KR101947801B1 - 다기능 입자들 스캐닝 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 무엇보다도, 유체 유동 기구, 예를들면, 유세포분석기를 이용한 다중 기능성 대상체 특성화 방법 및 시스템을 제공한다. 일부 실시예들에서, 본 발명에 의한 방법은 (a) 각각의 개별 대상체 (예를들면, 입자)가 일련의 현상들로서 검출 가능한 하나 이상의 조사 영역들을 가지는 다수의 대상체 (예를들면, 입자들)를 조사하는 단계; (b) 각각의 개별 현상이 예정 촉발 역치 이상에서 검출 가능한 각각의 개별 조사 영역에 해당하는 다수 현상들을 기록하는 단계; (c) 기록된 다수 현상들을 분류하는 단계, 및 (d) 분류된 현상들에 기초하여 다수의 대상체을 특성화하는 단계인 하나 이상의 단계들을 포함한다.

Description

다기능 입자들 스캐닝{SCANNING MULTIFUNCTIONAL PARTICLES}
본원은 2010.6.7자 출원된 미국임시특허출원번호 61/352,018, 2010.7.19자 출원된 출원번호 61/365738, 및 2010.9.29자 출원된 출원번호 61/387958에 대한 우선권을 주장하고, 이들은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
생물학적, 임상적 및 진단 연구에 있어서 특정한 시점에서 동일 시료에 존재하는 일조의 상이한 생체분자들을 식별할 필요가 있다. 전형적인 다중 검출 방법은 각각이 특정 표적을 인식하는 탐침으로 기능화된 코드화 입자들과 시료를 혼합하고, 각각의 입자들로부터의 결과를 분석하는 것이다. 이러한 방법이 신뢰성을 가지려면, (1) 각각의 입자가 확실하게 식별되도록 코드화되고 (2) 각각의 입자에 결합된 표적을 정량하는 것이 중요하다. 이러한 방법의 예시로는 유세포분석기로 스캔하여 조사될 수 있는 색-코드화 입자들이다.
이러한 방법에서, 코드화는 입자들 내부에 담지된 정밀하게 제어되는 다양한 수준의 형광색소에 의해 달성되며, 표적 정량화는 입자 표면에 결합되는 표적과 결합된 형광체의 형광 강도를 측정하여 이루어진다. 본 방법에서, 코드 식별 및 표적 정량은 동시 다발적으로 수행된다. 즉, 코드화 및 표적-결합 색소 모두는 동일 위치에 놓이고, 따라서 이들 신호는 정교한 광학적 또는 전자적 방법으로 분리될 필요가 있다. 이러한 이유로, 고차의 다중화는 더욱 고가의 장비가 필요하다. 따라서, 다중 분석에서 강력하고도 저렴한 방법이 요구된다.
본 발명은, 무엇보다도, 간단하고, 저렴하고 또는 휴대용 검출시스템 예를들면 표준 유세포분석기로 다중-기능성 입자들 (또는 기타 대상체)를 스캔하여 표적 검체를 다중 검출 및/또는 정량화하는 개선 방법 및 시스템을 제공하는 것이다. 본 발명은, 부분적으로, 입자들과 같은 대상체 (object)를 세포분석기 조사 (interrogation) 구역을 지나 유동하는 일련의 세포들과 같이 거동하도록 제조할 수 있다는 발명에 기초한다. 예를들면, 공간적으로 분리되는 다수의 기능성 영역들 (예를들면, 코드화 영역(들) 및 표적 영역(들))을 가지도록 대상체 (예를들면, 입자들)를 제조할 수 있다. 대상체 (예를들면, 입자)가 유세포분석기의 투사 레이저 광선을 통과하여 유동될 때 각각의 기능성 영역은 다른 시점에서 조사될 수 있다. 이후 표준 유세포분석 데이터를 복호화하여 입자들, 이들의 해당 기능성 영역들 및 결합된 표적 검체를 재구성한다. 이러한 방법으로 더욱 고차의 다중화, 더욱 유연성 있는 코드화, 더욱 정확한 표적 정량화, 및 입자당 여러 표적들에 대한 조사가 가능하다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 다중 기능성 대상체를 특성화하는 (characterizing) 방법을 제공하며 (a) 각각이 일련의 현상들 (events)로서 검출될 수 있는 하나 이상의 조사 영역들을 가지는 다수의 대상체를 조사하는 단계; (b) 각각의 현상이 예정 촉발 역치 이상에서 검출될 수 있는 각각의 조사 영역에 해당하는 다수 현상들을 기록하는 단계; (c) 다수 현상들을 분류하는 단계, 및 (d) 분류된 현상들에 따라 다수의 대상체를 특성화하는 단계로 구성된다.
일부 실시예들에서, 적합한 대상체는 입자들, 비드들, 파지들, 거대분자들, 세포들, 미생물들, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시예들에서, 적합한 대상체는 입자들이다. 일부 실시예들에서, 적합한 대상체는 단백질들, DNA 및/또는 RNA에서 선택되는 거대분자들이다. 일부 실시예들에서, 적합한 대상체는 예쁜 꼬마선충, 세균, 효모, 및/또는 곰팡이에서 선택되는 미생물들이다.
일부 실시예들에서, 다수 현상들은 비-동시 다발적으로 기록된다. 일부 실시예들에서, 다수 현상들은 동시 다발적으로 기록된다. 일부 실시예들에서, 현상들은 유세포분석기를 이용하여 기록된다. 일부 실시예들에서, 대상체는 하나 이상의 레이저들로 투사된다. 일부 실시예들에서, 현상들은 형광 및/또는 산란 신호로 구성된다.
일부 실시예들에서, 각각의 개별 대상체는 분리된 탐침 및 코드화 영역들로 구성된다. 일부 실시예들에서, 각각의 개별 대상체는 불활성 간격자들로 분리되는 두 개의 코드화 영역들 및 하나의 탐침 영역으로 구성된다. 일부 실시예들에서, 탐침 영역은 DNA, RNA, 단백질들, 및/또는 세포들을 가진다. 일부 실시예들에서, 탐침 영역은 유전체 연결 화학물질 (generic linking chemistry)을 가진다. 일부 실시예들에서, 탐침 영역은 표적 핵산에 특이적인 포획 서열 및 범용 어댑터와 결합하는 인접 어댑터 서열을 가지는 단일-가닥 폴리뉴클레오티드 주형을 포함하여 표적 핵산 및 범용 어댑터 (예를들면, 검출 가능하게 표지) 모두는 폴리뉴클레오티드 주형에 결합되어 후-혼성화 표지(post-hybridization labeling)를 통하여 검출될 수 있다.
일부 실시예들에서, 코드화 및/또는 탐침 영역들은 형광체들로 표지화된다. 일부 실시예들에서, 형광 수준으로 대상체를 특성화한다. 일부 실시예들에서, 하나의 검출 신호 수준은 다른 신호 크기 (magnitude)를 조정 (scale)하기 위하여 사용된다. 일부 실시예들에서, 조정에 사용되는 신호는 조정되는 신호와 동일한 여기원 (excitation source)에서 획득된다. 일부 실시예들에서, 코드화 및/또는 탐침 영역들 폭들은 대상체를 특성화하기 위하여 사용된다.
일부 실시예들에서, 조사 영역들은 산란 유발 개체 (entities)를 가지며 산란 신호는 현상 기록 촉발에 사용된다. 일부 실시예들에서, 조사 영역들은 형광 물질을 가지고 형광은 현상 기록에 사용된다. 일부 실시예들에서, 조사 영역들은 코드화 및/또는 탐침 영역들로 구성된다.
일부 실시예들에서, 조사 단계는 검출영역을 통과하여 다수의 대상체를 유동시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 조사 단계는 정적 방식 (static manner)으로 다수의 대상체를 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시예들에서, 현상들은 시공간적 근접성 (spatial and temporal-proximity)에 기초하여 분류된다. 일부 실시예들에서, 현상들은 각각의 현상에 대하여 측정된 특성 패턴에 기초하여 분류된다. 일부 실시예들에서, 분류 단계는 통계 분석을 포함한다.
일부 실시예들에서, 특성화 단계는 개별 대상체 동일성 결정 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 특성화 단계는 하나 이상의 대상체 정량화 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 특성화 단계는 개별 입자들을 식별할 수 있는 기능성 표와 분류된 현상들과의 비교 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 시료에 있는 다수의 검체들을 검출하는 방법을 제공하며 (a) 각각의 개별 입자가 일련의 현상들로서 검출될 수 있는 하나 이상의 조사 영역들 및 하나 이상의 표적 검체에 특이적인 하나 이상의 탐침을 가지는 다수의 다중 기능성 입자들, 및 하나 이상의 표적 검체를 가지는 시료와의 혼합 단계; (b) 다수의 다중 기능성 입자들의 조사 단계; (c) 각각의 개별 현상이 예정 촉발 역치 이상에서 검출되는 각각의 개별 조사 영역에 해당하고, 탐침 및 해당하는 표적 검체와의 결합으로 탐침을 가지는 조사 영역에 연관된 해당 현상을 변경시키는, 다수 현상들의 기록 단계; (d) 각각의 입자에 대한 현상들 분류 단계; 및 (e) 대조군과의 비교에 의해 단계 (d)의 분류 결과에 기초하여 변경된 현상들을 검출하는 하나 이상의 표적 검체 존재 검출 단계로 구성된다.
일부 실시예들에서, 단계 (c)에서, 탐침 및 해당 표적과의 결합으로 형광 신호로 결합-후 표지화가 가능하여 탐침을 가지는 조상 영역에 연관된 해당 현상을 변경시킬 수 있다. 일부 실시예들에서, 본 방법은 코드화 영역들에 연관된 현상들을 이용하여 각각의 입자에 코드를 연관시키는 단계를 더욱 포함한다. 일부 실시예들에서, 각각의 입자에 대한 코드는 부분적으로 현상 폭 (width), 형광 또는 산란 높이, 형광 또는 산란 면적, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 결정된다.
일부 실시예들에서, 본 방법은 결합된 표적 검체 함량을 정량화하는 단계를 더욱 포함한다. 일부 실시예들에서, 정량화 단계는 해당 탐침을 가지는 조사 영역들과 연관된 현상들의 형광 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 결합된 표적 검체 함량은 부분적으로 현상 폭, 형광 또는 산란 높이, 형광 또는 산란 면적, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 결정된다.
일부 실시예들에서, 조사 단계는 검출영역을 통과하여 다수의 다중 기능성 입자들을 유동시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 기록 단계는 하나 이상의 조사 영역들로부터 시간(temporal) 신호를 기록하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 시간 신호들은 형광 및/또는 산란 신호들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 본 방법은 개별 입자들을 표시하는 특성 신호 특징부 (features)를 식별하기 위하여 시간 신호들을 처리하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 처리 단계는 특성 특징부에 기초하여 입자들의 코드화 및 탐침 영역들을 식별하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 처리 단계는 코드화 영역들을 표시하는 특성 특징부에 기초하여 입자들을 분류하는 단계를 더욱 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다중 기능성 대상체를 특성화하는 방법을 제공하며 (a) 각각의 조사 영역이 일단 조사된 검출 가능 신호 패턴으로 특성화되는 하나 이상의 조사 영역들로 이루어지는 다수의 대상체를 조사하는 단계; (b) 검출 가능 신호들을 기록하는 단계; (c) 검출 가능 신호들을 분류하는 단계, 및 (d) 단계 (c)의 분류 결과에 기초하여 다수의 대상체를 특성화하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 검출 가능 신호 패턴은 연속적이다. 일부 실시예들에서, 검출 가능 신호들은 형광 및/또는 산란 신호들에서 선택된다. 일부 실시예들에서, 신호들은 시공간적 근접성에 기초하여 분류된다. 일부 실시예들에서, 신호들은 형광 및/또는 산란 신호들의 패턴에 기초하여 분류된다. 일부 실시예들에서, 조사 단계는 검출영역을 통과하여 다수의 대상체를 유동시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 시료에 있는 다수의 검체들을 검출하는 방법을 제공하며 (a) 각각의 조사 영역이 일단 조사된 검출 가능 신호 패턴으로 특성화되는 하나 이상의 조사 영역들, 및 하나 이상의 표적 검체에 특이적인 하나 이상의 탐침을 각각의 개별 입자가 가지는 다수의 다중 기능성 입자들 및 하나 이상의 표적 검체를 가지는 시료와의 혼합 단계; (b) 다수의 다중 기능성 입자들의 조사 단계; (c) 탐침 및 해당 표적 검체와의 결합으로 탐침을 가지는 조사 영역에 연관된 해당 검출 가능 신호 패턴을 변경시키는, 검출 가능 신호들의 기록 단계; (d) 각각의 입자에 대한 검출 가능 신호들 분류 단계; (e) 대조군과의 비교에 의해 단계 (d)의 분류 결과에 기초하여 변경된 신호 패턴을 검출하는 하나 이상의 표적 검체 존재 검출단계로 구성된다. 일부 실시예들에서, 검출 가능 신호 패턴은 연속적이다.
무엇보다도, 본 발명은 본원에 기재되는 다양한 입자들을 제공한다. 일부 실시예들에서, 본 발명은 다수의 조사 영역들을 포함하는 입자들을 제공하고, 본 입자는 유세포분석기에 의해 검출 가능하고 다수의 조사 영역들은 일련의 현상들로서 검출 가능하다.
일부 실시예들에서, 본 발명은 하나 이상의 조사 영역들을 포함하는 입자를 제공하고, 본 입자는 유세포분석기에 의해 검출 가능하고 각각의 개별 조사 영역은 일단 조사된 검출 가능 신호 패턴으로 특성화된다. 일부 실시예들에서, 검출 가능 신호 패턴은 연속적이다.
다양한 실시예들에서, 다수의 조사 영역들은 검출 불가능한 간격자들에 의해 분리되는 구분된 영역들이다. 다양한 실시예들에서, 다수의 조사 영역들은 탐침들로 담지된 (loaded) 영역들을 포함한다. 다양한 실시예들에서, 다수의 조사 영역들은 코드화 영역들을 포함한다. 다양한 실시예들에서, 코드화 영역들은 나노입자들 또는 미세입자들로 담지된다. 다양한 실시예들에서, 코드화 영역들은 형광색소로 담지된다. 다양한 실시예들에서, 다수의 조사 영역들은 일련의 밴드들 (bands)을 포함한다.
다양한 실시예들에서, 본 발명에 의한 입자는 1 이상의 (예를들면, 1.0, 1.2, 1.4, 1.5, 1.6, 1.8, 2.0, 2.5 이상) 종횡비를 가진다. 다양한 실시예들에서, 본 발명에 의한 입자는 유동에 있어서 자기-정렬(self-alignment)이 가능한 형태 (morphology)를 가진다. 다양한 실시예들에서, 본 발명의 입자는 봉-형상 또는 막대-형상이다. 다양한 실시예들에서, 본 발명의 입자는 중합체로 제조된다. 다양한 실시예들에서, 적합한 중합체는 PEG를 포함한다.
본원에서, "또는"이란 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 본원에서 사용되는, 용어 "포함하는" 및 이의 변형 예를들면 "포함하고" 및 포함한다"는 기타 부가, 요소, 정수 또는 단계를 배제하지 않는다. 본원에서 사용되는, 용어 "약" 및 "대략"은 균등적으로 적용된다. 약/대략을 포함하거나 하지 않고 본원에서 사용되는 임의의 수치는 본 관련 분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 수 있는 임의의 정상적인 변동을 포함한다. 소정의 실시예들에서, "약" 또는 "대략"은 달리 언급되거나 단리 문맥에서 명백하지 않는 한 (100%를 초과하는 것을 제외하고는) 언급된 참고 수치의 (증가하거나 감소하는) 양 방향에서 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 이하 내에 속하는 수치 범위를 언급하는 것이다.
기타 본 발명의 특징부, 목적, 및 이점들은 이하 상세한 설명, 도면 및 청구범위에서 명백하여 질 것이다. 그러나, 본 발명의 실시예들을 나타내는 상세한 설명, 도면, 및 청구범위는 단지 설명을 위한 것이지 제한할 의도는 아니라는 것을 이해하여야 한다. 본 발명의 범위에 속하는 다양한 변형 및 변경 사항은 본 분야의 기술자에게 분명하게 될 것이다.
본 도면은 제한적 목적이 아닌 예시적 목적이다.
도 1은 범용 코드화 및 기능화를 위한 예시적 도면이다. (a) 각각이 스템-루프 구조 및 스템-루프에 인접한 고유 4bp 서열을 가지는 여러 범용 코드화 영역들, 및 탐침 영역에 범용 앵커를 가지도록 수화겔 입자들이 제조된다. 연결효소 반응에서, 각각의 영역에서 원하는 형광 수준을 달성하기 위하여 형광적-변경 내지 변경되지 않는 다양한 비율로 코드화 어댑터들이 부가되고 입자 탐침 영역에 기능화를 부여하기 위하여 링커 서열과 함께 탐침들이 부가된다. (b) 범용 입자 세트와 다양한 연결 어댑터들을 사용하여 제조된 고유 코드 및 탐침들을 가지는 두 분량 (batch)의 입자들의 예시.
도 2는 입자들 또는 기질 (substrate)을 하나 이상의 색 (또는 달리 기능성 종들)으로 코드화시키기 위하여 다수의 형광체들을 이용한 범용 코드화의 예시적 도면이다. 각각이 고유 방출 분광을 가지는 다수의 어댑터 변형체가 적용될 수 있다. 각각의 색 수준은 각각의 어댑터 변형체 비율을 조정함으로써 변조되어 입자들의 코드화 영역들에서 다수의 형광색들의 고유 표시 (signature)를 나타낼 수 있다.
도 3은 3-종들 연결효소반응 (ligation), 2-종들 연결효소반응, 및 화학적 변형에 의한 탐침-영역 기능화의 예시적 도면이다.
도 4는 입자들 또는 기질들에 기능성을 부여하기 위하여 탐침-특이적 주형들과 중합효소를 이용하는 예시적 도면이다. 범용 앵커들 (본 경우에 2 종류의 상이한 앵커들이 존재)이 하나의 앵커에 특이적 영역 및 탐침 서열을 가지는 링커들과 사용된다. 중합효소들은 링커를 따라 앵커들을 신장시키고, 하나 또는 다수의 영역들에서 입자들/기질들을 기능화시킨다.
도 5는 유세포분석기로 다중-색을 스캔 (scanning)하는 예시적 도면이다.
도 6은 유체 유동 (flow-through) 기구로 단일-색 스캔하는 예시적 도면이다.
도 7은 범용 어댑터와 연결효소반응을 통한 후-혼성화 miRNA 표지화를 보이는 예시적 도면이다. (a) 코드화 수화겔 입자들 탐침 영역에 걸쳐 5' 말단이 정렬된 DNA 탐침들은, 포획된 표적의 3' 말단이 포획된 어댑터 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 인접하도록 범용 어댑터 서열에 인접한 miRNA_특이적 서열을 가진다. 우발적 연결 효소반응을 완화시키도록 본 탐침에는 역위 dT으로 모자를 씌우고, 효율적인 보고를 위하여 어댑터는 비오틴 결합 3' 말단이 수화겔로부터 멀어지도록 폴리(a) 간격자를 가진다. (b) 입자들이 총 RNA와 혼성화된 후, T4 DNA 스트렙타비딘-피코에리트린 (SA-PE)이 형광 보고자 (reporter)로 사용된다. (c) 본 분석은 신호-대-잡음 = 3에서 약 아토몰 (atomole)의 검출 한계 (detection limits)를 보인다. (d) let-7a, b, c, 및 d에 대한 탐침들을 가지는 입자들과 합성 let-7a RNA이 500 amol 첨가될 때 단일-뉴클레오티드 특이성이 보인다.
도 8은 시간 경과에 따른 상대적인 연결효소 반응 효율성을 보이는 예시적 결과이다. 에러 바들은 5 개의 입자들 측정 수치들의 표준편차를 나타낸다.
도 9는 비오틴 결합 어댑터들이 스트렙타비딘-피코에리트린 보고자와 함께 사용될 때 형광 신호에 대한 범용 어댑터 폴리(A) 꼬리 길이의 영향을 보이는 예시적 결과이다. 신호들은 꼬리 길이 12 bp에 대하여 측정된 것에 대한 상대 값들이다.
도 10은 12-중 분석에 있어서의 예시적 시스템 효율을 도시한 것이다. (a) 첨가된 (spiked) 표적 함량에 대하여 도식된 배경-제거 신호로 나타낸 입자 분량들에 대한 보정곡선들. miR-210, -221, -222 및 let-7a이 표시 함량으로 동일한 배양 혼합물 (incubation mixes)에 첨가되었다. 효율 검증을 위하여 나머지 7개의 자연-발생 표적들 ('+' 기호들)은 27- 및 243-amol로 첨가되었다. 모든 실험에서, 200 ng의 E. coli 총 RNA역시 복잡계에 첨가되었다. 5 amol 이상의 표적 수준을 고려할 때 표적 수준의 평균 COV는 6.35% 이다.　각 점들은, 평균적으로, 단일 운전 (single run)된 19개의 입자들을 나타낸다. (b) 의도된 표적과 밀접하게 관련된 서열들 존재에 대한 let-7a 탐침 특이성 (표적 세트는 삽입 박스 참조). 최고 교차-반응성은 27% 정도이다. (c) 4종의 인간 조직에 대한 종양 프로필 결과. 에러 바들은 동일한 단일-환자 분취 시료에 대하여 3회 측정된 표준편차를 나타낸다.　달리 언급이 없는 한 분석에 사용된 총 RNA 함량은 250 ng이다.
도 11은 순수 (neat) 시료들에 대한 검출 계산 한계 및 보정곡선들을 보이는 예시적 결과이다. (a) 검출 한계 (LOD) 결정을 위한 SNR 외삽. 4개의 보정 표적들 (범례 참고)의 LOD는 SNR이 3일 때 표적 함량을 찾아 계산되었다. 평균 피어슨 계수 0.9965 (miR-222 제외)인 회귀선들이 LOD 외삽을 위하여 사용되었다. (b) E. coli 총 RNA가 첨가되지 않고 배양된 입자 분량들에 대한 보정곡선들. E. coli RNA 존재 여부를 제외하고 도 3a을 구성하기 위하여 사용된 것들과 조건들은 동일하다. (c) 순수 및 E. coli 보정 측정에 의한 배경-제거된 신호들 비교. 식별선 (identity line) (적색) 주위의 점 집단은 더욱 복잡한 시료들에서 결합 속도가 현저하게 감소됨이 없이 높은 특이적 검출을 의미한다. 모든 도식에 있어서, 모든 표적 수준들 (miSpike 제외)은 100-amol miSpike 프로필의 배경-제거된 신호를 적용하여 비교 목적으로 조정되었다.
도 12는 예시적 조절 이상 (dysregulation) 구분을 도시한 것이다. 조직 프로필에서 조절 이상 표적들을 구분하기 위하여 SNR이 적용되었다. log-변환 발현 비율의 평균 및 표준편차가 3회 분석된 각각의 조직의 각각의 표적에 대하여 계산되었다. 조절 이상에 대한 역치로서SNR 3이 선택되었다. 모든 조절 이상20 경우들이 문헌에 기재된 것과 일치하였다.
도 13은 분석된 입자들 개수의 함수로써 표준 수준의 변이계수 (COV)를 보이는 예시적 결과이다. E. coli 보정 스캔에서 let-7a에 대한 표적 수준의 COV는 상기 제시된 5 개의 첨가 함량들에 대하여 10-15 입자 창에서 거의 일정한 값으로 안정화된 것으로 보였다.
도 14는 다중 기능성 입자들에 대한 스캔이 구현되는 개념적 예시 도면이다. 표준 세포분석은 선택된 검출기의 신호가 역치를 넘는 경우들을"현상들"로 기록하며, 단일 비드들을 단일 현상들로 기록하고, 각각의 채널에 대한 데이터를 저장한다. 다중 기능성 입자들은 촉발 물질들 (예를들면 산란 유발)로 제공된 기능성 영역들을 가지고 단일 입자들은 다수 현상들로 기록된다. 이러한 현상들의 형상 및 시간-순서를 분석하고, 적합하게 입자들을 설계하여, 동일 입자에 속하는 이러한 일련의 현상들을 재구성할 수 있다.
도 15는 형광 보정 비드들과 다중 기능성 입자들을 스캔한 예시적 비교 도면이다. 입자 설계도 (상부), 각각의 1ms 타임 스탬프 (중간)에서의 기록된 현상들, 및 보정 비드들 및 두 개의 형광 영역들을 가지는 다중-기능성 입자들에 대하여 최소한 하나의 현상이 기록된 타임 스탬프에 대한 타임 스탬프 당 현상들의 분포 (하부)가 도시된다.
도 16은 4 개의 구분된 수준의 Cy3 (채널 2에 표시) 및 Cy5 (채널 4)로 기능화된 단일 코드화 영역을 가지는 다중 기능성 입자들에 대한 예시적 형광 산란 도표이다.
도 17은 스캔 정렬 및 일관성을 평가하기 위한 테스트 입자들 기본 세트의 설계 및 사용을 예시적으로 보인다.
도 18은 스캔 정렬 및 일관성을 평가하기 위한 테스트 입자들 기본 세트의 예시적 결과이다.
도 19는 "바코드"를 나타내는 단일의 광폭 형광 영역 및 협폭 탐침 영역을 가지는 입자들을 이용하여 핵산 검출한 예시적 결과이다.
도 20은 입자 길이를 따라 평균 스캔한 예시적 결과이다 (폭 절반에 걸쳐 평균화). 최하부 신호, 하부에서 두 번째 신호, 상부에서 두 번째 신호, 및 최상부 신호는 각각 12.5%, 25%, 50%, 및 100%의 형광 연결효소반응 (ligation) 혼합액에 해당한다.
도 21은 a) 각각의 혼합물에 대한 입자 설계 및 영상; 및 b) 각각의 혼합물에 대한 5 개의 입자들에 대한 평균 스캔의 예시이다. (1 um ~ 3.3px, 범례에서 수치는 F1 및 F2를 나타낸다)
도 22는 측정된 형광 대 각각의 연결효소반응 혼합액의 어댑터 함량의 예시적 결과이다.
도 23은 범용 코드화를 위한 예시적인 일반적 입자 설계를 도시한 것이다.
도 24는 형광 (Cy3)에 대한 비-형광 어댑터의 다양한 비율을 가지는 바코드 1 영역에서 획득된 예시적 형광 신호를 도시한 것이다.
도 25는 바코드화 겔 입자들에 연관된 현상들의 예시적 도식을 보인다. YEL 형광 (바코드화에 적용) 대 RED2 형광 (촉발화에 적용) 도식은 좌측에 및 YEL 형광 (바코드화에 적용) 대 GRN 형광 (배향화에 적용) 도식은 우측에 도시된다.
도 26은 코드화 입자들의 바코드 1 및 바코드 2 영역들 모두에 5개의 고유 수준들의 YEL 형광을 사용한 25-중 코드화에 대한 예시를 보인다. 이들 데이터는 Guava 소프트웨어에서 FCS 파일로 저장된 미처리 현상들에서 재구성된 것이다.
도 27은 microRNA 표적들에 대한 Firefly BioWorks' 주문형 어세이 (assay)를 이용한 아토몰 감도 (좌측), >3 log 동적 범위 (좌측), 및 단일-뉴클레오티드 특이성 (우측)을 보이는 예시이다. 250ng의 E. coli 총 RNA에 첨가된11개의 microRNA 표적들 희석액을 검출하고 운전 간 (inter-run) COV (삽도)로 평균 검출기 신호 대 첨가량을 보고하도록 Firefly의 3-시간 어세이 (총 RNA 결과)를 사용하였다. 각각 하나 또는 둘의 뉴클레오티드만이 달라지는let-7a, 7b, 7c, 및 7d에 대한 탐침들을 담지한 입자들에 let-7a RNA 표적 시료를 첨가하여 특이성을 평가하였다 (우측).
도 28은 패널-기반 병원체 검출을 위한 예시적 다중화 등온 증폭 및 포획 분석을 도시한 것이다. 역전사 헬리카제-의존성 증폭 (RT-HDA)을 적용하여 생성된 형광 증폭산물은 단일 단계에서 코드화 수화겔 입자들에 포획된다. 주어진 종들에 대한 3개의 표시들 및 헬리카제 관통을 배제시키도록 형성된 다공성을 가지는 탐침 영역들이 있는 각각의 입자는, 세척하지 않고 미세기구에서 즉시 스캐닝 될 수 있다. 코드화 겔 입자들에 대한 높은 감도 및 두-수준의 특이성 (증폭 및 혼성화)으로 위-양성 및 음성 판단을 완화시킬 수 있다.
도 29는 ~11 주형 사본들의 증폭 특이성 및 민감 검출을 보이기 위하여 표준 PCR 및 등온 증폭을 이용한 개념-검증 단일-용기 (one-pot) 분석의 예시를 보인다. 두 개의 개별 프라이머 세트에 의해 생성된 증폭산물에 대하여 설계된 탐침들로 단일-용기 반응을 이용하여 λ-파지 DNA의 두 개의 표적화 영역들의 증폭 특이성을 평가하였다. ~11 사본들만으로 증폭산물을 검출할 수 있었지만 (우측)특이성 테스트를 위하여 주형 λ-파지를 (+) 시료들에 ~11,000 사본들을 첨가하였다. 인간 유전체 DNA에 대한 특이성을 위하여, 인간 유전체 DNA~11,000 사본들을 λ-파지 부재에서 반응에 첨가하였다.
도 30은 다중 검출 분석을 위한 예시적 증폭 프라이머 (좌측) 및 증폭산물 탐침 (우측) 설계를 도시한다. 정방향 프라이머들은 단일 Cy3 형광체를 가진다. 탐침들은 프라이머들보다 높은 Tm을 가지고 3' 인산화로 우연한 3'-신장을 회피하도록 설계된다.
도 31은 종-특이적 증폭산물 정량화를 위한 바코드화 겔 입자들에 대한 예시적 설계를 보인다.
정의
본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여, 먼저 소정의 용어들이 하기에 정의된다. 다음 용어들 및 기타 용어들의 추가적인 정의들은 명세서 전반에 걸쳐 제시된다.
본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여, 먼저 소정의 용어들이 하기에 정의된다. 다음 용어들 및 기타 용어들의 추가적인 정의들은 명세서 전반에 걸쳐 제시된다.
"인접한" : 본원에서 사용되는 용어 "인접한"이란 "옆에," "근접한," "서로 접한", "접경한" 또는 공통의 경계를 가진다는 의미이다.
"검체" : 본원에서 사용되는 용어 "검체"는 포괄적으로 분석, 검출, 측정, 또는 정량화 대상의 임의의 물질을 의미한다. 검체 예시로는, 제한적이지 않지만, 단백질들, 펩티드들, 호르몬들, 합텐들, 항원들, 항체들, 수용체들, 효소들, 핵산들, 다당류들, 화학물질들, 중합체들, 병원체들, 독소들, 유기약물들, 무기약물들, 세포들, 조직들, 미생물들, 바이러스들, 세균, 곰팡이, 조류, 기생충들, 알레르겐들, 오염원들, 및 이들의 조합을 포함한다.
" 연결된 ": 본원에서 사용되는 용어들 "연결된", "복합된", "결합된", "부착된", "착화된", 및 "이어진", 및 문법적 균등어들은, 전형적으로 둘 이상의 잔기들 (moieties)이 서로 직간접적으로 (예를들면, 결합제로 기능하는 하나 이상의 추가적인 잔기를 통하여) 연결되어, 충분히 안정된 구조체를 형성하는 것을 의미하고, 잔기들은 본 구조체가 사용되는 조건들, 예를들면, 생리적 조건들에서 사용될 때 연결 상태를 유지한다. 일부 실시예들에서, 잔기들은 하나 이상의 공유결합으로 서로 연결된다. 일부 실시예들에서, 잔기들은 특이적 (그러나 비-공유) 결합 (예를들면 스트렙타비딘/아비딘 상호작용, 항체/항원 상호작용, 기타 등)이 관여되는 기작에 의해 서로 결합된다. 달리 또는 추가로, 충분한 수의 더 약한 상호작용 (비-공유)으로 잔기가 연결된 상태로 유지될 수 있는 충분한 안정성이 제공된다. 예시적 비-공유 상호작용은 제한적이지 않지만 친화성 상호작용, 금속 배위, 물리적 흡착, 주-객 상호작용, 소수성 상호작용, pi 적층 상호작용, 수소결합 상호작용, 반 데르 빌스 상호작용, 자기적 상호작용, 정전기적 상호작용, 쌍극자-쌍극자 상호작용, 기타 등을 포함한다.
" 생체분자들 ": 본원에 사용되는 용어 "생체분자들"은 분자들 (예를들면, 단백질들, 아미노산들, 펩티드들, 폴리뉴클레오티드들, 뉴클레오티드들, 탄수화물들, 당들, 지질들, 핵단백질들, 당단백질들, 지방단백질들, 스테로이드들, 기타 등)을 의미하며 세포들 및 조직들에서 통상 발견되고 천연-발생적 또는 인공 합성될 수 있다 (예를들면, 합성 또는 재조합 방법으로). 생체분자들의 특정 군들은 제한적이지 않지만 효소들, 수용체들, 신경전달물질들, 호르몬들, 시토킨들, 세포반응조절물질들 예를들면 성장인자 및 주화성 인자, 항체들, 백신들, 합텐들, 독소들, 인터페론들, 리보자임들, 안티-센스 제제, 플라스미드들, DNA, 및RNA를 포함한다.
" 생체적합성 ": 본원에서 사용되는 용어 "생체적합성"은, 생체내에서 실질적으로 유해한 반응을 유발하지 않는 물질을 의미한다. 일부 실시예들에서, 시험관내 또는 생체내 세포들에 첨가될 때 약 50%, 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 또는 약 5% 또는 이하의 세포사멸 물질을"생체적합성" 인 것으로 고려한다.
" 생분해성 ": 본원에서 사용되는 용어 "생분해성"은, 생리적 조건들에서 분해되는 물질을 의미한다. 일부 실시예들에서, 생분해성 물질은 세포 기전에 의해 분해되는 물질이다. 일부 실시예들에서, 생분해성 물질은 화학처리에 의해 분해되는 물질이다.
"상보적": 본원에서 사용되는 용어 "상보적," "상보적인" 및 "상보성"은, 와슨/클릭 쌍형성 규칙에 따른 뉴클레오티드 서열들의 짝지음을 의미한다. 예를들면, 서열 5'-GCGGTCCCA-3' 는 상보적 서열 5'-TGGGACCGC-3'를 가진다. 또한 상보적 서열은 DNA 서열에 상보적인 RNA 서열일 수 있다. 천연 핵산에서 일반적으로 발견되지 않는 소정의 염기들이 제한적이지 않지만 인도신, 7-디아자구아닌, 잠금 핵산들 (LNA), 및 펩티드 핵산들 (PNA)을 포함한 상보적 핵산들에 포함될 수 있다. 상보성은 완전할 필요는 없다; 안정한 이중가닥은 불일치된 염기 쌍들을 가질 수 있다, 퇴행성, 또는 미일치 (unmatched) 염기들을 가질 수 있다. 핵산 기술 분야의 숙련가들은 예를들면, 올리고뉴클레오티드 길이, 올리고뉴클레오티드 염기 조성 및 서열, 이온 강도 및 불일치 염기 쌍들 빈도를 포함한 여러 변수들을 고려하여 실험적으로 이중가닥 안정성을 결정할 수 있다.
"동시다발적" 및 "비-동시다발적" : 본원에서 사용되는 용어들 "동시다발적," "동시 다발적으로" 또는 문법적 균등어들은, 검출 가능하거나 식별 가능한 순차적 순서없이 동시에 다수 현상들이 발생하거나 일어나는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어들 "비-동시다발적," "비-동시 다발적으로," 또는 문법적 균등어들은, 검출 가능하거나 식별 가능한 순차적 순서로 다수 현상들이 발생하거나 일어나는 것을 의미한다.
"조질( Crude )" : 본원에서 사용되는 용어 "조질"은 생물학적 시료와 관련하여 사용될 때, 실질적으로 미-정제 상태의 시료를 의미한다. 예를들면, 조질 시료는 세포 용해액 또는 생검 조직 시료일 수 있다. 조질 시료는 용액 또는 건조 시료일 수 있다.
"코드화 영역," "코드 영역," 또는 "바코드 영역" : 본원에서 사용되는 용어들 "코드화 영역," "코드 영역," "바코드 영역", 또는 문법적 균등어들은, 대상체 또는 기질 (예를들면, 입자)을 식별하기 위하여 사용되는 대상체 또는 기질 (예를들면, 입자)에 있는 영역을 의미한다. 이들 용어들은 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 전형적으로, 대상체의 코드화 영역은 대상체 식별과 연관된 도식적 (graphical) 및/또는 광학적 특징부를 가진다. 이러한 도식적 및/또는 광학적 특징부는 대상체의 표시 (signature) 특징부로도 언급된다. 일부 실시예들에서, 대상체의 코드화 영역은 (하나 또는 다수의 파장들의) 가변 형광 강도를 일으키는 공간적 패턴화 특징부 (예를들면, 다양한 형상 및/또는 치수의 띠들 (stripes), 또는 다양한 크기의 일련의 구멍들)를 가진다. 일부 실시예들에서, 대상체의 코드화 영역은 다양한 패턴들로 가변 형광 신호들 (예를들면, 다른 색들 및/또는 강도들)을 일으키는 다양한 공간적 패턴들로 다양한 유형 및/또는 함량의 형광체들 또는 기타 검출 가능 물질 (moieties)를 가진다.
"기능화: 본원에서 사용되는 용어 "기능화"란, 원래의 물질에서 발견되는 것과는 상이한 물리적, 화학적 또는 생물학적 특성들을 유발시켜 물질을 개질하는 임의의 과정을 의미한다. 전형적으로, 기능화는 물질에 관능기들을 도입하는 것이다. 본원에서 사용되는 관능기들은 분자들 내에 있고 이들 분자의 특징적 화학반응을 유발시키는 특정 원자들의 그룹들이다. 본원에서 사용되는 관능기들은 화학적 (예를들면, 에스테르, 카르복실레이트, 알킬) 및 생물학적 그룹들 (예를들면, 어댑터, 또는 링커 서열들) 모두를 포함한다.
" 혼성화 ": 본원에서 사용되는 용어 "혼성화" 또는 "혼성" 이란, 두 개의 상보적 핵산 가닥들이 적합한 엄격 조건들에서 서로 서냉 복원되는 과정을 의미한다. 혼성화에 적합한 올리고뉴클레오티드들 또는 탐침들은 길이가 전형적으로 10-100 뉴클레오티드들 (예를들면, 길이가 18- 50, 12-70, 10-30, 10-24, 18-36 뉴클레오티드들)이다. 핵산 혼성화 기술은 본 분야에서 잘 알려져 있다. 참고, 예를들면, Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. 본 분야의 기술자들은 원하는 수준의 상보성을 가진 서열들을 안정적으로 혼성화하고, 더 낮은 상보성의 서열은 그렇지 않도록 혼성화 조건들의 엄격성을 추정하고 조정하는 방법을 이해할 수 있다. 혼성화 조건들 및 인자들의 예로는, 참고, 예를들면, Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.; Ausubel, F. M. et al. 1994, Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Secaucus, N.J.
" 유체역학적 직경 ": 본원에서 사용되는 용어 "유체역학적 직경"이란 일반적으로 용액 중 수화 분자 (예를들면, 거대분자들, 콜로이드들, 또는 입자들)의 유효 직경을 의미하고, 이는 용액에서 동일 이동도를 가지는 구의 직경에 해당한다. 일부 실시예들에서, 유체역학적 직경은 용액 중 측정된 입자들 크기를 기술하기 위하여 사용된다. 소정의 실시예들에서, 유체역학적 직경은 may be determined by 동적 광산란 크기 측정법으로 결정된다. 예를들면, 하기 실시예에서와 같이Zetasizer Nano ZS 장비 (Malvern)가 입자들의 유체역학적 직경을 측정하기 위하여 사용된다.
"불활성 영역": 본원에서 사용되는 용어들 "불활성 영역," "불활성 간격자" 또는 문법적 균등어들은, 대상체 (예를들면, 입자)의 영역과 연관되어 사용될 때, 유체 유동 스캔 기구 예를들면 유세포분석기에 의해 예정 촉발 역치 이상에서 검출되지 않는 영역을 의미한다. 전형적으로, 불활성 영역 또는 간격자는 비-기능화 영역이다. 예를들면, 불활성 영역은 탐침들 또는 기타 검출 가능 물질이 담지되지 않은 영역이다.
"조사( Interrogate )" : 본원에서 사용되는 용어들 "조사", "질의", "검사" 또는 문법적 균등어들은, 데이터 획득을 위한 특성화 또는 검사 과정을 의미한다.
"표지화": 본원에서 사용되는 용어들 "표지화" 및 "검출 가능 조제 또는 물질로 표지화"란 상호 교환적으로 사용되어 예를들면 다른 개체 (예를들면, 핵산, 폴리펩티드, 기타 등)와 결합된 후 개체 (entity) (예를들면, 핵산 탐침, 항체, 기타 등)가 가시화될 수 있는 것을 의미한다. 검출 가능 조제 또는 물질은, 측정 가능하고 강도가 결합된 개체 함량과 관계되는 (예를들면 비례하는) 신호를 발생시키는 것에서 선택된다. 단백질들 및 펩티드들을 표지화 및/또는 검출하기 위한 광범위한 시스템들이 본 분야에 알려져 있다. 표지화 단백질들 및 펩티드들은 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적, 화학적 또는 기타 수단에 의해 검출 가능한 표지를 담지 또는 연결시켜 제조된다. 표지 또는 표지 물질은 직접 검출 가능하고 (즉, 검출 가능하도록 임의의 추가적 반응 또는 조작이 불요, 예를들면, 형광체는 직접 검출 가능) 또는 간접적으로 검출 가능 (즉, 반응 또는 다른 검출 가능 개체와의 결합을 통하여 검출 가능, 예를들면, 합텐은 형광체와 같은 보고자를 포함하는 적당한 항체와의 반응 이후 면역병리 염색에 의해 검출 가능). 적합한 검출 가능 조제들은 제한적이지 않지만 방사성뉴클레오티드들, 형광체들, 화학발광제들, 미세입자들, 효소들, 비색 표지들, 자기성 표지들, 합텐들, 분자 비콘들, 압타머 비콘들, 및 기타 등을 포함한다.
" 단분산성 ": 본원에서 사용되는 용어들 "단분산성" 또는 "동일 크기의" 란, 입자들과 관련할 때 실질적으로 동일한 크기 및 형태를 가지며, 중합체들과 연관될 때 실질적으로 동일한 중량을 가지는 대상체 집합을 의미한다. 반대로, 일관성 없는 크기, 형태 및 중량을 가지는 대상체 집합은 다분산성이라고 칭한다. 단분산성 입자들은 전형적으로 주형-기반 합성법을 이용하여 합성된다.
" 대상체 " 또는 "기질" : 본원에서 사용되는 용어들 "대상체" 및 "기질"은 상호 교환적으로 사용되어 임의의 이산 물질을 언급한다. 대상체 또는 기질은 입자, 비드, 평판 (planar surface), 파지, 거대분자들, 세포, 미생물, 및 기타 등이다.
" 입자 ": 본원에서 사용되는 용어 "입자"는, 이산 대상체를 의미한다. 이러한 대상체는 임의의 형태 또는 크기를 가질 수 있다. 입자들 조성은, 적용분야 및 합성방법에 따라 변할 수 있다. 적합한 재료는제한적이지 않지만 플라스틱, 세라믹, 유리, 폴리스틸렌, 메틸스틸렌, 아크릴 중합체, 금속, 상자성 재료, 토리아 졸, 흑연탄소, 이산화티탄, 라텍스 또는 교차 -결합된 덱스트란 예를들면 세라로오스, 셀룰로오스, 나일론, 교차-결합된 미셀 및 테프론을 포함한다. 일부 실시예들에서, 입자들은 광학적 또는 자기적으로 검출 가능하다. 일부 실시예들에서, 입자들은 형광 또는 발광 물질, 또는 기타 검출 가능 물질을 가진다. 일부 실시예들에서, 1000 나노미터 (nm) 이하의 직경을 가지는 입자들은 또한 나노입자들로 언급된다.
" 폴리뉴클레오티드 ", " 핵산 ", 또는 " 올리고뉴클레오티드 ": 용어들 "폴리뉴클레오티드", "핵산", 또는 "올리고뉴클레오티드"는 뉴클레오티드들의 중합체를 의미한다. 용어들 "폴리뉴클레오티드", "핵산", 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 전형적으로, 폴리뉴클레오티드는 최소한 3개의 뉴클레오티드들을 가진다. DNA 및 RNA는 폴리뉴클레오티드들이다. 중합체는 천연 뉴클레오시드 (즉, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시시티딘), 뉴클레오시드 유사체 (예를들면 , 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, C5-프로피닐시티딘, C5-프로피닐우리딘, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-메틸시티딘, 7-디아자아데노신, 7-디아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 및 2-티오시티딘), 화학적 변형 염기들, 생물학적 변형 염기들 (예를들면, 메틸화 염기들), 삽입 염기들, 변형 당들 (예를들면, 2'-플루오로리보오스, 리보오스, 2'-데옥시리보오스, 아라비노오스, 및 헥소오스), 또는 변형 인산기 (예를들면, 포스포로티오에이트 및5'-N-포스포라미디트 연결)를 포함한다.
"탐침" : 본원에서 사용되는 용어 "탐침"은 가변 길이 (예를들면, 3-1000 염기 길이)의 DNA 또는 RNA 단편을 의미하며, 탐침 서열과 상보적인 표적 뉴클레오티드 서열들 존재를 검출하기 위하여 사용된다. 전형적으로, 탐침은 탐침 및 표적 간의 상보성에 의한 염기 서열로 인하여 탐침-표적 염기쌍이 가능한 단일-가닥 핵산 (DNA 또는 RNA)와 혼성화된다.
"이차 구조" : 본원에서 사용되는 용어 "이차 구조"란, 핵산 구조와 연관되어 사용될 때, 단일 분자 내의 또는 상호 작용 분자들 집합 내의 염기쌍 상호작용에 의해 형성되는 임의의 구조를 의미한다. 예시적 이차 구조들은 스템-루프 또는 이중나선을 포함한다.
"신호": 본원에서 사용되는 용어 "신호"는 검출 가능 및/또는 측정 가능 실체를 의미한다. 소정의 실시예들에서, 신호는 시각으로 검출 가능한, 예를들면, 가시적이다. 예를들면, 신호는 가시스펙트럼에서 색의 강도 및/또는 파장이거나 관련될 수 있다. 이러한 신호의 비-제한적 예시들은 효소 반응과 같은 화학반응에 의한 유색 침전물 및 유색 용해성 생성물을 포함한다. 소정의 실시예들에서, 신호는 장치를 이용하여 검출 가능하다. 일부 실시예들에서, 신호는, 여기될 때 형광을 방출하는 형광체에 기인하고, 이때 형광은 형광 검출기로 검출 가능하다. 일부 실시예들에서, 신호는 분광광도계로 검출 가능한 광 (예를들면, 가시광 및/또는 자외선)이거나 관련된다. 예를들면, 화학발광 반응으로 생성된 광은 신호로 사용될 수 있다. 일부 실시예들에서, 신호는, 예를들면, 방사성 동위원소, 적외선, 기타 등에서 방출되는 방사선이거나 관련된다. 소정의 실시예들에서, 신호는 물리적 개체의 특성의 직간접적 지시자이다. 예를들면, 신호는 생물학적 시료 및/또는 반응 용기 내의 핵산 함량 및/또는 농도의 지시자로 사용될 수 있다.
"특이적" : 본원에서 사용되는 용어 "특이적"이란, 올리고뉴클레오티드 프라이머와 연관되어 사용될 때, 적합한 혼성화 또는 세척 조건들에서, 관심 표적과 혼성화할 수 있고 무-관심 핵산들과는 실질적으로 혼성화하지 않는 올리고뉴클레오티드 또는 프라이머를 의미한다. 더 높은 수준의 서열 동일성이 바람직하며 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시예들에서, 특이적 올리고뉴클레오티드 또는 프라이머는, 올리고뉴클레오티드 및 핵산이 정렬될 때 혼성화 또는 증폭되는 핵산 일부와 최소한 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 또는 이상의 염기들의 서열 동일성을 가진다.
" 스템 -루프" : 본원에서 사용되는 용어 "스템-루프"는, 핵산 구조와 연관하여 사용될 때, 전형적으로 단일-가닥 DNA 또는 RNA에서 일어나는 분자 내 염기쌍 형성으로 인한 구조를 의미한다. 본 구조는 헤어핀 또는 헤어핀 루프라고도 알려져 있다. 전형적으로, 이것은, 반대 방향으로 읽을 때 뉴클레오티드 서열이 통상 상보적인 동일 가닥의 두 영역들이 염기-쌍을 이루어 쌍을 이루지 않는 루프로 종료되어 막대사탕-형태의 구조에 이르는 이중나선을 형성할 때 생긴다.
"실질적으로 ": 본원에서 사용되는 용어 "실질적으로"란, 완전한 또는 거의-완전한 정도의 관심 특성 또는 성질을 보이는 정량적 조건을 의미한다. 생물 분야의 숙련가는 생물학적 및 화학적 현상이 완전하게 진행되거나 및/또는 완전히 수행되거나 절대적 결과를 달성하거나 피할 수 있도록 진행되는 것이 거의 없다는 것을 이해할 수 있다. 따라서 본원에서 사용되는 용어 "실질적으로"란, 많은 생물학적 및 화학적 현상에 특유한 잠재적 완전성 결여를 감안하는 것이다.
"실질적으로 상보적" : 본원에서 사용되는 용어 "실질적으로 상보적"이란, 엄격 혼성화 조건들에서 혼성화도는 두 서열들을 의미한다. 본 분야의 숙련가는 실질적으로 상보적인 서열들이 전체 길이를 따라 혼성화 될 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 일부 실시예들에서, "엄격 혼성화 조건들"이란 최소한 다음과 같이 엄격한 혼성화 조건들을 의미한다: 50% 포름아미드, 5XSSC, 50 mM NaH2PO4, pH 6.8, 0.5% SDS, 0.1 mg/mL 분쇄된 연어정자 DNA, 및 5XDenhart 용액에서 밤샘 42 oC로 혼성화; 45 oC에서 2XSSC, 0.1% SDS로 세척; 및 45 oC에서 0.2XSSC, 0.1% SDS로 세척. 일부 실시예들에서, 엄격 혼성화 조건들은 20개의 근접한 뉴클레오티드들에 걸쳐 2 이상의 염기들이 다른 두 핵산들을 혼성화하지 않는다.
본 발명은, 무엇보다도, 유체 유동 기구, 예를들면, 유세포분석기를 이용한 다중 기능성 대상체 특성화 방법 및 시스템을 제공한다. 일부 실시예들에서, 본 발명에 의한 방법은 (a) 각각의 개별 대상체 (예를들면, 입자)가 일련의 현상들로서 검출 가능한 하나 이상의 조사 영역들을 가지는 다수의 대상체 (예를들면, 입자들)를 조사하는 단계; (b) 각각의 개별 현상이 예정 촉발 역치 이상에서 검출 가능한 각각의 개별 조사 영역에 해당하는 다수 현상들을 기록하는 단계; (c) 기록된 다수 현상들을 분류하는 단계, 및 (d) 분류된 현상들에 기초하여 다수의 대상체을 특성화하는 단계인 하나 이상의 단계들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 다수 현상들은 비-동시 다발적으로 기록된다. 일부 실시예들에서, 각각의 조사 영역은 일단 조사된 검출 가능 신호 패턴에 의해 특성화된다. 일부 실시예들에서, 기록된 현상들 또는 신호 패턴들은 공간적 및/또는 시간적-근접성에 기초하여 분류된다. 일부 실시예들에서, 기록된 현상들 또는 신호 패턴들은 측정 특성의 패턴들에 기초하여 분류된다.
본 발명은 다중화 검체 검출 및/또는 정량화에 특히 유용하다. 본 발명에 의하면, 하나 이상의 표적 검체 및 하나 이상의 대상체 (예를들면, 입자들) 사이 결합은 전형적으로 본원에 기재되는 방법에 따라 검출되는 현상들 또는 신호 패턴들을 변경시킨다. 따라서, 하나 이상의 표적 검체의 존재는 변경된 패턴들에 기초하여 검출될 수 있다. 일부 실시예들에서, 대상체 (예를들면, 입자들)에 결합된 검체 함량은 변경 수준에 기초하여 더욱 정량화될 수 있다.
따라서, 본 발명은 간단하고, 저렴하고 또는 휴대할 수 있는 기구들을 이용한 신속한 유체 유동 입자 스캐닝에 기초하여 표적 검체에 대한 다중화되고, 강력하고, 효율적인 검출 및/또는 정량화가 가능한 조성물, 방법 및 시스템들을 제공한다.
본 발명의 다양한 양태들이 하기 세부항목들에 더욱 상세하게 기술된다. 세부항목들로 기술하는 것이 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 각각의 세부항목은 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있다. 본원에서, "또는"이란 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다.
대상체
본 발명은 임의의 대상체를 특성화하기 위하여 사용될 수 있다. 적합한 대상체는 제한적이지 않지만 입자들, 비드들, 파지들 (예를들면, 파지 디스플레이에 적합한 파지들), 거대분자들 (예를들면, 펩티드들 또는 응집된 펩티드들을 포함한 단백질들, DNA 사슬접기를 포함한 DNA, 및/또는 RNA), 임의의 유전자 변형된 세포들 (예를들면, 녹색형광단백질 (GFP) 유도체를 운반하는 세포들 및 기타 등)을 포함한 세포들, 임의의 유전자 변형된 미생물들 (예를들면, GFP 유도체를 운반하는 미생물들 및 기타 등)을 포함하는 미생물들 (예를들면, 예쁜 꼬마선충 (예를들면, 약물시험용 변형 선충), 세균, 효모, 및/또는 곰팡이)을 포함한다.
예시적 목적으로, 하기 다양한 실시예들과 연관하여 입자들이 기술된다.
입자들
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 입자들은 임의의 재료로 제조될 수 있다. 적합한 입자들은 생체적합성, 비-생체적합성일 수 있다. 또한 적합한 입자들은 생분해성 또는 비-생분해성일 수 있다.
재료들
일부 실시예들에서, 입자들은 중합체들로 제조된다. 예시적 중합체들은 제한적이지 않지만 폴리(아릴레이트), 폴리(무수물), 폴리(히드록시산), 폴리에스테르, 폴리(오르토 에스테르), 폴리(알킬렌 산화물), 폴리카보네이트, 폴리(프로필렌 푸마레이트), 폴리(카프로락톤), 폴리아미드, 폴리아미노산, 폴리아세탈, 폴리락티드, 폴리글리코리드, 폴리(디옥사논), 폴리히드록시부티레이트, 폴리히드록시발리레이트, 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리시아노아크릴레이트, 폴리우레탄 및 다당류들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 입자들의 중합체들은 폴리에틸렌글리콜 (PEG)을 포함한다. 일부 실시예들에서, 입자들의 중합체들은 단계 또는 사슬 중합으로 형성된다. 라디칼 개시제, 예를들면, 감광성 개시제 (예를들면, UV 또는 적외선), 감열성 개시제, 또는 화학적 개시제의 함량 및 종류, 또는 적용되는 열 또는 광량은, 반응 속도를 조절하거나 분자량 변경에 사용될 수 있다. 필요하다면, 촉매가 사용되어 반응 속도를 높이거나 분자량을 변경시킬 수 있다. 예를들면, 강산은 단계 중합에서 촉매로 사용될 수 있다. 삼중관능성 및 기타 다중 관능성 단량체들 또는 가교제들이 사용되어 가교밀도를 높일 수도 있다. 사슬 중합에서, 하나 이상의 단량체들의 혼합물에서 화학적 개시적 농도가 조정되어 최종 분자량을 조작할 수 있다.
예시적 입자들 제조 방법은 미국특허번호: 7709544 및 미국출원공개번호: 20080176216에 기재되며, 이들의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 예를들면, 임의의 중합성 액-상 단량체로 공정이 진행될 수 있으며, 여기에서 본 발명에서 사용에 적합한 입자들의 형태가 형성되고, 단일 식각-중합 단계에서 중합된다. 예시적 단량체들은 알릴 메타크릴레이트, 벤질 메틸아크릴레이트, 1,3-부탄디올 디메타크릴레이트, 1,4-부탄디올 디메타크릴레이트, 부틸 아크릴레이트, n-부틸 메타크릴레이트, 디에틸렌글리콜 디아크릴레이트, 디에틸렌글리콜 디메타크릴레이트, 에틸 아크릴레이트, 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트, 에틸 메타크릴레이트, 2-에틸 헥실 아크릴레이트, 1,6-헥산디올 디메타크릴레이트, 4-히드록시부틸 아크릴레이트, 히드록시에틸 아크릴레이트, 2-히드록시에틸 메타크릴레이트, 2-히드록시프로필 아크릴레이트, 이소부틸 메타크릴레이트, 라우릴 메타크릴레이트, 메타크릴산, 메틸 아크릴레이트, 메틸 메타크릴레이트, 모노에틸렌글리콜, 2,2,3,3,4,4,5,5-옥타플루오로펜틸 아크릴레이트, 펜타에리트리톨 트리아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 (200) 디아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 (400) 디아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 (600) 디아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 (200) 디메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 (400) 디메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 (600) 디메타크릴레이트, 스테아릴 메타크릴레이트, 트리에틸렌글리콜, 트리에틸렌글리콜 디메타크릴레이트, 2,2,2-트리플루오로에틸 2-메틸아크릴레이트, 트리메틸롤프로판 트리아크릴레이트, 아크릴아미드, N,N,-메틸렌-비스아크릴-아미드, 페닐 아크릴레이트, 디비닐 벤젠, 기타 등을 포함한다. 소정의 실시예들에서, 단량체는 종결 종들로 종결되는 중합 반응에 의해 특정된다. 종결 종들, 식각 조명, 및 단량체 구성들은 따라서 본 발명에서 사용에 적합한 입자들을 제조하도록 상호 고려되어 선택될 수 있다.
일부 실시예들에서, 입자들은 수화겔들이다. 포괄적으로, 수화겔들은 실질적으로 다소의 가교 망을 포함한다. 이러한 수화겔을 형성하는 망에 물 또는 기타 유체가 통과할 수 있다. 일부 실시예들에서, 본 발명에서 사용하기에 적합한 수화겔들은 친수성 중합체로 제조되거나 포함한다. 예를들면, 친수성 중합체들은 음이온성 기들 (예를들면 인산기, 황산기, 카르복실기); 양이온성 기들 (예를들면 4차 아민기); 또는 극성기들 (예를들면 히드록실기, 티올기, 아민기)을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 수화겔들은 고흡수제 (예를들면 99% 이상의 물을 함유)이고 상당한 물 함유량으로 인하여 천연 조직과 매우 유사한 유연도를 가진다. 중량 및 부피 양자에서, 수화겔들은 조성 중 유체이고 따라서 구성 액체 (예를들면, 물)의 밀도를 보인다. 본 발명은 본 발명의 일부 실시예들에서 수화겔들이 특히 유용하다는 인식을 포괄한다. 임의의 특정 이론에 구속되지 않고, 수화겔들은 1) 검출 장치들, 특히, 상업적으로 구입되는 장치들을 실질적으로 변형하지 않고도 용이하게 구현되고 (예를들면, 유세포분석기), 및 2) 표면 기능화가 필요하지 않고 기능성 물질들을 용이하게 포함시킬 수 있다 (예를들면, 단일 식각-중합 단계에서)는 것이 고려된다. 생체-친화적 성질로 인하여, 수화겔들은 조직 공학, 약물전달 및 생체분자 분리 분야에서 주로 사용된다.
다양한 추가적 재료들 및 방법으로 입자들을 합성할 수 있다. 일부 실시예들에서, 입자들은 하나 이상의 중합체들로 제조되거나 포함한다. 입자들에 사용되는 중합체들은 천연 고분자들 또는 인조 (예를들면 합성) 고분자들일 수 있다. 일부 실시예들에서, 중합체들은 선형 또는 분지형 중합체들이다. 일부 실시예들에서, 중합체들은 덴드리머일 수 있다. 중합체들은 동종중합체들 또는 둘 이상의 단량체들을 포함하는 공중합체들일 수 있따. 배열 순서 관점에서, 공중합체들은 블록 공중합체들, 그라프트 공중합체들, 랜덤 공중합체들, 블렌드, 혼합물, 및/또는 임의의 상기 및 기타 중합체들의 첨가물일 수 있다.
일부 실시예들에서, 본 발명의 입자들은 탄수화물, 단백질, 핵산, 지질, 기타 등과 같은 천연고분자로 제조되거나 포함한다. 일부 실시예들에서, 천연고분자들은 합성으로 제조될 수 있다. 포유동물의 세포외 기질의 다양한 성분들로부터 유래하는 콜라겐, 히알루론산 (HA), 및 피브린과 같은 많은 천연고분자들이 본 발명의 입자들로 사용될 수 있다. 콜라겐은 포유동물의 세포외 기질의 주요 단백질들 중 하나이고, HA는 거의 모든 동물 조직들에서 발견되는 다당류이다. 알긴산염 및 아가로오스는 해양 조류원에서 유래되는 다당류들이다. 천연고분자들은 독성이 낮고 생체적합성이 높아 유리하다.
일부 실시예들에서, 중합체는 탄수화물이다. 일부 실시예들에서, 탄수화물은 단당류 (즉 단당)이다. 일부 실시예들에서, 탄수화물은 이당류, 올리고당, 및/또는 본 분야에서 알려진 글리코시드 결합들로 연결되는 단당류들 및/또는 이들의 유도체들을 포함하는 다당류일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 탄수화물들이 전형적으로 천연 탄수화물들이지만, 이들은 최소한 부분적으로-합성될 수 있다. 일부 실시예들에서, 탄수화물은 유도된 천연 탄수화물이다.
소정의 실시예들에서, 탄수화물은 단당류이거나 이를 포함하며, 제한적이지는 않지만 글루코스, 프룩토오스, 갈락토오스, 리보오스, 락토오스, 수크로오스, 말토오스, 트레할로오스, 셀비오스, 만노오스, 자일로오스, 아라비노오스, 글루코론산, 갈락토론산, 만누론산, 글루코사민, 갈락토사민, 및 뉴라민산을 포함한다. 소정의 실시예들에서, 탄수화물은 이당류이거나 이를 포함하며, 제한적이지는 않지만 락토오스, 수크로오스, 말토오스, 트레할로오스, 및 셀로비오스를 포함한다. 소정의 실시예들에서, 탄수화물은 다당류이거나 이를 포함하며, 제한적이지 않지만 히알루론산 (HA), 알긴산염, 헤파린, 아가로오스, 키토산, N,O-카르복실메틸키토산, 키틴, 셀룰로오스, 결정 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 (HPMC), 히드록시셀룰로오스 (HC), 메틸셀룰로오스 (MC), 풀루란, 덱스트란, 시클로덱스트란, 글리코겐, 녹말, 히드록시에틸녹말, 카라기난, 글리콘, 아밀로오스, 녹말, 헤파린, 곤약, 글루코만난, 푸스투란 (pustulan), 커들란, 및 잔탄을 포함한다. 소정의 실시예들에서, 탄수화물은 당알코올이며, 제한적이지는 않지만 만니톨, 솔비톨, 자이리톨, 에리트리톨, 말티톨, 및 락티톨을 포함한다.
일부 실시예들에서, 본 발명의 입자들은 합성고분자들로 제조되거나 이를 포함하며, 제한적이지는 않지만, 폴리(아릴레이트), 폴리(무수물), 폴리(히드록시산), 폴리(알킬렌 산화물), 폴리(프로필렌 푸머레이트), 폴리메타크릴레이트 폴리아세탈, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트 (예를들면 폴리(1,3-디옥산-2-온)), 폴리무수물 (예를 들면 폴리(무수세바스산)), 폴리히드록시산 (예를들면 폴리(β-히드록시알카노에이트)), 폴리프로필푸마레이트, 폴리카프로락톤, 폴리아미드 (예를들면 폴리카프로락탐), 폴리아세탈, 폴리에테르, 폴리에스테르 (예를들면 폴리락티드, 폴리글리코리드, 폴리(디옥사논), 폴리히드록시부티레이트,), 폴리(오르토에스테르), 폴리시아노아크릴레이트, 폴리비닐알코올, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리우레아, 폴리아민 및 이들의 공중합체들를 포함한다. 또한 예시적 중합체들은 폴리발레로락톤, 폴리(무수세바스산), 폴리에틸렌글리콜, 폴리스틸렌, 폴리히드록시발리레이트, 폴리(비닐 피롤리돈) 폴리(히드록시에틸 메타크릴레이트) (PHEMA), 폴리(비닐 알코올) (PVA), 및 유도체들 및 이들의 공중합체들을 포함한다.
일부 실시예들에서, 입자들의 중합체들은 단계 또는 사슬 중합으로 형성된다. 라디칼 개시제, 예를들면, 감광성 개시제 (예를들면, UV 또는 적외선), 감열성 개시제, 또는 화학적 개시제의 함량 및 종류, 또는 적용되는 열 또는 광량은, 중합 속도를 조절하거나 분자량 변경에 사용될 수 있다. 필요하다면, 촉매가 사용되어 반응 속도를 높이거나 분자량을 변경시킬 수 있다. 예를들면, 강산은 단계 중합에서 촉매로 사용될 수 있다. 삼중관능성 및 기타 다중 관능성 단량체들 또는 가교제들이 사용되어 중합체들의 가교밀도를 높일 수도 있다. 사슬 중합에서, 하나 이상의 단량체들의 혼합물에서 화학적 개시적 농도가 조정되어 최종 분자량을 조작할 수 있다.
일부 실시예들에서, 본 발명에 의한 중합체 입자들을 제조하기 위하여 광가교방법이 적용될 수 있다. 빛에 노출되면 광개시제는 반응성 자유 라디칼 종들을 형성하고 이들은 단량체들 가교 및/또는 중합을 개시한다. 임의의 광개시제가 가교 및/또는 중합 반응에 사용될 수 있다. 광개시 중합 및 광개시제는 Rabek, Mechanisms of Photophysical Processes and Photochemical Reactions in Polymers, New York: Wiley & Sons, 1987; Fouassier, Photoinitiation, Photopolymerization , and Photocuring , Cincinnati, OH: Hanser/Gardner; Fisher et al ., 2001, Annu . Rev . Mater . Res ., 31:171에 상세한 기술된다 광개시제는 임의의 빛 파장에서 자유 라디칼들을 생성한다. 소정의 실시예들에서, 광개시제는 UV 광 (200-500 nm)에서 반응한다. 소정의 실시예들에서, UV 장파장 광선이 사용된다. 다른 실시예들에서, UV 단파장 광선이 사용된다. 일부 실시예들에서, 광개시제는 가시광 (400-800 nm)을 사용하여 반응된다. 소정의 실시예들에서, 광개시제는 청색광 (420-500 nm)을 사용하여 반응된다. 일부 실시예들에서, 광개시제는 IR 광 (800-2500 nm)을 사용하여 반응된다. 광 출력을 조절하여 가교 및/또는 중합 반응을 제어할 수 있다. 중합을 제어하여 형성 수화겔의 특성 및/또는 성질을 제어할 수 있다.
일부 실시예들에서, 입자는 실리카 (SiO2)와 같은 무기고분자이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 본 발명에 의한 입자들는 실리카에 기반한다. 예를들면, 규산염 재료는 생체적합성, 제조 용이성 및 기능화, 및 표면-대-부피의 높은 비율로 인하여 본 발명을 적용함에 유용하다. 다공성 실리카 입자들 및 임의의 변형 또는 혼성 입자들 과 같은 실리카-기반 입자들은 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 실리카-기반 입자들은 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 일부 방법에서는 물/에탄올 혼합물 중의 암모니아에 의해 촉매되는 테트라에톡시오르토실리케이트 (TEOS)의 가수분해, 또는 이의 변형이 관여되는Stober 합성법을 적용한다. 일부 실시예들에서, 실리카-기반 입자들은 공지된 졸-겔 화학을 이용하여, 예를들면, 실리카 전구체 또는 전구체들의 가수분해에 의해 합성된다. 실리카 전구체들은 실리카 전구체 및/또는 실리카 전구체 유도체 용액으로 제공된다. 가수분해는 알카리 (염기성) 또는 산성 조건들에서 수행된다. 예를들면, 가수분해는 하나 이상의 실리카 전구체 및/또는 유도체들을 포함한 용액에 수산화암모늄을 첨가하여 수행된다. 실리카 전구체들은 가수분해 조건들에서 실리카를 형성할 수 있는 화합물들이다. 예시적 실리카 전구체들은 제한적이지 않지만 유기실란들 예를들면, 테트라에톡시실란 (TEOS), 테트라메톡시실란 (TMOS) 및 기타 등을 포함한다. 일부 실시예들에서, 실리카 전구체는 관능기를 가진다. 이러한 실리카 전구체들의 예시로는, 제한적이지는 않지만, 이소시아나토프로필트리에톡시실란 (ICPTS), 아미노프로필트리메톡시실란 (APTS), 메르캅토프로필트리메톡시실란 (MPTS), 및 기타 등을 포함한다. 일부 실시예들에서, 마이크로에멀전 방법이 적용되어 본 발명에서 사용하기에 적합한 입자들을 합성한다. 예를들면, 수적들이 나노 크기의 액상체로 오일 및 계면활성제의 연속 매질 중에 분산되어 나노입자 합성을 위한 나노 반응기들로 작용하는유중수형 에멀전이 편리한 방법을 제공한다.
일부 실시예들에서, 입자들은 형광, 발광 및/또는 산란 신호를 발생하는 검출 가능 물질들을 가진다. 소정의 실시예들에서, 입자들은 양자점들 (QD)을 가진다. QD은 양자 구속 효과로 고유한 광학적 및 전자적 특성을 주기에 물리적으로 충분히 작은 밝은, 형광 나노결정들이다. 반도체 QD은 때로는 주기율표의 II-VI 또는 III-V 족 원자들로 이루어지지만, 다른 성분들도 가능하다. 크기 및 조성을 변경시켜, 방출 파장을 청색에서 근적외선으로 조정할 수 있다 (즉, 예측 가능하고 제어 가능한 방법으로 조정). QD은 일반적으로 광폭의 흡수 스펙트럼 및 좁은 방출 스펙트럼을 가진다. 따라서 단일 소스를 이용하여 구분 가능한 광학 특성들 (예를들면, 피크 방출 파장)을 가지는 상이한 QD들이 여기될 수 있다. 포괄적으로, QD들은 대부분의 종래 형광 염료들보다 더 밝고 광 안정성을 가진다. QD 및 합성 방법들은 본 분야에서 잘 알려져 있다 (참고, 예를들면, 미국특허들 6,322,901; 6,576,291; 및 6,815,064; 이들은 본원에 참조들로 포함된다). 다양한 상이한 재료들을 적용하여QD를 수용성으로 만들 수 있다 (참고, 예를들면, 미국특허들 6,423,551; 6,251,303; 6,319,426; 6,426,513; 6,444,143; 및 6,649,138; 이들 모두는 본원에 참조들로 포함된다). 예를들면, QD는 양친매성 중합체들을 이용하여 용해될 수 있다. 적용 가능한 예시적 중합체들은 옥실아민-변형 저분자량 폴리아크릴산, 폴리에틸렌-글리콜 (PEG)-유도화 인지질들, 폴리무수물, 블록 공중합체들, 기타 등을 포함한다.
일부 실시예들에서 본 발명에 따라 사용에 적합한 예시적 QD는, 넓은 다양한 흡수 및 방출 스펙트럼을 가지고 상업적으로 입수 가능한 것들, 예를들면, Quantum Dot Corp. (Hayward CA; now owned by Invitrogen) 또는 Evident Technologies (Troy, NY)에서 입수되는 것이다. 예를들면 약 525 nm, 약 535 nm, 약 545 nm, 약 565 nm, 약 585 nm, 약 605 nm, 약 655 nm, 약 705 nm, 및 약 800 nm의 피크 방출 파장들을 가지는 QD가 이용될 수 있다. 따라서 QD는 경우에 따라서는 초과될 수 있지만 가시 분광 영역에 걸쳐 사이한 색 영역들을 가질 수 있다.
소정의 실시예들에서, 광학적으로 검출 가능 입자들은 금속 입자들이거나 이를 포함한다. 사용되는 금속들은 제한적이지 않지만 금, 은, 철, 코발트, 아연, 카드뮴, 니켈, 가돌리늄, 크롬, 구리, 망간, 팔라듐, 주석, 및 이들의 합금을 포함한다. 임의의 이들 금속산화물들도 적용될 수 있다.
플라스몬 공명 입자들로 불리는 소정의 금속 입자들은 잘 알려진 플라스몬 공명을 보인다. 플라스몬 공명 입자 스펙트럼 특징부 (예를들면, 피크 파장)는 입자 재료 조성, 입자 형태 및 크기, 주변 매질의 굴절률 또는 유전특성, 및 주변 기타 입자들의 존재 여부를 포함한 많은 인자들에 따라 달라진다. 특정 입자 형태, 크기 및 조성 선택에 따라 광폭의 구별될 수 있는 광학적 검출 가능 특성들을 가지는 입자들을 제조할 수 있고 따라서 피크 산란 파장과 같은 상이한 특성들을 가지는 입자들을 이용하여 다수 검체들을 동시적으로 검출할 수 있다.
입자들의 자기적 특성들이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 일부 실시예들에서 입자들은 자성 입자들, 즉, 하나 이상의 금속들 또는 이들의 산화물 또는 수산화물을 함유하는자기적 반응성 입자들이거나 이를 포함한다. 자성 입자들은 하나 이상의 준강자성, 강자성, 상자성, 및/또는 초상자성 재료를 포함한다. 유용한 입자들은: 철, 코발트, 니켈, 니오브, 자성 산화철, 수산화물 예를들면 자적철석 (γ-Fe2O3), 자철석 (Fe3O4), 페로시하이트 (feroxyhyte) (FeO(OH)), 2- 또는 3-가 철 및 2- 또는 3-가 기타 금속 이온들 예를들면 Co(II), Mn(II), Cu(II), Ni(II), Cr(III), Gd(III), Dy(III), Sm(III)와 같은1열 전이금속 이온들의 복산화물 또는 수산화물, 상기 산화물 또는 수산화물의 혼합물, 및 상기 임의의 성분들의 혼합물에서 선택되는 하나 이상의 재료들에서 전적으로 또는 부분적으로 제조된다. 참고, 이들 소정 입자들의 적합한 합성방법을 위하여 예를들면, 미국특허 5,916,539 (참조로 본원에 포함됨). 자성 입자들에서 사용될 수 있는 추가적인 재료들은 이트륨, 유로퓸, 및 바나듐을 포함한다.
크기 및 형태
포괄적으로, 본 발명에 적합한 입자들은 임의의 크기를 가질 수 있다. 일부 실시예들에서, 적합한 입자들은 최대 치수 (예를들면 직경)가 1000 마이크로미터 (um)이다. 일부 실시예들에서, 적합한 입자들은 최대 치수가 500 um이하이다. 일부 실시예들에서, 적합한 입자들은 최대 치수가 약 250 um이하이다. 일부 실시예들에서, 적합한 입자들은 최대 치수 (예를들면 직경)가 약 200 um, 약 150 um, 약 100 um, 약 90 um, 약 80 um, 약 70 um, 약 60 um, 약 50 um, 약 40 um, 약 30 um, 약 20 um, 또는 약 10 um이하이다. 일부 실시예들에서, 적합한 입자들은 최대 치수가 1000 nm이하이다. 일부 실시예들에서, 적합한 입자들은 최대 치수가 500 nm이하이다. 일부 실시예들에서, 적합한 입자들은 최대 치수가 약 250 nm이하이다. 일부 실시예들에서, 최대 치수는 유체역학적 직경이다.
적합한 입자들은 다종의 형태를 가지며, 제한적이지는 않지만, 구형, 편구형, 원통형, 계란형, 타원형, 쉘형, 정육면체, 장방형, 원뿔형, 피라미드형, 막대형 (예를들면, 정사각형 또는 직사각형 단면을 가지는 원통 또는 장형 구조체), 4각다리형 (4개의 다리-유사 부속지를 가지는 입자들), 삼각형, 각기둥, 기타 등을 포함한다. 일부 실시예들에서, 입자들은 막대-형태이다. 일부 실시예들에서, 입자들은 봉-형태이다. 일부 실시예들에서, 입자들은 비드-형태이다. 일부 실시예들에서, 입자들은 기둥-형태이다. 일부 실시예들에서, 입자들은 리본 또는 사슬과 유사 형태이다. 일부 실시예들에서, 입자들은 임의의 기하 구조 또는 대칭 구조일 수 있다. 예를들면, 평면, 원형, 환형, 둥근형, 관형, 고리-형태, 사면체, 육각, 팔각 입자들, 기타 규칙적 기하구조의 입자들, 및/또는 불규칙 기하 입자들이 본 발명에서 사용될 수도 있다. 여러 크기들 및 형태를 가지는 추가적인 적합한 입자들은 미국특허번호 7,709,544 및 미국특허번호 7,947,487에 개시되고 본 발명에 사용되며, 이들은 본원에 참조로 포함된다.
입자들은 길이/폭, 길이/두께, 기타 등과 같은 이들 치수의 다양한 종횡비를 가질 수 있다. 입자들은, 일부 실시예들에서, 길이와 같은 최소한 하나의 치수가 폭과 같은 다른 치수보다 클 수 있다. 본 발명에 의하면, 1 이상의 최소한 하나의 종횡비를 가지는 입자들은 자기-정렬을 촉진시켜 (예를들면, 유세포분석기에서) 유체 유동 스캐닝에 특히 유용하다. 일부 실시예들에서, 입자들은 최소한 1.5:1, 최소한 2:1, 최소한 2.5:1, 최소한 3:1, 최소한 5:1, 최소한 10:1, 최소한 15:1, 또는 이상의 최소한 하나의 종횡비를 가진다.
각각의 입자가 유사한 특성을 가지도록 크기, 형태, 및/또는 조성에 있어서 상대적으로 균일한 입자들 집단을 이용하는 것이 바람직하다. 일부 실시예들에서, 직경들 (예를들면, 유체역학적 직경들)이 균일한 입자들 집단이 사용된다. 본원에서 사용되는, 직경들 (예를들면, 유체역학적 직경들)이 균일한 입자들 집단이란, 평균 직경 (예를들면, 유체역학적 직경)의5%, 10%, 또는 20% 내에 속하는 직경 (예를들면, 유체역학적 직경)을 가지는 입자들이 최소한 약 80%, 최소한 약 90%, 또는 최소한 약 95%인 입자들 집단을 의미한다. 일부 실시예들에서, 직경들 (예를들면, 유체역학적 직경들)이 균일한 입자들의 평균 직경 (예를들면, 유체역학적 직경)은 상기된 범위이다. 일부 실시예들에서, 직경들 (예를들면, 유체역학적 직경들)이 균일한 입자들이란, 0.2, 0.1, 0.05, 0.01, 또는 0.005 이하의 다분산지수를 가지는 입자들 집단을 의미한다. 예를들면, 본 발명에 따라 사용되는 입자들의 다분산지수는 약 0.005 내지 약 0.1이다. 임의의 이론에 구속되지 않고, (예를들면, 입자 크기에 있어서) 균일 입자들은 본원에서 더 높은 반복성 및 더 높은 정확성을 가진다. 일부 실시예들에서, 입자들 집단은 크기, 형태, 및/또는 조성에 있어서 불균일할 수 있다.
입자들은 중실 또는 중공일 수 있고 하나 이상의 층들 (예를들면, 나노셀들, 나노링들, 기타 등)을 포함할 수 있다. 입자들은 코어/셀 구조를 가질 수 있고, 여기에서 코어 (들) 및 셀 (들)은 상이한 재료들로 제조될 수 있다. 입자들은 구배 또는 균질 합금들을 포함할 수 있다. 입자들은 둘 이상의 재료들로 제조되는 복합 입자들일 수 있고, 이 중 하나, 하나 이상, 또는 모든 재료들은 자기적 특성들, 전기적 검출 가능 특성들, 및/또는 광학적으로 검출 가능 특성들을 가진다.
입자들은 피복층을 가질 수 있다. 예를들면, 입자들이 세포 독성 재료들을 함유하는 경우, 생체적합성 피복층을 사용하는 것이 유리하다. 적합한 피복 재료들은 include제한적이지 않지만 천연 단백질들 예를들면 소혈청알부민 (BSA), 생체적합성 친수성 중합체들 예를들면 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 또는 PEG 유도체, 인지질-(PEG), 실리카, 지질들, 중합체들, 탄수화물들 예를들면 덱스트란, 독창적 나노입자들과 연결될 수 있는 기타 나노입자들 기타 등을 포함한다. 침지, 교호흡착법 (layer-by-layer technique) 이용, 자기-조립, 공액화, 기타 등에 의한 다양한 방법으로 피복이 인가되거나 조립된다. 자기-조립이란, 더욱 고차의 구조체 (예를들면, 분자들) 성분들의 상호 간 자연적인 인력에 따라 더욱 고차 구조체의 자발적 조립 과정을 의미한다. 이것은 전형적으로, 크기, 형태, 조성, 또는 화학적 특성들에 기초한 분자들의 무작위 운동 및 결합 형성을 통하여 발생된다. 일부 실시예들에서, 피복된 입자들 역시 기능화 입자들 또는 표면 처리 입자들로 칭한다.
본 발명의 소정 실시예들에서, 입자는 다공성이고, 이는 입자 크기에 비해 일반적으로 작은 구멍들 또는 채널들을 입자가 가진다는 의미이다. 예를들면 입자는 다공성 실리카 입자, 예를들면, 다공성 실리카 나노입자이거나 다공성 실리카 피복을 가질 수 있다. 입자들은 약 1 nm 내지 약 200 nm 직경, 예를들면, 약 1 nm 내지 50 nm 직경의 세공들을 가진다. 입자 부피의 약 10% 내지 95%는 세공들 또는 채널들 내부의 공극들이다.
일부 실시예들에서, 입자들은 선택적으로 하나 이상의 분산 매질, 계면활성제, 서방제, 또는 기타 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 실시예들에서, 입자들은 선택적으로 하나 이상의 가소제 또는 첨가제를 포함한다.
다양한 실시예들에서, 본원에 기재되는 입자들은 본원에 기재되는 하나 이상의 탐침들을 가지는 최소한 하나의 영역을 가진다. 일부 실시예들에서, 입자들은 최소한 하나의 코드화 영역을 가진다. 일부 실시예들에서, 입자들은 최소한 하나의 코드화 영역 및 하나 이상의 탐침들을 가지는 최소한 하나의 영역을 가진다. 이러한 영역들은, 본 발명에 따라 적용되는 입자들을 포함한 기질들 (대상체)의 이산 영역들일 수 있다. 일부 실시예들에서, 각각의 영역은 선택적으로 기능화된다. 다양한 실시예들에서, 본원에 기재되는 입자들은 배향 지시자를 가질 수 있다 (예를들면, 코드화 영역을 먼저 이어 탐침 영역을 지시 또는 그 역).
기능화
본 분야에서 알려진 (예를들면, 미국특허번호 7,709,544 및 미국특허번호 7,947,487에 기재) 및 본원에서 제공되는 다양한 방법들이 본원에 기재되는 기질들 또는 대상체 (예를들면, 입자들)의 기능화에 유용하다.
다양한 기능성 물질들 또는 기들이 선택적 기능화 (예를들면, 코드화 어댑터들, 탐침들 또는 표적 핵산들 포획)을 제공하는 대상체 표면에 도입될 수 있다. 이러한 기능성 물질들은 표면에 화학적으로, 예를들면, 공유결합으로, 또는 물리적으로 부착되거나 내부에 포괄 (entrapped) 될 수 있다.
일부 실시예들에서, 대상체 (예를들면, 입자)의 최소한 일부는 단량체로 제조된다. 이러한 단량체는 단독 또는 공중합된 종들과 조합되어 형성된 대상체에서 선택적 기능화를 제공한다. 예를들면, 기능성 물질은 예를들면, 입자 합성의 식각-중합 단계에 의해 중합되는 단량체 또는 단량체 일부로 제공될 수 있다 (참고, 상세한 것은 미국특허번호 7,709,544 및 미국특허번호 7,947,487).
본 발명은 특정 코드화 방법에 제한되지 않는다. 코드화 표시는 가시적 검출 가능 특징부, 예를들면, 색, 겉보기 크기, 또는 가시성 (즉 단순히 입자가 특정 조건들에서 보이는지의 여부)일 수 있다.
다양한 실시예들에서, 도식적 표시들 및/또는 광학적 검출 가능 표시들은 본 발명에서 특히 유용하다. 본 발명의 다양한 실시예들에서, 미국특허번호 7,947,487에서 논의된 도식적 코드화 및 본원에서 개시되는 코드화 (예를들면, 범용 코드화)가 적용된다.
일부 실시예들에서, 코드화를 위한 도식적 표시는 하나 이상의 공간적 패턴 특징부이거나 이를 포함한다. 일부 실시예들에서, 공간적 패턴 특징부는 다수의 개방 및 폐쇄 코드화 요소들 (elements)을 포함한다. 코드화 요소들은 2-차원 격자에 배열된다. 또한 코드화 요소들은 비-균일 형태들 또는 크기들을 가진다. 소정의 실시예들에서, 공간적 패턴 특징부은 배향 지시자를 더욱 포함한다.
추가로 또는 달리, 광학적 표시가 본 발명에 따라 적용될 수 있다. 일부 실시예들에서, 코드화를 위한 광학적 표시는 흡수, 방출, 반사, 굴절, 간섭, 회절, 분산, 산란, 또는 이들의 임의의 조합의 특징부이거나 이를 포함한다.
일부 실시예들에서, 광학적 표시는 본 발명에 의한 기능성 기질들에 고유하다. 일부 실시예들에서, 광학적 표시는 기능화 기질들에 도입된다. 이러한 도입은 시료와의 접촉 전, 동시, 후에 가능하고, 이러한 접촉으로 신호가 발생되고, 및/또는 이러한 신호가 검출된다.
단지 예시적으로, 기능화 대상체 (예를들면, 입자)는 자체는 검출되지 않지만, 다른 물질과의 추가 작용 및/또는 다른 물질에 의한 변형으로 검출될 수 있는 기능성 물질을 가진다. 일부 실시예들에서, 이러한 기능성 물질은 기질 및 다른 개체들 (entities)과의 결합을 촉진하는 관능성 기 또는 잔기일 수 있다.
따라서, 추가로 또는 달리, 대상체 표면은 기능화되어 기질 및 기타 개체들 (예 를들면, 탐침들, 코드화 조제들, 기타 등)과의 결합을 촉진하는 화학적 기능성 물질들이 도입된다. 적합한 기능성 물질들은 공유결합으로 기질들 표면에 도입된다. 일부 실시예들에서, 기능화를 위하여 다양한 기질들과 함께 커플링제들이 이용된다. 예시적 커플링제들은 이관능성, 삼관능성, 고차 관능성 커플링제들을 포함하며, 이들은 MeSiCl3, 디옥틸프탈레이트, 폴리에틸렌-글리콜 (PEG), 기타 등과 같이 본 분야에서 잘 알려져 있다. 일부 실시예들에서, 기질들은, 폴리에틸렌-글리콜 (PEG) 간격자 아암 (arm)을 가진 헤테로이관능성 가교제로 표면에 스트렙타비딘을 공유결합하여 기능화된다. 다양한 기능화 방법들이 본 분야에서 공지되어 있고 본 발명을 구현하기 위하여 사용될 수 있다.
일부 실시예들에서, 대상체 표면은, 단일-가닥 폴리뉴클레오티드 주형들과 같은 개별 핵산 분자들, 코드화 어댑터들 또는 탐침들의 포획 및 고정화를 촉진하기 위한 포획 또는 앵커 올리고뉴클레오티드들을 도입하여 기능화된다. 일부 실시예들에서, 포획 또는 앵커 올리고뉴클레오티드들은 핵산 주형 분자들에 존재하는 범용 서열에 상보적인 서열들을 가진다. 예시적 포획 또는 앵커 올리고뉴클레오티드들은 다양한 개수의 뉴클레오티드들를 가진다. 예를들면, 적합한 올리고뉴클레오티드들은 1-50개의 뉴클레오티드들 (예를들면, 3-40, 3-30, 3-20, 30-15, 3-10, 6-40, 6-30, 6-20, 6-10, 8-30, 8-20, 8-15, 10-30, 10-20, 10-15 뉴클레오티드들)을 가진다. 일부 실시예들에서, 적합한 올리고뉴클레오티드들은 1, 2, 3, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 뉴클레오티드들을 가진다. 적합한 포획 또는 앵커 올리고뉴클레오티드들을 설계하고 합성하기 위한 다양한 방법들이 본 분야에 알려져 있고 이러한 방법들은 통상의 숙련가의 기술로 구현된다.
일부 실시예들에서, 포획 또는 앵커 올리고뉴클레오티드들은, 예를들면 Lund et al. Nucleic Adds Research, 16: 10861-10880 (1988); Albretsen et al, Anal. Biochem., 189: 40-50 (1990); Wolf et al, Nucleic Acids Research, 15: 2911-2926 (1987); 또는 Ghosh et al, Nucleic Acids Research, 15: 5353-5372 (1987)에 의해 개시된 바와 같이, 개별로 합성되고 기질 표면에 부착된다.
일부 실시예들에서, 결합은 공유적 성질이다. 또 다른 실시예들에서, 포획 또는 앵커 올리고뉴클레오티드들 및 핵산 주형(들)의 기질과의 공유결합은 가교제 예를들면 l-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염 (EDC), 숙신산무수물, 페닐디이소티오시안산염 또는 말레산무수물, 또는 헤테로-이관능성 가교제 예를들면 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (MBS), N-숙신이미딜[4-요오도아세틸]아미노벤조산염 (SIAB), 숙신이미딜 4-[N-말레이미도메틸]시클로헥산-1-카르복실산염 (SMCC), N-y-말레이미도부티릴옥시-숙신이미드 에스테르 (GMBS), 숙신이미딜-4-[p-말레이미도페닐]부티르산염 (SMPB) 및 해당 술포 (수용성) 화합물들에 의해 유도된다. .
일부 실시예들에서, 화학적 기들 또는 포획 또는 앵커 올리고뉴클레오티드들을 가지는 기능화 대상체는 코드화 및/또는 탐침 영역 기능화에 이용된다. 특정 실시예들에서, 본 발명을 위한 입자들을 코드화하기 위하여 범용 코드화가 이용된다.
범용 코드화
범용 코드화를 통하여 범용 구조로 기능화 대상체 (예를들면, 입자들)를 제조할 수 있고, 이는 더욱 코드화되어 구분된 동일성을 보이는 구분된 바코드를 가지는 대상체 하위집단들을 생성한다. 고도의 다중화 동정인 경우, 이러한 방식은, 각각의 표적에 대하여 구분된 대상체를 독립적으로 합성하는 것과 비교할 때 제조 시간 및 비용이 절감된다.
일부 실시예들에서, 기능화 대상체 (예를들면, 입자)는 하나 이상의 범용 코드화 영역들을 포함한다. 이러한 코드화 영역들은 불활성 또는 비기능화 영역들에 의해 이격된다. 전형적으로, 각각의 범용 코드화 영역은 관능기들을 통한 공유결합에 의해 또는 기능화 표면에 있는 포획 또는 앵커 올리고뉴클레오티드들과의 혼성화 및/또는 연결효소반응에 의해 코드화 어댑터들을 포획하기 위한 하나 이상의 주형들을 가진다. 일부 실시예들에서, 주형은 단일-가닥 폴리뉴클레오티드이거나 이를 포함한다. 예를들면, 이러한 단일-가닥 폴리뉴클레오티드는 원하는 코드화 어댑터와 특이적으로 결합하는 예정 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 주형은 스템-루프 구조 (즉, 헤어핀 구조)를 더욱 포함한다. 예정 뉴클레오티드 서열들은, 소정의 실시예들에서, 스템-루프 구조들에 인접하여 주형 및 코드화 어댑터와의 연결효소반응을 촉진시킨다. 이러한 실시예들에서, 주형과 결합하는 코드화 어댑터는 전형적으로 이차 구조를 형성하지 않는다. 일부 실시예들에서, 단일 가닥 주형은 헤어핀 구조를 형성하지 않고, 코드화 어댑터가 그러하다.
포괄적으로, 임의의 염기 조합들 또는 길이들을 가지는 예정 뉴클레오티드 서열이 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 일부 실시예들에서, 예정 뉴클레오티드 서열의 길이는 1, 2, 3 염기들 또는 그 이상이다. 일부 실시예들에서, 예정 뉴클레오티드 서열의 길이는 4 염기들, 5 염기들, 6 염기들, 7 염기들, 8 염기들, 9 염기들, 10 염기들, 11 염기들, 12 염기들, 13 염기들, 14 염기들, 15 염기들, 20 염기들, 25 염기들 또는 30 염기들 또는 그 이상이다. 일부 실시예들에서, 예정 뉴클레오티드 서열의 길이는 상기 임의의 두 값들 사이의 범위이다. 예정 뉴클레오티드 서열들의 길이는 하나의 기질에 대하여 동일하거나 서로 다를 수 있다. 전형적으로, 폴리뉴클레오티드 주형의 예정 서열은 코드화 어댑터의 자물쇠 (lock) 서열과 상보적이다.
일부 실시예들에서, 단일-가닥 폴리뉴클레오티드 주형들이 코드화 어댑터들을 포획하기 위하여 사용될 수 있다. 적합한 코드화 어댑터들은 DNA, RNA, 또는 임의 유형의 핵산 유사체이다. 다양한 실시예들에서, 코드화 어댑터는 단일-가닥 폴리뉴클레오티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시예들에서, 코드화 어댑터는 해당 주형의 예정 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 전형적으로, 코드화 어댑터는 30, 25, 20, 18, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 뉴클레오티드들을 가진다. 일부 실시예들에서, 코드화 어댑터는 약 10개의 염기들을 가지고 말단 4개의 염기들 ("자물쇠 서열")은 각각의 어댑터에 고유하고 해당 주형의 예정 서열과 상보적이며 나머지 6 염기들은 모든 어댑터들에 공통적이다.
일부 실시예들에서, 코드화 어댑터들이, 일단 주형과 연결되면, T4 DNA 연결효소 또는 기타 효소 또는 화학적 커플링으로 주형과 결합된다.
코드화 어댑터들은 표지되거나 되지 않을 수 있다. 일부 실시예들에서, 코드화 어댑터들은 검출 가능 물질 (예를들면, 광학적으로 검출 가능한 물질)로 표지된다. 다양한 검출 가능 물질들이 이용될 수 있고 형광체들, 발색단들, 방사성 동위원소, 양자점들, 나노입자들 및/또는 삽입 DNA/RNA 염료들을 포함한다. 검출 가능 물질들의 추가적 예시는 상기 검출 가능 물질들 절에서 기술된다.
다양한 실시예들에서, 본 발명에 따라 사용되는 코드화 어댑터들은 표지 및 비표지 코드화 어댑터들의 혼합이다. 일부 실시예들에서, 표지 및 비표지 코드화 어댑터들은 동일하거나 유사한 서열들을 가지고 동일 주형들과 결합한다. 일부 실시예들에서, 표지 코드화 어댑터들 대 비표지 코드화 어댑터 함량을 변경시켜, 영역에서 발생되는 신호 (예를들면 형광)량을 원하는 수준으로 조절할 수 있다. 일부 실시예들에서, 어떠한 어댑터들이 결합되고 각각의 헤어핀 탐침 영역에 연결되는지를 선택적으로 지시하기 위하여 자물쇠 서열이 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 독립적으로 지정 가능한 헤어핀 탐침 영역들의 여러 띠들 (stripes)을 코드화에 이용한다.
일부 실시예들에서, 최소한 하나의 표지 코드화 어댑터 신호는 대상체 (예를들면, 입자) 배향 결정에 사용된다. 일부 실시예들에서, 최소한 하나의 표지 코드화 어댑터 신호는 다른 표지 코드화 어댑터들의 검출 가능 신호들을 정규화시키기 위하여 사용된다.
본원에 기재되는 범용 코드화 방법을 구현할 때 다수의 색들 (또는 포괄적으로 방출 파장들)을 이용할 수 있다. 이것은, 고유 방출 스펙트럼을 가지는 형광체들과 같은 다양한 종들로 변형된 범용 어댑터들의 블렌드를 이용하여 달성된다. 연결효소 믹스 (mix)에 첨가되는 각각의 어댑터 함량에 따라, 가변 함량이 입자에 내장된 주형들에 연결되어, 각각의 코드화 영역에서 다수 "색들"의 수준이 조정될 수 있다. 일 실시예에서, 하기와 같이 입자들/기질들에 두 형광체들이 사용되어 2-색코드들을 발생시키지만, 더 많은 색들이 용이하게 적용될 수 있다.
일부 실시예들에서, 각각의 코드화 영역에서 형광은 여러 수준들로 예를들면, 10-20 수준들까지 (예를들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 수준들까지) 구분될 수 있다. 예를들면, 3개의 코드화 영역들이 사용되고 각각 10 수준들이 구분되는 경우, 1000 (10x10x10)개의 고유 코드들이 가능하다. 추가로 또는 달리, 다수 신호들 (예를들면, 상이한 형광색들)이 코드화에 이용될 수 있다. 일부 실시예들에서, 각각의 코드화 영역은 서로 구분되는 하나의 신호를 가진다. 일부 실시예들에서, 기질들 및 코드화 어댑터들은, 기질들의 최소한 하나의 코드화 영역이 다수 신호들을 발생시키는 일 유형 이상의 코드화 어댑터들과 부착되도록 설계된다. 일부 실시예들에서, 각각의 코드화 영역은 다수 신호들을 가지고, 코드화 어댑터들 함량을 조절하여, 원하는 신호비로 코드화를 달성한다.
탐침 영역 기능화
본 발명에 의해 사용되는 기질은 코드화 영역들과 더불어 하나 이상의 탐침을-가지는 (bearing) 영역들을 포함한다. 범용 코드화 및 탐침 기능화를 위한 두 가지 전형적인 방법들이 도 1 및 도 2에 도시된다. 일부 실시예들에서, 각각의 탐침 영역은, 예를들면, 연결효소 반응 (ligation)-기반 방법에 따라 관심 탐침들을 부착시키기 위한 앵커들을 가진다. 연결효소 반응은 3 종들 (앵커, 링커, 및 탐침) 또는 2 종들 (헤어핀 앵커 및 탐침)로 수행된다. 3-종들 연결효소반응, 2-종들 연결효소반응, 및 화학적 변형을 적용한 탐침-영역 기능화 방법이 도 3에 도시된다.
일부 실시예들에서, 탐침 영역 기능화는 카르복실화 기질들에 카르보디이미드 방법으로 아민화 탐침들을 부착시키는 펩티드 결합과 같은 화학적 변형을 포함한다. 기능화를 위한 예시적 방법들은 하기 실시예 절에 도시된다.
본 분야에서 알려진 다양한 방법들로 표적 핵산들에 특이적인 원하는 탐침들이 설계된다. 일부 실시예들에서, 탐침 영역 기능화를 위한 원하는 탐침들은 후-혼성 표지화를 위한 핵산 탐침들을 포함한다. 예를들면, 이러한 핵산 탐침은 표적 핵산과 결합하는 포획 서열 및 (예를들면, 전형적으로 검출 가능하게 표지된) 범용 어댑터와 결합하는 어댑터 서열을 포함하여, 표적 핵산 및 범용 어댑터의 핵산 탐침과의 결합은 후-혼성 표지화로 검출될 수 있다. 본원에 참조로 포함되는, "후-혼성화 표지화 및 범용 코드화에 의한 핵산 검출 및 정량화" 명칭의 동일한 출원된 국제출원 참고.
일부 실시예들에서, 탐침 영역들 및 코드화 영역들은 불활성 영역들에 의해 서로 이격된다. 일부 실시예들에서, 하나 이상의 탐침을-가지는 영역들 및 하나 이상의 코드화 영역들은 서로 중첩된다. 일부 실시예들에서, 코드화 및 탐침을-가지는 영역은 동일 영역일 수 있다.
일부 실시예들에서, 코드화 영역들 및 탐침을-가지는 영역들에 대하여 상이한 검출 가능 신호들 (예를들면, 상이한 형광색들)이 사용된다. 일부 실시예들에서, 특히, 코드화 영역들 및 탐침을-가지는 영역들이 서로 이격된 경우, 동일 유형의 검출 가능 신호들이 적용된다.
2-종들 기능화에 있어서, 선형 앵커들 및 헤어핀들을 가지는 어댑터들을 사용할 수 있다. 어댑터 및 앵커 종들은 연결효소반응 조건들에서 헤어핀 형성 또는 강하게 결합된 헤어핀들을 최소화하도록 설계된다. 코드화를 위한 검출 가능 물질들은 형광체들, 발색단들, 방사성 종들, 자성 종들, 양자점들, 전도성 물질들, 기타 등을 포함한다. 임의의 개수의 코드화 영역들이 사용되고, 이들이 띠 (strip)로 구성될 필요는 없다. 각각의 코드화 영역에 임의의 개수의 색들 또는 기타 구별 신호들이 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 비드들, 평탄 표면들, 겔 패드들, 기타 등을 포함한 기타 기질들에서도 적용될 수 있다. 기질들은 고체, 중합체, 에멀전, 기타 등일 수 있다.
연결효소 반응 기반의 방법과 더불어, 범용 코드화 및/또는 기능화를 위한 본 방법은 무엇보다도 연결효소들, 중합효소들을 포함한 기타 효소들로 구현될 수 있다. 예를들면, 하기 실험에서 T4 DNA 연결효소가 사용되지만, 올리고뉴클레오티드들을 서로 결합시키는 다른 효소들을 사용할 수 있다. 기타 효소들은 제한적이지 않지만 다른 DNA 연결효소들, RNA 연결효소들, 중합효소들, 기타 등을 포함한다. 약간 다른 방법으로, 또한 중합효소들이 사용되어, 코드화 또는 검출을 위한 기능화 또는 표지화 종들을 위하여 첨가 핵산 탐침들 수단으로 원하는 핵산 주형을 이용하여 올리고뉴클레오티드들을 신장시킬 수 있다 (도 4). 이러한 방법 또는 연결효소반응-기반 방법을 적용하여, 다중 탐침 "앵커들"이 사용될 때 다중 탐침 영역들이 단일 입자에 부가된다.
검출 가능 개체들 ( Entities )
임의의 광범위한 검출 가능 조제들이 본 발명을 구현하기 위하여 사용될 수 있다. 적합한 검출 가능 조제들은, 제한적이지 않지만: 다양한 리간드들, 방사성 핵종들; 형광 염료들; 화학발광제들 (예를들면, 아크리디늄 에스테르, 안정화 디옥세탄, 및 기타 등); 생물발광 조제들; 분광학적 분해 가능한 무기 형광 반도체 나노결정들 (즉, 양자점들); 미세입자들; 금속 나노입자들 (예를들면, 금, 은, 구리, 백금, 기타 등); 나노클러스터들; 상자성 금속 이온들; 효소들; 비색 표지들 (예를들면, 염료들, 금콜로이드, 및 기타 등); 비오틴; 디옥시제닌; 합텐들; 및 항혈청 또는 단일클론항체들이 이용될 수 있는 단백질들을 포함한다.
일부 실시예들에서, 검출 가능 물질은 비오틴이다. 비오틴은, 자체적으로 검출 가능한 다른 물질 (예를들면, 형광 물질)에 통상 조합되는 아비딘 (예를들면 스트렙타비딘)에 (직간접적으로) 결합될 수 있다.
기타 검출 가능 물질들의 일부 비-제한적 예시들이 하기된다.
형광 염료들
소정의 실시예들에서, 검출 가능 물질은 형광 염료이다. 다양한 화학 구조들 및 물성들을 가지는 수 많은 공지 형광 염료들이 본 발명의 구현에 사용될 수 있다. 형광 검출 가능 물질은 레이저에 의해 자극되어 방출 광들은 검출기에 의해 포획된다. 검출기는 전하결합소자 (CCD) 또는 공초점현미경이고, 강도를 기록한다.
적합한 형광 염료들은 제한적이지 않지만 플루오레세인 및 플루오레세인 계통 염료들 (예를들면, 플루오레세인 이소티오시아닌 또는 FITC, 나프토플루오레세인, 4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인, 6-카르복시플루오레세인 또는 FAM, 기타 등), 카르보시아닌, 메로시아닌, 스티릴 염료들, 옥소놀 염료들, 피코에리트린, 에리트로신, 에오신, 로다민 염료들 (예를들면, 카르복시테트라메틸-로다민 또는 TAMRA, 카르복시로다민 6G, 카르복시-X-로다민 (ROX), 리사민 로다민 B, 로다민 6G, 로다민 그린, 로다민 레드, 테트라메틸로다민 (TMR), 기타 등), 쿠마린 및 쿠마린 계통 염료들 (예를들면, 메톡시쿠마린, 디알킬아미노쿠마린, 히드록시쿠마린, 아미노메틸쿠마린 (AMCA), 기타 등), 오레곤 그린 염료들 (예를들면, 오레곤 그린 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514., 기타 등), 텍사스 레드, 텍사스 레드-X, 스펙트럼 레드TM, 스펙트럼 그린TM, 시아닌 염료들 (예를들면, CY-3TM, CY-5TM, CY-3.5TM, CY-5.5TM, 기타 등), ALEXA FLUORTM 염료들 (예를들면, ALEXA FLUORTM 350, ALEXA FLUORTM 488, ALEXA FLUORTM 532, ALEXA FLUORTM 546, ALEXA FLUORTM 568, ALEXA FLUORTM 594, ALEXA FLUORTM 633, ALEXA FLUORTM 660, ALEXA FLUORTM 680, 기타 등), BODIPYTM 염료들 (예를들면, BODIPYTM FL, BODIPYTM R6G, BODIPYTM TMR, BODIPYTM TR, BODIPYTM 530/550, BODIPYTM 558/568, BODIPYTM 564/570, BODIPYTM 576/589, BODIPYTM 581/591, BODIPYTM 630/650, BODIPYTM 650/665, 기타 등), IR염료들 (예를들면, IRD40, IRD 700, IRD 800, 기타 등), 및 기타 등을 포함한다. 추가적인 적합한 형광 염료들 예시 및 형광 염료들을 기타 화학적 개체들 예를들면 단백질들 및 펩티드들에 결합시키는 방법에 관하여, 예를들면, "The Handbook of Fluorescent Probes and Research Products", 9th Ed., Molecular Probes, Inc., Eugene, OR 참고. 형광 표지 조제들은 바람직한 특성들은 높은 몰 흡수계수, 높은 형광 양자수율, 및 광안정성을 포함한다. 일부 실시예들에서, 표지 형광체들은 자외선 영역 (즉, 400 nm 이하)에서보다는 가시 영역에서 (즉, 400 내지 750 nm) 흡수 및 방출 파장들을 보인다.
검출 가능 물질은 예를들면 형광 공명 에너지 전이 (FRET)에서 하나 이상의 화학적 개체를 포함한다. 공명 전이로 방출 강도가 전체적으로 개선된다. 예를들면, 본원에 참조로 포함되는 Ju et al. (1995) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 92: 4347 참고. 공명 에너지 전이를 달성하기 위하여, 제1 형광 분자 ("도너" 형광체)는 빛을 흡수하여 여기 전자들 공명을 통하여 제2 형광 분자 ("억셉터" 형광체)로 전이한다. 일 방법에서, 도너 및 억셉터 염료들 모두는 함께 연결되고 올리고 프라이머에 부착된다. 도너 및 억셉터 염료들을 핵산에 연결하는 방법은, 본원에 참조로 포함되는 예를들면, Lee et al. 의 미국특허번호 5,945,526 에 이미 기재되어 있다. 사용 가능한 염료들의 도너/억셉터 쌍들은, 예를들면, 플루오레세인/테트라메틸로다민, IAEDANS/ 플루오레세인, EDANS/DABCYL, 플루오레세인/플루오레세인, BODIPY FL/BODIPY FL, 및 플루오레세인/ QSY 7 염료를 포함한다. 참고, 예를들면, Lee et al. 의 미국특허번호 5,945,526. 많은 이들 염료들은 또한 예를들면, Molecular Probes Inc. (Eugene, Oreg.)로부터 상업적으로 입수될 수 있다. 적합한 도너 형광체들은 6-카르복시플루오레세인 (FAM), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인 (TET), 2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인 (VIC), 및 기타 등을 포함한다.
적합한 검출 가능 물질은 이중-가닥 DNA/RNA와 결합할 때 상당한 형광 증가를 보이는 삽입 DNA/RNA 염료일 수 있다. 예시적인 적합한 염료들은 제한적이지 않지만 SYBRTM 및 피코 그린 (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.), 브롬화 에티듐, 요오드화 프로피듐, 크로모마이신, 아크리딘 오렌지, Hoechst 33258, Toto-1, Yoyo-1, 및 DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐인돌 염산염)을 포함한다. 삽입 염료들 적용에 관한 추가적인 설명은 본원에 참조로 포함되는 Zhu et al., Anal . Chem . 66:1941-1948 (1994)에 제공된다.
효소들
소정의 실시예들에서, 검출 가능 물질은 효소 또는 이의 기질이다. 예시적인 적합한 효소들은 제한적이지 않지만 ELISA에서 사용되는 것들, 예를들면, 겨자무과산화효소, 베타-갈락토시다아제, 루시페라아제, 알칼리성 인산가수분해효소, 기타 등을 포함한다. 기타 예들로는 베타-글루쿠로니다아제, 베타-D-글루코시다아제, 우레아제, 글루코스 산화효소, 기타 등을 포함한다. 효소는 링커 그룹 예를들면 카르보디이미드, 디이소시안산염, 글루타르알데히드, 및 기타 등을 이용하여 분자와 결합될 수 있다.
방사성 동위원소들
소정의 실시예들에서, 검출 가능 물질은 방사성 동위원소이다. 예를들면, 분자는 동위원소로 -표지되거나 (즉, 자연에서 통상 발견되는 원자량 또는 질량수와 다른 원자량 또는 질량수를 가지는 원자로 치환된 하나 이상의 원자들을 포함) 동위원소가 분자에 부착될 수 있다. 분자들에 결합될 수 있는 동위원소들의 비-제한적 예시들로는 수소, 탄소, 불소, 인, 구리, 갈륨, 이트륨, 테크네튬, 인듐, 요오드, 레늄, 탈륨, 비스무트, 아스타틴, 사마륨, 및 루테튬의 동위원소들을 포함한다 (즉, 3H, 13C, 14C, 18F, 19F, 32P, 35S, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 90Y, 99mTc, 111In, 125I, 123I, 129I, 131I, 135I, 186Re, 187Re, 201Tl, 212Bi, 213Bi, 211At, 153Sm, 177Lu).
일부 실시예들에서, 신호 증폭은 검출 가능 물질로서 표지화 덴드리머를 사용하여 달성된다 (참고, 예를들면, 본원에 전체가 참조로 포함되는Physiol Genomics 3:93-99, 2000). 형광 표지된 덴드리머는 Genisphere (Montvale, N.J.)로부터 입수 가능하다. 이들은 본 분야에 알려진 방법들에 의해 올리고뉴클레오티드 프라이머들에 화학적으로 결합될 수 있다.
표적 검체
본원에 기재되는 방법들 및 조성물들은 임의의 표적 검체를 검출 및/또는 정량하기 위하여 사용된다. 예시적 검체는 제한적이지 않지만 단백질들, 펩티드들, 호르몬들, 합텐들, 항원들, 항체들, 수용체들, 효소들, 핵산들, 다당류들, 화학물질들, 중합체들, 병원체들, 독소들, 유기약물들, 무기약물들, 세포들, 조직들, 미생물들, 바이러스들, 세균, 곰팡이, 조류, 기생충들, 알레르겐들, 오염원들, 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시예들에서, 본 발명은 핵산들을 검출하기 위하여 적용된다. 본 발명의 방법을 사용하여 검출 및/또는 정량화되는 예시적 핵산들은 DNA, RNA, 또는 이들의 임의의 조합이다. 소정의 본 발명 실시예들에서, 표적 핵산은 유전자, 조절 서열, 유전체 DNA, cDNA, mRNA, rRNA, microRNA를 포함한 RNA, 또는 이들의 임의의 조합이거나 이를 포함할 수 있다.
표적 핵산은, 다양한 실시예들에서, 예를들면, 미생물 또는 감염원을 포함한 생물 유기체에서 발견되는 것, 또는 이들의 임의 자연 발생적, 유전공학적 또는 합성된 성분들이다.
본 발명에 의하면, 제공된 조성물들 및 방법들은 전사 (예를들면, 1차 전사물들, mRNA, 기타 등) 핵산들 정량화에 특히 유용하다. 일부 실시예들에서, 본원에 제공된 방법들은 miRNA를 검출하고 및/또는 정량화하기 위하여 사용된다. miRNA는 인간, 동물, 식물 및 바이러스의 유전체에서 발견된다. 본 발명에 의하면, 표적 핵산은, 일부 실시예들에서, 내인성 헤어핀-형태의 전사물들로부터 발생된 하나 이상의 miRNA이거나 이를 포함한다. 일부 실시예들에서, 표적 핵산은 예를들면, 동물에 있는 RNA 중합효소 II에 의해 긴 1차 전사물들 (pri-microRNA)로서 전사된 하나 이상의 miRNA이거나 이를 포함한다. miRNA 데이터베이스 (http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/ftp.shtml)에 현재 총 475개의 인간 miRNA 유전자들이 나열되어 있고 이 숫자는 약 1000개까지 늘어날 것으로 예상되며, 이것은 단백질-코드화 유전자들의 거의 3%에 달하는 것이다. 많은 miRNA들은 유전자 발현 조절에 중요하다고 여겨진다. 전형적으로, microRNA들은 전구체 형태로 생성되고 전형적으로 전구체 스템-루프 구조의 3' 암 (arm)을 절단하여 성숙체 형태로 진행된다. 따라서, 전구체 microRNA 및 성숙체 microRNA는 동일한 5' 말단을 가지지만 3' 말단은 구별된다. 3' 말단 서열에 상보적인 포획 서열을 설계하여 전구체 종들을 검출함이 없이 성숙 microRNA 종들을 검출하기 위하여 선택적 말단-표지화가 적용될 수 있다. 선택적 말단-표지화의 예시는 실시예 절에 기재된다.
임의의 다양한 생물학적 시료들이 본원에 기재된 방법들을 적용하기에 적합하다. 생물학적 시료들 유형은 제한적이지 않지만 세포들, 조직, 전혈, 혈장, 혈청, 요, 대변, 타액, 제대혈, 융모막 융모 시료들 양수, 및 자궁경부 세척액을 포함한다. 임의의 유형의 조직 생검체들도 사용될 수 있다. 임의의 상기 생물학적 시료들의 세포배양액들 예를들면, 융모막 융모 배양액, 양수 및/또는 양수세포 배양액, 혈액 세포 배양액 (예를들면, 림프구 배양액), 기타 등 도 본 발명의 방법들에 의해 사용 가능하다. 일부 실시예들에서, 생물학적 시료들은 질환 세포들 예를들면 암 또는 종양 세포들을 포함한다.
따라서, 본 발명에서 적합한 전형적인 생물학적 시료는 비균질 핵산들, 단백질들 또는 기타 생체분자들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 생물학적 시료는 상이한 유형의 세포들 (예를들면, 정상 세포들 및 질환 세포들 예를들면 종양 세포들)로부터 얻은 핵산들의 혼합물을 포함한다. 일부 실시예들에서, 생물학적 시료 (예를들면, 혈액, 혈청 또는 혈장)는 모체 핵산들 및 태아 핵산들의 혼합물을 포함한다.
일부 실시예들에서, 본 발명은 생물학적 시료에서 낮은 수도 (low abundance)로 또는 희귀 현상들로 존재하는 표적 검체를 검출하기 위하여 사용된다. 일부 실시예들에서, 본 발명의 방법에 의해 검출될 수 있는 표적 검체는 0.1 amol - 10,000 amol 범위의 농도로 존재한다. 일부 실시예들에서, 표적 검체 농도는 10,000 amol 이하, 5,000 amol 이하, 1,000 amol 이하, 800 amol 이하, 600 amol 이하, 400 amol 이하, 200 amol 이하, 100 amol 이하, 50 amol 이하, 40 amol 이하, 30 amol 이하, 20 amol 이하, 10 amol 이하, 또는 1 amol 이하로 존재할 수 있다. 일부 실시예들에서, 본 발명의 방법에 의해 검출되는 표적 검체 함량은 생물학적 시료에서 총 핵산들의 1% 이하 (예를들면, 0.5%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 0.0001% 이하)이다. 일부 실시예들에서, 본 발명의 방법에 의해 검출되는 표적 검체 함량은 생물학적 시료에서 총 핵산들의 1% 이하 (예를들면, 0.5%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 0.0001% 이하)이다. 일부 실시예들에서, 본 발명의 방법에 의해 검출되는 표적 검체 함량은 생물학적 시료에서 총 핵산들의 백만분의 1 이하이다. 일부 실시예들에서, 본 발명의 방법에 의해 검출되는 표적 검체 함량은 생물학적 시료에서 총 핵산들의 천만분의 1 이하이다. 표적 검체는 조질 시료에서 검출되거나 분리 또는 정제 시료로서 검출될 수 있다.
스캐닝 및 정량화
본원에 기재되는 대상체 (예를들면, 입자들)는 다양한 방법들을 이용하여 특성화될 수 있다. 특히, 유체 유동 스캐닝 및/또는 정적 영상화를 이용한 다양한 방법들로 표적 검체와 결합된 대상체 (예를들면, 입자들)을 검출 및/또는 표적 검체 함량을 결정할 수 있다. 전형적으로, 기질들에 부착된 표적 검체는 신호들을 검출하여 결정된다. 본 발명에 의하면, 표적 검체를 "표시하는" 신호들은 표적 검체가 부착된 대상체 (예를들면, 입자들)의 식별과 일반적으로 연관된다. 예를들면, 탐침들 또는 표적들을 가지는 대상체의 하나 이상의 코드화 영역들을 표시하는 신호들과 연관된 하나 이상의 검출 가능하게 표지된 탐침들 또는 표적들로부터 신호들이 발생된다.
일부 실시예들에서, 표적들을 표시하는 신호들은 대상체 (예를들면, 입자들)의 식별을 표시하는 신호들과 일반적으로 구분된다. 일부 실시예들에서, 표적에 특이적인 탐침들 또는 범용 어댑터들 및 코드화 영역들을 위한 코드화 어댑터들은 구별되는 검출 가능 신호들로 표지된다. 예를들면, 표적에 특이적인 탐침들 또는 범용 어댑터들은 코드화 영역들이 표지된 형광물질의 것과는 상이한 방출 스펙트럼 (즉, 색 및 파장)을 가지는 형광물질로 표지된다. 따라서, 일부 실시예들에서, 본 발명의 대상체 (예를들면, 입자들)는 하나 이상의 여기원들 (excitation sources) 및 검출기들 (참고 도 5)이 관여되는 다중-스캐닝 시스템을 이용하여 스캐닝될 수 있다.
일부 실시예들에서, 단색 스캐닝이 적용된다. 개별 "코드" 및 "탐침" 영역들을 표시하는 신호들이 각각 대상체 (예를들면, 입자들)를 식별하고 표적들을 포획하기 위하여 사용된다. 예로써 하기 상세하게 기술되는 입자들을 이용하여, 입자의 코드화 영역들 (예를들면, 담지 (bearing) 구멍들, 띠들, 코드화 어댑터들 및/또는 이들의 조합)에서 나오는 신호 패턴들은 특정 입자에서 탐침(들)을 식별하기 위한 도식적 다중 바코드의 기반을 구성한다. 일부 실시예들에서, 구들의 광학적 코드화를 이용하는 종래 비드-기반 시스템들과는 달리, 입자들이 다수의 구분된 영역들을 가지는 구조로 인하여 단색 스캐닝이 가능하고, 단지 하나의 여기원 및 하나의 검출기가 요구된다. 일부 실시예들에서, 입자들은 다양한 형광 강도들 (하나 이상의 파장들), 광학 특성들, 치수들, 등을 가지는 도식적 특징부 (예를들면, 띠들, 구멍들, 또는 기타 등)를 가질 수 있다 (참고 도 6).
더욱 상세하게 하기되는 스캐닝 및 정량화 과정을 보이기 위하여 예로써 입자들이 사용된다. 그러나, 본원에 기재되는 방법들은 다양한 기타 유형의 기질들 또는 대상체에 적용될 수 있다.
입자들 조사
일부 실시예들에서, 본 발명은 다중 기능성 대상체 (예를들면, 입자들)를 특성화하는 방법을 제공하며 (a) 각각이 일련의 현상들 (events)로서 검출될 수 있는 하나 이상의 조사 영역들을 가지는 다수의 대상체(예를들면, 입자들)를 조사하는 단계; (b) 각각의 현상이 예정 촉발 역치 이상에서 검출될 수 있는 각각의 조사 영역에 해당하는 다수 현상들을 기록하는 단계; (c) 다수 현상들을 분류하는 단계, 및 (d) 분류된 현상들에 따라 다수의 대상체를 특성화하는 단계를 포함하는 하나 이상의 단계들로 구성된다.
일부 실시예들에서, 입자들은 정적 또는 유체 유동 설정에서 영상분석을 이용하여 조사된다. 높은 처리율 적용을 위하여, 바람직하게는 현존 상업적 장비를 이용하여 입자들을 신속하게 스캐닝하는 것이 바람직하다. 예를들면, 형광 표지화 비드들 및 입자들의 유체 유동 분석에 있어 입자 정렬, 정밀한 조도 (illumination), 및 정확한 형광 방출 정량화를 제공하는 유세포분석기는 특히 유용하다. 일부 실시예들에서, 유세포분석기와 같이 상업적으로 입수되거나 주문 설계되는 유체 유동 기구를 이용하여 스캐닝될 수 있는 코드화 다중 기능성 입자들이 설계된다.
일부 실시예들에서, 유체 유동 스캐닝에 적합한 입자들은 조사 구역을 유동 통과하는 일련의 세포들 (예를들면, 2, 3, 4, 5, 또는 이상)을 모방하여 제조된다. 특정 실시예들에서, 적합한 입자들의 바깥 영역들 (예를들면, 말단 양 영역들)은 코드화 영역들이고, 하나 이상의 안쪽 영역들은 표적이 포획되는 탐침들을 가진다. 코드화 영역 및 탐침 영역 각각이 개별적으로 검사되고 (예를들면, 순차적으로 또는 비-동시 다발적으로) 각각의 영역을 조사 영역이라고도 칭한다. 특정 실시예들에서, 다수의 조사 영역들을 가지는 막대-형태 입자들은 표준 세포분석 신호 처리를 이용하여 "현상들"이 기록된다. 이러한 현상들의 순서 및 시간-근접성을 분석하여, 어떤 것이 동일 입자에 속하는 것인지를 추론할 수 있다. 이후 이러한 현상들을 분석하여 입자를 복호하고 탐침 영역에 결합된 표적을 정량한다. 형광, 광 산란, 발광, 기타 등을 이용하여 신호 정량화가 달성된다
전형적으로, 표준 세포분석 소프트웨어를 이용하여 미처리 신호가 세포분석기 검출기 (또는 신호 처리 보드)에서 획득된다. 이후 주문 소프트웨어를 이용하여 신호를 처리하여 표준 유세포분석 (FCS) 파일들을 가져와 현상들을 입자들 및 해당 탐침 및 코드화 영역들로 재구성한다.
다양한 유-세포분석기 및 기타 유체 유동 판독 기구들이 본 발명에 의해 사용될 수 있고, 다양한 상업적 입수 가능한 유-세포분석기 및 주문 설계 기구들이 포함된다. 예시적으로 적합한 유세포분석기들은 제한적이지 않지만 세포분석기들 중에서 Millipore Guava 8HT, Guava 5HT, Accuri C6, BD FACSCalibur를 포함한다.
다중-현상 입자들
비-제한적 예시로서, 입자가 세포분석기의 유동셀을 주행할 때, 조명점으로 입자는 여기되고 검출기들이 사용되어 조명의 정방향 산란 및 측방향 산란, 및 다양한 방출광 파장들을 포함한 여러 파라미터를 감시한다. 촉발 채널에서 이들 파라미터의 하나에 대한 역치를 설정하여, 사용자는 세포분석기 소프트웨어가 현상들로서 기록하는 경우들을 정의할 수 있다. 촉발 채널에 있는 검출기 신호가 사용자가 설정한 역치 수준을 초과하면, 세포분석 하드웨어 및 소프트웨어는 현상을 기록하기 시작하고 -촉발신호가 역치 이상을 유지할 때 각각의 검출기로부터 최대 신호 크기 및 적분 면적 측정한다. 전형적으로 현상이 일어날 때의 현상 폭 및 시간-스탬프와 함께 각각의 채널에서 관찰되는 높이 및 면적으로 현상들이 보고된다.
전형적으로, 단일 입자 또는 비드는 단일 현상으로 기록된다. 그러나, 다양한 실시예들에서, 본 발명에 의한 다수의 기능성 영역들을 가지는 입자들 (예를들면, 막대-형태 입자들)은 일련의 구분된 현상들로 판독된다. 이것은, 불활성 영역들 (예를들면: 비-형광)에 의해 이격되는 기능성 영역들 (예를들면: 형광)을 가지는 입자들을 이용하여 달성된다. 역치-촉발 개체들을 입자들의 기능성 영역들에 포함시키지만 불활성 영역들에는 포함시키지 않으면, 전형적인 세포분석 신호 처리 소프트웨어는 기능성 영역들을 이산 현상들로서 기록한다. 이것은, 산란 또는 형광을 유발하는 개체들을 이용하여 달성될 수 있다. 이러한 개체들은 미세입자들, 나노입자들, 반사성 단량체들, 금속성 재료들, 형광-표지 단량체들, 양자점들, 형광 염료들, 탄소 나노튜브들, 액정들, 및 본원에 기재되는 다양한 검출 가능 개체들을 포함한다.
실시예 절에서 표준 세포분석 (실시예 6)으로부터 이러한 방식의 동작 및 구분을 보이는 예가 제공된다. 특정 유세포분석을 이용한 입자 스캐닝 실시예가 실시예 7에 제공된다.
데이터 분석
데이터 분석을 위하여, 현상들을 입자들로 분류하고, 입자들을 배향 (orient), 필요하다면 표준에 대하여 형광을 정규화하고, 각각의 코드 및 탐침 영역에서 형광, 산란, 또는 현상 폭을 정량하는 알고리즘을 만든다. 이후 각각의 입자에 대한 해당 코드에 신뢰수준이 주어지고, 예정된 신뢰수준으로 호출되지 않는 것들은 분석에서 제외된다. 이후 탐침 영역에서의 형광은 분석 시료에 존재하는 표적 함량 결정에 사용된다. 이러한 시스템은 스캐닝 과정 또는 이후 분석을 수행한 소프트웨어를 이용하여 쉽게 자동화될 수 있다.
현상들 분류
일부 실시예들에서, 현상들은 시공간적 근접성에 기반하여 분류된다. 일부 실시예들에서, 현상들은 각각의 현상에 대하여 측정된 특성들 패턴들에 기반하여 분류된다.
전형적으로, 세포분석기에 의해 기록된 각각의 현상에는, 각각의 세포분석에서 유동속도에 기반하여 예를들면, 1ms의 예정 분해능으로 타임 스탬프가 주어진다. 예를들면, 입자들은 전형적으로 유동셀을 ~1m/s 속도로 이동하므로, 길이가 200um인 입자들을 조사하는 시간은 ~0.2ms 지속된다. 따라서, 단일 다중 기능성 입자에서 기록된 두 현상들이 동일한 타임 스탬프에 나타날 것이 예상된다.
일부 실시예들에서, 데이터 획득 과정에서 보정 비드들이 상당히 무작위로 스캐닝된다. 전형적으로, 보정 비드들에 대하여 최소한 하나의 현상이 기록된다. 그러나 다중 기능성 입자들은, 전형적으로 타임 스탬프 당 둘 또는 넷 현상들의 집단을 보이며, 이것은 각각의 입자가 두 현상들로 판독된다는 이론에 잘 맞는다. 또한, 현상 대 시간 도표로부터 각각의 타임 스탬프 과정에서, 높은 및 낮은 수준의 형광 판독이 있다는 것이 명백하게 보여진다. 입자들은 FL-2 채널에서 하나의 밝은 및 하나의 희미한 형광 영역을 가지도록 설계되었고, 이것 역시 각각의 입자가 2개의 이산 현상들로 판독된다는 이론을 지지하는 것이다. 이러한 방식은 또한 입자 당 셋 이상의 T현상들에 적용될 수 있다. 각각의 영역/현상은 형광 수준, 정방향 또는 측방향 산란, 및 폭에 있어서 가변적이다.
일부 실시예들에서, 다수의 형광체들의 구분된 수준들은 다중 기능성 입자들의 각각의 코드화 영역에 포함되어 코드화 수준을 더욱 확장하고 코드화 유연성을 증가시킨다.
입자 스캐닝 및 정량화에 대한 다양한 실시예들은 실시예 절에서 제공된다.
기타 실시예들
상기 실시예들에 대한 여러 변형들 및 대안들이 존재한다. 막대-형태 입자들이 상기 실시예들로 사용되지만, 많은 기타 형태들을 가지는 대상체 또는 입자들 역시 스캐닝하기 위하여 본 발명이 적용될 수 있다. 예를들면, 입자들은 이방성일 수 있고, 일측에 머리를 가질 수 있고, 둥근 형태들을 포함하고, 구멍들을 가지는 등의 경우가 있다. 일부 실시예들에서, 긴 핵산들, DNA 사슬접기, 자기-조립화 구조들, 생물학적 유기체들, 끈-유사 대상체, 리본-유사 대상체, 기타 등을 포함한 다양한 다중 기능성 개체들을 스캐닝하기 위하여 본 발명이 적용될 수 있다. 또한, 각각의 현상에 대하여 세포분석기에 의하여 기록된 높이, 면적, 폭, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한 임의의 정보 조합이 코드화 또는 표적 정량화에 사용될 수 있다.
기타 상업적으로 입수 가능한 장치들이 다중 기능성 영역들을 가지는 입자들을 판독할 수 있고 본 발명을 구현하기 위하여 사용된다. 하나의 예는 쿨터계수기와 같은 유체 채널의 전기전도도, 또는 전기저항 변화를 측정할 수 있는 장치이다. 이러한 시스템들의 검출기에 의한 입자에 의해 발생된 전류 또는 전압은 입자 크기, 형태, 화학 조성, 또는 표면 특성들을 특성화하기 위하여 사용될 수 있다. 추가로, 유동 입자들에 대한 높은 분해능의 가시화를 제공하는 레이저-스캐닝 세포분석기 (LSC)가 사용되어 여러 기능화 영역들을 가지는 입자들의 식별 영역들 및 탐침 영역들을 식별할 수 있다. 이러한 LSC 시스템들은 예를들면 CompuCyte 회사에서 상업적으로 입수된다. 또한 세포들/입자들이 통과할 때 영상화하는 상업적인 세포분석기들 (예를들면 Amnis ImageStream)이 존재한다. 이들은 적합한 영상-처리 소프트웨어와 함께 사용되어 입자들을 복호하고 표적을 정량한다. 또한, 비-형광 정량화 수단 예를들면 표면-플라스몬 공명 또는 방사선을 사용하는 것도 가능하다.
적용
본원에 기재된 방법들은 몇몇만을 언급하면 항체 검출, 치환 동정, 핵산 측정, 효소 측정을 포함한 임의의 검출에 적용될 수 있다. 본 발명에 의하면, 검출은 정성 또는 정량 검출 및/또는 측정을 포함한다.
일부 실시예들에서, 본 발며에 의한 방법들은 항체들 검출에 적용될 수 있다. 감염 검출에서 자가항체 결정에 이르기까지 광범위한 목적으로 의학적 및 임상적 분석에 항체 분석이 널리 사용된다.
일부 실시예들에서, 본 발명에 의한 방법들은 특이적 리간드-리게이트 또는 항원-항체 상호작용으로 간섭에 기반하여 임상검사실에서 많은 물질들을 동정하기 위하여 사용될 수 있다. 예를들면, 일부 동정에 있어서, 리간드-리게이트 쌍의 하나의 멤버는 형광체로 표지되고 다른 멤버는 입자들에 고정된다. 리간드 또는 리게이트일 수 있는 용해성, 비표지화 물질 (즉, 검체)이, 반응 혼합물에 첨가되어 고정화 성분과의 표지화 성분 상호반응을 경쟁적으로 저해한다.
일부 실시예들에서, 본 발명에 의한 방법들은 핵산 측정에 적용될 수 있다. 본원에 따라 적용되는 다중화 DNA 분석은 임의의 PCR 생성물 또는 DNA/RNA 서열들, 예를들면, 특정 다형성들 또는 변이들에 대한 관심 DNA를 검출하기 위하여 적용될 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 다중화 기술로, 질병 감수성과 연관된 조직적합성 대립유전자, 유전병, 자가면역질환과 연관된 변이들, 또는 종양형성 또는 이의 위험성과 연관된 암유전자들의 변이들 존재에 대하여 스캐닝 될 수 있다. 일부 실시예들에서, 본 발명에 의한 방법들은 제한적이지는 않지만, microRNA, mRNA을 포함한 다양한 RNA 종들을 검출, 측정 및/또는 정량하기 위하여 적용될 수 있다.
일부 실시예들에서, 본 발명에 의한 방법들은 효소들, 효소 저해제들 및 기타 검체 측정을 위한 임의의 방식에서 사용될 수 있다. 본 발명에 의해 검출되고 측정되는 효소들은 제한적이지 않지만 프로테아제, 글리코시다아제, 뉴클레오티다아제, 및 산화환원효소를 포함한다.
포괄적으로, 본 발명에 의한 방법들을 사용하여 분석되는 시료들은 제한적이지 않지만 혈장, 혈청, 눈물, 점액, 타액, 요, 흉수, 척수액 및 위액, 땀, 정액, 질 분비물, 궤양 및 기타 표피 발진, 수포, 및 종기로부터의 액, 및 정상, 악성, 및 의심 조직들 생검체를 포함한 조직들의 추출액을 포함한다. 본 발명에 따라 적용되는 예시적 적용은 본원에 참조로 전체가 포함되는 미국특허번호: 5981180에 기재된다.
실시예들
실시예 1: 미세입자 합성
본 실시예는 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다양한 미세입자들이 합성될 수 있다는 것을 보인다. 예시적 방법들 이 상세히 하기된다.
예시적 입자 분량들을 정지-유동 식각법으로 높이 38-um인 폴리디메틸실록산 (PDMS) 미세유체 채널들에서 합성하었다. 12-다중 연구를 위하여, 코드 및 불활성 완충 영역들을 35% (v/v) 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트 (MW = 700 g/mol) (PEG-DA 700), 20% 폴리(에틸렌 글리콜) (MW = 200 g/mol) (PEG 200), 40% 3x Tris-EDTA (TE) 완충액 (pH 8.0), 및 5% Darocur 1173 광개시제의 단량체 용액으로부터 합성하였다. 최종 농도들이 각각 9.4% 및 0.6%이 되도록 1x TE 및 로다민-아크릴레이트 (1 mg/ml)를 코드 단량체에 첨가하였다. 최종 농도들이 각각 8.0% 및 2.0%이 도도록 1x TE 및 청색 식품착색제를 완충 단량체에 첨가하였다. 식품착색제는 스트림 폭들이 가시화되도록 사용되었다. 원하는 최종 농도의 탐침이 되도록 1x TE 에 현탁된 아크리디트-변형 DNA 탐침 서열들 (Integrated DNA Technologies, IDT)이 첨가된, 18% (v/v) PEG-DA 700, 36% PEG 200, 및 4.5% Darocur; 나머지 성분은 3X TE인 단량체 용액으로부터 탐침 영역들을 중합하였다.
본 예시적 연구에서 표적 결합률을 대략 일치 (rate-match)시키기 위하여, 탐침 서열들을 상이한 농도들로 입자들에 포함시켰다 (표 1). 표적 소모 특성 시간은 탐침 농도의 역제곱근에 따르므로, 주어진 표적에 대한 결합률을 2배로 하기 위하여는 고정 크기의 탐침 영역에 포함한 탐침 함량을 4배로 증가시킬 필요가 있다. 본 예시적 연구에서 모든 결합율은 let-7a 결합의 경우와 일치하도록 보정하였다. 임의의 특정 이론에 구애되지 않고, 더 높은 감도 및 단기 분석은 탐침 농도를 최대로 로딩하여 달성될 수 있다고 고려한다. 본 특정 경우에, 목표는 모든 표적들에 대하여 넓은 동적 범위 및 ~1 amol 감도로 12-다중 분석법을 개발하는 것이었다.
표 1: 12-다중 연구를 위하여 합성된 분량들의 예시적 입자 코드들 및 탐침 정보. 탐침에 대한 프리폴리머 스트림에서 PEG-DA 700, PEG 200, 및 Darocur 1173 광개시제의 최종 조성 (v/v)은 각각 18, 36, 및 4.5%로 고정하였다. 본 예시적 연구에서 배양 조건들을 위하여 IDT's OligoCalc 어플리케이션에 의해 DNA-RNA 이중가닥에 대하여 계산된 헤어핀 융점들은 낮은 순서대로 나열된다. 각각의 miRNA에 대하여, 500 amol 표적 및 연결 표지로 30- 내지 60-분 배양된 액들의 평균 표적 신호들로부터 상대 결합률을 계산하였다. 시스템이 평형에 이르지 않았다는 것을 보증하기 위하여 단기 배양들을 선택하였다. 언급된 탐침 농도들은 프리폴리머 스트림 조성을 의미한다. 프리폴리머 스트림에서 약 11%의 탐침은 입자들에 공유 결합되었다 (Pregibon, D.C. et al ., Anal . Chem . 81, 4873-4881 (2009)).
Figure 112013001411229-pct00001
Figure 112013001411229-pct00002
전달 챔버들로서 변형된 피펫 팁들 (Biosciences)을 이용하고 가압 4.5 psi을 적용하여 코드, 완충, 및 탐침 프리폴리머 용액을4-구 미세유체 합성 채널들에 로딩하였다. 주문형 Python 자동화 스트립트로 인터페이스되는 셔터 시스템 (Uniblitz, Vincent Associates)에 의해 제어되는 100-ms UV 노출 (75% 설정된 Lumen 200, Prior Scientific)로 시간 당 16,000까지의 속도로수화겔 미세입자들 (250 x 70 x 35 um)이 동시에 합성, 코드화, 및 기능화되었다. 코드 및 탐침 영역들이 각각 140 및 40 um 길이가 되도록 스트림 폭들을 조정하였다. 나머지 길이인 70 um은 완충 영역들에 해당되었다. 배양, 표지화, 및 스캐닝 효율에 영향을 주지 않고 동일한 입자 치수들은 2개의 탐침 띠들을 쉽게 수용할 수 있다는 것을 보였다.
중합 후, 입자들을 합성 채널에서 꺼내 950 ul TET (1x TE with 0.05% (v/v) 트윈-20 계면활성제 (Sigma Aldrich))가 담긴1.7-ml Eppendorf 튜브에 회수하였다. 입자 응집을 방지하기 위하여 트윈을 첨가하였다. 입자들을 200 ? PEG 200에 5 분 동안 현탁시킨 후 700 ? TET로 세척하였다. 이러한 세척 순서는 미반응 PEG-DA, 탐침, 및 로다민의 입자들을 세척할 때도 적용되었다. 세척을 2차례 더 반복하고 고밀도 입자들을 원심분리한 상등액을 수작업으로 흡입하였다. 입자들을 냉장고 (4 ℃)에서 최종 농도들 ~12.5 입자들/ul로 TET 중에 보관하였다.
실시예 2. miRNA 배양 실험들
본 실시예는 본 발명에서 사용하기에 적합한 전형적인 시료 배양 단계들을 보인다.
모든 예시적 배양에서, 사용에 앞서 예를들면, 실시예 1의 방법들에 의해 합성된 입자들을 실온으로 옮기고, 최종 염 농도 350 mM NaCl 및 12 유형들의 모든 입자가 존재하는 0.65-ml Eppendorf 튜브에서 총 부피 50 ul로 각각 배양하였다 (~360 입자들/배양 튜브). 보정 및 특이성 연구를 위하여, 혼성화 완충액 (동정-특이적 NaCl 몰의 TET)를 먼저 Eppendorf 튜브에, 이어 1x TE 및 500 mM NaCl 혼합물로 희석된 모든 관련 표적 서열들 (IDT)을 첨가하였다. 계면활성제-유발 젖음성 (wettability) 변경으로 인한 피펫 단계들에서의 부정확성을 방지하기 위하여 트윈을 희석 완충액에서 제외하였다. 동정 유형에 따라, 1 ul TET 또는 1 ul E. coli 총 RNA (200 ng/ul)를 도입하였다. 조직 프로필 연구를 위하여, (조직 유형 당 각각; 100 ng/ul에 보관된) 2.5 또는 1.0 ul의 미리 추출되어 냉동된 총 RNA가 담긴 튜브에 직접 혼성화 완충액을 첨가하였다. 원발성 시료 쌍들은 원발성 종양 및 인접 정상 조직에서 분리된 총 RNA로 구성되었다. TRIzol 정제로 모든 조직들에 대한 총 RNA를 분리하였다; 무결 18S 및 28S 리보솜 RNA를 점검하여 단리 무결성 (integrity of isolation)을 확인하였다. 폐 시료 (BioChain)는 저분화 편평세포 암종을 가지는50-세 남성으로부터 채취하였다. 유방 시료 (BioChain)는 중증도 분화 침윤성 소엽 암종을 가지는 53-세 여성으로부터 채취하였다. 위 시료 (BioChain)는 저분화 선암종을 가지는 70-세 여성으로부터 채취하였다. 췌장 시료 (BioServe)는 고분화 선포 세포 암종을 가지는 65-세 여성으로부터 채취하였다. 모든 예시적 분석에서, 스캐닝/표지화 일관성을 측정하고 정량화 목적으로 500 mM NaCl로1x TE에서 적당히 희석된 1 ul miSpike (IDT)를 도입하여 합성 서열의 총 함량을 100 amol로 맞추었다. 입자들 첨가에 앞서, Multi-therm 진탕기 (Biomega)에서 배양 혼합물을 95℃로 5 분간 가열하고 7분 동안 실온에 두었다. 앞서 준비된 마스터 믹스 (master mix) 입자들 (ul 당 18개)을 1 분간 완전히 와류시키고, 20 ul (각각의 탐침 유형 당~30 입자들)을 각각의 배양 튜브에 도입하였다. 항온혼합기 (Quantifoil Rio)에서 혼합속도 1800 rpm로 55℃에서 90 분간 표적과 함께 배양하였다.
표적과의 혼성화 이후, 50 mM NaCl이 함유된500 ul TET 용액으로 3회 시료들을 세척하였다. 입자들을 원심분리한 후 튜브로부터 상등액을 수작업으로 흡입하였다. 3번째 세척 이후 거의 50 ul 용액을 흡입하였다. 다음, 245 ul의 미리 준비된 연결효소 마스터 믹스 (100 ul 10x NEBuffer 2, 875 ul TET, 250 pmol ATP, 40 pmol 범용 어댑터, 및 800 U T4 DNA 연결효소)를 튜브에 첨가하였다. 혼합물을 21.5℃에서 30 분 동안 혼합속도 1500 rpm로 Multi-therm 진탕기에 두었다. 연결효소반응 이후, 동일한 3-세척 사이클을 수행하였다. 스트렙타비딘-r-피코에리트린 보고자 (SA-PE, 1 mg/ml)를 TET에서1:50로 희석하고 첨가하여 최종 1:500로 희석하였다. 시료들을 Multi-therm 유닛에서 45분간 21.5℃에서 배양하였다. 또 다른 3-세척 사이클 이후, 입자들을 500 ul PTET (5x TE with 25% (v/v) PEG 400 및 0.05% 트윈-20)에서 추가로 세척하고, 스캐닝하기 위하여 최종 부피 50 ul PTET에 현탁하였다. 사용에 앞서, 모든 PTET를 5 분 동안 분쇄하여 중합체 응집체를 제거하였다.
실시예 3. 후- 혼성화 표지화
핵산 표적들 존재 및 포획을 표시하는 검출 가능 신호를 발생시키기 위하여, 예시적 후-혼성화 연결효소반응-기반 방법이 본 실시예 및 표지화를 위한 실시예 4에 제공되고 기재된다.
이러한 후-혼성화 방법은 결합된 선택적 표적들, 예를들면, miRNA 표적들을 형광적으로 표지하기 위하여 사용될 수 있다. 현재 방법들은화학적 또는 효소 수단을 이용한 RNA 대용량(bulk)-표지화에 의존한다. 이런 방법들은 고비용, 소형(small)-RNA 정제 및 정화의 필요성, 이차 구조에 기인한 서열 편중 (bias), 또는 복잡하고, 시간-소모적 프로토콜들의 문제점들이 있다. 본원에서는, 예를들면, 약 1시간 내에 혼성화 이후 표적들을 효율적으로 표지하는 두-단계 방법을 제공한다.
실험적으로, 연결효소반응 주형들로 작용하는 겔-내장된 (embedded) DNA 탐침들에 포획된 표적들3' 말단에 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터를 결합시키기 위하여 T4 DNA 연결효소 (도 7)를 사용하였다. 따라서, 단일 반응으로 공통의, 범용 어댑터를 사용하여 다수 표적들을 표지할 수 있다. 표지화 과정은 몇 개의 간단한 단계들만이 필요하다. 먼저, 입자 탐침 영역들에서 적합한 표적들을 포획하기 위하여 입자들을 시료, 이 경우 총 RNA와 혼성화한다. 과잉 시료를 세척한 후, 적합한 효소들, 모든 중요한 보조인자들 (예를들면 ATP), 및 공통의 비오틴 결합 어댑터를 포함하는 연결효소 믹스를 첨가한다. 실온에서 단기 반응 후(전형적으로 5 - 60분), 저-염 완충액을 사용하여 임의의 미반응 어댑터를 세척하여 제거한다. 미반응 어댑터를 제거한 후, 형광을 제공하는 피코에리트린-복합된 스트렙타비딘 보고자 (SA-PE)와 입자들을 배양한다. 다시 세척한 후, 입자들을 분석한다. 더욱 중요한 것은, 본 표지화 방법은 매우 효율적이고, 최소 RNA 투입 요건이 없고, 본 예시적 연구 (실시예들 3 및 4)에 사용된 표적들에 대한 서열 편중을 보이지 않았다. 각각의 새로운miRNA 표적 종들에 대하여, 표적-특이적 서열을 범용 탐침 주형에 포함하였고; 복잡한 변형 및 개별적 맞춤이 필요하지 않았다.
이러한 방식에서, 표적 혼성화을 저해할 수 있는 탐침 헤어핀 형성이 최소화되고 연결효소반응 완충액에서~10-20oC인 어댑터-탐침 융점 Tm을 제공하도록 어댑터 서열을 설계하였다. 세척 과정에서 완화 염 완충액을 사용하였지만, 미반응 어댑터의 탈혼성화 (dehybridization)는 핵산 상호작용을 불안정시키는 임의의 조건 (저염, 고온, 첨가제 예를들면 DMSO, PEG, 또는 글리세롤, 기타 등)을 적용하여 달성될 수 있다. 전형적으로, 최대 형광 신호를 획득하기 위하여 SA-PE 보고자를 사용한다. 추가로 또는 달리, 연결효소반응-기반 표지화는 형광체들 또는 기타 보고 개체들로 직접 표지된 어댑터들로 수행될 수 있다. 임의의 특정 이론에 구속되지 않고, 이것은 분석 시간 및 복잡성을 줄인다. 본 처리는, 적합한 탐침 및 어댑터를 설계하여, 어댑터들을 3' OH 또는 5' 말단에서 5' 인산화를 가지는 DNA 또는 RNA 종들의 3' 말단으로 연결하기 위하여 사용될 수 있다.
실시예 4. 연결효소반응-기반의 표지 최적화 및 변형들
다양한 실시예들에서, 탐침/어댑터 설계, 시약 농도들, 세척 완충 염 성분, 연결효소반응 시간, 및 연결효소반응 온도를 포함한, 본 발명에 기재된 표지화 방법의 여러 측면들을 최적화하였다. 여기서 연결효소반응시간 및 어댑터 꼬리 길이가 표지화 효율에 미치는 영향을 보인다. 핵산 탐침들, 표적들, 및 어댑터들 (모든 Integrated DNA Technologies, IDT에서 입수)을 하기 표에 나타낸다:
표 2: 최적화 연구에 사용되는 핵산 탐침들 및 표적들. 볼드체의 서열은 범용 어댑터-특이적 서열들, 보통체의 서열은 표적-특이적 서열들, 및 밑줄의 서열은 폴리(A) 꼬리들을 나타낸다.
Figure 112013001411229-pct00003
어댑터/탐침 설계
상기 예시적 탐침들은 miRNA-특이적 영역 및 어댑터-특이적 영역을 포함하여, 결합될 때, miRNA 표적의 3' 말단은 어댑터의 5' 말단과 인접하도록 설계되었다. DNA 주형을 사용할 때, DNA를 RNA 분자들에 결합시키는 T4 DNA 연결효소 작용이 5' 말단 대비 RNA의 3' 말단에서 수십배 신속하게 진행된다고 알려져 있으므로 (Bullard, D. R. 등, Biochem J 398, 135-144 (2006)), miRNA 표적들의3' 말단 표지화가 선택되었다. 어댑터 서열 및 길이는, (1) 연결효소 완충액에서 융점이 10-20C 범위이고, (2) 어댑터 헤어핀 또는 동종이량체 형성을 피하기 위하여 서열은 상당한 자기-상보성이 아니고, (3) (어댑터 및 miRNA 서열들을 가지는) 완전한 DNA 탐침들은 피검 miRNA에 대하여 현저한 헤어핀들을 형성하지 않도록 선정하였다.
연결효소반응 시간
let-7a를 모델 시스템으로 사용하여 본 표지화 분석에 필요한 최소 연결효소반응시간을 결정하였다. let-7a DNA 탐침 영역을 가지는 입자들을 5fmol 합성 let-7a RNA와 55C에서 110분 동안 배양하였다. 0.05% 트윈-20 (PBST, pH 7.4, Fluka)을 함유한 인산완충식염수로 입자들을 3회 세척하고 T4 DNA 연결효소 완충액 (NEB) 중 200 U T4 DNA 연결효소, 40 nM Cy3-변형된 어댑터 (UA10-Cy3), 및 0.05% 트윈-20을 함유한 연결효소반응 믹스 250?l와 함께 10, 30, 또는 90 분 동안 16C에서 배양하였다. 연결효소반응 후, 0.025 M NaCl을 함유한 TE에서 입자들을 3회 세척하고, 유리 슬라이드에 올려놓고, CMOS 카메라 (Imaging Source)로 영상화하였다. 각 입자의 탐침 영역에서 형광 강도를 측정하고, 배경 형광을 감산하여 연결효소반응의 효율을 나타내는 표적 신호를 얻었다. 결과를 도 8에 도시하였다.
90 분 시료에 대하여 획득한 신호로 각각의 신호를 정규화하여 상대 효율을 계산하였다. 도 SD1에 도시된 바와 같이, 단기 10-분 반응 후라도 연결효소반응은 >95% 완료되었다. 본 연구에 기재된 실험들에 대하여, 거의 완전한 연결효소반응이 보장되도록 연결효소반응시간 30　분을 적용하였다.
비오틴 결합 어댑터들에 대한 꼬리 길이
보고자 스트렙타비딘-피코에리트린 (SA-PE)은 회전반경이 ~10-15 nm 정도인 거대 단백질 구조체이다. 따라서, SA-PE 보고자와 함께 비오틴 결합 어댑터들을 사용할 때, 비오틴 기를 겔 기질 중합체 골격으로부터 연장하는 것이 유리하다는 것을 알았다. 이를 위하여, 어댑터 3' 말단에 폴리(A) 꼬리를 사용하고 꼬리 길이가 표적 신호에 미치는 영향을 조사하였다.
본 실험에서, 상기 절에서와 동일한 let-7a 입자들을 사용하였다. 50amol let-7a miRNA와 함께 60분 50C에서 배양하였다. 입자들을 3회 PBST에서 세척하고, 4개의 개별 튜브들에 분배하였다. 각각의 튜브에 있는 입자들을 30　분 동안 실온에서 0.05% 트윈-20을 함유한 1x T4 DNA 연결효소반응 완충액 (NEB) 중 200 U T4 DNA 연결효소, 및 40 nM UA10-비오 (0, 3, 6, 또는 12bp 폴리(A) 꼬리를 가짐)을 함유한 연결효소반응 믹스와 배양하였다. 연결효소반응 후, 0.05 M NaCl 및 0.05% 트윈-20을 함유한 TE에서 입자들을 3회 세척하고, 유리 슬라이드에 올려놓고, EB-CCD 카메라로 영상화하였다. 표적 신호들을 비교하여 도 9에 도시된 바와 같이 폴리(A) 꼬리 길이 영향을 결정하였다.
도 9에 도시된 바와 같이, 폴리(A) 꼬리 길이는 획득된 표적 신호에 큰 영향을 미친다. 0에서12 bp로 갈수록, 신호는 ~5x 증가하지만 이 점에서 변동이 없는 것으롤 보인다. 일부 실시예들에서 기재된 실험들에 대하여, 폴리(A) 꼬리 길이가 12bp인 범용 어댑터들을 사용하였다.
실시예 5: miRNA 프로필
본 실시예에 기재된 실험은 본 발명에서 제공되는 조성물들 및 방법들이 다양한 분야 (예를들면, miRNA 프로필)에 사용될 수 있다는 것을 보인다.
실험적으로, 10개의 임상 관련 miRNA 표적들을 특정하는12-다중 분석에서 동적 범위, 감도, 및 특이성을 조사하여 본 기술을 입증하였다. 조직 유형들 및 질환 상태에 따른 상대 불변성 (invariance)으로 인하여, RNU6B를 정규화 목적으로 내부 대조군으로 사용하였다. 또한 100 amol miSpike (합성 21-mer)를 외부 대조군으로 이용하여 표지화 및 스캐닝 처리들의 일관성을 검증하였다. 본 연구를 위하여 12 분량들의 단일-탐침 입자들을 합성하였다. 표적 혼성률 차이를 보상하기 위하여, 미리 결정된 축척법칙 (scaling law)을 이용하여 (표 1) 각각의 표적에 대한 탐침 농도를 조정하여 대략 비율을 일치시켰다 (coarse rate-matching). 스캐너 다용성을 완전히 보이기 위하여, 5개의 개별 코드들을 각각의 탐침 유형 입자들과 연관시킴으로써, 60-다중 분석을 모의하였다.
본 시스템의 감도 및 동적 범위를 더욱 평가하기 위하여, 12 표적들 중 4개를 50-ul 배양 혼합액들에 1 내지 2187 amol 함량으로 동시에 첨가하였다. 4개의 log들에 대하여 선형 검출기 반응을 관찰하였고, 4 표적들 중 3개에 대하여 부 (sub)-아토몰 감도를 달성하고 순수 (neat) 시료들 및 복잡계 (complexity)를 부가하기 위하여 200 ng E. coli 총 RNA가 첨가된 시료들 간 상당한 일치가 있다 (도 10 및 도 11). 비교하면, 현존 비드-기반 방법은 200-amol 검출 한계를 가지고 단 하나의 log 범위를 가진다. 특이성을 평가하기 위하여, let-7a 입자들 및 200 ng E. coli 총 RNA를 함유한 시료들에 각각 200 amol로 첨가된 let-7 계통의 4 멤버들에 대하여 분석하였다. 스캐닝 결과 최대 교차-반응성은 27%로 나타나고 (도 10b), 이것은 다른 시스템들 (미세배열 ~50%) 보다 낮은 것이고 더욱 낮은 혼성화 염 농도들로 상당히 개선될 수 있다 (도 12). 이러한 분석은 운전-중 (intra-run) 및 운전-간 COV는 2-7%으로 재현성이 매우 높았다 (표 3). 검출 및 입자 제조 한계로 인하여, 일반적으로 표적 수준에 대한 고-신뢰 추정을 위한 분석에서 비드-기반 시스템들 사용자들은 각 유형의 비드4,500 사본들을 적용한다. 이와는 대조로, 각각의 탐침 유형에 대하여 단지 10-15 수화겔 입자들을 분석하는 것으로 충분하다는 것을 알았다 (도 13).
표 3: E. coli 보정 곡선에 대한 표적 수준의 운전-중 COV. 모든 값들은 평균 19 입자들을 사용하여 통계적으로 계산된 백분율이다. miR-222는 1 amol 이상에서 검출 한계를 보였다. 9개의 표시 스캔 설정에 대하여 배경-제거된 miSpike 신호 (100 amol)에서 운전-간 COV는 6.84%였다.
Figure 112013001411229-pct00004
플랫폼에 대한 추가적 검증으로, 종양 및 인접 정상 조직에 걸쳐 여러 유형의 종양 발현 프로필을 수행하였다. 예상된 바와 같이, 검사된 모든 질환에 있어 여러 miRNA 표적들의 조절 이상을 관찰하였다 (도 10c, 표 4, 및 표 5). 이들 시료에 대하여250 ng 총 RNA를 사용하였지만, 100 ng만을 사용한 폐 시료들에 대하여 유사한 결과들을 얻었고, 이는 낮은 투입 RNA으로도 충분하다는 것을 제안하는 것이다. 단 3 h의 총 분석시간으로, 미세배열(~24 h) 방식보다 프로필은 더욱 효율적이고 현재의 비드-기반 방법들보다 훨씬 우수한 감도 및 재현성을 보인다.
표 4: 250-ng 조직 프로필 반복 검증에 대한 평균 표적 함량들 및 운전-간 표적 함량 COV. 각 항목의 상부 수치는 반복 시도들에 대한 평균 함량 (amol); 괄호 내 아래 수치는 운전-간 COV (%). 함량들은 각 운전으로부터 배경-제거된 100-amol miSpike 신호와 비교하여 결정되었다. 재현성을 엄격히 테스트하기 위하여 반복 분석들을 다른 날들에 수행하였다. 평균 16 입자들을 이용하여 각각의 통계를 계산하였다. 데이터가 없는 곳은 2 amol 절단값 이상에서 표적이 존재하지 않는다는 것을 나타낸다.
Figure 112013001411229-pct00005
표 5: 250-ng 분석에 대한 Log-변환 발현 비율. 각각의 항목의 상부 수치는 특정 조직에서 3회 시도에 따른 표시된 표적의 종양 함량-대-건강 조직 함량의 log-변환 비율의 평균이고; 괄호 내 아래 수치는 표준편차이다. 적색 항목은 조절 이상을 나타낸다. 데이터가 없는 항목은 비율이 계산되지 않았다는 것을 나타낸다.
Figure 112013001411229-pct00006
따라서 이러한 고효율의 핵산 프로필 시스템 및 플랫폼은 도식적-코드화 수화겔 미세입자들 이용을 가능하게 하는 다용성 스캐닝 및 표지화 방법의 적용을 보이는 것이다. 본 시스템의 전례없는 감도, 유연성, 및 처리량 조합으로 탐색 및 임상 적용, 특히 혈청과 같이 쉽게 입수 가능한 매질 중의 낮은-수도 miRNA 및 기타 생체분자들의 정량화에 놀라운 가능성을 제공한다.
실시예 6: 다중-현상 입자들 스캐닝
본 방법이 표준 세포분석과 차별되는 것을 보이는 실시예가 하기 도 14에 도시된다. 본 실시예에서, 다중 기능성 입자들의 기능성 영역들은 세포분석기로 하여금 현상 기록을 촉발시키는 조명 산란 유발 개체들을 담지한다.
두 개의 코드화 영역들 및 표적이 포획되는 단일 탐침 영역을 가지는 입자 구조가 보인다. 두 개의 코드화 영역들은 3 형광 채널들에서 구분된 형광 표시들을 주도록 내장된 다양한 수준의 형광체들을 가진다. 입자 배향을 나타내기 위하여 하나의 코드화 영역들은 다른 것보다 의도적으로 더 넓다. 표적은 도시된 바와 같이 바람직하게는 단일 형광 채널에서 나타나는 형광체로 표지될 수 있다. 본 실시예에서, 각각의 입자는 3 현상들로 보고될 것이다. 이들 3 현상들 중, 제1 및 마지막 현상은 코드 정보를 주고, 제2 현상은 표적 정량화에 사용된다. 이러한 방식으로, 코드 및 포획된 표적은 비-동시 다발적으로 정량화된다.
본 방법의 구현을 보이는 예비 실험들을 진행하였다. 넓은 불활성 영역 측면에 배치된 두 형광 영역들 (각각 Cy5 및 Cy3 형광 염료들로 염색된30mm 및 60mm)을 가지는 ~200x35x30mm 치수의 다중 기능성 입자들을 합성하였다. 유속 100ml/분 및 코어 크기 40mm의 Accuri C6 세포분석기에 입자들을 주행시켰다. FL4-H (Cy5 검출)에서 역치를 100,000으로 설정하였다.
세포분석기에 기록된 각각의 현상이 분해능 1ms의 타임 스탬프로 주어진다. 입자들은 전형적으로 유동셀을~1m/s 속도로 이동하므로, 200um 길이의 입자에 대한 조사는 ~0.2ms 지속된다고 예상된다. 따라서, 단일 다중 기능성 입자로부터 기록되는 두 현상들은 동일한 타임 스탬프에 나타날 것으로 예상된다. 각각의 입자가 두 개의 분리 현상들로 판독되는지를 보이기 위하여, 주어진 현상들 개수를 가지는 타임 스탬프들 카운트를 보이는 히스토그램을 도시하였다. 타임 스탬프 당 현상들 개수는 본 입자들에 대하여는 짝수 (단일 입자에 대하여는2 현상들, 두 입자들에 대하여는4 현상들, 기타 등)이고, 정규 입자들에 대하여는 홀짝일 것이라고 예측된다. 대조군으로, 전형적인 구 형태의 표준 Accuri 8-피크 보정 비드들을 주행하였다. 결과는 도 15에 도시된다.
데이터 획득 과정을 통하여 보정 비드들은 상당히 무작위로 스캔되어, 1 - 4 비드들/타임 스탬프의 범위를 제공한다는 것을 알 수 있다. 한편, 다중 기능성 입자들은 2 또는 4 현상들 집단/타임 스탬프을 보이고, 이는 각각의 입자가 두 현상들로 판독된다는 이론과 매우 잘 맞는다. 또한, 현상 대 시간 도표로부터 각각의 타임 스탬프 과정에서, 고- 및 저-수준의 형광 판독이 있다는 것을 알 수 있다. FL-2 채널에서 입자들이 하나는 밝고 하나는 어두운 영역의 형광을 가지도록 설계되었고, 이 역시 각각의 입자가 두 개의 이산 현상들로 판독된다는 이론을 지지하는 것이다. 이러한 방법은 입자 당 3 또는 그 이상의 현상들에도 적용될 수 있다. 각각의 영역/현상은 형광 수준, 정방향 또는 측 산란, 및 폭에 있어서 가변된다.
일부 경우에는, 다수 형광체들의구분된 수준들을 다중 기능성 입자들의 각 코드화 영역에 결합시키는 것이 유용하다. 기술 검증을 위하여, 일단에 단일 60mm 코드화 영역을 가지는 막대-형태 입자들, 200x35x30mm을 사용하였다. 코드화 영역을 Cy3 및 Cy5 형광 염료들의4개의 구분된 수준들을 이용하여 표지하였다. 입자들을 유속 100ml/분, 코어 크기 40mm, 및 FL4에서의 역치5000인 Accuri C6 세포분석기로 분석하였다. 결과는 하기 도 16에 도시된다.
도 16의 도표는 다중 기능성 입자들 각각의 코드화 영역에서 구분된 형광 지문이 생성될 수 있다는 것을 보인다. 데이터 점들의 각 집단은 구분된 코드를 나타낸다.
이러한 방법을 이용하여 데이터를 분석하기 위하여, 현상들을 입자들로 분류하고, 입자들을 배향하고 (orient), 원한다면 형광을 표준에 대하여 정규화하고, 각각의 코드 및 탐침 영역에서의 형광, 산란, 또는 현상 폭을 정량화하기 위한 알고리즘이 요구된다. 이후 각각의 입자에 대한 해당 코드에 대하여 신뢰수준이 주어지고, 예정된 신뢰수준으로 호출되지 않는 것들은 분석에서 제외된다. 이후 탐침 영역의 형광이 피검 시료에 존재하는 표적 함량을 결정하기 위하여 사용된다. 본 시스템은 스캐닝 과정 또는 이후에 분석 수행 소프트웨어를 이용하여 용이하게 자동화될 수 있다.
실시예 7. 미처리 신호 판독
본 실시예는 표준 유세포분석기들에서 다중 기능성 입자들을 조사하는 것을 보인다. 일부 실시예들에서, 조사는 세포분석기 검출기로부터 신호를 획득하는 것이고, 이후 장비의 펌웨어 및 주문형 소프트웨어로 현상들로 처리되어 입자들 스캔 식별, 배향 및 분석이 이루어진다. Partec, Accuri (C6), 및 Millipore (Guava)의 3개의 개별 세포분석기를 이용하여 입자들 스캐닝에 대한 기술을 검증하였다.
미가공 데이터를 수집하기 위하여, 간단한 회로 (때로는 단일 저항만)를 통하여 연결된, 각 세포분석기 단일 PMT로부터의 리드들 (Partec 및 Millipore) 또는 QC 핀 (Accuri)을 이용하고, 표준 데이터 획득 (DAQ) 보드 (National Instruments NIDAQ-USB6250)를 이용하여 전압을 측정하였다. Python으로 쓰여진 주문형 스트립트를 이용하여 DAQ 보드와 통신하고, 사용자는 시료들 개수 및 주파수를 입력할 수 있다. 시료들을 60 kHz 내지 1 MHz 범위에서 취하였다. 획득 후, 데이터를 단일 파일에 저장하였다.
분석을 위하여, 고속프리에변환-기반 필터링을 적용하여 각각의 스캔에 대하여 원하는 주파수 응답을 분리하였다. 이후, 역치를 설정하여 각각의 시료에서 입자들을 식별하였다. 신호가 예정된 수의 시료들에 대한 역치 이상에서 검출되면, 관심 영역 및 인접 데이터 점들이 단일 입자 스캔으로서 저장된다. 각각의 입자 내부에 제작된 설계 특징부를 사용하여 코드 및 탐침 영역들을 식별하였다. 또한, 각각의 입자에 주어진 특징부에 의해 각각의 신호를 정규화하였다. 실시예에서 본 바코드들은 입자를 따라 다른 형광 수준들을 가지는 일련의 띠들로 이루어졌다.
테스트 입자들의 기본 세트를 이용하여 3개의 상업적 세포분석기들에서 입자-대-입자 스캔의 정렬 및 일관성을 평가하였다. 3개의 구분된 영역들을 가지는 막대-형태 형광 입자들을 합성하였다. 정규 형광 현미경의 정적 영상 스캔들을 각각의 장비 단일 PMT에서 획득된 미처리 스캔들로부터 얻은 것들과 비교하였다. FFT-기반 필터링을 적용하여 각각의 장비에 대한 원하는 주파수 응답을 분리한 후, 속도 편차를 보상하기 위하여 식별된 각각의 입자로부터의 신호를 조정하고 (scaled) (x-축 만) 공통 x-축에 따라 도시하였다. 겹친 입자 스캔들 및 현상 폭 분포 (입자 속도와 역상관)를 가지는 결과를 하기 도 17 및 도 18에 나타낸다.
정적 스캔과 비교할 때, 모든 3 세포분석기들은 다중 기능성 입자들을 다양한 정확도 수준들에서 스캐닝할 수 있다는 것을 알 수 있다. 특히, Guava 장비는 매우 양호한 재현성을 보였으나, 각각의 특징부 (feature) 치수와 비교할 때 큰 레이저 스폿 크기 (~25mm)로 인하여 원형 (rounded) 특징부를 가졌다. Accuri는 상당히 재현 가능한 스캐닝을 보였으나 잡음이 상당하였다. 전체 유동셀에 이르지 못하는 레이저 스폿 크기로 인하여 및, 대부분은 입자가 유동셀 단면에 배치된 여부에 따라 입자 밝기가 달라짐으로 인하여 Partec는 스캔 강도에서 상당한 가변도를 보였다.
핵산 검출 "바코드"를 나타내는 단일의 광폭 형광 영역 및 두 개의 불활성 영역들에 의해 측면에 놓이는 소폭의 탐침 영역을 가지는 입자들을 이용하여 핵산 검출을 수행하였다. 50ml 반응액에1fmol 수준으로 첨가된 microRNA let-7a를 90분 동안 55C에서 혼성화하여 검출하였다. 결합된 표적은 스트렙타비딘-피코에리트린로 표지되고 Millipore Guava를 이용하여 입자들을 스캔하였다. 입자 탐침 영역에서의 형광 수준은 분석에 존재하는 표적 함량을 표시한다. 결과는 도 19에 나타난다.
재차, 결과들은 재현될 수 있지만 다양한 입자 영역들 간 인터페이스에 신호 라운딩을 보였다. 최고 감도의 분석은 그린 (532nm) 레이저 여기로부터 얻어질 것이다.
실시예 8: 탐침 기능화를 가진 두-띠 코드화
본 실시예는 본원에 기재되는 조성물들이 합성되고 코드화 특히, 범용 코드화를 위하여 기능화될 수 있다는 것을 보였다.
본원에 참조로 포함되는 미국특허 7,709,554에 기재된 바와 같이 정지-유동 식각법을 이용하여, 스템-루프 코드화 탐침 (SEQ ID NO:20) (/5Acryd/AATAAACACGGGAATAACCC, IDT, 10uM로 포함), 음성 대조 영역, 탐침 앵커 (SEQ ID NO:21) (/5Acryd/GATATATTTT, IDT, 50uM로 포함), 및 제2 음성 대조 영역을 가지는 직사각형 입자들을 합성하였다. 입자들 치수는 ~120x60x35um이고 4 띠들 각각의 두께는 ~30um이다. 형광-표지 코드화 어댑터 (SEQ ID NO:22) (5'-Phos-GTGTTTATAA-Cy3, IDT) 대 비표지화 어댑터 (SEQ ID NO:23) (5'-Phos-GTGTTTATAA-invdT, IDT) 의 여러 비율로 입자들을 배양하였다. 각각의 연결효소반응 믹스는 250nM ATP, 200U T4 DNA 연결효소 (모두 New England Biosciences에서 입수), 및 총 40nM 코드화 어댑터들이 있는 NEBuffer #2를 함유하였다. 항온혼합기에서1500rpm으로 혼합하면서 실온에서 30분 간 연결효소반응을 수행하였다. 이후, 50mM NaCl 및 0.05% 트윈-20을 함유한 TE 완충액으로 입자들을 3X 세척하였다. 20X 대물렌즈, NA=0.5, 및 CCD 카메라 (Imaging Source)를 가지는 Nikon Ti-S 현미경으로 입자들을 영상화하였다. 형광 강도 스캔들을 입자 길이에 따라 도식하고 각각의 시료에 있는 5개의 입자들에 대하여 형광 신호들을 측정하고 평균을 구하였다. 전형적인 결과들을 도 20에 나타낸다.
데이터에 따르면 표지화가 작동하였지만, 형광 대 어댑터 비율 관계는 선형이 아니라는 것을 보인다. 이것은 사용된 형광 및 비-형광 어댑터들 간 혼성화 또는 연결효소반응율이 다른다는 것을 의미한다. 그러나, 100% 수준에서 영상들은 포화되었고, 비교를 위하여 모든 4개의 데이터 점들을 사용하는 것은 어렵다. 미처리 및 조정된 데이터는 표 6에 나타난다:
Figure 112013001411229-pct00007
또한, 상기 정지-유동 식각법으로 합성된, 두 개의 코드화 영역들 (헤어핀 앵커들을 가짐) 및 탐침 영역 (선형 앵커를 가짐)을 가지는 범용 입자들을 사용하였다. 입자들은 길이가 ~180um, 폭이 35um, 및 두께가 ~25um이고, 4 영역들 - U코드1 (~10uM에서 합성), U코드2 (~10uM에서 합성), 불활성, 및 U앵커 (~50uM에서 합성)을 가진다. 본 연구에서 사용된 DNA 서열들은 다음과 같다 (Integrated DNA Technologies, 5 - '3'):
U코드1 탐침 = /5Acryd/AAT AAA CAC GGG AAT AAC CC (SEQ ID NO: 24)
U코드2 탐침 = /5Acryd/AAT AAT GTG CCC AAT AAG GG (SEQ ID NO:25)
U코드 1 어댑터 Cy3 = /5Phos/GTG TTT ATT A/3Cy3Sp/ (SEQ ID NO: 26)
U코드 1 어댑터 invdT = /5Phos/GTG TTT ATT A/3InvdT/ (SEQ ID NO:27)
U코드 2 어댑터 Cy3 = /5Phos/CAC ATT ATT A/3Cy3Sp/ (SEQ ID NO:28)
U코드 2 어댑터 invdT = /5Phos/CAC ATT ATT A/3InvdT/ (SEQ ID NO:29)
입자들을 합성하고 세척한 후, 총 500ul NEBUFFER #2 (NEB) 중 250nM ATP (NEB), 200U T4 DNA 연결효소 (NEB), 0.05% 트윈-20 (Sigma), 및 DNA 어댑터 (하기)를 가지는 연결효소반응 마스터 믹스를 준비하였다:
F1: 80nM U코드 어댑터 1 Cy3
N1: 80nM U코드 어댑터 1 invdT
F2: 80nM U코드 어댑터 2 Cy3
N2: 80nM U코드 어댑터 2 invdT
96-웰, 1.2um 여과-바닥판 (Millipore)에서, 표 7에 나열된 연결효소반응 혼합물의 믹스를 첨가하였다:
Figure 112013001411229-pct00008
10ul 입자들을 각각의 월에 첨가하고 (~200 입자들) 판을 혼합기에 넣고, 실온에서 30분 동안 1500rpm으로 혼합하였다. 이후 여과기 유닛을 사용하여 과잉 완충액을 뽑아내고 0.05% 트윈-20 (TET)의200ul TE 완충액으로2X 세척하였다. 영상화하기 위하여, 60ul TET를 각각의 웰에 첨가하고, 30초 혼합하고 피펫으로 각각의 웰로부터35ul를 유리 슬라이드로 옮겼다. 각각의 시료를 중간에 두고 18x18mm 커버슬립으로 덮었다. 밝기 = 30, 게인 = 600, 노출 = 0.412초, 감마 = 150인 Imaging Source CCD 카메라를 가진 Nikon Ti-U 현미경으로 입자들을 영상화하였다. 시료 당5 개의 입자들을 영상화한 후, ImageJ를 사용하여 영상을 배향하고 자르고, 분석을 위하여 데이터를 엑셀에 붙였다. 분석된 미처리 데이터는 표 8에 나타나고, 비율은 사용된 형광 어댑터 함량을 표시한다 (여기서 1=100%):
Figure 112013001411229-pct00009
도 21 (a 및 b)은 개략적 입자 설계, 각각의 연결효소반응으로인한 시료 형광 영상들, 및 입자들의 평균 스캔을 보인다.
각각의 연결효소반응 믹스로부터의 측정 형광 대 어댑터 함량 도표는 도 22에 도시되고, 여기서 "코드 1" 및 "코드 2"는 각각 제1 및 제2 코드화 영역의 평균 신호를 나타낸다. 코드화는 잘 작동하였다. 보다 중요한 것은, 코드화가 특이적이고; 각각의 코드화 영역에 대한 신호들은 서로 독립적이라는 것이다. 상기 실험들에서 관찰되는 바와 같이, 각각의 코드화 영역에 대한 형광 수준은 형광 어댑터 함량에 대하여 선형이 아니었다. 신호들은 특히 25% 형광 어댑터 수준들에서 매우 재현성이 높았다.
실시예 9: 주형 기능화를 이용한 범용 코드화
본 실시예에서, 코드화를 위한 여러 폴리뉴클레오티드 주형들을 가지는 범용 입자들를 제작하였다.
실시예에서, 2개의 불활성 영역들에 의해 이격되는3개의 활성 영역들을 가지고, 상업적 세포분석기로 스캔될 수 있는 입자들을 설계하였다. 코드화에 사용되는 아크릴레이트 변형 (5'acry로 표기)을 가지는 DNA 주형들이 하기 표 9에 나열된다:
Figure 112013001411229-pct00010
이들 주형들을 도 23에 도시된 입자 설계에 이용하였다. 본 설계에 따른 폴리(에틸렌 글리콜)로 이루어진 수화겔 입자들을 상기 유동 식각법으로 제작하였다. 표 10에 나열된 폴리뉴클레오티드 주형들의 농도들을 가지는 단량체들로 입자들을 제작하였다.
Figure 112013001411229-pct00011
유세포분석기에서 사용하기 위하여, RED2 채널에서 현상들을 촉발하기 위하여 UC2 주형은 Cy5 변형된 어댑터로 기능화된다. 바코드화를 위하여, UC1 및 UC3 주형들은 세포분석기 YEL 채널에서 바코드화를 위한 구분된 형광 수준들 및 GRN 채널에서 배향을 위한 구분된 형광 수준들을 달성하기 위하여 어댑터들 블렌드 (Cy3 변형, FAM-6 변형, 또는 비-형광)로 기능화된다. 사용된 어댑터들 서열들은 하기 표 11에 주어진다:
Figure 112013001411229-pct00012
각각의 바코드화 영역에서 구분 가능한 형광 수준들의 개수는 코드화 정확성, 사용되는 세포분석기의 성능 특성에 따라 다르다. 주어진 유세포분석기에서 다중화를 극대화하기 위한 적합한 코드 희석화를 결정하기 위하여, 형광 및 비-형광 어댑터들의 여러 블렌드들이 주어진 코드화 주형에 대하여 시도될 수 있다. 형광 대 비-형광 어댑터들의 여러 비율들은 형광 및 비-형광 간의 비율을 로그 함수적으로 변경하고 다수의 입자 분량들을 연결효소 반응하여 연구되고 도 24에 도시된 곡선을 얻었다. 연결효소반응을 통한 어댑터들과의 주형 기능화는 각각의 코드화 주형 (형광 또는 비-형광)에 대하여 ul 당 0.8U T4 DNA 연결효소, 총 40nM 어댑터를 이용하여 실온에서 1시간 동안 모든 주형들에 대하여 동시 다발적으로 수행되었다.
UC1-A-NF 에서 UC1-A-Cy3의 여러 희석화를 이용하여 범용 입자들을 기능화하여 획득 형광에 대한 적정 곡선을 만들었다. 도 24에서의 곡선은 0:1 내지 1:1 범위의 Cy3:NF 어댑터 비율을 적용하여 얻은 log(형광)을 보인다. 본 곡선은 Guava easyCyte 6HT의YEL 형광 측정으로 획득되었다.
본 방법을 이용하여, Cy3 변형 및 비-형광 어댑터들을 가지는 UC1 및 UC3 주형들에 대한 적정 곡선들을 만들었다. log(형광)를 보이는 전형적인 결과들은 하기 표 12에 제시된다.
Figure 112013001411229-pct00013
여기에서 측정된 신호들의 예상 변동계수 (COV)가 주어진다면 예상 형광 수준들이 인접 희석화와 중첩 가능이 거의 없도록 코드화에 이용되는 희석화가 선택된다. 각각의 바코드화 영역들에 대하여5 수준들을 얻기 위하여, 다음과 같은 표 13의 비-형광 대 Cy3-변형된 어댑터들 희석화가 적용되었다:
Figure 112013001411229-pct00014
각각의 바코드 1 및 바코드 2에서 구분된 5 수준들의 형광을 발생시킬 가능성으로, 총 25 고유 조합들이 얻어진다. 이들 희석화는 본 실시예에서 합성된 범용 입자들로 시도되었다. 두 개의 코드화 영역들을 차등시키기 위하여, 더 높은 수준의 그린 (FAM-6)이 바코드 2에 대한 일련의 희석화에 부가되었다. UC2에 대한 형광 어댑터 역시 기능화에 포함되어 세포분석기에서 현상들을 촉발하기 위하여 사용되는 RED2에서의 신호를 발생시킨다. 주어진 어댑터에 대한 어댑터 총 농도가 40nM이 되도록 UC1, UC2, 및 UC3에 대한 어댑터들 블렌드와의 동시적 연결효소반응으로 입자들은 기능화된다. T4 DNA 연결효소 0.8U/ul 존재에서반응들은 실온에서 1시간 수행되었다. 입자들을 TE 완충액에서 세척하고 Guava 6HT를 이용하여 스캔하였다.
실시예 10: 상업적 세포분석기들을 이용한 다중-현상 입자들 스캐닝
본 실시예에서, 상업적 세포분석기들로 스캐닝하기 위하여 실시예 12에서 제작된 범용 입자들을 이용하였다. 스캐닝을 위한 예시적 세포분석기로 Milipore Guave easyCyte 6HT-2L을 사용할 수 있다.
여기에서, 현상들 촉발을 위하여 RED 형광, 코드 입자들 코드화를 위하여 황색 형광, 및 입자들 배향을 위하여 그린 형광을 이용한 세포분석기로 입자들을 스캔하였다. 논의된 바와 같이, 도 23에 나타낸 입자들은 2개의 불활성 영역들에 의해 나뉘어진 3개의 활성 영역들 (바코드 1, 탐침 및 바코드 2)로 구성된다. 모든 3개의 활성 영역들은 Cy5-변형된 핵산을 가지고 Guava easyCyte 세포분석기 RED2 채널에서 현상들을 촉발시킨다. 탐침 영역의 Cy5 수준은 의도적으로 바코드화 영역들의 약 1/2이 되도록 제작된다. 2개의 바코드화 영역들은 Cy3-변형된 올리고뉴클레오티드들의 가변 수준들을 가진다. Guava 세포분석기 YEL 채널에서 검출되는 각각의 바코드화 영역의 Cy3 수준들은 입자에게 고유 코드화 표시를 부여하기 위하여 사용된다. 또한, 바코드 1에서 더 높은 수준으로 FAM6-변형된 올리고뉴클레오티드가 바코드화 영역들에 포함되어 배향 수단을 제공한다. 바코드 1에서 5개의 고유 Cy3 형광 수준들 및 바코드2에서5 개의 고유 수준들을 가지는 25개의 상이한 입자 바코드들을 함유한 혼합물을 기술 검증에 사용하였다.
Guava 6HT의 RED2 채널에 설정된 역치 500은 모든 3개의 입자 영역들을 식별하기에 충분하였다. TE 완충액에서 마이크로리터당 약 20 농도의 수 백개의 입자들을 초당 0.6 마이크로리터로 스캔하였다. YEL (바코드화 색) 대 RED2 (촉발화 색)로 도식화된 입자들과 연관된 현상들이 YEL 대 GRN (배향화)와 함께 도 25에 도시된다. 입자 탐침 영역은 더 낮은 수준들의 그린 (FAM-6TM 및 황색 (Cy3TM으로 도표 좌측 하부에 나타난다. 두 개의 입자 코드화 영역들은 도표 우측 상부에 보인다. 입자 바코드 1 영역에서 5 코드들 및 바코드 2 영역에서 5 코드들로 총 10 밴드들이 도표에서 구분된다. 이들 도포에 나타나는 미처리 값들은 추후 분석을 위하여 FCS 파일로 보내진다. CSV로 보내진 모든 현상들은 시간 순차대로 저장된다.
RED2 및 GRN 형광 패턴들을 기반으로 주문 소프트웨어를 사용하여 Guava 소프트웨어에서 보내온 현상들을 분석하고 재구성하였다. 소프트웨어는 현상들 순서를 살펴 이들 연속 현상들이 RED2 및 GRN 형광에 대한 예상 패턴들과 일치하는지를 평가한다. 패턴이 맞으면, 현상들은 입자로서 분류되고 YEL 형광에서 바코드에 대하여 분석되고 GRN 형광에 따라 배향된다. 재구성 후, 바코드 1 대 바코드 2 (각각 설계 코드 1 및 코드2)에서 황색 강도 (Cy3TM 수준을 이용하여 더욱 균일한 (coherent) 도표가 구성된다. 본 도표는 도 26에 도시된다. 존재하는 각각의 25 바코드들과 연관된 입자들 클러스터들을 식별하기 위하여 타원들이 사용된다. 형광 바코드 1 (코드 1) 및 바코드 2 (코드 2)의 5 수준들은 쉽게 구별될 수 있다는 것을 알 수 있다.
바코드 결정과 더불어, 주문형 소프트웨어는 또한 입자 탐침 영역에서 포획 표적과 연관된 형광을 정량화할 수 있고, 이들 정보는 입자와 연관된 3 현상들 중 제2 현상으로서 저장된다. YEL 채널에서 검출될 수 있는 보고 형광체를 사용할 때, 본 영역에서의 YEL 형광 수준은 존재하는 표적 함량을 나타낸다.
실시예 11: 단일-용기 ( One - spot ) 등온 핵산 증폭 분석 개발
본 실시예는 다양한 용도들, 예를들면 핵산 증폭 분석에서 본 발명에 의한 코드화 입자들의 사용을 보인다. 전기에서 보인바와 같이, 본 출원인은 (1) 서브-아토몰 감도, (2) 단일-뉴클레오티드 특이성, (3) 신속한 스캐닝, (4) 가시적 무제한 코드화 밀도, 및 (5) 저가를 제공하는 다양한 조성물들 및 방법들을 개발하였다. 예를들면, 상기 실시예들, 및 도 27에서 microRNA 표적들에 대한 고성능 분석을 보인다. 본원에 기재되는 본 입자 합성의 단순성, 단일-용기 분석, 및 단일-색 검출로 인하여 새로운 분류의 저가 진단 수단이 가능하다.
본 프로젝트에서, 코드화 수화겔 입자 분석을 이용하여 (1) 한번에 >10 병원체들의 DNA 또는 RNA에 대하여 정확한 패널 -기반 테스트를 수행하고, (2) 신속하고 사용이 쉬운 단일-용기, 등온 분석을 적용하고, (3)　휴대용 기구에서 저가의 1회용 카트리지를 이용하는 현장 검사 (point-of-care )시스템을 개발하였다. 본 출원인은 병원체들의 특정 유전체 표적들을 증폭하고, 증폭산물을 바코드화 겔 입자들과 혼성화, 및 단일 밀폐 튜브에서 결합된 증폭산물을 정량화할 수 있는 단일 사용자에 의한 (시료 로딩) 단일-용기 분석법을 개발하고 있다. 다수의 종들-특정 표적들은 등온의 헬리카제-의존성 증폭 (HDA)으로 증폭된다. 형광-표지된 증폭산물은 코드화 수화겔 입자들 내부로 확산되고 도처에 내장된 상보적 핵산 탐침들과 혼성화된다 (도 28). 본 혁신적인 미세가공 공정의 유연성으로 인하여 공극 크기 또는 입자들이 헬리카제 효소들 (~4.5nm)을 배제하도록 조정할 수 있고, 이에 따라 결합된 표적들이 풀릴 것이다. 이러한 이점으로, 전체 과정은 사용자 개입없이 수행될 수 있다. <1 시간 후, 입자들은 형광을 이용하여 유체 채널 내에서 신속하게 스캔되어 각각의 입자 바코드를 판독하고 해당 표적들을 정량한다. 휴대용 분석 유닛과 병용되는1회용 유닛들을 가지는 카트리지-기반의 시스템을 제작하는 것이 목적이다.
또한 본 출원인은 상기 다양한 실시예들에서 기재된 표준 PCR을 이용한 단일-용기 분석법을 개발하였고, 최근에는 본 프로젝트 목적에 따라 등온 분석법을 연구하였다. 분석법 개발을 위하여 λ-파지 DNA를 모델 시스템으로 이용하였다. 먼저, 비-특이적 증폭을 피하기 위하여 인간 유전체 DNA에 대하여 대조 검토하면서 λ의 2 표적 영역들에 대한 Tm-일치된 프라이머들을 설계하였다. ~60bp 길이의 증폭산물을 설계하였다. 정방향 프라이머에 대한 결합 부위를 제외하고 상보적 서열을 가지는 각각의 증폭산물을 표적화하는 탐침들을 설계하였다. 표준 PCR 및 등온성 증폭으로 단일-용기을 수행하였다 (도 29).
각각의 분석을 위하여, 단일 프라이머 세트 (Cy3로 표지된 정방향 프라이머), 증폭산물에 대한 두 개의 공간적-이격 탐침 영역들을 가지는~50 코드화 겔 입자들, 및 λ-파지 DNA 또는 인간 유전체 DNA를 함유한 PCR 믹스를 준비하였다. 표준 PCR 및 등온 증폭 모두를 사용하여, 생성된 각각의 증폭산물에 대한 특이적 증폭 및 혼성화를 보일 수 있었고 인간 유전체 DNA의 비-특이적 증폭은 보이지 않았다. 반응 당 11,000에서 11 사본들로 λ-파지에 대한 일련의 희석화를 진행하였다. 프라이머 세트 #1을 이용하여, 단일-용기 분석법을 이용하여 표준 PCR로 본 예비 연구에서 주형의~11 사본들을 검출할 수 있었다. 등온 반응에 대한 감도는 평가되지 않았지만, 60-분 반응 후의 입자들에 관찰된 신호들은 40 사이클 이후 표준 PCR에서 얻어진 것들보다 더 강한 신호들이었다.
증폭 프라이머들 및 DNA 검출 탐침들 설계
임의의 병원체에 대하여, 병원체에 특이적이고, 변형에 보존적인 유전체 표적들을 식별할 필요가 있다. 4개의 관심 병원체들에 대한 타인들의 PCR-기반 분석 개발에 기반한다. 유전체 HIV RNA에 대한 표적들: pol-인테그라아제 영역 및 env 및 gag 유전자들. 장티푸스균 유전체에 대한 PCR-기반 식별 표적들은 tyv, flag, viaB, 및 ratA 유전자들을 포함한다. 말라리아 원충 유전체에 대한 보존 영역들은 18s rRNA 유전자 및 포자소체 (CS) 유전자를 포함한다. 뎅기열 바이러스에 대하여, Gurukumar et al. 은 보존 바이러스 유전체의3'UTR에 있는 보존 영역을 표적화하였다. 우선, 본 실험들은 이들 병원체에 대한 유사 영역들을 표적화하도록 설계된다.
다중화 등온 증폭을 위하여, (1)　유사한 융점들을 가지고, (2) 이종-이량체를 형성하지 않고, (3)　각각의 병원체 종들에 대하여 식별된 표적들을 특이적이고 효율적으로 증폭하는 적합성 프라이머 세트들을 설계할 필요가 있다. 입자들이 증폭 반응에 존재하는 "단일-용기" 분석을 개발하고 있으므로, (1)　입자 탐침-영역들에 내장된 DNA 탐침들의 3'-신장을 피하고, (2) 증폭산물이 혼성화되는 본 입자들로 신속하게 확산되도록 소량 (<100　bp) 유지하는 것을 고려할 필요가 있다. 이러한 방식에 접근하기 위하여, 다중화 증폭에서 프라이머 설계를 위한 상당 분량의 서적들을 연구할 것이다 [29].
도 30에 도시된 바와 같이, 융점들이 거의 55oC이고, 길이가~20　bp이며, 크기가~60　bp인 증폭산물을 제공하도록 프라이머들이 설계될 것이다. 형광 검출을 위하여 정방향 프라이머들은 단일 Cy3 표지를 가질 것이다. 각각의 병원체 종들에 대하여, 상기 요건들을 충족하는 여러 세트의 프라이머들을 설계할 것이다. 프라이머 설계는 다음과 같이 달성된다:
먼저, 프라이머3과 같은 프라이머-설계 프로그램을 이용하여 관심 종들 (뎅기열, 장티푸스, 말라리아, 및 HIV 뿐 아니라 λ-파지 및 MS2 대조군들)에 대한 공통-표적화, 보존 유전체 영역들에 대하여 잠재적 프라이머들 세트들이 확인될 것이다.
두 번째로, 확인된 각각의 잠재적 프라이머는 BLAST 검색을 통하여 종들-특이성에 대하여 평가될 것이다.
셋째로, 모든 다른 프라이머들 (최 근린 (nearest neighbor) 계산법을 이용)로 이량체-형성을 평가하고, 모든 요건들을 충족하는 총 30 프라이머 세트들 (4 병원체들 및 2 대조군들 각각에 대하여 5 개) 을 식별하기 위하여 MATLAB로 스트립트를 작성할 것이다.
DNA 검출을 위한 헬리카제 -의존성 증폭 ( HDA ) 최적화.
잠정적인 등온 증폭 기술 개발 성공 가능성을 최대화하기 위하여, 모델 시스템으로 λ-파지를 이용하는 상업적으로 입수 가능한 키트들 및 표준 프로토콜들로 출발할 것이다. 모델 시스템으로 인간 유전체 DNA에 첨가된 λ-파지 ~5000 사본들에 대한 등온 증폭을 수행할 수 있는 IsoAmp®키트 (New England Biosciences)을 이용할 것이다. (1) 프라이머 농도들 (0.1uM - 10uM), (2) 프라이머 길이 (20 - 26bp), (3) 증폭 온도 (50 - 65C), 및 (4) 반응 시간 (10 - 120분)을 포함한 여러 파라미터를 최적화할 것이다. 등온 반응의 효율 및 수율을 평가하고 동일한 프라이머들 및 표적 영역들을 이용하는 표준 30-사이클 PCR 반응의 수율과 비교할 것이다. 표준화 기준으로 표적 밴드 강도를 이용한 이러한 정성적 비교를 위하여 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE)을 사용할 것이다.
반응 조건들 최적화 이후, 다른 DNA 종들 (P. 팔시파룸, 및 S. 타이피)에 대한 프라이머 세트들이 효율 및 특이성에 대하여 조사될 것이다. 재차, 10, 30, 및 90분 등온 증폭에서 생성된 표적 함량을 정량화하여 (PAGE을 통하여) 각각의 프라이머 세트에 대한 증폭 효율을 평가할 것이다. 모든 다른 종들에 대한 유전체 종들의 ~5000 사본들이 첨가된 인간 유전체 DNA를 사용하여 주어진 종들에 대한 프라이머 세트로 PCR을 수행하여 특이성을 평가할 것이다. 특정한 강력한 반응들은 표적 서열만의 증폭을 보일 것이다. 각각의 종들에 대하여 설계된5 프라이머 세트들 중에서, 양호한 특이성을 보이는 가장 효율적인 3 세트들을 이용할 것이다.
한번에 하나의 표적이 존재하는 다중화 증폭 분석에 각각의 종들에 대한 3 프라이머 세트들을 사용할 것이다. 다중화 반응들을 위하여, 도 30에 도시된 형광 정방향 프라이머를 이용하여 표적 증폭을 수행할 것이다. 각각의 반응을 위하여, 각각의 증폭산물에 대한 탐침들을 가지는 바코드화 겔 입자들(도 31)과30분 배양으로 증폭산물을 정량할 것이다. 역 프라이머 및 내부 영역에 걸치도록 각각의 입자에 대한 DNA 탐침들을 설계하고, 도 31에 도시된 바와 같이 연장을 피하기 위하여 3'에 모자를 씌울 것이다 (capped). 이러한 설계로 인하여 다음 연구들에서 단일-용기 증폭/포획이 가능하다.
이상적으로는, 입자들에서 관찰되는 형광 신호들은 각각의 종들에 대하여 생성되는3 증폭산물들에 걸쳐 일관적일 것이다. 다중화 증폭에 대하여 증폭/포획 효율에서 상당한 차이가 관찰되면, 각각의 입자 탐침 영역에서 포획된 증폭산물 함량을 정규화하기 위하여 여러 반응 조건들을 변경할 것이다. 먼저, 프라이머들의 상대 함량들을 조정하여 이에 따라 반응 동력학을 변경시킨다. 둘째로, 프라이머 길이를 조정하여 결합 효율을 변화시킨다 -이것은 프라이머 Tm에 영향을 미치고 비특이적 증폭을 증가시키고, 따라서 바람직하지 않을 것이다. 셋째, 입자들 각각의 영역에서 탐침 농도를 변경시킴으로써 결합률을 예측 가능한 방식으로 조정할 수 있다는 것을 보였다.
각각의 종들에 대한 정량화 신호를 정규화 한 후, 증폭 및 혼성화가 동일 반응에서 완료되는 단일-용기 분석을 수행할 것이다. 입자들이 감도 및 프라이머 세트들 특이성에 미치는 영향을 결정할 것이다. 반응 온도 및 주기와 함께프라이머 및 탐침 서열들에 대한 반복적 최적화가 필요할 것이다. 다중화, 단일-용기 분석들의 경우에, 입자들을 정적 (현미경) 및 유체 유동 모드들에서 영상화할 것이다. 두 방법들의 감도 및 재현도를 감시하고 비교할 것이다 - 이들은 실시예 13에서 제안된 일체 시스템을 설계할 때 중요한 고려 사항이다.
원체 유전체 물질의 역전사 .
P. 팔시파룸 및 S. 타이피의 유전체 DNA를 직접 증폭할 수 있지만, 모두 ssRNA 바이러스들인 HIV-1 및 뎅기열 바이러스에 대한 검출은 증폭 및 분석용 cDNA 로의 유전체 RNA 역전사가 요구된다. 이는 역전사효소를 등온 증폭 반응에 첨가할 필요가 있다. 역전사는 헬리카제-의존성 증폭과 성공적으로 조합되었으며 [16], 등온 RT-HAD 키트들은 상업적으로 입수된다 (IsoAmp®, NE Biolabs). 이것은 앞선 연구들에서 사용된 것과 동일한 키트이다.
최적화를 위한 모델 시스템으로 파지 MS2를 이용하여 RNA 역전사 및 cDNA 증폭에 대한 표준 추천 프로토콜로 시작할 것이다. 파지 MS2에 대하여 본래 식별된 5 프라이머 세트들을 이용하여, DNA 증폭에 대하여 수행된 바와 같이 유사한 최적화를 수행할 것이다. 일단 최적화되면, 병원체 RNA 표적들에 대한 프라이머 세트들, 재차 정량화 증폭 효율 및 특이성을 평가할 것이다. 각각의 RNA 종들에 대한 3개의 최선 프라이머 세트들을 이용하여, 각각에 대하여 다중 증폭을 수행할 것이다. 재차, 정적 및 유체 유동 모드들에서 코드화 겔 입자들을 사용하여 증폭산물을 정량할 것이다.
병원체 DNA 또는 RNA 다중화 검출을 위한 단일-용기 분석 최적화.
DNA 표적들 및 RNA 표적들 양자의 다중 검출을 독립적으로 최적화하고, 이들 분석을 조합하여 성능 및 속도를 최적화할 것이다. 인간 유전체 DNA 배경을 이용하여, 시료들에 각각의 병원체의 유전체 물질을 1 - 100,000 사본들 범위의 농도들로 첨가할 것이다. 프라이머 농도들, 효소 농도, 분석 주기 (duration), 및 분석 온도를 검사하고 최적화할 것이다. 특이성, 검출 한계 및 100 사본들/rxn에서의 감도를 측정하여 각각의 병원체에 대한 분석 성능을 평가할 것이다. 목표는 60분 분석시간으로100 사본들/rxn에서 모든 병원체들에 대하여 95% 감도를 보이는 것이다.
단일 시료에서 DNA 및 RNA 종들 모두를 검출할 수 있는 단일-단계 증폭/혼성화 반응으로 등온 증폭을 이용하는 것이 이상적이지만, 덜 매력적이지만 성공 가능성이 더 높은 여러 대안적 방식이 존재한다.
예를들면, 헬리카제-의존성 증폭 (HDA)이 효과적이 아니라면, 루프-변형 (Loop-Mediated) 등온 증폭 (LAMP), 가닥-교체 증폭 (SDA), 및 핵산 서열-기반 증폭 (NASBA)을 포함한 여러 기타 등온 방법들이 연구될 것이다. 중요한 것은, NASBA-기반 분석은 HIV-1 검출용으로 FDA에 의해 이미 승인되었고 따라서 RNA 검출을 위한 명백한 다음의 선택일 수 있다. 달리, 표준 PCR이 사용될 수 있다. 실제로, PCR 증폭을 위한 미세유체 방법들은 매우 보편화되어 [30] 이러한 방식을 이용하는 것이 불가능하지 않을 수 있다. 또한, 동일 튜브에서 (역전사가 필요한) RNA 병원체들 및 DNA 병원체들을 검출하는 것이 해결하기 어려운 문제들을 일으킨다면, 이들 분석은 2개의 구분된 테스트들로 나뉠 수 있다.
일부 실시예들에서, 단일-용기 분석들의 대안으로, 2-단계 증폭/혼성화가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 임의의 방식으로 입자들이 증폭 과정과 간섭된다면, 증폭 및 혼성화를 분리하여 수행할 필요가 있다. 이러한 방법이 구현될 수 있는 카트리지-기반 시스템을 상상하면, 본 분석법은 여전히 칩-상에서 달성될 수 있지만 약간은 더욱 정교한 액체 취급이 필요할 것이다. 이것이 이상적 상황은 아니지만, 감당할 수 있고 개발 국가들에서 진단 필요성에 실제로 부응된다.
실시예 12. 다중화 병원체 검출을 위한단일 -용기 분석 검증
실시예 11에서 병원체들 다중 검출용 단일-용기 분석을 개발한 후, 임상-관련 시료들을 이용하여 이를 검증하고 핵산 기반의 병원체 진단에 있어 현재 최적 표준인 정량적 PCR에 대하여 개발된 병원체-특이적 분석들에 대하여 비교할 것이다. 이러한 목적은 본 분석법의 임상적 활용을 보이는데 중요할 것이다.
여러 협력자들로부터 대표적인 임상-관련 시료세트를 입수할 것이다. 임의의 특정 이론에 구속되지 않고, 입수되는 시료들은 잘-보존될 것이다. 이것은 특히 RNA 검출에서 중요한데 RNA는 RNase 활성때문에 빨리 분해되기 때문이다. 입수 시료가 충분하다면, Agilent Bioanalyzer로 DNA/RNA 사이징(sizing)을 통한 품질 관리를 수행할 것이다. 또 다른 가정은 이들 시료가 본 기술이 전개되는 분야에서 획득될 수 있는 대표적인 시료라는 것이다. 이상적으로, 시료들은 병원체 부하 (load) 및, 환자 면역 반응 상태의 넓은 범위를 포괄하는 것이다.
본 분석을 검증하는 여러 단계들이 있다. 먼저, 전혈로부터 핵산들을 정제하는 다양한 방법들을 연구하고 각각의 병원체에 대한 본 분석과의 적합성을 결정할 것이다. 이것은, 본 초기 연구 프로젝트가 완료된 후 어떠한 정제 기술들이 본 플랫폼과 통합될 것인지를 결정하는데 중요할 것이다. 이상적으로는 모든 병원체들에 대하여 양호하게 수행되는 하나의 분리 기술을 선택하고, 이를 모든 검증 테스트들에 대하여 이용할 것이다. 협력자들에 의해 제공된 임상 시료들 (혈액 또는 혈장)로부터 핵산들을 정제하고 본 단일-용기 테스트 및 상업적으로 입수되는 병원체 qPCR 키트들을 이용하여 시료들을 테스트할 것이다. 이로써 현재 분 분야의 기술 상태에 대한 본 분석의 직접적인 비교가 가능하다. 검증 과정의 각 부분에 대한 상세 사항들이 하기된다.
핵산 정제 기술 평가. 전혈, 혈장, 또는 혈청에서 핵산들을 추출하는 여러 방법들이 있다. 대부분의 키트들은 RNA 또는 DNA에 특이적이고, 몇몇 키트들은 양자 모두를 추출하기 위하여 사용된다. 다음을 포함하는 여러 상업적 입수 가능한 키트들을 조사할 것이다:
DNA 추출: QIAamp Blood DNA Mini 추출 키트 (QIAGEN), 유전체 DNA 추출 키트 (Bioneer), Extract-N-Amp Blood PCR 키트들 (Sigma).
RNA 추출: QIAmp 바이러스 RNA Mini 추출 키트 (QIAGEN), 바이러스 RNA 추출 키트 (Bioneer).
DNA 및 RNA 동시 추출: QIAamp MinElute Virus Spin 키트, QIAamp UltraSens Virus 키트, NucleoSpin Virus 키트 (Macherey-Na겔).
분명한 것은, 다중화 분석용 최적 모드는 병원체 DNA 및 RNA의 병렬적 분리를 위한 단일 추출 방법을 사용하는 것이다. 본 단일-용기 분석과 양호하게 기능하는 이중 핵산 추출을 위한 방법 확인 및 최적화에 상당한 노력을 기울일 것이다. 적합성 평가를 위하여, 각각의 병원체를 함유하는 잘-특성화된 임상 시료들을 이용하여 각각의 키트들로 추출할 것이다. 계속하여 시료들을 본 단일-용기 분석법으로 평가하고 또한 각각의 병원체에 대하여 특정 설계된 qPCR 키트들을 이용하여 검증할 것이다.
qPCR 과 직접 비교되는 임상 시료들에 대한 분석. 임상 시료들로부터의 핵산들 (각각의 병원체 유형에 대하여 최소한 30)을 상기 절에서 결정된 최적 방법으로 정제할 것이다. 각각의 시료에 있는 병원체들 검출을 위한 단일-용기, 다중화 분석을 행하고 각각의 병원체에 대하여 특정 설계된 qPCR 분석들과 결과를 비교할 것이다. 4개의 피검 병원체들 중 3개에 대하여, 가용되는 여러 qPCR 키트들이 있다. 이러한 목적에 도달할 때, 최적 성능을 보이는 키트를 선택하고 진단 테스트 인증을 받는다:
뎅기열: Primer Design, Ltd. 및 Genome Diagnostics
말라리아: Primer Design, Ltd., AccuPower, 및 Genome Diagnostics
HIV -1: Primer Design, Ltd. 및 Genome Diagnostics
장티푸스: 알고 있는 범주에서, S. 타이피에 대한 상업적으로-가용되는 qPCR 분석은 없다. 본 프로젝트 목적에 도달할 때까지 테스트가 개발되지 않으면 qPCR을 대체하여 사용될 수 있는 Kumar 등 [11]에 의한 다중화 PCR-기반 방식이 있다.
감도에 대한 상대 비교를 위하여, 각각의 병원체 유형에 대한 대표적인 시료에 대하여 일련의 희석화를 진행하고 본 분석법 및 qPCR 표준을 이용하여 이들을 분석할 것이다. 본 분석 결과들 및 현재 기술 상태 간 강한 상관성이 검증에서 중요하다. If 본 분석법이 예상보다 덜 바람직하게 수행되면, 표적 영역들, 프라이머 설계, 및 분석 조건들을 재평가하여 분석 문제점을 해결할 것이다. 임의 문제를 해결하기 위하여 협력자들과 기밀하게 작업할 것이다.
실시예 13: 통합 시스템 기술 검증 개발
분석법을 성공적으로 개발한 후, 칩에 구현되는 분석 방법들에 대한 개념화를 개시하는 것이 중요하다. 이러한 이유로, 단일-용기 분석을 수행하고 단일 챔버에서 입자들을 분석하기 위한 방법을 개발할 것이다. 이를 위하여 정적 입자 분석을 위한 형광 영상화 또는 유체 유동 분석을 위한 신속한 신호 획득 성능을 갖춘 정밀 온도 제어가 가능한 통합 시스템 개발이 요구된다. 본 시스템으로 입자들에 대한 주기적 분석이 가능하여 반응 상황을 평가할 수 있따. 종말점 분석에 대하여 상당한 개선 방법으로, 본 분석 방법을 교정하면 병원체 부하에 대한 정밀한 정량 분석을 제공할 수 있다고 보여진다. 본 실시예에서, 병원체 핵산들을 정확하게 정량할 수 있는 신속한, 단일-용기 분석들을 수행하는 통합 시스템을 개발하는 것이 목표이다.
가장 간단한 초기 방법으로서, 현미경에서 정적 영상화할 수 있는 상업적으로-입수 가능한 온도-제어 세포 관류 챔버를 이용할 것이다. 병원체 검출을 위한 단일-용기 챔버 반응 사용을 평가하고 주기적 영상 분석으로 정량 분석 수행 가능성을 평가하기 위한 여로 연구들을 진행할 것이다. 성공적으로 구현한 후, LED 조명원 및 영상 획득용 CCD 카메라를 가지는 자립형 장치에 가열 유동 챔버를 통합시킬 것이다. 이는 궁극적으로 개발 도상국에 배치될 카트리지-기반 시스템 개발에 있어 중요한 단계이다. 본 목적을 위한 특정 활동들에 대한 상세 사항이 하기된다.
가열 유동셀에서의 단일-용기 분석들. Bioptechs에서 판매되는 것과 유사한 상업적으로-입수되는 가열 유동셀을 사용할 것이다. 이들 유동셀의 특징은 (1) 주문형 채널 설계, (2) 시료 도입을 위한 다중 인터페이스들, (3) +/- 0.2oC 안정도를 가지는 정밀 온도 제어, 및 (4) 임의의 현미경에 장착될 수 있는 표준 설계라는 점이다. 초기에는, 동정 및 분석용 간단한 직사각형 유동 챔버를 활용할 것이다. 관심 시료, 등온 증폭 시약들, 및 각각 4 병원체들 및 2 대조군에 대한~50 입자들을 포함하는 반응 혼합물을 미리 혼합할 것이다. 기구를 등온 증폭 온도 (~55oC)로 예열하고 반응 혼합물을 반응 챔버로 투입할 것이다. (넓은 시야를 위한) 5X 대물렌즈, 단일 여기 색, 및 단일 검출 색을 가지는 표준 도립 현미경을 이용하여, 증폭 과정에서, 예를들면 매 5 분 마다 입자들을 영상화할 것이다. 각각의 영상을 분석하고 탐침-영역 형광에 기반하여 생성된 각각의 증폭산물 함량을 추정할 것이다. 60분 반응 후, 이러한 동적 데이터를 사용하여 초기 존재하는 주형 함량을 추정할 것이다. 기술 검증을 위하여, 시스템 성능 및 정량 데이터 제공 능력을 특성화할 수 있도록2 대조군들, λ-파지 DNA 및 파지 MS2를 사용할 것이다.
통합 분석/스캐닝 시스템 설계 및 제작. 현미경-기반 시스템이 성공적으로 구현된 후 유동셀을 주문형 광학 시스템에 통합할 것이다. 균일한 LED 조명, 저-배율 렌즈, 및 CCD 칩을 활용할 것이다. 제어, 영상 획득, 및 분석을 위하여 LED 배열, CCD, 및 가열 유동셀을 랩톱 컴퓨터와 연결시킬 것이다. 본 유닛을 완벽하게 테스트하고, 결과들을 본 프로젝트에서 이미 얻은 결과들과 비교할 것이다. 본 장치를 이용하여 각각의 병원체 검출 감도 및 특이성을 재평가할 것이다. 또한 1 - 1M 사본들의 표적들을 첨가하여 시스템의 정량적 동적 범위를 검토할 것이다. 통합 시스템에서 성능이 제대로 작동한다고 보장되도록 대책을 강구할 것이다.
문헌 및 유사한 자료들 형태와는 무관하게, 특허, 특허출원, 기사, 서적, 논문, 대학논문 및 웹 페이지를 포함한, 본원에서 인용된 모든 문헌 및 유사한 자료들은 본원에 전체가 참조로 명시적으로 포함된다. 정의된 용어들, 용어 활용, 기재된 기술, 또는 기타 등을 포함하여 상기 포함된 하나 이상의 문헌 및 유사한 자료들이, 본원과 다르거나 모순되는 경우, 본원이 우선한다.
본원에서 사용된 절의 제목은 명세서 구성 목적만을 위한 것이고 어떠한 방식으로도 본원의 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
기타 실시예들 및 균등론
다양한 구현예 및 실시예들와 연계하여 본 발명을 설명하였지만, 이러한 구현예들 또는 실시예들에 국한되지 않는다. 이와는 반대로, 본 분야의기술자들에 의해 인지되는 바와 같이 본 발명은 다양한 대안들, 변형들, 및 균등들을 포괄한다. 따라서, 설명, 방법들 및 도면들은 명시적으로 언급되지 않는 한 기재 순서에 제한적으로 독해되어서는 아니된다.
본 발명은 소정의 실시예들을 설명하고 예시하였지만, 본 발명은 이러한 특정 실시예들에 국한되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 오히려, 본 발명은 설명되고 예시된 특정 실시예들 및 특징부들의 기능적 및/또는 균등적 모든 실시예들을 포함하는 것이다.
청구범위는 다음과 같다:
SEQUENCE LISTING <110> Firefly Bioworks, Inc. <120> Scanning Multifunctional Particles <130> 2009677-0005 <150> US 61/352018 <151> 2010-06-07 <150> US 61/365738 <151> 2010-07-19 <150> US 61/387958 <151> 2010-09-29 <160> 39 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe sequence for let-7a <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' acrydite <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> 3' inverted dT <400> 1 gatatatttt aaactataca acctactacc tcat 34 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe sequence for miR-21 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' acrydite <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> 3' inverted dT <400> 2 gatatatttt atcaacatca gtctgataag ctat 34 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe sequence fof miR-29b-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' acrydite <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> 3' inverted dT <400> 3 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(1)..(1) <223> 5' acrydite <400> 25 aataatgtgc ccaataaggg 20 <210> 26 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCode 1 adapter Cy3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' phosphate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> 3' Cy3Sp <400> 26 gtgtttatta 10 <210> 27 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCode 1 adapter invdT <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' phosphate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> 3' inverted dT <400> 27 gtgtttatta t 11 <210> 28 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCode 2 adapter Cy3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' phosphate <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' Cy3Sp <400> 28 cacattatta 10 <210> 29 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCode 2 adapter invdT <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' phosphate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> 3' inverted dT <400> 29 cacattatta t 11 <210> 30 <211> 20 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Claims (68)

  1. (a) 유세포분석기로 다수의 다중 기능성 입자들을 조사하는 (interrogating) 단계로서, 각각의 다중 기능성 입자는 (i) 제1 검출 가능한 표지를 갖는 하나 이상의 코드화 영역 및 (ii) 제2 검출 가능한 표지를 갖는 하나 이상의 탐침 영역을 포함하고, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 서로 구분되고, 각각의 영역은 검출 가능하지 않은 간격자(spacer)에 의해 공간적으로 다른 영역으로부터 이격되어, 영역들이 예정(pre-determined) 촉발 역치 초과의 일련의 이산 현상들로서 검출가능하고, 각각의 입자가 유세포분석기의 투사 레이저 광선을 통해 흐를 때 하나 이상의 코드화 영역 및 하나 이상의 탐침 영역이 상이한 시간에 조사되는, 단계;
    (b) 일련의 이산 현상들을 기록하는 단계로서, 각각의 이산 현상은 형광 신호, 산란 신호, 또는 형광 및 산란 신호를 포함하는, 단계;
    (c) 현상들을 각각의 현상들에 대해 측정된 형광 수준의 패턴들에 기초하여 분류하는 단계; 및
    (d) 분류된 현상들에 따라 다수의 다중 기능성 입자들을 특성화하는 단계를 포함하는, 다중 기능성 입자들을 특성화하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 입자들은 비드들, 파지들, 거대분자들, 세포들, 미생물들, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다수 현상들은 비-동시적으로 기록되는, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 개별 입자는 비-검출 가능한 영역으로 분리된 두개의 코드화 영역 및 하나의 탐침 영역을 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 코드화 영역, 탐침 영역, 또는 코드화 및 탐침 영역은 형광체들로 표지화된, 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나의 검출 가능한 신호 수준은 다른 신호 크기(magnitude)를 조정(scale)하기 위하여 사용되는, 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조사 영역들이 산란 유발 형광 개체를 포함하여 형광 산란 신호가 현상 기록 촉발에 이용되는, 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 코드화 영역은 상이한 색들의 둘 또는 초과의 형광체들로 표지화된, 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 검출 가능한 표지는 제1 형광 물질이고, 제2 검출 가능한 표지는 제2 형광 물질이며, 제1 형광 물질 및 제2 형광 물질은 상이한 방출 스펙트럼을 갖는, 방법.
  10. (a) 다수의 다중 기능성 입자들을 하나 또는 초과의 표적 검체들을 포함하는 시료와 혼합하는 단계로서, 각각의 개별 입자는 (i) 제1 검출 가능한 표지를 가지는 하나 이상의 코딩 영역 및 (ii) 제2 검출 가능한 표지를 가지는 하나 이상의 탐침을 포함하고, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 서로 구분되고, 각각의 영역은 검출 가능하지 않은 간격자에 의해 공간적으로 다른 영역으로부터 이격되어, 각각의 영역이 예정 촉발 역치 초과의 일련의 이산 현상들로서 검출가능하고, 탐침 및 이에 해당하는 하나 또는 초과의 표적 검체들 사이의 결합은 탐침을 포함하는 하나 이상의 탐침 영역과 연관된 해당 현상을 변경시키는, 단계;
    (b) 제1항의 방법에 따른 다수의 다중 기능성 입자들을 특성화하는 단계;
    (c) 각각의 다중 기능성 입자에 대한 현상들을 분류하는 단계; 및
    (d) 대조군과의 비교에 의해 각각의 다중 기능성 입자에 대한 현상들의 분류로부터의 분류 결과에 기초하여 변경된 현상들의 검출에 의해 하나 또는 초과의 표적 검체들의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 시료에서 다수 검체들을 검출하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 방법은 코드화 영역들에 연관된 현상들을 이용하여 코드를 각각의 입자와 연관시키는 단계를 추가로 포함하고, 각각의 입자에 대한 코드는 부분적으로 현상 폭, 형광 또는 산란 높이, 형광 또는 산란 면적, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 결정되는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 방법은 해당하는 탐침을 포함하는 조사 영역들에 연관된 현상들에서 형광 신호들, 산란 신호들, 또는 형광 및 산란 신호들을 결정함으로써 결합된 표적 검체 함량을 정량하는 단계를 추가로 포함하고, 결합된 표적 검체의 함량은 부분적으로 현상 폭, 형광 또는 산란 높이, 형광 또는 산란 면적, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 결정되는, 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 시료는 세포들, 조직, 전혈, 혈장, 혈청, 요 (urine), 대변, 타액, 제대혈, 융모막 융모 시료들 양수, 자궁경부 세척액, 암 및 종양 세포들을 포함하는 질환 세포들 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는, 방법.
  14. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 초과의 표적 검체들은 단백질들, 펩티드들, 호르몬들, 합텐들, 항원들, 항체들, 수용체들, 효소들, 핵산들, 다당류들, 화학물질들, 중합체들, 병원체들, 독소들, 유기약물들, 무기약물들, 세포들, 조직들, 미생물들, 바이러스들, 세균, 곰팡이, 조류, 기생충들, 알레르겐들, 오염원들, 및 이들의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 하나 또는 초과의 표적 검체들은 DNA; RNA; 또는 DNA 및 RNA의 임의의 조합; 유전자의 일부; 조절 서열; 유전체 DNA; cDNA; mRNA, rRNA, 및 microRNA를 포함하는 RNA; 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함하는 핵산들인, 방법.
  16. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 초과의 표적 검체들은 시료 내에 0.1 amol - 10,000 amol 범위의 농도로 존재하거나, 하나 또는 초과의 표적 검체들은 시료 내에 100 amol 미만의 농도로 존재하거나, 하나 또는 초과의 표적 검체들은 시료 내에 총 핵산들의 1% 미만의 농도로 존재하는, 방법.
  17. 제1항, 제2항 및 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 기능성 입자는 수화겔 입자인, 방법.
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