TWI302606B

TWI302606B - Molecular barcodes and methods of making

Info

Publication number: TWI302606B
Application number: TW093129011A
Authority: TW
Inventors: Xing Su; Tae-Woong Koo; Andrew A Berlin; Lei Sun; Narayanan Sundararajan; Mineo Yamakawa
Original assignee: Intel Corp
Priority date: 2003-09-24
Filing date: 2004-09-24
Publication date: 2008-11-01
Also published as: US20060199216A1; TW200517659A; CN1856580B; EP1668164A2; CN1856580A; US20070054288A1; KR20060094531A; US20050064435A1; WO2005030996A2; WO2005030996A3; JP2007506431A; JP5014789B2

Description

1302606 九、發明說明： L發明戶斤屬之技術領域】發明領域本方法、組成物及裝置係有關分子條碼領域。 y 符殊本 5 發明具體例係有關由有機聚合物主鏈形成分子條i 法。使用相同主鏈，經由附接標籤至主鏈之不同仅置製造多種分子條碼。其它具體例中，分子條碼包括—h可一探針區以及一個或多個碼成分。其它具體例中，分子條石馬。括聚合物拉曼標記附著於一或多個探針供檢測標乾八+匕 ίο 【先前技^r】發明背景生物分子的檢測及/或識別可用於多種應用用途勺括内科診斷學、法醫學、毒理學、病理學、生物戰、八 A共衛生及多種其它領域之應用用途。雖然研究的生物分子主要 15 類別為核酸及蛋白質，但碳水化合物、脂質、多醣、此4 &脂質、區別病原性孢脂肪酸等其它生物分子也同樣令人感興趣。需要有可决速、可靠、且具有成本效益的方法來識別生物分子、、類似之生物分子之方法以及分析巨分子複合物如子或微生物之方析方法 20 標準核酸檢測方法例如南方墨點法、北方墨點法、咬結合至核酸晶片，係仰賴螢光、化學光或放射性探針分子與標靶核酸分子的雜交。於基於寡核誓酸雜交之檢定分析，其序列與標輕核酸序列互補之經標記的寡核苔酸探針，用來結合核酸及檢測核酸。更為晚近，設計出DNA(去 1302606 氧核糖核酸）晶片，其含有數百個或數千個附著接的寡核苷酸探針用來結合至標靶核酸。靈敏度及/或專一性問題可能來自於並非完全互補的序列間之核酸雜交。另外，無法檢測得樣品中所存在的低濃度標把核酸。 5 目前使用多項技術用來識別蛋白質、多肽及胜肽。常見此等識別涉及抗體的結合及抗體的檢測。雖然基於抗體之識別方法相當快速，但此種檢定分析偶而顯示高度的偽陽性反應或偽陰性反應。此等檢定分析成本高，同時檢定多於一個標靶困難。此外，該方法要求於進行檢定分析前， 10事先準備對感興趣標靶蛋白質之抗體。

多種分子生物學、遺傳學、疾病診斷及藥物反應預測方面之應用用途，涉及識別核酸序列變異株。現有核酸定序方法包括山卓（Sanger)二去氧定序法以及雜交定序法相對緩慢、昂貴、勞力密集，涉及使用放射性標籤或其它毒 15性化學品。現有方法於一次反應，於一次反應所能獲得的序列資訊量有限，典型約為1〇〇〇氮鹼基或以下。需要有更快速、成本有效及自動化方法來從事核酸定序。 t發明内容I 本發明係為一種方法，包含··獲得一條碼，該條碼包 20含一或二以上標籤附接至一有機分子主鏈；結合該條碼至一標靶；以及檢測結合至該標靶之條碼。本發明亦為一種方法，包含··獲得一核酸樣板，其包含一谷器區段及一探針區段；以及雜交一或多個加標籤之寡核苷酸至該容器區段來形成一條碼。 1302606 本發明又為一種製造一聚合物拉曼標記之方法，包含·獲得兩個或兩個以上之單體單元；以及聚合該單體單元來製造一聚合物拉曼標記。本發明又為一種聚合物拉曼標記，包含：兩個或兩個 X上卓體單元共彳貝附接在一起；兩個或兩個以上拉曼標籤；以及至少一個探針。本發明又為一種系統，包含：一成像儀器；至少一條碼鍵聯至一探針；以及至少一標靶結合至該探針。圖式簡單說明 10 以下各圖構成本說明書之一部分，含括用來進一步驗證此處藉示本發明具體例之各個面向。經由參照附圖組合詳細說明將更瞭解具體例。第1圖顯示產生條碼100之範例方法，條碼100具有有機主鏈110以分支120及標籤130修飾。條碼1〇〇包括探針部分 15 150結合至標靶。標籤130可接受額外修飾，例如結合至抗體140修飾。第2圖顯示利用相同主鏈產生不同條碼201、202、203 之範例方法。標籤240、250、260可置於不同位置來產生可區別的條碼201、202、203。條碼201、202、203結合至標 20 乾，可藉探針部分2(U、202、203附接至條碼201、202、203 媒介。第3圖顯示若干有單股核酸主鏈之條碼301、302、303、 304範例。標籤31〇、320、330加至主鏈各個位置來產生例如可藉拉曼光譜術識別的不同光譜。有相同標籤330附接至 1302606 條碼302、303、304不同位置的條碼可產生可區別的拉曼光譜。第4圖顯示藉弟3圖揭示之條碼產生之拉曼光譜範例。條碼3CU、302、303及304以線圖表示。 5 第5圖顯示使用多種具有已知序列之短寡核苷酸52〇附接至一或多個標籤510來產生條碼之範例方法。寡核苷酸標籤分子可藉雜交至樣板分子5〇〇而組裝成為條碼。樣板5〇〇可包含募核苷酸標籤雜交用之容器區段54〇、以及結合至標把分子如核酸之探針區段550。另一具體例中，探針55〇例 10如包含適合體序列，其可結合至蛋白質、胜肽或其它類型標靶。第6圖表示製造條碼之範例方法示意圖，包括藉附接標籤部分至募核苷酸或核酸來形成碼成分6〇1、6〇2、6〇3、 604，形成樣板606，以及雜交碼成分至樣板6〇5來產生條碼 15 607 。第7圖表示利用第6圖產生之條碼來識別是否存在有互補標乾股之範例方法之示意圖。第8圖表示藉數種拉曼標籤8〇卜8〇2、803、804、805、 806產生之SERS(表面加強式拉曼光譜術)光譜之作圖範例。 20 第9圖顯示聚合物拉曼標記910範例。單體單元901、902 藉共價鍵906聯結，共價鍵906係經由附接至主鏈9〇9之官能基904、908與成長中聚合物鏈末端之另一官能基904、908 交互作用而產生。選擇性地，可加入額外單體單元9〇3。第10圖表示產生聚合物拉曼標記之範例方法示意無。 1302606 固體撐體1001用來附接組件1005(例如聚合物拉曼標記之一部分）。組件1005之開放端1104被脫去保護，單體單元 1010透過單體單元1010之脫去保護官能基1006附接至組件 1005。拉曼標籤1002、1003、1008附接至聚合物拉曼標記。 5 第11A圖表示產生聚合物拉曼標記1105之另一範例方法。第一反應用來附接官能基ll〇2a、ll〇2b至拉曼標藏 1101a、1101b，產生光能化拉曼標籤1103a、n〇3b。第二反應用來聚合官能化拉曼標籤ll〇3a、u〇3b，生成次聚合物拉曼標記1104a、1104b。各個次聚合物拉曼標記H〇4a、 10 n〇4b&含預定數目之單體拉曼標籤1103a、1103b。例如第一次聚合物1104b包含「n」套第一單體11〇3a。第二次聚合物1104b包含「m」套第二單體11〇3b。預定比例之次聚合物拉曼標記1104a、ll〇4b可混合且交聯而形成聚合物拉曼標記1105 。 15 第11B圖表示產生聚合物拉曼標記之又另一範例方法。有官能基1112之聚合物分子11〇9可組合不同拉曼標籤 πιο來形成聚合物拉曼標幻⑴。各類拉曼標籤111〇數目可經預定來產生具有特定光譜性質之聚合物拉曼標籤 im。 2〇帛12圖顯讀聯至-或多健針1206來識別標把分子之聚合物拉曼標記之若干範例。第一例咖顯示聚合物拉曼標記1204透過鍵聯基1205附接至探針麗。第二範例 1202顯示兩個聚合物拉曼標記1204鍵聯1205至奈米粒子 1207 ’且額外鍵聯基12()5附接奈米粒子1浙至兩個探針 Ϊ302606 1206。第三範例1203顯示多個探針12〇6透過鍵聯基12〇5附接至奈米粒子，多個拉曼標籤1208附接至奈米粒子12〇7。第13圖表示藉數種修飾核酸、腺嘌呤拉曼標籤產生之 SERS(表面加強式拉曼光譜術）光譜作圖範例。 5 【實施方式】較佳實施例之詳細說明後文詳細說明含有多項特定細節意圖更徹底瞭解所揭示之本發明具體例。但熟諳技藝人士顯然易知可未採用此等特定細節實施具體例。其它情況下，業界眾所周知之裝置、方法、程序、及個別組成元件在此不再說明其細節。定義用於此處「一」或個」表不' 個或多於'一個項目〇用於此處「複數個」項目表示兩個或兩個以上項目。 15 用於此處，「核酸」一詞涵蓋DNA、RNA(核糖核酸）、早月又又版、或參股及其任一種化學修飾。實質上預期包含核酸之任-種修飾。「核酸」幾乎可為任—種長度，由兩個或兩個以上氮驗基之寡核普酸，至全長染色體膽A分子。核酸包括(但非限制性)募核㈣及多核苔酸。「板針」分子是對_個或多個標乾具有選擇性結合及/ :、專ι、Ό合之任_種分子。多個本發明具體例中，不同 :針分子可附接至可區別條碼，因此可由—群不同探針中法則特（¼針的結合。具體例非僅限於使用之探針分子 +別業界已知之任_種探針分子皆可使用，該等探針分匕括(仁非限制性)募核誓酸、核酸、抗體、抗體片段、锋 20 1302606 σ蛋白質、受體蛋白質、胜肽、外源凝集素、酶基質、抑制知活化劑、配位子、激素、細胞激素等。若干具體例中探針包含抗體、適合體(aptamers)、寡核普酸及/或核酸其已經共價附接或非共價附接至一個或多個條碼來識別不 5同的標免。具體實施例揭不之方法、組成物及裝置用於檢測、識別、及/或標識生物刀子，例如核酸及蛋白質。本發明之特定具體例中。 °亥等方法組成物及裝置可用於對主鏈做多項修飾来由單一 1〇有機主鏈產生多種條碼。具體例非僅限於單一主鏈反而可利用種或多種不同主鏈。其優點包括經由改變標籤沿主鏈之附接位置，而可以相同主鏈來產生不同條碼。其它具體例係有關產生聚合物拉曼標示，供快速識別生物分子或標識生物分子。其它優點包括靈敏準碓地檢測及/或識別多 15 肽0 合成條碼本發明之一具體例中，如第1圖舉例說明，條碼主鏈110 Y由包含有機結構之聚合物鏈形成，該等有機結構包括核酸、胜肽、多醣及/或化學衍生聚合物序列之任一種組合。 20右干具體例中，主鏈11〇包含單股核酸或雙股核酸。若干具 :J中主鏈可附接至探針部分150，例如募核苷酸、抗體或適。體。主鏈11〇可以一種或多種分支結構12〇修飾，來形成額外形態多樣化及形成額外標籤附著位置。分支結構 120可使用f界眾所周知之技術形成。例如，條碼1〇〇包含 11 1302606 雙股核酸時，分支結構120可經由合成寡核誓酸，且雜交至單股樣板核酸形成。寡核苔酸可設計成部分序列(例如5，端) 與樣板互補，而部分序列（例如3’端）則否。如此，條碼1〇〇含有雙股序列節段及單股分支結構120短節段。如第丨圖揭 5 示，標籤130可加至條碼，例如將互補序列之經標記之13〇券核甘酸雜父至分支結構120之單股部分而將標藏加至條碼0 募核苷酸模仿物(mimetics)可用來產生有機主鍵11〇。核甘酸早元之糖及核苔間鍵聯亦即核苔酸單元主鏈可以新 10穎基團置換。探針150可用來與適當核酸標乾化合物雜交。顯示具有絕佳雜交性質之募聚物化合物或寡核誓酸模仿物之範例稱作為胜肽核酸(PNA)。於PNA化合物，寡核苔酸之糖主鏈以含醯胺之主鏈例如胺基乙基甘胺酸主鏈置換。此種情況下，核酸氮鹼基保持直接或間接結合至主鏈醯胺部 15分之氮雜氮原子。揭示PNA化合物製備之若干美國專利案包括例如美國專利案第5,539,082 ; 5,714,331 ;及5,719,262 號。此外PNA化合物係揭示於Nielsen等人（科學1991，254 1497-15) 〇為了區別條碼100，標籤130可直接加至主鏈no，或可 20加至一或多個分支結構120。條碼100可進一步經由附接另一個分子140(例如抗體)至一或多個標籤130修飾。若使用龐大基團，則附接至分支位置12〇之標籤部分130之修飾對探針150與標靶分子之交互作用產生較少立體封阻。標籤13〇可藉成像模式讀取，成像模式例如為螢光顯微術、FTIR(富 12 1302606 麗葉轉換紅外線）光譜術、拉曼光譜術 '電子顯微術及表面電漿共振。不同成像方法已知可檢測標籤130之形態學、表面地形、化學及/或電學性質，包括（但非限制性）導電性、穿隧電流、電容電流等。使用之成像模式係依據標籤部分 5 1如之性質以及所得信號決定。不同類型之已知標藏13〇包括（但非限制性）螢光、拉曼、奈米粒子、奈米管、富樂烯 (fullerenes)及量子點標藏130可藉其表面地形、化學、光學及/或電學性質用來識別條碼100。此等性質隨使用之標籤部分130類別以及標籤130於主鏈110或分支結構12〇之相對 10 位置之函數變化改變，結果獲得對各條碼1〇〇可產生可區別的信號。如第2圖所示，可識別特定標革巴之不同探針21〇、220、 230可附接至可區別的條碼201、202、203。本具體實施例中，多個標籤240、250、260可附接至條碼201、202、203 15 之不同位置。標籤240、250、260例如包含拉曼標籤或螢光標籤。由於相鄰標藏可彼此交互作用，例如藉勞光共振能量移轉(FRET)機轉或其它機轉交互作用，故由同一組標簸部分240、250、260所得之信號可依據標籤240、250、260 之所在位置之間距而改變（參考實施例1)。如此，有類似主 20 鏈或相同主鏈之條碼201、202、203可做區別標示。標靶分子結合專一性可經由附接探針210、220、230(例如抗體、適合體或寡核苷酸)之條碼201、202、203來提供。因對應於已知探針210、220、230專一性之條碼201、202、203信號為已知，故可經由測定何者探針210、220、230結合至樣 13 1302606 品的標靶來分析分子複合混合物，以及來檢測個別分子物種。如第1圖及第2圖所示，本發明之若干具體例中，條碼

201、 202、203主鏈110可由磷酸二酯鍵、胜肽鍵、及/或糖 5 苷鍵形成。例如標準磷酸亞脒酸化學可用來製造包含DNA 鏈之主鏈110。其它製造磷酸二酯鍵聯主鏈110之方法為已知，例如聚合酶連鎖反應(PCRTM)擴大方法。主鏈110之末端可有不同官能基例如生物素、胺基、醛基或巯基。官能基可用來結合至探針部分150、210、220、230，或用來附 10 接標籤 130、240、250、260。標籤130、240、250、260進一步經修飾來獲得不同尺寸、電學性質或化學性質俾輔助檢測。例如，抗體可用來結合至異羥基洋地黃毒苷元 (digoxigenin)標蕺或螢光素標籤130、240、250、260。鏈絲菌抗生物素可用來結合至生物素標籤130、240、250、260。 15 金屬原子可沉積於條碼100、201、202、203結構，例如經由使用酶標籤130、240、250、260催化還原金屬離子溶液而沉積金屬。若條碼100、201、202、203包含胜肽部分，則胜肽可經磷酸化用於標籤130、240、250、260之修飾140。修飾後140之標籤130、240、250、260可藉業界已知之多種 20 技術檢測。本發明之若干具體例中，含有一或多種條碼100、201、 202、 203之溶液可應用於物件供保全追蹤之用，此等方法為業界已知。例如英國公司（史馬瓦特(Smart Water)公司）開發出使用含有數位DNA股之流體來對貴重物品加標記之方 14 I3〇26〇6 法。DNA實質上無法由物件洗掉，而可用來獨特識別昂貴物項或傳家寶物。DNA可由任何法醫實驗室檢測。此種方法也可用來使用此處揭示之分子條碼1〇〇、201、202、203 標記物項。於此等應用，條碼1〇〇、201、202、203之檢測 5 無需基於DNA順序之法醫學分析。雜交條碼第5圖所示，本發明之其它具體例係有關藉雜交產生條碼530。本具體例中，條碼530包含核酸5〇〇雜交至寡核苷酸 520。一或多個標籤部分510可附接至例如藉已知化學合成 10技術製造的、具有已知序列之寡核苷酸520。多種製造加標籤寡核苷酸520之方法為業界眾所周知。條碼53〇係經雜交一系列加標籤之寡核苷酸520至單股DNA樣板500而形成。盎板500包含一容器區段54〇及一探針區段55〇。探針區段 550設計成雜交至互補標靶核酸序列。另外，探針區段可包 15含適合體序列，該適合體序列可結合至蛋白質、胜肽或其它標靶生物分子。各具體例中。探針區55〇長度可為2至3〇、 4赤20或14至15個核苷酸。探針55〇長度並無特殊限制，預期涵蓋2、3、4、5、ό、7、8、9、10、11、12、13、14、 15 16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、 20 60、65、70、75、80、85、9〇、95、1〇〇、125、ΐ5〇、2〇〇、 250個核苷酸或甚至更長的探針區段550。第3圖說明用於本發明之多個具體例之範例拉曼加標籤‘籤。拉叉標籤31〇、320、330可附接至同一個寡核苷酸序列之不同核㈣’來產生不同光譜(第4圖）。例如募核誓 15 1302606 酸302、303及304顯示相同寡核苷酸序列而標籤33〇之位置改變。如第4圖所示，第3圖揭示之加標籤3〇1、3〇2、3〇3、 304之募核苔酸之拉曼光譜可區別。第4圖驗證相同拉曼33〇附接至相同募核苷酸序列3〇2、3〇3、3〇4，之位置有微小改 5變’即可產生不同差曼光譜(有關進一步細節參考如下實施例1及2)。第5圖所示本發明之具體例，當允許一或多個加標籤寡核苷酸520雜交至樣板分子5〇〇之容器區段54〇時，可形成條碼530。加標籤之募核苷酸52〇之序列設計成與容器區段54〇 1〇互補’而非與探針區段550互補。藉雜交結合至樣板5〇〇之標鐵部分510組合係選自提供可區別之信號。對使用之信號類別並無特殊限制，可利用任一種已知技術包括（但非限制性)拉曼光譜、FTIR、表面拉曼電漿共振。雜交後，可藉已知方法包括（但非限制性)超濾、HPLC(高效液相層析術）、 15羥基磷灰石管柱層析術、超離心等將條碼530與未雜交之募核苷酸520及樣本股5〇〇分離。此種條碼530之製造方法有高度向度標記效率，比較標準技術要求製造較少加標籤之寡核誓酸520，其中各個加標籤之募核苷酸520包含一個分開及可識別之條碼530。如熟諳技藝人士顯然易知，第5圖所 2〇示方法舉例說明條碼530之組合製法，允許使用遠更少數加標籤募核苷酸520製造大量可區別的條碼530。第5圖所示本發明之若干具體例中，樣板5〇〇序列長度可由探針區段550以及欲雜交之加標籤募核苷酸52〇之尺寸決定。例如對長「n」個氮鹼基之探針區段55〇以及對長「m」 16 1302606 個氮鹼基之加標籤寡核苷酸520而言，樣板500長度係等於 (l+m)xn(或另外(nxm)+n)。例如假設探針區段55〇長9個氮鹼基以及加標籤募核苷酸520長5個氮鹼基，則對全部可能的9元體探針序列提供獨特條碼長度須為（1+5)><9或54個氮 5 驗基。允許部分序列重疊，一個指定54氮驗基樣板，假設全雜交（亦即5元體無法只結合至樣板5〇〇最末4個氮鹼基），可含有高達50種不同5元體序列。此種樣板所含有的可能不同 m元體數目也可計算成等於(n+(nxm)-m+i)。相反地，由於$ 10元體各個位置可含有四個可能的氮鹼基質，而有五個位置’故可成45(或1024)種可能的5元體序列。如此表示 4m-(n+(nxm)-m+l)不同類5元體可用作為碼成分。此種情況下’有974 (=1024-50)類別5元體可用作為碼成分。容器區段540可設計成雜交至974類為5元體中的一系列獨特5元 15體。包含適當碼序列之加標籤寡核苷酸520可被導入且雜交成容器區段540。各個加標籤寡核苔酸520將含有可提供獨特信號之標籤，故可與其它碼成分識別。其原理可參照範例舉例說明。若探針區段550長4氮鹼基(n=4)，且加標籤募核苷酸52〇包含3氮鹼基序列(m=3)， 20則樣板500長度為16氮鹼基長度((1+3)χ4)。如此獲得一個12 氮驗基容器區段540及一個4氮鹼基(4元體)嘆真區段550。因 m==3 ’故有64 (43)種可能的3元體序列。各個16氮鹼基樣板 5〇〇可含有高達十四類3元體(4+(3*4)-3+1 = 14)。任意樣板 50〇序列顯示如下SEQIDNO:l，探針區段550(下方晝線)於 17 1302606 左方’而谷裔區段540於右方。 AGAA AGT ACA TAT GTC (SEQ ID NO: 1) 本例中，因並無任何3元體完全相同，故16元體含有14

種不同的3元體序列(AGA GAA AAA AAG AGT GTA TAC 5 ACACAT ATATAT ATGTGRGTC)。為了防止碼成分結合於錯誤位置，至少需要18種不同類型（=14+4)獨特加標籤3 元體碼序列來區別標識全部可能的4元體探針序列550。[所

需獨特碼成分計算為等於((2xn)+(nxm)-m+l)]。使用SEQ ID ΝΟ··1揭示之特定容器序列54〇,只需要4種加標籤之3元體， 10亦即TCA，TGT，ATG及CAG。各個加標籤之3元體可結合於樣板500之一且唯一位置。因加標籤寡核苷酸52〇序列係與容器區段540互補，故容器區段540之「Α」係結合至加標戴养核甘酸520之「Τ」’而「G」係結合至「C」，反之亦然。探針區段550之序列之任一種變化皆要求容器區段540序列 15 做對應變化。例如若探針序列550由AGAA改成AGTA，則因探針550之AGT重疊容器序列540之AGT，故容器序列54〇也須改變。可能的新的樣板5〇〇序列顯示於如下SEQ ID N〇:2 〇 AGTA AGA ACA TAT GTC (SEQ ID NO:2) 20 對應寡核苷酸520序列可為TCT TGT ATA及CAG。再度’各個序列之結合至容器區段540的唯一位置，無法結合至探針區段550。為了允許獨特標識，全部可能的4元體探針序列540,要求18種不同3元體加標籤募核苷酸520,此數量係遠小於使用已知方法產生全部可能的3元體序列需要 18 1302606 的64種加標戴之3元體520，已知方法例如係使用完整探針存庫藉雜交來定序。只使用64種能的3元體之18種，也可際免使用加標戴寡核苔酸520序列可能彼此雜交的問題。 5 10 15 20 加標籤寡核苷酸520(或碼成分）可於條碼530合成前預先製備，且可經純化後儲存。一指定m元體集合可用來對任何所需探針550序列製備條碼530。如此比較現有方法可大為改良探針550的製備效率，現有方法中，各個加標籤探針 550分子係分開製備，且個別標示及純化。此處蹟示模組系統比較已知方法具有較高標示效率。通常附接信號(標記）成分至核酸股，涉及使用標示核苷酸或後合成標示方法，二者皆可引發問題。DNA聚合酶典型無法有效處理經過標示來結合於加標籤募核苷酸52〇或核I。§多個#號成分欲加至單一核酸股時，結合效率大減。與多於1個或2個標記的DNA股由於結合效率低，故需要大量起始物料’且相當純化標示分子才能將標示分子或部分標不分子分開來。使用此處揭示之多個短加標籤募核苷酸520，可避免此項問題。當條碼5 3 0分子設計用於特定標靶分子時，條碼530之 …構及k 5虎成分固定，條碼53〇只適合用於一項目的。若條碼530為其它標革巴所需’則各自必需由開頭製備。本模組分子系統使用短的加標籤募核苷酸52〇，其可預先製備及儲子’可大為改善對任何標靶製造條碼530的彈性、簡便及速度。所需獨特加標籤之碼成分數目減少，也可降低成本，可改良檢測效率，如此可減少必須製備與必須識別的可區 19 1302606 別之加標籤之探針550數目。 10 15 20 第6圖顯示產生條碼例如前文討論之條碼之範例方法。例如碼成分6〇1、6〇2、603、604可藉合成短的募核苷酸(例如3元體），且鍵聯標籤至該募核苷酸，或結合一個原先已經藉標籤修飾的核酸來產生碼成分。鍵聯至募核苷酸之標籤非僅限於拉曼標籤。例如螢光、奈米粒子、奈米管、富樂烯及量子點標籤也可附接至募核誓酸。附接至募核苷酸之模式可改變。標籤可直接附接至寡核苷酸，或標籤可透過分支結構附接至募核苷酸。多種製造加標籤之募核苷酸用作為竭成分觀為業界眾知。具有延長探針區^樣本606可形成，該樣板之序列係與加標籤之崎成分刪、、603、604互補。加標籤之碼成分謝、6〇2、⑻3、⑼4 可個別雜交或呈混合祕⑽5至樣板齡所得條碼術包括-個帶有可檢測標籤之雙股區、以及_個結合至餘分子之單股探針區。 —第7圖顯示產生及使用條碼之示意圖。條碼可經由形成 ^前文討論之樣板分子及碼成分而產生。如敎討論，碼 ^可雜交至樣板，產生㈣。—旦產生條碼，條碼可用 ;夕項用途，例如用於檢測樣本之募料酸、核酸或豆它標衫子，或條碼可用⑽序核酸分子。如第7圖所示，經 =複暴露標乾分子至含-種或多種條碼之溶液可將核酸 #定序。條碼雜交至綠，指示絲股存在有互補序列。 5亥方法重複，暴露於不同條竭，指示存在有不同的互補序列。由於該方法之「散彈搶式」定序，若干互補序列可能 20 1302606 、補序列可被組配成為完整標I巴核酸序列。、條褐可被導人樣本，結合至分子，藉任—種以知成像板式k測’例如蝥細微術、FTIR(富麗葉轉化紅外、、、）光曰術拉面先错術、表面電聚共振及/或電子顯微術。 5 #共價鍵結製備聚合物拉曼標記條碼本發明之若干指具體例中，可產生聚合物拉曼標記條碼通合物拉曼標記包含一主鏈部分，拉曼標鐵係直接附接或透過間隔基分子附接至主鏈部分。主鍵部分包含任，別適合用於聚合之單體，該等單體包括(但非限制性） 10核苔酸、胺基酸、單_或多種已知之塑膠單體之任一種，塑膠單體例如乙烯系、苯乙稀系、碳酸系、乙酸系、乙稀、丙烯醯胺等。聚合物拉曼標記可附接至探針部分，例如募核苔酸、抗體、外源凝集素或適合體探針。若聚合物主鍵包含核苷酸單體，則附接至抗體探針將減少探針成分及主 15鏈成分一者結合至不同標把分子的可能。另外，使用核苷酸單體之本發明之若干具體例中，結合於聚合物拉曼標記之核苔酸序列可設計成為與目標核酸互補，允許探針功能結合於聚合物拉曼標記。因基於核苷酸之主鏈本身可產生拉曼發光光譜’該光譜可能干擾附接的拉曼標籤的檢測， 2〇故若干具體例中’可使用極少產生或未產生拉慢發光信號之主鏈成分來最佳化信號檢測，及最小化噪訊比。下節係有關聚合物拉曼標記之概述，但非限於使用特定類型單體單元。如前文討論，聚合物拉曼標記可用於標靶分子的檢 21 1302606 測、識別及/或定序。目前探針標示與檢測方法有多項缺點。例如附接至有機螢光標籤之探針提供高度檢測靈敏度，但具有低多工檢測能力。螢光標籤有寬發光波尖，螢光共振能轉換(FRET)限制可附接至單一探針分子的不同榮 5光標籤數目，而自我定序則減少螢光信號量子的產率。若探針含有多於一類發射基團，則螢光標籤需要多重激發來源。由於光漂白緣故故不穩定。另一類可能的探針標鐵為量子點。量子點標籤為有多層的相當大型結構。除了势造上複雜外，量子點的塗層也干擾螢光發射。使用量子點標 10籤可產生的可區別信號數目有限。第三類探針標記為染料浸潰珠粒。染料浸潰珠粒的處寸極大，經常大於探針分子尺寸範圍。染料探針珠粒的檢測數於定性而非定量檢測。拉曼標㊂己提供產生銳利光譜波尖，允許更多或可區別標記附接至探針之優點。使用表面加強拉曼光譜術(SERS) 15或類似技術允許檢測靈敏度可媲美螢光靈敏度。範例拉曼標籤分子之發光光譜顯示於第8圖。由該圖可知，拉曼標鐵分子提供多重可區別光譜。第8圖表示如下拉曼標籤分子： NBU(寡核 4 酸5’-(T)20-去氧Nebularine-T-3’）； ETHDA(寡核苷酸5’-(T)20_(N-乙基去氧腺苔）_T-3，）； BRDA(寡核苔酸 20 5’-(Τ)20-(8-溴腺苷）-T-3，）； AMPUR(寡核苷酸5，-(Τ)20-(2-胺基嘌呤)-Τ-3’）； SPTA(募核苷酸5，-ThiSS-(T)20A-3，）；及 ACRGAM(募核苷酸5，-acrydite-(G)20-胺基-C7-3，）。第 13圖表示一種核酸腺嘌呤之若干核酸類似物之SERS光譜，與核酸本身之光譜比較：腺嗓呤；2-F腺嗓呤，4-Am_6-HS-7-去 22 1302606 氮雜-8-氮雜-腺嗓呤；激動素(kinetin) ; N6-苯曱醯基-腺嗓呤；DMAA-A ; 8-氮雜-腺嘌呤；腺嘌呤硫醇及σ票吟衍生物亦即6-Μ基嘌呤。表1列舉拉曼光譜術可使用之其它標籤分子。熟諳技藝人士瞭解拉曼標籤非僅限於此處揭示之標 5 籤’可包括任何已知可附接至探針且可檢測之拉曼標籤。多種此專拉哭標戴為業界已知（例如參考 www.glenres.com) 〇表1.拉曼標籤分子範例 2 ’，3 ’ -dd Α-5 ’ -CE磷酸亞脒酸 10 2’-去氧腺苷a-硫基三磷酸（15 mM)(2’dATTPaS) 2’ -氟腺苷a-硫基三磷酸(10 mM)(2’ -F-ATTPaS)

2’ -OMe-A-CE磷酸亞脒酸 2’ -OMe-A-Me磷酸亞脒酸 2，-OMe-A-RNA 15 2’-Ome-腺苷 a-硫基三磷酸(20 mM)(2’-0-Me-ATTPaS) 2’-OMe-Pac-A-CE磷酸亞脒酸 2 ’ -OMe-A-CE磷酸亞脒酸 2-胺基-d A-CE磷酸亞脒酸 2-胺基嘌呤核糖苷a-硫基三磷酸(2〇 mM)(2-AP-TTPaS) 20 2-F-dA-CE磷酸亞脒酸

3 ’ - A-TOM-CE磷酸亞脒酸 3’-dA-CE磷酸亞脒酸 3，-dA-CPG 7-去氮雜腺苷a-硫基三磷酸(1 mM)(7_DATTPaS) 23 1302606 7- 去氮雜-dA CE磷酸亞脒酸 8 -胺基-d A-CE磷酸亞脒酸 8- Br-dA-CE磷酸亞脒酸 8 -酮基-d A-CE磷酸亞脒酸 5 A-TOM-CE磷酸亞脒酸 A-RNA-TOM-CPG 腺苷a-硫基三磷酸(0.5 mM)(ATTPaS)

Bz-A-CE填酸亞脉酸 Bz-A-RNA-CPG 10 dA-5’-CE磷酸亞脒酸 dA-5，-CPG dA-CE磷酸亞脒酸 dA-CPG 1000 dA-CPG 2000 15 dA-CPG 500 dA-高負載-CPG dA-Me磷酸亞脒酸 dA-Q-CPG 500 二胺基嘌呤核糖苷a-硫基三磷酸(0.25 mM)(DTTPaS) 20 第9圖顯示經由將兩個或兩個以上拉曼加標籤單體單元901、902鍵聯在一起形成聚合物拉曼標記，產生條碼之範例方法。聚合物拉曼標記可附接至探針部分來結合至標靶分子且檢測標靶分子。聚合物拉曼標記可包含第一單體 24 1302606 單元901，藉共價鍵9〇6附接至第二單體單元9〇2。若需更高信號複雜度，則可附接額外單體單元903。單體單元9〇1、 902包括一或多個拉曼標籤部分907a、907b直接附接至主鏈 9〇9，或藉間隔基9〇5附接至主鏈9〇9。間隔基9〇5例如包含5 · 5個或5個以上碳原子。間隔基905長度例如可為2至3〇、2至 · 2〇、或3至15個碳原子。最有效的間隔基9〇5為有彈性，例如脂肪族碳(例如透過胺基己酸鍵聯）、胜肽鏈(例如透過離 * 月女&L支鏈鍵馬p)、或聚乙二醇(例如透過磷酸亞脒酸鍵聯）。間隔基905可含有碳、氮、硫及/或氧原子。多種製造及交鲁 10聯加標籤單體單元9〇1、9〇2之方法為業界已知。多種加標籤之單體單元也可得自商業來源(例如分子探針公司，俄勒岡州尤今）。如第9圖所示，透過官能基9〇4、9〇8，共價鍵聯一個單體單元901至另一個單體單元9〇2可形成條碼。官能基9〇4、 15 908可例如包括生物素、胺基、駿基、疏基或任何一個已知之反應性基團。各個單體單元9〇1、9〇2至少有兩個官能基 904、908 ’個別附接至單體各端。於交聯前，一個官能基 Φ 904 908可被活化（脫去保護）來附接至另一個單體單元 901、902，而第二個官能基9〇4、9〇8維持保護不產生交互 - 20作用或被封阻(例如藉化學修飾）封阻。單體單元901、902 , 之各端於活化時可結合至另一個單體單元9〇1、9〇2。各具體例中，聚合物拉曼標記包含2至3〇、4至2〇或5至15個單體單元901、902(例如核苷酸、胺基酸、塑膠單體等）。舉例說明包含兩個單體單元9〇1、902藉共價鍵9〇6鍵聯至聚合物拉 25 1302606 曼標記910範例。拉曼標籤907a、907b顯示透過間隔基分子 905至909。單體單元9(U、902藉共價鍵906彼此附接，本例中係藉甲二醯亞胺催化羧基於第一監反應形成的醯胺鍵聯彼此附接。 5 預期拉曼標籤907a、907b包含一或多個雙鍵，例如碳- 氮雙鍵。也預期拉曼標籤907a、907b包含環狀結構，有側基附接至環狀結構。側基包括(但非限制性）氮原子、氧原子及鹵素原子及奴原子及氫原子。可增加拉曼信號檢測強度之側基特別有用。有效側基包括有共軛環狀結構之化合物 10 例如嘌呤類、吖啶類、若丹明染料及花青染料。聚合物拉曼標記之總極性預期為親水性，但也可包括疏水側基。欲產生聚合物拉曼標記之範例方法顯示於第忉圖。固體撐體1001可用來固定成長中的聚合物拉曼標記。撐體 1001例如包含多孔玻璃珠、塑膠（包括但非限於丙烯酸系、 15聚苯乙稀、苯乙烯與其它材料之共聚物，聚丙烯、聚乙稀、聚丁烯、聚胺基曱酸酯類、鐵氟龍J等），多醣類、尼龍、硝基纖維素、複合材料、陶瓷、塑性樹脂、矽氧、以矽氧為主之材料、石夕、改性石夕、碳、金屬、無機玻璃、光纖束或任何其它已知之固體撐體類節。一或多個鍵聯基分子 20 101〇(例如碳原子鏈）可附接至撐體1001。鍵聯基分子1010 之長度可改變。例如鍵聯基1010長度可為2-50個原子。各種使用之鍵聯基1010類型討論如前。預期多於一種長度或多於一種類型之鍵聯基分子1010可附接至固體撐體丨001。鍵聯基1010作為附接位置，藉逐步附接單體單元1009來成 26 1302606 長聚合物拉曼標記。第10圖顯示包含二單體之聚合物拉曼標記附接組件。欲附接之各個單體單元100包含如前文討論之兩個官能基1006、1007，各一個附接於單體單元1〇〇9一端。單離 5單兀1009之添加，係經由選擇性活化於單體單元1009前端的官能基1006執行。活化官能基1〇〇6可附接至組件1〇〇5成長端之另一個活化官能基1〇〇4。聚合物之化學合成方法為業界已知，例如包括寡核苷酸之磷酸亞脒酸合成、及/或胜肽之固相合成。官能基1〇〇4、1〇〇6、1〇〇7之保護方法及脫 1〇保護方法為業界眾所周知，如於寡核苔酸或胜肽合成技術中已知。各個連續單體單元1〇〇9可導入溶液内，例如懸浮於乙經或其它溶劑。第一單體單元1009之前端之官能基1〇〇6可結合至鍵聯基分子1〇10。一旦第一單體單元1〇〇9附接至鍵 15聯基分子1010，則附接於第一單體單元1009之官能基1007 可藉化學處理(例如氫氧化銨處理)脫保護，來允許結合另一個單體單元1009。欲增加的第二單體單元1〇〇9包含一活化吕月b基1006及經保護的官能基1〇〇7，允許方向性附接單體單元1009。於單體單元1009結合入聚合物拉曼標記的成長 20中的組件1005後，經保護的官能基1004可脫去保護，加入另一個單體單元1009。此項處理之額外回合可持續至產生具有適當長度的聚合物拉曼標記為止。預期若干不同單體單元1009可於任何指定時間加至固體擇體1001，來產生不同聚合物拉曼標記。後述情況下， 27 1302606 若屬適當，不同聚合物拉曼標記可於合成後分離。聚合物拉曼標記之長度將依據所結合之單體單元1009數目而改變，但各個聚合物標記將含有兩個或兩個以上單體單元 1009。 5 本發明之各具體例中，聚合物拉曼標記含有1、2、3、 4、5、6、7、8、9 ' 10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25或25個以上的拉曼標籤 1002、 1003、1008。附接至單一聚合物拉曼標記的個別拉曼標籤1002、1003、1008各自可不同。另外聚合物拉曼標 10 §己可含有兩套或兩套以上相同拉曼標籤1002、1003、1008。為了最大化可區別的聚合物拉曼標記數目，預期若有複數個拉曼標籤1002、1003、1008結合至單一聚合物拉曼標記，則拉曼標籤通常個別相異。如前文討論，拉曼標籤1〇〇2、 1003、 1008可直接附接至聚合物拉曼標記1〇〇9主鏈1〇11， 15 或可透過間隔基分子附接。聚合物拉曼標記比單體標記可提供更大光譜區別變化，同時允許具有拉曼光譜檢測的敏感度。使用曼標籤1002附接至單一聚合物拉曼標記，運序製造極大量可區別的聚合物拉曼標記。由1〇個不同之可能的加桿藏: 2〇單體單元1009製造的4元體聚合物拉曼標記，將產2超過 5〇〇〇個可區別的拉曼電子簽章。使用15種不同的加標藏= 單=單iU，，則將獲得超過3G，_種可區別的拉^電子簽章。只使用10至20個不同的加標籤之單體單元，即可產生超過50,〇〇〇個可區別的拉曼電子簽章。因單體單 28 1302606 的大小約略等於核苷酸（約1000道爾頓），故4元體拉曼標記的平均大小約4000道爾頓。因此聚合物拉曼標記允許探針一標乾的結合極少有立體封阻。若干本發明具體例中，結合於單體單元1009，具有間 5隔基分支附接至主鏈，有另一個反應性基團1004、1006、 1007附接至間隔基分支。聚合物合成過程中，反應性基團 1004 ' 1〇〇6、1007可經保護或封阻。聚合物合成後，或單體單元1009結合入生長中的聚合物1〇〇5後，拉曼標籤 1002、1003、1008可附接至脫去保護後的間隔基分支。 10 若干本發明具體例中，如第11A圖所示，可產生無撐體之♦合物拉曼標記1105。拉曼標籤n〇ia、H〇ib可經化學變更，加上官能基1102a、1102b，例如生物素、胺基、酸基、硫基或任何其它反應性基團，來產生官能化拉曼標籤 (單體單元）1103a、1103b。然後單體單元11〇3a、i103b可接 15受聚合來產生次聚合物單元1104a、ll〇4b，各個次聚合物單元包含預定數目的單體單元。次聚合物單元1〇〇如、l〇〇4b 可以預定比率（例如1:1、1:2、1:1〇等）混合，接受額外聚合反應來製造最終聚合物拉曼標記1105。所示反例中，聚合物拉曼標記1105包含「η」套單體單元n〇3a，以及「m」套 20 第二類單體單元1103b。第11B圖顯示另一種產生不含撐體之聚合物拉曼標記 1111之方法。此種情況下，一或多個聚合物1109可含有反應性側基1112附接至由主鏈延伸的間隔基。反應性側基 1112可附接至一或多個不同的拉曼標籤111〇來形成聚合物 1302606 拉曼標記1111。反應性側基1112可包括聚離胺酸，經處理來將胺基側鏈轉成順丁烯二醯亞胺殘基（聚順丁烯二野），順丁烯二醯亞胺殘基可與HS(硫酸氫根）官能化拉曼標籤111〇反應。另外，側基1112可包含聚（丙烯酸胺)之胺基，其可與 5 NHS酯官能化拉曼標籤1110反應。側基1112也包含丁二酸化去離胺酸之羧基基或帶有胺基之羧酸基之合成募核苔酸之羧酸基。羧酸根側基1112可附接至拉曼標籤m〇，例如使用甲·一 ®避亞胺媒介之交聯附接。聚合物主鏈可由有機結構形成，例如由核酸胜肽多膽 10 及/或化學衍生聚合物之任一種組合形成。聚合物拉曼標記 1111主鏈可藉磷酸二酯鍵、胜肽鍵及/或糖苷鍵形成。例如標準磷酸亞脒酸化學可用來製造含DNA鏈之主鏈。其它製造石粦酸二酯鍵聯主鏈之方法為已知，例如聚合酶連鎖反應 (PCR™)擴大。主鏈末端可有不同官能基，例如生物素、胺 15基、醛基或巯基。此等官能基可用來將兩個或兩個以上的次聚合物單元鍵聯在一起。例如聚合物拉曼標記nn包含「m」套第一單體單元，「k」套第二單體單元及「丨」套第三單體單元。一旦聚合物主鏈合成為預定長度，兩種或兩種以上不同的拉曼標籤mo可循序或同時結合反應性側基 20 1112，藉此產生聚合物拉曼標記。單體單元非僅限於拉曼 t籤1110。其它標戴例如螢光、奈米粒子、奈米管、富樂烯及量子點標籤也可附接至一或多個單體單元，來讓聚合物拉曼標記1111變多樣化。通常大部分單體單元標籤1110 為拉叉軚籤1110。多於一個聚合物拉曼標記1111可接合來 30 1302606 產生更長的產物。右干本發明具體例中，如第12圖所示，前文討論之任一種聚合物拉曼標記可鍵聯至探針1206。探針分子1206例如包括(但非限制性)寡核苷酸、核酸、抗體、抗體片段、結 5合蛋白質、受體蛋白質、胜肽、外源凝集素、酶基質、抑制劑、活化劑、配位子、激素、細胞激素等。多種聚合物拉曼標記1204之範例結構1201、1202可包含共4貝鍵聯之單體單元，由一個主鏈以及一個或多個拉曼標籤直接附接或透過間隔基分子附接至主鏈。聚合物12〇4 10可透過鍵聯基1205或直接共價鍵1205附接至探針1206。另外’聚合物拉曼標記1204可透過奈米粒子12〇7間附接至奈米粒子1207。多種交聯分子至奈米粒子為業界已知，可使用任一種此等已知方法。例如經由於一Edac (1_乙基-3-(3_ 二曱基胺基丙基）曱二醯亞胺)存在下交聯羧基與胺基。如範 15例疾構1202所示，多於一個聚合物拉曼標記1204可附接至單一奈米粒子1207。然後奈米粒子12〇7附接至一或多個探針分子1206。此類型結構之優點為使用單一聚合物拉曼標冗1204可識別多於一標靶分子。另外，若奈米粒子12〇7附接至多套相同探針分子1206，則可結合多套相同標靶分 20子。其它優點包括由於有更多個探針分子1206附接至拉曼標記’故有更高機會來捕捉標靶分子；由於拉曼標記12〇2 可藉離心、過濾、或電泳分離，故自由態標靶分子以及結合拉曼標記的標靶分子的分離於溶液檢測應用變更容易。另一結構1203中，單體拉曼標籤1208可直接或透過間 1302606 隔基分子1205附接至奈米粒子1207。一或多個探針分子可直接或藉間隔基1205附接至同一個奈米粒子1207。如此允許形成複數個拉曼標籤1208附接至一個探針1206，而無須初步合成聚合物1204。本結構1203之優點為奈米粒子12〇7 5有較大表面積，允許更大量探針分子1206及拉曼標籤1208 結合，同時分子間的立體封阻減少。使用相對少數單體單元，可形成大量多種聚合物拉曼標記條碼。聚合物拉曼標記的產生允許條碼產生時有更大彈性及靈敏度，同時利用相對少數拉曼標籤。 10 核酸欲定序之核酸分子可藉任一種標準技術製造。一具體例中，核酸可為天然DNA或RNA分子。若使用RNA，則需 15

要將RNA轉叙補CDNA。實質上任何天然核酸皆可藉本發明製備之方法定序，該等天然核酸包括(但非限制性）染色體 DNA、粒線體DNA或葉綠體DNA、或信使rna、非同源核 20 疆、核糖體RNA或移轉RNA。多種不同形式細胞核酸之製法及分離方法為已知(例如參考分子轉殖技術指導，編輯

Berger及KimMe卜學術出版社，紐約州紐約，1987年丨分子轉殖·貫驗室手冊第二版，編者Sambr〇〇k、触灿及 Maniatis，冷泉港出版社，冷泉港紐約，1989年）。非天然核酸也可使賴揭示之方法及組成物定序。例如藉標準擴大技術如?炎合酶連鎖反應(pcrTM)擴大法製備之核酸，可於本發明範IS定序。核酸擴大;^為業界眾所周知。核酸可分離自寬廣多種不同來源，包括（但非限制性) 32 1302606 病毒、細菌、真核細胞、哺乳類及人類質體、]V[13、入噪菌體、P1人工染色體(PACs)、細菌人工染色體(BACs)、酵母人工染色體(YACs)及其它轉殖載體。核酸制動方法 5 各具體例中，核酸分子可藉附接至固體表面制動。核酸分子之制動可藉多種方法達成，涉及非共價附接或共價附接至撐體或表面。一具體例中，制動可經由使用鏈絲菌抗生物素或抗生物素塗覆固體表面，以及結合生物素化多核甘酸達成。制動也可藉下述方式達成，以poly-L-Lys咬 10 L_Lys、Phe塗覆聚苯乙烯、玻璃或其它固體表面，接著使用雙官能交聯劑共價附接胺基改性或巯基改性之核酸而達成。胺殘基可經由使用胺基矽烷導引至表面。經由直接共價附接5’-填酸化核酸至化學改性聚苯乙稀表面，可進行制動。核酸與固體表面間之共價鍵係經由與 15水溶性甲二醯亞胺縮合形成。此種方法可輔助核酸透過其 5’-磷酸根主要進行5,附接。苇見DNA結合至玻璃之方式，係經由首先矽烷化玻璃表面，然後以甲二醯亞胺或戊二醛活化玻璃表面結合dna 至玻璃。另一項程序係使用DNA合成過程中以透過胺基鍵 2〇聯基鍵聯於分子3,端或5,端之DNA之化學劑，該化學劑例如為3-縮水甘油氧基丙基三甲氧基矽烷或胺基丙基三甲氧基石夕烧(APTS)。DNA可使用紫外線輻射直接結合至膜。其它制動核酸之方法為已知。欲用來制動核酸之表面類別並無特殊限制。各具體例 33 1302606 中^動表面可為磁珠粒、非磁珠粒、平坦面、尖銳面或 2其它固體表面之構形’包含幾乎任—種材料，只要該材料允許核酸雜交至探針存庫即可。 *雙ΐ能t聯劑可用於各具體例。範例交聯劑包括戊二醛又B月匕王衣氧乙烧、乙二醇二縮水甘油喊、及甲二酿亞胺類例如！-乙基胺基丙基）甲：酿亞胺。若干具體例中’捕捉寡核㈣可結合至表面。捕捉寡核誓酸將與核酸樣板的特定核酸序列雜交。核酸可藉限剪 10

酶消化、核酸内㈣活性、升高溫度、降低鹽濃度或此等及類似方法的組合而由表面釋放。蛋白質純化

若干具體例中，蛋白質或胜肽可經分離或純化。一具體例中，蛋白質可用來產生抗體，使用任—種條碼(例如聚合物拉曼標記)加«。蛋μ純化技術為熟諳技藝人士眾 15所周知。此等技術就一層面而言，涉及均化，以及細胞、組織或器官粗分選成為多肽部分及非多肽部分。感興趣之蛋白質或多肽可進一步使用層析技術或電泳技術純化來達成部分純化或完全純化（或純化至均質）。特別適合用於製備純肽之分析方法為離子交換層析術、凝膠排除層析術、 20 HpLC(高效液相層析數）、FPLC(AP生技公司）、聚丙稀醯胺凝膠電泳、親核層析術、免疫親和層析術及等電聚焦方法。藉親和層析術受體蛋白質純化範例揭示於美國專利案第 5,206,347號，其完整内文以引用方式併入此處。更有效之純化胜肽方法之一為速效液相層析術(AKTA FPLC)或甚至 34 1302606 HPLC。純化後之蛋白質或胜肽意圖表示組成物，可與其它成分分離’其中蛋白質或胜肽純化至相對於其天然取得態的任-種程度。因此分離後或純化後之蛋自践職也表# 5不含其天然環境的蛋白質或胜肽。通常「純化」表示蛋白質組成物或胜肽組成物已經接受分選來去除多種其它成分，該組成物實質上保有其表現的生物活性。當使用「實質純化」一詞，此種術語表示一組成物，其中蛋白質或胜肽構成組成物之主要成分，例如占組成物蛋白質之約馨 10 50%、約60%、約70%、約8〇%、約9〇%、約％%或以上。鑑於本揭示的多種量化蛋白質或胜肽純化程度之方法為業界人士已知。例如包括測定活性部分之比活性，或藉 SDS/PAGE分析評比一部分之多肽含量。較佳評比一部分純度之方法，係計算該部分之比活性，將該部分比活性與初 1S期萃取物比活性比較，如此計算純度，卩「純化倍數」做評比。用來表示活性量的實際單位當然係依據選用來純化的特定檢定技術決定，而與表現之蛋白質或胜肽是否具有馨可檢測之活性無關。多項適合用於蛋白質純化之技術為熟諳技藝人士眾所 · 20周知。此等技術例如包括使用硫酸銨、PEG、抗體等沉澱， ' 或藉熱變性，接著為：離心；層析步驟例如離子交換層析術、凝膠過濾層析術、反相層析術、羥基磷灰石層析術及親和層析術；等電聚膠；凝膠電泳；及此等技術及其它技術的組合。如業界一般已知，相信進行各項純化步驟之技 35 1302606 :可改變’或可刪除某些步驟’而仍然獲得製備實質純化蛋白質或胜肽之適當方法。對經常性提供於最高純化態之蛋白質_肽並無特殊要求。確實預期實質上較非純化之產物可用於若干具體例。，部分純化可使賴少純化步驟的組合達成，或利用不 :式之相同概略純絲構達成。例如須瞭解利裝 =進行陽離子錢管柱層_，通讀觀低壓層析 ^糸統更面「倍」純化。有較低相對純化程度之方法具有 1〇點蛋白質產物總回收率較高或_所表現之蛋點。、 15 20

親和層析術為—種層析程序，其仰賴欲分離物質與: 特別結合分刊m和力之朴料。此乃受體心子型父互仙。管柱材料係經由共價偶合結合伴侣之一」谷性基體合成。然後管柱材料可特別由溶液中吸⑷ 質。經由將條件改變為不發生結合的條件(例如變更pH、# 子強度、溫度等）時’出現洗提作用。基體為本身不吸附: 子至任何，縣&度’且有寬廣化學物理安定性/ 熱安㈣m物質。配位子之偶合可不影響其結如質。配位子也提供相對緊密結合。可洗提㈣，而未破』樣品或配位子。蛋白貝或胜肽可藉热請技藝人士已知之任一種技術製備’包括經由鮮分子生物學技術表現蛋自質、多肽或胜肤；由天絲源分離蛋自質或職；或化學合《白質或胜狀。先前曾經揭示對應各種基因之核¥酸及蛋白質序 36 13〇26〇6 列、多肽序列及胜肽序列，可參考熟諳技藝人士已知的電腦化資料庫。一資料庫為國家生物技術資訊中心的基因庫及基因月生月大資斜座nittp://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。已知基因之編碼區可使用此處揭示之技術或為熟諳技藝人士已知技術擴大或表現。另外，多種蛋白質、多肽及胜肽之商品製劑為業界人士已知。胜肽模仿物根據本發明製備多肽之另一具體例係使用胜肽模仿物作單株抗體製造。模仿物為含胜肽分子其模仿蛋白質二次 10結構元體。例如參考Johnson等人「胜肽迴轉模仿物」，生否十與藥學’ Pezzuto等人編輯，chapman及Hall，紐約（1993 年）’以引用方式併入此處。使用胜肽模仿物的背後原理在於蛋白質之胜肽主鏈主要係定向胺基酸側鏈，因而輔助分子交互作用，例如抗體與抗原交互作用。胜肽模仿物預期 I5允4進行類似天然分子之分子交互作用。此等原理可用來 ^第代刀子，有多項此處揭示之標革巴胜肽自然性質，但有變更特性或甚至改良特性。融合蛋白質 20

其匕本發明具體例係有關融合蛋自質，此等分子通有全部或實質部分鍵聯於N端或C端的躲胜肽，鍵聯至部或料第二多肽或蛋白質。例如融合可制來自其它種之=端序列，允許於非同_主重組表現蛋白質。另員可^1^包括’加人免疫活性領域如抗體抗原作用 >、㉚σ蛋白*的純化。含括剪接位置於融合接 37 1302606 或接近融合接點，將輔助於純化後去除外生多肽。其它有用的融合包括鍵聯功能領域，例如來自酵素的活性位置、糖化領域、細胞鎖定目標信號、或穿膜區。若干具體例中，融合蛋白質包含標靶胜肽鍵聯至治療性蛋白質或治療性胜 5肽。於本發明範圍，預期實質上任何蛋白質或任何胜肽皆可結合於包含標革巴胜肽之融合蛋白質。產生融合蛋白質之方法為業界眾所周知。此等蛋白質例如可經由使用雙官能交聯劑化學附接、經由重新合成完整融合蛋白質、或經由附接編碼標靶胜肽之DNA序列至編碼第二胜肽或第二蛋白 10質之DNA序列，接著表現完好融合蛋白質來製備。合成胜肽因胜肽尺寸相當小，於真菌選擇法後識別的胜肽，可根據習知技術於溶液或於固體撐體合成。多種自動合成儀為市面上可得，可根據已知方案使用。例如參考Stewart及 15 Y〇ung(1984); Tam等人（1983); Merrifield，（1986);及Barany 及Merrifield (1979)，各別以引用方式併入此處。約6胺基酸至約35至50胺基酸的短胜肽序列方便藉此等方法合成。另外，可採用重組DNA技術，其中編碼本發明胜肽之核苷酸序列被插入表現載體，被轉形或轉移感染至適當宿主細 20 胞，且於適合表現之條件下培養。範例應用核酸定序特定具體例中，如此處揭示形成之條碼可用來定序標靶核酸分子。藉雜交定序方法為業界已知。包含已知序列 38 1302606 探針之一或多個加標籤條碼，允許雜交至標靶核酸序列。加標籤條碼結合至標靶，指示標靶股存在有互補序列。多重才示§己條碼允奸同時雜交至標把分子，且同時檢测。另一具體例中，結合探針可附接至各別標靶分子來識別，或另 5外，允許多套特定標靶分子同時結合至重疊探針序列集合。個別分子例如可使用已知分子組合技術偶合至檢測模型來掃描（例如參考Bensimon等人，PhyS. Rev Lett 74:4754-57, 1995; Michalet等人，科學277:1518-23, 1997 ; 美國專利案第 5,840,862 ; 6,054,327 ; 6,225,〇55 ; 6,248,537 ; 10 6,265，153 ; 6,303,296及6,344,319號）。不可能指定標乾核酸將雜交至連續探針序列，其完全覆盖標數序列。反而多套標乾可雜交至由各個來源收集所得之加標蕺之寡核苗酸及部分序列資料匯集物。部分序列可使用可為大眾取得之「散彈槍」序列編繹程式而編繹成 15為完整標靶核酸序列。部分序列也可由多組標革巴分子編繹而成’其允許同時結合至條碼探針存庫例如於溶液相。標靶分子檢測、識別及/或定量若干具體例中，樣品中之標靶分子可經由結合至條碼來檢測、識別及/或定量。鎖定目標之條碼設計成可結合至 20如前文討論之特定標靶。標靶非限於核酸，反而可包括蛋白質、胜肽、脂質、碳水化合物、糖脂質、糖蛋白或任何其它可製備特定探針的可能標靶。如前文討論，抗體探針或適合體探針可結合於條碼，用來識別可製備適合體或抗體的任何標靶。因條碼可區別標記及區別檢測，故一樣品 39 I3〇26〇6 在有複數個標靶可同時檢定分析。標靶的定量可藉光承斤眾所周知之標準技術進行。例如結合至加標籤條碼払靶數里可藉測定結合條碼之信號強度，且與由已知量之條碼標準準備的校準曲線作比較來測定。此種定量方法 5為業界人士眾所周知。陣列化學有不同化學官能基(例如不同結合特異性）之珠粒（例 2微球)可共同混合。使用可光學質疑的編碼方案（「光學簽早^可達成朗各個珠粒之官能基。例如可❹前文討論 5物拉曼輮5己產生光學簽章。基板例如晶片或微力價孔板包含圖案化表面，含有個別位置可結合至個別珠粒。 t此允許由其於_位置分_探針(亦即核酸、適合體或抗體)的合成。探針可合成、可附接至珠粒，珠粒隨機分佈於圖案化表面。因珠粒首先係使用光學簽章編碼，故所得㈣(k後可被「解碼」。換言之’可找出陣列個別位置與位在該特定位置之珠粒或探針間之交互關係。因珠粒可隨機分佈於陣列，如此導致比製造陣列之原位合成技術或打點技術更快速且更廉價的方法。陣列組成物包括至少第一基板有一表面包含個別位 2〇置。陣列大小係依據陣列的最終用途決定。可製作含有約兩種不同化學劑（亦即不同珠粒）至數百萬種不同化學劑的 =列。通常’依據珠粒大小及基板大小蚊，—個陣列包含二不同珠粒至多達十億個或十億個以上不同珠粒。如此，可製造極高密度陣列、高密度陣列、中密度陣列、低 40 1302606 密度陣列、或極低密度陣列。若干極高密度陣列係於每陣列約10,000,000至約2,000,000,000位置之範圍。高密度陣列係於約100,000至約1〇,〇〇〇,〇〇〇位置之範圍。中密度陣列係於約10,000至約50,000,000位置之範圍。低密度陣列通常少 5 於1〇,〇〇〇個位置。極密度陣列少於1，000位置。若干具體例中，可使用具有不同組成或相同組成的多片基板。例如大型陣列可包括多片小基板。「基板」或「固體撐體」一詞表示可經修飾而含有個別位置適合於珠粒附接或關聯且適合至少一種檢測方法之材料。通常，基板允 10許做光學檢測，且不會可察覺地干擾信號的發射。位置包含圖案，亦即規則設計或組配結構，或位置可隨機分佈。規則圖案位置可用來將位置於X-Y座標平面定址。基板表面可經修飾允許微球附接於個別位置。如此，基板表面可經修飾，讓分開位置形成，如只有單一關聯珠 15粒。一具體例中，基板表面可修飾成含有孔，亦即基板表面的凹部。可使用多項已知技術進行，包括（但非限制性) 微影術、衝壓術、成形術及微蝕刻術。如熟諳技蓺人士已知，採用之技術將依據基板組成及形狀決定。另外，美板表面可經修飾而含有化學衍生位置，該化學衍生位置可用 20來附接微球及/或珠粒至基板的個別位置。增加化學官处某圖案，例如胺基、羧基、酮基及巯基圖案可用來共價附接微球，微球通常含有對應之反應性官能基或鍵聯基分子。適當珠粒組成物包括用於合成胜肽、核酸及有機部分之組成物，包括(但非限制性）塑膠、陶瓷、玻璃、聚笨乙烯、 1302606 甲基苯乙烯、丙烯酸系聚合物、順磁性材料、敍氧溶膠、石炭石墨、二氧化欽、乳膠或交聯葡萄聚糖如西法羅斯 (Sepharose)、纖維素、尼龍、交聯膠束及鐵氟龍全部皆可使用。珠粒大小可由奈米亦即奈米至毫米亦即1毫米， 5 可使用約0.2微米至約200微米之珠粒，以及約〇·5微米至約5 微米之珠粒，但若干具體例可使用更小型珠粒。組成物可用來檢測特定標把被分析物的存在，標把被分析物例如為核酸、寡核苷酸、蛋白質、酵素、抗體或抗原。組成物也可用來篩檢生物活性劑亦即候選藥物，用來 10 結合特殊標輕，或檢測污染物等。如前文討論，任一種可設計探針部分之被分析物，例如胜肽、蛋白質、募核苔酸或適合體皆可組合所揭示之條碼使用。生物活性劑可得自寬廣多個來源’包括合成化合物或天然化合物存庫。例如多項所得可用於隨機合成以及取向 15 合成寬廣多種有機化合物及生物分子，包括表現隨機化寡核苷酸。另外，呈細菌、真菌、植物及動物萃取物形式之天然化合物存庫也方便製造。此外，天然製造或合成製造存庫及化合物方便透過習知化學手段、物理手段及生化手段修飾。已知藥劑可接受方向性或隨機化學改性，例如醯 20 化、烷化、酯化及/或醯胺化來製造結構類似物。生物活性劑可包含天然蛋白質或天然蛋白質片段。例如可使用含蛋白質之細胞萃取物，或含蛋白質細胞萃取物之隨機消化產物或方向性消化產物。藉此方式，可製造原核蛋白質及真核蛋白質存庫來篩檢此處揭示之系統。例如 42 !3 02606 細困性、真菌性、病毒性及哺乳類蛋白質存庫可用來篩檢目的。生物/舌性劑可為約5至約30個胺基酸或約5至約15個胺基酸之胜肽。胜肽可為天然蛋白質之消化產物或隨機胜肽。因通常隨機胜肽(或隨機核酸)係藉化學方式合成，故可、、口〇任何核苔酸或胺基酸於任何位置。合成方法可設計來產生Ik機化蛋白質或隨機化核酸，允許形成於該序列長度王邛或大部分可能的組合，如此形成隨機化生物活性劑存庫。 1 〇〇 »» 另外，生物活性劑可為核酸。核酸可為單股或雙股或其混合物。核酸可為DNA、基因體DNA、cDNA、RNA或雜父體，此處核酸含有去氧核糖核答酸及核糖核誓酸之任種組合，以及氮鹼基之任一種組合，包括尿嘴咬、腺嘌呤、胸腺嘴咬、胞喊。定、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌 15呤、異胞嘧啶、異鳥嘌呤及氮鹼基對類似物例如硝基吡咯及硝基吲哚等。此處揭示之條碼之應用用途非僅限於前述用途，反而包括任一種涉及標靶檢測識別及/或定量之用途。非限制性應用用途包括檢測單一核苷酸同質異形體(SNPs)、檢測遺 20傳突變、疾病診斷、法醫分析、檢測環境污染及/或病原、 S品床診斷試驗及/或寬廣多種其它業界已知用途。探針之製備寡核苔酸探針券核甘酸合成方法為業界♦所周知，可使用任一種此 43 1302606 等方法。例如寡核苔酸可使用料寡核㈣合成儀(例如應用生物系統公司，加州福斯特城)製備。附接至多個標籤之核苷酸前驅物可由市面上購得(例如分子探針公司，俄勒岡州尤今），且結合於寡核普酸。另外，可購買含有多種反應 5性基團（例如生物素、異經基洋地黃毒誓元、祕、胺基或羧基)之核苷酸前驅物。核苔酸合成後，標籤可使用標準化學附接。任何預定順序之寡核誓酸無論是否有反應性基團可供標籤附接，該等募核苔酸也可購自多個來源(例如密德蘭（Midland)有照試劑公司，德州密德蘭）。募核苷酸探針例 10如可使用聚合酶連鎖反應(PCR)擴大法，藉標準酵素法製備 (例如Sambrook等人，分子轉殖：實驗室手冊第二版，冷泉港出版社，冷泉港紐約州，1989年；美國專利案第 5,279,721 ; 4,683，195 ; 4,683,202 ; 4,800，159 ; 4,883,750號）。適合體探針 15 適合體為藉稱作為SELEX(例如Brody及Gold分子生物技術74:5-13，2000)的試管試驗創新方法衍生得之寡核苷酸。SELEX法涉及暴露可能之適合體(核酸配位子）至標乾之重複循環’允許結合，分離結合之核酸配物子與自由態核酸配位子，擴大結合配位子，以及重複結合程序。於多次 20循環週期後，可製備實質上對任何類別生物標靶皆有高度親和力及特異性之適合體。由於其尺寸小，相對穩定且容易製備’故適合體極為適合用作為探針。因適合體包含寡核苔酸’故容易結合於核酸類型條碼。適合體之製法為眾所周知（例如美國專利案第5,27〇，163 ; 5,567,588 ; 44 1302606 5,670,637; 5,696,249; 5,843,653號）。另外，多種針對特定標靶之適合體可得自商業來源(例如s〇mal〇gic，科羅拉多州伯得）。適合體之分子相當小，約為7至50 kDa。抗體探針 5 抗體製法也為業界眾所周知（例如Harlow及Lane，抗體·貫驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港紐約，1988年）。適合用作為探針之單株抗體也可得自多個商業來源。此種商業抗體可針對寬廣多種標靶而獲得。抗體探針可使用標準化學輛合至條碼，容後詳述。 10 揭不之方法及組成物非僅限於使用之探針類別，任何類別業界已知之探針部分皆可附接至條碼，且用於此處揭不之方法。此等探針包括(但非限制性)抗體片段、親和抗體 (affibodies)、嵌合抗體、單鏈抗體、配位子、結合蛋白質、受體、抑制劑、酶基質等。 15 標籤本發明之各具體例中，條碼可附接至一或多個標籤部刀來輔助檢測及/或識別。業界已知之任一種可檢測條碼皆可使用。可檢測條碼包括(但非限制性)可藉電、光、光譜度量、光化學、生物化學、免疫化學或化學技術檢測之組成 2〇物。標籤包括(但非限制性)導電部分、發光部分、蟹光部分、化學發光部分、生物發光部分及填光部分、量子點、奈米粒子、金屬奈錄子、金奈米粒子、銀奈米粒子、染色質、抗體、抗體片段、遺傳工程處理之抗體、酵素、酶基質、輔口子抑制劑、結合蛋白質、磁性粒子及自旋標記化合 45 1302606 物（美國專利案第 3,817,837 ; 3,850,752 ; 3,939,350 ; 3,996,345 ; 4,277,437 ; 4,275，149 ;及4,366,241 號）。拉曼標籤有用之拉曼標籤之非限制例包括TRIT(四甲基若丹明 5 異硫醇）、NBD (7-硝基苯并-2-胺-1,3-二唑）、德州紅染料、磷苯二甲酸、對苯二甲酸、間苯二曱酸、甲酚快速紫、甲酚藍紫、亮甲酚藍、對胺基苯甲酸、紅素(erythrosine)、生物素、異羥基洋地黃毒苷元、5-羧基-4’，5’-二氣-2’，7’-二甲氧基螢光素、TET(6-羧基·2’，4,7,7’-四氣螢光素）、HEX(6-1〇羧基-2’,4,4’，5’，7,7’-六氯螢光素）、1况（6-羧基-4’，5’-二氯 _2’，7’-二甲氧基螢光素）、5-羧基-2’，4’，5’，7’-四氯螢光素、 5-叛基勞光素、5-魏基若丹明、天慕拉(Tamra)(四曱基若丹明）、6·羧基若丹明、R0X(羧基-X-若丹明）、R6g(若丹明6G)、酞花青類、偶氮低甲基類、花青類(例如€73、〇73.5、€丫5)、 15黃嘌呤類、丁二醯基螢光素類、N，N-二乙基-4-(5，-偶氮苯并三唑基)笨胺及胺基吖啶。此等及其它拉曼標籤可得自商業來源(例如分子探針公司，俄勒岡州尤今）。通常多環芳香化合物可用作為拉曼標籤。其它有用的標籤包括氰化物、硫醇、氯、溴、甲基、磷及硫。若干具 20體例中，碳奈米管可用作為拉曼標籤。標籤於拉曼光譜術之用途為已知（例如美國專利案第5,3〇6,4〇3及6，174,677 號）。拉曼標籤可直接附接至條碼，或可透過各種鍵聯基化合物附接至條碼。共價附接至拉曼標籤之核苷酸可得自標 46 1302606 準商業來源(例如羅氏分子生化公司，印地安那州印地安那波利；波米加(Promega)公司，威斯康辛州馬里森；安畢昂 (Ambion)公司，德州奥斯汀；安莫山法馬西亞（Amersham Pharmacia)生技術公司，紐澤西州匹茲卡威）。設計用來與 5 其它分子例如核苔酸或胺基酸共價反應之含有反應性基團之拉曼標籤為市面上可得(例如分子探針公司，俄勒岡州尤今）。螢光標籤可使用之螢光標籤包括(但非限制性）螢光素、5-羧基螢 10 光素（FAM)、2’，7’-二甲氧基_4’，5，-二氯-6-羧基螢光素 (JOE)、若丹明、6_魏基若丹明（R6G)、N，N，N，，N’-四曱基-6-羧基若丹明（TAMRA)、6-羧基-X-若丹明（R〇X)、4-(4’-二甲基胺基苯基偶氮）苯甲酸(DABCYL)及5-(2’-胺基乙基)胺基萘-1-磺酸(EDANS)。其它可能之螢光標籤為業界已知(例如 15 美國專利案第5,866,336)。多種螢光標籤可得自商業來源，例如分子探針公司（俄勒岡州尤今）。加標籤分子之螢光檢測方法也為業界眾所周知，可使用任一種已知方法。有用之發光標籤包括（但非限制性）稀土金屬 cryptates、參聯吨咬二胺銪、銪cryptate或銪螯合物、三聯 20 吡啶Tb、二胺、二花青類、拉荷拉藍染料、別皮花青 (allopycocyanin)、別可花青（allococyanin) B、藻花青 (phycocyanin) C、藻花青R、賽胺、藻紅花青 (phycoerythrocyanin)、藻紅素(phycoerythrin) R、向上轉換磷或向下轉換磷、蟲螢光素或吖丁啶酯。 47 1302606 奈米粒子標籤奈米粒子可用作為標籤，例如欲藉多種模型檢測條碼。奈米粒子之製備方法為已知（例如美國專利案第 6,〇54,495 ; 6，127，120 ; 6，149,868號；Lee及Meisel，J. Phys· 5 Chem· 86:3391-3395，1982)。奈米粒子也可由市面上購得 (例如奈米探針公司，紐約州揚凡客；聚核科學公司賓州華靈頓）。雖然金奈米粒子或銀奈米粒子常用作為標籤，但任何類型奈米粒子組成物皆可附接至條碼且用作為標籤。欲使用之奈米粒子可為奈米粒子隨機聚集體（膠體奈 10米粒子）。另外，奈米粒子可經交聯來製造奈米粒子之特定聚集體，例如二元體、三元體、四元體或其它聚集體。含有選定數目奈米粒子之聚集體(二元體、三元體等）可藉已知技術豐富或純化，例如於蔗糖溶液超離心豐富或純化。適合附接至條碼之改性奈米粒子為市售，例如得自奈 15米探針公司（紐約揚帆客)之涅洛苟（Nanogold)奈米粒子。涅洛苟奈米粒子可以每個奈米粒子附接有單一或複數個順丁烯二醯亞胺、胺或其它基團獲得。此種改性奈米粒子可使用多種已知之鍵聯基化合物附接至條碼。金屬標籤 20 標籤可包含次微米尺寸金屬標籤（例如

Nicewamer-Pena 等人，科學 294:137 141，2〇〇1)。

Nicewarner-Pena等人(2001)揭示包含不同類別金屬以次微米長條編碼之多重金屬微桿之製法。此種系統允許製造極大虽可區別的標籤，亦即使用兩類金屬製造高達416〇可區 48 1302606 別標藏，以及使用三種不同類型金屬製造高達8xl05可區別標籤。此等標籤可附接至條碼且可檢測。附接金屬粒子例如金或銀至募核苷酸及其它類型分子之方法為業界已知 (例如美國專利案第5,472,881號）。 5 富樂烯標籤富樂烯也可用作為條碼標籤。富樂烯之製法為已知(例如美國專利案第6,358,375號）。富樂烯可藉類似後文揭示用於碳奈米管之方法衍生且附接至其它分子。加富樂烯標籤之條碼例如可使用多種技術識別。 10 預期也涵蓋其它可附接至條碼且可檢測的其它類型已知標籤。可使用之標籤之非限制性範例包括量子點（例如 Schoenfeld等人，第7屆國際經調變之半導體結構會議議事錄，馬德里，605-608頁，1995年；Zhao等人，第一屆國際低維度結構及裝置會議，新加坡，467-471頁，1995年）。量 15子點及其它類型標籤也可得自商業來源（例如量子點公司，加州黑沃）。碳奈米管標籤碳奈米管例如單壁碳奈米管（SWNTs)也可用作為標籤。奈米管例如可藉拉曼光譜術檢測(例如Freitag等人，phys. 2〇 Rev· B 62:R2307-R2310, 2000)。碳奈米管特性如電性質或光本性貝至少部分係依據奈米管尺寸決定。碳奈米管可藉業界已知之多種技術製造，該等製造技術包括（但非限制性)碳_弧放電、透過烴類催化熱解之化學氣相沉積、電漿輔助化學氣相沉積、含催化金屬石墨標靶 49 1302606 之雷射燒蝕、或冷凝相電解（例如參考美國專利案第 6,258,401，6,283,812及6,297,592號）。包含不同長度碳奈米管混合物之組成物可使用業界已知方法根據奈米管長度及直控分成不同大小類別。例如奈米管可藉質譜術作尺寸分 5類（參考Parker等人，「富樂烯C60-C266之高良率合成、分離及質譜術特性」，J· Am· Chem· Soc· 113:7499-7503, 1991)。碳奈米管也可購自商業來源例如卡波雷絲(Carb〇Lex)(肯塔基州雷辛頓）那諾樂伯（NanoLab)(馬省瓦特堂）、材料與電化學研究公司（亞力桑那州土桑）或碳奈米技術公司，德州休士 10 頓）。碳奈米管可以反應性基團衍生來輔助附接至條碼。例如奈米管可經衍生而含有羧酸基團（美國專利案第 6，187,823號）’其可使用甲一醯亞胺交聯劑聯結至胺類。核苷酸標籤 15 «酸或驗基如腺封、鳥料、胞錢或胸腺，密唆可用來標識寡核苔酸及核苔酸以外的分子條碼。例如基於胜肽之分子條碼可以核苔酸或嗓呤氮驗基或射氮縣標識。其它類型嘌呤或嘧啶或其類似物例如尿嘧啶、肌誓、 2,6-二胺基嗓呤、5|錢基胞·、7_錢雜·去氧基腺 2〇嗓呤或7_去氮雜-去氧基鳥嗓呤也可用作為標藏。其它標鐵包括氮驗基類似物。氮驗基為不含糖或碌酸的含氮環狀結構。此種標籤可藉光學技術例如拉曼光譜術或營光光譜術檢測。於欲檢測之標乾分子為核酸或寡核苔酸時，以使用核苔酸或核苔酸類似物標籤為適當，原因在於條碼標鐵部 50 1302606 分可能雜交至探針部分以外的不同標靶分子。胺基酸標籤胺基酸也可用作為標籤。可用作為標籤之胺基酸包括 (但非限制性）苯基丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、組胺酸、精胺 5 酸、半胱胺酸及蛋胺酸。交聯劑雙官能交聯劑可用於各項目的，例如附接標籤至條碼。雙官能交聯劑可根據官能基之專一性劃分，例如劃分為胺基專一性基團、胍基專一性基團、吲哚專一性基團或 10 羧基專一性基團。其中以針對自由態胺基之反應劑為普及，原因在於其於市面上可得，容易合成，應用條件溫和（美國專利案第5,603,872及5,401，511號）。可使用之交聯劑包括戊二醛(GAD)、雙官能環氧乙烷(OXR)、乙二醇二縮水甘油醚(EGDE)及甲二醯亞胺類如1 -乙基-3-(3-二甲基胺基丙基) 15 甲二醯亞胺類(EDC)。條碼檢測條碼可使用業界已知之任一種模型檢測。例如螢光光譜術可用來檢測條碼。數種螢光染料可附接至單一條碼。條碼之染料量及條碼之染料化學性質將決定條碼之螢光發 20 光情況。對一指定條碼組成物而言，信號也受到標籤間之相對距離影響，由於可能有共振能移轉。其它具體例中，拉曼光譜術可用來檢測條碼。多種拉曼標籤可附接至條碼，用來藉已知拉曼光譜術例如s E R S (表面加強式拉曼光譜術)檢測。除了附接拉曼標籤外，條碼主 1302606 鏈本身也可用作為拉哭標籤。dna分子之不同氮驗基組成可產生不同拉曼信號，可用來識別基於DNA的條碼。多種特定檢測模型討論如後。拉曼光譜術 5 用於拉曼光譜術之表面多種拉曼光譜術模型係藉加標籤（條碼）分子接近一表面來加強拉曼信號。若干模型中，例如表面加強式拉曼光瑨術(SERS)或表面加強式共振拉曼光譜術(SERRS)，接近拉曼活性金屬面（例如金、銀、鋁、鉑、銅或其它金屬）可增強 10 拉曼信號達6或7個次冪幅度。其它類別化合物也可用來加強SERS信號例如LiF、

NaF、KF、LiCl、MaCl、KC卜 LiBr、NaBr、Li卜 Nal及ΚΙ。特別氯化M證實可提高特定被分析物(例如DAMp、去氧腺苷、腺苷及腺嘌呤)之相對信號強度達2倍至1〇〇倍。氣化鋰 15比常用的氯化鈉可提高相對強度超過2倍，依據被分析物而定。其它具體例中，用於去氧鳥苷-一磷酸(dGMp)之被分析物，溴化鈉或碘化鈉優於氯化鋰。拉曼檢測器業界已知多種拉曼檢測方法。使用之拉曼檢測單元範 20例揭示於美國專利案第6,0〇2,471號。如該案揭示，激發光束係藉532奈米波長Nd:YAG雷射產生，或藉365奈米波長鈦：藍寶石雷射產生。脈衝式雷射束或連續雷射束皆可使用。激發光束通過共焦光學裝置以及顯微鏡物鏡，且聚焦於標靶區。拉曼標記發射的拉曼光藉顯微鏡物鏡及共焦光 52 1302606 學裝置收集’且耦聯至單色器進行光譜解離。共焦光學裝置包括雙色濾、光片、阻擋濾光片、共焦針孔、透鏡及鏡之組合’用來減少背景信號。標準全野光學裝置也可用作為共焦光學裝置。信號可藉任一種已知拉曼檢測器檢測。 5 其它檢測單元例如揭示於美國專利案第5,306,403號，包括司培斯(Spex)型號1403雙光柵分光光度計，裝配有砷化鎵(GaAs)光倍增管（RCA型號C31034或伯爾（Burle)工業公司型號C3103402)，以单光子計數模型操作。拉曼檢測單元之另一例包含雷射檢測器及拉曼檢測 10器。激發光束係由近紅外光波長(750至950奈米）之鈦:藍寶石雷射(Tsunami，Spectra-Physics公司製造)產生，或藉於785 奈米或830奈米之鋁砷化鎵二極體雷射（pi-ECL系列， Process儀器公司製造)產生。可使用脈衝式雷射束或連續式雷射束。激發光束藉雙色鏡（全像攝影凹口濾光片，開瑟 15 (kaiser)光學公司製造、或干涉濾光片，克洛瑪(Chr〇ma)或亞米加(Omega)光學公司製造)反射成為收集光束之準直幾何。反射光束通過顯微鏡物鏡(理光(Nikon)公司LU系列）聚焦於條碼結合標革巴之所在位置。拉曼散射光藉同樣的顯微鏡物鏡收集，通過雙色鏡至拉曼檢測器。拉曼檢測器包含 20 聚焦透鏡、光譜儀、及陣列檢測器。聚焦透鏡將拉曼散射光通過光浦儀之入射狹縫聚焦。光譜儀（羅普科學 (RoperScientific))包含光柵，光栅藉波長分散光。分散光成像至陣列檢測器（背光照明深部耗盡CCD攝影饑，羅普科學公司製造）。陣列檢測器連結至控制器電路，控制器電路連 53 1302606 結至電腦，進行資料傳送及檢測器功能控制。另一種激發源包括鼠雷射（雷射科學公司）及氮-編雷射理康諾斯(Liconox))(美國專利案第6,174,677號）。激發光束可使用帶通濾波器（可瑞恩(Corion))，純化光譜，可使用6X 5 物鏡(紐波(Newport)型號L6X)聚焦。物鏡可用來激發感興趣分子，且收集拉曼信號（開瑟光學系統公司，型號HB 647-26N18)。全像術凹口濾光片（開瑟光學系統公)可用來減少瑞雷(Rayleigh)散射輻射。可使用其它類型檢測器，例如充電注入裝置、二極體陣列或光電晶體陣列。 10 另一種有關多工條碼之檢測系統包括測定重疊條碼差異。區別此等條碼之一種方法係標準DSP(數位信號處理）法’例如可區別不同條碼元體間之距離，以信號單位表示 (波長吸收或由激發遷移、實體距離、穿隧傳導能力等）。可使用業界已知之任何適當形式或組配結構之拉曼光 15瑨術或相關技術，例如正常拉曼散射、共振拉曼散射、 SERS表面加強式共振拉曼散射、相干拉曼光譜術(CARS)、刺激拉曼散射、反相拉曼光譜術、刺激增益拉曼光譜術、超拉曼散射、分子光學雷射檢視1(m〇le) 或拉曼微探針或拉曼顯微術或共焦拉曼顯微光譜術、三度 2〇空間或掃描拉曼、拉曼飽和光譜術、時間解析共振拉曼、拉曼解耦光譜術或紫外光-拉曼顯微術。微機電系統(MEMS) 條碼製備、使用及/或檢測用裝置可結合成為更大型裝置及/或系統。若干具體例中，該裝置包含微機電系統 1302606 (MEMS)。MEMS為包括機械元件、感測器、致動器及電子裝置之整合糸統。全部組成元件皆藉微製造技術於以石夕為主之基材或相當基材之共同晶片上製造（例如Voldman等人 ’ Ann. Rev· Biomed. Eng· 1:401-245, 1999)。MEMs之感 5 測器組成元件可用來測定機械、熱、生物、化學、光學及/ 或磁學現象來檢測條碼。電子裝置可處理來自感測器之資訊，以及控制致動器組成元件(例如幫浦、閥門、加熱器等），藉此控制MEMS功能。 MEMS之電子組成元件可使用積體電路(IC)方法（例如 10 CMOS或雙極性方法）製造。可使用微影術方法及蝕刻方法圖樣化進行電腦晶片製造。微機組成元件可使用可相容之「微切削」法製造，微切削法選擇性蝕刻去除部分矽晶圓，或加上新的結構層，來形成機械組成元件及/或機電組成元件0 15 MEMS製造之基本技術包括沉積材料薄膜於基材上，藉若干微影術方法施用圖案化光罩於薄膜頂上，以及選擇性姓刻薄膜。薄膜厚度為於數奈米至1〇〇微米之範圍。使用之沉積技術包括化學氣相沉積(CVD)、電沉積、磊晶及熱氧化等化學程序；以及物理氣相沉積(PVD)及澆鑄等物理程 20 序。也可使用奈米機電系統製造方法(例如參考Craighead，科學290:1532-36, 2000)。若干具體例中，裝置及/或檢測器可連結至各種流體充填之腔體，例如微流體通道或奈米通道。此等及其它裝置組成元件可形成為單一單元，例如形成為晶片（如半導體晶 55 1302606 片九式）’及/或微毛細晶片或微流體晶片形式。另外，個別組成元件可分開製造且附接在一起。任一種已知用於此種曰曰片之材料皆可用於揭示之裝置，例如石夕、二氧化石夕、聚一甲基石夕氧烧(PDMS)、聚甲基甲基丙烯酸(pmma)、塑膠、 5 玻璃、石英等。批次式晶片製造技術為電腦晶片製造及/或微毛細晶片製造業界眾所周知。此種晶片可藉任一種業界已知方法製造，其製造方法例如微影術及蝕刻、雷射燒蝕、射出模製、澆鑄、分子束磊晶、浸泡筆奈米光刻術、化學氣相沉 1〇積(CVD)製造、電子束技術或聚焦離子束技術或壓印技術。非限制性範例包括習知模製、二氧化矽乾蝕刻；及電子束光刻術。奈米機電系統製造方法可用於若干具體例(例如參考Craighead，科學290:1532_36, 2000)，多種形式之微製造晶片可由市面裳購得，例如得自開立普（Caliper)技術公司 15 (加州山景市）及ACLARA生科公司（加州山景市）。若干具體例中，部分或全部裝置可選定為對於藉例如拉曼光譜術用於檢測條碼之激光頻率及發光頻率之電磁輕射為透明。適當組成元件可由玻璃、矽、石英或任何其它光學透明材料製造。用於可能暴露於各種被分析物(例如核 20酸、蛋白質等）之流體充填腔體，暴露於被分析物分子之表面可經修飾，例如藉塗覆修飾來將表面由疏水面轉換成為親水面，及/或減少分子吸附之表面。常用晶片材料如玻璃、矽、石英及/或PDMS之表面修飾為已知(例如參考美國專利案第6,263,286號）。此等修飾包括例如使用市售毛細塗 56 1302606 層（瑟匹可(SupelC0)，賓州貝拉奉特）塗覆、塗覆有各種官能基之石夕烧(例如聚環氧乙貌或丙稀醯胺等之石夕烧）。右干具體例中，此種MEMS裝i可用來製備分子條碼’由未結合之成分分離形成的分子條碼，暴露分子條碼 5至標靶，及7或檢測結合至標靶之分子條碼。實施例含括下列貫施例來驗證本發明之較佳具體例。熟諳技藝人士須瞭解後文貫施例揭示之技術表示發明人發現可於本發明之實作上功效良好之技術，可視為組成本發明實作 10之較佳模型。但熟諳技藝人士鑑於本揭示，瞭解可未悖離本發明之精髓及範圍就所揭示之特定具體例做修改而仍然獲得相同或類似的結果。實施例1·分子條碼之拉曼檢測第3圖顯不附接有拉曼標籤之範例單股條碼。範例募核 15苷酸序列3〇1、3〇2、303、304係藉標準磷酸亞脒酸化學合成。光學檢測用標籤附接至募核苷酸包括螢光染料R〇X(羧基-X-若丹明）310 ; FAM (6-羧基螢光素)320 ;及TAMRA(四甲基若丹明）330。附接至各條碼之染料標籤位置及身分示於第3圖。胺基係於合成期間附接至三種寡核苷酸3〇2、 20 303、304之5’端。實施例2·分子條碼之拉曼光譜第3圖所示分子條碼接受SERS。SERS發射光譜顯示於第4圖。含有220微升1 μΜ所示條碼301、302、303、304於銀膠體及氣化鋰存在下之溶液之樣品暴露於雷射束100毫 57 1302606 秒’記錄表面加強式拉曼光譜。光譜偏位1〇〇〇 CCD計數單位。如第4圖所示，四個分子條碼3〇1、3〇2、303、304各別產生可區別之拉曼發射光譜，但其中三分子條碼3〇2、3〇3、 304含有相同拉曼標籤330附接至相同寡核苷酸序列3〇2、 5 303、304上的不同位置。如此驗證使用所揭示方法製造可區別之分子條碼之可行性。實施例3. 藉若干附接至核誓酸之範例拉曼標籤產生的3^^光譜801、802、803、804、805、806顯示於第8圖。拉曼標籤 10產生的光譜圖案801、802、803、804、805、806容易區別。含有220微升1 mM條碼溶液於銀膠體及氣化鋰存在下之樣品暴露於雷射束100¾秒，記錄表面加強式拉曼光譜。顯示 SERS發光光譜：P〇lyT[NeBu]T 801 ; polyT[EthdA]T 802 ; poly T[8Br>dA]T 803 ； poly T[2AmPur]T 804 ； [ThiSS] poly 15 TdA 805及[5Acrd]polydG [AmC7]T 806。實施例4. 顯示本發明之一具體實施例。如第5圖及第6/7圖所示，核酸序列可使用解碼方法測定。碼成分存庫（第6圖 601、602、603、604)可形成讓存庫中的各個成分有個關聯 2〇標記(例如拉曼標籤），其特別且獨特識別該成分(例如一個三元體）。核酸與成分存庫共同培養，允許探針雜交至標革巴序列605。雜交後之核酸經由微流體通道操作，流過激發源及檢測器。碼成分之發射光譜可經檢測且接續至資料處理系統。核酸序列係經由比較發射光譜以及欲檢測之發射光 58 1302606 ，序與關聯標記之碼成分之光譜資料庫測定。品或品可得自懷疑生病個體(例如生檢所得樣细皰了 ^ 單細胞懸料可藉業界已知技術產生， 5 10 15 物。係緩衝液之—溶解來釋放出細胞内容 '、糟«已知方法(例㈣/氯仿萃取法、_純化法等） ^:純化後之核酸分子_接至尼顏、96孔微力價孔板或其它鶴基板而簡。碼成分例如可每次—個或每次 ^個導入制動核酸，允許其與具有預定苛刻程度（氣化納含幻之緩驗與好交互仙。編碼探針鱗較至標乾核酸。最初-個或多個碼成分雜交後，可加人其它編碼成分。未雜交之石馬成分及彼此雜交之碼成分藉徹底洗務去除，只留下雜交至制動核酸之碼成分。然後碼成分循序移出，藉解碼匹配碼成分之核酸序列讀取。全部或部分序列可依據預定終點決定。此項資訊可比較有關接受試誇疾病之已知資訊，是否存在有特定順序可決定個體之病情。一範例中 SNPs(單-核#酸同質異形體)可經識別，其與疾病交互關聯’如此無需完整定序被制動的核酸。另外，一或多個碼成分可制動於表面（例如％孔孔板）， δ亥表面用來捕捉含標起序列（例如已知snp)之對庳核酸分 20子，插入或刪除特定基因型等標記。由於標籤例如拉曼標記的靈敏度，故可快速識別標靶序列。實施例5. 顯示本發明之一具體實施例。蛋白質或胜肽(例如罕見調節蛋白質等）可如前述純化。然後純化後之蛋白質/胜肽用 59 1302606 來藉業界已知技術(抗體，實驗室切，冷泉港實驗室，冷泉港出版社’冷泉港紐約，刪年)產生抗體(單株抗體也; 藉業界已知技術產生）。抗原反應性可藉共同投予輔劑⑼如富朗斯(F_d，S)完全辅劑或不完全辅劑)增高。抗原性可藉 5抗原附接至載體（例如牛血清白蛋白或鎖孔蜞血藍質）增高。動物之免疫反應可藉定期追加注射抗原增高。抗體12〇6 分泌入動物血循環，可藉採血或藉心臟穿刺獲得。抗體Η㈨可藉已知方法與其它血液成分分離，分離方法例如為凝血、離心、過濾及/或免疫親和純化(例如使用抗兔抗體）、 10或免疫層析術(例如蛋白質A西法羅斯管柱層析術）。然後此等抗體鍵聯（例如共價鍵聯）至第12圖所示任一種聚合物拉曼標記。然後加聚合物拉曼標記之抗體可用來由多種分子萃取物中識別蛋白質。另外，加聚合物拉曼標記的抗體可用來由分子萃取物中分離數種相同蛋白質供識別用，進一 15步研究感興趣之蛋白質，封阻蛋白質活性，識別疾病相關蛋白質等。由於聚合物拉曼標記分子(例如聚合物拉曼標記抗體)容易檢測，故也可用於診斷來瞭解是否有疾病及/或疾病程度。實施例6·使用第5-7圖所示技術識別核酸序列： 2〇一具體例中，核酸可使用一或多個拉曼標籤修飾。可取得多種小而獨特的拉曼標籤。一範例中，若干腺嘌呤類似物顯示於第13圖，其有強烈且獨特的拉曼電子簽章（其它顯示於第8圖）。一例中，拉曼標籤可藉一或多個氮鹼基修飾而鍵聯至核酸，然後修飾後的氮鹼基用來製造磷酸亞脒 60 1302606 酸供化學合成募核苔酸。修飾後氮鹼基之磷酸亞脒酸可藉業界已知技術製造(McBride, LJ.及Carmher*s，M.H. (1983) 「可用於合成去氧寡核苷酸之若干去氧核苷磷酸亞脒酸研究」，四面體函件24:245-248)。 5 一具體例中，一個碼成分長約10-20個氮鹼基。對10元體而言則有4Λ1〇可能序列，對2〇元體而言可能有4八2〇序列。實際應用上，標靶序列為已知，或序列可被劃分為序列子集。如此，募核苷酸例如可藉一個或多個拉曼標籤標示且識別。一範例中，若使用1〇種不同磷酸亞脒酸(各有一 10個不同拉曼標籤）；若每個合成的寡核苷酸序列有1個拉曼標籤’則可合成10種不同的寡核誓酸；若每個合成的寡核苷酸有2個拉曼標籤，則可合成55種寡核苷酸；若每個合成的寡核苷酸有3個拉曼標籤，則可合成175種寡核苷酸證實。例如可使用磷酸亞脒酸用於募核苔酸(碼成分)之合成， 15此等方法為業界已知。一例中，一個成分為ATGCGACGT (SEQ ID ΝΟ:3)帶有激動素(ΚΝ)作標籤（第13圖），另一個成分為GCTATAGCCG (SEQ ID ΝΟ··4)帶有苯甲醯基_腺嘌呤 (ΒΑ)作為標籤（第13圖）。多個條碼成分可預先製造，儲存供後來使用。 20 一具體例中，條碼可藉下述方法製備。條碼可由數種碼成分組裝。條碼樣板可為相對長的聚核苔酸，例如40個核苷酸DNA之片段可藉標準磷酸亞脒酸化學合成： 5，ACGTCGCATT-CGKCTATAGC-mCTATAn「r^TATnr^c 3, (SEQID NO:5) 61 1302606 本例中下方畫線部分為容器區段，其它序列為探針區段。條碼成分5’-ATGCGACGT(KN)-3，(SEQ ID NO:3)及 5’-GCTATAGCCG (BA)-3’（SEQ ID NO:4)可於標準條件(例如寡核苷酸濃度1至10 μΜ，有200 mM NaCl，10 mM 5 TrisHCl，pH 7.5及1 mM EDTA共存）下雜交至容器區段。因此本例中，探針區段係以2條碼成分表示，其拉曼電子簽章係藉作為拉標籤之激動素及苯甲醯基-腺嘌呤二者決定。為了合成不同的條碼樣板，探針區段及容器區段也改變；不同條碼成分(預製）可共同雜交來形成新條碼。 10 此項技術例如可用來藉分析存在有對應感染因子的 DNA或RNA來檢測感染因子。藉業界已知技術收集樣品且由樣品萃取核酸後，核酸可經消化(例如藉限剪酶消化、限制DNase消化等），藉終端轉移酶(得自新英格蘭生物實驗室），於生物素化-ddNTP(伯京艾瑪(Perkin Elmer)生命科學 15公司）存在下，使用生物素加終端標示。藉凝膠過濾管柱(安莫山法瑪西亞生技公司）去除自由態核苷酸後，生物素化 DNA可捕捉於經鏈絲菌抗生物素塗覆之磁珠（羅氏公司）上。然後核酸以0·1 N氫氧化鈉（用於咖八)變性，來分離二互補股。中和標靶分子後，條碼分子可導入來結合互補序 2〇列。結合/洗滌緩衝液之一例為200 mM NaCl，1〇 mM TrisHCl，pH 7·5及 1 mM EDTA。磁鐵(戴諾(Dynal)公司）可用於藉業界已知方法操縱粒子。範例中’條碼之探針區段係與標靶序列互補，例如5, GTACCATAGCGCTATAGAAA 3，(SEQ ID ΝΟ··6)條瑪分子 62 1302606 將結合至標輕序列’如此藉磁鐵保有於本例（戴那(Dyna)珠粒，戴諾公司）。珠粒可混合銀膠體（由i mM硝酸銀製備，以水稀釋1:2)及0·1 Μ氯化鋰(終濃度）。當粒子通過拉曼檢測器時’檢測特別關聯條碼分子之拉曼信號(ΚΝ及ΒΑ)。本例 5中，資訊可用來證貫一或多個樣品是否存在有特定感染因子。實施例7 蛋白質檢測用條碼·抗體另一具體例包括如實施例6製備加拉曼標籤條碼，但條碼附接至抗體進行抗原檢測(例如蛋白質）。因此產生條碼製 10劑，製備DNA標識抗體。例如IgG抗體(如200微克（1.33奈莫爾）)可以20微克(52奈莫耳)磺基GMBS(皮爾斯(pierce)型號 22324)於200微升〇.ixpBS(以1〇xPBS稀釋得安碧昂公司）於 37t活化30分鐘，然後於室溫活化3〇分鐘。溶液通過][>1)_1〇管柱(安莫山法瑪西亞公司），收集含抗體洗提分。經過巯基 I5修飾之DNA寡核苷酸可由供應商（魁京亞伯隆 (Qiagen-Operon))合成。於遵照供應商的指示還原雙硫鍵(例如DTT處理)後’ DNA募核苔酸(例如13奈莫耳）可混合經純化且經活化之抗體。讓反應於室溫進行2小時，於4°C進行隔仪。然後DNA抗體使用〇-2 M氯化鈉梯度藉離子交換管柱 2〇 (安莫山法瑪西亞公司）純化。收集含DNA及蛋白質二者之洗提分。樣品於使用業界已知方法脫鹽及濃縮處理後準備進行抗原結合(蛋白質檢測）。右干方法可用於制動抗原（例如蛋白質）於固體撐體。較；測’被捕捉的抗體(捕捉抗體及檢測抗體應識別 63 1302606 同一個抗原，得自供應商例如R&D系統公司及BD生科公司）可藉EDC化學(Benson等人，科學，193,（2001)，1641-1644) 制動於金表面。含標靶抗原（如蛋白質）之樣品可於lxPBS稀釋，然後施用至固體表面進行特定結合。例如允許DNA標 5 識抗體結合至被捕捉的抗原（例如蛋白質標靶）。然後遵循樣準免疫檢定分析程序，典型係使用lxPBS及0.05%吞恩

(Tween)-20。一旦出現結合，允許互補拉曼標藏標識的DNA 結合至附接至檢測抗體之制動DNA募核苷酸。典型地，條碼分子於2xPBS及1微克/毫升酵母tRNA(西格瑪（Sigma)公 1〇司）為10 nM濃度。以lxPBS洗滌後，銀膠體（由1 mM硝酸銀製備’以水稀釋1:2)添加至結合面，然後添加氣化經至〇1 Μ ’接著以拉曼測定。因附接至抗體之dna之寡核苔酸係與條碼探針區段互補，或存在有條碼電子簽章，指示存在有抗體，如此存在有標靶抗原（蛋白質）。當不同捕捉抗體及 15 DNA標識檢測抗體用於相同系統時，數種不同抗原可同時藉此種方法檢測。此處揭示及請求專利之全部方法、組成物及裝置皆可鑑於本文揭示無須經過不當的實驗即可製造及使用。熟諳 20 技藝人士顯然易知可未‘_中請專利主題之構想、精髓^ 範圍對此處所述方法、組成物及裝置加以變化。特別顯然化學相關及生理相關之某些作關可取代此處所述作用劑’而仍達成相同或類似結果。業界人士顯然易知之全部類似取代及敍皆視為涵蓋於本轉求專利主題之精髓、範圍及構想範圍内。 64 1302606 【圖式簡單說明3 第1圖顯示產生條碼100之範例方法，條碼100具有有機主鏈110以分支120及標籤130修飾。條碼100包括探針部分 150結合至標靶。標籤130可接受額外修飾，例如結合至抗 5 體140修飾。第2圖顯示利用相同主鏈產生不同條碼201、202、203 之範例方法。標籤240、250、260可置於不同位置來產生可區別的條碼201、202、203。條碼201、202、203結合至標革巴’可藉探針部分201、202、203附接至條碼201、202、203 10 媒介。第3圖顯示若干有單股核酸主鏈之條碼301、302、303、 304範例。標籤31〇、32〇、33〇加至主鏈各個位置來產生例如可藉拉曼光譜術識別的不同光譜。有相同標籤33〇附接至條碼302、303、304不同位置的條碼可產生可區別的拉曼光 15 譜。第4圖顯示藉第3圖揭示之條碼產生之拉曼光譜範例。條碼301、302、303及304以線圖表示。第5圖顯示使用多種具有已知序列之短募核誓酸—附接至-或多個標籤510來產生條碼之範例方法。募核苔酸標籤分子:藉雜交至樣板分子而組裝成為條碼。樣板5〇〇 °已3养核籤雜父用之容器區段5务以及結合至標靶分子如核酸之探針區段550。另一具體例中，探針550例匕3適σ體序列，其可結合至蛋白質、胜肽或其它類型 65 1302606 第6圖表示製造條碼之範例方法示意圖，包括藉附接標籤部分至寡核苷酸或核酸來形成碼成分601、602、603、 604，形成樣板606，以及雜交碼成分至樣板605來產生條碼 607。 5 第7圖表示利用第6圖產生之條碼來識別是否存在有互補標靶股之範例方法之示意圖。第8圖表示藉數種拉曼標籤801、802、803、804、805、 806產生之SERS(表面加強式拉曼光譜術）光譜之作圖範例。第9圖顯示聚合物拉曼標記910範例。單體單元9〇1、9〇2 10 藉共價鍵906聯結，共價鍵906係經由附接至主鏈9〇9之官能基904、908與成長中聚合物鏈末端之另一官能基9〇4、908 交互作用而產生。選擇性地，可加入額外單體單元9〇3。第10圖表示產生聚合物拉曼標記之範例方法示意無。固體撐體1001用來附接組件1〇〇5(例如聚合物拉曼標記之 15 一部分）。組件1005之開放端1104被脫去保護，單體單元 1010透過單體單元1010之脫去保護官能基1006附接至組件 1005。拉曼標籤1〇〇2、1003、1008附接至聚合物拉曼標記。第11A圖表示產生聚合物拉曼標記1105之另一範例方法。第一反應用來附接官能基11〇2a、n〇2b至拉曼標籤 20 1101a、1101b，產生光能化拉曼標籤1103a、1103b。第二反應用來聚合官能化拉曼標籤1103a、1103b，生成次聚合物拉曼標記1104a、ll〇4b。各個次聚合物拉曼標記丨川如、 1104b包含預定數目之單體拉曼標籤11〇3a、n〇3b。例如第一次聚合物1104b包含「n」套第一單體1103a。第二次聚合 66 1302606 物ll〇4b包含「m」套第二單體ll〇3b。預定比例之次聚合物拉曼標記1104a、1104b可混合且交聯而形成聚合物拉曼標記1105 。第11B圖表示產生聚合物拉曼標記之又另一範例方 5 法。有官能基II12之聚合物分子1109可組合不同拉曼標籤 1110來形成聚合物拉曼標記1111。各類拉曼標籤1110數目可經預定來產生具有特定光譜性質之聚合物拉曼標籤 1111 〇

第12圖顯示鍵聯至一或多個探針1206來識別標靶分子 10 之聚合物拉曼標記之若干範例。第一例1201顯示聚合物拉曼標記1204透過鍵聯基1205附接至探針1206。第二範例 1202顯示兩個聚合物拉曼標記1204鍵聯1205至奈米粒子 1207，且額外鍵聯基1205附接奈米粒子1207至兩個探針 1206。第三範例1203顯示多個探針1206透過鍵聯基1205附 15 接至奈米粒子，多個拉曼標籤1208附接至奈米粒子1207。

第13圖表示藉數種修飾核酸、腺嗓呤拉曼標籤產生之 SERS(表面加強式拉曼光譜術）光譜作圖範例。【主要元件符號說明】 201-203···條碼 210-230···探針 240-260···標籤 301-304…养核答酸 310-330···拉曼標籤 500···核酸，樣板分子 100…條碼 110···條碼主鍵 120…分支結構 130…標籤 140···分子 150…探針部分 67 1302606 510…標籤 520.. .寡核苷酸 530.. .條碼 540.. .容器區段 550…探針區段 601-604...碼成分 605.. .雜交 606.. .樣板 607.. .條碼 901-902…單體單元 905.. .間隔基 906.. .主鏈 907.. .拉曼標籤 904、908...官能基 909.. .主鏈 910.. .聚合物拉曼標記 1001.. .固體撐體 1002、1003、1008…拉曼標籤 1005.. .組件 1004、1006、1007···官能基 1009…單體單元 1010.. .鍵聯基分子 1011.··主鏈 1102.. .官能基 1103…拉曼標籤 1104.. .次聚合物單元 1105…聚合物拉曼標記 1109.. .聚合物 1110.. .拉曼標籤 1111…聚合物拉曼標記 1112.. .反應性側基 1201-1202…範例結構 1204.. .聚合物 1205.. .鍵聯基、直接鍵 1206.. .探針 1207.. .奈米分子 1208.. .拉曼標籤

68

Claims

脳〇6[|15 第03129011號專k主恭案皁捧务科範·對势i本 97.05.12 十、申請專利範圍： 1. 一種方法，包含：獲得多數條碼，該等多數條碼之至少一者包含附接至一有機分子主鏈之二或多種不同類型的標籤；將該等多數條碼之至少一者結合至一標靶；以及檢測結合至該標靶之該等多數條碼之至少一者，其中該有機分子主鏈包含一或多個分支核酸且藉著選自於由螢光光譜術、拉曼光譜術、傅立葉轉換紅外線光譜術(FTIR)及表面電漿共振所組成之群組的技術來檢測該等多數條碼之至少一者，其中該等多數條碼中的條碼數目超過附接至該等多數條碼之不同類型的標籤數目，以及其中該等多數條碼係位於接近一訊號增強表面之位置，該位置係足夠地接近以將該訊號增強2_1〇〇倍，该訊號增強表面包含選自於由LiF、NaF、KF、LiCl、 Naa、LiBr、NaBr、Lil、Nal及ΚΙ所組成之群組的鹽類。 2·如申凊專利範圍第1項之方法，其中該主鏈包含共價連接至胜肽的核酸。 3·如中明專利|&圍第1項之方法’其中該標籤係選自於由核酸、核純、核純類似物、氮驗基類似物、榮光染料、胜肽、胺級、修飾之絲酸、有機部分、拉曼標籤、量子點、礙奈米管、富樂稀_⑽⑻、次微米金屬粒子、電子緊餘子騎晶粒子所城之群組。 4.如中請專利範圍第1項之方法，其中該分支係位於沿著 69 1302606 該主鏈之預定位置。 5·如申請專利範圍第1項之方法，其中該條碼係透過一探針部分結合至該標歡。 6·如申請專利範圍第1項之方法，其中藉由附接相同標籤至沿著相同主鏈的不同位置而產生可區別之條碼。 7·如申請專利範圍第1項之方法，其中該標籤係選自於由蛋白質、胜肽、_蛋白、脂蛋白、普利子(Prion)、核酸、聚核苦酸、募核苦酸、脂質、脂肪酸、醣類、醣脂質、磷脂質、鞘磷脂、脂多醣、多醣、真核細胞、原核細胞、細菌、噬菌體、病毒及病原體所組成之群組。 8. —種方法，包含：獲得多數核酸樣板，該等多數核酸樣板之至少一者包含一主鏈，該主鏈包含一容器區段及一探針區段；以及使二或多個加標籤之寡核苷酸與該等多數核酸樣板之容器區段雜交來形成多數條碼，其中該主鏈包含一或多個分支核酸且該容器區段包含二或多種不同類型的標籤，其中藉著選自於由螢光光譜術、拉曼光譜術、傅立葉轉換紅外線光譜術(FTIR)及表面電漿共振所組成之群組的技術來檢測該條碼，其中該等多數條碼的條碼數目超過附接至該等多數條碼之不同類型的標籤數目，以及其中该等多數條碼係位於接近-訊號增強表面之 70 1302606 位置，該位置係足夠地接近以將該訊號增強2-100倍，該訊號增強表面包含選自於由LiF、NaF、KF、LiCl、 NaCl、LiBr、NaBr、Lil、Nal及ΚΙ所組成之群組的鹽類。 9·如申請專利範圍第8項之方法，進一步包含結合該條碼至一標把。 10·如申請專利範圍第9項之方法，進一步包含檢測該結合至標靶之條碼。 11· 一種系統，包含：一成像儀器；連接至一探針之至少一條碼；以及結合至該探針之至少一標靶，其中該聚合的條碼係位於接近一訊號增強表面之位置’該位置係足夠地接近以將該訊號增強2-100倍，該訊號增強表面包含選自於由LiF、NaF、KF、LiCl、 NaCn、LiBr、NaBr、Lil、Nal 及 ΚΙ 所組成之群組。 12·如申請專利範圍第11項之系統，其中該成像儀器係選自於由螢光儀器、拉曼儀器及FTIR儀器所組成之群組。 13·如申請專利範圍第丨丨項之系統，其中各條碼包含兩或多個拉曼標籤。 14·如申請專利範圍第13項之系統，其中於單一條碼之各個拉曼標臧有不同之拉曼發射光譜。 71