JP2012500007A - 安定したナノレポーター - Google Patents

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Abstract

本発明は、生体分子試料中の個々の標的分子の検出および定量のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、標的分子に結合することができ、プローブの固有に検出可能なシグナルに基づいて標的分子を同定することができる、改善された、安定したナノレポータープローブに関する。そのようなプローブを作製し、使用するための方法が提供されるように、プローブ中への包含のために標的特異的配列を同定するための方法もまた、提供される。ある種のナノレポーター成分のポリヌクレオチド配列もまた、提供される。プローブは、診断、予後、品質管理、およびスクリーニングの適用において使用することができる。

Description

相互参照
この出願は、２００８年８月１４日に出願された米国仮出願第６１／０８８，９８８号（この出願は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
ヒト身体中のすべての細胞は、同じ遺伝物質を含有しているが、同じ遺伝子が、それらの細胞のすべてにおいて活性なわけではない。遺伝子発現パターンの変化は、生物学的機能に対して深刻な影響を有し得る。遺伝子発現におけるこれらの変異は、変化した生理学的および病理学的プロセスの中核となり得る。そのため、細胞における遺伝子の発現の同定および定量は、新しい治療標的および診断標的の発見を支援することができる。
現在までに、複雑な試料中の複数の遺伝子の発現レベルの検出を一度に可能にする利用可能ないくつかの技術がある。これらの技術のほとんどは、このプロセスをより効率的にした、小型化された表面上に存在する何千もの固定ＤＮＡ配列からなるデバイスであるＤＮＡマイクロアレイを用いる。あいにく、この方法は、配列構成の小型化にもかかわらず、なお、著しい量の生物学的試料を必要とする。しかしながら、患部組織の生検材料または個別の細胞型の試料などのいくつかの場合において、生物学的試料は、供給が限られている。さらに、マイクロアレイの表面上のハイブリダイゼーションの反応速度は、少量の水溶液中のハイブリダイゼーションほど効率的ではない。さらに、マイクロアレイハイブリダイゼーション結果に基づいて、試料中に存在する核酸の量を評価するための方法が存在するが、マイクロアレイ技術は、これまでのところ、個々のレベルに基づく標的分子の検出を可能にせず、
したがって、複雑な混合物中の標的分子の正確で高感度の検出、同定、および定量の必要性が存在する。
本発明は、一般に、試料中の標的分子の検出、同定、および定量の分野に関する。本発明は、改善された、安定したナノレポーターおよびナノレポーターバックボーンのポリヌクレオチド配列中のある種の設計特徴に部分的に基づく、これらのナノレポーターの集団ならびにそれに付加される相補的ポリヌクレオチド配列に部分的に関する。
いくつかの実施形態では、本発明は、固有に標識されたナノレポータープローブの集団であって、それぞれのナノレポータープローブは、ｉ）固有の標的特異的領域およびｉｉ）固有の、設計されたナノレポーターを含む領域を含み、ナノレポーターは、一本鎖核酸バックボーンを含み、バックボーンは、固有の線状の組合せにおいて共に共有結合された複数の標識結合領域を含み、標識結合領域は、設計されたポリヌクレオチド配列の集団から選択され、それぞれのポリヌクレオチド配列は、１つまたは複数の検出可能な分子をそれに付加させている相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それぞれの相補的ポリヌクレオチド配列は、特異的な検出可能な分子を明示しており、それぞれのナノレポーターは、それを、上述の集団中の他のナノレポーターを区別する、検出可能なシグナルを有する、ナノレポータープローブの集団を提供する。いくつかの実施形態では、それぞれのバックボーンのそれぞれの標識結合領域は、その同じバックボーン中の他の標識結合領域とは異なる。いくつかの実施形態では、それぞれのナノレポータープローブは、定常領域をさらに含み、定常領域は、複数の繰り返しヌクレオチド配列を含む。ナノレポータープローブの集団は、２以上のナノレポータープローブを含むことができる。
いくつかの実施形態では、本発明は、試料中の少なくとも１つの標的分子の存在を決定するための方法であって、（１）（ａ）少なくとも１つの標的分子ならびに（ｂ）固有の標的特異的領域および固有の設計されたナノレポーターを含む領域を含む少なくとも１つのプローブを含む、少なくとも１つの分子複合体を形成するステップであって、上述のナノレポーターは、一本鎖核酸バックボーンを含み、バックボーンは、固有の線状の組合せにおいて共に共有結合された複数の標識結合領域を含み、それぞれの標識結合領域は、１つまたは複数の検出可能な分子をそれに付加させている相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それぞれの相補的ポリヌクレオチド配列は、特異的な検出可能な分子を明示するステップならびに試料中の上述の少なくとも１つの標的分子の存在を決定するために、１つまたは複数の分子複合体または少なくとも１つの分子複合体の少なくとも一部の存在を個々にカウントするステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、分子複合体の有効な分子カウントの百分率は、約１２．５％よりも高い。いくつかの実施形態では、カウント数は、Ｍ１３ ＤＮＡを含むナノレポータープローブを使用する場合に得られるカウントの少なくとも２倍である。Ｍ１３ ＤＮＡを含むナノレポーターは、共に共有結合された複数のＭ１３ ＤＮＡ領域を含む一本鎖バックボーンを含むことができ、それぞれの領域は、１つまたは複数の検出可能な分子をそれに付加させている相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする。
本発明の方法および組成物のいくつかの実施形態では、試料の標準化の後の分子複合体のそれぞれのバックグラウンドを超えるカウント数は、Ｍ１３ ＤＮＡを含むナノレポータープローブと比較した場合、少なくとも２倍高い。いくつかの実施形態では、その標識結合領域にハイブリダイズした場合の相補的ポリヌクレオチド配列のＴｍは、約８０℃以上である。いくつかの実施形態では、その標識結合領域にハイブリダイズした場合の相補的ポリヌクレオチド配列の融解温度（Ｔｍ）は、Ｍ１３ ＤＮＡを含むナノレポータープローブにハイブリダイズした場合の、Ｍ１３ ＤＮＡに相補的なポリヌクレオチド配列のＴｍよりも高い。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、それぞれの複合体が、（ａ）少なくとも１つの標的分子ならびに（ｂ）固有の標的特異的領域および固有の設計されたナノレポーターを含む領域を含む少なくとも１つのプローブを含む、複数の分子複合体を形成することを含む方法によって、複数の標的分子の存在を決定するステップをさらに含み、それぞれのナノレポーターは、一本鎖核酸バックボーンを含み、バックボーンは、固有の線状の組合せにおいて共に共有結合された複数の標識結合領域を含み、それぞれの標識結合領域は、１つまたは複数の検出可能な分子をそれに付加させている相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それぞれのプローブは、異なるナノレポーター領域を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも５、１０、２０、３０、５０、１００、２００、３００、または５００の異なる標的分子の存在は、決定される。いくつかの実施形態では、標的分子は、核酸である。いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも１つの遺伝的突然変異、少なくとも１つの体細胞突然変異、少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）、少なくとも１つの点突然変異、少なくとも１つの欠失突然変異、少なくとも１つの挿入突然変異、少なくとも１つの染色体転座、またはその組合せを含む。いくつかの実施形態では、標的分子は、診断の指標となる。
いくつかの実施形態では、本発明は、ｉ）固有の標的特異的領域およびｉｉ）線状の組合せにおいて共に共有結合された複数の設計された標識結合領域を含む領域を含む、固有に標識されたナノレポータープローブであって、それぞれの標識結合領域は、約８００〜１３００ヌクレオチド塩基を含み、約５０％のＧ／Ｃ含量を有し、それぞれの選択される標識結合領域は、他の選択される標識結合領域とは異なり、それぞれの標識結合領域は、１つまたは複数の検出可能な分子をそれに付加させている相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、相補的ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１／１のＧ／Ｃ比を有する、固有に標識されたナノレポータープローブを提供する。いくつかの実施形態では、相補的ポリヌクレオチド配列は、約３／２のＧ／Ｃ比を有する。いくつかの実施形態では、ナノレポータープローブは、定常領域をさらに含み、定常領域は、複数の繰り返しヌクレオチド配列を含む。
本発明の方法および組成物のいくつかの実施形態では、標識結合領域は、約８００〜１３００ヌクレオチド塩基を含み、約５０％のＧ／Ｃ含量を有し、相補的ポリヌクレオチド配列は、約１／１のＧ／Ｃ比を有する。いくつかの実施形態では、相補的ポリヌクレオチド配列は、約３／２のＧ／Ｃ比を有する。本明細書において記載される標識結合領域を生成するために使用することができる鋳型の例は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群より選択される配列を含むが、これらに限定されない。
本発明の方法および組成物のいくつかの実施形態では、標識結合領域は、同様のアデニン含量を含む。いくつかの実施形態では、アデニン塩基は、少なくとも平均８〜１６ヌクレオチド塩基毎の間隔を置いて配置される。いくつかの実施形態では、標識結合領域は、アデニン塩基の規則的に繰り返されたパターンを含む。いくつかの実施形態では、アデニン塩基は、約８〜１６ヌクレオチド塩基毎の間隔を置いて配置される。いくつかの実施形態では、標識結合領域は、約３５〜４５％のチミン含量を含む。
本発明の方法および組成物のいくつかの実施形態では、相補的ポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡポリヌクレオチド配列を含む。ＲＮＡポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つのアミノアリル修飾ウラシル塩基を含むことができる。いくつかの実施形態では、相補的ポリヌクレオチド配列中の検出可能な分子は、アミノアリル修飾ウラシル塩基に付加される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチド配列は、上述のＲＮＡポリヌクレオチド配列中で平均約８〜１６塩基毎の間隔を置いて配置される、複数のアミノアリル修飾ウラシル塩基を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な分子は、アリル修飾ウラシル塩基のそれぞれに付加される。
本発明の組成物および方法のいくつかの実施形態では、検出可能な分子は、蛍光色素である。
いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも１つの固有に標識されたナノレポーターを調製するための方法であって、ｉ）それぞれが約８００〜１３００ヌクレオチド塩基および約５０％のＧ／Ｃ含量を含む、複数の標識結合領域を組み合わせるステップであって、それぞれの選択された標識結合領域は、他の選択された標識結合領域とは異なるステップ、ｉｉ）線状の組合せにおいて複数の標識結合領域を互いに共有結合させるステップ、ならびにｉｉｉ）上述の標識結合領域に相補的ポリヌクレオチド配列をハイブリダイズするステップを含み、上述の相補的ポリヌクレオチド配列は、１つまたは複数の検出可能な分子をそれに付加させている、方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、標的特異的領域に標識ナノレポーターを付加させることによって、標識ナノレポータープローブを調製するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、相補的ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１／１のＧ／Ｃ比を有する。
いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも１つの固有に標識されたナノレポーターを調製するためのキットであって、ａ）それぞれが約８００〜１３００ヌクレオチド塩基、約５０％のＧ／Ｃ含量を含む少なくとも３つの標識結合領域およびｂ）検出可能な分子をそれに付加させている少なくとも３つの相補的ポリヌクレオチド配列を含み、相補的ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１／１のＧ／Ｃ比を有するキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも３つの標的特異的プローブをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書において記載されるナノレポーターの集団およびその使用のための説明書を含むキットを提供する。
参照による組込み
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれの刊行物、特許、または特許出願が、参照によって組み込まれるように、明確に、個々に示されるのと同じ程度まで、参照によって本明細書において組み込まれる。
本発明の新規な特徴を、添付の特許請求の範囲において特殊性を用いて説明する。本発明の特徴および有利性のよりよい理解が、本発明の原理を利用する例示的実施形態を説明する下記の詳細な説明およびその添付図面の参照によって得られるであろう。
図１は、キャプチャープローブおよび単一の６位ナノレポーター成分を使用する６位ナノレポーターコードを用いるデュアルナノレポーターの略図である。矢印は親和性タグの例示であり、この親和性タグは場合により含まれ、ナノレポーターの精製または画像化目的のナノレポーター（またはナノレポーター−標的分子複合体）の固定に使用できる。 図２Ａは、図２Ｂおよび２Ｃに示された実験の略図である。この場合、ひし形は、伸長の前に、複合体を１方の末端と表面とで結合するために使用されたビオチンを表す。図２Ｂおよび２Ｃは、Ｓ２−Ａのキャプチャープローブ、Ｓ２−Ｂの標識ナノレポーターおよびＳ２の標的ＤＮＡ（図２Ｂ）またはＳ２の標的ＲＮＡ（図２Ｃ）をハイブリダイズさせた実験の画像を示す。図２Ｅは、個々にＳ２−Ａのキャプチャープローブ、Ｓ２−Ｂの標識ナノレポーターおよびＳ２標的ＤＮＡを含有する、図２Ｂによるナノレポーター複合体のクローズアップを示す。図２Ｄは、陰性対照実験の画像を示し、この実験において、Ｓ２−Ａのキャプチャープローブ、Ｓ２−Ｂの標識ナノレポーターをハイブリダイズさせ、Ｓ２の標的ＲＮＡはハイブリダイズさせなかった。 図３Ａ〜３Ｂは、一方の末端に親和性タグＡ１を有する、（核酸に基づく）標識ナノレポーターを示す。図３において、標識ナノレポーターは、Ａ１の結合を介して、固定化された親和性パートナーに固定化されている。ナノレポーターの他の末端は溶液中であるが（図３Ａ）、ナノレポーターを固定化するために使用される別の親和性タグ（Ａ２）を含有する相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより固定化できる（図３Ｂ）。アビジンまたはストレプトアビジンコーティング表面への固定化に関して、Ａ１およびＡ２は同じ、たとえばビオチンであり得る。Ａ１の固定化において、ナノレポーターコードの検出を可能にする手法において標識結合領域を分離するために、ナノレポーターは、たとえば、エレクトロストレッチングにより伸長または図３に表されるように「延長」されうる。場合により、ナノレポーターが延長された状態であると同時に、Ａ２は、表面下のＡ２に相補的なナノレポーターの末端に導入され、結合される。 図４Ａは、マイクロ流体素子中のＤＮＡ分子の一方の末端の固定化を例示し、図４Ｂは、電場におけるＤＮＡの伸長を例示し、図４Ｃは、延長後に素子に導入された親和性タグによる、伸長されたＤＮＡ分子の第二の末端の選択的固定化を表す。 図５は、ＤＶ１およびＭ１３ナノレポーター系の双方を使用する、同じ試料中のＩＬ−８の検出を示す。データは、実施例４に従って実施された実験から収集した。 図６は、２種の試料中の４０種の遺伝子の発現の測定におけるＤＶ１およびＭ１３系の比較を示す。データは、実施例４に従って実施された２種の代表的な実験から収集した。 図７はＧｕｓＢの発現の検出を示す。この実験において、１４８種の同一のプローブを含有するＭ１３およびＤＶ１ライブラリーを使用し、２６種のマウスＲＮＡ試料中の遺伝子発現レベルを測定した。Ｍ１３レポーターと比較してＤＶ１レポーターにより測定されたカウントの絶対数に関して平均６倍の増加が見られた。データは、実施例５に従って実施された代表的な実験から収集した。 図８は、「有効なレポーター」のグラフを示し、「有効なレポーター」は画像解析ソフトウェアにより「可算」レポーターとして解釈されうるスポットのストリングを指す。結果は、視野における結合事象の総数の百分率として記載している。ＤＶ１レポーターの有意に高い百分率は可算であり、この実験において、データ中で３倍の増加をもたらす（１２．５％から３８％）。 図９は、本発明の一本鎖ナノレポーターバックボーンをクローニング、増殖および作製するために利用できる、プラスミドベクターのポリヌクレオチド配列を示す。 図１０は、一本鎖ナノレポーターバックボーンを作製するための色素最適化実験に利用された２種の鋳型のポリヌクレオチド配列を示す（実施例６を参照されたい）。これらの鋳型配列において、規則的に繰り返された塩基はチミンであり、転写においてチミンは、規則的に繰り返された塩基としてアデニンを有する相補的一本鎖ナノレポーターバックボーンを産生する。図１０Ａは、約８ヌクレオチド毎に規則的に繰り返された塩基を有する鋳型のポリヌクレオチド配列を示す。図１０Ｂは、約１０ヌクレオチド毎に規則的に繰り返された塩基を有する鋳型のポリヌクレオチド配列を示す。 図１１は、一本鎖ナノレポーターバックボーンを作製するための色素最適化実験に利用された２種の鋳型のポリヌクレオチド配列を示す（実施例６を参照されたい）。図１１Ａは、約１２ヌクレオチド毎に規則的に繰り返された塩基を有する鋳型のポリヌクレオチド配列を示す。図１１Ｂは、約１４ヌクレオチド毎に規則的に繰り返された塩基を有する鋳型のポリヌクレオチド配列を示す。 図１２は、一本鎖ナノレポーターバックボーンを作製するための色素最適化実験に利用された２種の鋳型のポリヌクレオチド配列を示す（実施例６を参照されたい）。図１２Ａは、約１６ヌクレオチド毎に規則的に繰り返された塩基を有する鋳型のポリヌクレオチド配列を示す。図１２Ｂは、約２４ヌクレオチド毎に規則的に繰り返された塩基を有する鋳型のポリヌクレオチド配列を示す。
本発明は、生体分子試料中の個々の標的分子の検出および定量のための組成物および方法を提供する。特に、本発明は、個々の標的分子に結合することができる、安定したナノレポーターを提供し、標的分子の改善された検出を提供する。ナノレポーターの標識コードを通して、標的分子へのナノレポータープローブの結合は、標的分子の同定をもたらす。そのようなナノレポーターを作製し、使用するための方法もまた、提供される。ナノレポーターは、診断、予後、品質管理、およびスクリーニングの適用などの様々な適用において使用することができる。
本発明のある態様は、設計された（たとえば合成配列）ナノレポーターのライブラリーまたは集団の選択に関する。より具体的には、ある種の最適化された配列特徴は、ナノレポーターの改善された分子安定性およびナノレポーターが標的特異的配列と結合する場合に、改善された検出を提供する。たとえば、本発明の方法および組成物は、二次構造をもたらさず、一貫した明るさをもたらす、固有の合成バックボーンを含むナノレポーターを提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、設計された（たとえば合成）ナノレポーターの集団であって、上述のナノレポーターは、複数の異なる検出可能な分子を含み、それぞれのナノレポーター中の複数の異なる検出可能な分子は、それと、上述の集団中の他のナノレポーターを区別する、検出可能なシグナルを有する、設計された（たとえば合成）ナノレポーターの集団を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、改善された分子安定性を有する、設計されたナノレポーターの集団を提供し、集団中のそれぞれのナノレポーターは、それを、上述の集団中の他のナノレポーターと区別する、検出可能なシグナルを有する。
いくつかの実施形態では、本発明は、検出可能な標識をそれに付加させている固有の相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする、固有の設計されたバックボーン（たとえば合成）を含むナノレポーターを提供する。それぞれのナノレポーターは、検出アッセイの過程の間に変化しないであろう、固有のシグナルを生成するであろう。すなわち、ナノレポーターと関連する、固有で区別可能なシグナルまたはシグナルコードは、検出アッセイの過程の間、同じままであろう。いくつかの実施形態では、検出可能な標識をそれに付加させている相補的ポリヌクレオチド配列は、一貫した明るさを有するｉｎ ｖｉｔｒｏ転写色素結合ＲＮＡセグメントとすることができる。本明細書において記載される一貫した明るさは、色素結合ＲＮＡセグメントによって産生されるシグナルの強度、サイズ、および／または輝度を指す。すなわち、いくつかの実施形態では、色素のシグナルの強度、サイズ、および／または輝度は、それに付加された同じ色素を有する色素結合ＲＮＡセグメントの中で同様であろう。たとえば、それに付加された緑色色素を有する色素結合ＲＮＡセグメントは、同様のシグナルまたは同じ輝度および／もしくは明るさを有するシグナルを有するであろう。それは、画像分析ソフトウェア／アルゴリズムまたはユーザーが、特定の色のスポットが明るさおよびサイズに関してどのように見えるかを確定すること可能にするので、これは、とりわけ、有用である。さらに、いくつかの色素は、他の色素のチャネルににじむかもしれず、シグナルの強度が一貫している場合、シグナルを通してのにじみもまた、一貫しており、したがって、にじみを無視することを可能にするであろう。さらに、スポットパラメーター内にない画像中のノイズを無視することができる。その結果として、たとえば、ナノレポーターのシグナルと関連するパラメーターを厳密に確定することができ、ソフトウェア／アルゴリズムまたはユーザーがより高い百分率のノイズを無視することを可能にする。これらは、より強く、より信頼できる読取りを提供する。
いくつかの実施形態では、ナノレポーターは、ヌクレオチドベースの標識結合領域の配置を有するバックボーンを含み、それぞれの標識結合領域は、特異的な標識について明示される特異的配列を有する。この系では、バックボーンの固有の配列は、ナノレポーターのカラーコードを規定する。それぞれのバックボーンは、それぞれが特異的な明示される標識（たとえば色）を有する、その配列に相補的なポリヌクレオチド配列にのみアニールするであろう。したがって、たとえば、ポリヌクレオチド配列が、検出プロセスの間にバックボーンから分離しても、それぞれのバックボーンは、明示されるコードのみを生成するであろう。ナノレポーター中のポリヌクレオチド配列が、合成またはハイブリダイゼーション手順の間に分離する場合、それらは、同じ色のポリヌクレオチド配列とのみ交換することができ、共有される標識または取り換えられる標識の可能性を排除する。検出可能な標識をそれに付加させている相補的ポリヌクレオチド配列は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写色素結合ＲＮＡセグメントとすることができる。いくつかの実施形態では、個々に固有のポリヌクレオチドベースの標識結合領域鋳型のライブラリーから所与のナノレポーターバックボーンを構築する際に、それぞれの標識結合領域は、検出可能な標識（たとえば検出可能な分子）を割り当てられ、所与のバックボーン内のそれぞれの標識結合領域は、その同じバックボーン中の他の標識結合領域とは異なるように選択される。
いくつかの実施形態では、配列は、ある塩基が修飾ヌクレオチドとしてｉｎ ｖｉｔｒｏ重合ＲＮＡまたはＤＮＡの中に導入される場合、この塩基の一様な分布を有するように設計され、結合された標識（たとえば蛍光）の一様な分布を可能にする。いくつかの実施形態では、配列は、できるだけ不定形で固有のものとしてナノレポーターを作製するために、直列または逆向き反復配列を伴わないで、設計される。いくつかの実施形態では、配列は、長さが１１００塩基対の配列にわたって９以上のヌクレオチドのいかなる直列または逆向き反復配列をも伴わないで設計される。いくつかの実施形態では、配列は、任意の１００塩基対領域にわたって７以上のヌクレオチドのいかなる直列または逆向き反復配列をも伴わないで設計される。いくつかの実施形態では、標識結合領域および／または相補的ポリヌクレオチド配列は、特定のＧ／Ｃ含量および比を含む。
これらの設計された標識結合領域を生成するために利用されてもよいポリヌクレオチド鋳型の例は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４のポリヌクレオチド配列中に記載される。
したがって、本発明のある態様は、固有のナノレポーターまたはナノレポータープローブの集団を提供し、それぞれ、固有のポリヌクレオチドベースのバックボーンから成り、集団中のそれぞれのナノレポーターは、集団中の他のナノレポーターと異なるだけではなく、改善された分子安定性およびそれを、上述の集団中の他のナノレポーターと区別する検出可能なシグナルもまた有する。いくつかの実施形態では、それぞれのナノレポータープローブは、複数の個々の設計された標識結合領域を含む。いくつかの実施形態では、それぞれの標識結合領域は、その同じナノレポーター中の他の標識結合領域とは異なる。したがって、ある態様では、本発明は、改善された検出特性を有する固有のナノレポーターのより安定した集団を提供する。そのような特徴を有する例示的なナノレポーターは、本明細書において記載され、ＤＶ１ナノレポーターと呼ばれる。
ナノレポーター
完全に構築され、標識されたナノレポータープローブは、２つの主な部分、標的分子に結合することができる標的特異的配列および標的特異的配列と関連するシグナルの「コード」（「ナノレポーターコード」）を提供する標識ナノレポーターを含む。標的分子へのナノレポータープローブの結合に際して、ナノレポーターコードは、ナノレポーターが結合する標的分子を同定する。
ナノレポーターは、モジュール構造である。いくつかの実施形態では、ナノレポーターは、複数の異なる検出可能な分子を含む。いくつかの実施形態では、標識ナノレポーターは、ある種の基本的なエレメント：（ｉ）特定の固有の線状の組合せにおいて付加された複数の固有の標識結合領域および（ｉｉ）バックボーンの標識結合領域に付加された相補的ポリヌクレオチド配列を含有する分子の実体である。いくつかの実施形態では、標識ナノレポーターは、特定の固有の線状の組合せにおいて付加された２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の固有の標識結合領域およびバックボーンの標識結合領域に付加された相補的ポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、標識ナノレポーターは、特定の固有の線状の組合せにおいて付加された３以上の固有の標識結合領域およびバックボーンの標識結合領域に付加された相補的ポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、標識ナノレポーターは、特定の固有の線状の組合せにおいて付加された６以上の固有の標識結合領域およびバックボーンの標識結合領域に付加された相補的ポリヌクレオチド配列を含む。ナノレポータープローブは、これもまたバックボーンに付加された標的特異的配列をさらに含む。
標識結合領域という用語は、検出可能な分子に対する個々の結合ポイントとして果たしてもよい、所与のバックボーン内の規定されたポリヌクレオチド配列の領域を含む。いくつかの実施形態では、標識結合領域は、設計された配列を含む。一本鎖標識結合領域を生成するために利用されてもよい規定されるポリヌクレオチド鋳型配列の特定の例は、その適した変異体に加えて、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４において記載される鋳型配列を含む（すべての中間の整数を含む６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％以上の配列同一性を有する配列）。配列番号１〜２４の鋳型配列の転写は、配列番号１〜２４の配列に相補的なポリヌクレオチド配列を有する一本鎖標識結合領域を生成する。
いくつかの実施形態では、標識ナノレポーターはまた、定常領域を含有するバックボーンをも含む。定常領域という用語は、ナノレポーターに共有結合した約１０〜約２５ヌクレオチドの縦列反復配列を含む。定常領域は、ナノレポーターの５’領域または３’領域のいずれかに付加することができ、定常領域に相補的な配列を固体基質に付加させることによってなどのように、画像処理または検出のためのナノレポーターの捕捉および固定のために利用されてもよい。ある態様では、定常領域は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の縦列反復配列を含有し、反復配列は、それぞれ、約１２〜１８、１３〜１７、または約１４〜１６ヌクレオチドを含む、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上のヌクレオチドを含む。
本明細書において記載されるナノレポーターは、合成の設計された配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポーターは、標識の明るさの改善された一貫性を提供する。本明細書において記載される一貫した明るさは、標識セグメントによって産生されるシグナルの強度、サイズ、および／または輝度を指す。すなわち、いくつかの実施形態では、標識セグメントのシグナルの強度、サイズ、および／または輝度は、それに付加した同じ標識を有するセグメントの中で同様であろう。上記に記載されるように、この改善された一貫性は、より強いデータに至る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、少なくとも平均８、９、１０、１２、１５、１６、２０、３０、または５０塩基の間隔を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、少なくとも平均８〜１６塩基の間隔を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、少なくとも平均８塩基の間隔を有する。いくつかの実施形態では、配列は、バックボーン中に適正に規則的に間隔を有するパターンのヌクレオチド（たとえばアデニン）残基を含有する。これは、検出可能な分子をそれに付加させている相補的ポリヌクレオチド配列中の規則的に間隔を有する相補的ヌクレオチドを可能にする。たとえば、いくつかの実施形態では、ナノレポーター配列が、バックボーン中に適正に規則的に間隔を有するパターンのアデニン残基を含有する場合、その相補体は、相補的ＲＮＡセグメント中の規則的に間隔を有するパターンのウリジン（Ｕ）残基となり、セグメントのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は、アミノアリル修飾ウリジン塩基を使用して行うことができ、これは、セグメントに沿って規則的な間隔で色素分子の共有結合によるアミン結合を可能にする。いくつかの実施形態では、配列は、配列中に、少なくとも平均８、９、１０、１２、１５、１６、２０、３０、または５０塩基の間隔を有する、約同じ数または百分率のヌクレオチド（たとえばアデニン）を含有する。これは、検出可能な分子をそれに付加させている相補的ポリヌクレオチド配列中の同様の数または百分率を可能にする。したがって、いくつかの実施形態では、配列は、規則的に間隔を有していないが、少なくとも平均８、９、１０、１２、１５、１６、２０、３０、または５０塩基の間隔を有するヌクレオチドを含有し、配列中のヌクレオチドの数は、ナノレポーターについての所望の明るさに依存して変化することができる。いくつかの実施形態では、相補的ヌクレオチドの２０％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％は、検出可能な分子に結合する。たとえば、いくつかの実施形態では、ナノレポーター配列が、バックボーン中に同様の百分率のアデニン残基を含有する場合、相補的セグメントのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は、アミノアリル修飾ウリジン塩基を使用して行われ、アミノアリル修飾ウリジン塩基の２０％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％は、検出可能な分子に結合することができる。その代わりに、アミノアリル修飾ウリジン塩基およびウリジン塩基の比は、所望の明るさを達成するためにｉｎ ｖｉｔｒｏ転写プロセスの間に変化させることができる。たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写プロセスは、いくつかのまたはすべてのアミノアリル修飾ウリジン塩基を検出可能な分子に結合することができる場合、アミノアリル修飾ウリジン塩基に対するウリジンの１／１の比を有する混合物の存在下において行うことができる。したがって、当業者は、ナノレポーターの中で一貫した明るさを達成することができるいくつかの方法があることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポーターは、適正に一貫した融解温度（Ｔｍ）を有する。いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるナノレポーター中のその標識結合領域にハイブリダイズする場合の相補的ポリヌクレオチド配列のＴｍは、Ｍ１３ ＤＮＡを含むナノレポータープローブにハイブリダイズした場合のＭ１３ ＤＮＡ鋳型に相補的なポリヌクレオチド配列のＴｍよりも高い。あらゆる理論に制限されることを意図するものではないが、本明細書において記載されるナノレポーターのＴｍは、ナノレポーターバックボーンおよび検出可能な分子をそれに付加させている相補的ポリヌクレオチド配列の間のより強い結合を提供し、そのため、合成およびハイブリダイゼーション手順の間の解離を予防する。さらに、ナノレポーターの集団の中の一貫したＴｍは、最適条件がすべてのスポットおよび位置について同じとなるように、合成およびハイブリダイゼーション手順が厳重に最適化されることを可能にする。いくつかの実施形態では、ナノレポーターの配列は、５０％のグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）を有し、連続して多くとも３つのＧを有する。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、集団中のナノレポーターの中のＴｍが適正に一貫しているナノレポーターの集団を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、その標識結合領域にハイブリダイズした場合の相補的ポリヌクレオチド配列のＴｍが、約８０℃、８５℃、９０℃、１００℃以上である、ナノレポーターの集団を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、その標識結合領域にハイブリダイズした場合の相補的ポリヌクレオチド配列のＴｍが約８０℃以上である、ナノレポーターの集団を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポーターは、任意の安定した分子内塩基対形成相互作用（たとえばヘアピン）などの、最小限の二次構造を有するまたは二次構造を有していない。あらゆる理論に制限されることを意図するものではないが、ナノレポーター中の最小限の二次構造は、ナノレポーターバックボーンおよび検出可能な分子をそれに付加させているポリヌクレオチド配列の間のよりよいハイブリダイゼーションを提供する。さらに、ナノレポーター中の最小限の二次構造は、ナノレポーター中の検出可能な分子のよりよい検出を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポーターは、７５℃、１×ＳＳＰＥのアニール条件下で著しい分子内対形成を有しない。二次構造は、ＭＦＯＬＤなどの、当技術分野で公知のプログラムによって予測することができる。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポーターは、それぞれの鎖中に１％未満の逆向き反復配列を含有し、逆向き反復配列は、９塩基以上である。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポーターは、それぞれの鎖中に逆向き反復配列を含有していない。いくつかの実施形態では、ナノレポーターは、長さが１１００塩基対である配列にわたって９以上のヌクレオチドのいかなる逆向き反復配列をも含有していない。いくつかの実施形態では、ナノレポーターは、任意の１００塩基対領域にわたって７以上のいかなるヌクレオチドの逆向き反復配列をも含有していない。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポーターは、それぞれの鎖中に１％未満の逆向き反復配列を含有し、逆向き反復配列は、長さが１１００塩基対である配列にわたって９以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポーターは、それぞれの鎖中に１％未満の逆向き反復配列を含有し、逆向き反復配列は、任意の１００塩基対領域にわたって７以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポーターは、一方の鎖がＣＴリッチとなり、他方がＧＡリッチとなるように、偏った鎖特異的含量を含有する。
本発明は、固有のナノレポーターを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポーターは、１％未満の直列反復配列を含有する。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポーターは、直列反復配列を含有していない。いくつかの実施形態では、ナノレポーターは、長さが１１００塩基対である配列にわたって９以上のヌクレオチドのいかなる直列反復配列をも含有していない。いくつかの実施形態では、標識ナノレポーターは、任意の１００塩基対領域にわたって７以上のヌクレオチドのいかなる直列反復配列をも含有していない。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポーターは、それぞれの鎖中に１％未満の直列反復配列を含有し、直列反復配列は、長さが１１００塩基対である配列にわたって９以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポーターは、それぞれの鎖中に１％未満の直列反復配列を含有し、直列反復配列は、任意の１００塩基対領域にわたって７以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポーターは、バックボーンにおいて使用される任意の他の配列に対してまたはＲＥＦＳＥＱ公的データベースにおいて記載される任意の配列に対して、８５、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５％未満の相同性を含有する。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポーターは、バックボーンにおいて使用される任意の他の配列に対してまたはＲＥＦＳＥＱ公的データベースにおいて記載される任意の配列に対して、８５％未満の相同性を含有する。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポーターは、バックボーンにおいて使用される任意の他の配列に対してまたはＲＥＦＳＥＱ公的データベースにおいて記載される任意の配列に対して相同性の２０、１６、１５、１０、９、７、５、３、２未満の隣接する塩基を含有する。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポーターは、バックボーンにおいて使用される任意の他の配列に対してまたはＲＥＦＳＥＱ公的データベースにおいて記載される任意の配列に対して相同性の多くとも１５の隣接する塩基およびナノレポーターの全長にわたって多くとも８５％の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポータープローブの配列特徴は、標的分子の改善された検出を提供する。たとえば、標的分子の同定をもたらす、標的分子へのナノレポータープローブの結合は、ナノレポーターの存在を個々に検出することによって実行することができる。これは、試料中の１つまたは複数のナノレポーター分子の存在を個々にカウントすることによって実行することができる。そのようなカウント法が使用されるいくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポータープローブは、カウント数の増加を可能にする。いくつかの実施形態では、試料の標準化の後の上述の分子複合体のバックグラウンドを超える分子カウント数は、３００、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００分子カウントよりも高い。いくつかの実施形態では、試料の標準化の後の上述の分子複合体のバックグラウンドを超える分子カウント数は、４００分子カウントよりも高い。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポータープローブの有効な分子カウントの百分率は、約１０、１１、１２、１２．５、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％よりも高い。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポータープローブの有効な分子カウントの百分率は、約１０％よりも高い。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポータープローブの有効な分子カウントの百分率は、約１２．５％よりも高い。いくつかの実施形態では、上述の試料の標準化の後の本明細書において記載されるナノレポーターのバックグラウンドを超える分子カウントの数は、Ｍ１３ ＤＮＡを含む、比較可能なナノレポータープローブよりも、少なくとも２、３、５、６、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍高い。Ｍ１３ ＤＮＡを含む比較可能なナノレポーターは、Ｍ１３ ＤＮＡバックボーンに付加される、同じ標的特異的領域を含むナノレポーターである。Ｍ１３ ＤＮＡを含む比較可能なナノレポータープローブの例は、実施例の部において記載される。いくつかの実施形態では、上述の試料の標準化の後の本明細書において記載されるナノレポーターのバックグラウンドを超える分子カウントの数は、Ｍ１３ ＤＮＡを含む、比較可能なナノレポーターよりも、少なくとも２倍高い。いくつかの実施形態では、上述の試料の標準化の後の本明細書において記載されるナノレポーターのバックグラウンドを超える分子カウントの数は、Ｍ１３ ＤＮＡを含む、比較可能なナノレポーターよりも、少なくとも６倍高い。いくつかの実施形態では、上述の試料の標準化の後の本明細書において記載されるナノレポーターのバックグラウンドを超える分子カウントの数は、Ｍ１３ ＤＮＡを含む、比較可能なナノレポーターよりも、少なくとも２０倍高い。いくつかの実施形態では、上述の試料の標準化の後の本明細書において記載されるナノレポーターのバックグラウンドを超える分子カウントの数は、Ｍ１３ ＤＮＡを含む、比較可能なナノレポーターよりも、少なくとも１００倍高い。
ナノレポーターのエレメントは、単一分子の実体（「単一」ナノレポーター）または２つの異なる分子の実体（「二重」ナノレポーター）で見つけることができる。それぞれの分子の実体は、１つの分子または共有結合もしくは非共有結合の手段によって互いに付加される１つを超える分子から構成されてもよい。いくつかの実施形態では、二重ナノレポーターのそれぞれの成分は、同じ標的分子上の異なる部位に結合する標的特異的配列を有する。これは、標的分子へのナノレポーターの結合のより効率的な反応速度を有する、より小さなナノレポーター成分およびより大きな結合特異性に起因する、よりよいシグナル：ノイズ比を可能にする。二重ナノレポーター系を使用する場合、ナノレポータープローブの１つは、非標識であってもよい。いくつかの実施形態では、非標識ナノレポータープローブは、捕捉領域を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、非標識ナノレポータープローブは、標的特異的領域および一本鎖であってもよいバックボーンを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、非標識ナノレポータープローブは、標的特異的領域および二本鎖であってもよいバックボーンを含んでいてもよい。
ナノレポーターバックボーンに付加される相補的ポリヌクレオチド配列は、ナノレポーターバックボーンに検出可能な分子または標識モノマーを付加させるための役目をする。相補的ポリヌクレオチド配列は、たとえば、相補的ポリヌクレオチド配列の中への１つまたは複数の検出可能な分子の共有結合による組込みによって直接、標識されてもよい。その代わりに、相補的ポリヌクレオチド配列は、相補的ポリヌクレオチド配列の中への、ビオチンまたは特異的リガンド相互作用が可能な他の分子の組込みによってなどのように、間接的に標識されてもよい。そのような実例では、リガンド（たとえば相補的ポリヌクレオチド配列の中へのビオチン組込みの場合のストレプトアビジン）は、検出可能な分子に共有結合されてもよい。標識結合領域に付加される検出可能な分子が、相補的ポリヌクレオチド配列の中に直接組み込まれない場合、この配列は、検出可能な分子および標識結合領域の間のブリッジとして果たし、ブリッジ分子、たとえばブリッジ核酸と呼ばれてもよい。
本発明の核酸ベースのナノレポーターおよびナノレポーター標的複合体は、定常領域またはナノレポーターまたは標的核酸に対して相補的である、オリゴヌクレオチドなどの核酸を使用してアフィニティー精製されてもよいまたは固定されてもよい核酸を含む。上記に述べられるように、いくつかの実施形態では、ナノレポーターは、精製のためのおよび／または固定（たとえば固体表面への）のためのアフィニティータグとして果たしてもよい、少なくとも１つの定常領域を含む。定常領域は、典型的には、一連の１５塩基反復配列などの反復ヌクレオチドの２以上の縦列反復領域を含む。そのような例示的な実施形態では、ナノレポーターは、標的分子と複合体を形成するかどうかに関わらず、反復単位のリバース相補体である１５塩基オリゴヌクレオチドを用いてコートされるアフィニティー試薬によって精製するまたは固定することができる。
ナノレポーターまたはナノレポーター標的分子複合体は、２以上のアフィニティー選択ステップにおいて精製することができる。たとえば、二重ナノレポーターでは、一方のプローブは、第１のアフィニティータグを含むことができ、他方のプローブは、第２の（異なる）アフィニティータグを含むことができる。プローブは、標的分子と混合され、二重ナノレポーターの２つのプローブを含む複合体は、一方または両方の個々のアフィニティータグに対するアフィニティー精製によって、非結合物質から分離される（たとえば標的またはナノレポーターの個々のプローブ）。第１のステップで、混合物は、第１のアフィニティータグに対するアフィニティー試薬に結合することができ、第１のアフィニティータグおよび所望の複合体を含むプローブのみが精製される。結合物質は、第１のアフィニティー試薬から放出され、任意選択で、第２のアフィニティータグに対するアフィニティー試薬に結合され、第１のアフィニティータグを含むプローブからの複合体の分離を可能にする。このポイントでは、完全な複合体のみが結合するであろう。複合体は、最後に、第２のアフィニティータグに対するアフィニティー試薬から放出され、次いで、好ましくは伸長され、画像化される。アフィニティー試薬は、結合パートナーを用いてコートされるカラム、ビーズ（たとえばラテックスビーズもしくは磁気ビーズ）、またはスライドなどの、アフィニティータグに対する結合パートナーを用いてコートされる、任意の固体表面とすることができる。アフィニティー試薬を使用するナノレポーターの固定および伸長は、その全体が本明細書において参照によって組み込まれる、２００５年１２月２３日に提出された、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ｏｒｉｅｎｔｅｄ，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｉｒ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」と題する、Ｓｅａｎ Ｍ．ＦｅｒｒｅｅおよびＤｗａｙｎｅ Ｌ．Ｄｕｎａｗａｙによる米国仮特許出願第６０／７５３，８１６号において十分に記載される。
所与のナノレポーターのバックボーンの様々な標識結合領域と関連する標識モノマーによって提供されるシグナルの配列は、ナノレポーターの固有の同定を可能にする。たとえば、蛍光標識を使用する場合、固有の同一性または固有のスペクトル識別特性を有するナノレポーターは、特異的標的分子またはその部分を認識する標的特異的配列と関連する。ナノレポーターが、標的分子へのナノレポーターの標的特異的配列（複数可）の結合を可能にする条件下で、標的分子を含有する混合物に曝露される場合、標的特異的配列（複数可）は、優先的に標的分子に結合する。ナノレポーターと関連する蛍光標識ナノレポーターのスペクトルコードなどのナノレポーターシグナルの検出は、混合物中の標的分子の存在の検出を可能にする（定性分析）。所与のスペクトルコードまたは識別特性と関連するすべての標識モノマーのカウントは、ナノレポーターに結合された標的特異的配列と関連する、混合物中のすべての分子のカウントを可能にする（定量分析）。ナノレポーターは、したがって、公知の生物学的マーカーの定量分析によって異なる生物学的状態（たとえば疾患対健康）の診断または予後に有用である。さらに、本発明のナノレポーターによって提供される単一分子の検出および定量の鋭い感度は、異なる生物学的状態の間のその変動がわずかすぎるので従来の分子の方法を使用して特定の生物学的状態との相関を検出することができないものを含む、新しい診断マーカーおよび予後マーカーの同定を可能にする。ナノレポーターベースの分子の検出の感度は、少量の生物学的試料における治療剤および診断剤の詳細な薬物動態学的分析を可能にする。
単一ナノレポーターと呼ばれる多くのナノレポーターは、１つの分子の実体から構成される。しかしながら、ナノレポーターの特異性を増加させるためにおよび／または標的分子へのその結合の反応速度を改善するために、ナノレポーターは、それぞれが同じ標的分子の異なる領域に結合する異なる標的特異的配列を含有する２つの分子の実体から構成される二重ナノレポーターとすることができる。二重ナノレポーターでは、２つの分子の実体の少なくとも一方は、標識される。他方の分子の実体は、必ずしも標識される必要はない。二重ナノレポーターのそのような非標識成分は、捕捉プローブとして使用されてもよく（図１および２を参照されたい）、複合体の視覚化および／または画像化を可能にするために、二重ナノレポーターおよび標的分子を含有する複合体を固定するおよび／または伸長するのに有用である、ビオチンなどの付加されるアフィニティータグを任意選択で有する。たとえば、いくつかの実施形態では、１つの６位コードナノレポーターおよび捕捉プローブを使用する、６位ナノレポーターコードを有する二重ナノレポーター。いくつかの実施形態では、７位ナノレポーターコードを有する二重ナノレポーターは、１つの８位ナノレポーター成分および１つの１位ナノレポーター成分を使用して使用することができる。いくつかの実施形態では、アフィニティータグを有する１つの捕捉プローブおよび１つの６位ナノレポーター成分を使用する、６位ナノレポーターコードを有する二重ナノレポーター。いくつかの実施形態では、アフィニティータグは、任意選択で含まれ、画像化の目的のためにナノレポーターを精製するまたはナノレポーター（もしくはナノレポーター標的分子複合体）を固定するために使用することができる。
それらのモジュール構造のために、ナノレポーターは様々な異なる方法において構築され、標識されてもよい。たとえば、ナノレポーターバックボーンは、標的特異的配列に付加させることができ（たとえばハイブリダイゼーションおよび任意選択でライゲーションによって）、バックボーンおよび標的特異的配列を含む構造は、検出可能な分子をそれに直接または間接的に結合させている１つまたは複数の相補的ポリヌクレオチド配列に付加させることができる。その代わりに、ナノレポーターバックボーンは、最初に、１つまたは複数の相補的ポリヌクレオチド配列に付加させることができ、次いで、バックボーン構造は、標的特異的配列に付加させることができる。したがって、他に述べられない限り、ナノレポーター構築のステップの議論または列挙は、構築の特異的な経路に従わなければならないことを示唆するものではない。
ナノレポーターの合成は、当技術分野において公知の任意の適した方法によって実行することができる。ナノレポーター配列（たとえばＤＶ１配列）を運搬する二本鎖プラスミドは、低温（３４℃以下）の条件下でいくつかの細菌株中で成長することができる。ナノレポーター線状一本鎖バックボーンは、制限酵素を用いる線状化、熱不安定性のホスファターゼを用いる脱リン酸化、バックボーン配列からクローニングベクターを分離するための第２の制限酵素を用いる消化、および完全なバックボーン断片の一方の鎖のみを残す鎖特異的ラムダエキソヌクレアーゼ消化を含む４ステップのプロトコールを使用して、二本鎖プラスミドＤＮＡから作製することができる。図９は、ナノレポーターの合成に使用されるベクターの例を示す。
ナノレポーターの構築および使用は、大部分は、様々な核酸ベースのナノレポーターの記載によって本明細書において例示される。部分的におよび完全に構築されたナノレポーターの例証となる実施形態は、下記に列挙される。
端的に言えば、本発明は、標識され、分析することができる複数（たとえば３つ）の標識結合領域を有する核酸バックボーンを提供し、これらのそれぞれは、合理的に設計されたヌクレオチド配列から作製される。これらの配列は、ナノレポーターをより安定にする、本明細書において記載される１つもしくは複数のまたはすべての特徴を包含する。これらの設計された標識結合領域を生成するために利用されてもよいポリヌクレオチド鋳型の例は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４のポリヌクレオチド配列中に記載される。それぞれの個々のバックボーンの標識結合領域は、固有の線状の順序または組合せで配置され、それぞれの個々のバックボーンを、集団中の他のバックボーンと比較して固有にする。集団中の個々のナノレポーターは、それぞれ、固有のバックボーンから作製されるので、それぞれのナノレポーターは、集団中の他のナノレポーターと比較して、同様に固有である。いくつかの実施形態では、それぞれの標識結合領域は、バックボーン中の他の標識ナノレポーター領域と比較した場合、固有である。
いくつかの実施形態では、それぞれのナノレポーター内の個々の標識結合領域のヌクレオチド配列は、そのナノレポーター内の他の標識結合領域のヌクレオチド配列とは異なり、再配列、そのような組換え、標識ポリヌクレオチド配列の共有または取換えを防止し、それによって分子の安定性を改善する。バックボーン上に形成されることとなる標識結合領域の数は、バックボーンの長さおよび性質、ナノレポーターを標識する手段、ならびにバックボーンの標識結合領域に付加されることとなる、シグナルを提供する標識モノマーのタイプに基づく。いくつかの実施形態では、それぞれの標識結合領域の相補的ヌクレオチド配列は、特異的な検出可能な分子を割り当てられる。
本発明はまた、１つまたは複数の標識結合領域が、それぞれの検出可能な分子がシグナルを提供する対応する検出可能な分子に付加される標識ナノレポーターをも提供する。たとえば、いくつかの実施形態では、本発明による標識ナノレポーターは、これらの標識された標識結合領域またはスポットがそれらの固有の線状の配置に基づいて区別可能となるように、少なくとも３つの検出可能な分子が、バックボーンの３つの対応する標識結合領域に付加された場合に得られる。ナノレポーター検出との関連における「スポット」は、ナノレポーター上の標識結合部位に付加される標識モノマーから検出される、集合したシグナルであり、これは、標識結合領域のサイズおよび標識モノマーの性質（たとえば一次発光波長）に依存して、顕微鏡下で視覚化された場合、単一の点光源として現れてもよい。ナノレポーターに由来するスポットは、重複していてもよいまたは重複していなくてもよい。その標的分子を同定するナノレポーターコードは、スポットの長さの任意の順列、他のスポットと比較したその位置、および／またはそのシグナルの性質（たとえば一次発光波長（複数可））を含むことができる。一般に、本発明のそれぞれのプローブまたはプローブ対について、近接する標識結合領域は、非重複であるならびに／または近接する標識結合領域に由来するスポットは、少なくとも検出条件下で（たとえば、参照によって本明細書において組み込まれる米国特許出願第６１／０２９，２２０号において記載されるように、ナノレポーターが固定され、伸長され、顕微鏡下で観察される場合）、空間的におよび／もしくはスペクトル的に区別可能である。
時々、スポットサイズは、一定の数の塩基またはヌクレオチドとして言及される。当業者によって容易に理解されるように、これは、対応する標識結合領域における塩基またはヌクレオチドの数を指す。
ナノレポーターに由来するスポットの順序および性質（たとえば一次発光波長（複数可）、また任意選択で長さ）は、ナノレポーターの標的特異的配列（複数可）を通してナノレポーターが結合することが可能な標的分子を同定するナノレポーターコードとして働く。ナノレポーターが標的分子に結合した場合、ナノレポーターコードもまた、標的分子を同定する。任意選択で、スポットの長さは、ナノレポーターコードの成分となり得る。
バックボーンの異なる標識結合領域と関連するシグナルを提供する検出可能な分子は、検出条件下で区別不可能であるシグナルを提供することができる（「類似の」シグナル）または少なくとも検出条件下で（たとえば、ナノレポーターが固定され、伸長され、顕微鏡下で観察される場合）、区別可能なシグナルを提供することができる。
本発明はまた、２つ以上の検出可能な分子が標識結合領域に付加されるナノレポーターを提供する。上述の標識結合領域と関連する、検出可能な分子によって提供されるシグナルは、検出される、集合したシグナルを産生する。産生される集合したシグナルは、類似のシグナルから構成されてもよいまたは少なくとも２つの区別可能なシグナル（たとえばスペクトル的に区別可能なシグナル）から構成されてもよい。
一実施形態では、本発明は、類似のシグナルを提供する少なくとも３つの検出可能な分子が、バックボーンの３つの対応する標識結合領域に付加され、上述の３つの検出可能な分子が空間的に区別可能であるナノレポーターを提供する。他の実施形態では、本発明は、３つの区別可能なシグナルを提供する少なくとも３つの検出可能な分子が、３つの近隣の標識結合領域、たとえば３つの近接する標識結合領域に付加され、それによって、上述の少なくとも３つの標識モノマーがスペクトル的に区別可能であるナノレポーターを提供する。
本発明はまた、類似または非類似のシグナルを提供するスポットが、スペーサー領域によって分離され、それによって、スペーサー領域を間に置くことにより、ダークスポットの生成を可能にし、これによって、固有に検出可能なシグナルの可能な組合せを広げるナノレポーターをも提供する。用語「ダークスポット」は、ナノレポーター上の標識結合部位に由来するシグナルの欠如を指す。ダークスポットは、より多くのコード順列を追加し、ナノレポーター集団中のより大きなナノレポーター多様性を生成するためにナノレポーターコードの中に組み込むことができる。一実施形態では、スペーサー領域は、ナノレポーターを検出するために用いられる機器の分析によって決定される長さを有する。
本発明は、１つまたは複数の「ダブルスポット」を有するナノレポーターを提供する。それぞれのダブルスポットは、スペーサー領域によって分離されない、類似のシグナルを提供する、２以上（たとえば３、４、または５）の近接するスポットを含有する。ダブルスポットは、それらのサイズによって同定することができる。
本発明によるシグナルを提供する検出可能な分子は、標識結合領域に付加される相補的ポリヌクレオチド配列に共有結合または非共有結合されてもよい（たとえばハイブリダイゼーションを介して）。標識モノマーはまた、相補的ポリヌクレオチド配列の中に組み込まれる分子（たとえば相補的ポリヌクレオチド配列の中に組み込まれるビオチン）とのその相互作用を通して付加されるリガンド分子（たとえばストレプトアビジン）に共有結合することなどによって、相補的ポリヌクレオチド配列に間接的に付加されてもよく、これは、引き続いて、ハイブリダイゼーションを介してバックボーンに付加される。
本発明のある態様はまた、ナノレポーターのバックボーン上の標識結合領域に付加される（たとえば間接的に）標識モノマーによって提供されるシグナルの配列によって決定される、スペクトルコードなどの、固有に検出可能なシグナルと関連するナノレポーターであって、それによって、シグナルの検出は、ナノレポーターの同定を可能にするナノレポーターをも提供する。
一実施形態では、本発明は、ナノレポーターバックボーンに付加されるアフィニティータグをさらに含むナノレポーターを提供し、支持体へのアフィニティータグの結合は、バックボーン伸長およびバックボーン上の異なる標識結合領域に対応する標識モノマーによって提供されるシグナルの分析を可能にする。ナノレポーター伸長は、物理的、流体力学的、または電気的手段を含む手段を含むが、これらに限定されない、当技術分野において公知の任意の伸長手段を含んでいてもよい。アフィニティータグは、定常領域を含んでいてもよい。
本発明によるナノレポーターは、バックボーンに結合される標的特異的配列をさらに含むことができる。標的特異的配列は、ナノレポーターが標的分子を認識する、それに結合するまたは付加することを可能にするように選択される。本発明のナノレポーターは、すべてのタイプの標的分子の同定に適している。たとえば、適切な標的特異的配列は、標的分子の検出を可能にするためにナノレポーターのバックボーンに結合することができる。好ましくは、標的分子は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡ（ｍＲＮＡおよびｃＲＮＡを含む）、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。
本発明の一実施形態は、本発明による標識モノマーを用いる標的分子検出における増加した柔軟性を提供する。この実施形態では、それぞれが個別の標的特異的領域を有し、この少なくとも一方が標識される、２つの異なる分子の実体を含む二重ナノレポーターは、同じ標的分子に結合する。したがって、二重ナノレポーターの２つの成分の標的特異的配列は、選択される標的分子の異なる部分に結合し、それによって、二重ナノレポーターと関連するスペクトルコードの検出は、上述の二重ナノレポーターと接触させた生体分子試料中で、選択される標的分子の検出を提供する。
本発明はまた、生体分子試料中の特異的な標的分子の存在を検出するための方法であって、（ｉ）二重ナノレポーター中の標的特異的配列の標的分子への結合を可能にする条件下で、本明細書において記載されるナノレポーター（たとえば単一または二重ナノレポーター）と上述の試料を接触させるステップおよび（ｉｉ）二重ナノレポーターと関連するスペクトルコードを検出するステップを含む方法をも提供する。ナノレポーターアーキテクチャーに依存して、二重ナノレポーターは、標的分子に結合する前にまたはその後に標識されてもよい。
プローブの集団中のそれぞれのナノレポータープローブの固有性は、複数の標的分子の多重分析を可能にする。たとえば、いくつかの実施形態では、それぞれのナノレポータープローブは、６つの標識結合領域を含有し、それぞれのバックボーンのそれぞれの標識結合領域は、その同じバックボーン中の他の標識結合領域とは異なる。標識結合領域が、４つの色の１つを用いて標識され、標識結合領域についての２４の可能な固有の配列があり、それぞれの標識結合領域が特異的な色を割り当てられる場合、それぞれのバックボーン中のそれぞれの標識結合領域は、４つの配列の１つからなるであろう。この例において４０９６の可能なナノレポーターがあるであろう。可能なナノレポーターの数は、たとえば、色の数を増加させることによって、標識結合領域についての固有の配列の数を増加させることによって、および／またはバックボーン当たりの標識結合領域の数を増加させることによって増加させることができる。同様に、可能なナノレポーターの数は、色の数を減少させることによって、標識結合領域についての固有の配列の数を減少させることによって、および／またはバックボーン当たりの標識結合領域の数を減少させることによって減少させることができる。
ある実施形態では、検出の方法は、多重アッセイにおいて実行され、それによって、複数の標的分子は、同じアッセイ（単一反応混合物）において検出される。好ましい実施形態では、アッセイは、複数の標的分子が同時に検出されるハイブリダイゼーションアッセイである。ある実施形態では、同じアッセイにおいて検出される複数の標的分子は、少なくとも２、少なくとも５の異なる標的分子、少なくとも１０の異なる標的分子、少なくとも２０の異なる標的分子、少なくとも５０の異なる標的分子、少なくとも７５の異なる標的分子、少なくとも１００の異なる標的分子、少なくとも２００の異なる標的分子、少なくとも５００の異なる標的分子、もしくは少なくとも７５０の異なる標的分子、または少なくとも１０００の異なる標的分子である。他の実施形態では、同じアッセイにおいて検出される複数の標的分子は、５０までの異なる標的分子、１００までの異なる標的分子、１５０までの異なる標的分子、２００までの異なる標的分子、３００までの異なる標的分子、５００までの異なる標的分子、７５０までの異なる標的分子、１０００までの異なる標的分子、２０００までの異なる標的分子、または５０００までの異なる標的分子である。他の実施形態では、検出される複数の標的分子は、これらに限定されないが、２０〜５０の異なる標的分子、５０〜２００の異なる標的分子、１００〜１０００の異なる標的分子、５００〜５０００の異なる標的分子などの、異なる標的分子の先の数の中間の任意の範囲のものである。
ある実施形態では、本発明は、同じＲＮＡの異なるスプライス形態の検出に関する。異なるスプライス形態は、それぞれが、同じ遺伝子の異なるエクソンに相補的である異なる標的特異的配列を有する、複数のナノレポータープローブを使用して検出することができる。
本発明のナノレポーターによって提供される定性分析能力およびそれに基づく分析技術に加えて、本発明のナノレポーターは、定量分析を行うのに固有に適している。本発明のナノレポーター（単一または二重ナノレポーターに関わらず）および生体分子試料中のそれらの標的分子の間の１対１の結合を提供することによって、試料中に存在する標的分子のすべてのまたは代表的な部分は、同定し、カウントすることができる。様々な分子種のこの個々のカウントは、生体分子試料中の標的分子の絶対的または相対的濃度を決定するための正確なおよび直接的な方法を提供する。さらに、混合物中のそれぞれの分子を処理する能力は、高感度、最小限のサンプル量必要量、少量の容量の溶液相反応速度によって与えられる高反応速度、および最終的に非常に低い試薬費用を含む、小型化の有益性を個々に高める。
下記に提供される説明および実施例から理解されるように、本発明は、多数の有利性を提供する。たとえば、本発明によるナノレポーターを形成する際の複雑なモジュール性は、非常に高度の多様性を有する固有のナノレポーターのライブラリーの体系的な生成を可能にする（たとえば何百万もの固有に認識可能なナノレポーター）。このモジュール性は、引き続いて著しい生産効率を提供する特定の適用にナノレポーター集団をカスタマイズする際の柔軟性を可能にする。以下の説明を通して理解される他の有利性は、本発明のナノレポーターを構築する際の柔軟性に由来する。すなわち、それらのモジュール構造により、本発明のナノレポーターは、使用のポイントに対する出荷前に構築することができるまたは使用のポイントで構築することができる。
二重ナノレポーター
図１および２は、二重ナノレポーターに関する本発明のある実施形態を示す。いくつかの実施形態では、ナノレポーターの２つの成分のそれぞれは、標識され、その結果、ナノレポーターのスペクトルコードは、ナノレポーターの２つの成分がその標的分子に対する二重ナノレポーターの結合に際して集合する場合にのみ形成される。しかしながら、二重ナノレポーターでは、両方の成分が標識される必要はない。たとえば、図１および２において表されるように、二重ナノレポーターの一方の成分は、ナノレポーターコードを用いて標識され、他方の成分は、伸長および視覚化のために、ナノレポーターを固定するのに有用なアフィニティータグ（矢印）に付加される。
定義
他に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者らによって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと同様なまたはそれに等価な任意の方法および物質は、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および物質が記載される。本発明の目的のために、以下の用語が、下記に定義される。
冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、１または１を超える（たとえば少なくとも１）、冠詞の文法的な目的語を指すために本明細書において使用される。例として、「エレメント」は、１つのエレメントまたは１を超えるエレメントを意味する。
ポリヌクレオチドに関しての用語「相補的」は、塩基対形成の法則によって関係するポリヌクレオチドを指す。たとえば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に相補的である。相補性は、部分的なものであってもよく、核酸の塩基のいくつかのみが塩基対合則に従ってマッチする。または、核酸の間に完全なもしくは絶対的な相補性があってもよい。核酸鎖の間の相補性の程度は、核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率および強度に対して著しい影響を有する。
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、区別なく使用される。それらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそのアナログのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖分析から確定される座（複数の座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの構築の前にまたはその後に与えられてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識成分との抱合などによって重合の後にさらに修飾されてもよい。
記述「配列同一性」またはたとえば、「に対して５０％同一の配列」を含むは、本明細書において使用されるように、比較のウィンドウにわたって、ヌクレオチド毎に配列が同一である程度を指す。したがって、「配列同一性の百分率」は、比較のウィンドウにわたって２つの最適にアライメントされた配列を比較し、マッチした位置の数を得るために、同一の核酸塩基（たとえばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）が両方の配列中に生じる位置の数を決定し、マッチした位置の数を、比較のウィンドウにおける位置の総数（たとえばウィンドウサイズ）で割り、配列同一性の百分率を得るために結果に１００を掛けることによって計算されてもよい。
２以上のポリヌクレオチドの間の配列関係を記載するために使用される用語は、「相同性」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の百分率」、および「実質的な同一性」を含む。２つのポリヌクレオチドは、それぞれ、（１）２つのポリヌクレオチドの間で同様の配列（たとえば完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）および（２）２つのポリヌクレオチドの間で相違する配列を含んでいてもよく、２つ（以上）のポリヌクレオチドの間の配列比較は、配列類似性の局部領域を同定し、比較するために、「比較ウィンドウ」にわたって２つのポリヌクレオチドの配列を比較することによって典型的に実行される。「比較ウィンドウ」は、通常では約５０〜約１００、より通常では約１００〜約１５０の、少なくとも６つの隣接する位置の概念的なセグメントを指し、２つの配列が最適にアライメントされた後に、配列は、同数の隣接する位置の参照配列と比較される。比較ウィンドウは、２つの配列の最適なアライメントについて、参照配列（これは追加または欠失を含まない）と比較して、約２０％以下の追加または欠失（つまりギャップ）を含んでいてもよい。比較ウィンドウをアライメントするための配列の最適なアライメントは、アルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）のコンピューター化された実装によってまたは検査および選択される様々な方法のいずれかによって生成される最良のアライメント（つまり比較ウィンドウにわたって最も高い百分率の相同性をもたらす）によって行われてもよい。たとえば、Altschulら、１９９７年、Nucl. Acids Res. ２５巻：３３８９頁によって開示される、プログラムのＢＬＡＳＴファミリーもまた言及されてもよい。配列分析の詳細な議論は、Ausubelら、「CurrentProtocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons Inc、１９９４〜１９９８頁、１５章のユニット１９．３において見出すことができる。
バックボーン構造
本発明のナノレポーターバックボーンは、標識モノマーを直接または間接的に付加することができる、線状の組合せにおいて配置された複数の標識結合領域（たとえば少なくとも３つの標識結合領域）を含有する核酸分子である。一実施形態では、ナノレポーターバックボーンは、標識結合領域が、相補的オリゴヌクレオチド、相補的ＲＮＡ配列、または相補的ＤＮＡ配列などの他の核酸をハイブリダイゼーションによって付加することができる一本鎖領域である核酸バックボーンである。特定の実施形態では、ナノレポーターバックボーンは、一本鎖核酸分子である。
いくつかの実施形態では、本発明のバックボーンは、ＤＮＡである。ＤＮＡベースの構造は、少なくとも部分的に、ＤＮＡ構築物の操作を可能にする既存の技術および方法論の幅広い分野により、本発明との関連において多数の有利性を提供する。上記に示されるように、バックボーンは、一本鎖であってもよい。
それぞれのバックボーンは、固有の配置の標識結合領域からなる。ナノレポーターバックボーンの標識結合領域は、標識の方法に依存してサイズが変化するであろう。様々な実施形態では、標識結合領域は、１０ｎｍ〜１０，０００ｎｍあたりの長さを有することができるが、より好ましくは、５０ｎｍ〜５，０００ｎｍ、より好ましくは、１００ｎｍ〜１，０００ｎｍである。様々な実施形態では、標識結合領域は、約１００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約１５０ｎｍ〜約４５０ｎｍ、約２００ｎｍ〜約４００ｎｍ、または２５０〜約３５０ｎｍである。好ましい実施形態では、標識結合領域は、回折限界のスポットのサイズ、たとえば、約３００ｎｍである、標準の光学装置を用いて検出することができる最も小さなスポットに厳密に対応する。
いくつかの実施形態では、本発明の標識結合領域は、ポリヌクレオチド配列から作製される。本発明の核酸バックボーンについて、１ｎｍは、約３つのヌクレオチドに対応し、したがって、約３００ｎｍの標識結合領域は、約９００塩基のヌクレオチド配列に対応する。ある実施形態では、標識結合領域は、約３００ヌクレオチド〜約１．５ｋｂ、約４５０ヌクレオチド〜約１．３５ｋｂ、約０．６ｋｂ〜約１．２ｋｂ、または０．７５ｋｂ〜約１．０５ｋｂである。ある態様では、標識結合領域は、すべての中間の整数を含む、約３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００以上のヌクレオチドである。ある好ましい実施形態では、標識結合領域は、長さが約１１００ヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
バックボーンは、すべての中間の整数を含む、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４〜１００以上の標識結合領域を有することができる。ある実施形態では、バックボーンは、６つの標識結合領域を有する。いくつかの実施形態では、個々のバックボーンは、それぞれが、その同じバックボーン中の他の標識結合領域の配列とは異なるポリヌクレオチド配列を有する、異なる標識結合領域のセットを有する。
いくつかの実施形態では、バックボーンは、６つの固有の標識結合領域を有する。いくつかの実施形態では、それぞれのバックボーンは、複数の異なる検出可能な分子を含み、それぞれのバックボーン中の上述の複数の異なる検出可能な分子は、集団中の他のバックボーンをそれと区別する検出可能なシグナルを有する。
本発明によれば、バックボーンの集団中のそれぞれのバックボーンは、標識結合領域の固有の線状の組合せ、順序、または配置を有することによって、他のものと区別可能である。さらに、本発明の一態様として、所与のバックボーン中のそれぞれの標識結合領域のポリヌクレオチド配列は、その同じバックボーン中の他の標識結合領域のポリヌクレオチド配列とは異なる。同じバックボーン上の多重標識結合領域の線状の配置において、１を超える同じ標識結合領域を繰り返すことにより、バックボーンが生成されるプラスミドを、大腸菌における複製の間、不安定にし、そのため増殖することを困難にすることができる。さらに、そのようなバックボーンへのリバース相補体ＲＮＡセグメントの導入は、ＲＮＡセグメントが２つの同一の標識結合領域を架橋し、まとめ、レポーターの線状の配列を妨害し、他の問題の中でもレポーターコードの正確さおよび読みやすさに干渉する、「もつれた」レポーターの形成を引き起こす場合がある。プラスミド不安定性および可能性として貧しいレポーターの読みやすさが問題である実施形態では、これらの問題は、それぞれがその同じバックボーン中の他の標識結合領域の配列とは異なるポリヌクレオチド配列を有する、異なる標識結合領域のセットを有するようにそれぞれの個々のバックボーンを構築することによって、回避される。
さらに、本発明のさらなる態様として、これらの標識結合領域は、それぞれが、本明細書において詳述されるようにある種の特徴（たとえば、Ｇ／Ｃ含量およびＧ／Ｃ比、アデニン反復配列）によって表される固有のポリヌクレオチド配列を有し、それぞれが、所与の検出可能な分子を明示する、固有の、合理的に設計された（たとえば合成配列）ヌクレオチド配列の集団から選択される。これらの合理的に設計された配列は、二次構造形成を防止すること（たとえば、レポーターコードの正確さおよび読みやすさを維持するためにレポーターの線状の配列を保つこと）によって安定性を改善するだけではなく、それぞれの標識結合領域に付加される検出可能な分子の濃度および間隔を最適化し、それによって、固有に標識されたバックボーンの集団の中で所与の標識されたバックボーンの読みやすさを改善する。
標識結合領域
本発明は、ナノレポーターの標識および検出を最適化し、二次構造形成を防止する特徴を有するように合理的に設計された合成核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）であるナノレポーターバックボーンを提供する。本発明のいくつかの実施形態では、ナノレポーターバックボーンは、５０〜５０，０００塩基長の１つまたは複数の配列を含む、設計されたポリヌクレオチド配列である。
いくつかの実施形態では、ナノレポーターバックボーンは、予測可能な二次構造を最小限にするように設計される。いくつかの実施形態では、ナノレポーターバックボーンは、あらゆる二次構造が欠けている。推定上の二次構造（たとえばヘアピン、フォールディング、または内部塩基対形成）は、ＭＦＯＬＤなどの当技術分野において公知の方法によって予測することができる。あらゆる理論に制限されることを意図するものではないが、ナノレポーター構造における予測可能な二次構造は、逆向き反復配列を回避することによっておよびバックボーンがＣＴまたはＧＡリッチとなるようにバックボーン特異的含量を偏らせることによって最小限にすることができる。いくつかの実施形態では、ナノレポーターバックボーンは、７５℃、１×ＳＳＰＥのアニール条件下でいかなる著しい分子内対形成をも有しない。いくつかの実施形態では、ナノレポーターバックボーンは、約２０、１５、１０、５、４、３、２、または１％未満の逆向き反復配列を有し、逆向き反復配列は、９ヌクレオチド以上である。いくつかの実施形態では、バックボーンは、約１％未満の逆向き反復配列を有し、逆向き反復配列は、９ヌクレオチド以上である。いくつかの実施形態では、ナノレポーターは、長さが１１００塩基対である配列にわたって９以上のヌクレオチドのいかなる逆向き反復配列をも含有していない。いくつかの実施形態では、ナノレポーターは、任意の１００塩基対領域にわたって７以上のヌクレオチドのいかなる逆向き反復配列をも含有していない。いくつかの実施形態では、ナノレポーターバックボーンは、バックボーンがＣＴまたはＧＡリッチとなるように、バックボーンの鎖特異的含量を偏らせるように設計される。ＣＴまたはＧＡ領域は、ヌクレオチドＣおよびＴまたはＧおよびＡの任意の組合せによって構成される領域である。たとえば、最も小さなＣＴ領域は、２つのヌクレオチドがＣおよびＴである２つのヌクレオチドの領域である。領域は、長さが２、３、４、５、６、７、８以上のヌクレオチドとすることができる。いくつかの実施形態では、約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、または７０％のナノレポーターバックボーンは、ＣＴまたはＧＡ領域から構成される。いくつかの実施形態では、約５０〜６５％のナノレポーターバックボーンは、ＣＴまたはＧＡ領域から構成される。いくつかの実施形態では、約６０％のナノレポーターバックボーンは、ＣＴまたはＧＡ領域から構成される。いくつかの実施形態では、ナノレポーターバックボーンは、バックボーンがＣＴリッチとなるように、バックボーンの鎖特異的含量を偏らせるように設計される。いくつかの実施形態では、約６０％のナノレポーターバックボーンは、ＣＴ領域から構成される。
いくつかの実施形態では、ナノレポーターバックボーンは、直列反復配列を回避すること、およびナノレポーターの集団中の他のバックボーンにおいて使用される任意の他の配列に対してまたはＲＥＦＳＥＱ公的データベースにおいて記載される任意の配列に対して任意の著しい相同性を有したすべての配列をスクリーニングすることによって、ナノレポーター集団中の配列のすべての固有性を最大限にするように設計される。いくつかの実施形態では、ナノレポーターバックボーンは、約２０、１５、１０、５、４、３、２、または１％未満の直列反復配列を有する。いくつかの実施形態では、ナノレポーターバックボーンは、約１％未満の直列反復配列を有し、直列反復配列は、長さが１１００塩基対の配列中で９ヌクレオチド以上であるまたは任意の１００塩基対領域にわたって７ヌクレオチド以上である。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポーターは、ナノレポーターの集団中の他のバックボーンにおいて使用される任意の他の配列に対してまたはＲＥＦＳＥＱ公的データベースにおいて記載される任意の配列に対して、８５、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０または５％未満の相同性を含有する。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポーターは、ナノレポーターの集団中の他のバックボーンにおいて使用される任意の他の配列に対してまたはＲＥＦＳＥＱ公的データベースにおいて記載される任意の配列に対して、６０％未満の相同性を含有する。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポーターは、ナノレポーターの集団中の他のバックボーンにおいて使用される任意の他の配列に対してまたはＲＥＦＳＥＱ公的データベースにおいて記載される任意の配列に対して、５０％未満の相同性を含有する。いくつかの実施形態では、ナノレポーターのバックボーンは、バックボーンにおいて使用される任意の他の配列に対してまたはＲＥＦＳＥＱ公的データベースにおいて記載される任意の配列に対して、８５％未満の相同性を含有するように設計される。いくつかの実施形態では、ナノレポーターバックボーンは、バックボーンにおいて使用される任意の他の配列に対してまたはＲＥＦＳＥＱ公的データベースにおいて記載される任意の配列に対して、相同性の２０、１６、１５、１０、９、７、５、３、２未満の隣接する塩基を含有するように設計される。いくつかの実施形態では、ナノレポーターバックボーンは、バックボーンにおいて使用される任意の他の配列に対してまたはＲＥＦＳＥＱ公的データベースにおいて記載される任意の配列に対して、相同性の多くとも１５の隣接する塩基およびナノレポーターの全長にわたって多くとも８５％の同一性を有するように設計される。
本発明の核酸標識結合領域は、長さが１２塩基を超える直列または逆向き反復配列を好ましくは有していない。他の実施形態では、核酸標識結合領域は、長さが約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６以上のヌクレオチド塩基を超える直列または逆向き反復配列を有していない。いくつかの実施形態では、核酸標識結合領域は、長さが１１００塩基対である配列にわたって９以上のヌクレオチドのいかなる逆向き反復配列をも含有していない。いくつかの実施形態では、核酸標識結合領域は、任意の１００塩基対領域にわたって７以上のヌクレオチドのいかなる逆向き反復配列をも含有していない。
配列はまた、一般的な６塩基カッター制限酵素認識部位を回避するためにスクリーニングされてもよい。選択される配列は、予測される二次構造分析にさらにかけられてもよく、最小の二次構造を有するものはさらなる評価のために選ばれてもよい。ＭＦＯＬＤプログラムなどの、当技術分野において公知の任意のプログラムは、二次構造を予測するために使用することができる（Zuker、２００３年、Nucleic Acids Res. ３１巻（１３号）：３４０６〜１５頁；Mathewsら、１９９９年、J.Mol. Biol. ２８８巻：９１１〜９４０頁）。
ナノレポーターバックボーンは、いくつかの実施形態では一本鎖核酸分子であるが、特定の塩基の規則的なパターン（「規則的に繰り返された塩基」）を含む、１つまたは複数の標識結合領域を有するように設計される。そのような領域において、規則的に繰り返された塩基は、典型的に、約ｎ番目の残基毎の最小限の周期性で生じ、ｎは、任意の数とし、好ましくは４〜２５とする。好ましくは、標識結合領域における２５％以下の規則的に繰り返された塩基は、上述の規則的な間隔以外で現れる。たとえば、１００ヌクレオチドの標識結合領域において、１２のチミン塩基があり、チミンが、規則的に繰り返された塩基である場合、本発明のこの態様では、これらの２５％以下、つまり３チミン塩基は、規則的なパターンのチミンの外側に現れる。同様に、１００ヌクレオチドの標識結合領域において、１２のアデニン塩基があり、アデニンが、規則的に繰り返された塩基である場合、本発明のこの態様では、これらの２５％以下、つまり３アデニン塩基は、規則的なパターンのアデニンの外側に現れる。特定の実施形態では、２０％以下、１５％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、または１％以下の上述の塩基は、上述の領域の上述の規則的な間隔以外で現れる。いくつかの実施形態では、塩基は、規則的に間隔を有さないが、塩基は、少なくとも平均８、９、１０、１２、１５、１６、１８、２０、３０、または５０ヌクレオチド離れている。いくつかの実施形態では、塩基は、規則的に間隔を有さないが、塩基は、少なくとも平均８ヌクレオチド離れている。
ある実施形態では、所与の標識結合領域における規則的に繰り返された塩基は、少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上のヌクレオチド塩基の間隔を有する。ある態様では、規則的に繰り返された塩基は、約５〜１５ヌクレオチド塩基毎の、約６〜１２ヌクレオチド塩基毎の、約７〜１０ヌクレオチド塩基毎の、または約８〜１０ヌクレオチド塩基毎の間隔を置いて配置される。ある態様では、規則的に繰り返された塩基は、約８ヌクレオチド塩基毎の間隔を置いて配置される。ある特定の実施形態では、アデニン塩基は、約８ヌクレオチド塩基毎に繰り返される。ある特定の実施形態では、アデニン塩基は、約１５〜２０ヌクレオチド塩基毎に繰り返される。ある特定の実施形態では、アデニン塩基は、約１６ヌクレオチド塩基毎に繰り返される。
規則的に繰り返された塩基は、約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％のヌクレオチド含量で所与の標識結合領域のポリヌクレオチド配列中に存在してもよい。標識結合領域において平均約８〜１６ヌクレオチド毎に規則的に繰り返された塩基の存在は、約１２．５％のヌクレオチド含量を表す。ある実施形態では、規則的に繰り返された塩基のヌクレオチド含量は、約１２．５％であってもよい。ある態様では、標識結合領域は、選択される数または選択される百分率の、領域当たりの規則的に繰り返された塩基を含み、これらは、それらが、少なくとも約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４塩基以上離れているように、少なくとも一定の最小限の距離離れていなければならないという点を除いて無作為に分布する。
規則的に繰り返された塩基は、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、またはウラシルの任意のヌクレオチド塩基とすることができる。ある実施形態では、一本鎖標識結合領域における規則的に繰り返された塩基は、アデニンである。
ある態様では、標識結合領域のポリヌクレオチド配列はまた、一定のグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量を有するようにも設計される。たとえば、ある標識結合領域は、これが標識結合領域の多数の固有のポリヌクレオチド配列の中で適正に一貫したＴＭを提供するように、約４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、より好ましくは約５０％の全体的なＧ／Ｃ含量を有するように設計される。ある態様では、ポリヌクレオチド配列は、合成問題を最小限にするためには多くとも連続して３つのグアニンを有する。全体的なＧＣ含有率はまた、好ましくは、局所的なＴｍを同様にするために、比較的短いストレッチにわたって一貫している。あらゆる理論に制限されることを意図するものではないが、ナノレポーターが二本鎖核酸である場合、本明細書において記載されるナノレポーターのＴｍは、ナノレポーターバックボーンおよび検出可能な分子をそれに付加させている相補的ポリヌクレオチド配列の間のより強い結合を提供し、そのため、合成およびハイブリダイゼーション手順の間の解離を防止する。さらに、ナノレポーターの集団の中の一貫したＴｍは、最適条件がすべてのスポットおよび位置について同じとなるように、合成およびハイブリダイゼーション手順が厳重に最適化されることを可能にする。いくつかの実施形態では、ナノレポーターの配列は、約５０％のグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）を有し、連続して多くとも３つのＧを有する。
ある態様では、標識結合領域のポリヌクレオチド配列はまた、所与の鎖において一定のＧ／Ｃ比を有するように設計される。たとえば、ある実施形態では、標識結合領域のポリヌクレオチド配列は、相補的ポリヌクレオチド配列が約１／１、２／１、３／２、約５／３、または約７／５のＧ／Ｃ比を有するように設計される。ある態様では、Ｇ／Ｃ比は、少なくとも１／１である。ある態様では、Ｇ／Ｃ比は、所与の鎖において約１／１、２／１、３／２、５／３、または約７／５である。ある態様では、Ｇ／Ｃ比は、相補的ポリヌクレオチド配列中で少なくとも１／１である。ある態様では、Ｇ／Ｃ比は、相補的ポリヌクレオチド配列中で約３／２である。
アデニンが規則的に繰り返された塩基であり、少なくとも約８ヌクレオチド毎の間隔を有し（約１２．５％のアデニン含量）、Ｇ／Ｃ含量が約５０％である、ある特定の実施形態では、チミン含量は、約３７〜３８％または約３７．５％であってもよい。アデニンが規則的に繰り返された塩基であり、Ｇ／Ｃ含量が約５０％である、ある特定の実施形態では、チミン含量は、約３５〜４５％であってもよい。規則的に繰り返されたヌクレオチドがアデニンであり、約５０％のＧＣ含有率である例示的な標識結合領域において、超過アデニンは、Ｔの存在率の減少を補うために利用されてもよい。選択される配列を生成するために、４塩基毎〜２５塩基毎の範囲の固定パターンのＡを有する無作為の配列が、作製され、逆向きおよび直列反復配列の存在を最小限にするためにスクリーニングされてもよい。
いくつかの実施形態では、本発明は、ナノレポーターまたはナノレポーター標識ユニット集団、たとえば、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも７５０、または少なくとも１，０００の固有のナノレポーター、固有のナノレポーター標識ユニット、または固有の標識ナノレポーターを含有するナノレポーターまたはナノレポーター標識ユニットライブラリーを提供する。本明細書において使用されるように、集団内のナノレポーターまたはナノレポーター標識ユニットに関して使用される場合の「固有の」は、それを同じ集団中の他のナノレポーターと区別するコードを有するナノレポーターを意味するように意図され、たとえば、それぞれのナノレポーターは、それを上述の集団中の他のナノレポーターと区別する検出可能なシグナルを有する。典型的に、ナノレポーターは、それぞれが選択される標識モノマーをそれに付加させている標識結合領域の特定の線状の組合せによって「固有」とされる。
特定の実施形態では、本発明は、少なくとも１，０００、５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、または少なくとも５０，０００の固有のナノレポーターまたはナノレポーター標識ユニットを有するナノレポーター集団を提供する。
ナノレポーターの集団中のナノレポーターは、単一ナノレポーター、二重ナノレポーター、またはその組合せとすることができる。ナノレポーターは、標識または非標識とすることができる。本明細書において記載されるナノレポーターの集団は、２つ以上のナノレポーターを含むことができる。
いくつかの実施形態では、本発明は、塩基（たとえばアデニン）が規則的に間隔を有するナノレポーターバックボーンの集団を提供し、ナノレポーターは、二次構造の任意の著しい形成を有さず、集団中のナノレポーターの中でＴｍは、適正に一貫している。いくつかの実施形態では、本発明は、その標識結合領域にハイブリダイズした場合の相補的ポリヌクレオチド配列のＴｍが約８０℃以上である、ナノレポーターの集団を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、それぞれのナノレポーターバックボーンが、線状の組合せにおいて共に共有結合された複数の標識結合領域を含む領域を含み、それぞれの標識結合領域が、約８００〜１３００ヌクレオチド塩基を含み、約５０％のＧ／Ｃ含量を有し、それぞれの選択される標識結合領域が他の選択される標識結合領域とは異なり、それぞれの標識結合領域が、１つまたは複数の検出可能な分子をそれに付加させている相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、相補的ポリヌクレオチド配列が少なくとも１／１のＧ／Ｃ比を有する、ナノレポーターバックボーンの集団を提供する。いくつかの実施形態では、相補的ポリヌクレオチド配列は、約３／２のＧ／Ｃ比を有する。いくつかの実施形態では、ナノレポーターバックボーンは、バックボーンがＣＴリッチとなるように、バックボーンの鎖特異的含量を偏らせるように設計される。いくつかの実施形態では、約６０％のナノレポーターバックボーンは、ＣＴ領域から構成される。
いくつかの実施形態では、本発明は、それぞれのナノレポーターバックボーンが、一本鎖核酸バックボーンを含み、上述のバックボーンが固有の線状の組合せにおいて共に共有結合された複数の標識結合領域を含み、上述のナノレポーターバックボーンが、規則的に間隔を有する塩基（たとえばアデニン）を含み、ナノレポーターバックボーンは、二次構造の著しい形成を有さず、集団中の他のバックボーンにおいて使用される任意の他の配列に対してまたはＲＥＦＳＥＱ公的データベースにおいて記載される任意の配列に対して、８５％未満の相同性を含有するナノレポーターバックボーンの集団を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、それぞれのナノレポーターバックボーンが、一本鎖核酸バックボーンを含み、上述のバックボーンが固有の線状の組合せにおいて共に共有結合された複数の標識結合領域を含み、上述のナノレポーターバックボーンが、約５０％のＧ／Ｃ含量を有し、ナノレポーターバックボーンは、二次構造の著しい形成を有さず、集団中の他のバックボーンにおいて使用される任意の他の配列に対してまたはＲＥＦＳＥＱ公的データベースにおいて記載される任意の配列に対して、８５％未満の相同性を含有するナノレポーターバックボーンの集団を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、それぞれのナノレポーターバックボーンが、一本鎖核酸バックボーンを含み、上述のバックボーンが固有の線状の組合せにおいて共に共有結合された複数の標識結合領域を含み、上述のナノレポーターバックボーンが、約５０％のＧ／Ｃ含量を有し、ナノレポーターバックボーンは、二次構造の著しい形成を有さず、１％未満の直列反復配列を含有するナノレポーターバックボーンの集団を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、それぞれのナノレポーターバックボーンが、一本鎖核酸バックボーンを含み、上述のバックボーンが固有の線状の組合せにおいて共に共有結合された複数の標識結合領域を含み、標識結合領域は、固有の設計されたポリヌクレオチド配列の集団から選択され、それぞれのポリヌクレオチド配列が、１つまたは複数の検出可能な分子をそれに付加させている固有の相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それぞれのナノレポーターが、それを上述の集団中の他のナノレポーターと区別する検出可能なシグナルを有し、それぞれのナノレポーターが、Ｍ１３ ＤＮＡを含む比較可能なナノレポーターよりも安定している、ナノレポーターバックボーンの集団を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、それぞれのナノレポーターバックボーンが、一本鎖核酸バックボーンを含み、上述のバックボーンが固有の線状の組合せにおいて共に共有結合された複数の標識結合領域を含み、標識結合領域は、固有の設計されたポリヌクレオチド配列の集団から選択され、それぞれのポリヌクレオチド配列が、１つまたは複数の検出可能な分子をそれに付加させている固有の相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それぞれのナノレポーターが、それを上述の集団中の他のナノレポーターと区別する検出可能なシグナルを有し、本明細書において記載されるナノレポーター中のその標識結合領域にハイブリダイズする場合の相補的ポリヌクレオチド配列のＴｍは、Ｍ１３ ＤＮＡを含むナノレポータープローブにハイブリダイズした場合のＭ１３ ＤＮＡ鋳型に相補的なポリヌクレオチド配列のＴｍよりも高い、ナノレポーターバックボーンの集団を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書において記載されるナノレポータープローブの配列特徴が、標的分子の改善された検出を提供する、ナノレポーターバックボーンの集団を提供する。たとえば、標的分子へのナノレポータープローブの結合が、試料中のナノレポーターの１つまたは複数の分子の存在を個々にカウントすることによって実行される場合、本明細書において記載されるナノレポータープローブは、カウント数の増加を可能にする。いくつかの実施形態では、試料の標準化の後の上述の分子複合体のバックグラウンドを超える分子カウント数は、３００、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００分子カウントよりも高い。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポータープローブは、カウント数の増加を可能にする。いくつかの実施形態では、試料の標準化の後の上述の分子複合体のバックグラウンドを超える分子カウント数は、４００分子カウントよりも高い。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポータープローブの有効な分子カウントの百分率は、約１０、１１、１２、１２．５、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％よりも高い。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるナノレポータープローブの有効な分子カウントの百分率は、約１２．５％よりも高い。いくつかの実施形態では、上述の試料の標準化の後の本明細書において記載されるナノレポータープローブのバックグラウンドを超える分子カウントの数は、Ｍ１３ ＤＮＡを含む、比較可能なナノレポーターよりも、少なくとも２、５、６、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０倍高い。いくつかの実施形態では、上述の試料の標準化の後の本明細書において記載されるナノレポータープローブのバックグラウンドを超える分子カウントの数は、Ｍ１３ ＤＮＡを含む、比較可能なナノレポーターよりも、少なくとも６倍高い。いくつかの実施形態では、上述の試料の標準化の後の本明細書において記載されるナノレポータープローブのバックグラウンドを超える分子カウントの数は、Ｍ１３ ＤＮＡを含む、比較可能なナノレポーターよりも、少なくとも２倍高い。
比較可能なＭ１３ナノレポータープローブは、共に共有結合された複数のＭ１３ ＤＮＡ領域を含む一本鎖バックボーンに付加される、本明細書において記載されるナノレポータープローブと同じ標的特異的領域を含むナノレポーターであり、それぞれの領域は、１つまたは複数の検出可能な分子をそれに付加させている相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする。
ナノレポータープローブ集団のサイズ、およびその内部のナノレポーターの標的特異的配列の性質は、ナノレポーターの意図される使用に依存するであろう。標的特異的配列が、病気の細胞型を含む所与の細胞型のマーカーに対応するナノレポータープローブ集団を作製することができる。特定の実施形態では、細胞または組織は、哺乳動物細胞または組織、より好ましくはヒト細胞または組織である。
いくつかの実施形態では、適切な配列は、５０塩基〜２キロベース長の範囲の標識結合領域に分けられる（より長くすることができる）。標識結合領域はまた、これらの例示的な範囲の組合せおよび中間のすべての整数（たとえば８５０、９５０など）を含む、約２００塩基〜約１８００塩基、約４００塩基〜約１６００塩基、約６００塩基〜約１５００塩基、約８００塩基〜約１３００塩基、約９００塩基〜約１２００塩基、約１０００塩基〜約１１５０塩基、約１０５０塩基〜約１１５０塩基の範囲とすることができる。ある実施形態では、標識結合領域は、約１１００塩基である。
いくつかの実施形態では、それぞれの標識結合領域は、所与のレポーター配列中の他の標識結合領域に関して、固有の配列であるが、アデニンまたは他の選択される塩基の一貫した最小限の数および間隔を含有する。これらの標識結合領域は、配列が重要でない他の領域を用いて散在させることができる。ナノレポーターバックボーン中の標識結合領域は、異なる長さとすることができるおよび／または異なる規則的に繰り返された塩基を有することができる。
一本鎖標識結合領域を合成するために鋳型として利用されてもよいポリヌクレオチド配列の特定の例は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４において記載されるポリヌクレオチド配列を含む。これらの配列については、記述される、規則的に繰り返された塩基は、チミンであり、これは、典型的にナノレポーターバックボーンの形態をした一本鎖標識結合領域の合成に基づいて、規則的に繰り返されたものとしてアデニンを産生する。配列番号１〜２４において記載されるポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むこれらのポリヌクレオチド配列の変異体もまた企図され、そのような変異体は、より詳細に本明細書において記載されるように、標識結合領域の所望のまたは適した特徴を保持する（たとえば、所与の鎖における規則的に繰り返された塩基、Ｇ／Ｃ含量、Ｇ／Ｃ比、Ｔｍ、逆向き反復配列の欠如）。当業者によって理解されるように、他の配列は、本明細書において記載される標識結合領域の所望のまたは適した特徴を有するように設計することができる。
ＲＮＡポリメラーゼＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６による転写（転写物の＋１位で始まる）のための最適化された開始配列は、それぞれの標識結合領域の５’末端に追加することができる。制限部位は、従来のクローニング技術を使用して、配列に個々の標識結合領域の特異的な追加または欠失を可能にするために、それぞれの標識結合領域の境界に任意選択で追加される。
ナノレポーターバックボーン中の標識結合領域の数は、好ましくは１〜５０の範囲である。さらに他の実施形態では、ナノレポーターバックボーン中の合成標識結合領域の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０の合理的に設計された標識結合領域〜１５、２０、３０、４０、もしくは５０の標識結合領域の範囲または中間の任意の範囲である。ある実施形態では、バックボーン中の標識結合領域の数は、６である。
いくつかの実施形態では、ナノレポーターバックボーン中の標識結合領域における規則的に繰り返された塩基またはアニールされた相補的ポリヌクレオチド配列（もしくはセグメント）におけるその相補的規則的に繰り返された塩基は、ナノレポーターシグナルのよりよい分布のために、規則的な一様に間隔を有するパターンで、標識モノマー、好ましくは光放射標識モノマーをナノレポーターに付加させるために使用することができる。好ましくは、標識結合領域が標識される場合、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の発生率の規則的に繰り返された塩基は、塩基への標識モノマーの共有結合によってまたは規則的に繰り返された塩基の相補体がそのように標識される核酸へのハイブリダイゼーションによって、少なくとも１つの光放射標識モノマーに付加される。
発生率のこの百分率は、当技術分野において公知の任意の手段によって測定することができる。ある方法では、標識反応において産生される核酸の量は、精製され（たとえば、ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキットを使用して精製することができる）、ＵＶ分光光度法にかけられる。適切な波長での吸光度（「Ａ」）は、それぞれの核酸（２６０ｎｍ）およびその発生率が測定されることとなる標識モノマー（たとえばＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８について４９５ｎｍ；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４について５９０ｎｍ；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７について６５０；およびＣｙ３について５５０ｎｍ）について測定される。核酸の吸光度は、標識モノマーから「ノイズ」の寄与を除去するために２６０ｎｍ（「Ａ２６０」）での吸光度の値を調整し、標識モノマー（ＡＬＭ）についてのピーク波長での吸光度からその標識モノマーについての補正係数を引くことによって補正される。核酸がＲＮＡである場合、１０００ヌクレオチド当たりの標識モノマーの数は、式に従って計算される。
ＥＣＬＭは、標識モノマーについての消衰係数である。この式から、光放射標識モノマーに付加される、規則的に繰り返された塩基の発生率の百分率を計算することができる。
いくつかの実施形態では、標識結合領域における好ましい規則的に繰り返された塩基は、領域が、規則的に繰り返された塩基がウラシルである１つまたは複数の相補的ポリヌクレオチド配列（たとえばＲＮＡセグメント）に対するハイブリダイゼーションによって標識することができるように、アデニンである。いくつかの実施形態では、アデニンは、規則的に繰り返されていないが、少なくとも平均８塩基の間隔を有する。これは、他の場合には無作為の配列中で、標識モノマー結合部位として、容易に市販で入手可能であるアミノアリル修飾ＵＴＰの使用を可能にする。好ましくは、標識結合領域の規則的な周期性に加えて、領域（およびそれらを含む核酸）は、最小限の二次構造および適正に一貫したＴｍを含有する。
本発明の核酸は、自然発生のヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加させるようにもしくは標識結合領域およびアニールされた相補的ポリヌクレオチド配列またはセグメントの間で形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された様々に修飾されたヌクレオチドを使用して化学的に合成することができ、たとえば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。合成核酸を生成するために使用することができる修飾ヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロムウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（queosine）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、偽ウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む。
その代わりに、合成核酸は、核酸がサブクローニングされたベクターを使用して生物学的に産生することができる。一例として、線状の一本鎖ＤＮＡバックボーンは、（ｉ）制限酵素を用いるｄｓＤＮＡの線状化、（ｉｉ）熱不安定性のホスファターゼを用いる脱リン酸化、（ｉｉｉ）バックボーン配列からクローニングベクターを分離するための第２の制限酵素を用いる消化、および（ｉｖ）完全なバックボーン断片の一方の鎖のみを残す鎖特異的ラムダエキソヌクレアーゼを用いる消化を含む４ステップのプロトコールを使用して、二本鎖プラスミドＤＮＡから作製することができる。
様々な実施形態では、本発明の核酸分子は、たとえば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解性を改善するために、塩基成分、砂糖成分、またはリン酸バックボーンで修飾することができる。たとえば、核酸のデオキシリボースリン酸バックボーンは、ペプチド核酸を生成するために修飾することができる（Hyrupら、１９９６年、Bioorganic & Medicinal Chemistry ４０巻：５〜２３頁を参照されたい）。本明細書において使用されるように、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、核酸模倣物、たとえば、デオキシリボースリン酸バックボーンが偽ペプチドバックボーンと交換され、４つの自然な核酸塩基のみが保持されるＤＮＡ模倣物を指す。ＰＮＡの中性のバックボーンは、低イオン強度の条件下で、ＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的なハイブリダイゼーションを可能にすることが示された。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Hyrupら、１９９６年、Bioorganic& Medicinal Chemistry ４巻（１号）：５〜２３頁；Perry-O'Keefeら、１９９６年、Proc. Natl. Acad.Sci. USA ９３巻：１４６７０〜６７５頁において記載される標準の固相ペプチド合成プロトコールを使用して実行することができる。
例示的な実施形態では、選択される新規な配列は、民間の遺伝子合成会社によって二本鎖ＤＮＡとして合成的に構築することができ、ｐＵＣ１１９などの、ＤＮＡ複製およびファージキャプシド形成に必要なシス作用配列を含有するＭ１３またはｆ１ファージ遺伝子間（Ｉｇ）領域を含有するプラスミドベクターである「ファージミド」の中に方向づけられた様式でクローニングすることができる。ファージ複製開始点に関連するクローニング挿入物の適切な方向づけは、それぞれの標識結合領域についてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって生成されるＲＮＡ分子のリバース相補体である一本鎖ＤＮＡバックボーンの生成を可能にする。
新規なレポーターの一本鎖ＤＮＡバックボーンを生成するために、ファージミドは、Ｆ’エピソームを含有する大腸菌株の中に形質転換される。Ｍ１３突然変異体Ｋ０７などのヘルパーファージを用いて形質転換された細菌の続く感染は、環状一本鎖ＤＮＡが標準プロトコールを使用して調製される一本鎖パッケージファージとして新規なレポーター配列を運搬するファージミドの分泌をもたらす。このＤＮＡは、線状化され、ベクター部分は、二本鎖制限部位を生成するために新規なレポーター配列のいずれかの末端に短い相補的オリゴヌクレオチドをアニールし、その後に続いて適切な制限酵素を用いて処理することによって切り取られる。図９は、本明細書において記載されるナノレポーターをクローニングし、増殖し、生成するために使用されてもよいプラスミドベクターの例を示す。
相補的ポリヌクレオチド配列
いくつかの実施形態では、ナノレポーターコードのすべてまたは一部を構成する、シグナルを提供するまたは放射する検出可能な分子または標識モノマーは、本明細書において相補的ポリヌクレオチド配列と呼ばれる構造を通してナノレポーターバックボーンの標識結合領域（複数可）に付加される。検出可能な分子は、直接（たとえば共有結合もしくは非共有結合で）相補的ポリヌクレオチド配列に付加されるまたは間接的にそのような配列に付加される（たとえば、リガンドなどの介在成分を通して）。
いくつかの実施形態では、相補的ポリヌクレオチド配列は、長さが２５ヌクレオチド〜数キロベース（たとえば５ｋｂ）とすることができ、好ましくは、長さが５０ヌクレオチド〜２ｋｂとする。特定の実施形態では、相補的ポリヌクレオチド配列は、長さが約２５〜２５０、５０〜２００、５０〜１５０、または５０〜１００ヌクレオチドである。他の実施形態では、相補的ポリヌクレオチド配列は、長さが約５００〜２，０００、５００〜１，５００、５００〜１，０００、７５０〜１，２５０、または７５０〜１，０００ヌクレオチドである。ある態様では、相補的ポリヌクレオチド配列は、中間のすべての整数を含む、長さが約８００、８５０、９００、９５０、１１００、１１５０、または１１００ヌクレオチドである。相補的ポリヌクレオチド配列は、相補的ＲＮＡポリヌクレオチドまたは相補的ＤＮＡポリヌクレオチドとすることができる。好ましい実施形態では、相補的ポリヌクレオチド配列は、相補的ＲＮＡポリヌクレオチドである。
検出可能な分子または標識モノマーは、配列がナノレポーターバックボーンの標識結合領域に付加される前にまたはその後に、相補的ポリヌクレオチド配列に共有結合させることができる。たとえば、相補的ポリヌクレオチド配列に検出可能な分子を付加させる際に、標識は、その合成の間に、核酸の中への、検出可能な分子を含有するヌクレオチドの組込みによって共有結合させることができるが、それが、バックボーンの標識結合領域にハイブリダイズする前である。その代わりに、相補的ポリヌクレオチド配列の合成の間に、検出可能な分子アクセプター群を含有するヌクレオチドを含むことができ、検出可能な分子は、その合成の後に、それがバックボーンの標識結合領域にハイブリダイズする前にまたはその後に、相補的ポリヌクレオチド配列に追加される。その代わりに、標識モノマーは、たとえば、合成の間に相補的ポリヌクレオチド配列の中にリガンド結合分子（たとえばビオチン）を含有するヌクレオチドを組み込むこと、および検出可能な分子に共有結合されるリガンド（たとえばストレプトアビジン）を追加することによって、相補的ポリヌクレオチド配列に間接的に付加させることができる。
いくつかの実施形態では、相補的ポリヌクレオチド配列は、ナノレポーターの構築の方法に依存して、長さが２０ヌクレオチド〜５ｋｂを超えるあたりの範囲とすることができる。たとえば、相補的ポリヌクレオチド配列が、その中に、標識ナノレポーターとの関連におけるナノレポーターコードの一部であるシグナルを提供する１つまたは複数の標識モノマーを共有結合で組み込む場合、相補的ポリヌクレオチド配列は、好ましくは長さが約１００〜約１０，０００塩基、より好ましくは２００〜約２０００塩基、およびより好ましくは７００〜約１２００ヌクレオチドまたは長さが約１１００塩基対であり、一般に、本明細書において、セグメント、標識モノマーの組込み前の、相補的ポリヌクレオチド配列であるダークセグメント（しかし、好ましい実施形態では、アミノアリルヌクレオチドなどの標識モノマーアクセプター部位を含有する）および所望の１つまたは複数の標識モノマーを含有するものである有色のセグメントと呼ばれる。その標識結合領域にハイブリダイズする場合のセグメントのＴｍは、８２５ｍＭ Ｎａ＋（５×ＳＳＣ）において、好ましくは＞８０℃、より好ましくは＞９０℃である。
標識結合領域と同様に、相補的ポリヌクレオチド配列は、規則的に繰り返された塩基のパターンを含んでいてもよいまたはそれは、同様の百分率の、グアニン、アデニン、チミン、シトシン、もしくはウラシル反復塩基などの塩基を含んでいてもよい。一本鎖標識結合領域における反復塩基がアデニンである場合、相補的ポリヌクレオチド配列中の反復塩基は、相補的ポリヌクレオチド配列が相補的ＤＮＡポリヌクレオチドである場合、チミンであってもよいまたは相補的ポリヌクレオチド配列が相補的ＲＮＡポリヌクレオチドである場合、ウラシルであってもよい。
所与の相補的ポリヌクレオチド配列中の規則的に繰り返された塩基は、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上のヌクレオチド塩基毎の間隔を有していてもよい。ある態様では、規則的に繰り返された塩基は、約５〜１５ヌクレオチド塩基毎の、約６〜１２ヌクレオチド塩基毎の、約７〜１０ヌクレオチド塩基毎の、または約８〜１０ヌクレオチド塩基毎の間隔を置いて配置される。ある態様では、規則的に繰り返された塩基は、約８ヌクレオチド塩基毎の間隔を置いて配置される。ある態様では、規則的に繰り返された塩基は、約１５〜２０ヌクレオチド塩基毎の間隔を置いて配置される。ある態様では、規則的に繰り返された塩基は、約１６ヌクレオチド塩基毎の間隔を置いて配置される。
ある態様では、規則的に繰り返された塩基は、アミノアリル修飾されている。この修飾は、規則的に繰り返された塩基への検出可能な分子または標識モノマーの素早い付加（たとえば上記のように直接的なまたは間接的な）を可能にする。アミノアリル修飾塩基は、グアニン、アデニン、チミン、シトシン、またはウラシル塩基であってもよい。ある実施形態では、規則的に繰り返された塩基は、アミノアリル修飾ウラシル塩基である。
ある態様では、検出可能な分子または標識モノマーは、その塩基のアミノアリル修飾を介してなどのように規則的に繰り返された塩基に付加される。ある態様では、検出可能な分子は、所与のポリヌクレオチド相補的ポリヌクレオチド配列中の規則的に繰り返された塩基のすべてまたはほとんどすべてに付加される。ある実施形態では、検出可能な分子は、所与の相補的ポリヌクレオチド配列中の規則的に繰り返された塩基の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に付加される。
ある態様では、検出可能な分子または標識モノマーは、その塩基のアミノアリル修飾を介してなどのように、規則的に繰り返されないが、少なくとも８塩基離れた塩基に付加される。相補的ポリヌクレオチド配列の明るさは、配列中の塩基の数または配列中の標識塩基の数に従って変化し得る。
特定の一例として、アデニンが一本鎖標識結合領域において規則的に繰り返され、約８ヌクレオチド塩基毎に存在する場合、アミノアリル（amino-ally）修飾ウラシルもまた、相補的ＲＮＡポリヌクレオチドにおいて約８ヌクレオチド塩基毎に存在してもよい。また、アミノアリル修飾ウラシルは、合成反応において修飾ウラシル塩基に対するウラシル塩基の比を調整することなどによって相補的ポリヌクレオチド配列の中に無作為に組み込んでもよい。これらの実例では、蛍光色素などの検出可能な分子は、アミノアリル修飾ウラシルのすべてもしくはほとんどすべての中に組み込まれてもよい（たとえば、約８塩基毎に）またはそれは、無作為にアミノアリル修飾ウラシル塩基の中に組み込まれてもよい。
規則的に繰り返された塩基の数を変更し（たとえば５、６、７、８、９、１０以上の塩基毎に）、規則的に繰り返された塩基毎に、他の規則的に繰り返された塩基毎に、３つに１つの規則的に繰り返された塩基毎に、もしくは無作為になど、またはその組合せで検出可能な分子を組み込むことによって、検出可能な分子は、検出可能なシグナルの所望のレベルに依存して、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のヌクレオチド塩基毎に組み込むことができる。
ある実施形態では、相補的ポリヌクレオチド配列は、配列番号１〜２４において記載されるポリヌクレオチド鋳型配列によって生成される一本鎖標識結合領域に対して相補的な配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドである。相補的ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１〜２４の鋳型配列から生成される標識結合領域のいずれかの完全長配列に対して相補的であってもよいまたはそれは、中間のすべての整数を含む１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００以上のヌクレオチド塩基を含む領域などの、そのポリヌクレオチド配列内の領域に相補的であってもよい。
相補的ポリヌクレオチド配列がＲＮＡポリヌクレオチドである実施形態では、それぞれの標識結合領域についての相補的ＲＮＡヌクレオチド（たとえばセグメント）は、標準のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）プロトコールなどの、当技術分野において公知の方法を使用して作製されてもよい。相補的ＲＮＡヌクレオチドを合成するために、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）プライマーは、転写開始部位のすぐ上流（５’）のＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６）から始まり、３’制限酵素部位の後に終了する二本鎖鋳型を生成するように設計されてもよい。ある態様では、これらのＩＶＴ反応のための鋳型は、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流にクローニングされた、配列番号１〜２４において記載される鋳型の合成ＤＮＡ産物またはその変異体配列を含んでいてもよい。そのような鋳型を使用して、ＲＮＡ分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は、ＲＮＡにおけるアミノアリル修飾の規則的に繰り返された塩基（たとえばＵＴＰ）ならびに非修飾の他の塩基（たとえばＡＴＰ、ＣＴＰ、およびＧＴＰ）の存在下において実行されてもよい。これは、すべての規則的に繰り返された塩基（たとえばＵ）が、ＲＮＡ分子におけるその位置に標識モノマーの共有結合を可能にするように修飾されるＲＮＡ産物に至る。
次いで、結果として生じるアミノアリル修飾転写物（ａａセグメント）は、様々な蛍光体（たとえばＡｌｅｘａ ４８８（青）、Ａｌｅｘａ ５４６（緑）、Ａｌｅｘａ ５９４（黄）、およびＡｌｅｘａ ６４７（赤）−他の色素もまた使用することができる）に結合されてもよい。Ａｌｅｘａ蛍光体は、サクシニミジルエステルまたはＴＦＰエステル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））として購入されてもよく、標準プロトコールを使用して、アミド結合の形成を介して転写物に結合されてもよい。セグメントにおける色素組込みのレベルは、可能な付加部位（アミノアリル（ａａ）部分）の数と相互に関連する。できるだけ明るい有色のセグメントを作製するために、１００％のａａＵＴＰが使用される。明るさを変化させるために、任意の比のａａＵＴＰおよび非修飾ＵＴＰの混合物は、ａａセグメント上に存在するａａ部位の数を修飾するために、ＩＶＴ反応において使用することができる。所望の明るさは、検出システムの光学装置で変化する。
検出可能な分子または標識モノマー
本発明のナノレポーターは、直接（たとえば光発光によって）または間接的に（たとえば蛍光標識抗体の結合によって）検出することができる、放射性同位体、蛍光色素、色素、酵素、ナノ粒子、化学発光マーカー、ビオチン、または当技術分野において公知の他のモノマーなどの様々な標識モノマーのいずれかを用いて標識することができる。一般に、ナノレポーターにおける、１つまたは複数の標識結合領域は、１つまたは複数の標識モノマーを用いて標識され、ナノレポーターの標識結合領域に付加された標識モノマーによって提供されるシグナルは、ナノレポーターの標的特異的領域が結合する標的を同定する検出可能なコードを構成する。ある実施形態では、標識結合領域に由来する所与のシグナルの欠如（たとえばダークスポット）もまた、ナノレポーターコードの一部を構成することができる。
ある実施形態では、ナノレポーターバックボーンがライブラリー（たとえば配列番号１〜２４の例示的な標識結合領域鋳型）から構築される場合など、それぞれの固有の標識結合領域は、所与の検出可能な分子を割り当てられてもよい。単に、特定の実例として、２４の固有の標識結合領域、たとえば鋳型配列番号１〜２４についての産物のライブラリーにおいて、鋳型配列番号１、５、９、１３、１７、および２１の産物は、青い蛍光体などの第１の検出可能な分子を割り当てられてもよく、鋳型配列番号２、６、１０、１４、１８、および２２の産物は、緑の蛍光体などの第２の検出可能な分子を割り当てられてもよく、鋳型配列番号３、７、１１、１９、および２３の産物は、黄色の蛍光体などの第３の検出可能な分子を割り当てられてもよく、鋳型配列番号４、８、１２、２０、および２４の産物は、赤の蛍光体などの第４の検出可能な分子を割り当てられてもよい。当業者は、この例が単に例証となり、異なるサイズのおよび配列番号１〜２４において記載されるもの以外の配列を有するライブラリーの使用を含む、多数の組合せまたは代案が、固有に検出可能なナノレポーターの集団を作製する目標を達成するために利用されてもよいことを理解するであろう。
本発明によって利用することができる標識モノマーの他の例は、蛍光体である。いくつかの蛍光体は、たとえばフルオレセイン、テトラメチルローダミン、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄを含む、ヌクレオチドを標識するための標識モノマーとして使用することができる。全スペクトルにわたる、いくつかの異なる蛍光体は、公知であり、さらに産生され続けている。また、同じ蛍光体の異なる配合物が、異なる適用のために産生されてきた。たとえば、フルオレセインは、そのイソチオシアネート（isothiocynanate）形態（ＦＩＴＣ）で、カルボキシフルオレスセインサクシニミジルエステル（ＦＡＭ）の混合異性体形態もしくは単一異性体形態として、またはフルオレセイン（ＤＴＡＦ）の異性体ジクロロトリアジン形態として使用することができる。これらのモノマーは、化学的に異なるが、すべて、５１５〜５２０ｎｍの間のピークを有する光を放射し、それによって、同様のシグナルを生成する。フルオレセインの化学的修飾に加えて、フルオレセインと同じかまたは非常に類似している発光ピークを有する、完全に異なる蛍光体が合成された。たとえば、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ色素は、事実上、フルオレセインと比較して重ねることができる励起および発光スペクトルを有する。Ｒｈｏｄｏｌ ＧｒｅｅｎおよびＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎなどの他の蛍光体は、それらの発光ピークがわずかだけシフトし、そのため、また、フルオレセインの代わりとしても機能的に役立つ。さらに、異なる配合物または関連する色素が、スペクトルの他の部分の光を放射する他の蛍光体を中心にして開発されてきた。
非放射性および非蛍光標識モノマーもまた、利用可能である。たとえば、ビオチンは、ヌクレオチドに直接、付加させることができ、比色分析反応を触媒する酵素（ホスファターゼ、ルシフェラーゼ、またはペルオキシダーゼなど）に化学的に結合されたアビジンまたはストレプトアビジンへの特異的な高アフィニティー結合によって検出することができる。ジゴキシゲニン標識ヌクレオチドは、同様に、核酸の非同位体検出に使用することができる。ビオチン化ジゴキシゲニン標識ヌクレオチドは、市販で入手可能である。
ナノ粒子と名付けられる非常に小さな粒子もまた、核酸を標識するための標識モノマーとして使用することができる。これらの粒子は、サイズが１〜１０００ｎｍの範囲であり、金および銀の粒子などの種々の化学構造ならびに量子ドットを含む。
角度のある入射白色光を用いて照射された場合、４０〜１２０ｎｍの範囲の銀または金のナノ粒子は、高輝度を有する単色光を散乱するであろう。散乱光の波長は、粒子のサイズに依存する。非常に近接した異なる４〜５の粒子は、それぞれ、重ねられた場合に、特異的な固有色を発するであろう単色光を散乱するであろう。粒子は、Ｇｅｎｉｃｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓなどの会社によって製造されている。誘導体化された銀または金の粒子は、タンパク質、抗体、小分子、受容体リガンド、および核酸を含む、広範囲の分子に付加させることができる。たとえば、粒子の表面は、ヌクレオチドへの付加を可能にするために化学的に誘導体化することができる。
標識モノマーとして使用することができる他のタイプのナノ粒子は、量子ドットである。量子ドットは、光の広い範囲の波長によって励起性となる、直径が１〜５ｎｍの蛍光性の結晶である。これらの結晶は、それらの化学組成およびサイズに依存する波長を有する、単色光などの光を放射する。ＣｄＳｅ、ＺｎＳｅ、ＩｎＰ、またはＩｎＡｓなどの量子ドットは、固有の光学的性質を有する。
粒子の多数のクラスは、量子ドット結晶のサイズクラスの数に従って作製することができる。結晶のサイズクラスは、１）それぞれの所望のサイズクラスの粒子を作製するための結晶形成パラメーターの厳しい制御によってまたは２）緩く制御された結晶形成パラメーター下で結晶のバッチを生成し、その後に続いて所望のサイズおよび／または発光波長に従ってソートすることによって作製される。本発明との関連において粒子を標識するための量子ドットの使用は新しいが、半導体の技術分野において古い。量子ドットが半導体光放射／検出デバイスの真性シリコンエピタキシャル層内に埋め込まれる、前の参考文献の２つの例は、Ｃｈａｐｐｌｅ Ｓｏｋｏｌらに対する米国特許第５，２９３，０５０号および第５，３５４，７０７号である。
特定の実施形態では、ナノレポーターにおける１つまたは複数の標識結合領域は、１つまたは複数の光放射色素を用いて標識され、それぞれの標識結合領域は、直接または間接的に、１つまたは複数の検出可能な分子または標識モノマーを含有する。色素によって放射された光は、可視光線または紫外線もしくは赤外線などの不可視光線とすることができる。例示的な実施形態では、色素は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）色素；フルオレセインおよびローダミンなどのキサンテン色素；アルファまたはベータ位置においてアミノ基を有する色素（ナフチルアミン色素、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレン（naphthalenede）スルホネート、および２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネートなど）；３−フェニル−７−イソシアナトクマリンを有する色素；９−イソチオシアナトアクリジンおよびアクリジンオレンジなどのアクリジン；ピレン、ベンゾオキサジアゾールおよびスチルベン；３−（ε−カルボキシペンチル）−３’−エチル−５，５’−ジメチルオキサカルボシアニン（ＣＹＡ）を有する色素；６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）；５＆６−カルボキシローダミン−１１０（Ｒ１１０）；６−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）；６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）；ＡＬＥＸＡ Ｆｌｕｏｒ（商標）；Ｃｙ２；Ｔｅｘａｓ ＲｅｄおよびＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ；６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）；６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）；５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＺＯＥ）；ＮＡＮ；ＮＥＤ；Ｃｙ３；Ｃｙ３．５；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；およびＣｙ７．５；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４；またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７である。
標識モノマーは、その構築の異なるステージでナノレポーターの中にまたは成分（たとえば、ナノレポーターの中へのその構築前のナノレポーターの相補的ＲＮＡヌクレオチド）の中に組み込むことができる。
標識モノマーは、当技術分野において周知の方法を使用して、ヌクレオチドに直接、付加させることができる。ヌクレオチドはまた、標識モノマーを付加させるために化学的に修飾するまたは誘導体化することができる。たとえば、フルオレセイン分子などの蛍光モノマーは、４原子アミノアルキニル基を使用して、ｄＵＴＰ（デオキシウリジン三リン酸）に付加させることができる。それぞれの標識モノマーは、ヌクレオチドに付加され、標識モノマー：ヌクレオチド複合体を作製する。
この標識モノマー／ヌクレオチド複合体は、様々な方法において核酸（たとえばＤＮＡパッチまたは検出オリゴヌクレオチド）の中に組み込むことができる。たとえば、標識モノマー／ヌクレオチド複合体は、核酸内のたった１つの位置または核酸内の２つ以上の位置に組み込むことができる。
アミン反応性およびチオール反応性蛍光体は、入手可能であり、ヌクレオチドおよび生体分子を標識するために使用される。一般に、ヌクレオチドは、化学合成の間に蛍光標識され、たとえば、ヌクレオチド合成の間のアミンまたはチオールの組込みは、蛍光体の追加を可能にする。蛍光標識ヌクレオチドは、市販で入手可能である。たとえば、スペクトルをカバーする１０の異なる蛍光体にコンジュゲートされたウリジンおよびデオキシウリジン三リン酸は、入手可能である。
ヌクレオチドは、最初に標識モノマーに付加され、次いで、核酸の中に組み込むことができる。その代わりに、既存の核酸は、核酸内のヌクレオチドに標識モノマーを付加させることによって標識することができる。たとえばアミノアリル−（「ＡＡ−」）修飾ＵＴＰヌクレオチドは、転写の間にＲＮＡ産物の中に組み込むことができる。様々な実施形態では、相補的ＲＮＡヌクレオチドを生成するための転写反応における２０％以上のＵＴＰヌクレオチドは、ＡＡ修飾される。様々な実施形態では、転写反応における約１０％または約２０％〜１００％、２０％〜８０％、３０％〜８０％、４０％〜６０％、もしくは５０％〜７５％のＵＴＰは、ＡＡ修飾され、好ましい実施形態では、転写反応における約４０％または約５０％のＵＴＰは、ＡＡ修飾される。
さらに、たとえば、異なるタイプの標識モノマー：ヌクレオチド複合体は、単一の酸核酸の中に組み込むことができ、ナノレポーターコードの１つの成分は、１を超えるタイプのシグナルを含む。
ヌクレオチドに直接、結合することができる蛍光色素もまた、標識モノマーとして利用することができる。たとえば、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、およびＲＯＸは、ヌクレオチドに付加させられており、自動ＤＮＡ配列決定において使用されるアミン反応性蛍光色素である。これらの蛍光標識ヌクレオチド、たとえばＲＯＸ−ｄｄＡＴＰ、ＲＯＸ−ｄｄＣＴＰ、ＲＯＸ−ｄｄＧＴＰ、およびＲＯＸ−ｄｄＵＴＰは、市販で入手可能である。
ナノレポーターを標識するために使用されてもよい他のタイプの標識モノマーは、量子ドットである。それらの非常に小さなサイズにより、量子ドットは、オリゴヌクレオチドの溶解性や使用に影響することなく、オリゴヌクレオチドの中に直接、結合することができる。好ましい実施形態では、１つのオリゴヌクレオチド分子だけが、それぞれのナノ粒子に結合される。従来のバッチ化学によって１：１の比のオリゴヌクレオチドナノ粒子複合体を合成するために、オリゴヌクレオチドおよびナノ粒子の両方は、互いに反応することができる、異なる種類の単一の反応性基を必要とする。たとえば、オリゴヌクレオチドがアミノ基を有し、ナノ粒子がアルデヒド基を有する場合、これらの基は、反応して、シッフ塩基を形成することができる。オリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の化学作用を使用して単一のアミノ基または他の官能基を付加させるために誘導体化することができる。しかしながら、ナノ粒子が誘導体化される場合、それは、いくつかの官能基でのナノ粒子の全表面のコートをもたらす化学試薬で覆われる。
アフィニティータグ
当技術分野において公知の様々なアフィニティータグは、ナノレポーターを精製するおよび／または固定するために使用されてもよい。
アフィニティータグが検出または画像化の目的のためにナノレポーターを固定するために使用される場合、それは、本明細書において「アンカー」と呼ばれてもよい。（図３を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ビオチンアンカーは、ナノレポーターに付加され、ストレプトアビジンコートスライド上へのナノレポーターの固定を可能にする。
いくつかの実施形態では、標識ナノレポーターは、それぞれの末端、Ａ１およびＡ２にアフィニティータグを含有するであろう。標識ナノレポーターは、固定されたアフィニティーパートナーへのＡ１の結合を通して表面に固定することができる。Ａ２についてのアフィニティー結合パートナーの非存在下において、ナノレポーターのＡ２末端は、溶液中に残るが、アフィニティー結合パートナー（Ａ２’）の存在下において、ナノレポーターのＡ２末端もまた、固定される。いくつかの実施形態では、標識ナノレポーターは、単一のアフィニティータグ（Ａ１）を含有するであろう。他のアフィニティータグ（Ａ２）は、Ａ２を含有する分子にナノレポーターを直接、結合することによって、ナノレポーターに付加させることができる（たとえば、ナノレポーターが核酸であるまたはそれを含む場合、それはＡ２が付加される他の核酸と直接、ハイブリダイズすることができる）。その代わりに、いずれかのアフィニティータグは、ブリッジ核酸などのブリッジ分子を介して標識ナノレポーターに付加させることができる。図３は、標識された（核酸ベースの）ナノレポーターが、一方の末端にアフィニティータグ（Ａ１）を含有するさらに他の実施形態を示す。図３では、標識ナノレポーターは、固定アフィニティーパートナーへのＡ１の結合を通して固定される。ナノレポーターの他方の末端は、溶液中にある（図３Ａ）が、ナノレポーターを固定するために使用される他のアフィニティータグ（Ａ２）を含有する相補的オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって固定することができる（図３Ｂ）。Ａ１の固定に際して、ナノレポーターは、ナノレポーターコードの検出を可能にする方法で、標識結合領域の分離のために、たとえばエレクトロストレッチングによって、図３において表されるように伸長するまたは「伸ばす」ことができる。任意選択で、ナノレポーターが伸ばされた状態にある間に、Ａ２は、導入され、Ａ２に相補的なナノレポーターの末端に結合し、表面に至る。
アフィニティータグは、精製を含むが、これに限定されない様々な有用な適用のために、ビーズまたは他のマトリックスへの付加に使用することができる。
適したアフィニティータグの非限定的な例は、下記に提供される。ほとんどのアフィニティータグは、ナノレポーターの固定のためのアンカーおよびナノレポーター（完全にもしくは部分的にのみ構築された）またはそれらの成分の精製のためのタグの両方として二重の目的を果たすことができることを理解されたい。
ある実施形態では、アフィニティータグは、タンパク質モノマーである。タンパク質モノマーの例は、免疫グロブリン定常領域（Petty、１９９６年、Metal-chelate affinity chromatography、Current Protocolsin Molecular Biology、２号、Ausubelら編、Greene Publish. Assoc. & WileyInterscience中を参照されたい）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ；Smith、１９９３年、Methods Mol. Cell Bio. ４巻：２２０〜２２９頁）、大腸菌マルトース結合タンパク質（Guanら、１９８７年、Gene ６７巻：２１〜３０頁）、および様々なセルロース結合ドメイン（米国特許第５，４９６，９３４号；第５，２０２，２４７号；第５，１３７，８１９号；Tommeら、１９９４年、ProteinEng. ７巻：１１７〜１２３頁）などを含むが、これらに限定されない。
他のアフィニティータグは、特異的な結合パートナーによって認識され、したがって、固体担体上に固定することができる結合パートナーへのアフィニティー結合によって、単離および固定を促進する。たとえば、アフィニティータグはエピトープとし、結合パートナーは抗体とすることができる。そのようなエピトープの例は、ＦＬＡＧエピトープ、アミノ酸４０８〜４３９のｍｙｃエピトープ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープ、またはジゴキシゲニン（「ＤＩＧ」）を含むが、これらに限定されない。他の実施形態では、アフィニティータグは、他のタンパク質またはアミノ酸、たとえばアビジン／ストレプトアビジンおよびビオチンによって認識されるタンパク質またはアミノ酸配列である。
本発明のある態様では、アフィニティータグは、ヌクレオチド配列である。約８〜約３０塩基、より好ましくは約１０〜約２０塩基の様々な配列は、ナノレポーターの精製および固定に使用することができ、配列は、縦列反復とすることができる（たとえば１〜１０の縦列反復配列）。そのような配列は、好ましくは、アッセイされている試料において広く占めず（すなわち、遺伝子の５％未満で存在する、より好ましくは遺伝子の３％未満で存在する、最も好ましくは遺伝子の１％未満において存在する）（たとえば、ナノレポーターがヒト細胞ＲＮＡの検出に使用される場合、配列は、好ましくは、ヒトゲノムにおいて広く占めない）；内部にまたはマルチマーになった場合のそれ自体のコピーと二次構造または自己相補性をほとんどまたはまったく有さず（すなわち、マルチマーになったタグのすべての二次構造は、好ましくは、１Ｍ ＮａＣｌで２５℃未満のＴｍを有する）；バックボーンまたはセグメント配列との著しい同一性または相補性を有さず（すなわち、相補的配列のＴｍは、好ましくは、０．２Ｍ ＮａＣｌで２５℃未満である）；５０ｍＭ Ｎａ＋において、約３５〜６５℃、より好ましくは約４０〜５０℃のＴｍを有する。
ある実施形態では、異なる配列は、精製および固定タグとして使用される。この場合、たとえば、精製タグは、上記に記載されるとおりとすることができるが、固定タグは、５０ｍＭ Ｎａ＋において９５℃までのＴｍを有する１０〜１００塩基の範囲とすることができる。代替の実施形態は、固定タグ内に入れ子にされた精製タグを有するであろう（たとえば、アフィニティータグは、１５塩基が精製タグとして使用され、全２５塩基が固定タグとして使用される２５塩基の配列を含むであろう）。
ある実例では、アフィニティータグは、ナノレポーターの精製または固定に加えて、ナノレポーターを標識するために使用することができる。
当業者によって理解されるように、ＤＮＡクローニング、ＤＮＡ増幅、および合成法を含むが、これらに限定されない多くの方法は、アフィニティータグのコード領域を得るために使用することができる。それらの検出および単離のためのアフィニティータグおよび試薬のいくつかは、市販で入手可能である。
定常領域
本発明のナノレポーターは、少なくとも１つの定常領域を含んでいてもよい。定常領域は、ポリヌクレオチド配列を含んでいてもよい。ある態様では、定常領域のポリヌクレオチド配列は、反復配列の２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のコピーなどの複数の個々の反復ヌクレオチド配列を含む。ある態様では、定常領域は、反復配列の４つのコピーを含む。
ある実施形態では、個々の反復配列は、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上のヌクレオチド塩基を含む。ある実施形態では、個々の反復配列は、約１５のヌクレオチド塩基を含む。
１５塩基反復配列の１つの例は、５’−ＧＧＴＯＴＧＴＧＴＧＡＴＧＴＴ−３’（配列番号２５）である。ある実施形態では、定常領域は、配列番号２５の反復配列などのように、１５塩基反復配列の４つのコピーを含有する。
ある態様では、定常領域は、本明細書において記載されるように、バックボーンポリヌクレオチド配列の単離および調製の後にナノレポーターバックボーンにライゲーションされてもよい。いくつかの実施形態では、定常領域は、あたかもそれがバックボーンの「コード」配列に融合されるかのように、ポリヌクレオチドバックボーンの永続的な部分を占める（つまり、定常領域はバックボーンの中にクローニングされる）。ある実施形態では、定常領域は、選択される標識結合領域の素早い組込みのために制限酵素部位に近接している。
標的特異的領域
用語「標的特異的配列」は、標的分子に結合することができる分子の実体を指す。ナノレポーターとの関連において、標的特異的配列は、ナノレポーターバックボーンに付加される。
標的特異的配列は、一般に、アミノ酸配列（つまりポリペプチドもしくはペプチド配列）または核酸配列である。
標的特異的配列がアミノ酸配列である特定の実施形態では、標的特異的配列は、抗体Ｆａｂ’断片、単鎖Ｆｖ抗体などの抗体断片を含んでいてもよい。
標的特異的配列は、好ましくは、核酸配列であり、最も好ましくは、ナノレポーターバックボーンに共有結合される（たとえばライゲーションによって）または非共有結合される（たとえばハイブリダイゼーションによって）オリゴヌクレオチド内にある。標的特異的核酸配列は、好ましくは、長さが少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは、長さが少なくとも２０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、標的特異的配列は、長さが約１０〜５００、２０〜４００、３０〜３００、４０〜２００、または５０〜１００のヌクレオチドである。他の実施形態では、標的特異的配列は、長さが約３０〜７０、４０〜８０、５０〜９０、もしくは６０〜１００、３０〜１２０、４０〜１４０、または５０〜１５０のヌクレオチドである。
標的特異的ヌクレオチド配列は、好ましくは、８２５ｍＭ Ｎａ＋（５×ＳＳＣ）においてそれぞれのプローブについて約６５〜９０℃、最も好ましくは約７８〜８３℃のＴｍを有する。
ある好ましい実施形態では、二重ナノレポーターのそれぞれのプローブの標的特異的配列は、約３５〜１００のヌクレオチド（２つのプローブによってカバーされる、約７０〜２００のヌクレオチドの完全な標的配列について）、最も好ましくは、それぞれのプローブについて約４０〜５０のヌクレオチド（合計約８０〜１００のヌクレオチドについて）である。
標的分子
用語「標的分子」は、その標的特異的配列（複数可）が認識する（つまり、特異的な結合パートナーである）、標識ナノレポーターのそれに対する結合によって検出されるまたは測定される分子である。好ましくは、標的分子は、以下のいずれかとすることができるが、これらに限定されない：核酸、ペプチド、ポリペプチド／タンパク質（たとえば細菌もしくはウイルスタンパク質または抗体）、脂質、炭水化物、糖タンパク質、糖脂質、小分子、有機モノマー、または薬剤。本明細書における方法によって分析することができる核酸は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡヘアピン、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡ（たとえばｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）、およびＲＮＡヘアピンを含む。一般に、標的分子は、自然発生の分子または自然発生の分子のｃＤＮＡまたは上述のｃＤＮＡの相補体である。
標的分子は、他の成分を含有する生体分子試料の一部とすることができるまたは試料のただ１つのもしくは主な成分とすることができる。標的分子は、全細胞もしくは全組織の成分、細胞もしくは組織抽出物、その分画された溶解物、または実質的に精製された分子とすることができる。標的分子は、たとえば、チップ、マイクロアレイ、またはビーズなどの固体表面を含む、溶液または固相において付加させることができる。また、標的分子は、公知か未知の構造または配列のいずれかを有することができる。
ある特定の実施形態では、その標的分子は、染色体ではない。他の特定の実施形態では、標的分子は、サイズが１，０００ｋｂ（または１ｍｂ）以下、サイズが５００ｋｂ以下、サイズが２５０ｋｂ以下、サイズが１７５ｋｂ以下、サイズが１００ｋｂ以下、サイズが５０ｋｂ以下、サイズが２０ｋｂ以下、サイズが１０ｋｂ以下である。さらに他の特定の実施形態では、標的分子は、その細胞環境から単離される。
生体分子試料
本発明のナノレポーター系は、任意の生体分子試料中の標的分子を検出するために使用することができる。当業者らによって理解されるように、試料は、細胞（初代細胞および培養細胞株の両方を含む）、細胞溶解物、または抽出物（ＲＮＡ抽出物、精製ｍＲＮＡを含むが、これらに限定されない）、組織および組織抽出物（ＲＮＡ抽出物、精製ｍＲＮＡを含むが、これらに限定されない）；体液（哺乳動物試料が好ましく、ヒト試料が特に好ましい事実上任意の生物の血液、尿、血清、リンパ液、胆汁、脳脊髄液、間質液、眼房水または硝子体液、初乳、痰、羊水、唾液、肛門分泌物および膣分泌物、汗、ならびに精液、漏出液、滲出液（たとえば、感染もしくは炎症の膿瘍もしくは任意の他の部位から得られる体液）、または関節（たとえば、正常な関節または関節リウマチ、変形性関節症、痛風、もしくは化膿性関節炎などの疾患によって影響を受けた関節）から得られる体液を含むがこれらに限定されない）などの生物学的試料；環境試料（空気、農業、水、および土壌試料を含むが、これらに限定されない）；生物兵器剤試料；細胞外液、細胞培養物に由来する細胞外上清、細菌における封入体、細胞コンパートメント、細胞周辺質、ミトコンドリアコンパートメントを含む研究試料などを含むが、これらに限定されない、任意の数の物体を含んでいてもよい。
生体分子試料は、生物標本に間接的に由来し得る。たとえば、対象の標的分子が細胞転写物、たとえばメッセンジャーＲＮＡである場合、本発明の生体分子試料は、メッセンジャーＲＮＡの逆転写によって産生されるｃＤＮＡを含有する試料とすることができる。他の実施例では、本発明の生体分子試料は、生物標本を分画、たとえばサイズ分画または膜分画にかけることによって生成される。
本発明の生体分子試料は、天然のものであってもよい、たとえば操作もしくは処理にかけられなくてもよいまたは処理されてもよく、薬剤を含む候補作用物質への曝露、遺伝子操作（たとえば遺伝子の追加もしくは欠失）などを含む任意の数の処理を含むことができる。
生体分子試料はまた、ある種の海洋または土壌ベースの試料などにおいて、細菌またはとりわけ珪藻類、渦鞭毛藻類、藻類などの他の生物を含有するものなどの環境試料を含んでいてもよい。
方法
ある態様では、本発明は、１つまたは複数の標的分子の検出および／または定量のための方法を提供する。特に、本発明は、個々の標的分子に結合することができる、安定したナノレポーターを提供し、標的分子の改善された検出を提供する。ナノレポーターの標識コードを通して、標的分子へのナノレポータープローブの結合は、標的分子の同定をもたらす。検出および／または定量は、本明細書において記載される単一ナノレポータープローブ系または二重ナノレポータープローブ系を使用して実行することができる。
いくつかの実施形態では、本発明は、生体分子試料中の特定の標的分子の存在を検出するための方法であって、試料中の標的分子へのプローブにおける標的特異的配列の結合を可能にする条件下で本明細書において記載されるナノレポータープローブと試料を接触させるステップおよび固有に標識されたナノレポータープローブと関連するシグナルを検出するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、生体分子試料は、生物学的試料である。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、細胞、細胞溶解物、組織試料、組織抽出物、または体液から選択される。いくつかの実施形態では、生体分子試料は、環境試料である。
いくつかの実施形態では、本発明は、生体分子試料中の複数の特定の標的分子の存在を検出するための方法であって、試料中の標的分子へのプローブにおける標的特異的配列の結合を可能にする条件下で本明細書において記載される複数のナノレポータープローブと試料を接触させるステップおよび固有に標識されたナノレポータープローブと関連するシグナルを検出するステップを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、試料中の少なくとも１つの標的分子の存在を決定するための方法であって、（ａ）少なくとも１つの標的分子ならびに（ｂ）固有の標的特異的領域および固有の設計されたナノレポーターを含む領域を含む少なくとも１つのナノレポータープローブを含む、少なくとも１つの分子複合体を形成するステップであって、上述のナノレポーターは、複数の異なる検出可能な分子を含むステップならびに１つまたは複数のナノレポーター分子の存在を個々にカウントすることを含む方法によって、上述の少なくとも１つの分子複合体または上述の少なくとも１つの分子複合体の少なくとも一部を個々に検出して、試料中の少なくとも１つの標的分子の存在を決定するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、それぞれの複合体が、（ａ）少なくとも１つの標的分子ならびに（ｂ）固有の標的特異的領域および固有の設計されたナノレポーターを含む領域を含む少なくとも１つのナノレポータープローブを含む、複数の分子複合体を形成することを含み、それぞれのナノレポーターは、複数の異なる検出可能な分子を含み、それぞれのナノレポータープローブは、異なるナノレポーター領域を含む方法によって複数の標的分子の存在を決定することを提供する。いくつかの実施形態では、試料の標準化の後の上述の分子複合体のバックグラウンドを超える分子カウント数は、３００、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００分子カウントよりも高い。いくつかの実施形態では、試料の標準化の後の分子複合体のバックグラウンドを超える分子カウント数は、４００分子カウントよりも高い。いくつかの実施形態では、ナノレポータープローブの有効な分子カウントの百分率は、約１０、１１、１２、１２．５、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％よりも高い。いくつかの実施形態では、ナノレポータープローブの有効な分子カウントの百分率は、約１２．５％よりも高い。いくつかの実施形態では、上述の試料の標準化の後の本明細書において記載されるナノレポーターのバックグラウンドを超える分子カウントの数は、Ｍ１３ ＤＮＡを含む、比較可能なナノレポーターよりも、少なくとも６倍高い。いくつかの実施形態では、上述の試料の標準化の後の本明細書において記載されるナノレポーターのバックグラウンドを超える分子カウントの数は、Ｍ１３ ＤＮＡを含む、比較可能なナノレポーターよりも、少なくとも２倍高い。
いくつかの実施形態では、本発明は、試料中の少なくとも１つの標的分子の存在を決定するための方法であって、（１）（ａ）少なくとも１つの標的分子ならびに（ｂ）固有の標的特異的領域および固有の設計されたナノレポーターを含む領域を含む少なくとも１つのプローブを含む、少なくとも１つの分子複合体を形成するステップであって、上述のナノレポーターは、一本鎖核酸バックボーンを含み、上述のバックボーンは、固有の線状の組合せにおいて共に共有結合された複数の標識結合領域を含み、それぞれの標識結合領域は、１つまたは複数の検出可能な分子をそれに付加させている固有の相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするステップならびに（２）少なくとも１つの分子複合体または上述の少なくとも１つの分子複合体の少なくとも一部を個々に検出して、試料中の少なくとも１つの標的分子の存在を決定するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ナノレポータープローブの有効な分子カウントの百分率は、約１０、１１、１２、１２．５、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％よりも高い。いくつかの実施形態では、ナノレポータープローブの有効な分子カウントの百分率は、約１２．５％よりも高い。
いくつかの実施形態では、上述の試料の標準化の後の本明細書において記載されるナノレポーターのバックグラウンドを超える分子カウントの数は、Ｍ１３ ＤＮＡを含む、ナノレポーターよりも、少なくとも２倍高い。いくつかの実施形態では、その標識結合領域にハイブリダイズする場合の相補的ポリヌクレオチド配列のＴｍは、Ｍ１３ ＤＮＡを含むナノレポータープローブにハイブリダイズした場合のＭ１３ ＤＮＡ鋳型に相補的なポリヌクレオチド配列のＴｍよりも高い。Ｍ１３ナノレポータープローブは、ナノレポータープローブの同じ標的特異的配列を含み、共に共有結合された複数のＭ１３ ＤＮＡ領域を含む一本鎖バックボーンを含み、それぞれの領域は、１つまたは複数の検出可能な分子をそれに付加させている相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本発明は、それぞれの複合体が（ａ）少なくとも１つの標的分子および（ｂ）少なくとも１つのナノレポータープローブを含む、複数の分子複合体を形成することを含む方法によって、複数の標的分子の存在を決定するための方法であって、それぞれのナノレポータープローブが、Ｍ１３ ＤＮＡを含む比較可能なナノレポーターよりも高い融解温度を有する方法を提供する。
本発明の特定の実施形態の例は、図１および２において示される。
標識ナノレポーターから生成される全体的なシグナルの検出に加えて、本発明は、ナノレポーター上の標識モノマーから発されるシグナル（たとえばスポット）の空間的な位置の決定であって、それぞれのスポットが、所与の標識結合領域に付加された標識モノマーに由来する集合したシグナルを表す決定を提供する。スポットは、同じ波長または異なる波長のシグナルを含有していてもよい。したがって、ナノレポーター上のスポットの性質およびそれらの位置は、ナノレポーターコードを構成する。
いくつかの実施形態では、標識ナノレポーターは、ある位置において捕捉され、伸長される（図４を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ナノレポーターを伸長する前に、ナノレポーターは、上記に記載されるように、アフィニティータグを使用して固体表面に固定される（図３を参照されたい）。本発明のある態様では、ナノレポーターの一方の末端は、固体表面への特異的または非特異的結合を通して固定され、ナノレポーターは伸長され、次いで、レポーターの他方の末端は、また、固体表面への特異的または非特異的結合を通して固定される（図３を参照されたい）。核酸の捕捉、伸長および固定のための方法は、当技術分野において周知である。本明細書において記載される方法において使用することができる方法の例は、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎａｌｙｔｅｓ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｉｘｔｕｒｅｓ」と題する米国特許第７，４７３，７６７号、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎａｌｙｔｅｓ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｉｘｔｕｒｅｓ」と題する米国特許公開第２００７／０１６６７０８号、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｏｒｉｅｎｔｅｄ，ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」と題する米国特許出願第１１／６４５，２７０号、「Ｎａｎｏｒｅｐｏｒｔｅｒｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ ｕｓｅ ｔｈｅｒｅｏｆ」と題するＰＣＴ出願ＵＳ０６／０４９２７４、および「Ｓｔａｂｌｅ ｎａｎｏｒｅｐｏｒｔｅｒ」と題する米国仮特許出願第６０／０８８，９８８号において記載されており、これらのすべては、その全体が本明細書において参照によって組み込まれる。
したがって、いくつかの実施形態では、ナノレポーターは、ナノレポーターに付加された標識モノマーによって提供される（たとえば放射される）シグナルおよび互いに関連したそれらの位置を検出するおよび／または画像化することによって、ナノレポーターコードの分析を促進するために、その伸長されたまたは拡張された状態において「凍結される」。本発明のこれらの態様は、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎａｌｙｔｅｓ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｉｘｔｕｒｅｓ」と題する米国特許第７，４７３，７６７号、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎａｌｙｔｅｓ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｉｘｔｕｒｅｓ」と題する米国特許公開第２００７／０１６６７０８号、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｏｒｉｅｎｔｅｄ，ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」と題する米国特許出願第１１／６４５，２７０号、「Ｎａｎｏｒｅｐｏｒｔｅｒｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ ｕｓｅ ｔｈｅｒｅｏｆ」と題するＰＣＴ出願ＵＳ０６／０４９２７４、および「Ｓｔａｂｌｅ ｎａｎｏｒｅｐｏｒｔｅｒ」と題する米国仮特許出願第６０／０８８，９８８号において記載されており、これらのすべては、その全体が本明細書において参照によって組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ナノレポーターは、基質に固定することができる。本発明の方法では、固定のための基質は、当業者に明らかなナノレポーターに選択的に結合することができる任意の基質とすることができる。いくつかの実施形態では、ナノレポーターの第１の部分は、アビジン−ビオチン結合対を介して基質に固定することができる。ある実施形態では、ナノレポーターは、その第１の部分においてビオチン部分を含むことができる。たとえば、ポリヌクレオチドナノレポーターは、ビオチン化ヌクレオチド残基を含むことができる。二重ナノレポータープローブ系では、ナノレポータープローブの一方（たとえば、捕捉ナノレポータープローブ）は、ビオチン部分を含むことができる。このプローブは、標識または非標識であってもよい。好ましい実施形態では、二重ナノレポーター系が使用される場合、ビオチン部分を含むナノレポータープローブは、非標識である。アビジンを含む基質は、当業者に公知のアビジンを含む任意の基質とすることができる。ＴＢ０２００（Ａｃｃｅｌｒ８）、ＳＡＤ６、ＳＡＤ２０、ＳＡＤ１００、ＳＡＤ５００、ＳＡＤ２０００（Ｘａｎｔｅｃ）、ＳｕｐｅｒＡｖｉｄｉｎ（Ａｒｒａｙ−Ｉｔ）、ストレプトアビジンスライド（カタログ＃ＭＰＣ ０００、Ｘｅｎｏｐｏｒｅ）、およびＳＴＲＥＰＴＡＶＩＤＩＮｎｓｌｉｄｅ（カタログ＃４３９００３、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ）を含むアビジンを含む有用な基質は、市販で入手可能である。
ある実施形態では、ナノレポーターの第１の部分は、基質（たとえばビオチン）上のヌクレオチド配列に選択的に結合することができるヌクレオチド配列を含むことができる。ある態様では、ナノレポーターの定常領域（たとえば１５塩基反復配列の複数のコピー）は、基質上で固定される相補的ポリヌクレオチド配列に選択的に結合することができる。特定の実施形態では、ナノレポーターが、５’−ＧＧＴＣＴＧＴＧＴＧＡＴＧＴＴ−３’（配列番号２５）の例示的な１５塩基反復配列の４つのコピーを含む場合、配列５’−ＡＡＣＡＴＣＡＣＡＣＡＧＡＣＣ ＡＡＣＡＴＣＡＣＡＣＡＧＡＣＣ ＡＡＣＡＴＣＡＣＡＣＡＧＡＣＣ ＡＡＣＡＴＣＡＣＡＣＡＧＡＣＣ ＡＧＣＣＣＴＴＴＧ−３’（配列番号２６）を有するオリゴヌクレオチドは、基質にナノレポーターを固定するために利用されてもよい。
二重ナノレポータープローブ系が使用されるいくつかの実施形態では、ビオチンを含む第１の非標識の捕捉ナノレポータープローブおよび定常領域を含む第２の標識ナノレポータープローブは、標的分子の検出および／または定量に使用される（図１および２を参照されたい）。両方のナノレポータープローブは、それらの標的特異的配列を介して標的分子に結合し、標的分子およびナノレポータープローブを含む複合体を形成する。次いで、複合体は、本明細書において記載されるものなどの、アビジンを含有する基質の中に捕捉され、固定される。次いで、複合体は、本明細書において記載されるように伸長し、拡張することができる。次いで、ナノレポータープローブにおける定常領域は、基質上に固定される相補的ポリヌクレオチド配列に結合することができる。二重ナノレポーター系に関して本明細書において記載される方法において使用することができる方法の例は、「Ｎａｎｏｒｅｐｏｒｔｅｒｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ ｕｓｅ ｔｈｅｒｅｏｆ」と題するＰＣＴ出願ＵＳ０６／０４９２７４および「Ｓｔａｂｌｅ ｎａｎｏｒｅｐｏｒｔｅｒ」と題する米国仮特許出願第６０／０８８，９８８号において記載されており、これらのすべては、その全体が本明細書において参照によって組み込まれる。
本発明の特定の実施形態の例は、図２〜４において示される。
ある態様では、本発明は、固有の核酸バックボーンの適した集団を調製するための方法であって、（ａ）固有の設計された標識結合領域のライブラリーから標識結合領域のセットを選択するステップおよび（ｂ）集団中の他のバックボーンとは異なる線状の組合せにおいて標識結合領域のセットを互いに共有結合させるステップおよび固有の核酸バックボーンの適した集団が調製されるまでステップ（ａ）〜（ｂ）を繰り返すステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、標識結合領域は、約８００〜１３００ヌクレオチド塩基を含む。いくつかの実施形態では、標識結合領域は、約５０％のＧ／Ｃ含量を有する。いくつかの実施形態では、アデニン塩基は、標識結合領域において平均約８〜１６塩基毎の間隔を置いて配置される。いくつかの実施形態では、標識結合領域は、二次構造を欠く。いくつかの実施形態では、それぞれの選択された標識結合領域は、セットにおける他の選択された標識結合領域とは異なる。いくつかの実施形態では、選択するステップ（ａ）は、３、４、５、６、７、８の標識結合領域のセットを選択することを含む。いくつかの実施形態では、選択するステップ（ａ）は、６の標識結合領域のセットを選択することを含む。いくつかの実施形態では、標識結合領域は、検出可能な分子をそれに付加させている相補的ＲＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、相補的ＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも１／１のＧ／Ｃ比を有する。いくつかの実施形態では、相補的ＲＮＡポリヌクレオチドは、約３／２のＧ／Ｃ比を有する。
ある態様では、本発明は、固有の核酸バックボーンの適した集団を調製するための方法であって、（ａ）固有の設計された標識結合領域のライブラリーから標識結合領域のセットを選択するステップであって、それぞれの標識結合領域は、約８００〜１３００ヌクレオチド塩基を含み、約５０％のＧ／Ｃ含量を有し、それぞれの標識結合領域は、規則的に間隔を有するパターンのアデニン塩基を含むステップおよび（ｂ）集団中の他のバックボーンとは異なる線状の組合せにおいて標識結合領域のセットを互いに共有結合させるステップおよび固有の核酸バックボーンの適した集団が調製されるまでステップ（ａ）〜（ｂ）を繰り返すステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、アデニン塩基は、標識結合領域において約８〜１６塩基毎の間隔を置いて配置される。いくつかの実施形態では、標識結合領域は、二次構造を欠く。いくつかの実施形態では、それぞれの選択された標識結合領域は、セットにおける他の選択された標識結合領域とは異なる。いくつかの実施形態では、選択するステップ（ａ）は、３、４、５、６、７、８の標識結合領域のセットを選択することを含む。いくつかの実施形態では、選択するステップ（ａ）は、６の標識結合領域のセットを選択することを含む。いくつかの実施形態では、標識結合領域は、検出可能な分子をそれに付加させている相補的ＲＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、相補的ＲＮＡポリヌクレオチドは、約３／２のＧ／Ｃ比を有する。
固定された、拡張された、または方向づけられたナノレポーターを選択的に使用するための方法
ある実施形態では、本発明は、標識の分離および連続的な検出のために高分子バーコードを作製するために使用することができる選択的に固定され、伸ばされたナノレポーターを提供する。分子に沿って間隔を有するこれらの標識は、ナノレポーターが拡張され、固定される場合に読み取ることができる固有のコードを提供する。拡張および選択的な固定は、高分子バーコードの解読を促進することができる。
選択的に固定され、伸ばされるナノレポーターは、ナノレポーターの検出または画像化が有用であり得るあらゆる状況において使用することができる。それらは、診断、予後、治療、およびスクリーニングの目的に使用することができる。たとえば、それらは、病気の細胞型が試料中に存在するかどうかを決定するためにおよび／または疾患を段階づけるために、患者から得られるまたはそれに由来する生体分子試料の分析に適用することができる。それらは、試料中の細菌またはウイルスのマーカーの存在および／または量をそれぞれ決定することによって、病原体感染、たとえば細胞内細菌およびウイルスによる感染を診断するために使用することができる。本発明の組成物および方法は、その存在量が生物学的状態または疾患状態を示す標的分子、たとえば、疾患状態の結果として上方制御されるまたは下方制御される血液マーカーを定量するために使用することができる。さらに、本発明の組成物および方法は、患者のための治療の過程を決定するのを支援する予後情報を提供するために使用することができる。
ナノレポーターの検出
ナノレポーターは、所与のナノレポーター上の特異的なシグナルを検出することができる、当技術分野において入手可能な任意の手段によって検出される。ナノレポーターが蛍光標識される場合、適切な励起源の適した検討が調査されてもよい。可能な源は、ランプ、キセノンランプ、レーザー、発光ダイオード、またはそのいくつかの組合せを含むが、これらに限定されない。適切な励起源は、適切な光学検出システム、たとえば倒立蛍光顕微鏡、エピ蛍光顕微鏡、または共焦点顕微鏡と共に使用される。好ましくは、ナノレポーター上のスポットの配列を決定するのに十分な空間的分析を用いる検出を可能にすることができる顕微鏡が使用される。たとえば、一実施形態では、標的分子にハイブリダイズした二重ナノレポーターの画像を得ることができる。たとえば、ナノレポーターが、３つの異なる色、Ａｌｅｘａ ４８８、Ｃｙ３、およびＡｌｅｘａ ６４７（それぞれ標識１、２、および３）を用いて標識される場合。色１、２、および３は、それぞれ、異なるチャネルにおいて得られ、第１および第２のレジスターは、スポットの列として見ることができるが、それぞれのレジスターを個々に示すことができるように、数ピクセル、シフトされる。
本発明の方法において使用することができるナノレポーターの検出のための方法の例は、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎａｌｙｔｅｓ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｉｘｔｕｒｅｓ」と題する米国特許第７，４７３，７６７号、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎａｌｙｔｅｓ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｉｘｔｕｒｅｓ」と題する米国特許公開第２００７／０１６６７０８号、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｏｒｉｅｎｔｅｄ，ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」と題する米国特許出願第１１／６４５，２７０号、「Ｎａｎｏｒｅｐｏｒｔｅｒｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ ｕｓｅ ｔｈｅｒｅｏｆ」と題するＰＣＴ出願ＵＳ０６／０４９２７４、および「Ｓｔａｂｌｅ ｎａｎｏｒｅｐｏｒｔｅｒ」と題する米国仮特許出願第６０／０８８，９８８号において記載されており、これらのすべては、その全体が本明細書において参照によって組み込まれる。
顕微鏡および対物レンズの選択
顕微鏡対物レンズに関する主な検討は、その開口数（ＮＡ）によって決定される光学分解能を用いる。一般に、ＮＡが大きいほど、光学分解能はよくなる。必要とされるＮＡは、δ＝０．６１λ／ＮＡの関係に基づいて（δ＝光学分解能およびλ＝波長）、好ましくは、少なくとも１．０７である。対物レンズによって集められる光量は、ＮＡ４／Ｍａｇ２によって決定される（Ｍａｇ＝対物レンズの倍率）。そのため、できるだけ光を集めるために、高ＮＡおよび低倍率を有する対物レンズが選択されるべきである。
ＣＣＤカメラ選択および画像捕捉技術
ＣＣＤカメラを選択する場合、第１の検討は、ピクセルサイズであり、これは、画像システムの最終的な分解能を部分的に決定する。最適には、光学分解能は、ＣＣＤカメラによって損なわれるべきでない。たとえば、光学分解能が２１０〜３００ｎｍである場合、これは、６０×倍率の後にＣＣＤチップ上で１２．６〜１８μｍに対応するが、分解し、光学分解能を維持するために、それぞれのスポットをサンプリングするための少なくとも２ピクセルがあるべきである。またはＣＣＤチップのピクセルサイズは、せいぜい６．３〜９μｍとするべきである。
第２の検討は、ピクセルサイズ、量子収量、リードアウトノイズ、およびダークノイズを含むが、これらに限定されない多くの因子によって決定することができる検出感度である。高感度を達成するために、大きなピクセルサイズ（これは大きな収集エリアを与えることができる）、高量子収量、および低ノイズを有する定性的なカメラを選択されたい。これらの基準を有する例示的なカメラは、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｉｎｃ．からのＯｒｃａ−Ａｇカメラである。チップサイズは、１３４４×１０２４ピクセルであり、６０×対物レンズを使用する場合、視野は、１４４×１１０μｍ２である。
ナノレポーター技術の適用
本発明の組成物および方法は、診断、予後、治療、およびスクリーニングの目的に使用することができる。本発明は、本発明の方法を使用して、単一の生体分子試料から一度に様々な標的分子を分析することができるという有利性を提供する。これは、たとえば、いくつかの診断試験が１つの試料に対して実行されることを可能にする。
本明細書において記載される方法は、ヌクレオチド配列を区別する。標的ヌクレオチド配列の間の差異は、たとえば単一の核酸塩基差異、核酸欠失、核酸挿入、または再配列とすることができる。１を超える塩基に関するそのような配列差異もまた、検出することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブセットは、それらが実質的に類似したハイブリダイゼーション条件で標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように、同じ長さを実質的に有する。その結果として、本発明のプロセスは、感染症、遺伝子疾患、および癌を検出することができる。それはまた、環境モニタリング、法医学、および食品科学においても有用である。核酸に対して実行することができる遺伝子分析の例は、たとえば、ＳＮＰ検出、ＳＴＲ検出、ＲＮＡ発現分析、プロモーターメチル化、遺伝子発現、ウイルス検出、ウイルスサブ分類、および薬剤抵抗性を含む。
環境モニタリングのエリアでは、本発明は、都市廃水浄化システムおよび貯水器においてまたはバイオレメディエーションを受けている汚染エリアなどにおける、自然ならびに操作された生態系およびミクロコスムにおける病原性および常在性微生物の検出、同定、およびモニタリングに使用することができる。それはまた、集団動的研究において特定の標的微生物をモニターするためにまたは環境および工業用植物において遺伝的に修飾された微生物を検出する、同定する、またはモニターするために生体異物を代謝することができる遺伝子を含有するプラスミドを検出することも可能である。
本発明はまた、軍関係者および犯罪捜査、親子鑑別および家族関係分析、ＨＬＡ適合分類、ならびに血液、精子、または汚染についての移植器官のスクリーニングのためのヒト同定用を含む、様々な法医学のエリアにおいて使用することもできる。
食品および飼料産業では、本発明は、様々な適用を有する。たとえば、それは、ビール、ワイン、チーズ、ヨーグルト、パンなどの生産のための酵母などの生産生物の同定および特徴づけに使用することができる。使用の他のエリアは、汚染物質についての産物およびプロセス（たとえば家畜、低温殺菌、および食肉加工）の品質管理および検証に関してのものである。他の使用は、育種目的のための植物、球根、および種子の特徴づけ、植物特異的病原体の存在の同定、ならびに獣医学的感染の検出および同定を含む。
診断／予後方法
本発明の方法は、病気の細胞型が試料中に存在するかどうかを決定するためにおよび／または疾患を段階づけるために、患者から得られるまたはそれに由来する生体分子試料の分析に適用することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書において記載される方法は、状態の診断において使用される。本明細書において使用されるように、用語「診断する」または状態の「診断」は、状態の予測または診断、状態に対する素因の決定、状態の治療のモニタリング、疾患の治療応答の診断、ならびに状態、状態進行、および状態の特定の治療に対する応答の予後を含む。たとえば、血液試料は、試料中の癌細胞型のマーカーの存在および／または量を決定し、それによって癌を診断するまたは段階づけるために、本明細書において記載される方法のいずれかに従ってアッセイすることができる。
本発明のプロセスによって検出することができる癌は、一般に、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、またはＤＮＡ増幅、複製、組換え、もしくは修復に関与する遺伝子を含む。これらの例は、ＢＲＣＡ１遺伝子、ｐ５３遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ増幅、Ｂｃｒ／Ａｂ１、Ｋ−ｒａｓ遺伝子、ならびにヒトパピローマウイルス１６および１８型を含む。本発明の様々な態様は、以下の一般的なヒト癌における上記の遺伝子の増幅、大きな欠失、ならびに点突然変異および小さな欠失／挿入を同定するために使用することができる：白血病、結腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、膀胱腫瘍、黒色腫、肝臓癌、骨肉腫、ならびに他の骨癌、睾丸および卵巣癌、頭部および頚部腫瘤、ならびに頚部新生物。
遺伝子疾患もまた、本発明のプロセスによって検出することができる。これは、染色体および遺伝子異常または遺伝子疾患についての出生前または出生後のスクリーニングによって実行することができる。検出可能な遺伝子疾患の例は、２１ヒドロキシラーゼ欠失、嚢胞性繊維症、脆弱Ｘ症候群、ターナー症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ダウン症候群または他の３染色体性、心疾患、単一の遺伝子疾患、ＨＬＡ型判定、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球貧血、テイ・サックス病、サラセミア、クラインフェルター症候群、ハンチントン病、自己免疫性疾患、リピドーシス、肥満欠損症、血友病、先天性代謝異常、および糖尿病を含む。
その代わりに、本明細書において記載される方法は、試料中の細菌またはウイルスのマーカーの存在および／または量をそれぞれ決定することによって、病原体感染、たとえば細胞内細菌およびウイルスによる感染を診断するために使用することができる。
様々な感染症は、本発明のプロセスによって検出することができる。典型的に、これらは、細菌、ウイルス、寄生生物、および菌の病原菌によって引き起こされる。薬剤に対する様々な病原菌の抵抗性もまた、本発明を使用して決定することができる。
本発明によって検出することができる細菌の病原菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｂ−Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ｓｔｒｅｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌａｄｉｕｍ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、リケッチア属の病原体、Ｎｏｃａｒｄｉａ、およびＡｃｉｔｎｏｍｙｃｅｔｅｓを含む。
本発明によって検出することができる菌の病原菌は、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｕｔｕｓ、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｔｅｓ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｏｓｉｓ、およびＭａｄｕｒｏｍｙｃｏｓｉｓを含む。
本発明によって検出することができるウイルスの病原菌は、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス、肝炎ウイルス（たとえばＢ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス）、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、棒状ウイルス、ポリオウイルス、トガウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、ルベラウイルス、およびレオウイルスを含む。
本発明によって検出することができる寄生病原体は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、Ｏｎｃｈｏｖｅｒｖａ ｖｏｌｖｕｌｕｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ．、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｓｐｐ．、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｕｍ、Ｇｉａｒｄｉａ ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｉｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｂａｌａｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ、Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ、Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｔｒｉｃｈｉｕｒａ、Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ ｍｅｄｉｎｅｓｉｓ、ｔｒｅｍａｔｏｄｅｓ、Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ ｌａｔｕｍ、Ｔａｅｎｉａ ｓｐｐ．、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、およびＮｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｉｓを含む。
本発明はまた、病原菌による薬剤抵抗性の検出に有用である。たとえば、バンコマイシン抵抗性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、メチシリン抵抗性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、ペニシリン抵抗性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、多重薬剤抵抗性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、およびＡＺＴ抵抗性ヒト免疫不全ウイルスは、すべて、本発明を用いて同定することができる。
したがって、本発明の組成物および方法を使用して検出される標的分子は、患者マーカー（癌マーカーなど）または細菌もしくはウイルスマーカーなどの外来因子による感染のマーカーとすることができる。
ナノレポーターの定量的性質のために、本発明の組成物および方法は、その存在量が生物学的状態または疾患状態を示す標的分子、たとえば、疾患状態の結果として上方制御されるまたは下方制御される血液マーカーを定量するために使用することができる。
さらに、本発明の組成物および方法は、患者のための治療の過程を決定するのを支援する予後情報を提供するために使用することができる。たとえば、腫瘍についての特定のマーカーの量は、患者に由来する小さな試料からさえも正確に定量することができる。乳癌のようなある種の疾患については、Ｈｅｒ２−ｎｅｕなどのある種の遺伝子の過剰発現は、治療のより攻撃的な過程が必要であろうということを示す。
病理試料の分析
ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒド固定パラフィン包埋組織試料から抽出されるＲＮＡは、典型的に、品質が悪く（断片化）、収率が低い。これは、組織試料または保存用の病理組織における低発現遺伝子の遺伝子発現分析を非常に困難にし、多くの場合、完全に実行不可能にする。ナノレポーター技術は、非常に少数の低品質の全ＲＮＡの分析を可能にすることによって、この未解決の必要性を満たすことができる。
そのような適用においてナノレポーター技術を使用するために、全ＲＮＡは、メーカーのプロトコールに従って、ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）などの市販で入手可能なキットを使用して、ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒド固定パラフィン包埋組織試料（または同様のもの）から抽出することができる。そのような試料中のＲＮＡは、小さな断片（長さが２００〜５００ヌクレオチド）に頻繁に分解され、多くのパラフィン包埋組織試料から、数十ナノグラムの全ＲＮＡしか得られない。少量のこの断片化した全ＲＮＡ（５〜１００ｎｇ）は、本明細書において記載されるアッセイ条件に従って、ナノレポーターハイブリダイゼーションにおける標的物質として直接、使用することができる。
スクリーニング方法
本発明の方法は、様々な標的分子に対する、化学化合物、突然変異、温度変化、成長ホルモン、増殖因子、疾患、または培養条件における変化を含む混乱の影響を決定するために、とりわけ使用し、それによって、その存在、欠如、またはレベルが特定の生物学的状態を示す標的分子を同定することができる。好ましい実施形態では、本発明は、疾患状態の成分および経路を解明し、発見するために使用される。たとえば、「正常な」組織との、疾患組織において存在する標的分子の量の比較は、疾患に関与する重要な標的分子の解明を可能にし、それによって、疾患を治療するために使用することができる新しい薬剤候補の発見／スクリーニングのための標的を同定する。
ナノレポーターを含むキット
本発明は、本発明の１つまたは複数の成分を含むキットをさらに提供する。キットは、たとえば、本発明による基質および基質上に選択的に固定された、１つまたは複数の拡張されたもしくは方向づけられたまたはその両方のナノレポーターを含む。キットは、上記に記載されるものを含む、当業者に明らかな任意の目的に使用することができる。
ある実施形態では、本発明は、少なくとも１つの固有に標識されたナノレポーターを調製するためのキットであって、それぞれが約８００〜１３００ヌクレオチド塩基、約５０％のＧ／Ｃ含量を含む少なくとも３つの標識結合領域および検出可能な分子をそれに付加させている少なくとも３つの相補的ポリヌクレオチド配列を含み、相補的ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１／１のＧ／Ｃ比を有するキットを提供する。いくつかの実施形態では、相補的ポリヌクレオチド配列は、約３／２のＧ／Ｃ比を有する。キットは、少なくとも３つの標的特異的プローブをさらに含むことができる。
ある実施形態では、本発明はまた、ナノレポーターの拡張および選択的な固定に有用なキットを提供する。キットは、ナノレポーターの拡張または固定を促進するために固定のための基質および１つまたは複数の結合パートナーを含むことができる。結合パートナーは、ある実施形態では、適切な力においてナノレポーターの拡張に有用な部分を含むことができる。ある実施形態では、結合パートナーは、表面へのナノレポーターの固定または選択的な固定を促進することができる。さらなる実施形態では、キットは、拡張および固定のためのナノレポーターを含むことができる。さらなる実施形態では、キットは、ナノレポーターを拡張することができるデバイスを含むことができる。
キットは、本明細書において記載されるナノレポーターの集団を含有することができる。
キットは、ナノレポーターを標識するための１つまたは複数の成分と共に標識前ナノレポーターまたは非標識のナノレポーターを含有することができる。さらに、キットにおいて提供されるナノレポーターは、標的特異的配列をあらかじめ付加させてもよいまたはあらかじめ付加させなくてもよい。一実施形態では、標的配列は、ナノレポーターバックボーンに付加されないキットにおいて提供される。
キットは、同様に、他の試薬、たとえば、ハイブリダイゼーション反応を実行するためのバッファー、リンカー、制限エンドヌクレアーゼ、およびＤＮＡ Ｉリガーゼを含むことができる。
キットはまた、キットの成分を使用するためのならびに／または標識ナノレポーターを作製するためのおよび／もしくは使用するための説明書を含むであろう。
本発明は、下記に提供される非限定的な実施例によってさらに理解されてもよい。
（実施例１）
Ｄｅ Ｎｏｖｏ１（ＤＶ１）ナノレポーターバックボーンライブラリーの設計および製造プロトコール
多様なナノレポーターバックボーンのライブラリーを構築するために、標識結合領域を、固有の、合理的に設計されたポリヌクレオチド配列のライブラリーから選択し、配列番号２７で説明されるポリヌクレオチド配列を有するプラスミドベクター中に、様々な組合せでクローニングした。このベクター配列は最終レポーターバックボーンで終了せず、バックボーン配列のクローニングおよび増殖にも利用される。
具体的には、それぞれが固有の、配列番号１〜２４のポリヌクレオチド配列から選択された、６種の、約１１００塩基対の標識結合領域のコード特異的ＤＶ１プラスミドを構築した。これらのポリヌクレオチド配列により規定された標識結合領域を配列番号２７のベクター中に様々な組合せでクローニングし、それぞれの標識結合領域は、所与のバックボーンに固定された位置、すなわち１位、２位から６位までに相当する。所与のバックボーンにおける個々の位置にある標識結合領域は、その同じバックボーン中の他の標識結合領域とは異なった。個々の６位配列の３’末端を、レポーターの精製および固定化に使用される、Ｇ−４反復配列（配列番号２６）として公知の、共通の１５塩基の反復配列の４コピーに隣接してクローニングした。それぞれが、標識結合領域の固有の線状の組合せを有する、９７２種のナノレポーターバックボーンを設計し、日常的な分子生物学的技術に従ってクローニングした。
個々の標識結合領域が４種の検出可能な分子の１つであると指定した場合、４色のレポーター系中の６つの標識結合領域の使用は、４０９６の固有なナノレポーター候補を提供する。この実施例において、配列番号１、５、９、１３、１７および２１が、青の蛍光色素分子に指定され、配列番号２、６、１０、１４、１８および２２が緑の蛍光色素分子に指定され、配列番号３、７、１１、１５、１９および２３が黄色の蛍光色素分子に指定され、配列番号４、８、１２、１６、２０および２４が赤い蛍光色素分子に指定された。したがって、この実施例において、たとえ所与のバックボーンが、青の蛍光色素分子に指定された６つの標識結合領域（たとえば、１位から６位に配列番号１、５、９、１３、１７および２１）を含むとしても、個々の個別の標識結合領域は、その同じバックボーン中の他の標識結合領域とは異なるポリヌクレオチド配列を有すると思われる。
個別のプラスミドは、細菌内で増幅され、単離され、線状の一本鎖バックボーンに変換された。具体的には、線状の一本鎖ＤＮＡバックボーンは、二本鎖プラスミドＤＮＡから、４ステップのプロトコールを使用して作製した：（ｉ）ｄｓＤＮＡを制限酵素を用いて線状化した、（ｉｉ）線状化されたＤＮＡを、熱不安定性ホスファターゼを用いて脱リン酸化した、（ｉｉｉ）このＤＮＡを、第２の制限酵素を用いて消化し、クローニングベクターをバックボーン配列から分離した、（ｉｖ）混合物を、鎖特異的ラムダエキソヌクレアーゼ消化を用いて消化し、無傷のバックボーン断片の一本鎖のみを残した。
一本鎖バックボーンを、標的特異的ヌクレオチド配列にライゲーションし、色素着色された相補的ＲＮＡヌクレオチド配列と共にインキュベートし、標識ナノレポーターを作製した。
（実施例２）
色素染色された相補的ＲＮＡポリヌクレオチドの作製
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応を利用し、アミノアリル修飾相補的ＲＮＡポリヌクレオチドを、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６キット（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標））を使用し、製造業者の指示書ならびに以下の詳述および改良に従って作製した。
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよび対象のポリヌクレオチド配列を含有するプラスミドを、制限消化により線状化し、エタノール沈殿し、鋳型として使用した。この実施例において、配列番号１〜２４で説明された配列を、ＩＶＴ反応において鋳型として使用し、２４種の固有の相補的ＲＮＡポリヌクレオチドを作製した。
アミノアリル−ＵＴＰ（ａａＵＴＰ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を、キットに供給されたＵＴＰと置き換え、またはａａＵＴＰおよび供給されたＵＴＰの混合物を使用した。相補的ＲＮＡポリヌクレオチドにおける色素組込みのレベルは、アミノアリル（ａａ）結合部位候補の数と相関する。最も明るい染色されたセグメント候補を作製するために、１００％のａａＵＴＰを使用するべきである。明るさを変更するために、ａａＵＴＰおよび未修飾のＵＴＰの任意の比率の混合物をＩＶＴ反応に使用し、相補的ＲＮＡポリヌクレオチド上に存在するａａ部位の数を修正できる。たとえば、規則的に繰り返された塩基の５０％に色素を組み込ませるために、ａａＵＴＰおよびＵＴＰの１：１混合物を利用した。ａａＵＴＰ＋ＵＴＰ一緒の最終濃度は、個々の他の３種のヌクレオチド（すなわち、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ）の最終濃度と同じであった。
ＩＶＴ反応は、３７℃において２２時間継続できる。反応後、アミノアリル修飾ＲＮＡ転写産物を、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））を使用して、製造業者の指示書に従って精製した。
下記の色素カップリング反応は、１ｍｇの反応用である。エタノール沈殿を、１ｍｇのアミノアリル（ａａ）修飾ＲＮＡポリヌクレオチドに関して実施した。固体色素（Ａｌｅｘａ４８８ ＴＦＰエステル、Ａｌｅｘａ５４６スクシニミジルエステル、Ａｌｅｘａ５９４スクシニミジルエステルおよびＡｌｅｘａ６４７スクシニミジルエステル；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１１μｇ／μｌで無水ＤＭＳＯに再懸濁した。ａａ修飾ＲＮＡポリヌクレオチドを、最終容量９０ｕｌの１００ｍＭのＮａ２Ｂ４Ｏ７、ｐＨ８．５に再懸濁し、３７℃において２０分間加熱した。１１０μｌの再懸濁された色素を、９０μｌのａａ修飾ＲＮＡポリヌクレオチドと、個別に混合した。混合物を、暗所において、室温で３０分から２時間インキュベートした。
色素着色された、ａａ修飾ＲＮＡポリヌクレオチドを、混合物から、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））を使用して、製造業者の指示書に従って精製した。等量の個々の２４種の色素着色されたＲＮＡポリヌクレオチドを、個々のポリヌクレオチド（「着色セグメント混合物」）が最終濃度４０ｎＭになるように混合した。この混合物を、ナノレポーターバックボーン集団と組み合わせ、以下の実施例３に記載の固有のナノレポーター集団を作製した。
（実施例３）
標識ＤＶ１ナノレポーターライブラリーの作製
標識ＤＶ１ナノレポーター分子のライブラリーを作製するために、実施例１の個々のコード特異的ＤＮＡバックボーンを、対象の特異的遺伝子のためのプローブ領域、すなわち標的特異的ヌクレオチド配列と個別にライゲーションした。プローブを、オリゴヌクレオチドを介してバックボーンとライゲーションし、オリゴヌクレオチドは、バックボーンと特異的プローブとの間の架橋として機能する。具体的には、ライゲーションの「架橋」として機能したユニバーサルオリゴヌクレオチドを含有するマスター混合物＋リガーゼバッファーを、正規化された（１０μＭ）標的特異的オリゴヌクレオチドプローブ（３５〜５０塩基）を含有する９６ウェルプレートの個別のウェルに加えた。プローブオリゴヌクレオチドと架橋オリゴヌクレオチドの相補的部分とのアニーリングのために、３７℃において短時間インキュベーション後、１．２ｐモルの個別の一本鎖ナノレポーターバックボーン／ウェル、追加のライゲーションバッファーおよびＴ４リガーゼを添加することによって、ライゲーションを開始した。プレートを、３７℃で、９６ウェル・サーモサイクラーにおいて２時間インキュベーションした。ライゲーション反応を、９６ウェルフォーマットにおいて、遠心分離を介し、Ｇ−５０Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムを通して脱塩した。個々のライゲーションされたバックボーンをプールし、エタノール沈殿し、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０に２０ｎＭで再懸濁した。
色素標識ナノレポーターを作製するために、以下を混合した：２ｍｌの２０×ＳＳＰＥ、ｐＨ６．５、２８．０５ｍｌのＨ２Ｏ、５ｍｌの上記のプールされたＤＶ１ナノレポーターバックボーン、１．２ｍｌのエタノールおよび３．７５ｍｌの実施例２の着色されたセグメント混合物。混合物を７５℃において２時間インキュベートした。過剰のセグメントを取り除くために、混合物を、全バックボーン配列に共通のＧ−反復配列の逆相補鎖とカップリングされたオリゴヌクレオチドカラムにおいて精製した（逆相補鎖配列に関しては配列番号２６を参照されたい）。未標識の「キャプチャー」プローブを作製するために、ナノレポーターバックボーンを３’領域の近くまたは３’領域においてビオチン化した。
（実施例４）
ＤＶ１およびＭ１３のナノレポーター系の比較
４０遺伝子のＤＶ１レポーターライブラリーを、実施例１から３に記載のように作製し、比較可能なＭ１３ライブラリーもまた、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／１００，９９０号に記載のように作製した。ＤＶ１およびＭ１３のライブラリーは、同一のプローブ（すなわち標的特異的ヌクレオチド）配列を含有し、同じ試料−３６種の細胞溶解物のアッセイに使用し、３重にアッセイした。標準的ハイブリダイゼーション、精製および画像化のプロトコールを、その全体を参照により本明細書に組み込まれるGeissら、Nature Biotechnology ２６巻：３１７〜３２４頁、２００８年に記載のように続けて実施した。一般的に、ナノレポーターライブラリーを、ＲＮＡ含有細胞溶解物とハイブリダイゼーションさせ、過剰なレポーターを洗浄によって取り除き、レポーターをレポーターが固定化され、伸長された表面に結合させ、表面を画像化し、画像を解析した。
ハイブリダイゼーション反応
細胞転写産物の検出を、多重ハイブリダイゼーション反応において実施し、標識ナノレポータープローブおよび未標識ナノレポータープローブ、すなわち「キャプチャー」プローブの両方を有するデュアルナノレポーター系を利用した。個々の試料を、以下のような最終濃度のハイブリダイゼーション試薬を用いて、３重にハイブリダイゼーションした：２００ｐＭの個々の未標識、ビオチン化キャプチャープローブ（キャプチャープローブ）、４０ｐＭの個々の標識レポータープローブ、５×ＳＳＰＥ（ｐＨ７．５）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬（Ｓｉｇｍａ）、１００ｎｇ／μｌのせん断サケ精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）および０．１％のＴｗｅｅｎ−２０。個々の３０μｌのハイブリダイゼーション反応物もまた、１００ｎｇの全ＲＮＡを最終濃度３．３ｎｇ／μｌで含有した。試薬を混合し、６５℃で、サーモサイクラーにおいて、加熱された蓋で遮断し、２００時間インキュベートした。
ハイブリダイゼーション後の精製
ハイブリダイズされなかったレポーターを取り除くため、反応物を、各キャプチャープローブに含有された３’反復配列に相補的なオリゴヌクレオチドにカップリングされた磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））において精製した。反応物を、まず０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＴＥ中１×ＳＳＰＥに希釈し、２２．５℃において３０分間連続して回転させながら、ビーズに結合させた。ビーズを、１５０μｌの０．１×ＳＳＰＥ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、ハイブリダイズされた複合体を、１００μｌの０．１×ＳＳＰＥ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０に、４５℃において１５分間溶出させた。溶出後、試料を、過剰なキャプチャープローブを取り除くために、各レポータープローブに含有された５’反復配列に相補的なオリゴヌクレオチドとカップリングされた磁気ビーズと結合させることによって、２度目の精製をした。抗３’反復配列ビーズからの溶出液を、５０μｌの３×ＳＳＰＥ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を加えることによって最終濃度の１×ＳＳＰＥにし、回転させながら２２．５℃において１５分間結合させた。ビーズを上記のように洗浄し、３０μｌの０．１×ＳＳＰＥ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０に、４５℃において溶出させた。二重に精製した試料を、次いで下記のように捕捉用に調製した。
ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇレポーターの捕捉、伸長および画像化
１マイクロリットルの、Ｔｅｔｒａｓｐｅｃｋ蛍光ミクロスフェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））の特別注文配合品の０．１％固溶体の１／５０００希釈液を、個々の試料に加えた。ストレプトアビジンでコーティングされたカバーグラス（Ｏｐｔｉｃｈｅｍ（登録商標）Ａｃｃｅｌｒ８ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を有し、レーザーカットされた両面接着層（Ｆｒａｌｏｃｋ）を使用して、３０ｉ．ｔｍの深さのマイクロ流体のチャネルが作製された、レーザー加工されたキャストアクリルの積層により作られたＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ流体素子に試料を添加した。試料は、静水圧によってチャネル内を運ばれ、キャプチャープローブのビオチン化３’末端により特異的に結合される。捕捉後、表面を９０μｌの１×ＴＡＥを用いて１回洗浄し、４０μｌのＴＡＥを各ウェルに加えることによって伸長用に調製した。レポータープローブを伸長させ、流体チャネルに沿って１分間１６０Ｖ／ｃｍを印加することによってアラインさせた。次いで、伸長されたレポーターを、全レポータープローブの５’末端に存在する５’反復配列に相補的なビオチン化オリゴヌクレオチドの５００ｎＭ溶液の６０μｌを加えることによって表面に固定化した。固定化過程の間、電流は５分間に残存した。固定化後、ＴＡＥ溶液を取り除き、画像化のための抗光退色試薬Ｓｌｏｗ Ｆａｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の特別注文配合品と置き換えた。
スライドを、Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｆｏｃｕｓ、１．４ＮＡ Ｐｌａｎ Ａｐｏ ＶＣ ６０Ｘ油浸対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ）、Ｘ−ｃｉｔｅ１２０メタルハライド光源（Ｅｘｆｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、自動Ｈ１１７ステージ（Ｐｒｉｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＳｍａｒｔＳｈｕｔｔｅｒ（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を搭載したＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００Ｅにおいて画像化した。個々の視野に関して、異なる励起波長（４８０、５４５、５８０および６２２）において４種の画像を、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）または特注ソフトウェアのどちらかの管理下で、Ｏｒｃａ Ａｇ ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）を用いて獲得した。
画像処理
４種の画像（各波長に関して１種）について、視野毎に画像処理を実施した。特注のアルゴリズムは、以下の基本ステップが実施される基本的区画として個々のＦＯＶを扱う：１）スポットの同定、２）画像登録、３）ストリングを作製するための空間クラスタリングおよび４）ストリングの分類。
アルゴリズムの第１ステップにおいて、スポットを同定した。各チャネルのバックグラウンド強度のレベルを算出し、画像をシグナルとバックグラウンドとに分けるために使用し、ここでシグナル領域は、点拡がり関数（ＰＳＦ）として観察された光の特定波長の結果である。シグナルマスクを、特注のＷａｔｅｒｓｈｅｄアルゴリズムを使用して分割した。分割された領域をその後標識し、パラメーター化し、ろ過し、非ＰＳＦスポットを取り除いた。残存するスポットを、登録およびレポーターの招集における使用のために、中枢のアーカイブに保管した。
画像登録を、画像化表面に結合した蛍光ビーズ（基準）に相当する、アーカイブに保管されたスポットに基づく個々のＦＯＶについて実施した（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇレポーターの捕捉、伸長および画像化を参照されたい）。アーカイブに保管されたスポットを、相互参照し、基準条件（チャネル間強度の閾値および比率）を満たすスポットのチャネル間クラスタを同定した。条件を満たしたクラスタを基準としてアーカイブに保管した。基準の最終リストは、画像獲得の間のチャネル間に起こった空間変換を表した。空間オフセットは５〜６ピクセル程度であった。空間変換は、観察された基準の重心およびそれらの変換前（推測）の一致重心（Ｘ２＝Ｘ１＊Ｔ）の使用のために解決された。次いで、逆変換を、すべての同定されたスポットに適用し、それらのもともとの重心を回復させた。
スポット同定および画像登録後、スポットを、クラスタリングを介して「ストリング」にアセンブリさせた。現段階では、個々のストリングをろ過し、ブリードスルーシグナルの原因となる任意のスポットを取り除いた。次いでろ過されたストリングを、レポーターまたは非レポーターとして分類した。レポーターとして分類するために、ストリングは、スポットの正確な数を含有し、特定のスポットとスポットとの間隔の閾値（１．２〜２．９ピクセル）を満たし、許容可能な線形性および配向の条件を満たさなければならない。レポーターとして分類されたクラスタは、次いで全ＦＯＶにわたる個々の遺伝子に関してカウントされ、合計された。
ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇのデータの正規化および分析
ハイブリダイゼーションおよび精製効率におけるわずかな差を解明するために、データを、個々の試料において全コントロールスパイクに関して平均カウントに正規化した。遺伝子がＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ系によって「検出」されるかどうかを決定するために、個々の実験遺伝子に関して得られた３重の測定値を、陰性対照に関する３重の測定値と比較した。カテゴリー化され、検出されるべき遺伝子に関して、実験遺伝子に関する平均カウントは、２種の陰性対照に関する平均カウントより大きくなければならず、Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｔ検定のＰ値は０．０５未満でなければならない。
ＤＶ１系とＭ１３系とを比較する、プロービングされた４０種の遺伝子の代表的な３つに関して結果を示す。図５は１Ｌ−８に関する結果を示す（ＧＡＰＤＨおよびＴＳＣ２２Ｄ３に関する結果は非掲載）。個々の遺伝子の発現の全プロファイルは双方の系に関して同じであり（すなわち、多くても少なくても試料間に相対的に発現する）、個々のアッセイに関するカウントの数は、ＤＶ１を使用すると１００倍を超えて高い（Ｍ１３およびＤＶ１のグラフに関するスケールの差に留意されたい）。
系の間の全４０種の遺伝子の発現の比較結果を、２種の代表的試料においてさらに示す（図６を参照されたい）。図６において、Ｒ２値は２種の系における全遺伝子の相対発現の間でおよそ９０％の相関を示すが、一方、線の勾配は、Ｍ１３レポーターと比較したＤＶ１レポーターを使用するカウントの実際の数において、１００倍を超える増加を示す。
（実施例５）
ＤＶ１およびＭ１３のナノレポーター系の比較
１４８種のプローブのＤＶ１レポーターライブラリーを、実施例１から３に記載のように作製し、比較可能なＭ１３ライブラリーも、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願第１２／１００，９９０号に記載のように作製した。ＤＶｌおよびＭ１３ライブラリーは、同一のプローブ配列（すなわち標的特異的ヌクレオチド）を含有し、同じ試料、２６種のマウスＲＮＡ試料をアッセイするために使用した。標準的ハイブリダイゼーション、精製および画像化のプロトコールを、実施例４に記載のように続けて実施した。
ＧｕｓＢ発現の検出に関する結果を、それぞれ図７に示す。Ｍｏｄ１、Ａｃｏｔ４およびＡｔｇ７の発現の検出に関する結果は非掲載である。様々な試料にわたる所与の遺伝子の相対発現レベルの測定値は、２種のレポーター型の間で比較可能であった。しかし、Ｍ１３レポーターと比較して、ＤＶ１レポーターにより測定されたカウントの絶対数に関して平均６倍の増加が見られた。図８は「有効なレポーター」を示すグラフを提供し、有効なレポーターは、画像解析ソフトウェアによって「可算」レポーターとして解釈されるスポットのストリングを指し、視野中の結合事象の合計の百分率として記載される。ＤＶ１レポーターの有意に高い百分率は可算であり、この実験において、データの３倍の増加をもたらす（１２．５％から３８％）。
Ｍ１３およびＤＶ１により測定された１種の試料において、個々の遺伝子の発現の相関を決定した。結果は、２種の系の間で７７％の相関を示し、ＤＶ１を用いて平均６倍の増加を示す（データ非掲載）。
（実施例６）
相補的ＲＮＡポリヌクレオチドへの色素の組込みの最適化
所与のナノレポーター分子中の最適な蛍光色素濃度を決定するために、蛍光色素を、様々な量で相補的ＲＮＡポリヌクレオチド配列に組み込ませた。様々な量の色素を組み込まれたナノレポーター分子を、次いで標準的ナノレポーター検出アッセイにおいてシグナル強度を試験した。
具体的には、個々の組み込まれた色素分子間のヌクレオチドの間隔の最適な度合いを決定するために、蛍光色素分子を、８、１０、１２、１６または２４ヌクレオチド塩基毎に相補的ＲＮＡポリヌクレオチドに組み込んだ。これは、図９〜１２に示すように、８、１０、１２、１４、１６および２４塩基毎に間隔を置かれるＴの規則的パターンを含有する新規な配列を作製することによって達成された。これらの配列はおよそ１１００塩基長であり、単一の６６００塩基のレポーターバックボーンプラスミドにアセンブリされ、一本鎖バックボーンに変換された。個々の鋳型は転写され、逆相補鎖ＲＮＡを産生し、個々のＲＮＡのアリコートは、個別に４色：青（Ａｌｅｘａ４８８）、緑（Ｃｙ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ））、黄色（Ａｌｅｘａ５９４）および赤（Ａｌｅｘａ６４７）にカップリングされた。様々な色を使用する、一連の標識レポーターを、標識ＲＮＡセグメントをバックボーンにアニーリングすることによって作製した。これらのレポーターは、本明細書に記載のように画像化され、各色における個々の間隔での色素のカップリングによりもたらされるスポットの明るさを決定した（データ非掲載）。スポット強度の測定値は、任意単位である。
これらの実験は、スポットの明るさが、規則的に繰り返された塩基をより多くまたはより少なく含有するように基本的配列を設計することによって操作可能であることを示す。ここで、８ヌクレオチドの間隔が最も明るいスポットをもたらす。８個未満の間隔は、より近い間隔において近隣の色素分子のステアリン酸干渉の予測から試験しなかった。しかし、一部のスポットはより近い間隔によってさらに明るくなりうると思われる。最も近い間隔の可能性は、色素毎に変わると思われるが、８個の塩基は、市販の適切な色素すべてに適合するはずの間隔を提供する。塩基は規則的に間隔を置く必要は無い。
（実施例７）
ナノレポーターハイブリダイゼーションの反応速度に関する考察
背景技術
標的より非常に過剰なプローブを用いる溶液ハイブリダイゼーションは、擬一次反応速度に従う。この状況において、反応の速度はプローブ濃度のみに依存し、標的濃度には依存しない。溶液中の標的の濃度に関する正確な情報を提供するための、２種のプローブ、１種の標的の戦略のために、プローブは、双方とも標的より過剰に存在すべきである。したがって、濃度範囲の可能性は、標的濃度の下端を境界とすることが好ましい。しかし、本明細書に記載のナノレポーター技術のための有用な濃度範囲は、実際にはハイブリダイゼーションを実施するために必要な時間の下端を境界とする。
ハイブリダイゼーションの反応速度
好ましい実施形態において、標的の検出および定量化アッセイを実施し、このアッセイにおいて、標的（Ｔ）は、検出されるべきレポータープローブ（Ｒ）およびキャプチャープローブ（Ｇ）の双方とハイブリダイゼーションしなければならない（たとえば、親和性の選択および（Ｒ）および（Ｇ）のみを含む複合体の検出により、これらは（Ｔ）の存在下で順に複合体のみを形成する）。これらの反応が不可逆的であると仮定すると、
を起こす、４つの基本的反応が可能である。
ＲＴおよびＴＧは３種のうちの２種の中間複合体であるので、これらの４つの反応はＲ＋Ｔ＋Ｇ→ＲＴＧに単純化できる。
しかし、ＲＴＧ（レポーター−標的−キャプチャープローブ複合体）の産生速度を定量的に計算するために、４つすべての反応を考慮しなければならない。系を説明する微分方程式は、
であり、式中、ＣＲ、ＣＴ、ＣＧ、ＣＲＴ、ＣＴＧおよびＣＲＴＧは様々な種の濃度であり、１（１−１（４は４つの基本的反応の速度定数である。プローブおよび標的が相補的一本鎖分子である場合（すなわち、キャプチャープローブ上に精製タグがなく、レポーターもない場合）、これらの反応速度定数の値は、文献（Wetmur、J. Annu. Rev. Biophys. Bioeng. １９７６年、５巻：３３７〜３６１頁）中の利用可能なデータから計算できる
上記の方程式において、ｋＮは核生成速度定数であり、Ｌは核酸長（塩基対で）であり、Ｎは核酸の複雑性（非反復配列に関してはＬに等しい）であり、ａｓａｌｔおよびａｒｅｆは塩濃度のための補正である（Brittenら、１９７４年、Methods in Enzymology ２９Ｅ：３６３〜４０６頁）。本明細書に記載のナノレポーター系において、反応速度定数は結合されたキャプチャープローブタグおよびレポータープローブのサイズに依存すると思われる。任意の理論に縛られるものではないが、反応速度定数は長さに対して同じ依存性を有すると思われ、基本的反応は、反応物の拡散定数に同じ依存性を有するというのが本発明者らの意見である。
上記の方程式において、Ｄ１およびＤ２は２種の反応種の拡散定数であり（上記の反応を参照されたい）、Ｄ５０は５０ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡ分子の拡散定数である。１００塩基の一本鎖標的、１００塩基の一本鎖キャプチャープローブおよび７２００塩基の二本鎖レポーターを仮定すると、関連反応速度定数は、
ｋ１＝２．６４×１０５Ｌ／ｍｏｌ／ｓ
ｋ２＝６．５５×１０５Ｌ／ｍｏｌ／ｓ
ｋ３＝３．９９×１０５Ｌ／ｍｏｌ／ｓ
ｋ４＝１．９１×１０５Ｌ／ｍｏｌ／ｓ
である。
これらの反応速度定数（標的より少なくとも１０倍過剰であると仮定する）を含む微分方程式の系を数値的に解明すると、５ｐＭレポーターおよび５ｐＭキャプチャープローブは、一晩（１６〜１８時間）の反応においてハイブリダイゼーションを１０％完了させるであろうという予測をもたらす。５ｐＭ未満の濃度において、完全にハイブリダイゼーションした分子の量は、測定不可能であると思われる。したがって、好ましい実施形態において、低濃度のナノレポーター成分（キャプチャープローブおよび／またはレポータープローブ）は５ｐＭである。
レポーターの絡み合い
プローブ濃度が上昇した場合、理論によりハイブリダイゼーションの反応速度は限界なく加速し、唯一の制限はプローブの溶解度であることが予測される。しかし、本発明のナノレポーター系におけるレポータープローブは標的特異的配列と比較して非常に大型であってもよい。任意の理論に縛られるものではないが、本発明者らは、レポータープローブへのその結合によって、標特異的配列の反応速度は、古典的溶液ハイブリダイゼーションの反応速度により改変されると信じる。レポータープローブは大型のポリマー分子であるので、それらが接触した場合、他のナノレポーターとの長く続く相互作用（絡み合い）を有しうる。低濃度において、２種のポリマーが絡み合う可能性は低いが、溶液中のポリマーの濃度および／またはサイズが上昇した場合、これらの相互作用はますます一般的になる。非常に高濃度で非常に長い分子の極端な例において、ポリマーは、溶液中で永続的なネットワーク、すなわちゲルを形成する。溶液ハイブリダイゼーションを起こすために、プローブ（たとえば、ナノレポータープローブ）／標的対は、それらが互いに接触し、ハイブリダイゼーション核形成するまで溶液において拡散しなければならない。分子の移動拡散がハイブリダイゼーションの核生成より速いので（すなわち、プローブおよび標的は一緒に拡散し、核生成の前に何度も相互作用する）、古典的ハイブリダイゼーション反応は拡散が限定されない。希薄溶液において、その大きなサイズは、レポータープローブの移動拡散が遅くなると思われるが、反応速度に有意な影響は与えないと思われる。一部の中間体の濃度において、レポータープローブは溶液中の空間のほぼすべてを取り込み、永続的に絡み合うゲルを有効に形成し、もはや溶液中に拡散できない。しかし、キャプチャープローブおよび標的は、絡み合ったレポータープローブの間に未だ拡散すると考えられる小型分子であり、実施するハイブリダイゼーションを可能にする（しかし、おそらく低速度である）。本発明者らは、一部の高濃度において、溶液中のレポータープローブが、反応が拡散を制限する時点までキャプチャープローブおよび標的の動きを妨げるであろうと考えている。この濃度（定量的には公知ではなく、レポータープローブの構造、キャプチャープローブの構造および標的のサイズに依存する）はナノレポーター系における有用な濃度範囲の上限であり、本明細書に記載の原理により案内された当業者により実験的に決定されうる。
反応速度の長さ依存性
ハイブリダイゼーションの上限濃度は、レポーターの構造およびキャプチャープローブの構造（多くの変形候補がある）の双方に依存するので、有用な濃度範囲の並べ替えを予測する理論的フレームワークは、本発明の実践において有用である。古典的理論は、ハイブリダイゼーションの反応速度が小型プローブのサイズのみに依存することを予測する。したがって、理論は、標的分子およびキャプチャープローブの双方が有意に小型である限り、レポーターのサイズが、ハイブリダイゼーションの反応速度において役割を果たしていないことを予測する。次いで、理論は、（一定長さの標的に関する）ハイブリダイゼーションの速度が、Ｌがキャプチャープローブの長さである場合、ハイブリダイゼーションのステアリン酸による阻害のため１／Ｌ１／２に依存することを予測する。結果的に、ハイブリダイゼーションの反応速度は、小型のキャプチャープローブを用いるほど、より速くなると思われる。キャプチャープローブの長さが増加した場合、ハイブリダイゼーションの速度は１／Ｌ１／２に応じて減少するはずである。一定の長さのキャプチャープローブを想定する場合、その後、ハイブリダイゼーション事象の測定可能量をもたらすであろうレポーターの長さおよび濃度の範囲を定義できる。レポーターサイズが一度定義されたら、次いで、キャプチャープローブサイズのおよその範囲を決定できる。これは反復作業であるが、詳細な経験的ガイドラインを作りだすためのデータ収集のための優れた出発点をもたらすことができ、本発明者らの理論的解釈に基づく理論が、レポータープローブを用いない系におけるハイブリダイゼーションのデータから生み出されたことを示す。
絡み合いの閾値
レポータープローブは基本的に自由溶液中のポリマーであり、ランダムコイルとして機能する。単一のレポーター、Ｖｐによって占められている容積は、自由結合鎖モデル（ＦＪＣ、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡなどの柔軟性ポリマー用）またはミミズ鎖モデル（ＷＬＣ、二本鎖ＤＮＡまたはレポーターなどの剛性ポリマー用）に従って、ポリマーの物理理論から計算できる。どちらのモデルに関しても
式中、Ｒｇは旋回半径である。ＦＪＣに関しては
式中、ｂはセグメントの長さであり、Ｎは鎖中のセグメントの数である。ＷＬＣに関しては、
である。
絡み合いの閾値濃度は、溶液の全容量がレポーターにより占められる濃度として定義される。
式中、ＮＡはアボガドロ数である。この濃度を上回ると、レポーターの移動拡散が厳密に制限されると想定される。絡み合いの閾値濃度はレポーターの構造により変化する。レポーターの長さが増加した場合、絡み合いの閾値は減少する（１／Ｌ１.５のように）。上記の方程式から、異なるスポットサイズおよび異なる長さを有するレポータープローブに関する理論的絡み合いの閾値が計算できる。このような計算の結果は、それぞれ約９００ｂｙの８個の標識結合領域を有する７２００ｂｙのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドレポータープローブに関して、絡み合いの閾値は約７０ｎＭであることを示す。
標的およびキャプチャープローブの双方がレポーターより非常に小型である場合、その結果、それらはレポーターがこれらの高濃度であっても溶液の中を最も自由に拡散できると思われる。初期データは、ハイブリダイゼーションの反応速度は、７２００ｂｐのレポータープローブ、１００塩基の標的および１００塩基のキャプチャープローブを用いて８０ｎＭの濃度まではそれほど遅くないことを示す。
多重化における絡み合いの閾値の効果
ハイブリダイゼーション反応におけるレポーターの最大濃度をＣ＊と仮定すると、その結果個々のレポーター（特定の標的に特異的）の濃度はＣ＊／Ｍに等しく、ここでＭは反応の多重度である（異なる標的の数は同時に処理される）。逆に、特定のレポーター構造に関する多重化レベルの可能性は、プローブ（Ｃｐ、反応速度約１０ｎＭ）および絡み合いの閾値濃度の下限から計算できる。
利用可能なナノレポーターコードの数が、レポータープローブのサイズに依存しない場合、その結果、ナノレポーターの多重化は、主にレポータープローブのサイズおよび濃度に依存する（キャプチャープローブより非常に大きいので）。キャプチャープローブはハイブリダイゼーションにおいて絡み合いにあまり寄与しないので、キャプチャープローブの濃度は、レポータープローブの濃度をはるかに超えて上昇させることができるというのが本発明者らの意見である。下記の表４において、総キャプチャープローブの最大濃度（［Ｇ］）を、全レポーター濃度に対して１０００ｎＭに設定する。キャプチャープローブとレポータープローブとのこの濃度の差は、調整可能なパラメーターである。予備実験は、７２００ｂｙのレポーターおよび１００ｂのキャプチャー、４０ｐＭの各レポータープローブおよび２００ｐＭの各キャプチャープローブを用いた多重度ハイブリダイゼーション反応が、一晩の反応において完全に近いハイブリダイゼーションをもたらすことを示す。
最適サイズおよび濃度範囲
下記の表４は、上記の理論により概算された、異なる多重化におけるキャプチャープローブおよびレポータープローブの最適で有用なサイズおよび濃度範囲の要約である。２００塩基までのキャプチャープローブが大部分の適用に関して実用的であろうというのが本発明者らの意見である。
表４：本発明のナノレポーター系におけるレポータープローブ、キャプチャープローブおよび標的の最適サイズ濃度範囲ならびにプローブの多重度
前述より、本発明の具体的実施形態を例示目的で本明細書に記載したが、様々な改良が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく実施可能であることが理解されるであろう。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲によるものを除いて制限されない。
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し説明したが、このような実施形態が例としての目的のみで提供されることは当業者には明らかであろう。多くの変形、変更および置き換えが本発明から逸脱することなく当業者には思い付くであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な改変は、本発明の実践において採用可能であると理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの同等物は本発明に含まれるものと意図する。

Claims (63)

  1. 固有に標識されたナノレポータープローブの集団であって、前記ナノレポータープローブが、
    ｉ）固有の標的特異的領域および
    ｉｉ）固有の、設計されたナノレポーターを含む領域
    を含み、前記ナノレポーターが一本鎖核酸バックボーンを含み、前記バックボーンが固有の線状の組合せにおいて共に共有結合された複数の標識結合領域を含み、前記標識結合領域が、設計されたポリヌクレオチド配列の集団から選択され、前記ポリヌクレオチド配列が、１つまたは複数の検出可能な分子を付加した相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それぞれの相補的ポリヌクレオチド配列が、特異的な検出可能な分子を明示しており、それぞれのナノレポーターが、それを前記集団中の他のナノレポーターと区別する検出可能なシグナルを有する、集団。
  2. それぞれのバックボーンのそれぞれの標識結合領域がその同じバックボーン中の他の標識結合領域とは異なる、請求項１に記載の集団。
  3. 前記標識結合領域が、約８００〜１３００ヌクレオチド塩基を含み、約５０％のＧ／Ｃ含量を有し、前記相補的ポリヌクレオチド配列が約１／１のＧ／Ｃ比を有する、請求項１に記載の集団。
  4. 前記相補的ポリヌクレオチド配列が約３／２のＧ／Ｃ比を有する、請求項３に記載の集団。
  5. 前記標識結合領域が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群より選択される鋳型配列から生成される、請求項１に記載の集団。
  6. 前記ナノレポータープローブが定常領域をさらに含み、前記定常領域が複数の繰り返しヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の集団。
  7. 前記標識結合領域が同様のアデニン含量を含む、請求項１に記載の集団。
  8. アデニン塩基が、少なくとも平均８〜１６ヌクレオチド塩基毎の間隔を置いて配置される、請求項７に記載の集団。
  9. 前記標識結合領域が、アデニン塩基の規則的に繰り返されたパターンを含む、請求項１に記載の集団。
  10. 前記アデニン塩基が、約８〜１６ヌクレオチド塩基毎の間隔を置いて配置される、請求項９に記載の集団。
  11. 前記標識結合領域が約３５〜４５％のチミン含量を含む、請求項１に記載の集団。
  12. 前記相補的ポリヌクレオチド配列がＲＮＡポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の集団。
  13. 前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列が少なくとも１つのアミノアリル修飾ウラシル塩基を含む、請求項１２に記載の集団。
  14. 前記検出可能な分子が前記アミノアリル修飾ウラシル塩基に付加している、請求項１３に記載の集団。
  15. 前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列が、前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列中で平均約８〜１６塩基毎の間隔を置いて配置される複数のアミノアリル修飾ウラシル塩基を含む、請求項１２に記載の集団。
  16. 前記検出可能な分子が前記アリル修飾ウラシル塩基のそれぞれに付加している、請求項１５に記載の集団。
  17. 前記検出可能な分子が蛍光色素である、請求項１に記載の集団。
  18. ナノレポータープローブの前記集団が、（ａ）少なくとも１つの標的分子および少なくとも１つのナノレポータープローブを含む、それぞれのナノレポータープローブとの少なくとも１つの分子複合体を形成するステップ、ならびに（ｂ）試料中の前記分子複合体のそれぞれの１つまたは複数の分子の存在を個々にカウントするステップを含む方法によって、前記試料中の標的分子の集団を検出するのに使用されるとき、前記試料の標準化の後の前記分子複合体のそれぞれのバックグラウンドを超えるカウント数が、Ｍ１３ ＤＮＡを含むナノレポータープローブと比較した場合、少なくとも２倍高い、請求項１に記載の集団。
  19. その標識結合領域にハイブリダイズした場合の前記相補的ポリヌクレオチド配列の融解温度（Ｔｍ）が約８０℃以上である、請求項１に記載の集団。
  20. 試料中の少なくとも１つの標的分子の存在を決定するための方法であって、
    （１）（ａ）少なくとも１つの標的分子ならびに
    （ｂ）固有の標的特異的領域および固有の設計されたナノレポーターを含む領域を含む少なくとも１つのプローブを含む、少なくとも１つの分子複合体を形成するステップであって、前記ナノレポーターが一本鎖核酸バックボーンを含み、前記バックボーンが固有の線状の組合せにおいて共に共有結合された複数の標識結合領域を含み、それぞれの標識結合領域が、１つまたは複数の検出可能な分子を付加した相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それぞれの相補的ポリヌクレオチド配列が、特異的な検出可能な分子を明示している、ステップと、
    （２）１つまたは複数の分子複合体または前記少なくとも１つの分子複合体の少なくとも一部の存在を個々にカウントして、前記試料中の前記少なくとも１つの標的分子の存在を決定するステップとを含む、方法。
  21. 前記分子複合体の有効な分子カウントの百分率が約１２．５％よりも高い、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記カウント数が、Ｍ１３ ＤＮＡを含むナノレポータープローブを使用する場合に得られるカウントよりも少なくとも２倍高い、請求項２０に記載の方法。
  23. Ｍ１３ ＤＮＡを含む前記ナノレポーターが、共に共有結合された複数のＭ１３ ＤＮＡ領域を含む一本鎖バックボーンを含み、それぞれの領域が、１つまたは複数の検出可能な分子を付加した相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする、請求項２２に記載の方法。
  24. その標識結合領域にハイブリダイズした場合の前記相補的ポリヌクレオチド配列のＴｍが、Ｍ１３ ＤＮＡを含む前記ナノレポータープローブにハイブリダイズした場合の、Ｍ１３ ＤＮＡに相補的なポリヌクレオチド配列の融解温度よりも高い、請求項２３に記載の方法。
  25. その標識結合領域にハイブリダイズした場合の前記相補的ポリヌクレオチド配列のＴｍが約８０℃以上である、請求項２０に記載の方法。
  26. それぞれの標識結合領域が、約８００〜１３００ヌクレオチド塩基を含み、約５０％のＧ／Ｃ含量を有し、前記相補的ポリヌクレオチド配列が少なくとも１／１のＧ／Ｃ比を有する、請求項２０に記載の方法。
  27. それぞれの選択された標識結合領域が、前記バックボーン中の他の選択された標識結合領域とは異なる、請求項２０に記載の方法。
  28. それぞれの標識結合領域が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群より選択される鋳型配列から生成される、請求項２０に記載の方法。
  29. 前記プローブが定常領域をさらに含み、前記定常領域が複数の繰り返しヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の方法。
  30. 前記標識結合領域が同様のアデニン含量を含む、請求項２０に記載の方法。
  31. アデニン塩基が、少なくとも平均８〜１６ヌクレオチド塩基毎の間隔を置いて配置される、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記標識結合領域が、アデニン塩基の規則的に繰り返されたパターンを含む、請求項２０に記載の方法。
  33. 前記アデニン塩基が、約８〜１６ヌクレオチド塩基毎の間隔を置いて配置される、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記標識結合領域が約３５〜４５％のチミン含量を含む、請求項２０に記載の方法。
  35. 前記相補的ポリヌクレオチド配列がＲＮＡポリヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の方法。
  36. 前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列が少なくとも１つのアミノアリル修飾ウラシル塩基を含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記検出可能な分子が前記アミノアリル修飾ウラシル塩基に付加している、請求項３２に記載の方法。
  38. 前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列が、前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列中で少なくとも平均８塩基毎の間隔を置いて配置される複数のアミノアリル修飾ウラシル塩基を含む、請求項３６に記載の方法。
  39. 前記検出可能な分子が前記アリル修飾ウラシル塩基のそれぞれに付加している、請求項３７に記載の方法。
  40. 前記検出可能な分子が蛍光色素である、請求項２０に記載の方法。
  41. それぞれの複合体が、（ａ）少なくとも１つの標的分子ならびに（ｂ）固有の標的特異的領域および固有の設計されたナノレポーターを含む領域を含む少なくとも１つのプローブを含む、複数の分子複合体を形成することを含む方法によって、複数の標的分子の存在を決定するステップをさらに含み、前記ナノレポーターが一本鎖核酸バックボーンを含み、前記バックボーンが固有の線状の組合せにおいて共に共有結合された複数の標識結合領域を含み、それぞれの標識結合領域が１つまたは複数の検出可能な分子を付加した相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それぞれのプローブが異なるナノレポーター領域を含む、請求項２０に記載の方法。
  42. 少なくとも５、１０、２０、３０、５０、１００、２００、３００、または５００の異なる標的分子の存在が決定される、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記標的分子が核酸である、請求項２０に記載の方法。
  44. 前記核酸が、少なくとも１つの遺伝的突然変異、少なくとも１つの体細胞突然変異、少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）、少なくとも１つの点突然変異、少なくとも１つの欠失突然変異、少なくとも１つの挿入突然変異、少なくとも１つの染色体転座、またはその組合せを含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記標的分子が診断の指標となる、請求項２０に記載の方法。
  46. ｉ）固有の標的特異的領域および
    ｉｉ）線状の組合せにおいて共に共有結合された複数の設計された標識結合領域を含む領域
    を含む、固有に標識されたナノレポータープローブであって、それぞれの標識結合領域が、約８００〜１３００ヌクレオチド塩基を含み、約５０％のＧ／Ｃ含量を有し、それぞれの選択される標識結合領域が他の選択される標識結合領域とは異なり、
    それぞれの標識結合領域が、１つまたは複数の検出可能な分子を付加した相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、前記相補的ポリヌクレオチド配列が少なくとも１／１のＧ／Ｃ比を有する、ナノレポータープローブ。
  47. 前記相補的ポリヌクレオチド配列が約３／２のＧ／Ｃ比を有する、請求項４６に記載のナノレポータープローブ。
  48. 複数の繰り返しヌクレオチド配列を含む定常領域をさらに含む、請求項４６に記載のナノレポータープローブ。
  49. 前記標識結合領域が、アデニン塩基の規則的に繰り返されたパターンを含む、請求項４６に記載のナノレポータープローブ。
  50. 前記アデニン塩基が平均約８〜１６ヌクレオチド塩基毎の間隔を置いて配置される、請求項４９に記載のナノレポータープローブ。
  51. 前記標識結合領域が約３５〜４５％のチミン含量を含む、請求項４６に記載のナノレポータープローブ。
  52. 前記相補的ポリヌクレオチド配列がＲＮＡポリヌクレオチド配列を含む、請求項４６に記載のナノレポータープローブ。
  53. 前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列が少なくとも１つのアミノアリル修飾ウラシル塩基を含む、請求項５２に記載のナノレポータープローブ。
  54. 前記検出可能な分子が前記アミノアリル修飾ウラシル塩基に付加している、請求項５３に記載のナノレポータープローブ。
  55. 前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列が、前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列中で平均約８〜１６塩基毎の間隔を置いて配置される複数のアミノアリル修飾ウラシル塩基を含む、請求項５２に記載のナノレポータープローブ。
  56. 前記検出可能な分子が前記アリル修飾ウラシル塩基のそれぞれに付加している、請求項５５に記載のナノレポータープローブ。
  57. 前記検出可能な分子が蛍光色素である、請求項４６に記載のナノレポータープローブ。
  58. 前記複数の標識結合領域が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群より選択される鋳型配列から生成される、請求項４６に記載のナノレポータープローブ。
  59. 少なくとも１つの固有に標識されたナノレポーターを調製する方法であって、
    ｉ）それぞれが約８００〜１３００ヌクレオチド塩基および約５０％のＧ／Ｃ含量を含む複数の標識結合領域を組み合わせるステップであって、それぞれの選択された標識結合領域が他の選択された標識結合領域とは異なるステップ、
    ｉｉ）線状の組合せにおいて前記複数の標識結合領域を互いに共有結合させるステップ、ならびに
    ｉｉｉ）前記標識結合領域に相補的ポリヌクレオチド配列をハイブリダイズさせるステップ
    を含み、前記相補的ポリヌクレオチド配列が、１つまたは複数の検出可能な分子を付加している、方法。
  60. 標的特異的領域に前記標識されたナノレポーターを付加させることによって、標識ナノレポータープローブを調製するステップをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記相補的ポリヌクレオチド配列が少なくとも１／１のＧ／Ｃ比を有する、請求項５９に記載の方法。
  62. 少なくとも１つの固有に標識されたナノレポーターを調製するためのキットであって、
    ａ）それぞれが約８００〜１３００ヌクレオチド塩基、約５０％のＧ／Ｃ含量を含む少なくとも３つの標識結合領域、および
    ｂ）検出可能な分子を付加した、少なくとも３つの相補的ポリヌクレオチド配列
    を含み、前記相補的ポリヌクレオチド配列が少なくとも１／１のＧ／Ｃ比を有する、キット。
  63. 少なくとも３つの標的特異的プローブをさらに含む、請求項６２に記載のキット。
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