KR102052853B1 - 핵산서열 검출 방법, 다중 핵산마커 검출 방법 및 이를 위한 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다중 핵산서열 검출 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 부호화부를 포함하는 부호화 입자 및 상기 부호화 입자와 연결된 바코드 리셉터를 포함하고; 상기 부호화 입자는, 타겟인 바코드에 포함된 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 C-바코드부, 리포터, 이중 가닥 형성 시 제한효소가 작용할 수 있는 염기서열을 포함하는 제한효소 인식 서열부 및 상기 리포터와 상호작용을 할 수 있는 퀀처를 포함하는 단일 가닥을 포함함으로써, 혼합된 다양한 종류의 핵산 물질을 빠르고 정확하게 분석할 수 있다.

Description

핵산서열 검출 방법, 다중 핵산마커 검출 방법 및 이를 위한 키트 {METHOD FOR SIMULTANEOUS DETECTION OF MULTIPLE NUCLEIC ACID SEQUENCES, METHOD FOR ANALYZING MULTIPLE NUCLEIC MARKERS AND KIT FOR THE SAME}

본 발명은 복수의 타겟 핵산서열을 동시에 검출할 수 있는 다중 핵산서열 검출 방법, 다중 핵산서열 검출에 의한 다중 핵산마커 검출 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것이다.

생체분자들에 대한 다중 검출은 임상 진단, 발견 및 기초과학에 있어 매우 중요하고, 생체분자 중 핵산 마커는 최근 중요성이 더 높아지고 있다. ctDNA, miRNA, virus 등은 각종 질병 확인 및 치료를 위한 마커로서 활용범위가 증가하고 있으며, 임상에서는 단시간 내에 단일 분석이 아닌 수십 여개의 다중 핵산서열 검출이 가능하면서도 더 정확하면서도 더 빠른 분석이 요구되고 있는 실정이다.

종래의 미세배열 (microarray) 방식들은, 칩의 배열된 스팟-웰에 증폭된 생체 분자 용액을 떨어뜨리고 인큐베이터 내에 두고서 장시간 반응을 기다리면, 유동하는 타겟 물질이 확산에 의해 스팟-웰의 바닥에 고정된 리셉터(receptor)에 결합되고 이후 이를 검출하는 방식이다. 이는 동시에 수만 가지의 생체 분자를 검출할 수 있으나, 수동적인 검출 방법으로, 낮은 처리율, 최소 24시간 이상의 검출 시간, 복잡성 등에 의해 임상의 요구에 부합하지 못하고 있다.

REAL TIME PCR 기반 전략들은 비교적 단시간 내에 검출이 가능하지만, 표지자 수에 따라 다중 분석이 가능하여 동시 검출의 한계점이 명확하다. 즉, 다중 타겟 검출에서 서로 상이한 타겟 서열에 대하여 서로 상이한 종류의 형광 리포터를 필요로 하며, 이러한 형광 (reporter)의 종류 수의 한계와 스펙트럼 분석의 한계 때문에 검출되는 타겟 서열의 수는 5개 이하로 제한된다. 의심 질환 진단이나 검사를 하기 위해 필요한 십여 개 이상의 타겟서열에 대한 검사를 수행하기 위해 REAL TIME PCR 방법들은 시료 샘플을 다수 용기(container)에 나누어 각기 별개의 프로브 등을 포함한 검사 키트를 이용하여 반응시켜야 하므로, 사용자 편의성 및 신뢰도가 떨어지고 많은 샘플이 소요되는 문제가 있다. 따라서, 소량의 단일 생체 샘플을 이용하여 최소 10개 이상의 타겟 핵산서열에 대한 동시 검출을 빠른 시간 내에 함으로써 사용자 편의성 및 신뢰성이 있으면서 동시에 실효성 있는 진단을 하고자 하는 임상적 필요를 충족하지 못하고 있다.

그 밖에 차세대 시퀀싱 방법이 최근 각광을 받고 있지만, 이 방법 역시 복잡성, 표지자 수 한계성, 고비용 등 여전히 현장에 적용하기 어렵다.

따라서 표지자 수 한계성 및 낮은 처리율, 복잡성을 극복하면서 저비용으로 수십 개 이상의 핵산 마커를 단시간 내에 동시에 검출하여 분석 및 진단이 가능한 개선된 방법들이 요구된다.

한국등록특허 제10-1758145호

본 발명은 상기 과제들을 해결하여 혼합된 다양한 종류의 핵산 물질을 빠르고 정확하게 분석 가능한 다중 핵산서열 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 과제는 전술한 다중 핵산서열 검출 방법을 실시하기 위한 핵산서열 검출용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 과제는 저비용으로 동일한 용기 내에서 수 내지 수백 가지 종류의 핵산 물질을 단시간 내에 동시에 검출하여 분석할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 측면에 의한 타겟 핵산서열을 검출하는 방법은 (a)타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브 부위 및 상기 타켓 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바코드 부위를 포함하는 바코드 프로브(Barcode probe)와, (b)바코드 리셉터-부호화 입자(Barcode receptor-Encoding particle, BREP)를 사용하여, 핵산 또는 핵산 혼합물을 포함하는 시료로부터 타겟 핵산서열을 검출하는 방법으로서, 다음의 단계들을 포함한다.

(A) 상기 타겟 핵산서열을 업스트림 프라이머 및 바코드 프로브와 혼성화 시키는 단계로서; 상기 프로브 부위는 타겟 핵산서열에 혼성화되고, 상기 바코드 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않고, 상기 업스트림 프라이머는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하되 상기 바코드 프로브 보다 업스트림에 위치하는 단계;

(B) 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (A)의 결과물을 접촉시켜 상기 바코드 프로브를 절단하는 단계로, 상기 업스트림 프라이머는 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 연장가닥 형성 및 상기 바코드 프로브의 절단을 유도하여 상기 바코드 프로브의 바코드 부위를 방출하는 단계;

(C) 상기 방출된 바코드 부위를 상기 바코드 리셉터-부호화 입자와 혼성화시키는 단계로서; 바코드 리셉터-부호화 입자는 부호화 입자에 결합된 바코드 리셉터를 포함하고, 상기 바코드 리셉터는 올리고뉴클레오타이드로서, 상기 부호화 입자에 결합된 부분부터 순차로 i)상기 바코드 부위를 혼성화 시킬 수 있는 상보적인 서열을 가지는 C-바코드부, ii)상기 바코드 프로브의 바코드 부위 및 프로브 부위 각각에 비-상보적 서열을 갖는 연장서열부, 및 iii) 상기 바코드 프로브의 바코드 부위 및 프로브 부위 각각에 비-상보적 서열을 갖는 제한효소 인식 서열부를 포함하고; 상기 바코드 리셉터에 화학적으로 합성되어 있는 리포터(reporter)를 포함하되, 상기 리포터는 상기 제한효소 인식 서열부 보다 업스트림에 위치하고, 상기 제한효소 인식 서열부에 화학적으로 합성되고 상기 리포터를 제어하는 퀀처(quencher)를 가지는, 방출된 바코드 부위의 혼성화 단계;

(D) 상기 단계 (C)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서, 상기 C-바코드부와 혼성화된 상기 바코드 부위가 연장되어 상기 연장서열부 및 제한효소 인식 서열부와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥이 생성되어 연장이합체를 형성하는 단계;

(E) 제한효소에 의해, 상기 단계 (D)의 결과물인 상기 연장이합체에서 제한효소 인식서열부의 연장이합체를 절단하는 단계로서; 제한 효소에 의해 제한효소 인식서열부와 그에 합성된 퀀처가 동시에 제거되는 단계; 및

(F) 상기 단계 (E)에서의 절단 반응의 발생으로 인해 상기 퀀처가 제거됨으로써 제어된 리포터가 발생시키는 신호를 측정하는 단계로서, 상기 절단 반응의 발생은 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타내고, 상기 신호를 검출하여 타겟 핵산서열의 존재를 확인하는 단계.

상기 부호화 입자는 다공성 또는 비 다공성 재질의 마이크로미터 사이즈의 고체 입자로서 패턴이 형성되어 코드화되어 있는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명의 일 측면에 의한 타겟 핵산서열을 검출하는 방법은,

(G) 상기 단계 (E)의 결과물에 대한 현미경 관찰을 통해 상기 부호화 입자의 코드를 광학적으로 측정하는 단계로서; 상기 코드는 상기 타겟 염기서열과 1:1 대응 관계로서, 상기 부호화 입자의 코드를 측정하는 단계; 및

(H) 상기 (F) 단계의 측정 결과를 상기 (G) 단계의 측정 결과와 함께 처리하여 상기 타겟 염기서열과 대응 관계인 코드를 식별함으로써, 타겟 염기서열의 존재를 판단하는 단계;를 더 포함하는 것이 바람직하다.

상기 타겟 핵산서열은 DNA 또는 RNA에 존재하는 핵산서열이고, 상기 방법은 단일 용기 내에 존재하는 복수 개의 상기 타겟 핵산서열을 검출할 수 있고, 바람직하기로는 10 개 이상 100개 이하의 타겟 핵산서열을 동시에 검출할 수 있다.

상기 업스트림 프라이머는 올리고 뉴클레오타이드이며 중합효소 연쇄 반응 기술 (PCR) 및 실시간 중합효소 연쇄 반응 기술 (real-time PCR)에서 포함되는 중합반응 개시를 위한 프라이머인 것이 바람직하다.

상기 바코드 프로브의 말단은 연장을 제어하기 위해 탄소 사슬 또는 퀀처를 갖는다.

상기 리포터는 상기 퀀처와 소정의 거리 이상 이격될 경우 시각적 또는 비시각적으로 외부에서 인식할 수 있는 신호를 발생시킬 수 있다.

상기 바코드 프로브는 올리고 뉴클레오타이드이며, 서열 길이는 10~100 bp 로 제조될 수 있으며, 바코드 부위는 BREP과의 효율적 혼성화 반응을 위해 약 10 내지 80 의 길이를 갖는 것이 바람직하다.

상기 부호화 입자는 코드 식별을 위해 하나 이상의 기준 점과 하나 이상의 홀을 포함하는 것이 바람직하다.

상기 부호화 입자는 PEG 성분을 기반으로 제조된다.

본 발명의 일 측면에 의한 타겟 핵산서열을 검출하는 방법의 상기 단계들은 동일한 하나의 용기 내에서 실시되고, 상기 하나의 용기는 바이오 실험에서 사용되는 1.5 ml 샘플 튜브, 0.2 ml PCR 튜브, 세포 계측용 마이크로 칩 챔버, 웰 플레이트 등을 포함한다.

본 발명의 일 측면에 의한 타겟 핵산서열을 검출하는 방법은 복수개의 타겟 핵산마커 증폭을 위한 복수개의 프라이머 쌍, PCR 버퍼 폴리머라제, dNTP를 이용하는 것이 바람직하다.

복수개의 타겟 핵산서열의 증폭을 위해 PCR용 온도 가변 장치 (Thermal cycler)를 사용한다.

상기 바코드 프로브는 변성과정에서 분리된 단일가닥의 핵산마커에 결합되고, 프라이머에 의한 연장 단계에서 프로브 부위가 제거되고, 바코드 부위는 상기 단일가닥으로부터 분리되어 나오게 되고, 증폭 횟수에 따라 동일하게 바코드 부위도 증폭 생산된다.

상기 (A) 및 (B) 단계의 반복에 의해 복수개의 타겟 핵산서열의 증폭이 완료된 후 BREP와 제한효소가 포함된 용액을 추가로 첨가하여 상기 (C) 내지 (F)를 실행하는 것이 바람직하다. 이 경우, 타겟 핵산서열 및 바코드 부위의 증폭 완료 후에 BREP이 부가되므로 C-바코드부에 상보적 결합이 되는 바코드 부위 단편과 바코드 프로브의 경쟁이 줄어들게 되어 형광 검출 강도가 높아질 수 있다.

그러나 대안적으로 처음 (A) 단계부터 BREP와 제한효소를 프라이머 및 바코드 프로브와 함께 시료에 투입할 수도 있다.

타겟 핵산서열과 대응하는 바코드 프로브 및 BREP는 연동되게 설계되어, 하나의 타겟 핵산서열에 대해, 상보적인 프로브 부위, 이와 결합되는 바코드 부위, 바코드 부위와 상보적인 C-바코드부, BREP의 코드는 서로 관련되고(correlated), 서로 다른 타겟 핵산서열에 대한 바코드 프로브 및 BREP의 코드는 상이하다.

BREP와 제한효소가 포함된 상기 용액에는 타겟 핵산서열당 이를 검출하기 위한 대응하는 BREP이 5 ~ 50개 포함된다. 타겟 핵산서열이 10개 이상인 경우 각기 대응하는 BREP이 5 ~ 50개 포함되므로 총 50~ 500개의 BREP가 1회 검출을 위해 이용될 수 있다.

상기 부호화 입자와 상기 C-바코드부 사이에 링커(linker)가 포함되는 것이 바람직하다. 이는 방출된 바코드 부위의 혼성화 시에 공간적 제약 문제를 해결할 수 있다.

상기 (A) 및 (B) 단계를 포함하는 사이클의 반복에 의해 증폭된 바코드 부위(방출된 바코드 단편)가 상보적 염기서열을 가진 C-바코드 부를 가지는 바코드 리셉터-인코딩 입자와 혼성화 (Hybridization) 되는 단계에서, 타겟 핵산서열이 분석 시료에 존재하지 않아 바코드 프로브로 존재할 경우 상보적 C-바코드 부를 가진 BREP와 혼성화가 되지만, 프로브 부위의 존재로 인해 연장이 제한된다. 따라서, 이 경우에는 바코드 리셉터의 연장서열부 및 제한효소 인식서열부에 연장이합체가 형성되지 않아 절단 반응이 일어나지 않으므로 퀀처가 유지되고 리포터의 신호를 검출할 수 없고 부호화 입자의 코드만 확인이 된다. 즉, 코드만 확인되고 리포터(형광물질)의 신호(형광)이 관찰되지 않을 경우 해당 타겟 핵산서열은 시료에 존재하지 않는 것이다.

측정을 위한 형광 현미경 장치는 코드 식별을 위한 일반 조명 모드와 형광 측정을 위한 형광 조명 모드를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 바코드 프로브 (Barcode probe)와 바코드 리셉터-부호화 입자(Barcode receptor-Encoding particle, BREP)를 사용하여 타겟 핵산서열을 검출하는 방법은 다음의 단계들을 포함한다.

(a) 타겟 핵산마커를 변성화하고, 상기 타겟 핵산마커의 변성에 의한 제 1 단일가닥 핵산 서열 (3’--> 5’)을 포워드 프라이머(forward primer) 및 바코드 프로브와 혼성화 시키는 단계로서; 상기 포워드 프라이머는 상기 제 1 단일가닥의 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 바코드 프로브는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-프로브 부위 및 상기 타켓 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-바코드 부위를 포함하며; 상기 3’-프로브 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화 되고, 상기 5’-바코드 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 포워드 프라이머는 상기 3’-프로브 부위 보다 업스트림 핵산서열에 위치하고; 리버스 프라이머 (Reverse primer)는 상기 타켓 핵산마커의 변성에 의한 제 2 단일가닥 핵산 서열 (5’--> 3’)에 혼성화 되는 단계;

(b) 상기 바코드 프로브의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서, 상기 포워드 프라이머의 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 형성된 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 상기 바코드 프로브의 절단을 유도하여 상기 바코드 프로브의 5’-바코드 부위만을 방출하며; 동시에 상기 리버스 프라이머는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 제 2 단일가닥의 상보적인 제 2 연장가닥을 형성하는 단계;

여기에서, (a), (b) 단계의 상기 변성과 혼성화, 연장의 사이클 (cycle)이 연쇄 반복되어 제 1 및 2 연장가닥과 5’-바코드 부위는 사이클 수에 비례하여 복제 생산된다.

그 다음으로, (c) 상기 바코드 프로브로부터 방출된 상기 5’-바코드 부위를 상기 바코드 리셉터-부호화 입자와 혼성화 시키는 단계로서, 상기 BREP은 부호화 입자에 복수 개의 바코드 리셉터가 공유 또는 비공유 결합에 의해 결합되고, 상기 바코드 리셉터의 3’말단은 상기 부호화 입자에 결합되어 있으며; 상기 부호화 입자는 다공성 또는 비 다공성 재질의 수~수백 마이크로미터 사이즈의 고체 입자로서 표면에 패턴이 형성되어 코드화되어 있으며; 상기 바코드 리셉터는 올리고뉴클레오타이드로서 3’--> 5’순서로 고체 표면으로부터, i) 상기 방출된 바코드 부위의 혼성화 시 공간적 제약문제를 해결할 수 있는 링커 (linker)물질, ii)상기 방출된 5’-바코드 부위를 혼성화 시킬 수 있는 상보적인 서열을 가지는 C-바코드 부, iii)상기 바코드 프로브의 5’-바코드 부위 및 3’-프로브 부위 각각에 비-상보적 서열을 갖는 연장서열부, 및 vi) 상기 연장서열부의 5'말단 영역에는 연장 후 제한효소에 의해 절단될 수 있는 제한효소 인식 서열부를 포함하고, 상기 C-바코드 부 또는 연장서열부에는 형광물질이 화학적으로 합성되어 있고, 상기 형광물질의 형광을 상시 제어하기 위한 퀀처가 상기 제한효소 인식 서열부에 합성되어 있으며; 상기 방출된 5’-바코드 부위는 BREP의 상기 C-바코드부에 혼성화 되고;

(d) 상기 단계 (c)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서; 상기 C-바코드부에 혼성화된 상기 5’-바코드 부위는 연장되어 상기 연장서열부 및 제한효소 인식 서열부와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥이 생성되어 연장이합체를 형성하며;

(e) 상기 단계 (d)의 결과물인 상기 연장이합체 중 제한효소 인식 서열부의 연장이합체를 제한효소가 절단할 수 있는 조건 하에서 접촉시켜 절단하는 단계로서, 제한효소 인식 서열부와 그에 합성되어 있는 퀀처가 동시에 제거되는 단계; 및

(f) 상기 단계 (e)의 결과물인 BREP을 일반적인 백색광 또는 상기 형광물질의 형광 여기 파장이 아닌 단색광을 조사한 상태에서 현미경 관찰을 통해 코드를 식별하는 단계 및 (e)의 결과물인 BREP을 형광 여기 파장의 광 조사에 의한 현미경 관찰을 통해 형광 신호의 유무 및 정도(abundance)를 확인하는 단계.

상기 형광 신호를 확인하는 단계는 상기 절단 반응의 발생으로 인하여 제어된 상기 형광물질로부터 퀀처가 제거됨으로써 발생하는 형광 신호를 검출하고, 따라서 상기 절단 반응의 발생은 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.

상기 (a) 내지 (f) 단계는 동일한 하나의 용기 내에서 실행되는 것이 바람직하다.

상기 코드는 홀 또는 음각으로 표시되고, 상기 타겟 핵산서열과 상기 코드는 1:1 대응관계이고, 상기 단계 (a) 및 (b)의 변성과 혼성화, 연장의 사이클 (cycle)이 연쇄 반복되어 제 1 및 2 연장가닥과 5’-바코드 부위는 사이클 수에 비례하여 복제 생산된다.

상기 (f) 단계는, 일반적인 백색광 또는 상기 형광체의 형광 여기 파장이 아닌 단색광을 조사한 상태에서 현미경 관찰을 통해 BREP의 코드를 식별하는 단계; 및 상기 단계 (e)의 결과물인 BREP을 형광 여기 파장의 광 조사에 의한 현미경 관찰을 통해 형광 신호의 유무 및 세기(intensity)를 확인하는 단계;를 포함한다.

상기 형광 신호는 단계 (e)에서의 절단 반응의 발생으로 인해 상기 퀀처가 제거됨으로써 제어된 형광물질이 발생시키는 신호이고, 상기 형광 신호의 유무와 세기(intensity)를 확인함으로써 타겟 핵산서열의 존재를 확인한다.

상기 타겟 핵산마커는 DNA 또는 핵산 혼합물이고, 복수개이며, 바람직하게는 5개 내지 100개이고,

타겟 핵산마커 증폭이 완료된 후 BRET과 제한효소가 포함된 용액을 추가로 첨가하고, 상기 용액에는 하나의 핵산마커당 상보적인 BREP이 5~20개 포함된다.

본 발명의 또 다른 일 측면에 의하면, 복수의 타겟 핵산서열를 동시에 검출하기 위한 다중 핵산서열 검출 키트는,

(a) 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-프로브 부위 및 상기 타켓 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-바코드 부위를 포함하는 바코드 프로브 (Barcode probe); 및

(b) 부호화 입자와 바코드 리셉터로 구성된 바코드 리셉터-부호화 입자(Barcode receptor-Encoding particle, BREP)로서, 상기 부호화 입자는 다공성 또는 비다공성 재질의 고체 입자로서 마이크로미터 사이즈의 크기를 가지고 입자에 형성된 패턴 형상에 의해 부호화 되며; 상기 부호화 입자에 하나 이상의 바코드 리셉터가 공유 결합 또는 비공유 결합으로 3’말단이 결합되어 있으며; 상기 바코드 리셉터는 올리고뉴클레오타이드로서, 3’--> 5’순서로 고체 표면으로부터, i) 바코드 부위를 혼성화 시킬 수 있는 상보적인 서열을 가지는 C-바코드 부, ii)상기 바코드 프로브의 프로브 부위와 비-상보적 서열을 갖는 연장 서열부, 및 iii) 제한효소 인식 서열부를 가지고; 상기 C-바코드 부 또는 연장 서열부에는 형광물질이 화학적으로 합성되어 있고, 상기 형광물질의 작용을 제어하기 위한 퀀처가 상기 제한효소 인식 서열부에 합성되어 있으며; 상기 바코드 프로브로부터 방출된 바코드 부위는 상기 BREP의 상기 C-바코드 부에 혼성화 되는, BREP;를 포함한다.

상기 키트는 (c) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머로서, 상기 프라이머는 상기 3’프로브 부위 보다 업스트림에 위치하며, 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 연장 및 상기 바코드 프로브의 절단을 유도하여 상기 5’-바코드 부위 또는 5’-바코드 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하도록 하는 프라이머; 및 (d) 상기 BREP의 C-바코드 부에 혼성화된 상기 단편이 연장되어 상기 BRET의 연장서열부와 제한효소 인식 서열부와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥이 생성되어 연장이합체를 형성하면 제한효소 인식 서열부의 연장이합체를 절단하여 제한효소 인식 서열부와 그에 합성되어 있는 퀀처부를 동시에 제거하는 제한효소;를 더 포함할 수 있다.

상기 부호화 입자의 상기 패턴 형상은 부호화 입자의 표면에 형성된 음각 또는 관통공을 포함하고, 상기 C-바코드 부의 염기서열은 상기 바코드 프로브의 바코드 부위와 상보적이고, 상기 바코드 부위는 상기 프로브 부위와 1:1 대응 관계이므로 상기 프로브 부위와 상보적인 상기 타겟 염기서열은 상기 부호화 입자와 1:1 대응 관계이다.

상기 키트는 프라이머 쌍, 중합에 사용되는 버퍼혼합물, 중합효소 및 제한효소로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 더 포함한다.

상기 타겟 핵산서열은 타겟 핵산마커인 DNA 또는 RNA의 핵산서열이다.

상기 바코드 프로브는 프로브 부위의 말단에 연결된 블록커를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 다중 핵산서열 검출 방법은, 혼합된 다양한 종류의 핵산 물질을 빠르고 신뢰성 있게 동시에 분석할 수 있다.

본 발명에 따른 다중 핵산서열 검출 방법은, 동일한 용기에서 목적하는 핵산 물질의 유무, 종류, 양을 정밀하게 저렴한 비용으로 판별할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 바코드 프로브와 바코드 리셉터-부호화 입자(BREP, Barcode receptor-encoding particle)의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 타겟 핵산서열 검출 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 다른 실시예에 따른 바코드 리셉터-부호화 입자(이하, BREP라 함)의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 BREP의 부호화 입자(encoding particle)의 개략적인 사시도(a)와 평면도(b) 및 판독기로 촬영한 사진(c)이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 BREP의 예시들로서 부호화를 위해 구현된 패턴들을 중점적으로 비교한 촬영 사진들이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 바코드 프로브로부터 바코드 부위가 분리되는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 바코드 리셉터에 바코드 부위가 혼성화 되고 연장 이합체를 형성한 후 제한효소에 의해 절단되는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 바코드 단편 및 바코드 리셉터가 혼성화되고 바코드 단편으로부터 상보적인 가닥이 연장되는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 바코드 리셉터의 리포터가 시그널을 발생시키게 되는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 혼합된 다양한 종류의 핵산 물질들 중 타겟인 핵산서열에 바코드 프로브가 혼성되는 모습을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 바코드 리셉터에 바코드 부위 또는 바코드 프로브가 혼성화된 상태를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 바코드 리셉터의 혼성화 이후 연장 반응이 일어나는 경우와 그렇지 않은 경우를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 제1 실시예에 따른 BREP 어세이를 이용해 타겟 핵산서열을 검출하는 방법을 적용한 결과물을 형광 현미경으로 촬상한 사진이다.
도 14는 본 발명의 제2 실시예에 의한 다중 타겟 핵산서열 검출 방법의 단계를 나타낸 도면이다.
도 15는 본 발명의 제2 실시예에 의한 다중 타겟 핵산서열 검출 방법의 단계를 장비 측면에서 나타낸 도면이다.
도 16은 본 발명의 제2 실시예에서 이용되는 타겟 핵산마커인 P.vivax를 배양을 통해 증폭 생산한 과정을 나타낸 그래프이다.
도 17은 본 발명의 제2 실시예에서 이용되는 SA-encoding particle에 biotin-FAM 시약을 반응시킨 후 원심분리기를 이용하여 결합되지 않은 바코드 리셉터를 제거한 후 파티클의 형광을 확인한 결과인 사진과 그래프이다.
도 18은 본 발명의 제2 실시예에서 1 단계의 결과물인 증폭된 핵산 서열 산물을 겔 전기영동법에 의해 나타낸 사진이다.
도 19는 본 발명의 제2 실시예의 방법의 결과물을 자동형광스캐너 시스템에 의해 촬영한 사진과 분석 소프트웨어에 의해 얻은 그래프이다.
도 20은 본 발명의 제2 실시예의 단계 2, 3의 반응 온도 및 반응 시간, 효소의 농도를 최적화 하기 위한 실험 과정에서 촬영된 사진이다.
도 21은 본 발명의 분석 소프트웨어를 이용하여 스캐닝한 전체 이미지를 분석하고 각 코드별 입자의 수, 코드별 평균 형광값을 결과로 도출한 예시적 화면이다.

본 발명에 의하면, 혼합된 다중 핵산 마커들을 분석함에 있어서 그 수를 수십 내지는 수백가지로도 확장할 수 있다. 또한, 동일한 용기 내에 십 내지 수백 종류의 핵산 마커들이 혼합된 경우에도 단시간 내에 높은 정확도와 신뢰도로 타겟 핵산서열들을 동시에 검출할 수 있다. 나아가, 본 발명의 방법은 과정의 편의성, 타겟 검출 정확성이 우수한 방법이다.

이하, 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 도시된 도면들의 각 구성, 부재들의 사이즈, 면적 등은 설명의 편의를 위해 과장, 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 양태에 의한 다중 핵산서열 검출 방법은 바코드 프로브(Barcode probe)와 바코드 리셉터-부호화 입자(Barcode receptor-Encoding particle, 이하, "BREP"라 함);를 포함하는 어세이에 의해 타겟 핵산서열을 검출하는 방법이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “타겟 핵산”, “타겟 핵산서열”또는 “타겟 서열”은 검출하고자 하는 핵산서열을 의미하며, 혼성화 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 바코드 프로브와 혼성화된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머(primer)”는 올리고뉴클레오타이드(Oligonucleotide)를 의미하는 것으로 핵산가닥(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다.

“혼성화(hybridizing)”는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2 개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.

도 1을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 의한 어세이에 포함되는 바코드 프로브, 프라이머, BREP의 구조를 설명한다.

상기 바코드 프로브(Barcode probe)는 단일-가닥 핵산 분자로서, 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브 부위; 및 상기 타켓 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바코드 부위;를 포함한다. 본 명세서에서 "상보적"은 혼성화 조건 하에서 타겟 핵산서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하고 실질적 상보적, 완전히 상보적인 것을 모두 포괄하고, "비-상보적"은 소정의 혼성화 조건 하에서 타겟 핵산서열에 선택적으로 혼성화되지 않을 정도로 충분히 비-상보적인 것을 의미하고 실질적, 완전 비-상보적인 것을 모두 포괄한다.

특정 구현예에서, 바코드 프로브 및 프라이머는 단일-가닥 데옥시리보뉴클레오타이드 분자이다. 본 발명에서 이용되는 바코드 프로브 또는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 바코드 프로브 또는 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 프라이머는 중합제(polymeraze)의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍 시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)를 포함한 복수의 요소에 따라 결정된다.

한편, 도 1을 참조하면, 본 발명의 일 양태에 의한 바코드 리셉터-부호화 입자(Barcode receptor-Encoding particle, 이하, BREP라 한다)는 부호화 입자 및 상기 부호화 입자에 결합 또는 탑재된 바코드 리셉터를 포함한다. 도 1은 개념적으로 BREP는 부호화 입자와 바코드 리셉터의 화학적 결합에 의한 것임을 나타낸 것이고 공간적/물리적으로는 부호화 입자와 바코드 리셉터가 통합된 일체형일 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.

상기 부호화 입자는 다공성 또는 비 다공성 재질의 고체 입자로서 수~수백 마이크로미터 사이즈의 여러 형태로 제작될 수 있고, 패턴이 형성되어 수백 가지 이상의 코드를 생성할 수 있다. 이러한 코드는 광학 현미경에 의해 판별이 가능하도록 기하학적 형태의 패턴인 것이 바람직하다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 부호화 입자의 개략적인 사시도(a)와 평면도(b) 및 판독기로 촬영한 사진(c)이고, 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 BREP의 다양한 코드를 나타낸 예시들이다.

본 발명에 따른 BREP의 부호화 입자는 부호화부 즉, 코드를 포함한다. 부호화 입자의 코드, 바코드 리셉터 및 바코드 프로브는 타겟 핵산서열과 연동하여 설계된다. 따라서, 코드를 감지함으로써 어떤 핵산서열이 탐지되었는지 알 수 있다. 자세한 메커니즘은 아래의 개별 단계들에 대한 기재에서 설명하겠다.

본 발명의 일 양태에 의하면, 부호화 입자의 코드는 각각의 핵산서열을 판별할 수 있는 것이면 별다른 제한 없이 사용될 수 있으나, 필요에 따라, 기준부 및 판별 코드를 포함할 수 있다. 기준부는 부호화 입자의 방향의 기준점이 될 수 있고, 이를 기준으로 코드의 상대적 배치를 해석하여 어떤 핵산 서열이 탐지되었는지 확인할 수 있다. 예를 들어, 기준부는 외측으로 돌출된 형상을 포함하고, 상기 판별 코드는 입자에 형성된 홀(hole) 또는 음각으로 표시될 수도 있다.

도 4 및 도 5를 참조하면, 기준부(11)는 외측으로부터 돌출 형성되는데, 제어부가 촬영된 영상으로부터 기준부(11)를 기준으로 부호화 입자(10)의 회전 방향을 인식하게 된다. 그리고, 판별 코드(12)는 제어부가 타겟 물질을 판별하는데 사용하는데, 판별 코드(12)에 따라 부호화 입자(10)에 대응되는 타겟 물질의 종류를 판별할 수 있다. 즉, 특정 코드가 형성된 부호화 입자에는 특정한 바코드 프로브에 대응하는 바코드 리셉터가 결합되므로, 광학 현미경 관찰에 의해 코드 판별이 가능하고 이에 의해 타겟 핵산서열의 판별도 가능하다.

도 5는 부호화 입자의 다양한 판별 코드(12)의 예와, 이에 의해 촬영된 형광 영상의 예를 나타낸 도면으로, 홀의 개수, 홀의 위치의 조합에 따라 수십 내지 수천 개의 코드를 생성할 수 있다.

이러한 부호화 입자는 Stop flow lithography, Contact Flow Lithography 등을 포함하는 유체 리소그라피(flow lithography), 화학증착(chemical Vapor Deposition) 방법 또는 몰드 복제기법을 기반으로 한 레플리카몰드 등의 방법을 이용하여 다양한 기능과 형태를 가진 입자로 합성된다. 이 중 유체 리소그라피는 미세 유체 흐름의 패터닝과 포토마스크를 투과하는 자외선을 이용하여 다기능성 비대칭 입자를 합성하는 공정이다(D. C. Pregibon, M. Toner, P. S. Doyle, Science, 315, 1393(2007), K. W. Bong, S. C. Chapin, P. S. Doyle, Langmuir, 26, 8008(2010) 등 참조). 미세 채널 내부에서 유체는 낮은 레이놀즈 수(Re)를 가져 인접한 서로 다른 흐름이 혼합되지 않고 흐르며 다종의 평행 흐름으로 구조화될 수 있다. 또한 전구체 유체에 포토마스크를 투과하며 패터닝된 UV를 조사하여 선택적인 중합반응을 일으켜 포토마스크 모양과 동일한 입자를 합성할 수 있다.

상기 전구체 유체는 메타아크릴레이트기(methacrylate group) 또는 아크릴레이트기(acrylate group)를 함유하는 광경화성 모노머 및 광개시제를 포함할 수 있다. 광경화성 모노머는 일례로, 폴리에틸렌글리콜 모노머, MPC(2-methacryloyloxtethyl phosphoryl choline) 모노머, 또는 그 혼합물일 수 있다. 이때, 전구체 유체는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)과 같은 공극제(Porogen) 및 탈이온수(DI water)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 한편, 전구체 안의 광경화성 모노머는 서로 다른 종류로, 복수 개가 포함될 수도 있다.

이 때, 항체나 핵산과 같이 생체 분자와 결합하는 물질을 중합될 전구체 유체에 포함시키거나 접하는 별도 유체 레이어에 유동시키면, 생체분자 검출에 사용할 수 있는 바코드 리셉터가 함께 결합된 입자인 BREP를 합성할 수 있다.

한편, 상기 부호화 입자에 결합되어 BREP를 구성하는 바코드 리셉터를 설명하면, 바코드 리셉터는 단일 가닥의 올리고뉴클레오타이드로 구성되고, 바람직한 실시예에 의하면, 3’말단이 공유 결합 또는 비공유 결합으로 부호화 입자에 결합된다. 상기 바코드 리셉터는 i)상기 바코드 부위를 혼성화 시킬 수 있는 상보적인 서열을 가지는 C-바코드부와, ii)상기 바코드 프로브의 바코드 부위 및 프로브 부위위 각각에 비-상보적 서열을 갖는 연장서열부를 가진다. 하나의 부호화 입자에는 다수의 바코드 리셉터가 결합되는데, Sa-biotin에 의해 부호화 입자에 결합될 수도 있다.

C-바코드부는 바코드 프로브의 바코드 부위에 포함된 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함함으로써, 바코드-프로브로부터 분리된 바코드 부위와 혼성화될 수 있다. 바코드 리셉터를 포함한 BREP의 자세한 구성은 아래에서 추가로 설명될 것이다.

바코드 프로브와 BREP외에도 전 과정의 반응을 위해서 적어도 한 쌍의 프라이머, 중합을 위한 버퍼혼합물, 중합효소와 제한효소가 사용된다. 그리고 전 과정의 반응을 위해서 핵산 증폭 시스템, 온도조절 쉐이커, 형광 분석 장치가 사용된다.

상기 타겟 핵산 증폭과정에 의한 시료내 타겟 존재에 의한 단일 또는 복수 개의 특정 바코드 프로브 (Barcode probe)의 절단 단계에서는 하나의 튜브에 복수 종의 핵산 마커를 증폭할 수 있는 복수 종의 프라이머 세트, 중합을 위한 효소, 분석 시료와 분석하고자 하는 복수 종의 상보적인 바코드 프로브를 넣고 핵산 증폭 시스템을 이용하여 증폭과정을 진행한다. 이는 약 1시간이 소요되며, 시료 내 존재하는 핵산 마커에 한해서 상응하는 바코드 프로브의 바코드 부는 증폭 사이클 수와 비례하여 동일하게 증폭 생산된다.

복수개의 타겟 핵산서열의 증폭을 수행하고 검출하기 위해, 복수개의 프라이머 쌍, PCR 버퍼 폴리머라제, dNTP 등 당분야에 공지된 PCR 방법에서 사용되는 시약을 포함할 수 있다. 또한, 필요에 따라, 복수개의 타겟 핵산 마커 증폭을 위해 PCR용 온도 가변 장치 (Thermal cycler)를 사용될 수 있다. 다만, 여기에서는 설명의 편의를 위해 하나의 타겟 핵산서열을 기준으로 설명한다.

도 2를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 타겟 핵산서열를 탐지하는 과정을 개략적으로 이해할 수 있다. 1. 타겟 핵산서열 증폭 및 바코드 단편 생산 단계, 2. 바코드 단편과 BREP 혼성화 및 연장 단계, 3. 제한효소에 의한 퀀처 제거 단계, 4. 입자 코드 분석 및 형광 시그널 분석 단계로 간략히 구분될 수 있다. 이 과정들을 보다 구체적으로 설명하면, 바코드 프로브를 타겟 핵산서열과 혼성화하면서 동시에 업스트림 프라이머를 어닐링하고, 이후 업스트림 프라이머의 연장에 의해 바코드 부위가 절단되어 바코드 단편으로 방출된다(도 6 참조). 이후 분리된 바코드 단편은 바코드 리셉터의 C-바코드부에 혼성된 후 연장되어 이중 가닥을 형성한다. 형성된 이중 가닥 중 제한효소 인식 서열부에 대응되는 부분을 제한효소가 인식하여 이를 절단함으로써, 퀀처가 분리되고 그에 따라 리포터가 외부에서 인식할 수 있는 시그널을 발생시킬 수 있게 된다.

리포터에 의해 발생된 시그널을 통해 탐지된 핵산 마커가 무엇인지, 양이 얼마나 많은지 등 정성 및 정량 분석을 할 수 있다. 이러한 바코드 프로브 및 바코드 리셉터-부호화 입자 쌍의 종류를 핵산 마커의 종류의 수에 대응되게 준비할 경우 동시에 처리할 수 있는 핵산 마커의 수는 수십에서 수백 가지일 수 있다.

이하 본 발명의 단계들을 보다 상세히 설명한다.

단계 (A): 타겟 핵산서열과 업스트림 프라이머(upstream primer) 및 바코드 프로브(Barcode probe)의 혼성화

본 발명의 일 양태에 의하면, 먼저 타겟 핵산서열을 업스트림 프라이머(upstream primer) 및 바코드 프로브(Barcode probe)와 혼성화시킨다.

이 과정은 타겟 핵산마커가 DNA 인 경우 이중나선구조가 먼저 2개의 단일 가닥(제 1 및 제2 단일가닥)으로 풀리는 변성(denaturation)과정을 거쳐 이루어지고, 일반적인 PCR 과정과 유사하다.

혼성화 단계에서, 타겟 핵산마커의 변성에 의한 제 1 단일가닥 핵산 서열 (3’--> 5’)을 포워드 프라이머(forward primer) 및 바코드 프로브와 혼성화 시킨다. 상기 바코드 프로브는 올리고뉴클레오타이드로서, 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-프로브 부위 및 상기 타켓 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-바코드 부위를 포함한다.

상기 3’-프로브 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화 되고, 상기 5’-바코드 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 포워드 프라이머는 상기 제 1 단일가닥의 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 바코드-프로브보다 3’방향의 업스트림 핵산서열에 위치하도록 설계된다. 리버스 프라이머 (Reverse primer)는 상기 타켓 핵산마커의 변성에 의한 제 2 단일가닥 핵산 서열 (5’-> 3’)에 혼성화될 수 있다.

포워드 프라이머는 올리고뉴클레오타이드이며 중합효소 연쇄 반응 기술 (PCR) 및 실시간 중합효소 연쇄 반응 기술 (real-time PCR)에서 필수적으로 포함되는 중합반응 개시를 위한 프라이머일 수 있다.

업스트림 프라이머(포워드 프라이머) 및 바코드 프로브와 타겟 핵산서열의 혼성화는 최적화 절차에 의하여 일반적으로 결정되는 적합한 혼성화 조건 하에서 실시될 수 있다. 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 횟수, 버퍼 성분 및 이들의 pH 및 이온세기와 같은 조건은 올리고뉴클레오타이드(업스트림 프라이머 및 바코드 프로브)의 길이 및 GC 양 및 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 짧은 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 경우, 낮은 엄격조건(stringent condition)을 선택하는 것이 바람직하다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization,Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.

일 구현예에서, 3’-프로브 부위는 타겟 핵산서열에 혼성화되고 5’-바코드 부위는 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않는 엄격조건 하에서 단계 (A)의 혼성화가 실시된다. 바코드 프로브는 어떠한 특정 길이도 요구하지 않는다. 예를 들어, 15-150 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 20-150 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오 타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-50 뉴클레오타이드, 30-150 뉴클레오타이드, 30-100 뉴클레오타이드, 30-80 뉴클레오타이드, 30-60 뉴클레오타이드, 30-50 뉴클레오타이드, 35-100 뉴클레오타이드, 35-80 뉴클레오타이드, 35-60 뉴클레오타이드, 또는 35-50 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 바코드 프로브의 3’-프로브 부위는 타겟 핵산서열에 특이적으로 혼성화되는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다.

바코드 프로브의 3’-말단은 3’-OH 터미널(terminal)을 가질 수도 있다. 특정 구현예에서, 바코드 프로브의 3’-말단은 “블록킹”되어 그의 연장이 방지된다. 블록킹은 일반적인 방법에 따라 달성될 수 있다. 예를 들면, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기에 바이오틴, 포스페이트기, 알킬기, 비-뉴클레오타이드 링커, 포스포로티오에이트 또는 알칸-디올 잔기와 같은 화학적 모이어티(moiety)를 추가하여 실시할 수 있다. 대안적으로는 Barcode-probe의 3’-말단을 탄소 스페이서 또는 퀀처로 블록킹할 수도 있다.

일 구현예에 따르면, 포워드 프라이머는 바코드 프로브의 절단을 유도하는데 충분할 정도로 상기 프로브 부위의 혼성화 위치에 대해 업스트림에 위치하도록 설계할 수 있다. 이후 포워드 프라이머는 단계 (B)에서 그의 연장가닥을 통하여 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 바코드 프로브의 절단을 유도한다. 포워드 프라이머가 타겟 핵산서열에 혼성화된 바코드 프로브의 절단을 유도하여 5’-바코드 부위 또는 5’-바코드 부위의 일부를 포함하는 단편이 방출되는 한, 포워드 프라이머에 의한 절단반응 관련 종래 기술들은 본 발명에 적용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제 5,691,142호, 제5,994,069호, 제7,381,532호 및 미국 출원 공개번호 제2008-0241838호는 본 발명에 응용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 리버스 프라이머의 존재 하에서 실시한다. 리버스 프라이머는 바코드 프로브에 혼성화되는 타겟 핵산서열을 추가적으로 생성시키며, 타겟 검출의 민감도를 향상시킨다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머를 사용하는 경우, 상기 프라이머들의 연장을 위하여 주형-의존적 핵산 중합효소를 추가적으로 사용한다.

단계 (B): 프라이머 연장 및 바코드 프로브의 절단을 유도하여 바코드 부위를 방출하는 단계

혼성화 단계에 이어, 상기 바코드 프로브의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (A)의 결과물을 접촉시킨다. 도 2의 단계 B)에 도시된 바와 같이 업스트림 프라이머가 는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 형성된 상기 제1 단일가닥에 상보적인 제1 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 바코드-프로브의 절단을 유도하여, 상기 바코드-프로브의 5’-바코드 부위만을 방출할 수 있다. 동시에 상기 리버스 프라이머와 에 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 제2 단일가닥의 상보적인 제2 연장가닥이 형성되고, 변성과 혼성화, 연장의 사이클 (cycle)이 연쇄 반복되어 제1 및 2 연장가닥과 방출된 5’-바코드 부위는 사이클 수에 비례하여 복제 생산될 수 있다. 증폭 횟수에 따라 동일하게 바코드 부위도 증폭 생산될 수 있다.

상기 방출 과정을 보다 상세히 설명하면, 바코드 프로브가 타겟 핵산서열과 혼성화 되는 경우, 그의 3’-프로브 부위는 타겟 염기서열과 혼성화되지만, 5’-바코드 부위는 타겟 핵산서열에 혼성화 되지 않고 단일-가닥을 형성한다(도 2 참조). 이와 같이, 단일-가닥 및 이중-가닥 구조 모두를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 알려진 다양한 기술에 의해 5’뉴클레아제활성을 갖는 효소를 이용하여 절단될 수 있다.

바코드 프로브의 절단 위치는 포워드 프라이머의 종류, 포워드 프라이머의 혼성화 위치 및 절단 조건에 따라 다양해진다(참조 미국 특허 제5,210,015호, 제5,994,069호 및 제7,381,532호 또는 미국 출원 공개번호 제2008-0241838호). 본 발명은 바코드 프로브의 절단반응을 위하여 다수의 종래 기술을 이용할 수 있으며, 5’-바코드 부위 또는 5’-바코드 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출한다.

“바코드 프로브의 절단을 위한 조건”은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 타겟 핵산 서열에 혼성화된 바코드 프로브의 절단이 발생되는 데 충분한 조건, 예컨대 온도, pH, 이온세기, 버퍼, 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 서열 그리고 효소를 의미한다. 예를 들어, 5’뉴클레아제 활성을 가지는 효소로서 Taq DNA 중합효소가 이용되는 경우, 바코드 프로브의 절단을 위한 조건은 Tris-HCl 버퍼, KCl, MgCl2 및 온도를 포함한다.

이러한 혼성화 및 바코드 부위 방출 단계(A, B 단계)는 리얼 타임 PCR 의 방식으로 실행되어 대략 1시간 정도에 걸쳐 진행된다.

단계 (C): 방출된 바코드 부위와 바코드 리셉터-부호화 입자(BREP)의 혼성화 단계

이전 단계에서 바코드 프로브로부터 방출된 상기 5’-바코드 부위를 혼성화 조건 하에서 상기 BREP와 혼성화 시키는 단계이다.

BREP은 부호화 입자와 바코드 리셉터로 구성되고, 상기 바코드 리셉터는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 3’말단이 상기 부호화 입자에 공유 또는 비공유 결합으로 결합되어 있다.

상기 바코드 리셉터는 3’--> 5’순서로 고체 표면으로부터, i) 상기 방출된 5’-바코드 부위를 혼성화 시킬 수 있는 상보적인 서열을 가지는 C-바코드부와, ii)상기 바코드 프로브의 5’-바코드 부위 및 프로브 부위 각각에 비-상보적 서열을 갖는 연장서열부를 순차로 포함한다. 상기 연장서열부의 5’말단 영역에는 연장 후 제한효소에 의해 절단될 수 있는 제한효소 인식서열부가 포함된다. 또한, 상기 C-바코드 부 또는 연장서열부에는 화학적으로 리포터가 합성되어 있고, 상기 리포터를 상시 제어하기 위해 퀀처가 상기 제한효소 인식 서열부에 합성되어 있다.

상기 방출된 바코드 부의 혼성화 시 공간적 제약문제를 해결할 수 있는 링커 (linker)물질이 고체 표면과 C-바코드부의 사이에 형성되어 상기 방출된 5’-바코드 부위가 C-바코드부에 공간적으로 보다 용이하게 접근할 수 있도록 한다.

혼성화 조건하에서, 상기 방출된 5’-바코드 부위는 상보적 염기서열을 가지는 상기 C-바코드부에 혼성화 된다. 본 발명의 일 실시예에 따른 C-바코드부에 포함된 상기 타겟인 바코드 부위에 포함된 염기서열과 상보적인 염기서열의 길이는 본 발명의 목적을 달성하기에 충분한 길이이면 별다른 제한이 없으나, 예를 들어, C-바코드부에 포함된 바코드 부위에 포함된 염기서열과 상보적인 염기서열의 길이는 10 내지 80개 염기 길이일 수 있다.

타겟 핵산서열의 부재에 의해 바코드 프로브가 원형으로 존재하는 경우 또는 핵산서열이 존재하더라도 충분한 증폭이 이루어지지 않아 잔여의 바코드 프로브가 존재하는 경우에도 상보적인 BREP의 C-바코드부와 혼성이 이루어지므로 이 단계 (c)에서 바코드 부위 단편과 원형의 바코드 프로브는 경쟁 관계이고 이로 인해 타겟 검출 감도가 떨어질 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 상기 (A) 내지 (B) 단계의 사이클을 대략 1시간에 걸쳐 여러 번 돌려 PCR 과정을 완료한 후 BREP를 반응 용기에 섞어줄 수 있다. 이 경우, 타겟 핵산 서열이 있을 경우 바코드 프로브의 절단이 상당히 이루어져 바코드 부위 단편과 절단되지 않은 원형의 바코드 프로브의 경쟁이 상당 해소되어 타겟 검출 감도가 향상될 수 있다. 다만, 이것은 처음부터 BREP 를 용기 내에 섞어주는 방식을 배제하는 것은 아니고, 초기에 BREP와 제한효소를 같이 용기에 투입할 수도 있다.

단계 (D): C-바코드부에 혼성화된 바코드 부위가 연장되어 연장서열부와 함께 연장이합체를 형성하는 단계 ;

단계 (C)에서 상기 C-바코드부에 상보적인 5’-바코드 부위가 혼성화되면, 그 다음으로, 상기 단계 (C)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시한다. C-바코드부에 혼성화된 5’-바코드 부위가 연장되어 상기 연장서열부와 상보적인 서열의 연장가닥이 생성되어 연장이합체를 형성한다. 여기에서 “연장이합체”는 바코드 리셉터의 C-바코드부에 혼성화 된 바코드 부위 단편이 주형-의존적 핵산 중합효소와 바코드 리셉터의 연장서열부를 주형으로 이용하여 연장되는 연장반응에 의하여 형성된 이합체를 의미한다.

바람직한 실시예에 의하면, 바코드 리셉터는 단일 가닥의 올리고뉴클레오타이드로, 부호화 입자와의 결합부로부터 3’--->5'순서로 상기 5'-바코드 부위에 상보적 서열의 C-바코드부, 상기 바코드 프로브에 비-상보적 서열의 연장서열부를 가진다. 상기 바코드 리셉터는 또한, 리포터, 이중 가닥 형성 시 제한효소가 작용할 수 있는 염기서열을 포함하는 제한효소 인식서열부 및 상기 리포터와 상호작용을 할 수 있는 퀀처를 포함한다.

상기 제한효소 인식서열부는 연장서열부의 5’말단 영역에 포함되어 있고, 연장 후 제한효소에 의해 절단될 수 있다, 상기 리포터는 상기 C-바코드 부 또는 연장서열부에 화학적으로 합성되어 있고, 상기 리포터의 발현(활성)을 상시 제어하기 위해 상기 제한효소 인식 서열부에 합성되어 있는 퀀처를 가진다. 리포터와 퀀처에 대해서는 단계 (E)에서 상세히 설명한다.

이하에서, 도 11, 도 12를 참조하여 복수의 BREP와 상보적인 바코드 프로브/바코드 부위 단편의 혼성화 및 연장 과정을 상세히 셜명한다.

도 11의 (1)에는 타겟 핵산서열과 상보적인 바코드 프로브가 혼성화 후 업스트림 프라이머의 연장에 의해 절단이 유도되어 바코드 부위 단편으로 방출되고 이후 바코드 부위와 상보적 서열이 있는 BREP(코드 H-block1)의 C-바코드부에 혼성화된 상태를 나타내고 있다. 반면에 (2) 내지 (4)의 경우 코드 H-block2 내지 H-block4에 대응되는 타겟 핵산서열이 부재하여 상응하는 바코드 프로브가 절단되지 않고 원형으로 존재하는 경우이다. 이 경우에도 각기 상보적 서열이 있는 BREP(H-block2, H-block3, H-block4)의 C-바코드부에 혼성화된다.

도 12를 참조하여 상기 도 11의 (1) 내지 (4)의 결과물의 단계 (D)에서의 과정을 설명하면, 절단되어 방출된 바코드 부위 단편이 혼성화된 경우(도 11의 (1) 참조)에는 중합효소에 의해 연장서열부를 따라 혼성화가 이루어져 바코드 리셉터의 끝 부분까지 연장된다(도 12의 (1) 참조).

반면에 도 11의 (2) 내지 (4)의 경우와 같이 바코드 프로브가 바코드 리셉터와 혼성화 되는 경우, 그의 5’-바코드 부위는 상보적 핵산서열의 C-바코드부와 혼성화되지만, 3’-프로브 부위는 혼성화 되지 않고 단일-가닥을 유지한다. 이처럼 3'-프로브 부위의 단일가닥이 유지되면 도 12의 (2) 내지 (4)의 경우와 같이 연장이 제한되어 연장이합체가 형성되지 않는다. 즉, 복수의 타겟 핵산서열 중 부존재하는 타겟 핵산서열에 대응하는 BREP(H-block2, H-block3, H-block4)에 대해서는 혼성화가 이루어지더라도 이후 연장반응이 이루어지지 않게 된다(도 12의 (2) 내지 (4) 참조).

이러한 연장반응의 유무에 따라 후속 단계 (E)의 제한 효소에 의한 상기 연장이합체의 제한효소 인식서열부에 대한 절단반응이 일어나거나 일어나지 않게 되고, 절단반응의 유무에 따라 리포터의 발현 여부가 결정되므로, 결국 타겟 핵산서열의 존부를 리포터로 감지할 수 있게 된다.

단계 (E): 제한효소에 의해, 상기 단계 (D)의 결과물인 상기 연장이합체에서 혼성화된 제한효소 인식서열부를 절단하는 단계

상기 단계 (D)의 결과물인 상기 연장이합체에서 혼성화된 제한효소 인식 서열부를 제한효소에 의해 절단하는 단계로서, 제한 효소가 작용할 수 있는 조건 하에서 제한효소 인식 서열부와 함께 그에 합성되어 있는 퀀처가 상기 연장이합체로부터 절단됨으로써 제어된 리포터, 예를 들어 형광 시그널이 발생한다.

제한효소는 제한효소 인식 서열부의 염기서열을 포함하는 이중 가닥을 절단하여, 바코드 부위 단편과 혼성화된, 타겟인 핵산서열과 연동되는 바코드 리셉터를 선택적으로 절단할 수 있다. 제한효소가 부호화 입자에 결합된 이중 가닥을 절단함으로써 퀀처가 분리, 이격될 수 있고, 그에 따라 리포터가 외부로 시그널을 전달할 수 있게 된다.

제한효소는 본 발명의 부호화 입자로부터 파생되는 이중 가닥의 특정 염기서열을 인식하여 작용할 수 있는 것이면 별다른 제한 없이 사용될 수 있으나, 예를 들어, Ⅰ형 (Type Ⅰ); orthodox Ⅱ형, ⅡS형, ⅡE형, ⅡF형, ⅡT형, ⅡG형, ⅡM형, ⅡB형, Ⅱ형 등 Ⅱ형 (Type Ⅱ); Ⅲ형 (Type Ⅲ) 등일 수 있고, 구체적으로, EcoRI, BamHI, HindⅢ, kpnⅠ?, NotⅠ?, PstⅠ?, SmaⅠ?, XhoⅠ?, EcoRI, BamHI, HindⅢ?, kpnⅠ?, NotⅠ?, PstⅠ?, SmaⅠ?, XhoⅠ?, NaeⅠ?, NgoM Ⅳ, Eco57Ⅰ, BcgⅠ?, BpⅠ?, Bsp24Ⅰ?, BaeⅠ?, CjeⅠ?, EcoPⅠ?, HintⅢ?, StyLTⅠ? 등일 수 있다.

앞서 설명한 바와 같이 본 발명에 따른 BREP는 리포터를 포함한다. 본 발명의 리포터는 후술하는 퀀처와 상호작용함으로써 타겟 핵산서열 또는 핵산마커의 탐지를 사용자에게 알릴 수 있다. 리포터는 제한효소 인식 서열부로 인해 이중 가닥이 절단되거나 퀀처와의 거리가 소정의 거리 이상으로 멀어질 경우 시각적 또는 비시각적으로 외부에서 인식할 수 있도록 할 수 있다.

리포터는 예를 들어, 형광단, 발색단(chromophore)과 방사단(radiophore)일 수 있다. 형광단은 적 형광 스쿠아린 염료(red fluorescent squarine dye), 예를 들면, 2,4-비스[1,3,3-트리메틸-2-인돌리닐리덴메틸] 사이클로부텐디일륨-1,3-디옥솔레이트, 적외선 염료(infrared dye), 예를 들면, 2,4-비스[3,3-디메틸-2-(1H-벤즈[e]인돌리닐리덴메틸)] 사이클로부텐디일륨-1,3-디옥솔레이트, 또는 오렌지 형광 스쿠아린 염료(orange fluorescentsquarine dye), 예를 들면, 2,4-비스[3,5-디메틸-2-피롤릴] 사이클로부텐디일륨-1,3-디올롤레이트일 수 있고, 다른 예로, 양자점(quantum dot), Alexa Fluor염료, AMCA, BODIPY630/650, BODIPY650/665, BODIPY, BODIPY, BODIPY, BODIPY, Cascade Blue, CyDye™(가령, Cy2™, Cy3?, Cy5?), DNA삽입 염료, 6-FAM™, 플루오레세인(Fluorescein), HEX™, 6-JOE, Oregon Green488, Oregon Green500, Oregon Green514, Pacific Blue?, REG, 피코빌리단백질(phycobilliprotein)(가령, 피코에리트린(phycoerythrin)과 알로피코시아닌(allophycocyanin), Rhodamine Green™, Rhodamine Red?, ROX?, TAMRA?, TET?, 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), 또는 Texas Red이다. 형광 시그널을 강화하기 위하여 시그널 증폭 시약(signalamplification reagent), 예를 들면, 티라마이드(tyramide)(PerkinElmer)가 이용될 수 있다.

필요에 따라, 형광 공명 에너지 이동 쌍(fluorescence resonance energy transfer pair) 또는 염료-소광물질 쌍(dye-quencher pair)과 같은 라벨의 쌍이 이용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 리포터는 상기 퀀처보다 상기 부호화 입자에 가까운 측에 배치되고, 상기 제한효소 인식서열부는 상기 리포터 및 상기 퀀처 사이에 배치될 수 있다. 이로써, 리포터 및 퀀처가 제한효소 인식 서열부를 기준으로 절단되거나 멀어질 수 있어 리포터가 시그널을 생성하도록 할 수 있고, 또한, 리포터는 부호화 입자측과 분리되지 않음으로써 부호화 입자의 부호화부 해석을 통한 타겟인 핵산서열이나 이를 포함한 핵산 마커를 판별할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 핵산 바코드 리셉터는, 예를 들어, 도 1과 같이 부호화 입자와 가까운 측으로부터 상기 C-바코드부, 상기 리포터, 상기 제한효소 인식 서열부 및 상기 퀀처 순으로 연결된 단일 가닥; 또는 상기 리포터, 상기 C-바코드부, 상기 제한효소 인식 서열부 및 상기 퀀처 순으로 연결된 단일 가닥을 포함할 수 있다. C-바코드부, 리포터, 제한효소 인식 서열부 및 퀀처는 연속적으로 연결될 수도 있지만, C-바코드부, 리포터, 제한효소 인식 서열부 및 퀀처 각각의 사이에는 다른 염기서열이 개재될 수도 있다. 그 밖에 도 3과 같이 C-바코드부에 리포터가 합성되고, 제한효소 인식서열부에 퀀처가 합성될 수도 있다.

퀀처는 리포터의 시그널을 억제 시킬 수 있으므로, 바코드 리셉터에 바코드 부위 단편이 혼성되지 않는 한 외부에서 리포터에 의한 소정의 시그널 인식할 수 없다. 예를 들어, 리포터의 형광을 억제할 수 있는 퀀처에는 빛을 흡수할 수 있는 특성을 갖는 염료가 사용될 수 있고, 퀀처의 흡수 파장의 범위가 리포터가 나타내는 형광의 파장 영역의 상당부분 또는 전체 영역을 포괄(중첩)할 수 있다. 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET), 광-유도 전자 전달(photo-induced electron transfer) 및 H-이량체 형성과 같은 염료의 응집 등을 통해 ?칭이 일어날 수 있다. 또한，리포터의 형광을 억제하는 효과를 얻는데 있어 리포터와 퀀처 사이의 길이가 영향을 줄 수 있다. 리포터와 퀀처의 거리는 리포터와 퀀처의 종류에 따라 달라질 수 있으나, 예를 들어 ( 30 )개 염기 길이일 수 있다.

필요에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 퀀처는, 예를 들어, FITC(ex/em, 490/520)-BHQ-l, TRITC(ex/em, 547/572)-BHQ-2, Cy5.5(ex/em, 670/690)-BHQ-3 등의 조합일 수 있다.

단계 (F): 절단 반응의 발생을 검출하는 단계

상기 단계 (E)의 결과물인 상기 퀀처가 절단되어 방출된 BREP을 현미경 관찰을 통해 검출하는 단계로서, 상기 부호화 입자의 코드를 식별하고 리포터 시그널의 세기(intensity)를 측정하여 타겟 핵산서열의 존재 유무 및 정도(abundance)를 확인하는 단계이다. 상기 단계 (E)의 절단 반응의 발생으로 인하여 퀀처가 제거됨으로써 제어된 상기 리포터, 특히 형광체로부터 발생하는 형광 시그널을 검출할 수 있고, 상기 절단 반응의 발생은 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 것이다.

이 단계는 예를 들어, 부호화 입자의 코드를 일반적인 백색광 또는 형광물질의 여기, 발광 파장이 아닌 단색광에서 현미경 관찰을 통해 코드를 식별하는 코드 식별 단계와, 형광 여기 파장의 광을 조사하여 현미경 관찰을 통해 형광 시그널의 유무 및 정도를 확인하는 형광 식별 단계를 포함할 수 있다. 코드 식별 단계에서 현미경 관찰에 의해 코드를 식별함으로써 BREP의 종류를 확인할 수 있고, 형광 식별 단계에서는 해당 BREP에 대한 형광 시그널 발생 여부와 그 시그널의 강도를 확인함으로써 해당 BREP에 대응하는 타겟 핵산서열의 존재 여부와 정도(abundance)를 확인할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 결과물이 수용된 마이크로 칩을 2축 이동모듈을 이용하여 평면으로 스캐닝하면서 각 영역별 촬상을 하고, 제어부가 각각의 촬영 영역(FOV)에 대한 백색광 영상에서 BREP를 검출한다. 백색광 영상에서 입자의 검출을 위한 영상 처리과정으로 노이즈 제거 과정 등의 통상적인 영상 처리 과정이 적용될 수 있으며, 검출에는 에지 검출 방법이 적용될 수 있다. 제어부는 마이크로 칩의 전체 영역의 스캔이 완료되면, 촬영영역(FOV) 중 BREP가 검출된 촬영 영역(FOV)을 추출하고, 해당 촬영 영역(FOV)에 대한 형광 영상을 촬영하게 된다. 보다 구체적으로 설명하면, 제어부는 광원 모듈(150)의 백색광 조사를 차단하고 형광 카메라 모듈의 단색 광원을 켠 상태에서 입자가 검출된 촬영 영역(FOV)이 형광 카메라 모듈(130)의 상부에 위치하도록 2축 이동 모듈(120)을 제어하는 방법으로 임자가 검출된 촬영 영역(FOV)들의 형광 영상을 순차적으로 취득하게 된다.

본 발명의 또 다른 실시예에 의하면, 백색광 조사 상태에서 칩 스캐닝을 통해 현미경 촬상 결과 BREP가 감지되면 해당 BREP의 코드를 관찰(촬상)한 직 후 백색광을 차단하고 형광 발생을 현미경으로 촬상하여 형광 식별을 하게 된다. 이 모든 과정은 촬상 이미지, 영역 데이터를 소프트웨어로 처리하여 복수의 BREP의 코드와 형광 발생 여부 및 강도를 산출하여 그 결과값을 이용하여 해당 BREP에 대응하는 핵산서열의 존재 여부를 판단할 수 있게 된다.

탑재된 바코드 리셉터의 식별을 위한 코드를 포함하고 있다. 부호화된 입자를 활용하면 한 번의 검출 과정에서 다수의 생체 분자를 동시에 포획하는 다중 검출이 가능하며, 3차원의 입자 공간에서 프로브와 표적 생체 분자가 상호작용하며 고감도 검출이 이루어진다.

본 발명의 다른 실시형태는 전술한 바코드 프로브와 BREP를 포함하는, 핵산 분석용 키트를 제공한다.

다만, 본 실시형태에 대한 설명은 보다 명확하고 간결한 설명을 위해 전술한 실시예와 중복되는 부분은 생략하도록 하며, 그 설명이 생략되었다고 해서 그 부분이 본 발명에서 제외되는 것은 아니며 그 권리 범위는 전술한 실시예와 동일하게 인정되어야 한다. 따라서, 전술한 BREP, 바코드 리셉터, 부호화 입자, C-바코드부, 리포터, 제한효소 인식 서열부, 퀀처 등에 관한 자세한 설명은 생략한다.

본 발명의 일 실시예에 따른, 핵산 분석용 키트는 제한효소를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른, 핵산 분석용 키트는 프라이머 쌍, 중합에 사용되는 버퍼혼합물 및 중합효소로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.

복수의 핵산서열을 증폭할 수 있는 복수 종의 프라이머 세트, 중합을 위한 효소, 분석 시료와 분석하고자 하는 복수 종의 상보적인 바코드-프로브를 넣고 핵산 증폭 시스템을 이용하여 증폭과정을 진행할 수 있다. 시료 내 존재하는 핵산 마커에 한해서 상응하는 바코드-프로브의 바코드는 증폭 사이클 수와 비례하여 동일하게 증폭 생산될 수 있다.

바코드-프로브로부터 분리된 바코드는 전술한 C-바코드부에 혼성될 수 있고 전술한 핵산 바코드 리셉터의 부호화 입자를 따라 혼성된 프로브로부터 상보적인 염기가 연장됨에 따라 이중 가닥이 형성될 수 있다.

예를 들어, 바코드-프로브는 바코드와 프로브가 순서대로 5’에서 3’ 방향으로 연결될 수 있고, 이로써, 전술한 C-바코드부와의 혼성 및 연장 가닥 형성에 적절히 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 바코드-프로브에 있어서, 타겟인 핵산 마커는 DNA 또는 RNA일 수 있다.

상기 절단으로 인하여 퀀처가 제거됨으로써 퀀처에 의해 제어된 리포터가 시그널을 발생시킬 수 있다.

도 12를 참조하면, 본 발명에 따르면, 증폭된 바코드 부위가 상보적 시퀀스 부를 지닌 핵산 바코드 리셉터와 혼성화 (Hybridization) 되는 단계에서, 타겟 핵산 마커가 분석 시료에 존재하지 않아 바코드-프로브로 존재하더라도 상보적 시퀀스 부를 지닌 핵산 바코드 리셉터과 혼성화가 되지만, 프로브의 존재로 인해 연장이 제한될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 첨부된 특허청구범위를 제한하는 것이 아니며, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 실시예에 대한 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

실시예 1

단일 종 핵산서열 검출을 위한 신규 어세이 및 검출 방법의 평가

신규 어세이 (도 1)를 이용하여 타겟 핵산서열 ( Plasmodium vivax, 삼일열말라리아 바이러스)을 검출할 수 있는지를 실험을 통하여 검증하였다.

어세이를 위해 사용한 재료는 다음과 같다.

타겟 핵산 템플레이트 (template)는 바이러스 배양을 통해 얻은 배양액을 DNA 추출과정을 통해 획득하였고, 이를 실험 검증 템플레이트로 사용하였다. 5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소는 (업스트림, 다운스트림) 프라이머의 연장, Barcode-probe의 절단, Barcode-probe 단편의 연장을 위해 사용하였다.

Barcode-probe는 표지하지 않았고, 3’-말단을 탄소 스페이서로 블록킹하였다. 제한효소 (restriction enzyme)는 Barcode Receptor의 절단부위를 절단하기 위해 사용하였다. Barcode Receptor는 5’-말단에 퀀처 분자(BHQ-1)표지 분자를 포함하고, 3’-말단에 바이오틴(biotin)표지를 포함하고 5’-말단과 3' -말단 사이에 형광 리포터 표지 분자(FAM)를 포함한다.

본 실시예에서 사용된 타겟 핵산 템플레이트(template), 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, Barcode-probe, Barcode Receptor 서열은 다음과 같다:

타켓 핵산 템플레이트의 증폭 대상 서열: 5’-ATGGCACCAAAAGCAAAAATCGTTTTAGTTGGCTCAGGTATGATTGGAGGAGTAATGGCTACCTTAATTGTTCAGAAAAATTTAGGAGATGTAGTTTTGTTCGATATTGTAAAGAACATGCCACATGGAAAAGCTTTAGATACATCTCATACTAATGTTATGGCATATTCAAATTGCAAAGTAAGTGGTTCAAACACTTATGAC -3’(서열식별번호: 1)

P.f -다운스트림 프라이머: 5' -GTCATAAGTGTTTGAACCACTTAC-3'(서열식별번호: 2)

P.f -업스트림 프라이머: 5' - GGATCCATGGCACCAAAAGCAAAAAT -3' (서열식별번호:3)

P.f-Barcode probe:

5'-GAATAGTGTGCGATTCATGCCACATGGAAAAGCTTTAGA[C3spacer]-3’(서열식별번호: 4)

P.f -Barcode Receptor:

5'-[BHQ-1]AGGACGGGATCCACA[FAM(dT)]GAATCGCACACTATTCTTTTTTTTT[biotin]-3' (서열식별번호: 5)

(밑줄 친 문자는 Barcode probe의 Barcode 부위와 Barcode 부위와 상보적인 시퀀스 부위를 가리킨다. 진한문자(bold)는 Enzyme cut 부분을 가리킨다)

본 실시예에서 반응은 세가지 단계로 진행하였다.

1) 핵산증폭반응: 바코드 부위가 분리되어 나오는 단계

2) 바코드 부위의 혼성화 및 혼성화에 의한 연장 단계

3) 제한효소에 의해 퀀처부가 제거되어 BREP에서 형광이 도출되는 단계

[단계 1]에서는 핵산증폭반응(PCR)을 위해 양성 샘플과 음성샘플을 다음의 표 1과 같이 제작하였다.

그 후 다음의 표 2과 같은 온도, 반응시간, 연속반응 횟수로 [단계 1]을 수행하였다.

[단계 2]에서는 [단계 1]과정이 끝난 후 [단계 1]과정의 산물을 이용하여 다음과 같이 표3의 조성을 먼저 제조한 후,

Reaction 1 Mixture
PCR product	20ul
BREP	10ul(20ea)
Taq polymerase	2ul
dNTP-2mM	1ul
D.W	Up to 40ul

60°C에서 10분동안 반응을 시켜 [단계 2]를 수행한다.

[단계 3]에서는 [단계 2]과정이 끝난 후 [단계 2]과정의 산물을 이용하여 다음 표 4의 조성을 먼저 제조한 후,

Mixture
Reaction 2 product	40ul
BamH1	2ul
bam H1 Buffer	Up to 50ul

37°C에서 30분동안 반응시켜 모든 단계를 완료하였다.

완료된 샘플은 형광 스캐너로 측정을 하여 다음과 같은 결과를 획득하였다. 도 13에서 확인할 수 있듯이, 양성샘플이 들어간 반응에서는 모든 단계가 성공적으로 진행되어 입자에서 형광이 도출되는 반면 음성샘플에서는 1단계에서 바코드 프로브가 그대로 존재하여 그 이후 과정이 비성공적으로 진행되어 형광이 도출되지 않는 것을 실시예를 통해 명확하게 확인할 수 있다.

실시예 2

본 실시예에서는 BREP기반 다중핵산서열 검출 방법을 이용하여 말라리아 바이러스 subtype 4종 Plasmodium falciparum (열대열말라리아, 이하, "P.f" 라 함), Plasmodium vivax (삼일열말라리아, 이하, "P.v" 라 함), Plasmodium ovale (난형열말라리아, 이하, "P.o" 라 함), Plasmodium malariae (사일열말라리아, 이하, "P.m" 라 함)을 동시에 진단할 수 있는 방법을 개발하였다.

본 신규 진단법은 도 14 및 도 15와 같이 총 네 단계 1. 타겟 핵산서열 증폭 및 절단된 바코드 부위 생산 단계, 2. 바코드와 BREP 혼성화 및 연장단계, 3. 제한효소에 의한 ?처 제거 단계, 4. 입자 코드 분석 및 형광 시그널(signl) 분석 단계를 통해 수행되었다.

1. 재료 준비

(1) 말라리아 바이러스 핵산 (template)

4가지 말라리아 바이러스 중 타겟 말라리아 바이러스 subtype은 P.vivax으로 실험을 진행하였다. 이를 위해 P.vivax은 배양을 통해 증폭 생산한 후 Qiagen사의 핵산추출 키트 (QIAamp DNA Mini Kit ,Qiagen)를 이용하여 정제하였다(도 16 참조). 정제된 핵산은 qPCR 키트를 이용하여 확인하였다.

타켓 핵산 템플레이트 (P.v)의 증폭 대상 서열: 5'-TCGCCCTCTACTGCAGCATCATAAATAAGTTTCCTTTTCAAATATAATTTTCGAAATGTTATATCACTATGAAAATTTGTGTCTGTATTATTTACCAAATTCGTAAGTTCCTTCATACATAATTGATATCTTCGATCTGGTATACAAACATCCTTCTTAGTGTTACAGTCCCA-3' (서열식별번호: 6)

(2)업(F)/다운(R)스트림 프라이머, 바코드 프로브 (BP) set(표5)

각 프라이머 및 바코드 프로브는 위 표 5와 같은 서열로 합성하여 제작하였다. 핵산 증폭 반응을 위한 PCR master mix (QIAGEN Multiplex PCR Kit, Qiagen)는 Qiagen 사에서 구입하여 사용하였다. 바코드 프로브의 바코드 부위는 밑줄로 표시하였다.

(3)바코드 리셉터-인코딩 입자 (BREP)

바코드 리셉터는 다음의 표 6과 같은 서열로 합성 제조하였다. 여기에서 밑줄 친 부분이 C-바코드부이다. 회색 그림자로 표시된 부분이 Enzyme cut(효소 절단) 부분이다.

SA-인코딩 입자 제조: 인코딩 입자는 lithography 방법으로 PEGDA (PEG-DA 700, Sigma-Aldrich)를 UV로 경화시켜 제조하였으며, 바코드 리셉터를 파티클에 접착시키기 위하여 인코딩 파티클을 제조한 후 공유결합 방식으로 streptavidin(SA, Streptavidin, Sigma-Aldrich) (SA)을 파티클 전체 표면에 균질하게 결합시켰다.

균질하게 SA가 결합된 것을 확인하기 위하여 SA가 결합된 인코딩 파티클에 biotin-FAM 시약을 반응시킨 후 원심분리기를 이용하여 결합되지 않은 바코드 리셉터를 제거한 후 파티클의 형광을 확인한 결과, 도 17의 위 형광 이미지 및 그래프와 같이 입자 전 표면에서 고르게 형광이 나오는 것을 확인할 수 있다.

BREP 제조: 바코드 리셉터와 SA가 결합된 인코딩 입자를 반응 용기에 혼합하여 1시간 반응시킨다. 반응이 끝난 후 원심분리기를 이용하여 결합되지 않은 바코드 리셉터를 제거하여 순수한 바코드 리셉터-인코딩 입자 (BREP)을 제조한다.

(4)시약류: 연장 효소 (Taq polymerase)(Dyne Taq, 다인바이오, 성남, 대한민국), 제한 효소(BamH1)(BamH1, New England Biolabs), buffer(Dyne Taq, 다인바이오, 성남, 대한민국),

(5)장치류: Thermal shaker(TMS-300, hangzhou allsheng instruments co. ltd, China), Thermal cycler(S1000, BIO-RAD), Auto F-scanner(JULI FL, Nano EnTak, 서울, 대한민국)(FS-100, BIOROOTS, 성남, 대한민국)

2. 방법 실시

(1)타겟 핵산서열 혼성화, 증폭 및 바코드 단편 생산 단계

반응을 위한 조성은 다음의 표 7과 같고, 반응은 다음의 표 8의 조건으로 Thermal cycler를 이용하여 진행되었다.

수행 결과, 원하는 사이즈의 증폭 서열 산물이 성공적으로 증폭된 것을 도 18의 겔 전기영동 결과를 통해 확인할 수 있었다.

(2) 바코드 단편과 BREP 혼성화 및 연장단계

[단계 2]에서는 [단계 1]과정이 끝난 후 [단계 1]과정의 산물을 이용하여 다음 표 9와 같은 조성을 먼저 제조한 후 60°C에서 10분동안 Thermal shaker를 이용하여 반응을 시켜 [단계 2]를 수행한다.

(3) 제한효소에 의한 ?처 제거 단계

[단계 3]에서는 [단계 2]과정이 끝난 후 [단계 2]과정의 산물을 이용하여 다음 표 10과 같은 조성을 먼저 제조한 후, 37°C에서 30분동안 반응시켜 모든 단계를 완료하였다.

3. 입자 코드 분석 및 형광 시그널 분석 단계

자동형광스캐너 시스템과 분석 소프트웨어에 의해 도 19의 그래프와 같은 결과를 얻었다. Sample로 넣어준 P.vivax 종에 대한 입자에서만 blank 데이터와 형광 값 차이가 있는 것을 확인할 수 있었다. 이로써 본 실시예를 통해 본 발명으로 제시한 다중 진단 방법의 개념이 증명된 것을 확인할 수 있다.

총 진단시간은 2시간 30분이 소요되었다.

이는 본 실시예에 한정하여 기존의 real-time PCR과 비교하였을 때 시간적 우위점을 설명할 수 없으나, 진단해야 할 타겟 핵산서열이 수십, 수백 개 이상으로 증가하였을 때, 기존 real-time PCR 방법은 진단키트 수를 분석 마커 수에 비례하여 증가시키거나 시간이 많이 소요되는 반면 본 발명 방법은 단지 입자 코드 수만 더 추가하면 되기때문에 시간 및 비용적 측면에서 큰 우위가 있다.

본 발명의 실시예들에서는 타겟 핵산서열 (3’--> 5’)를 기준으로 하여, 바코드 프로브, BREP, 프라이머의 구성을 개시하였으나, 타겟 핵산서열 (5’-->3’)을 기준으로 한 구성도 가능하다.

<110> Bioroots <120> METHOD FOR SIMULTANEOUS DETECTION OF MULTIPLE NUCLEIC ACID SEQUENCES, METHOD FOR ANALYZING MULTIPLE NUCLEIC MARKERS AND KIT FOR THE SAME <130> APP20190068 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 204 <212> DNA <213> Plasmodium vivax <400> 1 atggcaccaa aagcaaaaat cgttttagtt ggctcaggta tgattggagg agtaatggct 60 accttaattg ttcagaaaaa tttaggagat gtagttttgt tcgatattgt aaagaacatg 120 ccacatggaa aagctttaga tacatctcat actaatgtta tggcatattc aaattgcaaa 180 gtaagtggtt caaacactta tgac 204 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 gtcataagtg tttgaaccac ttac 24 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 ggatccatgg caccaaaagc aaaaat 26 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p.f-BP <400> 4 gaatagtgtg cgattcatgc cacatggaaa agctttaga 39 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p.f-BR <400> 5 aggacgggat ccacagaatc gcacactatt cttttttttt 40 <210> 6 <211> 173 <212> DNA <213> Plasmodium vivax <400> 6 tcgccctcta ctgcagcatc ataaataagt ttccttttca aatataattt tcgaaatgtt 60 atatcactat gaaaatttgt gtctgtatta tttaccaaat tcgtaagttc cttcatacat 120 aattgatatc ttcgatctgg tatacaaaca tccttcttag tgttacagtc cca 173 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pf-R <400> 7 gtcataagtg tttgaaccac ttac 24 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pf-F <400> 8 ggatccatgg caccaaaagc aaaaat 26 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pf-BP <400> 9 gaatagtgtg cgattcatgc cacatggaaa agctttaga 39 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PV-R <400> 10 tcgccctcta ctgcagcatc 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PV-F <400> 11 tgggactgta acactaagaa gg 22 <210> 12 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PV-BP <400> 12 ggaaccggaa gaagagtata ccagatcgaa gatatcaatt atg 43 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PO-R <400> 13 cctttaccct tgtccccact 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PO-F <400> 14 ggcagtgata gcattgacga 20 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PO-BP <400> 15 ctatccttgt tgcttgcatg gcgttggtat gaataccag 39 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pm-R <400> 16 gcccttatac cacttccaca a 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pm-F <400> 17 gcagcaggaa atgaaaaagc 20 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pm-BP <400> 18 tctggtatcg tgttcagtat tacggaggaa tggtcacca 39 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pf-BR <400> 19 aggacgggat ccacagaatc gcacactatt cttttttttt 40 <210> 20 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pv-BR <400> 20 aggacgggat ccacaccgtc ttcttccggt tccttttttt tt 42 <210> 21 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> po-BR <400> 21 aggacgggat ccacaccgaa gcaacaagga tagttttttt tt 42 <210> 22 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pm-BR <400> 22 aggacgggat ccacaccgga acacgatacc agattttttt tt 42

Claims (27)

1. 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브 부위 및 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바코드 부위를 포함하는 바코드 프로브(Barcode probe)와, 바코드 리셉터-부호화 입자(Barcode receptor-Encoding particle, BREP)를 사용하여 타겟 핵산서열을 검출하는 방법으로서, 다음의 단계들을 포함하는 방법:
   (A) 상기 타겟 핵산서열을 업스트림 프라이머 및 바코드 프로브와 혼성화 시키는 단계로서; 상기 프로브 부위는 타겟 핵산서열에 혼성화되고, 상기 바코드 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않고, 상기 업스트림 프라이머는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하되 상기 바코드 프로브 보다 업스트림에 위치하는 단계;
   (B) 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (A)의 결과물을 접촉시켜 상기 바코드 프로브를 절단하는 단계로, 상기 업스트림 프라이머는 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 연장가닥 형성 및 상기 바코드 프로브의 절단을 유도하여 상기 바코드 프로브의 바코드 부위를 방출하는 단계;
   (C) 상기 방출된 바코드 부위를 상기 바코드 리셉터-부호화 입자와 혼성화시키는 단계로서; 바코드 리셉터-부호화 입자는, 다공성 또는 비다공성 재질의 마이크로미터 사이즈의 고체 입자로서 패턴이 형성되어 코드화된 부호화 입자와 상기 부호화 입자에 결합된 바코드 리셉터를 포함하고, 상기 바코드 리셉터는 올리고뉴클레오타이드로서, 상기 부호화 입자에 결합된 부분부터 순차로 i)상기 바코드 부위를 혼성화 시킬 수 있는 상보적인 서열을 가지는 C-바코드부, ii)상기 바코드 프로브의 바코드 부위 및 프로브 부위 각각에 비-상보적 서열을 갖는 연장서열부, 및 iii) 상기 바코드 프로브의 바코드 부위 및 프로브 부위 각각에 비-상보적 서열을 갖는 제한효소 인식 서열부를 포함하고; 상기 바코드 리셉터에 화학적으로 합성되어 있는 리포터(reporter)를 포함하되, 상기 리포터는 상기 제한효소 인식 서열부 보다 업스트림에 위치하고, 상기 제한효소 인식 서열부에 화학적으로 합성되고 상기 리포터를 제어하는 퀀처(quencher)를 가지는, 방출된 바코드 부위의 혼성화 단계;
   (D) 상기 단계 (C)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서, 상기 C-바코드부와 혼성화된 상기 바코드 부위가 연장되어 상기 연장서열부 및 제한효소 인식 서열부와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥이 생성되어 연장이합체를 형성하는 단계;
   (E) 제한효소에 의해, 상기 단계 (D)의 결과물인 상기 연장이합체에서 제한효소 인식서열부의 연장이합체를 절단하는 단계로서; 제한 효소에 의해 제한효소 인식서열부와 그에 합성된 퀀처가 동시에 제거되는 단계; 및
   (F) 상기 단계 (E)의 결과물에 대한 현미경 관찰을 통해 BREP의 코드를 식별하고, 단계 (E)에서의 절단 반응의 발생으로 인해 상기 퀀처가 제거됨으로써 제어된 리포터가 발생시키는 형광 신호를 측정하는 단계로서, 상기 절단 반응의 발생은 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타내고, 상기 신호를 검출하여 타겟 핵산서열의 존재를 확인하는 단계.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   단계 (F)는,
   (G) 상기 단계 (E)의 결과물에 대한 현미경 관찰을 통해 상기 부호화 입자의 코드를 광학적으로 측정하는 단계로서; 상기 코드는 상기 타겟 염기서열과 1:1 대응 관계로서, 상기 부호화 입자의 코드를 측정하는 단계; 및
   (H) 상기 제어된 리포터가 발생시키는 신호의 측정 결과를 상기 (G) 단계의 측정 결과와 함께 처리하여 상기 타겟 염기서열과 대응 관계인 코드를 식별함으로써, 타겟 염기서열의 존재를 판단하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산서열을 검출하는 방법.
   
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 타겟 핵산서열은 DNA 또는 RNA에 존재하는 핵산서열이고, 단일 용기 내에 존재하는 복수 개의 상기 타겟 핵산서열을 검출할 수 있고, 10 개 이상 100개 이하의 타겟 핵산서열을 동시에 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산서열을 검출하는 방법.
   
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 업스트림 프라이머는 올리고뉴클레오타이드이며 중합효소 연쇄 반응 기술 (PCR) 및 실시간 중합효소 연쇄 반응 기술 (real-time PCR)에서 포함되는 중합반응 개시를 위한 프라이머인 것을 특징으로 하는 타겟 핵산서열을 검출하는 방법.
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 바코드 프로브의 3’말단은 연장을 제어하기 위해 탄소 사슬 또는 퀀처를 갖는 것을 특징으로 하고,
   상기 리포터는 상기 퀀처와 소정의 거리 이상 이격될 경우 시각적 또는 비시각적으로 외부에서 인식할 수 있는 신호를 발생시킬 수 있는, 타겟 핵산서열을 검출하는 방법.
   
6. 청구항 1에 있어서,
   상기 바코드 프로브는 올리고 뉴클레오타이드이며, 서열 길이는 10~100 bp 로 제조될 수 있으며, 바코드 부위는 BREP과의 효율적 혼성화 반응을 위해 10 내지 80 의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산서열을 검출하는 방법.
7. 청구항 1에 있어서,
   상기 부호화 입자는 코드 식별을 위해 하나 이상의 기준 점과 하나 이상의 홀을 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산서열을 검출하는 방법.
8. 청구항 1에 있어서,
   상기 부호화 입자는 PEG 성분을 기반으로 제조되고, 하나의 부호화 입자는 복수의 동일한 바코드 리셉터를 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산서열을 검출하는 방법.
   
9. 청구항 1에 있어서,
   상기 단계들은 하나의 용기 내에서 실시되고, 상기 하나의 용기는 바이오 실험에서 사용되는 1.5 ml 샘플 튜브, 0.2 ml PCR 튜브, 세포 계측용 마이크로 칩 챔버, 웰 플레이트 등을 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산서열을 검출하는 방법.
   
10. 청구항 1에 있어서,
    복수개의 타겟 핵산마커 증폭을 위한 복수개의 프라이머 쌍, PCR 버퍼 폴리머라제, dNTP 를 이용하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산서열을 검출하는 방법.
    
11. 청구항 1에 있어서,
    상기 타겟 핵산서열의 증폭을 위해 PCR용 온도 가변 장치 (Thermal cycler)를 사용하고,
    상기 BREP와 제한효소는 프라이머 및 바코드 프로브와 같이 상기 (A) 단계에서 반응 용기에 투입되는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산서열을 검출하는 방법.
    
12. 청구항 1에 있어서,
    상기 바코드 프로브는 변성과정에서 분리된 단일가닥의 핵산마커에 결합되고, 프라이머에 의한 연장 단계에서 프로브 부위가 제거되고 바코드 부위는 분리되어 나오게 되고, 증폭 횟수에 따라 동일하게 바코드 부위도 증폭 생산되는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산서열을 검출하는 방법.
    
13. 청구항 1에 있어서,
    상기 (A) 및 (B) 단계의 반복에 의해 복수개의 타겟 핵산서열의 증폭이 완료된 후 BREP와 제한효소가 포함된 용액을 추가로 첨가하여 상기 (C) 내지 (F)를 실행하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산서열을 검출하는 방법.
    
14. 청구항 13에 있어서,
    타겟 핵산서열과 대응하는 바코드 프로브 및 BREP는 연동되게 설계되어, 하나의 타겟 핵산서열에 대해, 상보적인 프로브 부위, 이와 결합되는 바코드 부위, 바코드 부위와 상보적인 C-바코드부, BREP의 코드는 서로 관련되고(correlated),
    서로 다른 타겟 핵산서열에 대한 바코드 프로브 및 BREP의 코드는 상이하고,
    상기 용액에는 타겟 핵산서열당 이를 검출하기 위한 대응하는 BREP이 5 ~ 50개 포함되는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산서열을 검출하는 방법.
    
15. 청구항 1에 있어서,
    상기 부호화 입자와 상기 C-바코드부 사이에 링커(linker)가 포함되는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산서열을 검출하는 방법.
    
16. 청구항 1에 있어서,
    증폭된 바코드 부위가 상보적 염기서열을 가진 C-바코드 부를 가지는 바코드 리셉터-인코딩 입자와 혼성화 (Hybridization) 되는 단계에서, 타겟 핵산서열이 분석 시료에 존재하지 않아 바코드 프로브로 존재할 경우 상보적 C-바코드 부를 가진 BREP와 혼성화가 되지만, 프로브 부위의 존재로 인해 연장이 제한되는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산서열을 검출하는 방법.
    
17. 청구항 1에 있어서,
    측정을 위한 형광 현미경 장치는 코드 식별을 위한 일반 조명 모드와 형광 측정을 위한 형광 조명 모드를 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산서열을 검출하는 방법.
    
18. 다음의 단계를 포함하는, 바코드 프로브 (Barcode probe)와 바코드 리셉터-부호화 입자(Barcode receptor-Encoding particle, BREP)를 사용한 다중 핵산마커 검출 방법:
    하나의 공간(container)에서,
    (a) 타겟 핵산마커를 변성화하고, 상기 타겟 핵산마커의 변성에 의한 제 1 단일가닥 핵산 서열 (3’--> 5’)을 포워드 프라이머(forward primer) 및 바코드 프로브와 혼성화 시키는 단계로서; 상기 포워드 프라이머는 상기 제 1 단일가닥의 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 바코드 프로브는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-프로브 부위 및 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-바코드 부위를 포함하며; 상기 3’-프로브 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화 되고, 상기 5’-바코드 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 포워드 프라이머는 상기 3’-프로브 부위 보다 업스트림 핵산서열에 위치하고; 리버스 프라이머 (Reverse primer)는 상기 타겟 핵산마커의 변성에 의한 제 2 단일가닥 핵산 서열 (5’--> 3’)에 혼성화 되며;
    (b) 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서, 상기 포워드 프라이머의 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 형성된 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 상기 바코드 프로브의 절단을 유도하여 상기 바코드 프로브의 5’-바코드 부위만을 방출하며; 동시에 상기 리버스 프라이머는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 제 2 단일가닥의 상보적인 제 2 연장가닥을 형성하고;
    (c) 상기 바코드 프로브로부터 방출된 상기 5’-바코드 부위를 상기 바코드 리셉터-부호화 입자와 혼성화 시키는 단계로서, 상기 BREP은 부호화 입자와 바코드 리셉터로 구성되고, 상기 바코드 리셉터는 올리고뉴클레오타이드로서 3’말단은 상기 부호화 입자에 공유 또는 비공유 결합으로 결합되어 있으며; 상기 부호화 입자는 다공성 또는 비 다공성 재질의 마이크로미터 사이즈의 고체 입자로서 표면에 패턴이 형성되어 코드화되어 있으며; 상기 바코드 리셉터는 3’--> 5’순서로 고체 표면으로부터, i) 상기 방출된 바코드 부위의 혼성화 시 공간적 제약문제를 해결할 수 있는 링커 (linker)물질, ii)상기 방출된 5’-바코드 부위를 혼성화 시킬 수 있는 상보적인 서열을 가지는 C-바코드 부, iii)상기 바코드 프로브의 5’-바코드 부위 및 3’-프로브 부위 각각에 비-상보적 서열을 갖는 연장서열부, 및 iv) 제한효소 인식 서열부를 포함하고, 상기 C-바코드 부 또는 연장서열부에는 형광물질이 화학적으로 합성되어 있고, 상기 형광물질의 형광을 상시 제어하기 위한 퀀처가 상기 제한효소 인식 서열부에 합성되어 있으며; 상기 방출된 5’-바코드 부위는 BREP의 상기 C-바코드부에 혼성화 되고;
    (d) 상기 단계 (c)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서; 상기 C-바코드부에 혼성화된 상기 5’-바코드 부위는 연장되어 상기 연장서열부 및 제한효소 인식 서열부와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥이 생성되어 연장이합체를 형성하며;
    (e) 상기 단계 (d)의 결과물인 상기 연장이합체 중 제한효소 인식 서열부의 연장이합체를 제한효소가 절단할 수 있는 조건 하에서 접촉시켜 절단하는 단계로서, 제한효소 인식 서열부와 그에 합성되어 있는 퀀처가 동시에 제거되는 단계; 및
    (f) 상기 단계 (e)의 결과물을 현미경 관찰을 통해 BREP의 코드를 식별하고 형광 신호의 유무와 정도를 확인하는 단계.
    
19. 청구항 18에 있어서,
    상기 코드는 홀 또는 음각으로 표시되고,
    상기 타겟 핵산서열과 상기 코드는 1:1 대응관계이고,
    상기 단계 (a) 및 (b)의 변성과 혼성화, 연장의 사이클 (cycle)이 연쇄 반복되어 제 1 및 2 연장가닥과 5’-바코드 부위는 사이클 수에 비례하여 복제 생산되는 것을 특징으로 하는 다중 핵산마커 검출 방법.
20. 청구항 18에 있어서,
    상기 (f) 단계는,
    일반적인 백색광 또는 상기 형광물질의 형광 여기 파장이 아닌 단색광을 조사한 상태에서 현미경 관찰을 통해 BREP의 코드를 식별하는 단계; 및
    상기 단계 (e)의 결과물인 BREP을 형광 여기 파장의 광 조사에 의한 현미경 관찰을 통해 형광 신호의 유무 및 정도(abundance)를 확인하는 단계;를 포함하고,
    상기 형광 신호는 단계 (e)에서의 절단 반응의 발생으로 인해 상기 퀀처가 제거됨으로써 제어된 형광물질이 발생시키는 신호이고,
    상기 형광 신호의 유무와 세기(intensity)를 확인함으로써 타겟 핵산서열의 존재를 확인하는 것을 특징으로 하는 다중 핵산마커 검출 방법.
    
21. 청구항 18에 있어서,
    상기 타겟 핵산마커는 DNA 또는 핵산 혼합물이고, 복수개이며,
    타겟 핵산마커 증폭이 완료된 후 BREP와 제한효소가 포함된 용액을 추가로 첨가하고, 상기 용액에는 하나의 핵산마커당 상보적인 BREP이 5~20개 포함되는 것을 특징으로 하는 다중 핵산마커 검출 방법.
    
22. 다음을 포함하는, 복수의 타겟 핵산서열를 동시에 검출하기 위한 다중 핵산서열 검출 키트:
    (a) 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-프로브 부위 및 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-바코드 부위를 포함하는 바코드 프로브 (Barcode probe); 및
    (b) 부호화 입자와 바코드 리셉터로 구성된 바코드 리셉터-부호화 입자(Barcode receptor-Encoding particle, BREP)로서, 상기 부호화 입자는 다공성 또는 비다공성 재질의 고체 입자로서 마이크로미터 사이즈의 크기를 가지고 입자에 형성된 패턴 형상에 의해 코드화 되며, 코드의 식별이 현미경 관찰을 통해 가능하며; 상기 부호화 입자에 하나 이상의 바코드 리셉터가 공유 결합 또는 비공유 결합으로 3’말단이 결합되어 있으며; 상기 바코드 리셉터는 올리고뉴클레오타이드로서, 3’--> 5’순서로 고체 표면으로부터, i) 바코드 부위를 혼성화 시킬 수 있는 상보적인 서열을 가지는 C-바코드 부, ii)상기 바코드 프로브의 프로브 부위와 비-상보적 서열을 갖는 연장 서열부, 및 iii) 제한효소 인식 서열부를 가지고; 상기 C-바코드 부 또는 연장 서열부에는 형광물질이 화학적으로 합성되어 있고, 상기 형광물질의 작용을 제어하기 위한 퀀처가 상기 제한효소 인식 서열부에 합성되어 있으며; 상기 바코드 프로브로부터 방출된 바코드 부위는 상기 BREP의 상기 C-바코드 부에 혼성화 되는, BREP.
    
23. 청구항 22에 있어서,
    (c) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머로서, 상기 프라이머는 상기 3’-프로브 부위 보다 업스트림에 위치하며, 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 연장 및 상기 바코드 프로브의 절단을 유도하여 상기 5’-바코드 부위 또는 5’-바코드 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하도록 하는 프라이머; 및
    (d) 상기 BREP의 C-바코드 부에 혼성화된 상기 단편이 연장되어 상기 BREP의 연장서열부와 제한효소 인식 서열부와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥이 생성되어 연장이합체를 형성하면 제한효소 인식 서열부의 연장이합체를 절단하여 제한효소 인식 서열부와 그에 합성되어 있는 퀀처부를 동시에 제거하는 제한효소;을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 핵산서열 검출 키트.
    
24. 청구항 22에 있어서,
    상기 부호화 입자의 상기 패턴 형상은 부호화 입자의 표면에 형성된 음각 또는 관통공을 포함하고,
    상기 C-바코드 부의 염기서열은 상기 바코드 프로브의 바코드 부위와 상보적이고, 상기 바코드 부위는 상기 프로브 부위와 1:1 대응 관계이므로 상기 프로브 부위와 상보적인 상기 타겟 염기서열은 상기 부호화 입자와 1:1 대응 관계인 것으로 특징으로 하는 다중 핵산서열 검출 키트.
    
25. 청구항 22에 있어서,
    프라이머 쌍, 중합에 사용되는 버퍼혼합물, 중합효소 및 제한효소로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 더 포함하는, 다중 핵산서열 검출 키트.
    
26. 청구항 22에 있어서,
    상기 타겟 핵산서열은 타겟 핵산마커인 DNA 또는 RNA의 핵산서열인 것을 특징으로 하는 다중 핵산서열 검출 키트.
    
27. 청구항 22에 있어서,
    상기 바코드 프로브는 프로브 부위의 말단에 연결된 블록커를 더 포함하는, 다중 핵산서열 검출 키트.
    

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