ES2820242T3 - Análogos de caperuza en el extremo 5' de ARNm de fosfotriazol novedosos, composición que comprende los mismos, molécula de ARN que incorpora los mismos, utilizaciones de los mismos y procedimiento de síntesis de molécula de ARN, proteína o péptido - Google Patents

Abstract

Compuesto de fórmula (I) **(Ver fórmula)** o estereoisómero o sal del mismo, en la que R1 y R2 se seleccionan del grupo que consiste en N, N+-CH3, N+-C2H5, N+-C3H8, N+-C4H5, N+-CH2C6H5, en los que, como mínimo, uno de R1, R2 no es N, n y m se eligen independientemente del grupo que consiste en 0, 1 y 2; X se selecciona del grupo que consiste en O, NH, S, CH2 k es 1 o 2 Y está ausente o se selecciona del grupo de -CH2-, -CH2CH2-, -CH2O-, -CH2S-, -CH2NH-, -CH2CH2O-, -CH2CH2NH-, -CH2CH2S R 3, R4, R5, R6 se seleccionan del grupo que consiste en H, OH, OCH3 u OCH2CH3; en la que R3 y R4 pueden ser iguales o diferentes; R5 y R6 pueden ser iguales o diferentes; si cualquiera de R3, R4 es diferente de OH, entonces R5 y R6 son ambos OH; si cualquiera de R5, R6 es diferente de OH, entonces R3 y R4 son ambos OH.

Description

DESCRIPCIÓN

Análogos de caperuza en el extremo 5’ de ARNm de fosfotriazol novedosos, composición que comprende los mismos, molécula de ARN que incorpora los mismos, utilizaciones de los mismos y procedimiento de síntesis de molécula de ARN, proteína o péptido

SECTOR TÉCNICO

La presente invención se refiere a análogos de caperuza en el extremo 5’ de ARNm de fosfotriazol novedosos, a una composición que comprende los mismos, a una molécula de ARN que incorpora los mismos, a utilizaciones de los mismos y a un procedimiento de síntesis, in vitro o in vivo, de la molécula de ARN, así como a un procedimiento de síntesis de una proteína o un péptido, in vitro, o in vivo o en células en cultivo, comprendiendo dicho procedimiento traducir la molécula de ARN.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La caperuza de 7-metilguanosina (m⁷G) presente en el extremo 5’ de ARNm de eucariotas desempeña un papel crucial en numerosos procesos celulares fundamentales, principalmente protegiendo el ARNm frente a la escisión prematura y sirviendo como una plataforma molecular para proteínas que actúan en el transporte y la traducción de ARNm^{. 1} Por tanto, las modificaciones químicas de la caperuza en 5’ allanan el camino para diseñar herramientas moleculares para la modulación selectiva de procesos dependientes de caperuza y, por consiguiente, del metabolismo del ARNm^.2 La presencia de la caperuza en 5’ es necesaria para la vigilancia y la traducción eficaz del ARNm en condiciones normales. Los análogos de caperuza de ARNm sintetizados químicamente del tipo m7GpppG se utilizan como reactivos para la síntesis in vitro de ARNm con caperuza^.3

Los ARNm con caperuza en 5’ transcritos in vitro (TIV) son herramientas útiles para estudiar la traducción, el transporte y el recambio de ARNm, y son una clase emergente de moléculas terapéuticas muy prometedoras. Los ARNm TIV son aplicables en la expresión de proteínas en células eucariotas, extractos, células en cultivo o incluso organismos completos. Finalmente, los ARNm TIV han adquirido recientemente una gran atención como una herramienta para la administración segura de proteínas exógenas con el propósito de vacunas contra el cáncer y terapias de sustitución génica^.4

La síntesis de ARNm con caperuza en 5’ utilizando análogos de caperuza de ARNm se puede lograr mediante transcripción in vitro.3 Mediante este procedimiento, denominado adición de caperuza cotranscripcional, la síntesis de ARN se realiza por la ARN polimerasa en el molde de ADN en presencia de los 4 NTP y un dinucleótido de caperuza, tal como m⁷GpppG. El molde de ADN se diseña para incorporar G como primer nucleótido transcrito. La polimerasa inicia la transcripción a partir de GTP o m⁷GpppG, incorporando de ese modo uno de los nucleótidos en el extremo 5’ del ARN naciente. Para aumentar el porcentaje de incorporación de análogos con caperuza (eficacia de adición de caperuza), se disminuye la concentración de GTP en relación con los demás NTP, y se eleva la concentración del dinucleótido de caperuza (un exceso desde 4 hasta 10 veces en relación con GTP). Desafortunadamente, la incorporación inversa de dinucleótidos de caperuza se puede producir potencialmente, dando lugar a una fracción de ARN ‘con caperuza de Gpppm⁷G’, que son inactivos a nivel traduccional. Este problema se ha resuelto mediante el descubrimiento de ‘análogos de caperuza anti-inversos’ (ARCA, “Anti-Reverse Cap Analogs”) que se modifican en las posiciones 2’ o 3’ de 7-metilguanosina (reemplazando habitualmente uno de los grupos OH por OCH³) para bloquear la incorporación inversa^.5,6

Se ha mostrado que el procedimiento de adición de caperuza cotranscripcional permite la incorporación en el extremo 5’ del ARN de diversas estructuras de caperuza modificadas. Estas estructuras de caperuza modificadas pueden portar marcadores moleculares o conferir nuevas propiedades al ARNm, tales como estabilidad y eficacia de traducción aumentadas. Entre los análogos de caperuza especialmente beneficiosos se encuentran aquellos modificados en el puente trifosfato^.7 Se ha mostrado que incluso sustituciones de un único átomo en el puente 5’,5’-trifosfato pueden afectar significativamente a las propiedades de los ARNm. Por ejemplo, una sustitución de un único átomo en la posición p del puente de oligofosfato de la caperuza, introducida mediante el denominado p-S-ARCA, condujo a un aumento significativo de la eficacia de traducción del ARNm, in vitro e in vivo,8,9 mientras que una única sustitución de O por CH² en la posición a-p condujo a una disminución de la eficacia de traducción^{. 10} Los efectos biológicos considerablemente diferentes de las diferentes sustituciones de un único átomo dentro de la caperuza indican una alta sensibilidad de la maquinaria traduccional a la modificación de la cadena de oligofosfato y sugiere que este es un sector para una exploración adicional.

Sin embargo, el desarrollo de análogos de caperuza novedosos, como herramientas de investigación o compuestos con potencial farmacológico, está limitado por dificultades asociadas con la síntesis química de estos compuestos. La síntesis y la purificación de análogos de caperuza de mononucleótido y dinucleótido constituyen un reto debido a su alta naturaleza iónica y la labilidad química de la 7-metilguanosina^{. 11,12} El enfoque de síntesis habitual, basado en la química de la fosforimidazolida y la formación de enlaces pirofosfato mediada por exceso de cationes divalentes en un disolvente orgánico^,7,13,14 requiere mucho tiempo y mano de obra, constituye un reto en cuanto al escalado, requiere múltiples etapas de purificación y, ocasionalmente, da lugar a mezclas complejas de productos y productos secundarios que son difíciles de separar. Ocasionalmente, como en el caso de p-S-ARCA^{, 15} este enfoque también requiere la generación de productos intermedios de mononucleótido inestables, que son propensos a la degradación espontánea con el almacenamiento. De este modo, el enfoque de síntesis típico es eficaz habitualmente para la producción de análogos de caperuza a una baja escala de miligramos, pero presenta un rendimiento bastante bajo y es muy difícil de escalar. La capacidad de producir análogos de caperuza con una pureza y un rendimiento altos mediante un procedimiento de síntesis fácilmente escalable sería crítica para muchas aplicaciones, incluyendo aplicaciones in vivo y farmacológicas que requieren la administración de ARNm con caperuza sintetizados in vitro a animales o seres humanos.

La “química click" es un término que describe un grupo de reacciones químicas que son eficaces, tienen un amplio alcance, son sencillas de realizar y fáciles de escalar, crean productos de manera regioespecífica y estereoespecífica sin apenas productos secundarios y se pueden llevar a cabo en disolventes inocuos, tales como agua. La cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre que conduce a la formación de 1,2,3-triazoles sustituidos ^{es un e} * ^jemp ' ^{lo excelen} 1^t6^e 17 ^{de tal reacción. La CuAA} 18^C 22 ^{se ha a 1plicado} 2 ^a3^m 26^{pliamente en la funcionalización de AR} 27^{N y} J _{componentes de ARN, ’ , incluyendo el marcaje, ' bioconjugación ' y ligamiento químico de extremos 5’. Se} ^{ha d}3^e0^{s 3c3ubierto q 1ue el resto de triazol 1 puede reem 1plaza 3r4 uno o varios enlaces 5’,3’} J _{enerar miméticos funcionales. Piecyk et al. notificaron la funcionalizació}-_n ^fo

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_o ^e _s ⁿ _de ^AD _ca ^N28,29 _{ARN para g pe} ^y _ruza de mononucleótido mediante química click de CuAAC para obtener análogos que contienen un resto de 1,2,3-triazol en la posición N2 de la base nitrogenada, mientras que Walczak et al^.45 notificaron análogos de caperuza que contienen un resto de 1,2,3-triazol en la posición 5’ del resto de nucleósido. Sin embargo, dicha modificación nunca se ha investigado como una modificación interna de la cadena de 5’,5’-oligofosfato dentro de la caperuza ni como cualquier otro 5’,5’-oligofosfato de dinucleósido biológicamente activo.

En la Patente WO2013/059475 A1 también se describen análogos con caperuza derivatizados con alquinilo.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores obtuvieron una clase novedosa de análogos de caperuza de dinucleótido que se pueden proporcionar mediante un enfoque de síntesis más sencillo y más eficaz, basado en la química click.35 Los inventores utilizaron la cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre (I) (CuAAC) en medio acuoso para combinar dos subunidades de 5’-mononucleótido para dar un análogo con caperuza de 5’,5’-dinucleótido que contiene 1,2,3-triazol sustituido como una modificación interna de la cadena de oligofosfato. Los análogos varían en la longitud de la cadena de oligofosfato, la posición del resto de triazol dentro de la cadena de oligofosfato y el tipo de espaciadores que unen los grupos fosfato al resto de triazol. De manera opcional, los análogos novedosos también tienen un grupo 2’-O-alquilo o 3’-O-alquilo dentro de la 7-metilguanosina, de manera preferente, un grupo metilo, lo que produce análogos denominados análogos con caperuza anti-inversos (ARCA). Todos los análogos novedosos se sintetizaron en medio acuoso en las condiciones catalíticas de CuAAC convencionales (CuSO⁴ , ascorbato de sodio) a partir de dos productos intermedios de mononucleótido estables químicamente, con alto rendimiento, con una formación muy escasa o nula de productos secundarios. Varios de los análogos de fosfotriazol tienen una alta afinidad por el factor de iniciación de la traducción eucariota 4E (eIF4E). Los ARNm terminados con los análogos de caperuza novedosos se pueden obtener mediante una reacción de transcripción in vitro convencional. Las eficacias de incorporación de caperuza en los transcritos de ARN cortos (% de adición de caperuza) son comparables o ligeramente menores a las de caperuzas sin modificar. Los transcritos cortos que contienen los análogos novedosos son susceptibles de eliminación de la caperuza por la enzima de eliminación de caperuza Dcp2 in vitro, comportándose de ese modo como ARN con caperuza con estructuras de caperuza sin modificar. De manera sorprendente, los ARNm que codifican para luciferasa con caperuza con alguno de los análogos de caperuza de fosfotriazol novedosos tuvieron propiedades traduccionales comparables a los ARN que portaban caperuzas en 5’ convencionales, a pesar de la presencia del grupo triazol voluminoso. Esto contrasta con los análogos con caperuza notificados previamente que contienen modificaciones menos voluminosas de formación de puentes de oligofosfato, por ejemplo, (sustituciones de O por NH o de O por CH^{2 )10’36’37} o los análogos que contienen un resto de 1,2,3-triazol en la posición 5’ del resto de nucleósido^,45 los cuales han fomentado una traducción menos eficaz que los análogos de caperuza convencionales. De este modo, la propiedad inesperada y única de los análogos de caperuza de fosfotriazol es que son buenos miméticos funcionales de la caperuza natural. De este modo, los análogos de caperuza de fosfotriazol son una alternativa viable a los análogos de caperuza convencionales que se obtienen mediante una síntesis química más laboriosa.

Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es un compuesto de fórmula (I):

o un estereoisómero o una sal del mismo,

en la que R1 y R2 se seleccionan del grupo que consiste en N, N+-CH³ , N+-C²H⁵, N+-C³Hb, N+-C⁴H⁵ , N+-CH²C⁶H⁵, en los que, como mínimo, uno de R1, R2 no es N.

n y m se eligen independientemente del grupo que consiste en 0, 1 y 2;

X se selecciona del grupo que consiste en O, NH, S, CH²

k es 1 o 2

Y está ausente o se selecciona del grupo de -CH²-, -CH²CH²-, -CH²O-, -CH²S-, -CH²NH-, -CH²CH²O-, -CH²CH²NH-, -CH2CH2S-R3, R4 R5, R6 se seleccionan del grupo que consiste en H, OH, OCH³ u OCH²CH³ ; en la que R3 y R4 pueden ser iguales o diferentes; R5 y R6 pueden ser iguales o diferentes; si cualquiera de R3, R4 es diferente de OH, entonces R5 y R6 son ambos OH; si cualquiera de R5, R6 es diferente de OH, entonces R3 y R4 son ambos OH.

En una realización del compuesto, según la presente invención, R1 es N+-CH³, R3 y R4 se seleccionan del grupo que consiste en OH y OCH³ y, como mínimo, uno de R3, R4 no es OH, R5 y R6 son ambos OH, n es, como mínimo, 1. En otra realización del compuesto, según la presente invención, R2 es N+-CH³, R5 y R6 se seleccionan del grupo que consiste en OH y OCH³ y, como mínimo, uno de R5, R6 no es OH, R3 y R4 son ambos OH, m es, como mínimo, 1. De manera preferente, el compuesto de la presente invención se selecciona del grupo que consiste en los siguientes:

El objetivo de la presente invención es asimismo una composición que comprende, como mínimo, uno de los compuestos de la presente invención o, como mínimo, un estereoisómero o una sal del mismo, y un portador o diluyente adecuado.

El objetivo de la presente invención es asimismo una molécula de ARN cuyo extremo 5’ incorpora el compuesto de la presente invención.

El objetivo de la presente invención es asimismo un procedimiento de síntesis, in vitro o in vivo, de la molécula de ARN de la presente invención, comprendiendo dicho procedimiento hacer reaccionar ATP, CTP, UTP y GTP, el compuesto de la presente invención o la composición de la presente invención, y un molde de polinucleótido en presencia de ARN polimerasa, en condiciones que permiten la transcripción por la ARN polimerasa del molde de polinucleótido para dar una copia de ARN; mediante lo cual algunas de las copias de ARN incorporarán el compuesto de la presente invención para producir una molécula de ARN de la presente invención.

El objetivo de la presente invención es asimismo un procedimiento de síntesis de una proteína o un péptido in vitro, comprendiendo dicho procedimiento traducir la molécula de ARN de la presente invención en un sistema de síntesis de proteínas libre de células, en el que la molécula de ARN comprende un marco de lectura abierto, en condiciones que permiten la traducción del marco de lectura abierto de la molécula de ARN para dar la proteína o el péptido codificado por el marco de lectura abierto.

El objetivo de la presente invención es asimismo un procedimiento de síntesis de una proteína o un péptido, in vivo o en células en cultivo, comprendiendo dicho procedimiento traducir la molécula de a Rn de la presente invención in vivo o en células en cultivo, en el que la molécula de ARN comprende un marco de lectura abierto, en condiciones que permiten la traducción del marco de lectura abierto de la molécula de ARN para dar la proteína o el péptido codificado por el marco de lectura abierto.

Un objetivo adicional de la presente invención es una utilización del compuesto de la presente invención o la composición de la presente invención en la síntesis in vitro o in vivo de una molécula de ARN.

Un objetivo adicional de la presente invención es una utilización de la molécula de ARN de la presente invención en una síntesis in vitro o in vivo de una proteína o un péptido.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 representa la síntesis de análogos de caperuza de fosfotriazol.

La figura 2 representa un ejemplo de análisis mediante RP-HPLC de la reacción de CuAAC que conduce al análogo de caperuza de fosfotriazol.

La figura 3 representa el análisis en gel de poliacrilamida de ARN cortos obtenidos mediante transcripción in vitro en presencia de análogos de caperuza de fosfotriazol seleccionados junto con varios análogos de caperuza de referencia.

La figura 4 representa resultados representativos de un único experimento de eficacia de la traducción para ARNm de luciferasa con caperuza con diferentes estructuras de caperuza en lisados de reticulocitos de conejo.

La figura 5 representa el análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de reacciones de eliminación de caperuza catalizadas por Dcp2.

La figura 6 representa la eficacia de traducción relativa de análogos de caperuza de fosfotriazol seleccionados junto con varios análogos de caperuza de referencia.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 - Síntesis y aislamiento de análogos de caperuza

Se sintetizaron análogos de caperuza de fosfotriazol en reacciones de CuAAC entre dos análogos de mononucleótido “que se pueden someter a química clicK’, un nucleótido de guanina que contiene un alquino terminal dentro de la cadena de fosfato y un nucleótido que contiene azida apropiado (figura 1). Los reactantes que contienen alquino y azida se acoplaron en diferentes combinaciones en condiciones de CuAAC convencionales (CuSÜ⁴, ascorbato de sodio) en agua o la mezcla de agua y terc-butanol (tabla 1).

La tabla 1 enumera varios análogos de caperuza de fosfotriazol que se sintetizaron y caracterizaron mediante procedimientos químicos, biofísicos, bioquímicos y de biología molecular. También muestra las estructuras de los mononucleótidos utilizados como materiales de partida para la síntesis, y los rendimientos de HPLC de las síntesis correspondientes. Entre los compuestos que son particularmente favorables para la producción de ARNm con caperuza se incluyen m7GppptC²H⁴NHpG, mrGpppCHtC^NHpG, m²7,2-OGppptC²H⁴NHpG, m²7,2-OGppptC²H⁴NHppG, m27’2-OGppptC2H4ÜppG, m27,2-OGppptC2H4OpG, m27,2-OGPPtC2H4OppG.

Las reacciones se detuvieron con EDTA para garantizar la extracción eficaz de iones de cobre, que podrían interferir de otro modo con posteriores experimentos biológicos, y se purificaron directamente mediante cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC). Todos los análogos de caperuza de dinucleótido se obtuvieron con rendimientos de buenos a excelentes (del 70-100 %, superando habitualmente el 90 %) y se aislaron con alta pureza. Los materiales de partida se obtuvieron en 2-3 etapas a partir de materiales de partida disponibles en el mercado (Sigma-Aldrich). Los análogos de C-fosfonato que contienen alquino se obtuvieron mediante acoplamiento mediado por MgCl² entre sales de trietilamonio de subunidades de C-fosfonato e imidazolidas de guanosina monofosfato o difosfato, seguido por metilación en N7 con yoduro de metilo. Los análogos de fosforamidato que contienen un resto de alquino o azida se sintetizaron haciendo reaccionar propargilamina o 2-azidoetilamina y una imidazolida de nucleótido de guanina apropiada en tampón acuoso. Los análogos de fosfoéster que contienen azida se obtuvieron mediante acoplamiento mediado por MgCl² entre sales de trietilamonio de una subunidad de fosfato de azidoetilo e imidazolida de guanosina monofosfato o mediante la reacción entre H-fosfonato de guanosina protegido y azidoetanol seguido por la eliminación de los grupos protectores.

1.1. Materiales de partida y reactivos químicos

Todos los disolventes y reactivos fueron de calidad para síntesis y se utilizaron sin tratamiento adicional, a menos que se indique de otro modo. Los análogos de nucleótido de C-fosfonato (GppC²H, GppC³H³ , GppC⁴H⁵, GpppC²H, GpppC³H³, GpppC⁴H⁵),38 2’-O-metilguanosina 5’-monofosfato,6 2-azidoetanamina39 y 2’,3’-O,O-isopropilidenguanosina46 se sintetizaron tal como se ha descrito previamente en la bibliografía citada respectiva.

1.2. Cromatografía

1.2.1. Cromatografía de intercambio iónico

Los análogos de mononucleótido sintetizados funcionalizados con un grupo alquino o azida se purificaron mediante cromatografía de intercambio iónico en una columna de DEAE A-25 de Sephadex (forma de HCO³-). Después de cargar la columna con la mezcla de reacción y lavarla con agua, los productos se eluyeron utilizando diferentes gradientes de TEAB en agua desionizada: 0-0,7 M para nucleósidos monofosfato, 0-1,0 M para nucleósidos difosfato o 0-1,2 M para nucleósidos trifosfato. Las fracciones que contenían el producto deseado se recogieron conjuntamente después de análisis mediante RP-HPLC y espectrofotométrico (a 260 nm). La evaporación a presión reducida con adiciones repetidas de etanol al 96 %, a continuación etanol al 99,8 % y, al final, MeCN dio lugar al aislamiento de análogos de nucleótido como sales de trietilamonio (TEA).

1.2.2. HPLC de fase inversa (RP-HPLC) analítica y preparativa

Se realizaron HPLC analítica y semipreparativa en un dispositivo de la serie 1200 de Agilent Technologies con detección UV a 254 nm y detección de fluorescencia (excitación: 260 nm, emisión: 370 nm). Para las reacciones químicas y enzimáticas, se realizó HPLC analítica de monitorización utilizando una columna Supelcosil LC-18-T (4,6 x 250 mm, 5 pmi, caudal de 1,3 ml/min) con uno de tres gradientes lineales diferentes de metanol en tampón acetato de amonio 0,05 M (pH 5,9): programa A - gradiente de 0-25 % de metanol en 15 min, programa B - gradiente de 0­ 50 % de metanol en 15 min, programa C - gradiente de 0-50 % de metanol en 7,5 minutos y, a continuación, elución isocrática (50 % de metanol) hasta 15 minutos. Para estudios de degradación dependiente del pH y la monitorización de reacciones de las diferentes etapas de la síntesis de análogos ARCA, se realizó HPLC analítica utilizando una columna Grace VisionHT C18-HL (4,6 x 250 mm, 5 pmi, caudal de 1,3 ml/min) con un gradiente lineal de 0-25 % de metanol en tampón acetato de amonio 0,05 M (pH 5,9) en 15 minutos. Se realizó RP-HPLC semipreparativa utilizando una columna para HPLC Discovery RP Amide C-16 (25 cm x 21,2 mm, 5 pmi, caudal de 5,0 ml/min) con gradientes lineales de acetonitrilo en tampón acetato de amonio 0,05 M (pH 5,9). Los productos, después, como mínimo, de triple liofilización, se aislaron como sales de amonio.

En la figura 2 se muestran resultados a modo de ejemplo para el análisis mediante RP-HPLC de la reacción de CuAAC que conduce al análogo de caperuza de fosfotriazol.

1.3. Determinación de rendimientos y concentraciones

Los rendimientos de análogos de mononucleótido después de la purificación mediante intercambio iónico y las concentraciones de las soluciones de análogos de mononucleótido y dinucleótido utilizadas para los experimentos biofísicos y biológicos se determinaron basándose en mediciones de absorbancia realizadas a 260 nm en tampón fosfato 0,1 M pH 6,0 para análogos de mononucleótido de 7-metilguanina y en tampón fosfato 0,1 M pH 7,0 para análogos de dinucleótido y análogos de mononucleótido de guanina. Las cantidades de los productos purificados mediante intercambio iónico obtenidos se expresaron como miliunidades de densidad óptica (mu opt. = absorbancia de la solución por volumen en ml). Para el cálculo de rendimientos y concentraciones, se utilizaron los siguientes coeficientes de extinción molar [M-1 cm-1]: e = 22.600 (dinucleótidos), e = 11.400 (mononucleótidos de m7G), e = 12.080 (mononucleótidos de G). Las concentraciones de los transcritos se determinaron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 2000c (Thermo Scientific).

1.4. Espectroscopia de RMN y espectrometría de masas

La estructura y la pureza de cada producto final se confirmaron mediante espectrometría de masas de alta resolución utilizando ionización por electropulverización negativa o positiva (HRMS (“high resolution mass spectrometry”) (-) ESI o HRMS (+) ESI) y espectroscopía de 1H-RMN, 31P-RMN, gDQCOSY y gHSQCAD. Los espectros de masas se registraron en un espectrómetro LTQ OrbitrapVelos de Thermo Scientific. Los espectros de rMn se registraron en un espectrómetro INOVA 400 MHz o 500 MHz de Varian equipado con una unidad de temperatura de alta estabilidad que utiliza una sonda 4NUC de 5 mm, a 25 °C, si no se indica de otro modo, a 399,94/500,61 MHz (1H-RMN) y 161,90/202 MHz (31P-RMN). Los desplazamientos químicos de 1H-RMN y 31P-RMN se notificaron en ppm y se obtuvieron con referencia a patrones internos respectivos: 3-(trimetilsilil)-2,2’,3,3’-tetradeuteropropionato de sodio (TSP) y ácido fosfórico al 20 % en D²O. Las señales en los espectros de 1H-RMN de los dinucleótidos se asignaron según los espectros de RMN-2D (gDQCOSY, gHSQCAD). En la asignación de las señales de 31P de los análogos de caperuza de dinucleótido, los fosfatos se indicaron de manera análoga a m7G(p5)pYpppaG.

Algunos análogos de caperuza se hidrolizaron en D²O de manera gradual. Aunque los compuestos puros (véase los perfiles de HPLC, Información complementaria 2) se disolvieron en D²O justo antes de las mediciones, los espectros indicaron cierto nivel de hidrólisis. El % de hidrólisis se proporciona junto con los datos de caracterización de los compuestos, si es mayor del 5 %.

1.5. Síntesis de derivados de imidazolida de nucleótido

1.5.1. Preparación de compuestos para la activación de imidazol

Preparación de sales de trietilamonio (TEA)

La sal de disodio de guanosina 5’-monofosfato (GMP) y pirofosfato de tetrasodio disponibles en el mercado se convirtieron en formas de trietilamonio haciendo pasar sus soluciones acuosas (aproximadamente 1 g/20 ml) a través del intercambiador de cationes 50 W x 8 de Dowex. Los eluatos recogidos se evaporaron a presión reducida con adiciones repetidas de etanol y acetonitrilo hasta sequedad produciendo la sal de trietilamonio de nucleótido como un sólido blanco y pirofosfato de trietilamonio como un aceite incoloro.

El fosfato de trietilamonio se preparó añadiendo lentamente trietilamina a la solución poco concentrada de H² PO⁴ en agua hasta que se obtuvo pH 7, que estuvo seguido por evaporación para proporcionar un residuo incoloro y oleoso. Síntesis de guanosina 5’-difosfato (GDP), guanosina 5’-trifosfato (GTP) y 2 ’-O-metilguanosina 5’-difosfato (m2-OGDP) Se suspendió fosfato de trietilamonio (4 equivalentes) o pirofosfato de trietilamonio (4 equivalentes) en DMF (aproximadamente 0,4 M) en presencia de ZnCb (4 equivalentes) y se agitó durante ~5 minutos para obtener una solución. A continuación, se añadió GMP-Im o m2-OGMP-Im (1 equivalente) junto con una segunda porción de ZnCl² (4 equivalentes) y la mezcla se agitó durante 1-2 horas a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante una dilución de 10 veces con agua y la adición de EDTA (8 equivalentes) y NaHCO³ (aproximadamente 17,6 equivalentes). La purificación mediante intercambio iónico proporcionó la sal de trietilamonio de GDP (64 %), GTP (79 %) y m2-OGDP (95 %).

Metilación en N7 de nucleótidos de guanina (GMP, GDP y GTP)

Se disolvió un análogo apropiado (GMP, GDP o GTP, sal de TEA) en DMSO anhidro para obtener una solución aproximadamente 0,1 M, seguido por la adición de CH³ l (8 equivalentes). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante varias horas hasta que el análisis mediante HpLc indicó una conversión de más del 90 % del sustrato y la presencia de nucleótido metilado en N7 como el producto mayoritario. La reacción se detuvo mediante una dilución de 10 veces con agua y los compuestos solubles en disolventes orgánicos se extrajeron lavando 3 veces con dietil éter. A continuación, la fase acuosa se trató con una pizca de Na²S²O⁵ para reducir el yodo residual y el pH de la solución se ajustó a 7 mediante la adición de NaHCO³ sólido. La purificación mediante intercambio iónico posterior proporcionó la sal de trietilamonio de m7GMP (63 %), m7GDP (68 %) o m7GTP (58 %).

1.5.2. Activación con imidazol

Síntesis de imidazolidas de nucleótido

Los compuestos se prepararon según Mukaiyama y Hashimoto.40 Se mezclaron un nucleótido apropiado (1 equivalente, sal de TEA), imidazol (10 equivalentes), 2,2’-ditiodipiridina (3 equivalentes) en DMF (~2,5 ml/100 mg de nucleótido) antes de la adición de trietilamina (3 equivalentes) y trifenilfosfina (3 equivalentes). La mezcla se agitó durante 6-8 horas a temperatura ambiente. La adición de una solución de NaClO⁴ anhidro (4 equivalentes) en acetona anhidra (~8 volúmenes del volumen de DMF) dio lugar a la precipitación del producto como sal de sodio. La suspensión se enfrió a 4 °C y el precipitado se separó por filtración, se lavó repetidamente con acetona anhidra y fría y se secó a vacío sobre P⁴O¹⁰. Rendimientos del 90-100 %.

1.6. Síntesis de análogos de nucleótido de C-fosfonato de m⁷G

Procedimiento general B (PG B): metilación en N7 de nucleótidos de guanina utilizando CH³I

Se disolvió un nucleótido apropiado (sal de TEA) en DMSO anhidro para obtener una solución aproximadamente 0,1 M, seguido por la adición de CH³ l (8 equivalentes). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante varias horas hasta que el análisis mediante HPLC indicó una conversión de más del 90 % del sustrato y la presencia de nucleótido metilado en N7 como el producto mayoritario. La reacción se detuvo mediante una dilución de 10 veces con agua y los compuestos solubles en disolventes orgánicos se extrajeron lavando 3 veces con dietil éter. A continuación, la fase acuosa se trató con una pizca de Na²S²O⁵ para reducir el yodo residual y el pH de la solución se ajustó a 7 mediante la adición de NaHCO³ sólido. El producto se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico en una columna de DEAE A-25 de Sephadex y se evaporó hasta sequedad, tal como se describe en la Información general. Antes de la caracterización mediante RMN, el producto se purificó adicionalmente mediante HPLC semipreparativa, tal como se describe en la Información general.

Procedimiento general C (PG C): metilación en N7 de nucleótidos de guanina utilizando (CHs)² SÜ⁴

Se disolvió un nucleótido apropiado (sal de TEA) a una concentración ~ 0,2 M en CH³COOH acuoso aproximadamente 0,5 mM (pH 4) para obtener una solución aproximadamente 0,2 M. A continuación, 5 porciones de (CH³)²SO⁴ (2 equivalentes cada una) se añadieron cada 10 minutos a la mezcla con agitación vigorosa y el pH se mantuvo en 4 mediante la adición de KOH al 10 %, si era necesario. Se continuó con la agitación a temperatura ambiente durante varias horas hasta que el análisis mediante HPLC indicó una conversión de más del 90 % del sustrato y la presencia de nucleótido metilado en N⁷ como el producto mayoritario. La reacción se detuvo mediante una dilución de 10 veces con agua y los compuestos solubles en disolventes orgánicos se extrajeron lavando 3 veces con dietil éter. A continuación, el pH de la fase acuosa se ajustó a 7 mediante la adición de NaHCO³ sólido. El producto se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico en una columna de DEAE A-25 de Sephadex y se evaporó hasta sequedad, tal como se describe en la Información general. Antes de la caracterización mediante RMN, el producto se purificó adicionalmente mediante HPLC semipreparativa, tal como se describe en la Información general.

Sales de trietilamonio de p-C-(2-etinil), p-C-(2-propargil) y p-C-(3-butinil)-guanosina difosfato y y-C-(2-etinil), y-C-(2-propargil) y y-C-(3-butinil)-guanosina trifosfato (GppC²H, GPPC³H³, GPPC⁴H⁵, GpppC²H, GPPPC³H³, GPPPC⁴H⁵)

Los compuestos se obtuvieron según Wanat et al.³⁸ De manera resumida, 3-butinil-C-fosfonato de trietilamonio, 3-trimetilsilil-1 -propargil-C-fosfonato de tributilamonio o 2-etinil-C-fosfonato de trietilamonio (2,5 equivalentes cada uno) se agitó en DMF (aproximadamente 0,4 M) hasta la disolución completa. A continuación, se añadieron una imidazolida de nucleótido apropiada (1 equivalentes) junto con MgCl² (8 equivalentes) y la mezcla se agitó durante 1-2 horas a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante una dilución de 10 veces con agua. El producto se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico en una columna de DEAE A-25 de Sephadex y se evaporó hasta sequedad, tal como se describe en la Información general, para proporcionar productos en forma de sales de trietilamonio. A continuación, los análogos de nucleótido de trimetilsililpropargilofosfonato se desprotegieron mediante incubación en una mezcla de TBAF/THF (1 M):ACN (1:3, v/v) (1,1 equivalentes de TBAF por nucleótido) a temperatura ambiente durante 24 horas. Después de eliminar el disolvente a presión reducida, el producto en bruto se sometió directamente a reacciones de tipo click. Rendimientos: 45-90 %.

Sal de amonio de p-C-(3-butinil)-7-metilguanosina difosfato (m7GppC⁴Hs)

Se obtuvo según el PG B partiendo de sal de trietilamonio de p-C-(3-butinil)-guanosina difosfato (11000 mDO, 0,910 mmol), CH³l (0,454 ml, 7,285 mmol) y DMSO (9,0 ml). La purificación mediante intercambio iónico proporcionó 7061 mDO (0,619 mmol, 68 %) de sal de trietilamonio de m⁷GppC⁴H⁵. La purificación mediante HPLC adicional de una fracción del producto obtenido produjo m⁷GppC⁴H⁵ como sal de amonio.

¹H-RMN (400 MHz, D²O, 25 °C) S^h: 9,21 (1H, s, H8), 6,08 (1H, d, J¹ -²’ = 3,6, H1 ’), 4,70 (1H, dd, J¹ -²’ = 3,6, J² -³’ = 4,7, H2’), 4,51 (1H, dd, J² -³’ = 4,7, J³ -⁴’ = 5,5, H3’), 4,39-4,43 (1H m, H4’), 4,34 (1H, ddd, J^{5 5} = 12,0, J = 4,2, 2,5, H5’), 4,22 (1H, ddd, J⁵ -⁵” = 12,0, J = 5,2, 2,2, H5”), 4,13 (3H, s, m⁷), 2,46 (2H, dtd, Jch²(C²H)-ch = 2,6, Jch²(C²H)-ch²(P) = 8,1, JcH²(C²H)-Pp = 10,1, H^cH²(C²H)), 2,34 (1H, t, J^cH-CH²(C²H) = 2,6, H^ch), 1,94 (2H, dt, J^cH²(C²H)-CH²(P) = 8,1, JcH²(P)-Pp = 16,9, Hch²(P)); ³¹P-RMN (162 MHz, D²O, 25 °C) Sp: 16,45 (1P, dtt, JcH²(C²H)-pp = 10,1, Jch²(P)-pp = 16,9, Jpa-pp = 26,6, Pp), -11,34 (1P, d ancho, Jpa-pp = 26,6, Pa); HRMS (-) ESI m/z hallado: 492,0692, calculado para C¹⁵H²⁰N⁵O¹⁰P²-: 492,0685.

Sal de amonio de y-C-(3-butinil)-7-metilguanosina trifosfato (m7GpppC⁴H⁵)

Se obtuvo según el PG B partiendo de sal de trietilamonio de y-C-(3-butinil)-guanosina trifosfato (GPPPC⁴H⁵) (11000 mDO, 0,910 mmol), CH³ l (0,454 ml, 7,285 mmol) y DMSO (^{9 , 0} ml). La purificación mediante intercambio iónico proporcionó 7677 mDO (0,673 mmol, 74 %) de sal de trietilamonio de m7GpppC⁴H⁵. La purificación mediante HPLC adicional de una fracción del producto obtenido produjo m7GpppC⁴H⁵ como sal de amonio.

1H-RMN (400 MHz, D²O, 25 °C) S^h: 9,23 (1H, s, H8), 6,08 (1H, d, J¹ -²’ = 3,5, H1 ’), 4,69 (1H, dd, J¹ -²’ = 3,5, J² -³’ = 4,7, H2’), 4,54 (1H, dd, J² -³’ = 4,7, J³ -⁴’ = 5,5, H3’), 4,35-4,42 (2H, H4’ y H5’ solapados), 4,26 (1H, ddd, Jss- = 12,0, J = 5.2, 1,7, H5"), 4,13 (3H, s, m7), 2,44 (2H, dtd, Jch-ch²(C²H) = 2,5, Jch²(P)-ch²(C²H) = 8,3, JcH²(C²H)-Py = 11,2, Hch²(C²H)), 2,26 (1H, t, Jch-ch²(C²H) = 2,5, Hch), 1,99 (2H, dt, Jch²(P)-ch²(C²H) = 8,3, JcH²(P)-Py = 16,7, Hch²(P)); 31P-RMN (162 MHz, D²O, 25 °C) S^p: 16,46 (1P, dtt, J^ch2(C²H)-^py = 11,2, J^ch2(P)-^py = 16,7, Jpp-pY = 25,0, Py), -11,47 (1P, d ancho, Jpa-pp = 19.2, Pa), -23,10 (1P, dd, Jpa-pp = 19,2, JpP-py = 25,0, Pp); HRMS (-) ESI m/z hallado: 572,0357, calculado para C¹⁵H²¹N⁵O¹³P³-: 572,0349.

Sal de amonio de p-C-(2-propargil)-7-metilguanosina difosfato (m7GppCs^ Hs)

Se obtuvo según el PG B partiendo de sal de trietilamonio de p-C-(2-propargil)-guanosina difosfato (8310 mDO, 0,688 mmol), CH³l (0,343 ml, 5,503 mmol) y DMSO (7,0 ml). La purificación mediante intercambio iónico proporcionó 4706 mDO (0,413 mmol, 60 %) de sal de trietilamonio de m7GppC³H³. La purificación mediante HPLC adicional de una fracción del producto obtenido produjo m7GppC³H³ como sal de amonio.

1H-RMN (400 MHz, D²O, 25 °C) Sh: 6,06 (1H, d, J¹ -²’ = 3,5, H1’), 4,68 (1H, dd, J¹ -²’ = 3,5, J² -³’ = 5,0, H2’), 4,50 (1H, dd, J² -³’ = 5,0, J³ -⁴’ = 5,5, H3’), 4,40-4,42 (1H, m, H4’), 4,36 (1H, ddd, J^5-5- =11,8, J = 4,0, 2,4, H5’), 4,23 (1H, ddd, J⁵ -⁵" =11,8, J =5,4, 2,0, H5”), 4,12 (3H, s, m7), 2,76 (2H, dd, Jch²-pp = 21,4, Jch²-ch = 2,7, Hch²), 2,34 (1H, dt, Jch-ch² = 2,7, Jch-pp = 6,5, Hch); 31P-RMN (162 MHz, D²O, 25 °C) Sp: 9,44 (1P, dtd, Jpa-pp = 24,2, Jch²-pp = 21,4, Jch-pp = 6,5, PP), -10,76 (1P, d ancho, Jpa-pp = 24,2, Pa); HRMS (-) ESI m/z hallado: 478,0521, calculado para C¹⁴H¹⁸N⁵O¹⁰P²-: 478,0529.

Sal de amonio de Y-C-(2-propargil)-7-metilguanosina trifosfato (m7GpppCs^Hs)

Se obtuvo según el PG B partiendo de sal de trietilamonio de y-C-(² -propargil)-guanosina trifosfato (10000 mDO, 0,828 mmol), CH³l (0,412 ml, 6,622 mmol) y DMSO (8,0 ml). La purificación mediante intercambio iónico proporcionó 6324 mDO (0,555 mmol, 67 %) de sal de trietilamonio de m7GppC³H³. La purificación mediante HPLC adicional de una fracción del producto obtenido produjo 11 d como sal de amonio.

1H-RMN (400 MHz, D²O, 25 °C) Sh: 6,06 (1H, d, J¹ -²’ = 3,49, H1’), 4,69 (1H, dd, J¹ -²’ = 3,49, J² -³’ = 4,73, H2’), 4,53 (1H, dd, J² -³’ = 4,73, J³ -⁴’ = 5,48, H3’), 4,35-4,42 (1H, H4’ y H5’ solapados), 4,24-4,28 (1H, ddd, J^s- =11,7, J = 5,2, 2,0, H5"), 4,13 (3H, s, m7), 2,78 (2H, dd, JcH²-Py =21,7, Jch²-ch = 2,5, Hch²), 2,34 (1H, dt, Jch²-ch = 2,5, Jch-Py = 6,5, H^ch); 31P-RMN (162 MHz, D²O, 25 °C) S^p: 9,38 (1P, dtd, J^ch2-^py =21,7, J^pP-^py = 23,9, J^ch-^py = 6,5, Py), -10,85 (1H, d ancho, Jpa-pp = 19,2, Pa), -22,50 (1P, dd, Jpa-pp = 19,2, JpP-py = 23,9, Pp); HRMS (-) ESI m/z hallado: 558,0184, calculado para C¹⁴H¹⁹N⁵O¹³P³-: 558,0192.

Sal de amonio de p-C-(2-etinil)-7-metilguanosina difosfato (m7GppC²H)

Se obtuvo según el PG C partiendo de sal de trietilamonio de p-C-(2-etinil)-guanosina difosfato (10000 mDO, 0,828 mmol), (CH³)²SO⁴ (0,785 ml, 8,278 mmol) y solución de CH³COOH pH 4 (8,0 ml). La purificación mediante intercambio iónico proporcionó 4814 mDO (0,422 mmol, 51 %) de sal de trietilamonio de m7GppC²H. La purificación mediante HPLC adicional de una fracción del producto obtenido produjo m7GppC²H como sal de amonio.

1H-RMN (400 MHz, D²O, 25 °C) S^h: 6,08 (1H, d, J¹ -²’ = 3,7, H1’), 4,70 (1H, dd, J¹ -²’ = 3,7, J² -³’ = 4,7, H2’), 4,51 (1H, dd, J² -³’ = 4,7, J³ -⁴’ = 5,5, H3’), 4,41-4,44 (1H, m, H4’), 4,38 (1H, ddd, Jss- = 11,7, J = 4,3, 2,4, H5’), 4,24 (1H, ddd, J⁵ -⁵" = 11,7, J = 5,3, 2,2, H5"), 4,13 (3H, s, m7), 3,20 (1H, d, Jpy-c²H = 11,6, Hc²h); 31P-RMN (162 MHz, D²O, 25 °C) Sp: -10,58 (1P, d ancho, Jpa-pp = 22,0, Pa),-20,86 (1P, dd, Jpy-pP = 22,0, Jpy-c²h = 11,6, Pp); HRMS (-) ESI m/z hallado: 464,0378, calculado para C¹³H¹⁶N⁵O¹⁰P²-: 464,0372.

Sal de amonio de y-C-(2-etinil)-7-metilguanosina trifosfato (m7GpppC²H)

Se obtuvo según el PG B partiendo de sal de trietilamonio de y-C-(2-etinil)-guanosina trifosfato (10000 mDO, 0,828 mmol), (CH³)²SO⁴ (0,785 ml, 8,278 mmol) y solución de CH³COOH pH 4 (8,0 ml). La purificación mediante intercambio iónico proporcionó 5569 mDO (0,488 mmol, 59 %) de sal de trietilamonio de m7GpppC²H. La purificación mediante HPLC adicional de una fracción del producto obtenido produjo m7GpppC²H como sal de amonio.

1H-RMN (400 MHz, D²O, 25 °C) Sh: 6,08 (1H, d, J¹ -²’ = 3,9, H1’), 4,70 (1H, dd, J¹ -²’ = 3,9, J² -³’ = 4,9, H2’), 4,54 (1H, dd, J² -³’ = 4,7, J³ -⁴’ = 5,3, H3’), 4,41-4,44 (1H, m, H4’), 4,38 (1H, ddd, Jss- = 11,7, J = 4,1, 2,5, H5’), 4,24 (1H, ddd, J⁵ -⁵" = 11,7, J = 5,1, 2,0, H5"), 4,14 (3H, s, m7), 3,18 (1H, d, J = 12,9, H^c2h); 31P-RMN (162 MHz, D²O, 25 °C) S^p: -10,80 (1P, d ancho, Jpa-pp = 20,5, Pa), -21,02 (1P, dd, Jpy-pp = 20,5, Jpy-C²H = 11,7, Py), -22,93 (1P, t, Jpa-pp = Jpy-pp = 20,5, Pp); HRMS (-) ESI m/z hallado: 544,0042, calculado para C¹³H¹⁷N⁵O¹³P³-: 544,0036.

Sal de trietilamonio de p-C-(2-etinil)-2’-O-metilguanosina difosfato (m2'°GppC²H)

Se agitó 2-etinil-C-fosfonato de trietilamonio (1,053 mmol, 0,35 M) en 3 ml de DMF hasta la disolución completa. A continuación, se añadieron sal de sodio de P-imidazolida de 2’-O-metilguanosina 5’-monofosfato (4241 mDO, 0,35 mmol) junto con MgCl² (268 mg, 2,8 mmol) y la mezcla se agitó durante 0,5 horas a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante una dilución de 10 veces con agua. El producto se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico en una columna de DEAE A-25 de Sephadex y se evaporó hasta sequedad, tal como se describe en la Información general, para proporcionar 3647 mDO (0,302 mmol, 86 %) de sal de trietilamonio de m2-OGppC²H. La purificación mediante HPLC adicional de una fracción del producto obtenido produjo m2-OGppC²H como sal de amonio.

¹H-RMN (500 MHz, óxido de deuterio) 88,14 (s, 1H, H8), 5,93 (d, J = 6,5 Hz, 1H, H1’), 4,85 (dd, J = 6,5, 5,2 Hz, 1H, H2’), 4,59 (dd, J = 5,2, 3,0 Hz, 1H, H3’), 4,40 - 4,35 (m, 1H, H4’), 4,28 (ddd, J = 11,5, 6,0, 3,4 Hz, 1H, H5’), 4,22 (ddd, J = 11,5, 4,9, 3,5 Hz, 1H), 3,18 (d, J = 12,9 Hz, 1H, Hc²h); ³¹P-RMN (202 MHz, óxido de deuterio) 8 -10,58 (dt, J = 18.7, 6,0 Hz, 1P, Pa), -20,84 (dd, J = 18,6, 12,9 Hz, 1P, P8), -22,53 (t, J = 18,0 Hz, 1P, Pp o Py), -23,04 (t, J = 18,0 Hz, 1P, Pp o Py); HRMS (-) ESI m/z hallado: 464,0379, calculado para C¹³H¹⁶N⁵O¹⁰P²-: 464,0378.

Sal de trietilamonio de y-C-(2-etinil)-2’-O-metilguanosina trifosfato (m2-OGpppC²H)

Se agitó 2-etinil-C-fosfonato de trietilamonio (1,698 mmol, 0,2 M) en 8,5 ml de DMF hasta la disolución completa. A continuación, se añadieron sal de trisodio de p-P-imidazolida de 2’-O-metilguanosina 5’-difosfato (6842 mDO, 0,566 mmol) junto con MgCl² (431 mg, 4,531 mmol) y la mezcla se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante una dilución de 10 veces con agua. El producto se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico en una columna de DEAE A-25 de Sephadex y se evaporó hasta sequedad, tal como se describe en ; la Información general, para proporcionar 6385 mDO (0,528 mmol, 93 %) de sal de trietilamonio de m2-OGpppC²H. La purificación mediante HPLC adicional de una fracción del producto obtenido produjo m2-OGpppC²H como sal de amonio.

¹H-RMN (400 MHz, D²O, 25 °C) ⁸ h: 8,13 (1H, s, H8), 5,99 (1H, d, J¹ -²’ = 6,5, H1’), 4,74 (1H, dd, J² -³’ = 5,1, J³ -⁴’ = 3,1, H3’), 4,56 (1H, dd, J² -³’ = 5,1, J¹ -²’ = 6,5, H2’), 4,36-4,39 (1H, m, H4’), 4,28 (1H, ddd, JS-S- = 11,7, JPa-⁵’ = 5,9, J⁴ -⁵’ = 3,5, H⁵ ’), 4,24 (1H, ddd, J⁵’-y = 11,7, J^-^s- = 5,1, Jpa-⁵- = 3,4, H5"), 3,47 (3H, s, m^{2 - 0} ), 3,18 (1H, d, J^c2H-^ry = 13,1, H^c2h); ³¹P-RMN (162 MHz, D²O, 25 °C) ⁸ p: -10,80 (1P, ddd, JPa-PP = 20,5, Jpa-⁵’ = 5,9, Jpa-⁵- = 3,4, Pa), -21,02 (1P, dd, Jc²h-py = 13,1, JrP-ry = 19,1, Py), -22,99 (1P, dd, JpP-py = 10,1, JPa-PP = 20,5, Pp); HRMS (-) ESI m/z hallado: 544,0044, calculado para C¹³H¹⁷N⁵O¹³P³-: 544,0036.

Sal de amonio de p-C-(2-etinil)-2’-O-N7-dimetilguanosina difosfato (m²7'2-OGppC²H)

Se obtuvo según el PG C partiendo de sal de trietilamonio de p-C-(2-etinil)-2’-0 ’metilguanosina difosfato (3100 mDO, 0,257 mmol), (CH³)SO⁴ (0,292 ml, 3,08 mmol) y solución de CH³COOH pH 4 (3,1 ml). La purificación mediante intercambio iónico proporcionó 2180 mDO, (0,191 mmol, 74 %) de sal de trietilamonio de m²72-OGppC²H. La purificación mediante HPLC adicional de una fracción del producto obtenido produjo m²7,2’-OGppC²H como sal de amonio.

¹H-RMN (500 MHz, óxido de deuterio) 86,16 (d, J = 3,5 Hz, 1H, H1’), 4,62 (t, J = 4,9, 5,5 Hz, 1H, H3’), 4,41 (dd, J = 4,9, 3,5 Hz, 1H, H2’), 4,40 - 4,38 (m, 1H, H⁴ ’), 4,36 (ddd, J = 11,8, 4,3, 2,4 Hz, 1H, H5’), 4,23 (ddd, J = 11,8, 5,2, 2,1 Hz, 1H, H5"), 4,13 (s, 3H, m⁷), 3,60 (s, 3H, m2’-°), 3,19 (d, J = 12,5 Hz, 1H, C²H); ³¹P-RMN (202 MHz, óxido de deuterio) 8 -11,00 (dt, J = 22,1, 4,5 Hz, 1P, Pa), -20,80 (dd, J = 22,1, 12,5 Hz, 1P, Pp); HRMS (-) ESI m/z hallado: 478,0537, calculado para C¹⁴H¹⁸N⁵O¹⁰P²-: 478,0534.

Sal de amonio de Y-C-(2-etinil)-2’-O-N7-dimetilguanosina trifosfato (m²7'2-OGpppC²H)

Se obtuvo según el PG C partiendo de sal de trietilamonio de y-C-(2-etinil)-2’-O’metilguanosina trifosfato (5380 mDO, 0,445 mmol), (CH³)SO⁴ (0,422 ml, 4,454 mmol) y solución de CH³COOH pH 4 (5,0 ml). La purificación mediante intercambio iónico proporcionó 4014 mDO (0,352 mmol, 79 %) de sal de trietilamonio de m²7,2-OGpppC²H. La purificación mediante HPLC adicional de una fracción del producto obtenido produjo m²7,2’-OGpppC²H como sal de amonio.

1H-RMN (400 MHz, D²O, 25 °C) 8^h: 6,16 (1H, d, J¹ -²’ = 3,1, H1’), 4,65 (1H, dd, J = 5,1, 5,5, H3’), 4,36-4,42 (3H, H2’, H4’ y H5’ solapados), 4,26 (1H, ddd, J⁵ -⁵- = 12,5, Jpa.s- = 4,8, J^{4 -5}- = 2,7, H5"), 4,14 (3H, s, m7), 3,61 (3H, s, m2’-°), 3,18 (1H, d, Jry-c²h = 12,9, Hc²h); 31P-RMN (162 MHz, D²O, 25 °C) 8r: -10,80 (1P, ddd, Jpa-pp = 20,5, Jpa.s = 7,3, Jpa.s-= 4,8, Pa), -21,05 (1P, dd, JrP-ry = 19,1, Jry-c²h = 12,9, Py), -22,91 (1P, dd, Jrp-ry = 19,1, Jpa-pp = 20,5, Pp); HRMS (-) ESI m/z hallado: 558,0200, calculado para C¹⁴H¹⁹N⁵O¹³P³-: 558,0192.

1.7. Síntesis de análogos de nucleótido de fosforamidato

Procedimiento general D (PG D): acoplamiento de imidazolidas de nucleótido con enlazador de amina

Los compuestos se sinterizaron de manera análoga a como se describe en Guranowski et al. para la reacción de enlazadores de diamina con 5’-fosforimidazolida de guanosina.41 Una imidazolida de nucleótido apropiada se disolvió en tampón Tris-HCI 0,1 M pH 8,0 (aproximadamente 1 ml por 100 mg de nucleótido) y se añadió propargilamina o 2-azidoetiloamina (8 equivalentes). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas.

La reacción se diluyó con diez volúmenes de agua y se lavó con dietil éter. Después de ajustar el pH a 7 con HCI al

5 %, la fase acuosa se sometió a purificación mediante cromatografía de intercambio iónico, tal como se describe en la Información general, para proporcionar el producto deseado como sal de trietilamonio, o se purificó directamente mediante HPLC semipreparativa para proporcionar el producto deseado como sal de amonio.

1.7.1. Síntesis de análogos de nucleótido de fosforamidato modificados con azida

Sal de amonio de N-(2-azidoetil)-fosforamidato de guanosina monofosfato (GPNHC²H⁴N³)

Se obtuvo según el PG D partiendo de sal de sodio de P-imidazolida de guanosina 5’-monofosfato (200 mg, 4800 mDO, 0,397 mmol), 2-azidoetilamina (0,349 ml, 3,179 mmol) y 2,0 ml de tampón Tris-HCI. La purificación mediante intercambio iónico proporcionó 4004 mDO (0,331 mmol, 83 %) de sal de trietilamonio de GpNHC²H⁴N³. La purificación mediante HPLC adicional de una fracción del producto obtenido produjo GpNHC²H⁴N como sal de amonio.

1H-RMN (400 MHz, D²O, 25 °C) Sh: 8,11 (1H, s, H8), 5,93 (1H, d, J¹ -²’ = 5,9, H1’), 4,84 (1H, dd, J¹ -²’ = 5,9, J² -³’ = 5,1, H2’), 4,51 (1H, dd, J² -³’ = 5,1, J³ -⁴’ = 3,9, H3’), 4,31-4,34 (1H, m, H4’), 4,04 (1H, ddd, J⁵ -⁵-’ = 11,7, J = 4,7, 3,1, H5’), 4,00 (1H, ddd, J⁵ -⁵" = 11,7, J = 5,1, 3,5), 3,24 (2H, t a, J^ch2(N3)-^ch2(^nh) = 5,9, H^ch2(N3)), 2,89 (2H, dt, J^ch2(N3)-^ch2(^nh) =

5.9, Jch²(N³)-p« = 10,2, Hch²(nh)); 31P-RMN (162 MHz, D²O, 25 °C) Sp: 9,37-9,55 (1P, m, Pa); HRMS (-) ESI m/z hallado: 430,0991, calculado para C¹²H¹⁷N⁹O⁷ P-: 430,0989.

Sal de amonio de N-(2-azidoetil)-p-fosforamidato de guanosina difosfato (GppNHC²H⁴N³)

Se obtuvo según el PG D partiendo de sal de disodio de p-P-imidazolida de guanosina 5’-difosfato (458 mg, 8244 mDO, 0,682 mmol), 2-azidoetilamina (0,600 ml, 5,460 mmol) y 4,5 ml de tampón Tris-HCI. La purificación mediante intercambio iónico proporcionó 7085 mDO (0,586 mmol, 86 %) de sal de trietilamonio de GppNHC²H⁴N³.

La purificación mediante HPLC adicional de una fracción del producto obtenido produjo GppNHC²H⁴N³ como sal de amonio.

1H-RMN (400 MHz, D²O, 25 °C) S^h: 8,12 (1H, s, H8), 5,93 (1H, d, J¹ -²’ = 6,3, H1’), 4,80 (1H, solapado con HDO, H2’), 4,53 (1H, dd, J = 3,7, 5,3, H3’), 4,33-4,36 (1H, m, H4’), 4,18-4,21 (1H, m, H5’ y H5"), 3,32 (2H, t a, J^ch2(N³)-^ch2(^nh) =

5.9, H^ch2(N3)), 3,03 (2H, dt, J^ch2(N3)-^ch2(^nh) = 5,9, JcH2(N3)-pp = 10,4, H^ch2-^nh); 31P-RMN (162 MHz, D²O, 25 °C) S^p: -1,04

(1P, dt, Jch²(N³)-pp = ^{1 0} ,⁴ , JPa-PP = 22,0, PP), -10,26 (1P, d ancho, JPa-PP = 22,0, Pa); HRMS (-) ESI m/z hallado:

510,0657, calculado para C¹²H¹⁸N⁹O¹⁰P²-: 510,0652; hidrólisis en D²O: 15 %.

Sal de amonio de N-(2-azidoetil)-fosforamidato de 7-metilguanosina monofosfato (m⁷GpNHC²H⁴N³)

Se obtuvo según el PG D partiendo de sal de sodio de P-imidazolida de 7-metil-guanosina 5’-monofosfato (450 mg, 9900 mDO, 0,868 mmol), 2-azidoetilamina (0,764 ml, 6,944 mmol) y 4,5 ml de tampón Tris-HCI. La purificación directa mediante HPLC posterior proporcionó 3520 mDO de m7GpNHC²H⁴N³ (0,309 mmol, 36 %) como sal de amonio.

1H-RMN (400 MHz, D²O, 25 °C) Sh: 6,08

d, J¹ -²’ = 3,9, H1’), 4,68 (1H, dd, J¹ -²’ = 3,9, J² -³’ = 4,9, H2’), 4,48 (1H, dd, J² -³’ = 4,9, J³ -⁴’ = 5,4, H3’), 4,38-4,41 (1H, m, H4’), 4,18 (1H, ddd, J⁵ -⁵-’ = 11,7, J = 4,4, 2,4, H5’), 4,12 (3H, s, m7), 4,06 (1H, ddd, J⁵ -⁵-’ = 11,7, J = 4,9, 2,9, H5"), 3,35 (2H, t, J^ch2(N3)-^ch2(^nh) = 5,9, H^ch2(N3)), 3,0 (2H, dt, J^ch2(N3)-^ch2(^nh) =

5.9, JPa-cH²(NH) = 10,3, H^ch2(^nh)); 31P-RMN (162 MHz, D²O, 25 °C) S^p: 9,32-9,44 (1P, m, Pa); HRMS (-) ESI m/z hallado: 444,1146, calculado para C¹³H¹⁹N⁹O⁷ P-: 444,1145.

Sal de amonio de N-(2-azidoetil)-p-fosforamidato de 7-metilguanosina difosfato (m⁷GppNHC²H⁴N³)

Se obtuvo según el PG D partiendo de sal de disodio de p-P-imidazolida de 7-metilguanosina 5’-difosfato (238 mg, 3641 mDO, 0,319 mmol), 2-azidoetilamina (0,281 ml, 2,555 mmol) y 2,5 ml de tampón Tris-HCI. La purificación mediante intercambio iónico proporcionó 1785 mDO (0,156 mmol, 49 %) de sal de trietilamonio de m7GppNHC²H⁴N³.

La purificación mediante HPLc adicional de una fracción del producto obtenido produjo m7GppNHc²H⁴N³ como sal de amonio.

1H-RMN (400 MHz, D²O, 25 °C) Sh: 6,08 (1H, d, J¹ -²’ = 3,5, H1’), 4,68 (1H, dd, J¹ -²’ = 3,5, J² -³’ = 4,7, H2’), 4,51 (1H, J² -³’ = 4,7, J³ -⁴’ = 5,5, H3’), 4,39-4,42 (1H, m, H4’), 4,34 (1H, ddd, J⁵ -⁵-’ = 12,1, J = 4,3, 2,4, H5’), 4,22 (1H, ddd, J⁵ -⁵-’ = 12.1, J = 5,5, 2,4, H5”), 4,13 (3H, s, m7), 3,41 (² H, t, J^ch2(N3)-^ch2(^nh) = 5,9, H^ch2(N3)), 3,10 (2H, dt, J^ch2(N3)-^ch2(^nh) = 5,9, JcH²(NH)-pp = ^{1 0} ,⁵ , Hch²(nh)); 31P-RMN (162 MHz, D²O, 25 °C) Sp: -0,82 (1P, dt, JcH²-pp = 10,5, Jpa-pp = 22,7, Pp), -10,28 (1P, d ancho, Jpa-pp = 22,7, Pa); HRMS (-) ESI m/z hallado: 524,0819, calculado para C¹³H²⁰N⁹O¹⁰P² :

524,0808.

1.8. Síntesis de análogos de fosfoéster que contienen azida

Fosfato de azidoetilo

Se añadió H³ PO³ (50 mg, 0,610 mmol, 1 equivalente) a un matraz y se disolvió en 2-azidoetanol (1,385 ml, 18,293 mmol, 30 equivalentes). A continuación, se añadió TEA (253 |j.l, 1,819 mmol, 3 equivalentes) y la mezcla se agitó durante 5 minutos. A continuación, se añadió yodo (308 mg, 1,22 mmol, 2 equivalentes) de manera gradual y la mezcla se agitó durante 96 horas a temperatura ambiente. El producto precipitó tras la adición de la mezcla de 350 |j.l de ciclohexilamina en 15,8 ml de acetona. El precipitado se separó por filtración, se lavó repetidamente con acetona anhidra y fría hasta que se volvió de color blanco y, a continuación, se secó a vacío sobre P²O⁵.

31P-RMN (202 MHz, óxido de deuterio) 84,10 (t, J = 6,2 Hz).

H-fosfonato de 2 ’,3-O,O-isopropiliden-guanosina 2 ’3’-iPr-GpH

Se sintetizó H-fosfonato de 2’,3’-O,O-isopropiliden-guanosina agitando 2’,3’-O,O-isopropiliden-guanosina (1,010 g, 3,128 mmol, 1 equivalente) con PCl³ (312 |j.l, 3,567 mmol, 1,1 equivalente) en presencia de 15,24 ml de fosfato de trimetilo a 0 °C durante 1 hora. A continuación, la mezcla se diluyó con aproximadamente 150 ml de agua y el pH se ajustó a 7 utilizando NaHCO³ sólido. La purificación mediante intercambio iónico proporcionó 17760 mDO (1,470 mmol, 47 %) de sal de trietilamonio de 2’3’-iPr-GpH.

Sal de amonio de O-(2-azidoetil)-guanosina fosfato (GpOC²H⁴N³)

Al matraz que contenía 2’3’-iPr-GpH (3000 mDO, 0,248 mmol, 1 equivalente) se le añadieron BSA (607 |j.l, 2,48 mmol, 10 equivalentes) y ACN (607 ml). La mezcla se agitó durante 15 min, después de lo cual se añadieron TEA (102 |j.l, 0,744 mmol, 3 equivalentes) junto con 2-azidoetanol (564 |j.l, 7,44 mmol, 30 equivalentes) y se continuó con la agitación durante 5 minutos. A continuación, se añadió yodo (126 mg, 0,496 mmol, 2 equivalentes) de manera gradual y la reacción se agitó durante 7 días a 45 °C. Después de eso, se diluyó con aproximadamente 30 ml de agua y el pH se ajustó a 1,5 con HCI concentrado. La mezcla resultante se agitó a 60 °C durante 1,5 horas y, a continuación, el pH se ajustó a 7 con NaHCO³ sólido. La mezcla se sometió a purificación mediante intercambio iónico, lo que proporcionó 1350 mDO (0,112 mmol, 45 %) de sal de trietilamonio de GpOC²H⁴N³. La purificación mediante HPLC adicional de una fracción del producto obtenido produjo GpOC²H⁴ N³ como sal de amonio.

1H-RMN (500 MHz, óxido de deuterio) 88,20 (s, 1H, H8), 5,95 (d, J = 5,4 Hz, 1H, H1’), 4,81 (dd, J = 5,3, 5,4 Hz, 1H, H2’, solapado con HDO), 4,52 (dd, J = 5,2, 4,0 Hz, 1H, H3’), 4,34-4,36 (m, 1H, H4’), 4,20 - 4,08 (m, 2H, H5’, H5”), 3,98 - 3,88 (m, 2H, CH²-N³), 3,46 - 3,36 (m, 2H, CH²-O); 31P-RMN (202 MHz, óxido de deuterio) 80,94-1,05 (m, 1P, Pa); HRMS (-) ESI m/z hallado: 431,06262, calculado para C¹²H¹⁶N⁸O⁸ P-: 431,0834196(2).

Sal de amonio de p-O-(2-azidoetil)-guanosina difosfato (GppOC²H⁴N³)

Se añadieron DMF (3,7 ml) y MgCl² (74,2 mg, 0,78 mmol, 4 equivalentes) a un matraz con sal de ciclohexilamonio de fosfato de azidoetilo anhidra (aproximadamente 0,610 mmol, 3 equivalentes) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente hasta la dilución completa de la subunidad de fosfato. A continuación, se añadieron imidazolida de guanosina 5’-monofosfato (106 mg, 2353 mDO, 0,195 mmol, 1 equivalente) junto con una segunda porción de MgCl² (74,2 mg, 0,78 mmol, 4 equivalentes). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. A continuación, la reacción se detuvo mediante la dilución con diez volúmenes de agua y se sometió a purificación mediante intercambio iónico, lo que proporcionó 2047 mDO, (0,170 mmol, 87 %) de sal de trietilamonio de GppOC²H⁴N³. La purificación mediante H^pLC adicional de una fracción del producto obtenido produjo GppOC²H⁴N³ como sal de amonio.

1H-RMN (500 MHz, óxido de deuterio) 88,35 (s, 1H, H8), 5,97 (d, J = 5,5 Hz, 1H, H1’), 4,78 (dd, J = 5,1, 5,5 Hz, 1H, H2’), 4,53 (dd, J = 5,1,3,9 Hz, 1H, H3’), 4,37 (dt, J = 3,9, 2,3 Hz, 1H, H4’), 4,30 - 4,18 (m, 2H, H5’ y H5”), 4,06-4,09 (m, 2H, CH² enlazador CH2- o), 3,48 (t, J = 5,0 Hz, 2H, CH² enlazador CH2- N³); 31P-RMN (202 MHz, óxido de deuterio) 8 -10,57­ -10,30 (m, 2P, Pa y Pp solapados); HRMS (-) ESI m/z hallado: 511,0503, calculado para C¹²H¹⁷N⁸O¹¹P²-: 511,0498.

1.9. Síntesis de análogos de caperuza de dinucleótido

Procedimiento general G (PG G): Síntesis de análogos de caperuza de dinucleótido que contienen triazol ubicado entre subunidades de P (análogos de fosforamidato)

Se mezclaron conjuntamente soluciones acuosas de un nucleótido que contiene alquino (1 equivalente, 0,2-1,0 M) y un nucleótido que contiene azida (1 equivalente, 0,2-1,0 M), seguido por la adición de H²O (hasta la concentración de cada análogo de aproximadamente 50-150 mM), y soluciones acuosas de CuSO4-5H2O (0,2 equivalentes, 0,5-6,0 M) y ascorbato de sodio (0,4 equivalentes, 1-12 M). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante varias horas y se monitorizó mediante RP-HPLC. Se añadieron porciones adicionales de soluciones de CuSO⁴ o de ascorbato de sodio con una cinética lenta. Las concentraciones finales de los reactivos se proporcionan en los procedimientos detallados a continuación. Una vez completada, la reacción se detuvo mediante una dilución de 5 veces con agua y la adición de Na² EDTA (diez equivalentes de CuSO⁴ añadidos), seguido directamente por purificación mediante RP-HPLC semipreparativa.

Procedimiento general G (PG H): síntesis de análogos de caperuza de dinucleótido que contiene triazol ubicado

entre subunidades de P (análogos de fosforoéster)

Se mezclaron conjuntamente soluciones acuosas de un nucleótido que contiene alquino (1 equivalente, 0,2-0,5 M) y

un nucleótido que contiene azida (1 equivalente, 0,2-0,5 M), seguido por la adición de H²O y la mezcla de

H²O:t-BuOH (1:1, v/v) (hasta la concentración de cada análogo de aproximadamente 26-53 mM, H²O:t-BuOH final

(2-5:1, v/v)), y soluciones acuosas de CuSO4-5H2O (0,4 equivalentes, 0,6-0,65 M) y ascorbato de sodio

(^{0 , 8} equivalentes, 1,2-1,3 M). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 0,5-1 horas y se monitorizó mediante RP-HPLC. Las concentraciones finales de los reactivos se proporcionan en los procedimientos detallados

a continuación. Una vez completada, la reacción se detuvo mediante una dilución de 5 veces con agua y la adición

de Na² EDTA (diez equivalentes de CuSO⁴ añadido), seguido directamente por purificación mediante RP-HPLC semipreparativa.

m7GpNHC2H4-triazol-CH2ppG

Se obtuvo según el PG G a partir de GppC³H³ (848 mDO, 0,070 mmol, 150 mM) y m7GpNHC²H⁴N³ (800 mDO,

0,070 mmol, 150 mM) mientras se agitaba con CuSO⁴ (3,5 mg, 0,014 mmol, 30 mM) y ascorbato de sodio (5,5 mg,

0,028 mmol, 60 mM) en 0,70 ml de H²O durante 1 h. Después de detenerdetener la reacción con Na²EDTA

(52,2 mg, 0,14 mmol), el producto se sometió a purificación mediante RP-HPLC, lo que proporcionó m7GpNHC²H⁴-triazol-CH²ppG como sal de amonio.

1H-RMN (400 MHz, D²O, 25 °C) Sh: 8,03 (1H, s, H8 G), 7,84 (1H, s, J = 2,0, Htriazol), 5,98 (1H, d, J¹ -²’ = 3,9, H1 ’ m7G),

5,88 (1H, d, J¹ -²’ = 5,9, H1 ’ G), 4,77 (1H, dd, J¹ -²’ = 5,9, J² -³’ = 5,1, H2’ ^g ), 4,69 (1H, dd, J¹ -²’ = 3,9, J² -³’ = 5,1, H2’ m7G), 4,50 (1H, dd, J² -³’ = 5,1, J³ -⁴’ = 3,9, H3’ G), 4,42 (1H, dd, J² -³’ = 5,1, J³ -⁴’ = 5,5, H3’ m7G), 4,37 (2H, t a, JCH²(triazol)m⁷G-CH²(NH) = 6,1, HCH²(triazol)m⁷G), 4,31-4,34 (2H, m, H⁴ ’ G y m⁷G solapados), 4,14-4,21 (2H, m, H5’ y H5” G),

4,00 (1H, ddd, J⁵ -⁵” = 11,7, J = 4,7, 2,7, H5’ m7G), 3,90 (1H, ddd, J⁵ -⁵” = 11,7, J = 4,9, 3,3, H5” m7G), 3,23-3,28 (2H, m, H^ch2(^nh)), 3,16 (2H, d, Jpp-CH²(P) = 20,2, H^ch2(P)); 31P-RMN (162 MHz, D²O, 25 °C) Sp: 11,70 (1P, dt, Jpp-CH²(P) =

20,2, Jp„-pp = 26,4, Pp), 9,01-9,14 (1P, m, PS), -10,40 (1P, d ancho, Jpa-pp = 26,4, Pa); HRMS (-) ESI 909,1618, calculado para C²⁶H³⁶N¹⁴O¹⁷P³-: 909,1596; hidrólisis en D²O: 11 %.

m7GpNHC2H4-triazol-CH2pppG

Se obtuvo según el PG G a partir de GpppC³H³ (742 mDO, 0,061 mmol, 150 mM) y m7GpNHC²H⁴N³ (700 mDO,

0,061 mmol, 150 mM) mientras se agitaba con CuSO⁴ (3,0 mg, 0,012 mmol, 30 mM) y ascorbato de sodio (4,8 mg,

0,024 mmol, 60 mM) en 0,409 ml de H²O durante 1 hora. Después de detener la reacción con Na² EDTA (44,7 mg, 0,12 mmol), el producto se sometió a purificación mediante RP-HPLC, lo que proporcionó m7GpNHC²H⁴-triazol-CH²pppG como sal de amonio.

1H-RMN (400 MHz, D²O, 25 °C) Sh: 8,06 (1H, s, H8 G), 7,88 (1H, d, J = 2,0, Htriazol), 5,98 (1H, d, J¹ -²’ = 3,9, H1’ m7G),

5.86 (1H, d, J¹ -²’ = 6,3, H1’ G), 4,79 (1H, dd, J¹ -²’ = 6,3, J^2-3 = 5,1, H2’ G), 4,74 (1H, dd, J¹ -²’ = 3,9, J² -³’ = 5,1, H2’ m7G), 4,54 (1H, dd, J² -³’ = 5,1, J³ -⁴’ = 3,5, H3’ G), 4,37 (1H, dd, J^2-3 = 5,1, J^2-3 = 5,1, H3’ m7G), 4,37 (2H, t a, JcH²(triazol)m⁷G-cH²(NH) = 6,6, HcH²(triazol)m⁷G), 4,32-4,35 (2H, H4’ G y H4’ m⁷G y H5’ G solapados), 4,28 (1H, ddd, J⁵ -⁵” =

11.7, J = 5,3, 3,3, H5’ m7G), 4,23 (1H, ddd, J⁵ -⁵” = 11,7, J = 5,9, 3,9, H5” m7G), 4,06 (3H, s, m7), 4,02 (1H, ddd, J⁵ -⁵” =

11.7, J = 4,7, 2,7, H5’ G), 3,86 (1H, ddd, J⁵ -⁵” = 11,7, J = 5,1, 3,5, H5’ G), 3,21-3,26 (2H, m, H^ch2(^nh)), 3,22 (2H, d,

JcH²(P)-Py = 20,4, H^ch2(P)); 31P-RMN (162 MHz, D²O, 25 °C) Sp: 14,20 (1P, dt, Jpp-pY = 24,9, Jpy-CH²(P) = 20,4, Py),

11,20-11,32 (1P, m, Pe), -8,35 (1P, dt, Jpa-pp = 19,1 Jpa-⁵’/⁵” = 4,4, Pa), 20,05 (1P, Jpa-pp = 19,1, JpP-p HRMS (-) ESI m/z hallado: 989,1276, calculado para C²⁶H³⁷N¹⁴O²⁰P⁴-: 989,1259; hidrólisis en D²O: 7 %.

m7GppCH2-triazol-C2H4NHpG

Se obtuvo según el PG G a partir de m7GppC³H³ (1132 mDO, 0,099 mmol, 150 mM) y GpNHC²H⁴N³ (1200 mDO,

0,099 mmol, 150 mM) mientras se agitaba con CuSO⁴ (4,9 mg, 0,020 mmol, 30 mM) y ascorbato de sodio (7,9 mg,

0,040 mmol, 60 mM) en 0,662 ml de H²O durante 2 horas. Después de detener la reacción con Na² EDTA (74,5 mg, 0,20 mmol), el producto se sometió a purificación mediante RP-HPLC, lo que proporcionó m7GppCH²-triazol-C²H⁴NHpG como sal de amonio.

1H-RMN (400 MHz, D²O, 25 °C) S^h: 8,01 (1H, s, H8 G), 7,82 (1H, d, J = 2,0, Htriazol), 6,02 (1H, d, J¹ -²’ = 3,5, H1’ m7G),

5.86 (1H, d, J¹ -²’ = 5,5, H1’ G), 4,83 (1H, dd, J¹ -²’ = 5,5, J² -³’ = 5,5, H2’G), 4,68 (1H, dd, J¹ -²’ = 3,5, J² -³’ = 4,7, H2’ m7G), 4,46 (2H, H3’ G y m7G solapados), 4,35-4,37 (1H, m, H4’ G o m7G), 4,28-4,31 (3H, H4’ G o m7G solapados, HcH²(triazol)G’), 4,24 (1H, ddd, J⁵ -⁵” = 11,7, J = 4,3, 2,4, H5’ G o m7G), 4,16 (1H, ddd, J⁵ -⁵” = 11,7, J = 5,5, 2,4, H5” G o

m7G), 4,08 (3H, s, m7), 3,96 (1H, ddd, J⁵ -⁵” = 11,7, J = 4,7, 3,1, H5” G o m7G), 3,88-3,93 (1H, m, H5” G o m7G), 3,22

(2H, d, Jch²(P)-py = 20,5, Hch²(P)), 3,13-3,20 (2H, m, Hch²(nh)); 31P-RMN (162 MHz, D²O, 25 °C) Sp: 11,95 (1P, dt,

Jpy-CH²(P) = 20,5, Jpy-Ps = 26,4, Py), 9,05-9,18 (¹ P, m, Pa), -10,34 (1P, d ancho, Jpa-pp = 26,4, PS); HRMS (-) ESI m/z hallado: 909,1603, calculado para C²⁶H³⁶N¹⁴O¹⁷P³-: 909,1596.

m7GpppCH2-triazol-C2H4NHpG

Se obtuvo según el PG G a partir de m7GpppC³H³ (742 mDO, 0,061 mmol, 100 mM) y GPNHC²H⁴N³ (700 mDO, 0,061 mmol, 100 mM) mientras se agitaba con CuSO⁴ (6,0 mg, 0,024 mmol, 40 mM) y ascorbato de sodio (9,6 mg, 0,048 mmol, 80 mM) en 0,614 ml de H²O durante 24 horas. Después de detener la reacción con Na²EDTA (89,4 mg, 0,24 mmol), el producto se sometió a purificación mediante RP-HPLC, lo que proporcionó m7GpppCH²-triazol-C²H⁴NHpG como sal de amonio.

1H-RMN (400 MHz, D²O, 25 °C) Sh: 8,00 (1H, s, H8 G), 7,84 (1H, d, JcH²(P)-H(triazol) = 2 ,2, Htriazol), 6,00 (1H, d, J¹ -²’ = 3.5, H1 ’ m7G), 5,86 (1H, d, J¹ -²’ = 5,5, H1 ’ G), 4,89 (1H, dd, J¹ -²’ = 5,5, J^2-3 = 5,1, H2’ G), 4,69 (1H, dd, J¹ -²’ = 3,5, J² -³’ = 5,1, H2’ m7G), 4,56 (1H, dd, J² -³’ = 5,1, J³ -⁴’ = 5,5, H3’ m7G), 4,47 (1H, dd, J^2-3 = 5,1, J^2-3 = 4,3, H3’ G), 4,36-4,41 (2H, H4’ y H5’ m7G solapados), 4,23-4,30 (4H, H5” m7G, H4’G, HCH²(triazol)G solapados), 4,08 (3H, s, m7), 3,98 (1H, ddd, J⁵ -⁵” = 11,7, J = 4,3, 2,9, H5’G), 3,89-3,95 (1H, m, H5” G), 3,26 (2H, dd, J^ch2-^py = 20,5, JCH2(P)-H(triazol) = 2,2, Hch²(P)), 3,07-3,18 (2H, m, Hch²(nh)); 31P-RMN (162 MHz, D²O, 25 °C) Sp: 14,11 (1H, dt, Jptp5 = 24,9, Jch²(P)-py = 20.5, P^y), 11,18-11,37 (1P, m, Pa), -8,40 (1P, d ancho, Jpe-ps = 19,1, Pe), -19,96 (1P, dd, Jpe-ps = 19,1, J^py-^pS = 24,9, PS); HrMs (-) ESI m/z hallado: 494,0598, calculado para C²⁶H³⁶N¹⁴O²⁰P⁴2-: 494,0590; hidrólisis en D²O: 9 %.

m7GpNHC²H⁴-triazol-ppG

Se obtuvo según el PG G a partir de GpppC³H³ (700 mDO, 0,061 mmol, 100 mM) y m7GpNHC²H⁴N³ (742 mDO, 0,061 mmol, 100 mM) mientras se agitaba con CuSO⁴ (6,0 mg, 0,024 mmol, 40 mM) y ascorbato de sodio (9,6 mg, 0,048 mmol, 80 mM) en 0,614 ml de H²O durante 1 hora. Después de detener la reacción con Na² EDTA (89,4 mg, 0,24 mmol), el producto se sometió a purificación mediante RP-HPLC, lo que proporcionó m7GpNHC²H⁴-triazol-ppG como sal de amonio.

1H-RMN (400 MHz, D²O, 25 °C) S^h: 8,25 (1H, s, H8 G o Htriazol), 7,94 (1H, s, H8 G o Htriazol), 5,98 (1H, d, J¹ -²’ = 3,9, H1 ’ m7G), 5,83 (1H, d, J¹ -²’ = 5,9, H1’ G), 4,66 (1H, dd, J¹ -²’ = 5,9, J^2-3 = 5,1, H2’ G), 4,62 (1H, dd, J¹ -²’ = 3,9, J² -³’ = 5,1, H2’ m7G), 4,42-4,46 (3H, HcH²(triazol)m⁷G’ y H3’G solapados), 4,37 (1H, dd, J² -³’ = 5,1, J³ -⁴’ = 5,1, H3’ m7G), 4,29-4,32 (1H, m, H4’ m7G), 4,25-4,28 (1H, m, H4’ G), 4,13-4,15 (2H, m, H5’ y H5” G), 4,06 (3H, s, m7), 3,92 (1H, ddd, J⁵ -⁵” = 11,7, J = 4,7, 2,7, H5’ m7G), 3,82 (1H, ddd, J⁵ -⁵” = 11,7, J = 5,1, 3,1, H5’ m7G), 3,25-3,31 (2H, m, Hch²(nh)); 31P-RMN (162 MHz, D²O, 25 °C) Sp: 8,92-9,04 (1P, m, PS), -6,87 (1P, d, Jpa-pp = 22,7, Pp), -10,80 (1P, dt, Jpa-pp = 22,7, Jpa-⁵’/⁵’’’ = 6,6, Pa); HRMS (-) ESI m/z hallado: 895,1456, calculado para C²⁵H³⁴N¹⁴O¹⁷P³-: 895,1439; hidrólisis en D²O: 14 %.

m7GpNHC²H⁴-triazol-pppG

Se obtuvo según el PG G a partir de GpppC²H (700 mDO, 0,061 mmol, 100 mM) y m7GpNHC²H⁴N³ (742 mDO, 0,061 mmol, 100 mM) mientras se agitaba con CuSO⁴ (6,0 mg, 0,024 mmol, 40 mM) y ascorbato de sodio (9,6 mg, 0,048 mmol, 80 mM) en 0,614 ml de H²O durante 2,5 horas. Después de detener la reacción con Na²EDTA (89,4 mg, 0,24 mmol), el producto se sometió a purificación mediante RP-HPLC, lo que proporcionó m7GpNHC²H⁴-triazol-pppG como sal de amonio.

1H-RMN (400 MHz, D²O, 25 °C) Sh: 8,30 (1H, s, H8 G o Htriazol), 7,03 (1H, s, H8 G o Htriazol), 5,98 (1H, d, J¹-²’ = 3,7, H1 ’ m7G), 5,85 (1H, d, J¹ -²’ = 6,3, H1’ G), 4,73 (1H, dd, J¹ -²’ = 6,3, J^2-3 = 5,1, H2’ G), 4,66 (1H, dd, J¹ -²’ = 3,7, J² -³’ = 4.7, H2’ m7G), 4,48 (1 H, dd, J² -³’ = 5,1, J³ -⁴’ = 3,5, H³ ’ G), 4,45 (2H, t a, JcH2(triazol)m7G-CH2(NH) = 5,9, HcH2(triazol)m7G), 4,38 (1H, dd, J² -³’ = 4,7, J³ -⁴’ = 5,9, H3’ m7G), 4,31-4,34 (1H, m, H4’ m7G), 4,27-4,30 (1H, m, H4’ G), 4,14-4,16 (2H, m, H5’ y H5” G), 4,06 (3H, s, m7), 3,96 (1H, ddd, J⁵ -⁵” = 11,7, J = 4,7, 2,7, H5’ m7G), 3,84 (1H, ddd, J⁵ -⁵” = 11,7, J = 5,1, 3,5, H5’ m7G), 3,29 (1H, dt, JcH²(triazol)-CH²(NH) =5,9, JcH²(NH)-Pe = 10,6, H^ch2(^nh)’ y H^ch2(^nh)”); 31P-RMN (162 MHz, D²O, 25 °C) S^p: 8,94-9,12 (1P, m, Pe), -6,56 (1P, d, J^pP-^py = 22,0, P^y), -10,61 (1P, dt, Jpa-pp = 19,1, Jpa-⁵ /⁵” = 5,1, Pa), -22,49 (1P, dd, Jpa-pp = 22,7, Jpa-pp = 19,1, Pp); HRMS (-) ESI m/z hallado: 975,1124, calculado para C²⁵H³⁵N¹⁴O²⁰P⁴-: 975,1103; hidrólisis en D²O: 9 %.

m7Gpp-triazol-C²H⁴NHpG

Se obtuvo según el PG G a partir de m7GppC²H (742 mDO, 0,061 mmol, 100 mM) y GpNHC²H⁴N³ (700 mDO, 0,061 mmol, 100 mM) mientras se agitaba con CuSO⁴ (6,0 mg, 0,024 mmol, 40 mM) y ascorbato de sodio (9,6 mg, 0,048 mmol, 80 mM) en 0,614 ml de H²O durante 2 horas. Después de detener la reacción con Na² EDTA (89,4 mg, 0,24 mmol), el producto se sometió a purificación mediante RP-HPLC, lo que proporcionó m7Gpp-triazol-C²H⁴NHpG como sal de amonio.

1H-RMN (400 MHz, D²O, 25 °C) Sh: 8,24 (1H, s, H8 G o Htriazol), 8,03 (1H, s, H8 G o Htriazol), 5,99 (1H, d, J¹ -²’ = 3,3, H1 ’ m7G), 5,84 (1H, d, J¹ -²’ = 5,9, H1’ G), 4,75 (1H, dd, J¹ -²’ = 5,9, J^2-3 = 5,1, H2’ G), 4,64 (1H, dd, J¹ -²’ = 3,3, J² -³’ = 4.7, H2’ m7G), 4,41-4,45 (2H, solapados con H3’ G y H3’ m7G), 4,39 (2H, t a, JcH²(triazol)G-cH²(NH) = 6,3, HcH²(triazol)G), 4,34-4,36 (1H, m, H4’ m7G), 4,24-4,29 (2H, m, H5’ m7G y H4’ G solapados), 4,18 (1H, ddd, J⁵ -⁵” = 11,9, J = 5,5, 2,3, H5” m7G), 4,04 (3H, s, m7), 3,90 (1H, ddd, J = J⁵ -⁵” = 11,7, J = 4,5, 2,9, H5’ G), 3,77-3,83 (1H, m, H5” G), 3,17-3,28 (2H, m, H^ch2(^nh)); 31P-RMN (162 MHz, D²O, 25 °C) S^p: 8,93-9,1 (1P, m, Pa), -6,62 (1P, d, J^py-^pS = 23,5, P^y), -10,75 (¹ P, d ancho, J^py-^pS = 23,5, PS); HRMS (-) ESI m/z hallado: 895,1454, calculado para C²⁵H³⁴N¹⁴O¹⁷P³-: 895,1439.

m7Gppp-triazol-C²H⁴NHpG

Se obtuvo según el PG G a partir de m7GpppC²H (742 mDO, 0,061 mmol, 50 mM) y GPNHC²H⁴N³ (700 mDO, 0,061 mmol, 50 mM) mientras se agitaba con CuSO⁴ (6,0 mg, 0,024 mmol, 20 mM) y ascorbato de sodio (9,6 mg, 0,048 mmol, 40 mM) en 1,228 ml de H²O durante 1 hora. Después de detener la reacción con Na² EDTA (89,4 mg,

0,24 mmol), el producto se sometió a purificación mediante RP-HPLC, lo que proporcionó m7Gppp-triazol-C²H⁴NHpG como sal de amonio.

1H-RMN (400 MHz, D²O, 25 °C) Sh:8,23 (1H, s, H8 G o Htriazol), 8,02 (1H, s, H8 G o Htriazol), 6,00 (1H, d, Jr-² ' = 3,5, H1' m7G), 5,86 (1H, d, J¹ -² ' = 5,5, H1 ’ G), 4,84 (¹ H, dd, J¹ -² ' = 5,5, J^2-3 = 5,1, H2’ G), 4,66 (1H, dd, J¹ -²' = 3,5, J² -³ ' =

4,7, H2' m7G), 4,51 (1H, dd, J² -³ ' = 4,7, J³ -⁴ ' = 5,5, H3' m7G), 4,44 (1H, dd, J^2-3 = 5,1, J^2-3 = 3,9, H3' G), 4,27-4,37

(5H, H4' G y H4' m7G y H⁵ ' G o m7G solapados, HCH²(triazol)), 4,20 (1H, ddd, Jss- = 11,7, J = 5,5, 2,4, H5" G o m7G), 4,07 (3H, s, m7), 3,94 (1H, ddd, J^{5 5} = 11,5, J = 4,3, 3,1, H5' m7G o G), 3,84-3,89 (1H, m, H5' m7G o G), 3,13-3,24

(2H, m, H^ch2(^nh)); 31P-RMN (162 MHz, D²O, 25 °C) S^p: 11,08-11,21 (1P, m, Pa), -4,38 (1P, d, J^pp-^py = 22,0, Py), -8,41

(1P, d ancho, Jpa-pp = 19,1, Pe), -20,26 (1P, dd, Jpa-pp = 22,0, Jpa-pp = 19,1, Py); HRMS (-) ESI m/z hallado: 975,1122, calculado para C²⁵H³⁵N¹⁴O²⁰P⁴-: 975,1103; hidrólisis en D²O: 13 %.

m^27,2 OGppp-triazol-C²H⁴NHPG

Se obtuvo según el PG G a partir de m²7,2-OGpppC²H (650 mDO, 0,057 mmol, 100 mM) y GpNHC²H⁴N³ (689 mDO, 0,061 mmol, 50 mM) mientras se agitaba con CuSO4-5H2O (2,7 mg, 0,011 mmol, 20 mM) y ascorbato de sodio

(4,4 mg, 0,022 mmol, 40 mM) en 0,570 ml de H²O:t-BuOH (2:1, v/v) durante 2 horas. Después de detener la reacción con Na² EDTA (89,4 mg, 0,24 mmol), el producto se sometió a purificación mediante RP-HPLC, lo que proporcionó m²7,2'-OGppp-triazol-C²H⁴NHpG como sal de amonio.

1H-RMN (400 MHz, D²O, 25 °C) Sh: 9,14 (1H, q, JH⁸-m⁷ = 0,8, H8 m7G), 8,24 (1H, s, H8 G o Htriazol), 8,02 (1H, s, H8 G o Htriazol), 6,06 (1H, d, J¹ -² ' = 2,7, H1' m7G), 5,84 (1H, d, J¹ -² ' = 5,5, H1' G), 4,80 (1H, solapado con HDO, H2' G), 4,58

(1H, dd, J = 6,2, 4,7, H3' m7G), 4,42 (1H, dd, J = 5,1, 3,9, H3' G), 4,27-4,36 (6H, H2'm7G, H4' G y m7G, H5' G o m7G solapados, HcH²(triazol)), 4,18 (1H, ddd, J^ y = 12,3, J = 5,3, 2,7, H5" G o m7G), 4,06 (3H, d, JH⁸-m⁷ = 0,8, m7), 3,92 (1H, ddd, J⁵'-⁵" = 11,7, J = 4,3, 3,1, H5' G o m7G), 3,84 (1H, ddd, J^ - = 11,7, J = 5,1, 4,7), 3,59 (3H, s, m2’°), 3,12-3,26

(2H, m, H^ch2(^nh)); 31P-RMN (162 MHz, D²O, 25 °C) S^p: 8,95-9,15 (1P, m, Pa), -6,57 (1P, d, J^ptp5 = 21,3, Py), -10,64

(1P, ddd, Jpe-ps = 19,1, Jpe-⁵ ' = 4,4, Jpe-⁵- = 2,9, Pe), -22,42 (1P, dd, J^ptp5 = 21,3, Jpe-ps = 19,1, PS); HR hallado: 989,1272, calculado para C²⁶H³⁷N¹⁴O²⁰P⁴-: 989,1259; hidrólisis en D²O: 8 %.

m7GppNHC2H4-triazol-C2H4ppG

Se obtuvo según el PG G a partir de GppC⁴H⁵ (580 mDO, 0,048 mmol, 100 mM) y m7GppNHC²H⁴N³ (437 mDO, 0,038 mmol, 80 mM) mientras se agitaba con CuSO⁴ (4,8 mg, 0,019 mmol, 40 M) y ascorbato de sodio (7,5 mg, 0,038 mmol, 80 mM) en 0,485 ml de H²O durante 0,5 horas. Después de detener la reacción con Na² EDTA (0,7 mg, 0,19 mmol), el producto se sometió a purificación mediante RP-HPLC, lo que proporcionó m7GppNHC²H⁴-triazol-C²H⁴ppG como sal de amonio.

1H-RMN (400 MHz, D²O, 25 °C) Sh: 9,16 (1H, s, H8 m7G), 8,06 (1H, s, H8 G o Htriazol), 7,71 (1H, s, H8 G o Htriazol), 6,00 (1H, d, J¹ -² ' = 2,7, H1' G o m7G), 5,88 (1H, d, Jr-² ' = 5,5, H1' G o m7G), 4,80 (1H, solapado con HDO, H2' G o m7G), 4,69 (2H, dd, Jr-² ' = 2,7, J³ -⁴ ' =5,1, H2' G o m7G), 4,49-4,54 (2H, H3' G y m7G solapados), 4,35-4,39 (4H, H⁴ ' G y m7G solapados, HcH²(triazol)m⁷G), 4,18-4,33 (4H, H5' y H5"G y m7G solapados), 4,06 (3H, s, m7), 3,30 (2H, dt, JcH2(NH)-Ps = 11,9, JcH2(NH)-CH2(triazol)m7G = 6,5, HcH2(NH)), 2,78 (2H, m, HcH2(triazol)G o HcH2(P)), 1,99 (2H, m, HcH2(triazol)G o H^ch2(P)); 31P-RMN (162 MHz, D²O, 25 °C) S^p: 17,61-18,01 (1P, m, Pp), -1,54 (1P, dt, Jps-pe = 21,3, J^pS-^ch2(^nh) = 11,9, PS), -10,27 (1P, d ancho, Jps-pe = 21,3, Pe), -10,52 (1P, d ancho, Jpa-pp = 27,9, Pa); HRMS (-) ESI m/z hallado:

1003,1435, calculado para C²⁷H³⁹N¹⁴O²⁰P⁴-: 1003,1421; hidrólisis en D²O: 11 %.

m7GppC2H4-triazol-C2H4NHppG

Se obtuvo según el PG G a partir de m7GppC⁴H⁵ (375 mDO, 0,033 mmol, 100 mM) y GppNHC⁴H⁵N³ (397 mDO, 0,033 mmol, 100 mM) mientras se agitaba con CuSO⁴ (1,6 mg, 0,0066 mmol, 20 mM) y ascorbato de sodio (2,6 mg, 0,013 mmol, 40 mM) en 0,328 ml de H²O durante 1 h. Después de detener la reacción con Na²EDTA (24,6 mg, 0,066 mmol), el producto se sometió a purificación mediante RP-HPLC, lo que proporcionó m7GppC²H⁴-triazol-C²H⁴NHppG como sal de amonio.

1H-RMN (400 MHz, D²O, 25 °C) Sh: 9,18 (1H, s, H8 m7G), 8,12 (1H, s, H8 G o Htriazol), 7,69 (1H, s, H8 G o Htriazol), 6,02 (1H, d, J¹ -²' = 3,5, H1' G o m7G), 5,88 (1H, d, Jr-²' = 5,5, H1' G o m7G), 4,72-4,76 (2H, H2' G y m7G solapados), 4,50-4,54 (2H, H3' G y m7G solapados), 4,40-4,43 (1H, m, H4 G o m7G), 4,33-4,39 (2H, H4' G o m7G y H5' G o m7G solapados), 4,28 (2H, t a, JcH²(triazol)G-cH²(NH) = 6,6, HcH²(triazol)G), 4,17-4,29 (3H, H5" G y m7G y H5' G o m7G solapados), 4,06 (3H, s, m7), 3,20-3,28 (2H, m, H^ch2(^nh)), 2,79-2,85 (2H, m, HcH²(triazol)m⁷G) o H^ch2(P)), 1,99-2,08 (2H, m, HcH²(triazol)m⁷G) o H^ch2(P)); 31P-RMN (162 MHz, D²O, 25 °C) S^p: 17,61-18,10 (1P, m, PS), -1,64 (1P, dt, Jp^ pp = 22,0,

Jpp-CH²(NH) = 12,5, Pp), -10,22 (1P, d ancho, Jpa-pp = 22,0, Pa), -10,50 (1P, d ancho, Jps-pe = 24,9, Pe); HRMS (-) ESI m/z hallado: 1003,1444, calculado para C²⁷H³⁹N¹⁴O²⁰P⁴-: 1003,1421; hidrólisis en D²O: 10 %.

m27'2'OGppp-triazol-C2H4NHppG (m27'2-OGppptC2H4NHppG)

Se obtuvo según el PG H a partir de m²⁷,² -°GpppC²H (377 mDO, 0,033 mmol, 50 mM) y GPPNHC²H⁴N³ (400 mDO, 0,033 mmol, 50 mM) mientras se agitaba con CuS^{° 4} (3,3 mg, 0,013 mmol, 20 mM) y ascorbato de sodio (5,2 mg, 0,026 mmol, 40 mM) en 662 ml de H²°:t-Bu°H (2:1, v/v) durante 0,5 horas. Después de detener la reacción con Na² EDTA (48,4 mg, 0,13 mmol), el producto se sometió a purificación mediante RP-HPLC, lo que proporcionó m7Gppp-triazol-C²H⁴NHppG como sal de amonio.

1H-rMn (500 MHz, óxido de deuterio) 89,13 (s, 1H, H8 m7G), 8,24 (s, 1H, H8 G o Htriazol), 8,06 (s, 1H, H8 G o Htriazol), 6,08 (d, J = 3,1 Hz, 1H, H1' m7G), 5,87 (d, J = 5,8 Hz, 1H, H1' G), 4,82 (solapado con HDO, 1H, H2' G), 4,59 (dd, J = 6,1, 4,9 Hz, 1H, H3' m7G), 4,52 (dd, J = 5,3, 3,7 Hz, 1H, H3' G), 4,42 (t, J = 6,4 Hz, 2H, HcH²-triazol), 4,35-4,26 (m, 4H, H2' m7G, H4' G y m7G, H5' G o m7G solapados), 4,25 - 4,13 (m, 3H, H5' G o m7G, H5” G y m7G solapados), 4,07 (s, 3H, m7), 3,59 (s, 3H, m2°), 3,32 (dt, J = 12,6, 6,4 Hz, 2H, Hch²-nh); 31P-RMN (202 MHz, óxido de deuterio) 8 -1,36 - -1,72 (m, 1P, PP), -6,34 (d, J = 21,8 Hz, 1P, P8), -10,04 - -10,29 (m, 1P, Pa), -10,49- -10,65 (m, 1P, PQ, -22,34 (dd, J = 21,8, 19,7 Hz, 1P, Pe); HRMS (-) ESI m/z hallado: 1069,0946, calculado para C²⁶H³⁸N¹⁴° ²³P⁵-: 1069,0928.

m27'2-OGppp-triazol-C2H4OppG (m27'2-OoGppptC2H4OppG)

Se obtuvo según el PG H a partir de m²7,2-°GpppC²H (330 mD°, 0,029 mmol, 48 mM) y Gpp°C²^ N (350 mD°, 0,029 mmol, 48 mM) mientras se agitaba con CuS^{° 4} (2,9 mg, 0,012 mmol, 19 mM) y ascorbato de sodio (4,6 mg, 0,023 mmol, 38 mM) en 0,600 ml de H²°:t-Bu°H (5:1, v/v) durante 1 hora. Después de detener la reacción con Na² EDTA (44,7 mg, 0,12 mmol), el producto se sometió a purificación mediante RP-HPLC, lo que proporcionó m7Gppp-triazol-C²H⁴°ppG como sal de amonio.

1H-^rMⁿ (500 MHz, óxido de deuterio) 89,15 (s, 1H, H8 G o m7G o Htriazol), 8,38 (s, 1H, H8 G o m7G o Htriazol), 8,30 (s, 1H, H8 G o m7G o Htriazol), 6,09 (d, J = 3,1 Hz, 1H, H1' m7G), 5,93 (d, J = 5,3 Hz, 1H, H1' G), 4,77 (t, 1H, solapado con HD°, H2' G), 4,66 (t, J = 5,4 Hz, 2H, CH² enlazador ch²-n), 4,58 (dd, J = 6,0, 4,9 Hz, 1H, H3' m7G), 4,48 (dd, J = 5,1, 4.0 Hz, 1H, H3' G), 4,39 -4,26 (m, 6H, H2' m 7G, CH² enlazador ch²-°, H4'G, H4' m7G, H5' G o m7G solapados), 4,11-4,23 (m, 3H, H4' m7G, H5' G o m7G, H5' y H5” G o m7G), 4,08 (s, 3H, m7), 3,59 (s, 3H, m2-°); 31P-RMN (202 MHz, óxido de deuterio) 8 -6,58 (d, J = 21,6 Hz, 1P), -10,08 - -10,87 (m, 3P, solapados), - 22,34 (t, J = 20,6 Hz, 1P, P8); HRMS (-) ESI m/z hallado: 1070,0792, calculado para C²sH³⁷N¹³° ²⁴P⁵-: 1070,0768.

m27'2'OGppp-triazol-C2H4OpG (m27'2-OGppptC2H4OpG)

Se obtuvo según el PG H a partir de m²7,2-°GpppC²H (330 mD°, 0,029 mmol, 25 mM) y Gp°C ²^ N (350 mD°, 0,029 mmol, 25 mM) mientras se agitaba con CuS^{° 4} (2,9 mg, 0,012 mmol, 10 mM) y ascorbato de sodio (4,6 mg, 0,023 mmol, 20 mM) en 1,150 ml de H²°:t-Bu°H (3:1, v/v) durante 0,5 horas. Después de detener la reacción con Na² EDTA (44,7 mg, 0,12 mmol), el producto se sometió a purificación mediante RP-HPLC, lo que proporcionó m7Gppp-triazol-C²H⁴°pG como sal de amonio.

1H-^rMⁿ (500 MHz, óxido de deuterio) 89,14 (s, 1H, H8 G o m7G Htriazol), 8,31 (s, 1H, H8 G o m7G o Htriazol), 8,05 (s, 1H, H8 G o m7G Htriazol), 6,06 (d, J = 2,9 Hz, 1H, H1' m7G), 5,83 (d, J = 5,8 Hz, 1H, H1' G), 4,70 (dd, J = 5,2, 5,8 Hz, I H, H2' G), 4,65 (t, J = 5,2 Hz, 2H, CH² enlazador CH²-N³), 4,57 (dd, J = 6,3, 4,9 Hz, 1H, H3' m7G), 4,27-4,34 (m, 4H, H² ' m7G y H3' G, H4' G o H5' o H5” m7G solapados), 4,27 - 4,22 (m, 1H, H4' G), 4,16-4,21 (m, 3H, CH 2 enlazador CH2-° y H4' G o H5' o H5” m7G solapados), 4,06 (s, 3H, m7), 3,87 (ddd, J = 11,6, 4,6, 2,9 Hz, 1H), 3,81 (ddd, J = 11,6, 5,2, 4.0 Hz, 1H), 3,60 (s, 3H, m2-°); 31P-RMN (202 MHz, óxido de deuterio) 80,65-0,67 (m, 1P, Pa), -6,73 (d, J = 22,2 Hz, 1P, Py), -10,49--10,69 (m, 1P, Pe), -22,36 (dd, J = 22,2, 18,7 Hz, 1P, P8); HRMS (-) ESI m/z hallado: 990,1097, calculado para C²⁶H³⁶N¹³° ²¹P⁴-: 990,11047.

m27'2'OGpp-triazol-C2H4OppG (m27'2-OGpptC2H4OppG)

Se obtuvo según el PG H a partir de m²7,2-°GppC²H (330 mD°, 0,029 mmol, 48 mM) y Gpp°C²^ N (350 mD°, 0,029 mmol, 48 mM) mientras se agitaba con CuS^{° 4} (2,9 mg, 0,012 mmol, 19 mM) y ascorbato de sodio (4,6 mg, 0,023 mmol, 38 mM) en 0,600 ml de H²°:t-Bu°H (5:1, v/v) durante 1 hora. Después de detener la reacción con Na² EDTA (44,7 mg, 0,12 mmol), el producto se sometió a purificación mediante RP-HPLC, lo que proporcionó m7Gpp-triazol-C²H⁴°ppG como sal de amonio.

1H-rMn (500 MHz, óxido de deuterio) 89,13 (s, 1H, H8 G o m7G o Htriazol), 8,31 (s, 1H, H8 G o m7G o Htriazol), 8,09 (s, 1H, H8 G o m7G o Htriazol), 6,06 (d, J = 3,0 Hz, 1H, H1' m7G), 5,85 (d, J = 6,0 Hz, 1H, H1' G), 4,75 (dd, J = 5,1, 6.0 Hz, 1H, H2' G), 4,68 (t, J = 5,1 Hz, 2H, CH² enlazador ^ch2-ⁿ), 4,53 (dd, J = 6,1, 4,9 Hz, 1H, H3 m7G), 4,47 (dd, J = 5,1, 3,4 Hz, 1H, H3' G), 4,38 - 4,29 (m, 5H, H2' m7G, CH² enlazador ^ch2-°, H4'G, H4' m7G solapados), 4,26 (ddd, J = I I , 9, 4,7, 2,6 Hz, 1H, H5' G o m7G), 4,12-4,19 (m, 2H, H5' G o m7G, H5” G o m7G solapados), 4,05-4,10 (m, 1H, H5” G o m7G), 4,04 (s, 3H, m7), 3,59 (s, 3H, m2-°); 31P-RMN (202 MHz, óxido de deuterio) 8 -6,52 (d, J = 24,3 Hz, 1P), -10,70- -10,37 (m, 3P); HRMS (-) ESI m/z hallado: 990,1133, calculado para C²⁶H³⁶N¹³° ²¹P⁴-: 990,1105.

Ejemplo 2 - Determinación de Kas para complejos de análogo de caperuza-eIF4E

Las constantes de asociación para los complejos de análogo de caperuza-eIF4E se determinaron utilizando un procedimiento de valoración con detención por fluorescencia, tal como se ha descrito previamente.42 Las mediciones se realizaron utilizando una cubeta de cuarzo con una longitud de camino óptico de 4 mm para la absorción y de 10 mm para la emisión en un espectrofluorómetro LS-50B de Perkin-Elmer Co. (Waltham, MA, EE.UU.). Los experimentos de valoración se llevaron a cabo a 20 °C en tampón Hepes 50 mM/KOH, pH 7,20, que contiene KCI 100 mM, EDTA 0,5 mM y DTT 1 mM. Durante el experimento, se añadieron alícuotas de 1 p.l de solución de ligando a los 1.400 pl de solución de proteína 0,1 pM. La fluorescencia de proteína se monitorizó a 337 o 345 nm (excitación a 280 o 295 nm, respectivamente). Para el análisis de datos, se aplicó una corrección de intensidad de fluorescencia para la dilución de la muestra y el efecto de filtro interno. Las constantes de asociación se determinaron ajustando la dependencia teórica de la intensidad de fluorescencia con respecto a la concentración de ligando total. Cada experimento se realizó por triplicado, las constantes de asociación se calcularon como promedios ponderados. La tabla 2 enumera los valores de K^as para los complejos de elF4E y análogos de caperuza de fosfotriazol seleccionados en comparación con análogos de caperuza de referencia.

TABLA 2

Ejemplo 3 - Incorporación de análogos de caperuza de dinucleótido en el extremo 5’ de transcritos.

La tabla 3 enumera las secuencias de ADN y ARN de los oligonucleótidos utilizados en experimentos de biología molecular.

3.1. Síntesis de transcritos para la determinación de la eficacia de adición de caperuza

Antes de la transcripción in vitro, se realizó el apareamiento de un molde. Se incubaron ADN1 (SEQ ID NO: 1) y ADN2 (SEQ ID NO: 2) (20 pM cada uno) en presencia de Tris-HCI 4 mM pH 8,0, NaCl 15 mM y EDTA 0,1 mM a 95 °C durante 2 minutos y, a continuación, a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de una dilución de 10 veces, la mezcla se utilizó directamente para la transcripción in vitro.

La transcripción in vitro se realizó en ADN1 (SEQ ID NO: 1) y ADN2 (SEQ ID NO: 2) (0,5 pM) apareados previamente con ARN polimerasa de SP6 (New England BioLabs) (1 U/pl) en presencia de tampón de reacción de ARN pol. 1x (New England BioLabs), DTT 5 mM, inhibidor de ARNasa RiboLock (ThermoFisher Scientific) (2,0 U/pl), UTP 0,5 mM, ATP 0,5 mM, CTP 0,5 mM, GTP 0,125 mM y 1,25 mM de un análogo de caperuza de dinucleótido modificado con triazol apropiado (m ^ ' Gppp-triazol-G, m ^ ' Gppp-triazol-C²H⁴NHpG, m ^ ' Gppptriazol-C²H⁴NHppG, m²7’2-OGppp-triazol-C²H⁴OppG, m²7’2-OGppp-triazol-C²H⁴OpG, m²7,2-OGppp-triazol-C²H⁴OppG) y GpppG, m7GpppG y m²7,3-OGpppG de referencia.6 La mezcla de reacción se incubó a 40 °C durante 1,5 horas, seguido por la adición de ADNasa TURBO (Ambion) (0,1 U/pl) e incubación a 37 °C durante otros 30 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de 2 pl de EDTA 0,5 M pH 8,0 y se purificó con el kit RNA Clean&Concentrator-5 (Zymo Research) para proporcionar hebras de ARN1 con caperuza (SEQ ID NO: 4).

Para reducir la heterogeneidad, cada ARN1 con caperuza (11,42 ng/pl, aproximadamente 1 pM) se incubó en presencia de Tris-HCI 50 mM pH 8,0, MgCl²50 mM, inhibidor de ARNasa RiboLock (ThermoFisher Scientific) (2,0 U/pl) y ADN3 (SEQ ID NO: 3) (1 pM) a 37 °C durante 1 hora para proporcionar ARN2 (SEQ ID NO: 5).44 La reacción se detuvo mediante congelación en nitrógeno líquido y se analizó directamente mediante PAGE (figura 3).

La intensidad relativa de las bandas se determinó utilizando el programa CLIQS v1.0.

Ejemplo 4 - Estudios de traducción

4.1. Síntesis de transcritos

La transcripción in vitro se realizó con el producto de PCR que codifica para la luciferasa de luciérnaga bajo el control del promotor de SP6 (obtenido a partir de pGEN-luc (Promega) utilizando los cebadores: ADN4 (SEQ ID NO: 6) y ADN5 (SEQ ID NO:7) (5 ng/pl) con ARN polimerasa de SP6 (1 U/pl) (New England BioLabs) en presencia de tampón de reacción de ARN pol. 1x (New England BioLabs), DTT 5 mM, inhibidor de ARNasa RiboLock (ThermoFisher Scientific) (2,0 U/pl), UTP 0,5 mM, ATP 0,5 mM, CTP 0,5 mM, GTP 0,125 mM y 125 mM de un análogo de caperuza de dinucleótido modificado con triazol apropiado y GpppG, m7GpppG y m²7,3-OGpppG de referencia. La mezcla de reacción se incubó a 40 °C durante 1,5 horas, seguido por la adición de ADNasa TURBO (Ambion) (0,1 U/pl) e incubación a 37 °C durante otros 30 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de 2 pl de EDTA 0,5 M pH 8,0 y se purificó con el kit NucleoSpin RNA Clean-up XS (Macherey-Nagel) para proporcionar hebras de ARN que codifican para luciferasa con caperuza con un análogo de caperuza apropiado.

4.2. Traducción

Para cada ARN que codifica para luciferasa con caperuza, se prepararon cuatro soluciones diluidas, 3,0 ng/pl, 1,5 ng/pl, 0,75 ng/pl, 0,375 ng/pl. Los estudios de traducción se realizaron utilizando el sistema de lisado de reticulocitos de conejo (Promega). Se incubaron 9 pl de una mezcla que contenía lisado de reticulocitos de conejo (4 pl), mezcla de aminoácidos menos leucina (0,05 pl de una solución 1 mM), mezcla de aminoácidos menos metionina (0,05 pl de una solución 1 mM), acetato de potasio (1,9 pl de una solución 1 M), MgCl² (0,4 pl de una solución 25 mM) y 2,1 pl de agua, a 30 °C durante 1 hora, después de lo cual se añadió 1 pl de una solución de ARN que codifica para luciferasa apropiada y se continuó con la incubación de la reacción a 37 °C durante otra hora. La reacción se detuvo mediante congelación en nitrógeno líquido.

La eficacia de traducción se determinó utilizando el sistema de indicador de luciferasa (Promega). Las muestras se descongelaron justo antes del experimento. A cada muestra se le añadieron 50 pl de reactivo de ensayo de luciferasa justo antes de la medición de la luminiscencia en un lector de microplacas Synergy H1 (Bio Tek). Las mediciones se realizaron para cada cuatro muestras independientemente debido a la baja estabilidad de la señal de luminiscencia. Los resultados se presentan en la figura 4 como proporciones entre los coeficientes de regresión de las relaciones lineales entre la concentración de ARN que codifica para luciferasa con caperuza en la reacción de traducción (300 pg/pl, 150 pg/pl, 75 pg/pl, 37,5 pg/pl) y la señal de luminiscencia correspondiente.

La tabla 4 enumera las eficacias de adición de caperuza para oligonucleótidos cortos terminados con análogos de caperuza de fosfotriazol y las eficacias de traducción en lisados de reticulocitos de conejo para ARNm que codifican para luciferasa de luciérnaga con caperuza con diferentes análogos de fosfotriazol. También enumera los datos correspondientes para análogo de caperuza sin modificar (m7GpppG), ARCA sin modificar (m²7,3-OGpppG) y análogos de caperuza de ejemplo que contienen un resto de triazol dentro del resto de nucleósido para su comparación (m7GtpppG y m⁷GtCH²ÜpppG).

TABLA 4

Ejemplo 5 - Susceptibilidad a la degradación mediante hDcp2

La mezcla de reacción que contenía ARN2 sintetizado (SEQ ID NO: 5) con caperuza con m²⁷,³ -OGpppG, m²⁷,² -OGppptriazol-G y m²⁷,² -OGppp-triazol-C²H⁴NHpG (para los detalles de la síntesis, véase 1.4.1) se precipitó y el sedimento se disolvió en agua y se incubó en presencia de tampón de ADNasa TURBO 1x (Ambion), inhibidor de ARNasa RiboLock (ThermoFisher Scientific) (2,0 U/pl) y ADNasa TURBO (Ambion) (0,1 U/pl) a 37 °C durante 30 minutos. A continuación, la reacción se sometió a extracción con fenol-cloroformo, seguido por precipitación. La solución en agua de ARN2 resultante se utilizó directamente para los experimentos de eliminación de caperuza catalizada por Dcp2.

Se incubó ARN2 apropiado en presencia de NH⁴Cl 50 mM, MgCl²5 mM, Tris-HCI 50 mM pH 8,0, IGEPAL CA-630 al 0,01 % (Sigma Aldrich), MnCl² 2 mM, DTT 1 mM y hDcp2 7 nM a 37 °C. Se recogieron alícuotas de 5 pl de la reacción después de 5, 15, 30, 60 minutos de incubación o justo después de la adición de la enzima (punto de tiempo “0 min”) y se detuvieron con colorante de carga (urea 5 M, formamida al 44 %, EDTA 20 mM, azul de bromofenol al 0,03 %, xilenocianol al 0,03 %), y se analizaron directamente mediante PAGE al 15 % (figura 5). Ejemplo 6 - Estudios de estabilidad

Los análogos m² ’ - Gppp-triazol-C²H⁴NHppG, m² ’ - Gppp-triazol-C²H⁴OppG, m² ’ - Gppp-triazol-C²H⁴OpG, m²⁷,² -OGppp-triazol-C²H⁴OppG se incubaron en viales sellados a 20 pM y a temperatura ambiente en cuatro tampones diferentes: tampón formiato 0,1 M pH 3,0, tampón acetato 0,1 M pH 5,0, HEPES 0,1 M pH 7,0 y tampón borato 0,1 M pH 9,0. Se tomaron muestras de 50 pl para cada condición después de 0, 2 y 24 horas y se analizaron mediante RP-HPLC. El área de pico del compuesto de partida se determinó para cada punto de tiempo y se calculó el % de caperuza restante en referencia al punto de tiempo ⁰ horas.

TABLA 5

BIBLIOGRAFÍA

(Los números dentro de la solicitud escritos en superíndice indican uno de los siguientes documentos de bibliografía a los que hacen referencia)

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Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Compuesto de fórmula (I)

o estereoisómero o sal del mismo,

en la que R1 y R2 se seleccionan del grupo que consiste en N, N+-CH³ , N+-C²H⁵, N+-C³H⁸, N+-C⁴H⁵ , N+-CH²C⁶H⁵, en los que, como mínimo, uno de R1, R2 no es N,

n y m se eligen independientemente del grupo que consiste en 0, 1 y 2;

X se selecciona del grupo que consiste en O, NH, S, CH²

k es 1 o 2

Y está ausente o se selecciona del grupo de -CH²-, -CH²CH²-, -CH²O-, -CH²S-, -CH²NH-, -CH²CH²O-, -CH²CH²NH-, -CH2CH2S-R3, R4, R5, R6 se seleccionan del grupo que consiste en H, OH, OCH³ u OCH²CH³ ; en la que R3 y R4 pueden ser iguales o diferentes; R5 y R6 pueden ser iguales o diferentes; si cualquiera de R3, R4 es diferente de OH, entonces R5 y R6 son ambos OH; si cualquiera de R5, R6 es diferente de OH, entonces R3 y R4 son ambos OH.

2. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que R1 es N+-CH³ , R3 y R4 se seleccionan del grupo que consiste en OH y OCH³ y, como mínimo, uno de R3, R4 no es OH, R5 y R6 son ambos OH, y n es, como mínimo, 1.

3. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que R2 es N+-CH³ , R5 y R6 se seleccionan del grupo que consiste en OH y OCH³ y, como mínimo, uno de R5, R6 no es OH, R3 y R4 son ambos OH, y m es, como mínimo, 1.

4. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que el compuesto se selecciona del grupo que consiste en los siguientes:

5. Composición que comprende, como mínimo, uno de los compuestos, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o, como mínimo, un estereoisómero o una sal del mismo, y un portador o diluyente adecuado.

6. Molécula de ARN, cuyo extremo 5’ incorpora el compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

7. Procedimiento de síntesis in vitro de la molécula de ARN, según la reivindicación 6, comprendiendo dicho procedimiento hacer reaccionar ATP, CTP, UTP y GTP, el compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o la composición, según la reivindicación 5, y un molde de polinucleótido en presencia de ARN polimerasa, en condiciones que permiten la transcripción por la ARN polimerasa del molde de polinucleótido para dar una copia de ARN; mediante lo cual algunas de las copias de ARN incorporarán el compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, para producir una molécula de ARN, según la reivindicación 6.

8. Procedimiento de síntesis de una proteína o un péptido in vitro, comprendiendo dicho procedimiento traducir la molécula de ARN, según la reivindicación 6, en un sistema de síntesis de proteínas libre de células, en el que la molécula de ARN comprende un marco de lectura abierto, en condiciones que permiten la traducción del marco de lectura abierto de la molécula de ARN para dar la proteína o el péptido codificado por el marco de lectura abierto.

9. Procedimiento de síntesis de una proteína o un péptido en células en cultivo, comprendiendo dicho procedimiento traducir la molécula de ARN, según la reivindicación 6, en células en cultivo, en el que la molécula de ARN comprende un marco de lectura abierto, en condiciones que permiten la traducción del marco de lectura abierto de la molécula de ARN para dar la proteína o el péptido codificado por dicho marco de lectura abierto.

10. Utilización del compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, o la composición, según la reivindicación 5, en una síntesis in vitro de una molécula de ARN.

11. Utilización de la molécula de ARN, según la reivindicación 6, en una síntesis in vitro de una proteína o un péptido.