CN101918590A - 核酸测序 - Google Patents

Abstract

本发明涉及核酸序列分析领域。更具体地说，本发明涉及到高通量平行DNA测序的方法与设备。本发明同时提供一种筛选分析样品序列的方法，用于富集靶序列或去除特定分子，尤其是测序样品中不需要的序列模板。

Description

核酸测序

参照相关应用

本发明请求美国临时申请的优先权，编号为61/012,468，于2007年10月10日申请。其文纳入这里作为参照。

发明领域

本发明涉及核酸序列分析领域。更具体地说，本发明涉及到高通量平行DNA测序的方法与器件。本发明同时提供一种方法筛选样品中的序列，用于富集靶序列或去除特定分子，尤其是测序样品中不需要的序列模板。

背景技术

DNA基因组为基础生物学系统提供编码，RNA转录组为蛋白质和其它功能上具有科研价值的RNA元件提供足迹。DNA/RNA测序领域对解密这些系统来说是至关重要的，因此在过去几十年里测序经历了指数型增长。几种新一代测序技术的发明不仅刺激了megabase通量的发展，同时还刺激了与基因组和转录组相关的多种应用的发展，如全基因组快速测序和重测序，SNP检测，长链DNA基因突变分析(表观遗传学分析)，small RNA、ncRNA、蛋白质和具有重要生物学意义的RNA分子的检测与表达谱分析，加速了基因组学和基因组学领域的发展。这些更加深入和全面的遗传学和转录组分析可以应用于基础研究(功能鉴定，通路构建，相互作用图谱，系统生物学，生态进化，疾病机理研究等)也可以应用于临床领域(疾病早期检测、预测、预防和治疗的生物标记)。在微阵列独占鳌头的领域里，测序的应用正在逐渐增多。

Sanger测序法(Sanger et al.(1975)J.Mol.Biol.94，441-448；Sanger etal.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,5463-5467；Sanger et al.(1977)Nature 265，687-695；Maxam et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,560-564；Szekely et al.(1977)Nature 267，104)已经是人类基因组测序(Lander et al.(2001)Nature 409，860-921；Venter et al.(2001)Science 291，1304-1351；International Human Genome Sequencing Consortium(2004)Nature 431，931-945；Levy et al.(2007)PLoS Biol 5，e254)之后的主力，相比于其它测序方法，它的优势是读长更长(常规读长达到700bp)，精确度更高(单通道精确度达到99.0％)，操作简单，结果可靠。该方法包括样品以及通常PCR产物或扩增子的制备；随后，扩增子通过测序反应，如AB’s BigDye terminator cycle reaction，DNA聚合酶用dNTP和少量(～1％)2’，3’-双脱氧-ddNTP终止子结合，通过碱基识别延伸链长。以上反应生成一系列长度相差一个核苷酸的链终止DNA片段，并带有终止荧光染料结合产生的荧光标记。利用时间板(time slab)或过后用毛细管电泳分离混合序列，利用垂直的激光或光线照射进电泳束来检测单个碱基交错长度的读序，信号由光电倍增器或CCD器件获取，并以色谱图表示来产生base calls。用高温下的线性聚丙烯酰胺成分混合物和优化的电场在1个到2个小时内以低误码率(精确度＞99％)检出超长序列(1,000-1,300bp)(Zhou et al.(2000)Anal Chem 72，1045-1052；Carrilho etal.(1996)Anal Chem 68，3305-3313)。在自动测序仪中，AB(AppliedBioSystems)96通道毛细管电泳(CE)分析的一次运行可生成96×700，或67.2Kbp碱基对读序(表1)。一些国立人类基因组序列中心，如BaylorHuman Genome Sequencing Center和Washington University GenomeSequence Center，已经以ABI的测序仪为主力完成了人类基因组或大规模测序；每台仪器的价格是35万美元(AB 3730xl 96毛细管测序仪)。

自动化的ABI毛细管电泳测序仪包含一个由8，24或96个毛细管通道组成的1D毛细管阵列。检测是从阵列的侧边开始的。1D阵列能分析的样品数量是有限的。专利WO 2007/084702介绍了生物分子的测序、分离、检测和鉴定所使用的方法与器件。针对DNA测序，专利说明书中介绍了一种基于循环合成测序的系统，反应在微珠上的三维容器里进行，使用整体(monolithic)毛细管阵列进行检测。说明书中介绍了利用量子点和多种冷光(luminescence)标记进行检测。说明书介绍了从整体式多重毛细管阵列的管道中通过的微珠中检测荧光信号。利用激光或LED作为照明源和快速CCD相机作为检测器件，可在阵列顶端实时检测单个微珠。

科研人员一直在努力将PCR、样品制备、毛细管电泳和信号检测的器件小型化、集成化(Dolnik et al.(2000)Electrophoresis 21，41-54；Liu et al.(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97,5369-5374；Blazej et al.(2006)Proc NatlAcad Sci USA 103,7240-7245；Liu et al.(2006)Anal Chem 78，5474-5479；Blazej et al.(2007)Anal Chem 79，4499-4506；Kumaresan et al.(2008)AnalChem 80，3522-3529；Liu et al.(2007)Anal Chem 79，1881-1889)。在他们的优化配置里，微加工芯片可以以attomolar的灵敏度快速(几分钟至1到2小时)检测300bp到kbp长度的DNA片段。在一个四个扩增样品的试验中，轻便型的PCR-CE器件已经可以检测20个拷贝的DNA。因为传统的CE过程可以更进一步的小型化，灵敏度也可以进一步的提高，提高测序容量是很有希望的，Sanger测序法遇到的瓶颈是缺少工具而无法满足gigabase测序需求。基因组测序的主力军曾是Sanger测序法。该方法包括样品，通常还有PCR产物或扩增子的制备。之后，扩增子通过经过一个测序反应(即AB’s BigDye terminator cycle reaction)，DNA聚合酶用dNTP和2’，3’-双脱氧-ddNTP终止子结合，生成早期链终止DNA片段。以上反应混合物用电泳法分析和用色谱图表示测序结果。在自动的测序仪中，一次ABI的96通道毛细管电泳(CE)分析可以生成总共96×700，或67个千碱基(kbp)读序。基因组规模或大规模的测序曾经需要大量的测序仪，每个测序仪耗费$350,000才能完成(ABI 3730xl 96Capillary Sequencer)。在CE测序中，需要为每条序列制备测序样品，再加载到96孔板上。曾有报道称芯片上的CE可以得到更快、更简单的结果，但是操作模式基本上与自动CE测序仪相似。使用传统方法的基因组测序工作需要上百万美元的器件，数天的时间和5百万到1千万美元的材料消耗。另外，随着序列数量的增长，PCR和荧光终止序列反应的数量也随之增长。处理大量的反应所需的自动化设备和样品处理及储存代价高昂。很明显，为了解决DNA分析的许多应用，通过技术革明显降低测序的经费和提高DNA读序速度是十分有必要的。

包括美国专利6,210,891，7,264,929和7,335,762在内的许多文献和专利中都报道了焦磷酸测序。在焦磷酸测序中，模板是由附着在PTP孔板内的一百万到两百万个微珠内通过乳液PCR进行制备。带有磺化酶和荧光素酶的小微珠向内附着在模板微珠的周围，继而单独的脱氧磷酸核苷酸(dNTP)分布在孔室之间。当与模板链互补的一个dNTP结合到延伸的链中时，释放出一个焦磷酸(ppi)并转化成ATP。ATP将荧光素氧化成氧化荧光素，发出荧光。探测器检测到释放出的荧光并将此关联到dNTP的结合。这一技术可以达到将近400碱基的读长，并且可以检测约为6个碱基的均聚物。该技术易受插入或缺失错误的影响。

许多文献和专利中都报道了连接法测序，包括美国专利5,912,148和6,130,073。在连接法测序中，载玻片表面附着了近一千万个乳液PCR模板微珠，通用引物退火，与模板杂交。探针包含2个讯问碱基(interrogationbases)，结合了特定染料的讯问碱基(interrogation bases)杂交到模板上，与靶序列互补的被退火。用4种不同的染料标记探针中16种不同的二核苷酸。在以4种颜色成像后，通过化学方法剪切连接的二核苷酸并生成磷酸基团。杂交、链接、成像和剪切共循环重复7次，鉴定正确的双碱基序列。接下来，从模板上切下通用引物，用5’端带有一个未知碱基的n-1引物进行进行第二轮连接。再次进行7次杂交、连接、成像和剪切的循环和3次剪切和连接的过程，产生以颜色区间编码的一系列35数据位。这些数据与相应的基因组进行比对来解析DNA序列。该技术的局限性是读长有限，35个碱基，而且易发生替代错误。

另外还有2种技术利用可逆终止子来实现DNA测序。首先，在载玻片的8个通道之间进行随机的DNA片段的桥式扩增，高密度分布正向和反向引物共价结合。固相扩增共生成约8千万个来自于同一条模板链的分子簇。引物退火，与每个分子簇的模板的自由端结合。通过聚合酶开始延伸链，并在四种带有不同染料的可逆终止子的作用下终止DNA合成。洗脱未结合的可逆终止子，通过4种颜色的成像鉴定连接的碱基。利用化学剪切可除去封闭和荧光基团，进而进行另一个循环。该技术的局限性是读长有限-35个碱基，而且易于发生替代错误。

利用可逆终止子的第二种技术中，将poly(dA)尾巴与poly(dT)引物杂交，共价结合到载玻片上，得到数十亿个未经扩增的ssDNA模板。在第一轮测序中，引物-模板的复合体是足够的，但是在第二轮测序中，模板链被复制，原始模板被除去，退火引物直接连接到表面。与第一种可逆终止子技术不同，这里的可逆终止子全部用相同的染料标记，并按照预先设定的顺序进行单独供应。每次结合都会发出一个荧光信号。美国专利7,169,560介绍了使用这一可逆引物技术的方法。如果没有使用单个分子然后调整相位，一个给定分子簇中的数千个拷贝的模板不能有效的延伸它们的引物，无法延伸将会成为问题。该技术的局限性是读序较短，25个碱基，且易于发生缺失错误。

通过荧光共振能量转移(FRET)分子标记的DNA聚合酶与磷酸末端带有FRET分子标记的同源dNTP结合时，释放的FRET信号测序。当标记的dNTP与模板链互补时便会结合，FRET由于两个FRET分子的相互作用可指示碱基延伸过程，形成测序读序。该方法的优势是可实时记录DNA聚合反应和合成未经任何修饰的普通DNA分子，因此在美国专利申请[Hardin等，美国专利7,329,492；Korlach等，美国专利7,361,466]和Eid J等人的文章(2008)[PMID：19023044]中报道了更长的DNA读序。尚未经过证明，这些方法可用于测定一个DNA分子碱基的完整信息。

为提高速度并降低费用，科研人员研发了通过杂交、合成(3’延伸)、连接、克隆聚合(polony polymerization)、纳米孔、聚合酶结合染料标记的dNTP和其他的DNA测序方法。DNA测序技术的高速发展(如454的高通量焦磷酸测序(454Life Sciences)(Margulies et al.(2005)Nature 437，376-380；Wheeler et al.(2008)Nature 452，872-826；Ronaghi，et al.(1996)Anal Biochem 242，84-89；Ronaghi et al.(1998)Science 281，363-365)，Illumina/Solexa的表面单克隆合成测序(Illumina)(Margulies et al.(2005)Nature 437，376-380；Wheeler et al.(2008)Nature 452，872-826)，ABI的SOLiD技术(“Supported Oligonucleotide Ligation and Detection”，AppliedBiosystems))(Cloonan et al.(2008)Nat Methods 5，613-619)，基因组学分析，生物信息学技术给研究人员获得复杂的生物学系统中深度的分子图谱带来了可能。

从技术上讲，下一代测序技术通过以下几点简化和加快了测序过程：a)去除了传统测序样品制备中所需的单独克隆；b)平行制备数百万个需要分析的序列；c)同时检测数百万个测序信号。然而，大规模测序技术存在着以下几个常见的缺点，包括：d)每个dNTP的增加都需要逐级(循环)反应，限制了测序方法的读长(表1和Solexa和SOLiD测序的读长都均无法超过100bp)；e)循环反应同时还限制了全长测序的速度。Solexa测序每个步骤需要超过2小时的时间，添加35个核苷酸共需要2天或更长的时间，SOLiD则需要2倍的时间；f)某些途径需要对dNTP进行修饰，这些修饰进一步增加了费用并带来如材料在储存和使用过程中的稳定性等问题；g)454不能处理基因组中的重复序列；h)测序读序的质量大约10％的序列质量很差；i)利用短读序的全基因组测序需要进行深度测序，最长可能20x。特别是现有的技术不能提供足够长的碱基读长。现有的下一代测序方法的碱基读长过短而不能保证稳定的高精确度的组装长链DNA用于重测序和新基因组的全基因组测序。一个长度为20-30个碱基的DNA可能会在一个基因组中出现多次，因此它们的计数(counts)与基因组内的丰度或重复出现(multiple presences)无法区分。此外，某些基因组，例如人类，存在许多的重复序列，在这种情况下，不能确定大于30bp的碱基读长的精确基因组定位。因此当下迫切需要提高新的超快测序技术的能力，使碱基读长至少能达到或高于Sanger测序法这样的传统测序技术。我们可以想象，这样的测序技术将会在测序技术在需要更可靠的定量测定DNA或RNA拷贝的研究中大幅度的扩大，以及会大幅度的扩大依赖于较长序列信息的测量(如新基因组测序和高度突变或反式剪接编码序列研究)中的应用范围和规模。这样的技术进步同样会减少数据分析所需的时间，优势是节省时间或全通量提高。

因此，为实现DNA序列分析在人类医疗和基础生命科学研究中的全部潜力，这些技术即使具有上述的各种改进，也仍有几个方面有待提高，

其次，靶向测序仍需改进。上述的几种新测序方法随机选取扩增子，所以整个总体有限(如利用454焦磷酸测序检测到25/48barcode序列(Leamon等，(2007)Gene Ther.Reg.3，15-31)，表达会随着样本总体数量较大以及低丰度而降低，而且该方法会因特定种类序列的天然或实验偏好而产生选择偏差)。因此，现有技术方法或许适用于发现，但是并不适用于传统的靶向特异性Sanger测序法，因为它们无法保证一条特定序列一定会被测序，并且需要运行多次(通常10倍到20倍)测序以确保达到合理的靶序列覆盖度和测序精确度。由于DNA有许多的重复和功能未知序列，上述的限制排除了许多应用的可能性。除此之外，每个研究问题感兴趣的区域差异较大，例如，编码或非编码序列区域(small RNA，内含子区，基因间区域，非翻译区)，SNP，调控区(复制，转录或翻译调控，其它遗传学功能调控)，印迹或甲基化区域，反式剪接和转座子区，或以上的结合。不同细胞器的DNA可能也需要筛选。还有许多生物医药基因组学应用，如临床分析，其需要大量样品，但可能更关注一小部分的基因或突变位点。在需求很大但下一代测序技术单次运行费用仍然很高的情况下，急需将这些超快测序方法应用到靶向特异性测序，使得每次反应运行都可以分析和系统研究大量不同的样品。克服现有的取样限制将使测序技术在常规研究和临床实验应用中的潜力发挥到最大。

最后，下一代测序技术的操作流程需要进行简化。目前样品制备和测序流程都很繁琐，需要花费数天时间并包含多步酶促反应，通过合成延伸序列，每条链延伸需要4个碱基循环。这些复杂的操作步骤可能会带来不稳定的结果，导致实验失败，需要专业技术和实验时间的延长。本发明提供了一个稳定的测序系统，高度自动化且常规使用可生成megabase(Mbp)到Gbp的数据量。本发明使用的方法与新一代测序的合成测序法相比更具优势。本发明无需进行传统测序所需的单个样品制备，并在靶向测序的速度上比下一代测序方法有显著提高。本发明的器件与方法能生成长度与传统测序方法相当但更准确的读序，提供更同步的读序并将通量提高到传统测序方法的上千倍。

对于大规模实验，很多情况下都需要经过筛选得到更小的子集，可通过杂交完成核酸的筛选。通常使用色谱分析法(亲和分离，如沉淀析出和液体分层分离等物理方法分离)分离，通过微珠增加。小颗粒，有孔和无孔，多种形状(片状，球状，棒状，方形等)，洞状或固体或层状或有核与外壳，来自于多种材料，包括但不限于玻璃，陶瓷，聚合物，金属，金属离子，半导体，以及上述材料的结合。例如，一个微珠可以包含一个被聚合物薄膜包裹或覆盖的顺磁性核心。顺磁性核心便于利用磁力进行微珠的运送、分选和保存。另一种示范微珠则是在一个或多个部位带有顺磁性涂层，同样也便于利用磁性控制微珠。还有另一种示范微珠包含一个固体核心，如玻璃，核心表面包裹一层聚合物基质材料，可提高合成负荷。聚合物基质材料材料包括但不限于低交联聚苯乙烯，聚乙二醇和多种共聚物衍生物。

微珠表面可以带有功能基团和分子，如核酸PCR扩增的引物，等温扩增，滚环扩增技术和其他方法增加DNA或RNA等核酸的拷贝数。表面分子同样可以带有特异性的杂交探针，可作为捕获探针或captor将所需的序列保留在表面上。带有引物、captor或其他寡核苷酸的微珠被称为探针微珠。

虽然商业领域和科研实验室可以在微珠上常规进行寡核苷酸的合成，但只有在皮升阵列芯片器件上才能进行皮升规模的合成，平行合成上千个或更多不同的预先设计好的寡核苷酸，每条序列的量达到fmol(Tian et al.(2004)Nature 432，1050-1054；Zhou et al.(2004)Nucleic AcidsRes.32，5409-5417)。寡核苷酸和他们的化学修饰衍生物可以将性能提高到应用所需的水平。如专利PCT/US08/82167所述，利用这些微珠的合成能力和有效性生成靶序列筛选的探针微珠是可行的。

许多探针设计的方法都是基于核酸互补链作用形成碱基配对和螺旋结构。杂交特异性和亲和力是评估探针质量的重要参数。不同的探针设计还有不同的功能。一种探针设计成对单个探针具有高度特异性，因此不会出现交叉杂交。另一种探针则设计成捕获靶序列中的一个区域或几个区域，如10Mbp癌症易感基因区域。捕获这些区域的探针可通过不同的策略进行设计，例如，考虑到特异性，靶序列的长度，分布密度(每碱基探针数)。因此，除了高度序列特异性探针外，第二种叠瓦型探针，即探针是以重叠或依次错位一个或多个核苷酸。这些探针是冗余的，杂交特异性和亲和性(多数用Tm，即熔点表达)是不一致的。这种探针的捕获性质基本上是随机的，而且被捕获序列的拷贝数差异很大。这同样表示靶序列的拷贝数差异会很大。第三种探针被设计成覆盖一个区域，且探针均匀的分布在感兴趣的靶区域内。样品序列的平均长度决定了探针之间的距离大小。例如，探针与探针间的距离基本与靶序列的平均长度相同(假设靶序列是随机断裂产物)。在这种情况下，2-3个探针长度的小范围内的探针筛选可以获得更好的性能。总的来说，这种探针的杂交效率和质量更高。每个靶序列至少会与一个探针匹配。

探针应用于靶序列筛选时，可能需要减少探针的数量，并且，与靶序列杂交的探针数量被减到最少，这里，探针被有意设计成与尽可能多的靶序列共有序列(CR)区域(图20)杂交。图10说明，10条直线(S1，S2…到S10)表示的10条DNA序列和3个CR探针(CR1，CR2，CR3)。通常，10条序列需要10条探针；但在图20中，CR1探针可捕获3条靶序列(图21表示在错配点上，CR1探针用A、C、G的混合物结合，因此同时合成了3条靶序列的特异性探针)，CR2捕获4条靶序列，CR3捕获5条靶序列。靶序列S3和S10被捕获了2次。遵循这些工作原理，没有必要在这些应用中进行高度特异性杂交，那么可以允许错配的出现并将多条不同的靶序列对应于同一个CR探针。共有探针杂交法可以节省探针合成的费用，而且不同靶序列的杂交拷贝数基本相同。因此，CR探针同时减少了杂交拷贝数的差异。图22表示可将CR探针固定在磁珠上以方便使用。在本发明的一个较佳实施例中，用链霉亲和素包被磁珠，CR探针用生物素修饰。靶序列与磁珠上的CR探针杂交，通过冲洗磁珠洗脱没有选定的序列。洗提收集杂交的靶序列用于下一步应用。CR探针和特异性捕获探针的一个常见应用是用于富集miRNAs靶序列以及CR探针作为成熟体miRNAs的互补序列。其他的应用包括癌症基因，P450基因，HLA基因等。靶序列来自于序列数据库，通过一系列规则(如允许错配)的比对分析可鉴定CR探针。图22表示可将CR探针固定在微珠上以方便使用。在本发明的一个较佳实施例中，微珠包被了链霉亲和素，CR探针用生物素修饰。靶序列与磁珠上的CR探针杂交，通过冲洗微珠除去没有选定的序列。洗提收集杂交的靶序列用于下一步应用。CR探针和特异性捕获探针常见应用于富集miRNAs的靶序列，以及CR探针作为成熟体miRNA的互补序列。其他的应用包括癌症基因，P450基因，HLA基因等。靶序列来自于序列数据库，通过一系列规则(如允许错配)排列的分析可鉴定CR探针。

发明内容

本发明涉及高通量、长链测序、精确、快速和低成本的DNA测序器件与方法。本发明涉及下一代长链测序长读长测序(NG-SS，下一代Sanger测序法)技术，该技术利用经过时间检验的Sanger测序法和毛细管电泳建立了一个基于微珠的大规模平行反应Sanger测序反应的新平台，通过在一个三维(3D)高密度毛细管模块上独立设置上百万条不同序列，电泳分离测序片段，快速获取毛细管模块出口面的荧光图像，利用快速记录的时间-分辨图像来重组序列信息。这些方法的结合为克服现有下一代测序方法的短读长和逐步(或循环)反应限制提供了可靠的解决方案。本发明的方法与器件将测序通量提高到传统Sanger测序法的上千倍。本发明的器件提供了操作简单快速、可在数小时内精确读取基因组规模序列(上亿个bp)、成本更低的测序仪器。

除了长链测序外，本发明的器件与方法比先前技术相比，具有的另一优势是高通量样品处理无需进行克隆。本发明的器件采用2D毛细管模块而不是1D毛细管排列，因此将通量提高了n倍(n为二维中的列数)。本发明的器件具有数百万个测序毛细管。本发明的方法提供了高容量，短的靶序列，可以一起连接到连续的聚合物中(即串联体)，特别为同系物的延伸，长重复和结构变异位点提供更精确的测序。本发明的方法不涉及现有3种下一代测序技术所需的dNTP测序循环(454测序需要焦磷酸检测和每次增加一种dNTP，Solexa测序的每个循环需要增加染料标记dNTP，SOLiD测序每个反应运行需要5次寡核苷酸连接)，因此显著地减少了测序时间。本发明的方法中，可以持续记录每个毛细管道的测序数据。本发明的方法与器件可以显著减少测序冗余要求(如对于基因组测序，Solexa和SOLiD序列需要20倍的冗余)；因此本发明的方法可节省重测序的时间和费用。本发明的毛细管电泳阵列模块在冲洗填充胶体之后可重复使用。毛细管表面没有分子衍生，因此CE模块是可再生的。本发明的CE器件可以模块化，可用于建立同时满足基因组规模和常规测序需求的小型实验室或基因组测序仪。本发明的器件与方法可通过靶向特异性捕获分析序列应用于同步测序和平行测核酸拷贝数。测量的范围很宽，可以远远超过现有的Biotrove 300纳升反应平板；在序列信息方面，与现有的仅通过杂交识别序列的探针法实时定量PCR相比，本方法将假阳性减至最少。超快测序和杂交微阵列将会成为DNA和RNA基因组规模或特异的小子集基因组的发现和全方位、深度(in-depth)、精确、定量分析的互补技术。

附图说明

图1所示为皮升级微流体阵列合成器件的示意图。

图2所示为用于合成阵列的玻璃平板。

图3所示为二元微珠分拣合成系统的示意图。

图4所示为微珠合成系统和进程模式的示意图。

图5所示为寡核苷酸探针微珠分子的实例示意图。

图6所示为合成表面合成探针示意图。

图7所示为充满了反应微珠的反应小室的显微图像。

图8所示为探针微珠作为扩增引物的示意图。

图9所示为微珠在表面的图像。

图10所示为比较在寡核苷酸混合过程中使用和未使用磁性链霉亲和素微珠的结果的实验流程。

图11所示为本发明中一种样品制备方法的示意图。设计步骤1111到1114用于完成单个DNA分子的克隆乳液PCR(emPCR)，生成包含单个序列扩增子的微珠。步骤1115到1118是设计用於完成Sanger反应，在每个微珠上生成一整套来自于单个模板序列的纯净、荧光标记的Sanger测序片段。

图12所示为在带有Sanger产物捕获序列的微珠上进行乳液Sanger扩增反应的示意图。

图13所示为由一个毛细管阵列电泳子系统和一个激光共聚焦扫描显微镜检测子系统组成的集成系统的示意图。

图14A所示为毛细管阵列组成的电解池的剖面示意图。

图14B所示为毛细管阵列模块的3D视图。

图15所示为一个毛细管孔室部分来源-室末端的放大视图。

图16所示为从图像数据到序列处理过程的示意图。

图17所示为随着DNA胶迁移的时间进程检测到的图像，图像上方为2个放射波长(FAM：510nm，Cy3：535nm)下检测到的时间-依赖性信号强度。

图18所示为毛细管通道垂直面上获得的时间-分辨图像。

图19所示为微型毛细管芯片表面的放大视图，表示微珠加载到填充胶体的毛细管通道内。

图20所示为发现一系列DNA或RNA序列(如S1，S2…S10，但不限于10条序列)的共有区域(CR)的示意图。

图21所示为设计一系列DNA或RNA的共有区域(CR)探针的示意图。

图22所示为使用磁珠(但不限于磁珠)上的CR探针通过杂交捕获DNA或RNA靶标序列的示意图。

图23所示为点击(Click)化学反应的一个示例。

图24所示为核酸聚合链中结合的dU的的化学结构，dU的5-端是可进行点击(Click)反应连接基团和官能团修饰的。

图25所示为核酸聚合链中结合的dU的的化学结构，dU的5-端是可进行点击(Click)反应连接基团和官能团修饰的，或是与再加的双官能团的连接分子(L3)进行偶联反应进而可进行点击(Click)或官能团修饰。

图26所示为一个由在互补链上的两个修饰的残基形成的共价键连接而锁住的双链。

具体实施方式

本发明涉及高通量、长链测序、精确、快速和低成本的DNA测序器件与方法。本发明涉及新一代长链测序(NG-SS，新一代Sanger测序法)技术，利用经过时间检验的Sanger测序法和毛细管电泳建立一个基于微珠的大规模平行反应Sanger测序反应的新平台，该方法的原理是将上万条不同序列分别至于一个三维(3D)高密度毛细管模块上，电泳分离测序片段，快速获取毛细管模块出口平面的荧光图像，利用快速记录的时间-分辨图像来重组序列信息。

本发明为大规模平行制备探针和探针微珠提供了方法和器件。在本发明的一个较佳实施例中，探针合成方法为阵列上进行的微型化原位合成(见图1与图2)。以每个探针fmol到pmol的数量同时合成几千到几万个探针，这些探针连接到微珠原料上形成探针微珠。探针可以对但是不局限于DNA，RNA，碳水化合物，多肽，脂类，小分子和其他有用的分子嵌合体进行生物检测。本发明的另一个具体实施例，提供了一个二元分拣合成系统(图3和图4)和方法提供快速平行合成的探针微珠，这些微珠是数字编码，便于可以根据设计在每个微珠上特定的合成探针。这种合成方法使用了直径从纳米到毫米的微珠，生产出每个的数量为fmol到nmol的探针。本实验提供了基因组和大规模生物相关领域不同应用的通用产物。

在本发明中，在表面可容纳分子阵列的器件中完成探针合成。一个阵列的每个平方厘米面积内至少包含400种不同的探针，最好是1000个以上的不同分子。每种探针的合成浓度都在sub-fmol到nanomol，最好是pmols浓度。图1所示为微流体皮升阵列合成器件示意图(Zhou，X等，2004，Nucleic Acids Res.32，5409-5417；在此以提述方式纳入)。在200pL反应小室中每个探针平行完成探针合成。合成结束后，探针衍生一个长连接基团用来支撑功能性微珠与功能性基团形成共轭，以形成探针微珠。

在本发明的一个较佳实施例中，如图1所示的合成器件含有近4,000个反应小室。这种类型的反应器件可以包含更小的(即几百个)或更大数量的反应小室(即几千个或更多)。这些反应小室内可能包含诸如10mTantagel beads(Polymere GmbH)数量的微珠。这些微珠的表面容量可以支持10pmol以上的分子合成，这大约是直径90x200m2平面反应单元容量的10,000倍。

生成探针微珠的另一种方法必需逐个添加单位序列(例如如核苷酸单体或氨基酸)到标记好的微珠，并在每次添加之间引入一个分选步骤。分拣步骤隔离所有在下个步骤容易受到同样影响的微珠，在此之后，微珠可以重新排序以进入下一个步骤。

例如，图3与图4所示为合成寡核苷酸纳米微珠的一个较优方法，该方法可将一个特定分子添加到一个特殊标记的微珠上。微珠可通过多种方式进行标记，包括但不限于荧光、射频、分子标记、分子序列标记、光学、磁性、光磁性或是以上的组合。在这种合成寡核苷酸纳米微珠的方法中，用标记、延伸的纳米微珠(如OH官能化Tentagel(10μm)充填4个反应室(见图3，302到305)。每个反应室相当于4种DNA核苷酸A、T、C、G的其中一种。在向反应室的每个微珠添加特定的核苷酸后，通过再次分选，对应于下一个即将添加到链上的核苷酸的微珠进入反应室内。例如图3所示的8条序列。这些序列对应于8个需要合成的不同分子。在3’-5’合成(本发明的方法无合成方向的限制)的第一个循环中，对应于序列4和8的纳米微珠将会在IA反应室(见图3，302)中开始添加腺苷(A)单体。同样，对应于序列1的微珠将会置于IC反应室(见图3，303)中，对应于序列2，3，5的微珠将会置于IT反应室(见图3，305)中，对应于序列7的微珠将会置于IG反应室(见图3，304)中。各反应室相应的核苷酸将会添加到微珠上。本发明的一个较佳实施例中，核苷酸单体为5’-DMT保护的保守单体。在偶联反应完成后，微珠进行分选，在反应室中按照所需序列的第二个核苷酸进行重新分配。例如图3中，对应于序列1的微珠从IC反应室(见图3，303)转移到添加鸟嘌呤核苷酸的IIG反应室(见图3，308)。对应于序列2的微珠从IT反应室(见图3，305)转移到添加鸟嘌呤核苷酸的IIG反应室(见图3，308)。对应于序列3的微珠从IT反应室(见图3，305)转移到添加腺嘌呤核苷酸的IIA反应室(见图3，306)。对应于序列4的微珠从IA反应室(见图3，302)转移到添加胸腺嘧啶核苷酸的IIT反应室(见图3，309)。对应于序列5的微珠从IT反应室(见图3，305)转移到添加胞嘧啶核苷酸的IIC反应室(见图3，307)。对应于序列6的微珠从IT反应室(见图3，305)转移到添加鸟嘌呤核苷酸的IIG反应室(见图3，308)。对应于序列7的微珠从IG反应室转移到添加胸腺嘧啶核苷酸的IIT反应室(见图3，309)。对应于序列8的微珠从IA反应室(见图3，302)转移到添加胞嘧啶核苷酸的IIC反应室(见图3，307)。重复合成与分选循环，直到合成想要的序列。

本发明的方法不局限于已经讨论过的分子类型。在本发明的一个较佳实施例中，可在可寻址的纳米微珠上可修正的原位合成DNA、RNA、多肽、碳水化合物或其他分子。同时，本发明的合成方法也不局限于可用来合成分子纳米微珠的反应小室的数目。如图5所示，当使用单一的反应小室时，可以设想每个单体种类加到多重反应小室。反应室也可同时利用远远超过一个单一步骤。其他的合成步骤还包括二聚体和三聚体或更长可用元素的利用。

将被添加的不同元素的数量将确定必需的反应小室的最低数量，使得每个元素必需有一个反应小室。例如利用天然氨基酸合成多肽序列，依照序列的长度可能会需要20种不同的合成反应小室。

合成器件也可以有单独的反应小室，小室可以相互间物理性密封，或者器件可以在反应小室之间进行流体连接，其中微珠可以流经一个分选器件，并被重新分布到用分拣器件进行流体连接的其他反应小室。

本发明的可寻址纳米微珠的分子密度可以达到1-1,000,000分子/微珠。在某些较佳实施例中是单个分子粘附于纳米微珠。

可以改良纳米微珠和其他的纳米微粒，以便可以通过利用快速(107/min)珠子分选工具流式细胞仪进行微珠的分选，产生基于既定性能珠子的预分选微珠池。这样一个预分选微珠池克服了现有技术中需要从分子微珠混合物中随机组装冗余高水平阵列的局限性。预分选微珠允许选定可寻址纳米微珠中特定的微珠，和/或特殊应用中已知序列内容的微珠池。

标记好的微珠可制作成各种形状，包含但不限于圆柱形、管状、球形、空心球、椭圆形或盘状。为了保护活性基团与其他物质或微珠的物理性接触，微珠可能包含凹座形状或面积。例如，微珠可以做成在半节处有活性表面而哑铃两端被惰性原料覆盖的哑铃形。凹座结构可以帮助避免微珠凝聚和/或受到活性表面基团的损害。微珠的较佳尺寸为1纳米到1厘米。理想尺寸为10微米到5毫米。

标记好的微珠可以用各种不同的原料制成，包括但不限于玻璃、陶瓷、聚合物、金属、半导体或以上2种材料以上的结合。例如，一个微珠可以包含一个高分子材料胶囊化的顺磁性核心。顺磁性核心便于利用磁力进行运送、分选和保存微珠。另一种示范磁珠则是在一个或多个部位带有顺磁涂层，同样也便于利用磁性控制微珠。还有另一种示范磁珠包含一个固体核心，如玻璃，这是一个为了提高合成负荷而包裹一层聚合物基质材料。聚合物基质材料包括但不限于低交联聚苯乙烯，聚乙二醇和各种共聚物衍生物。(F.Z.

“Organic Synthesis on Solid Phase：Supports，Linkers，Reactions”，Wiley-VCH，2002；在此以提述方式纳入)。

利用微加工领域众所周知的各种不同过程，可以产生微珠上的标记标签。一种示范方法是激光标记。激光标记对激光加工领域内的专业人员来说是众所周知的(J.C.Ion“Laser Processing of EngineeringMaterials”，Elsevier Butterworth-Heinemann，2005；在此以提述方式纳入)。通过电镀或喷射可在玻璃纤维表面覆盖一层铁薄膜。较佳的薄膜厚度为5nm到5μm。薄膜覆盖技术对薄膜加工领域内的专业人员来说是众所周知的(R.L.Comstock“Introduction to Magnetism and MagneticRecording”，John Wiley & Sons，Inc.，New York，1999；在此以提述方式纳入)。光学标记形式为同轴环标签，然后在纤维表面通过烧蚀铁膜进行激光标记。通过保护性的薄硅膜或气相淀积或利用溶胶凝胶法包覆纤维((M.A.Aegerter“Sol-Gel Technologies for Glass Producers and Users”，KluwerAcademic Publishers，2004；在此以提述方式纳入)。纤维被切割或削减形成圆筒形微珠。然后，微珠或者用适合的连接基团衍生，或者包覆基体聚合物材料。上述方法仅是多种微珠加工过程的一个示例。例如，聚合物或金属纤维或金属丝可用作磁珠的核心。铁薄膜可用顺磁性铁氧化物或镍磷薄膜替代。深色的金属氧化膜可沉积在磁性薄膜的上方生成通过激光打标的高对比度标签。纤维可以在连接基团衍生后或者基质聚合物包覆后切割或削减。纤维与基体聚合物的涂层可以相似的方式完成，即把熔覆层置于玻璃纤维制造光学纤维。

图4所示为二元分拣合成系统示例的示意图。该系统使用含有包含光学标签的微珠。在开始合成之前，选择一组带有已知标签的微珠。每个微珠分配一条需要合成的序列。在开始合成反应时，包含微珠的溶液401通过通道入口402置于系统。当微珠通过检测入口404时，通过光学传感器405读取其标签。依靠标签和已设计序列，电磁发生器406L或406R活化使产生微珠流体，或者进入流体通道407L或者进入407R以完成一级分类。二级分类以相似的方式完成，通过检测入口408和409，光学传感器409和413，电磁发生器410L，410R，413L，和413R。微珠最终被引导进入指定的反应小室(414A，414B，414C，or 414D)，在这里特定序列残基将被添加到微珠上的分子基团。虽然图上没有显示，每个小室有可以容纳微珠的机理。示范的保持机制包括但是不局限于机械塞子和磁场。当所有的微珠被分拣并被放置于指定的反应小室中，反应试剂(例如417A)通过试剂传送线(例如，415A)进入反应小室(414A，414B，414C，和414D)来进行合成循环。反应试剂通过排泻线419排出。完成合成循环后，微珠从所有的反应小室中释放出来，并被推入循环线418。随着排泻线419的关闭(排气阀未在图中显示)，然后微珠通过返回通道返回到一级分拣系统。然后开始下一个分拣和合成循环。合成循环重复直到合成所有指定的序列。本发明可用于任何已知的固相和组合合成工艺(U.S.Pat.No.7，190，522和参考文献；在此以提述方式纳入)。

图4所示的流通管道可用玻璃、塑料、硅或其它合适的材料制作而成。管道直径大小依据用途可从亚微米到毫米不等。若是在小微珠上进行合成，较佳的流通管道直径为大约1到200微米之间。管道可在玻璃或硅薄片上通过蚀刻制作。在同一薄片上还可生成反应室(414A，414B，414C和414D)。若是在较大的微珠上进行合成，如基体聚合物包被的微珠，较佳的流通管道直径为大约100微米到1毫米之间。此时可以用玻璃、含氟聚合物或其它耐化学品材料制作的传统管道。反应室(414A，414B，414C和414D)可用含氟聚合物和聚次苯基硫醚等耐化学品聚合物、玻璃或不锈钢制作而成。

图3与图4所示的二元分拣合成系统仅是多种不同情况中的一个示例。例如，可在回收管线403和检测区404之间设置一个缓冲室，可更好的调控微珠流动。可在每个反应室(414A，414B，414C和414D)底部设置一个活动玻璃料滤片，将试剂运输管线置于滤片之下而底物微珠置于滤片之上。在这种布置之下，反应室中的反应器件可以用浮床方式控制，而合成反应过程中可以收到良好的传质效果。增加分选级数可以满足更多不同残基的需求，如多肽合成过程。在一个较佳实施模式中，光传感器405、409和413是光电二极管。在另一个较佳实施模式中，光传感器是CCD(charge-coupled device，电荷耦合传感器)。在某些操作模式中光传感器405只需要1个，例如微珠在分选管道中的流量稳定或是可预见时，或是2个相邻微珠间的时间间隔足够长，在第一个微珠进入选定的反应室之后第二个微珠再经过检测区404。虽然图中未显示，但可能需要照明灯和光传感器配合使用。光传感器(405、409和413)，磁场发生器(406L，406R，410L，410R，413L和413R)和流量控制阀门(图4中未显示)可与一台或多台计算机连接并由计算机控制它们的信号收集和/或移动运动(actuations)。也可以使用其它的磁性编码和解码方法。在这种情况下，可以在流动通道的侧边设置一个磁记录头。二进制编码可以记录或读取或者可以像一个或多个磁带或磁盘的数字记录一样的方式形成顺磁性薄膜覆盖的微珠。

微珠也可通过磁力之外的力量或影响进行操控。例如，利用压电器件可在流动通道内部产生机械变形控制微珠的流动方向。利用激光或电阻元件产生热能可在通道孔内产生流动干扰影响微珠的流动方向。用一个计算机控制的1D或2D的运输臂配合编码解读器件可以替代图4所示的二元分拣机理，将标记的微珠运送到选定的反应室内。本发明通过减少总的操作步骤和使用先进的微粒分选技术大大提高了合成速度。合成中每个反应的循环，以每秒几百到几百万的速度进行微珠的选择。

在本发明的一个较佳实施例中，所有指定序列的合成结束以后，带有标签的微珠可用于在微珠表面进行检验或通过从微珠上剪切合成产物生成原料。使用基体聚合物胶囊化的微珠尤其适用于生成脱离微珠的合成产物。将带标签的微珠放入96孔、384孔、1536孔或其它定制格局的剪切反应室中进行平行的剪切反应，得到单独的序列产物。可通过一个计算机控制的运输臂配合编码解读器件放置带标签的微珠。将所有或选定的一部分微珠放入剪切反应室进行剪切反应可以得到一个混合产物。此合成与传统的逐个寡核苷酸合成相比只消耗千分之一或更少的溶剂且生成的每条序列是fmol到nmol，更好的情况下是pmol到几nmol的材料，如Illumina公司用于生成微珠微阵列的寡核苷酸微珠的过程(www.illumina.com)。

在本发明中，用于承载探针的微珠具有多种性能。微珠的大小最好是在几个纳米至几个毫米范围内，在芯片合成器件中最适宜使用1微米左右的微珠。在二元分拣合成系统中，微珠的最佳直径范围为几个微米到毫米之间。微珠或纳米和微米级颗粒的形状可以是球形、细长形、圆柱形状及其他不规则形状。在微珠表面可以添加有孔和/或无孔的颗粒涂层来提供需要的表面合成或附着的性能。表面官能化后可作为检测探针的载体。制作探针微珠可以使用多种不同的微珠，包括但不限于二氧化硅微珠(如Bands Laboratories公司产品)，磁珠(如Invitrogen/Dynal公司产品)，高分子珠(如Rapp Polymere产品)。本发明中首选的四种微珠和相应的化学基团：黄金或黄金涂层球(10-100nm，巯基基团)，抗生物素/链霉亲和素涂层微珠(＜10m，生物素基团)，TentaGel珠(RappPolymere GmbH，德国，1-100m，3、10、30m，NH2或OH共轭化学)，葡聚糖凝胶微珠(20-50、40-120m，羧基，NH2共轭化学)。微珠可能包含用于检测和鉴定的标记/标签，如荧光分子(Fluoresbrite聚苯乙烯珠(Polysciences)，发光分子，发色团分子，磁电子组/点，量子点，生物素等。本发明中，图1所示的微流体芯片反应器中使用的微珠是由稳定的材料制作的，包括CPG(controlled pore glasses，可控孔度玻璃)、交联聚苯乙烯、和多种固相合成与分析中常用的树脂。

本发明涉及(图5，501)含有如烷基、聚乙烯糖基链等表面连接基团和间隔(spacer)基团的探针分子的固体表面合成。连接基团(图5，501)是附着物在表面和间隔(spacer)的一个定位点(图5，502)，为探针与目标分子的相互作用提供了可及性和结构的灵活性(图5，505)。探针分子可通过共轭作用(图5，506)添加标记(图5，507)，用于检测的荧光分子、发色团分子，可连接到检测分子或微珠基团的生物素(图5，507)。探针可在特定的剪切位点被剪切(图5，504)。在本发明中的一个较佳实施例中，剪切位点(504)是dU(利用New England Lab(NEB)的USER试剂盒剪切)，共轭位点(506)是一个生物素和链霉亲和素的连接，可连接到连有链霉亲和素的纳米微珠(507)上。

本发明还涉及到加入的两种分子，或分子与微珠，或微珠与表面的共轭反应。具体，寡核苷酸可以附着到表面或微珠上，或溶液里的微珠附着在表面的寡核苷酸上。微珠表面反应是利用溶液中的分子使用传统方法实施的，官能化后与微珠表面反应。一些共轭的化学连接方法是这些目的的适当选择(Kozlov，I.A.等，2004，Biopolymers 73，621-630；Soellner，M.B等，2003，J.Am.Chem.Soc.，125，11790-11791；Houseman，B.T.等，2002，Nat.Biotech.20，270-274；Farooqui，F.和Reddy，P.M.，2003，US 2003/0092901；Wang，Q.等，2003，J.Am.Chem.Soc.，125，3192-3193；Clarke，W.等，2000，J.Chrom.A，888，13-22；Raddatz，S.等，2002，Nucleic Acids Res.30，4793-4802；Konecsni，T，and Kilar，F.，2004，J.Chrom.A，1051，135-139；在此以提述方式纳入)。在本发明中的一个较佳实施例中，在表面合成了一个超过100个寡核苷酸的阵列，末端基5’-末端最好是烷基生物素。将链霉亲和素包被的磁珠(如

M-270链霉亲和素)溶液添加到表面上。生物素和链霉亲和素是亲和力很高的结合对(Kd＞1013M)，溶液与表面接触导致微珠寡核苷酸在表面的连接。如果当寡核苷酸反应位点的尺寸远大于微珠的尺寸时，反应位点中的微珠会被同一种寡核苷酸所环绕(图6)。在特定具体实例中，共轭到链霉亲和素微珠上的生物素酰化寡核苷酸是同样的序列以生成一珠一种寡核苷酸探针的微珠。

本发明也涉及到连接两种不同分子或分子和微珠，或微珠与表面的共轭反应。具体来说，寡核苷酸可以附着到表面或微珠上，或溶液里的微珠附着在表面的寡核苷酸上。共轭反应可以发生在一对反应物之间(来自这一对反应物的第一和第二官能团)和多对反应物之间(第二对反应物的第三和第四官能团)。官能团包含活性基团和高亲和力基团，如炔基、烷基叠氮、氨基、羟基、巯基、醛、phosphoinothioester、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、异氰酸酯、酯、肼、链霉亲和素、亲和素、neuavidin或生物素结合蛋白。在一个共轭反应中，第一官能团是生物素，第二官能团是链霉亲和素、亲和素、neuavidin或其它生物素结合蛋白；在另一个共轭反应中，第一官能团是炔基，第二官能团是叠氮；在另一个共轭反应中，第一官能团是氨基酸，第二官能团是酯、琥珀酰亚胺或异氰酸酯；在另一共轭反应中，第一官能团是巯基，第二官能团是phosphoinothioester、马来酰亚胺；在另一共轭反应中，第一官能团是羟基，第二官能团是酯、琥珀酰、琥珀酰亚胺或异氰酸酯；在另一共轭反应中，第一官能团是醛基，第二官能团是胺或肼。按照附着的官能团不同，官能团对，如第一和第二官能团是可以相互转化的。在一个分子中包含的官能团数量是没有限制的，因此在一对分子或物质之间可以发生一个或多个共轭反应。

两个分子实体共轭的方法很多，具有实用价值的基本条件是：(a)由此产生的共轭物适用于进一步应用，(b)共轭反应位点应该很容易制备，(c)反应产生最少的副作用和/或非特异性反应，(d)反应时间应适当缩短。本发明中首选的四种微珠和相应的化学基团：金(纳米，巯基基团)，链霉亲和素涂层磁珠(＜10m，生物素基团)，TentaGel珠(Rapp PolymereGmbH，德国，10m，NH2或OH共轭化学)，葡聚糖凝胶微珠(～25m，用于454测序技术，NH2共轭化学)。链霉亲和素包被磁珠广泛应用于利用生物素标记筛选的不同序列分离；这种技术在纯化、富集、分离和其他应用方面使用广泛。寡核苷酸的生物素官能化可以通过使用生物素改良试剂，利用标准亚磷酰胺化学(Glen Research)修饰完成。这是一个亚磷酰胺试剂，可以在合成全长序列后与一个寡核苷酸的5′-OH端偶联。特定的生物素酰化试剂在其偶联到表面寡核苷酸后可以偶联一个荧光染料。这种荧光标记可以用于验证生物素基团的结合。荧光分子可以作为合成的监测工具，因此可以提供指导优化生物素酰化反应。

本发明包括制作可寻址探针纳米微珠混合物的方法，其中每个纳米级小球附着到一个单一类型的探针分子上，包括：a)在表面合成一个探针分子阵列，这里分子具有第一个末端和第二个末端，这里第一个末端粘附于链接到表面的间隔(spacer)上，第二个末端可以偶联到第一个官能化基团；b)将一个官能化基团共轭到第二个末端；c)将第二官能团衍生的标记纳米微珠与探针分子上的第二末端的官能团偶联；d)从表面移除未偶联的标记纳米微珠；e)给未偶联的探针分子的官能化基团加帽；f)从阵列上切下标记探针纳米微珠，以形成可寻址探针纳米微珠混合物，其中每一个微珠都粘附有单一类型的探针分子。本发明的阵列可以包含超过1000种不同的探针分子。在较佳实例中，间隔(spacer)具有6-30个化学键，可以偶联到剪切位点，这样可寻址探针微珠可以从表面切除。功能性基团可以是但是不局限于生物素，氨，炔，叠氮物，氨基，羟基，巯基，醛，phosphoinothioester，马来酰亚胺，琥珀酰，琥珀，异氰酸盐，酯，链，抗生物素蛋白，neuavidin和生物素结合蛋白。纳米微珠可以和蛋白质以及表面封闭溶液一起处理(例如，0.5％BSA in PBSbuffer)以防止跟探针共轭前发生非特异性结合。阻遏蛋白或无离子的表面活性剂可以用来降低背景的非特异性反应。使用稀释后的反应溶液或者提高了离解能力的溶液进行严格的洗涤。这进一步消除了由于非特异性反应而残留在表面的微珠，提高了正确共轭微珠与非特异性结合微珠的比例。不同的反应条件(例如，缓冲液，溶剂，温度，pH和时间)可能对共轭反应有显著影响。本发明的一个首选方法，探针最好是10-200残基的DNA寡核苷酸，和/或10-200残基的RNA寡核苷酸，和/或10-200残基的DNA和RNA嵌合体(DNA和RNA混合组成)。

官能化可以通过化学共轭的方法实现。一个广泛使用的方法是产生一个氨基基团，比如在寡核苷酸序列中结合一个氨基修饰基团或一个5-(3-aminoallyl)-dU或使用亚磷酰胺(Glen Research)在5′-OH基团上偶联一个氨基酸连接基团(图5)。寡核苷酸的5′-端氨基基团能与一个活化酯发生反应，例如微珠表面的NHS酯涂层形成酰胺键。共轭寡核苷酸-微珠在绝大部分化学和生物测定条件下是稳定的。官能化并不一定需要寡核苷酸的5′-末端氨基基团；在其他寡核苷酸链中，该功能基团并不一定需要寡核苷酸，其它的寡核苷酸链，可以去结合本发明所述的共轭化学讨论到的适当的修饰。在修饰基团之间可形成分子内部共轭连接。

在本发明的另一实施例中，官能化可通过吸附法完成。寡核苷酸可以用5′-巯基修饰(Glen Research)，形成一巯基，那种包含硫醇的结构的寡聚核苷酸。硫醇与金的表面具有高亲和性。含有固定寡核苷酸的金球载体已成功地应用于DNA检测和纳米结构的构建。较好的官能化化学可与寡核苷酸合成或去保护化学作用兼容，且官能团通常作为寡核苷酸固定到固体表面的修饰物。优化适用于合成的表面连接化学和表面微珠-标记寡核苷酸的切除可提高探针微珠混合物的生成效率。

本发明还涉及到表面和溶液中的微珠的共轭反应方法。在本发明的一个实施例中，微珠表面用寡甘醇氨基基团簇衍生。间隔(spacer)的总链长如果用键的数量来衡量，其总长度超过6，较好是18以上，最好是大于30。偶联反应溶液(DIC/DMAP(1，3-1，3-diisopropylcarbodiimide/dimethylaminopyridine)在DMF/CH2Cl2)中的微珠含有表面琥珀酰，可与表面连接基团发生反应。反应结束后，多次清洗表面，微珠会保留在表面上。相比之下，不含有表面琥珀酰的微珠因为与表面之间没有形成共价键而被冲洗掉。

在本发明的一个实施例中，微珠附着的表面是由图1与图7所示的三维反应室组成的。微珠通过与孔室表面的共轭反应固定于反应室，使它们在多步化学合成反应中(图7，702)不会因为液体流过通道(图7，701)进入孔室而脱离。微珠同时也被孔室两侧与流通管道垂直的2面分隔墙固定于孔室(图7，703)。本发明的方法也提供了微珠表面官能化的优化方法，因此可得到更高质量的合成结果。反应室尺寸为10到500微米，这比微珠尺寸(10nm至几百m)大，使得单个反应室内可以固定大量的微珠，保证每次阵列合成可以合成足够数量的分子。这样在每个芯片中可合成足够大数量的分子(如fmol到nmol，最好pmol至nmol之间)。

在本发明的一个较佳实施例中，图1绘制了一个由三维反应小室构成的三维微流体pico-阵列的结构，其中，每个反应小室的表面积约为90×180mm2，高度为16-30m。图1所示的阵列含有3,968个反应室，可以容纳3,968个独立的合成反应。基于上述反应室的尺寸和反应室中填充20％1m微珠的容量，每个反应位点可以容纳将近8,100个或是更多的微珠。这一水平下，一次芯片合成生成的微珠可提供至少数百到一千个pmol水平的样本检测。

已经认识到，在玻璃平板合成器件中(图2)，探针合成并不局限于具有微珠附着表面的孔室(图6)，或作为切下的分子混合物的探针，或是将切下的分子附着到放到探针溶液的微珠的探针微珠。

根据微珠的尺寸和应用，具有该尺寸反应小室的阵列可以容纳数百万个微珠。微粒体器件同时还可以根据应用要求的不同增加或减小反应室的大小。在本发明的一个较佳实施例中，附着微珠上的分子合成是利用数控的投影光和光照射下形成的反应试剂(PGR)进行的。(Gao X等，US 6,426,184，Gao X等，US 7,235,670；在此以提述方式纳入)。在光照射下光照引发反应室内微珠上的化学反应。生物大分子可以通过重复光照、去保护和偶联反应步骤进行合成。图7所示为共轭到阵列芯片合成器件的微珠，这里10m的TentaGel微珠以分散的形式装载于微流体芯片上，通过与芯片表面的琥珀酰基团发生反应，微珠被固定于芯片表面上。为了适应阵列合成，需要调整发出适宜光强度的光能量单位功率以及充满了纳米微珠的反应小室内的流体传送器件。通常，合成表面位点需要数十mW到数百mW的光照能量；形成去保护反应所需的足量光生成试剂。

本发明中，阵列内微珠上的分子合成方法的应用之一是增加分子的合成产量。现有阵列的每个反应室大约只能合成1fmol的寡聚物。而利用本发明的微珠合成方法，每个反应室可以合成大约1pmol到20pmol的产物。此外，基于阵列的结构特点，每个阵列可以合成4,000到100,000条不同的DNA寡核苷酸。增加的容积可以使得科研人员利用部分探针微珠寡核苷酸将测序重点集中在特别感兴趣的区域。

本发明中，阵列中微珠上的分子合成方法的应用之一是增加分子的合成产量。在本发明的一个实施例中，一个反应位点使用伪密码子(Gao，X.et al.，WO2008/003100.)(伪密码子是一个标记，诸如Z，可以在合成中代表一个以上的单体构造单元，例如，Z＝A和G，合成人员可以利用这些信息进行合成)。根据伪密码子包含的单体数目，往合成中添加单体混合物会合成两个以上的化合物。使用多个伪密码子会形成组合库。例如，对于低聚物合成，如果第一个伪密码子代表3个单体，第二个伪密码子代表3个单体，低聚物的合成结果为形成9个不同化合物的库)。这样，单个反应位点上可以得到多个不同分子。这种合成形式大大受益于本发明的方法和器件。合成库中每个分子的数量远大于从传统合成中所得的量。

在另一个实施例中，本发明提供了连接微珠到已在表面合成的分子上(图7)的方法和器件。微珠可能连接的分子包括但不限于DNA、RNA、PNA、脂类、多肽、蛋白质和碳水化合物。微珠的附着过程是分子末端或内部的一个或多个位点的官能化，生成可与独立分子或微珠发生亲和结合或共价结合的活性位点。本发明的首选方法是将寡核苷酸的末端官能化，如5’末端，但是官能化可能选择要合成的分子的任何位置。低聚物5’-官能化的一个好处是，合成失败的序列在最后一步偶联以后被加帽，这样就不再参与官能化。这样收集到的5’-官能化序列的质量得到了提高。

微珠切割以后可以收集探针并配制为混合物。例如，寡核苷酸分子将要从合成表面切除，这种情况下，寡核苷酸可以包含几个功能位点(图5，每一个寡核苷酸包含至少一个剪切位点[特定X，图5]，一个5’-官能化位点[特定()图5]，和一个微珠共轭位点[特定(O)，图5])。但官能团并不局限于末端位置，并且可在探针分子的不同位点合成。释放表面分子到溶液中的剪切位点是特别设计的，因此可以得到进一步应用所需的分子。但是也有可能使用普通的碱性或酸性条件从表面分离探针分子。也可能使用酶催化从表面分离探针分子。探针分子切割位点在合成条件下应当是稳定的。探针微珠切割位点应该在合成寡核苷酸后切割。通常，剪切固体支持物(如可控毛细玻璃(CPG))上的合成寡核苷酸的可以通过酯键的液体氨水解完成。然而，在阵列寡核苷酸合成过程中，寡核苷酸应当保留在表面用于检测应用，因此不可以使用跟CPG寡核苷酸合成相同的表面连接化学。美国专利7,211,654(Gao X.，et al.，在此以提述方式纳入)介绍了一种从合成表面剪切寡核苷酸的方法；在此以提述方式纳入。剪切的寡核苷酸具有3’-OH基团，这样合成的OligoMixTM可在多种应用总使用，例如引物、诱变的克隆插入和siRNA序列库。rU化学修饰既可以用于切割的核酸酶反应，也可以用于碱性水解反应。这些反应可以与共轭键和化合物兼容，例如生物素-链霉亲和素或共价氨基连接。本发明的一个较佳实施例中，探针微珠寡核苷酸包含一个rU连接。表面的寡核苷酸合成中可以结合rU单体亚磷酰胺。切割反应条件可以在特殊类型的探针微珠混合物的基础上进行优化。

通常，如果表面的寡核苷酸更加“易溶”，反应效率越高。因此，在本发明的一个较佳实施例中，利用连接基团和(或)间隔(spacer)来实现效率更高的反应。在本发明的一个实施例中，连接基团单元是丙胺。间隔(spacer)单元基于链的长度是灵活的。六聚乙二醇可作为间隔(spacer)的建构基础。通过比较同一芯片不同反应位点上包含不同间隔(spacer)长度的序列，可以实现间隔(spacer)的长度优化。荧光信号强度的检测可以提供产生有效合成的间隔(spacer)信息(它们具有更强的荧光信号)。

微珠探针混合物的制备过程包括寡核苷酸合成(图6，901和902)、寡核苷酸官能化(图6，903)、寡核苷酸微珠共轭(图6，904)和微珠探针移除(图6，905)。包含大量不同序列的探针微珠混合物可以应用在各种方面，包括特殊靶标测序和特殊靶标扩增。寡核苷酸可以作为捕获探针(即杂交后随后把双链从样本或模板探针(即PCR或其他扩增方法的引物)中移除)用于扩增特定的基因组区域，以及扩增诸如癌相关基因的基因。

本发明的探针微珠也可以通过如图6(901和902)所示的分子阵列合成(平行以及大量不同的序列)获得，接着从合成表面剪切下来后混合并通过共轭作用附着到微珠上。

生成的探针微珠可以用于微珠，最好是纳米微珠的标记，标签和分类，纳米微珠装配和其他微珠或独立或者作为一组混合物的应用。本发明的微珠追踪和分选方法提供了多种纳米微珠灵活和不同的应用。使用分选的纳米微珠或通过微珠标记和标记检测可以得到可寻址纳米微珠阵列。纳米微珠的标记方法包括每个微珠的寡核苷酸编码，测序解码和多重荧光标记或使用组合方式(现在可以通过流式细胞仪进行操控)的内置光学编码微珠。根据使用者设计的可寻址纳米微珠，这种标记微珠的方法更容易装配。通过本发明的方法生产的纳米微珠比现有微阵列更具多样性。

本发明中的纳米微珠阵列或探针微珠混合物可以包含混合分子微珠。例如，一系列广泛的细胞蛋白表达谱或检测可以为很多生物医学检测提供关键信息。但在目前这是无法实现的，因为还没有一个工具可以同时检测不同的蛋白质。然而，本发明的纳米微珠或探针微珠混合物提供了具有不同分子探针的阵列，从而提供了一种可以同时会检测样本中多种不同类型分子的方法，例如核酸和蛋白质。例如，蛋白质的全方位检测可以通过包含DNA和RNA分子探针的纳米阵列完成，可以检测核酸结合蛋白，多肽作为底物的同源蛋白和酶(如激酶和蛋白酶)。

本发明的方法和成分提供了芯片上的高品质合成寡核苷酸，也提供了监测合成过程的方法。对合成过程的监测可以进行寡核苷酸质量的控制和持续改进。几种方法在评价合成质量上是有效的。将荧光残留与不同长度的寡核苷酸偶联。这些反应可以在较低荧光浓度下进行，以避免表面染料分子的饱和。利用很好的描述的(特征鉴定明了的)控制序列杂交以获取理想匹配(PM)与错位匹配(MM)比率。长片段寡核苷酸的剪切和测序在表面完成的。最后，阵列合成的单个序列进行毛细管电泳分析。

本发明制备纳米微珠阵列和探针微珠混合物的首选方法是使用光生试剂(PGR)化学和微流体阵列技术(

)来获得，本发明的方法与器件适用于当前的多种DNA微阵列，包括微流体picoarray平台(单个阵列上有4,000-30,000个特征点)，其他的从低到高密度的微阵列，(单个阵列上有40,000到大于1百万个特征点)，Agilent阵列(40,000-200,000个特征点)，Affymetrix/Nimblegen阵列(250,000到大于1百万个特征点)，Nimblegen-type technology的Febit阵列(8,000-40,000)，或使用PGA化学合成的生物学发现(BioDiscovery)的玻璃平板阵列(＞40,000个特征点)。现有的所有技术都适用于适当的微珠-共轭(随着化学修饰的发展)以产生全面的探针微珠混合产物。本发明方法和器件使用的微珠具体不同的尺寸(亚微米到30m)以及使用不同的材料，包括但不限于金、聚苯乙烯、葡聚糖凝胶、和grafted polyethylene glycol and polystyrene。通过系统优化微珠加样、表面相互作用、特殊亲和结合或共价结合可以使微珠与寡核苷酸的共轭作用最大化，副作用的产生最小化。通过以上讨论的方法获得的探针微珠量较少，大约为0.1fmol。

在本发明的一个较佳实施例中，芯片中的微珠呈现出单分散性。为了达到单分散性，需要考虑到几个因素。溶剂(如偶极、密度、粘度、温度等)、溶剂pH值和微珠的处理(浓度、混合方法、表面的开启或关闭等)会影响表面上微珠的均匀分布。

在本发明的一些实施例中，需要在每个单位面积内布满尽量多的序列。对于杂交微阵列和探针微珠寡核苷酸，当不必增加序列的密度时，一个积极的因素是增加合成寡核苷酸的拷贝数，可以在给定的区域获得更多的序列。状高聚物亚磷酰胺如trebler(Glen Research，TreblerPhosphoramidte)就是这样的例子，它可以偶联芯片表面的羟基，然后进行去保护形成3个羟基基团，随后在下一反应中和3个亚磷酰胺分子偶联。寡核苷酸产量的测定(由偶联到序列的5’-末端荧光素决定)作为三倍偶联的功能之一，得到原始OH数目的3×3，即9倍。Dentrimer法的局限性在于，只能在表面分子饱和表面之前或表面未太拥挤之前加入dentrimer。

本发明的一个实施例中，用探针和探针微珠来产生小滴形式的寡核苷酸库。液体的浓度控制在大约nM(nanomolar)以便每个液滴都包含一种类型的探针或探针微珠。利用RainDance(http://www.raindancetechnologies.com/applications/next-generation-sequencing-technology.asp)的器件，样品的液滴与特定寡核苷酸液滴混合，选择用于富集特殊区域的探针作为PCR引物，能够进行对序列特异性测序和其它遗传学分析。

基于微珠的Sanger法样品准备

在所有的下一代循环测序方法中一个基本的、普遍的方法就是利用体外单DNA分子扩增法，他们通过在在管子中进行的乳液PCR(emulsionPCR)扩增或是在玻璃表面上进行的桥式PCR扩增获得足够的分子进行荧光检测。在本发明中，乳液PCR扩增的使用延伸到了基于微珠的Sanger扩增反应。传统的低通量Sanger测序法依赖克隆或者PCR，一个管子(或者一个微量滴定孔)只进行一个Sanger反应，而本发明的方法采用了在一个PCR管子中进行上万个甚至是更多的独立反应。这显著缩短了样本准备的时间，试剂消耗也减少了上万或更多倍，因此降低了自动化设备以及用品的费用。在本发明中的一个实施例中，由于测序扩增反应采用双脱氧的NTPs(ddNTPs)，其扩增系数小于100，因此利用一个两步法乳液PCR来确保生成足够量的靶分子用于检测。在本发明的较佳实施例中采用了一步法乳液PCR。

图11所示为本发明中样品准备方法的一个实施例的工艺流程图。该实施例中的步骤包括但不限于模板扩增(步骤1111-1114)和Sanger扩增(步骤1115-1118)的乳液PCR扩增。对基因组DNA测序而言，首先基因组DNA被剪切成片段化，之后通过连接反应把通用接头连接到片段上，从而形成PCR的模板(未在图中显示)。将模板加入到含有聚合酶1104、dNTPs 1104以及反向引物1106的PCR反应混合液中。对模板的浓度进行优化，使得形成乳液时平均每个包含水相微珠液滴内均包含一个模板分子1102。在一个实施例中，每个微珠1103都与正向引物1101的多个拷贝共价结合。在另一个实施例中，每个微珠1103都与正向引物和反向引物的多个拷贝共价结合。在另一个实施例中，每个微珠1103都与PCR引物多个拷贝，还有设计用于通过杂交捕获特异性或所有PCR产物的捕获共价结合。在本发明的一个较佳实施例中，连接的PCR引物有一个3’-OH基团和与微珠表面相连的5’末端。在PCR反应混合液中加入含有微珠1103的引物/捕获序列。在矿物油中加入表面活性剂(如1％Sun Soft No.818SK)和助表面活性剂(如交酯化蓖麻酸聚甘油酯)可制得油溶液。在另一个实施例中，在磁力搅拌下将水相PCR反应混合液加入到油溶液中(＞70％油)可形成一个油包水乳状溶液。在另一个实施例中，使用机械振荡或使用钢珠等搅拌可形成一个油包水乳状溶液。多篇文献报道中详尽介绍了乳液PCR的各种不同的方法，例如Margulies2005和Kojima 2005，这些都将作为本发明的参考。图11步骤1111示意图表示一个最佳液滴的内容，其包含一个模板DNA分子1102和一个微珠1103。

乳液PCR扩增(图11的步骤11122和1113)被设计用于单分子DNA分子的克隆扩增，生成的每一个微珠都含有单个序列的扩增子。利用常规PCR仪在PCR管中进行扩增。每管中可能包含约1.0万至100万的微珠，微珠尺寸为1μm至100μm，溶于20μL至100μL溶液中。在另一个实施例中，采用96或384孔板进行PCR。PCR循环程序的设计将包括尽可能的考虑增加表面结合第一链DNA1107的全长序列的长度和产量，并将它们作为合成Sanger测序片段的模板。这可以在40个循环的常规PCR(94℃，30秒，58℃60秒，68℃90秒)之后通过增加10至15个循环反应(例如，在94℃30秒，58℃360秒)进行杂交延伸。PCR反应后，可以加入异丙醇或其他溶剂，如乙醇，从而破坏乳液。在退火缓冲液之后微珠会用异丙醇或其他溶剂如乙醇进行冲洗。微珠上的第二链DNA通过在一个基础溶液中孵化后将被移除。在一个实施例中，约30％的微珠含有扩增子，而其余微珠将没有序列连接。在另一个实施例中，约50％微珠含有扩增子。在另一个实施例中，约70％微珠含有扩增子。30％的产率虽然感觉很低，但实际上是合理和可以接受的，因为我们要保持足够低的初始模板浓度，以避免在每滴油珠中含有多个DNA模板分子。在一个较佳实施例中，包含的一个步骤可以富集扩增子包含微珠。在一个富集步骤的实施例中，扩增子包含微珠通过其5’-生物素化寡核苷酸retrieved，寡核苷酸与扩增子的3’-末端通用序列部分互补。利用链霉亲和素包被的磁珠进行提取。在另一个实施列中，扩增子包含微珠通过与荧光标记的寡核苷酸杂交，寡核苷酸与扩增子的3’-末端通用序列部分互补。然后通过流式细胞仪富集荧光标记的寡核苷酸结合微珠。

基于微珠的反应第二部分(图11的1115和1118步骤)是Sanger扩增反应。这些步骤的目的是在每个珠子上产生一个完整的一套干净的、荧光标记的Sanger序列片段，这些序列片段来自于同一个序列模板。在包含有来自于第一个emPCR(图11的1114)的微珠和矿物油的Sanger混合溶液中形成乳液。Sanger混合溶液包含聚合酶1104、dNTP 1104和荧光标记的ddNTP终止子1109，以及引物1108(图11的1115步骤)。Sanger扩增反应是在PCR仪上的PCR管内进行的。商业化试剂盒(例如ABI的

Terminator v3.1Cycle Sequencing Kits或GE HealthCare的DYEnamic ET mix)与方法可以用于这些步骤。在热循环程序末端的退火步骤可用于将扩增产物结合到固定模板上(图D11的1116步骤)。破乳和微珠洗涤条件，如利用低温和高盐缓冲液，可以被用来确保将Sanger扩增产物保留在微珠上(图11的1117)。在破乳中使用的异丙醇或其他溶剂，如乙醇会使DNA分子的结合更强，因此该进程没有关系。在微珠上直接纯化以去除未使用的标记终止子1109和其他影响信号检测和电泳分离的扩增试剂的能力，这是这一方法的一个显著优势。

图12所示为与图11相比的另一种可选微珠的表面组成。在这个方法中，捕获序列1202附着在连接有正向引物的微珠表面1203。捕获序列1202与Sanger片段的5’端通用部分互补(图121207)，被设计用于捕获与Sanger片段。在一个较佳实施列中，序列位于与前面所提的5’-生物素化寡核甘酸互补的部分之外，因此不会对富集PCR微珠造成任何问题。在一个较佳实施列中，这些捕获序列含有自由5’末端，避免任何聚合酶引伸以及减少与Sanger片段1207杂交的位阻效应。混合正向引物与捕获序列1203的一个潜在优势是减少了正向引物的表面密度，将改进在PCR反应中形成全长第一链DNA1201以及在Sanger反应中的引物延伸条件。

本发明的方法可能会使用各种大小、形状、材料和多孔性的微珠。在微珠的选择过程中，将考虑：寡核苷酸序列的共价结合力，乳液PCR与Sanger反应的稳定性，表面负载密度，尺寸分布以及凝胶电泳分离的能力。材料包括但不限于(GE Healthcare，前AmershamBiosciences)，即交联琼脂糖，交联聚丙烯酰胺(来自Thermo ScientificPierce或其他公司)，

(Rapp Polymere GmbH)，即聚乙二醇接枝的低交联聚苯乙烯，和其它任何合适的材料。多数微珠具有官能团，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)和胺，已存在在微珠表面上以用于附着寡核苷酸。在一个实施例中，含有3’或者5’末端胺基团的寡核苷酸通过形成稳定的胺键附着在NHS官能化微珠上。在一个较佳实施例中，具有54个骨架原子或者更长的聚乙二醇链被加到寡核苷酸的表面附着末端，达到减少在聚和反应和杂交反应的位阻效应。

在一个较佳实施例中，通过确定所需的微珠表面负载容量和毛细管电泳测序的检测极限来达到微珠尺寸的优化。根据入射光强度、荧光分子和光学检测，毛细管电泳中激光诱导荧光的检测极限为102-106个荧光团分子。对于毛细管电泳测序，应该很容易每条带检测105荧光分子，也有可能降低10倍(Blazej 2006)。因此，例如，为了读600条带，需要600×105＝6×107＝100attomoles标记Sanger的片段，可能可以减少到10attomoles。

电泳阵列

本发明器件与方法的第二个元件是高密度毛细管阵列电泳单元。与当前的分离毛细管不同，高密度毛细管阵列可用于形成3D电泳法分离系统，从而显著提高通量。毛细管阵列可以具有各种形状、大小和密度。材料可以通过玻璃加工技术制成，这一技术最初被发展用于光纤成像应用。Scott的阵列是用透明或者高对比度的黑色玻璃材料制作的。毛细管的内径(或孔径)大约为5μm-1mm。阵列的长度大约为1mm-2m。首选的阵列应该包含有密集包被、均一分布的毛细孔，其孔内构造光滑，并且前末端与后末端表面都是经过抛光工艺达到光学光洁度的。在一个实施例中，选用了来自Schott的一个线性高密度毛细管阵列，其孔径为50μm，毛细管长为80cm，并且在20x20mm2的横截面面积上可装载20万个。其他孔径，可以选择例如5μm，10μm，20μm，或者100μm。其他包装量，例如100，1,000，10,000，1,000,000，甚至更高以满足特定应用。

图14A所示为包含毛细管阵列模块的电泳池的示意图。毛细管阵列模块1412被置于电解池1406的正中间。图14B所示为毛细管阵列块的3D视图。虽然图中没有显示，电解池中还有冷却与加热元件、温度传感器和温度控制机制，既可以去除焦耳加热产生的热量也可以对电泳池进行加热以保持进行优化和可重复电泳分离所需的温度。图14所示的一个热交换区1404利用了毛细管阵列模块的部分毛细管。以水或空气等作为热交换流体通过入口1416进入电解池，达到强化传热的效果。在电解质池中合适的位置放置阴极电极1402以及阳极电极1409，产生一个横跨所有毛细管的电压降。在一个较佳实施列中，电极由铂制成。电极材料也可以采用例如多孔炭等其他材料。值得一提的是所有的毛细血管电泳条件没有必要完全一致，也没有必要使所有毛细管中特定大小的片段经过时间完全同步，因为每个泳道中所跑的胶是独立进行分析的，因此，可以根据本说明书后文提到的实时荧光图像在每个毛细管建立一个独立的色谱。还应该考虑到探针以及电解池的结构设计以便于释放电极表面产生的气体。在一个较佳实施例中，电解池支架1406是用玻璃制作的，也可采用其它耐热、非导电材料，例如耐热塑料和陶瓷。为使在进行胶填装时易于使用毛细管阵列，上层的套头1415以及底部窗口1407是可拆卸的。在一个较佳实施例中，套头是由耐热以及非导电材料制成的，如聚砜、聚苯硫醚或陶瓷。在一个较佳实施例中，底部窗口1407是由100μm-500μm的超薄玻璃制成。在玻璃窗口1407与底部毛细管模块表面1412之间的套头1417应相对较短，从50μm到200μm。这使得共聚焦激光扫描显微镜(在本说明书之后的章节中详细介绍)能够聚焦到毛细管1411。在一个较佳实施例中，电解质稳定流过目标孔室，冲走染色标记废料，从而降低光子检测信号的背景值。除电解池外，一个电泳子系统可能还包括一个用于电泳的高压电源和一个PID温度控制器。

在一个较佳实施列中，毛细管表面首先经由化合物处理，然后用胶填满。表面处理以及凝胶形成方法根据应用的不同而不同，并且在文献中有详细介绍，如Zhang 1999，Blazej 2006等，在此已以提述方式纳入。本发明的一个实施例中，毛细管阵列填胶的方式是注射法。用于注射的工具包括密封垫片和注射器。

有多种技术可将微珠加载到毛细管中。在一个实施例中，将微珠分散在凝胶垫上，通过轻压毛细管阵列块表面和凝胶垫将其推进毛细管阵列块内。在另一个实施例中，首次制造出如图15所示的毛细管进口上的浅井1502，表面流动着含有缓冲溶液的微珠，通过轻轻搅拌使微珠由于重力(所有交联胶材料的密度都必须比水的高)进入孔中。在一个较佳实施例中，微珠的尺寸应该是略微小于毛细管孔径，保证一个孔里面将不会填充2个微珠。在一个实施列中，孔1501是在填胶的过程中产生的。从毛细管阵列块的底部开始填充胶，并且略微溢出，通过挤压抹去表面被挤出来的过多的凝胶，然后从底部抽出少量、固定的量以生成孔。在一个较佳实施例中，在抽出之前先在阵列块上注入缓冲液，避免在孔内产生气泡。填充过后，用洗脱缓冲液冲走表面多余的微珠。

洗脱序列的快速样品进样对获得高分辨率的毛细管电泳分离至关重要。一方面，应该采取谨慎措施，防止Sanger片段在装载过程中与微珠分离。这可以通过将微珠保存在较低温度(如4℃)下和在装载过程中使用非变性缓冲液达到上述目的。尽管图14上未显示，电解池套头至少有两个用于流体流动、缓冲液交换、微珠搅动及从小室中移除多余微珠的液体口。微珠装载完毕后，打开电泳的电场，用电泳缓冲液替代非变性缓冲液，打开电解池套头上的快速加热器急骤加热微珠(未在图14上显示)，即开始进样。急骤加热将导致Sanger片断与微珠分离。

信号检测

推荐方法的第三个关键元件是快速共焦成像仪。现有的CE测序仪使用的信号检测方法是从一维组装毛细管的一侧激发和收集荧光信号。该方法显然不能用于二维毛细管阵列中。我们必须使用一个可收集二维平面上所有毛细管信号的方法。我们选择共聚焦激光扫描成像仪，因为它可以从原料上非常薄的表层上检出信号，同时限制了信号收集板(或焦平面)上方和下方材料的干扰。

图13所示为一个快速共焦激光扫描显微镜子系统与集成系统连接的示意图。这种设计是对一个最初由UC Irvine的Parker实验室(Callamaras 1999)制造的video rate共聚焦显微镜的改良。用一个双行氩离子激光器1331作为激发光源，激发标记ddNTP(来自ABI公司和GE HearlthCare)中使用的4种能量转换染料。在操作过程中，激光束通过平凹镜1333被放大，经由二向色滤光镜1334，Y检流计1335和X检流计1336完成一系列反射，由反射镜1338经过显微镜目镜1337，然后通过显微镜物镜1339，集中于毛细管阵列块1312下表面之上的焦平面1319。激发的共聚焦平面深度可通过改变平凹镜1333的焦距或显微镜物镜1339和平凹镜1333之间的距离进行调整。X-Y激光扫描由X和Y检流计1335及1336进行。用一个工作于8kHz的谐振振荡器(可向GeneralScanning购买)替代其中一个检流计可以实现视频频率高速扫描。荧光发射光由物镜1339收集，沿激光束相反的方向返回直到到达二向色滤光镜1334，一个长通滤光镜。该发射光穿过二向色滤光镜1334，由反射镜1352反射，穿过光圈1340，由一组二向色滤光镜(1341，1342和1343)和带通过滤器(1345，1346，1347和1344)选择，由匹配波长的光电倍增管(1348，1349，1350和1351)检测。通过改变虹膜光圈1340的孔径可以调整荧光探测共聚焦平面的深度。

作为推荐的毛细管阵列电泳的高通量信号检测器，成像仪必须满足几个要求。首先，它必须以足够快的速度以及足够高的分辨率捕获预定扫描范围内所有毛细管的色谱。通常毛细管电泳两个相邻测序峰之间的时间间隔为5到8秒。若在两个相邻峰之间需要10个数据点，成像仪扫描速度必须达到至少每秒2帧。其次，由于推荐的毛细管阵列实际上是一个X-Y方向上分布不同测序模板及Z方向(毛细管轴向方向)上分布不同尺寸测序碎片的3D电泳系统，该成像仪必须在三维空间上都具有足够的空间分辨率。在项目的第一阶段，我们将使用毛细管直径50μm、毛细管中心到中心距离60μm的毛细管阵列。假设每个毛细管捕捉的最低要求为5x5像素，该成像器在X和Y方向将需要60/5＝12μm的分辨率。在Z方向上，毛细管阳极末端两相邻峰之间的距离大约是在1500μm。为真正分辨两峰之间的10个数据点，聚焦深度不得超过1,500/10＝150μm。基于此前类似的显微镜设计结果，均可达到上述要求。至于图像分辨率，第一阶段计划显示为512×5122.6×105像素。在每秒2帧的情况下，每个光电倍增管需要能够收集到2.6×105×2＝5.2×105Hz速度的数据。一个光电倍增管的典型响应时间大约为2纳秒，这意味着最大数据收集频率为1/(2×10-9)＝5×108Hz，远远超出了我们的第一阶段的速度要求，并为我们在项目的第二阶段提高数据通量提供了充足空间。例如，我们计划在第二阶段在100万毛细管中进行测序。假设同样要求每个毛细管5×5像素及每秒2帧，我们需要一个5×5×106×2＝5×107Hz的数据收集率，仍然低于光电倍增管的极限。在系统层面，我们认识到了来自于制造以及在几十平方厘米区域内快速和高分辨率共焦成像的大范围潜在应用的挑战。

系统集成和操作

除图13所示的元件外，还需添加一个流体支管、多区温度控制元件、检流计的电子驱动、光电倍增管的电子放大器和一个具有高速数据采集板和高速数据存储的计算机系统。利用软件程序进行数据收集和仪器控制。该程序可以在图像上定位毛细管的位置，提取信号强度，并通过连接所有数据点的强度数据制成电泳图(图16)。

此处介绍的方法同时还可以用于形成已被形成双链固定(即没有分离)的核酸的双链。稳定的双链一旦发现特异性的互补位点就会保留溶液分子，防止表面分子返回到溶液表面。有一个方法揭示了用Huisgen环加成反应(click化学)进行偶联反应(图23)。改性后的dU位点含有末端炔基(图24与图25)，连接基团的长度适合在Click反应或其他偶联反应条件中形成跨链连接。在一个实施例中，在乙醇与水的混合物反应中，有CuSO4和Ph3P的存在和有如图26所示的序列存在的条件下进行2小时。

具体实施例

实施例1洗提毛细管束中的序列

测序CE块由拉制玻璃制成，用内径为100m的毛细管形成通道横截面积为2x3mm2、长5cm的凹陷通道束。在测序通道中通过毛细效应填充10％的PAGE胶，使溶液流过底部面积(与通道垂直)的一半区域来加载样品(见下文介绍)。使用的样品中含有4种荧光染料标记的长度不同的寡核苷酸。这4种寡核苷酸为FAM-18mer，Cy3-6mer，Cy3-38mer和FAM-46mer。之后将测序CE块在水平的电泳装置中放置一定时间(分钟)，取出后用荧光显微镜(Olympus BX41EPI荧光研究显微镜)获取外端表面的图像，再将其放回到电泳装置中继续。将这个过程重复几次，所得的记录图像如图5所示。A、B(顶部那一行，图C1)中图像较窄的一侧为没有加载样品的质控区。时间进程见图像上方。75-80min，检测到FAM-18mer，随后在85min检测到Cy3-6mer，在97min检测到Cy3-38mer，最后检测到的FAM-46mer为中心102min附近的一条宽条带。值得注意的是Cy3-6寡核苷酸，GGTTGG，是一个G-四链体基序；四链的6mer在凝胶图像在表现的像是24-mer。我们的实验室对Cy3-GGTTGG在多种条件下的G-四链体形成进行了研究，验证了我们在测序芯片中观察到的现象。通过利用2种检测波长，俯视图反映的是从毛细管通道洗提的物质以及一小时电泳中分解(图像A、B，图C1)的四种寡核苷酸(FAM-18mer，Cy3-6mer，Cy3-38mer，and FAM-46mer)。数据低分辨率较低(主要是由于样品溶液加载过程中在多个被照亮的通道之间发生交叉污染)。

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Claims (40)

1.一种测定DNA分子的核酸碱基序列的方法包括：

a)提供多个核酸模板和附着有聚合物分子的微珠，其中所述聚合物分子可将所述核酸模板结合到所述微珠上；

b)在包含扩增核酸模板序列所需试剂的第一反应溶液中混合所述核酸模板和微珠；

c)形成第一乳液来生成多个包含所述核酸模板、微珠和第一反应溶液的微反应器，其中至少一个所述微反应器包括单个的核酸模板和包被在第一反应溶液中的单个微珠，其中所述微反应器包含在同一容器中；

d)在所述微反应器中扩增核酸，形成核酸的扩增拷贝；

e)破第一乳液并冲洗微珠；

f)混合由4种不同三磷酸脱氧核苷、一种续进性DNA聚合酶和4种不同标记的、可在特定核酸碱基终止DNA合成的DNA合成终止剂组成的第二反应溶液和附着在微珠上的核酸模板；

g)形成第二乳液来生成多个包含核酸模板、微珠和第二反应溶液的微反应器，其中至少一个微反应器包括单个的核酸模板和包裹在第二反应溶液中的单个微珠，其中微反应器包含在同一容器中，其中每个终止剂在不同的核酸碱基终止DNA合成，所以形成终止序列；

h)破第二乳液并冲洗微珠；

i)将微珠加载到多个毛细管中，使得一个微珠加载到一个毛细管中；

j)使所述终止序列从微珠上分离；

k)根据序列大小分离第二乳液反应中的终止序列；

l)利用标记合成终止剂检测所述终止序列，这样至少可以确定上述DNA分子的一部分核酸碱基序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸模板的长度为25-1500碱基。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸模板的长度为50-1200碱基。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸模板的长度为100-1000碱基。

5.根据权利要求1所述的方法，其中附着在微珠上的所述聚合物分子是引物分子。

6.根据权利要求1所述的方法，其中附着在微珠上的所述聚合物分子是捕获分子。

7.根据权利要求1所述的方法，其中进一步包含所述微珠的孵化，使得在第二反应溶液中混合附着在微珠上的核酸模板之前和破乳液和冲洗微珠之后，该核酸模板为单链存在。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA合成终止剂是荧光染料标记的双脱氧核苷酸。

9.根据权利要求6所述的方法，其中所述双脱氧核苷酸是ddT、ddA、ddG和ddC。

10.根据权利要求1、6或7所述的方法，其中通过共聚焦显微镜来检测终止序列。

11.根据权利要求1所述的方法，其中加热将所述终止序列从微珠上分离。

12.根据权利要求1所述的方法，其中毛细管个数超过1000个毛细管。

13.根据权利要求1所述的方法，其中毛细管个数是大约10000到大约100000个毛细管。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述毛细管为整体式结构。

15.根据权利要求1所述的方法，其中第一反应溶液包含一种或多种引物。

16.一种制备标记终止的DNA序列的方法包括：

a)通过多个含有单条DNA模板序列的微珠提供多个DNA模板；

b)混合由4种不同三磷酸脱氧核苷、一种续进性DNA聚合酶和4种不同标记的、可在特定核酸碱基终止DNA合成的DNA合成终止剂组成的第二反应溶液和附着在微珠上的核酸模板；

c)形成第二乳液来生成多个包含核酸模板、微珠和第二反应溶液的微反应器，其中至少一个微反应器包括一个单个的核酸模板和包裹在第二反应溶液中的单个微珠，其中微反应器包含在同一容器中，其中每个所述终止剂在不同的核酸碱基终止DNA合成，所以形成终止序列。

17.根据权利要求13所述的方法，其中多个微珠是超过1000000个。

18.根据权利要求13所述的方法，其中多个微珠是大约100000到大约10000000之间。

19.根据权利要求13所述的方法，其中多个DNA模板是在大约100到大约1000000之间。

20.根据权利要求13所述的方法，其中多个DNA模板是在大约1000到大约100,000之间。

21.一种检测荧光标记终止DNA序列的器件包括：

a)多个填充了凝胶高聚物的毛细管；

b)将微珠送入毛细管的办法；和

c)共聚焦激光扫描仪。

22.根据权利要求21所述的器件，其中多个毛细管组成毛细管模块。

23.根据权利要求22所述的器件，其中所述毛细管模块包含大约1000到大约200000个毛细管。

24.根据权利要求22所述的器件，其中所述毛细管模块包含大约10000到大约50000个毛细管。

25.根据权利要求21所述的器件，其中所述毛细管直径为大约1微米到大约500微米。

26.根据权利要求21所述的器件，其中所述毛细管直径为大约10微米到大约100微米。

27.根据权利要求21所述的器件，其中所述毛细管长度为大约1厘米到大约500厘米。

28.根据权利要求21所述的器件，其中所述毛细管长度为大约10厘米到大约100厘米。

29.根据权利要求21所述的器件，其中所述毛细管长度为大约40厘米到大约80厘米。

30.根据权利要求21所述的器件，其中进一步包括电解池架。

31.根据权利要求21所述的器件，其中进一步包括换热器件。

32.根据权利要求21所述的器件，其中进一步包括盖子。

33.根据权利要求21所述的器件，其中所述共聚焦扫描仪包括激光器件。

34.根据权利要求21所述的器件，其中所述共聚焦扫描仪进一步包括一个或多个带通过滤器。

35.根据权利要求21所述的器件，其所述中共聚焦扫描仪进一步包括一个或多个选色过滤器。

36.根据权利要求21所述的器件，其中所述共聚焦扫描仪进一步包括显微镜目镜。

37.根据权利要求21所述的器件，其中所述共聚焦扫描仪进一步包括显微镜物镜。

38.根据权利要求21所述的器件，其中所述共聚焦扫描仪以100000赫兹到10000000赫兹的速率收集阵列图像数据。

39.根据权利要求21所述的器件，其中所述共聚焦扫描仪收集时间-分辨图像来获得多个序列信息。

40.根据权利要求21所述的器件，其中毛细管有一个末端凹陷以容纳微珠。

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