KR20060094531A

KR20060094531A - 프로그램가능한 분자 바코드

Info

Publication number: KR20060094531A
Application number: KR1020067007935A
Authority: KR
Inventors: 싱 수; 구태웅; 앤드류 버린; 라이 선; 나라야난 순다라라얀; 미네오 야마카와
Original assignee: 인텔 코포레이션
Priority date: 2003-09-24
Filing date: 2004-09-23
Publication date: 2006-08-29
Also published as: CN1856580A; EP1668164A2; JP2007506431A; US20070054288A1; TWI302606B; WO2005030996A2; CN1856580B; TW200517659A; WO2005030996A3; US20050064435A1; JP5014789B2; US20060199216A1

Abstract

본 발명은 분자 바코드의 제조 및/또는 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 바코드는 하나 이상의 분지 구조를 포함할 수 있는 중합체 백본을 포함한다. 태그는 백본 및/또는 분지 구조에 부착될 수 있다. 바코드는 또한 단백질, 핵산 및 기타 생분자 또는 응집체와 같은 표적에 결합할 수 있는 프로브를 포함한다. 다른 바코드들은 태그의 유형 및 위치에 의해 식별가능하다. 다른 구체예에서, 바코드는 컨테이너 섹션 및 프로브 섹션을 포함하는 주형에 하나 이상의 태그된 올리고뉴클레오타이드의 혼성화에 의해 생성될 수 있다. 태그된 올리고뉴클레오타이드는 모듈 코드 섹션으로서 고안되어, 다른 표적에 특이적인 다른 바코드를 형성할 수 있다. 대안적인 구체예에서, 바코드는 단량체 단위의 중합에 의해 제조될 수 있다. 결합된 바코드는 다양한 영상 모듈, 예컨대 표면 플라즈몬 공명, 형광 또는 라만 분광법에 의해 검출될 수 있다.

Description

프로그램가능한 분자 바코드{PROGRAMMABLE MOLECULAR BARCODES}

본원의 발명, 조성물 및 장치는 분자 바코드 분야에 관한 것이다. 본 발명의 특정 구체예는 유기 중합체 백본으로부터 분자 바코드를 생성하는 방법에 관한 것이다. 다중 분자 바코드는 백본 상의 다른 부위들에 태크를 결합시킴으로써 동일한 백본을 이용하여 제조될 수 있다. 다른 구체예에서, 분자 바코드는 프로브 영역 및 하나 이상의 코드 성분을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 분자 바코드는 표적 분자의 검출을 위해 하나 이상의 프로브에 결합된 중합성 라만 라벨을 포함할 수 있다.

생분자의 검출 및/또는 확인은 의학적 진단, 수사학, 독물학, 병리학, 세균전, 공중 위생 및 수많은 기타 분야에서 다양한 용도로 유용하다. 연구된 생분자의 주된 부류는 핵산 및 단백질이고, 기타 생분자 예컨대 탄수화물, 지질, 다당류, 지질, 지방산 및 그 이외의 것도 대상이다. 신속하고, 신뢰성있고 비용 효율적인 생분자의 확인 방법, 유사한 생분자들의 구별 방법 및 병원성 포자 또는 미생물과 같은 거대분자 복합체의 분석에 대한 요구가 있다.

핵산 검출을 위한 표준 방법, 예컨대 서던 블로팅, 노던 블로팅 또는 핵산 칩에의 결합은, 형광, 화학 발광 또는 방사성 프로브 분자와 표적 핵산 분자의 혼 성화에 의존한다. 올리고뉴클레오타이드 혼성화-기재의 분석은, 표적 핵산에 서열상 상보적인 라벨된 올리고뉴클레오타이드 프로브는 핵산에 결합 및 핵산을 검출하는데 사용된다. 보다 최근에는, DNA (데옥시리보핵산) 칩이 고안되어 표적 핵산에 결합을 위한 수백 또는 수천의 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함할 수 있게 되었다. 민감성 및/또는 특이성의 문제는 완전히 상보적이지 않은 서열들 간에 핵산 혼성화로부터 기인할 수 있다. 대안적으로, 샘플 내에 표적 핵산이 낮은 수준으로 존재하면 검출되지 않을 수 있다.

다양한 기술들이 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드의 확인을 위해 이용가능하다. 보통, 이들은 항체의 결합 및 검출에 관련된다. 항체-기재의 확인은 상당히신속하여, 이러한 분석은 때로 높은 수준의 가긍정적 판단(false positive) 또는 가부정적 판단(false negative)을 보여줄 수 있다. 이러한 분석의 비용은 높고 하나 이상의 표적의 동시적 분석은 쉽지 않다. 또한, 상기 방법은 분석이 수행되기 이전에 대상 표적 단백질에 대항하는 항체를 제조해야 함이 요구된다.

분자 생물학, 유전학, 질병 진단학 및 약물 반응의 예측에서의 다수의 용도는 핵산 서열 변이체의 확인과 관련된다. Sanger 디데옥시 시퀀싱 및 혼성화에 의한 시퀀싱을 포함하는 핵산 시퀀싱의 현존하는 방법은, 상대적으로 느리고, 고가이며, 노동 집약적인 경향이 있으며 방사성 태그 또는 기타 유독성 화학물의 사용과 관련된다. 기존 방법은 또한 한 반응에서 수득될 수 있는 서열 정보의 양은 보통 약 1000 염기 이하로 제한된다. 보다 신속하고, 비용 효율적이며 자동화된 핵산 시퀀싱 방법에 대한 요구가 있다.

도면의 간단한 설명

하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 포함됨으로써 본 발명의 개시된 실시양태 특정한 측면들을 추가로 나타낸다. 본 명세서에 제공된 본 발명의 구체적인 실시양태의 상세한 설명과 함께 이러한 하나 이상의 도면들을 참고함으로써 본 발명의 실시양태가 더욱 명확히 이해될 수 있다.

도 1 은 분지(120) 및 태그(130)로 개질된 유기 백본(110)으로 바코드(100)를 생성하는 예시적인 방법을 나타낸다. 바코드(100)은 표적에 결합된 프로브기(150)를 포함할 수 있다. 태그(130)는 추가적 변형, 예를 들어 항체(140)에 결합함으로써 추가적 변형을 거칠 수 있다.

도 2 는 동일한 백본을 이용하여 다른 바코드(201,202,203)를 생성하는 예시적인 방법을 나타낸다. 태그(240,250,260)은 다른 위치에 배치되어 식별가능한 바코드(201,202,203)를 생성할 수 있다. 표적으로의 바코드(201,202,203)의 결합은 바코드(201,202,203)에 결합된 프로브기(210,220,230)에 의해 매개될 수 있다.

도 3 은 단일 가닥 핵산 백본을 갖는 바코드(301,302,303,304)의 일부 예를 나타낸다. 태그(310,320,330)는 백본 상의 다양한 부위에 첨가되어 예를 들어, 라만 분광법에 의해 확인될 수 있는 다른 스펙트럼을 생성할 수 있다. 바코드(302,303,304) 상의 다른 부위에 결합된 동일한 태그(330)를 갖는 바코드는 식별가능한 라만 스펙트럼을 생성할 수 있다.

도 4 는 도 3 에 개시된 바코드에 의해 생성된 라만 스펙트럼의 예를 나타낸다. 바코드(301,302,303, 및 304)는 그래프에 나타나 있다.

도 5 는 하나 이상의 태그(510)에 결합된 공지된 서열의 다양한 단쇄 올리고뉴클레오타이드(520)를 이용하여 바코드를 생성하는 예시적인 방법을 나타낸다. 올리고뉴클레오타이드-태그 분자는 주형 분자(500)에 혼성화에 의해 바코드로 어셈블링될 수 있다. 주형(500)은 올리고뉴클레오타이드-태그 혼성화를 위한 컨테이너 섹션(540) 및 핵산과 같은 표적 분자에 결합을 위한 프로브 섹션(550)을 포함할 수 있다. 대안적인 구체예에서, 프로브(550)는, 예를 들어, 단백질, 펩타이드 또는 기타 유형의 표적에 결합할 수 있는 앱타머(aptamer) 서열을 포함할 수 있다.

도 6 은 태그기을 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산에 결합시켜 코드 성분 601 602 603 604 를 생성하는 단계, 태그기을 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산에 결합시켜, 주형(606)을 생성하는 단계 및 코드 성분을 주형(605)에 혼성화시켜 바코드(607)를 생성하는 단계를 포함하는, 바코드의 예시적 제조 방법의 개략도를 나타낸다.

도 7 은 상보적 표적 가닥의 부재 또는 존재를 확인하기 위해 도 6 의 방법에 의해 생성된 바코드를 이용하는 예시적인 방법의 개략도를 나타낸 것이다.

도 8 은 일부 라만 태그 801 802 803 804 805 806 에 의해 생성된 SERS (표면 증강 라만 분광법) 스펙트럼 플롯의 예를 나타낸다.

도 9 는 중합성 라만 라벨(910)의 예를 나타낸다. 단량체 단위(901,902)는 성장하는 중합성 쇄의 말단 상에서 다른 작용기(904,908)를 갖는 백본(909)에 결합된 작용기(904,908)의 상호 작용으로부터 생성된 공유결합(906)에 의해 결합된다. 임의로는, 부가적인 단위(903)가 추가될 수 있다.

도 10 은 중합성 라만 라벨을 생성하는 예시적인 방법의 개략도를 나타낸다. 고형 지지체(1001)는 성분(1005) (예를 들어 중합성 라만 라벨의 일부분)를 결합시키는 데 사용된다. 성분(1005)의 개방형 말단(1104)은 탈보호되며 단량체 단위(1010)는 단량체 단위(1010)의 탈보호된 작용기(1006)를 통해 성분(1005)에 결합된다. 라만 태그(1002,1003,1008) 은 중합성 라만 라벨에 결합된다.

도 11A 는 중합성 라만 라벨(1105)을 생성하는 다른 예시적인 방법을 나타낸다. 제1 반응은 작용기(1102a,1102b)를 라만 태그(1101a,1101b)에 부착시켜, 작용성 라만 태그(1103a,1103b)를 생성하는 데 사용된다. 제2 반응은 작용성 라만 태그(1103a,1103b)를 중합시켜 서브중합성 라만 라벨(1104a,1104b)을 형성하는데 사용된다. 각 서브중합성 라만 라벨(1104a,1104b)은 기결정된 수의 단량체성 라만 태그(1103a,1103b)를 포함한다. 상기 예에서, 제1 서브중합체(1104a)는 제1 단량체(1103a)의 "n" 개의 복사본을 포함하며 제2 서브중합체(1104b)는 제2 단량체(1103b)의 "m" 개의 복사본을 포함한다. 서브중합성 라만 라벨(1104a,1104b)의 기결정된 비율은 혼성 및 가교되어 중합성 라만 라벨(1105)을 형성할 수 있다.

도 11B 는 중합성 라만 라벨을 생성하는 다른 예시적인 방법을 나타낸다. 작용기(1112)를 가지는 중합체 분자(1109)는 다른 라만 태그(1110)와 조합되어 중합성 라만 라벨(1111)을 형성할 수 있다. 각 유형의 라만 태그(1110)의 수는 미리 결정되어 특정 분광학적 특성을 갖는 중합성 라만 라벨(1111)을 생성할 수 있다.

도 12 는 표적 분자를 확인하기 위해 하나 이상의 프로브(1206)에 연결된 중합성 라만 라벨의 일부 예를 나타낸 것이다. 첫번째 예(1201)는 링커(1205)를 통해 프로브(1206)에 결합된 중합성 라만 라벨(1204)를 나타낸다. 두번째 예(1202)는 링커(1205)를 통해 나노입자(1207)에 연결된 두개의 중합성 라만 라벨(1204) 및 나노입자(1207)를 두 프로브(1206)에 결합시키는 부가적인 링커(1205)를 보여준다. 세번째 예(1203)는 나노입자에 링커(1205)를 통해 결합된 다중 프로브(1206) 및 나노입자(1207)에 결합된 다중 라만 태그(1208)를 나타낸다.

도 13 개질 핵산, 아데닌의 일부 라만 태그에 의해 생성된 SERS (표면 증강 라만 분광법) 스펙트럼 플롯의 예를 나타낸다.

예시적인 구체예의 설명

하기 상세한 설명은 본 발명에 개시된 구체예의 보다 완전한 이해를 제공하기 위해 많은 구체적인 상세한 설명들을 포함한다. 그러나, 이러한 특정 상세한 설명없이 구체예가 실시될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 당업계에 잘 알려진 다른 경우, 장치, 방법, 절차, 및 개별 성분들은 본원에 상세히 기술하지는 않았다.

정의

본 명세서에 사용된 "a" 또는 "an" 은 하나 또는 1 초과의 물체를 의미할 수 있다.

본 명세서에 사용된 물체의 "다양성" 은 2 개 이상의 물체를 의미한다.

본 명세서에 사용된 "핵산" 은 DNA, RNA(리보핵산), 단일 가닥, 이중 가닥 또는 삼중 가닥 및 그들의 임의의 화학적 변형물을 포함한다. 핵산의 거의 모든 변형물이 고려된다. "핵산" 은 2 이상의 올리고뉴클레오타이드 염기에 전장 염색체 DNA 분자까지의 거의 임의의 길이일 수 있다. 핵산은, 이에 제한되지는 않지만, 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

"프로브" 분자는 하나 이상의 표적에 선택적 및/또는 특이적 결합을 나타내는 임의의 분자이다. 본 발명의 다양한 구체예에서, 각 다른 프로브 분자는 식별가능한 바코드에 결합될 수 있어 다른 프로브들의 군집으로부터 특정 프로브의 결합이 검출될 수 있다. 구체예는 사용될 수 있는 유형의 프로브 분자에 제한되지는 않는다. 당업계에 알려진 임의의 프로브 분자는 올리고뉴클레오타이드, 핵산, 항체, 항체 단편, 결합 단백질, 수용체 단백질, 펩타이드, 렉틴, 기질, 억제제, 활성화제, 리간드, 호르몬, 사이토킨, 등을 사용할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 구체예에서, 프로브는 다른 표적들을 확인하기 위해 하나 이상의 바코드에 공유 또는 비공유적으로 결합된 항체, 앱타머, 올리고뉴클레오타이드 및/또는 핵산을 포함할 수 있다.

예시적인 구체예

개시된 방법, 조성물 및 장치는 생분자, 예컨대 핵산 및 단백질의 검출, 확인 및/또는 태깅을 위해 유용하다. 본 발명의 특정 구체에에서, 방법, 조성물 및 장치는 백본의 다양한 변형을 통해 단일 유기 백본으로부터 다중 바코드를 생성하는데 사용될 수 있다. 그 구체예는 단일 백본으로 제한되지는 않지만, 하나 이상의 다른 백본을 사용할 수 있다. 백본을 따라 태그의 결합 부위를 다르게 함으로써 동일한 백본을 가지는 다른 바코드를 생성하는 능력을 장점으로 포함한다. 기타 구체예는 태깅된 생분자를 위한 또는 이의 신속한 확인을 위해 중합성 라만 라벨을 생성하는 것에 관련된다. 기타 장점은 폴리펩타이드의 민감하고 정확한 검출 및/또는 확인을 포함한다.

합성에 의한 바코드

도 1 에 도시된, 본 발명의 한 구체예에서, 바코드 백본(110)은 핵산, 펩타이드, 다당류, 및/또는 화학적으로 유도된 중합체 서열의 임의의 조합을 포함하는, 유기 구조들을 포함하는 중합체 사슬로부터 형성될 수 있다. 특정 구체예에서, 백본(110)은 단일 또는 이중 가닥 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 백본은 프로브기(150), 예컨대 올리고뉴클레오타이드, 항체 또는 앱타머에 결합될 수 있다. 백본(110)은 하나 이상의 분지 구조(120)로 개질되어 부가적인 형태학적 다양성 및 태그 부착 부위을 야기할 수 있다. 분지 구조(120)는 당업게에 잘 알려진 기술을 이용하여 형성될 수 있다. 예를 들어, 바코드(100)가 이중가닥 핵산을 포함하는 곳에서는, 분지 구조(120)는 올리고뉴클레오타이드의 합성 및 단일 가닥 주형 핵산에의 혼성화에 의해 형성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 서열의 일부(예를 들어 5' 말단)는 주형에 상보적이고 일부(예를 들어 3' 말단)는 그렇지 않도록 고안될 수 있다. 따라서, 바코드(100)는 이중 가닥 서열의 단편 및 단일 가닥 분지 구조(120)의 짧은 단편을 포함할 것이다. 도 1 에 개시된 바와 같이, 태그(130)는 예를 들어 분지 구조(120)의 단일 가닥 일부에 서열상 상보적인 라벨된 130 올리고뉴클레오타이드의 혼성화에 의해 바코드에 첨가될 수 있다.

올리고뉴클레오타이드 모방체는 유기 백본(110)을 생성하는데 사용될 수 있다. 당과 뉴클레오시드간 결합, 즉, 뉴클레오타이드 단위의 백본 모두는 신규한 기로 대체될 수 있다. 프로브(150)는 적절한 핵산 표적 화합물과 혼성화하는데 사용될 수 있다. 우수한 혼성화 특성을 가지는 것으로 보여진 올리고머성 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드 모방체는 펩타이드 핵산 (PNA)으로 지칭된다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오타이드의 당-백본은 백본, 예를 들어 아미노에틸글리신 백본을 포함하는 아미드로 대체된다. 상기 예에서, 뉴클레오염기는 보유되며 백본의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 개시하는 일부 미국특허는, 예를 들어, 미국특허 Nos. 5,539,082; 5,714,331; 및 5,719,262 를 포함한다. 또한, PNA 화합물은 Nielsen 등의 문헌(Science, 1991, 254, 1497-15)에 개시된다.

하나의 바코드(100)를 다른 바코드와 구별하기 위해, 태그(130)가 백본(110) 또는 하나 이상의 분지 구조(120)에 직접 첨가될 수 있다. 바코드(100)는 하나 이상의 태그(130)에 다른 분자(140) (예를 들어 항체)를 결합시켜 추가로 개질될 수 있다. 벌크(bulky) 기가 사용되는 곳에서는 분지 부위(120)에 결합된 태그기(130)의 변형으로 표적 분자와의 프로브(150) 상호작용에 대한 더 낮은 입체 장애를 제공할 수 있다. 태그(130)는 영상 기법, 예를 들어 형광 현미경법, FTIR (퓨리에 변환 적외선) 분광법, 라만 분광법, 전자 현미경법, 및 표면 플라즈몬 공명에 의해 판독될 수 있다. 영상의 다른 변형은 이에 제한되지는 않지만, 전도성, 두 물체사이에 흐르는 전류(tunneling current), 전류 용량 등을 포함하는, 태그(130)의 형태학적, 토포그래피적, 화학적 및/또는 전기적 특성을 검출하기 위해 공지된다. 사용된 영상 기법은 태그기(130)의 특성 및 생성된 결과적인 신호의 성질에 의존할 것이다. 이에 제한되지는 않지만, 형광, 라만, 나노입자, 나노튜브, 풀러렌 및 양자점 태그(130)를 포함하는 다른 유형의 공지된 태그(130)는, 바코드(100)를 이들의 토포그래피적, 화학적, 광학적 및/또는 전기적 특성에 의해 확인하는데 사용될 수 있다. 이러한 특성은 각 바코드(100)에 대해 생성된 식별가능한 신호를 초래하는 사용된 유형의 태그기(130) 및 백본(110) 또는 분지 구조(120) 상의 태그(130)의 상대적 위치 모두의 함수로서 다를 것이다.

도 2 에 나타난 바와 같이, 특이적 표적을 인식하는 다른 프로브(210,220,230)가 식별가능한 바코드(201,202,203)에 결합될 수 있다. 상기 예시적인 구체예에서, 다중 태그(240,250,260)는 다른 부위에서 바코드(201,202,203)에 결합될 수 있다. 태그(240,250,260)는, 예를 들어, 라만 태그 또는 형광 태그를 포함할 수 있다. 인접한 태그는, 예를 들어 형광 공명 에너지 전이 (FRET) 또는 기타 기작에 의해 서로 상호작용할 수 있기 때문에, 동일한 태그기(240,250,260)의 세트로부터 수득된 신호는 태그(240,250,260) 사이의 위치 및 거리에 따라 다를 수 있다 (실시예 1 참조). 따라서, 유사한 또는 동일한 백본을 갖는 바코드(201,202,203)는 식별가능하게 라벨될 수 있다. 표적 분자 결합의 특이성은 프로브(210,220,230), 예컨대 항체, 앱타머 또는 올리고뉴클레오타이드의, 바코드(201,202,203)에의 부착에 의해 제공될 수 있다. 주어진 프로브(210,220,230) 특이성에 해당하는 바코드(201,202,203) 신호는 공지되어 있기 때문에, 어떤 프로브(210,220,230)가 샘플 내의 표적에 결합하는 지를 측정하여 분자의 착체 혼합물을 분석하고 개별 종들을 검출하는 것이 가능하다.

도 1 및 도 2 에 예시된 본 발명의 특정 구체예에서, 바코드(100,201,202,203)의 백본(110)은 포스포디에스테르 결합, 펩타이드 결합, 및/또는글리코시드 결합으로 형성될 수 있다. 예를 들어, 표준 포스포라미다이트 화학(phosphoramidite chemistry)은 DNA 사슬을 포함하는 백본(110)을 제조하는데 사용될 수 있다. 포스포디에스테르 결합된 백본(110)의 기타 제조 방법은, 예컨대 연쇄 중합 반응 (PCR^TM) 증폭과 같이 공지되어 있다. 백본(110)의 말단은 다른 작용기, 예를 들어, 바이오틴, 아미노기, 알데히드기 또는 티올기를 가질 수 있다. 작용기는 프로브기(150,210,220,230)를 결합하는데 또는 태그(130,240,250,260)의 부착을 위해 사용될 수 있다. 태그(130,240,250,260)는 검출을 촉진하기 위하여 다른 크기, 전기적 또는 화학적 특성을 수득하기 위해 추가로 개질될 수 있다. 예를 들어, 항체는 디곡시게닌 또는 플루오레세인 태그(130,240,250,260)에 결합하기 위해 사용될 수 있다. 스트렙타비딘은 바이오틴 태그(130,240,250,260)에 결합하기 위해 사용될 수 있다. 금속 원자는 예를 들어 효소 태그(130,240,250,260)를 이용한 금속 이온 용액의 촉매적 환원에 의해 바코드(100,201,202,203) 구조 상에 증착될 수 있다. 바코드(100,201,202,203)가 펩타이드 부분을 포함하는 곳에서는, 펩타이드는 태그(130,240,250,260) 변형 140 에 대해 인산화될 수 있다. 개질 140 태그(130,240,250,260)는 당업계에 공지된 다양한 기술에 의해 검출될 수 있다.

본 발명의 특정 구체예에서, 하나 이상의 바코드(100,201,202,203)를 포함하는 용액은 보안 추적 목적을 위한 대상에 적용될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 영국 회사 (SmartWater Ltd.)는 디지탈 DNA의 가닥을 포함하는 유체로 귀중품을 마킹하는 방법을 개발하였다. DNA 는 물품으로부터 제거하는 것이 사실상 불가능하며 고가의 물체 또는 가보를 특별히 확인하기 위해 사용될 수 있다. DNA 는 임의의 수사학적 실험에 의해 검출될 수 있다. 이러한 방법은 또한 본원에 개시된 분자 바코드(100,201,202,203)로 물체를 마킹하는데 이용될 수 있다. 이러한 용도에서, 바코드(100,201,202,203)의 검출은 DNA 서열에 기초한 수사학적 분석을 필요로 하지 않을 것이다.

혼성화에 의한 바코드

도 5 에 예시된 본 발명의 다른 구체예는, 혼성화에 의한 바코드(530)의 생성 방법에 관한 것이다. 상기 구체예에서, 바코드(530)는 올리고뉴클레오타이드(520)에 혼성화된 핵산(500)을 포함한다. 하나 이상의 태그기(510)는 예를 들어 공지된 화학적 합성 기술에 의해 생성된 공지된 서열의 올리고뉴클레오타이드(520)에 결합될 수 있다. 태그된 올리고뉴클레오타이드(520)를 생성하는 다양한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 바코드(530)는 단일 가닥 DNA 주형(500)에 일련의 태그된 올리고뉴클레오타이드(520)을 혼성화시켜 형성된다. 주형(500)은 컨테이너 섹션(540) 및 프로브 섹션(550)을 포함한다. 프로브 섹션(550)은 상보적 표적 핵산 서열에 혼성화되도록 고안된다. 대안적으로, 프로브 섹션(550)은 단백질, 펩타이드 또는 기타 표적 생분자에 결합될 수 있는 앱타머 서열을 포함할 수 있다. 다양한 구체예에서, 프로브 영역(540)은 2 내지 30, 4 내지 20 또는 14 내지 15 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 프로브(550) 길이는 제한되지 않으며 2, 3, 4, S. 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 15O, 200, 250 뉴클레오타이드 길이 또는 그 이상의 프로브 섹션(550)도 고려된다.

도 3 은 본 발명의 다양한 구체예에서 유용한 예시적인 라만 태그된 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다. 라만 태그 310 320 330 은 다른 스펙트럼을 생성하기 위해 동일한 올리고뉴클레오타이드 서열의 다른 뉴클레오타이드에 결합될 수 있다 (도 4). 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 302 303 및 304 는 태그(330)의 위치가 변화된 동일한 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 도 4 에 보여진 바와 같이, 도 3 에 개시된 태그된 올리고뉴클레오타이드 301, 302, 303, 304 에 대한 라만 스펙트럼은 식별가능하다. 도 4 는 동일한 올리고뉴클레오타이드 서열 302, 303, 304 에 결합된 동일한 라만 태그(330)의 위치에서의 작은 변화는 다른 패턴의 라만 스펙트럼을 생성할 수 있음을 증명한다 (상세한 설명을 위해서는, 하기 실시예 1 및 2 참조).

도 5 에 예시된 본 발명의 구체예에서, 바코드(530)은 하나 이상의 태그된 올리고뉴클레오타이드(520)가 주형 분자(500)의 컨테이너 섹션(540)에 혼성화가 허용되는 경우에 형성될 수 있다. 태그된 올리고뉴클레오타이드(520)의 서열은 프로브 섹션(550)이 아니라, 컨테이너 섹션(540)에 상보적이도록 고안된다. 혼성화에 의해 주형(500)에 결합된 태그기(510)의 조합은 식별가능한 신호를 제공하도록 선택된다. ㅅ사용될 수 있는 신호의 유형에는 제한이 없고, 이에 제한되지는 않지만 라만 분광법, FTIR, 표면 플라즈몬 공명을 포함하는 임의의 검출기술이 사용될 수 있다. 혼성화 이후, 바코드(530)는 이에 제한되지는 않지만 내지 초여과, HPLC (고성능 액체 크로마토그래피), 히드록실아파타이트 컬럼 크로마토그래피, 초원심분리, 등을 포함하는 공지된 방법에 의해 비혼성화된 올리고뉴클레오타이드(520) 및 주형 가닥(500)으로부터 분리될 수 있다. 바코드(530) 생성을 위한 상기 방법은 높은 라벨링 효율성을 가지며 표준 기술에 대해서 생성될 태그된 올리고뉴클레오타이드(520)의 감소된 수를 필요로 하며, 여기에서 각 태그된 올리고뉴클레오타이드(520)는 분리되고 확인가능한 바코드(530)를 포함한다. 당업자에게 명백한 것처럼, 도 5 에 나타난 방법은 상당히 적은 수의 태그된 올리고뉴클레오타이드(520)를 이용하여 많은 다수의 식별가능한 바코드(530)의 형성을 허용하는 식별가능한 바코드(530)의 조합적 생성 방법을 예시한다.

도 5 에 예시된 본 발명의 특정 구체예에서, 주형(500) 서열의 길이는 컨테이너 섹션(540)에 혼성화하기 위해 프로브 섹션(550) 및 태그된 올리고뉴클레오타이드(520)의 크기로부터 측정될 수 있다. 예를 들어, "n" 염기 길이의 프로브 섹션(550) 및 "m" 염기 길이의 개별적 태그된 올리고뉴클레오타이드(520)에 대해서, 주형(500)의 길이는 (1 + m) × n (또는 대안적으로, (n × m) + n)과 같다. 예를 들어, 9 염기 길이의 프로브 섹션(550) 및 5 염기 길이의 태그된 올리고뉴클레오타이드(520)가 주어지면, 모든 가능한 9-mer 프로브 서열에 대한 특이한 바코드를 제공하도록 요구되는 주형(500)의 길이는 (1 + 5) × 9, 즉 54 염기이다.

부분적인 서열 중복을 허락한다 하더라도, 주어진 54 염기 주형은 50개 이하의 다른 완전한 혼성화를 가정한 다른 5-mer 서열을 포함할 수 있다 (즉, 5-mer 는 주형(500)의 마지막 4 염기에만 결합할 수 없다). 이러한 주형 내에 포함되는 가능한 다른 m-mer의 수는 또한 (n + (n × m) - m + 1)과 동일하게 계산될 수 있다. 한편, 5-mer의 각 위치는 4 개의 가능한 염기 중 하나를 포함할 수 있고, 5 개의 위치가 존재하기 때문에, 합성될 수 있는 4⁵(즉 1024)개의 가능한 5-mer의 서열이 존재한다. 이는 코드 성분으로서 사용될 수 있는 4^m - (n + (n × m) - m + 1) 유형의 5-mer가 존재한다는 의미이다. 이 경우에, 코드 성분으로서 사용될 수 있는 974 (1024 - 50) 유형의 5-mer 가 존재한다. 컨테이너 섹션(540)은 이용가능한 974 유형 중 일련의 독특한 5-mer 에 혼성화되도록 고안될 것이다. 적절한 코드 서열을 포함하는 태그된 올리고뉴클레오타이드(520)는 컨테이너 섹션(540)에 도입 및 혼성화될 수 있다. 각 태그된 올리고뉴클레오타이드(520)는 독특한 신호를 제공하는 태그를 포함할 것이어서, 이는 기타 코드 성분들로부터 확인될 수 있다.

원리는 예시적인 도시를 참고로 설명될 수 있다. 프로브 섹션(550)이 4 염기 길이 (n = 4) 이고 태그된 올리고뉴클레오타이드(520)가 3 염기 서열 (m = 3)인 경우, 주형(500) 길이는 16 염기 길이일 것이다 ((1 + 3) × 4). 이는 12 염기 컨테이너 섹션(540) 및 4 염기 (4-mer) 프로브 섹션(550)을 초래한다.

m = 3 이기 때문에, 64 (4³) 개의 가능한 3-mer 서열이 존재한다. 각 16 염기 주형(500)은 14 개 유형 이하의 3-mer (4 + (3*4) - 3 + 1 = 14)를 포함할 수 있다. 임의적인 주형(500) 서열이 좌측에 프로브 섹션(550) (밑줄) 및 우측에 컨테이너 섹션(540)을 가지는 하기 서열번호 1 로 나타나 있다.

AGAA AGT ACA TAT GTC (서열번호 1)

상기 예에서, 16-mer 는 14개의 다른 3-mer 서열 (AGA GAA AAA AAG AGT GTA TAC ACA CAT ATA TAT ATG TGT GTC)을 가지는데, 이는 3-mer 들 중 어느 것도 동일하지 않기 때문이다. 잘못된 위치에서의 코드 성분의 결합을 방지하기 위해, 18 개 이상의 다른 유형 (= 14 + 4)의 독특하게 태그된 3-mer 코드 서열이 모든 가능한 4-mer 프로브 서열(550)을 식별가능하게 태깅하기 위해 필요하다 (요구되는 독특한 코드 성분의 수는 ((2 × n) + (n × m) - m + 1)와 동일하게 계산될 있음). 서열번호 1 에 개시된 특이적 용기 서열(540) 에는, 4개 만의 태그된 3-mer가 필요하다 - TCA, TGT, ATG 및 CAG. 각 태그된 3-mer 는 주형(500) 상의 한 곳 및 단 한 부위에서 결합할 수 있다. 태그된 올리고뉴클레오타이드(520)는 서열상 컨테이너 섹션(540) 에 상보적이기 때문에, 컨테이너 섹션(540)의 "A" 는 올리고뉴클레오타이드(520)의 "T" 와 결합하는 반면, 반대로 "G" 는 "C" 에 결합할 것이다. 프로브 섹션(550)의 서열 내의 임의의 변화는 해당 변화가 컨테이너 섹션(540) 서열 내에서 이루어지는 것을 요구할 것이다. 예를 들어, 프로브 서열(550)이 AGAA 에서 AGTA 로 변화되는 경우, 프로브(550) 내의 AGT 가 용기(540) 내의 AGT 와 중복되기 때문에 용기 서열(540) 또한 변화되어야 한다. 가능한 새로운 주형(500) 서열이 하기 서열번호 2 로 나타나 있다.

AGTA AGA ACA TAT GTC (서열번호 2)

해당 올리고뉴클레오타이드(520) 서열은 TCT TGT ATA 및 CAG 일 수 있다. 다시, 각각은 컨테이너 섹션(540)의 단 한 부위에서 결합하고 프로브 섹션(550)에 결합할 수 없다. 모든 가능한 4-mer 프로브 서열(540)의 독특한 태깅을 허용하기 위해서는 18 개의 다른 3-mer 태그된 올리고뉴클레오타이드(520)를 필요로 하는데, 이는 완전한 프로브 라이브러리를 이용한 혼성화에 의한 시퀀싱과 같은 공지된 방법을 이용하여 모든 가능한 3-mer 서열을 생성하는데 필요할 64개의 태그된 3-mer 520 보다 훨씬 못 미치는 것이다. 64개의 가능한 3-mer 중 18개만을 사용하는 것 또한 서로 잠재적으로 혼성화활수 있는 올리고뉴클레오타이드(520) 서열을 사용하는 것의 문제점을 피하게 된다.

태그된 올리고뉴클레오타이드(520) (또는 코드 성분)는 바코드(530) 합성 전에 미리 제조될 수 있고 정제 및 저장될 수 있다. 주어진 세트의 m-mer 는 임의의 필요한 프로브(550) 서열에 대한 바코드(530)를 제조하는데 사용될 수 있다. 이는 각 태그된 프로브(550) 분자가 개별적으로 제조되고 라벨되고 정제되는 기존의 방법과 비교하여, 프로브(550) 제조의 효율성을 상당히 개선한다. 본원에 개시된 모듈 시스템은 공지된 방법과 비교하여 큰 효율성을 나타낸다.

보통, 핵산 가닥에 신호(라벨) 성분을 결합시키는 것은 라벨된 뉴클레오타이드 또는 후-합성 라벨링 방법의 사용과 관련되나, 이 모두는 문제를 야기할 수 있다. DNA 중합효소는 보통 올리고뉴클레오타이드(520) 또는 핵산으로의 혼입을 위한 라벨된 뉴클레오타이드를 효율적으로 처리할 수 없다. 다중 신호 성분이 단일 핵산 가닥에 첨가되는 경우, 혼입 효율은 엄청나게 감소된다. 1 이상 또는 2 라벨을 가지는 DNA 가닥은 낮은 혼입 효율 때문에, 비라벨된 또는 부분적으로 라벨된 분자로부터 이를 분리하기 위해 다량의 출발 물질 및 라벨된 분자의 실질적인 정제를 필요로 한다. 본원에 개시된 다중의 짧게 태그된 올리고뉴클레오타이드(520)의 사용은 이러한 문제를 피하게 된다.

바코드(530) 분자가 특이적 표적 분자를 위해 고안되는 경우, 바코드(530)의 구조 및 신호 성분은 고정되며 바코드(530)는 하나의 목적에만 적합하다. 바코드(530)이 다른 표적을 위해 요구되는 경우, 각각은 처음부터 제조되어야 한다. 미리 제조될 수 있고 저장될 수 있는 짧게 태그된 올리고뉴클레오타이드(520)를 이용한 본 발명의 모듈 시스템은, 임의의 표적에 대한 바코드(530)의 유연성, 단순성 및 속도를 상당히 개선한다. 독특하게 태깅된 코드 성분의 요구되는 감소된 수는 또한 비용을 줄이고 검출의 효율성을 개선하는데, 이는 제조되고 확인되어야 하는 식별가능한 태그된 프로브(550)의 수를 감소시키기 때문이다.

도 6 은 상기 거론된 바코드와 같은 바코드를 생성하는 예시적인 방법을 나타낸다. 예를 들어, 코드 성분 601 602 603 604 는 단쇄 올리고뉴클레오타이드 (예를 들어 3-mer)를 합성하고 태그를 올리고뉴클레오타이드에 연결하거나 또는 태그에의해 이미 개질된 뉴클레오타이드를 혼입시킴으로써 생성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드에 연결된 태그들은 라만 태그에 제한되지 않는다. 예를 들어, 형광, 나노입자, 나노튜브, 풀러렌 및 양자점 태그도 올리고뉴클레오타이드에 부착될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드에의 부착 양상은 다를 수 있다. 태그는 올리고뉴클레오타이드에 직접 부착될 수 있거나 또는 분지 구조를 통해 부착될 수 있다. 코드 성분 601 602 603 604 으로서 유용한 태그된 올리고뉴클레오타이드의 다양한 제조 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 신장된 프로브 영역을 갖는 주형(606)은 태그된 코드 성분 601 602 603 604 에 서열상 상보적으로 생성될 수 있다. 태그된 성분 601 602 603 604 은 주형(606)에 개별적으로 또는 혼합되어 혼성화된다(605). 생성된 바코드(607)는 검출가능한 태그를 가진 이중 가닥 영역 및 표적 분자에 결합을 위한 단일 가닥 프로브 영역을 포함한다.

도 7 은 바코드의 생성 및 사용의 개략도를 나타낸다. 바코드는 상기 ㄱ거걸거론된 바와 같이 주형 분자 및 코드 성분을 생성함으로써 제조될 수 있다. 코드 성분은 상기 거론된 바와 같이 주형에 혼성화되어, 바코드를 생성할 수 있다. 바코드가 일단 생성되면, 다양한 목적, 예컨대 샘플 내에 올리고뉴클레오타이드, 핵산 또는 기타 표적 분자를 검출하거나 또는 핵산 분자를 시퀀싱하는데 이용될 수 있다. 도 7 에 보여진 바와 같이, 핵산 표적은 하나 이상의 바코드를 포함하는 용액에 표적 분자의 반복적인 노출로 시퀀스될 수 있다. 표적에의 바코드의 혼성화는 표적 가닥 내의 상보적 서열의 존재를 나타낸다. 상기 방법은 다른 상보적 서열의 존재를 나타내는 다른 바코드에의 노출로 반복될 수 있다. "샷건(shotgun)" 시퀀싱 방법에서는, 일부 상보적 서열들이 중첩될 수 있다. 중첩된 상보적 서열은 완전한 표적 핵산 서열로 어셈블링될 수 있다.

바코드는 샘플에 도입될 수 있고 표적 분자에의 결합은 임의의 공지된 영상 기법, 예를 들어 형광 현미경법, FTIR (퓨리에 변환 적외선) 분광법, 라만 분광법, 표면 플라즈몬 공명, 및/또는 전자 현미경법에 의해 검출될 수 있다.

공유결합에 의한 중합성 라만 라벨 바코드

본 발명의 특정 구체예에서, 중합성 라만 라벨 바코드가 생성될 수 있다. 일반적으로, 중합성 라만 라벨은 라만 태그가 직접 또는 스페이서 분자를 통해 부착되는 백본 부분을 포함할 수 있다. 백본 부분은 이에 제한되지는 않지만 내지 뉴클레오타이드, 아미노산, 단당류 또는 임의의 다양한 공지된 가소성 단량체, 예컨대 비닐, 스티렌, 카르보네이트, 아세테이트, 에틸렌, 아크릴아미드, 등을 포함하는 중합에 적절한 임의의 유형의 단량체로 이루어질 수 있다. 중합성 라만 라벨은 프로브기, 예컨대 올리고뉴클레오타이드, 항체, 렉틴 또는 앱타머 프로브에 부착될 수 있다. 중합성 백본이 뉴클레오타이드 단량체로 이루어지는 곳에서는, 항체 프로브에 대한 부착은 다른 표적 분자에의 프로브 및 백본 성분 모두의 결합 가능성을 최소화할 것이다. 대안적으로, 백본을 위해 뉴클레오타이드 단량체를 이용한 본 발명의 특정 구체예에서, 중합성 라만 라벨에 혼입된 뉴클레오타이드 서열은 표적 핵산에 상보적으로 고안될 수 있어, 프로브 기능을 중합성 라만 라벨 내에 혼입시키는 것을 허용한다. 뉴클레오타이드-기재의 백본 그 자체가 부착된 라만 태그의 검출을 잠재적으로 간섭할 수 있는 라만 방출 스펙트럼을 생성하기 때문에, 일부 구체예에서는 라만 방출 신호를 생성하지 않거나 거의 생성하지 않는 백본 성분은 신호 검출의 최적화 및 신호 대 노이즈 비율을 최소화하기 위해 사용될 수 있다. 하기 섹션은 일반적인 중합성 라만 라벨에 관한 것이며, 사용될 특이적 유형의 단량체에 제한되지는 않는다.

중합성 라만 라벨 바코드는 상기 거론된 바와 같이 표적 분자 검출, 확인 및/또는 시퀀싱을 위해 사용될 수 있다. 프로브 라벨링 및 검출을 위한 최근의 방법은 다양한 단점을 보인다. 예를 들어, 유기 형광 태그에 부착된 프로브는 높은 검출 민감도를 제공하지만 낮은 다중적 검출 능력을 가진다. 형광 태그는 광역 방출 피크를 나타내며, 형광 공명 에너지 전이 (FRET)는 단일 프로브 분자에 부착될 수 있는 다른 형광 태그의 수를 제한하는 한편, 자가 퀀칭은 형광 신호의 양자 수율을 감소시킨다. 형광 태그는 프로브가 하나 이상의 발색단을 포함한다면 다중 여기 원천이 필요하다. 이들은 또한 광-표백에 의해 불안정하다. 다른 유형의 잠재적인 프로브 태그는 양자점이다. 양자점 태그는 다중층을 가지는 상대적으로 큰 구조이다. 제조하기가 복잡한 것 이외에도, 양자점 상의 코팅은 형광 방출을 간섭한다. 양자점 신호를 이용하여 발생할 수 있는 식별가능한 신호의 수에는 제한이 있다. 제3 유형의 프로브 라벨은 염료-함침된 비드로 이루어진다. 이들은 프로브 분자의 크기 범위보다 종종 큰, 크기상 아주 큰 경향이 있다. 염료-함침된 비드의 검출은 정량적이 아닌 정성적이다.

라만 라벨은 샤프한 스펙트럼 피크를 생성하는 장점을 제공하여, 프로브에 부착될 식별가능한 라벨의 수를 광범위하게 허용한다. 표면 증강 라만 분광법 (SERS) 또는 유사한 기술의 사용은 형광 태그에 필적할 만한 검출 민감도를 허용한다. 예시적인 라만 태그 분자의 방출 스펙트럼은 도 8 에 나타나 있다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 라만 태그 분자는 다중적인 식별가능한 스펙트럼을 제공한다. 도 8 은 하기 라만 태그 분자의 스펙트럼을 나타낸다: NBU (올리고뉴클레오타이드 5'-(T)20-데옥시네불라린-T-3'); ETHDA (올리고뉴클레오타이드 5'-(T)20-(N- 에틸데옥시아데노신)-T-3'); BRDA (올리고뉴클레오타이드 5'-(T)20-(8-브로모아데노신)-T-3'); AMPUR (올리고뉴클레오타이드 5'-(T)20-(2-아미노퓨린)-T-3'); SPTA (올리고뉴클레오타이드 5'-ThiSS-(T)20-A-3'); 및 ACRGAM (올리고뉴클레오타이드 5'-아크리다이트-(G)20-아미노-C7-3'). 도 13 은 핵산 자체의 스펙트럼과 비교하여, 하나의 핵산, 아데닌의 일부 핵산 유사체의 SERS 스펙트럼을 나타낸다: 아데닌; 2-F 아데닌, 4-암-6-HS-7-데아자-8-아자-아데닌; 키네틴; N6-벤조일-아데닌; DMAA-A; 8-아자-아데닌; 아데닌 티올 및 퓨린 유도체, 6-머캅토퓨린. 표 1 에서는 라만 분광법에서 잠재적으로 사용할 수 있는 기타 태그 분자를 열거하였다. 당업자는 유용한 라만 태그는 본원에 개시된 것들로 제한되지 않지만, 프로브에 부착될 수 있고 검출될 수 있는 임의의 공지된 라만 태그를 포함할 수 있음을 알 것이다.많은 이러한 라만 태그는 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, www.glenres.com 참조).

표 1. 라만 태그 분자의 예

2',3'-ddA-5'-CE 포스포르아미다이트

2'-데옥시아데노신 a-티오트리포스페이트 (15mM) (2'dATTPaS)

2'-플루오로- 아데노신 a-티오트리포스페이트 (1OmM) (2'-F-ATTPaS)

2'-OMe-A-CE 포스포르아미다이트

2'-OMe-A-Me 포스폰아미다이트

2'-OMe-A-RNA

2'-OMe-아데노신 a-티오트리포스페이트 (20mM) (2'-O-Me-ATTPaS)

2'-OMe-Pac-A-CE 포스포르아미다이트

2-아미노-dA-CE 포스포르아미다이트

2-아미노퓨린 리보시드 a-티오트리포스페이트 (20mM) (2-AP-TTPaS)

2-F-dA-CE 포스포르아미다이트

3'-A-TOM-CE 포스포르아미다이트

3'-dA-CE 포스포르아미다이트

3'-dA-CPG

7-데아자-아데노신 a-티오트리포스페이트 (1mM) (7-DATTPaS)

7-데아자-dA CE 포스포르아미다이트

8-아미노-dA-CE 포스포르아미다이트

8-Br-dA-CE 포스포르아미다이트

8-옥소-dA-CE 포스포르아미다이트

A-TOM-CE 포스포르아미다이트

A-RNA-TOM-CPG

아데노신 a-티오트리포스페이트 (0.5mM) (ATTPaS)

Bz-A-CE 포스포르아미다이트

Bz-A-RNA-CPG

dA-5'-CE 포스포르아미다이트

dA-5'-CPG

dA-CE 포스포르아미다이트

dA-CPG 1000

dA-CPG 2000

dA-CPG 500

dA-High Load-CPG

dA-Me 포스폰아미다이트

dA-Q-CPG 500

디아미노퓨린 리보시드 a-티오트리포스페이트 (0.25mM) (DTTPaS)

도 9 는 두개 이상의 라만 태그된 단량체 단위(901,902) 를 함께 연결하여 중합성 라만 라벨을 형성함으로써 바코드를 생성하는 예시적인 방법을 나타낸다. 중합성 라만 라벨은 표적 분자에의 결합 및 표적 분자의 검출을 위해 프로브기에 부착될 수 있다. 중합성 라만 라벨은 제2 단량체 단위(902) 에 공유결합(906)에 의해 부착된 제1 단량체 단위(901) 를 포함할 수 있다. 더 큰 신호의 복잡도가 요구되는 곳에서는 부가적인 단량체 단위(903)가 부착될 수 있다. 단량체 단위(901 902) 는 백본(909)에 직접 부착되거나 또는 스페이서(905)에 의해 부착된 하나 이상의 라만 태그기 907a, 907b 를 포함할 수 있다. 스페이서(905)는, 예를 들어, 5 이상의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 스페이서(905)의 길이는, 예를 들어, 2 내지 30, 2 내지 20 또는 3 내지 15 의 탄소 원자 길이로 다양할 수 있다. 가장 효율적인 스페이서(905)는 예컨대 지방족 탄소 (예를 들어 아미노카프로산을 통해), 펩타이드 사슬 (예를 들어 라이신의 측쇄를 통해 연결된) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (예를 들어, 포스포르아미다이트)과 같이 탄력적일 것이다. 스페이서(905)는 탄소, 질소, 황 및/또는 산소 원자를 포함할 수 있다. 태그된 단량체 단위(901 902)의 제조 및 가교를 위한 다양한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 다양한 태그된 단량체 단위는 또한 상업적 원천으로부터 수득될 수 있다 (예를 들어, Molecular Probes, Eugene, OR).

도 9 에 도시된 바와 같이, 바코드는 작용기(904,908)를 통해 하나의 단량체 단위(901)를 다른 단량체 단위(902)에 공유 결합시킴으로써 형성될 수 있다. 작용기(904,908)는 예를 들어 바이오틴, 아미노기, 알데히드기, 티올기 또는 당업계에 공지된 임의의 기타 반응기를 포함할 수 있다. 각 단량체 단위(901,902)는 각 말단 상에 하나씩 두 개 이상의 작용기(904,908)를 가진다. 가교 이전에, 하나의 작용기(904,908)는 다른 단량체 단위(901,902)에 부착되기 위해 활성화(탈보호)될 수 있는 반면, 제2 작용기(904,905)는 상호작용 또는 블로킹으로부터 보호된 채로 남아 있다 (예를 들어 화학적 개질에 의해). 단량체 단위(901,902)의 각 말단은 활성화되는 경우 다른 단량체 단위(901,902)에 결합될 수 있다. 다양한 구체예에서, 중합성 라만 라벨은 2 내지 30, 4 내지 20 또는 5 내지 15 의 단량체 단위(901,902) (예를 들어 뉴클레오타이드, 아미노산, 가소성 단량체, 등)을 포함할 수 있다. 공유결합(906)에 의해 함께 연결된 두 단량체 단위(901,902)로 이루어진 결합된 중합성 라만 라벨(910)의 예가 도시된다. 라만 태그(907a 907b)는 백본(909)에 스페이서 분자(905)를 통해 부착된 것으로 보여진다. 단량체 단위(901,902)는 이 경우 예를 들어, 일차 아미노기와 카르복실기의 카르보디이미드 촉매화 반응에 의해 형성된 아미드 결합에 의한, 공유결합(906)으로 서로 결합될 수 있다.

라만 태그(907a 907b)는 하나 이상의 이중 결합, 예를 들어 탄소-질소 이중 결합을 포함할 수 있는 것이 고려된다. 라만 태그(907a 907b)는 또한 고리 구조에 부착된 측쇄기를 가지는 고리 구조를 포함할 수 있는 것도 고려된다. 측쇄기는 이에 제한되지는 않지만 질소 원자, 산소 원자, 황 원자, 및 할로겐 원자 뿐만 아니라 탄소 원자 및 수소 원자를 포함할 수 있다. 검출을 위한 라만 신호 강도를 증가시키는 측쇄기는 특히 유용하다. 효과적인 측쇄기는 예컨대 퓨린, 아크리딘, 로다민 염료 및 시아닌 염료와 같은 콘쥬게이트된 고리 구조를 가지는 화합물을 포함한다. 중합성 라만 라벨의 전체적인 극성은 친수성이지만, 소수성 측쇄기도 포함될 수 있다.

중합성 라만 라벨을 생성하는 예시적인 방법이 도 10 에 나타나 있다. 고형 지지체(1001)는 성장하는 중합성 라만 라벨의 시발을 위해 사용될 수 있다. 지지체(1001)는, 예를 들어, 다공성의 유리 비드, 가소성 물질 (이에 제한되지는 않지만 내지 아크릴, 폴리스티렌, 스티렌 및 기타 물질의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, TeflonJ, 등), 다당류, 나일론, 니트로셀룰로스, 복합체 물질, 세라믹, 가소성 수지, 실리카, 실리카-기재의 물질, 실리콘, 개질 실리콘, 탄소, 금속, 무기 유리질, 광학 섬유 다발 또는 임의의 기타 유형의 공지된 고형 지지체를 포함할 수 있다. 하나 이상의 링커 분자(1010) (예컨대 탄소 원자 사슬)는 지지체(1001)에 부착될 수 있다. 링커 분자(1010)의 길이는 다양할 수 있다. 예를 들어, 링커(1010)는 2-50 원자 길이일 수 있다. 유용한 다양한 유형의 링커(1010)는 상기에 거론되어 있다. 하나 이상의 길이 또는 유형의 링커 분자(1010) 를 고형 지지체(1001)에 부착시킬 수 있음이 고려된다. 링커(1010)는 단량체 단위(1009)의 단계식 부착에 의해 중합성 라만 라벨을 성장시키기 위한 부착 부위로서 작용한다. 도 10 은 두 단량체를 포함하는 중합성 라만 라벨의 부착된 성분(1005)을 보여준다.

부착될 각 단량체 단위(1009)는, 상기 거론된 바와 같이, 단량체 단위(1009)의 각 말단 상에 하나씩 두 작용기(1006,1007)를 포함한다. 단량체 단위(1009)의 첨가는 단량체 단위(1009)의 선두 말단 상에서 작용기(1006)의 선택적 활성화에 의한다. 활성화된 작용기(1006)는 성분(1005)의 성장하는 말단에서 다른 활성화된 작용기(1004)에 부착될 수 있다. 중합체의 화학적 합성 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 포스포르아미다이트 합성 및/또는 펩타이드의 고체상 합성을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 또는 펩타이드 합성의 기술에서와 같이, 작용기(1004,1006,1007)의 보호 및 탈보호 방법도 당업계에 잘 공지되어 있다.

각각의 연속적인 단량체 단위(1009)는 예를 들어 아세토니트릴 또는 기타 용매에 현탁된 용액에 도입될 수 있다. 제1 단량체 단위(1009)의 선두 말단 상의 작용기(1006)는 링커 분자(1010)에 결합할 수 있다. 일단 제1 단량체 단위(1009)가 링커 분자(1010)에 부착되면, 단량체 단위(1009)의 다른 말단에 부착된 작용기(1007)는 다른 단량체 단위(1009)의 결합을 위해 화학적 처리 (예를 들어 수산화암모늄)에 의해 탈보호될 수 있다. 추가될 제2 단량체 단위(1009)는 활성화된 작용기(1006) 및 보호된 작용기(1007)를 포함하여, 단량체 단위(1009)의 직접적인 부착을 허용할 수 있다. 중합성 라만 라벨의 성장하는 성분(1005)으로의 단량체 단위(1009)의 혼입 후에, 보호된 작용기(1004)는 탈보호될 수 있으며 다른 단량체 단위(1009)가 첨가될 수 있다. 상기 방법의 추가적 일순(round)은 적절한 길이의 중합성 라만 라벨이 생성될 때까지 지속될 수 있다.

일부 다른 단량체 단위(1009)가 임의의 주어진 시간에 다른 중합성 라만 라벨을 생성하기 위해 고형 지지체(1001)에 첨가될 수 있다. 후자의 경우에, 다른 중합성 라만 라벨은 적절하게는 합성 후에 분리될 수 있다. 중합성 라만 라벨의 길이는 혼입될 단량체 단위(1009)의 수에 따라 다를 것이지만, 각 중합성 라벨은 두 개 이상의 단량체 단위(1009)를 포함할 것이다.

본 발명의 다양한 구체예에서, 중합성 라만 라벨은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 그 이상의 라만 태그(1002,1003,1008)를 포함할 수 있다. 단일 중합성 라만 라벨에 부착된 개개의 라만 태그(1002,1003,1008)는 각각 상이할 수 있다. 대안적으로, 중합성 라만 라벨은 동일한 라만 태그(1002,1003,1008)의 두 개 이상의 복사본을 포함할 수 있다. 식별가능한 중합성 라만 라벨 수를 최대화하기 위해, 다중 라만 태그(1002,1003,1008)가 단일 중합성 라만 라벨로 혼입되는 곳에서 이들은 일반적으로 다를 것이다 라는 것이 고려된다. 상기 거론된 바와 같이, 라만 태그(1002,1003,1008)는 중합성 라만 라벨(1009)의 백본(1011)에 직접 부착될 수 있거나 스페이서 분자를 통해 부착될 수 있다.

중합성 라만 라벨은 단량체성 라벨보다 스페트럼 구별에 대해 더 큰 다양성을 제공하는 반면에, 라만 분광학적 검출의 민감도를 허용한다. 단일 중합성 라만 라벨에 부착된 다중 라만 태그(1002,1003,1008)의 사용은 매우 큰 수의 식별가능한 중합성 라만 라벨이 생성되는 것을 허용한다. 10 개의 다른 가능한 태그된 단량체 단위(1009)로부터 제조된 4-mer 중합성 라만 라벨은 5000 개 이상의 식별가능한 라만 서명(signature)을 생성할 것이다. 15 개의 다른 태그된 단량체 단위(1009)를 이용하면, 30,000 개 이상의 식별가능한 라만 서명이 생성될 것이다. 50,000 개 이상의 식별가능한 라만 서명은 10 내지 20 개의 다른 태그된 단량체 단위(1009)로부터만 생성될 수 있다. 단량체 단위(1009)의 크기는 뉴클레오타이드 (대략 1000 달톤)와 대략적으로 동일하기 때문에, 4-mer 라만 라벨의 평균 크기는 약 4000 달톤일 수 있다. 따라서, 중합성 라만 라벨은 거의 입체 장애가 없는 프로브-표적 결합을 허용할 것이다.

본 발명의 일부 구체예에서, 중합성 라만 라벨에 혼입된 단량체 단위(1009)는 스페이서 분지에 부착된 다른 반응기(1004,1006,1007)를 이용하여 백본에 부착된 스페이서 분지를 가질 수 있다. 반응기(1004,1006,1007)는 중합체의 합성 동안 보호되거나 또는 블로킹될 수 있다. 라만 태그(1002,1003,1008)는 중합체 합성 후, 또는 성장하는 중합체(1005)로의 단량체 단위(1009)의 혼입 후에 탈보호된 스페이서 분지에 부착될 수 있다.

도 11A 에 도시된 본 발명의 특정 구체예에서, 중합성 라만 라벨(1105)은 지지체 없이 생성될 수 있다. 라만 태그(1101a 1101b)는 작용성 라만 태그 (단량체 단위) 1103a 1103b 를 생성하기 위해, 화학적으로 변형되어 작용기(1102a 1102b), 예를 들어 바이오틴, 아미노기, 알데히드기, 티올기 또는 임의의 기타 유형의 반응기를 첨가할 수 있다. 이후 단량체 단위(1103a 1003b)는 중합을 거쳐 각각 기결정된 수의 단량체 단위를 포함하는 서브중합성 단위(1104a 1104b)를 생성할 수 있다. 서브중합성 단위 1004a 1004b 는 기결정된 비율 (예를 들어 1:1; 1:2, 1:10 등)로 함께 혼합될 수 있고 최종 중합성 라만 라벨(1105)을 생성하기 위해 추가적 중합을 거칠 수 있다. 보여진 실시예에서, 중합성 라만 라벨(1105)은 제1 유형의 단량체 단위 1103a 의 "n" 개의 복사본 및 제2 유형의 단량체 단위 1103b 의 "m" 개의 복사본을 포함한다.

도 11B 는 지지체가 없는 중합성 라만 라벨(1111)의 대안적인 생성 방법을 예시한다. 이 경우, 하나 이상의 중합체(1109)는 백본으로부터 신장된 스페이서에 부착된 반응성 측쇄기(1112)를 포함할 수 있다. 반응성 측쇄기(1112)는 하나 이상의 다른 라만 태그(1110)에 부착되어 중합성 라만 라벨(1111)을 생성할 수 있다. 반응성 측쇄기(1112)는 HS (수소 설페이트) 작용성 라만 태그(1110)와 반응할 수 있는, 아민 측쇄를 말레이미드 잔기(폴리말레무수물)로 전환되도록 처리된 폴리라이신을 포함할 수 있다. 대안적으로, 측쇄기(1112)는 NHS 에스테르 작용성 라만 태그(1110)와 반응할 수 있는 폴리(알릴아민)의 아민기를 포함할 수 있다. 측쇄기(1112)는 또한 숙시닐화 폴리라이신 또는 아미노 또는 카르복실산기를 갖는 합성 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 카르복실레이트 측쇄기(1112)는 예를 들어 카르보디이미드 매개된 가교를 이용하여 라만 태그(1110)에 부착될 수 있다.

중합체 백본은 유기 구조, 예를 들어 핵산, 펩타이드, 다당류, 및/또는 화학적으로 유도된 중합체의 임의의 조합으로부터 형성될 수 있다. 중합성 라만 라벨(1111)은 포스포디에스테르 결합, 펩타이드 결합, 및/또는 글리코시드 결합으로부터 형성될 수 있다. 예를 들어, 표준 포스포라미다이트 화학이 DNA 사슬을 포함하는 백본을 제조하는데 사용될 수 있다. 포스포디에스테르-결합된 백본의 기타 제조 방법은 예컨대 연쇄 중합 반응 (PCR^TM) 증폭과 같이 공지되어 있다. 백본의 말단은 다른 작용기들, 예를 들어, 바이오틴, 아미노기, 알데히드기 또는 티올기를 가질 수 있다. 이러한 작용성기는 두개 이상의 서브중합성 단위를 함께 연결하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 중합성 라만 라벨(1111)은 제1 단량체 단위의 "m" 개의 복사본, 제2 단량체 단위의 "k" 개의 복사본, 및 제3 단량체 단위의 "l" 개의 복사본을 포함할 수 있다. 일단 중합체 백본이 목적하는 길이로 합성되면, 두 개 이상의 다른 라만 태그(1110)는 반응성 측쇄기(1112)에 결합하기 위해 연속적으로 또는 동시적으로 도입되어, 중합성 라만 라벨을 생성할 수 있다. 단량체 단위는 라만 태그(1110)에 제한되지는 않는다. 기타 태그, 예를 들어 형광, 나노입자, 나노튜브, 풀러렌 또는 양자점 태그는 중합성 라만 라벨(1111)을 다양화하기 위해 하나 이상의 단량체 단위에 부착될 수 있다. 일반적으로, 단량체 단위의 태그(1110) 대부분은 라만 태그(1110)일 것이다. 하나 이상의 중합성 라만 라벨(1111)은 결합되어 보다 긴 생성물도 생성할 수 있다.

도 12 에 도시된 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 개시된 임의의 중합성 라만 라벨은 프로브(1206)에 결합될 수 있다. 프로브 분자(1206)의 예로서 이에 제한되지는 않지만 올리고뉴클레오타이드, 핵산, 항체, 항체 단편, 결합 단백질, 수용체 단백질, 펩타이드, 렉틴, 기질, 억제제, 활성화제, 리간드, 호르몬, 사이토킨, 등을 포함할 수 있다. 중합성 라만 라벨(1204)의 다양한 예시적인 구조 1201 1202 는 백본 및 백본에 스페이서 분자를 통해 또는 직접 부착된 하나 이상의 라만 태그를 가지는 공유 결합된 단량체 단위를 포함할 수 있다. 중합체(1204)는 프로브(1206)에 링커(1205)를 통해 또는 직접적 공유결합(1205)을 통해 부착될 수 있다. 대안적으로, 중합성 라만 라벨(1204)은 나노입자(1207)에의 부착을 통해 하나 이상의 프로브기(1206) 에 간접적으로 부착될 수 있다. 나노입자에 분자를 가교하는 다양한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 임의의 이러한 공지된 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, EDAC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드)의 존재 하에 카르복실기를 아민기와 가교할 수 있다. 예시적인 구조 1202 에 보여진 바와 같이, 하나 이상의 중합성 라만 라벨(1204)은 단일 나노입자(1207)에 부착될 수 있다. 이후 나노입자(1207)는 하나 이상의 프로브 분자(1206)에 부착될 수 있다. 이 유형의 구조의 장점은 하나 이상의 표적 분자를 단일 중합성 라만 라벨(1204)을 이용하여 확인할 수 있다는 것이다. 대안적으로, 나노입자(1207)가 동일한 프로브 분자(1206)의 다수의 복사본에 부착되는 경우 동일한 표적 분자의 다수의 복사본이 결합될 수 있다. 기타 장점으로는 보다 많은 프로브 분자(1206)가 라만 라벨에 부착되기 때문에 표적 분자를 사로잡을 가능성이 더 높다는 것과, 라만 라벨 1202 은 원심분리, 여과, 또는 전기영동에 의해 단리될 수 있기 때문에 유리 및 라만 라벨-결합된 표적 분자의 분리는 용액 검출 용도에서 보다 용이하게 이루어진다는 것을 포함한다.

대안적인 구조 1203 에서, 단량체성 라만 태그(1208)는 직접적으로 또는 스페이서 분자 1205 를 통해 나노입자(1207)에 결합될 수 있다. 하나 이상의 프로브 분자는 동일한 나노입자(1207) 직접적으로 또는 스페이서 1205 에 의해 부착될 수 있다. 이는 중합체 1204 의 예비적 합성의 필요없이, 프로브(1206)에 부착된 다중 라만 태그(1208)의 형성을 허용한다. 이 구조 1203 의 장점은 나노입자(1207)가 보다 큰 표면 영역을 가져서, 분자들 사이의 감소된 입체 장애를 제공하면서 더 많은 프로브 분자(1206) 및 라만 태그(1208)가 결합될 수 있도록 허용한다.

많은 다양한 합성 라만 라벨 바코드가 상대적으로 적은 단량체 단위를 이용하여 생성될 수 있다. 중합성 라만 라벨의 생성은 바코드 생성에 있어서 상대적으로 적은 라만 태그를 이용하면서 보다 큰 탄력성과 민감성을 허용한다.

핵산

시퀀싱할 핵산 분자를 당업계에 공지되어 있는 임의의 기술에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 특정한 실시양태에서, 핵산은 천연 발생 DNA 또는 RNA 분자이다. RNA 가 사용되는 경우, RNA 를 상보적 cDNA 로 전환하는 것이 바람직할 수 있다. 염색체 DNA, 미토콘드리아 DNA 또는 클로로플라스트 DNA 또는 전령 RNA, 이질 핵 RNA, 리보좀 RNA 및 전이 RNA 를 포함하며 이에 한정되지 않는 거의 모든 천연 발생 핵산을 제조할 수 있고, 본 발명의 방법에 의해 시퀀싱할 수 있다. 다양한 형태의 세포 핵산의 제조 방법 및 단리 방법은 공지되어 있다. (예를 들면, 문헌[Guide to Molecular Cloning Techniques, eds. Berger and Kimmel, Academic Press, New York, NY, 1987; Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed., eds. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989] 참조). 비자연 발생 핵산도 개시된 방법 및 조성물을 이용하여 시퀀싱할 수 있다. 예를 들어, 표준 증폭 기술, 예컨대 연쇄 중합 반응 (PCR^TM) 증폭에 의해 제조된 핵산은, 본 발명의 범위 내에서 시퀀싱될 수 있다. 핵산 증폭의 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다.

핵산은 이에 제한되지는 않지만, 바이러스, 박테리아, 진핵생물, 포유류, 및 인간, 플라스미드, M13, 람다 파지, PI 인공 염색체 (PACs), 박테리아 인공 염색체 (BACs), 효모 인공 염색체 (YACs) 및 기타 클로닝 벡터를 포함하는 광범위하게 다양한 원천으로부터 단리될 수 있다.

핵산 고정화의 방법

다양한 구체예에서, 핵산 분자는 고체 표면에 부착하여 고정화할 수 있다. 핵산 분자의 고정화는 지지체 또는 표면에의 비공유 또는 공유 결합과 관련한 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 한 예시적인 실시양태에서, 고정화는 고체 표면을 스트렙타비딘 또는 아비딘으로 코팅하고, 후속적으로 바이오티닐화된 폴리뉴클레오타이드를 부착함으로써 달성될 수 있다. 또한, 고정화는 폴리스티렌, 유리 또는 다른 고체 표면들을 폴리-L-Lys (라이신) 또는 폴리 L-Lys, Phe (페닐알라닌)로 코팅한 후, 이작용성 가교 결합 시약을 사용하여 아미노- 또는 술프히드릴 개질 핵산을 공유결합으로 부착시킴으로써 발생할 수 있다. 아미노실란을 사용하여 아민 잔기를 표면에 도입시킬 수 있다.

고정화는 5'-인산화된 핵산을 화학적으로 개질된 폴리스티렌 표면에 직접 공유 부착시킴으로써 수행할 수 있다. 핵산과 고체 표면 사이의 공유 결합은 수용성 카르보디이미드와의 축합에 의해 형성될 수 있다. 이 방법은 주로 핵산의 5'-포스페이트를 통해 핵산의 5'-부착을 촉진시킨다.

통상, DNA는 먼저 유리 표면을 실란처리한 다음, 카르보디이미드 또는 글루타르알데히드를 사용하여 활성화시킴으로써 유리에 결합된다. 대안적인 방법은 DNA 합성 동안 분자의 3' 또는 5' 말단에 혼입된 아미노 링커를 통해 연결된 DNA를 사용하는 시약, 예를 들면 3-글리시드옥시프로필트리메톡시실란 또는 아미노프로필트리메톡시실란 (APTS)을 사용할 수 있다. 자외선 방사를 사용하여 DNA를 막에 직접 결합시킬 수 있다. 핵산 고정화 기술의 기타 방법들은 공지되어 있다.

핵산의 고정화를 위해 사용될 표면의 유형은 제한이 없다. 다양한 구체예에서, 고정화 표면은 자성 비드, 비자성 비드, 2차원 표면, 뾰족한 표면, 또는 물질이 프로브 라이브러리에 핵산의 혼성화를 허용하기만 하면 거의 모든 물질을 포함하는 고체 표면의 임의의 기타 배좌(conformation)일 수 있다.

이작용성 가교 결합 시약은 본 발명의 다양한 실시양태에서 사용될 수 있다. 예를 들면 핵산 분자를 표면에 부착시키는 데 사용될 수 있다. 예시적인 가교 결합 시약은 글루타르알데히드, 이작용성 옥시란, 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르, 및 카르보디이미드, 예를 들면 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드를 포함한다.

특정 구체예에서 캡쳐(capture) 올리고뉴클레오타이드는 표면에 결합될 수 있다. 캡쳐 올리고뉴클레오타이드는 핵산 주형의 특이적 핵산 서열과 혼성화할 것이다. 핵산은 제한 효소 소화, 엔도뉴클레아제 활성, 상승된 온도, 감소된 염 농도, 또는 이들의 조합 및 유사한 방법에 의해 표면으로부터 방출될 수 있다.

단백질 정제

특정 구체예에서 단백질 또는 펩타이드는 단리 또는 정제될 수 있다. 한 구체예에서, 이러한 단백질은 임의의 예시된 바코드와의 태깅을 위한 항체를 생성하는데 사용될 수 있다 (예를 들어 중합성 라만 라벨). 단백질 정제 기술은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 이러한 기술은 어느 수준에서는 세포, 조직 또는 기관의 폴리펩타이드 및 비폴리펩타이드 분획으로의 균질화 및 미정제 분획화에 관련된다. 대상 단백질 또는 폴리펩타이드는 부분적 또는 완전한 정제 (또는 균질성으로의 정제)를 달성하기 위해 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 사용하여 추가로 정제될 수 있다. 순수한 펩타이드의 제조에 특히 적합한 분석 방법은 이온 교환 크로마토그래피, 겔 배제 크로마토그래피, HPLC (고성능 액체 크로마토그래피) FPLC (AP Biotech), 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 면역친화성 크로마토그래피 및 등전 집속(isoelectric focusing)이다. 친화성 크로마토그래피에 의한 수용체 단백질 정제 예는 미국특허 No. 5,206,347 에 개시되며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로서 포함된다. 펩타이드를 정제하는 보다 효율적인 하나의 방법은 고속 성능 액체(fast performance liquid) 크로마토그래피 (AKTA FPLC) 또는 even HPLC 이다.

정제 단백질 또는 펩타이드는 다른 성분들로부터 단리가능한 조성물을 지칭하는 것으로 의도되며, 여기에서 단백질 또는 펩타이드는 이의 자연적으로 수득가능한 상태에 대해 임의의 정도로 정제된다. 따라서, 단리 또는 정제 단백질 또는 펩타이드는 또한 이것이 자연적으로 발생할 수 있는 환경으로부터 유리되는 단백질 또는 펩타이드를 지칭한다. 일반적으로, "정제된" 은 다양한 기타 성분들을 제거하기 위해 분획화를 거진 단백질 또는 펩타이드 조성물을 지칭할 것이며, 여기에서 조성물은 실질적으로 이의 발현된 생물학적 활성을 보유한다. 용어 "실질적으로 정제된" 이 사용되는 곳에서, 이러한 지칭은 단백질 또는 펩타이드가 조성물 내에서 예컨대 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 그 이상을 구성하는 것과 같이, 조성물의 주요한 성분을 형성하는 조성물을 의미할 것이다.

단백질 또는 펩타이드의 정제 정도를 정량하는 다양한 방법은 본 발명의 개시의 관점에서 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 예를 들어, 활성 분획의 특이적 활성의 측정, 또는 SDS/PAGE 분석에 의한 분획 내의 폴리펩타이드의 양 측정을 포함한다. 분획의 순도를 측정하는 바람직한 방법은 분획의 특이적 활성을 계산하고, 초기 추출물의 특이적 활성과 이를 비교하여, 이 순도 정도를 계산해 "-배 정제 수" 로 평가하는 것이다. 활성의 양을 나타내기 위해 사용되는 실제 단위는 물론 정제 이후에 선택되는 특정 분석 기술, 및 발현된 단백질 또는 펩타이드가 검출가능한 활성을 나타내는가의 여부에 의존할 것이다.

단백질 정제에서의 사용에 적합한 다양한 기술은 당업계에 잘 공지되어 있다. 이들은, 예를 들어, 하기에 이어 수반되는 암모늄 설페이트, PEG, 항체 등과의침전 또는 열 변성을 포함한다: 원심분리; 크로마토그래피 단계 예컨대 이온 교환, 겔 여과, 역상, 히드록실아파타이트 및 친화성 크로마토그래피; 등전 집속; 겔 전기영동; 및 이들의 조합 및 기타 기술. 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서는 변화될 수 있으며, 또는 특정 단계가 생략될 수 있어도, 이는 여전히 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩타이드의 제조를 위한 적절한 방법이라고 여겨진다.

단백질 또는 펩타이드가 항상 이들의 가장 정제된 상태로 제공되어야 한다는 일반적인 필수요건은 없다. 실제로, 실질적으로 덜 정제된 생성물은 특정 구체예에서 유용할 것으로 생각된다. 부분적 정제는 더 적은 정제 단계를 조합하여, 또는 동일한 일반 정제 단계의 다른 형태를 이용함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, HPLC 장치를 이용하여 수행된 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피는 일반적으로 저압 크로마토그래피 시스템을 이용한 동일한 기술보다 더 큰 "-배" 정제를 초래할 것이다. 더 낮은 정도의 상대적인 정제를 나타내는 방법은 단백질 생성물의 총 회수, 또는 발현된 단백질의 활성 유지에 있어서 장점을 가질 수 있다.

친화성 크로마토그래피는 단리될 물질과 그것이 특이적으로 결합할 수 있는 분자 사이의 특이적 친화성에 의존하는 크로마토그래피 방법이다. 이것은 수용체-리간드 유형의 상호작용이다. 컬럼 물질은 불용성 매트릭스에 결합 상대자 중 하나를 공유적으로 커플링시킴으로써 합성된다. 컬럼 물질은 이후 용액으로부터 물질을 특이적으로 흡수할 수 있다. 용출은 결합이 일어나지 않을 곳에 조건을 변화시켜 발생한다 (예를 들어 변화된 pH, 이온 강도, 온도, 등). 매트릭스는 그 자체가 임의의 현저한 정도로까지 분자를 흡수하지 않고 광범위한 화학적, 물리적 및 열적 안정성을 가지는 물질이어야 한다. 리간드는 이의 결합 특성에 영향을 주지 않는 이러한 방식으로 커플링되어야 한다. 리간드는 또한 상대적으로 단단한 결합을 제공해야 한다. 그리고 샘플 또는 리간드를 파괴하지 않고 물질을 용출하는 것이 가능해야 한다.

단백질 또는 펩타이드는 표준 분자 생물학적 기술을 통한 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 발현, 천연물로부터 단백질 또는 펩타이드의 단리, 또는 단백질 또는 펩타이드의 화학적 합성을 포함하는, 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 제조될 있다. 다양한 유전자에 해당하는 뉴클레오타이드 및 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드 서열은 이미 개시되어 있으며, 당업자에게 공지된 컴퓨터 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 이러한 데이터 중 하나는 미국립생물기술정보센터의 Genbank 및 GenPept 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)이다. 공지된 유전자의 코딩 영역은 본원에 개시된 또는 당업자에게 알려진 바와 같은 기술을 이용하여 증폭 및/또는 발현될 수 있다. 대안적으로, 다양한 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드의 상업적 제조가 당업자에게 공지되어 있다.

펩타이드 모방체

본 발명에 따른 폴리펩타이드 제조를 위한 다른 구체예는 단일 클론 항체 제조를 위한 펩타이드 모방체의 사용이다. 모방체는 단백질 2차 구조의 성분들을 모방한 펩타이드-함유 분자이다. 예를 들어, 문헌[Johnson et al., "Peptide Turn Mimetics", BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et al., Eds., Chapman and Hall, New York (1993)]을 참고할 수 있으며, 이는 본원에 참조로서 포함된다. 펩타이드 모방체의 사용 뒤에 숨겨진 근원적 원리는 단백질의 펩타이드 백본이 항체와 항원과 같이 주로 분자적 상호작용을 촉진시키도록 하는 방법으로 아미노산 측쇄를 배향하도록 존재한다는 것이다. 펩타이드 모방체는 천연 분자와 유사한 분자적 상호작용을 허용하는 것으로 기대된다. 이러한 원리는 본원에 개시된 표적 펩타이드의 천연 특성을 많이 가지지만, 변형되고 심지어는 향상된 특성을 가지는 차세대 분자를 제조하는데 사용될 수 있다.

융합 단백질

본 발명의 기타 구체예는 융합 단백질에 대한 것이다. 이러한 분자 일반적으로 제2 폴리펩타이드 또는 단백질의 모든 또는 일부분에, N- 또는 C-말단에서 연결된, 모든 또는 표적 펩타이드의 실질적인 부분을 가진다. 예를 들어, 융합은 이종 숙주에서 단백질의 재조합 발현을 허용하기 위해 다른 종으로부터 선두 서열을 사용할 수 있다. 다른 유용한 융합은 융합 단백질의 정제를 촉진하기 위해 항체 에피토프와 같은 면역학적으로 활성인 도메인의 첨가를 포함한다. 융합 접점에서 또는 부위의 분할 부위의 함입은 정제 후 외부 폴리펩타이드의 제거를 촉진할 것이다. 기타 유용한 융합은 효소의 활성 부위와 같은 작용성 도메인의 결합, 글리코실화 도메인, 세포 표적 신호 또는 막투과 영역을 포함한다. 특정 구체예에서, 융합 단백질은 치료 단백질 또는 펩타이드에 결합된 표적 펩타이드를 포함한다. 본 발명의 범위 내에서 사실상 임의의 단백질 또는 펩타이드가 표적 펩타이드를 포함하는 융합 단백질에 혼입될 수 있음이 고려된다. 융합 단백질의 생성 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 이러한 단백질은 완전한 융합 단백질의 발현 이후에 예를 들어, 이작용성 가교 결합 시약을 이용한 화학적 결합에 의해, 완전한 융합 단백질의 디 노보(de novo) 합성에 의해, 또는 제2 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 DNA 서열에 표적 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 부착함으로써 생성될 수 있다.

합성 펩타이드

균종 선택 절차 후에 확인된 펩타이드는 이들의 상대적으로 작은 크기 때문에,통상적인 기술에 따라 용액 중 또는 고체 지지체 상에서 합성될 수 있다. 다양한 자동 합성기가 시판되며 공지된 프로토콜을 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Stewart and Young, (1984); Tam et al., (1983); Merrifeld, (1986); 및 Barany and Merrifield (1979)], 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다. 보통 약 6 이상 약 35 내지 50 아미노산인 단쇄 펩타이드 서열은, 이러한 방법에 의해 용이하게 합성될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 발현 벡터에 삽입하고, 형질 전환 또는 적절한 숙주 세포에 감염시켜, 발현에 적절한 조건 하에 배양하는 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다.

예시적 적용

핵산 시퀀싱

특정 구체예에서, 본원에 개시된 바와 같이 형성된 바코드가 표적 핵산 분자를 시퀀싱하는데 사용될 수 있다. 혼성화에 의한 시퀀싱 방법은 공지되어 있다. 공지된 서열의 프로브를 포함하는 하나 이상의 태그된 바코드는 표적 핵산 서열로의혼성화가 허용된다. 표적으로의 태그된 바코드의 결합은 표적 가닥 내에서 상보적 서열의 존재를 가리킨다. 다중 라벨된 바코드는 표적 분자로의 동시적 혼성화 및 동시적 검출이 허용된다. 대안적인 구체예에서, 결합된 프로브는 개졀적 표적 분자에 부착된 것이 확인될 수 있으며, 또는 대안적으로 특이적 표적 분자의 다수의 복사본은 중첩된 세트의 프로브 서열에 동시적으로 결합하는 것이 허용될 수 있다. 개개의 분자들이 예를 들어, 검출 모드와 커플링된 공지된 분자 조합 기술을 이용하여 스캐닝될 수 있다 (예를 들어 Bensimon et al. Phys. Rev. Lett. 74:4754-57, 1995; Michalet et al., Science 277:1518-23, 1997; 미국특허 Nos. 5,840,862; 6,054,327; 6,225,055; 6,248,537; 6,265,153; 6,303,296 및 6,344,319 참조)

주어진 표적 핵산은 표적 서열을 완전히 커버하는 인접하는 프로브 서열에 혼성화할 것 같지는 않다. 오히려, 표적의 다수의 복사본이 각각으로부터 수집된 태그된 올리고뉴클레오타이드의 풀(pool) 및 부분적 서열 데이터로 혼성화될 수 있다. 부분적 서열들은 공개적으로 이용가능한 샷건 서열 컴파일 프로그램을 이용하여 완전한 표적 핵산 서열로 정리될 수 있다. 부분적 서열은 또한 예를 들어 용액 상에서 바코드 프로브의 라이브러리에 동시적으로 결합하도록 허용된 표적 분자의 군집으로부터 컴파일될 수 있다.

표적 분자 검출, 확인 및/또는 정량

특정 구체예에서, 샘플 내의 표적 분자는 바코드에 결합함으로써 검출, 확인및/또는 정량될 수 있다. 특이적 표적에 결합하도록 고안된 태그된 바코드는 상기 거론된 바와 같이 제조될 수 있다. 표적은 핵산에만 제한되지는 않지만, 또한 단백질, 펩타이드, 지질, 탄수화물, 당지질, 당단백질 또는 특이적 프로브가 제조될 수 있는 임의의 기타 잠재적인 표적을 포함할 수 있다. 상기 거론된 바와 같이, 항체 또는 앱타머 프로브는 바코드에 혼입될 수 있으며 앱타머 또는 항체가 제조될 수 있는 임의의 표적을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 샘플 내에 다중 표적의 존재는 각 바코드가 식별가능하게 라벨되고 검출될 수 있기 때문에 동시적으로 분석될 수 있다. 표적의 정량은 분광학적 분석에 잘 공지된 표준 기술로 수행될 수 있다. 예를 들어, 태그된 바코드에 결합된 표적의 양은 결합된 바코드의 신호 강도 측정 및 바코드 표준의 공지된 양으로부터 만들어진 눈금 곡선과의 비교를 통해 결정될 수 있다. 이러한 정량 방법은 당업계에 잘 알려진 일상적인 기법이다.

어레이 화학

다른 화학적 작용성 (예를 들어 다른 결합 특이성)을 수반하는 비드 (예를 들어 미소구체)는 함께 혼합될 수 있다. 각 비드의 작용성을 확인하는 능력은 광학적으로 송신가능한 코딩 체계 ("광학 서명")를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 광학 서명은 상기 거론된 바와 같이 중합성 라만 라벨을 사용하여 생성될 수 있다. 기질, 예컨대 칩 또는 마이크로타이터 플레이트는, 개개의 비드에 결합할 수 있는 개별 부위를 포함하는 패턴화된 표면을 포함할 수 있다. 이는 프로브 (즉 핵산, 앱타머 또는 항체)의 합성을 이들의 어레이 상의 위치로부터 분리되도록 허용한다. 프로브는 합성되고 비드에 부착될 수 있으며 비드는 패턴화된 표면 상에 랜덤하게 분포될 수 있다. 비드는 먼저 광학 서명으로 코딩되기 때문에, 생성되는 배열은 후에 "디코딩" 될 수 있다. 즉, 특정 부위에 위치한 비드 또는 프로브와 어레이 상의 개별 부위의 위치와의 상관관계가 만들어 질 수 있다. 비드가 배열상에서 랜덤하게 분포할 수 있기 때문에, 이는 어레이 생성을 위한 현장 합성 또는 스폿팅 기술과 비교하여 신속하며 비고가의 방법을 초래하게 된다.

어레이 조성물은 개별 부위를 포함하는 표면을 가지는 적어도 제1 기질을 포함할 수 있다. 어레이 크기는 어레이의 사용 목적에 의존할 것이다. 약 2개의 다른 작용제 (즉 다른 비드) 내지 많은 백만의 다른 작용제를 포함하는 어레이가 제조될 수 있다. 일반적으로, 어레이는 비드 및 기질의 크기에 따라, 2개의 다른 비드 내지 10 억 이상의 많은 정도의 것을 포함할 것이다. 따라서, 아주 높은 밀도, 높은 밀도, 중간 밀도, 낮은 밀도 또는 아주 낮은 밀도의 어레이가 제조될 수 있다. 아주 높은-밀도 어레이에 대한 일부 범위는 어레이 당 약 10,000,000 내지 약 2,000,000,000 부위이다. 높은-밀도 어레이의 범위는 약 100,000 내지 약 10,000,000 부위이다. 중간 밀도 어레이의 범위는 약 10,000 내지 약 50,000 부위이다. 낮은-밀도 어레이는 일반적으로 10,000 부위 미만이다. 아주 낮은-밀도 어레이는 1,000 부위 미만이다.

본 발명의 일부 구체예에서, 다르거나 또는 동일한 조성물의 다수의 기질이 사용될 수 있다. 따라서 예를 들어, 큰 어레이는 다수의 보다 작은 기질을 포함할 수 있다. "기질" 또는 "고형 지지체" 라는 것은 비드의 부착 또는 해리를 위해 적절한 불연속적인 개별 부위를 포함할 수 있고 하나 이상의 검출 방법에 따를 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 일반적으로, 기질은 광학 검출을 허용하며 신호 방출을 심하게 간섭하지 않는다.

부위들은 패턴, 즉 규칙적인 디자인 또는 구성을 포함하거나, 또는 랜덤하게 분포될 수 있다. 규칙적인 패턴 부위들은 X-Y 좌표 평면 상에 지정되도록 사용될 수 있다. 기질의 표면은 개별 부위에서 미소구체의 부착을 허용하기 위해 개질될 수 있다. 따라서, 기질의 표면은 단일 결합된 비드만을 가질 수 있는 불연속적인 부위들이 형성되도록 개질될 수 있다. 한 구체예에서, 기질의 표면은 웰(well), 즉 기질 표면의 함몰을 포함하도록 개질될 수 있다. 이는 이에 제한되지는 않지만, 포토리소그래피, 스탬핑 기술, 몰딩 기술 및 마이크로에칭 기술을 포함하는 다양하게 공지된 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 당업자에게 명백한 것처럼, 사용되는 기술은 기질의 조성 및 모양에 의존할 것이다. 대안적으로, 기질의 표면은 미소구체 및/또는 비드를 기질 상의 불연속적인 위치에 부착시키는데 사용될 수 있는 화학적으로 유도된 부위들을 포함하도록 개질될 수 있다. 화학적 작용기, 예컨대 아미노기, 카르복시기, 옥소기 및 티올기의 패턴의 첨가는 일반적으로 해당 반응성 작용기 또는 링커 분자를 포함하는 미소구체를 공유 결합시키는 데 사용될 수 있다.

적절한 비드 조성물은 펩타이드, 핵산 및 유기기 합성에 사용되는 것들을 포함하며, 이에 제한되지는 않지만 가소성 물질, 세라믹, 유리, 폴리스티렌, 메틸스티렌, 아크릴 중합체, 상자성 물질, 토리아 솔, 탄소 그래파이트, 이산화티탄, 라텍스 또는 가교-결합된 덱스트란 예컨대 세파로스, 셀룰로스, 나일론, 가교 결합된 마이셀(micelle) 및 Teflon

가 모두 사용될 수 있다. 비드 크기는 나노미터, 즉 100 nm, 내지 밀리미터, 즉 1 mm 인, 약 0.2 마이크론 내지 약 200 마이크론, 및 약 0.5 내지 약 5 마이크론의 비드 범위일 수 있지만, 일부 구체예에서는 보다 작은 비드가 사용될 수 있다.

조성물은 검출하고자 하는 특정 표적 물질, 예를 들어, 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 단백질, 효소, 항체 또는 항원의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다. 조성물은 또한 특정 표적에의 결합을 위한 생활성 작용제, 즉 약물 후보자를 스크리닝하거나 또는 오염물질과 같은 요인을 검출하는데 사용될 수 있다. 상기 거론된 바와 같이, 프로브기, 예컨대 펩타이드, 단백질, 올리고뉴클레오타이드 또는 앱타머에 대에 고안될 수 있는 임의의 분석 대상물이 개시된 바코드와 조합하여 사용될 수 있다.

생활성 작용제는 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위하게 다양한 원천으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 다양한 방법이 무작위화된 올리고뉴클레오타이드의 발현을 포함하는 다양한 유기 화합물 및 생분자의 무작위적 및 직접 합성을 위해 이용가능하다. 대안적으로, 박테리아, 진균류, 식물 및 동물 추출물의 형태인 천연 화합물의 라이브러리가 이용가능하거나 또는 바로 제조된다. 추가적으로, 천연 또는 합성적으로 제조된 라이브러리 및 화합물은 통상적인 화학적, 물리적 및 생화학적 방법을 통해 용이하게 개질된다. 공지된 약리학적 제제는 직접 또는 무작위적 화학적 개질, 예컨대 아실화, 알킬화, 에스테르화 및/또는 아미드화를 거쳐 구조적 유사체를 제조할 수 있다.

생활성 작용제는 자연 발생 단백질 또는 자연 발생 단백질의 단편을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 단백질을 함유하는 세포 추출물, 또는 단백질성 세포 출물의 무작위적 또는 직접적 소화물이 사용될 수 있다. 이러한 방법으로 원핵 및 진핵성 단백질의 라이브러리는 본원에 기술된 시스템을 스크리닝하기 위해 제조될 수 있다. 예를 들어 박테리아, 진균류, 바이러스, 및 포유동물의 단백질 라이브러리가 스크리닝 목적을 위해 생성될 수 있다.

생활성 작용제는 약 5 내지 약 30 아미노산 또는 약 5 내지 약 15 아미노산의 펩타이드일 수 있다. 펩타이드는 자연 발생 단백질 또는 랜덤 펩타이드의 소화물일 수 있다. 일반적으로 랜덤 펩타이드 (또는 랜덤 핵산)은 화학적으로 합성되기 때문에, 이들은 임의의 위치에 임의의 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 혼입할 수 있다. 합성 방법은 서열 길이에 걸쳐서 모든 또는 대부분의 가능한 조합의 형성을 허용하기 위해 랜덤화 단백질 또는 핵산을 생성하도록 고안되어, 랜덤화된 생활성 제제의 라이브러리를 형성할 수 있다.

대안적으로, 생활성 작용제는 핵산일 수 있다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥, 또는 이의 혼합물일 수 있다. 핵산은 DNA, 게놈 DNA, cDNA, RNA 또는 하이브리드일 수 있으며, 여기에서 핵산은 데옥시리보- 및 리보뉴클레오타이드의 임의의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 사이토신, 구아닌, 이노신, 크산타닌, 하이포크산타닌, 이소사이토신, 이소구아닌을 포함하는 염기의 임의의 조합, 및 염기쌍 유사체 예컨대 니트로피롤 및 니트로인돌, 등을 포함한다.

본원에 개시된 바코드의 적용은 상기 사용에만 제한되지는 않지만, 표적 검출, 확인 및/또는 정량이 관련되는 임의의 사용을 포함할 수 있다. 비제한적인 용도로서 단염기 다형 (SNPs)의 검출, 유전적 변이의 검출, 질병 진단, 수사학 분석, 환경적 오염물질 및/또는 병원균의 검출, 임상학적 진단 시험 및 당업계에 공지된 광범위하게 다양한 기타 용도가 포함된다.

프로브 제조

올리고뉴클레오타이드 프로브

올리고뉴클레오타이드 합성 방법은 당업계에 잘 공지되어 있어서 임의의 이러한 공지된 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 시판되는 올리고뉴클레오타이드 합성기를 사용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, Applied Biosystems, Foster City, CA). 다양한 태그에 부착된 뉴클레오타이드 전구체가 상업적으로 수득될 수 있으며 (예를 들어 Molecular Probes, Eugene, OR), 올리고뉴클레오타이드에 혼입될 수 있다. 대안적으로, 뉴클레오타이드 전구체는 다양한 반응기, 예컨대 바이오틴, 디곡시게닌, 술프히드릴, 아미노 또는 카르복실기를 포함하는 것으로 구매될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 합성 후, 태그는 표준 화학을 이용하여 부착될 수 있다. 태그 부착을 위한 반응성기가 있거나 없는 임의의 목적하는 서열의 올리고뉴클레오타이드도, 다양한 공급원으로부터 구매될 수 있다 (예를 들어 Midland Certifed Reagents, Midland, TX). 올리고뉴클레오타이드 프로브는 또한 표준 효소적 방법, 예를 들어 연쇄 중합 반응 (PCR^TM) 증폭을 사용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.; 미국특허 Nos. 5,279,721; 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,883,750).

앱타머 프로브

앱타머는 SELEX 로 불리는 시험관 내 진화적 방법에 의해 유도된 올리고뉴클레오타이드이다 (예를 들어 Brody and Gold, Molecular Biotechnology 74:5-13, 2000). SELEX 방법은 표적에 잠재적인 앱타머 (핵산 리간드)를 반복적인 주기로 노출시켜, 결합을 발생하게 하고, 유리 핵산 리간드로부터 결합을 분리하고, 결합된 리간드를 증폭하고 결합 공정을 반복하는 것과 관련된다. 수회의 주기 후, 사실상 임의의 유형의 생물학적 표적에 대해 높은 친화성 및 특이성을 나타내는 앱타머가 제조될 수 있다. 이들의 작은 크기, 상대적인 안정성 및 제조의 용이함 때문에, 앱타머는 프로브로서 사용을 위해 아주 적절할 수 있다. 앱타머는 올리고뉴클레오타이드로 이루어지기 때문에, 이들은 핵산 유형의 바코드에 쉽게 혼입될 수 있다. 앱타머의 제조 방법은 잘 공지되어 있다 (예를 들어 미국특허 Nos. 5,270,163; 5,567,588; 5,670,637; 5,696,249; 5,843,653). 대안적으로, 특이적 표적에 대한 다양한 앱타머가 상업적 공급원으로부터 수득될 수 있다 (예를 들어 Somalogic, Boulder, CO). 앱타머는 7 내지 50 kDa 정도의 상대적으로 소분자이다.

항체 프로브

항체의 제조 방법 또한 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988). 프로브로서 사용에 적절한 단일 클론 항체도 다수의 상업적 공급원으로부터 수득될 수 있다. 이러한 시판되는 항체는 광범위하게 다양한 표적에 대해 이용가능하다. 항체 프로브는 하기 기술되는 바와 같이, 표준 화학을 이용하여 바코드에 콘쥬게이트될 수 있다.

개시된 방법 및 조성물 사용된 프로브 유형에 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 임의의 유형의 프로브기는 바코드에 부착될 수 있으며 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 프로브는, 이에 제한되지는 않지만, 항체 단편, 항체, 키메라 항체, 단일-사슬 항체, 리간드, 결합 단백질, 수용체, 억제제, 기질, 등을 포함할 수 있다.

태그

본 발명의 다양한 구체예에서, 바코드는 하나 이상의 태그기에 부착되어 검출 및/또는 확인을 촉진시킬 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 검출가능한 태그가 사용될 수 있다. 검출가능한 태그는, 이에 제한되지는 않지만, 전기적, 광학적, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 또는 화학적 기술에 의해 검출가능한 임의의 조성물을 포함할 수 있다. 태그는, 이에 제한되지는 않지만, 전도성, 발광성, 형광성, 화학발광성, 생발광성 및 인광성기, 양자점, 나노입자, 금속 나노입자, 금 나노입자, 은 나노입자, 크로모겐(chromogen), 항체, 항체 단편, 유전공학적 항체, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 결합 단백질, 자성 입자 및 스핀 라벨 화합물을 포함할 수 있다 (미국특허 Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; 및 4,366,241.).

라만 태그

유용한 라만 태그의 비제한적인 예는 TRIT (테트라메틸 로다민 이소티올), NBD (7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸), 텍사스 레드 염료, 프탈산, 테레프탈산, 이소프탈산, 크레실 패스트 블루 (cresyl fast violet), 크레실 블루 바이올렛 (cresyl blue violet), 브릴리언트 크레실 블루 (brilliant cresyl blue), 파라-아미노벤조산, 에리트로신, 바이오틴, 디곡시게닌, 5-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시 플루오레세인, TET (6-카르복시-2',4,7,7'-테트라클로로플루오레세인), HEX (6-카르복시-2',4,4',5',7,7'-헥사클로로플루오레세인), Joe (6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인), 5-카르복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카르복시플루오레세인, 5-카르복시 로다민, Tamra (테트라메틸로다민), 6-카르복시로다민, Rox (카르복시-X-로다민), R6G (로다민 6G), 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌 (예를 들어 Cy3, Cy3.5, Cy5), 크잔틴, 숙시닐플루오레세인, N,N-디에틸-4-(5'-아조벤조트리아졸릴)-페닐아민 및 아미노아크리딘을 포함한다. 이들 및 기타 라만 태그는 상업적 공급원으로부터 수득될 수 있다(예를 들어, Molecular Probes, Eugene, OR).

폴리시클릭 방향족 화합물은 일반적으로 라만 태그로 기능할 수 있다. 사용될 수 있는 기타 태그들은 시아니드, 티올, 염소, 브롬, 메틸, 인 및 황을 포함한다. 본 발명의 특정한 실시양태에서, 탄소 나노튜브는 라만 태그로 사용될 수 있다. 라만 분광법에 태그를 사용하는 것은 공지되어 있다 (예를 들면, 미국 특허 제 5,306,403호 및 제 6,174,677호).

라만 태그를 바코드에 직접 부착시키거나 또는 다양한 링커 화합물을 통해 부착시킬 수 있다. 라만 태그에 공유결합으로 부착된 뉴클레오타이드는 표준 상업적 공급원 (예를 들면, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN; Promega Corp., Madison, WI; Ambion, Inc., Austin, TX; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)로부터 입수가능하다. 다른 분자, 예를 들면 뉴클레오타이드 또는 아미노산과 공유 반응하도록 고안된 반응성 기를 함유하는 라만 태그는 상업적으로 입수가능하다 (예를 들어, Molecular Probes, Eugene, OR).

형광 태그

잠재적으로 사용할 수 있는 형광 태그는, 이에 제한되지는 않지만, 플루오레세인, 5-카르복시플루오레세인 (FAM), 2'7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6-카르복시플루오레세인 (JOE), 로다민, 6-카르복시로다민 (R6G), N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민 (TAMPA), 6-카르복시-X-로다민 (ROX), 4-(4'-디메틸아미노페닐아조)벤조산 (DABCYL), 및 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산 (EDANS)을 포함한다. 기타 잠재적인 형광 태그는 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국특허 No. 5,866,336). 광범위하게 다양한 형광 태그는 상업적 공급원, 예컨대 Molecular Probes (Eugene, OR)로부터 수득가능하다. 태그된 분자의 형광 검출 방법은 또한 당업계에 잘 공지되어 있으며 임의의 이러한 공지된 방법이 사용될 수 있다.

유용한 발광 태그는, 이에 제한되지는 않지만, 희토류 금속 크립테이트(cryptate), 유로퓸 트리스비피리딘 디아민, 유로퓸 크립테이트 또는 컬레이트, Tb 트리비피리딘, 디아민, 디시아닌, 라 졸라 블루(La Jolla blue) 염료, 알로피코시아닌, 알로코시아닌 B, 피코시아닌 C, 피코시아닌 R, 티아민, 피코에리트로시아닌, 피코에리트린 R, 업컨버팅(up-converting) 또는 다운컨버팅(down-converting) 인, 루시페린, 또는 아크리디늄 에스테르를 포함한다.

나노입자 태그

나노입자가 태그, 예를 들어 다양한 양상에 의해 바코드가 검출되는 태그로서 사용될 수 있다. 나노입자의 제조 방법은 공지되어 있다 (예를 들면, 미국 특허 제 6,054,495호; 제 6,127,120호; 제 6,149,868호; 문헌[Lee and Meisel, J. Phys. Chez. 86: 3391-3395, 1982). 또한, 나노입자는 상업적 공급원으로부터 입수할 수 있다 (예를 들면, Nanoprobes Inc., Yaphank, NY; Polysciences, Inc., Warrington, PA). 금 또는 은 나노입자가 태그로서 가장 흔하게 사용되지만, 나노입자의 임의 유형 또는 조성물이 바코드에 부착되어 태그로서 사용될 수 있다.

사용될 나노입자는 나노입자의 랜덤 응집체 (콜로이드성 나노입자)일 수 있다. 대안적으로, 나노입자는 가교되어 나노입자의 특정 응집체, 예를 들면 이량체, 삼량체, 사량체 또는 다른 응집체를 생성할 수 있다. 선택된 수의 나노입자를 함유하는 응집체 (이량체, 삼량체 등)는 공지된 기술, 예를 들면 슈크로오스 용액 중에서 초원심분리에 의해 농축되거나 또는 정제될 수 있다.

바코드에 부착을 위해 적절한 개질된 나노입자는 상업적으로 입수가능하며, 예를 들면 Nanoprobes, Inc. (Yaphank, NY)의 Nanogold

가 있다. Nanogold

나노입자는 나노입자당 부착된 단일 또는 다수의 말레이미드, 아민 또는 다른 기들을 사용하여 수득될 수 있다. 이러한 개질된 나노입자를 다양한 공지된 링커 화합물을 이용하여 바코드에 부착시킬 수 있다.

금속성 태그

태그는 마이크로미터 이하의 크기인 금속성 태그 (예를 들어, Nicewarner-Pena et al., Science 294:137-141, 2001). Nicewarner-Pena 등 (2001)은 다른 유형의 금속으로 이루어진 마이크로미터 이하의 스트립으로 코딩된 다중 금속 마이크로로드를 제조하는 방법을 개시한다. 이 시스템은 두가지 유형의 금속 및 8 x 10⁵ 개와 같이 많은 3가지 다른 유형의 금속을 이용하여 4160 개 이하의 아주 다량의 식별가능한 태그의 제조를 허용한다. 이러한 태그는 바코드에 부착되어 검출될 수 있다. 금속 입자, 예컨대 금 또는 은을, 올리고뉴클레오타이드 및 기타 유형의 분자에 부착시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어 미국특허 No. 5,472,881).

풀러렌 태그

풀러렌 또한 바코드 태그로서 사용될 수 있다. 풀러렌의 제조 방법은 공지되어 있다 (예를 들어 미국특허 No. 6,358,375). 풀러렌은 하기 탄소 나노튜브에 대해 개시된 것과 유사한 방법에 의해 유도되어 다른 분자에 부착될 수 있다. 풀러렌-태그된 바코드는 예를 들어, 다양한 기술을 이용하여 확인될 수 있다.

바코드에 부착되어 검출될 수 있는 기타 유형의 공지된 태그가 고려된다. 잠재적으로 사용할 수 있는 태그의 비제한적인 예는 양자점 (예를 들어 Schoenfeld, et al., Proc. 7th lint. Conf. on Modulated Semiconductor Structures, Madrid, pp. 605-608, 1995; Zhao, et al., 1st Int. Conf. on Low Dimensional Structures and Devices, Singapore, pp. 467-471, 1995)을 포함한다. 양자점 및 기타 유형의 태그도 상업적 공급원으로부터 입수가능하다 (예를 들어, Quantum Dot Corp., Hayward, CA).

탄소 나노튜브 태그

탄소 나노튜브, 예컨대 단일벽 탄소 나노튜브 (SWNTs)도 태그로서 사용될 수 있다. 나노튜브는, 예를 들어, 라만 분광법에 의해 검출될 수 있다 (예를 들어 Freitag et al., Phys. Rev. B 62:R2307-R2310, 2000). 탄소 나노튜브의 특성, 예컨대 전기적 또는 광학 특성은 적어도 부분적으로는 나노튜브의 크기에 의존한다.

탄소 나노튜브는 이에 제한되지는 않지만 내지 탄소-아크 방전, 탄화수소의 촉매적 열분해를 통한 화학적 기상 증착, 플라즈마 보조된 화학적 기상 증착, 촉매적 금속 함유 그래파이트 표적의 레이저 절제, 또는 응집상 전기분해를 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기술로 제조될 수 있다 (예를 들어 미국특허 Nos. 6,258,401, 6,283,812 및 6,297,592 참조). 다른 길이의 탄소 나노튜브의 혼합물을 포함하는 조성ㄷ물은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 나노튜브 길이 및 직경에 따라 불연속적인 크기 부류로 분리될 수 있다. 예를 들어, 나노튜브는 질량 분광법에 의해 크기 분류될 수 있다 (Parker et al., "High yield synthesis, separation and mass spectrometric characterization of fullerene C60-C266, " J. Am. Chem. Soc. 113:7499- 7503, 1991). 탄소 나노튜브도 상업적 공급원, 예컨대 CarboLex (Lexington, KY), NanoLab (Watertown, MA), Materials and Electrochemical Research (Tucson, AZ) 또는 Carbon Nano Technologies Inc. (Houston, TX)로부터 입수가능하다.

탄소 나노튜브는 반응성기로 유도화되어 바코드에의 부착을 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 나노튜브는 유도화되어 카르보디이미드 가교 링커를 이용하여 아민에 결합될 수 있는 카르복실산기를 포함할 수 있다 (미국특허 No. 6,187,823).

뉴클레오타이드 태그

뉴클레오타이드 또는 염기, 예를 들어 아데닌, 구아닌, 사이토신, 또는 티민이 올리고뉴클레오타이드 및 핵산 이외의 분자 바코드를 태깅하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 기재의 분자 바코드는 뉴클레오타이드 또는 퓨린 또는 피리미딘 염기로 태깅될 수 있다. 기타 유형의 퓨린 또는 피리미딘 또는 이의 유사체, 예컨대 우라실, 이노신, 2,6-디아미노퓨린, 5-플루오로-데옥시사이토신, 7-데아자-데옥시아데닌 또는 7-데아자-데옥시구아닌도 태그로서 사용될 수 있다. 다른 태그는 염기 유사체로 사용될 수 있다. 염기는 당 또는 인이 없는 질소-함유 고리 구조이다. 이러한 태그는 광학 기술, 예컨대 라만 또는 형광 분광법으로 검출될 수있다. 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 태그의 사용은 검출될 표적 분자가 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드인 경우에는 적절하지 않은데, 그 이유는 바코드의 태그 일부가 프로브 부분 이외의 다른 표적 분자에 혼성화할 수 있기 때문이다.

아미노산 태그

아미노산도 태그로서 사용될 수 있다. 태그로서 잠재적으로 사용될 수 있는 아미노산은 이에 제한되지는 않지만 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 히스티딘, 아르기닌, 시스테인, 및 메티오닌을 포함한다.

가교-링커

이작용성 가교-결합 시약이 다양한 목적, 예컨대 태그를 바코드에 부착시키는 데 사용될 수 있다. 이작용성 가교-결합 시약은 이들의 작용기, 예를 들어, 아미노, 구아니디노, 인돌, 또는 카르복실 특이적 기의 특이성에 따라 나누어질 수 있다. 이들 중에서, 유리 아미노기 지향 시약이 상업적 이용성, 합성의 용이함 및 이들이 적용될 수 있는 온화한 반응 조건 때문에 많이 이용된다 (미국특허 Nos. 5,603,872 및 5,401,511). 잠재적으로 사용할 수 있는 가교-결합 시약은 글루타르알데히드 (GAD), 이작용성 옥시란 (OXR), 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (EGDE), 및 카르보디이미드, 예컨대 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC)를 포함한다.

바코드 검출

바코드는 당업계에 공지된 임의의 양상을 이용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 바코드를 검출하기 위해 형광 분광법이 사용될 수 있다. 일부 형광 염료가 단일 바코드에 부착될 수 있다. 염료의 양 및 바코드 내에서 염료의 화학적 특성은 바코드의 형광 방출 프로파일을 결정할 것이다. 주어진 바코드 조성물에 대해서, 신호는 또한 가능한 공명 에너지 전이에 기인하여 태그들 사이에 상대적인 거리에 의해 영향받을 수 있다.

다른 구체예에서, 바코드를 검출하기 위해 라만 분광법이 사용될 수 있다. 다양한 라만 태그는 공지된 라만 분광법 기술, 예컨대 SERS (표면 증강 라만 분광법)에 의한 검출을 위해 바코드에 부착될 수 있다. 부착된 라만 태그 이외에, 바코드 백본 그 자체가 라만 태그로서 사용될 수 있다. DNA 분자의 다른 염기 조성물은 DNA-기재의 바코드를 확인하기 위해 사용될 수 있는 다른 라만 신호를 생성한다. 다양한 특이적 검출 양상이 하기에 거론되어 있다.

라만 분광법

표면 라만 분광법

라만 분광법의 다양한 양상은 표면에 태그된 (바코드) 분자의 근접성에 의한 라만 신호의 증강을 이용한다. 예컨대 표면 증강 라만 분광법 (SERS) 또는 표면 증강 공명 라만 분광법 (SEARS)과 같은 특정 양태에서, 라만 활성 금속 표면, 예컨대 금, 은, 알루미늄, 백금, 구리 또는 기타 금속에의 근접성은 6 또는 7 이하 정도 크기로 라만 신호를 증강시킬 수 있다.

예컨대 LiP, NaF, KF, LiCl, NaCl, KCl, LiBr, NaBr, KBr, Lil, NaI 및 KI 와 같은 기타 유형의 화합물도 SERS 의 신호를 증강시킬 수 있다. 특히, LiCl 은 특정 분석 대상물의 상대적 신호 강도를 2배 내지 100배 증가시키는 것으로 증명되었다 (예를 들어 dAMP, 데옥시아데노신, 아데노신 및 아데닌). LiCl 은 대상 분석물에 따라, 흔하게 사용되는 NaCl 과 비교하여 2배 이상 상대적 강도를 증가시킨다. 다른 구체예에서, NaBr 또는 NaI 는 예컨대 데옥시구아노신-모노포스페이트 (dGMP)와 같은 분석 대상물에 대해 LiCl 보다 양호할 수 있다.

라만 검출기

라만 검출의 다양한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 사용되는 라만 검출 유닛의 한 예는 미국 특허 제 6,002,471호에 개시되어 있다. 개시된 바와 같이, 여기 빔은 532 nm 파장에서 Nd:YAG 레이저 또는 365 nm 파장에서 Ti:사파이어 레이저에 의해 생성된다. 펄스화된 레이저 빔 또는 연속 레이저 빔을 사용할 수 있다. 여기 빔은 공초점 광학계 및 현미경 대물 렌즈를 통과하고, 표적 영역으로 집속된다. 라만 라벨로부터의 라만 방출 광이 현미경 대물 렌즈 및 공초점 광학계에 의해 수집되고, 스펙트럼 해리를 위해 단색광장치 (monochromator)에 커플링된다. 공초점 광학계는 배경 신호를 감소시키기 위해 이색 필터, 장벽 필터, 공초점 핀홀, 렌즈 및 거울로 된 조합물을 포함한다. 표준 전체 장 광학계, 뿐만 아니라 공초점 광학계를 사용할 수 있다. 신호는 임의의 공지된 라만 검출기에 의해 검출될 수 있다.

라만 검출 유닛의 대안적인 예는 단일-광자 계수 방식으로 작동되는 갈륨-비화물 광전자 증배관 (RCA 모델 (Model) C31034 또는 벌 인더스트리스 모델 (Burle Industries Model) C3103402)가 구비된 스펙스 모델 (Spex Model) 1403 이중 격자 (double-grating) 분광 광도계를 포함하며, 미국 특허 제 5,306,403호에 개시되어 있다.

다른 예시적인 라만 검출 유닛은 레이저와 라만 검출기를 포함한다. 여기 빔은 적외선 부근 파장(750-950 nm)에서 티타늄:사파이어 레이저 (Tsunami, Spectra-Physics) 또는 785 nm 또는 365 nm 파장에서 갈륨 비소화 알루미늄 다이오 레이저(PI-ECL 시리즈, Process Instruments) 의해 생성된다. 펄스화된 레이저 빔 또는 연속 레이저 빔을 사용할 수 있다. 여기 빔은 이색 거울(홀로그래픽 노치 필터, Kaiser Optical 사, 또는 간섭 필터, Chroma 또는 Omega Optical 사)에 의해 반사되어 수집된 빔을 가지는 공선 기하학(collinear geometry)을 적용받는다. 반사된 빔은 현미경 대물렌즈 (Nikon LU 시리즈)를 통과하고, 바코드-결합된 표적이 위치하는 영역에 집속된다. 라만 분산광은 동일함 현미경 대물렌즈에 의해 수집되며, 이색 거울을 통과해 라만 검출기에 도착한다. 라만 검출기는 집속 렌즈, 분광기, 및 어레이 검출기를 포함한다. 집속 렌즈는 분광기의 입사 슬릿을 통해 라만 분산광을 집속한다. 분광기 (RoperScientific)는 빛을 이의 파장에 의해 분산시키는 그래팅을 포함한다. 분산된 광은 어레이 검출기 (후면 조사 방식의 심도 공핍(deep-depletion) CCD 카메라, RoperScientific 사) 상에 영상화된다. 어레이 검출기는 제어 회로에 연결되어, 이는 검출기 기능의 제어 및 컴퓨터로의 데이타 이송을 위해 연결된다.

대안적인 여기 공급원은 질소 레이저 (Laser Science Inc.) 및 헬륨-카드뮴 레이저 (Liconox) (미국 특허 제 6,174,677 호)를 포함한다. 여기 빔은 대역통과 필터 (Corion)를 사용하여 스펙트럼으로 정제될 수 있고, 6X 대물 렌즈(Newport, 모델 L6X)를 사용하여 집속시킬 수 있다. 대물 렌즈는 대상 분자를 여기시키고 라만 신호를 수집하는데 모두 사용될 수 있다 (Kaiser Optical Systems, Inc., 모델 HB647-26N18). 홀로그래픽 노치 필터 (Kaiser Optical Systems, Inc.)를 사용하여 레일리 (Rayleigh) 산란 방사를 감소시킬 수 있다. 다른 타입의 검출기, 예를 들면 하전된 주입 장치, 광다이오드 어레이, 또는 포토트랜시스터 (Phototransistor) 어레이를 사용할 수 있다.

다중 바코드와 관련된 대안적인 검출 시스템은 중첩된 바코드의 차이를 판독하는 것을 포함한다. 이들 바코드를 구별하는 한가지 방법은 표준 DSP(디지탈 신호 처리) 방법일 수 있는데, 이는 예를 들어, 신호 유닛 내의 다른 바코드 성분들 사이의 거리(여기로부터 파장 흡광도 또는 이동, 물리적 거리, 통과 전도성(tunneling conductivity))를 구분할 수 있다.

예를 들어 정상 라만 산란, 공명 라만 산란, SERS, 표면 증강 공명 라만 산란, 가간섭성 반스트로크 라만 분광법 (CARS), 자극된 라만 산란, 역전 라만 분광법, 자극된 이득 (gain) 라만 분광법, 초-라만 산란, 분자 광학 레이저 검사기 (MOLE) 또는 라만 미세탐침 또는 라만 현미경 사용법 또는 공초점 라만 미소분광법 (microspectrometry), 3차원 또는 스캐닝 라만, 라만 포화 분광기, 시간차 공명 라만, 라만 탈커플링 분광기 또는 UV-라만 현미경 사용법을 포함하는 라만 분광법의 임의의 적합한 형태 또는 형상 또는 당업계에 공지된 관련 기술을 사용할 수 있다.

초소형 전자 정밀 기계 시스템( Micro - Electro - Mechanical Systems , MEMS )

바코드 제조, 사용 및/또는 검출을 위한 장치가 더 큰 장치 및/또는 시스템에 포함될 수 있다. 특정 구체예에서, 장치는 초소형 전자 정밀 기계 시스템(MEMS)을 포함한다. MEMS 는 기계적 성분, 센서, 작동기, 및 전자부품을 포함하는 집적 시스템이다. 모든 이러한 성분들은 실리콘-기재의 또는 동등한 기질의 흔한 칩 상에서 마이크로 제조 기술에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어 Voldman et al., Ann. Rev. Biomed. Eng 1:401- 425, 1999). MEMS 의 센서 성분들이 바코드를 검출하기 한 기계적, 열적, 생물학적, 화학적, 광학 및/또는 자성 현상을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 전자부품들은 센서로부터의 정보를 처리할 수 있고 펌프, 밸브, 히터 등의 작동기 성분들을 제어할 수 있어서, MEMS 의 기능을 제어한다.

MEMS 의 전자 성분들은 집적 회로 (IC) 방법 (예를 들어, CMOS 또는 Bipolar 방법)을 이용하여 제조될 수 있다. 이들은 컴퓨터 칩 제조를 위한 포토리소그래피 및 에칭 방법을 사용하여 패턴화될 수 있다. 마이크로기계 성분들은 실리콘 웨이퍼의 일부를 선택적으로 에칭하여 제거하거나 또는 새로운 구조층을 추가하여 기계적 및/또는 전자기계적 성분들을 형성하는 양립성 "마이크로 기계 가공(micromachining)" 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

MEMS 제조에서의 기본적 기술은 기판 상에 물질의 박막을 증착하고, 일부 리소그래피 방법에 의해 필름의 상부에 패턴화된 마스크를 도포하고, 필름을 선택적으로 에칭하는 것을 포함한다. 박막은 나노미터 내지 100 마이크로미터의 범위일 수 있다. 사용될 수 있는 증착 기술은 화학적 방법 예컨대 화학적 기상 증착 (CVD), 전착, 에피탁시 및 열적 산화, 및 물리적 방법 예컨대 물리적 기상 증착 (PVD) 및 캐스팅을 포함할 수 있다. 나노전자기계 시스템의 제조방법도 사용될 수 있다 (예를 들어, Craighead, Science 290:1532-36, 2000 참조).

일부 구체예에서, 장치 및/또는 검출기는 다양한 유체 충전된 구획, 예를 들어 미세유체 채널 또는 나노채널로 연결될 수 있다. 이들 및 장치의 기타 성분들은 단일 단위, 예를 들어 칩 (예를 들어 반도체 칩) 및/또는 미세모세관 또는 미세유체 칩의 형태로 형성될 수 있다. 대안적으로, 개개의 성분은 별도로 제조되어 함께 결합될 수 있다. 이러한 칩에서 사용될 수 있는 공지된 임의의 물질, 예를 들어 실리콘, 실리콘 디옥시드, 폴리디메틸 실록산 (PDMS), 폴리메틸메타크릴레이트 (PMMA), 가소성 물질, 유리, 석영, 등이 개시된 장치에서 사용될 수 있다.

칩의 배치 제작 기술은 컴퓨터 칩 제조 및/또는 미소모세관 칩 제조 분야에서 잘 공지되어 있다. 이러한 칩들은 당업계에 공지되어 있는 방법, 예를 들면 사진 포토리소그래피 및 에칭, 레이저 절제, 사출 성형, 캐스팅, 분자 빔 에피탁시, 딥-펜 나노리소그래피 (dip-pen nanolithography), 화학 기상 증착 (CVD) 제작, 전자 빔 또는 집속 이온 빔 기술 또는 임프린팅 (imprinting) 기술에 의해 제조될 수 있다. 비제한적인 예는 통상적인 주조, 실리콘 디옥시드의 건식 에칭, 및 전자 빔 리소그래피를 포함한다. 나노전자기계적 시스템의 제조 방법을 본 발명의 특정한 실시양태에 사용할 수 있다 (예를 들면, 문헌[Craighead, Science 290: 1532-36, 2000] 참조). 미세제작된 칩은 예를 들면, Caliper Technologies Inc. (Mountain View, CA) 및 ACLARA BioSciences Inc. (Mountain View, CA)로부터 상업적으로 입수가능하다.

특정 구체예에서, 장치의 부분 또는 전체는 예를 들어 라만 분광법에 의한 바코드 검출에 사용되는 여기 및 방출 주파수에서 전자기 방사에 투명한 것으로 선택될 수 있다. 적절한 성분들은 물질 예컨대 유리, 실리콘, 석영 또는 임의의 기타 광학적으로 청명한 물질로부터 제조될 수 있다. 다양한 분석 대상물, 예를 들어, 핵산, 단백질 등에 노출될 수 있는 유체 충전된 구획들에 있어서, 이러한 분자들에 노출된 표면들은 예를 들어 표면을 소수성에서 친수성 표면으로 전환 및/또는 표면에 분자 흡수를 감소시키기 위해 코팅으로 개질될 수 있다. 흔한 칩 물질 예컨대 유리, 실리콘, 석영 및/또는 PDMS 의 표면 개질은 공지되어 있다 (예를 들어 미국특허 No. 6,263,286). 이러한 개질은, 예를 들어, 시판되는 모세관 코팅 (Supelco, Bellafonte, PA), 다양한 작용기를 가지는 실란으로의 코팅(예를 들어, 폴리에틸렌옥시드 또는 아크릴아미드, 등)을 포함할 수 있다.

특정 구체예에서, 이러한 MEMS 장치는 분자 바코드 제조, 비혼입된 성분들로부터 형성된 분자 바코드의 분리, 표적에 분자 바코드의 노출, 및/또는 표적에 결합된 분자 바코드를 검출하는데 사용될 수 있다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 설명하기 위해 포함된다. 당업자는 뒤따르는 실시예에 개시된 기술이 본 발명의 실시에서 잘 수행하기 위해 발명자들에 의해 발견된 기술을 나타내며, 따라서 이는 이의 실시를 위한 바람직한 양상을 구성하는 것으로 고려될 수 있음을 이해하여야 한다. 그러나, 당업자는 본 발명의 개시에 비추어, 개시된 특정 구체예에서 많은 변화가 행해질 수 있고 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 같거나 유사한 결과를 여전히 수득할 수 있음도 이해하여야 한다.

실시예 1. 분자 바코드의 라만 검출

도 3 은 부착된 라만 태그를 가지는 예시적인 단일 가닥 바코드를 도시한다.

예시적인 올리고뉴클레오타이드 서열 301, 302, 303, 304 은 표준 포스포라미다이트 화학에 의해 합성되었다. 광학 검출을 위한 태그를 형광 염료 ROX (카르복시-X-로다민) 310; PAM (6-카르복시플루오레세인) 320; 및 TAMRA (테트라메틸로다민) 330 을 포함하는, 올리고뉴클레오타이드에 부착시켰다. 각 바코드에 부착된 염료 태그의 위치 및 확인은 도 3 에 나타난 바와 같다. 아민기를 합성 동안 3개의 올리고뉴클레오타이드 302, 303, 304 의 5' 말단에 부착시켰다.

실시예 2. 분자 바코드의 라만 스펙트럼

도 3 에 보여진 분자 바코드를 SERS 를 거치게 하였다. SERS 방출 스펙트럼은 도 4 에 나타나 있다. 은 콜로이드 및 LiCl 존재하의 지시된 바코드(301,302,303,304)의 1 μM 용액의 220 ㎕ 를 함유하는 샘플을 100 ms 동안 레이저 빔에 노출시키고 표면 증강 라만 스펙트럼을 기록하였다. 스펙트럼 약 1000 COD 계수 단위까지 차감 계산하였다. 도 4 에서 보여진 바와 같이, 3개의 분자 바코드(302,303,304)가 동일한 올리고뉴클레오타이드 서열 302, 303, 304 상의 다른 위치에 부착된 동일한 라만 태그(330)를 함유하고 있지만, 4개의 각 분자 바코드(301,302,303,304)는 식별가능한 라만 방출 스펙트럼을 생성하였다. 이는 개시된 방법을 이용하여 식별가능한 분자 바코드를 생성할 수 있는 이용 가능성을 증명한다.

실시예 3.

뉴클레오타이드에 부착된 일부 예시적인 라만 태그에 의해 생성된 SERS 스펙트럼 801 802 803 804 805 806 은 도 8 에 나타나 있다. 각 라만 태그로부터 생성된 스펙트럼 패턴 801 802 803 804 805 806 은 용이하게 식별가능하다. 은 콜로이드 및 LiCl 존재하의 1 μM 바코드 용액의 220 ㎕ 를 함유하는 샘플을 100 ms 동안 레이저 빔에 노출시키고 표면 증강 라만 스펙트럼을 기록하였다. SERS 방출 스펙트럼이 폴리T[NeBu]T 801; 폴리T[EthdA]T 802; 폴리 T[8Br-dA]T 803; 폴리 T[ 2AmPur]T 804; [ThiSS] 폴리 TdA 805 및 [5Acrd]폴리dG [AmC7] 806 에 대해 보여진다.

실시예 4.

본 발명의 예시적인 구체예가 설명된다. 핵산 서열은 도 5 및 도 6/7 에 도시된 바와 같은 디코딩 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 코드 성분 라이브러리 또는 라이브러리들 (도 6, 601 602 603 604)은 라이브러리의 각 성분들이 성분(예를 들어 3-mer)을 특이적이고 독특하게 확인하는 부착된 라벨 (예를 들어 라만 태그)를 가지도록 생성될 수 있다. 핵산은 성분 라이브러리 또는 라이브러리들로 인큐베이트되어 표적 서열 605 에 프로브의 혼성화를 허용한다. 혼성화된 핵산은 이들이 여기 공급원 및 검출기를 지나서 흐르는 미세유체 채널을 통해 조작된다. 코드 성분의 방출 스펙트럼은 검출될 수 있거나 데이터 처리 시스템에 다시 놓여질 수 있다. 핵산의 서열은 방출 스펙트럼과 방출 스펙트럼이 검출되는 순서를 라벨과 결합된 코드 성분에 대한 스펙트럼의 데이터베이스와 비교함으로써 측정할 수 있다.

예를 들어, 조직 샘플은 질병의 의심이 가는 대상으로부터 수득할 수 있다 (예를 들어 샘플 또는 가능하게는 혈액 샘플의 생체 검사에 의해). 단일 세포 현탁액은 당업계에 공지된 기술에 의해 생성될 수 있으며 세포는 내용물의 방출을 위해 일부 막 붕괴 버퍼 중 하나로 용해된다. 핵산은 당업계에 공지된 방법으로 단리된다 (예를 들어 페놀/클로로포름 추출, 겔 정제 등).

정제된 핵산 분자는 나일론 막, 96-웰 마이크로타이터 플레이트 또는 기타 고정화 기질에 부착시켜 고정화된다. 코드 성분은, 예를 들어, 한번에 또는 수회에 고정화된 핵산에 도입되며 기결정된 농도 (NaCl 함량)의 버퍼에서 분자와의 상호작용이 허용된다. 코딩된 프로브는 표적 핵산에의 혼성화가 허용된다. 하나 이상의 제1 코드 성분의 혼성화 후, 부가적인 코딩된 성분이 추가될 수 있다. 비혼성화된 코드 성분 및 서로 혼성화된 코드 성분은 광범위한 세척에 의해 제거되어, 고정화된 핵산에 혼성화된 코드 성분만이 남는다. 이후 코드 성분은 연속적으로 제거되고 코드 성분에 매치되는 핵산 서열을 디코딩함으로써 판독된다. 전체 또는 일부 서열이 목적하는 말단 지점에 따라 결정될 수 있다. 이 정보는 시험되는 질병에 대해 공지된 정보와 비교될 수 있으며 특정 서열의 존재 또는 부재는 대상 질병에 관련된 개체의 상태를 결정할 수 있다. 한 예에서, SNPs (단일 뉴클레오타이드 다형)은 질병과 공존하는 것으로 확인될 수 있어 고정화된 핵산의 완전한 시퀀싱이 불필요하다.

대안적으로, 하나 이상의 코드 성분은 표면 예컨대 96-웰 플레이트 상에 고정화될 수 있으며 이들은 예컨대 특정 유전자형 등을위한 마커인 공지된 SNP, 삽입 또는 결실과 같은 표적 서열을 포함하는 해당 핵산 분자를 포획하는데 사용될 수 있다. 표적 서열의 신속한 확인은 라만 라벨과 같은 태그의 민감도에 기인하여 가능할 수 있다.

실시예 5.

본 발명의 한 예시적인 구체예가 설명된다. 단백질 또는 펩타이드 (예를 들어 희귀 조절 단백질 등)는 상기 거론된 바와 같이 정제될 수 있다. 정제된 단백질/펩타이드는 이후 당업계에 잘 공지된 기술 (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988)에 의해 항체 (단일 클론 항체도 당업계에 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다)를 생성하는데 사용된다. 항원의 반응성은 예컨대 프로이드(Freund)의 완전한 또는 불완전한 보조제와 같은 공동 투여되는 보조제로 인해 증가될 있다. 항원성은 예컨대 소 혈청 알부민 또는 키홀 림펫 에모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)과 같은 담체에 항원을 결합시켜 증가될 수 있다. 동물의 면역 반응은 항원의 부스터(booster) 주사를 주기적으로 투여함으로써 증가될 수 있다. 항체 1206 은 동물의 혈액으로 분비될 수 있고 출혈 또는 심장 채혈로 수득될 수 있다. 항체 1206 는 혈액 응집, 원심분리, 여과 및/또는 면역친화성 정제 (예를 들어, 항 래빗 항체) 또는 친화성 크로마토그래피 (예를 들어 단백질-A 세파로스 컬럼 크로마토그래피)와 같은 잘 공지된 방법에 의해 기타 혈액 성분으로부터 분리될 수 있다. 이러한 항체들은 이후 도 12 에 도시된 중합성 라만 라벨된 항체 중 임의의 하나와 결합 (예를 들어 공유적으로)될 수 있다. 중합성 라만 라벨된 항체는 이후 많은 분자들의 추출물로부터 단백질을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 중합성 라만 라벨된 항체는 단백질의 활성을 방지하고, 질병 등과 관련된 단백질을 확인하기 위한, 확인 목적으로, 추가로 대상 단백질의 연구를 목적으로 분자의 추출로부터 일부 동일한 단백질을 단리시키는데 사용될 수 있다. 중합성 라만 라벨된 분자 (예를 들어 중합성 라만 라벨된 Ab)는 쉽게 검출되기 때문에, 이 또한 질병의 존재 및/또는 정도에 접근하기 위해 진단 목적으로 사용될 수 있다.

실시예 6. 도 5-7 에 도시된 기술을 이용한 핵산 서열 확인:

한 구체예에서, 핵산은 하나 이상의 라만 태그를 이용하여 개질될 수 있다. 다수의 작고 독특한 라만 태그가 이용가능하다. 한 예에서, 강하고 독특한 라만 서명을 가지는 일부 아데닌 유사체가 도 13 에 도시되어 있다 (다른 것들은 도 8 에 도시됨). 한 예에서, 라만 태그는 하나 이상의 염기 변형을 통해 핵산에 연결될 수 있고 이후 이러한 개질된 염기들은 올리고뉴클레오타이드의 화학적 합성을 위한 포스포르아미다이트를 제조하는데 사용될 수 있다. 개질된 염기의 포스포르아미다이트는 당업계에 공지된 기술로 제조될 수 있다 (McBride, L.J. and Caruthers, M.H. (1983) "An investigation of several deoxynucleoside phosphoramidites useful for synthesizing deoxyoligonucleotides." Tetrahedron Lett. 24:245-248).

한 구체예에서, 코드 성분은 약 10-20 염기 길이로 이루어질 수 있다. 10-mer 에 있어서, 이는 4^10 의 가능한 서열일 수 있으며 20-mer 에 있어서는 이는 4^20 의 가능한 서열일 수 있다. 실제적인 적용에서, 표적 서열은 공지되거나 또는 서열은 서열의 하위 세트로 나누어질 수 있다. 따라서, 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어 하나 이상의 라만 태그로 라벨되어 확인될 수 있다. 한 예에서, 10개의 다른 포스포르아미다이트가 사용될 수 있다면 (각각 다른 라만 태그를 가짐); 합성된 올리고뉴클레오타이드 서열 당 1개의 라만 태그가 존재한다면 10개의 다른 올리고가 합성될 수 있고; 합성된 올리고뉴클레오타이드 서열 당 2개의 라만 태그가 존재한다면 55개의 올리고뉴클레오타이드가 합성될 수 있으며, 합성된 올리고뉴클레오타이드 당 3개의 라만 태그가 존재한다면 175개의 올리고가 합성될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드(코드 성분) 합성을 위한 포스포르아미다이트가 사용될 수 있으며 이러한 방법들은 당업계에 공지되어 있다. 한 예에서, 한 성분은 태그로서 키네틴 (KN)을 가지는 ATGCGACGT (서열번호 3) (도 13)일 수 있고, 다른 성분은 태그로서 벤조일-아데닌 (BA)을 가지는 GCTATAGCCG (서열번호 4)일 수 있다. 많은 바코드 성분들은 나중에 사용을 위해 미리 제조되어 저장될 수 있다.

한 구체예에서, 바코드는 하기 방법으로 제조될 수 있다. 바코드는 일부 코드 성분들로부터 어셈블링될 수 있다. 바코드 주형은 상대적으로 긴 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 표준 포스포라미다이트 화학으로 합성될 수 있는 40 뉴클레오타이드의 DNA 단편일 수 있다:

5'ACGTCGCATT - CGGCTATAGC-TTTCTATAGCGCTATGGTAC 3' (서열번호 5)

상기 예에서 밑줄친 부분은 컨테이너 섹션일 수 있고 기타 서열은 프로브 섹션일 수 있다. 바코드 성분 5'-ATGCGACGT(KN)-3' (서열번호 3) 및 5'-GCTATAGCCG (BA)-3' (서열번호 4)는 표준 조건(예를 들어, 200mM NaCl의 존재 하에서 1 내지 10 μM의 올리고뉴클레오타이드 농도, 10 mM TrisHCl, pH 7.5 및 1 mM EDTA) 하에서 컨테이너 섹션에 혼성화될 수 있다 . 따라서, 상기 예에서 프로브 섹션은 2-바코드 성분으로 나타내며 이의 라만 서명은 라만 태그로서 키네틴 및 벤조일-아데닌 모두에 의해 측정된다. 다른 바코드 주형을 합성하기 위해, 프로브 섹션 및 컨테이너 섹션은 대응되게 변화할 수 있다; 다른 바코드 성분 (미리 제조된)은 새로운 바코드를 형성하기 위해 함께 혼성화될 수 있다.

상기 기술은 예를 들어, 감염성 병원체에 해당하는 DNA 또는 RNA 의 존재를 분석함으로써 감염성 병원체를 검출하는데 사용될 수 있다. 샘플을 수집하고 공지된 기술로 샘플로부터 핵산을 추출한 후, 핵산은 소화 (예를 들어 제한 효소, 제한된 DNase 소화, 등) 및 바이오티닐화-ddNTP (Perkin Elmer Life Sciences)의 존재 하에서 Terminal Transferase (New England Biolabs 에서 입수가능)에 의해 바이오틴으로 말단-라벨될 수 있다. 겔 여과 컬럼 (Amersham-Pharmacia Biotech)에 의해 유리 뉴클레오타이드를 제거 한 후, 바이오티닐화 DNA 는 스트렙타비딘-코팅된 자성 비드 (Roche) 상에서 포획될 수 있다. 이후 핵산은 0.1N NaOH (DNA 를 위한)로 변성되어 2개의 상보적 가닥을 분리시킨다. 표적 분자를 중화시킨 후, 바코드 분자를 상보적 서열을 결합시키기 위해 도입할 수 있다. 결합/세척 버퍼의 한 예는 200mM NaCl, 10 mM TrisHCl, pH 7.5 및 1 mM EDTA 이다. 자석 (Dynal Corp)이 당업계에 공지된 방법에 의한 입자 조작을 위해 사용될 수 있다.

한 예에서, 바코드의 프로브 섹션은 표적 서열, 예를 들어, 5' GTACCATAGCGCTATAGAAA 3' (서열번호 6)에 상보적이고, 바코드 분자는 표적 서열에 결합할 것이며 따라서 상기 예에서 자석에 의해 유지될 수 있다 (Dyna 비드, Dynal). 비드는 은 콜로이드 (물로 1:2 희석된, 1mM AgNO3 으로부터 제조됨), 및 0.1 M LiCl (최종 농도)와 혼합될 수 있다. 입자가 라만 검출기를 통과하는 경우, 라만 신호 (KN 및 BA)는 바코드 분자와 특이적으로 결합하여 검출될 수 있다. 상기 예에서 정보가 하나 이상의 샘플 내에서 특정 감염성 병원체의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 사용될 수 있다.

실시예 7

단백질 검출을 위한 바코드-항체

다른 구체예는, 실시예 6 에서와 같이 라만 태그된 바코드의 제조를 포함하지만, 바코드는 이후 항원 검출을 위한 항체에 부착될 수 있다 (예를 들어 단백질). 따라서, 바코드 제조가 이루어지며 DNA-태그된 항체가 제조될 수 있다. 예를 들어, IgG 항체 (예를 들어 200 ㎍ (1.33 nmoles))는 37℃ 에서 30분 후, 실온에서 30분 동안, 0.1x PBS (10x PBS 희석, Ambion 사로부터 입수가능)의 200 ㎕ 중 20 ㎍ (52 nmoles)의 설포-GMBS (Pierce Cat. No. 22324)를 이용하여 활성화될 수 있다. 이후 상기 용액을 PD-10 컬럼 (Amersham-Pharmacia)에 통과시켜 항체-함유 분획을 수집하였다. 티올 개질된 DNA 올리고를 상업적 공급원(Qiagen-Operon)에 의해 합성할 수 있다. 상업적 공급원의 지시에 따라 이황화 결합을 감소시킨 후 (예를 들어 DTT 처리), DNA 올리고 (예를 들어 13 nmoles)를 정제되고 활성화된 항체와 혼합하였다. 반응을 실온에서 2시간 동안 4℃에서 밤새 처리하도록 하였다. DNA-항체는 이후 예를 들어 0-2M NaCl 그래디언트를 이용한 이온 교환 컬럼 (Amersham-Pharmacia)으로 정제될 수 있다. DNA 및 단백질 모두를 포함하는 분획을 수집하였다. 샘플은 당업계에 공지된 기술을 이용한 탈염 및 농축 처리 후 항원 결합 (단백질 검출)을 위해 준비하였다.

일부 방법이 고체 지지체 상에 항원 (예를 들어 단백질)을 고정화시키는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 라만 검출을 위해, 포획된 항체 (항체 포획 및 항체 검출은 상업적 공급원, 예컨대 R&D System 및 BD Biosciences으로부터 입수가능한 동일한 항원을 인식해야 한다)는 EDC 화학을 이용하여 금 표면 상에 고정화될 수 있다 (Benson et al, Science, 193, (2001), 1641-1644). 표적 항원을 포함하는 샘플 (예를 들어 단백질)은 1xPBS 중에서 희석된 후 특이적 결합을 위해 고체 표면에 도포될 수 있다. 예를 들어 DNA-태그된 항체는 포획된 항원 (예를 들어 단백질 표적)에 결합하는 것이 허용될 수 있다. 이후 표준 면역분석 절차를 보통 1xPBS 및 0.05% Tween-20 을 이용하여 뒤따를 수 있다. 일단 결합이 되면, 상보적 라만-태그된 DNA 는 검출 항체에 부착된 고정화된 DNA 올리고에 결합하는 것이 허용될 수 있다. 보통, 바코드 분자는 2xPBS 및 1□g/ml 효모 tRNA (Sigma) 중 10 nM 농도일 수 있다. 1xPBS 로 세척 후, 은 콜로이드 (물로 1:2 희석된, 1mM AgNO3 으로부터 제조)를 결합 표면에 추가할 수 있고, 라만 측정 후 LiCl 을 이후 0.1M 까지 첨가한다. 항체에 부착된 DNA 올리고가 바코드의 프로브 섹션에 상보적이기 때문에, 바코드 서명의 존재는 항체의 존재 따라서 표적 항원의 존재를 지칭할 것이다. 다른 포획된 항체 및 DNA 태그된 검출 항체가 동일한 시스템에 사용되는 경우 일부 다른 항원들은 상기 방법에 의해 동시적으로 검출될 수 있다.

* * *

본 명세서에 개시되고 청구된 모든 방법, 조성물 및 장치는 본 발명의 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이 제조되고 실시될 수 있다. 본 발명의 청구된 대상의 개념, 실시 사상 및 범위로부터 벗어남이 없이 본 명세서에 기재된 방법, 조성물 및 장치에 변형이 적용될 수 있다는 것이 당업자에게 명확히 이해될 것이다. 더욱 구체적으로, 동일한 또는 유사한 결과를 달성하면서 본 발명에 기재된 제제들을 화학적으로 및 생리학적으로 양쪽 모두 관련된 특정한 제제들로 치환할 수 있다는 점이 명확히 이해될 것이다. 당업자에게 자명한 이러한 모든 유사한 치환 및 변형은 본 발명의 청구된 대상의 개념, 실시 사상 및 범위 내에 속하는 것으로 간주된다.

Claims

유기 분자 백본에 부착된 두개 이상의 태그를 포함하는 바코드를 수득하는 단계;

바코드를 표적에 결합시키는 단계; 및

표적에 결합된 바코드를 검출하는 단계

를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 백본은 핵산, 펩타이드, 다당류, 생중합체 및 합성 중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분자를 포함하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 핵산은 단일 가닥 DNA 인 것인 방법.
제2항에 있어서, 백본은 펩타이드에 공유결합된 핵산을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 태그는 핵산, 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 염기 유사체, 형광 염료, 펩타이드, 아미노산, 개질된 아미노산, 유기기, 라만 태그, 양자점, 탄소 나노튜브, 풀러렌, 마이크로미터 이하의 금속 입자, 고 전자 밀도 입자 및 결정성 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 백본은 하나 이상의 분지형 핵산을 포함하는 것인 방법.
제6항에 있어서, 분지는 백본을 따라 기결정된 부위에 위치하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 바코드는 형광 분광법, 라만 분광법, 퓨리에 변환 적외선 분광법 (FTIR), 및 표면 플라즈몬 공명으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술에 의해 검출되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 바코드는 프로브기를 통해 표적에 결합하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 식별가능한 바코드는 동일한 백본을 따라 다른 부위에 동일한 태그의 부착에 의해 생성되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 표적은 단백질, 펩타이드, 당단백질, 지질단백질, 프라이온, 핵산, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 지질, 지방산, 탄수화물, 당지질, 인지질, 스핑고지질, 지질다당류, 다당류, 진핵세포, 원핵세포, 박테리아, 파지, 바이러스 및 병원균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
컨테이너 섹션 및 프로브 섹션을 포함하는 핵산 주형을 수득하는 단계; 및

하나 이상의 태그된 올리고뉴클레오타이드를 컨테이너 섹션에 혼성화시켜 바 코드를 생성하는 단계

를 포함하는 방법.
제12항에 있어서, 바코드를 표적에 결합시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제13항에 있어서, 표적에 결합된 바코드를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
두개 이상의 단량체 단위를 수득하는 단계; 및

단량체 단위를 중합하여 중합성 라만 라벨을 제조하는 단계

를 포함하는 중합성 라만 라벨의 제조 방법.
제15항에 있어서, 각 단량체 단위는 라만 태그를 포함하는 것인 방법.
제16항에 있어서, 단일 중합성 라만 라벨 중의 각 라만 태그는 다른 것인 방법.
제16항에 있어서, 라만 태그는 스페이서기를 통해 중합성 라만 라벨의 백본에 부착되는 것인 방법.
제15항에 있어서, 라만 태그는 단량체 단위의 중합 후 중합성 라만 라벨에 부착되는 것인 방법.
제15항에 있어서, 단량체 단위의 한 말단에서 작용기를 탈보호시키는 단계 및 단량체 단위와 중합성 라만 라벨 사이에 공유결합을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제15항에 있어서, 기결정된 수의 단량체 단위를 함유하는 서브중합성 단위를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제15항에 있어서, 중합성 라만 라벨을 고형 지지체에 부착시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제22항에 있어서, 고형 지지체는 나노입자 또는 비드인 것인 방법.
제15항에 있어서, 프로브를 중합성 라만 라벨에 부착시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제24항에 있어서, 프로브를 표적에 결합시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제25항에 있어서, 표적에 결합된 프로브를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
함께 공유 결합된 두개 이상의 단량체 단위;

두개 이상의 라만 태그; 및

하나 이상의 프로브

를 포함하는 중합성 라만 라벨.
제27항에 있어서, 중합성 라만 라벨에 부착된 나노입자 또는 비드를 추가로 포함하는 것인 중합성 라만 라벨.
제27항에 있어서, 라벨 중의 각 라만 태그는 다른 것인 중합성 라만 라벨.
제27항에 있어서, 각 라만 태그의 두개 이상의 복사본을 추가로 포함하는 것인 중합성 라만 라벨.
영상 기구;

프로브에 결합된 하나 이상의 바코드; 및

프로브에 결합된 하나 이상의 표적

을 포함하는 시스템.
제31항에 있어서, 영상 기구는 형광 기구, 라만 기구, 및 FTIR 기구로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
제31항에 있어서, 각 바코드는 두개 이상의 라만 태그를 포함하는 것인 시스템.
제33항에 있어서, 단일 바코드 중의 각 라만 태그는 다른 라만 방출 스펙트럼을 가지는 것인 시스템.