JP2007506431A - プログラム可能な分子バーコード - Google Patents
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Abstract
Description
本方法、組成物および装置は、分子バーコードの分野に関する。本発明の具体的な態様は、有機ポリマー骨格から分子バーコードを作製する方法に関する。複数の分子バーコードは、骨格上の異なる部位にタグを付着させることにより同じ骨格を用いて作製されうる。他の態様において、分子バーコードは、プローブ領域および1つまたは複数のコード構成要素を含んでもよい。他の態様において、分子バーコードは、標的分子の検出のための1つまたは複数のプローブに付着したポリマーラマン標識を含んでもよい。
生体分子の検出および/または同定は、医学的診断学、法科学、毒物学、病理学、生物戦、公衆衛生学および多数の他の分野における様々な適用として利用される。研究される生体分子の原則クラスは、核酸およびタンパク質であるが、炭水化物、脂質、多糖、脂肪酸などのような他の生体分子が対象となる。迅速で、信頼性があり、且つ費用効率が高い生体分子の同定の方法、類似した生体分子間を識別する方法、ならびに病原性胞子または微生物のような巨大分子複合体の分析についての必要性が存在している。
以下の詳細な説明は、本発明の開示された態様のより完全な理解を提供するために、多数の特定の詳細を含む。しかしながら、態様は、これらの特定の詳細なしに実施されうることは、当業者に明らかであると思われる。他の例では、当技術分野において周知である装置、方法、手順および個々の構成要素が、本明細書に詳細に記載されている。
本明細書に用いられる場合、「1つの(a)」または「1つの(an)」は、1つまたは1つより多いものを意味しうる。
開示された方法、組成物および装置は、核酸およびタンパク質のような生体分子の検出、同定ならびに/またはタグ付けに利用される。本発明の特定の態様において、方法、組成物および装置を、骨格の様々な修飾を行うことにより単一の有機骨格から複数のバーコードを作製するために用いることができる。態様は、単一の骨格に限定されず、1つまたは複数の異なる骨格を利用してもよい。利点には、骨格に沿ってタグの付着部位を変えることにより、同じ骨格で異なるバーコードを作製する能力が含まれる。他の態様は、生体分子の迅速な同定のための、または生体分子にタグを付けるための、ポリマーラマン標識を作製することに関する。他の利点には、感度が高くかつ正確な、ポリペプチドの検出および/または同定が含まれる。
本発明の一つの態様において、図1に示されているが、バーコード骨格110は、核酸、ペプチド、多糖および/または化学的に誘導されたポリマーの配列の任意の組み合わせを含む、有機的構造を含むポリマー鎖から形成されうる。特定の態様において、骨格110は、一本鎖または二本鎖核酸を含みうる。いくつかの態様において、骨格は、オリゴヌクレオチド、抗体またはアプタマーのようなプローブ部分150に付着しうる。骨格110は、追加の形態的多様性およびタグ付着部位を生じるために、1つまたは複数の分岐構造120で修飾されうる。分岐構造120は、当技術分野において周知の技術を用いて形成されうる。例えば、バーコード100が二本鎖核酸を含む場合、分岐構造120は、オリゴヌクレオチドの合成および一本鎖鋳型核酸へのハイブリダイゼーションにより形成されうる。オリゴヌクレオチドは、配列の一部(例えば、5'末端)は鋳型と相補的であり、かつ一部(例えば、3'末端)はそうではないように、設計されうる。従って、バーコード100は、二本鎖配列のセグメントおよび一本鎖分岐構造120の短いセグメントを含む。図1に開示されているように、タグ130は、例えば、分岐構造120の一本鎖部分と配列において相補的である標識130オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、バーコードに付加されうる。
本発明の他の態様は、図5に示されているが、ハイブリダイゼーションによりバーコード530を作製する方法に関する。この態様において、バーコード530は、オリゴヌクレオチド520にハイブリダイズした核酸500を含む。1つまたは複数のタグ部分510は、例えば、公知の化学合成技術により作製された、既知の配列のオリゴヌクレオチド520に付着しうる。タグ付きオリゴヌクレオチド520を作製するための様々な方法は、当技術分野において周知である。バーコード530は、一連のタグ付きオリゴヌクレオチド520の、一本鎖DNA鋳型500へのハイブリダイゼーションにより形成される。鋳型500は、コンテナ部540およびプローブ部550を含む。プローブ部550は、相補的な標的核酸配列にハイブリダイズするように設計される。または、プローブ部550は、タンパク質、ペプチドまたは他の標的生体分子に結合できるアプタマー配列を含んでもよい。様々な態様において、プローブ領域540は、2〜30、4〜20または14〜15ヌクレオチド長の間でありうる。プローブ550の長さは、制限はなく、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、200、250ヌクレオチドまたはより長いプローブ部550が企図される。
本発明の特定の態様において、ポリマーラマン標識バーコードが作製されうる。一般的に、ポリマーラマン標識は、ラマンタグが直接的にまたはスペーサー分子を介して付着している骨格部分を含む。骨格部分は、限定されるわけではないが、ヌクレオチド、アミノ酸、単糖、またはビニル、スチレン、カーボネート、アセテート、アクリルアミドなどのような様々な公知のプラスチックモノマーのいずれかを含む、ポリマー化に適した任意の型のモノマーから構成されうる。ポリマーラマン標識は、オリゴヌクレオチド、抗体、レクチンまたはアプタマープローブのようなプローブ部分に付着しうる。ポリマー骨格がヌクレオチドモノマーから構成されている場合、抗体プローブへの付着は、プローブおよび骨格の両方の構成要素の異なる標的分子への結合の可能性を最小限にする。または、骨格についてヌクレオチドモノマーを用いる本発明の特定の態様において、ポリマーラマン標識へ取り込まれたヌクレオチドの配列を、標的核酸と相補的であるように設計さしてもよく、プローブ機能がポリマーラマン標識へ組み入れられることを可能にする。ヌクレオチドに基づいた骨格は、それ自身、付着したラマンタグの検出に干渉しうる可能性があるラマン発光スペクトルを生じるため、いくつかの態様において、有るか無しかのラマン発光シグナルを生じる骨格構成要素が、シグナル検出を最適化し、かつシグナル対ノイズ比を最小限にするために用いられうる。以下の段落は、概して、ポリマーラマン標識に関するものであるが、非限定的に、使用されるモノマーユニットの特定の型についてである。
2',3'-ddA-5'-CEホスホラミダイト
2'-デオキシアデノシンa-チオトリホスフェート(15 mM)(2'dATTPaS)
2'-フルオロ-アデノシンa-チオトリホスフェート(10 mM)(2'-F-ATTPaS)
2'-OMe-A-CEホスホラミダイト
2'-OMe-A-Meホスホラミダイト
2'-OMe-A-RNA
2'-OMe-アデノシンa-チオトリホスフェート(20 mM)(2'-O-Me-ATTPaS)
2'-OMe-Pac-A-CEホスホラミダイト
2-アミノ-dA-CEホスホラミダイト
2-アミノプリンリボシドa-チオトリホスフェート(20 mM)(2-AP-TTPaS)
2-F-dA-CEホスホラミダイト
3'-A-TOM-CEホスホラミダイト
3'-dA-CEホスホラミダイト
3'-dA-CPG
7-デアザ-アデノシンa-チオトリホスフェート(1 mM)(7-DATTPaS)
7-デアザ-dA-CEホスホラミダイト
8-アミノ-dA-CEホスホラミダイト
8-Br-dA-CEホスホラミダイト
8-オキソ-dA-CEホスホラミダイト
A-TOM-CEホスホラミダイト
A-RNA-TOM-CPG
アデノシンa-チオトリホスフェート(0.5 mM)(ATTPaS)
Bz-A-CEホスホラミダイト
Bz-A-RNA-CPG
dA-5'-CEホスホラミダイト
dA-5'-CPG
dA-CEホスホラミダイト
dA-CPG 1000
dA-CPG 2000
dA-CPG 500
dA-高荷重-CPG
dA-Meホスホラミダイト
dA-Q-CPG 500
ジアミノプリンリボシドa-チオトリホスフェート(0.25 mM)(DTTPaS)
シーケンシングされうる核酸分子は、任意の標準技術により調製されうる。一つの態様において、核酸は、天然に存在するDNAまたはRNA分子でありうる。RNAが用いられる場合、RNAを相補的cDNAに変換することが望ましい可能性がある。事実上、非限定的に、染色体、ミトコンドリアもしくは葉緑体DNA、またはメッセンジャー、ヘテロ核、リボソームもしくはトランスファーRNAを含む、任意の天然に存在する核酸が、本発明の方法により、調製され、かつシーケンシングされうる。様々な型の細胞の核酸を調製および単離する方法は公知である(例えば、Guide to Molecular Cloning Techniques, eds. Berger and Kimmel, Academic Press, New York, NY, 1987; Molcecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, eds. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989参照)。天然に存在しない核酸もまた、開示された方法および組成物を用いてシーケンシングされうる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR(商標))増幅のような標準的増幅技術により調製された核酸は、本発明の範囲内でシーケンシングされうる。核酸増幅の方法は、当技術分野において周知である。
様々な態様において、核酸分子は、固体表面への付着により固定化されうる。核酸分子の固定化は、支持体または表面への非共有結合性かまたは共有結合性のいずれかの付着を含む様々な方法により達成されうる。例示的態様において、固定化は、固体表面をストレプトアビジンまたはアビジンでコーティングすること、およびビオチン化ポリヌクレオチドの結合により達成されうる。固定化はまた、ポリスチレン、ガラスまたは他の固体表面をポリ-L-LysまたはポリL-Lys、Pheでコーティングし、続いて、二官能性架橋試薬を用いるアミノ修飾かまたはスルフヒドリル修飾のいずれかの核酸の共有結合性付着により、生じうる。アミン残基は、アミノシランの使用を通して表面上へ導入されうる。
特定の態様において、タンパク質またはペプチドは、単離または精製されうる。一つの態様において、これらのタンパク質は、図示されたバーコード(例えば、ポリマーラマン標識)のいずれかでのタグ付けのための抗体を作製するために用いられうる。タンパク質精製技術は当業者に周知である。これらの技術は、あるレベルにおける、細胞、組織または器官のポリペプチドおよび非ポリペプチド画分へのホモジナイゼーションおよび粗分画を含む。対象となるタンパク質またはポリペプチドは、部分的または完全な精製(または均一性への精製)を達成するためにクロマトグラフィーおよび電気泳動の技術を用いてさらに精製されうる。純粋なペプチドの調製に特に適した分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、HPLC(高性能液体クロマトグラフィー)FPLC(AP Biotech)、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、および等電点電気泳動である。アフィニティークロマトグラフィーによる受容体タンパク質精製の例は、米国特許第5,206,347号に開示されており、その全本文は、参照により本明細書に組み入れられている。ペプチドを精製するより効率的な方法の1つは、高速液体クロマトグラフィー(AKTA FPLC)、すなわちHPLCである。
本発明によるポリペプチドの調製についてのもう一つの態様は、モノクローナル抗体産生のためのペプチド模倣体の使用である。模倣体は、タンパク質二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子である。例えば、参照により本明細書に組み入れられている、Johnson et al., "Peptide Turn Mimetics" in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et al., Eds., Chapman and Hall, New York (1993)を参照のこと。ペプチド模倣体の使用の基礎をなす理論的根拠は、タンパク質のペプチド骨格は、主として、抗体と抗原のもののような分子相互作用を促進するような様式でアミノ酸側鎖を配向するように存在することである。ペプチド模倣体は、天然分子と類似した分子相互作用を可能にすることが期待される。これらの原理は、本明細書に開示されたターゲティングペプチドの天然の性質の多くを有するが、変化したおよび改善までもされた特性をもつ、第二世代分子を操作するために用いられうる。
本発明の他の態様は融合タンパク質に関する。これらの分子は、一般的に、第二ポリペプチドもしくはタンパク質の全部または部分へN末端またはC末端において連結した、ターゲティングペプチドの全部または実質的部分を有する。例えば、融合は、異種性宿主においてタンパク質の組換え発現を可能にするために他の種由来のリーダー配列を用いうる。もう一つの有用な融合は、融合タンパク質の精製を容易にするために、抗体エピトープのような免疫学的活性ドメインの付加を含む。融合接合部における、または近くの切断部位の含有は、精製後、外来性ポリペプチドの除去を容易にする。他の有用な融合は、酵素由来の活性部位、グリコシル化ドメイン、細胞ターゲティングシグナルまたは膜貫通領域のような機能性ドメインの連結を含む。特定の態様において、融合タンパク質は、治療タンパク質またはペプチドに連結したターゲティングペプチドを含む。本発明の範囲内において、事実上、任意のタンパク質またはペプチドが、ターゲティングペプチドを含む融合タンパク質へ組み入れられうる。融合タンパク質を作製する方法は、当業者に周知である。そのようなタンパク質は、例えば、二官能性架橋試薬を用いる化学的付着により、完全な融合タンパク質の新たな合成により、またはターゲティングペプチドをコードするDNA配列の第二ペプチドもしくはタンパク質をコードするDNA配列への付着、続いて無傷の融合タンパク質の発現により、生成されうる。
比較的小さなサイズのため、真菌の選択過程後に同定されたペプチドは、通常の技術に従って溶液中または固体支持体上で合成されてもよい。様々な自動シンセサイザーが市販されており、公知のプロトコールに従って使用されうる。例えば、参照として本明細書に組み入れられるStewart and Young, (1984); Tam et al., (1983); Merrifield, (1986);およびBarany and Merrifield (1979)を参照されたい。短いペプチド配列(通常には約6アミノ酸から約35〜50アミノ酸まで)はそのような方法により容易に合成されうる。または、組換えDNAテクノロジーを用いてもよく、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現ベクターへ挿入され、適切な宿主細胞へ形質転換またはトランスフェクションされ、発現に適した条件下で培養される。
核酸シーケンシング
特定の態様において、本明細書に開示されているように形成されたバーコードを、標的核酸分子をシーケンシングするために使用することができる。ハイブリダイゼーションによりシーケンシングする方法は、当技術分野において公知である。既知の配列のプローブを含む1つまたは複数のタグ付きバーコードを、標的核酸配列にハイブリダイズするようにさせておいてもよい。タグ付きバーコードの標的への結合は、標的鎖における相補配列の存在を示す。複数の標識バーコードを、標的分子に同時にハイブリダイズするようにさせておき、同時に検出してもよい。代替の態様において、結合したプローブは、個々の標的分子に付着して同定されてもよい、または特定の標的分子の複数コピーをプローブ配列の重複セットに同時に結合するようにさせておいてもよい。個々の分子は、例えば、検出様式と連結された公知の分子コーミング技術を用いてスキャンされうる。(例えば、Bensimon et al., Phys. Rev. Lett. 74:4754-57, 1995; Michalet et al., Science 277:1518-23, 1997;米国特許第5,840,862号;第6,054,327号;第6,225,055号;第6,248,537号;第6,265,153号;第6,303,296号および第6,344,319号を参照。)
特定の態様において、試料における標的分子は、バーコードに結合することにより検出、同定および/または定量化されうる。特定の標的に結合するように設計されたタグ付きバーコードは、上記で考察されているように調製されうる。標的は、核酸に限定されず、タンパク質、ペプチド、脂質、糖、糖脂質、糖タンパク質、または特異的なプローブが調製されうる任意の他の可能性のある標的も含みうる。上記で考察されているように、抗体またはアプタマープローブは、バーコードへ組み入れられ、アプタマーまたは抗体が調製されうる任意の標的を同定するために用いられうる。試料における複数の標的の存在は、各バーコードが識別可能に標識および検出されうるため、同時にアッセイされうる。標的の定量化は、分光学的分析において周知の標準技術により行われうる。例えば、タグ付きバーコードに結合した標的の量は、結合したバーコードのシグナル強度を測定すること、およびバーコード標準の既知の量から作成された検量線との比較により決定されうる。そのような定量化方法は、当技術分野における日常的技術内で十分である。
異なる化学的機能性(例えば、異なる結合特異性)を有するビーズ(例えば、ミクロスフェア)は共に混合されてもよい。各ビーズの機能性を同定する能力は、光学的に質問可能な符号化スキーム(「光学シグネチャー」)を用いて達成されうる。例えば、光学シグネチャーは、上記で考察されているようなポリマーラマン標識を用いて作製されうる。チップまたはマイクロタイタープレートのような基板は、個々のビーズに結合できる個々の部位を含むパターン化された表面を含みうる。これは、プローブ(すなわち、核酸、アプタマーまたは抗体)の合成が、アレイ上のそれらの配置から分離されるのを可能にする。プローブは、合成され、ビーズに付着し、ビーズは、パターン化された表面上に無作為に分布されうる。ビーズは、最初、光学シグネチャーでコードされるので、その結果生じたアレイは、後で「解読」されうる。すなわち、アレイ上の個々の部位の位置と、その特定の部位に位置したビーズまたはプローブの間の相関が作成されうる。ビーズは、アレイ上に無作為に分布されうるため、これは、結果として、アレイ作製についてのインサイチュー合成かまたはスポッティング技術と比較して、速くかつ費用のかからない工程を生じる。
オリゴヌクレオチドプローブ
オリゴヌクレオチド合成の方法は、当技術分野において周知であり、任意のそのような公知の方法を用いることができる。例えば、オリゴヌクレオチドを、市販のオリゴヌクレオチドシンセサイザー(例えば、Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて調製してもよい。様々なタグに付着したヌクレオチド前駆体は商業的に入手されて(例えば、Molecular Probes, Eugene, OR)、オリゴヌクレオチドへ取り込まれうる。または、ビオチン、ジゴキシゲニン、スルフヒドリル、アミノまたはカルボキシル基のような様々な反応性基を含むヌクレオチド前駆体が購入されうる。オリゴヌクレオチド合成後、タグは、標準的化学作用を用いて付着しうる。タグ付着のための反応性基を含むまたは含まない、任意の望ましい配列のオリゴヌクレオチドもまた、幅広い種類の供給元(例えば、Midland Certified Reagents, Midland, TX)から購入されうる。オリゴヌクレオチドプローブはまた、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR(商標))増幅を用いる標準酵素的過程により調製されうる(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harobor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989;米国特許第5,279,721号;第4,683,195号;第4,683,202号;第4,800,159号;第4,883,750号)。
アプタマーは、SELEXと呼ばれるインビトロの進化的過程により引き出されたオリゴヌクレオチドである(例えば、Brody and Gold, Molecular Biotechnology 74:5-13, 2000)。SELEX過程は、可能性のあるアプタマー(核酸リガンド)を標的に曝露する段階、結合を生じるようにさせておく段階、結合したものを遊離核酸リガンドから分離する段階、結合したリガンドを増幅する段階、およびその結合過程を繰り返す段階の繰り返しサイクルを含む。多数のサイクル後、事実上、任意の型の生物学的標的に対して高い親和性および特異性を示すアプタマーが調製されうる。それらの小さなサイズ、相対的安定性および調製の容易さのために、アプタマーは、プローブとしての使用によく適しうる。アプタマーはオリゴヌクレオチドから構成されるため、それらは、核酸型バーコードへ容易に組み入れられうる。アプタマーの作製の方法は周知である(例えば、米国特許第5,270,163号;第5,567,588号;第5,670,637号;第5,696,249号;第5,843,653号)。または、特定の標的に対する様々なアプタマーは、商業的供給元(例えば、Somalogic, Boulder, CO)から入手されうる。アプタマーは、約7 kDa〜50 kDaの比較的小さな分子である。
抗体の産生の方法もまた、当技術分野において周知である(例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988)。プローブとしての使用に適したモノクローナル抗体はまた、多数の商業的供給元から入手されうる。そのような市販の抗体は、幅広い種類の標的に対して有効である。抗体プローブは、下に考察されているように、標準的化学作用を用いてバーコードに結合されうる。
本発明の様々な態様において、バーコードは、検出および/または同定を容易にするために1つまたは複数のタグ部分に付着しうる。当技術分野において公知の任意の検出可能なタグが用いられうる。検出可能なタグは、限定されるわけではないが、電気的、光学的、分光光度的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的技術により検出できる任意の組成物を含みうる。タグは、限定されるわけではないが、導電性、ルミネセンス、蛍光、化学ルミネセンス、生物ルミネセンスおよびリン光性の部分、量子ドット、ナノ粒子、金属ナノ粒子、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、色原体、抗体、抗体断片、遺伝子操作された抗体、酵素、基質、補因子、インヒビター、結合タンパク質、磁気粒子、ならびにスピン標識化合物を含みうる。(米国特許第3,817,837号;第3,850,752号;第3,939,350号;第3,996,345号;第4,277,437号;第4,275,149号;および第4,366,241号。)
使用されるラマンタグの非限定的例は、TRIT(テトラメチルローダミンイソチオール)、NBD(7-ニトロベンズ-2-オキザ-1,3-ジアゾール)、テキサスレッド色素、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレシルファストバイオレット、クレシルブルーバイオレット、ブリリアントクレシルブルー、パラ-アミノ安息香酸、エリトロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン、5-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン、TET(6-カルボキシ-2',4,7,7'-テトラクロロフルオレセイン)、HEX(6-カルボキシ-2',4,4',5',7,7'-ヘキサクロロフルオレセイン)、Joe(6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン)5-カルボキシ-2',4',5',7'-テトラクロロフルオレセイン、5-カルボキシフルオレセイン、5-カルボキシローダミン、Tamra(テトラメチルローダミン)、6-カルボキシローダミン、Rox(カルボキシ-X-ローダミン)、R6G(ローダミン6G)、フタロシアニン、アゾメチン、シアニン(例えば、Cy3、Cy3.5、Cy5)、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、N,N-ジエチル-4-(5'-アゾベンゾトリアゾリル)-フェニルアミン、およびアミノアクリジンを含む。これらを始めとするラマンタグは、商業的供給元(例えば、Molecular Probes, Eugene, OR)から入手されうる。
使用される可能性のある蛍光タグは、限定されるわけではないが、フルオレセイン、5-カルボキシフルオレセイン(FAM)、2'7'-ジメトキシ-4'5'-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(JOE)、ローダミン、6-カルボキシローダミン(R6G)、N,N,N',N',-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、4-(4'-ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、および5-(2'-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸(EDANS)を含む。他の可能性のある蛍光タグは当技術分野において公知である(例えば、米国特許第5,866,336号)。幅広い種類の蛍光タグは、Molecular Probes(Eugene, OR)のような商業的供給元から入手されうる。タグ付き分子の蛍光検出の方法もまた、当技術分野において周知であり、任意のそのような公知の方法が用いられうる。
ナノ粒子は、例えば、バーコードが様々な様式により検出されることになっている場合、タグとして使用可能である。ナノ粒子を調製する方法は公知である(例えば、米国特許第6,054,495号;第6,127,120号;第6,149,868号; Lee and Meisel, J. Phys. Chem. 86:3391-3395, 1982)。ナノ粒子はまた、商業的に入手されうる(例えば、Nanoprobes Inc., Yaphank, NY; Polysciences, Inc., Warrington, PA)。金または銀ナノ粒子は、タグとして最も一般的に用いられるが、ナノ粒子の任意の型または組成物は、バーコードに付着してタグとして使用可能である。
タグは、1マイクロメートル未満のサイズの金属性タグを含みうる(例えば、Nicewarner-Pena et al., Science 294:137-141, 2001)。Nicewarner-Pena et al. (2001)は、異なる型の金属から構成された、1マイクロメートル未満のストライプでコードされたマルチメタルマイクロロッドを調製する方法を開示している。この系は、非常に多数(金属の2つの型を用いて4160個まで、および金属の3つの異なる型で8x105個)の識別可能なタグの作製を可能にする。そのようなタグは、バーコードに付着し、検出されうる。金または銀のような金属粒子をオリゴヌクレオチドおよび他の型の分子へ付着させる方法は、当技術分野において公知である(例えば、米国特許第5,472,881号)。
フラーレンも、バーコードタグとして用いられうる。フラーレンを作製する方法は公知である(例えば、米国特許第6,358,375号)。フラーレンは、誘導体化され、カーボンナノチューブについて以下に開示されたものに類似した方法により、他の分子へ付着しうる。フラーレンタグ付きバーコードは、例えば、様々なテクノロジーを用いて同定されうる。
単層カーボンナノチューブ(SWNT)のようなカーボンナノチューブもまた、タグとして用いられうる。ナノチューブは、例えば、ラマン分光法により検出されうる(例えば、Freitag et al., Phys. Rev. B 62:R2307-2310, 2000)。電気的または光学的性質のようなカーボンナノチューブの特徴は、ナノチューブのサイズに少なくとも一部、依存する。
ヌクレオチドまたは塩基(例えば、アデニン、グアニン、シトシン、もしくはチミン)は、オリゴヌクレオチドおよび核酸以外の分子バーコードにタグを付けるために用いられうる。例えば、ペプチドに基づいた分子バーコードは、ヌクレオチドまたはプリンもしくはピリミジン塩基でタグを付けてもよい。ウラシル、イノシン、2,6-ジアミノプリン、5-フルオロ-デオキシシトシン、7デアザ-デオキシアデニン、または7-デアザ-デオキシグアニンのような、プリンもしくはピリミジンの他の型またはそれらの類似体もまた、タグとして使用可能である。他のタグは塩基類似体を含む。塩基は、糖またはリン酸を含まない窒素含有環構造である。そのようなタグは、ラマンまたは蛍光分光法のような光学技術により検出されうる。ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体タグの使用は、検出される標的分子が核酸またはオリゴヌクレオチドである場合、バーコードのタグ部分が、プローブ部分とは異なる標的分子にハイブリダイズする可能性がありうるため、適切ではない可能性がある。
アミノ酸もまたタグとして使用されうる。タグとして使用される可能性のあるアミノ酸は、限定されるわけではないが、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、アルギニン、システインおよびメチオニンを含む。
二官能性架橋試薬は、タグをバーコードへ付着させるような様々な目的のために用いられうる。二官能性架橋試薬は、それらの官能基、例えば、アミノ、グアニジノ、インドール、またはカルボキシルの特定の基の特異性により分類されうる。これらのうち、遊離アミノ基に向けられる試薬は、それらの商業的入手性、合成の容易さ、およびそれらが適用されうる穏やかな反応条件のために、人気がある(米国特許第5,603,872号および第5,401,511号)。使用される可能性のある架橋試薬は、グルタルアルデヒド(GAD)、二官能性オキシラン(OXR)、エチレングリコールジグリシジルエーテル(EGDE)、および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)のようなカルボジイミドを含む。
バーコードは、当技術分野において公知の任意の様式を用いて検出されうる。例えば、蛍光分光法は、バーコードを検出するために用いられうる。いくつかの蛍光色素は、単一のバーコードに付着しうる。バーコードにおける色素の量および色素の化学的性質は、バーコードの蛍光発光プロファイルを決定する。所定のバーコード組成物について、シグナルはまた、可能性のある共鳴エネルギー移転によるタグ間の相対的距離により影響を及ぼされることがある。
ラマン分光法のための表面
ラマン分光法の様々な様式は、タグ付き(バーコード)分子の表面への近接によるラマンシグナルの増強を利用する。特定の様式において、表面増強ラマン分光法(SERS)または表面増強共鳴ラマン分光法(SERRS)のように、金、銀、アルミニウム、白金、銅または他の金属のようなラマン活性金属表面への近接が、ラマンシグナルを6桁または7桁まで増強させうる。
ラマン検出の様々な方法は、当技術分野において公知である。使用されるラマン検出ユニットの一つの例は、米国特許第6,002,471号に開示されている。開示されているように、励起ビームは、532 nm波長におけるNd:YAGレーザーかまたは365 nm波長におけるTi:サファイアレーザーかのいずれかにより発生される。パルスレーザービームまたは連続レーザービームが用いられうる。励起ビームは、共焦点光学および顕微鏡対物を通過し、標的領域上に集束させられる。ラマン標識からのラマン放出光は、顕微鏡対物および共焦点光学により集められ、スペクトル解離のためにモノクロモネーターに連結される。共焦点光学は、バックグラウンドシグナルを低減させるための、二色性フィルター、バリアーフィルター、共焦点ピンホール、レンズおよびミラーの組み合わせを含む。標準全視野光学は、共焦点光学と同様に用いられうる。シグナルは、任意の公知のラマン検出器により検出されうる。
バーコード調製、使用および/または検出のための装置を、より大きな装置および/またはシステムへ組み入れてもよい。特定の態様において、装置は、微小電気機械システム(MEMS)を含みうる。MEMSは、機械的要素、センサー、アクチュエータおよび電子機器を含む集積システムである。それらの構成要素のすべては、シリコンベースまたは等価の基板の一般的なチップ上における微細加工技術により製造されうる(例えば、Voldman et al., Ann. Rev. Biomed. Eng. 1:401-425, 1999)。MEMSのセンサー構成要素は、バーコードを検出するために機械的、熱的、生物学的、化学的、光学的および/または磁気的現象を測定するのに用いられうる。電子機器は、センサー、およびポンプ、バルブ、ヒーターなどのような制御アクチュエータ構成要素からの情報を処理することができる。
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。後に続く実施例において開示された技術は、本発明の実施において十分に機能するように本発明者らにより発見された技術を提示し、従って、それの実施にとって好ましい様式を構成すると考えられうることは、当業者により認識されるべきである。しかしながら、開示されている特定の態様において多くの変更がなされ、かつ本発明の真意および範囲から逸脱することなく、同様なまたは類似した結果をなお得ることができることを、本開示に照らせば、当業者は認識するものと思われる。
図3は、例示的な、付着したラマンタグをもつ一本鎖バーコードを示す。例示的オリゴヌクレオチド配列301、302、303、304は、標準ホスホラミダイト化学作用により合成された。光学的検出のためのタグが、オリゴヌクレオチドに付着しており、蛍光色素ROX(カルボキシ-X-ローダミン)310;FAM(6-カルボキシフルオレセイン)320;およびTAMRA(テトラメチルローダミン)330を含んだ。各バーコードに付着した色素タグの位置および同定は、図3に示されているとおりである。アミン基は、合成中に、3つのオリゴヌクレオチド302、303、304の5'末端に付着した。
図3に示された分子バーコードはSERSにかけられた。SERS発光スペクトルは、図4に示されている。銀コロイドおよびLiClの存在下における示されたバーコード301、302、303、304の1 μM溶液の220 μlを含む試料は、100 ms、レーザービームに曝露され、表面増強ラマンスペクトルが記録された。スペクトルは、約1000 CCDカウントユニットによりオフセットされた。図4に示されているように、4つの分子バーコード301、302、303、304のそれぞれは、3つの分子バーコード302、303、304が、同じヌクレオチド配列302、303、304上の異なる位置に付着した同じラマンタグ330を含んでいるにしても、識別可能なラマン発光スペクトルを生じた。これは、開示された方法を用いて識別可能な分子バーコードを作製することの実行可能性を実証している。
ヌクレオチドに付着したいくつかの例示的ラマンタグにより発生したSERSスペクトル801 802 803 804 805 806は、図8に示されている。各ラマンタグから生じたスペクトルパターン801 802 803 804 805 806は、容易に識別できる。銀コロイドおよびLiClの存在下における1 μM バーコード溶液の220 μlを含む試料は、100 ms、レーザービームに曝露され、表面増強ラマンスペクトルが記録された。SERS発光スペクトルは、ポリT[NeBu]T 801;ポリT[EthdA]T 802;ポリT[8Br-dA]T 803;ポリT[2AmPur]T 804;[ThiSS]ポリTdA 805および[5Acrd]ポリdG[AmC7]806について示されている。
本発明の1つの例示的態様が例示される。核酸配列を、図5および図6/7に示されているように、解読方法を用いることにより決定することができる。コード構成要素ライブラリー(図6 601 602 603 604)は、ライブラリーの各構成要素が、構成要素(例えば、3-マー)を具体的かつ一意的に同定する結合した標識(例えば、ラマンタグ)を有するように、作製されうる。核酸は、プローブの標的配列605へのハイブリダイゼーションを可能にするように構成要素ライブラリーとインキュベートされる。ハイブリダイズした核酸は、それらが励起源および検出器を流れ過ぎる、微小流体チャネルを通して操作される。コード構成要素の発光スペクトルは、検出され、データ処理システムへ中継されうる。核酸の配列は、発光スペクトルおよび発光スペクトルが検出される順序を、標識と結合したコード構成要素についてのスペクトルのデータベースと比較することにより決定される。
本発明の1つの例示的態様が示される。タンパク質またはペプチド(例えば、まれな制御タンパク質など)は、前に考察されているように精製されうる。精製されたタンパク質/ペプチドは、当技術分野において周知の技術により抗体(モノクローナル抗体もまた当技術分野において公知の技術により作製されうる)を作製するために用いられる(Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988)。抗原の反応性は、フロイントの完全または不完全アジュバントのようなアジュバントを同時投与することにより増加しうる。抗原性は、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンのような担体に抗原を付着させることにより増加しうる。動物の免疫応答は、抗原のブースター注射を定期的に施すことにより増加しうる。抗体1206は、動物の循環へ分泌され、出血または心臓の穿刺により得られうる。抗体1206は、血液凝固、遠心分離、濾過および/またはイムノアフィニティー精製(例えば、抗ウサギ抗体を用いる)もしくはアフィニティークロマトグラフィー(例えば、プロテイン-Aセファロースカラムクロマトグラフィー)のような周知の方法により他の血液成分から分離されうる。その後、これらの抗体は、図12に示されたポリマーラマン標識のいずれか1つに連結(例えば、共有結合性に)されうる。その後、ポリマーラマン標識抗体は、多くの分子の抽出物からそのタンパク質を同定するために用いられうる。または、ポリマーラマン標識抗体は、同定を目的として、対象となるタンパク質のさらなる研究のために、そのタンパク質の活性をブロックするために、疾患に関連したタンパク質を同定するためになど、分子の抽出物からいくつかの同じタンパク質を単離するのに用いられうる。ポリマーラマン標識分子は容易に検出されるため、それはまた、疾患の存在および/または程度を評価する診断目的のために使用されうる。
一つの態様において、核酸は、1つまたは複数のラマンタグを用いて修飾されうる。多くの小さくかつ独特なラマンタグが利用できる。一つの例において、強くかつ独特なラマンシグネチャーを有するいくつかのアデニン類似体が図13に示されている(他のものは図8に示されている)。一つの例において、ラマンタグを、1つまたは複数の塩基修飾を通して核酸に連結してよく、その後、これらの修飾塩基を、オリゴヌクレオチドの化学合成のためのホスホラミダイトを作製するために用いてもよい。修飾塩基のホスホラミダイトを、当技術分野において公知の技術により作製することができる(McBride, L.J. and Caruthers, M.H. (1983) "An investigation of several deoxynucleoside phosphoramidites useful for synthesizing deoxyoligonucleotides." Tetrahedron Lett. 24:245-248)。
であってもよく、およびもう一つは、タグとしてベンゾイル-アデニン(BA)(図13)を有する
であってもよい。バーコード構成要素の多くは、予め作製されて、後の使用のために保存されてもよい。
および
は、標準条件(例えば、200 mM NaCl、10 mM トリスHCl、pH 7.5および1 mM EDTAの存在下において1〜10 μMのオリゴヌクレオチド濃度)下でコンテナ部にハイブリダイズしうる。それゆえに、この例において、プローブ部は、2-バーコード構成要素により表され、それのラマンシグネチャーは、ラマンタグとしてのキネチンおよびベンゾイル-アデニンの両方により決定される。異なるバーコード鋳型を合成するために、プローブ部およびコンテナ部は、相応じて変化させられる;異なるバーコード構成要素(予め作製された)は、新しいバーコードを形成するようにいっしょにハイブリダイズしうる。
バーコード分子は、標的配列に結合し、それに従って、この例においては磁石により保持される(Dyna beads, Dynal)。ビーズは、銀コロイド(1 mM AgNO3から調製され、水で1:2に希釈された)および0.1 M LiCl(最終濃度)と混合されうる。粒子がラマン検出器を通過する時、バーコード分子に特異的に結合したラマンシグナル(KNおよびBA)は、このようにして検出されうる。この例において、情報は、1つまたは複数の試料において特定の感染性原因物質の存在または非存在を確認するために使用されうる。
もう一つの態様は、実施例6においてのようにラマンタグ付きバーコードの調製を含みうるが、バーコードは、その後、抗原検出(例えば、タンパク質)のために抗体へ付着する。それゆえに、バーコード調製物は生じており、そして、DNAタグ付き抗体が作製されうる。例えば、IgG抗体(例えば、200 μg(1.33 nmoles))は、0.1x PBS(Ambionから入手できる、10x PBSから希釈された)の200 μlにおいてスルホ-GMBS(Pierceカタログ番号22324)の20 μg(52 nmoles)で、37℃で30 min、およびその後、室温で30 min、活性化されうる。溶液は、その後、PD-10カラム(Amersham-Pharmacia)を通過させられ、抗体含有画分は収集される。チオール修飾オリゴは、商業的ベンダー(Qiagen-Operon)により合成されうる。ベンダーからの指示に従ってジスルフィド結合を還元した(例えば、DTT処理)後、DNAオリゴ(例えば、13 nmoles)は、精製かつ活性化された抗体と混合されうる。反応は、室温で2時間、および4℃で一晩、進行するようにさせておく。DNA-抗体は、その後、例えば、0〜2 M NaCl勾配を用いるイオン交換カラム(Amersham-Pharmacia)により精製されうる。DNAおよびタンパク質の両方を含む画分が収集される。試料は、当技術分野において公知の技術を用いる脱塩および濃縮処理後、抗原結合(タンパク質検出)の準備ができている。
Claims (34)
- 以下の段階を含む方法:
有機分子骨格に付着した2つまたはそれ以上のタグを含むバーコードを得る段階;
バーコードを標的に結合させる段階;および
標的に結合したバーコードを検出する段階。 - バーコードが、核酸、ペプチド、多糖、生体ポリマー、および合成ポリマーからなる群より選択される少なくとも1つの分子を含む、請求項1記載の方法。
- 核酸が一本鎖DNAである、請求項2記載の方法。
- 骨格が、ペプチドに共有結合した核酸を含む、請求項2記載の方法。
- タグが、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、塩基類似体、蛍光色素、ペプチド、アミノ酸、修飾アミノ酸、有機部分、ラマンタグ、量子ドット、カーボンナノチューブ、フラーレン、1マイクロメートル未満の金属粒子、高電子密度粒子、および結晶状粒子からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 骨格が、1つまたは複数の分岐核酸を含む、請求項1記載の方法。
- 分枝が、骨格に沿って予め決められた部位に位置している、請求項6記載の方法。
- バーコードが、蛍光分光法、ラマン分光法、フーリエ変換赤外分光法(FTIR)、および表面プラズモン共鳴からなる群より選択される技術により検出される、請求項1記載の方法。
- バーコードが、プローブ部分を介して標的に結合する、請求項1記載の方法。
- 識別可能なバーコードが、同じ骨格に沿った異なる部位への同じタグの付着により作製される、請求項1記載の方法。
- 標的が、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、プリオン、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、脂質、脂肪酸、炭水化物、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、リポ多糖、多糖、真核細胞、原核細胞、細菌、ファージ、ウイルス、および病原体からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 以下の段階を含む方法:
コンテナ部およびプローブ部を含む核酸鋳型を得る段階;ならびに
バーコードを作製するように1つまたは複数のタグ付きオリゴヌクレオチドをコンテナ部にハイブリダイズさせる段階。 - バーコードを標的に結合させる段階をさらに含む、請求項12記載の方法。
- 標的に結合したバーコードを検出する段階をさらに含む、請求項13記載の方法。
- 以下の段階を含む、ポリマーラマン標識を作製する方法:
2つまたはそれ以上のモノマーユニットを得る段階;および
ポリマーラマン標識を作製するようにモノマーユニットを重合させる段階。 - 各モノマーユニットがラマンタグを含む、請求項15記載の方法。
- 単一のポリマーラマン標識における各ラマンタグが異なっている、請求項16記載の方法。
- ラマンタグが、スペーサー部分を通してポリマーラマン標識の骨格に付着している、請求項16記載の方法。
- ラマンタグが、モノマーユニットの重合後、ポリマーラマン標識に付着する、請求項15記載の方法。
- モノマーユニットの一方の末端における官能基を脱保護する段階、およびモノマーユニットとポリマーラマン標識の間に共有結合を形成する段階をさらに含む、請求項15記載の方法。
- 各サブポリマーユニットが予め決められた数のモノマーユニットを含むサブポリマーユニットを作製する段階をさらに含む、請求項15記載の方法。
- ポリマーラマン標識を固体支持体に付着させる段階をさらに含む、請求項15記載の方法。
- 固体支持体がナノ粒子またはビーズである、請求項22記載の方法。
- プローブをポリマーラマン標識に付着させる段階をさらに含む、請求項15記載の方法。
- プローブを標的に結合させる段階をさらに含む、請求項24記載の方法。
- 標的に結合したプローブを検出する段階をさらに含む、請求項25記載の方法。
- 共有結合性に互いに付着した2つまたはそれ以上のモノマーユニット;
2つまたはそれ以上のラマンタグ;および
少なくとも1つのプローブ
を含む、ポリマーラマン標識。 - ポリマーラマン標識に付着したナノ粒子またはビーズをさらに含む、請求項27記載のポリマーラマン標識。
- 標識における各ラマンタグが異なっている、請求項27記載のポリマーラマン標識。
- 各ラマンタグの2つまたはそれ以上のコピーをさらに含む、請求項27記載のポリマーラマン標識。
- イメージング装置;
プローブに連結した少なくとも1つのバーコード;および
プローブに結合した少なくとも1つの標的
を含むシステム。 - イメージング装置が、蛍光装置、ラマン装置、およびFTIR装置からなる群より選択される、請求項31記載のシステム。
- 各バーコードが、2つまたはそれ以上のラマンタグを含む、請求項31記載のシステム。
- 単一のバーコードにおける各ラマンタグが、異なるラマン発光スペクトルを有する、請求項33記載のシステム。
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