CN112526127B - 一种破伤风抗原的检测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种破伤风抗原的检测方法及其应用，涉及分子生物学技术领域。该破伤风抗原的检测方法，包括如下步骤：以作为破伤风抗原识别探针的核酸适配体为模板形成双链DNA，并以所述双链DNA为模板合成dsDNA模板铜纳米粒子或dsDNA模板银纳米粒子；基于破伤风抗原对所述dsDNA模板铜纳米粒子或所述dsDNA模板银纳米粒子中所述核酸适配体的特异性结合，使其引起信号分子的信号变化，而得到破伤风抗原的检测结果。本发明的检测方法具有分析速度快、低成本、高灵敏以及易于实现可视化POCT分析的优点，填补了破伤风抗原检测方法和试剂盒的空白，易于实现家庭便捷式和医学检测机构内高灵敏分析。

Description

一种破伤风抗原的检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种破伤风抗原的检测方法及其应用。
背景技术
破伤风是一种极为严重的疾病，平均病死率为20％-30％，重症患者高达 70％，新生儿及老年人的病死率尤其高。感染破伤风至发病，有一个潜伏期，通常为7-8天，可短至24小时或长达数月、数年。潜伏期越短者，预后越差。虽然，现已有破伤风抗体的酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒可供使用，但其存在分析时间长、成本高、分析灵敏度低、需要大型检测设备、难以构建家庭便携式诊断装置等不足。此外，其最为主要的不足之处在于：抗体的检测只是一种间接方法，且表达量受多种因素的影响，即不能很好的表达机体破伤风感染状况。相似于很多临床生化指标，抗原的含量可以准确提供多种有效信息。然而，现有医学诊断机构内对破伤风抗原(痉挛毒素)的检测处于空白，即现有技术中尚未有针对破伤风抗原痉挛毒素的检测试剂盒，因此，亟需开发一种针对破伤风抗原的快速、低成本、高灵敏的检测方法，以填补现有国内和国际上破伤风诊断的空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种破伤风抗原的检测方法及其应用。本发明的破伤风抗原的检测方法以破伤风抗原的核酸适配体为识别探针，设计包含该破伤风抗原核酸适配体的双链DNA，以该双链DNA为模板合成dsDNA模板Cu NPs 或者dsDNA模板Ag NPs，然后以CuNPs、Ag NPs或QDs为信号分子进行破伤风的检测，本发明的破伤风抗原的检测方法具有快速、低成本、高灵敏、以及易于实现可视化POCT分析的优点，本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供的一种破伤风抗原的检测方法包括如下步骤：以作为破伤风抗原识别探针的核酸适配体为模板，形成双链DNA，并以所述双链DNA为模板合成dsDNA模板铜纳米粒子或dsDNA模板银纳米粒子；基于破伤风抗原对所述dsDNA模板铜纳米粒子或所述dsDNA模板银纳米粒子中所述核酸适配体的特异性结合，使其引起信号分子的信号变化，而得到破伤风抗原的检测结果。
根据一种优选实施方式，所述信号分子包括Cu NPs、Ag NPs或QDs。
根据一种优选实施方式，所述信号分子为QDs。
根据一种优选实施方式，所述核酸适配体包括碱基序列如SEQ ID NO.1所示的核酸适配体A1或碱基序列如SEQ ID NO.2所示的核酸适配体A2。
根据一种优选实施方式，所述双链DNA包括以所述核酸适配体A1为长链模板，且通过特异性识别结合形成的包括短链核酸P1和短链核酸P2的dsDNA 模板；
其中，所述短链核酸P1和所述短链核酸P2的碱基序列分别如SEQ ID NO.3 和SEQID NO.4所示。
根据一种优选实施方式，所述双链DNA包括以双核酸适配体A1为短链模板，且通过特异性识别结合形成的包括长链核酸P3的dsDNA模板；
其中，所述长链核酸P3的碱基序列如SEQ ID NO.5所示。
根据一种优选实施方式，所述双链DNA包括以核酸适配体A2为长链模板，且通过特异性识别结合形成的包括短链核酸P4、短链核酸P5和短链核酸P6的 dsDNA模板。
根据一种优选实施方式，所述短链核酸P4、所述短链核酸P5和所述短链核酸P6的碱基序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供了一种如所述的破伤风抗原的检测方法用于检测破伤风的产品中的应用。
根据一种优选实施方式，所述产品包括检测试剂盒。
基于上述技术方案，本发明的破伤风抗原的检测方法及其应用至少具有如下技术效果：
本发明的破伤风抗原的检测方法以破伤风抗原的核酸适配体为识别探针，设计包含该破伤风抗原核酸适配体的双链DNA，以该双链DNA为模板合成 dsDNA模板Cu NPs或dsDNA模板Ag NPs，然后以Cu NPs、Ag NPs或QDs 为信号分子进行破伤风的检测，本发明的破伤风抗原的检测方法具有分析速度快、低成本、高灵敏、以及易于实现可视化POCT分析的优点，填补了破伤风抗原检测方法和试剂盒的空白，易于实现家庭便捷式和医学检测机构内高灵敏分析。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是以核酸适配体A1为识别探针的破伤风可视化和荧光检测原理图；
图2是以双核酸适配体A1构成长双链为模板的破伤风可视化和荧光检测原理图；
图3是以核酸适配体A2为识别探针，且长双链为模板的破伤风可视化和荧光检测原理图；
图4是破伤风痉挛毒素分析条件优化图；
图5是以核酸适配体A1为识别探针的破伤风可视化和荧光检测分析性能图；
图6是以双核酸适配体A1构成长双链为模板的破伤风可视化和荧光检测分析性能图；
图7是以核酸适配体A2为识别探针，且长双链为模板的破伤风可视化和荧光检测分析性能图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
本发明提供了一种破伤风抗原的检测方法，包括如下步骤：以作为破伤风抗原识别探针的核酸适配体为模板，形成双链DNA并以双链DNA为模板合成 dsDNA模板铜纳米粒子或dsDNA模板银纳米粒子；基于破伤风抗原对dsDNA 模板铜纳米粒子或所述dsDNA模板银纳米粒子中核酸适配体的特异性结合，使其引起信号分子的信号变化，而得到破伤风抗原的检测结果。优选的，信号分子包括Cu NPs、Ag NPs或QDs。优选的，信号分子为QDs。优选的，QDs为 CdTe QDs或CdSe QDs。
优选的，核酸适配体包括核酸适配体A1和A2，其中核酸适配体A1的碱基序列如SEQID NO.1所示，核酸适配体A2的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。见下表1。
表1
Figure RE-GDA0002933162770000041
实施例1
本实施例1提供了以核酸适配体A1为识别探针，并作为长链模板通过特异性识别结合形成的包括短链核酸P1和短链核酸P2的dsDNA模板；其中，短链核酸P1和短链核酸P2的碱基序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
在本实施例1中以核酸适配体A1为长链模板，设计了两条短链核酸P1 和P2(分别为16个碱基)，这三条链可特异性识别结合形成双链DNA，然后形成dsDNA模板Cu NPs。当加入痉挛毒素时，痉挛毒素能够与核酸适配体A1 特异性结合，进而破坏dsDNA模板Cu NPs的双链DNA模板，使得形成的Cu NPs的量降低，而剩下的Cu2+对QDs的荧光信号淬灭。因此，破伤风痉挛毒素的加入量越多，使得溶液的荧光信号越低，溶液颜色越浅，其分析原理如图1 所示，图1示出了以适配体A1为识别探针的破伤风可视化和荧光检测原理图。
在该实施例中dsDNA模板的核酸序列如表2：
表2
Figure RE-GDA0002933162770000051
实施例2
本实施例2以双核酸适配体A1为短链模板，且通过特异性识别结合形成的包括长链核酸P3的dsDNA模板。优选的，长链核酸P3的碱基序列如SEQ ID NO.5所示。
鉴于dsDNA模板浓度、长度、碱基种类等均对Cu NPs的形成影响极大，在实施例1的图1所示原理的基础上，设计了以双核酸适配体A1为短链的长双链模板，其分析原理如图2所示，图2示出了双适配体A1构成长双链为模板的破伤风可视化和荧光检测原理图，其分析原理图与实施例1相似，仅仅是改变了dsDNA模板链。
在该实施例2中dsDNA模板的核酸序列如表3所示：
表3
Figure RE-GDA0002933162770000061
实施例3
本实施例3提供了以核酸适配体A2为长链模板，且通过特异性识别结合形成的包括短链核酸P4、短链核酸P5和短链核酸P6的dsDNA模板。其中短链核酸P4、短链核酸P5和短链核酸P6的碱基序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
本实施例利用核酸适配体A2作为识别探针，设计了包含核酸适配体A2和三条短链核酸的长dsDNA模板，将其用于痉挛毒素的分析。如图3所示，以适配体A2-P4-P5-P6双链DNA作为Cu NPs生成的模板，加入痉挛毒素后，痉挛毒素能够破坏双链DNA模板，其原理与实施例1和实施例2相似。在该实施例3中dsDNA模板的核酸序列如表4所示：
表4
Figure RE-GDA0002933162770000062
实施例4
本实施例4提供了通过本发明的检测方法对破伤风进行分析检测的过程。
1、QDs的合成
CdTe QDs是根据一锅法合成的。
首先，将0.5mmol CdCl2和0.20g柠檬酸三钠溶解于50毫升水中，向以上溶液中加入52μL巯基丙酸(MPA)。使用NaOH溶液将以上混合物溶液pH 调节至10.5；
然后，将0.1mmol Na2TeO3和50mg KBH4加入以上溶液中，回流1小时至溶液呈红色，在紫外灯下呈现出强烈的红色荧光；
最后，通过沉淀(使用正丙醇)和离心(11000rpm，30分钟)纯化CdTe QDs溶液。
以上合成的MPA-CdTe QDs在使用前保存在4℃。
优选的，本发明的QDs也可以选用CdSe QDs。
2、破伤风的分析检测过程
首先，向50uL10 mM的MOPS缓冲液(pH 7.4，100mmol/L NaNO3，2.5 mmol/L Mg(NO3)2)中加入20uL dsDNA(其中A1-P1-P2和A1-A1-P3浓度均为2μM，A2-P4-P5-P6浓度为500nM)和20uL不同浓度痉挛毒素，室温下反应1小时，完成竞争识别反应。随后，向以上溶液中加入5uL 40mM抗坏血酸并混合均匀(振荡30s)，再加入5uL 1.5mM CuSO4，室温下反应4min，形成dsDNA模板Cu NPs。最后，向以上Cu NPs溶液中加入2.25uL QDs原液，反应10min完成阳离子交换反应。通过监测各溶液的荧光信号变化即可实现对破伤风痉挛毒素的定量分析。
实施例5
为获得最优的分析性能，本实施例对实验条件进行了优化，如图4所示，图4示出了破伤风痉挛毒素分析优化条件图，其中图4A示出了痉挛毒素与适配体的结合时间对荧光信号的影响；图4B和图4C示出了Cu2+浓度对荧光信号的影响；图4D示出了形成Cu NPs的时间对荧光信号的影响；图4E和4F示出了抗坏血酸浓度对荧光信号的影响；图4G和图4H示出了QDs体积对荧光信号的影响；图4I示出了选择性阳离子交换的反应时间对荧光信号的影响。
从图4可以看出，适配体探针链双链DNA模板与痉挛毒素的竞争结合反应可在60分钟内完成，如图4A所示。Cu2+浓度为1.5mM时，能够获得最大的荧光信号差值，如图4B和4C所示。从图4D可以看出，dsDNA模板形成 CuNPs的反应速度快，4分钟即可。抗坏血酸浓度为40mM时，可获得最大荧光信号差值，如图4E和4F所示。量子点原液体积为2.25微升为获得最大荧光信号差值，如图4G和4H。加入QDs反应10分钟后，加入痉挛毒素和空白溶液的信号差值相近，如图4I所示。以上结果误差源于至少三次以上重复测量。
实施例6
本实施例以实施例5的优化条件分别对实施例1至实施例3的双链DNA 模板以CuNPs和QDs为信号分子的分析性能进行了考察。
1、以适配体链A1为识别探针的破伤风可视化和荧光检测分析性能
首先对以核酸适配体A1为识别链，dsDNA模板Cu NPs为信号分子的痉挛毒素分析性能进行了考察。
图5示出了以核酸适配体A1为识别探针的破伤风可视化和荧光检测分析性能，其中图5A和5B为Cu NPs为信号分子时的标准曲线。图5C为QDs为信号分子的可视化照片。图5D和5E为QDs为信号分子时的标准曲线。如图 5A，在ng/mL浓度级别水平上，随着痉挛毒素浓度增加，溶液的Cu NPs荧光信号在逐渐降低；且CuNPs荧光信号变化量与150-300ng/mL浓度范围内痉挛毒素呈现良好的线性关系，如图5B。随后，将QDs加入以上体系中，探讨其能否实现可视化和高灵敏分析痉挛毒素。如图5C所示，在紫外灯照射下，可轻松区分10pg/mL浓度痉挛毒素。随后，使用荧光仪监测以上溶液的荧光信号，如图5D所示，在1pg/mL至500ng/mL浓度范围内，随着目标痉挛毒素浓度增加，QDs的荧光信号在逐渐降低。在线性拟合后，发现QDs的荧光信号变化与 10pg/mL至100ng/mL浓度范围内的对数呈现良好的线性关系，其线性方程为 Y＝-99.3LogC-352.9，线性相关性好(R2＝0.996)。
2、双适配体A1构成长双链为模板的破伤风可视化和荧光检测分析性能
鉴于以上适配体A1为识别探针的双链DNA模板的方案仅仅可实现10 pg/mL检测灵敏度，设计了以适配体A1为探针的长双链核酸模板方案，并分别探讨其以CuNPs和QDs为信号分子的性能。
图6示出了以双适配体A1构成长双链为模板的破伤风可视化和荧光检测分析性能图，其中，图6A和图6B为以CuNPs为信号分子时的标准曲线。图 6C为QDs为信号分子时的可视化照片。图6D和图6E为QDs为信号分子时的标准曲线。如图6A和6B所示，相似与图5A所示的结果，以Cu NPs为信号分子时，其依然仅仅可实现ng/mL浓度水平痉挛毒素的检测，然而其分析灵敏度显著优于实施例1所示的方案。随后，将QDs加入其中，其可视化分析结果显示灵敏度显著提高，可轻松区分空白溶液和0.1pg/mL浓度痉挛毒素，如图 6C。荧光仪分析结果显示在0.1pg/mL至100ng/mL浓度范围，荧光信号与浓度的对数呈现良好线性关系，其线性方程为Y＝-150.4LogC-740.1(R2＝0.991，图6D和6E)。
最后，将血液中共存的蛋白作为潜在干扰物，考察该体系的选择性。如图 6F和6G所示，高浓度的干扰蛋白(0.1ng/mL，0.1nM和0.1U/L)引起的荧光信号变化与空白溶液相似，几乎可以忽略。然而，低浓度的痉挛毒素(10 pg/mL)引起了显著的荧光信号变化。因此可见本实施例的方案具体良好的目标蛋白选择性，其主要源于目标蛋白和适配体间的高特异性结合力。
3、以核酸适配体A2为识别探针，且长双链为模板的破伤风可视化和荧光检测分析性能
相似与第1和第2的方案，采用核酸适配体A2为识别探针，同时设计三条短链核酸，其可自发互补形成室温下稳定的dsDNA，将其作为模板，探讨不同适配体链模板对痉挛毒素的分析性能。
图7示出了核酸适配体A2为识别探针，且长双链为模版的破伤风可视化和荧光检测分析性能图。其中，图7A和图7B为以Cu NPs为信号分子时的标准曲线。图7C为QDs为信号分子时的可视化照片。图7D和图7E为QDs为信号分子时的标准曲线。如图7A和图7B所示，在以Cu NPs为信号分子时，仅仅可实现ng/mL水平痉挛毒素的分析。在加入QDs为信号分子时，可视化读取依然可轻松区分0.1pg/mL浓度痉挛毒素和空白溶液，如图7C所示。荧光仪检测结果显示其荧光信号变化与0.1pg/mL至1ng/mL浓度范围内痉挛毒素的对数呈现良好线性关系，其线性方程为Y＝-91.8LogC-165.1，线性相关性好(R2＝0.984，图7D和图7E)。最后，以核酸适配体A2体系同样具有良好的目标痉挛毒素选择性，高浓度的干扰蛋白并未引起显著的荧光信号降低，而低浓度痉挛毒素引起的显著信号降低。即该采用该核酸适配体A2的长链模板的方案具体良好的选择性，为将其用于临床血清样品中痉挛毒素分析奠定了良好的实验基础。
综上，本发明填补了破伤风抗原的检测方法和试剂盒的空白。通过引入选择性阳离子交换反应，其均相反应、操作简单、无毒、反应速度快。该破伤风检测方法具有成本低、分析速度快、操作简单、灵敏度高、且可裸眼读取信号的优点。易于实现家庭便携式和医学检测机构内高灵敏分析。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种非诊断目的的破伤风抗原的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：以作为破伤风抗原识别探针的核酸适配体为模板形成双链DNA，并以所述双链DNA为模板合成dsDNA模板铜纳米粒子或dsDNA模板银纳米粒子；基于破伤风抗原对所述dsDNA模板铜纳米粒子或所述dsDNA模板银纳米粒子中所述核酸适配体的特异性结合，使其引起信号分子的信号变化，而得到破伤风抗原的检测结果，
其中，所述核酸适配体包括碱基序列如SEQ ID NO.1所示的核酸适配体A1或碱基序列如SEQ ID NO.2所示的核酸适配体A2。
2.根据权利要求1所述的非诊断目的的破伤风抗原的检测方法，其特征在于，所述信号分子包括Cu NPs、Ag NPs或QDs。
3.根据权利要求2所述的非诊断目的的破伤风抗原的检测方法，其特征在于，所述信号分子为QDs。
4.根据权利要求1所述的非诊断目的的破伤风抗原的检测方法，其特征在于，所述双链DNA包括以所述核酸适配体A1为长链模板，且通过特异性识别结合形成的包括短链核酸P1和短链核酸P2的dsDNA模板；
其中，所述短链核酸P1和所述短链核酸P2的碱基序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。
5.根据权利要求1所述的非诊断目的的破伤风抗原的检测方法，其特征在于，所述双链DNA包括以双核酸适配体A1为短链模板，且通过特异性识别结合形成的包括长链核酸P3的dsDNA模板；
其中，所述长链核酸P3的碱基序列如SEQ ID NO.5 所示。
6.根据权利要求1所述的非诊断目的的破伤风抗原的检测方法，其特征在于，所述双链DNA包括以核酸适配体A2为长链模板，且通过特异性识别结合，形成的包括短链核酸P4、短链核酸P5和短链核酸P6的dsDNA模板。
7.根据权利要求6所述的非诊断目的的破伤风抗原的检测方法，其特征在于，所述短链核酸P4、所述短链核酸P5和所述短链核酸P6的碱基序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
8.一种如权利要求1至7任一项所述的非诊断目的的破伤风抗原的检测方法用于检测破伤风的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述产品包括检测试剂盒。
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