CN110441526A - 一种基于蛋白质芯片技术鉴别羊毛纺织品文物样的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及文物鉴定领域，公开了一种基于蛋白质芯片技术鉴别羊毛纺织品文物样的方法，本发明采用蚕沙为原料以简易绿色的方式制备碳点，将稀土铽离子直接掺杂进碳点，使得碳点具有高稳定性，然后将其标记山羊抗兔抗体作为蛋白质芯片的捕捉抗体，提取文物样的蛋白质作为抗原，兔抗羊毛角蛋白抗体作为固定抗体，根据产生的荧光信号，定性的检测出羊毛纺织品，该方法具有高通量，高特异性、高灵敏度等特点。
Description
技术领域
本发明涉及文物鉴定领域，尤其涉及一种基于蛋白质芯片技术鉴别羊毛纺织品文物样的方法。
背景技术
在漫长的历史长河中，纺织品文物见证了我国社会更替、经济发展和文化交融，是研究我国古代社会经济技术文化水平的珍贵史料。目前出土的纺织品中，羊毛纺织品所占比例较大，该类纺织品易受到墓葬环境中水分、温度、酸碱度及微生物等影响而发生老化分解，从而引起大分子链的断裂，肽段的降解，出土时已成为碎片、微痕迹。这就使我们无法获得更多的信息来研究古代文明。因此，准确高效地鉴定古代羊毛纺织品文物样对于文物保护有着很重要的意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于蛋白质芯片技术鉴别羊毛纺织品文物样的方法。
本发明的具体技术方案为：一种基于蛋白质芯片技术鉴别羊毛纺织品文物样的方法，包括以下步骤：
1)将0.01g-0.1g文物样溶解于100-1000mL的CB 9.6缓冲液中，混合搅拌均匀，静置，取上清液即为抗原液；
2)取蚕沙，去除杂质，研磨成10μm-40μm的蚕沙粉末；将蚕沙粉末加去离子水后高温处理，取出冷却，将所得产物加入去离子水搅拌8-12min，然后超声处理，得到分散均匀的悬浊液，离心提取上清液；将上清液透析，微孔滤膜过滤，旋转蒸发浓缩后得到浓缩碳点溶液；
3)取8-12mL浓缩碳点溶液与4-6mL的0.1M Tb(NO3)3溶液在室温下反应2-4小时；然后再用分子量为500-1000Da的透析袋透析4天以上，移除自由的Tb3+，冷冻干燥后溶于去离子水中，得到铽修饰的碳点溶液；
4)取18-22μL铽修饰的碳点溶液，18-22μL EDC溶液和8-12μL NHS溶液混合反应3-7min；再加入0.15-0.25mg山羊抗兔抗体，常温下反应2-4h，反应结束后得到碳点标记的山羊抗兔抗体即为二抗液，置于1-5℃下保存保存；
5)将兔抗角蛋白抗体用蛋白质点样液制成0.4-0.6mg/mL的抗体固定液，用蛋白芯片点样仪的点样针在PSG上进行点样，点样结束后置于芯片固定盒中，在35-39℃下固定18-19h；
6)固定结束后，向所得基片的列阵加入30-40微升的0.8-1.2wt％BSA溶液，作为封闭液，在35-39℃下封闭1.5-2.5h；
7)弃去封闭液，用PBS 7.4洗涤4-6次后甩干，取步骤1)所得的抗原液30-40微升，加入列阵，将CB 9.6缓冲液作为阴性对照，在35-39℃的条件下孵育0.5-1.5h；
8)弃去抗原液，用PBS 7.4洗涤4-6次后甩干，取30-40微升步骤4)所得二抗液加入列阵，在35-397℃下孵育0.5-1.5h；
9)弃去二抗液，用PBS 7.4洗涤4-6次后甩干后，使用荧光扫描仪扫描检测荧光信号值，若文物样为羊毛纺织品，则能检测到荧光信号，反之则无。
作为优选，步骤2)中，取蚕沙粉末，加入去离子水，置于反应釜或马弗炉或烘箱中，在190-210℃下反应2-4h。
该方法所得到的碳量子点具有很大的荧光强度，且表面富含氨基，便于与抗体的结合。
作为优选，步骤4)中，所述铽修饰的碳点溶液浓度为0.3mg/mL，所使用的EDC溶液浓度为8-12mg/mL，NHS溶液浓度为1.3-1.7mg/mL。
在上述条件下，活化碳点表面的官能团以便与抗体结合。
作为优选，步骤7)、8)和9)中，用PBS 7.4洗涤时间为4-6min/次，以充分洗掉未结合物质的目的，防止残留对实验结果造成影响。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
(1)本发明以蚕沙为原料制备的碳点不仅表面富含氨基，而且荧光强度很大，该制备方法又符合绿色环保原则，无毒无害，与环境友好。
(2)本发明用稀土铽离子直接掺杂进碳点，使得碳点具有高稳定性和抗氧化能力，其光致发光性能不易受到环境的影响。
(3)本发明首次使用蛋白质芯片技术鉴定毛纺织品文物样，该方法具有高通量，高特异性、高灵敏度等特点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
一种基于蛋白质芯片技术鉴别羊毛纺织品文物样的方法，包括以下步骤：
1)将0.01g七种不同的文物样溶解于100ml的CB9.6缓冲液中，混合搅拌均匀，静置。
2)取蚕沙一定量，去除里面的残败枯叶和细小尘土等杂质，并且用研钵将原料磨成10μm的粉末。取适量蚕沙粉末，加入适量去离子水，置于马弗炉，在200℃下反应3h，取出瓷盘，冷却，将获得的产物加入适量去离子水磁力搅拌10min左右，然后进行超声处理，得到分散均匀的悬浊液，悬浊液经离心提取上清液；将获得的上清液透析，用微孔滤膜过滤，旋转蒸发浓缩得到浓缩碳点溶液。
3)10mL的步骤2)中的浓缩碳点溶液与5ml的Tb(NO3)3溶液(0.1M)在室温下反应3小时。然后再用分子量为500Da的透析袋透析4天以上，移除自由的Tb3+，冷冻干燥后溶于去离子水中。
4)取20μL步骤3)中的铽修饰的碳点溶液(0.3mg/m1)，20μL EDC溶液(10mg/mL)和10μL NHS(1.5mg/m1)溶液混合反应约5min。再加入0.2mg山羊抗兔抗体，常温下反应2h。标记物置磁力搅拌器中混匀，使其反应均匀，反应结束后置于4℃冰箱保存。
5)将兔抗角蛋白抗体用蛋白质点样液制成0.5mg/ml的抗体固定液，用蛋白芯片点样仪的点样针在PSG上进行点样，点样结束后置于芯片固定盒中，在37℃下固定18h。
6)固定结束后，基片的每列阵加入30微升的1％BSA溶液，在37℃的条件下封闭2h。
7)弃去封闭液，用PBS 7.4洗涤4次(5min/次)后甩干，取步骤1)处理后的七种不同的上清液各30微升，分别加入不同的列阵，将CB9.6缓冲液作为阴性对照，在37℃的条件下孵育1h。
8)弃去抗原液，用PBS 7.4洗涤4次(5min/次)后甩干，取步骤4)处理后的碳点标记的山羊抗兔抗体分别加入不同的列阵，每列阵30微升，在37℃的条件下孵育1h。
9)弃去二抗液，用PBS 7.4洗涤4次(5min/次)后甩干后，使用荧光扫描仪扫描检测荧光信号值，若文物样为羊毛纺织品，则能检测到荧光信号，反之则没有。
实施例2
一种基于蛋白质芯片技术鉴别羊毛纺织品文物样的方法，包括以下步骤：
1)将0.055g七种不同的文物样溶解于550mL的CB 9.6缓冲液中，混合搅拌均匀，静置。
2)取蚕沙一定量，去除里面的残败枯叶和细小尘土等杂质，并且用研钵将原料磨成25μm的粉末。取适量蚕沙粉末，加入适量去离子水，置于反应釜中，在200℃下反应3h，取出瓷盘，冷却，将获得的产物加入适量去离子水磁力搅拌10min左右，然后进行超声处理，得到分散均匀的悬浊液，悬浊液经离心提取上清液；将获得的上清液透析，用微孔滤膜过滤，旋转蒸发浓缩得到浓缩碳点溶液。
3)10mL的步骤2)中的浓缩碳点溶液与5ml的Tb(NO3)3溶液(0.1M)在室温下反应3小时。然后再用分子量为750Da的透析袋透析4天以上，移除自由的Tb3+，冷冻干燥后溶于去离子水中。
4)取20μL步骤3)中的铽修饰的碳点溶液(0.3mg/ml)，20μL EDC溶液(10mg/mL)和10μL NHS(1.5mg/ml)溶液混合反应约5min。再加入0.2mg山羊抗兔抗体，常温下反应3h。标记物置磁力搅拌器中混匀，使其反应均匀，反应结束后置于4℃冰箱保存。
5)将兔抗角蛋白抗体用蛋白质点样液制成0.5mg/ml的抗体固定液，用蛋白芯片点样仪的点样针在PSG上进行点样，点样结束后置于芯片固定盒中，在37℃下固定18.5h。
6)固定结束后，基片的每列阵加入35微升的1％BSA溶液，在37℃的条件下封闭2h。
7)弃去封闭液，用PBS 7.4洗涤5次(5min/次)后甩干，取步骤1)处理后的七种不同的上清液各35微升，分别加入不同的列阵，将CB 9.6缓冲液作为阴性对照，在37℃的条件下孵育1h。
8)弃去抗原液，用PBS 7.4洗涤5次(5min/次)后甩干，取步骤4)处理后的碳点标记的山羊抗兔抗体分别加入不同的列阵，每列阵35微升，在37℃的条件下孵育1h。
9)弃去二抗液，用PBS 7.4洗涤5次(5min/次)后甩干后，使用荧光扫描仪扫描检测荧光信号值，若文物样为羊毛纺织品，则能检测到荧光信号，反之则没有。
实施例3
一种基于蛋白质芯片技术鉴别羊毛纺织品文物样的方法，包括以下步骤：
1)将0.1g七种不同的文物样溶解于1000mL的CB 9.6缓冲液中，混合搅拌均匀，静置。
2)取蚕沙一定量，去除里面的残败枯叶和细小尘土等杂质，并且用研钵将原料磨成40μm的粉末。取适量蚕沙粉末，加入适量去离子水，置于烘箱，在200℃下反应3h，取出瓷盘，冷却，将获得的产物加入适量去离子水磁力搅拌10min左右，然后进行超声处理，得到分散均匀的悬浊液，悬浊液经离心提取上清液；将获得的上清液透析，用微孔滤膜过滤，旋转蒸发浓缩得到浓缩碳点溶液。
3)10mL的步骤2)中的浓缩碳点溶液与5ml的Tb(NO3)3溶液(0.1M)在室温下反应3小时。然后再用分子量为1000Da的透析袋透析4天以上，移除自由的Tb3+，冷冻干燥后溶于去离子水中。
4)取20μL步骤3)中的铽修饰的碳点溶液(0.3mg/ml)，20μL EDC溶液(10mg/mL)和10μL NHS(1.5mg/m1)溶液混合反应约5min。再加入0.2mg山羊抗兔抗体，常温下反应4h。标记物置磁力搅拌器中混匀，使其反应均匀，反应结束后置于4℃冰箱保存。
5)将兔抗角蛋白抗体用蛋白质点样液制成0.5mg/ml的抗体固定液，用蛋白芯片点样仪的点样针在PSG上进行点样，点样结束后置于芯片固定盒中，在37℃下固定19h。
6)固定结束后，基片的每列阵加入40微升的1％BSA溶液，在37℃的条件下封闭2h。
7)弃去封闭液，用PBS 7.4洗涤6次(5min/次)后甩干，取步骤1)处理后的七种不同的上清液各40微升，分别加入不同的列阵，将CB 9.6缓冲液作为阴性对照，在37℃的条件下孵育1h。
8)弃去抗原液，用PBS 7.4洗涤6次(5min/次)后甩干，取步骤4)处理后的碳点标记的山羊抗兔抗体分别加入不同的列阵，每列阵40微升，在37℃的条件下孵育1h。
9)弃去二抗液，用PBS 7.4洗涤6次(5min/次)后甩干后，使用荧光扫描仪扫描检测荧光信号值，若文物样为羊毛纺织品，则能检测到荧光信号，反之则没有。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (4)
1.一种基于蛋白质芯片技术鉴别羊毛纺织品文物样的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将0.01g-0.1g文物样溶解于100-1000mL的CB9.6缓冲液中，混合搅拌均匀，静置，取上清液即为抗原液；
2)取蚕沙，去除杂质，研磨成10μm-40μm的蚕沙粉末；将蚕沙粉末加去离子水后高温处理，取出冷却，将所得产物加入去离子水搅拌8-12min，然后超声处理，得到分散均匀的悬浊液，离心提取上清液；将上清液透析，微孔滤膜过滤，旋转蒸发浓缩后得到浓缩碳点溶液；
3)取8-12mL浓缩碳点溶液与4-6mL的0.1M Tb(NO3)3溶液在室温下反应2-4小时；然后再用分子量为500-1000Da的透析袋透析4天以上，移除自由的Tb3+，冷冻干燥后溶于去离子水中，得到铽修饰的碳点溶液；
4)取18-22μL铽修饰的碳点溶液，18-22μL EDC溶液和8-12μL NHS溶液混合反应3-7min；再加入0.15-0.25mg山羊抗兔抗体，常温下反应2-4h，反应结束后得到碳点标记的山羊抗兔抗体即为二抗液，置于1-5℃下保存保存；
5)将兔抗角蛋白抗体用蛋白质点样液制成0.4-0.6mg/mL的抗体固定液，用蛋白芯片点样仪的点样针在PSG上进行点样，点样结束后置于芯片固定盒中，在35-39℃下固定18-19h；
6)固定结束后，向所得基片的列阵加入30-40微升的0.8-1.2wt％BSA溶液，作为封闭液，在35-39℃下封闭1.5-2.5h；
7)弃去封闭液，用PBS7.4洗涤4-6次后甩干，取步骤1)所得的抗原液30-40微升，加入列阵，将CB9.6缓冲液作为阴性对照，在35-39℃的条件下孵育0.5-1.5h；
8)弃去抗原液，用PBS7.4洗涤4-6次后甩干，取30-40微升步骤4)所得二抗液加入列阵，在35-397℃下孵育0.5-1.5h；
9)弃去二抗液，用PBS7.4洗涤4-6次后甩干后，使用荧光扫描仪扫描检测荧光信号值，若文物样为羊毛纺织品，则能检测到荧光信号，反之则无。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，取蚕沙粉末，加入去离子水，置于反应釜或马弗炉或烘箱中，在190-210℃下反应2-4h。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述铽修饰的碳点溶液浓度为0.3mg/mL，EDC溶液浓度为8-12mg/mL，NHS溶液浓度为1.3-1.7mg/mL。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤7)、8)和9)中，用PBS7.4洗涤为4-6min/次。
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