CN110655546B - 索非布韦衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

索非布韦衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供如下化合物(1)所示的索非布韦衍生物或其药学上可接受的盐及其制备方法和应用。其中化合物(1)中，r选自1～5的整数，s选自1～10的整数；t选自0～20的整数；X选自O、S或SS；Y选自H、F、Cl、Br、I、C1‑6烷基、C1‑6烷氧基；所述药学上可接受的盐选自NH4、Li、Na、K、Ca或Mg。

Description

索非布韦衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及化学制药领域，具体涉及索非布韦衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
丙型肝炎病毒(HCV)感染可直接导致肝硬化及肝癌，严重威胁人类健康。世界卫生组织(WHO)调查结果显示，全球有超过2亿的人群感染丙型肝炎病毒，其中，约有20％的感染人群依靠自身免疫系统能够清除HCV病毒，而其余 HCV病毒感染人群中的HCV病毒会潜伏其余生，并导致约有10～20％的感染人群发展成肝硬化或肝癌而被夺去生命。
HCV病毒体呈球形，为单股正链RNA病毒，约含9600个编码并由3010 个氨基酸组成的多聚蛋白，其基因组排列顺序为： CE1E2/NS1NS2NS3NS4ANS4BNS 5ANS5B。HCV病毒多聚蛋白经宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用，裂解成各自独立的病毒蛋白，包括三种结构蛋白(即C， E1和E2/NS1)和四种非结构蛋白(NS2，NS3，NS4和NS5)。其中，结构蛋白E1和E2/NS1是糖蛋白，能产生抗HCV的中和作用。非结构蛋白(NS)为病毒复制提供催化结构。目前，还不清楚NS2和NS4的功能。NS3蛋白具有螺旋酶活性，参与解旋HCV-RNA分子，释放NS5B。NS5B是依赖于RNA的RNA 聚合酶，而HCV复制周期中由用作模板的单链病毒RNA合成双链RNA时就需要HCV NS5B聚合酶。因此，有效地抑制HCV-NS5B聚合酶就能阻断双链 HCV-RNA的合成，从而有效地控制HCV病毒感染。
HCV基因分型包括HCV-I～VII型7种。其中，HCV-I型病毒感染患者分布于全球各地，约占HCV感染患者的60％，且欧美国家人群为HCV-I型病毒的易感人群。亚洲国家HCV感染患者多以HCV-II型病毒感染为主，其次为HCV- III型病毒感染。其中，HCV-I型病毒感染的治疗最为困难。
利巴韦林(Ribavirin，EP0093401A1)、博赛泼维(Boceprevir， WO2002008244A2)或特拉匹韦(Telaprevir，WO2002018369A2)与聚乙二醇干扰素(alfa-2a或alfa-2b)联合用药成为急性丙型肝炎或慢性丙型肝炎的标准治疗方案，其中，约有50％的HCV感染患者对该治疗方案有应答，但其治愈率不超过50％，且干扰素治疗也为患者带来极大的痛苦。
Figure BDA0002014112710000021
索非布韦(Sofosbuvir，US20110251152A)为HCV-NS5B-RNA聚合酶抑制剂，雷迪帕韦(Ledipasvir，WO2011156757A1)为HCV-NS5A干扰素抗蛋白抑制剂。在不使用干扰素的情况下，索非布韦和利巴韦林的复方单片剂对HCV- Ⅱ～Ⅶ型感染有100％的治愈；索非布韦和雷迪帕韦的复方单片剂对HCV-I型感染有100％的治愈。
索非布韦的肝靶向代谢机理(JBio Chem 2010,285(45),34337-34347；代谢机理见图1)是依次经：(a)小肠吸收进入血浆，(b)血液循环进入丙肝靶细胞，(c) 丝氨酸蛋白酶组织蛋白酶-A(脱酰胺酶、酯酶和羧肽酶活性的溶酶体酶)促水解羧基酯键，去除异丙醇释放亚稳态代谢物(I)，(d)然后通过分子内环合去除酚基 (II)，水解成丙氨酸结合物(III)，(e)溶酶体内磷酰胺酶促化学水解去除丙氨酸得到单磷酸(IV)，(f)腺苷酸激酶磷酸化成二磷酸(V)，(g)核苷酸激酶进一步磷酸化成能抑制丙肝病毒的三磷酸(VI)。
然而，有研究表明，口服给药后索非布韦肝靶向性差，生物利用度低，因此有必要对其活性进行改进。
发明内容
为改善上述问题，本发明提供如下化合物(1)所示的索非布韦衍生物或其药学上可接受的盐，
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中，r选自1～5的整数，s选自1～10的整数；t选自0～20的整数；X选自 O、S或SS；Y选自H、F、Cl、Br、I、C1-6烷基、C1-6烷氧基；所述药学上可接受的盐选自NH4、Li、Na、K、Ca或Mg。
根据本发明的实施方案，化合物(1)中，r选自1～3的整数，s选自1～5 的整数；t选自0～17的整数；X选自O、S或SS；Y选自H、F、Cl、Br或I，条件是X为氧，s为1时，Y不为H；所述药学上可接受的盐选自NH4、Li、 Na、K、Ca或Mg；
优选地，化合物(1)中，r选自1～3的整数，s选自1～3的整数；t选自10～17 的整数；X选自O、S或SS；Y选自H、F、Cl、Br或I，条件是X为氧，s为 1时，Y不为H；所述药学上可接受的盐选自NH4、Li、Na、K、Ca或Mg。
作为实例，所述化合物(1)选自如下化合物，
Figure BDA0002014112710000032
Figure BDA0002014112710000041
作为实例，所述化合物(1)药学上可接受的盐选自如下化合物，
Figure BDA0002014112710000042
本发明还提供化合物(1)的制备方法，包括：
方案(1)
核苷(2)与磷酸脂质单酯(3)反应得到化合物(1)，
Figure BDA0002014112710000043
方案(2)
核苷(2)、化合物(4)与三氯氧磷反应得到化合物(1)，
Figure BDA0002014112710000044
方案(3)
化合物(5)、化合物(3)与化合物C反应得到化合物(1)，
Figure BDA0002014112710000051
其中，r、X、s、t、Y具有上文所述的定义；
R1选自H或羟基保护基；
当上述原料中使用保护基保护某些基团时，反应完成后还使用常规的方法脱去保护基制备得到化合物(1)；
化合物C选自三氯乙腈、甲磺酰氯、三氟甲磺酰氯、苯磺酰氯、对甲苯磺酰氯、2,4,6-三甲基苯磺酰氯中的任一种、两种或多种的组合。
根据本发明的实施方案，方案(1)中，
反应完成后还包括纯化步骤，所述纯化步骤为：将反应得到的产物使用溶剂结晶制得化合物(1)；
所述反应的温度为-20℃～150℃，优选为0℃～100℃，例如为90℃；
反应使用的溶剂可以是甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、四氢呋喃、 2-甲基四氢呋喃、二氧六环、乙二醇二甲醚、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二乙基甲酰胺、吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、 2,6-二甲基吡啶、乙腈、二甲亚砜中的一种、两种或更多种；
所述反应优选在缩合试剂的存在进行，所述缩合试剂选自N,N,-二环己基碳二亚胺、N,N,-二异丙基碳二亚胺、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐、三氯乙腈、三苯基膦-偶氮二甲酸二乙酯、三苯基膦-偶氮二甲酸二异丙酯、三苯基膦-偶氮二甲酸二叔丁酯中的一种、两种或更多种；
核苷(2)中R1可以是氢、酰基(酯)、硅基(醚)，如乙酰基、苯甲酰基、三甲基硅基、叔丁基二甲基硅基、叔丁基二苯基硅基；
核苷(2):磷酸脂质单酯(3):缩合试剂的摩尔比为1:1～5:1～10，例如可以为 1:1～2:1～5；
纯化步骤的温度为-20℃～150℃，优选为-5℃～100℃；
纯化步骤使用的溶剂可以是甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、二氧六环、乙二醇二甲醚、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、 N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二乙基甲酰胺、吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、2,6-二甲基吡啶、二甲亚砜、乙酸乙酯、醋酸异丙酯、甲基叔丁基醚、异丙醚、乙腈、丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇中的至少一种。
根据本发明的实施方案，方案(2)中，
还包括反应完成后的纯化步骤，所述纯化步骤包括：将反应完成后得到的产物进行结晶制得化合物(1)；
所述反应的温度为-20℃～150℃，优选为-5℃～50℃；
所述反应使用的溶剂可以是甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、二氧六环、乙二醇二甲醚、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、 N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二乙基甲酰胺、吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、2,6-二甲基吡啶、二甲亚砜、乙腈、磷酸三甲酯中的至少一种；
核苷(2)中，R1可以是氢、酰基(酯)、硅基(醚)，如乙酰基、苯甲酰基、三甲基硅基、叔丁基二甲基硅基、叔丁基二苯基硅基；
所述反应在碱的存在下进行，所述碱可以是三乙胺、N,N-二异丙基乙基胺、 N,N-二甲基苯胺、吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、2,6-二甲基吡啶、4-二甲基胺基吡啶中的至少一种；
核苷(2):三氯氧磷:碱:化合物(4)的摩尔比为1:1～5:1～10:1～5，例如可以为1:1～1.2:3～5:1～1.5；
纯化步骤的温度为-20℃～150℃，优选为-5℃～100℃；
纯化步骤使用的溶剂可以是甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、二氧六环、乙二醇二甲醚、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、 N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二乙基甲酰胺、吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、2,6-二甲基吡啶、二甲亚砜、乙酸乙酯、醋酸异丙酯、甲基叔丁基醚、异丙醚、乙腈、丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇中的至少一种。
根据本发明的实施方案，方案(3)中，
所述反应的温度为-20℃～150℃，例如可以为-20℃～100℃；
所述反应可以在溶剂中进行，所述溶剂可以是甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、二氧六环、乙二醇二甲醚、二氯甲烷、 1,2-二氯乙烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二乙基甲酰胺、吡啶、2-甲基吡啶、3- 甲基吡啶、4-甲基吡啶、2,6-二甲基吡啶、二甲亚砜、乙腈中的任一种、两种或更多种；
所述反应可以在碱的存在下进行，所述碱可以为三乙胺、N,N-二异丙基乙基胺、N,N-二甲基苯胺、吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、2,6-二甲基吡啶、4-二甲基胺基吡啶、四甲基氢氧化铵、四乙基氢氧化铵、四丁基氢氧化铵中的任一种、两种或更多种；
化合物(5)、化合物C、碱、化合物(3)的摩尔比为1:1～5:1～10:1～5，例如可以为1:1～1.2:3～5:1～1.5；
所述反应还包括反应完成后的纯化步骤，所述纯化步骤包括：反应完成后调节溶液pH，使用溶剂进行萃取；
所述纯化步骤的温度为-20℃～150℃，优选为-5℃～100℃；
所述纯化步骤使用的溶剂可以是甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、二氧六环、乙二醇二甲醚、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二乙基甲酰胺、吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、 4-甲基吡啶、2,6-二甲基吡啶、二甲亚砜、乙酸乙酯、醋酸异丙酯、甲基叔丁基醚、异丙醚、乙腈、丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇中的任一种、两种或更多种。
本发明还提供化合物(1)药学上可接受的盐的制备方法，包括：将化合物 (1)与含M的碱或无机盐反应，得到化合物(1)药学上可接受的盐；
其中M具有如上所述的定义。
根据本发明的实施方案，化合物(1)与含M的碱或无机盐的摩尔比为1:1～5；
根据本发明的实施方案，所述反应还包括纯化步骤，所述纯化步骤包括：将成盐反应后得到的产物使用有机溶剂进行处理；
根据本发明的实施方案，成盐步骤的温度为-20℃～100℃，优选为0℃～50℃；
根据本发明的实施方案，成盐步骤使用的溶剂可以是甲苯、二甲苯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、二氧六环、乙二醇二甲醚、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、异丙醇中的任一种、两种或多种的组合；
根据发明的实施方案，成盐步骤含M的碱或无机盐可以是异丙醇镁、叔丁醇镁、叔丁醇钠、叔丁醇钾、甲醇钠、乙醇钠、氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸钙、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢化钠、氨水中的任一种、两种或多种的组合；
本发明还提供化合物(1)和/或其药学上可接受的盐用于制备抗病毒药物中的应用。
优选地，所述病毒为丙肝病毒。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包括化合物(1)和/或其药学上可接受的盐。
优选地，所述药物组合物用于抗病毒，所述病毒优选为丙肝病毒。
所述药物组合物还任选包括辅料。
本发明还提供一种抗乙肝病毒的方法，包括将有效量的上述药物组合物施用于有此需要的个体。
有益效果
本发明涉及的肝靶向脂质磷酸酯前体药有别于索非布韦的代谢途径，其代谢机理是依次经：(a)小肠吸收进入血浆，(b)血液循环进入丙肝靶细胞，(c)磷酯酶-C促水解得到(IV)，(d)腺苷酸激酶磷酸化成二磷酸(V)，(e)核苷酸激酶进一步磷酸化成能抑制丙肝病毒的三磷酸(VI)。因此本发明的化合物进入体内后能够快速地被小肠吸收，选择性地在肝脏代谢成抗病毒活性成分，从而减少其在肠、血液、肾脏等组织的分布和积累，避免肾脏毒性。因而其生物利用度相对于索非布韦及其类似化合物大大改善。
术语定义和解释
本申请说明书和权利要求书记载的数值范围，当该数值范围被理解为“整数”时，应当理解为记载了该范围的两个端点以及该范围内的每一个整数。例如，“1～10的整数”应当理解为记载了0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的每一个整数。当该数值范围被理解为“数”时，应当理解为记载了该范围的两个端点以及该范围内的每一个整数以及该范围内的每一个小数。例如，“1～10的数”应当被理解为不仅记载了1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的每一个整数，还至少记载了其中每一个整数分别与0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9的和。
术语“C1-6烷基”应理解为优选表示具有1、2、3、4、5或6个碳原子的线性的或支化的饱和一价烃基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、 1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、 1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基或它们的异构体。特别地，所述基团具有1、2、3或4个碳原子(“C1-4烷基”)，例如甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基，更特别地，所述基团具有1、2或3个碳原子(“C1-3烷基”)，例如甲基、乙基、正丙基或异丙基。
上述对术语“烷基”，如“C1-6烷基”的定义同样适用于含有“C1-6烷基”的其他术语，例如术语“C1-40烷氧基”等。
本发明部分缩写代表的化合物如下：
Figure BDA0002014112710000101
本发明部分缩写化合物的化学名称为：
化合物HDP：3-十六烷氧基-1-丙醇；
化合物HDEE：2-(2-十六烷氧基乙氧基)乙醇；
化合物HDDSP：3-十六烷基二硫基-1-丙醇；
化合物HDPP：磷酸3-十六烷氧基-1-丙醇单酯；
化合物HDEEP：磷酸2-(2-十六烷氧基乙氧基)乙醇单酯；
化合物HDDSPP：磷酸3-十六烷基二硫基-1-丙醇单酯；
化合物SV：(2R,3R,4R,5R)-1-(3-氟-4-羟基-5-羟甲基-3-甲基四氢呋喃-2- 基)-1H-嘧啶-2,4-二酮；
化合物SBV：磷酸(2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢-2H-嘧啶-1-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-甲醇单酯；
化合物F-SV：(2R,3R,4R,5R)-5-氟-1-(3-氟-4-羟基-5-羟甲基-3-甲基四氢呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮；
化合物F-SBV：磷酸(2R,3R,4R,5R)-5-(5-氟-2,4-二氧代-3,4-二氢-2H-嘧啶-1-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-甲醇单酯；
化合物HDEE-SBV：磷酸((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢-2H-嘧啶-1-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-甲醇)(2-(2-十六烷氧基乙氧基)乙醇)二酯；
化合物HDDSP-SBV：磷酸((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢-2H-嘧啶 -1-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-甲醇)(3-十六烷基二硫基-1-丙醇)二酯；
化合物HDEE-F-SBV：磷酸((2R,3R,4R,5R)-5-(5-氟-2,4-二氧代-3,4-二氢-2H-嘧啶-1-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-甲醇)(2-(2-十六烷氧基乙氧基)乙醇) 二酯；
化合物HDP-F-SBV：磷酸((2R,3R,4R,5R)-5-(5-氟-2,4-二氧代-3,4-二氢-2H- 嘧啶-1-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-甲醇)(3-十六烷氧基-1-丙醇)二酯；
化合物HDDSP-F-SBV：磷酸((2R,3R,4R,5R)-5-(5-氟-2,4-二氧代-3,4-二氢-2H-嘧啶-1-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-甲醇)(3-十六烷基二硫基-1-丙醇)二酯；
本发明获得核磁数据所使用的仪器是布鲁克公司的400兆赫核磁共振仪(BrukerAdvance II 400MHz)。四甲基硅(TMS)作内标，室温收集。化学位移(δ)为百万分之一(ppm)。单峰记作s，双重峰记作d，三重峰记作t，四重峰记作q，多重峰记作m，宽单峰记作br s。偶合常数记作j，单位为Hz。氘代溶剂为氘代氯仿(CDCl3)或氘代二甲亚砜(DMSO-d6)。
本发明获得质谱(MS)数据所使用的仪器是岛津液质联用仪(Shimadzu LCMS2010EV)，正向(positive)，给出分子量加氢的离子峰(MH+)。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/ 重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
附图说明
图1为本申请化合物与索非布韦的代谢机理图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1索非布韦单(十六烷氧基乙氧基乙)酯(HDEE-SBV)的制备
Figure BDA0002014112710000121
1)无水、无氧条件下，将65克核苷(SV)、110克磷酸十六烷氧基乙氧基乙醇单酯(HDEEP)、70克N,N,-二环己基碳二亚胺和500毫升吡啶所组成的混合物，于90℃下搅拌18小时后，冷至室温；过滤，乙酸乙酯淋洗滤饼，合并的滤液于 60℃下减压浓缩去除挥发物；
2)加入500毫升乙酸乙酯，室温搅拌分散均匀，加入500毫升3N的盐酸，继续搅拌2小时；
3)静止分层，水层用200毫升乙酸乙酯萃取后，用35％的氢氧化钠调至 pH～3；水相用乙酸乙酯萃取(500毫升X2)；减压蒸除乙酸乙酯，加入300毫升甲醇和30毫升二氯甲烷于残留物中；
4)搅拌加热溶解后，缓慢降温至0～5℃，并在该温度下继续搅拌1小时；
5)过滤，滤饼经丙酮淋洗，50℃下干燥，得索非布韦脂质酯(HDEE-SBV)102 克，白色固体。
δ(1HNMR,DMSO-d6):0.84-0.92(m,3H),1.20-1.33(m,28H),1.46-1.68(m，2H),2.06(d,J＝18.0Hz，3H),3.39-3.46(m,1H),3.46-3.60(m,2H),3.60-3.70(m,2H), 3.70-3.82(m,3H),4.04-4.19(m,5H),4.30(ddd,J＝2.0,8.0,16.0Hz,1H),5.80 (d,J＝8.0Hz,1H),6.26(dd,J＝4.0,18.0Hz,1H),7.80(dd,J＝4.0,8.0Hz,1H)ppm； MS:653(M+H)。
实施例2索非布韦单(十六烷氧基乙氧基乙)酯(HDEE-SBV)的制备
Figure BDA0002014112710000131
1)无水、无氧条件下，将65克核苷(SV)、110克磷酸十六烷氧基乙氧基乙醇单酯(HDEEP)、200克三氯乙腈和500毫升吡啶所组成的混合物，于90℃下搅拌18小时后，冷至室温；于60℃下减压浓缩去除挥发物；
2)加入500毫升乙酸乙酯，室温搅拌分散均匀，加入500毫升3N的盐酸，继续搅拌2小时；
3)静止分层，水层用200毫升乙酸乙酯萃取后，用35％的氢氧化钠调至 pH～3；水相用乙酸乙酯萃取(500毫升X2)；减压蒸除乙酸乙酯，加入300毫升甲醇和30毫升二氯甲烷于残留物中；
4)搅拌加热溶解后，缓慢降温至0～5℃，并在该温度下继续搅拌1小时；
5)过滤，滤饼经丙酮淋洗，50℃下干燥，得索非布韦脂质酯(HDEE-SBV)110 克，白色固体。
实施例3索非布韦单(十六烷氧基乙氧基乙)酯(HDEE-SBV)的制备
Figure BDA0002014112710000132
1)无水、无氧、室温条件下，将65克核苷(SV)溶于500毫升吡啶；控温-10℃，分10批次加入共50克对甲苯磺酰氯；3小时加完后于-10℃下继续搅拌10小时；加入110克磷酸十六烷氧基乙氧基乙醇单酯(HDEEP)，于80℃下搅拌18小时；冷至室温，于60℃下减压浓缩去除挥发物；
2)加入500毫升乙酸乙酯，室温搅拌分散均匀，加入500毫升3N的盐酸，继续搅拌2小时；
3)静止分层，水层用200毫升乙酸乙酯萃取后，用35％的氢氧化钠调至 pH～3；水相用乙酸乙酯萃取(500毫升X2)；减压蒸除乙酸乙酯，加入300毫升甲醇和30毫升二氯甲烷于残留物；
4)搅拌加热溶解后，缓慢降温至0～5℃，并在该温度下继续搅拌1小时；
5)过滤，滤饼经丙酮淋洗，50℃下干燥，得索非布韦脂质酯(HDEE-SBV)138 克，白色固体。
实施例4索非布韦单(十六烷氧基乙氧基乙)酯(HDEE-SBV)的制备
Figure BDA0002014112710000141
1)无水、无氧、室温条件下，将65克核苷(SV)溶于500毫升吡啶；控温-10℃，缓慢滴加40克三氯氧磷；2小时加完后于0℃下继续搅拌6小时；加入85克十六烷氧基乙氧基乙醇(HDEE)，于60℃下搅拌10小时；冷至室温，于60℃下减压浓缩去除挥发物；
2)加入500毫升乙酸乙酯，室温搅拌分散均匀，加入500毫升3N的盐酸，继续搅拌2小时；
3)静止分层，水层用200毫升乙酸乙酯萃取后，用35％的氢氧化钠调至 pH～3；水相用乙酸乙酯萃取(500毫升X2)；减压蒸除乙酸乙酯，加入300毫升甲醇和30毫升二氯甲烷于残留物；
4)搅拌加热溶解后，缓慢降温至0～5℃，并在该温度下继续搅拌1小时；
5)过滤，滤饼经丙酮淋洗，50℃下干燥，得索非布韦脂质酯(HDEE-SBV)132 克，白色固体。
实施例5索非布韦单(十六烷基二硫基丙)酯(HDDSP-SBV)的制备
Figure BDA0002014112710000151
1)无水、无氧条件下，将65克核苷(SV)、110克磷酸十六烷基二硫基丙醇单酯(HDDSPP)、70克N,N,-二环己基碳二亚胺和500毫升吡啶所组成的混合物，于90℃下搅拌18小时后，冷至室温；过滤，乙酸乙酯淋洗滤饼，合并的滤液于 60℃下减压浓缩去除挥发物；
2)加入500毫升乙酸乙酯，室温搅拌分散均匀，加入500毫升3N的盐酸，继续搅拌2小时；
3)静止分层，水层用200毫升乙酸乙酯萃取后，用35％的氢氧化钠调至 pH～3；水相用乙酸乙酯萃取(500毫升X2)；减压蒸除乙酸乙酯，加入300毫升甲醇和30毫升二氯甲烷于残留物；
4)搅拌加热溶解后，缓慢降温至0～5℃，并在该温度下继续搅拌1小时；
5)过滤，滤饼经丙酮淋洗，50℃下干燥，得索非布韦脂质酯 (HDDSP-SBV)107克，白色固体。
δ(1HNMR,DMSO-d6):0.86-0.91(m,3H),1.17-1.34(m,29H)，1.63-1.71(m， 2H),1.95-2.02(m,2H),2.07(d,J＝18.0Hz,3H),2.62(t,J＝8.0Hz,2H), 2.68-2.75(m,2H),4.07-4.20(m,5H),4.30(ddd,J＝2.0,8.0,16.0Hz,1H),5.80 (d,J＝8.0Hz,1H),6.23(dd,J＝4.0,18.0Hz,1H),7.80(dd,J＝4.0,8.0Hz,1H)ppm； MS:671(M+H)。
实施例6索非布韦单(十六烷基二硫基丙)酯(HDDSP-SBV)的制备
Figure BDA0002014112710000152
1)无水、无氧条件下，将65克核苷(SV)、110克磷酸十六烷基二硫基丙醇单酯(HDDSPP)、200克三氯乙腈和500毫升吡啶所组成的混合物，于90℃下搅拌18小时后，冷至室温；于60℃下减压浓缩去除挥发物；
2)加入500毫升乙酸乙酯，室温搅拌分散均匀，加入500毫升3N的盐酸，继续搅拌2小时；
3)静止分层，水层用200毫升乙酸乙酯萃取后，用35％的氢氧化钠调至 pH～3；水相用乙酸乙酯萃取(500毫升X2)；减压蒸除乙酸乙酯，加入300毫升甲醇和30毫升二氯甲烷于残留物；
4)搅拌加热溶解后，缓慢降温至0～5℃，并在该温度下继续搅拌1小时；
5)过滤，滤饼经丙酮淋洗，50℃下干燥，得索非布韦脂质酯 (HDDSP-SBV)110克，白色固体。
实施例7索非布韦单(十六烷基二硫基丙)酯(HDDSP-SBV)的制备
Figure BDA0002014112710000161
1)无水、无氧、室温条件下，将65克核苷(SV)溶于500毫升吡啶；控温-10℃，分10批次加入50克对甲苯磺酰氯；3小时加完后于-10℃下继续搅拌10小时；加入110克磷酸十六烷基二硫基丙醇单酯(HDDSPP)，于80℃下搅拌18小时；冷至室温，于60℃下减压浓缩去除挥发物；
2)加入500毫升乙酸乙酯，室温搅拌分散均匀，加入500毫升3N的盐酸，继续搅拌2小时；
3)静止分层，水层用200毫升乙酸乙酯萃取后，用35％的氢氧化钠调至 pH～3；水相用乙酸乙酯萃取(500毫升X2)；减压蒸除乙酸乙酯，加入300毫升甲醇和30毫升二氯甲烷于残留物；
4)搅拌加热溶解后，缓慢降温至0～5℃，并在该温度下继续搅拌1小时；
5)过滤，滤饼经丙酮淋洗，50℃下干燥，得索非布韦脂质酯(HDDSP-SBV)142 克，白色固体。
实施例8索非布韦单(十六烷基二硫基丙)酯(HDDSP-SBV)的制备
Figure BDA0002014112710000171
1)无水、无氧、室温条件下，将65克核苷(SV)溶于500毫升吡啶；控温-10℃，缓慢滴加40克三氯氧磷；2小时加完后于0℃下继续搅拌6小时；加入90克十六烷基二硫基丙醇(HDDSP)，于60℃下搅拌10小时；冷至室温，于60℃下减压浓缩去除挥发物；
2)加入500毫升乙酸乙酯，室温搅拌分散均匀，加入500毫升3N的盐酸，继续搅拌2小时；
3)静止分层，水层用200毫升乙酸乙酯萃取后，用35％的氢氧化钠调至 pH～3；水相用乙酸乙酯萃取(500毫升X2)；减压蒸除乙酸乙酯，加入300毫升甲醇和30毫升二氯甲烷于残留物；
4)搅拌加热溶解后，缓慢降温至0～5℃，并在该温度下继续搅拌1小时；
5)过滤，滤饼经丙酮淋洗，50℃下干燥，得索非布韦脂质酯(HDDSP-SBV)136 克，白色固体。
实施例9氟索非布韦单(十六烷氧基乙氧基乙)酯(HDEE-F-SBV)的制备
Figure BDA0002014112710000172
1)无水、无氧条件下，将70克核苷(F-SV)、110克磷酸十六烷氧基乙氧基乙醇单酯(HDEEP)、70克N,N,-二环己基碳二亚胺和500毫升吡啶所组成的混合物，于90℃下搅拌18小时后，冷至室温；过滤，乙酸乙酯淋洗滤饼，合并的滤液于60℃下减压浓缩去除挥发物；
2)加入500毫升乙酸乙酯，室温搅拌分散均匀，加入500毫升3N的盐酸，继续搅拌2小时；
3)静止分层，水层用200毫升乙酸乙酯萃取后，用35％的氢氧化钠调至 pH～3；水相用乙酸乙酯萃取(500毫升X2)；减压蒸除乙酸乙酯，加入300毫升甲醇和30毫升二氯甲烷于残留物；
4)搅拌加热溶解后，缓慢降温至0～5℃，并在该温度下继续搅拌1小时；
5)过滤，滤饼经丙酮淋洗，50℃下干燥，得索非布韦脂质酯 (HDEE-F-SBV)105克，白色固体。
δ(1HNMR,DMSO-d6):0.85-0.92(m,3H),1.20-1.33(m,29H),1.49-1.66(m，2H),2.06(d,J＝18.0Hz，3H),3.39-3.46(m,1H),3.47-3.58(m,2H),3.60-3.69(m,2H), 3.69-3.83(m,3H),4.04-4.19(m,5H),4.30(ddd,J＝2.0,8.0,16.0Hz,1H),6.26(dd, J＝4.0,18.0Hz,1H),7.40(dd,J＝4.0,8.0Hz,1H)ppm；MS:671(M+H)。
实施例10氟索非布韦单(十六烷氧基乙氧基乙)酯(HDEE-F-SBV)的制备
Figure BDA0002014112710000181
1)无水、无氧条件下，将70克核苷(F-SV)、110克磷酸十六烷氧基乙氧基乙醇单酯(HDEEP)、200克三氯乙腈和500毫升吡啶所组成的混合物，于90℃下搅拌18小时后，冷至室温；于60℃下减压浓缩去除挥发物；
2)加入500毫升乙酸乙酯，室温搅拌分散均匀，加入500毫升3N的盐酸，继续搅拌2小时；
3)静止分层，水层用200毫升乙酸乙酯萃取后，用35％的氢氧化钠调至 pH～3；水相用乙酸乙酯萃取(500毫升X2)；减压蒸除乙酸乙酯，加入300毫升甲醇和30毫升二氯甲烷于残留物；
4)搅拌加热溶解后，缓慢降温至0～5℃，并在该温度下继续搅拌1小时；
5)过滤，滤饼经丙酮淋洗，50℃下干燥，得氟索非布韦脂质酯(HDEE-F-SBV)112克，白色固体。
实施例11氟索非布韦单(十六烷氧基乙氧基乙)酯(HDEE-F-SBV)的制备
Figure BDA0002014112710000191
1)无水、无氧、室温条件下，将70克核苷(F-SV)溶于500毫升吡啶；控温 -10℃，分10批次加入50克对甲苯磺酰氯；3小时加完后于-10℃下继续搅拌10 小时；加入110克磷酸十六烷氧基乙氧基乙醇单酯(HDEEP)，于80℃下搅拌18 小时；冷至室温，于60℃下减压浓缩去除挥发物；
2)加入500毫升乙酸乙酯，室温搅拌分散均匀，加入500毫升3N的盐酸，继续搅拌2小时；
3)静止分层，水层用200毫升乙酸乙酯萃取后，用35％的氢氧化钠调至 pH～3；水相用乙酸乙酯萃取(500毫升X2)；减压蒸除乙酸乙酯，加入300毫升甲醇和30毫升二氯甲烷于残留物；
4)搅拌加热溶解后，缓慢降温至0～5℃，并在该温度下继续搅拌1小时；
5)过滤，滤饼经丙酮淋洗，50℃下干燥，得索非布韦脂质酯(HDEE-F-SBV)145克，白色固体。
实施例12索非布韦单(十六烷氧基乙氧基乙)酯(HDEE-F-SBV)的制备
Figure BDA0002014112710000192
1)无水、无氧、室温条件下，将70克核苷(F-SV)溶于500毫升吡啶；控温 -10℃，缓慢滴加40克三氯氧磷；2小时加完后于0℃下继续搅拌6小时；加入 85克十六烷氧基乙氧基乙醇(HDEE)，于60℃下搅拌10小时；冷至室温，于60℃下减压浓缩去除挥发物；
2)加入500毫升乙酸乙酯，室温搅拌分散均匀，加入500毫升3N的盐酸，继续搅拌2小时；
3)静止分层，水层用200毫升乙酸乙酯萃取后，用35％的氢氧化钠调至 pH～3；水相用乙酸乙酯萃取(500毫升X2)；减压蒸除乙酸乙酯，加入300毫升甲醇和30毫升二氯甲烷于残留物；
4)搅拌加热溶解后，缓慢降温至0～5℃，并在该温度下继续搅拌1小时；
5)过滤，滤饼经丙酮淋洗，50℃下干燥，得索非布韦脂质酯(HDEE-F-SBV)136克，白色固体。
实施例13氟索非布韦单(十六烷基二硫基丙)酯(HDDSP-F-SBV)的制备
Figure BDA0002014112710000201
1)无水、无氧条件下，将70克核苷(F-SV)、110克磷酸十六烷基二硫基丙醇单酯(HDDSPP)、70克N,N,-二环己基碳二亚胺和500毫升吡啶所组成的混合物，于90℃下搅拌18小时后，冷至室温；过滤，乙酸乙酯淋洗滤饼，合并的滤液于60℃下减压浓缩去除挥发物；
2)加入500毫升乙酸乙酯，室温搅拌分散均匀，加入500毫升3N的盐酸，继续搅拌2小时；
3)静止分层，水层用200毫升乙酸乙酯萃取后，用35％的氢氧化钠调至 pH～3；水相用乙酸乙酯萃取(500毫升X2)；减压蒸除乙酸乙酯，加入300毫升甲醇和30毫升二氯甲烷于残留物；
4)搅拌加热溶解后，缓慢降温至0～5℃，并在该温度下继续搅拌1小时；
5)过滤，滤饼经丙酮淋洗，50℃下干燥，得氟索非布韦(HDDSP-F-SBV)115 克，白色固体。
δ(1HNMR,DMSO-d6):0.85-0.93(m,3H),1.16-1.53(m,30H)，1.63-1.71(m，2H),1.95-2.03(m,2H),2.07(d,J＝18.0Hz,3H),2.62(t,J＝8.0Hz,2H), 2.65-2.75(m,2H),4.07-4.19(m,5H),4.30(ddd,J＝2.0,8.0,16.0Hz,1H),6.27(dd, J＝4.0,18.0Hz,1H),7.40(dd,J＝4.0,8.0Hz,1H)ppm；MS:689(M+H)。
实施例14氟索非布韦单(十六烷基二硫基丙)酯(HDDSP-SBV)的制备
Figure BDA0002014112710000211
1)无水、无氧条件下，将70克核苷(F-SV)、110克磷酸十六烷基二硫基丙醇单酯(HDDSPP)、200克三氯乙腈和500毫升吡啶所组成的混合物，于90℃下搅拌18小时后，冷至室温；于60℃下减压浓缩去除挥发物；
2)加入500毫升乙酸乙酯，室温搅拌分散均匀，加入500毫升3N的盐酸，继续搅拌2小时；
3)静止分层，水层用200毫升乙酸乙酯萃取后，用35％的氢氧化钠调至 pH～3；水相用乙酸乙酯萃取(500毫升X2)；减压蒸除乙酸乙酯，加入300毫升甲醇和30毫升二氯甲烷于残留物；
4)搅拌加热溶解后，缓慢降温至0～5℃，并在该温度下继续搅拌1小时；
5)过滤，滤饼经丙酮淋洗，50℃下干燥，得氟索非布韦脂质酯 (HDDSP-F-SBV)118克，白色固体。
实施例15氟索非布韦单(十六烷基二硫基丙)酯(HDDSP-F-SBV)的制备
Figure BDA0002014112710000212
1)无水、无氧、室温条件下，将70克核苷(F-SV)溶于500毫升吡啶；控温 -10℃，分10批次加入50克对甲苯磺酰氯；3小时加完后于-10℃下继续搅拌10 小时；加入110克磷酸十六烷基二硫基丙醇单酯(HDDSPP)，于80℃下搅拌18 小时；冷至室温，于60℃下减压浓缩去除挥发物；
2)加入500毫升乙酸乙酯，室温搅拌分散均匀，加入500毫升3N的盐酸，继续搅拌2小时；
3)静止分层，水层用200毫升乙酸乙酯萃取后，用35％的氢氧化钠调至 pH～3；水相用乙酸乙酯萃取(500毫升X2)；减压蒸除乙酸乙酯，加入300毫升甲醇和30毫升二氯甲烷于残留物；
4)搅拌加热溶解后，缓慢降温至0～5℃，并在该温度下继续搅拌1小时；
5)过滤，滤饼经丙酮淋洗，50℃下干燥，得氟索非布韦脂质酯 (HDDSP-F-SBV)150克，白色固体。
实施例16氟索非布韦单(十六烷基二硫基丙)酯(HDDSP-F-SBV)的制备
Figure BDA0002014112710000221
1)无水、无氧、室温条件下，将70克核苷(F-SV)溶于500毫升吡啶；控温 -10℃，缓慢滴加40克三氯氧磷；2小时加完后于0℃下继续搅拌6小时；加入 90克十六烷基二硫基丙醇(HDDSP)，于60℃下搅拌10小时；冷至室温，于60 ℃下减压浓缩去除挥发物；
2)加入500毫升乙酸乙酯，室温搅拌分散均匀，加入500毫升3N的盐酸，继续搅拌2小时；
3)静止分层，水层用200毫升乙酸乙酯萃取后，用35％的氢氧化钠调至 pH～3；水相用乙酸乙酯萃取(500毫升X2)；减压蒸除乙酸乙酯，加入300毫升甲醇和30毫升二氯甲烷于残留物；
4)搅拌加热溶解后，缓慢降温至0～5℃，并在该温度下继续搅拌1小时；
5)过滤，滤饼经丙酮淋洗，50℃下干燥，得氟索非布韦脂质酯(HDDSP-F-SBV)142克，白色固体。
实施例17氟索非布韦单(十六烷氧基丙)酯(HDP-F-SBV)的制备
Figure BDA0002014112710000231
1)无水、无氧条件下，将70克核苷(F-SV)、100克磷酸十六烷氧基丙醇单酯(HDPP)、70克N,N,-二环己基碳二亚胺和500毫升吡啶所组成的混合物，于 90℃下搅拌18小时后，冷至室温；过滤，乙酸乙酯淋洗滤饼，合并的滤液于60℃下减压浓缩去除挥发物；
2)加入500毫升乙酸乙酯，室温搅拌分散均匀，加入500毫升3N的盐酸，继续搅拌2小时；
3)静止分层，水层用200毫升乙酸乙酯萃取后，用35％的氢氧化钠调至 pH～3；水相用乙酸乙酯萃取(500毫升X2)；减压蒸除乙酸乙酯，加入300毫升甲醇和30毫升二氯甲烷于残留物；
4)搅拌加热溶解后，缓慢降温至0～5℃，并在该温度下继续搅拌1小时；
5)过滤，滤饼经丙酮淋洗，50℃下干燥，得氟索非布韦脂质酯 (HDP-F-SBV)108克，白色固体。
δ(1HNMR,DMSO-d6):0.85-0.92(m,3H),1.19-1.36(m,29H),1.40-1.64(m,2H),1.92-2.03(m，2H),2.06(d,J＝18.0Hz，3H),3.32-3.52(m,4H),4.05-4.19(m,5H), 4.29(ddd,J＝2.0,8.0,16.0Hz,1H),6.27(dd,J＝4.0,18.0Hz,1H),7.41(dd,J＝4.0, 8.0Hz,1H)ppm；MS:641(M+H)。
实施例18氟索非布韦单(十六烷氧基丙)酯(HDP-F-SBV)的制备
Figure BDA0002014112710000241
1)无水、无氧条件下，将70克核苷(F-SV)、100克磷酸十六烷氧基丙醇单酯(HDPP)、200克三氯乙腈和500毫升吡啶所组成的混合物，于90℃下搅拌18 小时后，冷至室温；于60℃下减压浓缩去除挥发物；
2)加入500毫升乙酸乙酯，室温搅拌分散均匀，加入500毫升3N的盐酸，继续搅拌2小时；
3)静止分层，水层用200毫升乙酸乙酯萃取后，用35％的氢氧化钠调至 pH～3；水相用乙酸乙酯萃取(500毫升X2)；减压蒸除乙酸乙酯，加入300毫升甲醇和30毫升二氯甲烷于残留物；
4)搅拌加热溶解后，缓慢降温至0～5℃，并在该温度下继续搅拌1小时；
5)过滤，滤饼经丙酮淋洗，50℃下干燥，得氟索非布韦脂质酯 (HDP-F-SBV)126克，白色固体。
实施例19氟索非布韦单(十六烷氧基丙)酯(HDP-F-SBV)的制备
Figure BDA0002014112710000242
1)无水、无氧、室温条件下，将70克核苷(F-SV)溶于500毫升吡啶；控温 -10℃，分10批次加入50克对甲苯磺酰氯；3小时加完后于-10℃下继续搅拌10 小时；加入100克磷酸十六烷氧基丙醇单酯(HDPP)，于80℃下搅拌18小时；冷至室温，于60℃下减压浓缩去除挥发物；
2)加入500毫升乙酸乙酯，室温搅拌分散均匀，加入500毫升3N的盐酸，继续搅拌2小时；
3)静止分层，水层用200毫升乙酸乙酯萃取后，用35％的氢氧化钠调至pH～3；水相用乙酸乙酯萃取(500毫升X2)；减压蒸除乙酸乙酯，加入300毫升甲醇和30毫升二氯甲烷于残留物；
4)搅拌加热溶解后，缓慢降温至0～5℃，并在该温度下继续搅拌1小时；
6)过滤，滤饼经丙酮淋洗，50℃下干燥，得氟索非布韦脂质酯 (HDP-F-SBV)142克，白色固体。
实施例20氟索非布韦单(十六烷氧基丙)酯(HDP-F-SBV)的制备
Figure BDA0002014112710000251
1)无水、无氧、室温条件下，将70克核苷(F-SV)溶于500毫升吡啶；控温 -10℃，缓慢滴加40克三氯氧磷；2小时加完后于0℃下继续搅拌6小时；加入 85克十六烷氧基丙醇(HDP)，于60℃下搅拌10小时；冷至室温，于60℃下减压浓缩去除挥发物；
2)加入500毫升乙酸乙酯，室温搅拌分散均匀，加入500毫升3N的盐酸，继续搅拌2小时；
3)静止分层，水层用200毫升乙酸乙酯萃取后，用35％的氢氧化钠调至 pH～3；水相用乙酸乙酯萃取(500毫升X2)；减压蒸除乙酸乙酯，加入300毫升甲醇和30毫升二氯甲烷于残留物；
4)搅拌加热溶解后，缓慢降温至0～5℃，并在该温度下继续搅拌1小时；
6)过滤，滤饼经丙酮淋洗，50℃下干燥，得氟索非布韦脂质酯 (HDP-F-SBV)132克，白色固体。
实施例21索非布韦单(十六烷氧基乙氧基乙)酯(HDEE-SBV)钠盐的制备
Figure BDA0002014112710000252
1)将100索非布韦单(十六烷氧基乙氧基乙)酯(HDEE-SBV)，室温搅拌下，溶于由100毫升甲醇和900毫升二氯甲烷所组成的混合溶剂中，缓慢加入35克25％甲醇钠的甲醇溶液；继续搅拌1小时后，于50℃下减压浓缩去除挥发物；
2)加入350毫升乙醇，60℃下搅拌溶解后，加入350毫升丙酮，并于室温下继续搅拌20小时；
3)于0～5℃下继续搅拌48小时后，过滤，200毫升丙酮淋洗滤饼；
4)40℃下减压干燥，得索非布韦单(十六烷氧基乙氧基乙)酯(HDEE-SBV)钠盐98.7克，白色固体,纯度99.8％。
实施例22～25按照实施例21的方法，分别制备了化合物(HDEE-SBV、 HDDSP-SBV、HDP-F-SBV、HDEE-F-SBV、HDDSP-F-SBV)的每种化合物的钠、钾、镁、铵盐。
实施例26口服生物利用度研究结果
参照文献(Clin.Chem.1992,38,480-485；J.Med.Chem.1994,37,1857-1864) 公开的方法，通过测定小鼠口服给药和静脉注射给药后尿液中待测化合物 (Sofosbuvir、HDEE-SBV、HDDSP-SBV、HDP-F-SBV、HDEE-F-SBV、 HDDSP-F-SBV)的含量，比较研究待测化合物(Sofosbuvir、HDEE-SBV、 HDDSP-SBV、HDP-F-SBV、HDEE-F-SBV、HDDSP-F-SBV)的口服生物利用度；
将待测化合物(Sofosbuvir、HDEE-SBV、HDDSP-SBV、HDP-F-SBV、 HDEE-F-SBV、HDDSP-F-SBV)用二甲基亚砜溶解后，用磷酸缓冲液将其稀释至所需浓度，分别制得所需浓度的待测化合物(Sofosbuvir、HDEE-SBV、 HDDSP-SBV、HDP-F-SBV、HDEE-F-SBV、HDDSP-F-SBV)溶液；
取体重20-25克的BACLB/c小鼠48只，随机分为四组，每组12只。小鼠禁食12h后，将静脉注射的待测化合物(Sofosbuvir、HDEE-SBV、HDDSP-SBV、 HDP-F-SBV、HDEE-F-SBV、HDDSP-F-SBV)溶液配成15毫克/毫升的生理盐水溶液，通过尾静脉注射给药后；口服给药的待测化合物(Sofosbuvir、HDEE-SBV、HDDSP-SBV、HDP-F-SBV、HDEE-F-SBV、HDDSP-F-SBV)溶液配成浓度为3毫克/毫升含5％二甲亚砜的水溶液，灌胃给药。待测化合物的静脉注射给药量和口服给药量相当于30毫克/Kg的TFV；
给药48h后，分别收集各组小鼠的尿液，并测定尿液中待测化合物 (Sofosbuvir、HDEE-SBV、HDDSP-SBV、HDP-F-SBV、HDEE-F-SBV、 HDDSP-F-SBV)的含量；
根据下式计算口服给药的生物利用度，结果见表1；
生物利用度＝[M1]0-48h/[M2]0-48hX100％；
其中，[M1]0-48h为口服给药后48h内尿排泄药物的总量，[M2]0-48h为静脉注射给药后48h内尿排泄药物的总量；
表1口服生物利用度研究结果
Figure BDA0002014112710000271
Figure BDA0002014112710000281
由表1可见，与Sofosbuvir相比，本发明的HDEE-SBV、HDDSP-SBV、 HDP-F-SBV、HDEE-F-SBV、HDDSP-F-SBV，尤其是HDDSP-F-SBV具有更好的口服生物利用度。
实施例27大鼠肝细胞代谢为核苷三磷酸抑制剂(VI)的研究
1)大鼠肝细胞：选择自己觅食的体重250-300克的雄性Sprague Dawley大鼠，参考文献(J.Cell.Biol.1969,43,506-520；Eur.J.Biochem.1982,122,87-93.)公开的方法制得大鼠肝细胞20mg/mL(湿重)，大于85％台盼蓝(TrypanBlue)活性；
2)缓冲溶液：含有20mM浓度葡萄糖和1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)的克雷布斯(Krebs)碳酸氢钠缓冲溶液；于0～5℃下继续搅拌48小时后，过滤，200毫升丙酮淋洗滤饼；
3)乙腈水溶液：含0.1mg/mL二环己基碳二亚胺(DCCD)和0.1％(体积比)氢氧化铵的60％乙腈水溶液；
4)在37℃条件下，将10μM待测化合物(Sofosbuvir、HDEE-SBV、 HDDSP-SBV、HDP-F-SBV、HDEE-F-SBV、HDDSP-F-SBV)、2mL缓冲溶液和大鼠肝细胞培养2h，其中，将待测化合物(Sofosbuvir、HDEE-SBV、 HDDSP-SBV、HDP-F-SBV、HDEE-F-SBV、HDDSP-F-SBV)用二甲基亚砜溶解后，用磷酸缓冲液将其稀释至所需浓度，分别制得所需浓度的待测化合物(Sofosbuvir、HDEE-SBV、HDDSP-SBV、HDP-F-SBV、HDEE-F-SBV、 HDDSP-F-SBV)溶液；
5)将步骤1)所得的细胞悬浮液，进行1600μL等分和离心分离。弃去上清液，保留沉淀物，分别加入500μL乙腈水溶液，剧烈涡旋振荡；14000转/分离心10 分钟；
6)取上清液进行LC-MS/MS分析。用MS/MS模式检测，与拉米夫定-5’-三磷酸标准相比较，定量检测大鼠肝细胞中待测化合物(Sofosbuvir、HDEE-SBV、 HDDSP-SBV、HDP-F-SBV、HDEE-F-SBV、HDDSP-F-SBV)代谢成核苷三磷酸(VI)的含量(结果见表2)。
表2大鼠肝细胞核苷三磷酸(VI)的代谢
Figure BDA0002014112710000291
由表2可见，与Sofosbuvir相比，本发明的化合物(HDEE-SBV、HDDSP-SBV、 HDP-F-SBV、HDEE-F-SBV、HDDSP-F-SBV)，尤其是HDDSP-F-SBV更为容易在肝脏代谢成药物活性成分。
实施例28抗病毒作用研究
1)材料
细胞：HCV亚基因复制子细胞(上海复旦悦达生物技术有限公司提供)。
构建基本过程为：
(1.1)从丙型肝炎病毒感染者的肝脏组织分离出HCV基因组(HCVlb)，并对其进行克隆重建；删除HCV部分核心基因至NJISZ区，插入新霉素磷酸转移酶基因(noeR)，使亚基因组获得抗磷酸新霉素(G418)的基因；插入鼠脑心肌炎病毒基因的IRES。
(1.2)用合成的HCV亚基因组复制子转染人肝癌细胞H-hu7，用含G418 的培养基培养人肝癌细胞H-hu7，以获得抗磷酸新霉素的克隆，这些克隆可以表达复制子RNA[4I]。
2)方法
以Sofosbuvir为阳性对照，并设置病毒对照组(只加病毒，不加药物)、细胞对照组(不加病毒、药物)，比较研究实施例化合物(HDEE-SBV、HDDSP-SBV、 HDP-F-SBV、HDEE-F-SBV、HDDSP-F-SBV)的抗病毒作用。
将化合物Sofosbuvir和化合物(HDEE-SBV、HDDSP-SBV、HDP-F-SBV、 HDEE-F-SBV、HDDSP-F-SBV)用二甲基亚砜溶解后，用磷酸缓冲液将其稀释至表3记载浓度。
离心收集病毒细胞液，在96孔板的每个孔中加入所需浓度的细胞悬浮液 100μL。按照表3记载，各试验组中加入化合物Sofosbuvir和化合物(HDEE-SBV、 HDDSP-SBV、HDP-F-SBV、HDEE-F-SBV、HDDSP-F-SBV)的溶液，并设置病毒对照组(只加病毒，不加药物)、细胞对照组(不加病毒、药物)，每组设置4个重复孔。加完后，将96孔板置于37℃、5％CO2孵育培养5天。取上清液，上清液经高速离心后，再取上清液。以测定p24抗原的方法，检测上清液p24抗原的含量。
比较研究给药组、阳性对照组、病毒对照组和细胞对照组的病毒抑制率，结果见表3。
表3病毒抑制率对比
Figure BDA0002014112710000301
Figure DEST_PATH_IMAGE002
由表3可见，与阳性对照药物Sofosbuvir相比，实施例化合物(HDEE-SBV、HDDSP-SBV、HDP-F-SBV、HDEE-F-SBV、HDDSP-F-SBV)，尤其是化合物 (HDDSP-SBV、HDDSP-F-SBV)对丙型肝炎病毒(HCV)具有更好的抑制作用。
实施例29小鼠体内肝靶向性的评价
取质量20～25克的BACLB/c小鼠，随机分组，每组12只。禁食12小时后口服给予30毫克/公斤剂量的待测化合物(Sofosbuvir、HDEE-SBV、HDDSP-SBV、 HDP-F-SBV、HDEE-F-SBV、HDDSP-F-SBV)；于60和120分钟，每组随机取6只小鼠，采集小肠、肾、肝脏，小肠、肾、肝脏分别制成匀浆；将小肠、肾、肝匀浆分别高速离心后，分别取上清液，测定小肠、肾、肝中活性药物的含量(Clin.Chem.1992,38,480-485.)。实验结果如表4所示：
表4小鼠体内肝靶向性的评价
Figure BDA0002014112710000321
由表4可见，与Sofosbuvir相比，本发明化合物(HDEE-SBV、HDDSP-SBV、 HDP-F-SBV、HDEE-F-SBV、HDDSP-F-SBV)或其药学上可接受的盐极易被小肠吸收，在肾、胃、肠道、血浆中不易被体内酯水解酶水解，口服给药后，到达肝细胞之前不会被代谢，进入肝靶区后才会被肝细胞中的磷酯酶-C水解，再经腺苷酸激酶、核苷酸激酶两次磷酸化，代谢成能抑制丙肝病毒的三磷酸，使得肝细胞内的药物浓度高于正常组织，具有更好的靶向性、有效性、安全性。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.化合物(1)所示的索非布韦衍生物或其药学上可接受的盐，
Figure FDA0004165585230000011
r选自1～3的整数，s选自1；t选自10～17的整数；X选自SS；Y选自H、F、Cl、Br或I；所述药学上可接受的盐选自NH4、Li、Na、K、Ca或Mg。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物(1)选自如下化合物：
Figure FDA0004165585230000012
3.根据权利要求1或2所述化合物的制备方法，其特征在于，包括：
方案(1)
核苷(2)与磷酸脂质单酯(3)反应得到化合物(1)，
Figure FDA0004165585230000021
方案(2)
核苷(2)、化合物(4)与三氯氧磷反应得到化合物(1)，
Figure FDA0004165585230000022
方案(3)
化合物(5)、化合物(3)与化合物C反应得到化合物(1)，
Figure FDA0004165585230000023
其中，r、X、s、t、Y具有权利要求1或2所述的定义；
R1选自H或羟基保护基；
当上述原料中使用保护基保护某些基团时，反应完成后还使用常规的方法脱去保护基制备得到化合物(1)；
化合物C选自三氯乙腈、甲磺酰氯、三氟甲磺酰氯、苯磺酰氯、对甲苯磺酰氯、2,4,6-三甲基苯磺酰氯中的任一种、两种或多种的组合。
4.根据权利要求1或2所述化合物药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，包括：将化合物(1)与含NH4、Li、Na、K、Ca或Mg的碱或无机盐反应，得到化合物(1)药学上可接受的盐。
5.权利要求1或2所述化合物和/或其药学上可接受的盐用于制备抗丙肝病毒药物中的应用。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1或2所述化合物和/或其药学上可接受的盐。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述药物组合物用于抗丙肝病毒。
8.根据权利要求6或7所述的组合物，其特征在于，所述药物组合物还任选包括辅料。
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