EP1885876A2 - Makromolekulare nukleotidverbindungen und methoden zu deren anwendung - Google Patents

Makromolekulare nukleotidverbindungen und methoden zu deren anwendung

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EP1885876A2
EP1885876A2 EP06723505A EP06723505A EP1885876A2 EP 1885876 A2 EP1885876 A2 EP 1885876A2 EP 06723505 A EP06723505 A EP 06723505A EP 06723505 A EP06723505 A EP 06723505A EP 1885876 A2 EP1885876 A2 EP 1885876A2
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EP
European Patent Office
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nuc
component
linker
nucleic acid
macromolecules
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06723505A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Dmitry Cherkasov
Englbert BÄUML
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cherkasov Dmitry
Genovoxx GmbH
Original Assignee
Cherkasov Dmitry
Genovoxx GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Cherkasov Dmitry, Genovoxx GmbH filed Critical Cherkasov Dmitry
Publication of EP1885876A2 publication Critical patent/EP1885876A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Definitions

  • nucleotide and nucleoside building blocks hereinafter "nuc macromolecules”.
  • Low molecular weight substances play an important role in living organisms. They serve, for example, as building blocks of polymers, as messengers, as energy sources. In diagnostics, they are used to determine medically relevant parameters. These substances are often marked with specific signal carriers.
  • An example of the low molecular weight substances are nucleotides and nucleosides.
  • nucleotide Analogs Scheit, 1980, ISBN 0-471-04854-2, “Nucleosides and Nucleic Acid Chemistry", Kisakürek 2000, “Anti-HIV Nudeosides” Mitsuya, 1997, “Nucleoside Analogs in Cancer Therapy”, Cheson, 1997).
  • nucleic acids One of the most important fields of modern life science is analysis of nucleic acids.
  • a large area of these analyzes deals with the detection of nucleic acids or their components in the biological preparation.
  • a reaction partner is labeled for this purpose, which can react with the nucleic acid to be analyzed.
  • the person skilled in various ways for labeling the nucleic acids are known. On the one hand, individual On the other hand, short fragments of nucleic acids, oligonucleotides or polynucleotides can be used for detection.
  • nucleotides are, for example, in Lee et al. Nucleic acid research 1992, V. 20, p.2471; Augustin et. al. J. Biotechnology 2001, V. 86, p.289- 301; U.S. Patent 4,828,979; Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30, p 3857 described.
  • These nucleotides have a low molecular detectable portion that can be detected directly (such as a fluorescent dye molecule) or indirectly (as in a biotin molecule that is detected only after coupling with a streptavidin-dye conjugate).
  • Such nucleotides are examples of the art of nucleotide modifications.
  • nucleotides can be purchased commercially, e.g. from NEN Life Science Products (biotin-11-dUTP, DNP-11-dATP, fluorescein-12-dCTP), from Amersham Bioscience (dCTP-Cy3, .dCTP-Cy5) or from Roche (biotin-16-dUTP).
  • detection reagents e.g. labeled streptavidin, labeled antibodies, can be purchased from the same suppliers.
  • modified nucleosides will be discussed below. It should be obvious to a person skilled in the art that modified nucleosides can also be used for the enzymatic and non-enzymatic syntheses; conventionally modified nucleosides are obtainable, for example, from Trilink Biotechnologies or Eurogentec. Conventionally modified nucleotides have an equimolar ratio between the nucleotide component and the low molecular detectable part, e.g. Dye molecule or biotin molecule. Between both parts is a linker with an average length of 5 - 30 atoms.
  • nucleotides can be incorporated by polymerases into the growing strand and thus introduce a signal-carrying molecule (dye) or signal-transmitting molecule (biotin or digoxigenin) into the nucleic acid chain.
  • signal detection may be direct in the case of dye-labeled nucleotides or after incubation with a secondary signal-carrying molecule (eg, strepavidin-dye conjugate in the case of biotin) when signal-transmitting molecules are used.
  • a secondary signal-carrying molecule eg, strepavidin-dye conjugate in the case of biotin
  • signal amplification steps are used in the labeling of nucleic acids. These can be performed at different stages of the analysis. Examples of this are material amplification (PCR), multiple incorporation of labeled nucleotides, multistage postmarking of biotin nucleotides ("Molecular Cloning", J. Sambrook, vol. 1-3, 2001, ISBN 0-87969-576-5). These methods lead to a distortion of the signals, since they consist of several, often insufficiently controlled steps, which proceed with different yields and can be influenced by many factors.
  • WO02072892 rely on the detection of signals from single nucleotide molecules.
  • several phenomena e.g. bleaching of the dyes or blinking the results of single molecule detection.
  • increasing the signal strength and intensity of the nucleotide tag means a reduction in the error rate in the detection.
  • nucleotides or nucleosides which retain their substrate properties for polymerases or other enzymes and, upon their incorporation into the nucleic acids, provide enhanced signal intensity in their analysis.
  • a further object of the invention is the provision of methods for labeling nucleic acids with nucleotides modified according to the invention.
  • the present invention in one embodiment, describes a novel class of modified nucleotides, the nuc-macromolecules.
  • Nuc-macromolecules are characterized in that one or more nucleotide components are connected to one or more signaling or signal-mediating macromolecular components (markers) via a linker.
  • the respective nuc-component retains its substrate function for enzymes in a nuc-macromolecule.
  • a signaling macromolecular component carries multiple dye molecules.
  • Nuc-macromolecules may be used as conventionally modified nucleotides in various fields of biotechnology and medicine. In the following, only their use for the nucleic acid labeling should be shown as an example. Other fields of application of the nuc-macromolecules are already known to the person skilled in the art
  • Macromolecular compound - a molecule r or a molecular complex, or a nanocrystal or nanoparticle whose mass is between 2kDa and 2OkDa, 2kDa and 5OkDa, 2kDa and 10OkDa, 10OkDa and 20OkDa, 20OkDa and 100OkDa or IMDa and 100MDa or 100MDa and 100GDa.
  • macromolecular compounds are nucleic acids, such as oligonucleotides with a length of more than 10 nucleotides, polynucleotides, polypeptides, proteins or enzymes, quantum dots, polymers such as PEG, Mowiol, dextran, polyacrylate, nanogold particles but also complexes consisting of several macromolecules consist.
  • Biotin natural nucleotides
  • dATP dATP
  • dUTP dUTP
  • dyes such as Cy3, rhodamine, fluorescein
  • conventionally modified nucleotides such as biotin-16-dUTP.
  • a nuc-macromolecule in the context of this application is a chemical structure which includes one or more nuc-components, one or more linker components and a marker component, FIG. 1 or 2:
  • Linker - is a linker component
  • n - is a number from 1 to 1000
  • linker is water-soluble. His
  • Composition is not limited as long as the substrate properties of
  • the linker component consists of a coupling unit L for the coupling of the linker to the nuc-component, of a water-soluble polymer and of a coupling unit T for the coupling of the linker to the marker component.
  • a nuc-macromolecule has the following structure, Fig. 1 or 2:
  • Nuk - is a nucleotide or a nucleoside monomer (nuc-component)
  • T - is a part of the linker that represents the link between the linker residue and the marker (coupling unit T)
  • Linker component Polymer - a part of the linker being a water-soluble polymer with an average length between 5 and 100,000 atoms (coupling unit L, polymer linker, coupling unit T are in this embodiment summarized as linker component) Marker - a marker component n - a number from 1 to 1000, where (n) can represent an average value.
  • Nuc component can be both a nucleotide and a nucleoside.
  • nucleosides will be considered in the description. It should be obvious to a person skilled in the art that nucleosides can also be modified in a corresponding manner and be used in corresponding reactions.
  • nuc-component is a nucleotide or nucleoside monomer coupled to the linker moiety.
  • all conventional nucleotide variants suitable as substrate for nucleotide-accepting enzymes can serve as nuc-component of the nuc macromolecule, so that both natural and modified nucleotides (nucleotide analogues) are suitable for the nuc-component.
  • base, sugar or phosphate moieties may be modified, Figure 3.
  • the nuc-component preferably includes a base component (base), a sugar component (sugar) and optionally a phosphate component (phosphate).
  • sugar and phosphate can be modified, ie the basic structure looks similar to the natural nucleotides or nucleosides, but carries, for example, additional chemical groups. Examples of combinations of different components are known to the person skilled in the art. Such nuc-components can be used in many enzymatic and chemical reactions (Wright, Wright et al., Pharmac.Ther 1990, V. 47, p 447-).
  • a nuc-component is coupled to other nucleotides, e.g., in a nucleic acid chain.
  • the nuc-component occurs as a monomer of a polymer.
  • the nuc-component is a nucleoside. In another embodiment, the nuc-component is a nucleoside monophosphate. In another embodiment, the nuc-component is a nucleoside diphosphate. In another embodiment, the nuclide component Component is a nucleoside triphosphate. Also, higher phosphate derivatives (tetraphosphate, etc.) can be used. The phosphate modifications mentioned can, as with nucleoside triphosphates, be located at the 5 'position or also at other positions of the sugar part of the nucleotide, for example at the 3 ° position.
  • the phosphate component may include modifications, such modifications include, for example, in one embodiment, a linker (Jameson, D., et al., Methods in Enzymology 1997, v. 278, p363, A. Draganescu et al., 3. Biol. Chem. 2000, v.275, 4555).
  • the phosphate component of the nuc-component includes thiotriphosphate compounds (Burges et al., PNAS 1978 v. 75, pp. 4798-).
  • the phosphate component of the nuc-component includes protected phosphate groups (e.g., phosphoramidites).
  • the phosphate component is the link between the nuc-component and the linker component of the nuc-macromolecules.
  • the nuc-component may be a nucleotide or nucleoside or its analogues occurring naturally in the nucleic acids, preferably those participating in Watson-Crick pair formation, for example adenine, guanine, thymine, cytosine, uracil, inosine, or a modified base such as eg 7-deazaadenine, 7-deazaguanine, 6-thioadenine, literature see. above.
  • the base may include modifications, such as, for example, in one embodiment, include a linker coupled to the base, such as an amino-propargyl linker or an amino-allyl linker, further examples of the linkers are known (Ward et al Pat 4711955, G.
  • the linker coupled to the base is the link between the nuc-component and the linker moiety of the nuc-macromolecules. Further modifications to the base are, for example, in the catalog of Trilink Biotechnologies, Inc. San Diego, USA, 2003 Edition on page 38.
  • the sugar component of the nucleotides which are used for example in diagnostics, therapy or research.
  • Such variations include, for example, ribose, 2 "-deoxyribose or 2 ', 3" -didoxyribose.
  • the sugar component may include modifications (Metzger, M., et al., Nucleic Acid Research 1994, V. 22, 4259, Tsien WO 91/06678), such modifications include, for example, in one embodiment, a linker.
  • the modifying group or linker may be reversibly coupled to the sugar moiety (Hovinen et al., J. Chem. Soc.Prking Trans., 1994, pp.
  • the linker coupled to the sugar component is the link between the nuc-component and the linker component of the nuc-macromolecules.
  • the sugar component includes, for example, the following modifications: optionally, the 3 ' or the 2' -OH groups can be replaced by the following atoms or groups: halogen atoms, hydrogen, amino, mercapto or azido group ( Beabealashvilli et al., Biochem Biophys Acta 1986, v.868, 136-, Yuzhanov et al., FEBS Lett., 1992, v. 306, 185-).
  • the nuc-component includes acyclic nucleotide or nucleoside modifications (Hoiy Current Pharmaceutical Design 2003 v. 9, 2567, G. Wright et al., Pharmac. Thier 1990, V. 47, p. 447-).
  • the sugar component may include a double bond.
  • 2 "deoxynucleotides for example 2 * deoxyuridine triphosphate, 2 * deoxycytidine triphosphate, 2 * deoxyadenosine triphosphate, 2 '- deoxyguanosine triphosphate, are referred to as dUTP, dCTP, dATP and dGTP.
  • the nuc-component is connected to the linker at a coupling site.
  • the coupling site of the linker to the nuc-component may be located at the base, on the sugar (ribose or deoxyribose), or on the phosphate part.
  • connection between the linker component and the nuc-component is preferably covalent.
  • the coupling site When the coupling site is at the base, it is preferably located at positions 4 or 5 at pyrimidine bases and at positions 6, 7, 8 at the purine bases (Ward et al., US Patent 4,711,955, G. Wright et Pharmac.Ther 1990, V. 47, p 447, Hobbs et al., US Patent 5,047,519 or other linkers, eg, Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US Pat. Hanna M. Method in Enzymology 1996 v.274, p.403, Zhu et al NAR 1994 v.22 p.3418, Jameson et al Method in Enzymology, 1997, v. 278 pp.
  • the coupling to the phosphate groups can take place on the alpha, beta or gamma phosphate group.
  • the position of the coupling site depends on the area of application of the NT macromolecules.
  • preferably coupling sites on the sugar or on the base are used.
  • the coupling to the gamma or beta-phosphate groups can be carried out, for example, if the label is to be released during the incorporation of the nuc-macromolecule.
  • connection between the nuc-component and the linker component takes place, for example, via a coupling unit (L) which is a part of the linker component.
  • connection between the nuc-component and the linker may in one embodiment be resistant, eg at temperatures up to 130 ° C., for pH ranges between 1 and 14, and / or resistant to hydrolytic enzymes (eg proteases, esterases).
  • hydrolytic enzymes eg proteases, esterases
  • the connection between the nuc-component and the linker is cleavable under mild conditions.
  • This fissile connection allows removal of the linker and marker components. This may be important, for example, in the methods of sequencing by synthesis, such as Pyrosequencing, BASS (Canard et al., US Patent 5,798,210, Rasolonjatovo Nucleosides & Nucleotides 1999, V.18 S.1021, Metzker et al., NAR 1994, V.22, p.4259, Welch et al., Nucleosides & Nucleotides 1999, V.18, p.19, Milton et al., WO 2004018493, Odedra et al., WO 0192284), or single molecule sequencing, Tcherkassov WO 02088382.
  • Your Choice is not limited, provided that it remains stable under the conditions of the enzymatic reaction, no irreversible disruption of the enzymes (eg polymerase) is caused and can be cleaved off under mild conditions.
  • mild conditions are meant those conditions which, for example, do not destroy nucleic acid-primer complexes, where, for example, the pH is preferably between 3 and 11 and the temperature between 0 ° C. and a temperature value (x).
  • This temperature value (x) depends on the Tm of the nucleic acid-primer complex (Tm is the melting point) and is calculated, for example, as Tm (nucleic acid-primer complex) minus 5 ° C (eg Tm is 47 ° C, then the maximum Temperature at 42 0 C, under these conditions are particularly suitable ester, thioester, acetals, phosphoester, disulfide compounds and photolabile compounds as cleavable compounds).
  • said cleavable compound belongs to chemically or enzymatically cleavable or photolabile compounds.
  • ester, thioester, disulfide, acetal compounds are preferred (Short WO9949082, "Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc., Herman et al., Method in Enzymology 1990 V.184 p.584, Lomant et al., J. Mol., Biol., 1976, V. 104 243, "Chemistry of carboxylic acids and esters.” S. Patai 1969 Interscience Publ.).
  • photolabile compounds can be found in the following references Rothschild WO 9531429, "Protective groups in organic synthesis” 1991 John Wiley & Sons, Inc., V.
  • nuc-component only one nuc-component is coupled per one nuc-macromolecule. In another embodiment of the invention, several nuc-components are coupled per nuc-macromolecule. Several nuc-components may be unitary or different, with, for example, on average 2 to 5, 5 to 10, 10 to 25, 25 to 50, 50 to 100, 100 to 250, 250 to 500, 500 to 1000 nuc-components per one nuk Macromolecule can be coupled.
  • linker or linker component is used synonymously in the application and refers to the entire structural portion of the nuc macromolecule between the nuc-component and the marker component.
  • the linker is preferably water-soluble.
  • the exact linker composition is not limited and may vary.
  • nuc-macromolecules have a short linker. Its length is between 2 and 30 chain atoms. Such linkers may carry functional groups, such as amino, carboxy, mercapto and hydroxy groups. Other molecules, eg macromolecules, such as water-soluble polymers, can be coupled to these groups. Examples of short linkers coupled to nucleotides are known to those of skill in the art (Ward et al., US Pat., 4711955, G. Wright et al., Pharmac.Ther 1990, V. 47, p 447, Hobbs et al., US Patent 5,047,519 or other linkers, for example Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US Pat. No.
  • the linker may contain one or more units of water-soluble polymers, such as amino acids, sugars, PEG units or carboxylic acids.
  • Further examples of short linkers may be the coupling unit (L) of a long linker su linker with the lunge between 2 and 20 atoms, are preferably used in nuc macromolecules whose marker component comprises linear water-soluble polymers.
  • a long linker is used, having a length of more than 30 chain atoms.
  • the linker component represents a portion of the nucleated medullary molecule that lies between the respective nuc-component and the marker component.
  • the linker component has in its structure, for example, the following components:
  • linker component The division of the linker component into individual components is purely functional and is intended only to illustrate the structure. Depending on the perspective, individual structures of the linker can be calculated for one or the other component.
  • the coupling unit L has the function of connecting the linker component and the nuc-component. Preference is given to short, unbranched compounds, from 1 to 20 atoms in length.
  • the respective structure of the coupling unit L depends on the coupling site of the linker to the nucleotide and on the respective polymer of the linker. Some examples of the coupling units L are given in Examples 1 to 33.
  • Short linkers on the base Short WO 9949082, Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382 (see also commercially available nucleotides (Amersham, Roche), short linkers to ribose in Herrlein et al., Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, p 586, Jameson et al., Method in Enzymology, 1997, V. 368, Canard US Patent No. 5,798,210, Kwiatkowski US Pat. No.
  • R 6 is the nuc-component
  • R 7 is the polymer
  • a and B include the following structural elements: -NH-, -O-, -S-, -SS-, -CO-NH-, -NH- CO, - CO-O-, -O-C0-, -CO-S-, -S-CO-, -P (O) 2 -, -Si-, - (CH 2 ) n -, a photolabile group where n - is 1 to 5
  • the coupling unit L is covalently connected on one side with the nuc-component, on the other with polymer.
  • the type of coupling depends on the type of polymer.
  • the polymer has reactive groups at its ends, for example NH 2 (amino), OH (hydroxy), SH (mercapto), COOH (carboxy), CHO (aldehyde), acrylic or maleimide, halogen groups.
  • Such polymers are commercially available (e.g., Fluka).
  • the water-soluble polymer in a preferred embodiment forms the majority of the linker component. It is a polymer, preferably hydrophilic, consisting of identical or different monomers.
  • suitable polymers include polyethylene glycol (PEG), polyamides (eg polypeptides), polysaccharides and their derivatives, dextran and its derivatives, polyphosphates, polyacetates, poly (alkylene glycols), copolymers of ethylene glycol and propylene glycol, poly (olefinic alcohols), poly (Vinylpyrrolidones), poly (hydroxyalkylmethacrylamides), poly (hydroxyalkylmethacrylates), poly (x-hydroxyacids), polyacrylic acid and its derivatives, polyacrylamides in their derivatives, poly (vinyl alcohol), polylactate acid, polyglycolic acid, polyCepsilon-caprolactone), poly (beta-hydroxybutyrate), poly (beta-hydroxyvalerate), polydioxanone,
  • This polymer in one embodiment includes branched or further embodiment non-branched polymers.
  • the polymer may consist of several sections of different lengths, each section consisting of identical monomers and monomers differing in different sections. It should be obvious to a person skilled in the art that for a macromolecular linker usually only an average mass can be determined, so that the information on the molecular weights represents an average value ("Macromolecules, Chemical Structure and Syntheses", Volume 1, 4, H. Elias, 1999 , ISBN 3-527-29872-X). For this reason, no exact mass specification can often be made for nuc macromolecules.
  • the linker component includes a linear, unbranched polymer and does not carry sterically demanding chemical structures, such as dyes, fluorescent dyes, ligands.
  • sterically demanding chemical structures such as dyes, fluorescent dyes, ligands.
  • the polymer of the linker component is linear, but the linker component carries one or more bulky chemical structures, such as dyes.
  • the introduction of sterically demanding groups allows control of the enzymatic reaction in some processes (Tcherkassov WO 02088382). Further examples of sterically demanding groups are given in section 1.3.19.
  • Sterically demanding ligands or structures can be coupled to different linker segments.
  • the average number of sterically bulky ligands coupled to the linker can vary, for example, between 1 and 3, 3, and 5, 5, and 20, 20, and 50.
  • the coupling of sterically demanding groups should take into account the fact that a bulky structure is required in the Near the nucleotide component can lead to the abrogation of the substrate properties, s.
  • Sterically demanding ligands may be uniformly or randomly coupled along the entire length of the linker, or coupled to the linker at a certain distance from the nuc-component.
  • the distance between the Nuc component and steric barrier is, for example, 10 to 15, 15 to 20, 20 to 25, 25 to 30, 30 to 35, 35 to 40, 40 to 45, 45 to 50, 50 to 55, 55 to 60, 60 to 70, 70 to 80, 80 to 90, 90 to 100, 100 to 200, 200 to 1000, 1000 to 5000 chain atoms.
  • the sterically demanding group can be considered as part of the linker or as part of the marker. For example, the consideration may depend on whether or not a sterically demanding group has certain signal properties.
  • the average linker length is between 2 and 5, 5 and 10, 10 to 20, 20 to 30, 30 to 40, 40 to 50, 50 to 60, 60 to 70, 70 to 80, 80 to 90, 90 to 100, 50 to 100, 100 to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 10,000, 10000 to 100000 atoms (counting chain atoms), thus the average linker length is between 2 and 5, 5 and 10, 10 to 20, 20 to 30, 30 to 40, 40 to 50, 50 to 60, 60 to 70, 70 to 80, 80 to 90, 90 to 100, 50 to 100, 100 to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 10,000, 10,000 to 100,000 angstroms (measured on a potentially maximally extended molecule).
  • linker components may be the same or different in length.
  • Some sections of the linker may contain rigid areas and other sections may contain flexible areas.
  • the linker is bound to the nuk component on one side and to the marker component on the other side.
  • the linker can have coupling units at its ends, which fulfill this function.
  • the connection with the nuc-component has been discussed above.
  • the link between the linker and the marker components via coupling unit T Preferred are short, unbranched compounds, up to max. 20 atoms in length.
  • the respective structure of the coupling unit T depends on the coupling site on the marker component and on the particular polymer of the linker.
  • the coupling unit T is covalently bonded to the polymer.
  • the type of coupling depends on the type of polymer.
  • the polymer has reactive groups at its ends, for example NH 2 (amino), OH (hydroxy), SH (mercapto), COOH (carboxy), CHO (aldehyde), acrylic or maleimide, halogen groups.
  • reactive groups for example NH 2 (amino), OH (hydroxy), SH (mercapto), COOH (carboxy), CHO (aldehyde), acrylic or maleimide, halogen groups.
  • Such polymers are commercially available (eg Fluka).
  • Some examples of the coupling units L are in Examples 1 / to 33 Further Examples of the Chemical and Affine Couplings s. in the literature: “Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993, “Bioconjugation: protein coupling techniques for biomedical sciences", M. Aslam, 1996.
  • the linker may also contain other functional groups or sections, for example one or more cleavable groups under mild conditions (FIG. Examples 22, 23, 24, 31.
  • a cleavable linkage within the linker allows removal of a portion of the linker and the label moiety. After cleavage, a linker residue remains on the nuc-component, examples of cleavable compounds are given in section 1.3.3.1.4.
  • the marker component can have different structures.
  • the structures in detail are not limited as long as they do not abrogate the substrate properties of the nuc-components for enzymes.
  • This structure preferably has a signaling or a signal-switching function.
  • the marker may also have other functions, such as structural, antitoxic, or affine function (for example, in drugs or transmissions).
  • the marker in one embodiment includes a low molecular weight marker moiety. In another embodiment, the marker includes a macromolecular marker unit. In a further embodiment, the marker includes several low molecular weight marker moieties. In another embodiment, the marker includes several macromolecular marker units. In another embodiment, the label includes a combination of low molecular weight and macromolecular units. The marker units may have a signaling or signaling function.
  • the number of signaling or signal-switching units that are combined to form a marker component includes the following ranges: 1 and 2, 2 and 5, 5 and 20, 20 and 50, 50 and 100, 100 and 500, 500 and 1000 1000 and 10000, 10000 and 100000. If several marker units are combined in one marker, in one embodiment these units are linked to a scaffold, the core component of the marker ( Figure 4b, c). This core component connects the units with each other. The core component can connect to one or more nuc-linker components (FIG. 5).
  • the core component includes low molecular weight or macromolecular compounds.
  • the structural marker units include the following groups:
  • Biotin molecules hapten molecules (eg digoxigenin), radioactive isotopes (eg P 32 , J 131 ), or their compounds, rare earths, dyes, fluorescent dyes, fluorescence quenchers (eg dabsyl) (many of these molecules are commercially available eg from Molecular Probes, Inc., or Sigma-Aldrich) with the same or different spectral properties, dyes that undergo FRET among themselves.
  • Thermochromic, photochromic or chemiluminescent substances available from Sigma-Aldrich, for example
  • chromogenic substances eg as substrates for peptidases described in "Proteolytic enzymes Tools and Targets", E. Sterchi, 1999, ISBN 3-540-61233-5).
  • Chemically reactive groups such as, for example, amino, carboxy, mercapto, aldehyde, iodoacetate, acrylic, dithio, thioester compounds can also serve as signal-transmitting structural units (FIG. 6a). After incorporation, these reactive groups may be modified with signaling elements such as, for example, dyes having corresponding reactive groups (for example, NHS esters, mercapto, amino groups) ( Figure 6b).
  • signaling elements such as, for example, dyes having corresponding reactive groups (for example, NHS esters, mercapto, amino groups)
  • the combination of a nuc-unit, a markomolecular linker component and a low molecular weight marker already satisfies the requirements of the present invention.
  • Such compounds are also the subject of this invention. They can be used both as intermediates for the chemical synthesis of nuc macromolecules with a macromolecular marker, for example dUTP-PEG-biotin, as well as independently in the enzymatic reactions, such as with only one dye-labeled nucleotides.
  • dyes various fluorescent dyes may occur, their choice is not limited, as long as they do not significantly affect the enzymatic reaction.
  • dyes examples include rhodamines (rhodamine 110, tetramethylrhodamine, available from Fluka-Sigma), cyanine dyes (Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7 from Amersham Bioscience), coumarins, Bodipy, fluorescein, Alexa - Dyes: eg Alexa 532, Alexa 548, Alexa 555 (Molecular Probes). Many dyes are commercially available, for example from Molecular Probes Europe, Leiden, The Netherlands (hereinafter referred to as Molecular Probes) or from Sigma-Aldrich-Fluka (Taufkirchen, Germany). Examples of the synthesis of a nuc macromolecule with a low molecular weight marker are given in Example 19, 20, 23, 36, 37, 38.
  • a marker in one embodiment, includes multiple marker units.
  • the marker units can have the same or different properties among each other.
  • fluorescent dyes with different spectral properties can be used.
  • fluorescent dyes are used which form FRET pairs.
  • Nanocrystals e.g. Quantum dots can appear as marker units. Quantum dots having the same or different spectral properties may be used in a marker component, US Pat. No. 6,322,901, US Pat. No. 6,423,551, US Pat. No. 6,251,303, US Pat. No. 5,990,479).
  • Nanoparticles or micro-particles can occur as marker units, the largest dimensions of these particles being from 1 nm to 2 nm, from 2 nm to 5 nm, from 5 nm to 10 nm, from 10 nm to 20 nm, from 20 nm to 50 nm, from 50 nm to 100 nm, from 100nm to 200nm, from 200nm to 500nm, from 500nm to 100nm, from 1000nm to 5000nm.
  • the material of the particles may be, for example, pure metals such as gold, silver, aluminum, (for example, particles with surface plasmon resonance), - protein-Au conjugates: J. Anal. Chem. 1998, v. 70, p.
  • Protein molecules can occur as marker units, whereby they include the following groups: enzymes (eg peroxidase, alkaline phosphatase, urease, beta-galactosidase, proteinases), - fluorescent proteins (eg from GFP protein) Family or phycobiliproteins (eg, phycoerythrin, phycocyanin), available, for example, from Molecular Probes Inc.), antigen-binding proteins (eg, antibodies, tetramers, affibodies (Nord et al., AI Nature Biotechnology, V. 15 (p.772-777) or theirs Components (eg Fab fragments), nucleic acid binding proteins (eg transcription factor)
  • enzymes eg peroxidase, alkaline phosphatase, urease, beta-galactosidase, proteinases
  • - fluorescent proteins eg from GFP protein
  • phycobiliproteins eg, phycoerythrin,
  • the nucleic acid chains including the group, oligonucleotides, modified oligonucleotides, can occur as marker units.
  • the length of the nucleic acid chains including the group, oligonucleotides, modified oligonucleotides, can occur as marker units.
  • Nucleic acid chains are preferably in the following ranges of 10 to 20, from 20 to 50, from 50 to 100, from 100 to 200, from 200 to 500, from 500 to 1000, 1000 to 5000, from 5000 to 10,000, from 10,000 to 100,000 nucleotides , It can
  • Nucleic acid chains may carry additional modifications, such as free amino groups, dyes and other signaling molecules, e.g. macromolecular substances, enzymes or nanocrystals (Fig.
  • Modified nucleic acid chains are commercially available, e.g. MWG-Biotech.
  • marker units such as lectins; Growth factors, hormones, receptor molecules can be used. 1.3.3.3.3
  • the core component has the function of binding several structural elements of the nuc macromolecules.
  • the core component binds several marker units together.
  • linker components can be attached to the core component.
  • the term core component is functional and is used to illustrate possible structures of nuc macromolecules. Different chemical structures that hold linker and marker moieties together can be referred to as the core component.
  • the core component is one or more low molecular weight compounds. They have the function of connecting the marker units with each other.
  • the connection between the core component and the marker moieties may be covalent or affine.
  • compounds of general structural formula (F) m -R- (H) n may serve as the starting material where (F) and (H) - are reactive groups, and R - is a linking component wherein number of such groups and their arrangement can vary widely.
  • R - is a linking component wherein number of such groups and their arrangement can vary widely.
  • Many examples are known to the person skilled in the art, for example compounds from the group of cross-linkers (Shan S.
  • the structure is not restricted and is preferably water-soluble ) and (H) independently of each other include: NH 2 (amino), OH (hydroxy), SH (mercapto), COOH (carboxy), CHO (aldehyde), acrylic or maleimide
  • (R) represent water-soluble polymers such as PEG or polypeptide chains or short aliphatic chains.
  • the core component consists of a water-soluble polymer, in which case the polymer can consist of identical or different monomers.
  • Kem Kompovine represent the following polymers and derivatives thereof: polyamides (eg polypeptides such as poly (glutamine) or poly (glutamic acid)) and derivatives thereof, polyacrylic acid and derivatives thereof, natural or synthetic polysaccharides (eg starch, hydroxy Ethyl starch), dextran and its derivatives (eg, aminodextran, carboxy-dextran), dextrin, polyacrylamides and their derivatives (eg, N- (2-hydroxypropyl) -methacdylamide), polyvinyl alcohols and their derivatives, nucleic acids, proteins , These polymers may be linear, globular, eg, streptayidin or avidin, or branched, eg, dendrimers ( Figure 8a). Also networked soluble Polymers such as crosslinked poly-acrylamides (crosslinker bisacrylamide in combination with poly-acrylamide) can be used.
  • polyamides eg polypeptides such as poly (glu
  • both the linker component and the marker component can contain water-soluble polymers
  • such a polymer can serve both as a linker and as a core component.
  • one portion of such a polymer may be considered as a linker, another portion as a core component.
  • linear or less branched polymers are used as core components, for example polyamides (for example polypeptides), polyacrylic acid, polysaccharides, dextran, polyacrylamides, polyvinyl alcohols.
  • the polymer may consist of uniform or different monomers.
  • the linker component may have less than 50 chain atoms.
  • linker lengths of about 5 to 10, 10 to 20 or 20 to 50 chain atoms may be sufficient to preserve the substrate properties of the nuc-macromolecules for enzymes.
  • Such a core component of the marker fulfills the function of the linker component: it creates spatial distance between sterically demanding marker units and active centers of the respective enzymes.
  • the water-soluble polymers preferably have an average chain length of 20 to 1,000,000 chain atoms.
  • the average chain length is between 20 and 100, 100 and 500, 500 and 5000, 5000 and 100000, 100000 and 1000000 chain atoms.
  • the aqueous phase polymer is predominantly in a neutral form at pH between 4 and 10 (e.g., dextran or polyacrylamide).
  • the polymer is in an aqueous phase at pH between 4 and 10 in a charged form. It may carry both positive (e.g., polylysine) or negative charges (e.g., polyacrylic acid).
  • the coupling of label moieties to a water-soluble polymer depends on the nature of the polymer.
  • the reactive groups necessary for the coupling can already be present in the polymer (for example polylysine or polyacrylic acid) or introduced into the polymer in a separate step.
  • many variants of the introduction of reactive groups and chemical couplings are known (Molteni L. Methods in Enzymology 1985, v.112, 285, Rogovin AZ et al., J. Macromol Sci. 1972, A6, 569, Axen R. et Nature 1967, v. 214, 1302, Bethell GS et al. J. Biol. Chem. 1979, v.254, 2572, Lahm O. et al. Carbohydrate Res. 1977, v. 58, 249, WO 93/01498, WO 98/22620, WO 00/07019).
  • the core component preferably has multiple coupling sites to which further elements can be attached, e.g. structural marker units or nucl linker component.
  • poly-lysine molecules have multiple free amino groups to which multiple dye molecules, biotin molecules, hapten molecules or nucleic acid chains can be coupled.
  • Poly-lysines have different molecular weights, e.g. 1000- 2000, 2000-10000, 10000-50000 Da can be purchased.
  • the core component serve nucleic acid strands, wherein the nucleic acid chains have a length of 10 to 20, from 20 to 50, from 50 to 100, from 100 to 200, from 200 to 500, from 500 to 1000, 1000 to 5000, of 5000 to have 10,000 nucleotides.
  • These nucleic acids serve as binding partners for sequence-complementary marker units (FIG. 7b).
  • the core component consists of a dendrimer, e.g. Polypropyleneimines, polyaminoamines.
  • a dendrimer e.g. Polypropyleneimines, polyaminoamines.
  • Examples of other dendrimers are known: Cientifica "Dendrimers", 2003, Technology white papers No. 6, Klajnert et al. Acta Biochimica Polonica, 2001, v. 48, p. 199, Manduchi et al. Physiol.
  • Marker moieties can be attached to the core component or to the linker moiety through a covalent bond, for example via a cross-linker (Chemistry of protein conjugation and crosslinking, S. Wang, 1993, ISBN 0-8493-5886-8 , "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2), or via an affine coupling done, for example, biotin-streptavidin compound or hybridization of nucleic acid strands' or Antigen-antibody interaction ("Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2).
  • a cross-linker Choemistry of protein conjugation and crosslinking, S. Wang, 1993, ISBN 0-8493-5886-8 , "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2
  • the coupling of marker units to the core component takes place in one embodiment already during the synthesis of nuc-macromolecules.
  • the chemical synthesis of nuc-macromolecules takes place first, in which case the marker component consists only of the core component.
  • the coupling of marker units to the core component takes place only after the incorporation of nuc-macromolecules into the nucleic acid chain. Due to the large number of potential binding sites on the core part, the probability of binding the marker units to the core component and thus to the incorporated nuc-component is much greater compared to conventional nucleotide structures.
  • the coupling chemistry in each case depends on the structure of the marker units and the structure of the core component.
  • connection between the marker units and the core component may in one embodiment be resistant (Example 33), eg at temperatures up to 100 ° C., for pH ranges between 3 and 12, and / or hydrolytic Be enzymes (eg esterases).
  • connection between the nuc-component and the linker is cleavable under mild conditions.
  • connection between the linker component and the marker depends on the particular structure of the marker units or the structure of the core component.
  • the linker moiety is bound directly to the signaling or signal-conferring label moiety, Figure 4a.
  • the marker may consist of only one or more marker units.
  • one or more linker components are attached to the core component of the marker, Fig. 5d.
  • Binding between the linker moiety and the label can be both covalent and affine. Many examples are known in the art, s. e.g.
  • the linker-to-tagging compound may be resistant to, for example, temperatures up to 130 ° C., for pH ranges between 1 and 14, and / or resistant to hydrolytic enzymes (eg, proteases, esterases )be .
  • hydrolytic enzymes eg, proteases, esterases
  • connection between the nuc-component and the linker is cleavable under mild conditions.
  • the macromolecular compounds used in accordance with the invention to label nucleotides include, in some embodiments, water-soluble polymers (supra).
  • the linkers of nucmacromolecules also include water-soluble polymers (see above). It will be apparent to those skilled in the art that the assignment of individual polymers to the linker or to the label has a descriptive character.
  • a nuc macromolecule may include on average 1 to 2, 2 to 5, 5 to 10, 10 to 30, 30 to 100, 100 to 1000 nuc-components.
  • all nuc-macromolecules have an equal number of nuc-components per one nuc-macromolecule. For example, a maximum of 4 biotin molecules can be bound per one strepavidin molecule, with a saturating concentration of nuc-linker components, a uniform population of nuc macromolecules is formed.
  • the nuc macromolecules of a population have a defined average number of nuc-components per nuc-macromolecule, but in the population itself there is a distribution of the actual population of nuc-macromolecules with nuc-components.
  • the distribution data of nuc-components per nuc-macromolecule in this case represent an average value.
  • the number of marker units in a nuc macromolecule includes the following ranges: 1 and 2, 2 and 5, 5 and 20, 20 and 50, 50 and 100, 100 and 500, 500 and 1000. 1000 and 10,000, 10,000 and 100,000.
  • nuc-macromolecules have a fixed number of signaling units per marker.
  • the distribution of label moieties in a nuc-macromolecule population may vary and need not necessarily represent a constant value for each individual nucmacromolecule.
  • all nuc-macromolecules have an equal number of label moieties per one nuc-macromolecule. For example, a maximum of 4 biotin molecules can be bound per one strepavidin molecule, avidin biotin technology, method in Enzymology v.184, 1990.
  • the nuc macromolecules of a population have a defined average number of marker units per nuc-macromolecule, but in the population itself there is a distribution of the actual population of nuc-macromolecules with marker units. At saturating concentrations in the synthesis of marker components, an increasingly uniform occupation of the nuc-macromolecules with marker units takes place.
  • the nuc-component bound to a nuc-macromolecule can serve as a substrate for different enzymes.
  • the nuc-component in this embodiment a nucleoside triphosphate, serves as a substrate for a polymerase so that the nuc-component can be incorporated into a growing strand by a polymerase and thus the entire nuc-macromolecule is covalently coupled to the strand .
  • enzymes are kinases, phosphorylases, transferases.
  • nuc macromolecules can also occur as substrates for enzymes, for example for the 3 'or 5' exonucleases or Endonucleases ("Molecular cloning” 1989, Ed. Maniatis, ColD Spring Harbor Laboratory), or for the corresponding partial activities of polymerases, as described for example in real-time PCR (S.Meuer “Rapid Cycle Real Time PCR", Springer 2004 , ISBN 3-540-66736-9, T. Weissensteiner “PCR Technology: current innovation” CRC Press 2004 ISBN 0-8493-1184-5).
  • the substrate properties of the nuc-component (s) determine the substrate properties of the nuc-macromolecules.
  • the nuc-component can serve as a terminator so that only a single nuc-macromolecule can be incorporated.
  • the nuc-component serves as a reversible terminator that allows for the performance of a stepwise controlled extension reaction, such as, e.g. in Ju et al. US Pat. No. 6664079, Tcherkassov WO 02088382.
  • the enzymatic properties determine not only the nuc-components of the nuc-macromolecules, but also the contiguous nucleotides, as in the case of the endonucleases.
  • the macromolecular marker component may have a signaling function in one embodiment. In another embodiment, it has a signal-switching function. In another embodiment, it has a catalytic function. In another embodiment, it has an affine function. In another embodiment, the marker has more than one function, but e.g. combines both signaling and a signal-switched function. Other combinations are obvious.
  • the marker component contains components that are already bound to nuc macromolecules during the chemical synthesis, s.
  • Example 33 the marker component contains components that are already bound to nuc macromolecules during the chemical synthesis, s.
  • the marker component In the signal-mediating function, the marker component carries components that only develop their signal properties through a reaction with signaling molecules, s. Example 32.
  • biotin molecules eg, 100 biotin molecules
  • a detection reaction takes place with modified streptavidin molecules.
  • the nucleic acid chains have the signal-transmitting function.
  • a hybridization of uniform oligonucleotides with detectable units, eg fluorescent dyes (MWG-Biotech) to the marker component takes place.
  • amino or mercapto groups for example 50 amino groups per marker, have the signal-mediating function.
  • the macromolecular marker component has a catalytic function (in the form of an enzyme or ribozyme).
  • a catalytic function in the form of an enzyme or ribozyme.
  • Different enzymes can be used, e.g. Peroxidase or alkaline phosphatase. Thanks to the coupling to the nuc-component, the respective enzyme can be covalently bound to the nucleic acid strand by the incorporation of nuc-macromolecules.
  • the macromolecular marker component has an affinity functionality to a 1 other molecule.
  • markers are streptavidin molecules, antibodies or nucleic acid chains, example 30 or 32.
  • nucleotides for example, with one or two biotin molecules, one or two dye molecules, one or two hapten molecules (e.g., digoxigenin).
  • biotin molecules for example, one or two biotin molecules, one or two dye molecules, one or two hapten molecules (e.g., digoxigenin).
  • hapten molecules e.g., digoxigenin
  • nucleotide a nucleotide with a linker (average length between 5 and 30 atoms) and a marker.
  • a conventionally modified nucleotide carries a low molecular weight marker, e.g. a dye or a biotin molecule.
  • the nuc macromolecules can be used as substrates for enzymes.
  • Polymerases are often used in applications enzymes that use nucleotides as substrates. They are further exemplified and representative of other nucleotide-converting enzymes.
  • One of the central capabilities of polymerases is the covalent coupling of nucleotide monomers to a polymer.
  • the synthesis can be both template-dependent (such as DNA or RNA synthesis with DNA- or RNA-dependent polymerases) as well as template-independent, eg by terminal transferases ("J Sambrook” Molecular Cloning 3rd Ed. CSHL Press 2001).
  • RNA-dependent DNA polymerases can be used, e.g. AMV reverse transcriptase (Sigma), M-MLV reverse transcriptase (Sigma), HIV reverse transcriptase without RNAse activity.
  • reverse transcriptases may be largely free of RNAse activity ("Molecular cloning" 1989, Ed. Maniatis, ColD Spring Harbor Laboratory), e.g. mRNA mRNA for hybridization experiments.
  • suitable polymerases are in principle all DNA-dependent DNA polymerases with or without 3'-5 'exonuclease activity (DNA replication "1992 Ed A. Komberg, Freeman and Company NY ), eg, modified Sequenase Version 2 T7 polymerase (Amersham Pharmacia Biotech), Klenow fragment of DNA polymerase I with or without 3'-5 'exonuclease activity (Amersham Pharmacia Biotech), polymerase beta of various origins (Animal Cell DNA Polymerases "1983, Fry M., CRC Press Inc., commercially available from Chimerx) thermostable polymerases such as Taq polymerase (GibcoBRL), proHA DNA polymerase (Eurogentec), Vent, Vent exo minus, Pfu, Thermosequenase, Pwo- Polymerase, etc. (Promega).
  • DNA-dependent RNA polymerases can also be used, e.g. E. coli RNA polymerase, T7 RNA polymerase, SP6 RNA polymerase.
  • the polymerases may have 3 'or 5' exonuclease activity and may be used in certain applications (e.g., in real-time PCR). In the application, DNA-dependent DNA polymerases are considered as examples of polymerases.
  • Cleavable Compound - A compound cleavable under mild conditions. This connection may be a section in the linker and may be cleavable at one or more locations. It may be a chemically cleavable compound, such as a disulfide, an ester, an acetal, a thioester (Short WO 9949082, Tcherkassov WO 02088382). It may also be a photochemically cleavable compound as shown in (Rothschild WO 9531429). It may also be an enzymatically cleavable compound (e.g.
  • a cleavable compound may be part of the linker or may form the coupling site of the linker to the nucleotide, or the linkage between the linker moiety and the macroser moiety, or the linkage between the label moieties and the core moiety.
  • DNA - deoxyribonucleic acid of different origin and length e.g., oligonucleotides, polynucleotides, plasmids, genomic DNA, cDNA, ssDNA, dsDNA
  • dNTP - 2'-deoxynucleoside triphosphates substrates for DNA polymerases and reverse transcriptases, e.g. dATP, dGTP, dUTP, dTTP, dCTP.
  • NTP - ribonucleoside triphosphates substrates for RNA polymerases, UTP, CTP, ATP, GTP.
  • NT is also used in the length indication of a nucleic acid sequence, e.g. 1,000 NT.
  • NT stands for nucleoside monophosphates.
  • NT stands for “nucleotide”
  • NTs stands for several nucleotides.
  • NSKF nucleic acid chain fragment (DNA or RNA) corresponding to part of the total sequence, NSKFs - nucleic acid chain fragments.
  • the sum of the NSKFs is equivalent to the total sequence.
  • the NSKFs may be fragments of total DNA or RNA sequence resulting from a fragmentation step.
  • PBS Primer binding site
  • Reference sequence an already known sequence for which the deviations in the sequence to be investigated or in the sequences to be examined (for example total sequence) are determined.
  • sequences accessible in databases may be used, e.g. from the NCBI database.
  • a sterically demanding group or ligand that, by virtue of its chemical structure, alters the properties of the nucleotides coupled to this group in such a way that they can not be inserted one after the other by a polymerase in an extension reaction.
  • One or more sterically demanding groups coupled to the base can lead to the synthesis being halted or hindrance to further synthesis.
  • Biotin, digoxigenin and fluorescent dyes such as fluorescein
  • Tetramethylrhodamine, Cy3 dye are examples of such a sterically demanding group (Zhu et al., Cytometry 1997, v.28, p.206, Zhu et al., NAR
  • sterically demanding groups can be, for example, linear or branched
  • Polymers with a compact three-dimensional structure e.g. Proteins or
  • the invention describes a new class of modified nucleotides.
  • Nuk - a nucleotide or a nucleoside is (Nuk component)
  • Linker - a linker component that contains a nuc-component and a macromolecular marker component Marker - a macromolecular marker component is n - a number from 1 to 1000
  • Another aspect 2 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspect 1, wherein the nuc-component includes the following structures (Figure 3A):
  • Base - is independently selected from the group of adenine, or 7-deazaadenine, or guanine, or 7-deazaguanine, or thymine, or cytosine, or uracil, or their modifications, where L is the link between the nuc-component and the linker Component represents (coupling unit L) and X the
  • R 1 - is H
  • R 2 - is independently selected from the group H, OH, halogen, NH 2 , SH or protected OH group
  • R 4 - is H or OH
  • R 5 - is independently selected from the group OH, or a protected OH group, a monophosphate group, or a diphosphate group, or a
  • Triphosphate group or an alpha thiotriphosphate group is.
  • Another aspect 3 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspect 1, wherein the nuc-component includes the following structures ( Figure 3B):
  • Base - is independently selected from the group of adenine, or 7-deazaadenine, or guanine, or 7-deazaguanine, or thymine, or cytosine, or uracil, or their modifications capable of enzymatic reactions
  • Ri - is HR 2 - is independently selected from the group H, OH, Hal, NH 2 , SH or protected
  • R 3 - is independently selected from the group O-R 3-2 -L, P (O) m - R 3-2 -L, where m is 1 or 2, NH-R 3-2 -L, SR 3 2 -L, Si-R 3-2 -L or wherein R 3-2 is the coupling site of the linker to the nucleotide and L - is the coupling moiety of the linker (L).
  • R 4 - is H or OH
  • R 5 - is independently selected from the group OH, or a protected OH group, a monophosphate group, or a diphosphate group, or a
  • Triphosphate group or an alpha thiotriphosphate group is.
  • Another aspect 4 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspect 1, wherein the nuc-component includes the following structures (Figure 3B):
  • Base - is independently selected from the group of adenine, or 7-deazaadenine, or guanine, or 7-deazaguanine, or thymine, or cytosine, or uracil, or their modifications capable of enzymatic reactions
  • R 2 - is independently selected from the group H, OH, Hal, NH 2, SH or protected OH group
  • R 3 - is independently selected from the group H, OH, Hal, PO 3 , SH, NH 2 , O-R 3-I ,
  • R 3 -i is a chemically, photochemically or enzymatically cleavable group and m is 1 or 2.
  • R 4 - is H or OH
  • R 5 - is independently selected from the group O-R 5-1 -L, or P- (O) 3 - R 5 -IL (modified monophosphate group), or P- (O) 3 -P- (O) 3 -R 5- IL (modified diphosphate group) or P- (O) 3 -P- (O) 3- P- (O) 3 -R 5-I- L (modified triphosphate group), wherein R 5 - I is the coupling site of the coupling unit L to the nucleotide and coupling unit L is the connection between the nuc-component and the linker component.
  • Another aspect 5 of the invention relates to macromolecular compounds according to
  • coupling unit L includes the following structural elements:
  • R 6 - is the nuc-component
  • R 7 - is the linker radical
  • a and B independently include the following structural elements: -NH-, -O-, -S-, -SS-, -CO-NH-, -NH -CO-, -CO-O-, -O-C0-, -CO-S-, -S-CO-, -P (O) 2 -, -Si-, - (CH 2 V, a photolabile group, where n - is 1 to 5
  • Another aspect of the invention pertains to macromolecular compounds of aspects 1-5 wherein the linker component includes a water-soluble polymer.
  • linker component includes water-soluble polymers independently selected from the following group: Polyethylene glycol (PEG), polysaccharides, dextran, polyamides, polypeptides, polyphosphates, polyacetates, poly (alkylene glycols), copolymers of ethylene glycol and propylene glycol, poly (olefinic alcohols), poly (vinylpyrrolidones), poly (hydroxyalkylmethacrylamides), poly (hydroxyalkyl methacrylates) , Poly (x-hydroxy acids), polyacrylic acid, poly-acrylamide, poly (vinyl alcohol).
  • PEG Polyethylene glycol
  • PEG polysaccharides
  • dextran polyamides
  • polypeptides polypeptides
  • polyphosphates polyphosphates
  • polyacetates poly (alkylene glycols), copolymers of ethylene glycol and propylene glycol
  • poly (olefinic alcohols) poly (vinylpyrrolidones)
  • Another aspect 8 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 1 to 7, wherein the linker component has an average length between 2 and 5, 5 and 10, 10 to 20, 20 to 50, 50 to 100, 100 to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 10000, 10000 to 100000,
  • Another aspect of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 1-8, wherein a marker component has a signaling, signal-mediating, catalytic or affine function
  • Another aspect of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 1 to 9, wherein a marker component consists of a structural marker unit
  • Another aspect of the invention pertains to macromolecular compounds of aspects 1-9 wherein a marker component consists of multiple structural marker units bound to a core component
  • Another aspect 12 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 10 or 11, wherein a structural marker unit independently includes one of the following structural elements:
  • Another aspect 13 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 10 or 11, wherein a structural marker unit independently includes one of the following elements:
  • Nanocrystals or their modifications proteins or their modifications, nucleic acid chains or their modifications, particles or their
  • Another aspect of the invention relates to macromolecular compounds according to aspect 13, wherein a structural marker unit includes one of the following proteins:
  • Another aspect of the invention relates to macromolecular compounds according to aspect 13, wherein a structural marker moiety is one of the following types
  • Nucleic acid chains include: DNA, RNA, PNA, wherein the length of nucleic acid chains is between 10 and 10,000 nucleotides or their equivalents.
  • the core component of the label component includes independently one of the following: water soluble polymer independently selected from the group of: polyamides (eg polypeptides), polyacrylic acid and their derivatives, polyacrylamides and their derivatives, polyvinyl alcohols and their derivatives, polysaccharides, dextran and its derivatives,
  • water soluble polymer independently selected from the group of: polyamides (eg polypeptides), polyacrylic acid and their derivatives, polyacrylamides and their derivatives, polyvinyl alcohols and their derivatives, polysaccharides, dextran and its derivatives,
  • Another aspect 17 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 1 to 9, 11 to 16, wherein the connection between a plurality of structural marker units and the core component is covalent or affine.
  • a further aspect of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 1 to 10, wherein the connection between a structural marker unit and the linker is covalent or affine.
  • Another aspect 19 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 1 to 9, 11 to 17, wherein the connection between the core
  • Component and the linker is covalent or affine
  • Another aspect of the invention pertains to macromolecular compounds of aspects 1-19 wherein only one Nuk component having a coupled linker moiety is attached to the label component, the linker length being between 2 and 5, 5 and 10, 10 to 20 , 20 to 50, 50 to 100, 100 to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 5000, 5000 to
  • Another aspect 21 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 1 to 20, wherein only one Nuk component with a coupled linker component is bound to the marker component, wherein the
  • Linker length between 2 and 5, 5 and 10, 10 to 20, 20 to 50, 50 to 100, 100 to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 5000, 5000 to 20,000, 20,000 to 100,000 atoms and the linker component includes one or more compounds which can be cleaved under mild conditions.
  • a further aspect 22 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 1 to 21, wherein only one Nuk component with a coupled linker component is bound to the marker component, the linker length being between 2 and 5, 5 and 10, 10 to 20 , 20 to 50, 50 to 100, 100 to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 5000, 5000 to
  • nuc macromolecule 20000, 20,000 to 100,000 atoms and one or more parts of the nuc macromolecule are so modified that only a nuc-component can be incorporated into a growing strand.
  • a further aspect 23 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 1 to 19, wherein a plurality of nuc-components are each coupled via their own linker to a marker components, wherein the length of the respective linker component between 2 and 5, 5 and 10, 10 to 20, 20 to 50, 50 to 100, 100 to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 5000, 5000 to 20,000, 20,000 to 100,000 atoms.
  • a further aspect 24 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 1 to 19, 23, wherein a plurality of nuc-components are each coupled via their own linker to a marker component, wherein the length of the respective linker component is between 2 and 5, 5 and 10 , 10 to 20, 20 to 50, 50 to 100, 100 to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 5000, 5000 to 20,000, 20,000 to 100,000 atoms and the respective linker one or more of mild conditions includes fissile compounds.
  • a further aspect 25 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 1 to 19, 23, 24, wherein several nuc-components are each coupled via their own linker to a marker components, wherein the length of the respective linker component between 2 and 5, 5 and 10, 10 to 20, 20 to 50, 50 to 100, 100 to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 5000, 5000 to 20,000, 20,000 to 100,000 atoms, and one or more parts of Nuk macromolecule are so modified that only one Nuk component can be incorporated into a growing Nukieinklakette.
  • a further aspect of the invention relates to oligonucleotides or polynucleotides which comprise at least one nuc-macromolecule according to aspects 1 to 25 per one
  • oligonucleotides or polynucleotides according to aspect 26, wherein oligo- or polynucleotides are RNA, DNA or PNA whose length is between 5 and 50,000 nucleotides.
  • a further aspect 28 of the invention relates to a method for modifying nucleic acid chains, wherein nuclacromolecules according to aspects 1 to 25 are used for the coupling
  • Another aspect 29 of the invention relates to a method according to aspect 28, wherein the modification is by an enzymatic coupling and the reaction mixture includes the following components:
  • each kind of the nuc-macromolecules has a characteristic marking for them
  • At least one population of the nucleic acid chains at least one type of enzyme for coupling nuc macromolecules to the nucleic acid chains,
  • Another aspect 30 of the invention relates to a method according to aspect 28, wherein the modification is carried out by an enzymatic coupling and the
  • Reaction mixture includes the following components:
  • each type of nuc-macromolecule has a characteristic marking for it - at least one population of the nucleic acid chains
  • Another aspect 31 of the invention relates to a method according to aspects 29,
  • the type of enzyme independently includes one of the following groups: DNA polymerase, RNA polymerase, terminal transferase,
  • nucleoside triphosphates is independently selected from the group of: ribo-nucleoside triphosphates (ATP, GTP, UTP, CTP), of 2 1 -deoxyribonucleoside triphosphates ( dATP, dUTP, dTTP, dCTP, dGTP), of 2 ⁇ 3 "dideoxynucleoside triphosphates (ddATP, ddGTP, ddUTP, ddCTP, ddTTP).
  • ribo-nucleoside triphosphates ATP, GTP, UTP, CTP
  • dATP, dUTP, dTTP, dCTP, dGTP 2 1 -deoxyribonucleoside triphosphates
  • ddATP, dUTP, dTTP, dCTP, dGTP 2 1 -deoxyribonucleoside triphosphates
  • Another aspect 33 of the invention relates to a method according to aspect 32, wherein the "other type" of nucleoside triphosphates are conventionally modified nucleotides with a label, which label is independently selected from the group of: a fluorescent dye, a biotin, a hapten radioactive element.
  • Another aspect 34 of the invention relates to a method according to aspects 28 to 33, wherein at least two different populations of nucleic acid chains are present
  • Another aspect of the invention relates to a method according to aspect 34, wherein at least one of the populations of the nucleic acid chains has a primer function and at least one pu- pulation of the nucleic acid chains has a template function.
  • a further aspect 36 of the invention relates to a method according to aspect 28, wherein the modification is effected by a chemical coupling, wherein the coupling of the nuc-macromolecules to nucleic acid chains by phosphoroamidite coupling takes place.
  • a further aspect 37 of the invention relates to a method according to aspects 28 to 36, whereby in the labeling method nuc-macromolecules are used which permit the coupling of only a single nuc-component into the growing nucleic acid strand and the multiple incorporation by modifications to the nucleic acid strand. Component, and / or the linker component and / or the marker component is prevented.
  • Another aspect 38 of the invention relates to a method according to aspect 37, wherein the further coupling is reversibly prevented.
  • Another aspect 39 of the invention relates to a method according to aspect 37, wherein the further coupling is irreversibly prevented.
  • Another aspect 40 of the invention relates to a method according to aspects 28 to
  • nuc macromolecules are used, which allow a coupling of several nuc-component in the growing nucleic acid strand
  • Another aspect 41 of the invention relates to a method according to aspects 28-40, wherein the nucleic acid chains participating in the reaction are coupled to a solid phase and have addressable positions.
  • Another aspect 42 of the invention relates to a method according to aspect 41, wherein the nucleic acid chains represent a uniform population
  • Another aspect 43 of the invention relates to a method according to aspect 41, wherein the nucleic acid chains represent two or more distinct populations and each of the populations has an addressable position on the solid phase
  • Another aspect 44 of the invention relates to a method according to aspects 41,42 wherein the coupling of nuc-macromolecules to a population of uniform, solid-phase-fixed nucleic acid molecules is performed, wherein the marker component of the nuc-macromolecule after coupling to the extended nucleic acid strand remains and is not separated.
  • a further aspect 45 of the invention relates to a method according to aspects 41, 42, wherein the coupling of nuc-macromolecules to a population of uniform, solid phase-fixed nucleic acid molecules takes place, wherein the marker component or its individual components, with or without linker
  • Component of the nuc-macromolecule is separated during the coupling or after the coupling of the incorporated into the growing nucleic acid strand nuc-component.
  • a further aspect 46 of the invention relates to a method according to aspects 41, 43, wherein the coupling of nuc-macromolecules in one reaction batch takes place in parallel on two or more different populations of the solid phase of fixed nucleic acid molecules, these populations each having different addressable positions on the solid Phase and the marker component of the nuc-macromolecule remains after coupling on the extended nucleic acid strand and is not separated.
  • Another aspect 47 of the invention relates to a method according to aspects 41,43, wherein the coupling of nuc-macromolecules in one reaction batch occurs in parallel on two or more different populations of solid phase of fixed nucleic acid molecules, said populations having different addressable positions on the solid phase and the Märker component or its individual components with or without linker component of the nuc macromolecule is separated during coupling or after coupling from the nuc-component.
  • Another aspect 48 of the invention relates to a method according to aspects 41 to 47, wherein the addressable positions are distributed with nucleic acid molecules on the solid phase as spots on a planar surface, wherein per one spot nucleic acid molecules are uniform.
  • Another aspect 49 of the invention relates to a method according to aspects 41 to 47, wherein the addressable positions with nucleic acid molecules are attached to the beads, wherein for each bead nucleic acid molecules are uniform.
  • Another aspect 50 of the invention relates to a method according to aspects 41 to 47, wherein the addressable positions are distributed with nucleic acid molecules in a multi-vascular system, such as microtiter plate or nanotiter plate or picotiter plate, wherein in a vessel of the multi-vascular system, the nucleic acid molecules are uniform.
  • a multi-vascular system such as microtiter plate or nanotiter plate or picotiter plate
  • Another aspect 51 of the invention relates to a method according to aspects 28 to 35 and 37 to 50, which includes the following steps:
  • Nucleic acid chains b) hybridization of sequence-specific primers to these nucleic acid chains, whereby NSK primer complexes capable of extension arise c) incubation of at least one type of nuc-macromolecule
  • Another aspect 52 of the invention relates to a method of aspects 28-40, wherein the nucleic acid chains are coupled to a solid phase in a random arrangement.
  • Another aspect 53 of the invention relates to a method according to aspects 28 to 41, 52 for the parallel sequence analysis of nucleic acid sequences (nucleic acid chains, NSKs) in which
  • NSKFs Single-stranded NSKs with a length of about 50 to
  • Reaction surface in a random arrangement binds, wherein the diphte of the surface-formed NSKF primer complexes allows optical detection of the signals from single incorporated N uk macromolecules one
  • step b) incubating the stationary phase obtained in step a) under conditions which are suitable for extending the complementary strands, wherein the complementary strands are each extended by one nuc-macromolecule; c) washing the stationary phase obtained in step b) under conditions which are suitable for removing nuc-macromolecules not incorporated into a complementary strand;
  • step f) washing the stationary phase obtained in step e) under conditions suitable for removing the marker component;
  • a further aspect 54 of the invention relates to a process according to aspect 53, characterized in that the steps a) to 0 of the cyclic synthesis reaction are repeated several times, whereby in each cycle only one type of nuc-macromolecule is used.
  • a further aspect 55 of the invention relates to a process according to aspect 53, characterized in that the steps a) to f) of the cyclic synthesis reaction are repeated several times, whereby in each cycle two differently labeled types of the nuc-macromolecules are used.
  • a further aspect 56 of the invention relates to a process according to aspect 53, characterized in that the steps a) to f) of the cyclic synthesis reaction are repeated several times, whereby in each cycle four differently labeled types of the nuc macromolecules are used.
  • a further aspect 57 of the invention relates to a process according to aspect 53, characterized in that the NSKs are variants of a known reference sequence and the steps a) to f) of the cyclic synthesis reaction are repeated several times, wherein in the cycles alternately two differently labeled species using the nuc-macromolecule and two unlabeled NTs and determining the total sequences by comparison with the reference sequence.
  • a further aspect 58 of the invention relates to a method according to aspects 53 to 57, characterized in that in each case a primer binding site (PBS) is introduced into the NSKFs, whereby in the case of double-stranded NSKs a PBS is introduced at both complementary single strands and wherein the Primer binding sites for each NSKFs have the same or different sequences.
  • PBS primer binding site
  • a further aspect 59 of the invention relates to a method according to aspects 53 to 57, characterized in that the NSKFs are brought into contact with primers in a solution under conditions which are suitable for hybridizing the primers to the primer binding sites (PBSs) of the NSKFs, wherein the primers have identical or different sequences to one another, and then the formed NSKF-primer complexes are subsequently bound to the reaction surface.
  • PBSs primer binding sites
  • a further aspect 60 of the invention relates to a method according to aspects 53 to 57, characterized in that the NSKFs are first immobilized on the reaction surface and only then brought into contact with primers under conditions which are suitable for hybridizing the primers to the primer binding sites (PBSs).
  • the NSKFs are suitable, wherein NSKF primer complexes are formed, wherein the primers have mutually identical or different sequences.
  • a further aspect 61 of the invention relates to a method according to aspects 53 to 60, in which the incorporation reaction is carried out in parallel on 10 to 100,000 different sequence populations
  • a further aspect 62 of the invention relates to a method according to aspects 53 to 60, in which performed at 100,000 to 10,000,000,000 different sequence populations in parallel the incorporation reaction.
  • Another aspect 63 of the invention relates to a method according to aspects 28 to
  • Another aspect 64 of the invention relates to a method according to aspects 28 to
  • Another aspect 65 of the invention relates to a method according to aspects 41 to
  • solid phase is independently selected from the group: silicon, glass, ceramics, plastics, gels or their modifications
  • signal amplifying macromolecules could only be coupled to the nucleotide after successful enzymatic incorporation of the nucleotides into the nucleic acid chain, for example labeled streptavidin to biotinylated nucleotides.
  • nucleotide monomers in a nucleic acid chain are considered: only low molecular weight substances can be coupled, for example, to an oligonucleotide near the 3 'OH position if this oligonucleotide should occur as a primer in further reactions. Too big molecules, for example, streptavidin coupled to a nucleotide monomer at the 3 'end or in the vicinity of ⁇ 3 -Endes an oligonucleotide primer lead to loss of properties. Without wishing to be bound by any particular theory, this can be explained, for example, by steric influences of the macromolecules.
  • nucleotide monomers The spatial relationships in the active site of many enzymes are very demanding, and the catalytic mechanism of many enzymes involves complex conformational changes of the enzyme structure itself and of the substrates (nucleotide monomers). In many cases, even minor chemical modifications to nucleotide monomers, which occur as monomers of a polymer chain, lead to an altered enzymatic acceptance of the nucleic acid chains. An example of this is the alpha-thiophosphonate modification of the nucleotide monomers, which leads to the exonuclease resistance of the nucleic acid chain.
  • the mass of the conventionally modified nucleotides is substantially in the same range as unmodified nucleotides, and is relatively low compared to the mass of proteins, e.g. Streptavidin or polymerases. Increasing the mass of the nucleotide by introducing macromolecular components can result in alteration of biochemical and physicochemical properties of nucleotides.
  • the nuc-macromolecules of the invention retain their substrate activity despite the massive changes in their properties and can be used as substrates by enzymes.
  • polymerases incorporate the nuc-macromolecules of the invention into the growing strand.
  • Terminal deoxy-nucleotidyl transferase can couple nuc-macromolecules to a 3 X- end of a nucleic acid (Example 34B, C and Example 35).
  • nuc-macromolecules forms a multiple of the natural nucleotides and exerts a great influence on the nuc-component.
  • Coupling a macromolecular marker to a substrate for enzymes, to a nucleotide offers the potential for widespread use of these nuc-macromolecules in a variety of applications in biotechnology, medicine, and science.
  • nuc-macromolecules can be used in processes in which they serve as substrates for enzymes.
  • nuc-macromolecules are used in the methods for labeling nucleic acids.
  • a incorporation reaction of nuc-macromolecules according to general rules of the enzymatic extension reaction of nucleic acid chains, ("Molecular Cloning", J. Sambrook, 3rd Ed. 2001).
  • the big advantage of a macromolecular label per one incorporated nucleotide is in a much higher signal strength compared to conventional modified nucleotides.
  • Another advantage is the large distance of the marker to the nucleic acid strand, so that only slight interaction between the marker and the nucleic acid strand can be expected. This has an influence, for example, on the fluorescence properties of the markers: the fluorescence of the markers is not quenched by the nucleobases (purines and pyrimidines).
  • nuc-macromolecules are incorporated in a nucleic acid chain, a greater distance between the label and the nucleotide components will result in a significant reduction in the interaction between labels from adjacent nucleotides, If the labeling of a nucleic acid chain, for example, during the enzymatic synthesis of this chain by the incorporation of nuc-macromolecules, it may be necessary no further multi-stage signal amplification steps. Many of the known signal amplification steps, eg biotin-strepavidin antibodies, or digoxigenin-antibody I antibodies II, proceed with only moderate yields, such as signal amplifications in FISH analyzes.
  • nucleic acids can be used in different methods.
  • the specific conditions of nucleic acid preparation, the order of the enzymatic steps and detection procedures depend in detail on the method in which the label is used.
  • nuc-macromolecules of the invention make possible an above-average improvement in the labeling strategies of the nucleic acid chains.
  • nucleic acid chains include nuc-components of the nuc-macromolecules as units of the chain.
  • the nuc macromolecules are considered to be monomers of a polymer chain, the nucleic acid chain.
  • Such nucleic acid chains with integrated nuc macromolecules can be used as probes and as reactants in various fields (e.g., real-time PCR, ligase chain reaction).
  • a nuc-macromolecule is integrated at the 5 ' end of the nucleic acid chain. In one embodiment, a nuc-macromolecule is integrated at the 3 'end of the nucleic acid chain. In a further embodiment, a nuc-macromolecule is integrated in the interior of the nucleic acid chain, the distance from the nearest chain end being in the following ranges (number of monomers of the chain to the next chain end): 1 to 2, 2 to 4, 4 to 8 , 8 to 15, 15 to 30, 30 to 100, 100 to 500.
  • a nuc macromolecule may include several nuc-components.
  • nuc-component of a nuc-macromolecule is integrated into a nucleic acid chain, the other nuc-components are in monomeric form.
  • nuc-components of a nuc-macromolecule can be integrated into different nucleic acid chains, wherein the nucleic acid chains can have identical or different sequences among each other.
  • nuc-macromolecules modified nucleic acid chains when Nuk macromolecule participates as part of a polymer chain in an enzymatic reaction / conversion or is in the immediate vicinity of the participating in the reaction nucleotide.
  • the long linker of the nuc-macromolecules greatly reduces the influence of a macromolecular marker component on the enzyme, so that the modified nucleotide components are involved in the enzymatic reactions (eg primer function in a template-dependent, polymerase-controlled reaction) a ligase-dependent reaction (eg, ligase chain reaction), 3 'exonuclease or 5' exonuclease activities of various enzymes, endonuclease cleavage,), or not interfere with the reaction at adjacent nucleotides (J. Wilhelm. Development of Real-Time-PCR-based Methods for Modern DNA Analysis "Dissertation, 2003, G simplifyen, S.
  • the distance between the position of the nuc-macromolecule in the nucleic acid chain and the nucleotide of the same nucleic acid chain which participates as the substrate in the enzymatic reaction is, for example, in the following ranges (number of nucleotides): 0 to 3, 3 to 6, 6 to 10, 10 to 20, 20 to 40. Number 0 means that the nuc macromolecule is directly coupled to the nucleotide participating in the reaction.
  • nuc macromolecules are examples of the use of nuc macromolecules.
  • the nucleic acid chains to be labeled are in the liquid phase, s.
  • Example 34, 35 Many other methods, such as PCR, nick translation, random primer reaction, reverse transcription reverse transcriptase and transcription with RNA polymerases ("Molecular Cloning", 3rd Sambrook, 3rd Ed., 2001) can be used be performed with nuc-macromolecules of the invention.
  • This Nuk macromolecules are similar to conventionally dye-modified nucleotides added to the reaction.
  • General rules for the use of conventionally modified nuclides, such as dCTP-Cy3 (Amersham Bioscience) or dUTP-TMR (NEN) have been extensively described in literature ("Molecular Cloning", 3, Sambrook, 3 Ed.
  • nuc macromolecule eg dATP or dCTP
  • dATP dCTP
  • dCTP dCTP
  • mixtures of modified and unmodified nucleotides are used in most reactions (H. Yu et al Nucleic Acid Research 1994, v. 22 3226, "Molecular Cloning", J. Sambrook, 3rd Ed., 2001).
  • nuc macromolecules may carry different labels.
  • the markers of the nuc-macromolecules are chosen to form a .FRET pair (Faner, R et al., Hum Immunol 2004, v. 65, 826-38, Lazowski, K.W et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev 2000, v.10, 97-103, Talavera, EM, Appl Spectrosc 2003, v.57, 208-15, Tsourkas, A. et al., Anal Chem, 2003, v.
  • the exact condition of the reaction can be optimized with regard to the choice of fluorophores, their coupling in the nuc-macromolecule, the concentration of the nuc-macromolecules, and the ratio between the nuc-macromolecules and unlabelled nucleotides.
  • the average distance between the fluorophores of a FRET pair should be less than 10 nm.
  • the nucleic acid chains to be labeled or their complementary strands are fixed to a solid phase.
  • Many methods for labeling immobilized nucleic acid chains with conventionally modified nucleotides are known (Suomalainen A et al., Methods Mol Biol., 2003, Pirrung MC et al., Bioorg Med Chem Lett., 2001 Sep 17; 11 (18): 2437-40), Examples for the solid phase introduce microspheres (Spherotech Ine, Streptavidin-polystyrene Particle, 2 "17 ⁇ ).
  • Example 34C describes a incorporation reaction of nuc macromolecules on a solid phase. Another example of the solid phase is to plan surfaces to which nucleic acids are bound.
  • the nuc macromolecules are suitable for analytical procedures involving a incorporation reaction on the nucleic acids coupled to a solid phase, and they can be used in many processes, similar to conventionally modified nucleotides, such as, for example, mini-sequencing (Suomalainen A et al., Methods Mol Biol. 2003; 361-6. Liljedahl U et al Pharmacogenetics 2003 Jan; 13 (l): 7-17, Olsson C et al., Methods Mol Biol. 2003; 212: 167-76), primer extension (Pirrung MC et al.
  • nuc-macromolecules can bring a particularly great advantage, since the signal intensity is increased above average.
  • the number of signaling marker units of nuc-macromolecules may have a size determined during the synthesis, so that the intensity of the signal from the incorporated nuc-macromolecules can be quantified.
  • Nuc-macromolecules that include fluorescent, radioactive or enzymes as marker moieties can be used in such methods. Very advantageous in such methods is the use of nuc macromolecules with fluorescence signals, since the fluorescence has a high sensitivity.
  • the detection of the fluorescence signals from the markers of the incorporated nuc macromolecules is also possible to use FRET pairs between individual nuc macromolecules.
  • primers labeled with solid phase nucleic acid chains may be used in the labeling, wherein in one embodiment the primers include one or more nuc-macromolecules and in a further embodiment include a conventional label.
  • the primer labeling may occur as part of a FRET pair.
  • the primer-coupled partner of a FRET pair can act as a donor as well as an acceptor during detection.
  • the incorporated nuc-macromolecules with a corresponding partner of the FRET pair can carry a cleavable or a non-cleavable marker.
  • the detection may take place during installation in another embodiment as a separate step of the method.
  • nuc-macromolecules with a nuk component of one type preferably carry a marker component specific to them, so that, for example, four types of nuc-macromolecules (corresponding to the dTTP, dCTP, dATP and dGTP) are used and distinguished simultaneously can be.
  • Other marking schemes are known in the s. e.g. Tcherkassov WO 02088382.
  • unmarked, e.g. natural nucleotides are added to the reaction mixture together with the nuc macromolecules.
  • nuc-macromolecules are used, which allow the incorporation of only a single nuc-component in the growing nucleic acid strand and the multiple incorporation by modifications to the nuc-component, and / or the linker component and / or Marker component is prevented.
  • the further installation can be prevented both reversibly and irreversibly.
  • An irreversible stop can be achieved, for example, by the use of nuc-macromolecules, which include a dideoxy-nucleoside triphosphate as the nuc-component.
  • a reversible stop can be canceled in a further process step, so that further incorporation reactions take place can.
  • Examples of a reversible blockade of the reaction are in applications (Metzker et al Nucleic Acid Research 1994, V.22, p 4227, Canard et al., Gene, 1994, V. 148, 1, Kwiatkowski US Pat 6255475, Kwiatkowski WO 01 / 25,247, Parce WO 0050642, Tcherkassov WO 02088382, Ju et al US Pat., 6664079, Milton et al., WO 2004018497, Milton et al., WO 2004018493, Balasubramanian et al., WO 03048387).
  • the already incorporated nucl macro molecules do not prevent the further incorporation of nucleotides. If a mixture of modified and unmodified nucleotides is used, after incorporation of a nuc-macromolecule, further nuc-macromolecules may be sequentially incorporated into the growing strand.
  • the solid phase may be, for example, a planar surface or beads or a type of multi-vessel array (e.g., microtiter plate, nanotiter plate).
  • Nucleic acids can be coupled to the solid phase by various methods (McGaill et al., U.S. Patent 5,421,087, Nikiforov et al., U.S. Patent 5,610,287, Barrett et al., U.S. Patent 5,482,867, Mirzabekov et al., U.S. Patent 5,981,834, Microarray biochip technology. 2000 M.Schena Eaton Publishing, "DNA Microarrays" 1999 M.
  • nucleic acid chains starting from single molecules. Such methods can be used to form site-specifically bound populations of nucleic acid chains of identical sequence, wherein both planar surfaces and beads can be used.
  • the nucleic acid strands to be analyzed are provided with a primer so that it is a primer-template complex and an enzymatic synthesis of a complementary strand can take place ("Molecular Cloning", Maniatis, 3. Ed. 2001).
  • the incorporation reaction of N + k macromolecules into a single population is more uniform, on the solid phase fixed nucleic acid molecules, wherein the marker component of the nuc macromolecule remains after installation on the extended primer and is not separated.
  • Such methods essentially include the steps of: 1) providing a solid phase with fixed primer-template complexes
  • Such methods essentially include the following steps:
  • the repetition can be carried out, for example, 1 to 2, 2 to 5, 5 to 10, 10 to 20, 20 to 30 times.
  • the incorporation of nuc-macromolecules in an enzymatic reaction takes place in parallel on two or more different populations of uniform, fixed on the solid phase nucleic acid molecules, said populations addressable positions on the solid phase, wherein the marker component of the nuc-macromolecule remains after installation on the extended primer and is not separated.
  • the addressable positions may, for example, take the form of spots, in the case of a flat surface.
  • Such methods essentially include the following steps:
  • the incorporation of nuc-macromolecules in an enzymatic reaction occurs in parallel on two or more different populations of uniform nucleic acid molecules fixed to the solid phase, which populations have addressable positions on the solid phase.
  • the uniform nucleic acid populations can be fixed to the surface by different methods (see above).
  • the marker component or its individual components with or without linker component of the nuc macromolecule is separated from the incorporated nuc-component during the incorporation reaction or after the incorporation reaction in this embodiment.
  • Nuc-macromolecules with cleavable compounds in the linker are suitable for such processes.
  • the addressable positions may, for example, take the form of spots, in the case of a flat surface.
  • Such methods essentially include the following steps:
  • Steps 2 to 5 The repetition can be carried out, for example, 1 to 2, 2 to 5, 5 to 10, 10 to 20, 20 to 30, 30 to 50, 50 to 100, 100 to 200 times.
  • nuc-macromolecules are used in step (2) together with the other modified nucleotides.
  • the synthesis of the complementary strand takes place-stepwise: complementary strands are extended by a maximum of one nucleotide per one synthesis step.
  • the control of the enzymatic reaction is carried out by reversible terminators. Preference is given to using the terminators modified at 3'-OH group which do not carry any further modifications to the base. After cleavage of the modification from the incorporated nucleotide, further synthesis can take place on these strands.
  • the structure of the nuc macromolecules used in this embodiment may be different.
  • nuc-macromolecules are terminating nuc-macromolecules, ie after their incorporation no further nucleotide can be incorporated by a polymerase.
  • the linker is preferably coupled to the base of the nuc-component and includes a cleavable compound.
  • the mixing together of the nuc-macromolecules with terminating properties and the reversible terminators allows a population of nucleic acid chains to separate the label and the reversible termination. Since the nuc-macromolecules have a terminating effect in this embodiment of the process, a smaller number of strands is available for further sequencing reactions in each further installation step. In order for an incorporation reaction to take place in further steps, part of the strands must be reversibly blocked in each step.
  • the proportion of nucleic acid chains modified with nuc-macromolecules can be very low, since the signal strength of the nuc-macromolecules can be very large.
  • the ratio between the nuc-macromolecules and reversible terminators in a reaction step can be, for example, in the following ranges: between 100: 1 and 1:10, between 10: 1 and 1: 1, 1: 1 and 1:10, between 1:10 and 1: 100, between 1: 100 and 1: 1000 (concentration of nuc-macromolecules: concentration of reversible Terminators). This ratio can remain constant or variable throughout the sequencing reaction. Since polymerases can accept different levels of nuc macromolecules and reversible terminators, several types of polymerase can be used during the incorporation step.
  • the removal of the signals after detection leads to a better signal-to-noise ratio in the next detections and is typical of the methods of sequencing by the synthesis.
  • the reversal of the reversible termination can be done in a separate step or coincide, for example, with the step of removing the marker.
  • the advantage of using the nuc macromolecules is that the labeling of a small proportion of the total population is sufficient to detect the incorporation event. This allows the Sequez istsrecision perform with much lower amounts of the starting material.
  • reversible terminators having a protecting group at the 3 'position and a base without modification results in the nucleotide remaining in the nucleic acid chain after removal of the blocking group from undergoing no further modifications and thus being well accepted as a natural substrate of polymerases.
  • the incorporation reaction of NT macromolecules takes place simultaneously on a population of different nucleic acid molecules fixed to the solid phase, these nucleic acid molecules being bound to the solid phase in a random arrangement (Tcherkassov WO 02088382).
  • sequences of individual nucleic acid chain molecules are determined.
  • the primer nucleic acid complexes that participate in the enzymatic reaction are fixed at a density that allows detection of the signals from individual nuc-macromolecules coupled to a single nucleic acid molecule, wherein the density of the fixed primers or nucleic acids can be significantly higher.
  • the density of the primer nucleic acid complexes participating in the incorporation reaction is from 1 complex to 10 ⁇ m 2 to 1 complex to 100 ⁇ m 2 , from 1 complex to 100 ⁇ m 2 to 1 complex to 100 ⁇ m 2 , from 1 complex to 100 ⁇ m 2 to 1 complex to 10. OOO ⁇ m 2 .
  • the number of individual nucleic acid molecules to be analyzed in parallel is, for example, between 1000 and 100,000, 10,000 to 1,000,000, 100,000 to 10,000,000 molecules.
  • the marker component or its individual components with or without linker component of the nuc macromolecule is separated during the incorporation reaction or after the incorporation reaction of the nuc-component.
  • This method for parallel sequence analysis of nucleic acid sequences includes the following steps:
  • NSKFs Generates fragments (NSKFs) of single-stranded NSKs with a length of about 50 to 1000 nucleotides, which can represent overlapping partial sequences of an overall sequence; the NSKFs bind in a random array using a single or multiple different primers in the form of NSKF primer complexes on a reaction surface, the density of the surface-built NSKF primer complexes providing optical detection of the signals from single incorporated nuclides -Macromolecules allows, one
  • Fluorescent dyes are selected so that the nuc-macromolecules used can be distinguished from one another by measuring different fluorescence signals, wherein the nuc-macromolecules are structurally modified so that the polymerase after incorporation of such nuc-macromolecule in a growing complementary strand not in the
  • the linker component with the marker component are cleavable, one
  • step b) incubating the stationary phase obtained in step a) under conditions which are suitable for extending the complementary strands, wherein the complementary strands are each extended by one nuc-macromolecule;
  • step b) washing the stationary phase obtained in step b) under conditions which are suitable for removing nuc-macromolecules not incorporated into a complementary strand;
  • the individual nucleated macromolecules incorporated into complementary strands are detected by measuring the signal characteristic of the respective fluorescent dye, while simultaneously determining the relative position of the individual fluorescence signals on the reaction surface; e) to generate unlabelled (NTs or) NSKFs, cleave the linker component and the label component from the nucleation components attached to the complementary strand;
  • step f) washing the stationary phase obtained in step e) under conditions suitable for removing the marker component;
  • nucleic acid chains After incorporation of a nuc-macromolecule at the 3 "end of the nucleic acid, the nucleic acid chains, which in turn are modified, surprisingly retain the ability to couple additional nucleotides to the 3 ⁇ - hydroxyl group by polymerases, see Example 34C, meaning that not only the nucl Component in the nuc-macromolecules but also the nucleic acid chains modified with these nuc-macromolecules may remain accessible to the enzymes and find application in various fields of biotechnology: Nucleic acid chains modified not only at the 3 'end with nuc macromolecules, but those containing at the 5 'end or in the inner region of the nucleic acid polymer one or more nuc macromolecules as monomers retain their substrate properties for polymerases, exonucleases and ligases Examples of the applications of nuclmacromolecule modified oligonucleotides are known to those skilled in the art, eg the P rimer extension reactions, real time PCR or
  • Nucleotides play a central role as monomers in various metabolic processes, for example in the storage and transmission of genetic information in the cell ("Genes V” B. Lewin, 1994). Also, nucleotides are known as energy carriers of the cell (ATP, UTP), or Signalvemittler (messenger, GTP) of intracellular signaling ("Biochemistry and Pathobiochemistry", G. Löffler, 2003). For this reason, nucleotides and their analogues are used as therapeutics and diagnostics.
  • nucleic acid polymers Coupled into nucleic acid polymers (nucleic acid chains), the nucleotide monomers provide the basis for information storage in living organisms.
  • Nuc-macromolecules have the potential to find application in different areas of biotechnology.
  • nucleotide prodrugs The possibility of coupling the nucleotides to a macromolecule while retaining the substrate properties of the nucleotides also opens up many possibilities for targeted addressing of the modified nucleotides within an organism or a cell, so that nuc macromolecules represent a new basic model for nucleotide prodrugs.
  • enzymes for example, different types of polymerases can be used ("DNA Replication", Kornberg, 2 Ed. 1992), in particular DNA-dependent DNA polymerases, RNA-dependent DNA polymerases, DNA-dependent. RNA polymerases and RNA-dependent RNA polymerases.
  • thermostable and thermolabile polymerases can be used, such as Klenow polymerase or Taq polymerase.
  • Other examples of possible polymerases will be understood by one of ordinary skill in the literature cited herein.
  • Another example of enzymes are transferases, such as terminal deoxynucleotidyltransferase ("Molecular Cloning", Maniatis, 3 Ed., 2001).
  • Other enzymes and proteins for example, kinases, membrane receptors, nucleotides as substrates), energy source, cofactors or Accepting messenger substances can be used.
  • Enzymes differ in their ability to accept modified nucleotides as substrates. It should be obvious to one skilled in the art that various functional tests must be used to study and apply certain properties of nucleotides. Examples of different test procedures for the labeling of nucleic acids are described in H. Held et al. Nucleic Acid Research 2002, V. 30, p. 3857, M. Metzger et al. Nucleic Acid Research 1994, V. 22, 4259, M. Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta 1994, V.77, p. 586, B. Canard et al. PNAS 1995, V. 92, p. 10859, Canard US Pat. 5798210, J. Hovinen et al. J.
  • Nuc-macromolecules or their intermediates can also be used in conventional chemical oligonucleotide synthesis, for example in a solid-phase synthesis (Giegrich, "New Photolabile Protecting Groups for Light-Controlled Oligonucleotide Synthesis", 1997, Beier, “New Strategies for the Construction of RNA and DNA Oligonucleotides” , 1996), while the nuc-component of the nuc-macromolecules carries corresponding modifications which permit a chemical coupling to the nucleic acid chain, as for example in Herrlein, "Synthesis of modified nucleosides, nucleotides and oligonucleotides", 1993, Gugler, “Hommebau und für of Systems for Simplified Chemo-enzymatic Synthesis of Oligonucleotide Hybridization Probes ", 1993, Schmidt,” New Methods for the Synthesis and Isolation of Long-Chain Oligonucleotides ", 1991, Buehler,” New Photol
  • Another aspect of the present invention is a method for rapidly purifying the labeled nucleotides just prior to their use in the labeling reaction.
  • Methods for sequencing individual molecules require labeled nucleotides in a very clean state because contaminants of a labeled nucleotide preparation with unlabelled nucleotides can cause a sequence error. For this reason, it is important that the labeled nucleotides are as free as possible of unlabeled nucleotides.
  • nucleotide modifications that are used in such methods have one or more cleavable under mild conditions group (Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382) During storage, such nucleotides may be degraded to some extent and provide the source of nucleotide analogues without label that would result in a sequence error upon incorporation into the nucleic acid.
  • a standard purification for modified nucleotides is, for example, HPLC purification with water-methanol gradient. After such purification, the fraction must be worked up with modified nucleotides, for example by lyophilization. Such a cleaning is a complex procedure.
  • nuc-macromolecules can be freed of minute impurities directly before use by ultrafiltration.
  • Filters are selected with a pore size, which are freely passable for nucleotides without marker shares.
  • the nucleotides modified with a macromolecular marker can not pass through the filter. Such a purification makes it possible to obtain nuc-macromolecules in a very clean state in a short time.
  • Another aspect of the invention is the use of modified Klenow fragment exo-minus the DNA polymerase together with the nuc-macromolecules in the enzymatic reactions, wherein the SH group of the cysteine of the Klenow fragment exo-minus the DNA polymerase chemically is modified.
  • This modification is preferably a covalent modification. Examples of such modification is alkylation on the SH group, e.g. with alpha-halo-acetyl derivatives such as iodoacetamide and its derivatives, iodoacetate and its derivatives, or with N-maleimide derivatives, other selective SH groups. Reagents are described in "Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc.
  • This modification can also be carried out by a fluorescent dye Activated fluorescent dyes that react selectively with SH groups are commercially available, eg from Molecular Probes Inc.
  • a selective modification of the Klenow fragment occurs Exo-minus of the DNA polymerase on the SH group of the cysteine
  • Example 43 Example of the production of such a Klenow fragment Exo-minus of the DNA polymerase is given under Example 43.
  • DNA polymerase in another embodiment, other modifications may be made to the DNA polymerase, such as couplings to amino groups of the DNA polymerase.
  • the cyst modified Klenow fragment Exo-minus of the DNA polymerase can be used in one embodiment instead of an unmodified Klenow fragment exo minus the DNA polymerase together with nuc macromolecules in the enzymatic incorporation reaction.
  • the nuc macromolecules according to the invention can be synthesized in different ways.
  • the order of the coupling steps can vary. For example, first a linker component can be coupled to the nuc-component, then the marker component is coupled. On the other hand, one or more linkers may be coupled to the label component and then the nuk component (s).
  • the coupling between individual components of the nuc-macromolecules can be covalent or affine. Whereby both chemical and enzymatic coupling can be used to link individual components.
  • Couplings to amino and thiol groups serve as examples of covalent linkages (Jameson, D., et al., Methods in Enzymology 1997, V. 278, pp. 363-, "The chemistry of the amino group” S. Patai, 1968, “The chemistry of the thiol group "S. Patai, 1974).
  • Biotin-streptavidin binding or hybridization between complementary nucleic acid strands or antigen-antibody interactions are examples of affine couplings.
  • a macromolecular marker often offer a variety of coupling possibilities.
  • a macromolecular marker can have multiple linker coupling sites, such as multiple biotin binding sites, as is streptavidin.
  • a macromolecular marker can also have several amino or thiol groups.
  • the core component of the marker can be modified with different numbers of signaling or signal-transmitting units. The exact relationships between marker units can vary. Examples of the
  • nucleic acids are used as macromolecular markers, they may have different sections for coupling to others
  • a nuc macromolecule may carry macromolecular markers having different detection properties, for example, a nuc macromolecule may be both carry several dye molecules as well as sites for affine binding (eg by hybridization) of other macromolecules.
  • the coupling between the nuc-components and the linker components is preferably covalent.
  • Many examples of covalent coupling to nucleotides or their analogs are known (Jameson et al., Methodology in Enzymology, 1997, v. 278, pp. 363-, Held et al., Nucleic acid research, 2002, v. 30, 3857, Short US Pat. No. 6579704, Odedra WO 0192284).
  • the coupling can be carried out, for example, on phosphate, amino, hydroxyl or mercapto groups.
  • the linker component can be built in several steps.
  • a short linker having a reactive group is coupled to the nucleotide or nucleoside, e.g. Propargylamine Linker to Pyrimidines Hobbs et al. U.S. Patent 5,047,519 or other linkers e.g. Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US pat. 6211158, US pat. 4804748, EP 0286028, Hanna M. Method in Enzymology 1996, v.274, p.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 p.3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, p. 363-, Held et al.
  • Propargylamine Linker to Pyrimidines Hobbs et al. U.S. Patent 5,047,519 or other linkers e.g. Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US pat. 6211158, US pat. 4804748, EP 0286028, Hann
  • the coupling of the nucleotide or Nudeosides can be done with a short linker to the linker polymer.
  • Polymers with reactive functional groups can be purchased (Fluka).
  • the marker component can now be coupled as the last step.
  • precursors for modified nucleosides can be obtained commercially from Trilink Biotechnologies (San Diego, Calif., USA) or from Chembiotech (Münster, Germany).
  • the coupling between the linker component and the marker component can be effected, for example, between reactive groups on the linker component and the marker component.
  • Reagents for such couplings are detailed in "Chemistry of protein conjugation and cross-linking", S. Wang, 1993, ISBN 0-8493-5886-8.
  • the methods for handling and coupling a plurality of macromolecules are illustrated for different types of macromolecules also in the above patents. Further examples of couplings to and between the macromolecules are for proteins in "Bioconjugation: protein coupling techniques for biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2; "Reactive dyes in protein an enzyme technology", D.
  • the marker component usually has many coupling sites, further modifications to complete nuc-macromolecules can be made. For example, excess amino groups can be blocked or altered by further modifications.
  • nuc macromolecules Depending on the field of application and the reaction conditions under which nuc macromolecules are used, different chemical bonding modes may be used individual parts of the macromolecules be beneficial. For example, in processes with higher temperature steps, such as hybridization or PCR, nuc-macromolecules have covalent, thermostable bonds between individual parts.
  • nuc macromolecules are given with polyethylene glycol (PEG) as the linker component.
  • PEG polyethylene glycol
  • Examples of the coupling of PEG to other molecules are described in "Poly (ethylene glycol): chemistry and biological applications", 1997.
  • very different reactive groups can be used for coupling: N-succinimidyl carbonate (US Pat. No. 5,281,698, US Pat.
  • polymers can be coupled in a similar manner.
  • examples of such polymers are other poly (alkylene glycols), copolymers of ethyleriglyco! and propylene glycol, poly (olefinic alcohols), poly (vinylpyrrolidones), poly (hydroxyalkylmethacrylamides), poly (hydroxyalkyl methacrylates), poly (saccharides), poly (x-hydroxy acids), poly (acrylic acid), poly (vinyl alcohol).
  • nucleotide purification is carried out by conventional means of nucleotide chemistry, for example by silica gel chromatography in a water-ethanol mixture, ion exchange chromatography in a salt gradient and reverse-phase chromatography in a water-methanol. gradient.
  • nucleotide purification optimized chromatography columns are e.g. offered by Sigma-Aldrich.
  • the mass of nuc macromolecules differs significantly from the mass of nucleotides. For this reason, it is advantageous to use ultrafiltration in the final purification steps. Since only an average mass is enriched for the nuc-macromolecules, ultrafiltration is also suitable as an analytical method for the separation of synthesis products.
  • nucleic acid chains include nuc-components of the nuc-macromolecules as units of the chain. Synthesis of modified nucleic acid chains
  • nuc macromolecules can be incorporated or integrated into the chain in different ways. In general, one can distinguish between the chemical and enzymatic steps. In the following some examples of the synthesis strategies are presented.
  • nuc-macromolecule i.e., nul-linker marker
  • its components e.g. only Nuk component, or nuc-linker component
  • the nuk component is first introduced into the nucleic acid sequence according to the rules of oligonucleotide synthesis (MWG-Biotech, TriLink Biotech nologies, Glen Research Laboratories,, S.
  • nuc-macromolecule i.e., nul-linker label
  • its components e.g. only Nuk component, or nuc-linker component
  • nuc-components which carry a reactive group suitable for coupling a linker component are incorporated into the nucleic acid chain as triphosphates in a template-dependent polymerase-controlled reaction. Subsequently, a linker and marker coupling can take place.
  • nuc-macromolecule in another embodiment, can be incorporated into the nucleic acid chain (see Example 34).
  • Modified nucleic acid chains include ribonucleic acids and also deoxy-ribonucleic acids.
  • the proportion of nuc macromolecules and the unmodified monomers of the nucleic acid chain is preferably in the ratio between 1: 5 and 1:20, 1:20 and 1: 100, 1:50 and 1: 1000, 1: 500 and 1: 10000.
  • nuc macromolecules can also be incorporated per one nucleic acid chain.
  • a nucleic acid chain includes only one nuc-macromolecule, in another embodiment, the number of nuc-macromolecules per one nucleic acid chain is in the following ranges: 2 to 20, 5 to 50, 10 to 100.
  • a nuc macromolecule is attached to the 5 'end of
  • a nuc-macromolecule is integrated at the 3 ' end of the nucleic acid chain.
  • a nuc-macromolecule is integrated within the nucleic acid chain, the distance from the nearest chain end being as follows
  • TLC Thin layer chromatography
  • Analytical "TLC aluminum foil 20 ⁇ 20 cm silica gel 60 F 254" (VWR), coated with fluorescent indicator visualization by means of UV light eluent ethanol-water mixture (70:30) (eluent, LM 1 ) or ethanol-water mixture (90:10) (LM 2)
  • Preparative Silica gel glass plates with collecting layer (VWR), LM 1 or LM 2.
  • UV / Vis control collected and pooled on the same spectra.
  • nuc macromolecules can be used, for example, if nuc macromolecules are oligonucleotides of the marker component. By hybridizing to a complementary, fixed on a solid phase nucleic acid, they can be selectively isolated.
  • Diamono PEG 10,000 (diamino-polyethylene glycol 10,000, Sigma), dUTP-AA (dUTP-allylamine, Jena-Bioscience), dCTP-PA (dCTP-propargyl-amine, Jena Bioscience), dATP-PA (7- (3-amino) 1-propynyl) -2 "deoxy-7-deazaadenosine-5 'triphosphate.
  • dGTP-PA (7- (3-amino-1-propynyl) -2'deoxy-7-deazaguanosine-5 '- triphosphate (custom synthesis of JenaBioscience), TTP (thymidine triphosphate, can be also referred to as dTTP, Sigma), 3 "-amino-TTP (3' -amino-3 '-deoxy- thymidine triphosphate, Trilink Biotechnologies) , PDTP (3- (2-pyridinyl-dithio) -propionic acid, Fluka), 7- (3-phthalimido-1-propynyl) -2'-deoxy-7-deazaguanosine and 7- (3-phthalimidol-propynyl) -2'-desoxy-7-deazaadenosine (Chembiotech), PDTP-NHS (3- (2-pyridinyldithio) -propionic acid N-hydroxysuccinimi
  • J-Ac iodoacetate, Sigma), iodoacetamide (Sigma), TEAE (tris- (2-aminoethyl) amine, Sigma), maleimido-ES-NHS (maleimido-acetic acid N-hydroxysuccinimidyl ester, Sigma), EDA (ethylene diamine , Sigma), CDI (1,1'-carbonyldiimidazole, Sigma), EDC N- (3-dimethylaminopropyl) -N-ethyleneecarbodiimide (Sigma), NH2-PEG-biotin (30 atoms), Sigma), PAS 100 kDa (polyacrylic acid , 100 kDa, Aldrich), NHS-PEG-maleimide, 3,400 Da, biotin-PEG-NHS, 5,000 Da, Fmoc-PEG-NHS, 3,400 Da, mPEG-SPA 5,000 Da, mPEG-SPA 20,000 Da (nectar), diamine -PEG,
  • QDot Qdot 605 streptavidin conjugate, quantum dot.
  • Poly-lysine 1000-2000 poly-L-lysine-hydrobromide 1000 -2000 Da, Fluka
  • poly-lysine 10,000-20,000 poly-L-lysine-hydrobromide 10,000 -20,000 Da, Fluka.
  • Solvents were used, if necessary, in the absolute form (Fluka) or dried by standard methods.
  • the mixing ratios given are based on the volumes used (v / v).
  • Example 1 dUTP-AA-PDTP, Fig. 10A.
  • dUTP-AA 20 mg dUTP-AA were dissolved in ImI water and the pH adjusted to 8.5 with NaOH.
  • PDTP-NHS 60 mg in 0.5 ml of methanol, dropwise with stirring. Reaction was carried out at 40 ° C. for 2 h.
  • nucleotides This example shows a general possibility to further modify nucleotides.
  • Other base-modified nucleotide analogs such as 7-deaza-aminopropargyl-deoxy-guanosine triphosphate and 7-deaza-aminopropargyl-deoxy-adenosine triphosphate, 5-amino-propargyl-deoxy-uridine triphosphates, 5-amino-allyl-deoxy-uridine Triphosphates, 5-amido-propargyl-deoxy-cytidine triphosphates can also be modified as indicated above. It can both Ribonucleotides, 2 "deoxyribonucleotides as well as 2 ⁇ 3 ⁇ - deoxyribonuclides are used, Figs. 11-14.
  • Example 3 dUTP-AA-Propionate-SH, Fig. 15 To 200 ⁇ l 40mmol / L solution of dUTP-AA-PDTP was added ImI TCEP solution 250mmol / L, pH 8, adjusted with NaOH and stirred at RT for 10 min. The separation of nucleotides from other reagents was done on preparative silica gel plates, LM 2. product, dUTP-AA-propionate-SH, remains on the start line. The nucleotides were eluted from the plate with water and concentrated. This dUTP analog carries a reactive SH group that can be easily modified, for example, to form disulfide bond.
  • Biotin-PEG-ethyl-SH Fig. 16
  • aqueous CA solution 100 mmol / l
  • pH 8.5 pH 8.5
  • NaOH sodium EDTA
  • 10 mg of biotin-PEG-NHS were added and stirred at 40 ° C. for 18 hours. Subsequently was
  • the product carries a reactive SH group that can be easily modified, for example, to form disulfide bond.
  • This product can be coupled to another molecule by thiol exchange. By cleavage of the SS bond, a free SH group can be provided.
  • Example 5
  • the product has a disulfide compound that can participate in thiol exchange reactions.
  • the product carries a reactive SH group that can be easily modified, for example, to form disulfide bond.
  • the product has two amino groups that can be easily modified with other reagents and can couple new functionality to the dye.
  • DC substances with Rf. 0.55 (Cy3-TEAE-PDTP) and 0.95 (Cy3-TEAE- (PDTP) 2).
  • Poly-lysine (Cy3) n, n 10-15, poly-lysine 10,000-20,000 To ImI aqueous poly-lysine solution, 1 mmol / l, Cy3-NHS was added until the concentration of Cy3 dye was 18 mmol / l amounted to. The reaction was stirred at RT for 40 min. The separation of modified poly-lysine from dye residues was carried out by ultrafiltration, 3000 MWCO. Determination of the average number of Cy3 molecules was carried out via UV-Vis spectrometers.
  • Poly-lysine is an example of a core component to which multiple label moieties, such as dyes, can be coupled.
  • label moieties such as dyes
  • the product carries a disulfide bond that can easily participate in a thiol exchange reaction and thus can be coupled to other compounds.
  • the product carries a reactive SH group that can be easily modified, for example, to form disulfide bond.
  • the product (HS propionate) m-poly-lysine (Cy3) n, was separated from the low molecular weight components at 3,000 MWCO.
  • the product carries several reactive SH groups that can be easily modified, for example, to form disulfide bond.
  • DTBP 210 mg
  • ImI DMF ImI DMF
  • CDI 320 mg 320 mg
  • 10 ⁇ l of methanol were added and, after a further 10 minutes, 100 ⁇ l of this solution, 1 mmol / l, were added to 300 ⁇ l aqueous 100 mmol / l solution of TTP, pH 8.5 with NaOH, and vigorously stirred at RT for about 4 h.
  • the nucleotides were isolated by precipitation with ethanol and then dissolved in 300 ⁇ l of water.
  • the product carries a reactive SH group that can be easily modified, for example, to form disulfide bond.
  • Example 14
  • TTP-3 * -Am i no- PDTP Figure 24B
  • the synthesis was carried out as described for dUTP-AA, Example 1: As starting materials were 3 x -Amino-3 * -Deoxy-TTP, lOO ⁇ l, lOmmol / l solution, pH 8 and PDTP-NHS used. Yield 19%, UV Vis.
  • the product carries a disulfide bond that can easily participate in a thiol exchange reaction and thus can be coupled to other compounds.
  • the X 3 -end with a binding site for example, a short linker, modified nucleotides can be used. Syntheses are shown, for example, in Metzker et al. Nucleic acid Research 1994, V.22, p. 4259, Canard et al. Gene, 1994, V. 148, 1, Hovinen et al. J. Chem. Soc. Perk. Trans. 1994V.1, p. 211, Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, p. 586, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, p. 363, Canard US. Pat. 5798210, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642, Faulstich DE 4418691.
  • nucleosides and nucleic Acid Chemistry are described in Balasubramanian WO 03048387.
  • nucleotide analogues are described in "Nucleotide Analogs" Scheit, 1980, ISBN 0-471-04854-2, “Nucleosides and Nucleic Acid Chemistry", Kisakürek 2000, “Anti-HIV Nucleosides” Mitsuya, 1997, “Nucleoside Analogs in Cancer Therapy ", Cheson, 1997.
  • nucleosides and nucleotides may be used.
  • a compound was obtained which carries a nucleotide functionality and a low molecular weight marker functionality. It can be representative of conventionally modified nucleotides with only one small molecule marker. This compound is accepted by polymerases (eg Klenow exo minus polymerase) as substrate, s.
  • polymerases eg Klenow exo minus polymerase
  • Example 16 dUTP-AA-SS-TEAE- (Cy3) 2
  • Figure 26 dUTP-AA-SS-TEAE- (Cy3) 2 was synthesized similar to dUTP-AA-SS-MEA- (Cy3), Example 15 using TEAE- (Cy3) 2-propionate-SH instead of MEA-Cy3. Yields 43%, UV Vis.
  • a compound was obtained which carries a nucleotide functionality and two low molecular weight marker functionalities. This compound is not accepted by polymerases (e.g., Klenow exo minus polymerase) as a substrate. The modification of the nucleotide leads to the loss of the substrate properties.
  • polymerases e.g., Klenow exo minus polymerase
  • Example 17 dUTP-AA-SS-Propionate-TEAE-Cy3, Fig. 27 dUTP-AA-SS-propionate-TEAE-Cy3 was synthesized similarly to dUTP-AA-SS-MEA-Cy3, Example 15, to give Cy3 TEAE propionate SH is used instead of MEA-Cy3. Yield 37%, UV Vis.
  • This compound carries a nucleotide functionality and a low molecular weight marker functionality.
  • the linker at the base has a free amino group that can be modified.
  • the nucleotide is accepted by polymerases as a substrate.
  • a compound was obtained which carries a nucleotide functionality and a macromolecular marker functionalities.
  • This compound is not accepted by polymerases (e.g., Klenow exo minus polymerase and terminal transferase) as a substrate.
  • polymerases e.g., Klenow exo minus polymerase and terminal transferase
  • the modification of the nucleotide leads to the loss of the substrate properties.
  • This compound carries a nucleotide functionality and a macromolecular
  • Biotin serves as the coupling unit T.
  • macromolecular structures can be coupled, e.g. Streptavidin without that
  • This nuc macromolecule serves as a substrate for polymerases.
  • Biotin may also be considered as a low molecular weight tag unit with signal-switching functionality coupled to the long linker.
  • the product of the reaction is an intermediate of a nuc macromolecule.
  • This example shows a general possibility to further modify nucleotides.
  • Other base-modified nucleotide analogs such as 5-propargylamino-dCTP, 7-deaza-aminopropargyl-dGTP, 5-amino-propargyl-dUTP, and 7-deaza-aminopropargyl-dATP (Figure 29) may also be modified as noted above.
  • Ribonucleotides, 2 X -Deoxyribonukleotide and 2 ⁇ 3 ⁇ - 11 to 14 dideoxyribonucletide be used.
  • polymers eg, PEG derivatives
  • linkers eg, dATP-PA-PEG-NH 2 .
  • LOO ⁇ l aqueous solution to 7-deaza-7-aminopropargyl-dATP prepared from 7- (3- phthalimido-l-propynyl) -2 '-deoxy-7-deazaadenosine from Jena Bioscience
  • 50 mmol / l, pH 8.0 were 10mg Fmoc-PEG-NHS (Fmoc-protected NH 2 -PEG-NHS) and stirred at 40 0 C for 18 hours. Subsequently, the pH was increased to 11 and the reaction mixture stirred for a further 2 hours at RT.
  • the unreacted nucleotide was separated by ultrafiltration, 3,000 MWCO, and the product of the reaction, the dATP-PA-PEG-NH 2 , was washed several times with water.
  • This compound carries a nucleotide functionality and a macromolecular linker.
  • NH2 group serves as coupling unit T for the marker component.
  • Macromolecular structures can be coupled to this coupling unit T, for example polyacrylic acid derivatives, without losing the substrate properties of these nucleotide analogs.
  • This nuc macromolecule serves as a substrate for polymerases.
  • TTP-3 'amino-PEG-biotin Synthesis was similar for dUTP-AA-PEG-biotin, Example 19. The reactants were 3 * 3 * amino-deoxy-TTP and biotin-PEG-NHS used.
  • This compound carries a nucleotide functionality and a macromolecular linker and a low molecular weight tag unit (biotin) that has a signal-conferring function. Macromolecular signal-carrying streptavidin molecules can be coupled to the biotin.
  • nucleotide analogs having an amino group in the 3 "position can be coupled in a similar manner.
  • This compound has a nucleotide functionality and a macromolecular
  • Linker Coupling unit T at this linker is the maleimide group.
  • Maleimide functionality can be coupled to macromolecular signal-carrying molecules bearing one or more SH groups.
  • Maleimide group can also be considered as a low molecular weight marker unit with signal-switching function coupled to the long linker. Macromolecular structures can be coupled to this marker component without losing the substrate properties of these analogs.
  • the synthesis was carried out similarly as described for dl) TP-AA-PEG-biotin, Example 19.
  • the starting materials used were dUTP-AA-SS-propionate-TEAE-Cy3 and biotin-PEG-NHS.
  • the separation from the unreacted dUTP analog was carried out by ultrafiltration, 3,000 MWCO.
  • This compound carries a nucleotide functionality, a dye, a macromolecular linker, and a low molecular weight marker functionality (biotin) that has a signal-conferring function. Biotin can also be considered as a coupling unit T of the linker.
  • Macromolecular structures can be coupled to the coupling unit T (biotin in this example) without losing the substrate properties of these analogs.
  • This nuc macromolecule serves as a substrate for polymerases.
  • the dye serves as a sterically demanding group that allows the enzymatic incorporation of only one Nuk macromolecule in the growing strand through the polymerase.
  • the properties of such nucleotides are described in detail in Tcherkassov WO 02088382.
  • Example 23 dUTP-AA-SS-PEG-biotin, Fig. 31A,
  • This compound carries a nucleotide functionality and a macromolecular linker.
  • Biotin serves as the coupling unit T.
  • macromolecular structures can be coupled, e.g. Streptavidin without that
  • This nuc macromolecule serves as a substrate for polymerases.
  • Other macromolecules for example enzymes or nucleic acid genes can also be coupled via streptavidin.
  • Biotin can also be referred to as a signal-transmitting low molecular weight marker unit.
  • the linker component can be cleaved off the nuc-component with the marker component under mild conditions. This can be, for example be advantageous when sequencing by synthesis (Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382, Quake WO0132930, Kartalov WO02072892) is performed, wherein after each detection step, a removal of the marker is necessary.
  • dUTP-AA-propionate-S-CO-PEG-biotin Rg. 31 B
  • the dUTP-AA-PDTP was first purified on RP-HPLC in water-methanol gradient. To 10 ⁇ l of a 50 mmol / l solution of dUTP-AA-PDTP in water was added 20 ⁇ l of a 100 mmol / l solution of TCEP, pH 8. The reaction was carried out at RT for 10 min. The product of the reaction, dUTP-AA-propioate-SH, was separated from other reagents on silica gel preparative plates, LM 2. The product, dUTP-AA-Propionate-SH, remains on the starting line. It was eluted from the plate with water, concentrated and in 50 ⁇ ! 50 mmol / l borate buffer, pH 8, dissolved.
  • the dUTP-AA-propionate-S-CO-PEG-biotin thus obtained can be incorporated into the growing strand of nucleic acids by DNA polymerases, for example, Klenow fragment Exo minus or Taq polymerase.
  • biotin can be coupled via the streptavidin further marker components.
  • the dUTP-AA-propionate S-CO-PEG-biotin contains a cleavable group under mild conditions so that the linker with the dye can be cleaved from the nucleotide.
  • This is of particular interest, for example, in methods of sequencing by synthesis (Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382, Quake WO0132930, Kartalov WO02072892).
  • nucleotide analogues such as 5-propargylamino-dCTP, 5-amino-propargyl-dUTP, 7-deaza-aminopropargyl-dGTP and 7-deaza Aminopropargyl-dATP may also be modified as noted above.
  • Ribonucleotides, 2 ⁇ -Deoxyribonukleotide and 2 ⁇ 3 * - 11 to 14 dideoxyribonucletide be used.
  • a linker component can be coupled.
  • Examples of couplings of linkers to phosphate groups of nucleotides are shown in US Patent 5,981,507.
  • To such a linker further macromolecular linker can be coupled, which carry a low molecular weight marker or a low molecular weight coupling unit or a markomolekularen marker.
  • markomolecular linker is added to the phosphate groups coupled at the 5 'position of the ribose.
  • the coupling is preferably carried out on the gamma-phosphate group of the nucleotides, wherein both ribonucleotides and 2 * -Deoxyribonukleotide as well as 2 ⁇ 3 * -Didoxynukleotide can be used.
  • coupling of the macromolecular linker to the 3'-phosphate group of a 5'-nucleoside triphosphate is preferably carried out on the gamma-phosphate group of the nucleotides, wherein both ribonucleotides and 2 * -Deoxyribonukleotide as well as 2 ⁇ 3 * -Didoxynukleotide can be used.
  • coupling of the macromolecular linker to the 3'-phosphate group of a 5'-nucleoside triphosphate can be used.
  • (dUTP-16-biotin) 4-SA To 200 ⁇ l of a solution of biotin-16-dUTP 200 ⁇ mol / l in 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, was added 200 ⁇ l of a streptavidin solution, 1 mg / ml, in 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, added. After 1 h at RT, the (dUTP-16-biotin) 4-SA was separated from the unreacted biotin-16-dUTP by ultrafiltration, 50,000 MWCO.
  • a compound was obtained which carries a nucleotide functionality and a macromolecular marker functionalities.
  • the compound serves as the equivalent to the compound of Example 25, wherein streptavidin is fluorescently labeled for visualization.
  • synthesis was carried out as described in d UTP-AA-SS-M EA-Cy3.
  • dCTP-PA-PDTP 100 ⁇ l, 20mmol / L, oligo-dT30-3 * -SH (MWG-Biotech) was added, final concentration 200 ⁇ mol / L, and stirred for 18h at RT, pH 9.
  • the purification was carried out by ultrafiltration with 3,000 MWCO.
  • This compound is not accepted by polymerases (e.g., Klenow exo minus polymerase and terminal transferase) as a substrate.
  • polymerases e.g., Klenow exo minus polymerase and terminal transferase
  • the modification of the nucleotide portion leads to abolition of the substrate properties.
  • Biotin 4-SA. To 200 ⁇ l of l ⁇ g / ⁇ l streptavidin was added 10 ⁇ l of a solution of dUTP-AA-PEG-biotin, approximately 1 mmol / l, and stirred at RT for 1 h.
  • the product was separated from the uncoupled dUTP-AA-PEG-biotin by ultrafiltration, 50,000 MWCO, and the product was washed twice with water.
  • a compound carrying a nucleotide functionality, a long macromolecular linker, and a macromolecular marker moiety was obtained.
  • the product can be considered representative of nuc macromolecules.
  • This compound is accepted as a substrate by polymerases (e.g., Klenow exo minus polymerase and terminal transferase).
  • polymerases e.g., Klenow exo minus polymerase and terminal transferase.
  • This compound is derived from polymerases (e.g., Klenow exo minus polymerase and
  • Terminal transferase accepted as a substrate.
  • the substance carries a nucleoside triphosphate functionality and a macromolecular marker functionalities (oligo-dT31).
  • Oligo-dT31 consists of
  • Oligonucleotide can be hybridized to complementary nucleic acids that have a signaling function (FIG. 35B).
  • FOG. 35B signaling function
  • This compound is accepted as a substrate by polymerases (e.g., Klenow exo minus polymerase and terminal transferase).
  • polymerases e.g., Klenow exo minus polymerase and terminal transferase.
  • this derivative can be coupled to poly-dA or poly-A (eg, 260NT average length, Amersham Bioscience) by hybridization.
  • Both a single and several (dUTP-AA-PEG-biotin) 2- (dT31-biotin) 2-SA-Cy2 molecules can be coupled to a poly-dA molecule, see also Fig. 5.
  • the ratio is determined by determines the concentration ratios.
  • Other oligonucleotides, for example labeled with dyes, together with (dUTP-AA-PEG-biotin) 2- (dT31-biotin) 2-SA-Cy2 can be coupled to the same strand of the poly-dA or poly-A, the ratios between individual molecules are variable.
  • nuc-macromolecule consists in a readily cleavable macromolecular labeling: the labeled oligonucleotides hybridized to the poly-dA or poly-A strands can be removed by denaturation.
  • Tm the length of the labeled oligonucleotides
  • the rules for Tm calculation are known in the art ("Molecular Cloning", J. Sambrook, vol. 1-3, 2001).
  • dT 25 oligonucleotides labeled with a Cy3 molecule can be coupled to poly-dA.
  • RNA eg poly-A
  • the cleavage can be carried out by an RNase.
  • nuc macromolecules Since streptavidin has 4 binding sites for biotin, a mixture of nuc macromolecules is formed in which 4 binding sites are differently occupied. This mixture can be separated by different means.
  • One of the possibility consists of isolation of nuc-macromolecules bearing at least one oligo-dT31, for example by absorption on an anion exchanger (eg a DEAE-cellulose column). Gel electrophoresis is suitable for the separation of individual derivatives.
  • nucleic acid chains which carry a biotin molecule for example poly-A-biotin, prepared, for example, by a terminal coupling of ddUTP-18-biotin by a TdT-dependent reaction ("Molecular Cloning", J. Sambrook, Vol. 3, 2001), can be similarly coupled to the streptavidin to form molecules having an average composition of (dUTP-AA-PEG-biotin) N- (nucleic acid chain-biotin) M -SA. Both single-stranded and double-stranded nucleic acid chains can be coupled.
  • the length of the coupled nucleic acid chains may be between 10 and 100, 100 and 1000 nucleotides.
  • hybridized oligonucleotides carrying a dye can also be covalently attached to the poly-dA strand by cross-linkers.
  • dUTP-AA-PEG-biotin 4-SA described.
  • the starting materials used were streptavidin and dUTP-AA-SS-PEG-biotin.
  • a compound carrying a nucleotide functionality, a long macromolecular linker and a macromolecular marker component was obtained.
  • the linker moiety and the label moiety can be cleaved from the nuc moiety under mild conditions.
  • the product can be considered representative of nuc macromolecules carrying a mildly cleavable compound in the linker moiety.
  • Example 31B This compound is accepted as substrate by polymerases (eg Klenow exo minus polymerase and terminal transferase) s.
  • polymerases eg Klenow exo minus polymerase and terminal transferase
  • dGTP-PA was modified with PDTP-NHS, similar to that shown in Example 1, the product is dGTP-PA-PDTP.
  • streptavidin biotin-PEG-R-SH
  • macromolecular products were i.a. (dGTP-PA-SS-PEG-biotin) 4-SA separated by ultrafiltration of 3OkDa MWCO of low molecular weight components by repeated washing with borate buffer.
  • the resulting product (dGTP-PA-SS-PEG-biotin) 4-SA has a linker of 42 atoms between the nuc-component and the biotin.
  • This nuc-macromolecule has a cleavable SS bond in its linker and can be inserted by Klenow fragment into a nucleic acid chain.
  • Example 32 dCTP-PA-PEG-maleimide-S-oligo-dT30, Fig. 37A
  • the substance carries a nucleoside triphosphate functionality and a macromolecular marker functionalities (oligo-dT30).
  • the oligo-dT30 consists of nucleotides, which, however, do not participate in the enzymatic reaction and have only one signal-transmitting function.
  • oligonucleotide complementary nucleic acids can be hybridized, which have a signaling function (Fig. 37B).
  • Fig. 37B general rules for the hybridization of nucleic acids are known in the art, Anderson "Nucleic Acid Hybridization", 1999.
  • This compound is accepted as substrate by polymerases (eg Klenow exo minus polymerase and terminal transferase).
  • nucleotide analogs such as 5-allylamino-dUTP, 5-amino-propargyl-dUTP, 7-deaza-aminopropargyl-dGTP and 7-deaza-aminopropargyl-dATP may also be modified as indicated above.
  • Ribonucleotides, 2 ⁇ -Deoxyribonukleotide and 2 *, 3 X - 11 to 14 dideoxyribonucletide be used.
  • dCTP-PA-PEG-maleimide-S-oligo-dT30 e.g. 10-20
  • dCTP-PA-PEG-maleimide-S-oligo-dT30 e.g. 10-20
  • a compound carrying a nucleotide functionality, a long macromolecular linker and a macromolecular marker component was obtained.
  • Several nuc-components are coupled per nuc-macromolecule. This compound is accepted as a substrate by polymerases (e.g., Klenow exo minus polymerase and terminal transferase).
  • nuc-components linker components and marker components are obvious to those skilled in the art. Comparison of substrate properties of some members of nuc macromolecules with conventionally modified nucleotides.
  • Example 34 Substrate properties of nuc macromolecules or conventionally modified nucleotides versus polymerases
  • Matrices used were both short oligonucleotides and poly-dA. Primers and oligonucleotides were synthesized by MWG-Biotech.
  • primers were hybridized to the respective template: The reaction mixture without polymerase was heated to 75 ° C and cooled to 37 ° C for 5 min. Thereafter, the polymerase was added. All reactions were carried out for 1 h at 37 ° C. The reactions were stopped by addition of EDTA (final concentration of 10 mmol / l). For some preparations, after stopping the reaction, streptavidin was added to a final concentration of 1 mg / ml, and the mixture was incubated at 37 ° C for a further 10 minutes. This allows already incorporated nucleotides that carry a biotin, react with streptavidin and thus connect streptavidin and oligonucleotide. These experiments are useful as controls for the running properties of modified primers.
  • Oligonucleotide oligo l 5 ' -Ab III IAb III «ACCCTATAGTGA6TCGTATTA-3 *
  • the primer binding site is underlined
  • Lanes 1-6 1) only primers T7-20-Cy3 + oligo 1
  • dUTP-AA-SS-MEA-Cy3 is incorporated by the polymerase (lane 4).
  • the dye can be cleaved from the primer (lane 5) (one sees a shift in the band, which is due to the smaller size of oligonucleotide). Subsequently, further nucleotides can be incorporated (lane 6).
  • a nuc macromolecule (dUTP-AA-SS-PEG-biotin) 4-SA, is incorporated into the primer (lane 2).
  • the labeled primer has a greatly altered electrophoretic mobility after incorporation of a nuc macromolecule.
  • the mere presence of nuc macromolecules has no effect on the primer (lane 3).
  • a conventionally modified nucleotide, (dUTP-16-biotin) 4-SA, with a macromolecular marker is not incorporated into the primer (lane 4). Despite the presence of the polymerase in reaction 4 (lane 4), no differences between lane 4 and lane 5 can be observed.
  • Lane 6 shows the position of the conventionally-modified nucleotide with a macromolecular marker, (dUTP-16-biotin) 4-SA-Cy3, the upper band, and the position of the labeled primer (the lower band).
  • Lane 7 shows the result of incorporation of dUTP-16-biotin with a subsequent reaction with streptavidin: the biotin-mimicked primers react with streptavidin and change their running properties. The unmodified primers retain their electrophoretic properties.
  • Lane 8 shows the result of the incorporation reaction of a conventionally modified nucleotide, dUTP-16-biotin.
  • dUTP-16-biotin a conventionally modified nucleotide
  • the extension of primer is limited because dUTP-16 biotin can not be incorporated indefinitely one by one, on average, about 3 dUTP analogs are incorporated so that the length of primer increases on average to 38 NT.
  • the incorporation of conventionally modified nucleotides with a low molecular weight marker does not result in a large change in the electrophoretic mobility of the primers.
  • nuc-macromolecules (dUTP-AA-SS-PEG-biotin) 4-SA can be incorporated into the primer without difficulty by the polymerases.
  • the appearance of multiple bands in the gel leads the inventors back to multiple incorporation of nuc-macromolecules into the primer (3 bands).
  • Nucleotides (dUTP-AA-SS-PEG-biotin) 4-SA, (dU-AA-PEG-biotin) 4-SA Streptavidin-polystyrene Particle, 2.17 ⁇ , Spherotech Ine,
  • This amount of oligo dA50 solid phase can hybridize to PrimerrdT-35-Cy3 in 2 ⁇ mol / L.
  • primer dT-35-Cy3 The hybridization of primer dT-35-Cy3 was carried out at 40 0 C for 10 min, followed by cooling to RT within 10 min. All other steps were the same at all
  • the primer bands are at dT40-Cy3 (see ladder). This means that up to 5 nuc-macromolecules were incorporated into the primers during the reaction.
  • TdT Nucleotides over terminal transferase
  • the reaction was carried out according to the kit manufacturer (Roche): to each 50 ul volume were added: 1OuI 5x reaction buffer, l ⁇ l TdT (25Units), 5 ⁇ l 25mmol / l CoCI 2 - The primer and nucleotide concentrations were as in the polymerase reactions. The reaction was carried out for 2 h at 37 ° C. Primers: primer dT 35 -5 '-Cy3 (dT35-Cy3), primer dT 35 (dT35)
  • lane 1 In lane 1, one clearly sees two bands, the band in the middle corresponds to the dT35-Cy3, the upper band corresponds to the reaction product: nuc-macromolecule was incorporated into dT35 by TdT. Lane 2 serves as a negative control. Lane 3 shows the result of labeling the dT35 with the conventional nucleotide dUTP-
  • lane 4 is the nagative control.
  • lane 5 the result of the coupling of dUTP-16-biotin to the dT35-Cy3 is difficult to recognize.
  • lane 6 you can see a shabby band in the upper area, which is the result of the reaction of the dUTP
  • Lane 7 shows the position of the modified streptavidin.
  • Lanes 8 and 9 show only one band in the middle of the gel corresponding to the dT35-Cy3, no band is seen in the upper gel region, which clearly indicates that conventionally modified nucleotides with a macromolecular marker of TdT do not to be built in.
  • Lane 10 shows the
  • Example 36 dUTP-AA-SS-PEG-Cy3, Fig. 42A
  • SH-PEG-Cy3 was prepared. To 200 ⁇ l of a 10 mmol / l solution of diamine PEG (6 kDa, Fluka) in 50 mmol / l borate buffer, pH 8, Cy3-NHS (Amersham-Bioscience) was added to a final concentration of 15 mmol / l. The reaction was carried out at RT for 30 minutes. Subsequently, NH 2 -PEG-Cy 3 (FIG.
  • the product of the reaction washed 5 times with 1 ml of 50 mmol / l Tris-HCl buffer, pH 7, and dissolved in a volume of 200 ul 50 mmol / l Tris-HCl, pH 7.
  • the pH was adjusted to 9.0 with 1 mol / l NaOH.
  • the dUTP-AA-SS-PEG-Cy3 obtained in this way can be incorporated into the growing strand of nucleic acids by DNA polymerases, for example Klenow fragment exo-minus or Taq polymerase.
  • the dUTP-AA-SS-PEG-Cy3 contains a cleavable group under mild conditions so that the linker with the dye can be cleaved from the nucleotide. This is of particular interest, for example, in methods of sequencing by synthesis (Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382, Quake WO0132930, Kartalov WO02072892).
  • nucleotide 11 to 14 shows a general possibility to further modify nucleotides.
  • Other base-modified nucleotide analogs such as 5-propargylamino-dCTP, 5-propargylamino-dUTP, 7-deaza-aminopropargyl-dGTP and 7-deaza-aminopropargyl-dATP may also be modified as indicated above.
  • Ribonucleotides, 2 ⁇ -Deoxyribonukleotide and 2 ", 3 '- are used dideoxyribonucletide 11 to 14.
  • the dUTP-R-COOCH 3 ( Figure 44) was synthesized analogously to the protocol (Heike A. Held, Abhijit Roychowdhury, and Steven A. Benner, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, VoI 22, 391-404 (2003)).
  • the triphosphate synthesis was carried out according to T. Kovacs, L. ⁇ tvös, Tetrahedron Letters, VoI 29, 4525-4588 (1988)).
  • This nucleotide has a thioester group which can be cleaved under mild conditions and can be modified at the amino group on the linker.
  • a dye can be coupled to it: Synthesis of dUTP-R-CO-S-CH 2 -CH 2 -NH-R-Cy3 ( Figure 46)
  • Such a nucleotide can be used as a reversible terminator in a method for sequencing nucleic acids (Tcherkassov WO 02088382).
  • the cleavage of the thioester compound can be carried out, for example, by adding 100 mmol / l mercaptoethanol in 50 mmol / l borate buffer, pH 9.
  • a long linker can also be coupled with a low molecular weight marker, similar to Example 19.
  • Das dUTP-R-CO-S-CHrCHr-NH-PEG-biotin obtained can serve as an intermediate for a nuc macromolecule.
  • This derivative may be prepared from dUTP-AA-SS-propionate TEAE-Cy3 (see Example 17) by modification of the amino group in the linker with an mPEG-SPA, e.g. 5,000 Da, to be obtained.
  • the modification conditions are similar to Example 19.
  • This molecule has a long linker and can be used by the method of the invention for rapid purification of the modified nucleotides prior to their use in the labeling reactions.
  • a filter with MWCO of 3000 can be used in this example.
  • the eluate was first concentrated by ultrafiltration (MWCO 3000) and the product, SH-R-PEG-oligo- dT 3 i-Cy3 was buffered in 50 mmol / l borate buffer, pH 9.0.
  • the concentration of SH-R-PEG-O! Igo-dT 3 i-Cy3 was 100 ⁇ mol / l.
  • AA-PDTP was carried out with 0.3 mol / l NaCl in 50 mmol / l Na acetate, pH 6.0.
  • Elution of dUTP-AA-SS-R-PEG-oligo-dT31-Cy3 was carried out with 0.8 mol / l NaCl in 50 mmol / l Na acetate, pH 6.0.
  • the eluate was first concentrated by ultrafiltration (MWCO 3000) and the product was rebuffered in 50 mmol / l Na acetate, pH 6.0.
  • the substance carries a nucleoside triphosphate functionality and a macromolecular marker functionalities (oligo-dT31).
  • the oligo-dT31 consists of nucleoside monophosphates, which, however, do not participate in the enzymatic reaction and have only one signal-transmitting function.
  • oligonucleotide complementary nucleic acids can be hybridized, which have a signaling function (Fig. 37B). (general rules for the hybridization of nucleic acids are known in the art, Anderson "Nucleic Acid Hybridization", 1999.).
  • This compound is accepted as a substrate by polymerases (e.g., Klenow exo minus polymerase and terminal transferase).
  • polymerases e.g., Klenow exo minus polymerase and terminal transferase.
  • oligonucleotides can be coupled to the dUTP derivative.
  • other homopolymer oligonucleotides such as e.g. Poly-dC, poly-dG or poly-dU or poly-dA.
  • oligonucleotides with specific sequences can also be used. By the specific sequences of oligonucleotides nucleic acid chains can be hybridized sequence-specific. For the synthesis of nuc-macromolecules also oligonucleotides can be used which include hairpin structures (Stemloops).
  • the oligonucleotide carries an amino group coupled via a linker at the 3 % end, which acts as a coupling site for maleimide-PEG-NHS, and the Cy3 fluorescent dye.
  • Other coupling groups such as SH, carboxy, aldehyde groups can be used.
  • the position of the coupling group may be at one of the ends of the oligonucleotides, or even in the middle of the sequence.
  • Such oligonucleotides can be synthesized by the company MWG-Biotech, Germany.
  • oligonucleotides may carry fluorescent dyes or other reporter groups such as biotin, digaxygenin.
  • fluorescent dyes or other reporter groups such as biotin, digaxygenin.
  • FRET pairs or fluorescent dye-quaternary molecule pair can be inserted into an oligonucleotide.
  • nucleotide analogs such as e.g. 5-propargylamino-dCTP, 5-amino-propargyl-dUTP, 7-deaza-aminopropargyl-dGTP and 7-deaza
  • Aminopropargyl-dATP may also be modified as noted above.
  • Deoxyribonuclides can be used, Figures 11 to 14. Also other base modified nucleotides can be used in a similar manner.
  • dUTP-AA-SS-R-PEG-oligo- dT31-Cy3 By adding poly-dA or poly-A, several dUTP-AA-SS-R-PEG-oligo- dT31-Cy3, e.g. 10-20, be coupled to a nuc macromolecule. This results in a nuc macromolecule with linearly arranged nuc-linker components (FIG. 37 C).
  • nuc macromolecule with linearly arranged nuc-linker components (FIG. 37 C).
  • other modifications may also be introduced, e.g. Fluorescent label.
  • EDA-Cy3 was synthesized as follows: To ImI aqueous EDA solution, 400 mmol / L, pH 8.5 adjusted with HCl, 0.1 mg of Cy3-NHS was added. The reaction was stirred at RT for 30 min. The product was separated on RP-18 (water-methanol gradient) and concentrated to 0.2 ml.
  • PAS 100 kDa (35% aqueous solution) was converted into an anhydrous DMF solution by repeated rotation with DMF. Subsequently, to 200 ⁇ l of a 0.1 mmol / l PAS (2 mg in 200 ⁇ l) in DMF 3 mg CDI was added. Reaction took place and for 30 min at RT. Subsequently, 0.2 ml of 0.7 mmol / l EDA-Cy3 solution and 0.2 ml of 0.5 mmol / l dATP-PA-PEG-NH 2 were added simultaneously to this solution. The reaction was carried out at RT for 1 h. Subsequently, product (dATP-PA-PEG) n -PAS- (Cy3) m separated by ultrafiltration with 100 kDa MWCO of EDA-Cy3 and dATP-PA-PEG-NH 2 .
  • the average number of Cy3 derivatives is 5 per one PAS molecule, and the average number of Nuc units (dATP) per PAS molecule is 2. In this way, one Nuk macromolecule was synthesized containing several Makrer units and several Includes Nuk units.
  • (dATP-PA-PEG) n -PAS- (Cy3) m serves as a substrate for the DNA polymerases and can be used in the labeling reactions.
  • IMuk macromolecules as monomer components of an oligonucleotide
  • nucleotide monomers bearing a reactive group have been described.
  • a nucleotide monomer which occurs as part of a polymer, e.g. a nucleic acid chain, and a reactive group is also modified.
  • a long, linear, non-branched linker, such as PEG is preferred.
  • Nucleotide monomers having a reactive group for example, an amino or mercapto group, can be coupled to the means of conventional oligonucleotide synthesis in a nucleic acid chain.
  • Many modifications can be introduced into an oligonucleotide in a custom synthesis, for example by MWG-Biotech. Synthesis of a modified oligonucleotide:
  • an oligonucleotide with 31 dT monomers and an amino group coupled at the 5 'end was synthesized by MWG Biotech (5'-amino-dT31).
  • an Fmoc-PEG-NHS linker can be coupled to such an oligonucleotide:
  • the product of the reaction is NH2-PEG-dT31 was dissolved in 50 ⁇ l of 50 mmol bicarbonate buffer, pH 8.0 (concentration 0.3 mmol / l). To the terminal amino group, a macromolecular marker can be coupled.
  • a macromolecular marker-modified oligonucleotide can be synthesized: EDA-Cy3 was synthesized as in Example 40. PAS 100 kDa (35% aqueous solution) was converted into an anhydrous DMF solution by repeated rotation with DMF.
  • the average number of Cy3 derivatives is 7 per one PAS molecule, the average number of coupled oligonucleotides per PAS molecule is 1. In this way, a polymer-mofidized oligonucleotide that includes a nuc macromolecule was synthesized.
  • a linker may also be coupled to the phosphate groups of a nucleotide.
  • a linker can be coupled to such a modified phosphate group.
  • the triphosphate synthesis was carried out according to T. Kovacs, L. ⁇ tvös, Tetrahedron Letters, VoI 29, 4525-4588 (1988).
  • the triphosphate nucleotide was precipitated with ethanol and purified on DEAE-cellulose and RP-18.
  • the Fmoc protecting group was then removed with 0.1 M NaOH (room temperature for 30 min).
  • Example 43 Preparation of a nuc macromolecule with a linker of 4 chain atoms and a water-soluble linear polymer.
  • the short linker in this example may also be considered as the L linker of the long linker, with PAS appearing as part of the linker.
  • dCTP-PA was modified with FmOC-NH- (PEG) 2 -COOH (dCTP-PA- (PEG) 2 -
  • Fmoc-NH- (PEG) 2 -COOH was activated with CDI.
  • Marker moieties for example dyes, can be coupled to the polymer.
  • the amino group of PEG was modified with PDTP-NHS as in Example 1 to give dCTP-PA- (PEG) 2 -NH-PDTP.
  • Aminodextran 70,000 was modified by reaction with PDTP-NHS, with an average of one amino-dextran molecule modified with 1.4 PDTP groups. Subsequent reduction with TCEP produced free SH groups to result in amino-dextran-SH. The cleaning was carried out with 10 kD WMCO.
  • nucleotides are incorporated into the nucleic acid chains by Klenow fragment in a primer-dependent reaction.
  • Marker units for example dyes, can be coupled to the aminodextran.
  • Example 46 Preparation of a modified Klenow fragment Exo minus the DNA polymerase I of E. coli (hereinafter referred to as Klenow fragment Exo minus).
  • Klenow fragment Exo minus 70 ⁇ l of a buffer solution containing Klenow fragment Exo-minus DNA polymerase (750 units vial from Amersham Bioscience, dissolved in the manufacturer buffer: 50 mmol / l potassium phosphate buffer, pH7 , 1.0 mmol / l DTT, 50% glycerol) 100 .mu.l of a buffer solution (200 mmol / l Tris-HCl buffer, pH 10.0, 60% glycerol) was added, the pH of the solution with polymerase is now 9.0 , Subsequently, 30 .mu.l of a 1 mol / l aqueous iodine-acetamide solution are added. The reaction is carried out at RT for 30 min. In this way, a selective modification of the polymerase takes place
  • the purification of the modified polymerase can be carried out, for example, by ultrafiltration or by ion exchange or dialysis.
  • the storage of the modified polymerase takes place, for example, in a glycerol-containing buffer.
  • Suitable buffers are, for example, Tris-HCl, borate, phosphate buffer.
  • the pH of these buffers is, for example, between 5 and 10.
  • the concentration of glycerol may be, for example, between 10 and 70%.
  • the storage buffer additionally contains a reagent that can selectively react with SH groups, for example, iodoacetamide in concentration between 1 mmol / l and 500 mmol / l.
  • a polymerase modified in this way can be used instead of Klenow fragment Exo minus the DNA polymerase in reactions with nuc macromolecules.

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Struktur, die Herstellung und die Verwendung modifizierter Nukleotid- und Nukleostdbausteine, die "Nuk-Makromoleküle".

Description

Makromolekulare Nukleotidverbindungen und Methoden zu deren Anwendung
Beschreibung der Erfindung
1. Einführung
1.1 Einordnung in das technologische Feld
In einer Ausführung bezieht sich die Erfindung auf die Struktur, die Herstellung und die Verwendung modifizierter Nukleotid- und Nukleosidbausteine, im folgenden „Nuk- Makromoleküle".
1.2 Stand der Technik: Niedermolekulare Stoffe spielen eine wichtige Rolle in lebendigen Organismen. Sie dienen Beispielsweise als Bausteine von Polymeren, als Botenstoffe, als Energieträger. In der Diagnostik werden sie zur Bestimmung von medizinisch relevanter Parameter eingesetzt. Dabei werden diese Stoffe oft mit bestimmten Signal-Trägern markiert. Ein Beispiel für die niedermolekularen Stoffe bieten Nukleotide und Nukleoside.
Sie spielen ebenfalls eine zentrale Rolle in unterschiedlichen Stoffwechselvorgängen der lebenden Organismen ("Biochemie und Pathobiochemie", G. Löffler, 2003) und stellen in der modernen Biotechnologie verbreitete Elemente dar ("Molecular-Cloning", J. Sambrook, band 1-3, 2001, ISBN 0-87969-576-5), beispielsweise für künstliche Detektionssysteme ("DNA Microarrays", Bowtell, 2003, ISBN 0-87969-624-9, "Microarray-Biochip Technology" M Schena, 2000, ISBN 1-881299-37-6). Aus diesem Grund werden modifizierte Nukleotide, Nukleotid-Analoga, in unterschiedlichen Bereichen der Biotechnologie, Medizin und Pharmakologie eingesetzt ("Nucleotide Analogs" Scheit, 1980, ISBN 0-471-04854-2, "Nucleoside and Nucleic Acid Chemistry", Kisakürek 2000, "Anti-HIV Nudeosides" Mitsuya, 1997, "Nucleoside Analogs in Cancer therapy", Cheson, 1997).
Eines der wichtigsten Felder der modernen Life-Science sind Analysen der Nukleinsäuren. Ein großer Bereich dieser Analysen befasst sich mit dem Nachweis der Nukleinsäuren oder deren Bestandteilen im biologischen Präparat. In vielen Fällen wird zu diesem Zweck ein Reaktionspartner markiert, der mit der zu analysierenden Nukleinsäure reagieren kann. Dem Fachmann sind unterschiedliche Möglichkeiten zur Markierung der Nukleinsäuren bekannt. Einerseits können einzelne Nukleinsäurebausteine, Nukleotide bzw. Nukleoside modifiziert sein, andererseits können kurze Fragmente von Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder Polynukleotide zum Nachweis eingesetzt werden.
Konventionell modifizierte Nukleotide sind beispielsweise in Lee et- al. Nucleic acid research 1992, V. 20, S.2471; Augustin et. al. J. Biotechnology 2001 V. 86, S.289- 301; US Patent 4828979; Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30, S. 3857 beschrieben. Diese Nukleotide haben einen niedermolekularen detektierbaren Teil, der direkt (wie beispielsweise ein Fluoreszenzfarbstoffmolekül) oder indirekt detektiert werden kann (wie beispielsweise bei einem Biotin-Molekül, das erst nach Kopplung mit einem Streptavidin-Farbstoff-Konjugat nachgewiesen wird). Solche Nukleotide stellen Beispiele für die Stand der Technik der Nukleotid-Modifikationen dar. Viele modifizierte Nukleotide können kommerziell erworben werden, z.B. von NEN Life Science Products ( Biotin-11-dUTP, DNP-11-dATP, Fluorescein-12-dCTP), von Amersham Bioscience ( dCTP-Cy3, . dCTP-Cy5) oder von Roche (Biotin-16-dUTP). Entsprechende Nachweisreagenzien, z.B. markiertes Streptavidin, markierte Antikörper, können von den selben Anbietern bezogen werden.
Zur Vereinfachung der Darstellung werden im Folgenden modifizierte Nukleotide besprochen. Einem Fachmann sollte es naheliegend erscheinen, dass auch modifizierte Nukleoside für die enzymatische und nicht enzymatische Synthesen eingesetzt werden können, konventionell modifizierte Nukleoside sind erhältlich beispielsweise bei Trilink Biotechnologies oder Eurogentec. Konventionell modifizierte Nukleotide haben ein äquimolares Verhältnis zwischen der Nukleotid-Komponente und dem niedermolekularen detektierbaren Teil, z.B. Farbstoff- Molekül bzw. Biotin-Molekül. Zwischen beiden Teilen liegt ein Linker mit einer durchschnittlichen Länge von 5 - 30 Atomen.
Solche Nukleotide können von Polymerasen in den wachsenden Strang eingebaut werden und somit ein signaltragendes Molekül (Farbstoff) oder signalvermittelndes Molekül (Biotin oder Digoxigenin) in die Nukleinsäurekette einführen. Nach dem Einbau von modifizierten Nukleotiden kann die Signaldetektion im Fall von farbstoffmarkierten Nukleotiden direkt erfolgen oder nach Inkubation mit einem sekundären signaltragenden Molekül (z.B. Strepavidin-Farbstoff-Konjugat im Fall von Biotin), wenn signalvermittelnde Moleküle verwendet werden. Die nachträgliche Kopplung der signaltragenden Moleküle, wie Streptavidin, erfolgt oft mit unzureichenden Ausbeuten von 20-60%. Sehr oft werden bei der Markierung der Nukleinsäuren Signalvervielfältigungsschritte eingesetzt. Diese können auf unterschiedlichen Stufen der Analyse durchgeführt werden. Beispiele dafür stellen Materialvervielfältigung (PCR), mehrfacher Einbau von markierten Nukleotiden, mehrstufige nachträgliche Markierung von Biotin-Nukleotiden ("Molecular-Cloning", J. Sambrook, Band 1-3, 2001, ISBN 0-87969-576-5). Diese Verfahren führen zu einer Verzerrung der Signale, da sie aus mehreren, oft ungenügend kontrollierten Schritten bestehen, die mit unterschiedlichen Ausbeuten ablaufen und von vielen Faktoren beeinflusst werden können.
Bestimmte Verfahren, beschrieben beispielsweise in Seeger WO 0018956, Kartalov
WO02072892, sind auf die Detektion der Signale von einzelnen Nukleotid-Molekülen angewiesen. Beim Einsatz konventioneller Nukleotide beeinflussen mehrere Phänomene wie z.B. das Ausbleichen der Farbstoffe oder Blinking die Ergebnisse der Einzelmoleküldetektion. Für solche Verfahren bedeutet eine Steigerung von Signalstärke und Intensität der Nukleotidmarkierung eine Verringerung der Fehlerrate bei der Detektion.
Es besteht somit ein Bedarf an modifizierten Nukleotiden oder Nukleosiden mit einer verbesserten signalgebenden oder signalvermittelnden Wirkung, insbesondere für deren Einsatz zur Markierung von Nukleinsäuren bei der Nukleinsäureanalyse.
Aufgaben der Erfindung:
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist folglich die Bereitstellung von modifizierten Nukleotiden oder Nukleosiden, die ihre Substrateigenschaften für Polymerasen oder andere Enzyme beibehalten und nach ihrem Einbau in die Nukleinsäuren eine verbesserte Signalintensität bei deren Analyse gewährleisten.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren zur Markierung von Nukleinsäuren mit erfindungsgemäß modifizierten Nukleotiden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt in einer Ausführungsform eine neue Klasse an modifizierten Nukleotiden, die Nuk-Makromoleküle. Nuk-Makromoleküle sind dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere Nukleotid-Komponenten mit einem oder mehreren signalgebenden oder signalvermittelnden makromolekularen Komponenten (Marker) über einen Linker verbunden sind. Die jeweilige Nuk-Komponente bewahrt in einem Nuk-Makromolekül seine Substratfunktion für Enzyme. Eine signalgebende makromolekulare Komponente trägt beispielsweise mehrere Farbstoffmoleküle. / Nuk-Makromoleküle können wie konventionell modifizierte Nukleotide in verschiedenen Bereichen der Biotechnologie und Medizin verwendet werden. Im Folgenden sollte lediglich als Beispiel deren Einsatz für die Nukleinsäuremarkierung dargestellt werden. Andere Einsatzbereiche der Nuk-Makromoleküle sind dem Fachmann bereits bekannt s.o.
1.3 Begriffe / Definitionen:
1.3.1. Makromolekulare Verbindung - ein Molekülr oder ein Molekülkomplex, oder ein Nanokristall oder ein Nanoteilchen, dessen Masse zwischen 2kDa und 2OkDa, 2kDa und 5OkDa, 2kDa und 10OkDa, 10OkDa und 20OkDa, 20OkDa und 100OkDa oder IMDa und 100MDa oder 100 MDa und 100GDa liegt. Beispiele für makromolekulare Verbindungen sind Nukleinsäuren, wie Oligonukleotide mit einer Länge von mehr als 10 Nukleotiden, Polynukleotide, Polypeptide, Proteine oder Enzyme, Quantum Dots, Polymere wie PEG, Mowiol, Dextran, Polyacrylat, Nanogold-Partikel aber auch Komplexe, die aus mehreren Makromolekülen bestehen.
1.3.2. Niedermolekulare Verbindung - ein Molekül oder ein Molekülkomplex, dessen Masse kleiner 2000 Da (2kDa) beträgt, z.B. Biotin, natürliche Nukleotide, dATP, dUTP, viele Farbstoffe, wie Cy3, Rhodamine, Fluorescein und konventionell modifizierte Nukleotide, wie Biotin-16-dUTP.
1.3.3. Ein Nuk-Makromolekül im Sinne dieser Anmeldung ist eine chemische Struktur, die eine oder mehrere Nuk-Komponenten, eine oder mehrere Linker- Komponenten und eine Marker-Komponente einschließt, Fig. 1 oder 2:
(Nuk-Linker)n-Marker
wobei:
Nuk - eine Nuk-Komponente ist
Linker - eine Linker-Komponente ist
Marker - eine Makrer-Komponente ist n - eine Zahl von 1 bis 1000 ist
In einer Ausführungsform der Erfindung ist Linker wasserlöslich. Seine
Zusammensetzung ist nicht eingeschränkt, solange die Substrat-Eigenschaften der
Nukleotide nicht verloren gehen. Seine Länge liegt zwischen 2 und 100.000 Atome. In einer weiteren Ausführungsform besteht die Linker-Komponente aus einer Kopplungseinheit L für die Kopplung des Linkers an die Nuk-Komponente, aus einem wasserlöslichen Polymer und aus einer Kopplungseinheit T für die Kopplung des Linkers an die Marker-Komponente. In dieser bevorzugten Ausführungsform hat ein Nuk-Makromolekül folgende Struktur, Fig. 1 oder 2:
(Nuk-L- Polymer-T)n-Marker
wobei:
Nuk - ein Nukleotid- oder ein Nukleosid-Monomer ist (Nuk-Komponente)
L - ein Teil des Linkers ist, das die Verbindung zwischen Nuk und dem
Linkerrest darstellt (Kopplungseinheit L)
T - ein Teil des Linkers ist, das die Verbindung zwischen dem Linkerrest und dem Marker darstellt (Kopplungseinheit T)
Polymer - ein Teil des Linkers ist, das ein wasserlösliches Polymer mit einer durchschnittlichen Länge zwischen 5 und 100.000 Atome ist (Kopplungseinheit L, Polymerlinker, Kopplungseinheit T sind bei dieser Ausführungsform als Linker-Komponente zusammengefaßt) Marker - eine Marker-Komponente n - eine Zahl von 1 bis 1000, wobei (n) einen durchschnittlichen Wert darstellen kann.
1.3.3.1 Nuk-Komponente Nuk-Komponente kann sowohl ein Nukleotid als auch ein Nukleosid darstellen. Im folgenden werden bei der Beschreibung Nukleotide betrachtet. Einem Fachmann sollte es naheliegend erscheinen, dass auch Nukleoside in entsprechender Weise modifiziert und in entsprechenden Reaktionen werden können.
In einer Ausführungsform ist Nuk-Komponente ein Nukleotid- oder ein Nukleosid- Monomer, das mit der Linker-Komponente gekoppelt ist. Prinzipiell können alle als Substrat für Nukleotid-akzeptierende Enzyme geeigneten konventionellen Nukleotid- Varianten als Nuk- Komponente des Nuk-Makromoleküls dienen, so dass sowohl natürliche als auch modifizierte Nukleotide (Nukleotid-Analoga) für die Nuk- Komponente in Frage kommen. Bei modifizierten Nukleotiden können Base-, Zuckeroder Phosphat-Teile modifiziert werden, Fig. 3. Viele Beispiele für Nukleotid- Modifikationen sind dem Fachmann bekannt ("Advanced organic chemistry of nucleic acids", 1994, Shabarova, ISBN 3-527-29021-4, "Nucleotide Analogs" Scheit, 1980, ISBN 0-471-04854-2, "Nucleoside and Nucleic Acid Chemistry", Kisakürek 2000, "Anti- HIV Nucleosides" Mitsuya, 1997, "Nucleoside Analogs in Cancer therapy", Cheson, 1997) im Text werden auch weitere Beispiele für die Modifikationen der Nukleotide angegeben. Die Nuk-Komponente schließt vorzugsweise eine Base-Komponente (Base), eine Zucker-Komponente (Zucker) und wahlweise eine Phosphat-Komponente (Phosphat) ein. Base, Zucker und Phosphat können modifiziert sein, d.h. die Grundstruktur sieht den natürlichen Nukleotiden oder Nukleosiden ähnlich, trägt aber beispielsweise zusätzliche chemische Gruppen. Beispiele für Kombinationen aus verschiedenen Komponenten sind dem Fachmann bekannt. Solche Nuk-Komponenten können in vielen enzymatischen und chemischen Reaktionen eingesetzt werden (G. Wright et al. Pharmac.Ther. 1990, V. 47, S. 447-).
In einer anderen Ausführungsform ist eine Nuk-Komponente mit weiteren Nukleotiden gekoppelt, z.B in einer Nukleinsäurekette. Dabei tritt die Nuk-Komponente als ein Monomer eines Polymers auf.
1.3.3.1.1 Variationen am Phosphat
In einer Ausführungsform stellt die Nuk-Komponente ein Nukleosid dar. In einer anderen Ausführungsform stellt die Nuk-Komponente ein Nukleosid-Monophosphat dar. In einer anderen Ausführungsform stellt die Nuk-Komponente ein Nukleosid- Diphosphat dar. In einer weiteren Ausführungsform stellt die Nuk-Komponente ein Nukleosid-Triphosphat dar. Auch höhere Phosphat-Derivate (Tetraphosphat usw.) können verwendet werden. Die genannten Phosphatmodifikationen können wie bei Nukleosid-Triphosphaten an der 5' -Position oder auch an anderen Positionen des Zucker-Teils des Nukleotides sitzen, beispielsweise an der 3Λ -Position.
Wahlweise kann die Phosphat-Komponente Modifikationen einschließen, solche Modifikationen schließen beispielsweise in einer Ausführungsform einen Linker ein (D. Jameson et al. Methods in Enzymology 1997, V. 278, S. 363-, A. Draganescu et al. 3. Biol.Chem. 2000 v.275, 4555-). In einer werteren Ausführungsform schließt die Phosphat-Komponente der Nuk-Komponente Thiotriphosphat-Verbindungen ein (Burges et al. PNAS 1978 v. 75, S. 4798-). In einer weiteren Ausführungsform schließt die Phosphat-Komponente der Nuk- Komponente geschützte Phosphat-Gruppen (z.B. Phosphoroamidite) ein.
In einer Ausführungsform stellt die Phosphat-Komponente die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente der Nuk-Makromoleküle dar. 1.3.3.1.2 Variationen an der Base
Die Nuk-Komponente kann ein in der Natur in den Nukleinsäuren vorkommendes Nukleotid oder Nukleosid oder seine Analoga darstellen, vorzugsweise die an Watson- Crick-Paarbildung teilnehnem, beispielsweise Adenin, Guanin, Thymin, Cytosin, Uracil, Inosin, oder eine modifizierte Base, wie z.B. 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanin, 6-Thio- adenin, einschließen, Literatur s. oben. Wahlweise kann die Base Modifikationen einschließen, solche Modifikationen schließen beispielsweise in einer Ausführungsform einen an die Base gekoppelten Linker wie beispielsweise ein Amino-propargyl-Linker oder ein Amino-Allyl-Linker ein, weitere Beispiele für die Linker sind bekannt (Ward et al. US Pat 4711955, G. Wright et al. Pharmac.Ther. 1990, V. 47, S. 447-, Hobbs et al. US Patent 5.047.519 oder andere Linker z.B. Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US pat. 6211158, US pat. 4804748, EP 0286028, Hanna M. Method in Enzymology 1996 v.274, S.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 S.3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nnucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Short US Pat. 6579704, Odedra WO 0192284). In einer Ausführungsform stellt der an die Base gekoppelte Linker die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker- Komponente der Nuk-Makromoleküle dar. Weitere Modifikationen an der Base sind beispielsweise im Katalog von Trilink Biotechnologies, Inc. San Diego, USA, Ausgabe 2003 auf Seite 38 aufgeführt.
1.3.3.1.3 Variationen am Zucker
Dem Fachmann sind verschiedene Variationen der Zucker-Komponente der Nukleotide bekannt, die z.B. in der Diagnostik, Therapie oder Forschung eingesetzt werden. Solche Variationen schließen z.B. Ribose , 2" -Deoxyribose oder 2 ',3" -Dideoxyribose ein. Wahlweise kann die Zucker-Komponente Modifikationen einschließen (M. Metzger et al. Nucleic Acid Research 1994, V. 22, 4259-, Tsien WO 91/06678), solche Modifikationen schließen beispielsweise in einer Ausführungsform einen Linker ein. Die modifizierende Gruppe oder Linker kann beispielsweise reversibel an die Zucker- Komponente gekoppelt sein (Hovinen et al. J.Chem.Soc.Prking Trans. 1994, S. 211-, Canard US Pat. 5798210, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Ju et al. US Pat. 6664079, Fahnestock et al. WO 91066678, Cheeseman US Pat. 5302509, Parce et al. WO 0050642, Milton et al. WO 2004018493, Milton et al. 2004018497). In einer Ausführungsform stellt der an die Zucker-Komponente gekoppelte Linker die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente der Nuk- Makromoleküle dar. In einer weiteren Ausführungsform schließt die Zuker-Komponente z.B. folgende Modifikationen ein: wahlweise kann die 3 '- oder die 2 '-OH-Gruppen durch folgende Atome oder Gruppen ersetzt werden: Halogenatome, Wasserstoff, Amino-, Merkapto- oder Azido-Gruppe (Beabealashvilli et al. Biochem Biophys Acta 1986, v.868, 136-, Yuzhanov et al. FEBS Lett. 1992 v. 306, 185-).
In einer weiteren Ausführungsform schließt die Nuk-Komponente azyklische Nukleotid- oder Nukleosid-Modifikationen ein ( A. HoIy Current Pharmaceutical Design 2003 v. 9, 2567-, G. Wright et al. Pharmac.Ther. 1990, V. 47, S. 447-). In einer weiteren Ausführung kann die Zucker-Komponente eine Doppeltbindung einschließen.
In der Anmeldung werden 2" -Deoxynukleotide, beispielsweise 2* -Deoxyuridin- Triphosphat, 2* -Deoxycytidin-Triphosphat, 2* -Deoxyadenosin-Triphosphat, 2' - Deoxyguanosin-Triphosphat als dUTP, dCTP, dATP und dGTP bezeichnet.
1.3.3.1.4 Kopplung von NT und Linker
Die Nuk-Komponente ist an einer Kopplungsstelle mit dem Linker verbunden. Die Kopplungsstelle des Linkers an die Nuk-Komponente kann sich an der Base, am Zucker (Ribose bzw. Deoxyribose), oder am Phosphat-Teil befinden.
Die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und der Nuk-Komponente ist vorzugsweise kovalent.
Wenn die Kopplungsstelle an der Base liegt, so befindet sie sich vorzugsweise an den Positionen 4 oder 5 bei Pyrimidin-Basen und an den Positionen 6,7,8 bei den Purin- Basen (Ward et al. US Pat 4711955, G. Wright et al. Pharmac.Ther. 1990, V. 47, S. 447-, Hobbs et al. US Patent 5.047.519 oder andere Linker z.B. Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US pat. 6211158, US pat. 4804748, EP 0286028, Hanna M. Method in Enzymology 1996 v.274, S.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 S.3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Short US Pat. 6579704, Odedra WO 0192284). Am Zucker können die Positionen 2\ 3" , 4" oder 5' die Kopplungsstellen darstellen. Die Kopplung an die Phosphatgruppen kann an der alpha, beta, oder gamma-Phosphatgruppe erfolgen. Beispiele für die Kopplungsstelle an der Base sind in Short WO 9949082, Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382 (siehe auch kommerziell erhältliche Nukleotide (Amersham, Roche), an der Ribose in Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, S. 586, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363, Canard US Pat. 5798210, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642., an Phosphatgruppen in Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363 beschrieben.
Die Position der Kopplungsstelle hängt vom Einsatzgebiet der NT-Makromoleküle ab. So werden beispielsweise für die Markierung von Nukleinsäuren, die am Nukleinsäurestrang verbleiben soll, vorzugsweise Kopplungsstellen am Zucker oder an der Base verwendet. Die Kopplung an die Gamma- oder Beta-Phosphatgruppen kann beispielsweise dann erfolgen, wenn die Markierung beim Einbau des Nuk- Makromoleküls freigesetzt werden soll.
Die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente erfolgt beispielsweise über eine Kopplungseinheit (L), die ein Teil der Linker-Komponente ist.
Die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker kann in einer Ausführungsform widerstandsfähig sein, z.B. bei Temperaturen bis zu 1300C, für pH- Bereiche zwischen 1 und 14, und/oder resistent gegen hydrolytische Enzyme (z.B. Proteasen, Esterasen) sein. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker unter milden Bedingungen spaltbar.
Diese spaltbare Verbindung ermöglicht die Entfernung der Linker- und der Marker- Komponenten. Dies kann beispielsweise in den Verfahren der Sequenzierung durch die Synthese von Bedeutung sein, wie Pyrosequencing, BASS (Canard et al. US Patent 5.798.210, Rasolonjatovo Nucleosides & Nucleotides 1999, V.18 S.1021, Metzker et al. NAR 1994, V.22, S.4259, Welch et al. Nucleosides & Nucleotides 1999, V.18, S.19, Milton et al. WO 2004018493, Odedra at al. WO 0192284) oder Single molecule sequencing, Tcherkassov WO 02088382. Ihre Wahl ist nicht eingeschränkt, sofern sie unter den Bedingungen der enzymatischen Reaktion stabil bleibt, keine irreversible Störung der Enzyme (z.B. Polymerase) verursacht und unter milden Bedingungen abgespalten werden kann. Unter "milden Bedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, die zum Beispiel Nukleinsäure-Primer-Komplexe nicht zerstören, wobei z.B. der pH-Wert vorzugsweise zwischen 3 und 11 und die Temperatur zwischen 00C und einem Temperaturwert (x) liegt. Dieser Temperaturwert (x) hängt von der Tm des Nukleinsäure-Primer-Komplexes (Tm ist der Schmelzpunkt) und wird beispielsweise als Tm (Nukleinsäure-Primer-Komplex) minus 5°C errechnet (z.B. Tm ist 47°C, dann liegt die maximale Temperatur bei 420C; unter diesen Bedingungen eignen sich besonders Ester-, Thioester-, Acetale, Phosphoester-, Disulfid-Verbindungen und photolabile Verbindungen als spaltbare Verbindungen). Vorzugsweise gehört die genannte spaltbare Verbindung zu chemisch oder enzymatisch spaltbaren oder photolabilen Verbindungen. Als Beispiele von chemisch spaltbaren Gruppen sind Ester-, Thioester-, Disulfid-, Acetal-Verbindungen bevorzugt (Short WO 9949082, „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc., Herman et al. Method in Enzymology 1990 V.184 S.584, Lomant et al. J.Mol.Biol. 1976 V.104 243, "Chemistry of carboxylic acid and esters" S.Patai 1969 Interscience Publ.). Beispiele für photolabile Verbindungen können in folgenden Literaturstellen gefunden werden: Rothschild WO 9531429, "Protective groups in organic synthesis" 1991 John Wiley & Sons, Inc., V. Pillai Synthesis 1980 S.l, V. Pillai Org. Photochem. 1987 V.9 S.225, Dissertation „Neue photolabile Schutzgruppen für die lichtgesteuerte Oligonucleotidsynthese" H.Giegrich, 1996, Konstanz, Dissertation „Neue photolabile Schutzgruppen für die lichtgesteuerte Oligonucleotidsynthese" S.M. Bühler, 1999, Konstanz)..
1.3.3.1.5 Zahl der gekoppelten Nuk-Komponenten
In einer Ausführungsform der Erfindung ist pro ein Nuk-Makromolekül nur eine Nuk- Komponente gekoppelt. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind mehrere Nuk- Komponenten pro Nuk-Makromolekül gekoppelt. Mehrere Nuk-Komponenten können einheitlich oder unterschiedlich sein, wobei beispielsweise durchschnittlich 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 25, 25 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 250, 250 bis 500, 500 bis 1000 Nuk-Komponenten pro ein Nuk-Makromolekül gekoppelt sein können.
1.3.3.2 Linker-Komponente Die Bezeichnung Linker oder Linker-Komponente wird synonym in der Anmeldung verwendet und bezieht sich auf den gesamten strukturellen Abschnitt des Nuk- Makromoleküls zwischen der Nuk-Komponente und der Marker-Komponente. Der Linker ist vorzugsweise wasserlöslich. Die genaue Linkerzusammensetzung ist nicht eingeschänkt und kann variieren.
In einer bevorzugten Form haben Nuk-Makromoleküle einen kurzen Linker. Seine Länge beträgt zwischen 2 und 30 Kettenatomen. Solche Linker können funktionelle Gruppen tragen, wie beispielsweise Amino-, Carboxy-, Mercapto- und Hydroxygruppen. An diese Gruppen können weitere Moleküle, z.B. Makromoleküle, wie wasserlösliche Polymere, gekoppelt werden. Beispiele von kurzen Linkern gekoppelt an Nukleotide sind dem Fachmann bekannt (Ward et al. US Pat 4711955, G. Wright et al. Pharmac.Ther. 1990, V. 47, S. 447-, Hobbs et al. US Patent 5.047.519 oder aridere Linker z.B. Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US pat. 6211158, US pat. 4804748, EP 0286028, Hanna M. Method in Enzymology 1996 v.274, S.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 S.3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Short US Pat. 6579704, Odedra WO 0192284). Der Linker kann eine oder mehrere Einheiten von wasserlöslichen Polymeren enthalten, wie beispielsweise Aminosäuren, Zucker, PEG-Einheiten oder Carbonsäuren. Weitere Beispiele für kurze Linker kann die Kopplungseinheit (L) eines langen Linkers dienen s.u. Linker mit der Longe zwischen 2 und 20 Atome, werden vorzugsweise in Nuk- Makromolekülen eingesetzt, deren Marker-Komponente lineare wasserlösliche Polymere aufweist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein langer Linker eingesetzt, mit eine Länge von mehr als 30 Ketten-Atomen.
Nachfolgend werden Beispiele für die Zusammensetzung der Linker angeführt.
1.3.3.2.1 Linker-Bestandteile
Die Linker-Komponente stellt einen Teil des Nuk-Markromoleküls dar, der zwischen der jeweiligen Nuk-Komponente und der Marker-Komponente liegt.
Die Linker-Komponente hat in ihrer Struktur beispielsweise folgende Bestandteile:
1) Kopplungseinheit L
2) wasserlösliches Polymer
3) Kopplungseinheit T
Die Aufteilung der Linker-Komponente in einzelne Bestandteile ist rein funktionell und soll lediglich der Anschaulichkeit der Struktur dienen. Je nach Betrachtungsweise können einzelne Strukturen des Linkers zum einen oder zum anderen Bestandteil gerechnet werden.
Die Kopplungseinheit L hat die Funktion, die Linker-Komponente und die Nuk- Komponente zu verbinden. Bevorzugt sind kurze, unverzweigte Verbindungen, von 1 bis 20 Atome in- der Länge. Die jeweilige Struktur der Kopplungseinheit L hängt von der Kopplungsstelle des Linkers an das Nukleotid und von dem jeweiligen Polymer des Linkers ab. Einige Beispiele für die Kopplungseinheiten L sind in Beispielen 1 bis 33 angegeben. Viele konventionell modifizierte Nukleotide tragen einen kurzen Linker, diese kurzen Linker dienen als weitere Beispiele für die Kopplungseinheit L, z.B. kurze Linker an der Base: Short WO 9949082, Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382(siehe auch kommerziell erhältliche Nukleotide (Amersham, Roche), kurze Linker an der Ribose in Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, S. 586, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363, Canard US. Pat. 5798210, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Ju et al. US Pat. 6664079, Parce WO 0050642., kurze Linker an Phosphatgruppen in Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S-. 363 . Noch weitere Beispiele für die Kopplungseinheit L sind nachfolgend angegeben:
R6-NH-R7, R6-O-R7, R6-S-R7, R6-SS-R7, R6-CO-NH-R7, R6-NH-CO-R7, R6-CO-O-R7, R6-O-CO-R7, R6-CO-S-R7, R6-S-CO-R7, R6-P(O)2-R7, R6-Si-R7, R6-(CH2VR?,
R6-(CH2)n-R7, R6-A-(CH2)n-R7, R6-(CHz)n-B-R7, R6-(CH=CH-)n-R7, R6-(A-CH=CH-)n-R7, R6-(CH=CH-B-)n-R7, R6-A-CH=CH-(CH2-)n"R7, R6-(-CH=CH-CH2)n-B-R7, R6-(-CH=CH-CH2-CH2)n-B-R7, R6-(OO)n-R7, R6-(A-CaO)n-R7, R6-(C≡C-B-)n-R7, R6-A-C≡C-(CH2-)n-R7, R6-(-C≡C-CH2)n-B-R7, R6-(-C=C-CH2-CH2)n-B-R7,
wobei R6 - die Nuk-Komponente ist, R7 - de Polymer ist und A und B folgende strukturelle Elemente einschließen: -NH-, -O-, -S-, -SS-, -CO-NH-, -NH-CO-, - CO-O-, -0-C0-, -CO-S-, -S-CO-, -P(O)2-, -Si-, -(CH2)n-, eine photolabile Gruppe, wobei n - gleich 1 bis 5 ist
Die Kopplungseinheit L ist auf einer Seite mit der Nuk-Komponente, auf der anderen mit Polymer kovalent verbunden. Die Art der Kopplung hängt von der Art des Polymers ab. In bevorzugter Form hat das Polymer an seinen Enden reaktive Gruppen, beispielsweise NH2 (Amino), OH (Hydroxy), SH (Mercapto), COOH (Carboxy), CHO (Aldehyd), Acryl- oder Maleimid, Halogen-Gruppen. Solche Polymere sind käuflich erwerblich (z.B. Fluka). Einige Varianten für die Kopplung von Polymeren an die Kopplungseinheiten sind unter Beispielen 1 bis 33 angegeben.
Das wasserlösliche Polymer bildet in einer bevorzugten Ausführungsform den Hauptanteil der Linker-Komponente. Es ist ein Polymer, vorzugsweise hydrophil, bestehend aus gleichen oder unterschiedlichen Monomeren. Beispiele für geeignete Polymere stellen Polyethylen-glycol (PEG), Polyamide (z.B. Polypeptide), Polysaccharide und deren Derivate, Dextran und seine Derivate, Polyphosphate, Polyacetate, Poly(alkyleneglycole), Kopolymere aus Ethylenglycol und Propylenglycol, Poly(olefinische Alkohole), Poly(Vinylpyrrolidone), Poly(Hydroxyalkylmethacrylamide), Poly(Hydroxyalkylmethacrylate), Poly(x-Hydroxy-Säuren), Poly-Acrylsäure und ihre Derivate, Poly-Acrylamide in ihre derivate, Poly(Vinylalkohol), Polylactat Saure, polyglycolic Säure, PolyCepsilon-caprolactone), Poly(beta-hydroxybutyrate), Poly(beta- hydroxyvalerate), Polydioxanone, Poly(ethylene terephthalate), Poly(malic Säure), Poly(tartronic Säure), Poly(όrtho ester), Polyanhydride, Polycyanoacrylate, Poly(phosphoester), Polyphosphazene, Hyaluronidate, Polysulfones.
Dieses Polymer schließt in einer Ausführungsform verzweigte oder weiteren Ausführungsform nicht verzweigte Polymere ein. Das Polymer kann aus mehreren unterschiedlich langen Abschnitten bestehen, wobei jeder Abschnitt aus gleichen Monomeren besteht und Monomere in unterschiedlichen Abschnitten unterschiedlich sind. Einem Fachmann sollte naheliegend erscheinen, dass für einen makromolekularen Linker meistens nur eine durchschnittliche Masse bestimmt werden kann, so dass die Angaben zu den Molmassen einen Mittelwert darstellen ("Makromoleküle, Chemische Struktur und Synthesen", Band 1, 4, H. Elias, 1999, ISBN 3-527-29872-X). Aus diesem Grund kann für Nuk-Makromoleküle oft keine exakte Massenangabe gemacht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schließt die Linker-Komponente ein lineares, nicht verzweigtes Polymer ein und trägt keine sterisch anspruchsvollen chemischen Strukturen, wie beispielsweise Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, Liganden. Solche Linker ermöglichen eine geringe sterische Hinderung der enzymatischen Erkennung der Nuk-Komponenten.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Polymer der Linker-Komponente linear, die Linker-Komponente trägt jedoch eine oder mehrere sterisch anspruchsvollen chemischen Strukturen, wie beispielsweise Farbstoffe. Die Einführung der sterisch anspruchsvollen Gruppen erlaubt bei manchen Verfahren eine Kontrolle der enzymatischen Reaktion (Tcherkassov WO 02088382). Weitere Beispiele für sterisch anspruchsvolle Gruppen sind im Abschnitt 1.3.19 angegeben.
Sterisch anspruchsvollen Liganden bzw. Strukturen können an unterschiedliche Linker- Abschnitte gekoppelt sein. Die durchschnittliche Zahl der an den Linker gekoppelten sterisch anspruchsvollen Liganden kann variieren und liegt beispielsweise zwischen 1 und 3, 3 und 5, 5 und 20, 20 und 50. Die Kopplung von sterisch anspruchsvollen Gruppen sollte die Tatsache berücksichtigen, dass eine raumfordernde Struktur in der Nähe der Nukleotid-Komponente zur Aufhebung der Substrateigenschaften führen kann, s. Beispiel 25. Sterisch anspruchsvolle Liganden können gleichmäßig oder zufällig über die gesamte Länge des Linkers gekoppelt sein, oder in einem bestimmten Abstand von der Nuk-Komponte am Linker gekoppelt sein. Der Abstand zwischen der Nuk-Komponente und dem sterischen Hindernis beträgt beispielsweise 10 bis 15, 15 bis 20, 20 bis 25, 25 bis 30, 30 bis 35, 35 bis 40, 40 bis 45, 45 bis 50, 50 bis 55, 55 bis 60, 60 bis 70, 70 bis 80, 80 bis 90, 90 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 1000, 1000 bis 5000 Kettenatome. Die sterisch anspruchsvolle Gruppe kann als Teil des Linkers oder als Teil des Markers betrachtet werden. Die Betrachtugnsweise kann beispielsweise davon abhängen, ob sterisch anspruchsvolle Gruppe gewisse Signaleigenschaften aufweist oder nicht.
1.3.3.2.2 Linker-Länge Die durchschnittliche Linkerlänge beträgt zwischen 2 und 5, 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 30, 30 bis 40, 40 bis 50, 50 bis 60, 60 bis 70, 70 bis 80, 80 bis 90, 90 bis 100, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 10.000, 10000 bis 100000 Atome (gezählt werden Ketten-Atome), somit beträgt die durchschnittliche Linker-Länge zwischen 2 und 5, 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 30, 30 bis 40, 40 bis 50, 50 bis 60, 60 bis 70, 70 bis 80, 80 bis 90, 90 bis 100, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 10.000, 10000 bis 100000 Angström (gemessen an einem potenziell maximal ausgestrecktem Molekül).
Falls ein Nuk-Makromolekül mehrere Linker-Komponenten einschließt, können diese Linker-Komponenten untereinander gleiche oder auch unterschiedlich lang sein.
Einige Abschnitte des Linkers können rigide Bereiche enthalten und andere Abschnitte können flexible Bereiche enthalten.
1.3.3.2.3 Linker-Kopplung in einem Nuk-Makromolekül
Der Linker ist an einer Seite an die Nuk-Komponente und auf der anderen Seite an die Marker-Komponente gebunden. Dazu kann der Linker an seinen Enden Kopplungseinheiten haben, die diese Funktion erfüllen. Die Verbindung mit der Nuk- Komponenten wurde oben erörtert. Die Verbindung zwischen dem Linker und der Marker-Komponenten erfolgt über Kopplungseinheit T. Bevorzugt sind kurze, unverzweigte Verbindungen, bis max. 20 Atome in der Länge. Die jeweilige Struktur der Kopplungseinheit T hängt von der Kopplungsstelle an der Marker-Komponente und von dem jeweiligen Polymer des Linkers. Die Kopplungseinheit T ist mit dem Polymer kovalent verbunden. Die Art der Kopplung hängt von der Art des Polymers ab. In bevorzugter Form hat das Polymer an seinen Enden reaktive Gruppen, beispielsweise NH2 (Amino), OH (Hydroxy), SH (Mercapto), COOH (Carboxy), CHO (Aldehyd), Acryl- oder Maleimid, Halogen-Gruppen. Solche Polymere sind kommerziell erhältlich (z.B. Fluka). Einige Beispiele für die Kopplungseinheiten L sind in Beispielen 1 /bis 33 angegeben, Weitere Beispiele für die chemische und affine Kopplungen s. in der Literatur: „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993, "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996.
Der Linker kann auch andere funktionelle Gruppen, bzw. Abschnitte enthalten, beispielsweise eine oder mehrere unter milden Bedingungen spaltbare Gruppen (Fig.9) s. Beispiele 22, 23, 24,31.
Eine spaltbare Verbindung innerhalb des Linkers ermöglicht eine Entfernung eines Teils des Linkers und der Marker-Komponente. Nach der Spaltung verbleibt ein Linker- Rest an der Nuk-Komponente, Beispiele für spaltbare Verbindungen sind im Abschnitt 1.3.3.1.4 angegeben.
1.3.3.3 Marker-Komponente
Die Marker-Komponente kann unterschiedliche Strukturen haben. Die Strukturen im einzelnen sind nicht eingeschränkt, solange sie die Substrateigenschaften der Nuk- Komponenten für Enzyme nicht aufheben. Diese Struktur hat vorzugsweise eine signalgebende oder eine signalvermittelnde Funktion. Der Marker kann auch andere Funktionen haben, beispielsweise strukturturelle, antitoxische oder affine Funktion (beispielsweise in Arzneimittel oder Zuberetungen).
1.3.3.3.1 Die Zusammensetzung der Marker-Komponente (Marker)
Der Marker schließt in einer Ausführung eine niedermolekulare Marker-Einheit ein. In einer weiteren Ausführungsform schließt der Marker eine makromolekulare Marker- Einheit ein. In einer weiteren Ausführungsform schließt der Marker mehrere niedermolekulare Marker-Einheiten ein. In einer weiteren Ausführungsform schließt der Marker mehrere makromolekulare Marker-Einheiten ein. In einer weiteren Ausführungsform schließt der Marker eine Kombination aus niedermolekularen und makromolekularen Einheiten ein. Die Marker-Einheiten können eine signalgebende oder signalvermittelnde Funktion haben.
Diese Einheiten können Moleküle mit geringer Molekularmasse, z.B. unter 2000 Da, oder auch selbst Makromoleküle sein. Dabei schließt die Zahl der signalgebenden oder signalvermittelnden Einheiten, die zu einer Marker-Komponenten zusammengefaßt sind, folgende Bereichen ein: 1 und 2, 2 und 5, 5 und 20, 20 und 50, 50 und 100, 100 und 500, 500 und 1000. 1000 und 10000, 10000 und 100000. Falls mehrere Marker-Einheiten in einem Marker zusammengefasst sind, sind diese Einheiten in einer Ausführungsform an ein Gerüst gebunden, die Kern-Komponente des Markers (Fig. 4b,c). Diese Kern-Komponente verbindet die Einheiten untereinander. Die Kern-Komponente kann die Verbindung zu einem oder mehreren Nuk-Linker-Komponenten herstellen (Fig 5). Die Kern-Komponente schließt niedermolekulare oder makromolekulare Verbindungen ein.
1.3.3.3.2 Struktur der signalgebenden oder der signalvermittelnden Einheiten des Markers Die strukturellen Marker-Einheiten schließen folgende Gruppen ein:
1.3.3.3.2.1 Strukturen mit niedriger Molmasse:
Biotin-Moleküle, Hapten-Moleküle (z.B. Digoxigenin), radioaktive Isotope (z.B. P32, J131), oder deren Verbindungen, seltene Erden , Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, Fluoreszenz-Quencher (z.B. Dabsyl) (viele dieser Moleküle sind kommerziell erhältlich z.B. von Molecular Probes, Inc., oder Sigma-Aldrich) mit gleichen oder unterschiedlichen spektralen Eigenschaften, Farbstoffe, die untereinander FRET eingehen. Thermochrome, photochrome oder chemolumineszente Substanzen (erhältlich z.B. bei Sigma-Aldrich), Chromogene Substanzen (z.B. als Substrate für Peptidasen beschrieben in „Proteolyse enzymes Tools and Targets", E. Sterchi, 1999, ISBN 3-540-61233-5).
Auch chemisch reaktive Gruppen, wie beispielsweise Amino-, Carboxy-, Merkapto-, Aldehyd-, Jodacetat-, Acryl-, Dithio-, Thioester-Verbindungen können als signalvermittelnde strukturelle Einheiten dienen (Fig. 6a). Nach dem Einbau können diese reaktiven Gruppen mit signalgebenden Elementen, wie beispielsweise Farbstoffe mit entsprechenden reaktiven Gruppen (beispielsweise NHS-Ester, Merkapto-, Amino- Gruppen) modifiziert werden (Fig. 6b). Allgemeine Grundlagen für die Wahl eines passenden Paares von reaktiven Gruppen sind in „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 dargestellt.
In einer speziellen Ausführungsform erfühlt die Kombination aus einer Nuk-Einheit, einer markomolekularen Linker-Komponente und einem Marker mit niedriger Molmasse bereits die Anforderungen der vorliegenden Erfindung. Solche Verbindungen sind ebenfalls Gegenstand dieser Erfindung. Sie können sowohl als Zwischenprodukte für die chemische Synthese von Nuk-Makromolekülen mit einem makromolekularen Marker, z.B. dUTP-PEG-Biotin, als auch selbständig in den enzymatischen Reaktionen verwendet werden, wie beispielsweise mit nur einem Farbstoff markierte Nukleotide. Als Farbstoffe können verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe auftreten, ihre Wahl ist nicht eingeschränkt, solange sie die enzymatische Reaktion nicht wesentlich beeinflußen. Beispiele für Farbstoffe sind Rhodamine (Rhodamin 110, Tetramethylrhodamin, erhältlich bei Fluka-Sigma), Cyan in- Farbstoffe (Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7 von Amersham Bioscience), Coumarine, Bodipy, Fluorescein, Alexa- Farbstoffe: z.B. Alexa 532, Alexa 548, Alexa 555 (Molecular Probes). Viele Farbstoffe sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von Molecular Probes Europe, Leiden, Niederlande (im weiteren als Molecucular Probes bezeichnet) oder von Sigma-Aldrich-Fluka (Taufkirchen, Deutschland). Beispiele für die Synthese eines Nuk-Makromoleküls mit einem niedermolekularem Marker ist in Beispiel 19, 20, 23, 36, 37, 38 angegeben.
In einer Ausführungsform schließt ein Marker mehrere Marker-Einheiten ein. Dabei können die Marker-Einheiten untereinander gleiche oder verschiedene Eigenschaften haben. Beispielsweise können Fluoreszenzfarbstoffe mit unterschiedlichen Spektraleigenschaften eingesetzt werden. In einer Ausführungsform werden Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt, die FRET-Paare bilden.
1.3.3.3.2.2 Strukturen mit hoher Masse (Makromoleküle)
1.3.3.3.2.2.1 Nanokristalle
Nanokristalle, z.B. Quantum Dots können als Marker-Einheiten auftreten. Dabei können in einer Marker-Komponente Quantum Dots mit gleichen oder unterschiedlichen spektralen Eigenschaften verwendet werden, US Pat. 6.322.901, US Pat. 6.423.551, US Pat. 6.251.303, US Pat. 5.990.479).
1.3.3.3.2.2.2 Nano oder Mikro-Teilchen.
Nano oder Mikro-Teilchen können als Marker-Einheiten auftreten, wobei die größten Ausmaße dieser Teilchen von lnm bis 2nm, von 2nm bis 5nm, von 5nm bis lOnm, von lOnm bis 20 nm, von 20nm bis 50nm, von 50nm bis lOOnm, von 100 nm bis 200nm, von 200nm bis 500nm, von 500nm bis lOOOnm, von 1000 nm bis 5000 nm betragen. Das Material der Teilchen können beispielsweise reine Metalle wie Gold, Silber, Aluminium, (beispielsweise Teilchen mit surface plasmon resonance ), - Protein- Au-Konjugate: J. Anal.Chem. 1998, V. 70,S. 5177, - Nukleinsäure-Au-Konjugaten: J. Am. Chem. Soc. 2001, V. .123, S.5164, J. Am. Chem. Soc. 2000, V. 122, S. 9071 Biochem. Biophys. Res. Commun 2000, V. 274, S. 817, Anal. Chem. 2001, V. 73, S. 4450), - Latex (z.B. Latex-IManopartikel, Anal. Chem. 2000,V. 72, S. 1979) - Kunststoff (Polystyrene), - paramagnetische Verbindungen / Gemische Zhi ZL' et al. Anal Biochem. 2003 JuI 15;318(2):236-43, Dressman D et al. Proc Natl Acad Sei U S A. 2003 JuI 22;100(15):8817-22„ - Metall-Teilchen, - magnetische Verbindungen / Gemische Jain KK. Expert Rev Mol Diagn. 2003 Mar;3(2): 153-61, Patolsky F et al. Angew Chem Int Ed Engl. 2003 May 30;42(21): 2372-2376, Zhao X et al. Anal Chem. 2003 JuI 15;75(14): 3144-51, Xu H et al. J Biomed Mater Res. 2003 Sep 15;66A(4): 870-9, JOSEPHSON Lee et al. US Pat. 2003092029, KLICHE KAY-OLIVER et al. WO0119405.
1.3.3.3.2.2.3 Proteinmoleküle, Proteinmoleküle können als Marker-Einheiten auftreten, wobei sie folgende Gruppen schließen: Enzyme (z.B. Peroxidase, alkalische Phosphotase, Urease, beta- Galaktosidase, Proteinasen), - fluoreszierenden Proteine (z.B. aus GFP-Protein-Familie oder Phycobiliproteine (z.B. Phycoerythrin, Phycocyanin), erhältlich z.B. von Molecular Probes Inc.), Antigen-bindende Proteine (z.B. Antikörper, Tetramere, Affibodies (Nord et. AI Nature Biotechnology, V. 15 (S.772-777) oder deren Bestandteile (z.B. Fab-Fragmente), Nukleinsäurebindende Proteine (z.B. Transcriptionsfaktor)
1.3.3.3.2.2.4 Nukleinsäureketten,
Die Nukleinsäureketten einschließlich der Gruppe, Oligonukleotide, modifizierte Oligonukleotide, können als Marker-Einheiten auftreten. Die Länge der
Nukleinsäureketten liegt vorzugsweise in folgenden Bereichen von 10 bis 20, von 20 bis 50, von 50 bis 100, von 100 bis 200, von 200 bis 500, von 500 bis 1000, 1000 bis 5.000, von 5.000 bis 10.000, von 10.000 bis 100.000 Nukleotiden. Es können
DNA, RNA, PNA-Moleküle verwendet werden. Nukleinsäureketten können zusäzliche Modifikationen tragen, wie beispielsweise freie Aminogruppen, Farbstoffe und andere signalgebende Moleküle, z.B. makromolekulare Stoffe, Enzyme oder Nanokristalle (Fig.
7a, c). Modifizierte Nukleinsäureketten sind kommerziell zugängig, z.B. MWG-Biotech.
Weitere Beispiele für Makromoleküle oder Makromolekülkomplexe, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Marker oder Marker-Einheiten in der Marker-Komponente für die Signalverstärkung eingesetzt werden können, sind in US Pat. 4882269, US Pat.
4687732, WO 8903849, US Pat. 6017707, US Pat. 6627469 beschrieben.
Auch anderen Marker-Einheiten, wie Lektine; Wachstumsfaktoren, Hormone, Rezeptor- Moleküle können eingesetzt werden. 1.3.3.3.3 Die Kern-Komponente der Marker-Komponente
Die Kernkomponente hat die Funktion mehrere strukturelle Elemente der Nuk- Makromoleküle zu binden. Beispielsweise bindet die Kern-Komponente mehrere Marker-Einheiten zusammen. In einer weiteren Ausführungsform können Linker- Komponenten an die Kern-Komponente gebunden werden s. Fig. 5. Der Begriff der Kern-Komponente ist funktionell und dient zur Erläuterung von möglichen Strukturen von Nuk-Makromolekülen. Unterschiedliche chemische Strukturen, die Linker und Marker-Einheiten zusammenhalten, können als Kern-Komponente bezeichnet werden. Im Folgenden sind Beispiele für Bestandteile der Kernkomponente angegeben.
1.3.3.3.3.1 Bestandteile der Kernkomponente
In einer Ausführungsform besteht die Kern-Komponente aus einer oder mehreren niedermolekularen Verbindungen. Sie haben die Funktion, die Marker-Einheiten untereinander zu verbinden. Die Verbindung zwischen der Kern-Komponente und den Marker-Einheiten kann kovalent oder affin sein. Bei kovalenter Bindung können beispielsweise Verbindungen mit allgemeiner Struktur-Formel (F)m-R-(H)n als Ausgangsmateriel dienen, wo (F) und (H) - reaktive Gruppen darstellen, und R - eine Verbindungskomponente, wobei Zahl solcher Gruppen und ihre Anordnung stark variieren kann. Viele Beispiele sind dem Fachmann bekannt, z.B. Verbindungen aus der Gruppe Cross- Linker („Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc.). Die Struktur ist nicht eingeschränkt. Sie ist vorzugsweise wasserlöslich. Beispielsweise schließen (F) und (H) unabhängig von einander folgende Gruppen ein: NH2 (Amino), OH (Hydroxy), SH (Mercapto), COOH (Carboxy), CHO (Aldehyd), Acryl- oder Maleimid. Beispiele für (R) stellen wasserlösliche Polymere wie PEG oder Polypeptid-Ketten oder kurze aliphatische Ketten dar.
In einer weiteren Ausführungsform besteht die Kern-Komponente aus einem wasserlöslichen Polymer, dabei kann das Polymer aus gleichen oder unterschiedlichen Monomeren bestehen.
Beispiele für den Kem-Komponennte stellen folgende Polymere und deren Derivate dar: Polyamide (z.B. Polypeptide wie Poly(glutamin) oder Poly(Glutamin säure)) und deren Derivate, Poly-Acrylsäure und deren Derivate, natürliche oder synthetische Polysaccharide (z.B. Stärke, Hydroxy-Ethyl-Strärke), Dextran und seine Derivate (z.B. Aminodextran, Carboxy-Dextran), Dextrin, Poly-Acrylamide und deren Derivate (z.B. N-(2-hydroxypropyl)-methacdylamid) , Poly-Vinylalkohole und deren Derivate, Nukleinsäuren, Proteine. Diese Polymere können linear, globulär, z.B. Streptayidin oder Avidin, oder verzweigt sein, z.B. Dendrimere (Fig. 8a). Auch vernetzte lösliche Polymere, wie beispielswiese vernetzte Poly-Acrylamide (Crosslinker Bisacrylamid in Kombination mit Poly-Acrylamid), eingesetzt werden.
Da sowohl die Linker-Komponente als auch die Marker-Komponente wasserlösliche Polymere enthalten können, kann in einer Ausführungsform ein solches Polymer sowohl als Linker als auch als Kern-Komponente dienen. In diesem Fall kann ein Abschnitt eines solchen Polymers als Linker, ein anderer Abschnitt als Kern- Komponente betrachtet werden.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden lineare oder wenig verzweigte Polymere als Kernkomponenten eingesetzt, beispielsweise Polyamide (z.B. Polypeptide), Poly-Acrylsäure, Polysaccharide, Dextran, Poly-Acrylamide, PoIy- Vinylalkohole. Das Polymer kann aus einheitlichen oder unterschiedlichen Monomeren bestehen. Insbesondere in dieser Ausführungsform kann die Linker-Komponente weniger als 50 Kettenatome aufweisen. So können auch Linker-Längen von ca. 5 bis 10, 10 bis 20 oder 20 bis 50 Kettenatome ausreichend sein, um die Substrateigenschaften der Nuk-Makromoleküle für Enzyme zu bewahren. Eine solche Kern-Komponente des Markers erfüllt die Funktion der Linker-Komponente: sie schafft räumlichen Abstand zwischen sterisch anspruchsvollen Marker-Einheiten und aktiven Zentren der jeweiligen Enzyme.
Die wasserlöslichen Polymere haben vorzugsweise eine durchschnittliche Ketten-Länge von 20 bis 1.000.000 Kettenatomen. Beispielsweise liegt die durchschnittliche Kettenlänge zwischen 20 und 100, 100 und 500, 500 und 5000, 5000 und 100000, 100000 und 1000000 Kettenatome.
In einer Ausführungsform liegt das Polymer in wässriger Phase bei pH zwischen 4 und 10 vorwiegend in einer neutralen Form vor (z.B. Dextran oder Polyacrylamid). In einer anderen Ausführungsform liegt das Polymer in einer wässrigen Phase bei pH zwischen 4 und 10 in einer geladen Form vor. Es kann sowohl positive (z.B. Polylysin) oder negative Ladungen (z.B. Polyacrylsäure) tragen.
Die Kopplung von Marker-Einheiten an ein wasserlösliches Polymer hängt von der Art des Polymers ab. Die für die Kopplung notwendigen reaktiven Gruppen können bereits im Polymer vorhanden sein (z.B. Polylysin oder Polyacrylsäure) oder in einem getrennten Schritt in das Polymer eingeführt werden. Beispielsweise bei Dextran sind viele Varianten der Einführung von reaktiven Gruppen und chemischen Kopplungen bekannt (Molteni L. Methods in Enzymology 1985, v.112, 285, Rogovin A.Z. et al. J.Macromol Sei. 1972, A6, 569, Axen R. et al. Nature 1967, v. 214, 1302, Bethell G.S. et al. J. Biol.Chem. 1979, v.254, 2572, Lahm O. et al. Carbohydrate Res. 1977, v. 58, 249, WO 93/01498, WO 98/22620, WO 00/07019 ).
Die Kern-Komponennte hat vorzugsweise mehrere Kopplungsstellen, an die weitere Elemente gebunden werden können, z.B. strukturelle Marker-Einheiten oder Nuk- Linker-Komponente.
Beispielsweise Poly-Lysin-Moleküle haben multiple freie Aminogruppen, an die mehrere Farbstoffmoleküle, Biotinmoleküle, Haptenmoleküle oder Nukleinsäureketten gekoppelt werden können. Poly-Lysine haben unterschiedliche Molmasse, z.B. 1000- 2000, 2000-10000, 10000-50000 Da können käuflich erworben werden.
Als weiteres Beispiel für die Kernkomponente dienen Nukleinsäurenstränge, wobei die Nukleinsäureketten eine Länge von 10 bis 20, von 20 bis 50, von 50 bis 100, von 100 bis 200, von 200 bis 500, von 500 bis 1000, 1000 bis 5000, von 5000 bis 10000 Nukleotiden haben. Diese Nukleinsäuren dienen als Bindungspartner für sequenzkomplementäre Markereiήheiten (Fig. 7b).
In einer weiteren Ausführungsform besteht die Kern-Komponente aus einem Dendrimer, z.B. Polypropylenimine, Polyaminoamine. Beispiele für andere Dendrimere sind bekannt: Cientifica "Dendrimers", 2003, Technology white papers Nr. 6, Klajnert et al. Acta Biochimica Polonica, 2001, v. 48, S. 199, Manduchi et al. Physiol.
Genomics 2002, V.10, S.169, Sharma et al. Electrophoresis. 2003, V. 24, S. 2733,
Morgan et al. Curr Opin Drug Discov Devel. 2002 Nov;5(6):966-73, Benters et al. Nucleic Acids Res. 2002 Jan 15;30(2):E10, Nilsen et al. J Theor Biol. 1997 JuI
21; 187(2): 273-84. Viele Dendrimere sind kommerziell erwerblich (Genisphere, www.genisphere.com, Chimera Biotech GmbH).
Weitere Kombinationen für die Kern-Komponennte aus den oben dargestellten Bestandteilen sind einem Fachmann naheliegend.
1.3.3.3.3.2 Kopplung der Marker-Einheiten
Marker-Einheiten können an die Kern-Komponente oder an die Linker-Komponente durch eine kovalente Bindung, beispielsweise über einen Cross-Iinker (Chemistry of protein conjugation and cross-Iinking, S. Wang,1993, ISBN 0-8493-5886-8, "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2), oder über eine affine Kopplung erfolgen, beispielsweise Biotin-Streptavidin-Verbindung oder Hybridisierung von Nukleinsäuresträngen' oder Antigen-Antikörper-Wechselwirkung ("Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2).
Die Kopplung von Marker-Einheiten an die Kern-Komponente erfolgt in einer Ausführungsform bereits während der Synthese der Nuk-Makromoleküle.
In einer anderen Ausführungsform erfolgt zunächst die chemische Synthese von Nuk- Makromoleküle, bei denen die Markerkomponente nur aus der Kern-Komponente besteht. Die Kopplung von Marker-Einheiten an die Kern-Komponente erfolgt erst nach dem Einbau von Nuk-Makromoleküle in die Nukleinsäurekette. Durch eine große Zahl der potenziellen Bindungsstellen am Kernteil ist die Wahrscheinlichkeit der Bindung der Marker-Einheiten an die Kern-Komponente und somit an die eingebaute Nuk- Komponente wesentlich größer im Vergleich zu konventionellen Nukleotid-Strukturen. Die Kopplungschemie im einzelnen hängt von der Struktur der Marker-Einheiten und der Struktur der Kern- Komponente ab.
Kovalente Kopplung: Die Verbindung zwischen den Marker-Einhejten und der Kern- Komponente kann in einer Ausführungsform widerstandsfähig sein (Beispiel 33), z.B. bei Temperaturen bis zu 1000C, für pH-Bereiche zwischen 3 und 12, und/oder resistent gegen hydrolytische Enzyme (z.B. Esterasen) sein. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker unter milden Bedingungen spaltbar.
Beispiele für die Kopplung von Nukleinsäuren an Dendrimere (entspricht einer Kopplung von Marker-Einheiten an eine Kernkomponente) sind z.B. in Shchepinov et al. Nucleic Acids Res. 1999 Aug l;27(15):3035-41, Goh et al. Chem Commun (Camb). 2002 Dec 21; (24): 2954 dargestellt.
1.3.3.3.3.3 Kopplung zwischen Linker und Marker
Die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und dem Marker hängt von der jeweiligen Struktur der Marker-Einheiten bzw. der Struktur der Kern-Komponente ab.
In einer Ausführungsform ist die Linker-Komponente direkt an die signalgebende oder signalvermittelnde Marker-Einheit gebunden, Fig. 4a . Dabei kann der Marker aus nur einer oder mehreren Marker-Einheiten bestehen.
In einer weiteren Ausführungsform sind ein oder mehrere Linker-Komponenten an die Kern- Komponente des Markers gebunden, Fig. 5d.
Die Bindung zwischen der Linker-Komponente und dem Marker kann sowohl kovalent als auch affine erfolgen. Viele Beispiele sind dem Fachmann bekannt, s. z.B.
"Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2. „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc.).
Kovalente Kopplung: Die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und dem Marker kann in einer Ausführungsform widerstandsfähig sein, z.B. bei Temperaturen bis zu 1300C, für pH-Bereiche zwischen 1 und 14, und/oder resistent gegen hydrolytische Enzyme (z.B. Proteasen, Esterasen)sein . In einer anderen
Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker unter milden Bedingungen spaltbar.
Die für die Markierung von Nukeotiden erfindugnsgemäß eingesetzten Makromolekulare Verbidungen schließen in einigen Ausführungsformen wasserlösliche Polymere ein (s.o.). Die Linker der Nukmakromoleküle schließen ebenfalls wasserlösliche Polymere ein (s.o.). Es ist für den Fachmann erkennbar, dass die Zuordung einzelner Polymere zum Linker oder zum Marker einen beschreibenden Charakter hat.
1.3.3.3.4 Das Verhältnis der Nuk- Komponenten in einem Nuk-Makromolekiil
Ein Nuk-Makromolekül kann durchschnittlich 1 bis 2, 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 30, 30 bis 100, 100 bis 1000 Nuk-Komponenten einschließen.
In einer Ausführungsform haben alle Nuk-Makromoleküle eine gleiche Anzahl an Nuk- Komponenten pro ein Nuk-Makromolekül. Beispielsweise können pro ein Strepavidin- Molekül maximal 4 Biotin-Moleküle gebunden werden, bei sättigender Konzentration von Nuk-Linker- Komponenten, eine einheitliche Population an Nuk-Makromolekülen entsteht.
In einer anderen Ausführungsform haben die Nuk-Makromoleküle einer Population eine definierte durchschnittliche Anzahl von Nuk- Komponenten pro Nuk- Makromolekül, in der Population selbst findet allerdings eine Verteilung der tatsächlichen Besetzung der Nuk-Makromoleküle mit Nuk- Komponenten statt. Die Verteilungsangaben von Nuk- Komponenten pro Nuk-Makromolekül stellen in diesem Fall einen Mittelwert dar.
1.3.3.3.5 Das Verhältnis von Marker-Einheiten in einem Nuk-Makromolekül
Die Zahl der Marker-Einheiten in einem Nuk-Makromolekül schließt folgende Bereiche ein: 1 und 2, 2 und 5, 5 und 20, 20 und 50, 50 und 100, 100 und 500, 500 und 1000. 1000 und 10000, 10000 und 100000. In einer Ausführungsform der Erfindung haben Nuk-Makromoleküle eine feste Anzal von signalgebenden Einheiten pro Marker.
In einer anderen Ausführunsform kann die Verteilung von Marker-Einheiten in einer Nuk-Makromolekül-Population schwanken und muß nicht notwendigerweise einen konstanten Wert für jedes einzelne Nuk-Makromolekül darstellen.
In einer Ausführungsform haben alle Nuk-Makromoleküle eine gleiche Anzahl der Marker-Einheiten pro ein Nuk-Makromolekül. Beispielsweise können pro ein Strepavidin-Molekül maximal 4 Biotin-Moleküle gebunden werden, Avidin-Biotin- Technology, Methode in Enzymology v.184, 1990..
In einer anderen Ausführungsform haben die Nuk-Makromoleküle einer Population eine definierte durchschnittliche Zahl der Marker-Einheiten pro Nuk-Makromolekül, in der Population selbst findet allerdings eine Verteilung der tatsächlichen Besetzung der Nuk-Makromoleküle mit Marker-Einheiten statt. Bei sättigenden Konzentrationen bei der Synthese von Marker-Komponenten findet eine zunehmend einheitlichere Besetzung der Nuk-Makromoleküle mit Marker-Einheiten statt.
So spielt beispielsweise in Bereichen, wo es um den qualitativen Nachweis geht, die exakte Zahl der Marker-Einheiten pro Nuk-Makromolekül eine untergeordnete Rolle. In solchen Fällen ist das Vorhandensein eines stabilen Signals an sich von Bedeutung.
Es sollte einem Fachmann naheliegend erscheinen, dass die angeführten Marker- Komponenten eine beträchtlich größere Molekül-Größe und -Masse haben, als die jeweilige Nuk-Komponente selbst. Weiterhin sollten andere Beispiele für makromolekulare Marker-Komponenten einem Fachmann naheliegend erscheinen.
1.3.3.3.6 Substrateigenschaften der Nuk-Makromoleküle
Die Nuk-Komponente gebunden an ein Nuk-Makromolekül kann als Substrat für unterschiedliche Enzyme dienen. Beispielsweise dient die Nuk-Komponente, in dieser Ausführungsform als Nukleosid-Triphosphat, als Substrat für eine Polymerase, so dass die Nuk-Komponente in einen wachsenden Strang durch eine Polymerase eingebaut werden kann und somit das gesamte Nuk-Makromolekül an den Strang kovalent gekoppelt wird. Weitere Beispiele für Enzyme stellen Kinasen, Phosphorylasen, Transferasen dar.
Als Monomer-Teil einer Nukleinsäurekette können Nuk-Makromoleküle ebenfalls als Substrate für Enzyme auftreten, beispielsweise für die 3 '- oder 5 '-Exonukleasen oder Endonukleasen ("Molecular cloning" 1989, Ed. Maniatis, CoId Spring Harbor Laboratory), oder für die entsprechenden Teilaktivitäten von Polymerasen, wie beispielsweise in für real-time-PCR beschrieben (S. Meuer "Rapid cycle real time PCR", Springer 2004, ISBN 3-540-66736-9, T. Weissensteiner "PCR-Technology: current innovations" CRC Press 2004 ISBN 0-8493-1184-5).
Die Substrateigenschaften der Nuk-Komponente(n) bestimmt/bestimmen die Substrateigenschaften der Nuk-Makromoleküle. So kann die Nuk-Komponente als ein Terminator dienen, so dass nur ein einziges Nuk-Makromolekül eingebaut werden kann. In einer anderen Ausführungsform dient die Nuk-Komponente als ein reversibler Terminator, der die Durchführung einer schrittweise kontrollierten Verlängerungsreaktion erlaubt, wie z.B. in Ju et al. US Pat. 6664079, Tcherkassov WO 02088382 dargestellt ist.
Als Monomer-Teil einer Nukleinsäurekette können sie alleine für die enzymatischen Eigenschaften bestimmtend sein, wie z.B. für Exonuklease-Aktivität. In einer anderen Ausführungsform bestimmen die enzymatischen Eigenschaften nicht nur die Nuk- Komponenten der Nuk-Makromoleküle, sondern auch die benachbarten Nukleotide, wie im Falle der Endonukleasen.
1.3.3.3.7 Funktion der Marker
Die makromolekulare Marker-Komponente kann in einer Ausführungsform eine signalgebende Funktion haben. In einer anderen Ausführungsform hat sie eine signalvermittelnde Funktion. In einer weiteren Ausführungsform hat sie eine katalytische Funktion. In einer weiteren Ausführungsform hat sie eine affine Funktion. In einer weiteren Ausführungsform hat der Marker mehr als nur eine Funktion, sondern z.B. vereinigt sowohl signalgebende als auch eine signalvermitteldne Funktion. Weitere Kombinationen sind nahe liegend.
Bei der signalgebenden Funktion enthält die Marker-Komponente Bestandteile, die bereits während der chemischen Synthese an Nuk-Makromoleküle gebunden werden, s. Beispiel 33.
Bei der signalvermittelnden Funktion trägt die Marker-Komponente Bestandteile, die erst durch eine Reaktion mit signalgebenden Molekülen ihre Signaleigenschaften entfalten, s. Beispiel 32.
Beispielsweise können mehrere Biotin-Moleküle, z.B. 100 Biotin-Moleküle, den Marker- Teil bilden. Nach dem Einbau der Nuk-Makromoleküle erfolgt eine Nachweisreaktion mit modifizierten Streptavidin-Molekülen. In einem anderen Beispiel haben die Nukleinsäureketten die signalvermittelnde Funktion. Nach dem Einbau von Nuk- Makromoleküle, erfolgt eine Hybridisierung von einheitlichen Oligonukleotiden mit detektierbaren Einheiten, z.B. Fluoreszenzfarbstoffen (MWG-Biotech) an die Marker- Komponente. In einem weiteren Beispiel haben Amino- oder Merkapto-Gruppen, beispielsweise 50 Aminogruppen pro Marker, die signalvermittelnde Funktion. Nach dem Einbau der Nuk-Makromoleküle in die Nukleinsäurekette erfolgt eine chemische Modifikation mit reaktiven Komponenten, z.B. mit Farbstoffen, wie beispielsweise für eingebaute Allyl-Amino-dUTP beschrieben, Diehl et al. Nucleic Acid Research, 2002, V. 30, Nr. 16 e79.
In einer anderen Ausführungsform hat die makromolekulare Marker-Komponente eine katalytische Funktion (in Form eines Enzyms oder Ribozyms). Dabei können unterschiedliche Enzyme verwendet werden, z.B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase. Dank der Kopplung an die Nuk-Komponente kann das jeweilige Enzym durch den Einbau von Nuk-Makromolekülen an den Nukleinsäurestrang kovalent gebunden werden.
In einer weiteren Ausführungsform hat die makromolekularer Marker-Komponente eine Affinitätsfunktionalität zu einem1 anderen Molekül. Beispiele für solche Marker bilden Streptavidin-Moleküle, Antikörper oder Nukleinsäureketten, Beispiel 30 oder 32.
1.3.4. Niedermolekularer Marker - zum Stand der Technik gehörende Markierung von Nukleotiden beispielsweise mit ein oder zwei Biotin-Molekülen, ein oder zwei Farbstoff-Molekülen, ein oder zwei Hapten-Moleküln (z.B. Digoxigenin).
1.3.5. Konventionell modifiziertes Nukleotid - ein Nukleotid mit einem Linker (durchschnittliche Länge zwischen 5 und 30 Atomen) und einem Marker. Üblicherweise trägt ein konventionell modifiziertes Nukleotid einen niedermolekularen Marker, z.B. ein Farbstoff- oder ein Biotinmolekül.
1.3.6. Enzyme (Polymerasen)
In einer Ausführungsform können die Nuk-Makromoleküle als Substrate für Enzyme eingesetzt werden. Polymerasen stellen in Anwendungen oft eingesetzte Enzyme, die Nukleotide als Substrate verwerden. Sie werden im weiteren beispielhaft und stellvertretend für andere Nukleotid-umsetzende Enzyme betrachtet. Eine der zentralen Fähigkeit der Polymerasen besteht in kovalenten Kopplung von Nukleotid-Monomeren zu einem Polymer. Dabei kann die Synthese sowohl matrizen-abhängig (wie z.B. DNA-oder RNA-Synthese mit DNA- oder RNA-abhängigen Polymerasen) als auch matrizenunabhängig, z.B. durch Terminale Transferasen ("J Sambrook "Molecular Cloning" 3. Ed. CSHL Press 2001).
Falls RNA als Substrat (z.B. mRNA) in die Sequenzierungsreaktion eingesetzt wird, können handelsübliche RNA-abhängige DNA-Polymerasen eingesetzt werden, z.B. AMV- Reverse Transcriptase (Sigma), M-MLV Reverse Transcriptase (Sigma), HIV-Reverse Transcriptase ohne RNAse-Aktivität. Für bestimmte Anwendungen, können Reverse Transcriptasen von RNAse-Aktivität weitgehend frei sein ("Molecular cloning" 1989, Ed. Maniatis, CoId Spring Harbor Laboratory), z.B. bei mRNA-Makrierung für Hybridisierungsexperimente.
Falls DNA als Substrat (z.B. cDNA) verwendet wird, eignen sich als Polymerasen prinzipiell alle DNA-abhängigen DNA-Polymerasen mit oder ohne 3'-5' Exonuklease- Aktivität (DNA-Replication" 1992 Ed. A.Komberg, Freeman and Company NY), z.B. modifizierte T7-Polymerase vom Typ "Sequenase Version 2" (Amersham Pharmacia Biotech), Klenow Fragment der DNA-Polymerase I mit oder ohne 3'-5' Exonukleaseaktivität (Amersham Pharmacia Biotech), Polymerase Beta verschiedenen Ursprungs (Animal Cell DNA Polymerases" 1983, Fry M., CRC Press Inc., kommerziell erhältlich bei Chimerx) thermostabile Polymerasen wie beispielsweise Taq-Polymerase (GibcoBRL), proHA-DNA-Polymerase (Eurogentec), Vent, Vent exo minus, Pfu, Thermosequenase, Pwo-Polymerase usw. (Promega).
Auch DNA-abhängige RNA- Polymerasen können verwendet werden, z.B. E. coli RNA- Polymerase, T7-RNA-Polymerase, SP6 RNA Polymerase.
Die Polymerasen können eine 3 '- oder eine 5 '-Exonuklease-Aktivität aufweisen und in bestimmten Anwendungen eingesetzt werden (z.B. bei real-time PCR). In der Anmeldung werden DNA-abhängige DNA-Polymerasen als Beispiele für Polymerasen betrachtet.
1.3.7. Spaltbare Verbindung - Eine unter milden Bedingungen spaltbare Verbindung. Diese Verbindung kann einen Abschnitt im Linker darstellen und kann an einer oder an mehreren Stellen spaltbar sein. Es kann sich um eine chemisch spaltbare Verbindung, wie z.B. eine Disulfid-, eine Ester-, eine Acetal-, eine Thioesterverbindung (Short WO 9949082, Tcherkassov WO 02088382) handeln. Es kann auch eine photochemisch spaltbare Verbindung, wie in (Rothschild WO 9531429) dargestellt sein. Es kann auch eine enzymatisch spaltbare Verbindung (beispielsweise eine Peptid- oder Polypeptide-Bindung, Odedra WO 0192284), spaltbar durch Peptidasen, eine PoIy- oder Oligosaccharid-Bindung, spaltbar durch Disaccharidasen) sein, wobei die Spaltung durch ein spezifisches Enzym zwischen bestimmten Monomeren der spaltbaren Stellen stattfinden kann. Mehrere Beispiele für spaltbare Verbindungen sind bekannt. Die Kopplung einer solchen Verbindung ist beispielsweise beschrieben in (Tcherkassov 02088382, Metzker et al. Nucleic Acid Research 1994, V.22, S. 4259, Canard et al. Gene, 1994, V. 148, 1, , Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642.). Eine Spaltbare Verbindung kann ein Teil des Linkers sein oder die Kopplungsstelle des Linkers an das Nukleotid bilden, oder die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und der Makrer-Komponente, oder die Verbindung zwischen den Marker-Einheiten und der Kern-Komponente.
1.3.8 DNA - Deoxyribonukleinsäure verschiedenen Ursprungs und unterschiedlicher Länge (z.B. Oligonukleotide, Polynukleotide, Plasmide, genomische DNA, cDNA, ssDNA, dsDNA)
1.3.9 RNA - Ribonukleinsäure
1.3.10 dNTP - 2'-deoxi-Nudeosid-Triphosphate, Substrate für DNA-Polymerasen und Reverse-Transkriptasen, z.B. dATP, dGTP, dUTP, dTTP, dCTP.
1.3.11 NTP - Ribonukleosid-Triphosphate, Substrate für RNA-Polymerasen, UTP, CTP, ATP, GTP.
1.3.12 Abkürzung "NT" wird auch bei der Längenangabe einer Nukleinsäuresequenz verwendet, z.B. 1.000 NT. In diesem Fall steht "NT" für Nukleosid-Monophosphate.
Im Text wird bei Abkürzungen die Mehrzahl durch Verwendung des Suffixes "s" gebildet, "NT" steht zum Beispiel für "Nukleotid", "NTs" steht für mehrere Nukleotide.
1.3.13 NSK - Nukleinsäurekette. DNA oder RNA
1.3.14 Gesamtsequenz - Summe aller Sequenzen im Ansatz, sie kann ursprünglich aus einer oder mehreren NSKs bestehen. Dabei kann die Gesamtsequenz Teile oder
Äquivalente einer anderen Sequenz oder von Sequenz-Populationen darstellen (z.B. mRNA, cDNA, Plasmid-DNA mit Insert, BAC, YAC) und aus einer oder unterschiedlichen Spezies stammen. 1.3.15 NSKF - Nukleinsäurekettenfragment (DNA oder RNA), das einem Teil der Gesamtsequenz entspricht, NSKFs - Nukleinsäurekettenfragmente. Die Summe der NSKFs bildet ein Äquivalent zur Gesamtsequenz. Die NSKFs können beispielsweise Fragmente von DNA- oder RNA-Gesamtsequenz sein, die nach einem Fragmentierungsschritt entstehen.
1.3.16 Primerbindungstelle (PBS) - Teil der Sequenz in der NSK oder NSKF, an den der Primer bindet.
1.3.17 Referenzsequenz - eine bereits bekannte Sequenz, zu der die Abweichungen in der zu untersuchenden Sequenz bzw. in den zu untersuchenden Sequenzen (z.B. Gesamtsequenz) ermittelt werden. Als Referenzsequenzen können in Datenbanken zugängliche Sequenzen verwendet werden, wie z.B. aus der NCBI-Datenbank.
1.3.18 Tm - Schmelztemperatur
1.3.19 Sterisches Hindernis, sterisch anspruchsvolle Gruppe oder Ligand
Sterisch anspruchsvolle Gruppe oder Ligand, die durch ihre chemische Struktur die Eigenschaften der mit dieser Gruppe gekoppelten Nukleotide so verändert, dass diese durch eine Polymerase in einer Extensionsreaktion nicht nacheinander eingebaut werden können. Eine oder mehrere an die Base gekoppelte sterisch anspruchsvolle Gruppen können zur Aufhenung der Synthese oder zu Behinderung der weiteren Synthese führen.
Viele in der modernen Forschung eingesetzten Marker stellen ein sterisches Hindernis dar für die Enzyme dar. Biotin, Digoxigenin und Fluoreszenzfarbstoffe wie Fluoreszein,
Tetramethylrhodamine, Cy3-Farbstoff stellen Beispiele einer solchen sterisch anspruchsvollen Gruppe dar (Zhu et al. Cytometry 1997, v.28, S.206, Zhu et al. NAR
1994, v.22, S.3418, Gebeyehu et al., NAR 1987, v.15, S.4513, Wiemann et al. Analytical
Biόchemistry 1996, v.234, S.166, Heer et al. BioTechniques 1994 v.16 S.54). Weitere sterisch anspruchsvollen Gruppen können beispielsweise lineare oder verzweigte
Polymere mit einer kompakten drei-dimensionalen Struktur, wie z.B. Proteine oder
Dendrimere darstellen.
1.3.20 PNA - Peptide Nucleic Acid 2. Detaillierte Beschreibung:
Die Erfindung beschreibt eine neue Klasse an modifizierten Nukleotiden.
1. Aspekt der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen mit der Struktur:
(Nuk-Linker)n-Marker
wobei:
Nuk - ein Nukleotid oder ein Nukleosid ist (Nuk-Komponente)
Linker - eine Linker-Komponente, die eine Nuk-Komponente und eine makromolekulare Marker-Komponente vebindet Marker - eine makromolekulare Marker-Komponente ist n - eine Zahl von 1 bis 1000 ist
Ein weiterer Aspekt 2 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekt 1, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt (Fig. 3A):
Wobei:
Base - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7-Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren Modifikationen, wobei L die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente darstellt (Kopplungseinheit L) und X die
Kopplungsstelle der Kopplungseinheit L an der Base ist
R1 - ist H
R2 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Halogen, NH2, SH oder geschützte OH-Gruppe
R3 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Halogen, PO3, SH, N3, NH2, O-R3-1, P(O)m-R3-i (m ist 1 oder 2 ist), NH-R3-1, S-R3-1, Si-R3-1 wobei R3-1 eine chemisch, photochemisch oder enzymatisch spaltbare Gruppe ist, oder eine der folgenden Modifikationen einschließt: -CO-Y, -CH2-O-Y, -CH2-S-Y, -CH2-N3, -CO- O-Y, -CO-S-Y, -CO-NH-Y, -CH2-CH=CH2, wobei Y ein Alkyl ist, beispielsweise
(CH2)n-CH3 wobei n zwischen 0 und 4 liegt, oder ein substituiertes Alkyl ist, beispielsweise mit Halogen, Hydroxy, Amino, Carboxy-Gruppen). R4 - ist H oder OH R5 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe OH, oder eine geschützte OH- Gruppe, eine Monophosphat-Gruppe, oder eine Diphosphat-Gruppe, oder eine
Triphosphat-Gruppe, oder eine Alpha-Thiotriphosphat-Gruppe ist. Ein weiterer Aspekt 3 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekt 1, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt (Fig. 3B):
Wobei: Base - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7-Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren zu enzymatischen Reaktionen fähigen Modifikationen
Ri - ist H R2 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, HaI, NH2, SH oder geschützte
OH-Gruppe
R3 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe O- R3-2-L, P(O)m- R3-2-L, wobei m 1 oder 2 ist, NH-R3-2-L, S-R3-2-L, Si-R3-2-L oder, wobei R3-2 die Kopplungsstelle des Linkers an das Nukleotid ist und L - die Kopplungseinheit des Linkers (L) ist.
R4 - ist H oder OH
R5 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe OH, oder eine geschützte OH- Gruppe, eine Monophosphat-Gruppe, oder eine Diphosphat-Gruppe, oder eine
Triphosphat-Gruppe, oder eine Alpha-Thiotriphosphat-Gruppe ist.
Ein weiterer Aspekt 4 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekt 1, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt (Fig. 3B):
Wobei:
Base - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7-Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren zu enzymatischen Reaktionen fähigen Modifikationen
Ri - ist H
R2 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, HaI, NH2, SH oder geschützte OH-Gruppe
R3 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, HaI, PO3, SH, NH2, O- R3-I,
P(0)m- R3-1, NH-R3-I, S-R3-I, Si-R3-I wobei R3-i eine chemisch, photochemisch oder enzymatisch spaltbare Gruppe ist und m 1 oder 2 ist. R4 - ist H oder OH
R5 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe O- R5-1-L, oder P-(O)3- R5-I-L (modifizierte Monophosphat-Gruppe), oder P-(O)3-P-(O)3-R5-I-L (modifizierte Diphosphat-Gruppe) oder P-(O)3-P-(O)3-P-(O)3- R5-I-L (modifizierte Triphosphat-Gruppe), wobei R5-I die Kopplungsstelle der Kopplungseinheit L an das Nukleotid ist und Kopplungseinheit L die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente ist.
Ein weiterer Aspekt 5 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach
Aspekten 1 bis 4, wobei Kopplungseinheit L folgende strukturelle Elemente einschließt:
R6-NH-R7, R6-O-R7, R6-S-R7, R6-SS-R7, R6-CO-NH-R7, R6-NH-CO-R7, R6-CO-O-R7, R6-O-CO-R7, R6-CO-S-R7, R5-S-CO-R7, R6-P(O)2-R7, R6-Si-R7, R6-(CH2)n-R7,
R6-(CHz)n-R7, R6-A-(CH2)n-R7, R6-(CH2)n-B-R7,
R6-(CH=CH-)n-R7/ R6-(A-CH=CH-)n-R7, R6-(CH=CH-B-)n-R7, R6-(CH=CH-CH2-B- VR7, R6-A-CH=CH-(CH2-VR7, R6-(-CH=CH-CH2)n-B-R7, R6-(GCOn-R7, R6-(A-C-C-VR7, R5-(A-C≡C-CH2)n-R7, R6-(C≡C-B-)n-R7, R6-(G-C-CH2-B-VR7, R6-A-C≡C-(CH2-)n-R7, R6-(-C≡C-CH2)n-B-R7,
R6-(-C≡C-CH2-CH2)n-B-R7
wobei R6 - die Nuk-Komponente ist, R7 - der Linkerrest ist und A und B unabhängig folgende strukturelle Elemente einschließen: -NH-, -O-, -S-, -SS-, - CO-NH-, -NH-CO-, -CO-O-, -0-C0-, -CO-S-, -S-CO-, -P(O)2-, -Si-, -(CH2V, eine photolabile Gruppe, wobei n - gleich 1 bis 5 ist
Ein weiterer Aspekt 6 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 5, wobei die Linker-Komponente ein wasserlösliches Polymer einschließt.
Ein weiterer Aspekt 7 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekt 6, wobei die Linker-Komponente wasserlösliche Polymere unabhängig ausgewählt aus folgender Gruppe einschließt: Polyethylen-glycol (PEG), Polysaccharide, Dextran, Polyamide, Polypeptide, Polyphosphate, Polyacetate, Poly(alkyleneglycole), Kopolymere aus Ethylenglycol und Propylenglycol, Poly(olefinische Alkohole), Poly(Vinylpyrrolidone), Poly(Hydroxyalkylmethacrylamide), Poly(Hydroxyalkylmethacrylate), Poly(x- Hydroxy-Säuren), PoIy- Acrylsäure, Poly-Acrylamid, Poly(Vinylalkohol).
Ein weiterer Aspekt 8 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 7, wobei die Linker-Komponente eine durchschnittliche Länge zwischen 2 und 5, 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 10000, 10000 bis 100000,
100000 bis 500000 Atomen hat.
Ein weiterer Aspekt 9 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 8, wobei eine Marker-Komponente eine signalgebende, signalvermittelnde, katalytische oder affine Funktion hat
Ein weiterer Aspekt 10 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 9, wobei eine Marker-Komponente aus einer strukturellen Marker-Einheit besteht
Ein weiterer Aspekt 11 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 9, wobei eine Marker-Komponente aus mehreren strukturellen Marker-Einheiten gebunden an eine Kern-Komponente besteht
Ein weiterer Aspekt 12 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 10 oder 11, wobei eine strukturelle Marker-Einheit unabhängig eines der folgenden strukturellen Elemente einschließt:
Biotin, Hapten, radioaktives Isotop, seltenes Erdenelement, Farbstoff,
Fluoreszenzfarbstoff.
Ein weiterer Aspekt 13 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 10 oder 11 , wobei eine strukturelle Marker-Einheit unabhängig eines der folgenden Elemente einschließt:
Nanokristalle oder deren Modifikationen, Proteine oder deren Modifikationen, Nukleinsäureketten oder deren Modifikationen, Teilchen oder deren
Modifikationen. Ein weiterer Aspekt 14 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekt 13, wobei eine strukturelle Marker-Einheit eines der folgenden Proteine einschließt:
Enzyme oder deren Konjugate oder Modifikationen, Antikörper oder deren Konjugate oder Modifikationen,
Streptavidin oder seine Konjugate oder Modifikationen, Avidin oder seine Konjugate oder Modifikationen
Ein weiterer Aspekt 15 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekt 13, wobei eine strukturelle Marker-Einheit eine der folgenden Arten
Nukleinsäureketten einschließt: DNA, RNA, PNA, wobei die Länge von Nukleinsäureketten zwischen 10 und 10.000 Nukleotiden oder deren Äquivalente liegt.
Ein weiterer Aspekt 16 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 11 bis 15, wobei die Kern-Komponente der Marker-Komponente unabhängig eines der folgenden Elemente einschließt: wasserlöslichen Polymer unabhängig ausgewählt aus der Gruppe von: Polyamide (z.B. Polypeptide), PoIy- Acrylsäure und deren Derivate, Poly-Acrylamide und deren Derivate, PoIy- Vinylalkohole und deren Derivate, Polysaccharide, Dextran und seine Derivate,
Nukleinsäureketten und deren Derivate, Streptavidin oder Avidin und deren Derivate, Dendrimere, wobei einzelne Polymere linear oder verzweigt oder unter einander vernetzt sein können
Ein weiterer Aspekt 17 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 9, 11 bis 16, wobei die Verbindung zwischen mehreren strukturellen Marker-Einheiten und der Kern-Komponte kovalent oder affine erfolgt.
Ein weiterer Aspekt 18 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 10, wobei die Verbindung zwischen einer strukturellen Marker-Einheit und dem Linker kovalent oder affine erfolgt.
Ein weiterer Aspekt 19 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 9, 11 bis 17, wobei die Verbindung zwischen der Kern-
Komponente und dem Linker kovalent oder affine erfolgt Ein weiterer Aspekt 20 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 19, wobei nur eine Nuk-Komponente mit einer gekoppelten Linker-Komponente an die Marker-Komponente gebunden ist, wobei die Linkerlänge zwischen 2 und 5, 5 und 10, 10 bis 20, 20. bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000, 5000 bis
20000, 20000 bis 100000 Atome beträgt.
Ein weiterer Aspekt 21 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 20, wobei nur eine Nuk-Komponente mit einer gekoppelten Linker-Komponente an die Marker-Komponente gebunden ist, wobei die
Linkerlänge zwischen 2 und 5, 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000, 5000 bis 20000, 20000 bis 100000 Atome beträgt und die Linker-Komponente eine oder mehrere unter milden Bedingungen spaltbare Verbindungen beinhaltet.
Ein weiterer Aspekt 22 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 21, wobei nur eine Nuk-Komponente mit einer gekoppelten Linker-Komponente an die Marker-Komponente gebunden ist, wobei die Linkerlänge zwischen 2 und 5, 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000, 5000 bis
20000, 20000 bis 100000 Atome beträgt und ein oder mehrere Teile des Nuk- Makromoleküls dermaßen modifiziert sind, dass nur eine Nuk-Komponente in einen wachsenden Strang eingebaut werden kann.
Ein weiterer Aspekt 23 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 19, wobei mehrere Nuk-Komponenten jeweils über einen eigenen Linker an einer Marker-Komponenten gekoppelt sind, wobei die Länge der jeweiligen Linker- Komponente zwischen 2 und 5, 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000, 5000 bis 20000, 20000 bis 100000 Atome beträgt. Ein weiterer Aspekt 24 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 19, 23, wobei mehrere Nuk- Komponenten jeweils über einen eigenen Linker an einer Marker-Komponenten gekoppelt, wobei die Länge der jeweiligen Linker- Komponente zwischen 2 und 5, 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000, 5000 bis 20000, 20000 bis 100000 Atome beträgt und der jeweilige Linker eine oder mehrere unter milden Bedingungen spaltbare Verbindungen beinhaltet.
Ein weiterer Aspekt 25 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 19, 23, 24, wobei mehrere Nuk- Komponenten jeweils über einen eigenen Linker an einer Marker- Komponenten gekoppelt, wobei die Länge der jeweiligen Linker- Komponente zwischen 2 und 5, 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000, 5000 bis 20000, 20000 bis 100000 Atome beträgt und ein oder mehrere Teile des Nuk-Makromoleküls dermaßen modifiziert sind, dass nur eine Nuk-Komponente in eine wachsende Nukieinsäurekette eingebaut werden kann.
Ein weiterer Aspekt 26 der Erfindung betrifft Oligonucleotide oder Polynucleotide die mindestens ein Nuk-Makromolekül nach Aspekten 1 bis 25 pro eine
Nukieinsäurekette einschließen.
Ein weiterer Aspekt 27 der Erfindung betrifft Oligonucleotide oder Polynucleotide nach Aspekt 26, wobei Oligo- oder Polynucleotide RNA, DNA oder PNA sind, deren Länge zwischen 5 und 50.000 Nukleotide beträgt.
Ein weiterer Aspekt 28 der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Modifizierung von Nukleinsäureketten, wobei für die Kopplung Nuk-Makromoleküle nach Aspekten 1 bis 25 verwendet werden
Ein weiterer Aspekt 29 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 28, wobei die Modifizierung durch eine enzymatische Kopplung erfolgt und das Reaktionsgemisch folgende Komponenten einschließt:
- mindestens eine Art der Nuk-Makromoleküle oder deren Zwischenstufen nach Aspekten 1 bis 25, wobei jede Art der Nuk-Makromoleküle eine für sie charakteristische Markierung besitzt
- mindestens eine Population der Nukleinsäureketten, - mindestens eine Enzymart zur Kopplung von Nuk-Makromoleküle an die Nukleinsäureketten,
Ein weiterer Aspekt 30 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 28, wobei die Modifizierung durch eine enzymatische Kopplung erfolgt und das
Reaktionsgemisch folgende Komponenten einschließt:
- mindestans eine Art der Nuk-Makromoleküle oder deren Zwischenstufen nach Aspekten 1-25, wobei jede Art der Nuk-Makromoleküle eine für sie charakteristische Markierung besitzt - mindestens eine Population der Nukleinsäureketten,
- mindestens eine Enzymart zur Kopplung von Nuk-Makromoelküle an die Nukleeinsäureketten
- mindestens eine weitere Art von Nukleosidtriphosphaten
Ein weiterer Aspekt 31 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 29,
30, wobei die Enzymart unabhängig eine der folgenden Gruppen einschließt: DNA-Polymerase, RNA- Polymerase, Terminale Transferase,
Ein weiterer Aspekt 32 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 30, wobei die "weitere Art" der Nukieosidtriphosphaten unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe von: Ribo-Nukleosidtriphosphaten (ATP, GTP, UTP, CTP), von 21 - Deoxyribonukleosid-Triphosphaten (dATP, dUTP, dTTP, dCTP, dGTP), von 2\3" - Dideoxynukleosidtriphosphaten (ddATP, ddGTP, ddUTP, ddCTP, ddTTP).
Ein weiterer Aspekt 33 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 32, wobei die "weitere Art" der Nukleosidtriphosphaten konventionell modifizierte Nukleotide mit einer Markierung sind, wobei diese Markierung unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe von: ein Fluoreszenzfarbstoff, ein Biotin, ein Hapten, ein radioakives Element.
Ein weiterer Aspekt 34 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 28 bis 33, wobei mindestens zwei unterschiedliche Populationen an Nukleinsäureketten präsent sind
Ein weiterer Aspekt 35 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 34, wobei mindestens eine der Populationen der Nukleinsäureketten eine Primer- Funktion hat und mindestens eine Pupulation der Nukleinsäureketten eine Matrizen-Funktion. Ein weiterer Aspekt 36 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 28, wobei die Modifizierung durch eine chemische Kopplung erfolgt, wobei die Kopplung der Nuk-Makromoleküle an Nukleinsäureketten durch Phosphoroamidit-Kopplung erfolgt.
Ein weiterer Aspekt 37 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 28 biß 36, wobei im Markierungsverfahren Nuk-Makromoleküle eingesetzt werden, die die Kopplung nur einer einzigen Nuk-Komponente in den wachsenden Nukleinsäure-Strang zulassen und der mehrfache Einbau durch Modifikationen an der Nuk-Komponente, und/oder der Linker-Komponente und/oder der Marker- Komponente verhindert wird.
Ein weiterer Aspekt 38 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 37, wobei die weitere Kopplung reversibel verhindert wird.
Ein weiterer Aspekt 39 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 37, wobei die weitere Kopplung irreversibel verhindert wird.
Ein weiterer Aspekt 40 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 28 bis
36, wobei im Markierungsverfahren Nuk-Makromoleküle eingesetzt werden, die eine Kopplung mehrer Nuk-Komponente in den wachsenden Nukleinsäurestrang zulassen
Ein weiterer Aspekt 41 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 28-40, wobei die an der Reaktion teilnehmenden Nukleinsäureketten an eine feste Phase gekoppelt sind und adressierbare Positionen haben.
Ein weiterer Aspekt 42 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 41, wobei die Nukleinsäureketten eine einheitliche Population darstellen
Ein weiterer Aspekt 43 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 41, wobei die Nukleinsäureketten zwei oder mehrere unterschiedliche Populationen darstellen und jede der Populationen eine adressierbare Position auf der festen Phase hat Ein weiterer Aspekt 44 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 41,42, wobei die Kopplung von Nuk-Makromolekülen an einer Population einheitlicher, an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle erfolgt, wobei die Marker- Komponente des Nuk-Makromoleküls nach der Kopplung am verlängerten Nukleinsäurestrang verbleibt und nicht abgetrennt wird.
Ein weiterer Aspekt 45 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 41,42, wobei die Kopplung von Nuk-Makromolekülen an einer Population einheitlicher, an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle erfolgt, wobei die Marker- Komponente oder ihre einzelnen Komponenten mit oder ohne Linker-
Komponente des Nuk-Makromoleküls während der Kopplung oder nach der Kopplung von der in den wachsenden Nukleinsäurestrang eingebauten Nuk- Komponente abgetrennt wird.
Ein weiterer Aspekt 46 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 41,43, wobei die Kopplung von Nuk-Makromolekülen in einem Reaktionsansatz parallel an zwei oder mehreren unterschiedlichen Populationen an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle erfolgt, wobei diese Populationen jeweils unterschiedliche adressierbare Positionen an der festen Phase haben und die Marker-Komponente des Nuk-Makromoleküls nach der Kopplung am verlängerten Nukleinsäurestrang verbleibt und nicht abgetrennt wird.
Ein weiterer Aspekt 47 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 41,43, wobei die Kopplung von Nuk-Makromolekülen in einem Reaktionsansatz parallel an zwei oder mehreren unterschiedlichen Populationen an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle erfolgt, wobei diese Populationen unterschiedliche adressierbare Positionen an der festen Phase haben und die Märker-Komponente oder ihre einzelnen Komponenten mit oder ohne Linker-Komponente des Nuk- Makromoleküls während der Kopplung oder nach der Kopplung von der Nuk- Komponente abgetrennt wird.
Ein weiterer Aspekt 48 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 41 bis 47, wobei die adressierbaren Positionen mit Nukleinsäuremolekülen auf der festen Phase als Spots auf einer planen Oberfläche verteilt sind, wobei pro ein Spot Nukleinsäuremoleküle einheitlich sind. Ein weiterer Aspekt 49 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 41 bis 47, wobei die adressierbaren Positionen mit Nukleinsäuremolekülen an den Kügelchen bzw. Partikel befestigt sind, wobei pro ein Kügelchen Nukleinsäuremoleküle einheitlich sind.
Ein weiterer Aspekt 50 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 41 bis 47, wobei die adressierbaren Positionen mit Nukleinsäuremolekülen in einem Multigefäßsystem, wie Mikrotiterplatte oder Nanotiterplatte oder Pikotiterplatte, verteilt sind, wobei in einem Gefäß des Multigefäßsystems die Nukleinsäuremoleküle einheitlich sind.
Ein weiterer Aspekt 51 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 28 bis 35 und 37 bis 50, das folgende Schritte einschließt:
a) Bereitstellung mindestens einer Population an einzelsträngigen
Nukleinsäureketten b) Hybridisierung von sequenzspezifischen Primern an diese Nukleinsäureketten, wobei extensionsfähige NSK-Primer-Komplexe entstehen c) Inkubation von mindestens einer Art der Nuk-Makromoleküle nach
Aspekten 1 bis 25 zusammen mit einer Art der Polymerase nach Aspekt 31 mit den in Schritten a und b bereitgestellten NSK-Primer-Komplexen unter Bedingungen, die den Einbau von komplementären Nuk-Makromolekülen zulassen, wobei jede Art der Nuk-Makromoleküle eine für sie charakteristische Markierung besitzt. d) Entfernung der nicht eingebauten Nuk-Makromoleküle von den NSK- Primer-Komplexen e) Detektion der Signale von in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nuk-Makromolekülen f) Entfernung der Linker-Komponente und der Marker-Komponente von den in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nuk-Makromolekülen g) Waschen der NSK-Primer-Komplexe gegebenenfalls Wiederholung der Schritte (c) bis (g),
Ein weiterer Aspekt 52 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 28-40, wobei die Nukleinsäureketten an eine feste Phase in zufälliger Anordnung gekoppelt sind. Ein weiterer Aspekt 53 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 28 bis 41, 52 zur parallelen Sequenzanalyse von Nukleinsäuresequenzen (Nukleinsäureketten, NSKs), bei dem man
Fragmente (NSKFs) einzelsträngiger NSKs mit einer Länge von etwa 50 bis
1000 Nukleotiden erzeugt, die überlappende Teilsequenzen einer Gesamtsequenz darstellen können, man
die NSKFs unter Verwendung eines einheitlichen oder mehrerer unterschiedlichen Primer in Form von NSKF-Primer-Komplexen auf einer
Reaktionsoberfläche in einer zufälligen Anordnung bindet, wobei die Diphte der an die Oberfläche gebudenen NSKF-Primer-Komplexen eine optische Detektion der Signale von einzelnen eingebauten N uk- Makromolekülen zuläßt, man
eine zyklische Aufbaureaktion des komplementären Stranges der NSKFs unter Verwendung einer oder mehrerer Polymerasen durchführt, indem man
a) zu den auf der Oberfläche gebundenen NSKF-Primer-Komplexen eine Lösung zugibt, die eine oder mehrere Polymerasen und ein bis vier Nuk-
Makromoleküle enthält, die eine mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Marker- Komponente haben, wobei die bei gleichzeitiger Verwendung von mindestens zwei Nuk-Makromoleküle jeweils an die Marker-Komponente befindlichen Fluoreszenzfarbstoffe so gewählt sind, dass sich die verwendeten Nuk- Makromoleküle durch Messung unterschiedlicher Fluoreszenzsignale voneinander unterscheiden lassen, wobei die Nuk-Makromoleküle strukturell so modifiziert sind, dass die Polymerase nach Einbau eines solchen Nuk- Makromoleküls in einen wachsenden komplementären Strang nicht in der Lage ist, ein weiteres Nuk-Nakromolekül in denselben Strang einzubauen, wobei die Linker-Komponente mit der Marker-Komponente abspaltbar sind, man
b) die in Stufe a) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen inkubiert, die zur Verlängerung der komplementären Stränge geeignet sind, wobei die komplementären Stränge jeweils um ein Nuk-Makromolekül verlängert werden, man c) die in Stufe b) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung nicht in einen komplementären Strang eingebauter Nuk-Makromoleküle geeignet sind, man
d) die einzelnen, in komplementäre Stränge eingebauten Nuk-
Makromoleküle durch Messen des für den jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff charakteristischen Signals detektiert, wobei man gleichzeitig die relative Position der einzelnen Fluoreszenzsignale auf der Reaktionsoberfläche bestimmt, man
e) zur Erzeugung unmarkierter (NTs oder) NSKFs die Linker- Komponente und die Marker-Komponente von den am komplementären Strang angefügten Nuk-Komponenten abspaltet, man
f) die in Stufe e) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung der Marker-Komponente geeignet sind, man
die Stufen a) bis f) gegebenenfalls mehrfach wiederholt,
wobei man die relative Position einzelner NSKF-Primer-Komplexe auf der Reaktionsoberfläche und die Sequenz dieser NSKFs durch spezifische Zuordnung der in Stufe d) in aufeinanderfolgenden Zyklen an den jeweiligen Positionen delektierten Fluoreszenzsignale zu den Nuk-Makromolekülen bestimmt.
Ein weiterer Aspekt 54 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 53, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis 0 der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus nur jeweils eine Art der Nuk-Makromoleküle einsetzt.
Ein weiterer Aspekt 55 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 53, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbau reaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus jeweils zwei unterschiedlich markierte Arten der Nuk-Makromoleküle einsetzt.
Ein weiterer Aspekt 56 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 53, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus jeweils vier unterschiedlich markierte Arten der Nuk-Makromoleküle einsetzt. Ein weiterer Aspekt 57 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 53, dadurch gekennzeichnet, dass die NSKs Varianten einer bekannten Referenzsequenz sind und man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in den Zyklen abwechselnd jeweils zwei unterschiedlich markierte Arten der Nuk-Makromoleküle und zwei unmarkierte NTs einsetzt und man die Gesamtsequenzen durch Vergleich mit der Referenzsequenz ermittelt.
Ein weiterer Aspekt 58 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach den Aspekten 53 bis 57, dadurch gekennzeichnet, dass man in die NSKFs jeweils eine Primerbin- dungsstelle (PBS) einführt, wobei man bei doppelsträngigen NSKs an beiden komplementären Einzelsträngen jeweils eine PBS einführt und wobei die Primer- bindungsstellen für alle NSKFs jeweils gleiche oder verschiedene Sequenzen aufweisen.
Ein weiterer Aspekt 59 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach den Aspekten 53 bis 57, dadurch gekennzeichnet, dass man die NSKFs mit Primern in einer Lösung unter Bedingungen in Kontakt bringt, die zur Hybridisierung der Primer an die Primerbindungsstellen (PBSs) der NSKFs geeignet sind, wobei die Primer untereinander gleiche oder verschiedene Sequenzen aufweisen, und man die gebildeten NSKF-Primer-Komplexe anschließend auf der Reaktionsoberfläche bindet.
Ein weiterer Aspekt 60 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach den Aspekten 53 bis 57, dadurch gekennzeichnet, dass man die NSKFs zunächst auf der Reaktionsoberfläche immobilisiert und erst anschließend mit Primem unter Bedingungen in Kontakt bringt, die zur Hybridisierung der Primer an die Primerbindungsstellen (PBSs) der NSKFs geeignet sind, wobei NSKF-Primer-Komplexe gebildet werden, wobei die Primer untereinander gleiche oder verschiedene Sequenzen aufweisen.
Ein weiterer Aspekt 61 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 53 bis 60, bei dem an 10 bis 100.000 unterschiedlichen Sequenzenpopulationen die Einbaureaktion parallel durchgeführt
Ein weiterer Aspekt 62 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 53 bis 60, bei dem an 100.000 bis 10.000.000.000 unterschiedlichen Sequenzenpopulationen die Einbaureaktion parallel durchgeführt. Ein weiterer Aspekt 63 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 28 bis
62, wobei die Sequenzen der Nukleinsäureketten ermittelt werden
Ein weiterer Aspekt 64 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 28 bis
63, wobei die Marker-Komponente fluoreszent markiert ist
Ein weiterer Aspekt 65 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 41 bis
64, wobei die feste Phase unabhängig aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Silicon, Glas, Keramik, Kunststoffe, Gele oder deren Modifikationen
Gegenüberstellung von Eigenschaften konventionell modifizierter Nukleotide und Nuk-Makromoleküle:
Substrateigenschaften der konventionell modifizierten Nukleotide
Der Einfluß unterschiedlicher Linkergrößen, der chemischen Linkerzusammensetzung und die unterschiedlicher Größe und Beschaffenheit von niedermolekularen Markern auf die Substrat-Eigenschaften der Nukleotide (G. Wright et al. Pharmac.Ther. 1990, V. 47, S. 447, Klevan US Patent 4828979, Lee. et al. Nucleic Acid Research 1992, V. 20, 2471, J. Brandis Nucleic Acid Research, 1999, V.27, 1912 ) macht deutlich, dass bereits geringfügige Veränderungen an der Nukleotid- , Linker- und Marker-Struktur zu einer starken Veränderung der Substrateigenschaften der modifizierten Nukleotide führen können.
Folgerichtig läßt sich nachweisen, dass die Kopplung eines deutlich größeren Moleküls (z.B. eines Proteins) an ein konventionell modifiziertes Nukleotid zur Aufhebung von dessen Substrateigenschaften führt, s. Beispiel 34B.
Aus diesem Grund konnten bis jetzt signalverstärkende Makromoleküle nur nach erfolgtem enzymatischem Einbau der Nukleotide in die Nukleinsäurekette mit dem Nukleotid gekoppelt werden, wie beispielsweise markiertes Streptavidin an biotinylierte Nukleotide.
Ähnliches lässt sich feststellen, wenn Nukleotid-Monomere in einer Nukleinsäurekette betrachtet werden: nur niedermolekulare Stoffe können beispielsweise an ein Oligonukleotid in der Nähe der 3 '-OH-Posiition gekoppelt werden, falls dieses Oligonukleotid als Primer in weiteren Reaktionen auftreten sollte. Zu große Moleküle, z.B. Streptavidin, gekoppelt an ein Nukleotid-Monomer am 3 '-Ende oder in der Nähe des 3λ -Endes eines Oligonukleotids führen zum Verlust der Primereigenschaften. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden sein zu wollen, kann dies beispielsweise durch sterische Einflüsse der Makromoleküle erklärt werden. Die räumlichen Verhältnisse im aktiven Zentrum vieler Enzyme sind sehr anspruchsvoll und der katatalytische Mechanismus vieler Enzyme schließt komplexe konformationelle Änderungen der Enzym-Struktur selber sowie die der Substrate (Nukleotid-Monomere). In vielen Fällen führen auch nur geringfügige chemische Modifikationen an Nukleotid-Monomeren, die als Monomere einer Polymer-Kette auftreten, zu einer veränderten enzymatischen Akzeptanz der Nukleinsäureketten. Ein Beispiel dafür ist die alpha-thiophosphonat- Modifikation der Nukleotid-Monomere, die zur Exonuklease-Resistenz der Nukleinsäurekette führt.
Auch wenn eine Markierung mit Fluoreszenzfarsbtoffen einen breiten Einsatz in der modernen Diagnostik und Forschung gefunden hat, besteht nach wie vor ein dringeder Bedarf nach Signalverstärkung der biologisch aktiven markierten Molekülen. Man bedient sich oft einer sekundären Signalverstärkung durch Enzymreaktionen.
Trotz der naheliegenden Überlegung, eine mehrfache Markierung in Form einer makromolekularen Marker-Komponente an Nukleotide zu koppein, gelang es noch nicht, diesen Schritt durch einfache Kombination zwischen konventionellen Nukleotidstrukturen und einer makromolekularen Marker-Komponente unter Beibehaltung der Substrateigenschaft der Nukleotide zu realisieren.
Die Masse der konventionell modifizierten Nukleotide liegt im Wesentlichen im selben Bereich wie bei nicht modifizierten Nukleotiden, und ist relativ gering verglichen mit der Masse von Proteinen, wie z.B. Streptavidin oder Polymerasen. Die Steigerung der Masse des Nukleotids durch Einführung makromolekularer Komponenten kann zu Veränderung von biochemischen und physikalsichen Eigenschaften von Nukleotiden führen.
Die Überwindung dieses Nachteils des Standes der Technik gelang überraschenderweise durch die räumliche Trennung zwischen raumfordernden bzw. sterisch anspruchsvollen Bestandteilen der Nuk-Makromoleküle und der enzymatisch aktiven Nuk-Komponente. Diese räumliche Trennung kann beispielsweise durch die Einführung einer wesentlich längeren Linker-Komponente zwischen der Nük- Komponente und der Marker-Komponente, als es vom Stand der Technik bekannt war, erreicht werden. Überraschenderweise behalten die erfindungsgemäßen Nuk-Makromoleküle ihre Substrataktivität trotz der massiven Veränderungen in ihren Eigenschaften bei und können von Enzymen verwendet als Substrate werden. So bauen beispielsweise Polymerasen die erfindungsgemäßen Nuk-Makromoleküle in den wachsenden Strang ein. Terminale deoxy-Nucleotidyl-Transferase (TdT) können Nuk-Makromoleküle an ein 3X -Ende einer Nukleinsäure koppeln (Beispiel 34B,C und Beispiel 35).
Einem Fachmann sollte es naheliegend erscheinen, dass die Masse der erfindungsgemäßen Nuk-Makromoleküle ein vielfaches der natürlichen Nukleotide bildet und einen großen Einfluß auf die Nuk- Komponente ausübt.
Einsatzgebiete der Nuk-Makromoleküle:
Die Kopplung eines makromolekularen Markers an ein Substrat für Enzyme, an ein Nukleotid, bietet die Möglichkeit eines breiten Einsatzes dieser Nuk-Makromoleküle in unterschiedlichen Anwendungen in der Biotechnologie, Medizin und Wissenschaft.
Erfindungsgemäß können Nuk-Makromoleküle in Verfahren eingesetzt werden, bei denen Sie als Substrate für Enzyme dienen.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden Nuk-Makromoleküle in den Verfahren zur Markierung von Nukleinsäuren eingesetzt. Dabei erfolgt eine Einbaureaktion von Nuk-Makromolekülen nach allgemeinen Regeln der enzymatischen Verlängerungsreaktion von Nukleinsäureketten, ("Molecular Cloning", J. Sambrook, 3. Ed. 2001).
Der große Vorteil eines makromolekularen Markes pro ein eingebautes Nukleotid liegt in einer wesentlich höheren Signalstärke im Vergleich zu herkömmlichen modifizierten Nukleotiden.
Ein weiterer Vorteil ist die große Distanz des Markers zum Nukleinsäurestrang, so dass nur geringfügige Wechselwirkung zwischen dem Marker und dem Nukleinsäurestrang zu erwarten sind. Dies hat einen Einfluß beispielsweise auf die Fluoreszenzeigenschaften der Marker: Die Fluoreszenz der Marker wird von den Nukleobasen (Purine und Pyrimidine) nicht gequencht. Falls mehrere Nuk- Makromoleküle in einer Nukleinsäurekette eingebaut sind, führt eine größere Distanz zwischen dem Marker und der Nukleotid-Komponenten zu einer deutlichen Verminderung der Interaktion zwischen Markern von benachbarten Nukleotiden, Erfolgt die Markierung einer Nukleinsäurekette beispielsweise während der enzymatischen Synthese dieser Kette durch den Einbau von Nuk-Makromolekülen, so sind unter Umständen keine weiteren mehrstufigen Signalamplifikationsschritte mehr notwendig. Viele der bekannten Signalamplifikationsschritte, z.B. Biotin-Strepavidin- Antikörper, oder Digoxigenin-Antikörper I -Antikörper II laufen mit nur mäßigen Ausbeuten ab, wie z.B. Signalamplifikationen bei FISH-Analysen. Schwankende und schwache Ausbeuten in der Markierung verursachen ebenfalls Schwankungen und Schwäche im Signal, was zu Fehlinterpretationen führen kann. Durch den Einsatz von Nuk-Makromolekülen kann die Schäche der Markierung beseitigt werden. Durch den Einsatz von Nuk-Makromolekülen mit konstanten Signalmengen können auch die Schwankungen weitgehend ausgeglichen werden.
Die Markierung von Nukleinsäuren kann in unterschiedlichen Verfahren eingesetzt werden. Die konkreten Bedingungen der Nukleinsäurevorbereitung, die Reihenfolge der enzymatischen Schritte und Detektionsvorgänge hängen im einzelnen vom Verfahren ab, in dem die Markierung eingesetzt wird.
Insgesamt kann festgestellt werden, dass die erfindungsgemäßen Nuk-Makromoleküle eine überdurchschittliche Verbesserung der Markierungsstrategien der Nukleinsäureketten ermöglichen.
Modifizierte Nukleinsäureketten
In einer Ausführung der Erfindung schließen Nukleinsäureketten Nuk-Komponenten der Nuk-Makromoleküle als Einheiten der Kette ein. Die Nuk-Makromoleküle werden als Monomere einer Polymerkette, der Nukleinsäurekette, betrachtet. Solche Nukleinsäureketten mit integriereten Nuk-Makromolekülen können als Sonden und als Reaktionspartner in verschiedenen Bereichen eingesetzt werden (z.B. Real -Time- PCR, Ligase-Ketten-Reaktion).
In einer Ausführungsform ist ein Nuk-Makromolekül an das 5 '-Ende der Nukleinsäurekette integriert. In einer Ausführungsform ist ein Nuk-Makromolekül an das 3 '-Ende der Nukleinsäurekette integriert. In einer weiteren Ausführungsform ist ein Nuk-Makromolekül im Inneren der Nukleinsäurekette integriert, wobei der Abstand vom am nächsten liegenden Kettenende in folgenden Bereichen liegt (Zahl der Monomeren der Kette bis zum nächsten Kettenende): 1 bis 2, 2 bis 4, 4 bis 8, 8 bis 15, 15 bis 30, 30 bis 100, 100 bis 500. Ein Nuk-Makromolekül kann mehrere Nuk-Komponente einschließen. In einer Ausführungsform wird nur eine Nuk-Komponente eines Nuk-Makromoleküls in eine Nukleinsäurekette integriert, die anderen Nuk-Komponenten liegen in Monomer-Form vor. In einer anderen Ausführungsform können mehrere Nuk-Komponenten eines Nuk- Makromoleküls in unterschiedliche Nukleinsäureketten intergriert werden, wobei die Nukleinsäureketten unter einander identische oder auch unterschiedliche Sequenzen aufweisen können.
Besonders vorteilhaft ist der Einsatz mit Nuk-Makromolekülen modifizierter Nukleinsäureketten dann, wenn Nuk-Makromolekül als Teil einer Polymer-Kette an einer enzymatischen Reaktion / Umwandlung teilnimmt oder sich in unmittelbaren Nähe vom an der Reaktion teilnehmenden Nukleotid befindet. Durch den langen Linker der Nuk-Makromolekülen wird der Einfluß einer makromolekularen Marker- Komponente auf das Enzym stark reduziert, so dass die modifizierten Nukleotid- Komponenten an den enzymatischen Reaktionen (z.B. Primer-Funktion bei einer matrizen-abhängigen, polymerase-gesteuerten Reaktion, bei einer Ligase-abängigen Reaktion (z.B. Ligase-Ketten-Reaktion), 3 '-Exonuklease oder 5 '-Exonuklease- Aktivitäten verschiedener Enzyme, Endonuklease-Spaltung, ) teilnehmen können, bzw. die Reaktion an benachbarten Nukleotiden nicht beeinträchtigen (J. Wilhelm "Entwicklung Real-Time-PCR-basierter Methoden für die moderne DNA-Analytik" Dissertation, 2003, Gießen, S. Meuer "Rapid cycle real time PCR", Springer 2004, ISBN 3-540-66736-9, T. Weissensteiner "PCR-Technology: current innovations" CRC Press 2004 ISBN 0-8493-1184-5). Der Abstand zwischen der Position des Nuk- Makromoleküls in der Nukleinsäurekette und dem Nukleotid derselben Nukleinsäurekette, das als Substrat an der enzymatischen Reaktion teilnimmt, liegt beispielsweise in folgenden Bereichen (Zahl von Nukleotiden): 0 bis 3, 3 bis 6, 6 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 40. Zahl 0 bedeutet, dass das Nuk-Makromolekül direkt an das an der Reaktion teilnehmende Nukleotid gekoppelt ist.
Im weiteren folgen einige Beispiele zum Einsatz der Nuk-Makromoleküle.
Verfahren in der Flüssigphase
In einer Ausführungsform der Markierungsverfahren befinden sich die zu markierenden Nukleinsäureketten in der Flüssigphase, s. Beispiel 34, 35. Viele andere Verfahren, z.B. PCR, Nick-Translation, Random-Primer-Reaktion, reverse Transkription mit Reversen Transkriptasen und Transkription mit RNA-Polymerasen ("Molecular Cloning", 3. Sambrook, 3. Ed. 2001) können mit erfindungsgemäßen Nuk- Makromolekülen durchgeführt werden. Dabei werden Nuk-Makromoleküle ähnlich zu konventionell mit Farbstoff modifizierten Nukleotiden in die Reaktion zugegeben. Allgemeine Regeln der Verwendung konventionell modifizierter Nukletide, wie beispielsweise dCTP-Cy3 (Amersham Bioscience) oder dUTP-TMR (NEN) sind ausführlich in Literatur beschrieben ("Molecular Cloning", 3, Sambrook, 3. Ed. 2001). Beispielsweise kann für die Kopplung eines einzelnen komplementären Nukleotids an den Primer eine Art der Nuk-Makromoleküle, z.B. dATP oder dCTP, verwendet werden. Bei den meisten Reaktionen werden allerdings Gemische aus modifizierte und nicht modifizierten Nukleotiden eingesetzt (H. Yu et al. Nucleic Acid Research 1994, v. 22 3226-, "Molecular Cloning", J. Sambrook, 3. Ed. 2001). Beispielsweise können nicht markierte und markierte Nukleotide für eine Markierung mit einem Nuk-Makromolekül, bei dem dUTP als Nuk-Komponente auftritt, in folgenden Verhältnissen gemischt werden: dATP : dCTP : dGTP : dTTP : dUTP-Nuk-Makromolekül = 1:1:1:0,5:0,5 dATP : dCTP : dGTP : dTTP : dUTP-Nuk-Makromolekül = 1:1: 1:0,7:0,3 dATP : dCTP : dGTP : dTTP : dUTP-Nuk-Makromolekül = 1:1:1:0,9:0,1 oder dATP : dCTP : dGTP : dTTP : dUTP-Nuk-Makromolekül = 1:1:1:0,7:0,3 oder dATP : dCTP : dGTP : dTTP : dUTP-Nuk-Makromolekül = 1:1:1:0,95:0,05 die genaue Mischverhältnisse können für einzelne Markierungsreaktionen optimiert werden. Auch mehrere Arten der Nuk-Mäkromoleküle können in einer Reaktion eingesetzt werden. Beispielsweise können Nuk-Makromoleküle unterschiedliche Markierung tragen. In einer Ausführungsform werden die Marker der Nuk-Makromoleküle so gewählt, dass sie ein .FRET-Paar bilden ( Faner, R et al. Hum Immunol 2004, v.65, 826-38, Lazowski, K. W et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 2000, v.10, 97-103, Talavera, E. M., Appl Spectrosc 2003, v.57, 208-15, Tsourkas, A. et al. Anal Chem, 2003, v. 75, 3697-703, Singh, K. K., et al. Methods Mol Biol 2004, v.252, 33-48, Wang, L., Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc , 2004, v.60, 2741-50 ). Nach dem Einbau solcher Nuk-Makromoleküle in die wachsende Nukleinsäurekette verringert sich die durchschnittliche Distanz zwischen den Fluorophoren, so dass es bei der Anregung des Donors zu FRET an den Akzeptor kommt. Da die Nuk- Makromoleküle eine deutlich stärkere Markierung tragen als die konventionell modifizierten Nukleotide, kann die Signalintensität eines FRET-Signal deutlich größer sein. Die genauen Bedingung der Reaktion können im Hinblick auf die Wahl der Fluorophore, ihre Kopplung im Nuk-Makromolekül, die Konzentration der Nuk- Makromoleküle und Verhältnis zwischen den Nuk-Makromolekülen und nicht markierten Nukleotiden optimiert werden. Als generelle Regel gilt dabei, dass die durchschnittliche Distanz zwischen den Fluorophoren eines FRET-Paars sollte unter 10 nm liegen. Festphasenverfahren
In einer weiteren Ausführungsform der Markierungsverfahren sind die zu markierenden Nukleinsäureketten oder deren komplementären Stränge an einer festen Phase fixiert. Viele Verfahren zur Markierung von immobilisierten Nukleinsäureketten mit konventionell modifizierten Nukleotiden sind bekannt (Suomalainen A et al. Methods Mol Biol. 2003, Pirrung MC et al. Bioorg Med Chem Lett. 2001 Sep 17; 11(18): 2437-40), Beispiele für die feste Phase stellen Mikrokügelchen (Spherotech Ine, Streptavidin-polystyre Particle, 2„17μ). Im Beispiel 34C wird eine Einbaureaktion von Nuk-Makromolekülen an fester Phase beschrieben. Ein weiteres Beispiel für die feste Phase stellen planen Oberflächen, an die Nukleinsäuren gebunden sind.
Die Nuk-Makromoleküle eignen sich für Analysenverfahren mit einer Einbaureaktion an den an einer festen Phase gekoppelten Nukleinsäuren, sie können ähnlich zu konventionell modifizierten Nukleotiden in vielen Verfahren eingesetzt werden, wie beispielsweise Minisequencing (Suomalainen A et al. Methods Mol Biol. 2003;226:361- 6. Liljedahl U et al. Pharmacogenetics. 2003 Jan;13(l):7-17, Olsson C et al. Methods Mol Biol. 2003;212: 167-76), Primer-Extension (Pirrung MC et al. Bioorg Med Chem Lett. 2001 Sep 17;ll(18):2437-40, Cai H, et al. Genomics. 2000 Jun 1;66(2):135- 43., Kurg A et al. Genet Test. 2000;4(l):l-7., Pastinen T et al. Genome Res. 1997 Jun;7(6):606-14). US pat. 6287766, US pat. 2003148284, US pat. 2003082613, EP 1256632, WO0194639, WO 2004/076692, Ju et al. US Pat. 6664079. Fest-Phasen- PCR (WO 9626291, WO 9409156, US Pat. 6221635), Sequenzierung durch die Synthese (Ju et al US Pat. 6664079), Single-Molecular-Sequencing (Tcherkassov WO 02088382, Seeger WO 0018956, Kartalov WO 02072892). In vielen Fällen erfolgt dabei eine Synthese der komplementären Stränge an den fixierten Primer-Matrizen- Komplexen.
Viele Analyse- Verfahren bei denen Nukleinsäureketten fixiert sind, benötigen routinemäßig Vervielfältigungsschritte. In solchen Verfahren können Nuk- Makromoleküle einen besonders großen Vorteil bringen, da die Signal-Intensität überdurchschnittlich gesteigert wird. Die Zahl der signalgebenden Marker-Einheiten von Nuk-Makromolekülen kann eine noch während der Synthese festgelegte Größe aufweisen, so dass die Intensität des Signal von den eingebauten Nuk- Makromolekülen quantifiziert werden kann.
Bei solchen Verfahren können Nuk-Makromoleküle eingesetzt werden, die fluoreszente, radioaktive oder Enzyme als Marker-Einheiten einschließen. Sehr vorteilhaft bei solchen Verfahren ist die Verwendung von Nuk-Makromolekülen mit Fluoreszenzsignalen, da die Fluoreszenz eine hohe Sensitivität aufweist.
In einer Ausführung solcher Verfahren erfolgt die Detektion der Fluoreszenz-Signale von den Markern der eingebauten Nuk-Makromoleküle. Dabei können auch FRET- Paare zwischen einzelnen Nuk-Makromolekülen verwendet werden. In einer weiteren Ausführung können bei der Markierung an einer festen Phase fixierten Nukleinsäureketten markierte Primer eingesetzt werden, wobei die Primer in einer Ausführungsform einen oder mehrere Nuk-Makromoleküle einschließen und in einer weiteren Ausführungsform eine konventionelle Markierung einschlißen.
In diesen beiden Ausführungsformen kann die Markieung am Primer als ein Teil eines FRET-Paars auftreten. Der an Primer gekoppelte Partner eines FRET-Paars kann dabei als Donor als auch als Akzeptor während der Detektion auftreten. Die eingebauten Nuk-Makromoleküle mit einem entsprechenden Partner des FRET-Paars können dabei einen abspaltbaren oder auch einen nicht abspaltbaren Marker tragen.
Durch den Einsatz des FRET zwischen den eingebauten Nuk-Makromolekülen oder der Primer-Markierung und den eingebauten Nuk-Makromolekülen kann eine große Steigerung der Signalspezifität erzielt werden. Die Detektion kann dabei in einer Ausführungsform während des Einbaus in einer anderen Ausführugnsform als separater Schritt des Verfahrend erfolgen.
In einer Ausführungsform tragen Nuk-Makromoleküle mit Nuk-Komponente einer Art (beispielsweise dTTP) vorzugsweise eine für sie spezifischen Marker-Komponente, so dass beispielsweise 4 Arten der Nuk-Makromoleküle (entsprechend dem dTTP, dCTP, dATP und dGTP) gleichzeitig eingesetzt und unterschieden werden können. Andere Markierungsschema sind in bekannt s. z.B. Tcherkassov WO 02088382. Je nach Verfahren werden auch nicht markierte, z.B. natürliche Nukleotide in das Reaktionsgemisch zusammen mit den Nuk-Makromolekülen zugegeben.
In einer Ausführungsform der Markierungsverfahrens werden Nuk-Makromoleküle eingesetzt, die den Einbau nur einer einzelnen Nuk-Komponente in den wachsenden Nukleinsäure-Strang erlauben und der mehrfache Einbau durch Modifikationen an der Nuk-Komponente, und/oder der Linker-Komponente und/oder der Marker-Komponente verhindert wird. Der weitere Einbau kann sowohl reversibel als auch irreversibel verhindert werden. Ein irreversibler Stopp kann beispielsweise durch den Einsatz von Nuk-Makromolekülen erreicht werden, die als Nuk-Komponente ein Dideoxi- Nukleosidtriphosphat einschließen. Ein reversibler Stops kann in einem weiteren Verfahrensschritt aufgehoben werden, so dass weitere Einbaureaktionen stattfinden können. Beispiele für eine reversible Blockade der Reaktion sind in Anmeldungen (Metzker et al. Nucleic acid Research 1994, V.22, S. 4259, Canard et al. Gene, 1994, V. 148, 1, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642, Tcherkassov WO 02088382, Ju et al. US Pat. 6664079, Milton et al. WO 2004018497, Milton et al. WO 2004018493, Balasubramanian et al. WO 03048387) beschrieben.
In einer anderen Ausführungsform verhindern die bereits eingebauten Nuk- Makrpmoleküle den weiteren Einbau von Nukleotiden nicht. Falls ein Gemisch aus modifizierten und nicht modifizierten Nukleotiden eingesetzt wird, können nach dem Einbau von einem Nuk-Makromolekül auch weitere Nuk-Makromoleküle in den wachsenden Strang nacheinander eingebaut werden.
Die feste Phase kann beispielsweise eine plane Oberfläche oder Kügelchen (Beads) oder eine Art von Multigefäßarrays (z.B. Microtiterplatte, Nanotiterplatte) darstellen. Dabei können Nukleinsäuren mit verschiedenen Methoden an die feste Phase gekoppelt werden (McGaIl et al. US Patent 5412087, Nikiforov et al. US Patent 5610287, Barrett et al. US Patent 5482867, Mirzabekov et al. US Patent 5981734, "Microarray biochip technology" 2000 M.Schena Eaton Publishing, "DNA Microarrays" 1999 M. Schena Oxford University Press, Rasmussen et al. Analytical Biochemistry v.198, S.138, Allemand et al. Biophysical Journal 1997, v.73, S.2064, Trabesinger et al. Analytical Chemistry 1999, v.71, S.279, Osborne et al. Analytical Chemistry 2000, v.72, S.3678, Timofeev et al. Nucleic Acid Research (NAR) 1996, v.24 S.3142, Ghosh et al. NAR 1987 v.15 S.5353, Gingeras et al. NAR 1987 v.15 S.5373, Maskos et al. NAR 1992 v.20 S.1679). Es sind Verfahren zur Vervielfältigung der Nukleinsäureketten ausgehehd von einzelnen Molekülen beschrieben. Solche Verfahren können zur Ausbildung ortsspezifisch gebundener Populationen der Nukleinsäureketten mit identischer Sequenz eingesetzt werden, wobei sowohl plane Oberflächen als auch Beads verwendet werden können. Vorzugsweise sind die zu analysierenden Nukleinsäurestränge mit einem Primer versehen, so dass es ein Primer-Matrizen- Komplex ausgebildet ist und daran eine enzymatische Synthese eines komplementären Stranges stattfinden kann ("Molecular Cloning", Maniatis, 3. Ed. 2001).
Primer-Extension:
In einer Ausführungsform des Verfahrens erfolgt die Einbaureaktion von Nύk- Makromolekülen an einer einzigen Population einheitlicher, an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle, wobei die Marker-Komponente des Nuk-Makromoleküls nach dem Einbau am verlängerten Primer verbleibt und nicht abgetrennt wird.
Solche Verfahren schließen im wesentlichen folgende Schritte ein: 1) Bereitstellung einer festen Phase mit fixierten Primer-Matrizen-Komplexen
2) Inkubation der bereitgestellten festen Phase mit einer Reaktionslösung, die eine oder mehrere Arten der Polymerasen, eine oder mehrere Arten der Nuk- Makromoleküle enthält, wobei die Nuk-Makromoleküle durch ihre Markierung eindeutig identifiziert werden können. 3) Enfernung der Reaktionslösung und waschen der festen Phase
4) Detektion der Signale von eingebauten Nuk-Makromolekülen und die Zuordnung der Art der eingebauten Nuk-Makromoleküle aufgrund ihrer Signaleigenschaften.
Sequenzierung: In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens erfolgt die Einbaureaktion von Nuk- Makromolekülen an einer einzigen Population einheitlicher, an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle, wobei die Marker-Komponente oder ihre einzelnen Komponenten mit oder ohne Linker-Komponente des Nuk-Makromoleküls während der Einbaureaktion oder nach der Einbaureaktion von der N uk- Komponente abgetrennt wird.
Solche Verfahren schließen im wesentlichen folgende Schritte ein:
1) Bereitstellung einer festen Phase mit fixierten Primer-Matrizen-Komplexen
2) Inkubation der bereitgestellten festen Phase mit einer Reaktionslösung, die eine oder mehrere Arten der Polymerasen, eine oder mehrere Arten der Nuk- Makromoleküle enthält, wobei die Nuk-Makromoleküle durch ihre Markierung eindeutig identifiziert werden können.
3) Enfernung der Reaktionslösung und waschen der festen Phase
4) Detektion der Signale von eingebauten Nuk-Makromolekülen und die Zuordnung der Art der eingebauten Nuk-Makromoleküle aufgrund ihrer Signaleigenschaften. 5) Entfernung der Marker-Komponente von den eingebauten Nuk-Makromolekülen 6) Wiederholung der Schritte 2 bis 5
Die Wiederholung kann beispielsweise 1 bis 2, 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 30 mal durchgeführt werden.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens erfolgt der Einbau von Nuk- Makromolekülen in einer enzymatischen Reaktion parallel an zwei oder mehreren unterschiedlichen Populationen einheitlicher, an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle, wobei diese Populationen adressierbare Positionen an der festen Phase haben, wobei die Marker-Komponente des Nuk-Makromoleküls nach dem Einbau am verlängerten Primer verbleibt und nicht abgetrennt wird. Die adressierbaren Positionen können beispielsweise die Form von Spots haben, im Falle einer planen Oberfläche. Bei der Verwendung von Kügelchen als feste Phase werden unterschiedliche Populationen von Nukleinsäuren an unterschiedlichen Kügelchen fixiert. Bei der Verwendung von Multigefäßarrays (z.B. Mikrotiter-Platte, oder Nanotiter-Platte) sind einzelne Nukleinsäurepopulationen in einzelnen Gefäßen getrennt fixiert.
Solche Verfahren schließen im wesentlichen folgende Schritte ein:
1) Bereitstellung einer festen Phase mit fixierten Primer-Matrizen-Komplexen
2) Inkubation der bereitgestellten festen Phase mit einer Reaktionslösung, die eine oder mehrere Arten der Polymerasen, eine oder mehrere Arten der Nuk- Makromoleküle enthält, wobei die Nuk-Makromoleküle durch ihre Markierung eindeutig identifiziert werden können.
3) Enfernung der Reaktionslösung und waschen der festen Phase
4) Detektion der Signale von eingebauten Nuk-Makromolekülen und die Zuordnung der Art der eingebauten Nuk-Makromoleküle aufgrund ihrer Signaleigenschaften.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens erfolgt der Einbau von Nuk- Makromolekülen in einer enzymatischen Reaktion parallel an zwei oder mehreren unterschiedlichen Populationen einheitlicher, an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle, wobei diese Populationen adressierbare Positionen an der festen Phase haben. Die einheitlichen Nukleinsäurepopulationen können durch unterschidliche Verfahren an die Oberfläche fixiert werden (s.o.). Die Marker- Komponente oder ihre einzelnen Komponenten mit oder ohne Linker-Komponentedes Nuk-Makromoleküls wird bei dieser Ausführungsform während der Einbaureaktion oder nach der Einbaureaktion vom der eingebauten Nuk-Komponente abgetrennt. Für solche Verfahren eignen sich Nuk-Makromoleküle mit spaltbaren Verbindungen im Linker. Die adressierbaren Positionen können beispielsweise die Form von Spots haben, im Falle einer planen Oberfläche. Bei der Verwendung von Kügelchen als feste Phase werden unterschiedliche Populationen von Nukleinsäuren an unterschiedlichen Kügelchen fixiert. Bei der Verwendung von Multigefäßarrays sind einzelne Nukleinsäurepopulationen in einzelnen Gefäßen getrennt fixiert.
Solche Verfahren schließen im wesentlichen folgende Schritte ein:
1) Bereitsteilung einer festen Phase mit fixierten Primer-Matrizen-Komplexen 2) Inkubation der bereitgestellten festen Phase mit einer Reaktionslösung, die eine oder mehrere Arten der Polymerasen, eine oder mehrere Arten der Nuk- Makromoleküle enthält, wobei die Nuk-Makromoleküle durch ihre Markierung eindeutig identifiziert werden können. 3) Enfernung der Reaktionslösung und waschen der festen Phase
4) Detektion der Signale von eingebauten Nuk-Makromolekülen und die Zuordnung der Art der eingebauten Nuk-Makromoleküle aufgrund ihrer Signaleigenschaften.
5) Entfernung der Marker-Komponente von den eingebauten Nuk-Makromolekülen
6) Wiederholung der Schritte 2 bis 5 Die Wiederholung kann beispielsweise 1 bis 2, 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 30, 30 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200 mal durchgeführt werden.
Ein einer Ausführungsform eines solchen Verfahrens werden im Schritt (2) Nuk- Makromoleküle zusammen mit den anderen modifizierten Nukleotiden eingesetzt. Dabei erfolgt die Synthese des komplementären Stranges -schrittweise: pro ein Syntheseschritt werden komplementäre Stränge maximal um ein Nukleotid verlängert. Die Kontrolle der enzymatischen Reaktion erfolgt dabei durch reversible Terminatoren. Vorzugsweise werden die an 3 '-OH-Gruppe modifizierten Terminatoren eingesetzt, die keine weiteren Modifikationen an der Base tragen. Nach der Abspaltung der Modifikation vom eingebauten Nukleotid kann weitere Synthese an diesen Strängen stattfinden. Die Struktur der in dieser Ausführungsform eingesetzten Nuk- Makromoleküle kann unterschiedlich sein. Vorzugsweise sind es terminierende Nuk- Makromoleküle, d.h. nach ihren Einbau kann kein weiteres Nukleotid durch eine Polymerase eingebaut werden. Der Linker ist vorzugsweise an die Base der Nuk- Komponente gekoppelt und schließt eine spaltbare Verbindung ein. Das Zusammenmischen der Nuk-Makromoleküle mit terminierenden Eigenschaften und der reversiblen Terminatoren erlaubt an einer Population der Nukleinsäureketten die Markierung und die reversible Termination zu trennen. Da die Nuk-Makromoleküle in dieser Ausführungsform des Verfahrens terminierend wirken, steht in jedem weiteren Einbauschritt eine geringerere Anzahl an Strängen für weitere Sequenzierungsreaktion zur Verfügung. Damit eine Einbaureaktion in weiteren Schritten stattfinden kann, muß ein Teil der Stränge in jedem Schritt reversibel blockiert werden. Der Anteil der mit Nuk-Makromolekülen modifizierten Nukleinsäureketten kann sehr gering sein, da die Signalstärke der Nuk-Makromoleküle sehr groß sein kann. Das Verhältnis zwischen den Nuk-Makromolekülen und reversiblen Terminatoren in einem Reaktionsschritt kann beispielsweise in folgenden Bereichen liegen: zwischen 100 :1 und 1:10, zwischen 10 :1 und 1:1, 1 :1 und 1: 10, zwischen 1:10 und 1: 100, zwischen 1: 100 und 1: 1000 (Konzentration von Nuk-Makromoleküle : Konzentration von reversiblen Terminatoren). Dieses Verhältnis kann während der gesamten Sequenzierunsreaktion konstant bleiben oder varisieren. Da Polymerasen die Nuk-Makromoleküle und die reversible Terminatoren unterschiedlich gut akzeptieren können, können mehrere Polymerase-Arten während des Einbauschritts eingesetzt werden. Die Entfernung der Signale nach der Detektion führt zu einem besseren Signal- Rauschen-Verhältnis bei den nächsten Detektionen und ist typisch für die Verfahren der Sequenzierung durch die Synthese. Die Aufhebung der reversiblen Terminierung kann in einem eigenen Schritt erfolgen oder beispielsweise mit dem Schritt der Entfernung der Markierung zusammenfallen. Der Vorteil des Einsatzes der Nuk-Makromoleküle besteht darin, dass die Markierung eines geringen Anteils der Gesamtpopulation zur Detektion des Einbauereignisses ausreicht. Dies erlaubt mit wesentlich geringeren Mengen des Ausgangsmaterials die Sequezierungsreaktion durchzuführen. Die Verwendung von reversiblen Terminatoren mit einer Schutzgruppe an der 3 '-Position und einer Base ohne Modifikation führt dazu, dass das nach der Entferung der blockierenden Gruppe in der Nukleinsäurekette verbleibende Nukleotid keine weiteren Modifikationen trägt und somit als natürliches Substrat von Polymerasen gut akzeptiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahren, werden folgende Schritte durchgeführt:
a) Bereitstellung mindestens einer Population an einzelsträngigen Nukleinsäureketten b) Hybridisierung von sequenzspezifischen Primern an diese Nukleinsäureketten, wobei extensionsfähige NSK-Primer-Komplexe entstehen c) Inkubation von mindestens einer Art der Nuk-Makromoleküle nach Aspekten 1 bis 25 zusammen mit einer Art der Polymerase nach Aspekt 31 mit den in Schritten a und b bereitgestellten NSK-Primer-Komplexen unter Bedingungen, die den Einbau von komplementären Nuk-Makromolekülen zulassen, wobei jede Art der Nuk-Makromoleküle eine für sie charakteristische Markierung besitzt. d) Entfernung der nicht eingebauten Nuk-Makromoleküle von den NSK- Primer-Komplexen e) Detektion der Signale von in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten
Nuk-Makromolekülen f) Entfernung der Linker-Komponente und der Marker-Komponente von den in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nuk-Makromolekülen g) Waschen der NSK-Primer-Komplexe gegebenenfalls Wiederholung der Schritte (c) bis (g),
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens erfolgt die Einbaureaktion von NT- Makromolekülen gleichzeitig an einer Population unterschiedlicher, an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle, wobei diese Nukleinsäuremoleküle in einer zufälligen Anordnung an die feste Phase gebunden sind (Tcherkassov WO 02088382). Bei diesem Verfahren werden Sequenzen von einzelnen Nukleinsäurekettenmolekülen ermittelt. Die an der enzymatischen Reaktion teilnehmende Primer- Nukleinsäurekomplexe sind in einer Dichte fixiert, die die Detektion der Signale von einzelnen Nuk-Makromolekülen ermöglicht, die an ein einzelnes Nukleinsäure-Molekül gekoppelt sind, wobei die Dichte der fixierten Primer oder Nukleinsäuren wesentlich höher liegen kann. Beispielsweise beträgt die Dichte der an der Einbaureaktion teilnehmenden Primer-Nukleinsäurekomplexe von 1 Komplex auf 10μm2 bis 1 Komplex auf lOOμm2, von 1 Komplex auf lOOμm2 bis 1 Komplex auf lOOOμm2, von 1 Komplex auf lOOOμm2 bis 1 Komplex auf lO.OOOμm2.
Beispiele der Fixierung der Nukleinsäuren an die feste Phase mit einer Auflösung, die Analysen an einzelnen Molekülen erlaubt sind in WO0157248, US Pat. 2003064398, US Pat.2003013101 und WO 02088382 dargestellt. Eine passende Detektionsapparatur ist in der Anmeldung WO 03031947 beschrieben.
Die Zahl der parallel zu analysierenden einzelnen Nukleinsäuremoleküle liegt beispielsweise zwischen 1000 und 100.000, 10.000 bis 1.000.000, 100.000 bis 10.000.000 Moleküle. Wobei die Marker-Komponente oder ihre einzelnen Komponenten mit oder ohne Linker- Komponente des Nuk-Makromoleküls während der Einbaureaktion oder nach der Einbaureaktion von der Nuk- Komponente abgetrennt wird..
Dieses Verfahren zur parallelen Sequenzanalyse von Nukleinsäuresequenzen (Nukleinsäureketten, NSKs) schließt folgende Schritte ein, man:
- Fragmente (NSKFs) einzelsträngiger NSKs mit einer Länge von etwa 50 bis 1000 Nukleotiden erzeugt, die überlappende Teilsequenzen einer Gesamtsequenz darstellen können, man - die NSKFs unter Verwendung eines einheitlichen oder mehrerer unterschiedlichen Primer in Form von NSKF-Primer-Komplexen auf einer Reaktionsoberfläche in einer zufälligen Anordnung bindet, wobei die Dichte der an die Oberfläche gebudenen NSKF-Primer-Komplexen eine optische Detektion der Signale von einzelnen eingebauten Nuk-Makromolekülen zuläßt, man
- eine zyklische Aufbaureaktion des komplementären Stranges der NSKFs unter Verwendung einer oder mehrerer Polymerasen durchführt, indem man
a) zu den auf der Oberfläche gebundenen NSKF-Primer-Komplexen eine Lösung zugibt, die eine oder mehrere Polymerasen und ein bis vier Nuk- Makromoleküle enthält, die eine mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Marker- Komponente haben, wobei die bei gleichzeitiger Verwendung von mindestens zwei Nuk-Makromoleküle jeweils an die Marker-Komponente befindlichen
Fluoreszenzfarbstoffe so gewählt sind, dass sich die verwendeten Nuk- Makromoleküle durch Messung unterschiedlicher Fluoreszenzsignale voneinander unterscheiden lassen, wobei die Nuk-Makromoleküle strukturell so modifiziert sind, dass die Polymerase nach Einbau eines solchen Nuk- Makromoleküls in einen wachsenden komplementären Strang nicht in der
Lage ist, ein weiteres Nuk-Nakromolekül in denselben Strang einzubauen, wobei die Linker-Komponente mit der Marker-Komponente abspaltbar sind, man
b) die in Stufe a) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen inkubiert, die zur Verlängerung der komplementären Stränge geeignet sind, wobei die komplementären Stränge jeweils um ein Nuk-Makromolekül verlängert werden, man
c) die in Stufe b) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung nicht in einen komplementären Strang eingebauter Nuk-Makromoleküle geeignet sind, man
d) die einzelnen, in komplementäre Stränge eingebauten Nuk- Makromoleküle durch Messen des für den jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff charakteristischen Signals detektiert, wobei man gleichzeitig die relative Position der einzelnen Fluoreszenzsignale auf der Reaktionsoberfläche bestimmt, man e) zur Erzeugung unmarkierter (NTs oder) NSKFs die Linker- Komponente und die Marker-Komponente von den am komplementären Strang angefügten Nuk-Komponenten abspaltet, man
f) die in Stufe e) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung der Marker-Komponente geeignet sind, man
die Stufen a) bis f) gegebenenfalls mehrfach wiederholt,
wobei man die relative Position einzelner NSKF-Primer-Komplexe auf der Reaktionsoberfläche und die Sequenz dieser NSKFs durch spezifische Zuordnung der in Stufe d) in aufeinanderfolgenden Zyklen an den jeweiligen Positionen detektierten Fluoreszenzsignale zu den Nuk-Makromolekülen bestimmt.
Anwendung von Nukleinsäuereketten, die Nuk-Makromoleküle einschließen.
Nach dem Einbau eines Nuk-Makromolekül an das 3 " -Ende der Nukleinsäure behalten die nun ihrerseits modifizierten Nukleinsäureketten überraschenderweise die Fähigkeit zur Kopplung weiterer Nukleotide an die 3 Λ -Hydroxylgruppe durch Polymerasen, s. Beispiel 34C. Dies bedeutet, dass nicht nur die Nuk-Komponente in den Nuk- Makromolekülen sondern auch die mit diesen Nuk-Makromolekülen modifizierten Nukleinsäureketten für die Enzyme zugängig bleiben können und in unterschiedlichen Bereichen der Biotechnologie eine Anwendung finden. Nicht nur am 3 '-Ende mit Nuk- Makromolekülen modifizierte Nukleinsäureketten, sondern Nukleinsäureketten, die am 5 '-Ende oder im inneren Bereich des Nukleinsäurepolymers eines oder mehrere Nuk- Makromoleküle als Monomere einschließen, behalten ihre Substrateigenschaften für Polymerasen, Exonukleasen und Ligasen. Beispiele für die Anwendungen von mit Nuk- Makromolekülen modifizierten Oligonucleotiden sind dem Fachmann bekannt, z.B. in den Primer-Extension-Reaktionen, Real Time PCR oder Ligase-Reaktionen.
Wahl der Enzyme:
Nukleotide spielen als Monomere eine zentrale Rolle in unterschiedlichen Stoffwechselvorgängen, beispielsweise bei der Speicherung und Übertragung der genetischen Information in der Zelle ("Genes V" B. Lewin, 1994). Auch sind Nukleotide als Energieträger der Zelle bekannt (ATP, UTP), oder Signalvemittler (Messenger, GTP) der intrazellulären Signalvermittlung ("Biochemie und Pathobiochemie", G. Löffler, 2003). Aus diesem Grund werden Nukleotide und ihre Analoga als Therapeutika und Diagnostika eingesetzt.
Gekoppelt in Nukleinsäurepolymere (Nukleinsäureketten) stellen die Nukleotid- Monomere die Basis für die Informationsspeicherung in den lebenden Organismen dar.
Nuk-Makromoleküle haben das Potenzial, in unterschiedlichen Bereichen der Biotechnologie eine Anwendung zu finden.
Die Möglichkeit einer Kopplung der Nukleotide an ein Makromolekül unter Beibehaltung der Substrateigenschaften der Nukleotide eröffnet viele Wege auch für eine gezielte Adressierung der modifizierten Nukleotiden innerhalb eines Organismus oder einer Zelle, so dass Nuk-Makromoleküle ein neues grundsätzliches Model für Nukleotid-Prodrugs darstellen.
Als Enzyme können beispielsweise unterschiedliche Sorten von Polymerasen verwendet werden ("DNA Replication", Kornberg, 2. Ed. 1992), im einzelnen DNA- abhängige DNA-Polymerasen, RNA-abhängige DNA-Polymerasen, DNA-abhängige . RNA-Polymerasen und RNA-abhängige RNA-Polymerasen. Dabei können sowohl thermostabile als auch thermolabile Polymerasen verwendet werden, wie beispielsweise Klenow-Polymerase oder Taq-Polymerase. Andere Beispiele für mögliche Polymerasen findet ein Fachmann in der hier zitierten Literatur. Ein weiteres Beispiel für Enzyme stellen Transferasen, wie Terminale Deoxynucleotidyltransferase ("Molecular Cloning", Maniatis, 3. Ed. 2001), dar. Auch andere Enzyme und Proteine (beispielsweise Kinasen, Membranrezeptoren) die Nukleotide als Substrate), Energiequelle, Cofaktoren oder als Messenger-Substanzen akzeptieren können verwendet werden.
Enzyme unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit, modifizierte Nukleotide als Substrate zu akzeptieren. Einem Fachmann sollte es naheliegend erscheinen, dass verschiedene funktionelle Tests eingesetzt werden müssen, um bestimmte Eigenschaften von Nukleotiden zu untersuchen und anzuwenden. Beispiele für unterschiedliche Testabläufe für die Markierung von Nukleinsäuren sind in H. Held et al. Nucleic Acid Research 2002, V. 30, S. 3857, M. Metzger et al. Nucleic Acid Research 1994, V. 22, 4259, M. Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta 1994, V.77, S. 586 , B. Canard et al. PNAS 1995, V. 92, S. 10859 , Canard US Pat. 5798210, J. Hovinen et al. J. Chem. Soc. Perkin 1994, 1994, 211 und auch in anderen hier zitierten Patenten und Publikationen angegeben. Die passenden Kombinationen zwischen Polymerasen und modifizierten Nukleotiden können für den jeweiligen Zweck entsprechend gewählt werden. Beispiele für den Einbau von Nuk-Makromolekülen in die Primer sind in Beispiel 34 angegeben. Die angegebenen Beispiele dienen nicht zur Einschränkung der Verwendungsmöglichkeit von Nuk-Makromolekülen, sondern sollten dem Fachmann den Unterschied in Eigenschaften der Nuk-Makromoleküle zu den konventionellen modifizierten IMT darstellen.
Nuk-Makromoleküle oder deren Zwischenprodukte können auch in der konventionellen chemischen Oligonucleotidsynthese verwendet werden, beispielsweise in einer Festphasensynthese (Giegrich, "Neue photolabile Schutzgruppen für die lichtgesteuerte Oligonucleotidsynthese", 1997, Beier, "Neue Strategien zum Aufbau von RNA- und DNA-Oligonucleotiden", 1996), dabei trägt die Nuk-Komponente der Nuk-Makromoleküle entsprechende Modifikationen, die eine chemische Kopplung an die Nukleinsäurekette erlaubt, wie beispielsweise in Herrlein, "Synthese von modifizierten Nukleosiden, Nukleotiden und Oligonukleotiden", 1993, Gugler, "Aufbau und Anwendung von Systemen zur vereinfachten chemo-enzymatischen Synthese von Oligonukletid-Hybridisierungssonden", 1993, Schmidt, "Neue Methoden zur Synthese und Isolierung langkettiger Oligonucleotide", 1991, Bühler, "Neue photolabile Schutzgruppen für die Oligonucleotidsynthese", 2000, Bretzger, "Wege zur präparativen Oligonucleotidsynthese" 1991, Stengele, "Automatisierte Oligonucleotidsynthese unter Verwendung [beta]-elirninierbare Schutzgruppen", 1991).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Methode zur schnellen Reinigung der von markierten Nukleotiden direkt vor ihrem Einsatz in die Markierungsreaktion.
Verfahren zur Sequenzierung einzelner Moleküle (z.B. Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382, Kartalov WO02072892) benötigen markierte Nukleotide in einem sehr sauberen Zustand, weil Verunreinigungen einer markierten Nukleotidpräparation mit nicht markierten Nukleotiden einen Sequenzfehler verursachen können. Aus diesem Grund ist es wichtig, dass die markierten Nukleotide möglichst frei von nicht markierten Nukleotiden sind. Viele Nukleotidmodifikationen, die in solchen Verfahren eingesetzt werden, haben eine oder mehrere unter milden Bedingungen spaltbare Gruppe (Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382) Während der Lagerung können solche Nukeotide zu einem Teil zerfallen und stellen die Quelle für Nukleotidanaloga ohne Markierung dar, die beim Einbau in die Nukleinsäure zu einem Sequenzfehler führen würden.
Dieses Problem führt dazu, dass eine Reinigung direkt vor dem Einsatz markierter Nukletide durchgeführt werden muß. Eine Standardreinigung für modifizierten Nukleotide ist beispielsweise eine HPLC-Reinigung mit Wasser-Methanol-Gradient. Nach einer solchen Reinigung muß die Fraktion mit modifizierten Nukleotiden aufgearbeitet werden, beispielsweise durch Lyophilisation. Eine solche Reinigung stellt eine aufwendige Prozedur dar.
Nuk-Makromoleküle können erfindungsgemäß direkt vor dem Gebrauch durch eine Ultrafiltration von geringsten Verunreinigungen befreit werden.
Es werden Filter mit einer Porengröße ausgewählt, die für Nukleotide ohne Marker- Anteile frei passierbar sind. Die mit einem makromolekularen Marker modifizierten Nukleotide können aber durch den Filter nicht durchgehen. Durch eine solche Reinigung gelingt es in kurzer Zeit Nuk-Makromoleküle in einem sehr sauberen Zustand zu erhalten.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von modifizierten Klenow- Fragment Exo-minus der DNA-Polymerase zusammen mit den Nuk-Makromolekülen in den enzymatischen Reaktionen, wobei die SH-Gruppe des Cysteins des Klenow- Fragments Exo-minus der DNA-Polymerase chemisch modifiziert ist. Diese Modifizierung ist vorzugsweise eine kovalente Modifizierung. Beispiele für eine solche Modifizierung stellt eine Alkylierung an der SH-Gruppe dar, z.B. mit alpha- Halogen-Acetyl-Derivate, wie beispielsweise Iodacetamid und seinen Derivaten, Iodacetat und seinen Derivaten, oder mit N-Maleimid-Derivaten, weitere selektive SH- Gruppen Reagenten sind in „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc. beschrieben. Diese Modifizierung kann auch durch einen Fluoreszenzfarbstoff erfolgen. Aktivierte Fluoreszenzfarbstoffe, die selektiv mit SH- Gruppen reagieren, sind kommerziell erhältlich, z.B. von Molecular Probes Inc. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt eine selektive Modifikation des Klenow-Fragment Exo-minus der DNA-Polymerase an SH-Gruppe des Cysteins. Beispiel für die Herstellung eines solchen Klenow-Fragments Exo-minus der DNA-Polymerase ist unter Beispiel 43 angegeben.
In einer anderen Ausführungsform können auch andere Modifikationen an der DNA- Polymerase vorgenommen werden, wie beispielsweise Kopplungen an Amino-Gruppen der DNA-Polymerase. Das an dem Cysten modifizierte Klenow-Fragment Exo-minus der DNA-Polymerase kann in einer Ausführungsform an stelle eines nicht modifizierten Klenow-Fragment Exo-minus der DNA-Polymerase zusammen mit Nuk-Makromolekülen in der enzymatischen Einbau-Reaktion eingesetzt werden.
Allgemeine Hinweise für die Synthesen von Nuk-Makromolekülen
Die erfindungsgemäßen Nuk-Makromoleküle können auf unterschiedliche Art und Weise synthetisiert werden. Die Reihenfolge der Kopplungsschritte kann variieren. Beispielsweise kann zunächst eine Linker-Komponente an die Nuk-Komponente gekoppelt werden, anschließend wird die Marker-Komponente gekoppelt. Andererseits können ein oder mehrere Linker an die Marker-Komponente gekoppelt werden und anschließend der / die Nuk-Komponenten.
Die Kopplung zwischen einzelnen Komponenten der Nuk-Makromoleküle kann kovalent oder affin erfolgen. Wobei sowohl chemische als auch enzymatische Kopplung zur Verknüpfung einzelner Komponenten eingesetzt werden kann. Kopplungen an Amino- und Thiolgruppen dienen als Beispiele für kovalente Kopplungen (D. Jameson et al. Methods in Enzymology 1997, V. 278, S. 363-, "The chemistry of the amino group" S. Patai, 1968, "The chemistry of the thiol group" S. Patai, 1974). Biotin-Streptavidin- Bindung oder Hybridisierung zwischen komplementären Nukleinsäuresträngen oder Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen stellen Beispiele für affine Kopplungen dar.
Die makromolekularen Marker bieten oft eine Vielfalt an Kopplungsmögiichkeiten. Ein makromolekularer Marker kann mehrere Kopplungsstellen für den Linker haben, beispielsweise mehrere Bindungsstellen für Biotin, wie es bei Streptavidin der Fall ist.
Ein makromolekularer Marker kann auch mehrere Amino- bzw. Thiol-Gruppen aufweisen. Die Kern-Komponente des Markers kann mit unterschiedlicher Zahl von signalgebenden oder signalvermittelnden Einheiten modifiziert werden. Die genauen Verhältnisse zwischen Marker-Einheiten können variieren. Beispiele für die
Modifikation von Polymeren mit Farbstoffen sind bekannt (Huff et al. US Pat. 5661040,
D. Brigati US Pat. 4687732). Falls Nukleinsäuren als makromolekulare Marker eingesetzt werden, so können diese unterschiedliche Abschnitte zur Kopplung anderer
Makromoleküle besitzen. An einen makromolekularen Marker können andere Makromoleküle gebunden werden, z.B. Enzyme.
Ein Nuk-Makromolekül kann makromolekulare Marker mit unterschiedlichen Detektionseigenschaften tragen, beispielsweise kann ein Nuk-Makromolekül sowohl mehrere Farbstoffmoleküle als auch Stellen zur affinen Bindung (z.B. durch Hybridisierung) weiterer Makromoleküle tragen.
Die Kopplung zwischen der Nuk-Komponenten und der Linker-Komponenten erfolgt vorzugsweise kovalent. Viele Beispiele für eine kovalente Kopplung an Nukleotide oder deren Analoga sind bekannt (Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Short US Pat. 6579704, Odedra WO 0192284). Dabei kann die Kopplung beispielsweise an Phosphat, Amino-, Hydroxy- oder Mercaptogruppen erfolgen. Oft kann die Linker-Komponente in mehreren Schritten aufgebaut werden. Beispielsweise wird im ersten Schritt ein kurzer Linker mit einer reaktiven Gruppe an das Nukleotid oder Nucleosid angekoppelt, z.B. Propargylamin-Linker an Pyrimidine Hobbs et al. US Patent 5.047.519 oder andere Linker z.B. Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US pat. 6211158, US pat. 4804748, EP 0286028, Hanna M. Method in Enzymology 1996 v.274, S.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 S.3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Held et al. Nudeosides, nucleotides & nnudeic acids, 2003, v. 22, S. 391, Short US Pat. 6579704, Ward et al. US Pat 4711955, Engelhardt et al. US Pat 5241060 Taing et al. US Pat 6811979, Odedra WO 0192284, Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, S. 586, Canard US. Pat. 5798210, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642, Faulstich et al. DE 4418691, Phosphoroamidite (Glen Research Laboratories, http://www.glenres.com/, Trilink Biotechnologies, S. Agrawal "Protocols for oligonucleotide conjugation", Humana Press 1994, M.Gait "Oligonucleotide synthesis: a practical approach" IRL Press, 1990), Dissertation "Synthese basenmodifizierter Nukleosidtriphosphate und ihre enzymatische Polymerisation zu funktionalierter DNA", Oliver Thum, Bonn 2002. Einige Verbindungen kann man käuflich erwerben, z.B. bei Trilink Biotechnologies, Eurogentec, Jena Bioscience. Diese kurzen Linker dienen als Kopplungseinheiten L oder deren Teile, und sind ein Bestandteil der Linker-Komponente im fertigen Nuk-Makromolekül.
Im zweiten Schritt kann die Kopplung des Nukleotides oder Nudeosides mit einem kurzen Linker an das Linker-Polymer erfolgen. Polymere mit reaktiven funktionellen Gruppen können käuflich erworben werden (Fluka). Nach der Kopplung des Nukleotids an das Polymer kann nun die Marker-Komponente als letzter Schritt gekoppelt werden.
Oft ist es vorteilhaft an ein Nukleosid einen kurzen Linker zu koppeln, dann, falls erforderlich, dieses modifizierte Nucleosid in ein Nucleosid-Triphosphat umzuwandeln (Synthesen von Triphosphaten können beispielsweise in folgenden Literaturstellen gefunden werden: Held et al. Nucleosides, nucleotides & nnucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Faulstich et al. DE 4418691, T. Kovacs, L. Ötvös, Tetrahedron Letters, VoI 29, 4525-4588 (1988) oder Dissertation "Synthese basenmodifizierter Nukleosidtriphosphate und ihre enzymatische Polymerisation zu funktionalierter DNA", Oliver Thum, Bonn 2002).
Weitere Modifikationen können am Nukleosid-Triphosphat-Analog durchgeführt werden.
Vorstufen für modifizierte Nukleoside können sind beispielsweise bei Trilink Biotechnologies (San Diego, CA, USA) oder bei Chembiotech (Münster, Deutschland) kommerziel erhältlich.
Die Kopplung zwischen der Linker-Komponente und der Marker-Komponente kann beispielsweise zwischen reaktiven Gruppen an der Linker-Komponente und der Marker-Komponente erfolgen. Reagenzien für solche Kopplungen sind in "Chemistry of protein conjugation and cross-linking", S. Wang,1993, ISBN 0-8493-5886-8, ausführlich dargestellt. Die Verfahren zur Handhabung und zur Kopplung von mehreren Makromolekülen sind für unterschiedliche Typen von Makromolekülen auch in oben genannten Patenten dargestellt. Weitere Beispiele für Kopplungen an die und zwischen den Makromolekülen sind für Proteine in "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2; "Reactive dyes in protein an enzyme technology", D. Clonis, 1987, ISBN 0-333-34500- 2; "Biophysical labeling methods in molecular biology" G. Likhtenshtein, 1993, 1993, ISBN 0-521-43132-8; "Techniques in protein modification" R. Lundblad, 1995, ISBN 0-8493-2606-0; "Chemical reagents for protein modification" R. Lundblad, 1991, ISBN 0-8493-5097-2; für Nukleinsäuren in "Molecular-Cloning", J. Sambrook, band 1-3, 2001, ISBN 0-87969-576-5, für andere Polymerarten "Makromoleküle, Chemische Struktur und Synthesen", Band 1, 4, H. Elias, 1999, ISBN 3-527-29872-X beschrieben.
Da die Marker-Komponente meistens viele Kopplungsstellen aufweist, können weitere Modifikationen an kompletten Nuk-Makromolekülen vorgenommen werden. Beispielsweise können überschüssige Amino-Gruppen abgeblockt werden oder durch weiterführende Modifikationen verändert werden.
Je nach Einsatzgebiet und Reaktionsbedingungen, unter denen Nuk-Makromoleküie verwendet werden, können unterschiedliche chemische Bindungsarten zwischen einzelnen Teilen der Makromoleküle von Vorteil sein. So eignen sich beispielsweise bei Verfahren mit Schritten mit höheren Temperaturen, wie z.B. bei Hybridisierung oder PCR, Nuk-Makromoleküle, die kovalente, thermostabile Bindungen zwischen einzelnen Teilen haben.
Nachfolgend sollen beispielhaft einige Möglichkeiten zur Synthese von Nuk-Makromolekülen dargestellt werden. Diese dienen nicht zur Einschränkung der möglichen Synthesewege und nicht zur Einschränkung der möglichen Nuk- Makromolekülstrukturen. In folgenden Beispielen werden Nuk-Makromoleküle mit Polyethylenglycol (PEG) als Linker-Komponente angegeben. Beispiele für die Kopplungen von PEG an andere Moleküle sind in "Poly(ethylene glycol) : chemistry and biological applications", 1997 beschrieben. Im einzelnen können sehr unterschiedliche reaktive Gruppen zur Kopplung eingesetzt werden: N-succinimidyl carbonate ( US Pat.. 5,281,698, US Pat. 5,468,478), Amine (Buckmann et al. Makromol. Chem. V.182, S.1379 (1981), Zalipsky et al. Eur. Polym. J. V.19, S. 1177 (1983)), succinimidyl propionate und succinimidyl butanoate (Olson et al. in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D.C., 1997; U.S. Pat. No. 5,672,662), Succinimidyl succinate (Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. v. 7, S.175 (1984), Joppich et al., Makromol. Chem. Iv. 80, S.1381 (1979), Benzotriazole carbonate (U.S. Pat. No. 5,650,234), Glycidylether (Pitha et al. Eur. J. Biochem. v. 94, S.11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. v.13, S. 354 (1991), Oxycarbonylimidazole (Beauchamp, et al., Anal. Biochem. v.131, S. 25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Release v.l, S.251 (1985)), p-nitrophenyl carbonate (Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., v.ll, S.141 (1985); and Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., v.27, S.45 (1991)), Aldehyde (Harris et al. J. Polym. Sei. Chem. Ed. v.22, S. 341 (1984), US. Pat. 5824784, US. Pat. 5252714), Maleimide (Goodson et al. Bio/Technology v.8, S. 343 (1990), Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins v.2, S.29 (1984)), and Kogan, Synthetic Comm. v.22, S.2417 (1992)), Orthopyridyl-disulfide (Woghiren, et al. Bioconj. Chem. v. 4, S. 314 (1993)),
Acrylol (Sawhney et al., Macromolecules, v. 26, S.581 (1993)), Vinylsulfone (U.S. Pat.
No. 5,900,461). Weitere Beispiele für Kopplungen von PEG an andere Moleküle sind in Roberts et al. Adv. Drug Deliv. Reviews v. 54, S. 459 (2002), US Pat. 2003124086,
US Pat. 2003143185, WO 03037385, US Pat. 6541543, US Pat. 2003158333, WO 0126692 zu finden.
Andere ähnliche Polymere können in ähnlicher Art gekoppelt werden. Beispiele für solche Polymere stellen andere Poly(Alkylenglykole), Copolymere aus Ethyleriglyko! und Propyleneglykol, Poly(olefiniische Alkohole), Poly(Vinylpyrrolidone), Poly(Hydroxyalkylmethacrylamide), Poly(Hydroxyalkylmethacrylate), Poly(saccharide), Poly(x-Hydroxy-Säuren), Poly(Acrylsäure), Poly(Vinylalkohol).
Die Aufreinigung der Nuk-Komponenten der Nuk-Makromoleküle erfolgt mit konventionellen Mitteln der Nukleotidchemie: beispielsweise mit Kieselgel- Chromatographie in einem Wasser-Ethanol-Gemisch, Ionenaustausch- Chromatographie in einem Salz-Gradienten und Reverse-Phase-Chromatographie in einem Wasser-Methanol-Gradienten. Für die Nukleotid-Aufreinigung optimierte Chromatographie-Säulen werden z.B. von der Firma Sigma-Aldrich angeboten.
Die Aufreinigung von makromolekularen Linker-Komponenten und Marker- Komponenten kann durch Ultrafiltration, Gel-Elektrophorese, Gelfiltration und Dialyse erfolgen, siehe "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2.
Die Masse der Nuk-Makromoleküle unterscheidet sich wesentlich von der Masse der Nukleotide. Aus diesem Grund ist es vorteilhaft, bei den Endreinigungsschritten die Ultrafiltration einzusetzen. Da für die Nuk-Makromoleküle nur eine durchschnittliche Masse bereichnet wird, eignet sich Ultrafiltration auch als analytische Methode zu Trennung von Syntheseprodukten.
Zur Charakterisierung der Nuk-Makromoleküle können unterschiedliche Methoden der makromolekularen Chemie angewendet werden, z.B. UV-Vis-Spektroskopie, Fluoreszenzmessung, Massenspektroskopie, Fraktionierung, Größenausschlußchromatographie, Ultrazentrifugation und elektrophoretische Techniken, wie IEF, denaturierende und nicht denaturierende Gel-Elektrophorese ("Makromoleküle, Chemische Struktur und Synthesen", Band 1, 4, H. Elias, 1999, ISBN 3-527-29872-X, "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2). Die Messung von freien SH-Gruppen in einer Substanz erfolgte mit Ellmans Reagenz (5,5Λ -Dithiobis (2-Nitrobenzolsäure), Riddles et al. Method in Enzym. 1983, V.91, S. 49.
Modifizierte Nukleinsäureketten In einer Ausführung der Erfindung schließen Nukleinsäureketten Nuk-Komponenten der Nuk-Makromoleküle als Einheiten der Kette ein. Synthese modifizierter Nukleinsäureketten
Als Monomer einer Polymer-Kette können Nuk-Makromoleküle in unterschiedlicher Art und Weise in die Kette eingebaut bzw. integriert werden. Generell kann man zwischen den chemischen und enzymatischen Schritten unterscheiden. Im weiteren werden einige Beispiele der Synthese-Strategien vorgestellt.
Chemischer Einbau:
Beim chemischen Einbau kann ein komplettes Nuk-Makromolekül (d.h. Nul-Linker- Marker) oder auch seine Bestandteile, z.B. nur Nuk-Komponente, oder Nuk-Linker- Komponente, in die Reaktion eingesetzt werden. Beispielsweise wird zunächst die Nuk- Komponente in die Nukleinsäurekette nach Regeln der Oligonukleotid-Synthese (MWG- Biotech, TriLink Biotech nologies, Glen Research Laboratories, , S. Agrawal "Protocols for oligonucleotide conjugation", Humana Press 1994, M.Gait "Oligonucleotide synthesis: a practical approach" IRL Press, 1990) eingebaut, wobei ein Monomer der Kette eine zur Modifikation geeignete, geschützte reaktive Gruppe, beispielsweise eine geschützte Amino- oder Merkapto-Gruppe trägt. Nach der Entfernung der Schutzgruppe kann die Linker-Komponente und die Marker-Komponente an das Oligonukleotid gekoppelt werden. Die Reinigung kann beispielsweise durch die Ultrafiltration oder durch Elektrophrese erfolgen.
Enzymatischer Einbau:
Ähnlich zum chemischen Einbau kann auch beim enzymatischen Einbau ein komplettes Nuk-Makromolekül (d.h. Nul-Linker-Marker) oder auch seine Bestandteile, z.B. nur Nuk-Komponente, oder Nuk-Linker-Komponente, in die Reaktion eingesetzt werden. Beispielsweise werden Nuk-Komponenten, die eine zur Kopplung einer Linker- Komponente geeignete reaktive Gruppe tragen, als Triphosphate in einer matrizenabhängigen polymerase-gesteuerten Reaktion in die Nukleinsäurekette eingebaut. Anschließen kann eine Linker- und Marker-Kopplung erfolgen.
In einer anderen Ausführungsform kann ein komplettes Nuk-Makromolekül in die Nukleinsäurekette eingebaut werden (s. Beispiel 34).
Modifizierte Nukleinsäureketten schließen Ribonucleinsäuren und auch Desoxy- Ribonukleinsäuren ein.
Der Anteil der Nuk-Makromoleküle und der nicht modifizierten Monomeren der Nukleinsäurekette liegt vorzugsweise im Verhältnis zwischen 1:5 und 1:20, 1:20 und 1:100, 1:50 und 1:1000, 1:500 und 1:10000. Auch mehrere Nuk-Makromoleküie können pro eine Nukleinsäurekette eingebaut sein. In einer Ausführungsform schließt eine Nukleinsäurekette nur ein Nuk-Makromolekül ein, in einer weiteren Ausführungsform liegt die Zahl der Nuk-Makromoleküle pro eine Nukleinsäurekette in folgenden Bereichen: 2 bis 20, 5 bis 50, 10 bis 100.
In einer Ausführungsform ist ein Nuk-Makromolekül an das 5 '-Ende der
Nukleinsäurekette integriert.
In einer Ausführungsform ist ein Nuk-Makromolekül an das 3 '-Ende der Nukleinsäurekette integriert.
In einer Ausführungsform ist ein Nuk-Makromolekül im Inneren der Nukleinsäurekette integriert, wobei der Abstand vom am nächsten liegenden Kettenende in folgenden
Bereichen liegt (Zahl der Monomeren der Kette bis zum nächsten Kettenende): 1 bis
2, 2 bis 4, 4 bis 8, 8 bis 15, 15 bis 30, 30 bis 100, 100 bis 500.
3. Synthesen von modifizierten Nukleotiden
Trennungsmethoden:
Dünnschichtchromatographie, DC: Analytisch: „DC- Alufolien 20 x 20 cm Kieselgel 60 F 254" (VWR), beschichtet mit Fluoreszenzindikator. Visualisierung erfolgt mittels UV-Licht. Laufmittel Ethanol- Wasser-Gemisch (70:30) (Laufmittel, LM 1) oder Ethanol-Wasser-Gemisch (90:10) (LM 2). Präparativ: Kieselgel-Glasplatten mit Sammelschicht (VWR). LM 1 oder LM 2.
Umkehrphasen-Chromatographie (RP-Chromatographie), RP-18: C-18 Material (Fluka), Säulenvolumen 10ml, Wasser-Methanol-Gradient. Fraktionen je ImI wurden gesammelt und mit UV-Vis-Spektrometer analysiert. Fraktionen mit ähnlichen Spektren wurden vereinigt und lyophilisiert. HPLC-Säulen mit ähnlichem Material können verwendet werden (Sigma).
Ionenaustausch-Chromatographie
DEAE-Zellulose (VWR), Gradient NH4HCO3 20mmol/l - lmol/l, Fraktionen wurden unter
UV/Vis -Kontrolle gesammelt und auf Grundlage gleicher Spektren vereinigt.
Die Affinitätsisolierung von Nuk-Makromolekülen kann beispielsweise eingesetzt werden, wenn Nuk-Makromoleküle Oligonukleotide Bestandteil der Marker- Komponente sind. Durch die Hybridisierung an eine komplementäre, auf einer festen Phase fixierte Nukleinsäure können sie selektiv isoliert werden.
Die Bestimmung der Ausbeuten für farbstoffmarkierte Produkte erfolgte an UV-Vis- Spektrometer.
Die Vollständigkeit der Kopplung an Strepavidin wurde durch eine Kontrolltitration mit einem Biotin-Farbstoff (Biotin-4-Fluoreszein, Sigma) 100 μmol/l in 50 mmol/l Borat, pH 8, 5 min bei RT durchgeführt. Bei einer kompletten Besetzung von Biotin- Bindungsstellen an Strepavidin während der Synthese erfolgt keine Markierung von Streptavidin. Bei einer nicht ausreichenden Reaktion erfolgt eine Bindung an SA. Analyse mit UV-Vis. Material:
Diamono PEG 10.000 (Diamino-Polyethylenglycol 10.000, Sigma), dUTP-AA (dUTP- Allylamine, Jena-Bioscience), dCTP-PA (dCTP-Propargyl-Amin, Jena Bioscience), dATP-PA (7-(3-Amino-l-propynyl)-2" deoxy-7-deazaadenosin-5 '-Triphosphat) . (Auftragssynthese von JenaBioscience), dGTP-PA (7-(3-Amino-l~propynyl)-2'deoxy-7-deazaguanosin-5 '- Triphosphat, (Auftragssynthese von JenaBioscience), TTP (Thymidin-Triphosphat, kann auch als dTTP gekennzeichnet werden, Sigma), 3" -Amino-TTP (3 '-Amino-3" -deoxy- Thymidin-Triphosphat, Trilink Biotechnologies), PDTP (3-(2-Pyridinyl-dithio)-propionsäure, Fluka), 7-(3-Phthalimido-l-propynyl)-2 '-desoxy-7-deazaguanosin und 7-(3-Phthalimido- l-propynyl)-2 '-desoxy-7-deazaadenosin (Chembiotech), PDTP-NHS (3-(2-Pyridinyl- dithio)-propionsäure-N-hydroxysuccinimidyl-ester, Sigma), Cy3- NHS (Cy3- N- hydroxysuccinimidyl-ester, Amerscham Bioscience), MEA ( Mercaptoethylamine, Sigma), DTT (1,4-Dithio-DL-threit, Sigma), CA (Cystamine, Sigma), TCEP - (Tris-(2- carboxyethyl)phosphine, Sigma), DTBP (3,3 '-Dithio-Bis-Propionsäure, Fluka), Biotin-NHS (Biotin-N-hydroxysuccinimidyl-ester, Sigma). J-Ac (Iodoacetat, Sigma), Iodacetamid (Sigma), TEAE (Tris-(2~Aminoethyl)amine, Sigma), Maleimido-ES-NHS (Maleimido- Essigsäure-N-hydroxysuccinimidyl-ester, Sigma), EDA (Ethylendiamin, Sigma), CDI (1,1 '- Carbonyldiimidazol, Sigma), EDC N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-Ethylenecarbodiimide (Sigma), NH2-PEG-Biotin (30 Atome), Sigma), PAS 100 kDa (Polyacrylsäure, 100 kDa, Aldrich), NHS-PEG-Maleimid, 3.400 Da, Biotin-PEG-NHS, 5.000 Da, Fmoc-PEG-NHS, 3.400 Da, mPEG-SPA 5.000 Da, mPEG-SPA 20.000 Da (Nektar), Diamin-PEG, 6.000 Da (Fluka), FmOC-NH-(PEG)2-COOH (20 Atome), (Novabiochem, Merck Biosciences, Darmstadt), Fmoc-Amino-PEG-acid (n=ll) (BioVectra) Aminodextran 70000, Aminodextran 500000 (Molecular Probes), 3" -Biotin-dT31 ein Oligonucleotid mit einer Sequenz aus 31 Thymidinmonophosphaten, mit einem Biotin-Molekül am 3Λ-Ende (MWG-Biotech), 3 '-SH- Oligo-dT30 ein Oligonucleotid mit einer Sequenz aus 30 Thymidinmonophosphaten, mit einer Merkaptogruppe am 3* -Ende (MWG-Biotech), 3 '-Amino-Oligo-dT31-5* -Cy3 ein Oligonucleotid mit einer Sequenz aus 31 Thymidinmonophosphaten, mit einer über einen Linker aus 6 Atomen am 3' -Ende gekoppelten Amino-Gruppe und einem Cy3-Farbstoff, gekoppelt am 5V -Ende (MWG-Biotech,), SA ( Streptavidin, Roche,), SA-Cy2 ( mit Cy2- Farbstoff modifiziertes Streptavidin, Amersham Bioscience). QDot (Qdot 605 Streptavidin Conjugat, Quantum Dot). Poly-Lysin 1000 - 2000 (Poly-L-lysin-hydrobromid 1000 -2000 Da, Fluka), Poly-Lysin 10.000 - 20.000 (Poly-L-lysin-hydrobromid 10.000 -20.000 Da, Fluka).
Lieferanten und Firmenverzeichnis:
Aldrich - s. Sigma
Amersham - Amerscham Bioscience, Freiburg, Deutschland Chembiotech - Chembiotech, Münster, Deutschland
Fluka - s. Sigma
Jena-Bioscience - Jena-Bioscience, Jena, Deutschland
Molecular Probes - Molecular Probes Europe, Leiden, Niederlande
MWG - MWG-Biotech, Ebersberg bei München, Deutschland,
Nektar - Nektar Molecular engineering, früher Shearwater Corporation,
Huntsville, AL, USA
Quantum Dot - Quantum Dot Hayward, CA, USA Roche - Roche, Mannheim, Deutschland Sigma - Sigma-Aldrich-Fluka, Taufkirchen, Deutschland, Trilink - Trilink Biotechnologies Inc. San Diego, CA, USA,
Lösungsmittel wurden, wenn nötig, absolutiert verwendet (Fluka) oder nach Standardverfahren getrocknet. Bei Lösungsmittelgemischen beziehen sich die angegebenen Mischungsverhältnisse auf die eingesetzten Volumina (v/v).
Synthese einzelner Komponenten:
Beispiel 1: dUTP-AA-PDTP, Fig 10A.
20 mg dUTP-AA wurden in ImI Wasser gelöst und der pH-Wert mit NaOH auf 8.5 eingestellt. Zur dUTP-AA - Lösung wurde PDTP-NHS 60mg in 0.5 ml Methanol, tropfenweise unter Rühren zugegeben. Reaktion wurde 2 h bei 400C durchgeführt. DC-Kontrolle: dUTP-AA-PDTP ( in LM 1 Rf 0.45).
Die Trennung von überschüssigem PDTP-NHS und PDTP erfolgte auf präparativen Kieselgel-Platten, LM 2. Das Produkt, dUTP-AA-PDTP, und dUTP-AA bleiben auf der Startlinie. Die Nukleotide wurden von der Platte mit Wasser eluiert und eingeengt. Dieses dUTP-Analog trägt nun eine Disulfid-Bindung, die in einer Thiolaustauschreaktion mit anderen Thiolen reagieren kann und eine unter milden Bedingungen spaltbare Verbindung darstellt.
Dieses Beispiel zeigt eine generelle Möglichkeit, an Nukleotiden weitere Modifikationen vorzunehnem. Weitere basenmodifzierte Nukleotidanaloga, wie z.B. 7-Deaza- Aminopropargyl-Desoxy-Guanosin-Triphosphat und 7-Deaza-Aminopropargyl Desoxy- Adenosin-triphosphate, 5-Amino-Propargyl-Desoxy-Uridin-Triphosphate, 5-Amino- Allyl-Desoxy-Uridin-Triphosphate, 5-Amiho-Propargyl-Desoxy-Cytidin-Triphosphate können wie oben angeführt ebenfalls modifiziert werden. Es können sowohl Ribonukleotide, 2" -Deoxyribonukleotide als auch 2\3Λ -Deoxyribonukletide verwendet werden, Fig. 11 bis 14.
Beispiel 2: dCTP-PA-PDTP, Fig. 1OB
Die Synthese wurde wie für dUTP-AA-PDTP, Beispiel 1, beschrieben durchgeführt.
Beispiel 3: dUTP-AA-Propionat-SH, Fig. 15 Zu 200μl 40mmol/l Lösung von dUTP-AA-PDTP wurde ImI TCEP-Lösung 250mmol/l, pH 8, eingestellt mit NaOH, zugegeben und 10 min bei RT gerührt. Die Trennung der Nukleotide von anderen Reagenzien erfolgte auf präparativen Kieselgel-Platten, LM 2. Produkt, dUTP-AA-Propionat-SH, bleibt auf der Startlinie. Die Nukleotide wurden von der Platte mit Wasser eluiert und eingeengt. Dieses dUTP-Analog trägt eine reaktive SH-Gruppe, die leicht modifiziert werden kann, beispielsweise unter Ausbildung von Disulfid-Bindung.
Beispiel 4:
Biotin-PEG-Ethyl-SH, Fig.16 Zu 200 μl wässriger CA-Lösung (lOOmmol/l), pH 8.5, eingestellt mit NaOH, wurden 10 mg Biotin-PEG-NHS zugegeben und bei 400C 18 Stunden gerührt. Anschließend wurde
200 μl TCEP-Lösung (0.5 mol/l), pH 8.0, zugegeben und weitere 10 min bei RT gerührt. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration auf 3.000 MWCO (Molecular weight cut off) von anderen Reagenzien getrennt. Ausbeute 35%.
Das Produkt trägt eine reaktive SH-Gruppe, die leicht modifiziert werden kann, beispielsweise unter Ausbildung von Disulfid-Bindung.
Ein weiteres Beispiel für die Einführung von SS-Bindung bzw. Kopplung einer Mercaptogruppe an PEG ist hier angeführt:
10 mg Amino-PEG-Biotin (30 Atome) wurden in 280 μl 50 mM Borat-Puffer aufgelöst und pH auf 9 eingestellt. Zu dieser Lösung wurden zwei Äquivalente von PDTP-NHS in 100 μl DMF zugegeben. Nach 1 Stunde bei RT wurde der Überschuß von PDTP-NHS mit Überschuß von NH4HCO3 abreagiert. Das Produkt stellt folgende Verbidung dar: Biotin-PEG-PDTP dar.
Dieses Produkt kann durch Thiolaustausch an ein weiteres Molekül gekoppelt werden. Durch Spaltung der SS-Bindung kann eine freie SH-Gruppe bereitgestellt werden. Beispiel 5:
Bis-Dithio-(Ethyl-PEG-Biotin),
Zu 1 ml wässriger CA-Lösung (2 mmol/l), pH 8.5 mit NaOH eingestellt, wurden 100mg Biotin-PEG-NHS zugegeben und bei RT 18 Stunden gerührt. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration auf 10.000 MWCO von anderen Reagenzien getrennt und lyophilisiert. Ausbeute 13%.
Das Produkt besitzt eine Disulfid-Verbindung, die an Thiolaustauschreaktionen teilnehmen kann.
Beispiel 6:
MEA-Cy3, Fig. 17
Zu ImI wässriger CA-Lösung, 200 mmol/l, pH 8.5 eingestellt mit NaOH, wurde Cy3- NHS zugegeben, bis die Konzentration des Cy 3 -Farbstoffs 10 mmol/l betrug. Die Reaktion wurde 10 min bei RT gerührt. Anschließend wurde 1 ml TCEP-Lösung (0.5 mol/l), pH 8.0 eingestellt mit NaOH, zugegeben und weitere 10 min bei RT gerührt. Das Produkt wurde auf RP-18 getrennt (Wasser-Methanol-Gradient) und auf 0.5ml eingeengt, Ausbeute 93%, UV-Vis.
Das Produkt trägt eine reaktive SH-Gruppe, die leicht modifiziert werden kann, beispielsweise unter Ausbildung von Disulfid-Bindung.
Beispiel 7:
Cy3-TEAE, Fig. 18
Zu ImI wässriger TEAE-Lösung, 300 mmol/l, pH 8.5 mit NaOH eingestellt, wurde Cy3- NHS zugegeben, bis die Konzentration des Cy3- Farbstoffs 5mmol/l betrug . Die
Reaktion wurde 10 min bei RT gerührt. Das Produkt wurde auf RP-18 getrennt und auf
0.5ml eingeengt, Ausbeute 82%, UV-Vis.
Das Produkt hat zwei Aminogruppen, die leicht mit anderen Reagentien modifiziert werden können und neue Funktionalitäten an den Farbstoff koppeln können.
Beispiel 8:
Cy3-TEAE-Propionat-SH, Fig. 19
Zu 300μl wässriger Cy3-TEAE, 2mmol/l, pH 7.5, wurden langsam 30μl einer frisch bereiteten methanolischen Lösung von PDTP-NHS, 30mmol/l, zugegeben. Der Ablauf der Reaktion wurde durch DC, LM 1, kontrolliert. Als Reaktionsprodukte erscheinen auf
DC Substanzen (LM 1) mit Rf. 0.55 (Cy3-TEAE-PDTP) und 0.95 (Cy3-TEAE-(PDTP)2).
Nach Ablauf von 1 h wurde die Reaktion gestoppt und die Produkte auf DC mit LM 1 getrennt. Die Substanz mit Rf. 0.55 wurde isoliert, eingeengt und in 200μl Wasser aufgelöst. Zu dieser Lösung wurde 0.1ml TCEP-Lösung (0.5 mol/l), pH 8.0, zugegeben und weitere 10 min bei RT gerührt. Das Produkt, Cy3-TEAE-Propionat-SH, wurde auf RP-18 getrennt (Wasser-Methanol-Gradient) und auf 0.5ml eingeengt, Ausbeute 26%, UV-Vis. Das Produkt trägt einerseits eine reaktive SH-Gruppe, die leicht modifiziert werden kann, beispielsweise unter Ausbildung von Disulfid-Bindung, andererseits eine Amino- Gruppe, die mit anderen Reagentien reagieren kann.
Beispiel 9: TEAE-(Cy3)2, Fig. 20
Zu ImI wässriger TEAE-Lösung, 2 mmol/l, wurde Cy3-NHS zugegeben, bis die Konzentration des Cy 3- Farbstoffs 4mmol/l betrug. Die Reaktion wurde 10 min bei RT gerührt. Das Produkt (Rf. 0.45) wurde auf präparat. Kieselgel DC mit LM 1 von anderen Reaktionsprodukten getrennt, mit 5OmM Borat-Puffer, pH 9, eluiert, danach auf RP-18 gesammelt und anschließend mit 50% Et-OH eluiert und auf 0.5ml eingeengt, Ausbeute 22%, UV-Vis.
Beispiel 10, Fig. 21
PoIy-Lysin-(Cy3)n, n = 10-15, Poly-Lysin 10.000-20.000 Zu ImI wässriger Poly-Lysin-Lösung, 1 mmol/l, wurde Cy3-NHS zugegeben, bis die Konzentration des Cy 3- Farbstoffs 18mmol/l betrug. Die Reaktion wurde 40 min bei RT gerührt. Die Trennung von modifiziertem Poly-lysin von Farbstoffresten erfolgte durch Ultrafiltration, 3000 MWCO. Bestimmung der durchschnittlichen Zahl Cy3-Moleküle erfolgte über UV-Vis-Spektrometer.
Poly-Lysin stellt ein Beispiel für ein Kern-Komponente dar, an die mehrere Marker- Einheiten, beispielsweise Farbsoffe gekoppelt werden können. In diesem Experiment wurde die Verteilung von Cy3-Molekülen in Poly-Lysin-Population rechnerisch ermittelt, aus den bekannten Größenunterschieden der Poly-Lysin-Moleküle und der mittleren ermittelten Zahl von Cy3-Moleküle.
Beispiel 11,
TEAE-(Cy3)2-PDTP und TEAE-(Cy3)2-Propionat-SH, Fig 22:
Zu 200μl TEAE-(Cy3)2, lmmol/l wurden 10mg, PDTP-NHS zugegeben und 1 Stunde bei RT gerührt. Der Reaktionsverlauf wurde durch DC, LM 1, kontrolliert. Nach 1 h wurde eine fast quantitative Umsetzung von TEAE-(Cy3)2 (Rf. 0.45) zu TEAE-(Cy3)2- PDTP, (Rf. 0.85) festgestellt. Der Ansatz wurde in zwei gleiche Teile geteilt. Das Produkt, TEAE~(Cy3)2-PDTP, aus dem ersten Teil wurde auf RP-18 getrennt und lyophilisiert. Ausbeute 82%, UV-Vis.
Das Produkt trägt eine Disulfidbindung, die leicht an einer Thiolaustauschreaktion teilnehmen kann und somit an andere Verbindungen gekoppelt werden kann.
Zum zweiten Teil wurde 0.1ml TCEP-Lösung (0.5 mol/l), pH 8.0, zum Ansatz zugegeben und noch 10 min bei RT gerührt. Das Produkt, TEAE-(Cy3)2-Propionat-SH, wurde auf RP-18 getrennt, Ausbeute 68%, UV-Vis.
Das Produkt trägt eine reaktive SH-Gruppe, die leicht modifiziert werden kann, beispielsweise unter Ausbildung von Disulfid-Bindung.
Beispiel 12, Fig 23
(HS-Propionat)m-Poly-Lysin-(Cy3)n, (n = 10-15, m 3-9, Poly-Lysin 10.000-20.000) Zu 200μl Poly-Lysin-(Cy3)n, lmmol/l wurden 10mg, PDTP-NHS zugegeben und 1 Stunde bei RT gerührt. Das Produkt, (PDTP)m-Poly-Lysin-(Cy3)n, wurde durch Ultrafiltration von den PDTP-Resten abgetrennt und anschließend in lOOμl Wasser gelöst. Danach wurde 0.1ml TCEP-Lösung (0.5 mol/l), pH 8.0, zum Ansatz zugegeben und weitere 10 min bei RT gerührt. Das Produkt, (HS-Propionat)m-Poly-Lysin-(Cy3)n, wurde mit 3.000 MWCO von den niedermolekularen Bestandteilen getrennt. Das Produkt tragt mehrere reaktive SH-Gruppen, die leicht modifiziert werden können, beispielsweise unter Ausbildung von Disulfid-Bindung.
Beispiel 13:
TTP-3' -O-Propionat-SH, Fig 24A, Die Synthese von 3' -modifizierten Nukleotiden erfolgt nach Gottikh et al. Tetrahedron, 1970, v. 26, 4419-, Schäfer et al. Method in Enzymology, 1986, v. 126, S. 682-.
DTBP, 210 mg, wurden in ImI DMF gelöst. Zu dieser Lösung wurde CDI 320mg zugegeben und 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden lOμl Methanol zugegeben und nach weiteren 10 min wurden lOOμl dieser Lösung, lmol/l, zu 300μl wässriger lOOmmol/l-Lösung von TTP, pH 8.5 eingestellt mit NaOH, zugegeben und ca. 4 h bei RT kräftig gerührt. Die Nukleotide wurden durch Präzipitation mit Ethanol isoliert und dann in 300μl Wasser gelöst. Anschließend wurde 200μl TCEP-Lösung (0.5 mol/l), pH 8.0, zugegeben und nach 10 min bei RT erfolgt die wiederholte Präzipitation der Nukleotide. Die Trennung der modifizierten Nukleotide von den nicht modifizierten ist auf dieser Stufe nicht notwendig. Ausbeute 13%, UV-Vis.
Das Produkt trägt eine reaktive SH-Gruppe, die leicht modifiziert werden kann, beispielsweise unter Ausbildung von Disulfid-Bindung. Beispiel 14:
TTP- 3 * -Am i no- PDTP, Fig 24B Die Synthese erfolgte wie für dUTP-AA, Beispiel 1, beschrieben: Als Edukte wurden 3x -Amino-3* -Deoxy-TTP, lOOμl, lOmmol/l Lösung, pH 8 und PDTP-NHS eingesetzt. Ausbeute 19%, UV-Vis.
Das Produkt trägt eine Disulfidbindung, die leicht an einer Thiolaustauschreaktion teilnehmen kann und somit an andere Verbindungen gekoppelt werden kann.
Auch andere, am 3X -Ende mit einer Bindungsstelle, z.B. einem kurzen Linker, modifizierte Nukleotide können eingesetzt werden. Synthesen sind dargestellt beispielsweise in Metzker et al. Nucleic acid Research 1994, V.22, S. 4259, Canard et al. Gene, 1994, V. 148, 1, Hovinen et al. J. Chem. Soc. Perk. Trans. 1994V.1, S. 211, Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, S. 586, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363, Canard US. Pat. 5798210, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642, Faulstich DE 4418691.
Weitere Beispiele für basenmodifizierte Nukleotide, die als Nuk-Komponente verwendet werden können, sind in Balasubramanian WO 03048387 beschrieben. Noch weitere Beispiele für Nukleotid-Analoga sind in "Nucleotide Analogs" Scheit, 1980, ISBN 0-471-04854-2, "Nucleoside and Nucleic Acid Chemistry", Kisakürek 2000, "Anti- HIV Nucleosides" Mitsuya, 1997, "Nucleoside Analogs in Cancer therapy", Cheson, 1997 angegeben. Ein Fachmann sollte erkennen, dass auch andere Nukleoside und Nukleotide verwendet werden können.
Beispiele für Kopplung von Linker-Komponenten und Marker-Komponenten an Nuk-Komponenten Beispiel 15: dUTP-AA-SS-MEA-Cy3, Fig. 25
Zu lOOμl, 10mmol/l MEA-Cy3 in 5OmM Borat, pH 9.5, wurde 50μl 30mmol/l dUTP-AA- PDTP in 5OmM Borat, pH 9.5 zugegeben. Nach 1 Stunde wurde das dUTP-AA-SS-MEA- (Cy3) durch Dünnschicht-Chromatographie, LM 1, Rf. 0.6, von MEA-Cy3, Rf. 0.9, getrennt. Anschließend wurde dUTP-AA-SS-MEA-(Cy3) auf RP-18 von dUTP-AA-PDTP getrennt. Ausbeute 67%, UV-Vis. Es wurde eine Verbindung erhalten, die eine Nukleotid-Funktionalität und eine niedermolekulare Marker-Funktionalität trägt. Es kann stellvertretend für konventionell modifizierte Nukleotide mit nur einem niedermolekularen Marker auftreten. Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase) als Substrat akzeptiert, s. Beispiel 34A.
Beispiel 16: dUTP-AA-SS-TEAE-(Cy3)2, Fig. 26 dUTP-AA-SS-TEAE-(Cy3)2 wurde ähnlich wie dUTP-AA-SS-MEA-(Cy3), Beispiel 15, synthetisiert, dabei wurde TEAE-(Cy3)2-Propionat-SH anstatt von MEA-Cy3 verwendet. Ausbeuten 43%, UV-Vis.
Es wurde eine Verbindung erhalten, die eine Nukleotid-Funktionalität und zwei niedermolekulare Marker-Funktionalitäten trägt. Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase) als Substrat nicht akzeptiert. Die Modifikation des Nukleotids führt zum Verlust der Substrateigenschaften.
Beispiel 17: dUTP-AA-SS-Propionat-TEAE-Cy3, Fig. 27 dUTP-AA-SS-Propionat-TEAE-Cy3 wurde ähnlich wie dUTP-AA-SS-MEA-Cy3, Beispiel 15, synthetisiert, dabei wurde Cy3-TEAE-Propionat-SH anstatt von MEA-Cy3 verwendet. Ausbeute 37%, UV-Vis.
Diese Verbindung trägt eine Nukleotid-Funktionalität und eine niedermolekulare Marker-Funktionalität. Der Linker an der Base hat eine freie Aminogruppe, die modifiziert werden kann. Das Nukleotid wird von Polymerasen als Substrat akzeptiert.
Beispiel 18: (dUTP-AA-SS-PropionatOm-Poly-Lysin-CCyS).!
Edukte: dUTP-AA-PDTP
(HS-Propionat)m-PoIy-Lysin-(Cy3)n, n = 10-15, m 3-9, Poly-Lysin 10.000-20.000
Zu 50μl einer Lösung mit dUTP-AA-PDTP, 20mmol/l, in 5OmM Borat-Puffer, pH 9.0, wurde 20μl (HS-Propionat)m-Poly-Lysin-(Cy3)n, ca. lmmol/l, in Wasser, gegeben und 18 h bei RT gerührt. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration, 30.000 MWCO, gereinigt. 19
Es wurde eine Verbindung erhalten, die eine Nukleotid-Funktionalität und eine makromolekulare Marker-Funktionalitäten trägt.
Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat nicht akzeptiert. Die Modifikation des Nukleotids führt zum Verlust der Substrateigenschaften.
Beispiel 19: dUTP-AA-PEG-Biotin, Fig. 28
Zu lOOμl wässriger Lösung dUTP-AA, 50mmol/l, pH 8.0, wurden 10mg Biotin-PEG-NHS gegeben und bei 400C 18 Stunden gerührt. Anschließend wurde das nicht umgesetzte
Nukleotid durch Ultrafiltration, 3.000 MWCO, abgetrennt und das Produkt der
Reaktion, das dUTP-AA-PEG-Biotin, mehrmals mit Wasser gewaschen.
Diese Verbindung trägt eine Nukleotid-Funktionalität und einen makromolekularen
Linker. Biotin dient als Kopplungseinheit T. An diese Kopplungseinheit T können makromolekulare Strukturen gekoppelt werden, z.B. Streptavidin, ohne dass die
Substrateigenschaften dieser Analoga verloren gehen. Dieses Nuk-Makromolekül dient als Substrat für Polymerasen.
Biotin kann auch als eine niedermolekulare Marker-Einheit mit signalvermittelnden Funktion betrachtet werden, die an den langen Linker gekoppelt ist.
Das Produkt der Reaktion ist eine Zwischenstufe eines Nuk-Makromoleküls. Dieses Beispiel zeigt eine generelle Möglichkeit, an Nukleotiden weitere Modifikationen vorzunehnem. Weitere basenmodifzierte Nukleotidanaloga, wie z.B. 5-Propargylamino- dCTP, 7-Deaza-Aminopropargyl-dGTP, 5-Amino-Propargyl-dUTP und 7-Deaza- Aminopropargyl-dATP (Fig. 29) können wie oben angeführt ebenfalls modifiziert werden. Es können sowohl Ribonukleotide, 2X -Deoxyribonukleotide als auch 2\3Λ - Deoxyribonukletide verwendet werden, Fig. 11 bis 14.
In einer ähnlichen Weise können auch andere Polymere, z.B. PEG-Derivate, als Linker gekoppelt werden. Ein Beispiel dafür stellt dATP-PA-PEG-NH2.
Zu lOOμl wässriger Lösung 7-Deaza-7-Aminopropargyl-dATP (hergestellt aus 7-(3- Phthalimido-l-propynyl)-2 '-desoxy-7-deazaadenosin von Jena Bioscience), 50mmol/l, pH 8.0, wurden 10mg Fmoc-PEG-NHS (Fmoc-geschützter NH2-PEG-NHS) gegeben und bei 400C 18 Stunden gerührt. Anschließend wurde der pH-Wert auf 11 erhöht und die Reaktionsmischung weitere 2 Stdunden bei RT gerührt. Anschließend wurde das nicht umgesetzte Nukleotid durch Ultrafiltration, 3.000 MWCO, abgetrennt und das Produkt der Reaktion, das dATP-PA-PEG-NH2, mehrmals mit Wasser gewaschen. Diese Verbindung trägt eine Nukleotid-Funktionalität und einen makromolekularen Linker. NH2-Gruppe dient als Kopplungseinheit T für die Marker-Komponente. An diese Kopplungseinheit T können makromolekulare Strukturen gekoppelt werden, z.B. Polyacryl-säurederivate, ohne dass die Substrateigenschaften dieser Nukleotid- Analoga verloren gehen. Dieses Nuk-Makromolekül dient als Substrat für Polymerasen.
Beispiel 20:
TTP-3 '-Amino-PEG-Biotin, Die Synthese erfolgte ähnlich wie für dUTP-AA-PEG-Biotin, Beispiel 19. Als Edukte wurden 3* -Amino-3* -Deoxy-TTP und Biotin-PEG-NHS eingesetzt. Diese Verbindung trägt eine Nukleotid-Funktionalität und einen makromolekularen Linker und eine niedermolekulare Marker-Einheit (Biotin), die eine signalvermittelnde Fuktion hat. An das Biotin können makromolekulare signaltragende Streptavidin-Moleküle gekoppelt werden.
Auch andere Nukleotid-Analoga mit einer Amino-Gruppe in der 3 " -Position können in ähnlicher Weise gekoppelt werden.
Beispiel 21: dCTP-PA-PEG-Maleimid,
Die Synthese erfolgte wie für dUTP-AA-PEG-Biotin, Beispiel 19, beschrieben. Als
Edukte wurden dCTP-PA und Maleimid-PEG-NHS eingesetzt.
Diese Verbindung hat eine Nukleotid-Funktionalität und einen makromolekularen
Linker. Kopplungseinheit T an diesem Linker ist die Maleimid-Gruppe. An Maleimid- Funktionalität können makromolekulare signaltragende Moleküle gekoppelt werden, die eine oder mehrere SH-Gruppen tragen.
Maleimid-Gruppe kann auch als eine niedermolekulare Marker-Einheit mit signalvermittelnden Funktion betrachtet werden, die an den langen Linker gekoppelt ist. An diese Marker-Komponente können makromolekulare Strukturen gekoppelt werden, ohne dass die Substrateigenschaften dieser Analoga verloren gehen.
Dieses Beispiel zeigt eine generelle Möglichkeit, an Nukleotiden weitere Modifikationen vorzunehnem. Weitere basenmodifzierte Nukleotidanaloga, wie z.B. 5-Allylamino- dUTP, 5-Amino-Propargyl-dUTP, 7-Deaza-Aminopropargyl-dGTP und 7-Deaza- Aminopropargyl-dATP können wie oben angeführt ebenfalls modifiziert werden. Es können sowohl Ribonukleotide, 2" -Deoxyribonukleotide als auch 2" ,3" - Deoxyribonukletide verwendet werden, Fig. 11 bis 14. Beispiel 22: dUTP-AA-SS-Propionat-TEAE-(Cy3)-PEG-Biotin, Fig. 30
Die Synthese erfolgte ähnlich wie für dl)TP-AA-PEG-Biotin, Beispiel 19 beschrieben. Als Edukte wurden dUTP-AA-SS-Propionat-TEAE-Cy3 und Biotin-PEG-NHS eingesetzt. Die Trennung vom nicht abreagierten dUTP-Analog erfolgte durch Ultrafiltration, 3.000 MWCO.
Diese Verbindung trägt eine Nukleotid-Funktionalität, einen Farbstoff, einen makromolekularen Linker und eine niedermolekulare Marker-Funktionalität (Biotin), die eine signalvermittelnde Fuktion hat. Biotin kann auch als eine Kopplungseinheit T des Linkers betrachtet werden.
An die Kopplungseinheit T (in diesem Beispiel Biotin) können makromolekulare Strukturen gekoppelt werden, ohne dass die Substrateigenschaften dieser Analoga verloren gehen. Dieses Nuk-Makromolekül dient als Substrat für Polymerasen.
Der Farbstoff dient als sterisch anspruchsvolle Gruppe, die den enzymatischen Einbau von nur einem Nuk-Makromolekül in den wachsenden Strang durch die Polymrase zuläßt. Die Eigenschaften solcher Nukleotide sind detailliert in Tcherkassov WO 02088382 beschrieben.
Beispiel 23: dUTP-AA-SS-PEG-Biotin, Fig. 31 A,
Zu lOOμl, lOmmol/l Biotin-PEG-Ethyl-SH in 5OmM Borat, pH 9.5, wurde 50μl 30mmol/l dUTP-AA-PDTP in 5OmM Borat, pH 9.5 zugegeben. Reaktion wurde 18 Stunden bei RT gerührt. Die Trennung erfolgt ähnlich wie für die Synthese von dUTP- AA- PEG- Biotin, Beispiel 19 beschrieben.
Diese Verbindung trägt eine Nukleotid-Funktionalität und einen makromolekularen Linker. Biotin dient als Kopplungseinheit T. An diese Kopplungseinheit T können makromolekulare Strukturen gekoppelt werden, z.B. Streptavidin, ohne dass die
Substrateigenschaften dieser Analoga verloren gehen. Dieses Nuk-Makromolekül dient als Substrat für Polymerasen. Über Streptavidin können auch weitere makromoleküle, beispielsweise Enzyme oder Nukleinsäurenge koppelt werden. Biotin kann auch als signalvermittelnde niedermolekulare Marker-Einheit bezeichnet werden.
Die Linker-Komponente kann zusammen mit der Marker-Komponente von der Nuk- Komponente unter milden Bedingungen abgespalten werden. Dies kann beispielsweise von Vorteil sein, wenn eine Sequenzierung durch Synthese (Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382, Quake WO0132930, Kartalov WO02072892 ) durchgeführt wird, wobei nach jedem Detektionsschritt eine Entfernung der Marker notwendig ist.
Ein weiteres Beispiel für die Nuk-Makromoleküle mit einer unter milden Bedingungen spaltbaren Gruppe: dUTP-AA-Propionat-S-CO-PEG-Biotin (Rg. 31 B). Für diese Reaktion wurde das dUTP-AA-PDTP zunächst auf RP-HPLC in Wasser- Methanol-Gradient gereinigt. Zu lOμl einer 50 mmol/l Lösung von dUTP-AA-PDTP in Wasser wurden 20 μl einer 100 mmol/l Lösung von TCEP, pH 8, zugegeben. Die Reaktion wurde bei RT 10 min durchgeführt. Das Produkt der Reaktion, das dUTP-AA-Propioat-SH, wurde von anderen Reagenzien auf präparativen Kieselgel-Platten, LM 2, getrennt. Das Produkt, dUTP-AA-Propionat-SH, bleibt auf der Startlinie. Es wurde von der Platte mit Wasser eluiert, eingeengt und in 50 μ! 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 8, aufgelöst.
Zu dieser Lösung wurden 50 μl einer frisch angesetzten 2 % wässrigen Lösung von Biotin-PEG-NHS zugegeben. Die Reaktion erfolgte be RT 30 min lang. Anschließend wurde das Produkt der Reaktion, das dUTP-AA-Propionat-S-CO-PEG-Biotin, durch Ultrafiltration mit MWCO 3000 von niedermolekularen Reaktionskomponenten abgetrennt, fünf mal mit 0,5 ml Wasser gewaschen und in einem Volumen von 50 μl aufgelöst.
Das auf diese Weise erhaltene das dUTP-AA-Propionat-S-CO-PEG-Biotin kann von DNA-Polymerasen, beispielsweise Klenow-Fragment Exo minus oder Taq-Polymerase, in den wachsenden Strang der Nukleinsäuren eingebaut werden.
An das Biotin können über das Straptavidin weitere Marker-Komponenten gekoppelt werden.
Das das dUTP-AA-Propionat-S-CO-PEG-Biotin enthält eine unter milden Bedingungen spaltbare Gruppe, so dass der Linker mit dem Farbstoff von dem Nukleotid abgespalten werden kann. Dies ist beispielsweise in Verfahren der Sequenzierung durch die Synthese vom besonderen Interesse (Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382, Quake WO0132930, Kartalov WO02072892).
Dieses Beispiel zeigt eine generelle Möglichkeit, an Nukleotiden weitere Modifikationen vorzunehnem. Weitere basenmodifzierte Nukleotidanaloga, wie z.B. 5-Propargylamino- dCTP, 5-Amino-Propargyl-dUTP, 7-Deaza-Aminopropargyl-dGTP und 7-Deaza- Aminopropargyl-dATP können wie oben angeführt ebenfalls modifiziert werden. Es können sowohl Ribonukleotide, 2Λ -Deoxyribonukleotide als auch 2\3* - Deoxyribonukletide verwendet werden, Fig. 11 bis 14.
Beispiel 24:
TTP-O-Propionat-SS-PEG-Biotin,
Zur lOOμl Lösung von TTP-O-Propionat-SH, lOmmol/l, in 5OmM Borat-Puffer, pH 9.5, wurden lOOμl einer Lösung von Bis-Dithio-(Ethyl-PEG-Biotin), 0.5mmol/l, in Wasser gegebenund 24 Stunden bei RT gerührt. Die Aufreinigung erfolgte durch Ultrafiltration mit 3.000 MWCO ähnlich wie in Beispiel 19.
Beispiele für die Kopplung von Aminogruppen an die Phosphatreste der Nukleotide sind in D. Jameson et al. Methods in Enzymology 1997, V. 278, 363 angegeben. An diese Amino-Gruppe kann eine Linker-Komponente gekoppelt werden. Beispiele für Kopplungen von Linkern an Phosphat-Gruppen von Nukleotiden sind in US Patent 5.981.507 dargestellt. An einen solchen Linker können weitere makromolekulare Linker gekoppelt werden, die einen niedermolekularen Marker oder eine niedermolekulare Kopplungseinheit oder einen markomolekularen Marker tragen. In einer Ausführungform wird markomolekularer Linker an die Phosphat-Gruppen angefügt, die an der 5 '-Position der Ribose gekoppelt sind. Die Kopplung erfolgt vorzugsweise an der Gamma-Phosphat-Gruppe der Nukleotide, wobei sowohl Ribonukleotide als auch 2* -Deoxyribonukleotide als auch 2\3* -Dideoxynukleotide eingesetzt werden können. In einer anderen Ausführungsform erolgt die Kopplung des makromolekularen Linker an die 3' -Phosphat-Gruppe eines 5' -Nukleosid-Triphosphat.
Kopplungen an Marker-Komponenten Beispiel 25, :
(dUTP-16-Biotin)4-SA, Zu 200μl einer Lösung von Biotin-16-dUTP 200μmol/l in 5OmM Tris-HCI, pH 8.0, wurden 200μl einer Streptavidin-Lösung, lmg/ml, in 5OmM Tris-HCI, pH 8.0, zugegeben. Nach 1 Stunde bei RT wurde wurde das (dUTP-16-Biotin)4-SA vom nicht umgesezten Biotin-16-dUTP durch Ultrafiltration, 50.000 MWCO, abgetrennt.
Es wurde eine Verbindung erhalten, die eine Nukleotid-Funktionalität und eine makromolekulare Marker-Funktionalitäten trägt.
Es kann stellvertretend für konventionell modifizierte Nukleotide mit einem makromolekularen Markern betrachtet werden. Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat nicht akzeptiert. Die Modifikation führt zum Verlust der Substrateigenschaften, s. Beispiel 34B. Eigenschaften der Biotin-Streptavidin-Bindung sind z.B.in Gonzalez et al. Journal Biolog. Chem. 1997, v. 272, S. 11288 beschrieben.
Beispiel 26:
(dUTP-16-Biotin)4-SA-Cy2, Die Kopplung von dUTP-16-Biotin an SA-Cy2 wurde wie für (dUTP-16-Biotin)4-SA beschrieben durchgeführt.
Die Verbindung dient als Äquivalent zu Verbindung aus Beispiel 25, wobei zur Visualisierung Streptavidin fluoreszent markiert ist.
Beispiel 27: dCTP-PA-SS-Oligo-dT30,
Die Synthese erfolgte wie bei d UTP-AA-SS- M EA-Cy3 beschrieben. Zu dCTP-PA-PDTP, lOOμl, 20mmol/l, wurde Oligo-dT30-3* -SH (MWG-Biotech) zugegeben, Endkonzentration 200μmol/l, und 18 Std bei RT, pH 9, gerührt. Die Aufreinigung erfolgte durch Ultrafiltration mit 3.000 MWCO.
Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat nicht akzeptiert. Die Modifikation des Nukleotidteils führt zu Aufhebung der Substrateigenschaften.
Beispiel 28:
(dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA-Cy2 und (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA, Fig. 32
Die Kopplung von dUTP-AA-PEG-Biotin an SA-Cy2 bzw. an SA wurde wie für (dUTP-16-
Biotin)4-SA beschrieben durchgeführt. Zu 200μl lμg/μl Streptavidin wurden lOμl einer Lösung von dUTP-AA-PEG-Biotin, ca. lmmol/l, gegeben, und bei RT 1 h gerührt.
Danach wurde das Produkt durch Ultrafiltration, 50.000 MWCO, von dem nicht gekoppelten dUTP-AA-PEG-Biotin abgetrennt und das Produkt 2 mal mit Wasser gewaschen.
Ein Teil des gewonnenen (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA-Cy2 wurde mit Cy3-NHS modifiziert: 50μl (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA-Cy2 wurden in 50mmol/l Borat, pH 8.5, aufgelöst, bis zur Konzentration von 1.4μg/μl, und anschließend mit Cy3-NHS versetzt. Endkonzentration von Cy3 betrug lOmmol/l. Die Reaktion wurde 1 Std. bei RT durchgeführt. Das Produkt, (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA-Cy2/Cy3,wurde durch Ultrafiltration mit 30.000 MWCO getrennt.
Dadurch wurde ein Nuk-Makromolekül hergestellt, dass sehr wenige freie Amino- Gruppen am Marker-Teil aufweist.
Es wurde eine Verbindung erhalten, die eine Nukleotid-Funktionalität, einen langen makromolekularen Linker und eine makromolekulare Marker- Komponente trägt. Das Produkt kann stellvertretend für Nuk-Makromoleküle betrachtet werden.
Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat akzeptiert s. Beispiel 34,35.
Auch andere Verbindungen, die einen langen Linker haben und ein Biotin-Molekül tragen, S.Beispiele 20, 22, 23, 24, können ähnlich in der Synthese eingesetzt werden.
Beispiel 29:
(dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA-Alkalische Phosphatase, Fig.33, und (dUTP-AA-PEG-
Biotin)4-SA-QDot, Fig. 34,
Die Kopplung von dUTP-AA-PEG-Biotin an SA-AP bzw. QDot wurde wie für (dUTP-16- Biotin)4~SA beschrieben durchgeführt.
Im Falle von QDot werden Nuk-Linker-Teile an der Oberfläche der QDots angeordnet.
Es wurden Verbindung erhalten, die eine Nukleotid-Funktionalität, einen langen makromolekularen Linker und eine makromolekulare Marker-Komponente mit einem
Enzym bzw. Q-Dots trägt. Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und
Terminaler Transferase) als Substrat akzeptiert.
Auch andere Verbindungen, die einen langen Linker haben und ein Biotin-Molekül tragen, S.Beispiele 20, 22, 23, 24, können ähnlich in der Synthese eingesetzt werden.
Beispiel 30:
(dUTP-AA-PEG-Biotin)2-(dT31-TEG-Biotin)2- SA-Cy2, , Fig. 35A
Die Kopplung von dUTP-AA-PEG-Biotin an SA-Cy2 wurde wie für (dUTP-16-Biotin)4-SA beschrieben durchgeführt:
Zu lOOμl einer Streptavidin-Cy2-Lösung, 20μmol/l (1.2mg/ml), in Tris-HCI, 50mmol/l, pH 8, wurden 80μl 80μmol/I dT31-3* -TEG-Biotin (MWG Biotech) zugegeben und 10 min bei RT inkubiert. (TEG ist ein kurzer Linker zwischen Biotin und dT31). Danach wurden lOOμl einer Lösung dUTP-AA-PEG-Biotin 50μmol/l in 5OmM Tris-HCI, pH 8.0, zugegeben. Nach 10 min bei RT wurde (dUTP-AA-PEG-Biotin)2-(dT31-TEG-Biotin)2- SA-Cy2 durch Ultrafiltration, 50.000 MWCO, gereinigt.
Die Substanz trägt eine Nukleosid-Triphosphat-Funktionalität und eine makromolekulare Marker-Funktionalitäten (Oligo-dT31). Das Oligo-dT31 besteht aus
Nukleosidmonophosphaten, die allerdings an der enzymatischen Reaktion nicht teilnehmen und nur eine signalvermittelnde Funktion haben. An ein solches
Oligonukleotid können komplementäre Nukleinsäuren hybridisiert werden, die eine signalgebende Funktion haben (Fig. 35B). (allgemeine Regeln zur Hybridisierung von Nukleinsäuren sind dem Fachmann bekannt, Anderson "Nucleic Acid Hybridization",
1999).
Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat akzeptiert.
Dieses Derivat kann beispielsweise an Poly-dA oder poly-A (z.B. mit durchschnittlicher Länge 260NT, Amersham Bioscience) durch Hybridisierung gekoppelt werden. Sowohl ein einziges als auch mehrere (dUTP-AA-PEG-Biotin)2-(dT31-Biotin)2- SA-Cy2 Moleküle können an ein Poly-dA-Molekül gekoppelt werden, s.auch Fig. 5. Das Verhältnis wird durch die Konzentrationsverhältnisse bestimmt. Auch andere Oligonukleotide, beispielsweise markiert mit Farbstoffen, können zusammen mit(dUTP-AA-PEG-Biotin)2-(dT31-Biotin)2- SA-Cy2 an denselben Strang der Poly-dA oder poly-A gekoppelt werden, wobei die Verhältnisse zwischen einzelnen Molekülen variabel sind. Dadurch ist es möglich, ein polyfunktionales Nuk-Makromolekül herzustellen. Der große Vorteil eines solchen Nuk-Makromoleküls besteht in einer leicht spaltbaren makromolekularen Markierung: die an die poly-dA bzw. poly-A Stränge hybridisierten markierten Oligonukleotide können durch Denaturierung abgelöst werden. Durch die Wahl der Länge der markierten Oligonukleotide, kann die Tm dieser Oligonukleotide für die jeweiligen Anforderungen der reversiblen Markierung angepasst werden. Die Regeln zur Tm-Berechnung sind dem Fachmann bekannt ("Molecular-Cloning", J. Sambrook, band 1-3, 2001). Beispielsweise können dT25- Oligonukleotide, markeirt mit einem Cy3-Molekül an Poly-dA gekoppelt werden. Durch den Einsatz von RNA, z.B. poly-A, zur Bindung mehrer (dUTP-AA-PEG-Biotin)2-(dT31- Biotin)2-SA Moleküle, kann die Spaltung durch eine RNase erfolgen.
Da Streptavidin 4 Bindungsstellen für Biotin hat, entsteht ein Gemisch von Nuk- Makromolekülen, bei dem 4 Bindungsstellen unterschiedlich besetzt sind. Dieses Gemisch kann mit unterschiedlichen Mitteln getrennt werden. Eine der Möglichkeit besteht in Isolierung von Nuk-Makromolekülen, die mindestens ein Oligo-dT31 tragen, beispielsweise durch eine Absorbtion an einem Anionaustauscher (z.B. einer DEAE- Cellulose-Säule). Auf Gel-Elektrophorese eignet sich zur Trennung einzelner Derivaten.
Auch längere Nukleinsäureketten, die ein Biotin-Molekül tragen, beispielsweise poly- dA-Biotin, hergestellt beispielsweise durch eine terminale Kopplung von ddUTP-18- Biotin durch eine TdT-abhängige Reaktion ("Molecular-Cloning", J. Sambrook, Band 1- 3, 2001), können in ähnlicher Weise an das Streptavidin gekoppelt werden, so dass Moleküle mit einer durchschnittlichen Zusammensetzung von (dUTP-AA-PEG-Biotin)N- (Nukleinsäureketten-Biotin)M-SA entstehen. Sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige Nukleinsäureketten können gekoppelt werden. Die Länge der gekoppelten Nukleinsäureketten kann zwischen 10 und 100, 100 und 1000 Nukleotiden liegen.
Die hybridisierten Oligonukleotide, die einen Farbstoff tragen, können an den Poly-dA Strang auch kovalent durch Cross-Linker gebunden werden.
Auch andere Verbindungen, die einen langen Linker haben und ein Biotin-Molekül tragen, S.Beispiele 20, 22, 23, 24, können ähnlich in der Synthese eingesetzt werden.
Beispiel 31A:
(dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA und (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA-Cy2, Fig. 36
Die Kopplung von dUTP-AA-SS-PEG-Biotin an SA bzw. an SA-Cy2 wurde wie für
(dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA beschrieben durchgeführt. Als Edukte wurden Streptavidin und dUTP-AA-SS-PEG-Biotin eingesetzt.
Es wurde eine Verbindung erhalten, die eine Nukleotid-Funktionalität, einen langen makromolekularen Linker und eine makromolekulare Marker-Komponente trägt. Die Linker-Komponente und die Marker-Komponente können von der Nuk-Komponente unter milden Bedingungen abgespalten werden.
Das Produkt kann stellvertretend für Nuk-Makromoleküle betrachtet werden, die eine unter milden Bedingungen spaltbare Verbindung in der Linker-Komponente tragen.
Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat akzeptiert s. Beispiel 34. Beispiel 31B
(dGTP-PA-SS-PEG-Biotin)4-SA
200 μl 50 mM Lösung an Streptavidin in 50 mM Borat-Puffer, pH 9, wurden mit 5 Äquivalenten von Biotin -PEG -PDTP (PEG-Linker 30 Atome; Synthese s. Beispiel 4) 10 Minuten inkubiert. Streptavidin-(Biotin-PEG-PDTP)4 wurde durch Ultrafiltration an 3OkDa MWCO von niedermolekularen Komponenten durch mehrmaliges Waschen mit Borat-Puffer getrennt. Zu 200 μl 50 mM Streptavidin-(Biotin-PEG-PDTP)4 Lösung in Borat-Puffer wurden mit 100 μl 10 mM Lösung von TCEP, pH 8, zugegeben. Nach 30 min wurde Streptavidin-(Biotin~PEG-R-SH)4 erneut durch Ultrafiltration an 3OkDa MWCO von niedermolekularen Komponenten durch mehrmaliges Waschen mit Borat- Puffer getrennt.
dGTP-PA wurde mit PDTP-NHS modifiziert, ähnlich wie im Beispiel 1 dargestellt, das Produkt ist dGTP-PA-PDTP. 50 μl einer 100 mM Lösung von dGTP-PA-PDTP in 50 mM Borat-Puffer, pH 9, wurden zu 200 μl 50 μM Streptavidin-(Biotin-PEG-R-SH)4 in 50 mM Borat Puffer zugegeben. Nach 30 min RT wurden makromolekulare Produkte u.a. (dGTP-PA-SS-PEG-Biotin)4-SA durch Ultrafiltration an 3OkDa MWCO von niedermolekularen Komponenten durch mehrmaliges Waschen mit Borat-Puffer getrennt. Das resultierende Produkt (dGTP-PA-SS-PEG-Biotin)4-SA hat einen Linker von 42 Atomen zwischen Nuk-Komponente und dem Biotin. Dieses Nuk-Makromolekül hat eine spaltbare SS-Bidung in seinem Linker und kann von Klenow Fragment in eine Nukleinsäurekette eingebaut werden.
Beispiel 32: dCTP-PA-PEG-Maleimid-S-Oligo-dT30, Fig. 37A
Zu lOOμl einer Lösung mit dCTP-PA-PEG-Maleimid, 5mmol/l, in 5OmM Borat-Puffer, pH 9.5, wurde lOOμl einer Lösung von 3 '-SH-Oligo-dT30, 200μmol/l, in Wasser zugegeben und 48 Std. bei RT gerührt. Das Produkt wurde mittels präparativer GeI- Elektrophorese, 12% Polyacrylamid-Gel, gereinigt.
Die Substanz trägt eine Nukleosid-Triphosphat-Funktionalität und eine makromolekulare Marker-Funktionalitäten (Oligo-dT30). Das Oligo-dT30 besteht aus Nukleotiden, die allerdings an der enzymatischen Reaktion nicht teilnehmen und nur eine signalvermittelnde Funktion haben. An ein solches Oligonukleotid können komplementäre Nukleinsäuren hybridisiert werden, die eine signalgebende Funktion haben (Fig. 37B). (allgemeine Regeln zur Hybridisierung von Nukleinsäuren sind dem Fachmann bekannt, Anderson "Nucleic Acid Hybridization", 1999.) Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat akzeptiert.
Dieses Beispiel zeigt eine generelle Möglichkeit, an Nukleotiden weitere Modifikationen vorzunehnem. Weitere basenmodifzierte Nukleotidanaloga, wie z.B. 5-Allylamino- dUTP, 5-Amino-Propargyl-dUTP, 7-Deaza-Aminopropargyl-dGTP und 7-Deaza- Aminopropargyl-dATP können wie oben angeführt ebenfalls modifiziert werden. Es können sowohl Ribonukleotide, 2Λ -Deoxyribonukleotide als auch 2* ,3X - Deoxyribonukletide verwendet werden, Fig. 11 bis 14.
Durch Zugabe von Poly-dA oder PoIy-A können mehrere dCTP-PA-PEG-Maleimid-S- Oligo-dT30, z.B. 10-20, zu einem Nuk-Makromolekül gekoppelt werden. Dabei entsteht ein Nuk-Makromolekül mit linear angeordneten Nuk-Linker-Komponenten (Fig. 37 C).
Beispiel 33 :
(dCTP-PA-PEG-Maleimid-S)n-Poly-Lysin-(Cy3)m, Edukte: dCTP-PA-PEG-Maleimid (HS-Propionat)m-Poly-Lysin-(Cy3)n, n = 10-15, m 3-9, Poly-Lysin 10.000-20.000
Zu lOOμl einer Lösung mit dCTP-PA-PEG-Maleimid, 5mmol/l, in 5OmM Borat-Puffer, pH 9.5, wurde 20μl einer Lösung von (HS-Propionat)m-Poly-Lysin-(Cy3)n, ca. lmmol/l, in Wasser, gegeben und 18 Std. bei 400C gerührt. Das Produkt wurde durch Ultrafiitration, 30.000 MWCO, gereinigt.
Es wurde eine Verbindung erhalten, die eine Nukleotid-Funktionalität, einen langen makromolekularen Linker und eine makromolekulare Marker-Komponente trägt. Pro Nuk-Makromolekül sind mehrere Nuk-Komponenten gekoppelt. Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat akzeptiert.
Weitere Kombinationen von Nuk-Komponenten, Linker-Komponenten und Marker- Komponenten sind dem Fachmann naheliegend. Vergleich von Substrateigenschaften einiger Vertreter von Nuk- Makromolekülen mit konventionell modifizierten Nukleotiden.
Substrateigenschaften der Nuk-Makromoleküle gegenüber Polymerasen und Terminale deoxy-Nucleotidyl-Transferase (TdT) wurden mit den Eigenschaften der konventionell modifizierten Nukleotide in einer Markierungsreaktion verglichen. Allgemeine Prinzipien von Markierungsreaktionen findet man in "Molecular-Cloning", J. Sambrook, Band 1-3, 2001, ISBN 0-87969-576-5.
Beispiel 34: Substrateigenschaften von Nuk-Makromolekülen oder konventionell modifizierten Nukleotiden gegenüber Polymerasen
Dieses Beispiel soll nicht zur Einschränkung der möglichen Markierungsreaktionen dienen, sondern lediglich Unterschiede in den Substrateigenschaften verdeutlichen.
In den Reaktionen wurden sowohl selbst synthetisierte als auch kommerziell erhältliche modifizierte Nukleotide dUTP-Cy3 (Amersham) und dUTP-16-Biotin (Roche) verwendet. Nicht modifizierte dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) wurden bei der Firma Roth erworben.
Als Matrizen dienten sowohl kurze Oligonudeotide als auch poly-dA. Primer und Oligonukleotide wurden von MWG-Biotech synthetisiert.
Reaktionen wurden in 20mmol/l Tris-Puffer, pH 8.5, 5mmol/l MgCI2, 10% Glycerin, durchgeführt. Die Konzentrationen der Primer betrugen lμmol/l, die der
Oligonukleotide lμmol/l und die Konzentration der poly-dA, O.lμg/μl (für die
Konzentrationsverhältnisse an der festen Phase s.u.). Als Polymerase wurde Klenow
Exo minus lUnit /lOOμl (Amersham) verwendet. Die Konzentrationen von Nukleotiden betrugen 20μmol/l für konventionell modifizierte Nukleotide und 5 μmol/l für Nuk- Makromoleküle. Nicht modifizierte Nukleotide wurden in Konzentrationen von 50μmol/l eingesetzt.
Zunächst wurden Primer an die jeweilige Matrize hybridisiert: Das Reaktionsgemisch ohne Polymerase wurde auf 75°C erhitzt und über 5 min auf 37°C abgekühlt. Danach wurde die Polymerase zugegeben. Alle Reaktionen wurden über 1 h bei 37°C durchgeführt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von EDTA (Endkonzentration von lOmmol/l) gestoppt. Zu einigen Ansätzen wurde nach dem Stop der Reaktion Streptavidin, bis zu Endkonzentration von lmg/ml, zugegeben und der Ansatz weitere 10 min bei 37°C inkubiert. Dadurch können bereits eingebaute Nukleotide, die ein Biotin tragen, mit Streptavidin reagieren und somit Streptavidin und Oligonukleotid verbinden. Diese Experimente eignen sich als Kontrolle für die Laufeigenschaften von modifizierten Primern.
Zu entsprechend gekennzeichneten Ansätzen wurde Mercaptoethanol (bis 20mmol/l Endkonzentration) zugegeben und der jeweilige Ansatz wurde 10 min bei 37°C inkubiert. Mercaptoethanol wurde bei einigen Anstzen während, bei anderen Ansätzen auch nach der Reaktion zugegeben.
Die Analyse der Reaktion erfolgte mittels denaturierender Gel-Elektrophorese, 20% Polyacrylamid-Gel, 50mmol/l Tris-HCI, pH 8.7, wie in "Gel electrophoresis of nucleic Acids", Ed. D. Rickwood, 1990, dargestellt. Zur Denaturierurig der Proben wurde anstatt von 7M Urea eine erhöhte Temperatur bei der Gelelektrophorese eingesetzt (600C). Die Elektrophorese wurde in Biorad-Gelkammern (Protean 3) durchgeführt, 200V, ca. Ih. Die Visualisierung erfolgte auf einer UV-Vis Gel-Dokumentationsanlage (Biorad).
Beispiel 34A, Fig. 38
Darstellung des Einbaus und Spaltung von einem konventionell modifizierten
Nukleotid (d UTP- AA-SS-M E A-Cy 3)
Sequenzen:
Primer:
Primer-T7-20-5 '-Cy3: 5* - Cy3-TAATACGACTCACTATAGGG-3" Matrize:
Oligonukleotid Oligo l : 5' -Ab I I I IAb I I I « ACCCTATAGTGA6TCGTATTA-3 *
Die Primer-Bindungsstelle ist unterstrichen
Legende zu Figur 38:
Spuren 1-6: 1) nur PrimerT7-20-Cy3 + Oligo 1
2) PrimerT7-20-Cy3 + Oligo 1+ dCTP-Cy3 + dATP + dGTP+ Polymerase
3) PrimerT7-20-Cy3 + Oligo 1+ dCTP-Cy3 + dATP + dGTP + dTTP+ Polymerase
4) PrimerT7-20-Cy3 + Oligo 1+ dUTP-AA-SS-MEA-Cy3 + Polymerase
5) nach 1 Std. wurde zu einem Aliquot von Ansatz 4 Mercaptoethanol zugegeben und weitere 10 min inkubiert, es erfolgt eine Abspaltung der Markierung
6) nach 10 min wurde zum Aliquot von Ansatz 5 dATP, dGTP zugegeben und 30 min bei 37°C inkubiert
Wie man sieht, wird dUTP-AA-SS-MEA-Cy3 von der Polymerase eingebaut (Spur 4). Der Farbstoff kann vom Primer abgespalten werden (Spur 5) (man sieht eine Verschiebung der Bande, die durch die geringere Größe von Oigonukleotid zu begründen ist). Anschließend können weitere Nukleotide eingebaut werden (Spur 6).
Ein ähnlich durchgeführter Reaktionsansatz mit dUTP-AA-SS-TEAE-(Cy3)2 führte nicht zum Einbau des Nukleotid- Analogs in den Primer.
Dieses Beispiel zeigt, dass sogar geringfügige Veränderungen in der Analog-Struktur, wie z.B. Verdopplung der Zahl der Farbstoffe, die an ein Nukleotid gekoppelt sind, zu Veränderung in Substrateigenschaften der Nukleotide führen können.
Beispiel 34B, Fig.39
Vergleich von Substrateigenschaften eines konventionell modifizierten Nukleotid mit einem makromolekularen Marker und einem Nuk-Makromolekül
Sequenzen:
Primer:
Primer-dT35-5'-Cy3 (dT35-Cy3): 5*Cy3-ι itiiiiiiiiiiiiiii ιιi iitiii ι ιι ιιι 11— 3" Matrize:
Poly-dA (Amersham), durchschnittlich 270 Nukleotide lang.
Nukleotide: (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA, (dUTP-16-Biotin)4-SA, dUTP-16-Biotin
Legende zu Figur 39: Spuren 1-9:
1) Leiter: T-7-20-Cy3, dT35-Cy3, dT40-Cy3, dT50-Cy3
2) (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA+ Polymerase
3) (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA
4) (dUTP-16-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA+ Polymerase 5) (dUTP-16-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA
6) (dUTP-16-Biotin)4-SA-Cy3 + dT35-Cy3 + Poly-dA Im Kontroll- Ansatz, Spuren 7-9:
7) dUTP-16-Biotin + dT35-Cy3 + Poly-dA + Polymerase, Inkubation 1 std. 37°C danach + EDTA bis 10mmol/l Endkonzeentration, danach + Streptavidin 10 min 370C
8) dUTP-16-Biotin + dT35-Cy3 + Poly-dA+ Polymerase, Inkubation 1 std. 370C danach + EDTA bis lOmmol/l Endkonzeentration, 9) Leiter: T-7-20-Cy3, dT35-Cy3, dT40-Cy3, dT50-Cy3
Ein Nuk-Makromolekül, (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA, wird in den Primer eingebaut (Spur 2). Der markierte Primer hat nach dem Einbau eines Nuk-Makromoleküls eine stark veränderte elektrophoretische Beweglichkeit. Bloße Anwesenheit von Nuk- Makromolekülen hat keinen Einfluß auf den Primer (Spur 3).
Ein konventionell modifiziertes Nukleotid, (dUTP-16-Biotin)4-SA, mit einem makromolekularen Marker wird nicht in den Primer eingebaut (Spur 4). Trotz der Anwesenheit der Polymerase in Reaktion 4 (Spur 4) lassen sich keine Unterschiede zwischen Spur 4 und Spur 5 feststellen.
Spur 6 zeigt die Position des konventionell modifizierten Nukleotids mit einem makromolekularen Marker, (dUTP-16-Biotin)4-SA-Cy3, die obere Bande, und die Position des markierten Primers (die untere Bande).
Spur 7 zeigt das Ergebnis des Einbaus von dUTP-16-Biotin mit einer nachfolgenden Reaktion mit dem Streptavidin: die mit Biotin makrierten Primer reagieren mit Streptavidin und verändern ihre Laufeigenschaften. Die nicht modifizierten Primer behalten ihre elektrophoretischen Eigenschaften bei.
Spur 8 zeigt das Ergebnis der Einbaureaktion eines konventionell modifizierten Nukleotides, dUTP-16-Biotin. Man sieht eine verbreitete Primer-Bande, die durch den Einbau von dUTP-16-Biotin in den Primer zustande kommt. Die Verlängerung von Primer ist eingeschränkt, da dUTP-16-Biotin nicht unbegrenzt nacheinander eingebaut werden kann, durchschnittlich wird ca. 3 dUTP-Analoga eingebaut, so dass die Länge von Primer durchschnittlich auf 38 NT ansteigt. Erwartungsgemäß führt der Einbau von konventionell modifizierten Nukleotiden mit einem niedermolekularen Marker nicht zu einer starken Veränderung in der elektrophoretischen Mobilität der Primer.
In diesem Experiment wurden Eigenschaften der Nuk-Makromoleküle, (dUTP-AA-SS- PEG-Biotin)4-SA, mit denen der Konventionell modifizierten Nukleotide verglichen. Man sieht deutlich, dass die Kopplung eines makromolekularen Markers an ein kommerziell erworbenen dUTP-16-Biotin zum vollständigen Verlust der Substrateigenschaften der Nukleotide führt. Spuren 7 und 8 zeigen allerdings, dass die Polymerase sehr wohl in der Lage ist, dUTP-16-Biotin ohne makromolekularen Marker in den Primer einzubauen. Die Koppung von Streptavidin an das Biotin nach der Einbaureaktion führt zu genannten Veränderungen in Primer-Eigenaschaften.
Im Gegensatz dazu können Nuk-Makromoleküle (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA in den Primer ohne Schwierigkeiten durch die Polymerasen eingebaut werden. Das Auftreten von mehreren Banden im Gel führen die Erfinder auf einen mehrfachen Einbau von Nuk-Makromolekülen in den Primer (3 Banden) zurück.
Beispiel 34C, Fig. 40:
Vergleich von Substrateigenschaften von Nuk-Makromolekülen, Einbau- Reaktion in der Lösung und an einer festen Phase
Sequenzen:
Primer: (dT35-Cy3)
Primer-dT-35-5* -Cy3 : 5 " Cy 3- 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 -3 '
Matrize:
Poly-dA (Amersham), durchschnittlich 270 Nukleotide lang. Oligo-dA50-3v -TEG-Biotin (MWG-Biotech)
Nukleotide: (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA, (dU-AA-PEG-Biotin)4-SA Streptavidin-polystyre Particle, 2.17μ, Spherotech Ine,
Vorbereitung von Streptavidin-polystyren Kügelchen (feste Phase). Drei Ansätze wurden in gleicher Weise vorbereitet.
Je 0.5 ml der Lösung mit Kügelchen (im Hersteller-Puffer) wurde kurz zentrifugiert und Kügelchen-Pellet wurde in lOOμl Einbaupuffer (20 mmol/l Tris, pH 8.5, 5mmol/l
MgCI2) resuspendiert. Anschließend wurden lOOμl Oligo-dA50-3λ -TEG-Biotin Konz.
50μmol/l zugegeben und 1 h bei RT gerührt. In dieser Zeit binden die Oligo-dA- Moleküle an die Kügelchen. Anschließend wurden Kügelchen kurz abzentrifugiert und drei mal im Einbaupuffer gewaschen. Endvolumen der festen Phase betrugt je lOOμl.
Diese Menge an Oligo-dA50-feste-Phase kann PrimerrdT-35-Cy3 in 2μmol/l hybridisieren.
Die Hybridisierung von Primer-dT-35-Cy3 erfolgte bei 400C 10 min, mit anschließender Abkühlung auf RT innerhalb von 10 min. Alle anderen Schritte wurden gleich bei allen
Ansätzen durchgeführt. Legende zu Figur 40:
Spuren 1-10:
1) Leiter: dT35-Cy3, dT40-Cy3,
Reaktionen in der Flüssigphase: 2) (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA+ Polymerase
3) (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA
4) (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA+ Polymerase, Inkubation 1 h bei 37°C, dann + EDTA
5) (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + PoIy-(IA+ Polymerase, Inkubation 1 h bei 37°C, dann + EDTA, anschließend + Mercaptoethanol bis zu 200mmol/l
(Endkonzentration), für 30 min.
6) (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA + EDTA Reaktionen an der Festphase:
7) (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Oligo-dA50-feste-Phase+ Polymerase, Inkubation 1 h bei 37°C, dann + EDTA
8) (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Oligo-dA50-feste-Phase + Polymerase, Inkubation 1 h bei 37°C, dann + EDTA, anschließend + Mercaptoethanol bis zu 200mmol/l (Endkonzentration), für 30 min.
9) (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Oligo-dA50-feste-Phase, vor Elektrophorese + EDTA
10) Leiter: dT35-Cy3, dT40-Cy3,
Man sieht deutlich das Ergebnis der Einbaureaktion von Nuk-Makromolekϋlen in Spuren 2,4,5,7,8. Sowohl in der Lösung, als auch an der festen Phase läuft die enzymatische Markierungsreaktion gut ab.
Nach Zugabe von Mercaptoethanol zu mit EDTA gestoppten Reaktionen erfolgt die Abspaltung von Linker-Komponenten mit dem gebundenen Streptavidin von den Primern.
Dies fühhrt zu Wiederherstellung der elektrophoretischen Eigenschaften der Primer. Die
Verschiebung der Primer-banden in Spuren 5 und 8 ist durch multiplen Einbau von Nuk-
Makromolekülen in die Primer zu begründen. Tatsächlich, liegen die Primer-Banden nach der Spaltung in Höhe von dT40-Cy3 (s. Leiter). Dies bedeutet, dass bis zu 5 Nuk- Makromolekülen während der Reaktion in die Primer eingebaut wurden.
Beispiel 35, Fig. 41:
Substrateingenschaften der Nuk-Makromoleküle und konventionell modifizierter
Nukleotide gegenüber Terminaler Transferase (TdT).
Die Reaktion wurde nach Angaben des Kit-Herstellers (Roche) durchgeführt: Auf jeweils 50μl Volumen wurden zugegeben: 1OuI 5x Reaktionspuffer, lμl TdT (25Units), 5μl 25mmol/l CoCI2- Die Primer- und Nukleotid-Konzentrationen waren wie bei den Polymerase-Reaktionen. Die Reaktion wurde für 2 h bei 37°C durchgeführt. Primer: Primer-dT35-5' -Cy3 (dT35-Cy3), Primer-dT35 (dT35)
Legende zu Figur 41:
1) (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + TdT
2) (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 3) dUTP-Cy3 (Amersham)+ dT35 + TdT
4) dUTP-Cy3 (Amersham)H- dT35
5) dUTP-16-Biotin (Roche) + dT35-Cy3 + TdT;
6) Ansatz 5; nach dem Stop + Streptavidin
7) Streptavidin -Cy2 8) (dUTP-16-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + TdT
9) (dUTP-16-Biotin)4-SA + dT35-Cy3
10) (dUTP-16-Biotin)4-SA-Cy2
In der Spur 1 sieht man deutlich 2 Banden, die Bande in der Mitte entspricht dem dT35-Cy3, die obere Bande entspricht dem Reaktionsprodukt: Nuk-Makromolekül wurde in dT35 durch TdT eingebaut. Spur 2 dient als Negativkontrolle. In Spur 3 sieht man das Ergebnis der Markierung des dT35 mit dem konventionellen Nukleotid dUTP-
Cy3, Spur 4 ist die Nagativkontrolle. In Spur 5 ist das Ergebnis der Kopplung von dUTP-16-Biotin an die dT35-Cy3 schlecht zu erkennen. In Spur 6 sieht man allerdings eine schache Bande im oberen Bereich, die dem Ergebnis der Reaktion des mit dUTP-
16-Biotin modifizierten Primers mit Streptavidin entspricht. Spur 7 zeigt die Position des modifizierten Streptavidins. In Spur 8 und 9 sieht man nur eine Bande in der Mitte des Gels, die dem dT35-Cy3 entspricht, im oberen Gel-bereich ist keine Bande zu sehen, was eindeutig darauf deutet, dass konventionell modifizierten Nukleotide mit einem makromolekularen Marker von TdT nicht eingebaut werden. Spur 10 zeigt die
Position des (dUTP-16-Biotin)4-SA-Cy2 im Gel.
Beispiel 36: dUTP-AA-SS-PEG-Cy3, Fig. 42 A Zunächst wurde SH-PEG-Cy3 hergestellt. Zu 200 μl einer 10 mmoi/l Lösung von Diamin-PEG (6kDa, Fluka) in 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 8, wurde Cy3-NHS (Amersham-Bioscience) bis zu Endkonzentration von 15 mmol/l zugegeben. Die Reaktion wurde bei RT 30 min lang durchgeführt. Anschließend wurde NH2-PEG-Cy3 (Fig. 42 B) von Farbstoffresten durch Ultrafiltration mit MWCO 3000 abgetrennt, 3 mal mit 1 ml 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 8, gewaschen und in einem Volumen von 200 μl 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 8, aufgelöst.
Zu dieser Lösung wurde PDTP-NHS bis zu Endkonzentration von 50 mmol/l zugegeben. Die Reaktion wurde bei RT 30 min lang durchgeführt. Anschließend wurden 50 μl einer 1 mol/l Lösung von NH4HCO3, pH 8, zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde weitere 60 min inkubiert. Zur Reduktion der Disulfidbindungen wurden 100 μl einer 1 mol/l TCEP-Lösung, pH 8, zum Reaktionsgemisch zugegeben. Nach 5 min bei RT wurde das Produkt der Reaktion, das SH-PEG-Cy3, von den niedermolekularen Komponenten durch Ultrafiltration mit MWCO 3000 abgetrennt, 5 mal mit 1 ml 50 mmol/l Tris-HCI-Puffer, pH 7, gewaschen und in einem Volumen von 200 μl 50 mmol/l Tris-HCI, pH 7, aufgelöst. Unmittelbar vor Kopplung des Nukleotid-Teils wurde der pH-Wert auf 9.0 mit 1 mol/l NaOH eingestellt.
Kopplung des SH-PEG-Cy3 an den Nukleotid-Teil:
Zu lOOμl 20 mmol/l dUTP-AA-PDTP in 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 9, wurden 100 μl der Lösung mit SH-PEG-Cy3 in 50 mmol/l Tris-HCI, pH 9.0, zugegeben. Reaktion wurde bei RT über 30 min durchgeführt. Das Produkt der Reaktion wurde durch Ultrafiltration mit MWCO 3000 von niedermolekularen Komponenten abgetrennt, 5 mal mit 1 ml 50 mmol/l Tris-HCI-Puffer, pH 7, gewaschen und in einem Volumen von 200 μl 50 mmol/l Tris-HCI, pH 7, aufgelöst.
Das auf diese Weise erhaltene dUTP-AA-SS-PEG-Cy3 kann von DNA-Polymerasen, beispielsweise Klenow-Fragment Exo-minus oder Taq-Polymerase, in den wachsenden Strang der Nukleinsäuren eingebaut werden.
Das dUTP-AA-SS-PEG-Cy3 enthält eine unter milden Bedingungen spaltbare Gruppe, so dass der Linker mit dem Farbstoff von dem Nukleotid abgespalten werden kann. Dies ist beispielsweise in Verfahren der Sequenzierung durch die Synthese vom besonderen Interesse (Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382, Quake WO0132930, Kartalov WO02072892) .
Dieses Beispiel zeigt eine generelle Möglichkeit, an Nukleotiden weitere Modifikationen vorzunehnem. Weitere basenmodifzierte Nukleotidanaloga, wie z.B. 5-Propargylamino- dCTP, 5-Propargylamino-dUTP, 7-Deaza-Aminopropargyl-dGTP und 7-Deaza- Aminopropargyl-dATP können wie oben angeführt ebenfalls modifiziert werden. Es können sowohl Ribonukleotide, 2Λ -Deoxyribonukleotide als auch 2" , 3' - Deoxyribonukletide verwendet werden, Fig. 11 bis 14.
Beispiel 37: dUTP-R-CO-S-PEG-Biotin Fig. 43
Das dUTP-R-COOCH3 (Fig. 44) wurde analog zur Vorschrift (Heike A. Held, Abhijit Roychowdhury, and Steven A. Benner , Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, VoI 22,391-404 (2003)) synthetisiert. Die Triphosphatsynthese erfolgte nach T. Kovacs, L. Ötvös, Tetrahedron Letters, VoI 29, 4525-4588 (1988)).
500 mg (1.41 mmol) 5-Iod-2'-Deoxyuridin wurden bei Raumtemperatur in 10 ml wasserfreiem DMF unter Stickstoffatmosphäre suspendiert und 10 min. gerührt. Nun gibt man 160 mg ( 0.14 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)-palladium(0) zu: Nach weiteren 10 min gibt man nacheinander 400 ul Triethylamin, 480 mg (4.28 mmol) Pent-1-insäuremethylester und 55 mg (0.29 mmol) Kupfer-(I)-iodid zu. Nach 15 h wird die Reaktionsmischung am Rotationsverdampfer eingeengt und das erhaltene rote Öl chromatographisch an Kieselgel gereinigt (Dichlormethan : Methanol = 20 : 1). Man erhält 400 mg (84%) Produkt. Nach Triphosphorylierung wurde dUTP-R-COOCH3.erhalten.
In ähnlicher Weise können auch andere Basen wie Cytosin, Adenosin und Guanosin- Derivaten mit dem Pent-1-insäuremethylester modifiziert werden (Dissertation "Synthese basenmodifizierter Nukleosidtriphosphate und ihre enzymatische Polymerisation zu funktionalierter DNA", Oliver Thum, Bonn 2002).
Weitere Modifikation erfolgt am dUTP-R-COOCH3:
Zu 100 μl einer 50 mmol/l Lösung der dUTP-R-COOCH3 in 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 9, wird 100 μl .einer 1 mol/l Lösung des Merkaptoethanolamins, pH 9, zugegeben und bei 400C 3 h gerührt. Das Produkt der Reaktion, das dUTP-R-CO-S-CH2-CH2-NH2 (Fig. 45), wird vom überschüssigen
Merkaptoethanolamin auf DEAE-Cellulose im Borat-Puffer 10 mmol/l abgetrennt und mit 0,3 mol/l NaCI von der Säule eluiert.
Dieses Nukleotid hat eine unter milden Bedingungen spaltbare Th ioester- Gruppe und kann an der Aminogruppe am Linker modifiziert werden.
An diese Amino-Gruppe können weitere Modifikationen vorgenommen werden. Beispielsweise kann an sie ein Farbstoff gekoppelt werden: Synthese von dUTP-R-CO-S-CH2-CH2-NH-R-Cy3 (Fig. 46)
Zu 100 μl einer 10 mmol/l Lösung des dUTP-R-CO-S-CH2~CH2-NH2 in 50 mmol/l Borat- Puffer, pH 9, wurde Cy3-NHS bis zu Konzentration von 15 mmol/l zugegeben. Die Reaktion erfolgte bei RT über 30 min. Anschließend wurde das mit Cy3-modifiziertes Nukleotid auf Kieselgel-Platte und RP-18 Säule gereinigt, ähnlich wie in Beispiel 15 dargestellt.
Ein solches Nukleotid kann als reversibler Terminator in einem Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren eingesetzt werden (Tcherkassov WO 02088382). Die Spaltung der Thioester-Verbindung kann beispielsweise durch Zugabe von 100 mmol/l Merkaptoethanol in 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 9, erfolgen.
An die Aminogruppe des dUTP-R-CO-S-CH2-CH2-NH2 kann auch ein langer Linker mit einem niedermolekularen Marker gekoppelt werden, ähnlich wie im Beispiel 19. Das erhaltene dUTP-R-CO-S-CHrCHr-NH-PEG-Biotin kann als Zwischenprodukt für ein Nuk-Makromolekül dienen.
Beispiel 38: dUTP-AA-SS-Propionat-TEAE-Cy3-PEG (Fig. 47),
Dieses Derivat kann aus dUTP-AA-SS-Propionat-TEAE-Cy3 (s. Beispiel 17) durch Modifikation der Aminogruppe im Linker mit einem mPEG-SPA, z.B. 5.000 Da, erhalten werden. Die Modifikationsbedingungen sind ähnlich wie im Beispiel 19. Dieses Molekül besitzt einen langen Linker und kann durch die erfindungsgemäße Methode zur schnellen Reinigung der modifizierten Nukleotide vor ihrem Einsatz in den Markierungsreaktionen eingesetzt werden. Für eine Trennung von markierten von unmarkierten Nukleotiden kann in diesem Beispiel ein Filter mit MWCO von 3000 verwendet werden.
Beispiel 39:
Synthese von dUTP-AA-SS-R-PEG-Oligo-dT31-Cy3 (Fig. 48) Hestellung von SH-R-PEG-Oligo-dT3i-Cy3 (Fig. 49):
Zu 200 μl einer 100 μmol/l Lösung von 3" ~Amino-Oligo-dT31-Cy3 im 50 mmol/l Borat- Puffer, pH 9, wurde NHS-PEG-Maleimid zugegeben, bis die Konzetration von 20% (w/v) erreicht wurde. Das Gemisch wurde 2 h bei 400C kräftig gerührt. Die Trennung des Maleimid-PEG-Oligo-dT3i~Cy3 vom Überschuß an PEG-Derivat erfolgte aug DEAE- Cellulose-Säulenchromatographie: Das Reaktionsgemisch wurde in 10 mmol/l Borat, pH 9, auf die Säule aufgetragen, und mit 20 Säulenvolumina 50 mmol/l Borat, pH 9, gewaschen. Elution von Maleimid-PEG-Oligo-dT31-Cy3 von der Säule erfolgte mit 1 M NaCI in 50 mmol/l Borat, pH 9. Das Eluat wurde durch Ultrafiltration (MWCO 3000) zunächst eingeengt und das Produkt wurde in 20 mmol/l Borat-Puffer, pH 9.0, umgepuffert. Das Maleimid-PEG-Oligo-dT31-Cy3 wurde vom Oligo-dT3i-Cy3 auf präparativem 15% Polyacrylgel durch die Elektrophorese getrennt, aus dem Gel isoliert und in 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 9.0, aufgelöst. Ausbeute: 55%. Zu Lösung mit Maleimid-PEG-Oligo-dT31-Cy3 wurde DTT bis zu Konzentration 0,5 mol/l zugegeben und das Gemisch wurde 16 h bei RT gerührt. Durch Reaktion von DTT mit Maleimid entsteht SH-R-PEG-Oligo-dT3:L-Cy3. Diese Substanz wurde auf DEAE-Säule vom DTT-Überschuß abgetrennt: Das Reaktionsgemisch wurde in 50 mmol/l Na- Acetat, pH 6.0, auf die Säule aufgetragen, und mit 20 Säulenvolumina 50 mmol/l Na- Acetat, pH 6.0 gewaschen. Elution von SH-R-PEG-Oligo-dT31-Cy3 von der Säule erfolgte mit 1 mol/l NaCI in 50 mmol/l Na-Acetat, pH 6.0. Das Eluat wurde mit Ultrafiltration (MWCO 3000) zunächst eingeengt und das Produkt, SH-R-PEG-Oligo- dT3i-Cy3, wurde in 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 9.0 umgepuffert. Die Konzentration von SH-R-PEG-O!igo-dT3i-Cy3 betrug 100 μmol/l.
Zu dieser Lösung wurden 50 Äquivalente an dUTP-AA-PDTP (synthetisiert wie im Beispiel 1) zugegeben. Nach 3 h bei RT erfolgte Trennung auf DEAE-Cellulose: Das
Gemisch wurde in 50 mmol/l Na-Acetat-Puffer, pH 6.0, auf die Säule aufgetragen, und mit 20 Säulenvolumina 50 mmol/l Na-Acetat, pH 6.0, gewaschen. Elution von dUTP-
AA-PDTP erfolgte mit 0,3 mol/l NaCI in 50 mmol/l Na-Acetat, pH 6.0, Elution von dUTP-AA-SS-R-PEG-Oligo-dT31-Cy3 erfolgte mit 0,8 mol/l NaCI in 50 mmol/l Na- Acetat, pH 6.0. Das Eluat wurde mit Ultrafiltration (MWCO 3000) zunächst eingeengt und das Produkt wurde in 50 mmol/l Na-Acetat, pH 6.0, umgepuffert.
Die Substanz trägt eine Nukleosid-Triphosphat-Funktionalität und eine makromolekulare Marker-Funktionalitäten (Oligo-dT31). Das Oligo-dT31 besteht aus Nukleosid-Monophosphaten, die allerdings an der enzymatischen Reaktion nicht teilnehmen und nur eine signalvermittelnde Funktion haben. An ein solches Oligonukleotid können komplementäre Nukleinsäuren hybridisiert werden, die eine signalgebende Funktion haben (Fig. 37B). (allgemeine Regeln zur Hybridisierung von Nukleinsäuren sind dem Fachmann bekannt, Anderson "Nucleic Acid Hybridization", 1999.).
Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat akzeptiert.
In ähnlicher Weise können auch andere Oligonukleotide an das dUTP-Derivat gekoppelt werden. In einer Ausführungsform der Erfindung können andere Homopolymer-Oligonukleotide, wie z.B. Poly-dC, poly-dG oder poly-dU oder poly-dA. In einer anderen Ausführungsform können auch Oligonukleotide mit spezifischen Sequenzen eingesetzt werden. Durch die spezifische Sequenzen von Oligonukleotiden können Nukleinsäureketten sequenzspezifisch hybridisiert werden. Zur Synthese von Nuk-Makromolekülen können auch Oligonukleotide eingesetzt werden, die Haarnadel- Strukturen (Stemloops) beinhalten.
In diesem Beispiel trägt das Oligonukleotid eine am 3% -Ende über einen Linker gekoppelte Amino-Gruppe, die als Kopplungsstelle für Maleimid-PEG-NHS auftritt, und den Cy3-Fluoreszenzfarbstoff. Auch andere Kopplungsgruppen, wie SH-, Carboxy - , Aldehyd-Gruppen können eingesetzt werden. Die Position der Kopplungsgruppe kann an einem der Enden der Oligonukleotide sein, oder auch mitten in der Sequenz liegen. Solche Oligonukleotide können von der Firma MWG-Biotech, Deutschland, synthetisiert werden.
Als Modifikationen können Oligonukleotide Fluoreszenzfarbstoffe oder andere Reporter-Gruppen, wie Biotin, Digaxygenin tragen. Auch mehrere Modifikationen pro ein Oligonukleotid sind möglich. Beispielsweise können FRET-Paare oder Fluoreszenzfarbstoff-Quanchermolekül-Paar in ein Oligonukleotid eingefügt werden.
Dieses Beispiel zeigt eine generelle Möglichkeit, an Nukleotiden weitere Modifikationen vorzunehnem. Weitere basenmodifzierte Nukleotidanaloga, wie z.B. 5-Propargylamino- dCTP, 5-Amino-Propargyl-dUTP, 7-Deaza-Aminopropargyl-dGTP und 7-Deaza-
Aminopropargyl-dATP können wie oben angeführt ebenfalls modifiziert werden. Es können sowohl Ribonukleotide, 2Λ -Deoxyribonukleotide als auch 2" ,3X -
Deoxyribonukletide verwendet werden, Fig. 11 bis 14. Auch andere basenmodifizierte Nukleotide können in ähnlicher Weise eingesetzt werden.
Durch Zugabe von Poly-dA oder PoIy-A können mehrere dUTP-AA-SS-R-PEG-Oligo- dT31-Cy3, z.B. 10-20, zu einem Nuk-Makromolekül gekoppelt werden. Dabei entsteht ein Nuk-Makromolekül mit linear angeordneten Nuk-Linker-Komponenten (Fig. 37 C). Durch Zugabe von anderen modifizierten Oligonukleotiden, die an Poly-dA oder PoIy-A binden können, können auch weitere Modifikationen eingeführt werden, z.B. Fluoreszenzmarkierung.
Beispiel 40: Synthese von (dATP-PA-PEG)n-PAS~(Cy3)m
Die Herstellung von dATP-PA-PEG-NH2 wurde im Beispiel 19 beschrieben. EDA-Cy3 wurde wie folgt synthetisiert: Zu ImI wässriger EDA-Lösung, 400 mmol/l, pH 8.5 eingestellt mit HCl, wurden 0,1 mg Cy3-NHS zugegeben. Die Reaktion wurde 30 min bei RT gerührt. Das Produkt wurde auf RP-18 getrennt (Wasser-Methanol- Gradient) und auf 0.2 ml eingeengt.
PAS 100 kDa (35% wässrige Lösung) wurde durch mehrmaliges Einrotieren mit DMF in eine wasserfreie DMF-Lösung überführt. Anschließend wurde zu 200 μl einer 0,1 mmol/l PAS (2 mg in 200 μl) in DMF 3 mg CDI zugegeben. Reaktion erfolgte und 30 min bei RT. Anschließend wurden zu dieser Lösung gleichzeitig 0,2 ml 0,7 mmol/l Lösung EDA-Cy3 und 0,2 ml 0,5 mmol/l dATP-PA-PEG-NH2 zugegeben. Die Reaktion wurde 1 Std. bei RT durchgeführt. Anschließend wurde Produkt (dATP-PA-PEG)n-PAS- (Cy3)m durch Ultrafiltration mit 100 kDa MWCO von EDA-Cy3 und dATP-PA-PEG-NH2 getrennt.
Die durchschnittliche Zahl der Cy3-derivaten beträgt 5 pro ein PAS-Molekül, die durchschnittliche Zahl der Nuk-Einheiten (dATP) pro ein PAS-Molekül beträgt 2. Auf diese Weise wurde ein Nuk-Makromolekül synthetisiert, das mehrere Makrer-Einheiten und mehrere Nuk-Einheiten einschließt.
(dATP-PA-PEG)n-PAS-(Cy3)m dient als Substrat für die DNA-Polymerasen und kann in den Markierungsreaktionen eingesetzt werden.
Beispiel 41:
IMuk-Makromoleküle als Monomer-Bestandteile eines Oligonukleotides
Beispiele der enzymatischen Einbaus von Nuk-Makromolekülen in die Nukleinsäure s.
Beispiel 34 und 35. Oben wurden Kopplungen eines langen Linkers und eines Markers an Nukleotid- Monomere beschrieben, die eine reaktive Gruppe tragen. In analoger Weise kann auch ein Nukleotid-Monomer, das als Teil eines Polymeres auftritt, z.B. einer Nukleinsäurekette, und eine reaktive Gruppe trägt, ebenfalls modifiziert werden. Bevorzugt wirde bei der Modifizierung ein langer, linearer, nicht verzweigter Linker, wie PEG. Nukleotid-Monomere mit einer reaktiven Gruppe, beispielsweise einer Amino- oder Merkapto-Gruppe, können mit den Mitteln der konventionellen Oligonukleotid- Synthese in eine Nukleinsäurekette gekoppelt werden. Viele Modifikationen können bei einer Auftragssynthse, beispielsweise durch MWG-Biotech, in ein Oligonukleotid eingeführt werden. Synthese eines modifizierten Oligonukleotids:
Ein Oligonukleotid mit 31 dT-Monomeren und einer am 5 '-Ende gekoppelten Amino- Gruppe wurde von der MWG-Biotech synthetisiert (5 '-Amino-dT31). An ein solches Oligonukleotid kann beispielsweise ein Fmoc-PEG-NHS Linker gekoppelt werden:
Zu lOOμl wässriger Lösung 5 '-Amino-dT31, 0,5 mmol/l, pH 8.0, wurden lmg Fmoc- PEG-NHS (Fmoc-geschützter NH2-PEG-NHS) gegeben und bei 300C 8 Stunden gerührt. Anschließend wurde der pH-Wert auf 11 erhöht und die Reaktionsmischung weitere 2 Stdunden bei RT gerührt. Anschließend wurde das modifizierte Oligonukleotid durch Elektrophorese in einem 15% Polyacrylgel vom nicht modifizierten getrennt und isoliert. Das Produkt der Reaktion ist NH2-PEG-dT31 wurde in 50 μl 50 mmol Hydrogencarbonat-Puffer, pH 8,0, aufgelöst (Konzentration 0,3 mmol/l). An die endständige Aminogruppe kann ein makromolekularer Marker gekoppelt werden. Durch eine ähnliche Reaktion wie im Beispiel 40 kann ein mit einem makromolekularen Marker modifizieriertes Oligonukleotid synthetisiert werden: EDA-Cy3 wurde wie im Beispiel 40 synthetisiert. PAS 100 kDa (35% wässrige Lösung) wurde durch mehrmaliges Einrotieren mit DMF in eine wasserfreie DMF-Lösung überführt. Anschließend wurde zu 50 μl einer 0,1 mmol/l PAS in DMF 1 mg CDI (als konzentrierte Lösung in DMF) zugegeben. Reaktion erfolgte und 30 min bei RT. Anschließend wurden zu dieser Lösung gleichzeitig 50 μl 1,5 mmol/l Lösung EDA-Cy3 und 50 μl 0,3 mmol/l NH2-PEG-dT31 zugegeben. Die Reaktion wurde 1 Std. bei RT durchgeführt. Anschließend wurde Produkt (dT31-PEG)n-PAS-(Cy3)m durch Ultrafiltration mit 100 kDa MWCO von EDA-Cy3 und NH2-PEG-dT31 getrennt.
Die durchschnittliche Zahl der Cy3-derivaten beträgt 7 pro ein PAS-Molekül, die durchschnittliche Zahl der gekoppelten Oligonukleotide pro ein PAS-Molekül beträgt 1. Auf diese Weise wurde ein mit einem polymer mofidiziertes Oligonukleotid synthetisiert, das ein Nuk-Makromolekül einschließt.
Beispiel 42
Synthese eines Nuk-Makromoleküls mit einem Linker an einer Phosphatgruppe.
Ein Linker kann auch an die Phosphatgruppen eines Nukleotids gekoppelt werden. Die
Kopplung einer reaktiven Gruppe, beispielsweise einer Amino-Gruppe an die endständige Phosphatgruppe ist bereits bekannt (Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V 278, S. 363, A. Draganescu et al. J. Biol. Chem. 2000, V 275, 4555, Sood A, et al. 3. Am. Chem. Soc. 2005, V.127, 2394). Analog zu Synthesen in anderen Beispielen kann die Linker-Komponente an das Nukleotid gekoppelt werden.
Hier wird die Synthese eines Nukleotidanalogs mit einer modifizierten 3 '- Phosphatgruppe beschrieben. An eine so modifizierte phosphatgruppe kann ein Linker gekoppelt werden.
Zunächst wird 3 '-O-[(2-Cyanoethoxy)-(4-N-Fmoc-aminobutoxy)phosphoryl]- 2 '- deoxythymidin synthetisiert. Daraus erhält man anschließend durch Phosphorylierung das 5 '-Tri phosphat. Nach Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe kann ein Linker an die endständige Aminofunktion gekoppelt werden.
Synthese von 3 '-O-[(2-Cyanoethoxy)-(4-N-Fmoc-aminobutoxy)phosphoryl]- 2 '- deoxythymidin.
530 mg 5'-0-DMT-deoxythymidin-3'-0-(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)- phosphoramidit und 633 mg 4-(Fmoc-amino)-l-butanol wurden bei Raumtemperatur in 8 ml wasserfreiem Acetonitril unter Schutzgas (Stickstoff) vorgelegt. Innerhalb von 5 min. wurden 4.0 ml einer 0.45M Tetrazol-Lösung in Acetonitril zugetropft. Nach 12 h wurde zur Oxidation des Phosphoramidits Cumol-Hydroperoxide (135 mg) zugegeben. Nach 30 min wurde mit 150 μl Isopropanol überschüssiges Cumol-Hydroperoxid zersetzt. Anschließend wurde das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Zur Abspaltung der DTM-Schutzgruppe wurde der Rückstand in 20 ml einer Mischung aus Essigäure/ Wasser(8/2) gelöst und bei Raumtemperatur gerührt. Nach ca. 2h zeigte die Reaktionskontrolle ( DC KG 60 jDichlormethan/Methanol = 95/5) kein Edukt mehr und es wurden 20 ml Toluol zugesetzt und das Gemisch am Rotationsverdampfer eingeengt. Zur vollständigen Entfernung von Essigsäure und Wasser wurde noch 5 mal mit je 20 ml Toluol eingeengt. Das erhaltene schwachrote Öl wurde durch Chromatographie an Kieselgel gereinigt (2 mm PSC-Platte Merck; Dichlormethan/Methanol = 9/1).
Die Triphosphat-Synthese erfolgte nach T. Kovacs, L. Ötvös, Tetrahedron Letters, VoI 29, 4525-4588 (1988).
150 mg 3 '-O-[(2-Cyanoethoxy)-(4-N-Fmoc-aminobutoxy)phosphoryl]- 2 '- deoxythymidin und 74 mg Protonenschwam wurden in 0,8 ml Trimethylphosphat vorgelegt. Anschließend wurde POCI3 zugegeben (100 mg) und 1 h bei RT gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 4°C abgekühlt und es wurden 2,5 ml 0,5 M Lösung von Pyrophosphat in DMF:Tributylamin, (8:1) zugegeben. Nach 20 min wurde zur Hydrolyse 10 ml 0,2 M TEAB-Puffer, pH 8, zugesetzt.
Das Triphosphat-Nukleotid wurde mit Ethanol gefällt und auf DEAE-Cellulose und RP- 18 gereinigt.
Für die Kopplung eines Linkers wurde anschließend die Fmoc-Schutzgruppe mit 0,1 M NaOH (30 min Raumtemperatur) entfernt.
Beispiel 43 Herstellung eines Nuk-Makromoleküls mit einem Linker von 4 Kettenatomen und einem wasserlöslichen linearen Polymer.
Zu 50 μl 5% PAS (100 kD) pH 6.0 wurde 5 mg EDC zugegeben und direkt danach 20 μl 100 mM AA-dUTP mM pH 8 zugegeben. Nach 30 min bei RT wurde das Produkt durch Ultrafiltraiton mit 50 kDa MWCO von niedrigmolekularen Substanzen getrennt. Es wurden durchschnittlich ca. 4 Nukleotide pro ein Polymer-Molekül gekoppelt. Diese Nukleotide werden durch Klenow Fragment in einer Primer-abhängigen Reaktion in die Nukleinsäureketten eingebaut.
Der kurze Linker in diesem Beispiel kann auch als L-Kopplungseinheit des langen Linkers betrachtet werden, wobei PAS als Teil des Linkers auftritt.
Beispiel 44
Herstellung eines Nuk-Makromoleküls mit einem Linker von 25 Kettenatomen und einem wasserlöslichen linearen Polymer.
Zunächst wurde dCTP-PA mit FmOC-NH-(PEG)2-COOH modifiziert (dCTP-PA-(PEG)2-
NH2).
Fmoc-NH-(PEG)2-COOH wurde mit CDI aktiviert.
Zu den 200 μl 20 mM dCTP-PA in 100 mM Borat, pH 8.0, wurden 200 μl 40 mM aktivierten Fmoc-NH-(PEG)2-COOH in DMF zugegeben. Nach 30 min bei RT wurde pH- Wert auf 12 mit NaOH eingestellt und das Gemisch weitere 30 min bei RT inkubiert.
Nach einer anschließenden Trennung mit Kieselgel und RP-18 wurde das Produkt erhalten. Ausbeite 15%.
Zu 50 μl 5% PAS (100 kD) pH 6.0 wurde 5 mg EDC zugegeben und direkt danach 30 μl 10 mM (dCTP-PA-(PEG)2-NH2) pH 7 zugegeben. Nach 30 min bei RT wurde das Produkt durch Ultrafiltraiton mit 50 kDa MWCO von niedrigmolekularen Substanzen getrennt. Diese Nukleotide werden durch Klenow Fragment in einer Primer-abhängigen Reaktion in die Nukleinsäureketten eingebaut.
An das Polymer können Marker-Einheiten, beispielsweise Farbstoffe gekoppelt werden.
Beispiel 45
Herstellung eines Nuk-Makromoleküls mit einem Linker von 34 Kettenatomen und einem wasserlöslichen linearen Polymer.
Synthese von dCTP-PA-(PEG)2-NH2 s. Beispiel 44.
Die Aminogruppe von PEG wurde mit PDTP-NHS wie im Beispiel 1 modifiziert, so dass dCTP-PA-(PEG)2-NH-PDTP resultierte.
Aminodextran 70.000 wurde durch die Reaktion mit PDTP-NHS modifiziert, wobei durchschnittlich ein Amino-Dextran-Molekül mit 1,4 PDTP-Gruppen modifiziert wurde. Durch eine anschließende Reduktion mit TCEP wurden freie SH-Gruppen erzeugt, so dass Amino-Dextran-SH resultierte. Die Reinigung erfolgte mit 10 kD WMCO.
Zu 200 μl 2,5% Amino-Dextran-SH (70 kD) in 50 mM Borat-Puffer, pH 9.0, wurden 10 μl 10 mM (dCTP-PA-(PEG)2-NH-PDTP) zugegeben. Nach 120 min bei RT wurde das Produkt durch Ultrafiltration mit 10 kDa MWCO von niedrigmolekularen Substanzen getrennt. Es resultierte Aminodextran-SS-R-dCTP, wobei (R) 34 Kettenatome aufweist.
Diese Nukleotide werden durch Klenow Fragment in einer Primer-abhängigen Reaktion in die Nukleinsäureketten eingebaut.
An das Aminodextran können Marker-Einheiten, beispielsweise Farbstoffe gekoppelt werden.
Beispiel 46 Herstellung eines modifizierten Klenow-Fragments Exo minus der DNA-Polymerase I der E. coli (im weiteren Bezeichnet als Klenow-Fragments Exo minus). In einer Ausführungsform der Modifikation werden zu 70 μl einer Puffer-Lösung mit Klenow-Fragment Exo-minus der DNA-Polymerase (750 Units-Vial von Amersham Bioscience, aufgelöst im Hersteller-Puffer: 50 mmol/l Kalium-Phosphat-Puffer, pH7, 1,0 mmol/l DTT, 50% Glycerol) 100 μl einer Puffer-Lösung (200 mmol/l Tris-HCI- Puffer, pH 10.0, 60% Glycerin) zugegeben, der pH-Wert der Lösung mit Polymerase beträgt nun 9.0. Anschließend werden 30 μl einer 1 mol/l wässrigen Iod-Acetamid- Lösung zugegeben. Die Reaktion wird 30 min bei RT durchgeführt. Auf diese Weise erfolgt eine selektive Modifizierung der Polymerase an der SH-Gruppe des Cysteins.
In einer anderen Ausführungform der Modifikation erfolgt zunächst eine Zugabe von 10 μl 50 mmol/l TCEP-NaOH-Lösung, pH 8, zu 70 μl einer Puffer-Lösung mit Klenow- Fragment Exo-minus der DNA-Poiymerase (750 Units-Vial von Amersham Bioscience aufgelöst im Hersteller-Puffer, s.o.). Nach 10 min bei RT erfolgt dann die Zugabe von 100 μl einer Puffer-Lösung (200 mmol/l Tris-HCI-Puffer, pH 10.0, 60% Glycerin) zur Lösung mit Polymerase. Anschließend werden 30 μl einer 1 mol/l wässrigen Iod- Acetamid-Lösung zugegeben. Die Reaktion erfolgt 30 min bei RT. Auf diese erfolgt eine selektive Modifizierung der Polymerase an der SH-Gruppe.
Die Reinigung der modifizierten Polymerase kann beispielsweise über Ultrafiltration oder über Ionenaustauscher oder Dialyse erfolgen.
Die Aufbewahrung der modifizierten Polymerase erfolgt beispielsweise in einem glycerinhaltigen Puffer. Als Puffer eignen sich beispielsweise Tris-HCI, Borat, Phosphat- Puffer. Der pH-Wert dieser Puffer liegt beispielsweise zwischen 5 und 10. Die Konzentration des Glycerins kann beispielsweise zwischen 10 und 70% liegen.
Auch andere Reagenzien, wie bespielsweise PEG oder Salze wie NaCI, NH4CI können zur Polymerase-Lösung zugegeben werden. Vorzugsweise wird kein Reduzierungsmittel, wie beispielsweise DTT, zur Lösung mit Polymerase zugegeben. In einer Ausführungform enthält der Aufbewahrungspuffer zusätzlich ein Reagenz, das mit SH-Gruppen selektiv reagieren kann, beispielsweise IodAcetamid in Konzentration zwischen 1 mmol/1 und 500 mmol/l.
Eine auf diese Weise modifizierte Polymerase kann anstelle von Klenow-Fragment Exo- minus der DNA-Polymerase in Reaktionen mit Nuk-Makromolekülen eingesetzt werden.

Claims

Makromolekulare Nukleotidverbindungen und Methoden zu deren AnwendungPatentansprüche:
1. Makromolekulare Verbindungen mit der Struktur: (Nuk-Linker)n-Marker
wobei:
Nuk - ein Nukleotid oder ein Nukleosid ist Linker - eine Linker-Komponente, die Nuk-Komponente und die makromolekulare Marker-Komponente vebindet
Marker - eine makromolekulare Marker-Komponente ist n - eine Zahl von 1 bis 1000 ist
2. Makromolekulare Verbindungen nach Anspruch 1, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt:
Wobei: Base - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7-Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren Modifikationen , wobei X die Kopplungsstelle des Linkers an der Base ist und L - die Kopplungseinheit des Linkers (L).
R1 - ist H
R2 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Halogen, NH2, SH oder geschützte OH-Gruppe
R3 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Halogen, PO3, SH, N3, NH2,
0-CH3, 0-CH2-O-CH3, 0-CH2-CH=CH2, 0-R3-1, P(O)m-R3-1 (m ist gleich 1 oder 2), NH-R3-1, S-R3-1, Si-R3-1 wobei R3-1 eine chemisch, photochemisch oder enzymatisch spaltbare Gruppe ist.
R4 - ist H oder OH R5 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe OH, oder eine geschützte OH- Gruppe, oder eine Monophosphat-Gruppe, oder eine Diphosphat-Gruppe, oder eine Triphosphat-Gruppe, oder eine Tetraphosphat-Gruppe, oder eine Alpha- Thiotriphosphat-Gruppe ist.
3. Makromolekulare Verbindungen nach Anspruch 1, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt:
Wobei: Base - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7-Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren zu enzymatischen Reaktionen fähigen Modifikationen
R1 - ist H R2 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Halogen, NH2, SH oder geschützte OH-Gruppe
R3 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe O- R3-2-L, P(O)m- Rs-2-L, wobei m 1 oder 2 ist, NH-R3-2-L, S-R3-2-L, Si-R3-2-L oder, wobei R3-2 die Kopplungsstelle des Linkers an das Nukleotid ist und L - die Kopplungseinheit des Linkers (L) ist.
R4 - ist H oder OH
R5 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe OH, oder eine geschützte OH- Gruppe, oder eine Monophosphat-Gruppe, oder eine Diphosphat-Gruppe, oder eine Triphosphat-Gruppe, oder eine Tetraphosphat-Gruppe, oder eine Alpha- Thiotriphosphat-Gruppe ist.
4. Makromolekulare Verbindungen nach Anspruch 1, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt:
Wobei: Base - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7-Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren zu enzymatischen Reaktionen fähigen Modifikationen
R1 - ist H R2 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, HaI, NH2, SH oder geschützte OH-Gruppe
R3 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, HaI, PO3, SH, NH2, O- R3-1, P(0)m- R3-1 (m ist gleich 1 oder 2), NH-R3-1, S-R3-1, Si-R3-1 wobei R3-1 eine chemisch, photochemisch oder enzymatisch spaltbare Gruppe ist.
R4 - ist H oder OH
R5 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe O- R5-1-L, oder P-(O)3- R5-1-L (modifizierte Monophosphat-Gruppe), oder P-(O)3-P-(O)3-R5-1-L (modifizierte
Diphosphat-Gruppe) oder P-(O)3-P-(O)3-P-(O)3- R5-1-L (modifizierte Triphosphat- Gruppe), wobei R5-1 die Kopplungsstelle des Linkers an das Nukleotid ist und L - die Kopplungseinheit des Linkers (L) ist.
5. Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 4, wobei die
Kopplungseinheit des Linkers (L) folgende strukturelle Elemente einschließt: R6-NH-R7, R6-O-R7, R6-S-R7, R6-SS-R7, R6-CO-NH-R7, R6-NH-CO-R7, R6-CO-O-R7, R6-O-CO-R7, R6-CO-S-R7, R6-S-CO-R7, R6-P(O)2-R7, R6-Si-R7, R6-(CH2)n-R7, R6-(CH2VR7, R6-A-(CHz)n-R7, R6-(CH2)n-B-R7, R6-(CH=CH-VR7, R6-(A-CH=CH-VR7, R6-(CH=CH-B-)n-R7,
R6-A-CH=CH-(CHr)n-R7, R6-(-CH=CH-CH2)n-B-R7, R6-(G-O)n-R?/ R6-(A-GaO)n-R7, R6-(C≡C-B-)n-R7, R6-A-OC-(CH2-)n-R7, R6-(-C≡C-CH2)n-B-R7, R6-(-C≡C-CH2-CH2-)n-B-R7,
wobei R6 - die Nuk-Komponente ist, R7 - der Linkerrest ist und A und B folgende strukturelle Elemente einschließen: -NH-, -O-, -S-, -SS-, -CO-NH-, -NH-CO-, - CO-O-, -0-C0-, -CO-S-, -S-CO-, -P(O)2-, -Si-, -(CHz)n-, eine photolabile Gruppe, wobei n - gleich 1 bis 5 ist
6. Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 5, wobei die Linker- Komponente ein wasserlösliches Polymer einschließt.
7. Makromolekulare Verbindungen nach Anspruch 6, wobei die Linker- Komponente wasserlösliche Polymere unabhängig ausgewählt aus folgender Gruppe einschließt:
Polyethylen-glycol (PEG), Polysaccharide, Dextran, Polyamide, Polypeptide,
Polyphosphate, Pol,yacetate, Poly(alkyleneglycole), Kopolymere aus Ethylenglycol und Propylenglycol, Poly(olefinische Alkohole), Poly(Vinylpyrrolidone), Poly(Hydroxyalkylmethacrylamide), Poly(Hydroxyalkylmethacrylate), PoIy(X- Hydroxy-Säuren), Poly-Acrylsäure, Poly-Acrylamid, Poly(Vinylalkohol).
8. Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 7, wobei ein Linker- Komponente eine durchschnittliche Länge zwischen 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 10000, 10000 und 50000, 50000 bis 100000, 100000 bis 500000 Atome (Kettenatome) hat.
9. Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 8, wobei eine Marker- Komponente eine signalgebende, signalvermittelnde, katalytische oder affine Funktion hat
10. Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 9, wobei eine Marker- Komponente aus einer strukturellen Marker-Einheit besteht
11. Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 9, wobei eine Marker- Komponente mehrere strukturelle Marker-Einheiten einschließt
12. Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 10 oder 11, wobei eine strukturelle Marker-Einheit unabhängig eines der folgenden strukturellen Elemente einschließt:
Biotin, Hapten, radioaktives Isotop, seltene Erdenatom, Farbstoff, Fluoreszenzfarbstoff.
13. Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 10 oder 11 , wobei eine strukturelle Marker-Einheit unabhängig eines der folgenden Elemente einschließt: Nanokristalle oder deren Modifikationen, Proteine oder deren Modifikationen,
Nukleinsäureketten oder deren Modifikationen, Teilchen oder deren Modifikationen.
14. Makromolekulare Verbindungen nach Anspruch 13, wobei eine strukturelle Marker-Einheit eines der folgenden Proteine einschließt:
Enzyme oder deren Konjugate oder Modifikationen, Antikörper oder deren Konjugate oder Modifikationen, Streptavidin oder seine Konjugate oder Modifikationen, Avidin oder seine Konjugate oder Modifikationen
15. Makromolekulare Verbindungen nach Anspruch 13, wobei eine strukturelle Marker-Einheit eine der folgenden Arten Nukleinsäureketten einschließt: DNA, RNA, PNA, wobei die Länge von Nukleinsäureketten zwischen 10 und 10.000 Nukleotide liegt
16. Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 11 bis 15, wobei die Marker-Einheiten durch eine oder mehrere Kem-komponenten untereinander zu einer Marker-Komponente verbunden sind.
17. Makromolekulare Verbindungen nach Anspruch 16, wobei eine Kernkomponente unabhängig eines der folgenden Elemente einschließt: wasserlöslichen Polymer, aus der Gruppe von: Polyamide (z.B. Polypeptide), Polysaccharide, Dextran,- Poly-Acrylsäure und deren Derivate, Poly-Acrylamide und deren Derivate, Poly-Vinylalkohole und deren Derivate, Nukleinsäuren und deren Derivate, Streptavidin oder Avidin und deren Derivate, Dendrimere, wobei diese Elemente linear oder verzweigt oder unter einander vernetzt sein können
18. Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 10, wobei die Verbindung zwischen einer strukturellen Marker-Einheit und dem Linker kovalent oder affine erfolgt
19. Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 9, 11 bis 17, wobei die Verbindung zwischen der Kern-Komponente und dem Linker kovalent oder affine erfolgt
20. Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 19, wobei nur eine Nuk-Komponente mit einer gekoppelten Linker-Komponente an die Marker-
Komponente gebunden ist, wobei die Linkerlänge zwischen 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000, 5000 bis 20000, 20000 bis 100000 Kettenatome beträgt.
21. Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 20, wobei nur eine
Nuk-Komponente mit einer gekoppelten Linker-Komponente an die Marker- Komponente gebunden ist, wobei die Linkerlänge zwischen 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000, 5000 bis 20000, 20000 bis 100000 Kettenatome beträgt und die Linker-Komponente eine oder mehrere unter milden Bedingungen spaltbare Verbindungen beinhaltet.
22. Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 21, wobei nur eine Nuk-Komponente mit einer gekoppelten Linker-Komponente an die Marker- Komponente gebunden ist, wobei die Linkerlänge zwischen 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000, 5000 bis 20000, 20000 bis 100000 Kettenatome beträgt und ein oder mehrere Teile des Nuk-Makromoleküls dermaßen modifiziert sind, dass nur eine Nuk-Komponente in einen wachsenden Strang eingebaut werden kann.
23. Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 19 wobei mehrere Nuk-Komponenten jeweils über einen Linker an einer Marker-Komponenten gekoppelt sind, wobei die Länge der jeweiligen Linker- Komponente zwischen 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000, 5000 bis 20000, 20000 bis 100000 Kettenatome beträgt.
24. Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 19, 23, wobei mehrere Nuk-Komponenten jeweils über einen Linker an einer Marker- Komponenten gekoppelt, wobei die Länge der jeweiligen Linker- Komponente zwischen 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000, 5000 bis 20000, 20000 bis
100000 Kettenatome beträgt und der jeweilige Linker eine oder mehrere unter milden Bedingungen spaltbare Verbindungen beinhaltet.
25. Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 19, 23, 24, wobei mehrere Nuk-Komponenten jeweils über einen Linker an einer Marker- Komponenten gekoppelt, wobei die Länge der jeweiligen Linker- Komponente zwischen 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000, 5000 bis 20000, 20000 bis 100000 Kettenatome beträgt und ein oder mehrere Teile des Nuk-Makromoleküls dermaßen modifiziert sind, dass nur eine Nuk-Komponente in eine wachsende
Nukleinsäurekette eingebaut werden kann.
26. Oligonucleotide oder Polynucleotide die mindestens ein Nuk-Makromolekül nach Ansprüchen 1 bis 25 pro eine Nukleinsäurekette einschließen.
27. Oligonucleotide oder Polynucleotide nach Anspruch 26, wobei Oligo- oder Polynucleotide RNA, DNA oder PNA sind, deren Länge zwischen 5 und 50.000 Nukleotide beträgt.
28. Verfahren zur Modifizierung von Nukleinsäureketten, wobei für die Kopplung
Nuk-Makromoleküle nach Ansprüchen 1 bis 25 verwendet werden
29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Modifizierung durch eine enzymatische Kopplung erfolgt und das Reaktionsgemisch folgende Komponenten einschließt:
- mindestens eine Art der Nuk-Makromoleküle oder deren Zwischenstufen nach Ansprüchen 1 bis 25, wobei jede Art der Nuk-Makromoleküie eine für sie charakteristische Markierung besitzt
- mindestens eine Population der Nukleinsäureketten, - mindestens eine Enzymart zur Kopplung von Nuk-Makromoleküle an die
Nukleinsäureketten,
30. Verfahren nach Anspruch 28, wobei . die Modifizierung durch eine enzymatische Kopplung erfolgt und das Reaktionsgemisch folgende Komponenten einschließt:
- mindestens eine Art der Nuk-Makromoleküle oder deren Zwischenstufen nach Ansprüchen 1-25, wobei jede Art der Nuk-Makromoleküle eine für sie charakteristische Markierung besitzt
- mindestens eine Population der Nukleinsäureketten,
- mindestens eine Enzymart zur Kopplung von Nuk-Makromoelküle an die Nukleeinsäureketten - mindestens eine weitere Art von Nukleosidtriphosphaten
31. Verfahren nach Ansprüchen 29, 30, wobei die Enzymart unabhängig eine der folgenden Gruppen einschließt: DNA-Polymerase, RNA-Polymerase, Terminale Transferase,
32. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die "weitere Art" der Nukleosidtriphosphaten unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe von: Ribo- Nukleosidtriphosphaten (ATP, GTP, UTP, CTP), von 2X -Deoxyribonukleosid- Triphosphaten (dATP, dUTP, dTTP, dCTP, dGTP), von 2\3^ - Dideoxynukleosidtriphosphaten (ddATP, ddGTP, ddUTP, ddCTP, ddTTP).
33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die "weitere Art" der Nukleosidtriphosphaten konventionell modifizierte Nukleotide mit einer Markierung sind, wobei diese Markierung unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe von: ein Fluoreszenzfarbstoff, ein Biotin, ein Hapten, ein radioakives
Element.
34. Verfahren nach Ansprüchen 28 bis 33, wobei mindestens zwei unterschiedliche Populationen an Nukleinsäureketten präsent sind
35. Verfahren nach Anspruch 34, wobei mindestens eine der Populationen der Nukleinsäureketten eine Primer-Funktion hat und mindestens eine Pupulation der Nukleinsäureketten eine Matrizen-Funktion.
36. Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Modifizierung durch eine chemische
Kopplung erfolgt, wobei die Kopplung der Nuk-Makromoleküle an Nukleinsäureketten durch Phosphoroamidit-Kopplung erfolgt.
37. Verfahren nach Ansprüchen 28 bis 36, wobei im Markierungsverfahren Nuk- Makromoleküle eingesetzt werden, die die Kopplung nur einer einzigen Nuk- Komponente in den wachsenden Nukleinsäure-Strang zulassen und der mehrfache Einbau durch Modifikationen an der Nuk-Komponente, und/oder der Linker-Komponente und/oder der Marker-Komponente verhindert wird.
38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei die weitere Kopplung reversibel verhindert wird.
39. Verfahren nach Anspruch 37, wobei die weitere Kopplung irreversibel verhindert wird.
40. Verfahren nach Ansprüchen 28 bis 36, wobei im Markierungsverfahren Nuk- Makromoleküle eingesetzt werden, die eine Kopplung mehrer Nuk-Komponente in den wachsenden Nukleinsäurestrang zulassen
41. Verfahren nach Ansprüchen 28-40, wobei die an der Reaktion teilnehmenden Nukleinsäureketten an eine feste Phase gekoppelt sind und adressierbare Positionen haben.
42. Verfahren nach Anspruch 41, wobei die Nukleinsäureketten eine einheitliche Population darstellen
43. Verfahren nach Anspruch 41, wobei die Nukleinsäureketten zwei oder mehrere unterschiedliche Populationen darstellen und jede der Populationen eine adressierbare Position auf der festen Phase hat
44. Verfahren nach Ansprüchen 41,42, wobei die Kopplung von Nuk- Makromolekülen an einer Population einheitlicher, an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle erfolgt, wobei die Marker-Komponente des Nuk-
Makromoleküls nach der Kopplung am verlängerten Nukleinsäurestrang verbleibt und nicht abgetrennt wird.
45. Verfahren nach Ansprüchen 41,42, wobei die Kopplung von Nuk- Makromolekülen an einer Population einheitlicher, an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle erfolgt, wobei die Marker-Komponente oder ihre einzelnen Komponenten mit oder ohne Linker-Komponente des Nuk-Makromoleküls während der Kopplung oder nach der Kopplung von der in den wachsenden
Nukieinsäurestrang eingebauten Nuk-Komponente abgetrennt wird.
46. Verfahren nach Ansprüchen 41,43, wobei die Kopplung von Nuk- Makromolekülen in einem Reaktionsansatz parallel an zwei oder mehreren unterschiedlichen Populationen an der festen Phase fixierter
Nukleinsäuremoleküle erfolgt, wobei diese Populationen jeweils unterschiedliche adressierbare Positionen an der festen Phase haben und die Marker-Komponente des Nuk-Makromoleküls nach der Kopplung am verlängerten Nukieinsäurestrang verbleibt und nicht abgetrennt wird.
47. Verfahren nach Ansprüchen 41,43, wobei die Kopplung von Nuk- Makromolekülen in einem Reaktionsansatz parallel an zwei oder mehreren unterschiedlichen Populationen an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle erfolgt, wobei diese Populationen unterschiedliche adressierbare Positionen an der festen Phase haben und die Marker-Komponente oder ihre einzelnen Komponenten mit oder ohne Linker-Komponente des Nuk- Makromoleküls während der Kopplung oder nach der Kopplung von der Nuk- Komponente abgetrennt wird.
48. Verfahren nach Ansprüchen 41 bis 47, wobei die adressierbaren Positionen mit Nukleinsäuremolekülen auf der festen Phase als Spots auf einer planen Oberfläche verteilt sind, wobei pro ein Spot Nukleinsäuremoleküle einheitlich sind.
49. Verfahren nach Ansprüchen 41 bis 47, wobei die adressierbaren Positionen mit Nukleinsäuremolekülen an den Kügelchen bzw. Partikel befestigt sind, wobei pro ein Kügelchen Nukleinsäuremoleküle einheitlich sind.
50. Verfahren nach Ansprüchen 41 bis 47, wobei die adressierbaren Positionen mit Nukleinsäuremolekülen in einem Multigefäßsystem, wie Mikrotiterplatte oder Nanotiterplatte oder Pikotiterplatte, verteilt sind, wobei in einem Gefäß des Multigefäßsystems die Nukleinsäuremoleküle einheitlich sind.
51. Verfahren nach Ansprüchen 28 bis 35 und 37 bis 50, das folgende Schritte einschließt:
a) Bereitstellung mindestens einer Population an einzelsträngigen
Nukleinsäureketten (NSK) b) Hybridisierung von Primern an diese Nukleinsäureketten, wobei extensionsfähige NSK-Primer-Komplexe entstehen c) Inkubation von mindestens einer Art der Nuk-Makromoleküle nach Ansprüchen 1 bis 25 zusammen mit einer Art der Polymerase nach
Anspruch 31 mit den in Schritten a und b bereitgestellten NSK-Primer- Komplexen unter Bedingungen, die den Einbau von komplementären Nuk- Makromolekülen zulassen, wobei jede Art der Nuk-Makromoleküle eine für sie charakteristische Markierung besitzt. d) Entfernung der nicht eingebauten Nuk-Makromoleküle von den NSK-
Primer-Komplexen e) Detektion der Signale von in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nuk-Makromolekülen f) Entfernung der Linker-Komponente und der Marker-Komponente von den in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nuk-Makromolekülen g) Waschen der NSK-Primer-Komplexe gegebenenfalls Wiederholung der Schritte (c) bis (g).
52. Verfahren nach Ansprüchen 28-40, wobei die Nukleinsäureketten an eine feste Phase in zufälliger Anordnung gekoppelt sind.
53. Verfahren nach Ansprüchen 28 bis 41, 52 zur parallelen Sequenzanalyse von Nukleinsäuresequenzen (Nukleinsäureketten, NSKs), bei dem man
Fragmente (NSKFs) einzelsträngiger NSKs mit einer Länge von etwa 50 bis
1000 Nukleotiden erzeugt, die überlappende Teilsequenzen einer Gesamtsequenz darstellen können, man
die NSKFs unter Verwendung eines einheitlichen oder mehrerer unterschiedlichen Primer in Form von NSKF-Primer-Komplexen auf einer
Reaktionsoberfläche in einer zufälligen Anordnung bindet, man eine zyklische Aufbaureaktion des komplementären Stranges der NSKFs unter Verwendung einer oder mehrerer Polymerasen durchführt, indem man
a) zu den auf der Oberfläche gebundenen NSKF-Primer-Komplexen eine Lösung zugibt, die eine oder mehrere Polymerasen und ein bis vier Nuk-
Makromoleküle enthält, die eine mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Marker- Komponente haben, wobei die bei gleichzeitiger Verwendung von mindestens zwei Nuk-Makromoleküle jeweils an die Marker-Komponente befindlichen Fluoreszenzfarbstoffe so gewählt sind, dass sich die verwendeten Nuk- Makromoleküle durch Messung unterschiedlicher Fluoreszenzsignale voneinander unterscheiden lassen, wobei die Nuk-Makromoleküle strukturell so modifiziert sind, dass die Polymerase nach Einbau eines solchen Nuk- Makromoleküls in einen wachsenden komplementären Strang nicht in der Lage ist, ein weiteres Nuk-Nakromolekül in denselben Strang einzubauen, wobei die Linker-Komponente mit der Marker-Komponente abspaltbar sind, man
b) die in Stufe a) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen inkubiert, die zur Verlängerung der komplementären Stränge geeignet sind, wobei die komplementären Stränge jeweils um ein Nuk-Makromolekül verlängert werden, man
c) die in Stufe b) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung nicht in einen komplementären Strang ein- gebauter Nuk-Makromoleküle geeignet sind, man
d) die einzelnen, in komplementäre Stränge eingebauten Nuk- Makromoleküle durch Messen des für den jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff charakteristischen Signals detektiert, wobei man gleichzeitig die relative Posi- tion der einzelnen Fluoreszenzsignale auf der Reaktionsoberfläche bestimmt, man
e) zur Erzeugung unmarkierter (NTs oder) NSKFs die Linker- Komponente und die Marker-Komponente von den am komplementären Strang angefügten Nuk-Komponenten abspaltet, man
f) die in Stufe e) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung der Marker-Komponente geeignet sind, man die Stufen a) bis f) gegebenenfalls mehrfach wiederholt,
wobei man die relative Position einzelner NSKF-Primer-Komplexe auf der Reak- tionsoberfläche und die Sequenz dieser NSKFs durch spezifische Zuordnung der in
Stufe d) in aufeinanderfolgenden Zyklen an den jeweiligen Positionen detektierten Fluoreszenzsignale zu den Nuk-Makromolekülen bestimmt.
54. Verfahren nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbau reaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem
Zyklus nur jeweils eine Art der Nuk-Makromoleküle einsetzt.
55. Verfahren nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus jeweils zwei unterschiedlich markierte Arten der Nuk-Makromoleküle einsetzt.
56. Verfahren nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus jeweils vier unterschiedlich markierte Arten der Nuk-Makromoleküle einsetzt.
57. Verfahren nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, dass die NSKs Varianten einer bekannten Referenzsequenz sind und man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbau reaktion mehrfach wiederholt, wobei man in den Zyklen abwechselnd jeweils zwei unterschiedlich markierte Arten der Nuk-Makromoleküle und zwei unmarkierte NTs einsetzt und man die Gesamtsequenzen durch Vergleich mit der Referenzsequenz ermittelt.
58. Verfahren nach den Ansprüchen 53 bis 57, dadurch gekennzeichnet, dass man in die NSKFs jeweils eine Primerbindungsstelle (PBS) einführt, wobei man bei doppelsträngigen NSKs an beiden komplementären Einzelsträngen jeweils eine PBS einführt und wobei die Primerbindungsstellen für alle NSKFs jeweils gleiche oder verschiedene Sequenzen aufweisen.
59. Verfahren nach den Ansprüchen 53 bis 57, dadurch gekennzeichnet, dass man die NSKFs mit Primern in einer Lösung unter Bedingungen in Kontakt bringt, die zur Hybridisierung der Primer an die Primerbindungsstellen (PBSs) der NSKFs geeignet sind, wobei die Primer untereinander gleiche oder verschiedene Sequenzen aufweisen, und man die gebildeten NSKF-Primer-Komplexe anschließend auf der Reaktionsoberfläche bindet.
60. Verfahren nach den Ansprüchen 53 bis 57, dadurch gekennzeichnet, dass man die NSKFs zunächst auf der Reaktionsoberfläche immobilisiert und erst anschließend mit Primern unter Bedingungen in Kontakt bringt, die zur Hybridisierung der Primer an die Primerbindungsstellen (PBSs) der NSKFs geeignet sind, wobei NSKF-Primer-Komplexe gebildet werden, wobei die Primer untereinander gleiche oder verschiedene Sequenzen aufweisen.
61. Verfahren nach Ansprüchen 53 bis 60, bei dem an 10 bis 100.000 unterschiedlichen Sequenzenpopulationen die Einbaureaktion parallel durchgeführt
62. Verfahren nach Ansprüchen 53 bis 60, bei dem an 100.000 bis 100.000.000 unterschiedlichen Sequenzenpopulationen die Einbaureaktion parallel durchgeführt.
63. Verfahren nach Ansprüchen 28 bis 62, wobei die Sequenzen der Nukleinsäureketten ermittelt werden
64. Verfahren nach Ansprüchen 28 bis 63, wobei die Marker-Komponente fluoreszent markiert ist
65. Verfahren nach Ansprüchen 41 bis 64, wobei die feste Phase unabhängig aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Silicon, Glas, Keramik, Kunststoffe, Gele oder deren Modifikationen
66. Ein Kit, das die makromolekularen Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 25 einschließt.
67. Verfahren, bei denen makromolekulare Verbindungen nach Anspruch 1 bis 25 in enzymatischen Reaktionen eingesetzt werden, wobei Enzyme folgende Gruppen einschließen: Polymerasen, Ligasen, Nukleasen (Endo oder Exonukleasen).
68. Verfahren, bei denen makromolekulare Verbindungen nach Anspruch 26 und 27 in enzymatischen Reaktionen eingesetzt werden, wobei Enzyme folgende Gruppen einschließen: Polymerasen, Ligasen, Nukleasen (Endo oder Exonukleasen).
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