej., la duración es de 12 semanas o la duración es de 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 semanas). El tratamiento comprende administrar los al menos dos AAD a un sujeto infectado por VHC. La duración del tratamiento puede ser de 12 semanas y también puede, por ejemplo, no superar las ocho semanas (p. ej., la duración es de 8 semanas o la duración es de 7, 6, 5, 4 o 3 semanas). El tratamiento puede incluir la administración de ribavirina pero no incluye la administración de interferón. El tratamiento también puede incluir la administración de ritonavir u otro inhibidor de CYP3A4 (p. ej., cobicistat) si uno de los DAA requiere potenciación farmacocinética. Los al menos dos DAA se pueden administrar de forma simultánea o secuencial. Por ejemplo, un DAA se puede administrar una vez al día y otro DAA se puede administrar dos veces al día. En otro ejemplo, los dos DAA se administran una vez al día. Aún en otro ejemplo, los dos DAA se coformulan en una única composición y se administran de forma simultáneo (p. ej., una vez al día). Como ejemplo no limitante, el paciente que está recibiendo tratamiento puede estar infectado por el genotipo 1 del VHC, tal como el genotipo 1a o 1b. Como otro ejemplo no limitante, el paciente puede estar infectado con el genotipo 2 o 3 del VHC. Aún como otro ejemplo no limitante, el paciente puede ser un paciente que no ha recibido tratamiento previo contra el VHC, un paciente que ya haya recibido tratamiento contra el VHC, un paciente que no responde al tratamiento con interferón (p. ej., un paciente que responde en absoluto al tratamiento, un paciente que responde parcialmente al tratamiento o que es recidivante) o un paciente que no es candidato para el tratamiento con interferón
En otro aspecto, la presente tecnología presenta una combinación de al menos dos DAA para su uso en el tratamiento de una infección por VHC, en la que dicha combinación comprende un compuesto de la presente invención en combinación con compuestos seleccionados de:
una combinación de PSI-7977 y/o PSI-938;
una combinación de BMS-790052 y/o BMS-650032;
una combinación de GS-5885 y/o GS-9451;
una combinación de GS-5885, GS-9190 y/o GS-9451;
una combinación de BI-201335 y/o BI-27127;
a la combinación de telaprevir y/o VX-222;
combinación de PSI-7977 y/o TMC-435;
una combinación de danoprevir y/o R7128;
una combinación de ABT-450 y/o ABT-267 y/o ABT-333;
uno o más de los siguientes inhibidores de proteasa: ABT450, Simeprevir, Asunaprevir, GS-9451, ACH-2684, Boceprevir, MK-5172, Faldaprevir y Telaprevir;
uno o más de los siguientes inhibidores de NS5A: ABT-267, GSK805, Daclastavir, Dedipasvir, GS-5816, ACH-3102, MK-8742, PPI-668 y Samatasvir;
uno o más de los siguientes inhibidores no nucleosídicos de NS5B: ABT-333, TMC055, BMS-325, GS-9669 y Deleobuvir.
También divulgado en el presente documento, pero no reivindicado, el compuesto de la presente invención usado en las politerapias anteriores es 1911, 2023 o 2024. También divulgado en el presente documento, pero no reivindicado, el compuesto novedoso de la presente invención usado en las politerapias anteriores es 2023. Uno o más de 1911, 2033 y 2024 se pueden combinar con uno o más de ABT-450, ABT-267 y/o ABT-333 y/o un compuesto divulgado en los documentos US 2010/0144608; US 61/339.964; US 2011/0312973; WO 2009/039127; US 2010/0317568; 2012/151158; US 2012/0172290; WO 2012/092411; WO 2012/087833; WO 2012/083170; WO 2009/039135; US 2012/0115918; WO 2012/051361; WO 2012/009699; WO 2011/156337; US 2011/0207699; WO 2010/075376; US 7.910.595; WO 2010/120935; WO 2010/111437; WO 2010/111436; US 2010/0168384 o US 2004/0167123.
Aún en otro aspecto, la presente tecnología presenta una combinación de al menos dos DAA para su uso en el tratamiento de una infección por VHC, en la que dicha combinación comprende un compuesto de la presente invención en una combinación seleccionada de:
ABT-450 y/o ABT-267 y/o ABT-333 y/o un compuesto divulgado en los documentos US 2010/0144608; US 61/339.964; US 2011/0312973; WO 2009/039127; US 2010/0317568;
2012/151158; US 2012/0172290; WO 2012/092411; WO 2012/087833; WO 2012/083170;
WO 2009/039135; US 2012/0115918; WO 2012/051361; WO 2012/009699; WO 2011/156337; US 2011/0207699; WO 2010/075376; US 7.910.595; WO 2010/120935; WO 2010/111437; WO 2010/111436; US 2010/0168384 o US 2004/0167123;
una combinación de PSI-797 y/o BMS-790052;
una combinación de PSI-7977 y/o BMS-650032;
una combinación de PSI-7977, BMS-790052 y/o BMS-650032;
una combinación de INX-189 y/o BMS-790052;
combinación de INX-189 y/o BMS-650032; o
una combinación de INX-189, BMS-790052 y/o BMS-650032.
Todavía en otro aspecto, la presente tecnología presenta una combinación de al menos dos DAA para su uso en el tratamiento de una infección por VHC, en la que dicha combinación comprende una combinación de un compuesto de la presente invención y un compuesto seleccionado de:
una combinación de mericitabina y/o danoprevir;
una combinación de daclatasvir y/o BMS-791325; y
una combinación de PSI-7977 y/o GS-5885.
El tratamiento comprende administrar la combinación de DAA a un sujeto infectado por VHC.
Todavía en otro aspecto, la presente tecnología presenta un compuesto de la presente invención con PSI-7977, o una combinación de al menos dos DAA, para su uso en el tratamiento de una infección por VHC, en la que dicha combinación comprende una combinación seleccionada de:
una combinación de mericitabina y/o danoprevir;
combinación de INX-189, daclatasvir y/o BMS-791325; y
una combinación de PSI-7977 y/o GS-5885.
El tratamiento comprende administrar la combinación de DAA a un sujeto infectado por VHC.
Todavía en otro aspecto, la presente tecnología presenta una combinación de al menos dos DAA para su uso en el tratamiento de una infección por VHC, en la que dicha combinación comprende una combinación seleccionada de un compuesto de la presente invención y:
una combinación de tegobuvir y/o GS-9256;
una combinación de BMS-791325, asunaprevir y/o daclatasvir; y
una combinación de TMC-435 y/o daclatasvir.
El tratamiento comprende administrar la combinación de DAA a un sujeto infectado por VHC.
Aún en otro aspecto, la presente tecnología presenta una combinación de un compuesto de la presente invención con pSI-7977 y/o BMS-790052 para su uso en el tratamiento de una infección por VHC. El tratamiento comprende administrar la combinación de DAA a un sujeto infectado por VHC.
Aún en otro aspecto, la presente tecnología presenta una combinación de un compuesto de la presente invención con pSI-7977 y/o TMC-435 para su uso en el tratamiento de una infección por VHC.
Aún en otro aspecto, la presente tecnología presenta una combinación de un compuesto de la presente invención con danoprevir y/o mercitabina para su uso en el tratamiento de una infección por VHC.
Aún en otro aspecto, la presente tecnología presenta una combinación de un compuesto de la presente invención con daclatasvir y/o BMS-791325 para su uso en el tratamiento de una infección por VHC. El tratamiento comprende administrar la combinación de DAA a un sujeto infectado por VHC.
Aún en otro aspecto, la presente tecnología presenta una combinación de un compuesto de la presente invención con PSI-7977 y/o GS-5885 para su uso en el tratamiento de una infección por VHC. El tratamiento comprende administrar la combinación de DAA a un sujeto infectado por VHC.
La duración de los regímenes de tratamiento no supera las dieciséis semanas (p. ej., la duración es de 16 semanas; o la duración es de 14, 12 o 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 semana). El tratamiento incluye la administración de ribavirina pero no incluye la administración de interferón. El tratamiento puede incluir la administración de ritonavir u otro inhibidor de CYP3A4 (p. ej., cobicistat) si uno de los DAA requiere potenciación farmacocinética. Los dos DAA se pueden administrar de forma simultánea o secuencial. Por ejemplo, un DAA se puede administrar una vez al día y el otro DAA se puede administrar dos veces al día. En otro ejemplo, los dos DAA se administran una vez al día. Aún en otro ejemplo, los dos DAA se coformulan en una única composición y se administran de forma simultáneo (p. ej., una vez al día). Como ejemplo no limitante, el paciente que está recibiendo tratamiento puede estar infectado por el genotipo 1 del VHC, tal como el genotipo 1a o 1b. Como otro ejemplo no limitante, el paciente puede estar infectado con el genotipo 2 o 3 del VHC. Aún como otro ejemplo no limitante, el paciente puede ser un paciente que no ha recibido tratamiento previo contra el VHC, un paciente que ya haya recibido tratamiento contra el VHC, un paciente que no responde al tratamiento con interferón (p. ej., un paciente que responde en absoluto al tratamiento) o un paciente que no es candidato para el tratamiento con interferón.
Aún en otro modo de realización de este aspecto de la invención, los al menos dos DAA comprenden un inhibidor de proteasa del VHC y un inhibidor de polimerasa del VHC de la presente invención. El tratamiento puede tener una duración, por ejemplo y sin limitación, no superior a 12 semanas, tal como 8, 9, 10, 11 o 12 semanas. Preferentemente, el tratamiento tiene una duración de 12 semanas. El tratamiento también puede tener una duración de 8 semanas. El sujeto que está recibiendo tratamiento puede ser, por ejemplo, un paciente que no ha recibido tratamiento previo. El sujeto también puede ser un paciente que ya haya recibido tratamiento o un paciente que no responde al tratamiento con interferón (p. ej., un paciente que responde en absoluto al tratamiento). Preferentemente, el sujeto que está recibiendo tratamiento está infectado por el genotipo 1 del VHC, por ejemplo, el genotipo 1a del VHC. Como otro ejemplo no limitante, el sujeto que está recibiendo tratamiento está infectado por el genotipo 3 del VHC.
Aún en otro modo de realización de este aspecto de la invención, los al menos dos DAA comprenden un compuesto de la presente invención con un inhibidor de proteasa del VHC y un inhibidor no nucleosídico o no nucleotídico de polimerasa del VHC. El tratamiento puede tener una duración, por ejemplo y sin limitación, no superior a 12 semanas, tal como 8, 9, 10, 11 o 12 semanas. Preferentemente, el tratamiento tiene una duración de 12 semanas. El tratamiento también puede tener una duración de 8 semanas. El sujeto que está recibiendo tratamiento puede ser, por ejemplo, un paciente que no ha recibido tratamiento previo. El sujeto también puede ser un paciente que ya haya recibido tratamiento o un paciente que no responde al tratamiento con interferón (p. ej., un paciente que responde en absoluto al tratamiento). Preferentemente, el sujeto que está recibiendo tratamiento está infectado por el genotipo 1 del VHC, p. ej., el genotipo 1a del VHC. Como otro ejemplo no limitante, el sujeto que está recibiendo tratamiento está infectado con el genotipo 3 del VHC.
Aún en otro modo de realización de este aspecto de la invención, los DAA comprenden un compuesto de la presente invención con un inhibidor de proteasa del VHC y un inhibidor de NS5A del VHC.
Aún en otro modo de realización de este aspecto de la invención, los al menos dos DAA comprenden un inhibidor de polimerasa del VHC de la presente invención y un inhibidor de NS5A del VHC.
Aún en otro modo de realización de este aspecto de la invención, los DAA comprenden un compuesto de la presente invención y un inhibidor no nucleosídico o no nucleotídico de polimerasa del VHC y un inhibidor de NS5A del VHC.
Aún en otro modo de realización de este aspecto de la invención, los DAA pueden comprender un inhibidor nucleosídico o nucleotídico de polimerasa del VHC de la presente invención y un inhibidor de NS5A del VHC. Aún en otro modo de realización de este aspecto de la invención, los al menos dos DAA comprenden un compuesto de la presente invención con PSI-7977 y/o TMC-435.
Aún en otro modo de realización de este aspecto de la invención, los DAA comprenden un compuesto de la presente invención con PSI-7977 y/o daclatasvir.
Aún en otro modo de realización de este aspecto de la invención, los DAA comprenden un compuesto de la presente invención con PSI-7977 y/o GS-5885.
Aún en otro modo de realización de este aspecto de la invención, los DAA comprenden un compuesto de la presente invención con mericitabina y/o danoprevir.
Aún en otro modo de realización de este aspecto de la invención, los DAA comprenden un compuesto de la presente invención con BMS-790052 y/o BMS-650032.
Aún en otro modo de realización de este aspecto de la invención, los DAA comprenden un compuesto de la presente invención e INX-189, daclatasvir y/o BMS-791325.
Un régimen de tratamiento de la presente tecnología constituye en general un régimen de tratamiento completo, es decir, no se prevé ningún régimen posterior que contenga interferón. Por tanto, un tratamiento o uso descrito en el presente documento no incluye en general ningún tratamiento posterior que contenga interferón.
En un aspecto de la divulgación, una "infección" o "infección bacteriana" se refiere a una infección causada por Acinetobacter spp., Bacteroides spp., Burkholderia spp., Campylobacter spp., Chlamydia spp., Chlamydophila spp., Clostridium spp., Enterobacter spp., Enterococcus spp., Escherichia spp., Fusobacterium spp., Gardnerella spp., Haemophilus spp., Helicobacter spp., Klebsiella spp., Legionella spp., Moraxella spp., Morganella spp., Mycoplasma spp., Neisseria spp., Peptococcus spp., Peptostreptococcus spp., Proteus spp., Pseudomonas spp., Salmonella spp., Serratia spp. Staphylococcus spp., Streptoccocus spp., Stenotrophomonas spp. o Ureaplasma spp.
En un aspecto de la divulgación, una "infección" o "infección bacteriana" se refiere a una infección causada por Acinetobacter baumanii, Acinetobacter haemolyticus, Acinetobacter junii, Acinetobacter johnsonii, Acinetobacter Iwoffi, Bacteroides bivius, Bacteroides fragilis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia urealyticus, Chlamydophila pneumoniae, Clostridium difficile, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Gardnerella vaginalis, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Staphylococus aureus resistente a la meticilina, Staphylococcus aureus sensible a la meticilina, Moraxella catarrhalis, Morganella morganii, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae resistente a la penicilina, Streptococcus pneumoniae sensible a la penicilina, Peptostreptococcus magnus, Peptostreptococcus micros, Peptostreptococcus anaerobius, Peptostreptococcus asaccharolyticus, Peptostreptococcus prevotii, Peptostreptococcus tetradius, Peptostreptococcus vaginalis, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus resistente a las quinolonas, Staphylococcus epidermis resistente a las quinolonas, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptoccocus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Stenotrophomonas maltophilia, Ureaplasma urealyticum, Enterococcus faecium resistente a la vancomicina, Enterococcus faecalis resistente a la vancomicina, Staphylococcus aureus resistente a la vancomicina, Staphylococcus epidermis resistente a la vancomicina, Mycobacterium tuberculosis, Clostridium perfringens, Klebsiella oxytoca, Neisseria miningitidis, Proteus vulgaris o Staphylococcus negativos a coagulasa (incluyendo Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus hominis o Staphylococcus saprophyticus). En un aspecto de la divulgación, "infección" o "infección bacteriana" se refiere a aerobios, anaerobios estrictos, anaerobios facultativos, bacterias grampositivas, bacterias gramnegativas, bacterias gramvariables o patógenos respiratorios atípicos.
Como se divulga en el presente documento, la divulgación encuentra uso en el tratamiento de una infección bacteriana tal como una infección ginecológica, una infección de las vías respiratorias (IVR), una enfermedad de transmisión sexual o una infección de las vías urinarias.
Como se divulga en el presente documento, la divulgación encuentra uso en el tratamiento de una infección bacteriana tal como una infección causada por bacterias resistentes a los fármacos.
Como se divulga en el presente documento, la divulgación encuentra uso en el tratamiento de una infección bacteriana tal como neumonía extrahospitalaria, neumonía hospitalaria, infecciones de la piel y de la estructura de la piel, cervicitis gonocócica, uretritis gonocócica, neutropenia febril, osteomielitis, endocarditis, infecciones de las vías urinarias e infecciones causadas por bacterias resistentes a los fármacos, tales como Streptococcus pneumoniae resistente a la penicilina, Staphylococcus aureus resistente a la meticilina, Staphylococcus epidermidis resistente a la meticilina y Enterococci resistentes a la vancomicina, sífilis, neumonía asociada al respirador, infecciones intraabdominales, gonorrea, meningitis, tétanos o tuberculosis.
Como se divulga en el presente documento, la divulgación encuentra uso en el tratamiento de infecciones fúngicas tales como infecciones causadas por pitiriasis versicolor, Microsporum, Trichophyton, Epidermophyton, candidiasis, criptococosis o aspergilosis.
Como se divulga en el presente documento, la divulgación encuentra uso en el tratamiento de una infección causada por protozoos que incluyen, pero sin limitarse a, malaria, amebiasis, giardiasis, toxoplasmosis, criptosporidiosis, tricomoniasis, leishmaniasis, encefalitis letárgica o disentería.
Determinados compuestos divulgados en el presente documento son útiles para prevenir o tratar una infección por un parásito de la malaria en un sujeto y/o para prevenir, tratar y/o aliviar las complicaciones y/o los síntomas asociados con la misma y se pueden usar a continuación en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de dicha enfermedad. La malaria puede ser causada por Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale o P. malariae.
En un modo de realización, el compuesto se administra después de que el sujeto haya estado expuesto al parásito de la malaria. En otro modo de realización, un compuesto divulgado en el presente documento se administra antes de que el sujeto viaje a un país donde la malaria es endémica.
Los compuestos o las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente también se pueden usar en combinación con una o más de otras sustancias terapéuticamente útiles seleccionadas del grupo que comprende antipalúdicos como las quinolinas (p. ej., quinina, cloroquina, amodiaquina, mefloquina, primaquina, tafenoquina); antipalúdicos de peróxidos (p. ej., artemisinina, arteméter, artesunato); antipalúdicos de pirimetamina-sulfadoxina (p. ej., Fansidar); hidroxinaftoquinonas (p. ej., atovacuona); antipalúdicos de tipo acrolina (p. ej., pironaridina); y agentes antiprotozoicos tales como etilestibamina, hidroxiestilbamidina, pentamidina, estilbamidina, quinapiramina, puromicina, propamidina, nifurtimox, melarsoprol, nimorazol, nifuroxima, aminitrozol y similares. En un modo de realización, los compuestos divulgados en el presente documento se pueden usar en combinación con un fármaco adicional seleccionado del grupo que consiste en cloroquina, artemesina, qinghaosu, 8-aminoquinolina, amodiaquina, arteéter, arteméter, artemisinina, artesunato, ácido artesúnico, ácido artelínico, atovocuona, azitromicina., biguanida, fosfato de cloroquina, clorproguanil, cicloguanil, dapsona, desbutil halofantrina, desipramina, doxiciclina, inhibidores de la dihidrofolato reductasa, dipiridamol, halofantrina, haloperidol, sulfato de hidroxicloroquina, imipramina, mefloquina, penfluridol, inhibidores de fosfolípidos, primaquina, proguanil, pirimetamina, pironaridina, quinina, quinidina, quinacrineartemisinina, sulfonamidas, sulfonas, sulfadoxina, sulfaleno, tafenoquina, tetraciclina, tetrandina, triazina, sales o mezclas de los mismos. Cáncer
Como se divulga en el presente documento, la divulgación encuentra uso en un procedimiento para tratar el cáncer que comprende administrar a un paciente un compuesto divulgado en el presente documento. En algunos modos de realización, la divulgación se refiere a un compuesto divulgado en el presente documento, o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para usos en el tratamiento del cáncer.
En algunos modos de realización, la divulgación se refiere a un compuesto divulgado en el presente documento, o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el presente documento para su uso en el tratamiento del cáncer de mama, colorrectal, de pulmón (incluyendo carcinoma de pulmón microcítico, carcinoma de pulmón no microcítico y cáncer bronquioalveolar) y de próstata.
En algunos modos de realización, la divulgación se refiere a un compuesto divulgado en el presente documento, o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el presente documento para su uso en el tratamiento del cáncer del conducto biliar, de huesos, vejiga, cabeza y cuello, riñón, hígado, tejido gastrointestinal, esófago, ovario, endometrio, páncreas, piel, testículos, tiroides, útero, cuello uterino y vulva y de leucemias (incluyendo LLA y LMC), mieloma múltiple y linfomas.
En algunos modos de realización, la divulgación se refiere a un compuesto divulgado en el presente documento, o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el presente documento para su uso en el tratamiento de cáncer de pulmón, cáncer de próstata, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de endometrio, cáncer de riñón, cáncer gástrico, sarcomas, cánceres de cabeza y cuello, tumores del sistema nervioso central y sus metástasis, y también para el tratamiento de glioblastomas.
En algunos modos de realización, los compuestos divulgados en el presente documento se podrían usar en el entorno clínico como un único agente por sí mismo o en combinación con otros agentes clínicamente relevantes. Este compuesto también podría prevenir los potenciales mecanismos de resistencia al cáncer que pueden surgir debido a mutaciones en un conjunto de genes.
El tratamiento antineoplásico definido en el presente documento se puede aplicar como un tratamiento único o puede implicar, además del compuesto de la divulgación, cirugía o radioterapia o quimioterapia convencionales. Dicha quimioterapia puede incluir una o más de las siguientes categorías de agentes antitumorales:
(i) fármacos antiproliferativos/antineoplásicos y combinaciones de los mismos, como se usan en oncología médica, tales como agentes alquilantes (por ejemplo, cisplatino, carboplatino, ciclofosfamida, mecloretamina, melfalán, clorambucilo, busulfán y nitrosoureas); antimetabolitos (por ejemplo, antifolatos tales como fluoropirimidinas como 5-fluorouracilo y gemcitabina, tegafur, raltitrexed, metotrexato, arabinósido de citosina e hidroxiurea); antibióticos antitumorales (por ejemplo, antraciclinas como adriamicina, bleomicina, doxorrubicina, daunomicina, epirrubicina, idarrubicina, mitomicina-C, dactinomicina y mitramicina); agentes antimitóticos (por ejemplo, alcaloides de la vinca como vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina y taxoides como taxol y taxotere); e inhibidores de topoisomerasa (por ejemplo, epipodofilotoxinas como etopósido y tenipósido, amsacrina, topotecán y camptotecina); e inhibidores del proteosoma (por ejemplo, bortezomib [Velcade®]); y el agente anegrilida [Agrylin®]; y el agente interferón alfa;
(ii) agentes citostáticos tales como antiestrógenos (por ejemplo, tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno y yodoxifeno), reguladores por disminución del receptor de estrógeno (por ejemplo, fulvestrant), antiandrógenos (por ejemplo, bicalutamida, flutamida, nilutamida y acetato de ciproterona), antagonistas de LHRH o agonistas de LHRH (por ejemplo, goserelina, leuprorelina y buserelina), progestágenos (por ejemplo, acetato de megestrol), inhibidores de aromatasa (por ejemplo, como anastrozol, letrozol, vorazol y exemestano) e inhibidores de la 5areductasa tales como finasteride;
(iii) agentes que inhiben la invasión de células cancerosas (por ejemplo, inhibidores de metaloproteinasas como marimastat e inhibidores de la función del receptor activador del plasminógeno de urocinasa);
(iv) inhibidores de la función de los factores de crecimiento, por ejemplo, dichos inhibidores incluyen anticuerpos contra factores de crecimiento, anticuerpos contra receptores de factores de crecimiento (por ejemplo, el anticuerpo anti-erbb2 trastuzumab [Herceptin™] y el anticuerpo anti-erbbl cetuximab), inhibidores de farnesil transferasa, inhibidores de tirosina cinasa e inhibidores de serina/treonina cinasa, por ejemplo, inhibidores de la familia del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo, inhibidores de tirosina cinasa de la familia de EGFR tales como: N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metoxi-6-(3-morfolinopropoxi)quinazolin-4-amina (gefitinib), N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietoxi)quinazolin-4-amina (erlotinib) y 6-acrilamido-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-(3-morfolinopropoxi)quinazolin-4-amina (CI 1033), por ejemplo, inhibidores de la familia de factores de crecimiento derivados de plaquetas y, por ejemplo, inhibidores de la familia de factores de crecimiento de hepatocitos, por ejemplo, inhibidores de fosfotidilinositol 3-cinasa (PI3K) y, por ejemplo, inhibidores de proteína cinasa activada por mitógeno (MEK1/2) y, por ejemplo, inhibidores de proteína cinasa B (PKB/Akt), por ejemplo, inhibidores de la familia de tirosina cinasa Src y/o de la familia de tirosina cinasa Abelson (AbI) tales como dasatinib (BMS-354825) y mesilato de imatinib (Gleevec™); y cualquier agente que modifique la señalización STAT;
(v) agentes antiangiogénicos tales como aquellos que inhiben los efectos del factor de crecimiento del endotelio vascular (por ejemplo, el anticuerpo contra el factor de crecimiento de células endoteliales vasculares bevacizumab [Avastin™]) y compuestos que actúan mediante otros mecanismos (por ejemplo, linomida, inhibidores de la función de integrina ocvp3 y angiostatina);
(vi) agentes que provocan daño vascular tales como Combretastatina A4;
(vii) tratamientos antisentido, por ejemplo aquellos que están dirigidos a las dianas enumeradas anteriormente, tales como un antisentido anti-ras;
(viii) enfoques de tratamiento génico, incluyendo, por ejemplo, enfoques para reemplazar genes anómalos tales como p53 anómalo o BRCA1 o BRCA2 anómalos, enfoques GDEPT (tratamiento con profármacos enzimáticos dirigidos por genes) tales como aquellos que usan citosina desaminasa, timidina cinasa o una enzima nitroreductasa bacteriana y enfoques para incrementar la tolerancia del paciente a la quimioterapia o la radioterapia, tales como el tratamiento génico de resistencia a múltiples fármacos; y
(ix) enfoques de inmunoterapia, incluyendo, por ejemplo, enfoques ex vivo e in vivo para incrementar la inmunogenicidad de las células tumorales del paciente, tales como la transfección con citocinas tales como la interleucina 2, la interleucina 4 o el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, enfoques para disminuir la anergia de los linfocitos T, enfoques que usan células inmunitarias transfectadas tales como células dendríticas transfectadas con citocinas, enfoques que usan líneas de células tumorales transfectadas con citocinas y enfoques que usan anticuerpos anti-idiotípicos, y enfoques que usan los fármacos inmunomoduladores talidomida y lenalidomida [Revlimid®].
Dicho tratamiento conjunto se puede lograr por medio de la dosificación simultánea, secuencial o separada de los componentes individuales del tratamiento. Dichos productos de combinación emplean los compuestos de la presente divulgación, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, dentro del intervalo de dosificación descrito anteriormente en el presente documento y el otro agente farmacéuticamente activo dentro de su intervalo de dosificación aprobado.
Formulaciones
Las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento pueden estar en forma de sales farmacéuticamente aceptables, como se describe en general a continuación. Algunos ejemplos preferentes, pero no limitantes, de ácidos orgánicos y/o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados son ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido acético y ácido cítrico, así como otros ácidos farmacéuticamente aceptables conocidos per se (para los cuales se hace referencia a las referencias mencionadas a continuación).
Cuando los compuestos de la divulgación contienen un grupo ácido, así como un grupo básico, los compuestos de la divulgación también pueden formar sales internas, y dichos compuestos están dentro del alcance de la divulgación. Cuando un compuesto de la divulgación contiene un heteroátomo donante de hidrógeno (p. ej., NH), la divulgación también cubre las sales y/o los isómeros formados por transferencia de dicho átomo de hidrógeno a un grupo o átomo básico dentro de la molécula.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos incluyen las sales de adición de ácido y básicas de los mismos. Las sales de adición de ácido adecuadas se forman a partir de ácidos que forman sales no tóxicas. Los ejemplos incluyen las sales de acetato, adipato, aspartato, benzoato, besilato, bicarbonato/carbonato, bisulfato/sulfato, borato, camsilato, citrato, ciclamato, edisilato, esilato, formiato, fumarato, gluceptato, gluconato, glucuronato, hexafluorofosfato, hibenzato, clorhidrato/cloruro, bromhidrato/bromuro, yodhidrato/yoduro, isetionato, lactato, malato, maleato, malonato, mesilato, metilsulfato, naftilato, 2-napsilato, nicotinato, nitrato, orotato, oxalato, palmitato, pamoato, fosfato/hidrogenofosfato/dihidrogenofosfato, piroglutamato, sacarato, estearato, succinato, tanato, tartrato, tosilato, trifluoroacetato y xinofoato. Las sales básicas adecuadas se forman a partir de bases que forman sales no tóxicas. Los ejemplos incluyen las sales de aluminio, arginina, benzatina, calcio, colina, dietilamina, diolamina, glicina, lisina, magnesio, meglumina, olamina, potasio, sodio, trometamina y zinc. También se pueden formar hemisales de ácidos y bases, por ejemplo, sales de hemisulfato y hemicalcio. Para una revisión sobre las sales adecuadas, véase Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use de Stahl y Wermuth (Wiley-VCH, 2002).
Los compuestos descritos en el presente documento se pueden administrar en forma de profármacos. Un profármaco puede incluir un vehículo unido covalentemente que libera el fármaco original activo cuando se administra a un sujeto mamífero. Se pueden preparar profármacos modificando grupos funcionales presentes en los compuestos de tal manera que las modificaciones se escindan, ya sea en la manipulación rutinaria o in vivo, en los compuestos originales. Los profármacos incluyen, por ejemplo, compuestos en los que un grupo hidroxilo está unido a cualquier grupo que, cuando se administra a un sujeto mamífero, se escinde para formar un grupo hidroxilo libre. Los ejemplos de profármacos incluyen, pero no se limitan a, derivados de acetato, formiato y benzoato de grupos funcionales alcohol en los compuestos. Los procedimientos para estructurar un compuesto como un profármaco son conocidos, por ejemplo en Testa y Mayer, Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism, Wiley (2006). Los profármacos típicos forman el metabolito activo mediante la transformación del profármaco por enzimas hidrolíticas, la hidrólisis de amida, lactamas, péptidos, ésteres de ácidos carboxílicos, epóxidos o la escisión de ésteres de ácidos inorgánicos. Se ha demostrado que los profármacos de ésteres se degradan fácilmente en el cuerpo para liberar el alcohol correspondiente. Véase, por ejemplo, Imai, Drug Metab Pharmacokinet. (2006) 21(3):173-85, titulado “Human carboxylesterase isozymes: catalytic properties and rational drug design”.
Las composiciones farmacéuticas para su uso en la presente divulgación comprenden típicamente una cantidad eficaz de un compuesto y un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado. Se pueden preparar las preparaciones de una manera conocida per se, que normalmente implica mezclar el al menos un compuesto de acuerdo con la divulgación con el uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables y, si se desea, en combinación con otros compuestos activos farmacéuticos, cuando sea necesario en condiciones asépticas. Se hace referencia a la patente de EE. UU. n.° 6.372.778, la patente de EE. UU. n.° 6.369.086, la patente de EE. UU. n.° 6.369.087 y la patente de EE. UU. n.° 6.372.733 y las referencias adicionales mencionadas anteriormente, así como a los manuales estándar, tales como la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences.
En general, para uso farmacéutico, se pueden formular los compuestos como una preparación farmacéutica que comprende al menos un compuesto y al menos un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, uno o más compuestos farmacéuticamente activos adicionales.
Las preparaciones farmacéuticas de la divulgación están preferentemente en una forma farmacéutica de dosificación unitaria, y se pueden envasar adecuadamente, por ejemplo, en una caja, blíster, vial, frasco, sobre, ampolla o en cualquier otro soporte o recipiente adecuado de dosis única o multidosis (que puede estar apropiadamente etiquetado); opcionalmente con uno o más prospectos que contienen información del producto y/o instrucciones de uso. En general, dichas dosificaciones unitarias contendrán entre 1 y 1000 mg, y normalmente entre 5 y 500 mg, del al menos un compuesto de la divulgación, por ejemplo, aproximadamente 10, 25, 50, 100, 200, 300 o 400 mg por dosificación unitaria.
Se pueden administrar los compuestos mediante una variedad de vías, incluyendo la vía oral, ocular, rectal, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular o intranasal, dependiendo principalmente de la preparación específica usada. En general, se administrará el compuesto en una "cantidad eficaz", lo que significa cualquier cantidad de un compuesto que, tras una administración adecuada, sea suficiente para lograr el efecto terapéutico o profiláctico deseado en el sujeto al que se le administra. Normalmente, dependiendo de la afección que se vaya a prevenir o tratar y de la vía de administración, dicha cantidad eficaz estará normalmente entre 0,01 y 1000 mg por kilogramo de peso corporal del paciente por día, más a menudo entre 0,1 y 500 mg, tal como entre 1 y 250 mg, por ejemplo aproximadamente 5, 10, 20, 50, 100, 150, 200 o 250 mg, por kilogramo de peso corporal del paciente por día, que se pueden administrar como una dosis única diaria, dividida en una o más dosis diarias. El médico tratante puede determinar la(s) cantidad(es) que se va(n) a administrar, la vía de administración y el régimen de tratamiento adicional, dependiendo de factores tales como la edad, el sexo y el estado general del paciente y la naturaleza y gravedad de la enfermedad o los síntomas que se van a tratar. Se hace referencia a la patente de EE. UU. n.° 6.372.778, la patente de EE. UU. n.° 6.369.086, la patente de EE. UU. n.° 6.369.087 y la patente de EE. UU. n.° 6.372.733 y las referencias adicionales mencionadas anteriormente, así como a los manuales estándar, tales como la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences.
Para una forma de administración oral, se puede mezclar el compuesto con aditivos adecuados, tales como excipientes, estabilizantes o diluyentes inertes, y prepararse por medio de los procedimientos habituales en las formas de administración adecuadas, tales como comprimidos, comprimidos recubiertos, cápsulas duras, soluciones acuosas, alcohólicas u oleosas. Ejemplos de vehículos inertes adecuados son goma arábiga, magnesia, carbonato de magnesio, fosfato de potasio, lactosa, glucosa o almidón, en particular, almidón de maíz. En este caso, se puede llevar a cabo la preparación tanto en forma de gránulos secos como húmedos. Los excipientes o disolventes oleosos adecuados son aceites vegetales o animales, tales como aceite de girasol o aceite de hígado de bacalao. Los disolventes adecuados para soluciones acuosas o alcohólicas son agua, etanol, soluciones de azúcar o mezclas de los mismos. Los polietilenglicoles y polipropilenglicoles también son útiles como auxiliares adicionales para otras formas de administración. Como comprimidos de liberación inmediata, estas composiciones pueden contener celulosa microcristalina, fosfato dicálcico, almidón, estearato de magnesio y lactosa y/u otros excipientes, aglutinantes, expansores, desintegrantes, diluyentes y lubricantes conocidos en la técnica.
Cuando se administran por aerosol nasal o inhalación, se pueden preparar las composiciones de acuerdo con técnicas bien conocidas en a técnica de la formulación farmacéutica y se pueden preparar como soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservantes, promotores de absorción para potenciar la biodisponibilidad, fluorocarbonos y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes adecuados conocidos en la técnica. Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración en forma de aerosoles o nebulizadores son, por ejemplo, soluciones, suspensiones o emulsiones de los compuestos de la divulgación o sus sales fisiológicamente tolerables en un disolvente farmacéuticamente aceptable, tal como etanol o agua, o una mezcla de dichos disolventes. Si es necesario, la formulación puede contener adicionalmente otros auxiliares farmacéuticos tales como tensioactivos, emulsionantes y estabilizantes, así como un propulsor.
Para la administración subcutánea o intravenosa, se disuelven, suspenden o emulsionan los compuestos, si se desea con las sustancias habituales, tales como solubilizantes, emulsionantes u otros auxiliares. También se pueden liofilizar los compuestos y usar los liofilizados obtenidos, por ejemplo, para la producción de preparaciones para inyección o infusión. Los disolventes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina fisiológica o alcoholes, por ejemplo, etanol, propanol, glicerol, soluciones de azúcar tales como soluciones de glucosa o manitol, o mezclas de los diversos disolventes mencionados. Se pueden formular las soluciones o suspensiones inyectables de acuerdo con la técnica conocida, utilizando diluyentes o disolventes no tóxicos y parenteralmente aceptables adecuados, tales como manitol, 1,3-butanodiol, agua, solución de Ringer o solución isotónica de cloruro de sodio, o agentes dispersantes o humectantes y de suspensión adecuados tales como aceites fijos, suaves y estériles, incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos, y ácidos grasos, incluyendo ácido oleico.
Cuando se administran por vía rectal en forma de supositorios, se pueden preparar las formulaciones mezclando los compuestos de fórmula I con un excipiente no irritante adecuado, tal como manteca de cacao, ésteres de glicéridos sintéticos o polietilenglicoles, que son sólidos a temperaturas ordinarias, pero se licúan y/o disuelven en la cavidad rectal para liberar el fármaco.
En determinados modos de realización, se contempla que estas composiciones puedan ser formulaciones de liberación prolongada. Las formaciones de liberación prolongada típicas utilizan un recubrimiento entérico. Típicamente, se aplica una barrera a la medicación oral que controla la localización en el sistema digestivo donde se absorbe. Los recubrimientos entéricos evitan la liberación del medicamento antes de que llegue al intestino delgado. Los recubrimientos entéricos pueden contener polímeros de polisacáridos, tales como maltodextrina, xantano, escleroglucano dextrano, almidón, alginatos, pululano, ácido hialorónico, quitina, quitosano y similares; otros polímeros naturales, tales como proteínas (albúmina, gelatina, etc.), poli-L-lisina; poli(ácido acrílico) de sodio; poli(metacrilatos de hidroxialquilo) (por ejemplo, poli(metacrilato de hidroxietilo)); carboxipolimetileno (por ejemplo Carbopol™); carbómero; polivinilpirrolidona; gomas, tales como goma guar, goma arábiga, goma karaya, goma ghatti, goma garrofín, goma de tamarindo, goma gellan, goma tragacanto, agar, pectina, gluten y similares; poli(alcohol vinílico); etilenvinílalcohol; polietilenglicol (PEG); y éteres de celulosa, tales como hidroximetilcelulosa (HMC), hidroxietilcelulosa (HEC), hidroxipropilcelulosa (HPC), metilcelulosa (MC), etilcelulosa (EC), carboxietilcelulosa (CEC), etilhidroxietilcelulosa (EHEC), carboximetilhidroxietilcelulosa (CMHEC), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropiletilcelulosa (HPEC) y carboximetilcelulosa sódica (Na-CMC); así como copolímeros y/o mezclas (simples) de cualquiera de los polímeros anteriores. Algunos de los polímeros mencionados anteriormente se pueden reticular además por medio de técnicas estándar.
La elección del polímero vendrá determinada por la naturaleza del ingrediente activo/fármaco que se emplee en la composición de la divulgación, así como por la velocidad de liberación deseada. En particular, el experto en la técnica apreciará, por ejemplo en el caso de HPMC, que un peso molecular mayor proporcione, en general, una velocidad de liberación más lenta del fármaco de la composición. Además, en el caso de HPMC, los diferentes grados de sustitución de los grupos metoxilo y los grupos hidroxipropoxilo darán lugar a cambios en la velocidad de liberación del fármaco de la composición. A este respecto, y como se establece anteriormente, puede ser deseable proporcionar las composiciones de la divulgación en forma de recubrimientos en los que el vehículo polimérico se proporcione por medio de una mezcla de dos o más polímeros de, por ejemplo, diferentes pesos moleculares para generar un perfil de liberación requerido o deseado particular.
Se pueden usar microesferas de poliláctido, poliglucólido y sus copolímeros poli(láctido-co-glucólido) para formar sistemas de administración de proteínas de liberación sostenida. Las proteínas pueden quedar atrapadas en el depósito de microesferas de poli(láctido-co-glucólido) mediante varios procedimientos, incluyendo la formación de una emulsión de agua en aceite con proteína a base de agua y polímero a base de disolvente orgánico (procedimiento de emulsión), la formación de una suspensión de sólido en aceite con proteína sólida dispersada en una solución de polímero a base de disolvente (procedimiento de suspensión) o disolviendo la proteína en una solución de polímero a base de disolvente (procedimiento de disolución). Se puede unir poli(etilenglicol) a las proteínas (PEGilación) para incrementar la semivida in vivo de las proteínas terapéuticas circulantes y disminuir la posibilidad de una respuesta inmunitaria.
También se pueden preparar suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos a antígenos víricos) mediante procedimientos convencionales para preparar vehículos farmacéuticamente aceptables. Esto puede ser apropiado para la administración de nucleósidos libres, nucleósidos de acilo o formas de profármacos de ésteres de fosfato de los compuestos nucleósidos de acuerdo con la presente invención.
Se aprecia que los nucleósidos de la presente invención tienen varios centros quirales y pueden existir y aislarse en formas ópticamente activas y racémicas. Algunos compuestos pueden presentar polimorfismo. Se debe entender que la presente invención engloba cualquier forma racémica, ópticamente activa, diastereoisómera, polimórfica o estereoisómera, o mezclas de las mismas, de un compuesto de la invención que posea las propiedades útiles descritas en el presente documento. Es bien conocido en la técnica cómo preparar formas ópticamente activas (por ejemplo, mediante resolución de la forma racémica mediante técnicas de recristalización, mediante síntesis a partir de materiales de partida ópticamente activos, mediante síntesis quiral o mediante separación cromatográfica utilizando una fase estacionaria quiral).
Los carbonos del nucleósido son quirales, sus sustituyentes distintos del hidrógeno (la base y los grupos CHOR, respectivamente) pueden ser cis (en el mismo lado) o trans (en lados opuestos) con respecto al sistema de anillos de azúcar. Por lo tanto, los cuatro isómeros ópticos están representados por las siguientes configuraciones (al orientar el resto de azúcar en un plano horizontal de modo que el átomo de oxígeno quede en la parte posterior): cis (con ambos grupos "hacia arriba", que corresponde a la configuración de los p-D-nucleósidos naturales), cis (con ambos grupos "hacia abajo", que es una configuración p-L no natural), trans (con el sustituyente en C2' "hacia arriba" y el sustituyente en C4' "hacia abajo") y trans (con el sustituyente en C2' "hacia abajo" y el sustituyente en C4' "hacia arriba"). Los "D-nucleósidos" son nucleósidos cis en una configuración natural y los "L-nucleósidos" son nucleósidos cis en la configuración no natural.
Asimismo, la mayoría de los aminoácidos son quirales (designados como L o D, en los que el enantiómero L es la configuración natural) y pueden existir como enantiómeros separados.
Los ejemplos de procedimientos para obtener materiales ópticamente activos son conocidos en la técnica e incluyen al menos los siguientes. i) separación física de cristales, una técnica mediante la cual se separan manualmente los cristales macroscópicos de los enantiómeros individuales. Se puede usar esta técnica si existen cristales de los enantiómeros separados, es decir, si el material es un conglomerado y los cristales son visualmente distintos; ii) cristalización simultánea, una técnica mediante la cual se cristalizan por separado los enantiómeros individuales a partir de una solución del racemato, posible solo si este último es un conglomerado en estado sólido; iii) resoluciones enzimáticas, una técnica mediante la cual se logra la separación parcial o completa de un racemato en virtud de las diferentes velocidades de reacción de los enantiómeros con una enzima; iv) síntesis asimétrica enzimática, una técnica sintética en la que al menos una etapas de la síntesis usa una reacción enzimática para obtener un precursor sintético enantioméricamente puro o enriquecido del enantiómero deseado; v) síntesis asimétrica química, una técnica sintética mediante la cual se sintetiza el enantiómero deseado a partir de un precursor aquiral en condiciones que generan asimetría (es decir, quiralidad) en el producto, que se puede lograr usando catalizadores quirales o auxiliares quirales; vi) separaciones de diastereómeros, una técnica mediante la cual un compuesto racémico reacciona con un reactivo enantioméricamente puro (el auxiliar quiral) que convierte los enantiómeros individuales en diastereómeros. Se separan a continuación los diastereómeros resultantes mediante cromatografía o cristalización en virtud de sus diferencias estructurales ahora más claras y posteriormente se elimina el auxiliar quiral para obtener el enantiómero deseado; vii) transformaciones asimétricas de primer y segundo orden, una técnica mediante la cual los diastereómeros del racemato se equilibran para proporcionar una preponderancia en la solución del diastereómero del enantiómero deseado o donde la cristalización preferente del diastereómero del enantiómero deseado perturba el equilibrio de modo que finalmente, en principio, todo el material se convierte en el diastereómero cristalino del enantiómero deseado. A continuación, el enantiómero deseado se libera del diastereómero; viii) resoluciones cinéticas, esta técnica se refiere lograr la resolución parcial o completa de un racemato (o la resolución adicional de un compuesto parcialmente resuelto) en virtud de velocidades de reacción desiguales de los enantiómeros con un reactivo o catalizador quiral, no racémico en condiciones cinéticas; ix) síntesis enantioespecífica a partir de precursores no racémicos, una técnica sintética mediante la cual se obtiene el enantiómero deseado a partir de materiales de partida no quirales y en la que, durante el transcurso de la síntesis, no se compromete o sólo se compromete mínimamente la integridad estereoquímica; x) cromatografía líquida quiral, una técnica mediante la cual se separan los enantiómeros de un racemato en una fase móvil líquida en virtud de sus diferentes interacciones con una fase estacionaria. La fase estacionaria puede estar hecha de material quiral o la fase móvil puede contener un material quiral adicional para provocar las diferentes interacciones; xi) cromatografía de gases quiral, una técnica mediante la cual se volatiliza el racemato y se separan los enantiómeros en virtud de sus diferentes interacciones en la fase móvil gaseosa con una columna que contiene una fase adsorbente quiral no racémica fija; xii) extracción con disolventes quirales, una técnica mediante la cual se separan los enantiómeros en virtud de la disolución preferente de un enantiómero en un disolvente quiral particular; xiii) transporte a través de membranas quirales, una técnica mediante la cual se pone en contacto un racemato con una barrera de membrana delgada. Típicamente, la barrera separa dos fluidos miscibles, uno conteniendo el racemato, y una fuerza impulsora tal como la concentración o la presión diferencial provoca un transporte preferente a través de la barrera de membrana. Se produce la separación como resultado de la naturaleza quiral no racémica de la membrana que permite que solo pase un enantiómero del racemato. En un modo de realización se usa la cromatografía quiral, incluyendo la cromatografía de lecho móvil simulado. Están disponibles comercialmente una amplia variedad de fases estacionarias quirales.
Algunos de los compuestos descritos en el presente documento contienen dobles enlaces olefínicos y, a menos que se especifique de otro modo, se pretende que incluyan ambos isómeros geométricos E y Z.
Además, algunos de los nucleósidos descritos en el presente documento pueden existir como tautómeros, tales como tautómeros ceto-enol. Se pretende que los tautómeros individuales, así como las mezclas de los mismos, estén englobados dentro de los compuestos de la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Preparación de conjugados
Varios grupos han preparado profármacos mono y difosfato. Véase Jessen et al., Bioreversible Protection of Nucleoside Diphosphates, Angewandte Chemie-International Edition English 2008, 47 (45), 8719-8722. Para evitar la ruptura del enlace anhídrido P-O-P, se utiliza un grupo pendiente que se fragmenta rápidamente (por ejemplo, bis-(4-aciloxibencil)-nucleósido difosfato (BAB-NDP) que se desacila por una esterasa endógena) para generar una carga negativa en el segundo fosfato. Véase también Routledge et al., Synthesis, Bioactivation and Anti-HIV Activity of 4-Acyloxybenzyl-bis(nucleosid-5'-yl) Phosphates, Nucleosides & Nucleotides 1995, 14 (7), 1545-1558 y Meier et al., Comparative study of bis(benzyl)phosphate triesters of 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrothymidine (d4T) and cycloSal-d4TMP -hydrolysis, mechanistic insights and anti-HIV activity, Antiviral Chemistry and Chemotherapy 2002, 13,101-114. Cuando esto se produce, el enlace anhídrido P-O-P es menos susceptible a la escisión y el grupo protector restante puede entonces liberarse para generar el nucleósido difosfato.
En la figura 5 se muestran otros procedimientos para preparar profármacos de difosfato y monotiodifosfato. Se usan condiciones de acoplamiento estándar para preparar profármacos de esfingolípido-nucleósido monofosfato. Se pueden preparar los profármacos de difosfato correspondientes de acuerdo con los protocolos que se muestran en la figura 5 y se proporcionan en Smith et al., Substituted Nucleotide Analogs. Solicitud de patente de EE. UU. 2012/0071434; Skowronska et al., Reaction of Oxophosphorane-Sulfenyl and Oxophosphorane-Selenenyl Chlorides with Dialkyl Trimethylsilyl
Phosphites - Novel Synthesis of Compounds Containing a Sulfur or Selenium Bridge Between 2 Phosphoryl Centers, Journal of the Chemical Society-Perkin Transactions 11988, 8, 2197-2201;
Dembinski et al., An Expedient Synthesis of Symmetrical Tetra-Alkyl Mono-thiopyrophosphates, Tetrahedron Letters 1994, 35 (34), 6331-6334; Skowronska et al., Novel Synthesis of Symmetrical Tetra-Alkyl Monothiophosphates, Tetrahedron Letters 1987, 28 (36), 4209-4210; y Chojnowski et al., Methods of Synthesis of O,O-Bis TrimethylSilyl Phosphorothiolates. Synthesis-Stuttgart 1977, 10, 683-686.
Ejemplo 2. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Actividad de 2-fluoronucleósidos
Los análogos de ribonucleósidos, cuando se activan a su correspondiente trifosfato, inhiben la replicación del virus de ARN dependiente de ARN al actuar como inhibidores de la RdRp codificada por el virus que compiten con el sustrato. Los compuestos de esta clase terapéutica son útiles en el tratamiento de virus que se encuentran en, pero sin limitarse a, las familias de virus Arenaviridae, Bunyaviridae, Flaviviridae, Orthomyxoviridae, Paramixoviridae y Togaviridae. Se contempla que determinados compuestos divulgados en el presente documento tienen ventajas tales como una alta barrera genética para la resistencia antivírica; una actividad de amplio espectro dentro de las familias de virus; y una alta biodisponibilidad oral con administración dirigida en los sitios de infección.
Los análogos de nucleósidos se diseñaron con un sustituyente 2'-alfa-flúor para imitar a los ribonucleósidos naturales. La longitud del enlace C-F (1,35 A) es similar a la longitud del enlace C-O (1,43 A) y el flúor es un aceptor de enlaces de hidrógeno que hace que el sustituyente de flúor sea un reemplazo isopolar e isostérico de un grupo hidroxilo. A diferencia de los análogos de ribonucleósidos actualmente utilizados en ensayos clínicos para tratar infecciones por VHC, los análogos de 2',3'-didesoxi-2'-fluoronucleósidos divulgados en el presente documento carecen de un grupo 3'-hidroxilo y, por tanto, son finalizadores de cadena estrictos de la replicación del virus. Cuando los nucleósidos se convierten en sus trifosfatos, actúan como inhibidores de la RdRp codificada por el virus que compiten con el sustrato. Después de la incorporación del finalizador de cadena al ARN incipiente, cesa la replicación del virus. Una ventaja de los finalizadores de cadena estrictos es que no son mutagénicos para el huésped cuando se tratan enfermedades crónicas.
Ejemplo 3.
Condiciones de reacción de la ARN polimerasa dependiente de ARN NS5B
Se sometieron a ensayo los compuestos para determinar la inhibición de NS5B-6621 de GT-1b Con-1 de VHC. Las reacciones incluyeron enzima recombinante purificada, molde de ARN IRES del VHC de cadena negativa 1 u/pL y sustratos de NTP 1 pM que incluían [32P]-CTP o [32P]-UTP. Se incubaron las placas de ensayo a 27 °C durante 1 hora antes de desactivarlas. Se evaluó la incorporación de [32P] en el producto macromolecular mediante la unión al filtro.
La siguiente tabla muestra la actividad de trifosfatos análogos seleccionados contra la polimerasa NS5B del VHC.
Figure imgf000029_0002
Figure imgf000029_0001
Indica que el compuesto no está dentro del alcance de las reivindicaciones.
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Figure imgf000030_0002
Figure imgf000030_0001
Indica que el compuesto no está dentro del alcance de las reivindicaciones.
Ejemplo 4. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones) Resultados del ensayo de luciferasa de GT-1b del replicón del VHC
Figure imgf000031_0001
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Ejemplo 5.
Datos de inhibición de ADN polimerasas humanas:
Figure imgf000037_0001
Ejemplo 6. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones) Inhibición de replicones de VHC naturales, mutantes y quiméricos
Figure imgf000038_0001
Ejemplo 7. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones) Actividad contra el virus del dengue:
Figure imgf000039_0001
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Ejemplo 8. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones) Actividad contra el virus del dengue de serotipo universal
Figure imgf000041_0001
Ejemplo 9. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Inhibición de la replicación de virus de ADN
Figure imgf000041_0002
Ejemplo 10. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Actividad antivírica para análogos de citidina
Figure imgf000041_0003
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Figure imgf000042_0002
Ejemplo 11. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones) Resultados de un ensayo de replicón de VEEV.
Compuestos examinados:
Figure imgf000043_0001
Repeticiones de VEEV-gfp en VERO
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Ejemplo 12. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Compuestos examinados en el ensayo de replicón de VEEV:
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Resultados del ensayo de replicón de VEEV
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
Ejemplo 13. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de esfingolípidos y derivados
La preparación de esfingolípidos se proporciona en el documento PCT/US12/57448.
Ejemplo 14. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis general de 2',3'-didesoxi-2'-p-sustituido-2'-a-fluoronucleósidos
Figure imgf000047_0001
Reactivos y condiciones: a) NaNÜ2 , HCl(ac); b) BH3SMe2; c) TBDPSCl, DMAP, piridina; d) i. LiHMDS, ii. RX (X = Cl, Br, I, etc.); e) i. TBSOTf, Et3N, ii. NFSi; f) DIBAL; g) Ac2Ü, DMAP; h) HMPT, CCU
Ejemplo 15.
Acoplamiento de base y desprotección (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000047_0002
Reactivos y condiciones: a) base sililada, TMSOTf, DCE; b) TBAF, THF; c) nucleobase, TDA-1, KOH, MeCN Ejemplo 16. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de 2',3'-didesoxi-2'- a -fluoronucleósidos
Figure imgf000048_0001
Reactivos y condiciones: a) NaNÜ2 , HCl(ac); b) BH3SMe2; c) TBDPSCI, DMAP, piridina; d) i. LiHMDS, ii. NFSi; e) DIBAL; f) Ac2O, DMAP; g) HMPT, CCL
Ejemplo 17. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Acoplamiento de base y desprotección
Figure imgf000048_0002
Reactivos y condiciones: a) base sililada, TMSOTf, DCE; b) TBAF, THF; c) nucleobase, TDA-1, KOH, MeCN Ejemplo 18. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
1-Cloro-2,3-didesoxi-2-fluoro-5-ferc-butildimetilsililrribosa 17
Figure imgf000048_0003
Se trató gota a gota una mezcla de 2,3-didesoxi-2-fluoro-5-terc-butildimetilsililrribosa (840 mg, 2,24 mmol) y tetracloruro de carbono (1,55 g, 10,09 mmol) en tolueno anhidro (15 ml) a -50 °C con una solución de triamida de hexametilfósforo (440 mg, 2,69 mmol) en tolueno (15 ml) durante un período de 35 min. Se agitó la mezcla con calentamiento gradual hasta 0 °C y se mantuvo a esta temperatura durante 3 h. Después de enfriar a -20 oC, se diluyó la mezcla con tolueno frío (50 ml) y se desactivó mediante la adición gota a gota de salmuera fría (5 ml a -10 oC). Después de 10 min, se separó la capa orgánica y se lavó de nuevo con salmuera fría (10 ml). Después de secar sobre sulfato de sodio, se filtró la fase orgánica y se concentró en un evaporador rotatorio (baño ajustado a 20 °C) para dar 17 bruto (900 mg) en una proporción crD 9:1. Se usó el material bruto en la siguiente etapa sin purificación adicional.
RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) ó 7,65-7,58 (m, 5H), 7,46-7,32 (m, 7H), 6,28 (d, J = 4,1 Hz, 1H), 5,36 (td, J = 8,4, 4,2 Hz, 1H), 5,22 (td, J = 8,3, 4,1 Hz, 1H), 4,55 (ddt, J = 7,6, 5,2, 2,8 Hz, 1H), 3,78 (ddd, J = 11,5, 2,7, 1,8 Hz, 1H), 3,60 (dd, J = 11,5, 2,8 Hz, 1H), 2,44-2,35 (m, 2H).
Ejemplo 19. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de 2,,3,-didesoxi-2'-a-metil-2,-a-fluoronucleósidos
Figure imgf000049_0001
Reactivos y condiciones: a) NaNÜ2 , HCl(ac); b) BH3-SMe2; c) TBDPSCl, DMAP, piridina; d) i. LiHMDS, ii. Mel; e) i. TBSOTf, EtaN, ii. NFSi; f) DIBAL; g) Ac2Ü, DMAP; h) HMPT, CCk
Ejemplo 20. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones) Acoplamiento de base y desprotección
Figure imgf000049_0002
Reactivos y condiciones: a) base sililada, TMSOTf, DCE; b) TBAF, THF; c) nucleobase, TDA-1, KOH, MeCN Ejemplo 21. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
(3R,5S)-5-(((terc-Butildifenilsilil)oxi)metil)-3-metildihidrofuran-2(3H)-ona (31)
Figure imgf000050_0001
A una solución de diisopropilamina (2,01 ml, 14,1 mmol) en THF seco (20 ml) a 0 °C bajo atmósfera inerte se añadió n-butillitio (8,83 ml de una solución 1,6 M en hexano, 14,13 mmol). Después de 30 minutos de agitación, se enfrió la solución a -78 °C y se añadió gota a gota una solución de (4S)-4-terc-butildifenilsiloximetil-4-butanolida (5,01 g, 14,13 mmol) en THF seco (5 ml) durante un período de 5 minutos. Después de agitar durante 30 minutos adicionales a -78 °C, se añadió yodometano (1,31 ml, 21,0 mmol) y el recipiente de reacción se retiró del baño de hielo. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, se añadió agua desionizada (40 ml) a la solución y los compuestos orgánicos se extrajeron con éter (3 x 15 ml). Se lavó la capa orgánica combinada con HCl 1 M (3 x 20 ml) y una vez más con salmuera, antes de secarse sobre Mg2SÜ4. Se purificó el producto bruto mediante cromatografía en sílice (Rf del producto = 0,26 en hexano:acetato de etilo 4:1), eluyendo con hexano:acetato de etilo 85:15 para dar el producto final como un sólido cristalino blanco. La estereoquímica se estableció en base a la comparación de los datos de RMN con los datos notificados.
RMN de 1H (400 MHz, CDCla): ó 7,67-7,65 (m, 4H), 7,48-7,39 (m, 6H), 4,58-4,53 (m, 1H), 3,86 (dd, J = 3,2, 10,8 Hz, 1H), 3,68 (dd, J = 3,2, 11,2 Hz, 1H), 2,90-2,81 (m, 1H), 2,45 (ddd, J = 3,2, 9,2, 12,8 Hz, 1H), 1,98 (dt, J = 8,8, 12,4 Hz, 1H), 1,30 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 1,06 (s, 9H).
Ejemplo 22. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
(3R,5S)-5-(((terc-Butildifenilsilil)oxi)metil)-3-fluoro-3-metildihidrofuran-2(3H)-ona (32)
Figure imgf000050_0002
Se colocó el compuesto 31 (0,1000 g, 0,27 mmol) en un matraz seco bajo atmósfera de argón y se disolvió en DCM seco (5 ml). A continuación, se añadió gota a gota TBSOTf (0,075 ml, 0,33 mmol) a la solución de lactona en DCM en agitación a temperatura ambiente, seguido de la adición gota a gota de trietilamina pura (0,057 ml, 0,41 mmol) también a temperatura ambiente. Se dejó en agitación la mezcla de reacción a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 2 horas con seguimiento por CCF. A continuación, se disolvió NFSi (0,1280 g, 0,41 mmol) en 2 ml de DCM seco y se añadió gota a gota al silil enol éter a temperatura ambiente bajo nitrógeno. La mezcla de reacción se volvió de color rojo oscuro. Se dejó en agitación la mezcla de reacción durante la noche. Se desactivó la mezcla de reacción con NH4Cl sat. y se diluyó con éter. Se lavó la capa orgánica con salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró. Se purificó el producto sobre sílice eluyendo con hexanos/acetato de etilo 8:1.
RMN de 1H (400 MHz, CDCla): ó 7,67-7,64 (m, 4H), 7,48-7,39 (m, 6H), 4,75-4,70 (m, 1H), 3,96 (dd, J = 3,6, 12 Hz, 1H), 3,71 (dd, J = 3,6, 11,6 Hz, 1H), 2,53 (ddd, J = 6,4, 14,6, 22,8 Hz, 1H), 2,37 (ddd, J = 8,8, 14,6, 35,2 Hz, 1H), 1,66 (d, J = 22,8 Hz, 3H), 1,05 (s, 9H).
Ejemplo 23. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
(2R,3R,5S)-5-(((terc-Butildifenilsilil)oxi)metil)-3-fluoro-3-metiltetrahidrofuran-2-ol (33)
Figure imgf000050_0003
Se preparó el compuesto 33 siguiendo el procedimiento descrito por JOC (1998), 63, 2161-2167.
RMN de 1H (400 MHz, CDCb): ó 7,70-7,67 (m, 4H), 7,47-7,39 (m, 6H), 5,10 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 4,50 (m, 1H), 3,87 (dd, J = 2,4, 11,2 Hz, 1H), 3,46 (dd, J = 2,4, 11,2 Hz, 1H), 2,27-2,11 (m, 2H), 1,57 (d, J = 21,6 Hz, 3H), 1,09 (s, 9H).
Ejemplo 24. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones) (2S,3R,5S)-5-(((terc-Butildifenilsilil)oxi)metil)-3-fluoro-3-metiltetrahidrofuran-2-il acetato (34)
Figure imgf000051_0001
Se preparó el compuesto 34 siguiendo el procedimiento descrito por JOC (1998), 63, 2161-2167.
RMN de 1H (400 MHz, CDCla): ó 7,69-7,66 (m, 4H), 7,46-7,37 (m, 6H), 6,13 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 4,53-4,47 (m, 1H), 3,79 (dd, J = 4,4, 10,8 Hz, 1H), 3,72 (dd, J = 4,4, 11,6 Hz, 1H), 2,27-2,02 (m, 2H), 1,92 (s, 3H), 1,50 (d, J = 21,6 Hz, 3H), 1,07 (s, 9H).
Ejemplo 25. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Condiciones generales de acoplamiento de nucleobase
Se transfirió la nucleobase deseada (5 equivalentes) a un matraz seco bajo atmósfera de argón y se suspendió en HMDS (2 ml/mmol de nucleobase). Se añadió sulfato de amonio catalítico (1-3 mg) al recipiente de reacción y se dejó la suspensión a reflujo durante 1-3 horas. Durante el curso de la reacción, la suspensión blanca se volvió transparente. Se dejó enfriar el recipiente de reacción a temperatura ambiente y se eliminó el exceso de HMDS bajo presión reducida. Se disolvió el residuo resultante en DCE seco (5 ml/mmol del compuesto 34), seguido de la adición del compuesto 34 a temperatura ambiente. Finalmente, se añadió TMSOTf puro (5,5 equivalentes) a la solución en agitación. Se desactivó la reacción con una solución saturada de bicarbonato de sodio. Se recogió la capa orgánica, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró bajo presión reducida. Se purificó el nucleósido protegido deseado sobre gel de sílice eluyendo con DCM/MeOH 9:1.
Ejemplo 26. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Condiciones generales de desprotección
Se trató una solución de nucleósido protegido disuelto en THF seco (10 ml/mmol de nucleósido protegido) con fluoruro de tetrabutilamonio (TBAF, solución 1 M en THF, 1,1 equivalentes) y se dejó agitar a temperatura ambiente durante 3 horas. Se concentró a vacío la mezcla bruta y se purificó el residuo resultante sobre gel de sílice (0 a 10 % de metanol en diclorometano) para dar el nucleósido deseado.
Ejemplo 27. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Ruta alternativa para la síntesis de 2',3'-didesoxi-2'-p-sustituido-2'-a-fluoronucleósidos
Figure imgf000051_0002
Reactivos y condiciones: a) AcCl, piridina, DCM; b) TCDI, piridina, DCM; c) Bu3SnH, AIBN; d) Ac2O, AcOH, H2SO4; e) i. base sililada, TMSOTf, ii. K2CO3, MeOH; f) BzCl; g) DMP; h) RLi o RMgBr; i) DAST; j) NH3 , MeOH Ejemplo 28. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Ruta alternativa para 2,,3,-didesoxi-2,-a-fluoronucleósidos
Figure imgf000052_0001
Reactivos y condiciones: a) AcCl, piridina, DCM; b) TCDI, piridina, DCM; c) Bu3SnH, AIBN; d) AC2O, AcOH, H2SO4; e) i. base sililada, TMSOTf, ii. K2CO3, MeOH; f) BzCl; g) DMP; h) NaBH4; i) DAST; j) NH3 , MeOH Ejemplo 29. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
2,,3,-Didesoxi-2,-p-etinil-2,-a-fluoronucleósidos
Figure imgf000052_0002
Reactivos y condiciones: a) AcCl, piridina, DCM; b) TCDI, piridina, DCM; c) Bu3SnH, AIBN; d) Ac2O, AcOH, H2SO4; e) i. base sililada, TMSOTf, ii. K2CO3 , MeOH; f) BzCl; g) DMP; h) i.trimetilsililacetileno, BuLi, ii. NH4F, MeOH; i) DAST; j) NH3, MeOH
Ejemplo 30. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
2,,3,-Didesoxi-2,- p -fluorometil-2,- a -fluoronucleósidos
Figure imgf000053_0001
Reactivos y condiciones: a) AcCl, piridina, DCM; b) TCDI, piridina, DCM; c) Bu3SnH, AIBN; d) AC2O, AcOH, H2SO4; e) i. base sililada, TMSOTf, ii. K2CO3 , MeOH; f) BzCl; g) DMP; h) Me3S(O)I, NaH; i) KF, 18-corona-6; j) DAST; k) NH3 , MeOH
Ejemplo 31. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
2',3'-Didesoxi-2'-p-difluorometil O trifluorometil-2'-a-fluoronucleósidos
Figure imgf000053_0002
Reactivos y condiciones: a) AcCl, piridina, DCM; b) TCDI, piridina, DCM; c) Bu3SnH, AIBN; d) Ac2O, AcOH, H2SO4; e) i. base sililada, TMSOTf, ii. K2CO3 , MeOH; f) BzCl; g) DMP; h) CHF2 : i. PhSO2CF2H, LiHMDS, ii. SmI2 CF3 : TMSCF3, TBAF; i) DAST; j) NH3 , MeOH
Ejemplo 32. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Ruta alternativa para 2',3'-didesoxi-2'- p -sustituido-2'- a -fluoronucleósidos
Figure imgf000054_0001
Reactivos y condiciones: a) AcCl, piridina, DCM; b) TCDI, piridina, DCM; c) Bu3SnH, AIBN; d) i. H2SO4 , MeOH ii. K2CO3, MeOH; e) BzCl, piridina; f) DMP; g) RLi or RMgBr; h) DAST; i) Ac2O, AcOH, H2SO4 ; j) base sililada, TMSOTf; k) NH3 , MeOH
Ejemplo 33. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de 2,-desoxi-2,-a-fluororribonucleósidos
Figure imgf000054_0002
Reactivos y condiciones: a) TBDPSCl, imidazol; b) acetona, CuSO4, H2SO4 ; c) KOH, BnCl; d) CSA, MeOH; e) i. Tf2O, ii. TBAF; f) 90 % TFA(ac); g) Ac2O, DMAP; h) HMPT, CCl4
Ejemplo 34. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Acoplamiento de base y desprotección
Figure imgf000055_0001
Reactivos y condiciones: a) base sililada, TMSOTf, DCE; b) BCI3 , DCM; c) nucleobase, TDA-1, KOH, MeCN Ejemplo 35. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de 2'-desoxi-2'-p-sustituido-2'-a-fluororribonucleósidos
Figure imgf000055_0002
102 Reactivos y condiciones: a) i. I2 , acetona, ii. K2CO3 , MeOH; b) KOH, BnCl; c) H2SO4 , MeOH; d) DMP; e) RLi o RMgBr; f) DAST; g) H2SO4, H2O; h) Ac2O, DMAP; i) HMPT, CCU
Ejemplo 36. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Acoplamiento de base y desprotección
Figure imgf000056_0001
Reactivos y condiciones: a) base sililada, TMSOTf, DCE; b) BCI3 , DCM; c) nucleobase, TDA-1, KOH, MeCN Ejemplo 37. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis alternativa para 2,-desoxi-2,-a-fluororribonucleósidos
Figure imgf000056_0002
Reactivos y condiciones: a) i. I2, acetona, ii. K2CO3 , MeOH; b) KOH, BnCl; c) H2SO4 , MeOH; d) DMP; e) NaBH4; f) DAST; g) H2SO4 , H2O; h) Ac2O, DMAP; i) HMPT, CCl4
Ejemplo 38. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Acoplamiento de base y desprotección
Figure imgf000057_0001
Reactivos y condiciones: a) base sililada, TMSOTf, DCE; b) BCI3 , DCM; c) nucleobase, TDA-1, KOH, MeCN Ejemplo 39. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de 2'-desoxi-2'-p-fluorometil-2'-a-fluororribonucleósidos
Figure imgf000057_0002
Reactivos y condiciones: a) i. I2 , acetona, ii. K2CO3 , MeOH; b) KOH, BnCl; c) H2SO4 , MeOH; d) DMP; e) i. Me3S(O)I, NaH, ii. KF, 18-corona-6; f) DAST; g) H2SO4 , H2O; h) Ac2O, DMAP; i) HMPT, CCU
Ejemplo 40. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Acoplamiento de base y desprotección
Figure imgf000058_0001
Reactivos y condiciones: a) base sililada, TMSOTf, DCE; b) BCI3 , DCM; c) nucleobase, TDA-1, KOH, MeCN Ejemplo 41. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de 2'-desoxi-2'-p-difluorometil O trifluorometil-2'-a-fluororribonucleósidos
Figure imgf000058_0002
113
Reactivos y condiciones: a) i. I2 , acetona, ii. K2CO3 , MeOH; b) KOH, BnCl; c) H2SO4 , MeOH; d) DMP; e) CHF2 : i. PhSO2CF2H, LiHMDS, ii. Smh o CF3 : TMSCF3 , TBAF; f) DAST; g) H2SO4 , H2O; h) Ac2O, DMAP; i) HMPT, CCl4 Ejemplo 42. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Acoplamiento de base y desprotección
Figure imgf000059_0001
Reactivos y condiciones: a) base sililada, TMSOTf, DCE; b) BCI3 , DCM; c) nucleobase, TDA-1, KOH, MeCN Ejemplo 43. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis alternativa de 2',3'-didesoxi-2'-p-sustituido-2'-a-fluoronucleósidos
Figure imgf000059_0002
Reactivos y condiciones: a) TBSCl, Et3N, DMAP; b) i. fenilclorotionoformiato, ii. AIBN; c) TBAF
Ejemplo 44. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de profármacos monofosfato y difosfato
Figure imgf000059_0003
Reactivos y condiciones: a) clorofosforamidato, imidazol; b) DIC, lípido-1-fosfato; c) POCl3, O=P(OMe)3; d) i. DIC, morfolina, ii. Base esfingoide-1-fosfato, tetrazol
Ejemplo 45. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
N-ferc-Butiloxicarbonil-esfingosina (124)
Figure imgf000060_0001
124
Preparado de acuerdo con Boumendjel, Ahcene y Miller, Stephen Journal o f Lipid Research 1994, 35, 2305.
Se trató una mezcla de esfingosina (450 mg, 1,50 mmol) y dicarbonato de di-ferc-butilo (0,656 g, 3,01 mmol) en diclorometano (100 ml) a 4 °C gota a gota con diisopropiletilamina (0,53 ml, 3,01 mmol). Después de permitir que la mezcla alcanzara t.a. de forma gradual, se agitó durante 12 h adicionales y, a continuación, se diluyó con diclorometano (100 ml) seguido de un lavado con agua (30 ml) y salmuera (30 ml). Se secó la fase orgánica sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró hasta sequedad. Se purificó el residuo bruto mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (19 mm x 175 mm) usando 50 % de acetato de etilo en hexanos para dar N-ferc-butiloxicarbonil-esfingosina (540 mg, 90 %) como un sólido blanco.
RMN de 1H (300 MHz, cloroformo-d) 55,77 (dt, J = 15,4, 8,4 Hz, 1H), 5,52 (dd, J = 15,4, 8,4 Hz, 1H), 3,93 (dd, J = 11,4, 3,7 Hz, 1H), 3,70 (dd, J = 11,4, 3,7 Hz, 1H), 3,59 (s, 3H), 2,05 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 1,52 (s, 9H), 1,25 (s, 22H), 0,87 (t, J = 6,5 Hz, 3H).
Ejemplo 46. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
N-ferc-Butiloxicarbonil-esfingosina-1-O-dimetilfosfato (125)
Figure imgf000060_0002
La N-ferc-butiloxicarbonil-esfingosina 124 (540 mg, 1,35 mmol) se volvió anhidra mediante coevaporación con piridina anhidra (2 x 12 ml). A continuación, se disolvió el residuo en piridina anhidra y se trató con tetrabromuro de carbono (622 mg, 1,88 mmol). Se enfrió la mezcla a 0 °C y se trató gota a gota con una solución de trimetilfosfito (0,25 ml, 2,10 mmol) en piridina anhidra (3 ml) durante un período de 30 min. Después de 12 h adicionales a t.a., tanto el análisis por CLEM como por CCF (metanol al 5 % en diclorometano) indicaron una conversión completa. Se desactivó la mezcla con agua (2 ml) y, a continuación, se concentró hasta sequedad. Se disolvió el aceite oscuro resultante en acetato de etilo (150 ml) y se lavó con una solución de HCl al 3 % (2 x 20 ml), seguido de una solución saturada de bicarbonato de sodio (30 ml). Se secó la capa orgánica sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. Se purificó el residuo bruto mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (19 mm x 175 mm) usando 2 % de metanol en diclorometano para dar N-fercbutiloxicarbonil-esfingosina-1-O-dimetilfosfato 125 (350 mg, 51 %) como una goma.
RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) 55,82 (dt, J = 15,4, 7,1 Hz, 1H), 5,48 (dd, J = 15,4, 7,1 Hz, 1H), 4,99 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 4,32 (ddd, J = 10,7, 8,0, 4,6 Hz, 1H), 4,11 (ddt, J = 10,7, 7,4, 3,1 Hz, 2H), 3,77 (dd, J = 11,1, 2,1 Hz, 6H), 2,01 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 1,41 (s, 9H), 1,34 (m, 2H), 1,23 (m, 20H), 0,86 (t, J = 6,4 Hz, 3H).
RMN de 31P (162 MHz, cloroformo-d) 52,00.
EM C17H25NO4 [M+Na+]; calculado: 330,2, hallado: 330,2.
Ejemplo 47. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Esfingosina-1-fosfato (126).
Figure imgf000061_0001
126
Se trató una solución de W-terc-butiloxicarbonil-esfingosina-1-O-dimetilfosfato 125 (350 mg, 0,689 mmol) en diclorometano anhidro (8 ml) gota a gota con bromuro de trimetilsililo (0,45 ml, 3,45 mmol) a 0 oC. Después de permitir que la mezcla alcanzara temperatura ambiente, se dejó en agitación a t.a. durante 6 h y, a continuación, se concentró hasta sequedad. Se coevaporó el residuo resultante con diclorometano para eliminar el exceso de bromuro de trimetilsililo y, a continuación, se trató con THF acuoso al 66 % (6 ml). Se recogió el precipitado resultante por filtración para dar esfingosina-1-fosfato 126 (218 mg, 83 %) como un sólido blanco.
RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4 CD3CO2D) ó 5,84 (dt, J = 15,5, 6,7 Hz, 1H), 5,46 (dd, J = 15,5, 6,7 Hz, 1H), 4,33 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 4,13 (ddd, J = 11,8, 7,7, 3,6 Hz, 1H), 4,03 (dt, J = 11,8, 8,4 Hz, 1H), 3,47 (ddd, J = 8,3, 4,8, 3,2 Hz, 1H), 2,10-1,99 (m, 2H), 1,37 (m, 2H), 1,24 (m, 20H), 0,83 (t, J = 6,4 Hz, 3H).
RMN de 31P (162 MHz, cloroformo-d) ó 0,69.
EM C18H38NO5P [M-H+]; calculado: 378,2, hallado: 378,2.
Ejemplo 48. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
W-Trifluoroacetil-fitoesfingosina (131).
OH
Figure imgf000061_0002
o 131
A una suspensión de fitoesfingosina (4 g, 12,6 mmol) y carbonato de potasio en polvo anhidro (5,22 g, 37,8 mmol) en diclorometano (85 ml) se añadió anhídrido trifluoroacético (1,96 ml, 13,9 mmol). Se agitó la mezcla a t.a. durante 18 h y, a continuación, se diluyó con diclorometano (500 ml). Se lavó la mezcla con agua (100 ml). Se añadió metanol (60 ml) para romper la emulsión. A continuación, se secó la fase orgánica sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró para dar 131 (4,9 g, 94 %) como un sólido blanco.
RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) ó 8,90 (s, 1H), 4,90-4,68 (m, 1H), 4,56 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 4,43 (s, 1H), 3,97 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 3,65 (d, J = 10,8 Hz, 1H), 3,46 (t, J = 10,2 Hz, 1H), 3,32-3,16 (m, 1H), 1,42 (tt, J = 15,7, 7,5 Hz, 2H), 1,20 (s, 24H), 0,83 (t, J = 6,8 Hz, 3H).
Ejemplo 49. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
1-0-terc-Butildifenilsilil-2-W-trifluoroacetil-fitoesfingosina (132)
Figure imgf000061_0003
o 132
Se trató W-trifluoroacetil-fitoesfingosina (131, 1,88 g, 4,5 mmol) en piridina anhidra (23 ml) con DMAP (56 mg, 0,45 mmol) y, a continuación, gota a gota cloruro de terc-butildifenilsililo (1,38 g, 5,0 mmol). Después de 18 h, se concentró hasta sequedad. Se disolvió el residuo resultante en acetato de etilo (200 ml) y se lavó con una solución saturada de cloruro de amonio (2 x 50 ml) y, a continuación, con salmuera (50 ml). Se extrajeron las fases acuosas con acetato de etilo (50 ml). Se secaron las fases orgánicas combinadas sobre sulfato sódico y se concentraron para dar 1 -O-terc-butildifenilsilil-2-W-trifluoroacetil-fitoesfingosina 132 (3 g, 100 %) bruto como una goma. Se usó el material en la siguiente etapa sin purificación adicional.
RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) 67,62 (m, 2H), 7,60-7,56 (m, 2H), 7,47-7,31 (m, 6H), 7,07 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,23 (dd, J = 8,5, 4,1 Hz, 1H), 4,04 (dt, J = 11,0, 2,5 Hz, 1H), 3,82 (ddd, J = 11,0, 4,3, 1,8 Hz, 1H), 3,64 (dq, J = 10,6, 6,0, 4,3 Hz, 2H), 1,45 (m, 2H), 1,39-1,15 (m, 24H), 1,05 (m, 9H), 0,94-0,80 (t, J = 6,9 Hz, 3H).
Ejemplo 50. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
1-0-terc-Butildifenilsilil-3,4-0-isopropiliden-2-N-trifluoroacetil-fitoesfingosina (133)
Figure imgf000062_0001
Se trató una solución de 1-0-terc-butildifenilsilil-2-W-trifluoroacetil-fitoesfingosina 132 (3 g, 4,5 mmol) en 2,2-dimetoxipropano/THF 1/1 (v/v) con una cantidad catalítica de ácido p-toluenosulfónico (87 mg, 0,45 mmol) y se dejó en agitación durante 16 h a t.a. Se desactivó la mezcla con una solución saturada de bicarbonato de sodio (30 ml) y, a continuación, se eliminó el exceso de THF/2,2-dimetoxipropano a vacío. Se extrajo la mezcla con acetato de etilo (200 ml). Después de lavar con salmuera, se secó la capa orgánica sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. Se purificó el aceite bruto mediante cromatografía en columna (25 mm x 175 mm) sobre gel de sílice con una fase móvil de hexanos/acetato de etilo para dar 133 (2,45 g, 78 %).
RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) 67,68-7,63 (m, 2H), 7,63-7,57 (m, 2H), 7,39 (m, 6H), 6,54 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 4,23 (dd, J = 8,2, 5,6 Hz, 1H), 4,12 (ddd, J = 13,3, 6,9, 3,8 Hz, 2H), 3,96 (dd, J = 10,5, 3,9 Hz, 1H), 3,69 (dd, J = 10,5, 2,9 Hz, 1H), 1,52-1,36 (m, 2H), 1,33 (s, 3H), 1,31 (s, 3H), 1,24 (m, 24H), 1,03 (s, 9H), 0,86 (t, J = 53,7, 6,9 Hz, 3H).
Ejemplo 51. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
3,4-0-Isopropiliden-2-N-trifluoroacetil-fitoesfingosina (134).
Figure imgf000062_0002
Se trató una solución de 1-0-terc-butildifenilsilil-3,4-0-isopropiliden-2-W-trifluoroacetil-fitoesfingosina 133 (2,45 g, 3,54 mmol) en THF (18 ml) con fluoruro de tetrabutilamonio (4,25 ml de una solución 1,0 M en THF, 4,25 mmol) y se agitó a t.a. durante 12 h. Se diluyó la mezcla con acetato de etilo (100 ml) y solución saturada de cloruro de amonio (2 x 50 ml) y, a continuación, salmuera (50 ml). Se secó la fase orgánica sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró para dar un sólido blanco que se purificó adicionalmente mediante cromatografía en columna (25 mm x 175 mm) sobre gel de sílice con una fase móvil de hexanos:acetato de etilo 9:1 para dar 134 (1,5 g, 93 %) como un sólido blanco.
RMN de 1H (300 MHz, cloroformo-d) 66,92 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 4,31-4,16 (m, 2H), 4,11 (dq, J = 11,7, 3,7 Hz, 1H), 4,00 (dd, J = 11,5, 2,6 Hz, 1H), 3,70 (dd, J = 11,5, 3,6 Hz, 1H), 1,48 (s, 3H), 1,35 (s, 3H), 1,25 (m, 26H), 0,88 (t, J = 6,9 Hz 3H).
Ejemplo 52. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
3,4-0-Isopropiliden-2-W-trifluoroacetil-fitoesfingosina-1-0-dimetilfosfato (135)
Figure imgf000063_0001
Una solución de 3,4-0-isopropiliden-2-W-trifluoroacetil-fitoesfingosina 134 (630 mg, 1,39 mmol) se volvió anhidra mediante coevaporación con piridina anhidra (2 x 12 ml). A continuación, se disolvió el residuo en piridina anhidra (12 ml) y se trató con tetrabromuro de carbono (533 mg, 1,67 mmol). Se enfrió la mezcla a 0 °C y se trató gota a gota con una solución de trimetilfosfito (0,23 ml, 1,95 mmol) en piridina anhidra (3 ml) durante un período de 30 min. Después de 12 h adicionales a t.a., tanto el análisis por CLEM como por CCF (metanol al 5 % en diclorometano) indicaron una conversión completa. Se desactivó la mezcla con agua (2 ml) y, a continuación, se concentró hasta sequedad. Se disolvió el aceite oscuro resultante en acetato de etilo (100 ml) y se lavó con una solución de HCl al 3 % (2 x 20 ml), seguido de una solución saturada de bicarbonato de sodio (30 ml). Se secó la capa orgánica sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. Se purificó el residuo bruto mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (19 mm x 175 mm) usando 2 % de metanol en diclorometano para dar 135 (650 mg, 83 %).
RMN de 1H (300 MHz, cloroformo-d) ó 7,42 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 4,36 (td, J = 10,9, 5,0 Hz, 1H), 4,25 (m, 1H), 4,19 (m, J = 6,5, 2,0 Hz, 3H), 3,77 (dd, J = 11,2, 7,5 Hz, 6H), 1,44 (s, 3H), 1,33 (s, 3H), 1,25 (m, 26H), 0,87 (t, J = 6,6 Hz, 3H).
RMN de 31P (121 MHz, cloroformo-d) ó 1,69.
EM C25H47F3NO7P [M-H+]; calculado: 560,3, hallado: 560,2.
Ejemplo 53. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
3,4-0-Isopropiliden-2-W-trifluoroacetil-fitoesfingosina-1-fosfato (136)
Figure imgf000063_0002
Se trató una solución de 3,4-0-isopropiliden-2-W-trifluoroacetil-fitoesfingosina-1-0-dimetilfosfato 135 (650 mg, 1,16 mmol) en diclorometano anhidro (12 ml) gota a gota con bromuro de trimetilsililo (0,81 ml, 6,23 mmol) a 0 °C. Después de 12 h a t.a., se concentró la mezcla hasta sequedad y se coevaporó el residuo resultante con diclorometano (3 x 50 ml) para eliminar el exceso de bromuro de trimetilsililo. A continuación, se disolvió el residuo en una solución fría (4 °C) de NH4OH al 1 % mientras se mantenía el pH entre 7 y 8. Después de 10 min a t.a., se concentró la mezcla hasta sequedad y se trituró el sólido resultante con metanol/acetonitrilo. Se recogió el sólido por filtración, se lavó con acetonitrilo y se secó a alto vacío para dar 136 (500 mg, 75 %) como un sólido blanco.
RMN de 1H (300 MHz, metanol-d4) ó 4,31 (dd, J = 8,7, 5,4 Hz, 1H), 4,09 (m, 4H), 1,42 (s, 3H), 1,36 (s, 3H), 1,31 (m, 26H), 0,89 (t, J = 6,4 Hz, 3H).
RMN de 31P (121 MHz, metanol-d4) ó 1,28.
RMN de 19F (282 MHz, metanol-d4) ó -77,13.
EMAR C23H42F3NO7P [M-H+]; calculado: 532,26565, hallado: 532,26630.
Ejemplo 54. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
2',3'-Didesoxi-2'-fluoro-5'-(W-trifluoroacetil-3,4-(O-isopropiliden-fitoesfingosina-1-fosfo)-7-desazaguanosina (137)
Figure imgf000064_0001
Una mezcla de W-trifluoroacetil-fitoesfingosina-1-fosfato 136 (200 mg, 0,373 mmol) y 2',3'-didesoxi-2'-fluoro-7-desazaguanina (100 mg, 0,373 mmol) se volvió anhidra mediante coevaporación con piridina anhidra (3 x 10 ml). A continuación, se disolvió el residuo resultante en piridina anhidra (4 ml) y se trató con diisopropilcarbodiimida (127 mg, 1,01 mmol) y HOBt (60 mg, 0,447 mmol). Después de 24 h a 75 oC, se enfrió la mezcla de reacción a t.a. y se concentró hasta sequedad. Se purificó el material bruto mediante cromatografía en columna ultrarrápida (19 mm x 170 mm) sobre gel de sílice usando un gradiente de disolventes del 5 al 7,5 % de metanol en cloroformo con 1 % (v/v) de NH4OH para dar 137 (80 mg, 27 %) como un sólido blanco.
RMN de 1H (300 MHz, m etano^) 66,88 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 6,46 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 6,24 (d, J = 19,9 Hz, 1H), 5,34 (dd, J = 52,4, 4,6 Hz, 1H), 4,53 (s, 1H), 4,34-3,97 (m, 6H), 2,63-2,17 (m, 2H), 1,40 (s, 3H), 1,30 (s, 3H)), 1,27 (m, 26H), 0,89 (t, J = 6,6 Hz, 3H).
RMN de 31P (121 MHz, m etano^) 612,50.
RMN de 19F (282 MHz, m etano^) 6 -77,10, -179,69 a -180,25 (m).
EM C34H522 F4N5O9P [M-H+]; calculado: 781,3, hallado: 782,2.
Ejemplo 55. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Procedimiento experimental para la síntesis de profármacos
Se añadió una solución de 2-((cloro(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de isopropilo (0,397 g, 1,300 mmol) en THF anhidro (5 ml) a una solución en agitación a -78 °C de 2'-desoxi-2'-fluoronucleósido (0,812 mmol) y 1-metil-1H-imidazol (0,367 ml, 4,63 mmol) en piridina (10,00 ml). Después de 15 min, se permitió que la reacción alcanzara temperatura ambiente y se agitó durante 3 horas adicionales. A continuación, se eliminó el disolvente bajo presión reducida. Se disolvió el producto bruto en 120 ml de DCM y se lavó con 20 ml de solución de HCl 1 N seguido de 10 ml de agua. Se secó la fase orgánica sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró a vacío. Se separaron los residuos sobre columna de sílice (neutralizada con TEA) utilizando MeOH al 5 % en DCM como fase móvil para proporcionar los productos respectivos como diastereómeros.
Ejemplo 56. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000064_0002
RMN de 1H (400 MHz, CDCla) 61,48-1,06 (m, 9H), 4,04-3,84 (m, 1H), 4,60-4,14 (m, 3H), 4,86-4,64 (m, 1H), 5,11­ 4,90 (m, 1H), 5,61-5,19 (m, 1H), 6,32-5,94 (m, 3H), 7,44-7,02 (m, 5H), 8,11-7,89 (m, 1H), 8,46-8,20 (m, 1H). CL-EM m /z 589,4 (M+H+).
Ejemplo 57. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000065_0001
RMN de 1H (400 MHz, CDCI3) 61,14-1,29 (m, 6H), 1,31-1,43 (m, 3H), 3,83-4,07 (m, 2H), 4,15-4,54 (m, 3H), 4,91­ 5,11 (m, 1H), 5,61-5,74 (m, 1H), 5,81-5,97 (m, 1H), 7,14-7,24 (m, 3H), 7,27-7,44 (m, 2H), 7,48-7,51 (m, 1H), 7,80 (t, J = 7,96, 7,96 Hz, 0H), 9,30 (s, 1H). CL-EM m/z 516,3 (M+1+)
Ejemplo 58. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de fosfonatos
Figure imgf000065_0002
Reactivos y condiciones: a) BAIB, TEMPO; b) Pb(OAc)4; c) (EtO)2POCH2OH, pTSA
Ejemplo 59. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000065_0003
Reactivos y condiciones: a) i. Pt/C, O2 , ii. DMF-dineopentil acetal; b) IBr, (EtO)2POCH2OH; c) AIBN, Bu3SnH; d) i. AgOAc, ii. NaOMe, MeOH, iii. PPh3, DIAD, 4 -NO2C6H4COOH, iv. NaOMe, MeOH.
Ejemplo 60. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000066_0001
Reactivos y condiciones: a) i. I2 , acetona, ii. K2CO3 , MeOH; b) Pt/C, O2; c) i. Pb(OAc)4, ii. AC2O, DMAP; d) i.
(EtO)2POCH2OH, pTSA, ii. K2CO3 , MeOH; e) BnCl, KOH; f) Ac2O, AcOH, H2SO4 ; g) i. base sililada, TMSOTf, ii.
K2CO3, MeOH; h) DMP; i) i. RLi o RMgBr, ii. DAST; j) H2, Pd/C.
Ejemplo 61. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000066_0002
Reactivos y condiciones: a) i. I2 , acetona, ii. K2CO3 , MeOH; b) Pt/C, O2; c) i. Pb(OAc)4, ii. Ac2O, DMA (EtO)2POCH2OH, pTSA, ii. K2CO3 , MeOH; e) i. TCDI, piridina, ii. Bu3SnH, AIBN; f) Ac2O, AcOH, H2SO4 ; g) i. base
sililada, TMSOTf, ii. K2CO3, MeOH; h) DMP; i) i. RLi o RMgBr, ii. DAST
Ejemplo 62. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000067_0001
Reactivos y condiciones: a) i. SOCI2, ii. NaIÜ4, RuCb; b) TBAF; c) BF3-OEÍ2, DIBAL; d) AC2O, AcOH, H2SO4 ; e) (EtO)2POCH2OH, pTSA; f) i. DIBAL, ii. Ac2O, Et3N, DMAP; g) i. base sililada, TMSOTf, ii. K2CO3, MeOH Ejemplo 63. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de profármacos de tipo fosfonato
Figure imgf000067_0002
Reactivos y condiciones: a) TMSBr; b) aminoéster, ArOH, Et3N, 2,2'-ditiodipiridina, PPh3; c) i. DIC, base esfingoide, ii. TFA; d) clorofosforamidato, Et3N; e) DIC, base esfingoide-1-fosfato
Ejemplo 64. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
N-ferc-Butiloxicarbonil-fitoesfingosina (174)
Figure imgf000068_0001
174
Se trató una suspensión de fitoesfingosina (10,6 g, 33,5 mmol) y trietilamina (5,6 ml, 40,2 mmol) en THF (250 ml) gota a gota con dicarbonato de di-terc-butilo (8,6 ml, 36,9 mmol). Después de 12 h a t.a., se concentró la mezcla hasta sequedad y se recristalizó el sólido blanco resultante en acetato de etilo (80 ml) y, a continuación, se secó a alto vacío a 35 °C durante 12 h para dar 174 (10,5 g, 75 %).
RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) 65,31 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 3,89 (d, J = 11,1 Hz, 1H), 3,83 (s, 2H), 3,74 (dd, J = 11,1, 5,2 Hz, 1H), 3,65 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 3,61 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 1,43 (s, 9H), 1,23 (s, 27H), 0,86 (t, J = 6,4 Hz, 3H).
Ejemplo 65. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
2-0-ferc-Butildifenilsilil-1-N-ferc-butiloxicarbonil-fitoesfingosina (175)
Figure imgf000068_0002
Se trató una solución de W-ferc-butiloxicarbonil-fitoesfingosina 174 (9,5 g, 22,65 mmol) y trietilamina (3,8 ml, 27,2 mmol) en diclorometano anhidro/DMF (120 ml/10 ml) gota a gota con ferc-butilclorodifenilsilano (7 ml, 27,25 mmol). Después de 18 h a t.a., se diluyó la mezcla con diclorometano (200 ml) y se lavó con HCl 0,2 N (100 ml) y, a continuación, con salmuera (100 ml). Se secó la fase orgánica sobre sulfato de sodio, se filtró y, a continuación, se concentró para dar 175 (14,9 g) como un aceite que se usó en la siguiente reacción sin purificación adicional.
RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) 65,31 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 3,89 (d, J = 11,1 Hz, 1H), 3,83 (m, 1H), 3,74 (dd, J = 11,1, 5,2 Hz, 1H), 3,65 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 3,61 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 1,43 (s, 9H), 1,23 (s, 27H), 0,86 (t, J = 6,4 Hz, 3H).
Ejemplo 66. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
2-0-ferc-Butildifenilsilil-1-N-ferc-butiloxicarbonil-3,4-0-isopropiliden-fitoesfingosina (176)
Figure imgf000068_0003
Se trató una solución de 2-O-ferc-butildifenilsilil-1-W-ferc-butiloxicarbonil-fitoesfingosina (175, 14,9 g, 22,65 mmol) en THF/2,2-dimetoxipropano 1/1 (v/v) con ácido p-toluenosulfónico catalítico (860 mg, 4,53 mmol). Después de 24 h, se desactivó la mezcla con una solución saturada de bicarbonato de sodio (50 ml). Se concentró la mezcla y, a continuación, se disolvió en acetato de etilo (200 ml) y se lavó con salmuera (2 x 50 ml). Se secó la fase orgánica sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró para dar 176 (15,7 g) como una goma que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) ó 7,66 (m, 4H), 7,51-7,27 (m, 6H), 4,78 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 4,18 (dd, J = 9,3, 5,5 Hz, 1H), 3,89 (dd, J = 9,9, 3,3 Hz, 1H), 3,80 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 3,72 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 1,45 (s, 9H), 1,42 (s, 3H), 1,35 (s, 3H), 1,25 (s, 27H), 1,05 (s, 9H), 0,87 (t, J = 6,5 Hz, 3H).
Ejemplo 67. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
1-N-ferc-Butiloxicarbonil-3,4-0-isopropiliden-fitoesfingosina (177).
Figure imgf000069_0001
Se trató una solución de 2-O-ferc-butildifenilsilil-1-W-ferc-butiloxicarbonil-3,4-O-isopropiliden-fitoesfingosina 176 (15,7 g, 22,6 mmol) en THF a 0 °C gota a gota con una solución de fluoruro de tetrabutilamonio (1,0 M en THF, 24,9 ml, 24,9 mmol) durante un período de 20 min. Después de 16 h a t.a., la CCF (hexanos:acetato de etilo 3:1) indicó una conversión completa. Se concentró la mezcla hasta sequedad y se disolvió el residuo resultante en acetato de etilo (300 ml) y se lavó con agua (3 x 100 ml). Se secó la fase orgánica sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. Se purificó el aceite resultante mediante cromatografía en columna ultrarrápida (35 mm x 180 mm) usando un gradiente de disolventes del 25 al 50 % de acetato de etilo en hexanos para dar 177 (7,3 g, 71 % en 3 etapas) como un sólido blanco.
RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) ó 4,93 (d, J = 9,1, 1H), 4,16 (q, J = 7,1, 6,4 Hz, 1H), 4,07 (t, J = 6,5 Hz, 1H), 3,83 (dd, J = 11,1, 2,4 Hz, 1H), 3,76 (m, 1H), 3,67 (dd, J = 11,2, 3,6 Hz, 1H), 1,43 (s, 3H), 1,42 (s, 9H), 1,32 (s, 3H), 1,23 (s, 27H), 0,86 (t, J = 6,9 Hz, 3H).
Ejemplo 68. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de profármacos de tipo fosfato cíclicos
Figure imgf000069_0002
Reactivos y condiciones: a) i. RiOP(N/Pr2)2 , DCI, ii. mCPBA; b) i. clorofosforamidato, imidazol, ii. t-BuOK; c) i. imidazol, ii. t-BuOK
Ejemplo 69. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Procedimiento general para la síntesis de análogos de nucleósidos de 4-tiouridina
Figure imgf000070_0001
Reactivos y condiciones: a) Ac2O, Et3N, DMAP; b) reactivo de Lawesson, dioxano, reflujo; c) NH3 , MeOH Ejemplo 70. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000070_0002
206
Se agitó una suspensión de 2'-metiluridina (0,258 g, 0,999 mmol) en Ac2O (4,00 ml) en presencia de DMAP (0,024 g, 0,200 mmol) y Et3N (0,139 ml, 0,999 mmol) a t.a. durante la noche. La mezcla de reacción se volvió homogénea y amarillenta al agitarla. Se condensó la reacción en un rotavapor y se coevaporó con EtOH (15 ml x 3). Se purificó el producto por medio de ISCO para dar un sólido blanco con un rendimiento >95 %.
Datos físicos: RMN de 1H (400 Hz, CDCb): 61,519 (s, 3H), 2,087 (s, 6H), 2,099 (s, 3H), 4,265 (m, 1H), 4,369 (m, 2H), 5,220 (d, 1H, J = 6 Hz), 5,756 (d, 1H, J = 8 Hz), 6,217 (s, 1H), 7,407 (d, 1H, J = 8 Hz), 9,744 (s, 1H); RMN de 13C (100 Hz, CDCb): 6 17,773, 20,520, 20,687, 21,461, 62,649, 74,313, 79,284, 84,195, 89,409, 102,364, 140,530, 150,040, 163,071, 169,643, 169,742, 170,318; EM: m/z 273,1 (M-uracilo+H); CL-EM: 99,6 % de pureza; EMAR calculado para C16H21O9N2 (M+H): 385,12416, hallado: 385,12420.
Ejemplo 71. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000070_0003
207
Se calentó a reflujo una mezcla de per-Ac-2'-metiluridina (0,100 g, 0,260 mmol) y reactivo de Lawesson (0,127 g, 0,315 mmol) en dioxano seco (1,301 ml) bajo nitrógeno durante 2 h. Se condensó la reacción en un rotavapor y se cargó el residuo amarillo obtenido en ISCo y se eluyó con MeOH al 3 %/CH2Cl2. Se usó la espuma amarilla obtenida en la siguiente etapa sin purificación adicional, y la CL-EM mostró una pureza del 53 %.
Ejemplo 72. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000071_0001
208
Se agitó una solución de per-Ac-5-tio-2'-metiluridina bruta obtenida en la etapa previa (0,126 g, 0,315 mmol) en NH3 en MeOH (7 M, 1,573 ml, 11,01 mmol) a t.a. en un tubo sellado durante 4,5 h. Se condensó la solución amarilla en un rotavapor y se cargó en ISCO (columna de 4 g, MeOH/CH2Cl2 8 % ^ a 15 %) para dar una espuma amarilla con un rendimiento del 55 % en dos etapas.
Datos físicos: RMN de 1H (400 Hz, CD3OD): 51,201 (s, 3H), 3,835 (m, 2H), 3,983 (m, 2H), 5,595 (s, 1H), 6,396 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 8,006 (d, 1H, J = 7,2 Hz); RMN de 13C (100 Hz, CD3OD): 520,983, 61,259, 74,123, 80,862, 84,809, 94,144, 114,863, 137,236, 150,806, 192,972; EM: m/z 275,0 (M+H); CL-EM: 95,9 % de pureza; EMAR calculado para C10H15O5N2S (M+H): 275,06962, hallado: 275,06967.
Ejemplo 73. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000071_0002
Reactivos y condiciones: a) Ac2O, Et3N, DMAP; b) reactivo de Lawesson, dioxano, reflujo; c) NH3 , MeOH Ejemplo 74. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000071_0003
210
Se agitó una suspensión pardusca de 2'-F-2'-metiluracilo (0,120 g, 0,461 mmol) en Ac2O (1,845 ml) en presencia de DMAP (5,63 mg, 0,046 mmol) a t.a. durante 2 h. La mezcla de reacción se volvió homogénea al agitarla. Se condensó la reacción en un rotavapor y se coevaporó con MeOH (5 ml x 2). Se purificó el residuo obtenido por medio de ISCO (columna de 12 g, 40 % a ^ 80 % de EtOAc en hexanos) para dar un sólido blanco con un rendimiento del 81 %.
Datos físicos: RMN de 1H (400 Hz, CDCb): 5 1,398 (d, 3H, J = 22 Hz), 2,142 (s, 3H), 2,183 (s, 3H), 4,379 (m, 3H), 5,128 (dd, 1H, J i = 21,2 Hz, J 2 = 8,8 Hz), 5,788 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 6,179 (d, 1H, J = 18,4 Hz), 7,549 (d, 1H, J = 8 Hz), 8,882 (s, 1H); RMN de 13C (100 Hz, CDCb): 517,113, 17,363, 20,490, 20,672, 61,457, 71,498, 71,665, 98,539, 100,390, 103,085, 138,990, 149,911, 162,312, 169,924; EM: m/z 345,0 (M-uracilo+H); CL-EM: 95 % de pureza; EMAR calculado para C14H18FO7N2 (M+H): 345,10926, hallado: 345,10906.
Ejemplo 75. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000072_0001
211
Se calentó a reflujo una suspensión amarilla de per-Ac-2'-F-2'-met¡lurac¡lo (0,129 g, 0,375 mmol) y reactivo de Lawesson (0,183 g, 0,453 mmol) en dioxano seco (1,873 ml) bajo argón durante 1 h, que se volvió homogénea al calentarse. Se condensó la reacción en un rotavapor y se cargó el residuo amarillo en ISCO (columna de 12 g, 20 a 100 % de EtOAc en hexanos). La espuma amarilla obtenida mostró una pureza del 74 % del producto deseado en CL-EM, que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Ejemplo 76. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000072_0002
212
Se agitó una solución de per-Ac-2'-F-2'-metil-4-tiouracilo (0,135 g, 0,375 mmol) en NH3 en MeOH (7 M, 1.873 ml, 13,11 mmol) a t.a. en un tubo sellado durante 4,5 h (10:04:05 AM). Se condensó la solución amarilla en un rotavapor y se cargó en ISCO (columna de 4 g, 5 % a ^ 12 % de MeOH en CH2Cb). El producto obtenido es una espuma amarilla con un rendimiento del 73 % en dos etapas.
Datos físicos: RMN de 1H (400 Hz, CD3OD): ó 1,367 (d, 3H, J = 22,4 Hz), 3,794 (dd, 1H, J i = 12,4 Hz, J 2 = 2,4 Hz), 3,971 (m, 3H), 6,094 (d, 1H, J = 18 Hz), 6,368 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 7,888 (d, 1H, J = 7,6 Hz). RMN de 13C (100 Hz, CD3OD): ó 16,757 (d, J = 25 Hz), 59,951, 72,276, 83,395, 90,704 (d, J = 34,9 Hz), 101,894 (d, J = 179,9 Hz), 114,435, 135,602, 149,733, 192,200; EM: m/z 277,0 (M+H); CL-EM: 100 % de pureza; EMAR calculado para C10H14FO4N2S (M+H): 277,06528, hallado: 277,06496.
Ejemplo 77. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000072_0003
Reactivos y condiciones: a) dioxano, reactivo de Lawesson, reflujo; b) NH3/MeOH
Ejemplo 78. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000073_0001
214
Se cargó una solución en agitación de benzoato (1 g, 1,37 mmol) en dioxano (6,9 ml, 0,2 M) con reactivo de Lawesson (673 mg, 1,66 mmol) y se calentó a reflujo, tiempo durante el cual la reacción se volvió homogénea y marrón. Después de 2 h, se concentró la reacción y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice con 10 a 30 % de acetato de etilo en hexanos para proporcionar 600 mg de tiouridina al 68 %.
Ejemplo 79. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000073_0002
215
Se preparó una solución en agitación de benzoato (600 mg, 2,08 mmol) en amoníaco (9 ml, 7 M en metanol). Después de 16 h, se concentró la reacción y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice con 2 a 15 % de acetato de etilo en DCM para proporcionar 269 mg de tiouridina (87 %).
Ejemplo 80. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000073_0003
Reactivos y condiciones: a) dioxano, reactivo de Lawesson, reflujo; b) TBAF, THF
Ejemplo 81. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000074_0001
Se calentó 1-((6aR,8R,9S,9aR)-2,2,4,4-tetraisopropil-9-metiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioxadisilocin-8-il)pirimidin-2,4(1H,3H)-diona (0,16 g, 0,33 mmol) con reactivo de Lawesson (0,17 g, 0,43 mmol) en 1,4-dioxano seco (1,65 ml) bajo argón durante 1 h. A continuación, se eliminó el solvente a vacío y se purificó el material bruto mediante cromatografía en columna ISCO eluyendo con 10 % a 40 % de EtOAc en hexanos para dar 1-((6aR,8R,9S,9aR)-2,2,4,4-tetraisopropil-9-metiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioxadisilocin-8-il)-4-tioxo-3,4-dihidropirimidin-2(1H)-ona (0,11 g, 67 %) como un sólido amarillo.
RMN de 1H (400 MHz, CDCla) ó 9,33 (s an., 1H), 7,68 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 6,40 (dd, J = 7,6, 1,6 Hz), 6,20 (d, J = 7,2 Hz), 1H), 4,18 (d, J = 13,6 Hz, 1H), 4,04-3,89 (m, 2H), 3,78 (dd, J = 8,8, 2,4 Hz, 1H), 2,71-2,62 (m, 1H), 1,12­ 0,84 (m, 31H).
Ejemplo 82. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000074_0002
217
Se agitó 1-((6aR,8R,9S,9aR)-2,2,4,4-tetraisopropil-9-metiltetrahidro-6H-furo[3,2-f][1,3,5,2,4]trioxadisilocin-8-il)-4-tioxo-3,4-dihidropirimidin-2(1H)-ona (0,11 g, 0,22 mmol) con TBAF (1,0 M en t Hf , 0,44 ml, 0,44 mmol) a t.a. durante la noche. A continuación, se eliminó el disolvente a vacío y se purificó el material bruto mediante cromatografía en columna de SiO2, eluyendo con un gradiente del 100 % DCM al 4 % de MeOH en DCM para dar 1-((2R,3S,4R,5R)-4-hidroxi-5-(hidroximetil)-3-metiltetrahidrofuran-2-il)-4-tioxo-3,4-dihidropirimidin-2(1H)-ona (33 mg, 58 %) como un sólido amarillo.
RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) ó 7,81 (d, J = 7,6 Hz 1H), 6,38 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,17 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 3,96­ 3,71 (m, 4H), 2,53-2,50 (m, 1H), 0,96 (d, J = 7,2 Hz, 3H).
CLEM C10H13N2O4S [M+H+]; calculado: 257,1; hallado, 256,9.
Ejemplo 83. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Ruta sintética para la síntesis de análogos de nucleósidos de 2'-fluoro-2-tiouridina
Figure imgf000074_0003
Reactivos y condiciones: a) cloruro de tosilo, Et3N, DMAP; b) NaHCO3, etanol, reflujo; c) NaSH, DMF
Se pueden preparar análogos de nucleósidos de 2'-fluoro-2-tiouridina tratando el nucleósido original (1 equivalente) con cloruro de tosilo (1,2 equivalentes) disuelto en piridina:DCM (1:1) en atmósfera inerte. A continuación, se puede tratar el análogo de 5'-tosilnucleósido resultante con bicarbonato de sodio (5 equivalentes) en etanol a reflujo para obtener el 2-etoxinucleósido. Finalmente, se puede obtener el análogo de 2-tionucleósido deseado tratando el intermedio 2-etoxi con hidrosulfuro de sodio (10 equivalentes) en un disolvente polar tal como DMF.
Ejemplo 84. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Ruta sintética para la síntesis de análogos de nucleósidos de 2'-fluoro-2'-metil-2-tiouridina
Figure imgf000075_0001
Reactivos y condiciones: a) cloruro de tosilo, Et3N, DMAP; b) NaHCO3, etanol, reflujo; c) NaSH, DMF
Se pueden preparar análogos de nucleósidos de 2'-fluoro-2'-metil-2-tiouridina tratando el nucleósido original (1 equivalente) con cloruro de tosilo (1,2 equivalentes) disuelto en piridina:DCM (1:1) en atmósfera inerte. A continuación, se puede tratar el análogo de 5'-tosilnucleósido resultante con bicarbonato de sodio (5 equivalentes) en etanol a reflujo para obtener el 2-etoxinucleósido. Finalmente, se puede obtener el análogo de 2-tionucleósido deseado tratando el intermedio 2-etoxi con hidrosulfuro de sodio (10 equivalentes) en un disolvente polar tal como DMF.
Ejemplo 85. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Ruta sintética para la síntesis de análogos de nucleósidos de 2'-C-metil-2-tiouridina
Figure imgf000075_0002
Reactivos y condiciones: a) cloruro de tosilo, Et3N, DMAP; b) NaHCO3, etanol, reflujo; c) NaSH, DMF
Se pueden preparar análogos de nucleósidos de 2'-C-metil-2-tiouridina tratando el nucleósido original (1 equivalente) con cloruro de tosilo (1,2 equivalentes) disuelto en piridina:DCM (1:1) en atmósfera inerte. A continuación, se puede tratar el análogo de 5'-tosilnucleósido resultante con bicarbonato de sodio (5 equivalentes) en etanol a reflujo para obtener el 2-etoxinucleósido. Finalmente, se puede obtener el análogo de 2-tionucleósido deseado tratando el intermedio 2-etoxi con hidrosulfuro de sodio (10 equivalentes) en un disolvente polar tal como DMF.
Ejemplo 86. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Ruta sintética alternativa para la síntesis de análogos de nucleósidos de 2'-C-metil-2-tiouridina
Figure imgf000076_0001
240 241 242 243
Reactivos y condiciones: a) SnCl4, DCE, t.a.; b) Nhb/MeOH
Ejemplo 87. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000076_0002
242
Se preparó el 2-tiouracilo persililado en un matraz de fondo redondo cargado con 2-tiouracilo (1,99 g, 15,5 mmol), clorotrimetilsilano (1,55 ml, 12,21 mmol) y bis(trimetilsilil)amina (46,5 ml, 222 mmol) bajo nitrógeno. Se calentó la mezcla a reflujo con agitación durante la noche (16 h) hasta que se disolvieron todos los sólidos y se formó una solución azul verdosa. Se enfrió la mezcla hasta temperatura ambiente y se eliminaron los volátiles mediante evaporación rotatoria seguida de alto vacío para dar el 2-tiouracilo persililado como un líquido azul claro. Este compuesto se usó de inmediato en la siguiente etapa.
Se disolvió el 2-tiouracilo persililado 240 recién preparado (4,22 g, 15,50 mmol) en 1,2-dicloroetano (50 ml) bajo nitrógeno con agitación a temperatura ambiente. Se añadió una solución de 241 (4,50 g, 7,75 mmol) en 1,2-dicloroetano (50 ml) de una vez a la mezcla en agitación.
A esta mezcla se le añadió SnCU (1,36 ml, 3,03 g, 11,63 mmol) gota a gota con una jeringa y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 6 h hasta que se consumió todo el material de partida. Se enfrió la mezcla a 0 °C y se añadió una solución ac. sat. de NaHCO3 (125 ml). Se permitió que la mezcla alcanzara temperatura ambiente y se agitó durante 30 min. Se extrajo la mezcla con EtOAc (2 x 200 ml) y se lavaron las capas orgánicas combinadas con salmuera (1 x 100 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron mediante evaporación rotatoria para dar 5,5 g de producto bruto. Se recogió el material bruto en diclorometano, se inmovilizó en Celite y se sometió a cromatografía ultrarrápida en el Combiflash (columna de 120 g, gradiente del 5 al 50 % de EtOAc en hexanos) para dar 242 (2,41 g, 53 %) como un sólido pegajoso transparente con un ~90 % de pureza. Se usó el material directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional. RMN de 1H (400 MHz, CDCla) 6 ppm 9,37 (s an., 1H), 8,10-8,05 (m, 4H), 7,82 (d, J = 7,7 Hz, 2H), 7,70 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,66-7,45 (m, 6H), 7,42 (t, J = 7,8 Hz, 2H), 7,27-7,21 (m, 2H), 5,88 (d, J = 8,2, 1H), 5,62 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 4,91­ 4,83 (m, 2H), 4,77 (dd, J = 11,8 Hz, 4,7 Hz, 1H), 1,77 (s 3H).
Ejemplo 88. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000076_0003
243
Se cargó un matraz de fondo redondo con 242 (2,41 g, 4,11 mmol) bajo nitrógeno y se enfrió a 0 °C. A este matraz se le añadió una solución ~7,0 N de amoníaco en metanol (58,7 ml, 411 mmol), se agitó la mezcla suavemente y se permitió que alcanzara temperatura ambiente durante la noche. Después de 24 h de agitación a temperatura ambiente, se eliminaron los volátiles mediante evaporación rotatoria para dar 2,5 g de material bruto. Se recogió el material bruto en diclorometano, se inmovilizó en Celite y se sometió a cromatografía ultrarrápida en el Combiflash (columna de 80 g, gradiente del 0 al 10 % de EtOH en EtOAc) para dar 243 (0,873 g, rendimiento en dos etapas del 41 %) como un sólido blanquecino. RMN de 1H (400 MHz, MeOH-d4) ó ppm 8,27 (d, J = 8,2 Hz, 1H); 6,95 (s, 1H), 5,95 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 3,98 (dd, J = 12,5 Hz, 2,1 Hz, 1H), 3,93 (dt, J = 9,3 Hz, 2,1 Hz, 1H), 3,84 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 3,78 (dd, J = 12,5 Hz, 2,3 Hz), 1,24 (s, 3H).
Ejemplo 89. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Procedimiento general para la preparación de profármacos de 5'-fosforamidato
Síntesis de clorofosforamidato:
Figure imgf000077_0001
251
Se añadió gota a gota cloruro de tionilo (80 g, 49,2 ml, 673 mmol) durante un período de 30 min a una suspensión de L-alanina (50 g, 561 mmol) en isopropanol (500 ml). Se calentó la mezcla a reflujo suave durante 5 h y, a continuación, se concentró en un evaporador rotatorio (baño ajustado a 60 oC). La goma espesa resultante solidificó por trituración con éter (150 ml). Se trituró el polvo blanco una segunda vez con éter (150 ml), se recogió por filtración bajo una corriente de argón y, a continuación, se secó a alto vacío durante 18 h para dar clorhidrato de 2-aminopropanoato de (S)-isopropilo (88 g, 94 %).
RMN de 1H (400 MHz, DMSO-cfe) ó 8,62 (s, 3H), 5,10-4,80 (m, 1H), 3,95 (q, J = 7,2 Hz, 1H), 1,38 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 1,22 (d, J = 4,6 Hz, 3H), 1,20 (d, J = 4,6 Hz, 3H).
Ejemplo 90. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000077_0002
Se enfrió una solución de diclorofosfato de fenilo (30,9 g, 146 mmol) en diclorometano (450 ml) a 0 oC; a continuación, se trató con clorhidrato de 2-aminopropanoato de (S)-isopropilo (24,5 g, 146 mmol). Se enfrió adicionalmente la mezcla a -78 °C y, a continuación, se trató gota a gota con trietilamina (29,6 g, 40,8 ml, 293 mmol) durante un período de 30 min. Se mantuvo la mezcla en agitación a -78 °C durante 2 h adicionales y, a continuación, se permitió que alcanzara t.a. de forma gradual. Después de 18 h, se concentró la mezcla hasta sequedad y se disolvió la goma resultante en éter anhidro (150 ml). Se filtró la suspensión bajo una corriente de argón y se lavó el sólido recogido con pequeñas porciones de éter anhidro (3 x 30 ml). Se concentraron los filtrados combinados hasta sequedad en un evaporador rotatorio para dar una mezcla diastereomérica 1:1 de fosfocloridato (41,5 g, 93 %) como un aceite amarillo pálido.
RMN de 1H (300 MHz, cloroformo-d) ó 7,43-7,14 (m, 5H), 5,06 (m, 1H), 4,55 (dd, J = 14,9, 7,0 Hz, 1H), 4,21-4,01 (m, 1H), 1,48 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 1,27 (d, J = 6,2 Hz, 3H), 1,26 (d, J = 5,8 Hz, 3H).
RMN de 31P (121 MHz, cloroformo-d) ó 8,18 y 7,87.
Ejemplo 91. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de 2-cloro-4-nitrofenil fosforamidato:
Figure imgf000078_0001
Se enfrió una solución de diclorofosfato de fenilo (60 g, 42,5 ml, 284 mmol) en diclorometano (300 ml) a 0 °C y, a continuación, se trató con clorhidrato de 2-aminopropanoato de (S)-isopropilo (47,7 g, 284 mmol). Se enfrió adicionalmente la mezcla a -78 °C y se trató gota a gota con una solución de trietilamina (57,6 g, 79 ml, 569 mmol) en diclorometano (300 ml) durante un período de 1 h. Se permitió que la mezcla de reacción alcanzara 0 °C durante 30 min y, a continuación, se trató con una mezcla preformada de 2-cloro-4-nitrofenol (46,9 g, 270 mmol) y trietilamina (28,8 g, 39,6 ml, 284 mmol) en diclorometano (120 ml) durante un período de 20 min. Después de 2 h a 0 °C, se filtró la mezcla a través de un embudo de vidrio poroso y se concentró el filtrado recogido hasta sequedad. Se disolvió la goma bruta en MTBE (500 ml) y se lavó con K2CO30,2 M (2 x 100 ml) seguido de salmuera al 10 % (3 x 75 ml). Se secó la fase orgánica sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró hasta sequedad en un evaporador rotatorio para dar una mezcla diastereomérica (100 g, 93 %) como un aceite amarillo pálido.
RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) ó 8,33 (dd, J = 2,7, 1,1 Hz, 1H, diastereómero 1), 8,31 (dd, J = 2,7, 1,1 Hz, 1H, diastereómero 2), 8,12 (dd, J = 9,1, 2,7 Hz, 1H), 7,72 (dt, J = 9,1, 1,1 Hz, 1H), 7,40-7,31 (m, 2H), 7,28-7,19 (m, 6H), 5,01 (pd, J = 6,3, 5,2 Hz, 1H), 4,22-4,08 (m, 1H), 3,96 (td, J = 10,7, 9,1, 3,6 Hz, 1H), 1,43 (dd, J = 7,0, 0,6 Hz, 3H), 1,40 (dd, J = 7,2, 0,6 Hz, 3H, diastereómero 2), 1,25-1,20 (m, 9H).
Ejemplo 92. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Separación de diastereómeros del compuesto 253:
Figure imgf000078_0002
Se disolvió la mezcla diastereomérica 253 (28 g, 63,2 mmol) en acetato de etilo:hexanos 2:3 (100 ml) y se enfrió a -20 °C. Después de 16 h, se recogió el sólido blanco resultante por filtración y se secó a alto vacío para dar una mezcla de diastereómeros Sp:Rp 16:1 (5,5 g, 19,6 %). Se concentraron las aguas madres y se disolvió el residuo resultante en acetato de etilo:hexanos 2:3 (50 ml). Después de 16 h a -10 °C, se recogió el sólido blanco resultante y se secó a alto vacío para dar una mezcla de diastereómeros Sp:Rp 1:6 (4 g, 14 %). Se suspendió la mezcla de diastereómeros Sp:Rp 16:1 (5,5 g, 12,4 mmol) en hexanos calientes (50 ml) y se trató lentamente con acetato de etilo (aproximadamente 10 ml) hasta la disolución completa. Después de enfriar a 0 °C, se recogió el sólido blanco resultante por filtración, se lavó con hexanos y se secó a alto vacío para dar el diastereómero Sp de 254 (4,2 g, 76 %) como un solo isómero.
RMN de 1H (diastereómero Sp, 400 MHz, cloroformo-d) ó 8,33 (dd, J = 2,7, 1,1 Hz, 1H), 8,12 (dd, J = 9,1, 2,7 Hz, 1H), 7,71 (dd, J = 9,1, 1,2 Hz, 1H), 7,41-7,30 (m, 2H), 7,29-7,11 (m, 3H), 5,00 (m, 1H), 4,25-4,07 (m, 1H), 3,97 (dd, J = 12,7, 9,4 Hz, 1H), 1,43 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,23 (d, J = 2,2 Hz, 3H), 1,21 (d, J = 2,2 Hz, 3H).
Se suspendió la mezcla de diastereómeros Sp:Rp 1:6 (4 g, 12,4 mmol) en hexanos calientes (50 ml) y se trató lentamente con acetato de etilo (aproximadamente 5 ml) hasta la disolución completa. Después de enfriar a 0 °C, se recogió el sólido blanco resultante por filtración, se lavó con hexanos y se secó a alto vacío para dar el diastereómero Rp de 255 (3,2 g, 80 %) como un solo isómero. Se confirmó la estereoquímica absoluta mediante análisis por rayos X.
RMN de 1H (diastereómero Rp, 400 MHz, cloroformo-d) ó 8,31 (dd, J = 2,7, 1,1 Hz, 1H), 8,11 (dd, J = 9,1, 2,7 Hz, 1H), 7,72 (dd, J = 9,1, 1,2 Hz, 1H), 7,42-7,30 (m, 2H), 7,31-7,14 (m, 3H), 5,01 (p, J = 6,3 Hz, 1H), 4,15 (tq, J = 9,0, 7,0 Hz, 1H), 4,08-3,94 (m, 1H), 1,40 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,24 (d, J = 3,5 Hz, 3H), 1,22 (d, J = 3,5 Hz, 3H). Ejemplo 93. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones) Procedimiento general para la formación de profármacos de fosforamidato:
Se secó el nucleósido deseado (1 equivalente) que se va a convertir en su profármaco de 5'-fosforamidato en un horno de vacío a 50 °C durante la noche. Se colocó el nucleósido seco en un matraz seco bajo una atmósfera inerte y se suspendió en THF seco o DCM seco hasta lograr una solución 0,05 M. A continuación, se enfrió el matraz a 0 °C y se añadió el reactivo de clorofosforamidato (5 equivalentes) al nucleósido en suspensión. A continuación, se añadió gota a gota 1-metilimidazol (8 equivalentes) a la mezcla de reacción. Se mantuvo la reacción en agitación a temperatura ambiente durante 12-72 horas. Una vez completada la reacción, según se determinó por CCF, se diluyó la mezcla de reacción con acetato de etilo. A continuación, se lavó la mezcla de reacción diluida con solución acuosa saturada de cloruro de amonio. Se volvió a extraer la capa acuosa con acetato de etilo. A continuación, se lavaron las capas orgánicas combinadas con salmuera, se secaron sobre MgSÜ4, se filtraron y se concentraron. A continuación, se purificó el producto bruto concentrado sobre sílice eluyendo con un gradiente de DCM a 5 % de MeOH en DCM.
Ejemplo 94. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Profármacos de 5'-fosforamidato sintetizados utilizando el procedimiento general:
Figure imgf000079_0001
Ejemplo 95. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Procedimiento para la síntesis de 2'-C-metil-2-tiouridina-5'-fosforamidato:
Figure imgf000079_0002
Se secó el nucleósido deseado (1 equivalente) que se va a convertir en su profármaco de 5'-fosforamidato en un horno de vacío a 50 °C durante la noche. A una solución en agitación de 1-((2R,3R,4R,5R)-3,4-dihidroxi-5-(hidroximetil)-3-metiltetrahidrofuran-2-il)-2-tioxo-2,3-dihidropirimidin-4(1H)-ona (100 mg, 0,365 mmol) en THF (4 ml) a 0 °C bajo nitrógeno se le añadió (2S)-isopropil 2-((cloro(fenoxi)fosforil)amino)propanoato (334 mg, 1,094 mmol) en THF (2,000 ml) gota a gota por medio de una jeringa. Se trató la mezcla en agitación con 1-metil-1H-imidazol (0,145 ml, 1,823 mmol) gota a gota por medio de una jeringa durante 5 min. Se permitió que la mezcla alcanzara lentamente t.a. y se agitó durante la noche. Tras 20 h de agitación, se concentró la mezcla mediante evaporación rotatoria y se recogió en 2 ml de EtOH. Una columna rápida en Isco (columna de 12 g, 0 a 3 % de EtOH en EtOAc) eliminó la mayoría de las impurezas de la línea base para dar 220 mg del compuesto. Una segunda columna en Isco (columna de 12 g, 0 a 3 % de EtOH en EtOAc) eliminó las impurezas menos polares, pero las más polares permanecieron con el producto. Se recuperaron 170 mg en total. Una tercera columna en Isco (columna de 12 g, 0 a 10 % de MeOH en DCM) proporcionó una buena separación y dio lugar al producto deseado (93 mg, 0,171 mmol, rendimiento del 46,9 %).
Ejemplo 96. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis del diastereómero (S,Sp) del compuesto 275:
Figure imgf000080_0001
A un matraz seco de 50 ml se le añadió 1-((2R,3R,4R,5R)-3,4-dihidroxi-5-(hidroximetil)-3-metiltetrahidrofuran-2-il)-2-tioxo-2,3-dihidropirimidin-4(1H)-ona (0,5 g, 1,823 mmol) y THF (20 ml) y se enfrió la suspensión en un baño de hielo bajo nitrógeno. Se añadió cloruro de terc-butilmagnesio (2,260 ml, 2,260 mmol) por medio de una jeringa y se formó una solución transparente. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos y se enfrió nuevamente a 0 °C. Se añadió una solución del compuesto 254 en THF (20 ml) por medio de una jeringa durante un período de 10 min a 0 °C. Se agitó la solución de color amarillento resultante a temperatura ambiente durante la noche.
Se desactivó la reacción con solución saturada de cloruro de amonio y se extrajo con acetato de etilo. Se lavó la capa orgánica con solución de K2CO3 al 5 %, agua y salmuera, se secó y se concentró bajo presión reducida para dar el producto bruto. CCF en MeOH al 5 %/Dc M: Rf de material de partida = 0,25 y Rf producto = 0,5. Se purificó el producto en 20 g de SiO2 y eluyendo con 500 ml de 3 % de MeOH en DCM. Se combinaron las fracciones deseadas y se concentraron para dar un producto como un punto único por CCF. Se cristalizó una pequeña cantidad en placas mediante disolución en tolueno y dejando reposar a t.a. durante algunas semanas. RMN de 1H (400 MHz, metanol-04) ó 7,76 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,38 (t, J = 7,9 Hz, 2H), 7,34-7,13 (m, 3H), 6,98 (s, 1H), 5,87 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,06-4,89 (m, 1H), 4,53 (ddd, J = 11,8, 5,8, 2,0 Hz, 1H), 4,39 (ddd, J = 11,9, 5,8, 3,3 Hz, 1H), 4,11 (dp, J = 7,9, 2,2 Hz, 1H), 3,92 (dq, J = 9,9, 7,0 Hz, 1H), 3,78 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 1,36 (dd, J = 7,2, 1,0 Hz, 3H), 1,24 (s, 3H), 1,23 (d, J = 1,5 Hz, 3H), 1,21 (d, J = 1,5 Hz, 3H).
EM C22H31N3O9PS [M+H+]; calculado: 544,1, hallado: 544,1.
Ejemplo 97. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis del diastereómero (S,Rp) del compuesto 275:
Figure imgf000081_0001
A un matraz seco de 50 ml se le añadió 1-((2R,3R,4R,5R)-3,4-dihidroxi-5-(hidroximetil)-3-metiltetrahidrofuran-2-il)-2-tioxo-2,3-dihidropirimidin-4(1H)-ona (0,5 g, 1,823 mmol) y THF (20 ml) y se enfrió la suspensión en un baño de hielo bajo nitrógeno. Se añadió cloruro de terc-butilmagnesio (2,260 ml, 2,260 mmol) por medio de una jeringa y se formó una solución transparente. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos y se enfrió nuevamente a 0 °C. Se añadió una solución del compuesto 255 en THF (20 ml) por medio de una jeringa durante un período de 10 min a 0 °C. Se agitó la solución de color amarillento resultante a temperatura ambiente durante la noche.
Se desactivó la reacción con solución saturada de cloruro de amonio y se extrajo con acetato de etilo. Se lavó la capa orgánica con solución de K2CO3 al 5 %, agua y salmuera, se secó y se concentró bajo presión reducida para dar el producto bruto. CCF en MeOH al 5 %/Dc M: Rf de material de partida = 0,25 y Rf producto = 0,5. Se purificó el producto en 20 g de SiO2 y eluyendo con 500 ml de 3 % de MeOH en DCM. Se combinaron las fracciones deseadas y se concentraron para dar un producto como un punto único por CCF.
RMN de 1H (400 MHz, metanol-04) ó 7,78 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,38 (t, J = 7,9 Hz, 2H), 7,31-7,14 (m, 3H), 6,98 (s, 1H), 5,91 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,99 (mz, 1H), 4,60 (ddd, J = 11,9, 4,8, 2,1 Hz, 1H), 4,43 (ddd, J = 11,8, 5,3, 2,6 Hz, 1H), 4,18-3,98 (m, 1H), 3,90 (dq, J = 9,3, 7,2 Hz, 1H), 3,78 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 1,32 (dd, J = 7,1, 1,3 Hz, 3H), 1,23 (m, 8H).
EM C22H31N3O9PS [M+H+]; calculado: 544,1, hallado: 544,1.
Ejemplo 98.
Procedimiento general para la preparación de 5'-trifosfatos:
Se secó el análogo de nucleósido a alto vacío a 50 °C durante 18 h y, a continuación, se disolvió en trimetilfosfato anhidro (0,3 M). Después de la adición de proton-sponge® (1,5 equiv. molares), se enfrió la mezcla a 0 °C y se trató gota a gota con cloruro de fosforilo (1,3 equiv. molares) por medio de una microjeringa durante un período de 15 min. Se mantuvo la mezcla en agitación a 0 °C durante 4 a 6 h mientras se monitorizaba por CCF (isopropanol:NH4OH conc.:agua 7:2:1). Cuando la conversión al monofosfato fue mayor del 85 %, se trató la mezcla de reacción con una mezcla de bis(pirofosfato de tri-n-butilamonio) (3 equiv. molares) y tributilamina (6 equiv. molares) en DMF anhidra (1 ml). Después de 20 min a 0 °C con monitorización por CCF (NH4OH:isopropanol:agua 11:7:2), se trató la mezcla con 20 ml de una solución 100 mM de bicarbonato de trietilamonio (TEAB), se agitó durante 1 h a t.a. y, a continuación, se extrajo con éter (3 x 15 ml). A continuación, se purificó la fase acuosa mediante cromatografía de intercambio aniónico sobre resina DEAE Sephadex® A-25 (11 x 200 mm) utilizando un gradiente de tampón de 50 mM (400 ml) a 600 mM (400 ml) de TEAB. Se analizaron fracciones de 10 ml por CCF (NH4OH:isopropanol:agua 11:7:2). Se combinaron las fracciones que contenían trifosfato (eluido a TEAB 500 mM) y se concentraron mediante evaporador rotatorio (baño <25 °C). Se reconstituyó el sólido resultante en agua desionizada (10 ml) y se concentró por liofilización.
Ejemplo 99.
Figure imgf000081_0002
Se preparó el trifosfato de acuerdo con el procedimiento general.
Datos físicos: RMN de 1H (400 Hz, D2O): ó 1,226 (s, 3H), 1,280 (t, 36H, J = 7,2 Hz), 3,202 (q, 24H, J = 7,2 Hz), 4,143 (m, 2H), 4,363 (dq, 2H, J i = 12,8 Hz, J 2 = 1,2 Hz), 6,006 (s, 1H), 6,666 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 7,889 (d, 1H, J = 7,2 Hz); EM (ion negativo): m/z 512,9 (M-H).
Ejemplo 100.
Figure imgf000082_0001
Se preparó el trifosfato de acuerdo con el procedimiento general.
Datos físicos: RMN de 1H (400 Hz, D2O): ó 1,402 (d, 3H, J = 23,2 Hz), 1,262 (t, 36H, J = 7,2 Hz), 3,186 (q, 24H, J = 7,2 Hz), 4,314 (m, 4H), 6,212 (d, 1H, J = 18,8 Hz), 6,650 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 7,770 (d, 1H, J = 7,6 Hz); EM (ion negativo): m/z 514,9 (M-H).
Ejemplo 101.
Figure imgf000082_0002
Siguiendo el procedimiento general para la preparación de trifosfatos, se obtuvo ((2R,3S,4R,5R)-3-hidroxi-4-metil-5-(2-oxo-4-tioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)tetrahidrofuran-2-il)metiltetrahidrógeno trifosfato (4 mg, 3,5 %) como un sólido amarillo como sal de tetratrietilamonio.
RMN de 1H (400 MHz, D2O) ó 7,84 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 6,66 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 6,29 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,33 (s an., 2H), 4,13 (t, J = 8,8, 1H), 4,00 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 3,21 (q, J = 6,8 Hz, 24H), 2,72-2,64 (m, 1H), 1,27 (t, J = 7,2 Hz, 36H).
Ejemplo 102.
Figure imgf000082_0003
Siguiendo el procedimiento general para la preparación de trifosfatos, se obtuvo ((2R,3S,4R,5R)-3-hidroxi-4-metil-5-(4-oxo-2-tioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)tetrahidrofuran-2-il)metiltetrahidrogeno trifosfato (69 mg, 44 %) como un sólido blanco como una sal triple de trietilamina.
RMN de 1H (400 MHz, D2O) 68,07 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,14 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,24 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 4,35 (s an., 2H), 4,20 (t, J = 8,4 Hz, 1H), 4,03-4,01 (m, 1H), 3,21 (q, J = 7,6 Hz, 18H), 2,80-2,73 (m, 1H), 1,28 (t, J = 7,6 Hz, 27H), 1,00 (d, J = 7,2 Hz, 3H).
RMN de 31P (121 MHz, D2O) 6 -6,03 (d, J = 21,1 Hz, yP), -10,52 (d, J = 20,2 Hz, aP), -21,76 (t, J = 20,7 Hz, pP). EMAR C10H16N2O13P3S [M-H+]; calculado: 496,9664; hallado, 496,9586.
Ejemplo 103.
Procedimiento para la síntesis de 2'-C-metil-2-tiouridina-5'-trifosfato
Figure imgf000083_0001
293
Después de secar a alto vacío a 50 °C durante 18 h, se disolvió 2'-C-metil-2-tiouridina (29 mg, 0,106 mmol) en trimetilfosfato anhidro (0,4 ml) y se trató con proton-sponge® (34 mg, 0,159 mmol). Se enfrió la mezcla a 0 °C y se trató gota a gota con cloruro de fosforilo (13 pl, 0,137 mmol, 1,3 equiv) por medio de una microjeringa durante un período de 5 min. Después de 2 h a 0 °C, la CCF (isopropanol:NH4OH conc.:agua 7:2:1) mostró principalmente material de partida, lo que indica que el nucleósido original reaccionaba lentamente en condiciones estándar. A continuación, se trató la mezcla gradualmente (10 pl/h) con cloruro de fosforilo adicional (40 pl, 0,137 mmol, 4 equiv.) y, después de 5 h, de CCF indicó una conversión completa al intermedio de dicloridato de monofosforilo. Mientras la mezcla de reacción aún estaba a 0 °C, se trató gota a gota con una solución que contenía bis(pirofosfato de tri-n-butilamonio) (145 mg, 0,264 mmol) y tributilamina (153 pl, 0,634 mmol) en DMF anhidra (1 ml). Después de 20 min a 0 °C, se desactivó la mezcla con 20 ml de una solución 100 mM de bicarbonato de trietilamonio (TEAB), se agitó durante 1 h permitiendo que alcanzara t.a. y, a continuación, se extrajo con éter (3 x 15 ml). Se purificó la fase acuosa mediante cromatografía de intercambio aniónico sobre resina DEAE Sephadex® A-25 (11 x 200 mm) utilizando un gradiente de tampón de 50 mM (400 ml) a 600 mM (400 ml) de TEAB. Se analizaron fracciones de 8 ml primero por CCF (NH4OH:isopropanol:agua 11:7:2) y, a continuación, se analizaron adicionalmente las fracciones que contenían trifosfato por RMN de fósforo para asegurar que el producto estuviera libre de fosfato inorgánico (la mezcla del producto contenía alta concentración de fosfato inorgánico debido al exceso de cloruro de fosforilo necesario para iniciar la fosforilación de este análogo de nucleósido no reactivo). Se combinaron las fracciones que contenían trifosfato puro (eluido a TEAB 500 mM) y se concentraron mediante evaporador rotatorio (baño <25 °C). Se reconstituyó el sólido resultante en agua desionizada (10 ml) y se concentró por liofilización para dar 2'-C-metil-2'-tiouridina-5'-trifosfato (25 mg, 33 %) como una sal de bis(trietilamonio).
RMN de 1H (400 MHz, óxido de deuterio) 68,01 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,08 (s, 2H), 6,20 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 4,36 (m, 2H), 4,14 (m, 2H), 3,19 (q, J = 7,3 Hz, 12H), 1,27 (t, J = 7,3 Hz, 20H).
RMN de 31P (162 MHz, óxido de deuterio) 6 -8,81 (d, J = 20,6 Hz), -13,70 (d, J = 19,9 Hz), -24,82 (t, J = 20,6 Hz). EMAR C10H17N2O14P3S [M-H+]; calculado: 512,95287, hallado: 512,95406.
Ejemplo 104. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de nucleótido alaninil fosfato
Figure imgf000084_0001
Reactivos y condiciones: a) Et3N, H2O, 37 °C
Ejemplo 105. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000084_0002
Se suspendió el nucleótido original 5'-fosforamidato (0,1 mmol) en trietilamina (5 ml) y agua destilada (5 ml) en un matraz de fondo redondo a temperatura ambiente. Se agitó la mezcla de reacción a 37 °C durante 24 horas y, a continuación, se eliminaron los disolventes bajo presión reducida. Se purificó el residuo bruto sobre sílice eluyendo con 2-propanol:agua:amoníaco (8:1:1). Se agruparon las fracciones que contenían el producto deseado y se concentraron bajo presión reducida para eliminar la mayoría de los volátiles. Se transfirió la solución acuosa restante a un vial y, a continuación, se congeló en un baño de hielo seco/acetona. A continuación, el material se liofilizó para proporcionar el producto deseado como un sólido blanco.
Ejemplo 106. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de (R)-2,2,2-trifluoro-N-(1-hidroxioctadecan-2-il)acetamida
Figure imgf000084_0003
Figure imgf000085_0001
n h 2 o h rt
305 c f 3
3 131
Se disolvió fitoesfingosina (15,75 mmol) en EtOH (0,5 M) y se añadió gota a gota trifluoroacetato de etilo (15,75 mmol). A continuación, se añadió NEt3 (24,41 mmol) y se agitó la mezcla de reacción durante la noche. Se eliminó el disolvente a vacío y se recogió el residuo en EtOAc y salmuera, se lavó, se secó y se concentró. El material bruto que era un polvo blanco era lo suficientemente bueno para su uso en la siguiente etapa sin purificación adicional. Caracterización conforme con la literatura: Synthesis, 2011, 867.
Ejemplo 107. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000085_0003
131
Se disolvieron el alcohol primario (15,75 mmol), DMAP (1,575 mmol) y NEt3 (39,4 mmol) en una mezcla de CH2Cl2 y DMF (0,18 M) y se enfrió a 0 °C. Se añadió gota a gota TBDPSCl (19,69 mmol); a continuación, se permitió que la solución alcanzara temperatura ambiente y se agitó durante la noche.
Se añadió solución de NH4Cl para desactivar la reacción. Se extrajo la mezcla de reacción con EtOAc y se lavaron las capas orgánicas combinadas con agua (x2) para eliminar la DMF. A continuación, se secó y se concentró. Se corrió una columna para purificar la mezcla en 10-20 % de EtOAc en hexanos. Caracterización conforme con la literatura: Synthesis, 2011, 867.
Ejemplo 108. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000085_0002
Se disolvieron el diol (12,58 mmol), trifenilfosfina (50,3 mmol) e imidazol (50,03 mmol) en tolueno y se calentaron a reflujo. A continuación, se añadió lentamente yodo (37,7 mmol) y la mezcla de reacción se mantuvo en agitación a reflujo. Después de tres horas, se enfrió a temperatura ambiente y se añadió 1 equivalente de yodo (12,58 mmol) seguido de 8 equivalentes de NaOH 1,5 M (100,64 mmol). Se agitó la mezcla de reacción hasta que se disolvieron todos los sólidos. Se eliminó la capa acuosa en un embudo de decantación y se lavó la capa orgánica con una solución de Na2S2O3 , seguido de una solución de NaHCO3 y de salmuera. Se secó y se concentró. Se corrió una columna en 0-20 % de EtOAcen hexanos para purificar la mezcla y se obtuvo una mezcla de cis y trans, que se utilizó en la siguiente etapa.
ó RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) ó 7,64 (ddt, J = 7,8, 3,8, 1,7 Hz, 4H), 7,51-7,35 (m, 6H), 6,68 (dd, J = 16,0, 8,2 Hz, 1H), 5,6-5,40 (m, 2H), 4,57-4,46 (m, 1H), 3,84-3,62 (m, 2H), 2,04 (q, J = 7,0 Hz, 1H), 1,28-1,21 (m, 24H), 1,15-0,98 (m, 9H), 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H).
EMAR: 617,38759.
Ejemplo 109. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000086_0001
Se disolvió el alqueno (2,91 mmol) en MeOH (0,1 M) y se añadió Pd(OH)2/C (0,146 mmol). Se usó un hidrogenador Parr a 40 psi. Se filtró con cuidado el catalizador de paladio a través de Celite y se enjuagó con EtOAc. Se usó el material bruto en la siguiente etapa y proporcionó un rendimiento cuantitativo.
Ejemplo 110. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000086_0002
CF
3 307 60%
Se disolvió el silil éter en THF y se enfrió a 0 °C; a continuación, se añadió TBAF gota a gota. Después de agitar durante 1 hora, se permitió que alcanzara temperatura ambiente. Después de dos horas, se añadió una solución de NH4Cl y se extrajo con EtOAc, se lavó con salmuera y se secó y se concentró. Se corrió una columna en 10­ 50 % EtOAc/Hex.
RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) ó 7,60 (tt, J = 7,0, 1,5 Hz, 2H), 7,48-7,33 (m, 4H), 3,733,61 (m, 1H), 1,24 (d, J = 3,5 Hz, 18H), 1,05 (s, 6H), 0,86 (t, J = 6,8 Hz, 3H). EMAR: 381,28546.
Ejemplo 111. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de conjugados de 2-amino-octadecil-FTC-5'-monofosfato
Figure imgf000086_0003
Etapa 1: Se disolvió el alcohol (0,604 mmol) en piridina (0,1 M) y se enfrió a 0 °C; a continuación, se añadió CBr4 (0,755 mmol) seguido de la adición gota a gota de P(OMe)3 (0,845 mmol) durante una hora. Tras completar la adición, se agitó la mezcla a 0 °C durante una hora; a continuación, se permitió que alcanzara temperatura ambiente. Para desactivar la reacción, se añadió agua y se eliminó el disolvente a vacío. Se disolvió el residuo en EtOAc y se lavó con HCl al 3 % (x2), seguido de una solución de NaHCO3 y de salmuera. Se produjo una mala emulsión especialmente después del lavado con solución de NaHCO3. A continuación, se secó y se concentró. El material bruto se llevó a la siguiente etapa, aunque se podría haber corrido una columna dado que una parte de material de partida estaba presente al no haberse completado la reacción. La formación de fosfato se confirmó por RMN de 31P y RMN de 1H.
RMN de 1H (300 MHz, cloroformo-d) 67,55 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,10 (dq, J = 7,1, 4,4 Hz, 3H), 3,76 (dd, J = 11,2, 4,7 Hz, 6H)), 1,67-1,56 (m, 2H), 1,23-1,18 (m, 28H), 0,91-0,76 (m, 3H).
EMAR: 489,28309.
Etapa 2: Se disolvió el fosfato de dimetilo (0,291 mmol) en CH2Cl2 seco (0,1 M) y se enfrió a 0 °C con un baño de hielo y, a continuación, se trató gota a gota por medio de una bomba de jeringa con TMSBr (1,454 mmol) durante un período de 30 min. Se permitió que la mezcla alcanzara temperatura ambiente durante una hora. Se concentró hasta sequedad después de 4 horas y, a continuación, se coevaporó con CH2Cl2 (3 x 50 ml). Se enfrió el residuo bruto en un baño de hielo y se trató con una mezcla enfriada con hielo de aprox. 1 % de NH4OH acuoso en THF. Se agitó la mezcla a 4 °C durante 10 min y, a continuación, se concentró hasta sequedad. El material bruto se analizó mediante RMN de 1H y RMN de 31P y, a continuación, se trituró con metanol/ACN y se filtró. Se lavó el sólido blanquecino recogido con acetonitrilo seco.
Figure imgf000087_0001
pyr, 50°C
38-47%
Se disolvieron FTC (0,155 mmol) y el fosfato (0,155 mmol) en piridina (0,05 M) y se añadió cloruro de trisilo. Se agitó a 50 °C durante la noche. Se eliminó el disolvente a vacío y se purificó el material bruto mediante una columna usando 5 % a 50 % MeOH/NH4OH/CHCl3.
RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) 68,15-8,08 (m, 1H), 6,27-6,19 (m, 1H), 5,37 (t, J = 4,0 Hz, 1H), 4,19-4,10 (m, 1H)), 4,07 (td, J = 7,7, 5,5, 3,1 Hz, 1H), 3,96-3,83 (m, 2H), 3,29 (s, 1H), 1,58-1,50 (m, 1H), 1,26-1,18 (m, 28H), 0,92-0,83 (m, 3H).
EMAR: 690,28392.
Ejemplo 112. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000087_0002
Se disolvió el fosfato en MeOH (0,05 M) y NH4OH en un tubo de presión y se agitó a 40 °C durante la noche. Esta reacción fue muy difícil y, en más de una ocasión, la reacción no se había completado después de 24 horas. En esos casos, se dejó reaccionar durante otras 24 horas.
RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) 68,10 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 6,24 (q, J = 5,4 Hz, 1H), 5,49-5,42 (m, 1H), 5,38 (dt, J = 9,2, 4,1 Hz, 1H), 4,26-4,10 (m, 2H), 4,07 (q, J = 5,0, 4,6 Hz, 1H), 3,95-3,82 (m, 1H), 3,48 (dt, J = 9,5, 4,6 Hz, 1H), 3,32 (d, J = 3,6 Hz, 2H), 3,17 (ddd, J = 12,3, 7,7, 4,3 Hz, 1H), 1,61 (dt, J = 13,0, 7,2 Hz, 2H), 1,25 (d, J = 9,1 Hz, 28H), 0,87 (t, J = 5,7, 4,8 Hz, 3H).
EMAR: 594,30162.
Ejemplo 113. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de conjugados de 2-amino-octadecil-tenofovir-5'-monofosfato
Figure imgf000088_0001
312 CF3
Se disolvieron tenofovir (0,149 mmol) y el alcohol (0,149 mmol) en piridina (0,05 M) y se añadió cloruro de trisilo (0,448 mmol). Se agitó a 50 °C durante la noche. Se eliminó el disolvente a vacío y se purificó el material bruto mediante una columna usando 5 % a 50 % de MeOH/NhUOH/CHCb.
RMN de 1H (400 MHz, metanol^) 58,3 (s, 1H), 8,2 (s, 1H), 4,4-3,2 (m, 8H), 1,6 (m, 2H), 1,4-1,1 (m, 31H)), 0,9 (t, 3H). EMAR: 650,35324.
Ejemplo 114. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000088_0002
CF3 312
Se disolvió el fosfato en MeOH (0,05 M) y NH4OH en un tubo de presión y se agitó a 40 °C durante la noche. Esta reacción fue muy difícil y, en más de una ocasión, la reacción no se había completado después de 24 horas. En esos casos, se dejó reaccionar durante otras 24 horas.
RMN de 1H (300 MHz, metanol^) 58,31 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 8,21 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 4,5-3,2 (m, 10H), 1,63-1,52 (m, 2H), 1,4-1,0 (m, 31H), 0,87 (t, J = 6,3 Hz, 3H).
EMAR: 554,37094.
Ejemplo 115. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de conjugados de 2'-fluoro-2'-metiluridina-5'-HDP-monofosfato
Figure imgf000089_0001
319
El compuesto 314 se preparó siguiendo el procedimiento de la literatura (Bioorganic & Medicinal Chemistry 20 (2012) 3658-3665).
Compuesto 315: A una solución de 1H-tetrazol (0,415 g, 5,92 mmol) en 25 ml de éter y 10 ml de acetonitrilo se le añadió diisopropilamina (0,93 ml, 0,726 g, 7,03 mmol). Se filtró el precipitado, se lavó con éter y se secó a vacío para dar tetrazolida de diisopropilamonio.
Compuesto 316: Se coevaporaron 3-(hexadeciloxi)propan-1-ol (0,301 g, 1,00 mmol) y tetrazolida de diisopropilamonio (0,115 g, 0,67 mmol) con una mezcla DCM-AcCN (10:10) 3 veces. Se disolvió la mezcla seca en 7 ml de DCM y se añadió 3-((bis(diisopropilamino)fosfino)oxi)propanonitrilo (0,673 ml, 2,120 mmol). Después de 1 hora de agitación a temperatura ambiente, se añadió 1 ml de metanol y se agitó durante 15 minutos. A continuación, se concentró la reacción a vacío; se diluyó con solución de TEA al 10 % en EtOAc (100 ml) y se lavó con solución de NaHCO3 al 10 % (2 x 50 ml) y agua (2 x 50 ml); se secó sobre MgSO4 anhidro; se filtró y se evaporó. Se purificó el producto bruto mediante cromatografía en columna utilizando Hexanos:EtOAc:TEA (10:4:0,5).
RMN de 1H: 3,89-3,54 (m, 6H); 3,49 (t, 2H, J = 6,4 Hz); 3,39 (t, 2H, J = 6,4 Hz); 2,63 (dt, 2H, J = 1,6, 6,4 Hz); 1,89-1,83 (m, 1H); 1,57-1,51 (m, 1H); 1,24 (s, 24H); 1,19-1,16 (m, 16H); 0,87 (t, 3H, J = 6,4 Hz).
Compuesto 317, 318, 319: Se secaron el amidofosfito (compuesto 3) (0,114 g, 0,228 mmol) y 1-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroxi-5-(hidroximetil)-3-metiltetrahidrofuran-2-il)pirimidin-2,4(1H,3H)-diona (0,065 g, 0,248 mmol) por coevaporación con DCM anhidro (4 x 10 ml), se disolvieron en 4 ml de DCM y se añadió una solución de 1H-tetrazol al 3 % en acetonitrilo (0,75 ml, 0,320 mmol). Después de 1 hora de agitación a temperatura ambiente, se añadió una solución 5,5 M de peróxido de terc-butilo (0,25 ml, 1,359 mmol). Después de 40 minutos, se evaporaron los disolventes y se disolvió la mezcla de reacción en tolueno y se añadió 1 ml de TEA. Se agitó durante 5 horas. Se evaporaron todos los disolventes y se coevaporaron con tolueno (2 x 2 ml). Se purificó el material bruto mediante cromatografía en columna comenzando con CHCl3 y se aumentó lentamente la polaridad con CHCl3:MeOH:NH4OH (75:25:5) para dar el compuesto 319.
RMN de 1H: (CDCl3-CD3OD, 3:1) 1,024 (t, 3H, 6,4 Hz); 1,35-1,49 (m, 27H); 1,55 (d, 2H, 6,0 Hz); 1,63-1,70 (m, 2H); 2,011-2,067 (m, 2H); 3,47-3,49 (m, 2H); 3,54 (q; 2H, J = 4,8 Hz); 3,65-3,70 (m, 2H); 4,07-4,20 (m, 3H); 4,23­ 4,42 (m, 2H); 5,99 (d, 1H, J = 8,4 Hz); 6,32 (dd, 1H, J = 19,2, 5,2 Hz); 8.125 (t, 1H, J = 8,0 Hz).
RMN de 31P: (CDCl3-CD3OD, 3:1) 17,95 ppm.
EMAR: 623,34722.
Ejemplo 116. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de 2'-desoxi-2'-beta-metil-2-tiouridina
Figure imgf000090_0001
320
Se secó el nucleósido (4,15 g, 15,13 mmol) por destilación azeotrópica del agua residual disolviéndolo en piridina y eliminando los volátiles mediante evaporación rotatoria (3 x 50 ml). Se disolvió el residuo en piridina (200 ml) con agitación bajo nitrógeno a 0 °C y se añadió 1,3-dicloro-1,1,3-3-tetraisopropildisiloxano (5,81 ml, 18,2 mmol) gota a gota por medio de una jeringa durante 5 min. Se permitió que la mezcla alcanzara t.a. y se agitó durante 16 h. A continuación, se concentró la mezcla mediante evaporación rotatoria y se recogió en CH2Cl2 (500 ml). Se lavó la solución con NaHCO3 ac. sat. (2 x 500 ml) y, a continuación, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró mediante evaporación rotatoria para dar 12 g de material bruto. La mezcla se recogió en CH2Cl2 y la cromatografía ultrarrápida en el Combiflash (columna de 120 g, gradiente del 5 al 30 % de EtOAc en hexanos) dio 320 (6,55 g, 84 %) como un sólido pulverulento blanco.
RMN de 1H (400 MHz, CDCla) ó 9,29 (s an., 1H), 7,81 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,87 (s an., 1H), 5,97 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,24 (d, J = 13,6 Hz, 1H), 4,10 (dd, J = 9,1 Hz, 2,6 Hz, 1H), 4,02 (dd, J = 13,6 Hz, 2,8 Hz, 1H), 3,99 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 1,33 (s, 3H), 1,14-1,05 (m, 28H).
Ejemplo 117. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000090_0002
A una solución en agitación de 320 (6,25 g, 12,09 mmol) y 4-DMAP (2,95 g, 24,19 mmol) en acetonitrilo (121 ml) a t.a. bajo nitrógeno se le añadió 2-cloro-2-oxoacetato de metilo (1,67 ml, 18,14 mmol) gota a gota por medio de una jeringa. Se agitó la mezcla a t.a. durante 2 h y, a continuación, se diluyó con EtOAc (600 ml). Se lavó esta solución orgánica secuencialmente con NaHCO3 ac. sat., agua y salmuera (1 x 120 ml cada una), se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró mediante evaporación rotatoria. Se secó el bruto resultante a alto vacío durante la noche para dar 321 (7,60 g) como un sólido amarillo pálido. La totalidad de esta mezcla de producto bruto se llevó a la siguiente etapa sin purificación adicional.
RMN de 1H (400 MHz, CDCla) ó 7,82 (1H, d, J = 8,2 Hz), 7,12 (s, 1H), 5,99 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,25-4,18 (m, 2H), 4,10 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 4,02 (dd, J = 13,7 Hz, 2,8 Hz, 1H), 3,91 (s, 3H), 1,86 (s, 3H), 1,15-0,90 (m, 28H).
Ejemplo 118. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000091_0001
A una solución en agitación de 321 bruto (7,60 g) e hidruro de tributilestaño (4,89 ml, 18,14 mmol) en tolueno (216 ml) a reflujo bajo nitrógeno se le añadió AIBN sólido (0,397 g, 2,42 mmol) de una sola vez. Se calentó la mezcla a reflujo durante 2 h y, a continuación, se enfrió a t.a. Se eliminaron los volátiles mediante evaporación rotatoria y se recogió el residuo bruto en una pequeña cantidad de PhMe. La cromatografía ultrarrápida en el Combiflash (columna de 120 g, gradiente del 1 al 30 % de EtOAc en hexanos) dio 322 (5,30 g, rendimiento de ~79 %) como un sólido blanco de ~90 % de pureza (residuos de tributilestannano restantes). El análisis por RMN mostró una proporción 10:1 de diastereómeros p:a en la posición C2 '. La totalidad de este producto prácticamente puro se llevó inmediatamente a la siguiente etapa sin purificación adicional. RMN de 1H del isómero mayoritario (400 MHz, CDCla) ó 9,37 (s an., 1H), 7,87 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,01 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 5,96 (dd, J = 8,0 Hz, 2,1 Hz, 1H), 4,17 (d, J = 13,2 Hz, 1H), 4,03 (dd, J = 13,5 Hz, 2,8 Hz, 1H), 3,98 (t, J = 9,6 Hz, 1H), 3,78 (ddd, J = 8,8 Hz, 2,8 Hz, 1,0 Hz), 2,74 (m, 1H), 1,15-0,95 (m, 31H). También se observaron señales para el isómero minoritario en RMN de 1H (400 MHz, CDCla) ó 8,08 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,38 (dd, J = 9,1 Hz, 7,5 Hz, 1H), 4,24 (d, J = 12,9 Hz, 1H), 2,53 (m, 1H).
Ejemplo 119. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000091_0002
323
A una solución en agitación de 322 (5,30 g, 10,58 mmol) en THF (106 ml) bajo nitrógeno a 0 °C se le añadió una solución de TBAF (1,0 M en THF, 21,17 ml) gota a gota por medio de una jeringa. Se llevó la mezcla a t.a. y se agitó durante 2 h. Se eliminaron los volátiles mediante evaporación rotatoria para dar un aceite bruto amarillo. Se recogió el material en EtOAc y la cromatografía ultrarrápida en el Combiflash (columna de 330 g, gradiente del 0 al 5 % de MeOH en DCM) dio 2,8 g del material mayormente purificado como un sólido blanco. Se disolvió este material en metanol y se inmovilizó en Celite; a continuación, se cargó en la parte superior de una columna de sílice/KF al 10 % p/p. La cromatografía ultrarrápida (10 % de MeOH en EtOAc) dio 323 (1,96 g, rendimiento del 63 % en 3 etapas) como un sólido blanco. El análisis por RMN de 1H mostró una proporción 13:1 de diastereómeros p:a en la posición C2 ' (integración del doblete del metilo).
RMN de 1H del isómero mayoritario (400 MHz, MeOH-d4) ó 8,18 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,04 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 5,95 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 3,93 (dd, J = 12,2 Hz, 2,1 Hz, 1H), 3,89 (t, J = 8,2 Hz, 1H), 2,64 (m, 1H), 0,99 (d, 7,1 Hz, 3H). ES+APCI (70 eV) m/z: [M+HCO2]" 302,9.
Ejemplo 120. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de 2'-desoxi-2'-fluoro-2-tiouridina
Figure imgf000092_0001
324
Se secó la 2'-desoxi-2'-fluorouridina (4,92 g, 20,0 mmol) por destilación azeotrópica del agua residual disolviéndolo en piridina y eliminando los volátiles mediante evaporación rotatoria (3 x 50 ml). Se disolvió el residuo en piridina (100 ml) con agitación bajo nitrógeno a 0 °C y se añadió 1,3-dicloro-1,1,3-3-tetraisopropildisiloxano (7,68 ml, 24,0 mmol) gota a gota por medio de una jeringa durante 5 min. Se permitió que la mezcla alcanzara t.a. y se agitó durante 16 h. A continuación, se concentró la mezcla mediante evaporación rotatoria y se recogió en CH2Cl2 (500 ml). Se lavó la solución con NaHCO3 ac. sat. (2 x 500 ml) y, a continuación, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró mediante evaporación rotatoria para dar 324 (9,09 g, rendimiento del 93 %) como un sólido blanco de >95 % de pureza en el análisis por RMN.
RMN de 1H (400 MHz, CDCla) 88,07 (s an., 1H), 7,81 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,90 (d, J = 16,2 Hz, 1H), 5,71 (dd, J = 8,2 Hz, 2,3 Hz, 1H), 4,90 (dd, J = 53,2 Hz, 3,4 Hz, 1H), 4,30 (ddd, J = 28,2 Hz, 9,6 Hz, 3,6 Hz, 1H), 4,29 (d, J = 14,3 Hz, 1H), 4,16 (d, J = 10,6 Hz, 1H), 4,02 (dd, J = 13,6 Hz, 2,5 Hz, 1H), 1,15-1,00 (m, 28H).
Ejemplo 121. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000092_0002
A una mezcla bifásica en agitación enérgica de 324 (4,89 g, 10,0 mmol) en CH2Cl2 (200 ml) y Na2CO30,2 M (400 ml) a t.a. se le añadió n-Bu4Br sólido (1,29 g, 4,00 mmol) seguido de cloruro de 2,4,6-triisopropilbenceno-1-sulfonilo (3,94 g, 13,0 mmol). Se agitó la mezcla enérgicamente durante 20 h a t.a., después de lo cual se eliminó la capa orgánica y se extrajo la capa acuosa con CH2O 2 (2 x 250 ml). Se secaron las capas orgánicas combinadas sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron mediante evaporación rotatoria, seguido de la eliminación azeotrópica del agua por coevaporación con PhMe (100 ml) para dar 325 bruto como un aceite amarillo, que también contenía residuos de los reactivos en exceso. La totalidad del bruto se llevó a la siguiente etapa sin purificación adicional.
RMN de 1H (400 MHz, CDCb) ó 8,28 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 7,23 (s, 2H), 6,04 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 5,86 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 4,92 (dd, J = 52,4 Hz, 2,9 Hz, 1H), 4,30-4,05 (m, 5H), 3,99 (dd, J = 13,7 Hz, 2,3 Hz, 1H), 3,0-2,85 (m, 1H), 1,35-1,25 (m, 18H), 1,15-1,00 (m, 28H).
Ejemplo 122. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000093_0001
326
A una solución en agitación de 325 bruto en MeCN (100 ml) bajo nitrógeno a t.a. se le añadió gota a gota una solución de 2,6-dimetilfenol (1,22 g, 10,0 mmol), trietilamina (4,18 ml, 30,0 mmol) y DABCO (0,112 g, 1,00 mmol) en MeCN durante 30 min. La mezcla se volvió inmediatamente de color rojo intenso al comienzo de la adición y se agitó durante 90 minutos adicionales después de que se completara la adición. Se concentró la mezcla de reacción mediante evaporación rotatoria y se volvió a disolver el residuo en CHCl3 (300 ml). Se lavó la solución secuencialmente con NaHCO3 ac. sat. (1 x 300 ml) y salmuera (2 x 300 ml), se secó sobre Na2SO4 , se filtró y se concentró mediante evaporación rotatoria para dar aceite rojo bruto. La cromatografía ultrarrápida en el Combiflash (columna de 330 g, gradiente del 5 al 20 % de EtOAc en hexanos) dio 326 (5,02 g, rendimiento del 85 % en 2 etapas) como una espuma sólida blanquecina.
RMN de 1H (400 MHz, CDCb) ó 8,20 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 7,06 (s, 3H), 6,08 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 5,94 (d, J = 15,9 Hz, 1H), 5,02 (dd, J = 52,1 Hz, 3,1 Hz, 1H), 4,31 (d, J = 13,8 Hz, 1H), 4,32-4,18 (m, 2H), 4,03 (dd, J = 13,6 Hz, 2,0 Hz, 1H), 2,13 (s, 6H), 1,15-0,97 (m, 28H).
Ejemplo 123. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000093_0002
326 327
A una solución de 326 (4,50 g, 7,59 mmol) en PhMe (76 ml) bajo nitrógeno con agitación se le añadió reactivo de Lawesson (4,61 g, 11,39 mmol) de una sola vez como un sólido. Se sometió a reflujo la mezcla con agitación bajo nitrógeno durante 2 h y, a continuación, se enfrió a t.a. Se filtró la mezcla a través de Celite y se enjuagó la almohadilla con PhMe (2 x 30 ml). Se concentraron los filtrados combinados mediante evaporación rotatoria, se recogió el residuo bruto en CH2Cl2 , y la cromatografía ultrarrápida en el CombiFlash (columna de 120 g, gradiente del 1 al 15 % de EtOAc en hexanos) dio 327 (2,80 g, rendimiento del 55 %) como un sólido amarillo esponjoso con una pureza aproximada del 90 % según lo determinado en el análisis por RMN de 1H.
RMN de 1H (400 MHz, CDCb) ó 8,46 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,08 (s, 3H), 6,57 (d, J = 14,6 Hz, 1H), 6,26 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 5,23 (dd, J = 51,3 Hz, 3,4 Hz, 1H), 4,35-4,25 (m, 2H), 4,16 (ddd, J = 29,4 Hz, 10,3 Hz, 3,9 Hz, 1H), 4,03 (dd, J = 13,8 Hz, 2,5 Hz, 1H), 2,14 (s, 6H), 1,15-0,95 (m, 28H).
Ejemplo 124. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000094_0001
327 328 329
A una solución en agitación de 327 (2,70 g, 4,43 mmol) en MeCN (44 ml) a t.a. bajo nitrógeno se le añadió una solución de 1,1,3,3-tetrametilguanidina (1,67 ml, 13,3 mmol) y (Z)-2-nitrobenzaldehído oxima (2,21 g, 13,3 mmol) en MeCN (44 ml) gota a gota por medio de una jeringa durante 5 min. Se agitó la mezcla durante 20 h; a continuación, se diluyó con CHCl3 (450 ml). Se lavó la solución con NaHCO3 ac. sat. (1 x 450 ml) y salmuera (1 x 450 ml), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró mediante evaporación rotatoria. La cromatografía ultrarrápida en el CombiFlash (columna de 40 g, gradiente del 1 al 25 % de EtOAc en hexanos) dio una mezcla inseparable de 328 y nitrobenzaldehído oxima (proporción molar ~5:3 por RMN) como un aceite amarillo. La totalidad de este producto se llevó a la siguiente etapa sin purificación adicional.
RMN de 1H (400 MHz, CDCla) ó 9,72 (s an., 1H), 8,02 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,47 (d, J = 14,6 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 5,03 (dd, J = 51,8 Hz, 3,4 Hz, 1H), 4,32 (d, J = 13,7 Hz, 1H), 4,24 (dt, J = 9,8 Hz, 1,8 Hz, 1H), 4,16 (ddd, J = 28,0 Hz, 9,7 Hz, 3,3 Hz, 1H), 4,02 (dd, J = 13,7 Hz, 2,3 Hz, 1H), 1,15-0,95 (m, 28H).
A una solución en agitación de 328 en THF (44 ml) a 0 °C bajo nitrógeno se le añadió una solución de TBAF (8,86 ml, 1,0 M en THF, 8,86 mmol) gota a gota por medio de una jeringa durante 5 min. Se permitió que la mezcla alcanzara t.a. y se agitó durante 1 h. Se concentró la mezcla mediante evaporación rotatoria, se recogió el residuo bruto en EtOAc y la cromatografía ultrarrápida en el CombiFlash (columna de 80 g, 10 % de MeOH en EtOAc) eliminó las impurezas más importantes para dar 1,8 g de producto impuro. Se redisolvió la mezcla en MeOH y se inmovilizó sobre Celite. Una segunda columna de cromatografía ultrarrápida en el Combiflash (80 g, gradiente del 1 al 10 % de MeOH en EtOAc) dio 329 (0,940 g, rendimiento del 81 % en 2 etapas) como un sólido blanco.
RMN de 1H (400 MHz, MeOH-d4) ó 8,36 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,68 (d, J = 15,6 Hz, 1H), 5,94 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,03 (dd, J = 52,0 Hz, 4,0 Hz, 1H), 4,24 (ddd, J = 24,2 Hz, 9,0 Hz, 4,1 Hz, 1H), 4,08 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 4,03 (d, J = 12,7 Hz, 1H), 3,81 (dd, J = 12,6 Hz, 2,2 Hz, 1H).
ES+APCI (70 eV) m/z: [M+H]+ 263,0.
Ejemplo 125. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de análogos de a-boranotrifosfato
Figure imgf000094_0002
Se secó el nucleósido elegido para la conversión durante la noche en un horno de vacío a 60 °C. Se suspendió el nucleósido seco en THF seco en un matraz seco bajo atmósfera de argón. A continuación, se trató la suspensión con 2-cloro-4H-1,2,3-benzodioxafosporin-4-ona y tributilamina. Después de que se consumiera el material de partida, se añadió una solución de pirofosfato de tributilamonio 0,5 M en DMF y tributilamina. A continuación, se añadió un complejo de dimetilsulfuro borano 2,0 M en THF. Se desactivó la mezcla de reacción con una mezcla trietilamina/agua (3:2). Se purificó el producto deseado en una columna DEAE eluyendo con solución de bicarbonato de trietilamonio.
Ejemplo 126. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de análogos de boranofosforamidato de aminoácidos de nucleótidos
Figure imgf000095_0001
Se suspendió clorhidrato de éster isopropílico de L-alanina (0,5 mmol) en DCM seco en un matraz seco bajo atmósfera de argón y se trató con DIPEA (1 mmol). Después de que se formara una solución transparente, se añadió 2-cloro-1,3,2-oxatiafosfolano 333 (0,55 mmol). Después de 30 minutos de agitación a temperatura ambiente, se añadió complejo borano-sulfuro de dimetilo (2,5 mmol). Se dejó la reacción en agitación durante 30 minutos adicionales. A continuación, se añadieron a la reacción el nucleósido (0,4 mmol) y DBU (1,5-5 equivalentes) en acetonitrilo seco. Se desactivó la reacción con trietilamina/agua (1:1 v/v) con agitación durante 15 minutos. A continuación, se redujeron los disolventes bajo presión reducida. A continuación, se coevaporó el residuo con etanol (3 x 15 ml). Se purificó el producto deseado sobre sílice eluyendo con metanol (3-15 %) en DCM que contenía un 0,5 % de trietilamina.
Ejemplo 127. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de análogos de ribonucleósidos 3'-fluoro-2'-sustituidos
Figure imgf000095_0002
Ejemplo 128. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000096_0001
Ejemplo 129. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de análogos de ribonucleósidos 3'-sustituidos
Figure imgf000096_0002
Ejemplo 130. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000096_0003
Ejemplo 131. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000096_0004
380
A 33,4 g de solución de etóxido de sodio (21 % en peso) en etanol se le añadieron gota a gota malonato de dietilo (15 g) y, a continuación, 1-bromohexadecano (31,5 g). Después de someter la reacción a reflujo durante 8 h, se evaporó el etanol a vacío. Se mezcló la suspensión restante con agua con hielo (200 ml) y se extrajo con éter dietílico (3 x 200 ml). Se secaron las capas orgánicas combinadas sobre MgSO4, se filtraron y se evaporó el filtrado a vacío para proporcionar un residuo de aceite viscoso. Se purificó este residuo mediante cromatografía en columna (sílice: 500 g) utilizando hexano/éter dietílico (12:1) como fase móvil para proporcionar el compuesto principal.
Ejemplo 132. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000097_0001
381
En un matraz de fondo redondo de 250 ml se puso hidruro de litio y aluminio (2,503 g, 66,0 mmol) en éter dietílico (90 ml) para dar una suspensión. A esta suspensión se le añadió gota a gota 2-hexadecilmalonato de dietilo (18,12 g, 47,1 mmol) y se sometió la reacción a reflujo durante 6 h. Se siguió la reacción por CCF usando PMA y H2SO4 como agentes desecantes. El exceso de hidruro de litio y aluminio se destruyó con 200 ml de agua con hielo. Se añadieron 150 ml de H2SO4 al 10 % para disolver el hidrato de aluminio. Se extrajo la mezcla de reacción con éter dietílico (100 ml x 3). Se filtró la capa orgánica que incluía el producto no disuelto. Se lavaron los sólidos recogidos con acetato de etilo. Se secó el filtrado sobre MgSO4, se filtró y se concentró bajo presión reducida. Se purificó el producto en una columna de sílice (100 g) eluyendo con hexano:EtOAc (3:1) a (1:1).
Ejemplo 133. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000097_0002
382
A una solución de 2-hexadecilpropano-1,3-diol (7,04 g, 23,43 mmol) en 100 ml de DCM se le añadió gota a gota tricloruro de fósforo (3,59 g, 23,43 mmol) disuelto en 20 ml de DCM, seguido de trietilamina (6,53 ml, 46,9 mmol). La reacción se sometió a reflujo durante una hora. El análisis por CCF mostró que el material de partida se consumió y se formaron dos nuevos puntos. Se concentró la mezcla hasta sequedad, se disolvió en éter dietílico seco y se filtró. El filtrado se concentró para proporcionar el producto bruto (8,85 g) que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Ejemplo 134. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de análogos de nucleósidos 5'-deuterados
Figure imgf000097_0003
Se suspendió el nucleósido en diclorometano (40 ml, parcialmente soluble). Después de agitar a t.a. durante 30 min, se trató la mezcla secuencialmente con PDC, anhídrido acético y, a continuación, terc-butanol. Se mantuvo la mezcla en agitación a temperatura ambiente. La CCF (5 % de metanol en DCM) y la CLEM indicaron la presencia de solo una pequeña cantidad de material de partida restante tras 4 horas. Se filtró la mezcla a través de una almohadilla de gel de sílice que se cargó en un embudo de vidrio poroso de 150 ml. Se eluyó la sílice con acetato de etilo. Se concentró el filtrado recogido bajo presión reducida. Se purificó el aceite bruto oscuro mediante cromatografía sobre gel de sílice (25 mm x 175 mm) con un gradiente de hexanos:acetato de etilo 2:1 a acetato de etilo. Se recogieron las fracciones puras y se concentraron para dar una goma blanca. Se colocó el material bajo alto vacío durante 2 días y se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Se disolvió el nucleósido protegido en 5' en etanol puro (al 100 %) y, a continuación, se trató con borodeuteruro de sodio sólido. La mezcla se volvió homogénea y, a continuación, se calentó a 80 °C. Después de 12 h, se formó un precipitado blanco/amarillo pálido. Se permitió que la mezcla alcanzara t.a. La CCF (5 % de metanol en diclorometano) indica la conversión completa del material de partida. Se enfrió la mezcla a 0 °C con un baño de hielo y, a continuación, se desactivó lentamente con ácido acético (aproximadamente 1 ml). Se permitió que la solución transparente alcanzara t.a. y, a continuación, se repartió entre acetato de etilo (30 ml) y salmuera (3 ml). Se concentró la fase orgánica y, a continuación, se purificó mediante cromatografía sobre gel de sílice (19 mm x 180 mm) usando una fase móvil de 5 % de metanol en diclorometano.
Ejemplo 135. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de análogos de nucleósidos l'-deuterados
Figure imgf000098_0001
Se añadió la lactona (0,0325 mol) a un matraz seco bajo atmósfera de argón y, a continuación, se disolvió en THF seco (250 ml). A continuación, se enfrió la solución a -78 °C y se añadió gota a gota una solución de DIBAL-D en tolueno (0,065 mol). Se mantuvo la reacción en agitación a -78 °C durante 3-4 horas. A continuación, se desactivó la reacción mediante la adición lenta de agua (3 ml). A continuación, se mantuvo la reacción en agitación mientras se permitía que alcanzara temperatura ambiente. A continuación, se diluyó la mezcla con dos volúmenes de éter dietílico y, a continuación, se vertió en un volumen igual de solución saturada de tartrato de sodio y potasio. Se separó la capa orgánica, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró bajo presión reducida. Se purificó el residuo sobre sílice eluyendo con hexanos/acetato de etilo.
Ejemplo 136. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de análogos de nucleósidos 4'-sustituidos
Figure imgf000098_0002
1-(4'-Azido-5'-0-(3-cloro)benzoil-2',3'-0-dibenzoil-(6-D-ribofuranosil)-4-tiouracilo (396): Se cargó un matraz piriforme bajo atmósfera de nitrógeno con 1-(4'-azido-5'-0-(3-cloro)benzoil-2',3'-0-dibenzoil-(6-D-ribofuranosil)uracilo (1,08 g, 1,709 mmol), reactivo de Lawesson (0,76 g, 1,88 mmol), THF (40 ml) y se colocó en un baño de aceite a 55 °C. La reacción, monitorizada por CCF, se completó después de ~4 h. A continuación, se concentró la mezcla mediante evaporación rotatoria para dar un aceite que se purificó mediante cromatografía en gel de sílice con 20 a 25 % de EtOAc en hexanos para proporcionar 1-(4'-azido-5'-0-(3-cloro)benzoil-2',3'-0-dibenzoil-^-D-ribofuranosil)-4-tiouracilo (1,04 g, 94 %) como un sólido amarillo. RMN de 1H (400 MHz, CDCb); 5 9,51 (s an., 1 H), 8,04-7,91 (m, 5H), 7,59-7,51 (m, 3H), 7,41-7,30 (m, 6H), 7,06 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 6,40 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 6,25 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 5,97 (dd, J = 2,4, 7,6 Hz, 1H), 5,86 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,82 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 4,77 (d, J = 12,0 Hz, 1H).
1-(4,-Azido-^-D-ribofuranosil)-4-tiouracilo (397): A una solución en agitación de 1-(4'-azido-5'-0-(3-cloro)benzoil-2',3'-0-dibenzoil-^-D-ribofuranosil)-4-tiouracilo (1,04 g, 1,605 mmol) en metanol (32 ml) a 0 °C se le añadió amoníaco metanólico (7 ml, 7 M en MeOH). Se permitió que la mezcla alcanzara temperatura ambiente y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se evaporó el disolvente bajo presión reducida y se purificó el residuo mediante cromatografía en columna en gel de sílice [eluyente: gradiente gradual de metanol (5-8 %) en diclorometano] para dar 1-(4'-azido-(6-D-ribofuranosil)-4-tiouracilo (410 mg, 85 %) como un sólido amarillo. RMN de 1H (400 MHz, CD3OD); 57,71 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,37 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,13 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,38 (t, J = 5,2 Hz, 1H), 4,30 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 3,67 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 3,58 (d, J = 12,0 Hz, 1H). RMN de 13C (100 MHz, CD3OD); 5192,4, 149,8, 136,6, 114,7, 100,8, 92,1, 74,6, 73,3, 64,9. EMAR (ESI) calculado para CgHuOsNsNaS [M+Na]+: 324,0373. Hallado: 324,0372.
Ejemplo 138. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000099_0001
Se cargó un matraz de fondo redondo con 2-tiouracilo (1,28 g, 10,0 mmol), (NH4)2SO4 (66 mg, 0,50 mmol) y bis(trimetilsilil)amina (21 ml, 100 mmol) bajo nitrógeno. Se calentó la mezcla a reflujo con agitación durante la noche (16 h) hasta que se formó una solución azul verdosa. Se enfrió la mezcla hasta temperatura ambiente y se eliminaron los volátiles mediante evaporación rotatoria seguida de alto vacío para dar el 2-tiouracilo persililado como un líquido azul claro. Se asumió un rendimiento cuantitativo y se usó este compuesto inmediatamente en la siguiente etapa.
Se añadió una solución de 398 (2,19 g, 5,00 mmol) en 1,2-dicloroetano (50 ml) al 240 recién preparado bajo nitrógeno y se enfrió la mezcla turbia resultante a 0 °C con agitación. Se añadió cloruro de estaño(IV) (1,17 ml, 10.0 mmol) a la mezcla en agitación por medio de una jeringa durante un minuto y se permitió que la mezcla alcanzara t.a. Después de agitar durante 20 h, se diluyó la mezcla con 75 ml de DCM y se añadieron con cuidado NaHCO3 sólido y Celite (2,0 g cada uno) a la mezcla de reacción en agitación enérgica. Se enfrió la mezcla a 0 °C y se añadió NaHCO3 ac. sat. (1,2 ml) gota a gota a la mezcla en agitación enérgica. Se permitió que la mezcla alcanzara temperatura ambiente y se agitó durante 2 h. Se filtró la mezcla a través de una almohadilla de Celite, que se enjuagó con DCM (30 ml). Se concentraron los filtrados combinados mediante evaporación rotatoria para proporcionar ~5 g de un aceite bruto naranja. Se recogió el bruto en DCM y la cromatografía ultrarrápida automatizada en un Combiflash (columna de 80 g, gradiente del 5 al 50 % de EtOAc en hexanos) proporcionó 399 (2,21 g, 83 %) como un sólido escamoso blanco con un 95 % de pureza. RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) 5 9,17 (s an., 1H), 7,96 (d, 1H), 7,40-7,30 (m, 8H), 7,14-7,06 (m, 2H), 6,75 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 5,45 (dd, J = 5,4 Hz, 2.0 Hz, 1H), 5,27 (dd, J = 8,3 Hz, 2,5 Hz, 1H), 4,76 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 4,50 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 4,33 (d, J = 10,6 Hz, 1H), 4,25-4,20 (m, 2H), 3,92 (d, J = 10,7 Hz, 1H), 3,61 (d, J = 10,7 Hz, 1H), 2,72 (s, 1H), 2,20 (s, 3H). ESI-EM: m /z 379,1 ([M-tiouridina]+).
Figure imgf000099_0002
A una solución en agitación de 399 (2,21 g, 4,36 mmol) en 1,4-dioxano (227 ml) y agua (38 ml) a temperatura ambiente se le añadió NaOH acuoso 1,0 M (38 ml, 38 mmol) de una sola vez. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 16 h y se neutralizó mediante la adición gota a gota de AcOH (2,17 ml, 38 mmol). Se agitó la mezcla a durante 30 min y, a continuación, se concentró mediante evaporación rotatoria. Se repartió el residuo entre EtOAc y agua (100 ml cada uno). Se retiró la capa orgánica y se extrajo la capa acuosa con EtOAc (1 x 100 ml). Se secaron las capas orgánicas combinadas sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron mediante evaporación rotatoria para dar 2,5 g del material bruto. Se recogió el bruto en DCM y la cromatografía ultrarrápida automatizada en un Combiflash (columna de 80 g, gradiente del 5 al 50 % de EtOAc en hexanos) proporcionó 400 (1,57 g, 77 %) como un sólido blanco. RMN de 1H (400 MHz, CDCla) ó 9,21 (s an., 1H), 7,91 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,45-7,30 (m, 8H), 7,20-7,15 (m, 2H), 6,72 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 5,37 (dd, J = 8,2 Hz, 2,3 Hz, 1H), 4,79 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 4,70 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 4,45 (d, J = 10,8 Hz, 1H), 4,41 (d, J = 10,8 Hz, 1H), 4,28 (td, J = 5,6 Hz, 2,6 Hz, 1H), 4,21 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 3,95 (d, J = 10,6 Hz, 1H)), 3,71 (d, J = 10,7 Hz, 1H), 3,08 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 2,77 (s, 1H). ESI-EM: m /z 465,1 ([M+H]+).
Figure imgf000100_0001
A una solución en agitación de 400 (1,57 g, 3,38 mmol) en DMF (68 ml) bajo nitrógeno a -78 °C se le añadió gota a gota por medio de una jeringa una solución 1,0 M de BCl3 en DCM (16,9 ml, 16,9 mmol). Se agitó la mezcla a -78 °C durante 3 h; a continuación, se desactivó mediante la adición lenta gota a gota de una mezcla piridina/MeOH 7:10 (v/v) (68 ml). Se permitió que la mezcla alcanzara temperatura ambiente con agitación y se concentró mediante evaporación rotatoria para dar 11 g de aceite bruto. Se recogió el producto bruto en DCM:MeOH 9:1 y la cromatografía ultrarrápida automatizada en un Combiflash (columna de 120 g, gradiente del 10 al 25 % de MeOH en DCM) eliminó las impurezas más importantes. Se recogieron las fracciones que contenían el producto deseado y se concentraron para dar 2 g de producto semipuro. Se recogió este bruto en MeOH y se inmovilizó sobre Celite. Una segunda cromatografía ultrarrápida automatizada en un Combiflash (columna de 40 g, gradiente del 2,5 al 25 % de MeOH en DCM) proporcionó 401 (0,622 g, 65 %) como un sólido pulverulento blanco. RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) ó 8,19 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,88 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 5,95 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,26 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 4,23 (dd, J = 5,9 Hz, 3,4 Hz, 1H), 3,85 (d, J = 12,2 Hz, 1H), 3,77 (d, J = 12,2 Hz, 1H), 3,08 (s, 1H). RMN de 13C (100 MHz, CD3OD) ó 178,2, 162,3, 142,7, 106,9, 94,7, 85,6, 80,6, 79,2, 76,4, 71,0, 65,8. ESI-EM: m /z 285,0 ([M+H]+).
Ejemplo 139. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000100_0002
Se calentó a reflujo una suspensión en agitación de tiouracilo (3,48 g, 27,2 mmol, 2,2 equiv.) en HMDS (25,9 ml, 1 M) con 10 mg de sulfato de amonio bajo argón. Después de 2 h, la solución transparente resultante se enfrió y se concentró hasta obtener una pasta blanca. A continuación, se añadió una solución del bromosazúcar (5,4 g, 12,35 mmol, 1 eq.) en DCE (40 ml) al matraz del tiouracilo por medio de una cánula con lavados de DCE (2 x 10 ml). Se cargó la reacción con óxido de mercurio (3,48 g, 16 mmol, 1,3 eq.), se añadió bromuro de mercurio (3,56 g, 9,88 mmol, 0,8 eq.) y se equipó la reacción con un condensador de reflujo y se sometió a reflujo. Después de 16 h, se enfrió y se desactivó con 100 ml de una mezcla 3:1 de metanol y agua. Después de 30 min de agitación, se diluyó la reacción en 300 ml de agua y se extrajo con diclorometano (3 x 100 ml). Se secaron las fases orgánicas combinadas con sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron a vacío. Se purificó la reacción bruta mediante cromatografía en gel de sílice (2 a 10 % de metanol en diclorometano) para proporcionar 2,5 g de nucleósido como una mezcla de dos compuestos que tenían la masa correcta. La cromatografía en gel de sílice adicional (20-70 % de acetato de etilo en hexanos) dio 785 mg del compuesto 404 (13 %) y 805 mg del compuesto 405 (13 %).
Compuesto 404 RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) 68,03 (dd, J = 34,2, 7,8 Hz, 4H), 7,86 (d, J = 6,6 Hz, 1H), 7,61 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,57-7,32 (m, 4H), 6,48 (d, J = 21,7 Hz, 1H), 6,30 (d, J = 6,6 Hz, 1H), 5,50 (dd, J = 16,6, 8,1 Hz, 1H), 4,87-4,48 (m, 4H), 1,71 (d, J = 21,5 Hz, 3H).
Compuesto 405 RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) 68,06 (dd, J = 26,3, 8,0 Hz, 5H), 7,86 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 7,71-7,33 (m, 7H), 6,43 (d, J = 17,5 Hz, 1H), 6,29 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 5,69 (dd, J = 21,8, 8,5 Hz, 1H), 4,94-4,35 (m, 5H), 1,66 (d, J = 22,1 Hz, 3H).
Figure imgf000101_0001
Se preparó una suspensión del compuesto 404 (785 mg, 1,62 mmol) en amoníaco 7 M en metanol (16 ml, 0,1 M). Después de 16 h, se concentró la reacción y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (5 a 20 % de metanol en DCM) para proporcionar 220 mg de diol (49 %). RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) 67,85 (d, J = 6,6 Hz, 1H), 6,38 (d, J = 28,2 Hz, 1H), 6,19 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 4,13-3,91 (m, 2H), 3,85 (dd, J = 12,6, 1,9 Hz, 1H), 3,64 (dd, J = 12,5, 3,7 Hz, 1H), 1,62-1,42 (m, 3H). CLEM calculado para C10H13FN2O4S 276,06; hallado 277,00 [M+1]; 274,90 [M-1].
Figure imgf000101_0002
Se preparó una suspensión del compuesto 405 (805 mg, 1,62 mmol) en amoníaco 7 M en metanol (16 ml, 0,1 M). Después de 16 h, se concentró la reacción y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (5 a 20 % de metanol en DCM) para proporcionar 210mg de diol (46%). RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) 67,89 (d, J = 6,6 Hz, 1H), 6,43 (d, J = 18,3 Hz, 1H), 6,19 (d, J = 6,6 Hz, 1H), 4,02-3,88 (m, 1H), 3,81 (dd, J = 12,5, 2,1 Hz, 1H), 3,72-3,53 (m, 1H), 3,39-3,23 (m, 1H), 1,56 (d, J = 22,3 Hz, 3H). CLEM calculado para C10H13FN2O4S 276,06; hallado 274,90 [M-1]. El profármaco de fosforamidato del compuesto 236 se puede sintetizar usando el procedimiento general del Ejemplo 93, y el trifosfato del compuesto 236 se puede sintetizar usando el procedimiento general del Ejemplo 98.
Ejemplo 140. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000101_0003
Se cargó una suspensión en agitación del nucleósido (190 mg, 0,73 mmol) en diclorometano (14,6 ml, 0,05 M) secuencialmente con DMAP (89 mg, 0,73 mmol), imidazol (124 mg, 1,83 mmol) y TBSCl (242 mg, 1,61 mmol) y se agitó durante la noche. Después de 18 h, se concentró la reacción, se diluyó en éter y se filtró. Se concentró la solución y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice con 5 a 50 % de acetato de etilo en hexanos para proporcionar 200 mg (57 %) del nucleósido bis-TBS deseado. RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) 57,89 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,18 (d, J = 17,8 Hz, 1H), 5,70 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,17-3,90 (m, 3H), 3,87-3,64 (m, 1H), 1,31 (d, J = 21,7 Hz, 3H), 0,90 (d, J = 10,2 Hz, 18H), 0,10 (s, 12H).
Figure imgf000102_0001
409
Se cargó una solución en agitación de 408 (200 mg, 0,409 mmol) en DCM (4 ml) con DMAP (100 mg, 0,818 mmol) y trietilamina (120 pl, 0,859 mmol). Se enfrió la solución transparente a 0 °C y, a continuación, se cargó con cloruro de 2,4,6-triisopropilbenceno-1-sulfonilo (248 mg, 0,818 mmol). Se agitó la reacción durante 18 h; a continuación, se enfrió de nuevo a 0 °C. Se preparó una solución a 0 °C de 2,6-dimetilfenol (150 mg, 1,228 mmol), DABCO (9,18 mg, 0,082 mmol) y trietilamina (171 pl, 1,228 mmol) en DCM (4 ml) y se añadió gota a gota a la reacción. Se agitó la reacción durante 3 h; a continuación, se desactivó con 50 ml de NaHCO3 sat. fría y 100 ml de DCM. Se lavó la capa orgánica separada una vez con salmuera, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró a vacío. Se purificó el aceite resultante con 5 a 50 % de EtOAc en hexanos para proporcionar 234 mg de fenol éter como un cristal. RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) 58,33 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 7,04 (s, 3H), 6,33 (d, J = 17,8 Hz, 1H), 6,08 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 4,30-3,94 (m, 3H), 3,84 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 2,13 (s, 6H), 1,32 (d, J = 21,8 Hz, 3H), 0,95 (d, J = 27,3 Hz, 18H), 0,15 (d, J = 15,3 Hz, 12H).
Figure imgf000102_0002
Se cargó una solución en agitación de 409 (200 mg, 0,338 mmol) en tolueno (6,6 ml, 0,05 M) con reactivo de Lawesson (204 mg, 0,506 mmol) y se calentó a 110 °C. Después de 3 h, se enfrió la reacción, se concentró con 1 g de Celite y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice con 1 a 20 % de EtOAc en hexanos para proporcionar un total de 200 mg de material que contenía una cantidad minoritaria de impurezas de fósforo que se mantuvo. RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) 58,42 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 7,41 (d, J = 18,2 Hz, 1H), 7,03 (s, 3H), 6,28 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 4,34-3,95 (m, 4H), 2,11 (s, 6H), 1,44 (d, J = 21,6 Hz, 3H), 1,06-0,82 (m, 18H), 0,14 (dd, J = 9,0, 1,1 Hz, 12H).
Se cargó una solución en agitación de 410 (200 mg, ~0,338 mmol) en THF (6,6 ml, 0,5 M) con TBAF (821 ul, 1 M en THF, 0,821 mmol). Se agitó la reacción durante 18 h, se concentró con 1 g de Celite y, a continuación, se purificó por medio de cromatografía en gel de sílice con 2 a 7 % de metanol en DCM para proporcionar 100 mg (~80 % en 2 etapas) de material que contenía una cantidad minoritaria de sal de tetrabutilamonio. RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) 58,75 (dd, J = 7,5, 1,7 Hz, 1H), 7,35 (dd, J = 18,2, 1,7 Hz, 1H), 7,22-6,96 (m, 3H), 6,60­ 6,41 (m, 1H), 4,13-3,91 (m, 3H), 3,91-3,73 (m, 2H), 2,11 (s, 6H), 1,42 (dd, J = 22,2, 1,6 Hz, 3H).
Se cargó una solución de sin-o-nitrobenzaldoxima (131 mg, 0,789 mmol) en acetonitrilo (2,6 ml) con 1,1,3,3-tetrametilguanidina (99 pl, 0,789 mmol) para dar una solución naranja. Después de 15 minutos, se añadió gota a gota la solución resultante a una solución en agitación de 411 (100 mg, 0,63 mmol) en acetonitrilo (2,6 ml). Después de 3 h, se concentró la reacción con 500 mg de Celite y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice con 2 a 20 % de metanol en DCM para proporcionar 45 mg de 412 (62 %). RMN de 1H (400 MHz, metanold4) 58,17 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,16 (d, J = 18,7 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,09-3,87 (m, 3H), 3,80 (dd, J = 12,5, 1,9 Hz, 1H), 1,43 (d, J = 22,2 Hz, 3H). EN C10H13FN2O4S [M-H+]; calculado: 277,1, hallado: 277,0.
El trifosfato del compuesto 412 tiene actividad contra la infección por el virus del dengue.
Ejemplo 141. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Profármacos de 5'-fosforamidato sintetizados utilizando el procedimiento general:
Figure imgf000103_0001
Ejemplo 142. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones) Síntesis de 2'-metil-2-selenouridina:
Figure imgf000103_0002
Síntesis de 421. A una solución en agitación de (2R,3R,5R)-5-((benzoiloxi)metil)-3-metil-2-(4-oxo-2-tioxo-3,4-dihidropirimidin-1 (2H)-il)tetrahidrofurano-3,4-diil dibenzoato 420 (2,899 g, 4,94 mmol) en CH2Cl2 anhidro (35 ml) se le añadió yodometano (3,08 ml, 49,4 mmol) y se enfrió a 0 oC. A continuación, se añadió DBU (1,106 ml, 7,41 mmol) gota a gota y se agitó a 0 °C durante 1 h. Se desactivó la reacción mediante la adición de 15 ml de agua y se extrajo con CH2Cl2. Se separó la capa acuosa y se lavó la capa orgánica con agua (2 x 15 ml) y se volvió a extraer la capa acuosa con CH2Cl2 (25 ml). Se secaron las capas orgánicas combinadas (Na2SO4), se filtraron y se concentraron para dar un aceite, que se purificó mediante cromatografía en columna en gel de sílice usando un gradiente lineal de 0 a 50 % de EtOAC en hexanos para obtener 421 puro como un sólido blanco (2,678 g, rendimiento del 90 %). RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) ó 8,11-7,98 (m, 4H), 7,83-7,79 (m, 2H), 7,67 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,65-7,53 (m, 2H), 7,53-7,32 (m, 5H), 7,32-7,16 (m, 2H), 6,63 (s, 1H), 5,95 (dd, J = 7,8, 0,6 Hz, 1H), 5,64 (d, J = 6,0 Hz, 1H)), 5,00-4,63 (m, 3H), 2,63 (s, 3H), 1,68 (s, 3H). RMN de 13C (100 MHz, CDCla) ó 167,7, 166,2, 165,5, 165,3, 162,9, 138,5, 134,0, 133,9, 130,1, 129,9, 129,8, 129,6, 129,4, 129,3, 128,9, 128,8, 128,6, 128,4, 109,6, 91,21, 85,5, 80,5, 77,5, 77,2, 76,9, 74,7, 62,6, 19,4, 15,4.
Síntesis de 422. Se enfrió etanol anhidro (10 ml) a 0 °C y se desoxigenó pasando argón durante 15 min y se añadió esta solución a una mezcla de selenio en polvo gris (0,263 g, 3,33 mmol) y tetrahidroborato de sodio (0,132 g, 3,50 mmol) enfriada en un baño de hielo. Después de agitar durante 30 min, se añadió esta solución con cuidado al sólido puro desoxigenado de 421 (1,000 g, 1,665 mmol) a 0 °C y se agitó durante 10 min a 0 oC; a continuación, se permitió que alcanzara temperatura ambiente durante la noche. La CCF (MeOH al 5 %: CH2Cl2 ) mostró un Rf de producto = 0,71. Se burbujeó argón sobre la mezcla para eliminar el H2Se durante una hora, se diluyó con EtOAC (30 ml) y se lavó con agua (15 ml), seguido de salmuera (15 ml). Se extrajo nuevamente la capa acuosa con EtOAc (30 ml). Se secaron las capas orgánicas combinadas (Na2SO4), se filtraron y concentraron para obtener un sólido bruto que se purificó mediante cromatografía en columna de sílice usando un gradiente lineal de 0 a 10 % de metanol en diclorometano para obtener 422 como un sólido amarillo pálido. Se volvió a purificar el sólido mediante cromatografía en columna usando EtOAC y hexanos para eliminar las impurezas minoritarias y se obtuvo 422 puro con un rendimiento del 99 %. RMN de 1H (300 MHz, cloroformo-d) ó 10,25 (s, 1H), 8,07 (t, J = 8,4 Hz, 4H), 7,81 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 7,77 (s, 1H), 7,71 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 7,67-7,36 (m, 7H), 7,30-7,19 (m, 2H), 5,96 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 5,61 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,01-4,59 (m, 3H), 1,77 (s, 3H).
Síntesis de 423. Se calentó una solución de 422 (0,950 g, 1,500 mmol) en NH37 N en metanol (10 ml) en un tubo sellado a 40 °C durante la noche. La CCF (MeOH al 10%:CH2Cb) mostró una conversión completa con un Rf del producto = 0,2, mientras que el Rf del material de partida = 0,7. Se concentró la mezcla de reacción y se purificó la mezcla bruta resultante mediante cromatografía en columna en gel de sílice y se eluyó con un gradiente lineal de 0 a 20 % de metanol en CH2Cl2 para obtener 423 como un sólido amarillo pálido (0,350 g, rendimiento del 72,7 %). RMN de 1H (300 MHz, metanol-d4) ó 8,29 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,10 (s, 1H), 6,08 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,62 (s, 1H), 4,08-3,69 (m, 4H), 1,28 (s, 3H); RMN de 13C (150 MHz, DMSO): 179,3, 161,76, 143,8, 111,1, 100,5, 85,4, 81,8, 74,5, 61,4, 23,5; EMAR [M+Na]+ para C iüH^OsNaSe calculado: 344,99601, observado: 344,99632.
Ejemplo 143. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones) Profármacos de 5'-fosforamidato sintetizados utilizando el procedimiento general:
Figure imgf000104_0001
Ejemplo 144. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
5'-Trifosfatos sintetizados utilizando el procedimiento general:
Figure imgf000104_0002
Ejemplo 145. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de 2'-metil-4-tiouridina-5'-monofosfato:
Figure imgf000105_0001
427
A un matraz piriforme de 10 ml secado a la llama cargado con 1-((2R,3R,4R,5R)-3,4-dihidroxi-5-(hidroximetil)-3-metiltetrahidrofuran-2-il)-4-tioxo-3,4-dihidropirimidin-2(1H)-ona (0,205 g, 0,747 mmol) se le añadió PO(OMe)3 (1,868 ml) para dar una solución amarilla brillante. Esta se enfrió a 0 °C y, a continuación, se añadió POCb gota a gota (0,139 ml, 1,495 mmol) para dar todavía una solución amarilla brillante. Después de agitar a 0 °C durante 4,5 h, la CCF no mostró material de partida. Se vertió la mezcla bruta en 30 ml de agua desionizada fría. Después de agitar durante 5 min, se transfirió a un embudo de decantación y se añadió CHCb (30 ml). Se lavó la capa acuosa con CHCb (30 ml) una vez más. A continuación, se neutralizó la capa acuosa a aproximadamente pH = 7,2 mediante la adición gota a gota de NH4OH concentrado. Se volvió a extraer la mezcla con CHCb (30 ml) una vez. Se concentró la capa acuosa a vacío para dar un sólido amarillo claro. Se agitaron los sólidos con MeOH (60 ml) durante 1 h y, a continuación, se filtraron a través de una placa filtrante. Se trató el filtrado con Celite y se concentró a vacío. Se purificó el material bruto mediante cromatografía en columna de SiO2 eluyendo de 100 % DCM a 100 % IPA a IPA/NH4OH/H2O = 8/1/1 a 7/2/1 para dar el producto y algunos otros compuestos inorgánicos (blanco). A continuación, se diluyó el material con MeOH y se añadió Celite. Se concentró el material bruto a vacío y se purificó con 100 % IPA a IPA/NH4OH/H2O = 9/1/1 a 8/1/1 a 7/2/1. Se combinaron las fracciones que contenían el producto y se concentraron a vacío y se coevaporaron con MeOH para dar un aceite amarillo, que se disolvió en agua y se liofilizó durante la noche para dar 427 (25 mg) como un sólido amarillo.
RMN de 1H (400 MHz, CD3OD); 57,99 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,51 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 5,93 (s, 1H), 4,29-4,25 (m, 1H), 4,14-4,09 (m, 1H), 4,03-3,94 (m, 2H), 1,18 (s, 3H). RMN de 13C (100 MHz, CD3OD); 5192,3, 150,2, 136,7, 114,8, 93,2, 83,1, 80,3, 73,0, 63,3, 20,3. RMN de 31P (400 MHz, CD3OD); 5 1,27. EMAR (ESI) calculado para C10H14O8N2PS [M-H]+: 353,0214. Hallado: 353,0213.
Ejemplo 146. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Síntesis de 2'-metil-4-tiouridina-5'-difosfato:
Figure imgf000105_0002
428
Se cargó una solución en agitación de 427 (39 mg, 110 umol) en DMF (1,1 ml, 0,1 M) con tributilamina (262 ul, 1,1 mmol). Se agitó la reacción durante 25 min; a continuación, se concentró a vacío. Se volvió a disolver la pasta resultante en DMF (1,1 ml, 0,1 M) y se cargó con carbonil diimidazol (89 mg, 550 umol) para dar una solución transparente. Después de agitar durante 24 h, se añadió metanol (150 ul, 1,4 mmol) gota a gota. Después de 2 h, se cargó la reacción con fosfato de tributilamonio (12 ml, 0,5 M en DMF, 2,2 mmol) para dar una solución turbia. La reacción se agitó durante 2 días; a continuación, se eliminó el solvente y se cargó la pasta bruta en una columna DEAE eluyendo con TEAB 50 a 450 mM para proporcionar sal de trietilamonio del difosfato. Se transformó el difosfato en sal sódica eluyendo a través de una columna de Na+ Dowex a 0 °C para dar 28 mg (rendimiento del 51 %) de la sal sódica del difosfato.
RMN de 1H (400 MHz, D2O) 67,73 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 6,53 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 5,87 (s, 1H), 4,24-4,11 (m, 2H), 4,00 (d, J = 2,1 Hz, 2H), 1,08 (s, 3H). RMN de 32P (162 MHz, D2O) -6,55 (d, J = 23,0 Hz), -11,02 (d, J = 22,9 Hz). EMAR C10H16N2O11P2S [M-]; calculado: 432,995, hallado: 432,988.
Ejemplo 147. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000106_0001
431
Se persililó 2-tiouracilo (1,025 g, 8,0 mmol) mezclándolo con sulfato de amonio (0,053 g, 0,400 mmol) en hexametildisilazano (16,77 ml, 80,0 mmol) y calentando la mezcla a reflujo durante 16 h. Se enfrió la solución azul claro resultante a temperatura ambiente y se eliminaron los volátiles mediante evaporación rotatoria seguida de alto vacío para dar 2-tiouracilo persililado como un líquido azul claro, que tenía una pureza >95 % en el análisis por r Mn de 1H. Se usó la totalidad de este material inmediatamente en la siguiente etapa.
A una solución en agitación del persilil-2-tiouracilo bruto recién preparado (8,0 mmol) en 1,2-dicloroetano (20,0 ml) bajo nitrógeno a temperatura ambiente se le añadió una solución de 429 (1,666 g, 4,00 mmol) en 1,2-dicloroetano de una sola vez. Se enfrió la solución en agitación a 0 °C y se añadió SnCl4 (0,94 ml, 8,00 mmol) gota a gota por medio de una jeringa. Se permitió que la mezcla alcanzara t.a. y se agitó durante la noche durante 16 h. A continuación, la mezcla se volvió a enfriar a 0 °C y se desactivó con cuidado con NaHCO3 ac. sat. (40 ml). Se permitió que la mezcla alcanzara t.a. y se agitó enérgicamente durante 1 h. Se extrajo la mezcla con EtOAc (2 x 150 ml) y se secaron las capas orgánicas combinadas sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron mediante evaporación rotatoria para dar 3,5 g de residuo bruto. Se recogió el residuo bruto en DCM y la cromatografía ultrarrápida automatizada en un Combiflash (columna de 80 g, gradiente del 5 al 50 % de EtOAc en hexanos) dio 430 (0,708 g, 1,46 mmol, rendimiento del 37 %) como un sólido escamoso blanco. El análisis por RMN de 1H mostró una pureza de ~95 %; se usó la totalidad del compuesto directamente en la siguiente etapa. RMN de 1H (400 MHz, CDCla) 69,52 (s an., 1H), 8,18 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 8,06 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 7,67-7,57 (m, 2H), 7,59 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,55-7,45 (m, 5H), 5,96 (dd, J = 8,3 Hz, 2,1 Hz, 1H), 5,33 (dd, J = 52,0 Hz, 2,4 Hz, 1H), 4,84-4,68 (m, 3H), 1,65 (d, J = 2,0 Hz, 3H).
Se cargó un tubo de presión sellable con una barra de agitación, 430 (0,708 g, 1,461 mmol) y una solución de amoníaco 7 N en MeOH (20 ml, 140 mmol) a 0 °C. Se selló el tubo, se permitió que alcanzara temperatura ambiente y se agitó durante 3 días a t.a. A continuación, se calentó el tubo a 45 °C durante 5 h, se volvió a enfriar a t.a. y se concentró mediante evaporación rotatoria para dar 700 mg de bruto. Se disolvió el bruto en MeOH y se inmovilizó sobre Celite. La cromatografía ultrarrápida automatizada en un Combiflash (columna de 24 g, gradiente del 0 al 10 % de MeOH en DCM) dio aproximadamente 450 mg de un producto 2'-monobenzoato parcialmente desprotegido. Se colocó este compuesto en un tubo de presión sellable con una barra de agitación y una solución de amoníaco 7 N en MeOH (20 ml, 140 mmol). Se calentó la mezcla con agitación, incrementando gradualmente el calor, hasta completar la reacción: 24 h a 45 °C, 24 h a 55 °C y, finalmente, 24 h a 75 °C. Se enfrió la mezcla a t.a. y se concentró mediante evaporación rotatoria para dar 500 mg de un aceite marrón. Se disolvió el bruto en MeOH y se inmovilizó sobre Celite. La cromatografía ultrarrápida automatizada en un Combiflash (columna de 24 g, gradiente del 0 al 10 % de MeOH en DCM) dio 160 mg de un compuesto prácticamente puro. Se recogió de nuevo en MeOH y se inmovilizó sobre Celite. Una segunda columna flash automatizada en el Combiflash (columna de 12 g, gradiente del 0 al 7 % de MeOH en DCM) dio 115 mg de un sólido blanco con algo de disolvente ocluido. Se disolvió el sólido en agua, se congeló en un baño de hielo seco/acetona y se liofilizó para dar 431 (0,102 g, 0,369 mmol, rendimiento del 9,2 % en 2 etapas) como un sólido blanco. RMN de 1H (400 MHz, DMSO-cfe) 612,70 (s, 1H), 8,03 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,85 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,02 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,86 (s, 1H), 5,47 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 4,76 (dd, J = 52,9 Hz, 8,7 Hz, 1H), 4,20-4,10 (m an., 1H), 3,85 (ddd, J = 13,1 Hz, 5,4 Hz, 2,1 Hz, 1H), 3,66 (ddd, J = 12,8 Hz, 4,9 Hz, 2,5 Hz, 1H), 1,20 (s, 3H); RMN de 1H (400 MHz, D2O) 67,94 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,98 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 6,17 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,81 (dd, J = 52,4, 8,1 Hz, 1H), 4,38-4,27 (m, 1H), 4,04 (dd, J = 13,2 Hz, 2,7 Hz, 1H), 3,90 (dd, J = 13,2 Hz, 3,6 Hz, 1H), 1,34 (s, 3H); RMN de 13C (100 MHz, D2O) 6176,5, 162,2, 141,8, 106,9, 94,2 (d, J = 3,8 Hz), 91,3 (d, J = 190,6 Hz), 79,9 (d, J = 24,3 Hz), 78,6 (d, J = 14,2 Hz), 59,0, 19,5; RMN de 19F (376 MHz, D2O) 6 -212,37 (dd, J = 52,3 Hz, 14,3 Hz); EMAR calculado para C10H13FN2O4SNa [M+Na]+: 299,04723, hallado: 299,04743.
Ejemplo 148. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000106_0002
3.5- Di-0-bencil-4-C-hidroximetil-1,2-0-isopropilideno-a-D-ribofuranosa: A una solución de 3-0-bencil-4-C-hidroximetil-1,2-0-isopropilideno-a-D-ribofuranosa (10,0 g, 32,2 mmol) en DMF anhidra (50 ml) a -5 °C se le añadió a una suspensión de NaH (60 % en aceite mineral (p/p), dos porciones durante 30 min (total, 1,48 g, 37,1 mmol). Se añadió bromuro de bencilo (4,4 ml, 37,1 mmol) gota a gota y se mantuvo la agitación a temperatura ambiente durante 3 h, después de lo cual se añadió agua con hielo (50 ml). Se extrajo la mezcla con EtOAc (4 x 50 ml) y se secó la fase orgánica combinada (Na2SO4). Después de la evaporación, se purificó el residuo mediante cromatografía en columna en gel de sílice eluyendo con 15 a 20 % de EtOAc en hexanos (v/v) para proporcionar el producto 433 (8,84 g, 69 %) como un líquido incoloro. RMN de 1H (400 MHz, CDCb); 57,37-7,25 (m, 10H), 5,79 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 4,79 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 4,65 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 4,54 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 4,51 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 4,46 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 4,27 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 3,93 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 3,83 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 3,61 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 3,54 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 2,26 (s an., 1H), 1,64 (s, 3H), 1,35 (s, 3H).
3.5- Di-0-bencil-4-C-fluorometil-1,2-0-isopropilideno-a-D-ribofuranosa: A una solución en agitación de 433 (7,87 g, 19,65 mmol) en CH2Cl2 (190 ml) se le añadió sucesivamente piridina (2,37 ml, 29,5 mmol) y anhídrido trifluorometanosulfónico (3,64 ml, 21,62 mmol) a 0 °C. Se agitó la mezcla de reacción a 0 °C durante ~45 min. y, a continuación, la CCF indicó la finalización de la reacción a un único compuesto de elución más rápida. Después de eso, se lavó la mezcla con agua y salmuera. Se volvieron a extraer las capas acuosas combinadas con CH2Cl2. Se secó la fase orgánica combinada (Na2SO4 ), se concentró bajo presión reducida para dar un sólido marrón claro.
Se disolvió el sólido obtenido en la etapa previa en acetonitrilo (100 ml). Se añadió una solución 1 M de fluoruro de tetrabutilamonio en THF (78 ml, 78,0 mmol) y se agitó la mezcla de reacción a ~50 °C durante la noche. La eliminación del disolvente bajo presión reducida y la cromatografía en gel de sílice del residuo oleoso oscuro[10 a 15 % de EtOAc en hexanos] dio 434 (4,3 g, 55 %) como un aceite incoloro. RMN de 1H (400 MHz, CDCb); 5 7,34-7,26 (m, 10H), 5,77 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 4,87 (dd, J = 10,0, 48,8 Hz, 1H), 4,73 (d, J = 10 Hz, 1H), 4,63- 4,47 (m, 5H), 4,26 (dd, J = 1,6, 4,8 Hz, 1H), 3,61 (dd, J = 1,6, 10,4 Hz, 1H), 3,55 (dd, J = 1,6, 10,4 Hz, 1H), 1,63 (s, 3H), 1,35 (s, 3H). RMN de 19F (400 MHz, CDCb); 5 -28,46 (t, J = 48,8 Hz).
1,2-Di-0-acetil-3,5-di-0-bencil-4-C-fluorometil-D-ribofuranosa: Se cargó una solución en agitación de 434 en ácido acético al 70 % (73 ml) con TFA (7,3 ml) y se calentó a 40 °C. Después de 4 h, se concentró la reacción y se coevaporó con tolueno. A continuación, se disolvió la pasta en piridina (27 ml) y se cargó con anhídrido acético (10,57 ml, 112 mmol). Después de agitar durante la noche, se concentró la reacción y se extrajo en acetato de etilo y se lavó con agua. Se filtró la fase orgánica secada (Na2SO4) y se concentró para dar un aceite que se purificó mediante cromatografía en gel de sílice con 5 a 20 % de acetato de etilo en hexanos para proporcionar 435 (3,54 g, 71 %) como un líquido incoloro. RMN de 1H (400 MHz, CDCb); 57,35-7,25 (m, 10H), 6,18 (s, 1H), 5,35 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,73-4,66 (m, 1H), 4,60-4,48 (m, 5H), 4,43 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 3,68 (dd, J = 1,6, 10,4 Hz, 1H), 3,51 (dd, J = 1,6, 10,4 Hz, 1H), 2,11 (s, 3H), 1,90 (s, 3H).
Figure imgf000107_0001
436 437 438
1-(2'-0-Acetil-3',5'-di-0-bencil-4'-C-fluorometil-p-D-ribofuranosil)-2-tiouracilo: Se calentó a reflujo una mezcla en agitación de 2-tiouracilo (600 mg, 4,68 mmol) y sulfato de amonio (30 mg, 0,23 mmol) en hexametildisilazano (4,9 ml, 23,41 mmol) y clorobenceno (10 ml) bajo nitrógeno durante 3-4 h. hasta que se disolvieron todos los sólidos y se formó una solución azul clara. Se enfrió la mezcla a t.a. y se concentró mediante evaporación rotatoria, seguido de alto vacío, para dar un líquido azul con algo de sólido blanco en él. La totalidad del bruto se llevó a la siguiente etapa inmediatamente.
A una solución turbia en agitación de 435 (950 mg, 2,13 mmol) y 2-tiouracilo bis-sililado en 1,2-DCE (10,0 ml) a 0 °C bajo nitrógeno se le añadió cloruro de estaño(IV) (0,5 ml, 4,26 mmol). La mezcla se volvió inmediatamente amarilla y la mezcla se volvió menos turbia. Se permitió que la mezcla alcanzara t.a. y se agitó durante la noche. Después de agitar durante 15 h a t.a., se diluyó la mezcla con 25 ml de DCM y se añadieron con cuidado 1,0 g de cada uno de NaHCO3 sólido y Celite a la mezcla de reacción en agitación enérgica. Se enfrió la mezcla a 0 °C y se añadió NaHCO3 ac. sat. (2 ml) gota a gota con agitación enérgica. Se permitió que la mezcla alcanzara t.a. y se agitó durante 2 h. Se filtró la mezcla a través de una pequeña almohadilla de Celite, que a continuación se enjuagó con DCM (20 ml). Se concentraron los filtrados combinados para dar un aceite que se purificó mediante cromatografía en gel de sílice con 30 a 35 % de acetato de etilo en hexanos para proporcionar 436 (890 mg, 81 %) como un sólido espumoso incoloro. RMN de 1H (400 MHz, CDCb); 5 10,11 (s an., 1H), 8,05 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,40-7,19 (m, 10H), 6,81 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 5,49 (dd, J = 3,2, 4,8 Hz, 1H), 5,38 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,73 4,59 (m, 3H), 4,50-4,35 (m, 4H), 3,95 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 3,57 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 2,15 (s, 3H). RMN de 19F (400 MHz, CDCla); 5 -28,22 (t, J = 50,8 Hz).
1-(3,,5,-Di-0-bencil-4,-C-fluorometil-^-D-ribofuranosil)-2-tiouracilo: A una solución en agitación de 436 (890 mg, 1,73 mmol) en metanol (29 ml) a 0 °C se le añadió amoníaco metanólico (6,2 ml, 7 M en MeOH). Se permitió que la mezcla alcanzara 40 °C y se agitó durante la noche. Se evaporó el disolvente bajo presión reducida y, a continuación, se purificó mediante cromatografía en gel de sílice con 25 a 30 % de acetato de etilo en hexanos para proporcionar 437 (800 mg, 89 %) como un sólido espumoso incoloro.
1-(4'-C-Fluorometil-p-D-ribopentofuranosil)-2-tiouracilo: En un matraz piriforme de 50 ml cargado con 437 (800 mg, 1,693 mmol) se añadió DCM seco (20,0 ml) bajo N2. Se enfrió a -78 °C y, a continuación, se añadió BCl3 (11,8 ml, 11,8 mmol, 1,0 M en DCM) gota a gota. Se dejó la reacción en agitación a -78 °C durante 15 min y, a continuación, se permitió que alcanzara lentamente -40 °C. Cuando la CCF no mostró material de partida, se añadió MeOH (5 ml) gota a gota y se agitó a -40 °C durante. Después de eso, se eliminó el disolvente a vacío y se purificó el material bruto mediante cromatografía en columna de SiO2 eluyendo con 5 a 7 % de MeOH en DCM para proporcionar 438 (340 mg, 69 %) como un sólido blanco. RMN de 1H (400 MHz, CD3OD); 58,21 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,67 (t, J = 0,8 Hz, 1H), 4,56 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,34-4,30 (m, 2H), 3,81-3,78 (m, 2H). RMN de 13C (100 MHz, CD3OD); 5178,9, 162,4, 143,0, 107,3, 93,3, 88,9, 88,8, 85,3, 83,6, 76,7, 72,3, 63,5. RMN de 19F (400 MHz, CDCla); 5 -30,18 (t, J = 50,8 Hz). EMAR (ESI) calculado para C10H1aOaN2FNaS [M+Na]+: 315,0421. Hallado: 315,0424.
Ejemplo 149. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000108_0001
439
A un matraz piriforme de 100 ml cargado con 260 (300 mg, 0,552 mmol) se le añadió H2O (8,00 ml) y Et3N (8 ml). Se calentó a 35 °C (temperatura del baño de aceite), comenzando a las 16:50 h y finalizando a las 9:00 h. Después de agitar durante la noche, la CCF no mostró material de partida. A continuación, se eliminó el solvente a vacío, se añadió Celite y se concentró la mezcla a vacío. Se purificó el material bruto mediante cromatografía en columna de SiO2 eluyendo de iPrOH (3 volúmenes de columna) a iPrOH/NH4OH/H2O = 8/1/1 para dar 439 (0,18 g, rendimiento del 77 %) como un sólido amarillo.
RMN de 1H (400 MHz, D2O); 57,91 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 6,66 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 5,98 (s, 1H), 4,23-4,11 (m, 2H), 4,03-3,96 (m, 2H), 3,62-3,55 (m, 1H), 1,29 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,21 (s, 3H). RMN de 13C (100 MHz, D2O); 5 190,4, 180,4, 149,0, 136,2, 113,7, 91,7, 80,7, 79,0, 71,6, 61,9, 51,0, 20,4, 18,8. RMN de 31P (400 MHz, D2O) 5 7,67. EMAR (ESI) calculado para C13H19O9N3PS [M-H]+: 424,0585. Hallado: 424,0584.
Ejemplo 150. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Figure imgf000108_0002
440 441
A un matraz piriforme de 250 ml cargado con 1-((2R,3R,4S,5R)-5-azido-3,4-bis((terc-butildimetilsilil)oxi)-5-(((tercbutildimetilsilil)oxi)metil)tetrahidrofuran-2-il)pirimidin-2,4(1H,3H)-diona (6,4 g, 10,19 mmol) se le añadió Dc M seco (85 ml) para dar una solución incolora bajo argón. Esta se trató con N,N-dimetilpiridin-4-amina (2,490 g, 20,38 mmol) y trietilamina (2,98 ml, 21,40 mmol) para dar una solución todavía incolora. Se enfrió el matraz a 0 °C y, a continuación, se añadió cloruro de 2,4,6-triisopropilbenceno-1-sulfonilo (6,17 g, 20,38 mmol). Después de 1 h, se retiró el baño de agua con hielo. Después de agitar durante 17 h, la reacción se convirtió en una solución pardusca. Se enfrió a 0 °C y, a continuación, se añadió gota a gota una solución en DCM seca (21,23 ml) de 2,6-dimetilfenol (3,73 g, 30,6 mmol), DABCO (0,229 g, 2,038 mmol) y trietilamina (4,26 ml, 30,6 mmol). Después de la adición, se retiró el baño de agua con hielo. Después de agitar durante 5 h, se desactivó con 50 ml de NaHCO3, se separó la capa orgánica, se lavó nuevamente con 50 ml de agua una vez, 50 ml de salmuera una vez, se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró a vacío. Se disolvió el material bruto en DCM y se purificó mediante cromatografía en columna ISCO (120 g, 50 ml cada una) eluyendo de 100 % a 20 % de EtOAc en hexanos en 30 min (el producto salió a ~4,5 % de EtOAc en hexanos) para dar el producto, que se trituró con hexanos para dar 441 (4,7 g, 6,42 mmol, rendimiento del 63,0 %) como un sólido blanco.
RMN de 1H (400 MHz, CDCla) ó 8,28 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 7,04 (d, J = 1,6 Hz, 3H), 6,14 (d, J = 3,7 Hz, 1H), 6,10 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 4,37-4,29 (m, 1H), 4,26 (d, J = 4,7 Hz, 1H), 3,86 (d, J = 11,3 Hz, 1H), 3,64 (d, J = 11,3 Hz, 1H), 2,14 (s, 6H), 0,99 (s, 8H), 0,96 (s, 8H), 0,92 (s, 8H), 0,18 (d, J = 7,1 Hz, 6H), 0,14 (d, J = 3,1 Hz, 6H), 0,08 (d, J = 0,5 Hz, 5H).
Figure imgf000109_0001
442
A un matraz de fondo redondo de 500 ml cargado con 441 (12,7 g, 17,35 mmol) se le añadió tolueno seco (173 ml) bajo argón. A continuación, se añadió 2,4-disulfuro de 2,4-bis(4-metoxifenil)-1,3,2,4-ditiadifosfetano (10,52 g, 26,0 mmol). Se calentó esta mezcla a 110 °C durante 5 horas, se concentró el material bruto a vacío y se purificó el material bruto mediante cromatografía en columna de SiO2 eluyendo de 100 % de hexanos a 5 % de EtOAc en hexanos a 10 % de EtOAc en hexanos para dar 442 (10 g, 13,37 mmol, rendimiento del 77 %) como un sólido vítreo que contenía algunas impurezas pero que se usó directamente para la siguiente etapa.
Figure imgf000109_0002
443
A un matraz piriforme de 200 ml cargado con 442 (0,14 g, 0,187 mmol) (sólido amarillo) se le añadió THF seco (1,871 ml) para dar una solución amarilla. Esta se sometió a vacío y se cargó con argón. Se enfrió el matraz a 0 °C y, a continuación, se añadió TBAF (0,599 ml, 0,599 mmol) gota a gota, seguido de AcOH glacial (0,034 ml, 0,599 mmol). Después de 3 min, se retiró el baño de agua con hielo. Después de 1,5 h, la CCF no mostró material de partida. A continuación, se diluyó la mezcla bruta con CHCb, que se vertió en un embudo de decantación. A continuación, se añadió una solución saturada de NaHCO3. Se volvió a extraer la capa acuosa con CHCl3 una vez, se lavó la capa orgánica combinada una vez con salmuera. La capa acuosa se volvió a extraer de nuevo con DCM. Se secó la capa orgánica combinada (Na2SO4 ), se filtró y se concentró a vacío. Se purificó el material bruto mediante cromatografía en columna de SiO2 eluyendo de 100 % DCM (75 ml, 3 volúmenes de columna) a 1 % de MeOH en DCM (100 ml) a 2 % de MeOH en DCM (200 ml) para dar 443 (70 mg, 0,173 mmol, rendimiento del 92 %) como un sólido blanquecino.
RMN de 1H (400 MHz, CDCI3) 68,54 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 7,9 (s, 3H), 6,60 (s, 1H), 6,39 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,39­ 4,26 (m, 3H), 4,05-3,90 (m, 2H), 3,16 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 2,14 (s, 6H).
Figure imgf000110_0001
444
A un matraz piriforme de 10 ml cargado con 443 (70 mg, 0,173 mmol) se le añadió CH3CN seco (1,7 ml) para dar una soIución amariIIo cIara. A continuación, a otro matraz de 10 mI cargado con sin-o-nitrobenzaIdoxima (86 mg, 0,518 mmol) se le añadió CH3CN seco (1,7 ml), seguido de 1,1,3,3-tetrametilguanidina (0,065 ml, 0,518 mmol) para dar una solución naranja. Esta se añadió gota a gota al matraz previo para dar una solución naranja al final. Después de agitar a t.a. durante 2 h, la CCF no mostró material de partida. A continuación, se añadió gel de sílice y se concentró el material bruto a vacío. Se purificó el material bruto mediante cromatografía en columna de SO 2 eluyendo de 5 % de MeOH en DCM a 7,5 % de MeOH en DCM para dar 444 (38 mg, rendimiento del 73%) como un sólido blanquecino.
RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) 68,20 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,06 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 5,97 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,34­ 4,27 (m, 2H), 3,68 (dd, J = 38,4, 12,0 Hz, 2H). RMN de 13C (100 MHz, CD3OD); 5 178,5, 162,4, 142,4, 107,3, 101,1, 95,2, 75,8, 72,4, 64,2. EMAR (ESI) calculado para CgHuOsNsNaS [M+Na]+: 324,0373. Hallado: 324,0370.
Ejemplo 151. (ejemplo fuera del alcance de las reivindicaciones)
Profármacos de 5'-fosforamidato sintetizados utilizando el procedimiento general:
Figure imgf000110_0002
Ejemplo 152.
Protocolos de ensayo
(1) Ensayos de detección para DENV, JEV, POWV, WNV, YFV, PTV, RVFV, CHIKV, EEEV, VEEV, WEEV, TCRV, PCV, JUNV, MPRLV
Ensayo de reducción del efecto citopático (ECP) principal. Se realizan ensayos de inhibición de ECP a cuatro concentraciones. Se preparan monocapas de cultivo celular confluentes o casi confluentes en microplacas desechables de 96 pocillos. Se mantienen las células en MEM o DMEM complementado con FBS según se requiera para cada línea celular. Para los ensayos antivíricos, se usa el mismo medio pero con FBS reducido al 2 % o menos y complementado con 50 pg/ml de gentamicina. Se prepara el compuesto de prueba a cuatro concentraciones log10 finales, normalmente 0,1, 1,0, 10 y 100 pg/ml o pM. En cada microplaca existen pocillos de control vírico y control celular. Paralelamente, se somete a prueba un fármaco activo conocido como fármaco de control positivo usando el mismo procedimiento que se aplica para los compuestos de prueba. El control positivo se somete a prueba con cada serie de pruebas. El ensayo se establece retirando primero el medio de crecimiento de las placas de células de 96 pocillos. A continuación, el compuesto de prueba se aplica a los pocillos en un volumen de 0,1 ml a una concentración 2X. El virus, normalmente en dosis infectiva al 50 % en cultivo celular (CCID50) <100 en un volumen de 0,1 ml, se coloca en los pocillos designados para la infección por virus. Se coloca medio desprovisto de virus en los pocillos de control de toxicidad y en los pocillos de control celular. Los pocillos de control vírico se tratan de forma similar con virus. Se incuban las placas a 37 °C con 5 % de CO2 hasta que se observa el ECP máximo en los pocillos de control vírico. A continuación, se tiñen las placas con rojo neutro al 0,011 % durante aproximadamente dos horas a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 %. Se retira el medio rojo neutro por aspiración completa y se pueden enjuagar las células 1X con solución tamponada con fosfato (PBS) para retirar el tinte residual. Se retira completamente el PBS y se eluye el rojo neutro incorporado con tampón citrato de Sorensen al 50 %/etanol al 50 % (pH 4,2) durante al menos 30 minutos. El tinte rojo neutro penetra en las células vivas; por tanto, cuanto más intenso es el color rojo, mayor es el número de células viables presentes en los pocillos. Se cuantifica el contenido de tinte en cada pocillo usando un espectrofotómetro de 96 pocillos a una longitud de onda de 540 nm. Se convierte el contenido de tinte en cada conjunto de pocillos en un porcentaje de tinte presente en los pocillos de control sin tratar usando una hoja de cálculo basada en ordenador de Microsoft Excel. A continuación, se calculan las concentraciones eficaces al 50 % (EC50, inhibidora de virus) y las concentraciones citotóxicas al 50 % (CC50, inhibidora de células) mediante análisis de regresión lineal. El cociente de CC50 dividido por EC50 da el valor del índice de selectividad (SI).
Ensayo de reducción de rendim iento de virus (RRV)/ECP secundario. Este ensayo implica una metodología similar a la descrita en los párrafos previos usando microplacas de células de 96 pocillos. En esta sección se indican las diferencias. Se someten a prueba ocho concentraciones semilogarítmicas de inhibidor para determinar la actividad antivírica y la citotoxicidad. Después de que se produzca suficiente replicación del virus, se toma una muestra de sobrenadante de cada pocillo infectado (se combinan tres pocillos replicados) y se guarda para la parte de RRV de esta prueba, si es necesario. De forma alternativa, se puede preparar una placa separada y se puede congelar la placa para el ensayo de RRV. Después de que se observe el ECP máximo, se tiñen las placas viables con tinte rojo neutro. Se cuantifica el contenido de tinte incorporado como se describe anteriormente. Los datos generados a partir de esta parte de la prueba son valores de EC50, CC50 e SI de rojo neutro. Los compuestos que se ha observado anteriormente que son activos se evalúan adicionalmente mediante el ensayo de RRV. La prueba de RRV es una determinación directa de cuánto inhibe el compuesto de prueba la replicación del virus. Se titula el virus que se replicó en presencia del compuesto de prueba y se compara con el virus de los controles infectados no tratados. La titulación de muestras víricas agrupadas (recogidas como se describe anteriormente) se realiza mediante dilución de punto final. Esto se logra titulando diluciones log10 de virus usando 3 o 4 micropocillos por dilución en monocapas recién preparadas de células por dilución de punto final. Se puntúan los pocillos en función de la presencia o ausencia de virus después de que se observe un ECP distintivo (medido por la captación de rojo neutro). Trazar el log10 de la concentración de inhibidor frente al log10 de virus producido a cada concentración permite calcular la concentración efectiva al 90 % (un log10) mediante regresión lineal. Al dividir la EC90 por la CC50 obtenida en la parte 1 del ensayo, se obtiene el valor de SI para esta prueba.
Ejemplo 153.
(2) Ensayos de detección del virus de la fiebre de Lassa (LASV)
Ensayo principal del virus de la fiebre de Lassa. Se preparan monocapas de cultivo celular confluentes o casi confluentes en placas de cultivo celular desechables de 12 pocillos. Se mantienen las células en DMEM complementado con FBS al 10 %. Para los ensayos antivíricos, se usa el mismo medio pero con FBS reducido al 2 % o menos y complementado con penicilina/estreptomicina al 1 %. Se prepara el compuesto de prueba a cuatro concentraciones log10 finales, normalmente 0,1, 1,0, 10 y 100 pg/ml o pM. El control vírico y el control celular se ejecutarán en paralelo a cada compuesto sometido a prueba. Además, se somete a prueba un fármaco activo conocido como fármaco de control positivo usando la misma configuración experimental que se describe para el control vírico y celular. El control positivo se somete a prueba con cada serie de pruebas. El ensayo se establece retirando primero el medio de crecimiento de las placas de células de 12 pocillos e infectando las células con 0,01 MOI de la cepa Josiah del LASV. Se incubarán las células durante 90 min: 500 pl de inóculo/pocillo M12, a 37 °C, 5 % de CO2 con oscilación suave constante. Se retirarán los inóculos y se lavarán las células 2 veces con medio. A continuación, se aplica el compuesto de prueba en 1 ml de volumen total de medio. Se recogerá el sobrenadante del cultivo tisular (SCT) en los puntos de tiempo apropiados. A continuación, se usará el SCT para determinar el efecto inhibidor de los compuestos sobre la replicación del virus. Se titula el virus que se replicó en presencia del compuesto de prueba y se compara con el virus de los controles infectados no tratados. Para la titulación de SCT, se prepararán diluciones sucesivas 1:10 y se usarán para infectar monocapas recién preparadas de células. Se cubrirán las células con agarosa al 1 % mezclada 1:1 con 2X MEM complementado con FBS al 10 % y penicilina al 1 %, y se determinará el número de calvas. Trazar el log10 de la concentración de inhibidor frente al log10 de virus producido a cada concentración permite calcular la concentración efectiva al 90 % (un log10) mediante regresión lineal.
Ensayo secundario del virus de la fiebre de Lassa. El ensayo secundario implica una metodología similar a la descrita en los párrafos previos usando placas de células de 12 pocillos. En esta sección se indican las diferencias. Se infectan las células como se describe anteriormente, pero esta vez se cubren con agarosa al 1 % diluida 1:1 con 2X MEM y complementada con FBS al 2 % y penicilina/estreptomicina al 1 % y complementada con la concentración de fármaco correspondiente. Se incubarán las células a 37 °C con 5 % de CO2 durante 6 días. A continuación, se retira la cubierta y se tiñen las placas con violeta cristal al 0,05 % en formol tamponado al 10 % durante aproximadamente veinte minutos a temperatura ambiente. A continuación, se lavan las placas, se secan y se hace un recuento del número de calvas. El número de calvas en cada conjunto de dilución de compuesto se convierte a un porcentaje con respecto al control vírico sin tratar. A continuación, se calculan las concentraciones eficaces al 50 % (EC50, inhibidora de virus) mediante análisis de regresión lineal.
Ejemplo 154.
(3) Ensayos de detección del virus del Ébola (EBOV) y el virus de Nipah (NIV)
Ensayo principal del virus del Ébola/Nipah. Se realizan ensayos de reducción de calvas a cuatro concentraciones. Se preparan monocapas de cultivo celular confluentes o casi confluentes en placas de cultivo celular desechables de 12 pocillos. Se mantienen las células en DMEM complementado con FBS al 10 %. Para los ensayos antivíricos, se usa el mismo medio pero con FBS reducido al 2 % o menos y complementado con penicilina/estreptomicina al 1 %. Se prepara el compuesto de prueba a cuatro concentraciones log10 finales, normalmente 0,1, 1,0, 10 y 100 pg/ml o pM. El control vírico y el control celular se ejecutarán en paralelo a cada compuesto sometido a prueba. Además, se somete a prueba un fármaco activo conocido como fármaco de control positivo usando la misma configuración experimental que se describe para el control vírico y celular. El control positivo se somete a prueba con cada serie de pruebas. El ensayo se establece retirando primero el medio de crecimiento de las placas de células de 12 pocillos. A continuación, el compuesto de prueba se aplica a los pocillos en un volumen de 0,1 ml a una concentración 2X. El virus, normalmente a aproximadamente 200 unidades formadoras de calvas en un volumen de 0,1 ml, se coloca en los pocillos designados para la infección por virus. Se coloca medio desprovisto de virus en los pocillos de control de toxicidad y en los pocillos de control celular. Los pocillos de control vírico se tratan de forma similar con virus. Se incuban las placas a 37 °°C con 5 % de CO2 durante una hora. Se retirarán los inóculos de compuestos de virus, se lavarán las células y se cubrirán con tragacanto al 1,6 % diluido 1:1 con 2X MEM y complementado con FBS al 2 % y penicilina/estreptomicina al 1 % y complementado con la concentración de fármaco correspondiente. Se incubarán las células a 37 °°C con 5 % de CO2 durante 10 días. A continuación, se retira la cubierta y se tiñen las placas con violeta cristal al 0,05 % en formol tamponado al 10 % durante aproximadamente veinte minutos a temperatura ambiente. A continuación, se lavan las placas, se secan y se hace un recuento del número de calvas. El número de calvas en cada conjunto de dilución de compuesto se convierte a un porcentaje con respecto al control vírico sin tratar. A continuación, se calculan las concentraciones eficaces al 50 % (EC50, inhibidora de virus) mediante análisis de regresión lineal.
Ensayo secundario del virus del Ébola/Nipah con componente de RRV. El ensayo secundario implica una metodología similar a la descrita en los párrafos previos usando placas de células de 12 pocillos. En esta sección se indican las diferencias. Se someten a prueba ocho concentraciones semilogarítmicas de inhibidor para determinar la actividad antivírica. Se somete a prueba un fármaco de control positivo por lote de compuestos evaluados. Para este ensayo, se infectan las células con virus. Se infectan las células como se describe anteriormente, pero esta vez se incuban con DMEM complementado con FBS al 2 % y penicilina/estreptomicina al 1 % y complementada con la concentración de fármaco correspondiente. Se incubarán las células durante 10 días a 37 °C con 5 % de CO2 , observando todos los días bajo el microscopio el número de células fluorescentes verdes. Se tomarán diariamente alícuotas de sobrenadante de las células infectadas y se agrupan los tres pocillos replicados. A continuación, se usan los sobrenadantes combinados para determinar el efecto inhibidor de los compuestos sobre la replicación del virus. Se titula el virus que se replicó en presencia del compuesto de prueba y se compara con el virus de los controles infectados no tratados. Para la titulación de muestras víricas agrupadas, se prepararán diluciones sucesivas 1:10 y se usarán para infectar monocapas recién preparadas de células. Se cubren las células con tragacanto y se determina el número de calvas. Trazar el log10 de la concentración de inhibidor frente al log10 de virus producido a cada concentración permite calcular la concentración efectiva al 90 % (un log10) mediante regresión lineal.
Ejemplo 155.
Ensayo de citoprotección contra el virus del Dengue:
Preparación de las células: se pasaron células BHK21 (células renales de hámster dorado sirio, n.° de catálogo ATCC CCL-I 0), células Vero (células renales de mono verde africano, n.° de catálogo ATCC CCL-81) o células Huh-7 (carcinoma hepatocelular humano) en DMEM complementado con FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina en matraces T-75 antes de su uso en el ensayo antivírico. El día anterior al ensayo, se dividieron las células 1:2 para asegurarse de que estaban en una fase de crecimiento exponencial en el momento de la infección. La cuantificación de la viabilidad y las células totales se realizó usando un hemocitómetro y exclusión con tinte azul tripano. La viabilidad celular fue mayor de un 95 % para las células que se utilizarían en el ensayo. Se resuspendieron las células a 3 x 103 (5 x 105 para células Vero y células Huh-7) células por pocillo en medio de cultivo tisular y se añadieron a placas de microtitulación de fondo plano en un volumen de 100 pl. Se incubaron las placas a 37 °C/5 % de CO2 durante la noche para permitir la adherencia de las células. Se observó que las monocapas tenían aproximadamente un 70 % de confluencia.
Preparación del virus: se obtuvo la cepa C de Nueva Guinea del virus del Dengue tipo 2 del ATCC (n.° de catálogo VR-1584) y se cultivó en células LLC-MK2 (células renales de macaco de la India; n.° de catálogo CCL7.1) para la producción de reservas de virus madre. Se sacó del congelador (-80 °C) una alícuota de virus previamente titulada en células BHK21 y se dejó descongelar lentamente a temperatura ambiente en una cabina de seguridad biológica. Se resuspendió el virus y se diluyó en medio de ensayo (DMEM complementado con FBS inactivado por calor al 2 %, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina) de modo que la cantidad de virus añadida a cada pocillo en un volumen de 100 pl fuera la cantidad determinada para proporcionar de un 85 a un 95 % de muerte celular 6 días después de la infección.
Formato de placas: cada placa contiene pocillos de control celular (solo células), pocillos de control vírico (células más virus), pocillos de toxicidad de fármaco triplicados por compuesto (células más fármaco solo), así como pocillos experimentales triplicados (fármaco más células más virus).
Eficacia y toxicidad XTT: después de la incubación a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 %, se tiñeron las placas de prueba con el tinte de tetrazolio XTT (2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamino)carbonil]-2H-tetrazolio hidróxido). El tetrazolio del XTT fue metabolizado por las enzimas mitocondriales de las células metabólicamente activas para dar un producto de formazán soluble, lo que permitió un análisis cuantitativo rápido de la inhibición de la muerte celular inducida por virus mediante sustancias de prueba antivíricas. La solución de XTT se preparó diariamente como una solución madre de 1 mg/ml en RPMI 1640. Se preparó una solución de metosulfato de fenacina (PMS) a 0,15 mg/ml en PBS y se almacenó en oscuridad a -20 °C. Se preparó solución madre de XTT/PMS inmediatamente antes de su uso mediante la adición de 40 pl de PMS por ml de solución de XTT. Se añadieron cincuenta microlitros de XTT/PMS a cada pocillo de la placa y se volvió a incubar la placa durante 4 horas a 37 °C. Se sellaron las placas con selladores de placas adhesivos y se agitaron suavemente o se invirtieron varias veces para mezclar el producto de formazán soluble y se leyó la placa espectrofotométricamente a 450/650 nm con un lector de placas Vmax de Molecular Devices.
Análisis de datos: se recopilaron datos sin procesar del software Softmax Pro 4.6 y se importaron a una hoja de cálculo de Microsoft Excel para su análisis. Se calculó el porcentaje de reducción del efecto citopático vírico en comparación con los controles víricos no tratados para cada compuesto. Se calculó el valor de control celular en porcentaje para cada compuesto comparando las células no infectadas tratadas con fármaco con las células no infectadas en medio solo.
Ejemplo 156.
Ensayo de citoprotección contra el RSV:
Preparación de las células: se pasaron células HEp2 (células epiteliales humanas, n.° de catálogo A TCC CCL-23) en DMEM complementado con FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina, piruvato sódico 1 mM y NEAA 0,1 mM en matraces T-75 antes de su uso en el ensayo antivírico. El día anterior al ensayo, se dividieron las células 1:2 para asegurarse de que estaban en una fase de crecimiento exponencial en el momento de la infección. La cuantificación de la viabilidad y las células totales se realizó usando un hemocitómetro y exclusión con tinte azul tripano. La viabilidad celular fue mayor de un 95 % para las células que se utilizarían en el ensayo. Se resuspendieron las células a 1 x 104 células por pocillo en medio de cultivo tisular y se añadieron a placas de microtitulación de fondo plano en un volumen de 100 pL. Se incubaron las placas a 37 °C/5 % de CO2 durante la noche para permitir la adherencia de las células. Preparación del virus: se obtuvo la cepa Long de RSV y la cepa 9320 de RSV de ATCC (n.° de catálogo VR-26 y n.° de catálogo VR-955, respectivamente) y se cultivaron en células HEp2 para la producción de reservas de virus madre. Se sacó del congelador (-80 °C) una alícuota de virus previamente titulada y se dejó descongelar lentamente a temperatura ambiente en una cabina de seguridad biológica. Se resuspendió el virus y se diluyó en medio de ensayo (DMEM complementado con FBS inactivado por calor al 2 %, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, piruvato sódico 1 mM y NEAA 0,1 mM) de modo que la cantidad de virus añadida a cada pocillo en un volumen de 100 pl fuera la cantidad determinada para proporcionar de un 85 a un 95 % de muerte celular 6 días después de la infección. Eficacia y toxicidad: se tiñeron las placas XTT y se analizaron como se describe previamente para el ensayo de citoprotección contra el virus del Dengue.
Ejemplo 157.
Ensayo de citoprotección contra el virus de la gripe:
Preparación de las células: se pasaron células MOCK (células renales caninas, n.° de catálogo ATCC CCL-34) en DMEM complementado con FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, piruvato sódico 1 mM y NEAA 0,1 mM en matraces T-75 antes de su uso en el ensayo antivírico. El día anterior al ensayo, se dividieron las células 1:2 para asegurarse de que estaban en una fase de crecimiento exponencial en el momento de la infección. La cuantificación de la viabilidad y las células totales se realizó usando un hemocitómetro y exclusión con tinte azul tripano. La viabilidad celular fue mayor de un 95 % para las células que se utilizarían en el ensayo. Se resuspendieron las células a 1 x 104 células por pocillo en medio de cultivo tisular y se añadieron a placas de microtitulación de fondo plano en un volumen de 100 pl. Se incubaron las placas a 37 °C/5 % de CO2 durante la noche para permitir la adherencia de las células.
Preparación del virus: se obtuvieron cepas de gripe A/PR/8/34 (ATCC n.° VR-95), A/CA/05/09 (CDC), A/NY/18/09 (CDC) y A/NWS/33 (ATCC n.° VR-219) de ATCC o del Centro de Control de Enfermedades de EE. UU. y se cultivaron en células MDCK para la producción de reservas de virus madre. Se sacó del congelador (-80 °C) una alícuota de virus previamente titulada y se dejó descongelar lentamente a temperatura ambiente en una cabina de seguridad biológica. Se resuspendió el virus y se diluyó en medio de ensayo (DMEM complementado con BSA al 0,5 %, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, piruvato sódico 1 mM, NEAA 0,1 mM y 1 pg/ml de tripsina tratada con TPCK) de modo que la cantidad de virus añadida a cada pocillo en un volumen de 100 pl fue la cantidad determinada para proporcionar 85 a 95 % de muerte celular 4 días después de la infección. Eficacia y toxicidad: se tiñeron las placas XTT y se analizaron como se describe previamente para el ensayo de citoprotección contra el virus del Dengue.
Ejemplo 158.
Ensayo contra el virus de la hepatitis C:
Cultivo celular: se obtuvo la línea celular indicadora Huh-luc/neo-ET del Dr. Ralf Bartenschlager (Departamento de Virología Molecular, Instituto de Higiene, Universidad de Heidelberg, Alemania) por ImQuest BioSciences a través de un acuerdo de licencia específico. Esta línea celular alberga el replicón l389luc-ubi-neo/NS3-3'/ET de replicación persistente que contiene la proteína de fusión del gen luciferasa de luciérnaga-ubiquitina-neomicina fosfotransferasa y secuencias codificantes de VHC NS3-5B impulsadas por EMCV IRES que contienen las mutaciones adaptativas de cultivo tisular ET (E1202G, Tl2081 y K1846T). Se expandió un cultivo madre de Huhluc/neo-ET mediante cultivo en DMEM complementado con FCS al I 0 %, glutamina 2 mM, penicilina (100 pU/ml)/estreptomicina (100 pg/ml) y I X aminoácidos no esenciales más 1 mg/ml de G418. Se dividieron las células 1:4 y se cultivaron durante dos pases en el mismo medio más 250 pg/ml de G418. Se trataron las células con tripsina y se enumeraron por tinción con azul tripano y se sembraron en placas de cultivo tisular de 96 pocillos a una densidad de cultivo celular de 7,5 x 103 células por pocillo y se incubaron a 37 °C con 5 % de CO2 durante 24 horas. Después de 24 horas de incubación, se retiró el medio y se reemplazó con el mismo medio menos el G418 más los compuestos de prueba por triplicado. Seis pocillos de cada placa recibieron medio solo como control sin tratamiento. A continuación, se incubaron las células 72 horas adicionales a 37 °C con 5 % de CO2 , y se midió la actividad anti-VHC por punto final de la luciferasa. Se trataron placas duplicadas y se incubaron en paralelo para evaluar la toxicidad celular mediante tinción con XTT.
Viabilidad celular: se tiñeron las monocapas de cultivo celular de las células tratadas con el tinte de tetrazolio XTT para evaluar la viabilidad celular de la línea celular indicadora Huh-luc/neo-ET en presencia de los compuestos.
Medición de la replicación del virus: se midió la replicación del VHC a partir del sistema de ensayo de replicón mediante la actividad luciferasa usando el kit del gen indicador de luminiscencia Britelite plus de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Perkin Elmer, Shelton, CT). En resumen, se solubilizó un vial de sustrato liofilizado Britelite plus en 10 ml de tampón de reconstitución Britelite y se mezcló suavemente por inversión. Después de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente, se añadió el reactivo Britelite plus a las placas de 96 pocillos a 100 pl por pocillo. Se sellaron las placas con una película adhesiva y se incubaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos para lisar las células. El contenido de los pocillos se transfirió a una placa blanca de 96 pocillos y se midió la luminiscencia en los siguientes 15 minutos usando el contador de centelleo líquido Wallac 1450 Microbeta Trilux. Se importaron los datos a una hoja de cálculo personalizada de Microsoft Excel 2007 para determinar la concentración de inhibición al 50 % del virus (EC50).
Ejemplo 159.
Ensayo de citoprotección contra el virus paragripal 3:
Preparación de las células: se pasaron células HEp2 (células epiteliales humanas, n.° de catálogo ATCC CCL-23) en DMEM complementado con FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, piruvato sódico 1 mM y NEAA 0,1 mM en matraces T-75 antes de su uso en el ensayo antivírico. El día anterior al ensayo, se dividieron las células 1:2 para asegurarse de que estaban en una fase de crecimiento exponencial en el momento de la infección. La cuantificación de la viabilidad y las células totales se realizó usando un hemocitómetro y exclusión con tinte azul tripano. La viabilidad celular fue mayor de un 95 % para las células que se utilizarían en el ensayo. Se resuspendieron las células a 1 x 104 células por pocillo en medio de cultivo tisular y se añadieron a placas de microtitulación de fondo plano en un volumen de 100 pl. Se incubaron las placas a 37 °C/5 % de CO2 durante la noche para permitir la adherencia de las células.
Preparación del virus: se obtuvo la cepa SF4 del virus paragripal tipo 3 de ATCC (n.° de catálogo VR-281) y se cultivó en células HEp2 para la producción de reservas de virus madre. Se sacó del congelador (-80 °C) una alícuota de virus previamente titulada y se dejó descongelar lentamente a temperatura ambiente en una cabina de seguridad biológica. Se resuspendió el virus y se diluyó en medio de ensayo (DMEM complementado con FBS inactivado por calor al 2 %, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina) de modo que la cantidad de virus añadida a cada pocillo en un volumen de 100 pl fuera la cantidad determinada para proporcionar de un 85 a un 95 % de muerte celular 6 días después de la infección.
Formato de placas: cada placa contiene pocillos de control celular (solo células), pocillos de control vírico (células más virus), pocillos de toxicidad de fármaco triplicados por compuesto (células más fármaco solo), así como pocillos experimentales triplicados (fármaco más células más virus). Eficacia y toxicidad XTT: después de la incubación a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 %, se tiñeron las placas de prueba con el tinte de tetrazolio XTT (2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamino)carbonil]-2H-tetrazol hidróxido). El tetrazolio del XTT fue metabolizado por las enzimas mitocondriales de las células metabólicamente activas para dar un producto de formazán soluble, lo que permitió un análisis cuantitativo rápido de la inhibición de la muerte celular inducida por virus mediante sustancias de prueba antivíricas. La solución de XTT se preparó diariamente como una solución madre de 1 mg/ml en RPMI 1640. Se preparó una solución de metosulfato de fenacina (PMS) a 0,15 mg/ml en PBS y se almacenó en oscuridad a -20 °C. Se preparó solución madre de XTT/PMS inmediatamente antes de su uso mediante la adición de 40 pl de PMS por ml de solución de XTT. Se añadieron cincuenta microlitros de XTT/PMS a cada pocillo de la placa y se volvió a incubar la placa durante 4 horas a 37 °C. Se sellaron las placas con selladores de placas adhesivos y se agitaron suavemente o se invirtieron varias veces para mezclar el producto de formazán soluble y se leyó la placa espectrofotométricamente a 450/650 nm con un lector de placas Vmax de Molecular Devices.
Análisis de datos: se recopilaron datos sin procesar del software Softmax Pro 4.6 y se importaron a una hoja de cálculo de Microsoft Excel para su análisis. Se calculó el porcentaje de reducción del efecto citopático vírico en comparación con los controles víricos no tratados para cada compuesto. Se calculó el valor de control celular en porcentaje para cada compuesto comparando las células no infectadas tratadas con fármaco con las células no infectadas en medio solo.
Ejemplo 160.
Ensayo de inhibición de la polimerasa de la gripe:
Preparación del virus: se obtuvo el virus de la gripe A/PR/8/34 purificado (1 ml) de Advanced Biotechnologies, Inc. (Columbia, MD), se descongeló y se dispensó en cinco alícuotas para su almacenamiento a -80 °C hasta su uso. El día de la preparación del ensayo, se añadieron 20 pl de Triton N-101 al 2,5 % a 180 pl de virus purificado. Se diluyó 1:2 el virus alterado en una solución que contenía Triton al 0,25 % y PBS. La alteración proporcionó la fuente de ribonucleoproteína (RNP) de la gripe que contiene la ARN polimerasa dependiente del ARN de la gripe y el ARN molde. Se almacenaron las muestras en hielo hasta su uso en el ensayo.
Reacción de la polimerasa: cada reacción de la polimerasa de 50 pl contenía lo siguiente: 5 pl de la RNP alterada, Tris-HCl 100 mM (pH 8,0), KCl 100 mM, MgCb 5 mM. Ditiotreitol 1 mM, Triton N-101 al 0,25 %, 5 pCi de [a-32P]-GTP, ATP 100 pM, (CTP, UTP) 50 pM cada uno, GTP 1 pM y adenil (3'-5')guanosina 200 pM. Para someter a prueba el inhibidor, las reacciones contenían el inhibidor y lo mismo se hizo para las reacciones que contenían el control positivo (2'-desoxi-2'-fluoroguanosina-5'-trifosfato). Otros controles incluyeron RNP mezcla de reacción y RNP DMSO al 1 %. Se incubó la mezcla de reacción sin el cebador ApG y los NTP a 30 °C durante 20 minutos. Una vez que se añadieron el ApG y los NTP a la mezcla de reacción, se incubaron las muestras a 30 °C durante 1 hora y, a continuación, seguido inmediatamente de la transferencia de la reacción a placas de filtro de fibra de vidrio y la posterior precipitación con ácido tricloroacético (TCA) al 10 %. A continuación, se lavó la placa cinco veces con TCA al 5 %, seguido de un lavado con etanol al 95 %. Una vez que el filtro se hubo secado, se midió la incorporación de [a-32P]-GTP usando un contador de centelleo líquido (Microbeta).
Formato de placas: cada placa de prueba contenía muestras por triplicado de los tres compuestos (6 concentraciones), además de muestras por triplicado de RNP mezcla de reacción (RNP solo), RNP DMSO al 1 % y mezcla de reacción sola (sin RNP).
Análisis de datos: se recopilaron los datos son procesar del contador de centelleo Microbeta. La incorporación de GTP radiactivo se correlaciona directamente con los niveles de actividad polimerasa. Se obtuvieron los "valores de inhibición en porcentaje" dividiendo el valor medio de cada compuesto de prueba por el control de RNP DMSO al 1 %. Se comparó la media obtenida a cada concentración de 2DFGTP con el control de RNP reacción. A continuación, se importaron los datos a una hoja de cálculo Microsoft Excel para calcular los valores de IC50 mediante análisis de regresión lineal.
Ejemplo 161.
Ensayo de inhibición de la polimerasa del VHC:
Se evaluó la actividad de los compuestos para la inhibición de la polimerasa del VHC usando procedimientos previamente descritos (Lam et al. 2010. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 54(8):3187-3196). Los ensayos de polimerasa de VHC NS5B se realizaron en volúmenes de 20 pl en placas de reacción de 96 pocillos. Cada reacción contenía 40 ng/pl de polimerasa NS5B22 de genotipo-1b recombinante purificada, 20 ng/pl de molde IRES complementaria del genotipo-1b del VHC, 1 pM de cada uno de los cuatro ribonucleótidos naturales, 1 U/ml de inhibidor de RNasa Optizyme (Promega, Madison, WI), MgCl2 1 mM, MnCl20,75 mM y ditiotreitol (DTT) 2 mM en tampón HEPES 50 mM (pH 7,5). Se combinaron las mezclas de reacción sobre hielo en dos etapas. La etapa 1 consistió en combinar todos los componentes de la reacción excepto los nucleótidos naturales y el uTp marcado en una mezcla de reacción de polimerasa. Se dispensaron diez microlitros (10 pl) de la mezcla de polimerasa en pocillos individuales de la placa de reacción de 96 pocillos sobre hielo. Se incluyeron mezclas de reacción de polimerasa sin polimerasa NS5B como controles sin enzima. Se prepararon diluciones semilogarítmicas sucesivas de los compuestos de prueba y de control, 2'-O-metil-CTP y 2'-O-metil-GTP (Trilink, San Diego, CA) en agua y se añadieron 5 pl de los compuestos diluidos de forma sucesiva o solo agua (sin control de compuesto) a los pocillos que contenían la mezcla de polimerasa. A continuación, se añadieron cinco microlitros de mezcla de nucleótidos (nucleótidos naturales y UTP marcado) a los pocillos de la placa de reacción y se incubó la placa a 27 °C durante 30 minutos. Se desactivaron las reacciones mediante la adición de 80 pl de solución de parada (EDTA 12,5 mM, NaCl 2,25 M y citrato de sodio 225 mM) y los productos de ARN se aplicaron a una membrana Hybond-N+ (GE Healthcare, Piscataway, NJ) bajo presión de vacío usando un aparato de inmunotransferencia por puntos. Se retiró la membrana del aparato de inmunotransferencia por puntos y se lavó cuatro veces con 4X SSC (NaCl 0,6 M y citrato de sodio 60 mM) y, a continuación, se enjuagó una vez con agua y una vez con etanol al 100 %. Se secó la membrana al aire y se expuso a una pantalla de fosfoimagen y se capturó la imagen usando un generador de imágenes Typhoon 8600 Phospho. Después de la captura de la imagen, se colocó la membrana en un casete Microbeta junto con fluido de centelleo y se realizó un recuento del CPM en cada reacción en un Microbeta 1450. Los datos de CPM se importaron a una hoja de cálculo Excel personalizada para la determinación de las IC50 de los compuestos.
Ejemplo 162.
Condiciones de reacción de la ARN polimerasa dependiente de ARN NS5B
Se sometieron a ensayo los compuestos para determinar la inhibición de NS5B-621 de GT-1b Con-1 de VHC. Las reacciones incluyeron enzima recombinante purificada, molde de ARN IRES del VHC de cadena negativa 1 U/pl y sustratos de NTP 1 pM que incluían [32P]-CTP o [32P]-UTP. Se incubaron las placas de ensayo a 27 °C durante 1 hora antes de desactivarlas. Se evaluó la incorporación de [32P] en el producto macromolecular mediante la unión al filtro.
Ejemplo 163.
Ensayo de inhibición de ADN polimerasas humanas:
Las ADN polimerasas humanas alfa (n.° de catálogo 1075), beta (n.° de catálogo 1077) y gamma (n.° de catálogo 1076) se adquirieron de CHIMERx (Madison, WI). La inhibición de la actividad beta y gamma ADN polimerasa se sometió a ensayo en placas de microtitulación en una mezcla de reacción de 50 ul que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 8,7), KCl (10 mM para beta y 100 mM para gamma), MgCl210 mM, 0,4 mg/ml de BSA, DTT 1 mM, glicerol al 15 %, 0,05 mM de dCTP, dTTP y dATP, 10 uCi de [32P]-alfa-dGTP (800 Ci/mmol), 20 ug de ADN de timo de ternera activado y el compuesto de prueba a las concentraciones indicadas. La mezcla de reacción de la alfa ADN polimerasa fue como sigue en un volumen de 50 ul por muestra: Tris-HCl 20 mM (pH 8), acetato de magnesio 5 mM, 0,3 mg/ml de BSA, DTT 1 mM, espermina 0,1 mM, 0,05 mM de dCTP, dTTP y dATp, 10 uCi de [32P]-alfa-dGTP (800 Ci/mmol), 20 ug de ADN de timo de ternera activado y el compuesto de prueba a las concentraciones indicadas. Para cada ensayo, se dejó que las reacciones enzimáticas prosiguieran durante 30 minutos a 37 °C, seguido de la transferencia a placas de filtro de fibra de vidrio y posterior precipitación con ácido tricloroacético (TCA) al 10 %. A continuación, se lavó la placa con TCA al 5 %, seguido de un lavado con etanol al 95 %. Una vez que el filtro se hubo secado, se midió la incorporación de radiactividad usando un contador de centelleo líquido (Microbeta).
Ejemplo 164.
Ensayo de PBMC infectados por VIH:
Se obtuvieron leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) humanos frescos de una fuente comercial (Biological Specialty) y se determinó que eran seronegativos para VIH y VHB. Dependiendo del volumen de sangre de donante recibido, los glóbulos sanguíneos leucoforetizados se lavaron varias veces con PBS. Después del lavado, se diluyó la sangre leucoforetizada 1:1 con solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco y se colocó en capas sobre 15 ml de gradiente de densidad Ficoll-Hypaque en un tubo de centrífuga cónico de 50 ml. Estos tubos se centrifugaron durante 30 min a 600 x g. Los PBMC en bandas se aspiraron suavemente de la interfase resultante y se lavaron tres veces con PBS. Después del lavado final, se determinó el número de células mediante exclusión del tinte azul tripano y se resuspendieron las células a 1 x 10A6 células/ml en RPMI 1640 con suero fetal bovino (FBS) al 15 %, 2 mmol/l de L-glutamina, 2 ug/ml de PHA-P, 100 U/ml de penicilina y 100 ug/ml de estreptomicina y se dejó incubar durante 48-72 horas a 37 °C. Después de la incubación, se centrifugaron los PBMC y se resuspendieron en medio de cultivo tisular. Se mantuvieron los cultivos hasta su uso mediante cambios de cultivo de medio volumen con medio de cultivo tisular fresco que contenía IL-2 cada 3 días. Los ensayos se iniciaron con PBMC a las 72 horas después de la estimulación con PHA-P.
Para minimizar los efectos debidos a la variabilidad del donante, los PBMC empleados en el ensayo eran una mezcla de células derivadas de 3 donantes. Inmediatamente antes de su uso, se resuspendieron las células diana en medio de cultivo tisular fresco a 1 x 10A6 células/ml y se sembraron en los pocillos interiores de una placa de microtitulación de fondo redondo de 96 pocillos a 50 ul/pocillo. A continuación, se transfirieron 100 ul de concentraciones 2X de medio que contenía el compuesto a la placa de 96 pocillos que contenía las células en 50 ul del medio. Se empleó AZT como estándar interno del ensayo.
Después de la adición del compuesto de prueba a los pocillos, se añadieron 50 ul de una dilución predeterminada de virus VIH (preparada a partir de 4X de la concentración final deseada en el pocillo) y se mezcló bien. Para la infección, se añadieron 50-150 TCID50 de cada virus por pocillo (MOI final aproximadamente 0,002). Los PBMC se expusieron por triplicado al virus y se cultivaron en presencia o ausencia del material de prueba a concentraciones variables como se describe anteriormente en las placas de microtitulación de 96 pocillos. Después de 7 días en cultivo, se cuantificó la replicación del VIH-1 en el sobrenadante del cultivo tisular midiendo la actividad retrotranscriptasa (RT). Los pocillos con células y virus solo sirvieron como controles víricos. Se prepararon de forma idéntica placas separadas sin virus para los estudios de citotoxicidad de fármaco.
Ensayo de actividad retrotranscriptasa: se midió la actividad retrotranscriptasa en sobrenadantes libres de células usando un ensayo de polimerización por incorporación radiactiva estándar. Se adquirió trifosfato de timidina tritiado (TTP; New England Nuclear) a 1 Ci/ml y se usó 1 ul por reacción enzimática. Se preparó una solución madre de rAdT mezclando 0,5 mg/ml de poli rA y 1,7 U/ml de oligo-dT en agua destilada y se almacenó a -20 °C. El tampón de reacción de RT se preparó diariamente y consiste en 125 ul de EGTA 1 mol/l, 125 ul de dH2O, 125 ul de Triton X-100 al 20 %, 50 ul de Tris 1 mol/l (pH 7,4), 50 ul de DTT 1 mol/l y 40 ul de MgCb 1 mol/l. Para cada reacción, se mezclaron 1 ul de TTP, 4 ul de dH2O, 2,5 ul de rAdT y 2,5 ul de tampón de reacción. Se colocaron diez microlitros de esta mezcla de reacción en una placa de microtitulación de fondo redondo y se añadieron y mezclaron 15 ul de sobrenadante que contenía virus. Se incubó la placa a 37 °C en una incubadora humidificada durante 90 minutos. Después de la incubación, se colocaron 10 ul del volumen de reacción sobre una estera filtrante de DEAE en el formato de placa apropiado, se lavaron 5 veces (5 minutos cada una) en un tampón de fosfato de sodio al 5 %, 2 veces (1 minuto cada una) en agua destilada, 2 veces (1 minuto cada una) en etanol al 70 %, y, a continuación, se secaron al aire. La estera filtrante seca se colocó en una funda de plástico y se añadieron 4 ml de Opti-Fluor O a la funda. Se cuantificó la radiactividad incorporada utilizando un contador de centelleo líquido Wallac 1450 Microbeta Trilux.
Ejemplo 165.
VHB:
Se añadieron células HepG2/2/15 (100 pL) en medio RPMI 1640 con suero fetal bovino al 10 % a todos los pocillos de una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 x 104 células por pocillo y se incubó la placa a 37 °C en un entorno con 5 % de CO2 durante 24 horas. Después de la incubación, a los pocillos individuales de la placa se añadieron por triplicado seis diluciones sucesivas 1:10 del compuesto de ensayo preparadas en medio RPMI 1640 con suero fetal bovino al 10 %. Seis pocillos de la placa recibieron medio solo como control de virus solo. Se incubó la placa durante 6 días a 37 °C en un entorno con 5 % de CO2. El día 3, se cambió el medio de cultivo por un medio que contenía la concentración indicada de cada compuesto. Se recogieron cien microlitros de sobrenadante de cada pocillo para el análisis del ADN vírico mediante qPCR y se evaluó la citotoxicidad mediante tinción con XTT de la monocapa de cultivo celular en el sexto día.
Se diluyeron diez microlitros de sobrenadante de cultivo celular recogidos el sexto día en tampón de dilución de qPCR (40 pg/ml de ADN de esperma de salmón cortado) y se hirvieron durante 15 minutos. Se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real en placas de 386 pocillos usando un sistema de detección de secuencias Applied Biosystems 7900HT y el software de soporte s Ds 2.4. Cinco microlitros (5 pl) de ADN hervido para cada muestra y diluciones 1:10 sucesivas de un estándar de ADN cuantitativo se sometieron a Q-PCR en tiempo real usando Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG (Invitrogen) y cebadores de oligonucleótidos de ADN específicos (IDT, Coralville, ID) HBV-AD38-qF1 (5'-CCG TCT GTG CCT TCT CAT CTG-3'), HBV-AD38-qR1 (5'-AGT CCA AGA GTY CTC TTA TRY AAG ACC TT-3') y HBV-AD38-qP1 (5'-FAM CCG TGT GCA /ZEN/CTT CGC TTC ACC TCT GC-3'BHQ1) a una concentración final de 0,2 pM para cada cebador en un volumen de reacción total de 15 pl. Se interpoló el número de copias de ADN de v Hb en cada muestra a partir de la curva estándar mediante el software s Ds .24 y se importaron los datos a una hoja de cálculo de Excel para su análisis.
La concentración citotóxica del 50 % para los materiales de prueba se obtiene midiendo la reducción del tinte de tetrazolio XTT en las placas de cultivo tisular tratadas. El XTT es metabolizado por la enzima mitocondrial NADPH oxidasa para dar un producto de formazán soluble en células metabólicamente activas. Se preparó diariamente la solución de XTT como una solución madre de 1 mg/ml en PBS. Se preparó una solución madre de metosulfato de fenacina (PMS) a 0,15 mg/ml en PBS y se almacenó en oscuridad a -20 °C. Se preparó la solución de XTT/PMS inmediatamente antes de su uso mediante la adición de 40 pl de PMS por 1 ml de solución de XTT. Se añadieron cincuenta microlitros de XTT/PMS a cada pocillo de la placa y se incubó la placa durante 2-4 horas a 37 °C. Se ha determinado empíricamente que la incubación durante 2-4 horas está dentro del intervalo de respuesta lineal para la reducción del tinte XTT con el número de células indicado para cada ensayo.Se usaron selladores de placas adhesivos en lugar de las tapas, la placa sellada se invirtió varias veces para mezclar el producto de formazán soluble y se leyó la placa a 450 nm (longitud de onda de referencia de 650 nm) con un espectrofotómetro SpectraMax Plus 384 de Molecular Devices. Se recogieron los datos con el software Softmax 4.6 y se importaron a una hoja de cálculo Excel para su análisis.
Ejemplo 166.
Condiciones de reacción de la ARN polimerasa dependiente de ARN del Dengue
El ensayo de ARN polimerasa se realizó a 30 °C usando 100 pl de mezcla de reacción en un tubo de 1,5 ml. Las condiciones de reacción finales fueron Hepes 50 mM (pH 7,0), DTT 2 mM, MnCl21 mM, KCl 10 mM, UTR-Poli A 100 nM (cebador de autohibridación), UTP 10 pM, enzima RdRp 26 nM. Se incubó la mezcla de reacción con diferentes compuestos (inhibidores) a 30 °C durante 1 hora. Para evaluar la cantidad de pirofosfato generado durante la reacción de la polimerasa, se mezclaron 30 pl de mezcla de reacción de polimerasa con una mezcla de reacción de enzima acoplada a luciferasa (70 pl). Las condiciones de reacción finales de la reacción de luciferasa fueron MgCl25 mM, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, 200 pU de ATP sulfurilasa, APS 5 pM, luciferasa 10 nM, D-luciferina 100 pM. Se transfirieron de inmediato las placas blancas que contenían las muestras de reacción (100 pl) al luminómetro Veritas (Turner Biosystems, CA) para la detección de la señal lumínica.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:
Figure imgf000119_0001
Figure imgf000120_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
2. Un compuesto de la reivindicación 1 que es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:
Figure imgf000120_0002
o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
3. Un compuesto de la reivindicación 1 que es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:
Figure imgf000121_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
4. Un compuesto de la reivindicación 1 que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000121_0002
o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
5. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o su sal farmacéuticamente aceptable, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
6. Una composición de la reivindicación 5, que incluye también uno o más compuestos farmacéuticamente activos adicionales.
7. Una composición de la reivindicación 5 o de la reivindicación 6, que es una composición liposomal.
8. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o su sal farmacéuticamente aceptable, para su uso en tratamientos.
9. Una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, para su uso en tratamientos.
10. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, para su uso en el tratamiento de infecciones causadas por virus de ARN y ADN.
11. El compuesto o la composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que los virus de ARN y ADN son picornavirus, cardiovirus, enterovirus, erbovirus, hepatovirus, kobuvirus, parechovirus, teschovirus, calicivirus, que incluyen norovirus, sapovirus, lagovirus, vesivirus, astrovirus, togavirus, flavivirus, hepacivirus, coronavirus, arterivirus, rhabdovirus, filovirus, paramixovirus, ortomixovirus, hantavirus, reovirus, rotavirus, birnavirus, crisovirus, cistovirus, hipovirus, partitivirus, totovirus, lentivirus, poliomavirus, papilomavirus, adenovirus, circovirus, parvovirus, eritrovirus, betaparvovirus, amdovirus, densovirus, iteravirus, brevidensovirus, pefudensovirus, herpesvirus 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8, poxvirus o hepadnavirus.
12. El compuesto o la composición para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 10 u 11, en el que el compuesto o la composición se administra en combinación con al menos un segundo agente antivírico seleccionado de abacavir, aciclovir, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir, ampligen, arbidol, atazanavir, atripla, boceprevir, cidofovir, combivir, darunavir, delavirdina, didanosina, docosanol, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtida, entecavir, famciclovir, fomivirsen, fosamprenavir, foscarnet, fosfonet, ganciclovir, ibacitabina, imunovir, idoxuridina, imiquimod, indinavir, inosina, interferón tipo III, interferón tipo II, interferón tipo I, lamivudina, ledipasvir, lopinavir, loviride, maraviroc, moroxidina, metisazona, nelfinavir, nevirapina, nexavir, oseltamivir, peginterferón alfa-2a, penciclovir, peramivir, pleconaril, podofilotoxina, raltegravir, ribavirina, rimantadina, ritonavir, piramidina, saquinavir, sofosbuvir, estavudina, telaprevir, tenofovir, tenofovir disoproxilo, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valaciclovir, valganciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidina, zalcitabina, zanamivir, zidovudina, ABT 450, ABT 267, ABT 333 y combinaciones de los mismos.
13. Una composición liposomal que comprende un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o su sal farmacéuticamente aceptable, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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