CN116724125A - 用于原位分析的核酸类似物探针 - Google Patents

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Abstract

在一些方面，本公开涉及用于探测生物样品中的分析物的蛋白质和核酸。在一些实施方案中，本文公开了一种方法，其中检测探针(例如，荧光标记的检测探针)可在合成主链上包含核碱基序列，所述检测探针因此比在糖‑磷酸主链上具有相同核碱基序列的参考检测探针生成更大的信号。

Description

用于原位分析的核酸类似物探针
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年1月26日提交的标题为“NUCLEIC ACID ANALOG PROBES FORIN SITU ANALYSIS”的美国临时申请号63/141,908的优先权，所述临时申请的内容出于所有目的通过引用以其全文并入本文。
技术领域
在一些方面，本公开涉及用于原位分析生物样品中作为分析物或其他分析物的报告物的核酸分子的方法。
背景技术
存在用于分析生物样品如细胞或组织中存在的核酸的方法。用于分析生物样品中存在的核酸例如用于原位分析的当前方法可能灵敏度和特异性低、复用性有限、结果偏倚、耗时、劳动密集和/或易于出错。需要用于分析生物样品中存在的核酸的改进方法。本文提供了满足此类及其他需要的方法、多核苷酸、多核苷酸组、组合物和试剂盒。
发明内容
在一些方面，本文提供了一种分析生物样品的方法，其包括：将多个检测探针与生物样品中的DNA多联体直接或间接地结合，其中所述多个检测探针中的一个检测探针在合成主链上包含核碱基序列，并且所述检测探针与DNA多联体中的靶标序列直接或间接地结合，和检测来自所述多个结合的检测探针的信号，其中生成的信号大于在糖-磷酸主链上具有相同核碱基序列的多个参考检测探针。在一些实施方案中，所述多个检测探针中的至少一些在合成主链上包含核碱基序列。在一些实施方案中，所述多个检测探针中的每一个在合成主链上包含核碱基序列。在一些实施方案中，所述多个检测探针中的全部在合成主链上包含核碱基序列。在一些实施方案中，所述多个检测探针中的至少一些、每一个或全部为基于吗啉代物的探针。
在一些实施方案中，检测探针的静电负性可低于参考检测探针。
在前述实施方案中的任一个中，可以将检测探针直接或间接地偶联至可检测标记。在一些情况下，可检测标记包括荧光标记。在一些实施方案中，检测探针共价偶联(例如，经由键或经由接头部分)至可检测标记，例如荧光标记。在一些实施方案中，检测探针非共价偶联至可检测标记，例如荧光标记，例如经由结合对之间的非共价相互作用(例如，生物素偶联至检测探针而链霉亲和素偶联至可检测标记，或反过来)。在一些实施方案中，检测探针不直接偶联(例如，共价或非共价地)至可检测标记，并且检测探针可以是与可检测地标记的探针直接或间接地结合的中间探针，所述可检测地标记的探针直接或间接地偶联(例如，共价或非共价地)至可检测标记。在一些实施方案中，中间探针与共价偶联至可检测标记的可检测地标记的探针杂交。在前述实施方案中的任一个中，中间探针和/或可检测地标记的探针可以是核酸类似物探针，其在合成主链上包含核碱基序列，在所述合成主链中，天然存在的核酸的主链中的糖被替换为吗啉(例如，亚甲基吗啉代物)环，并且亚甲基吗啉环由磷酰二胺部分连接。在一些实施方案中，本文公开的核酸类似物探针沿着分子具有中性电荷，并通过Watson-Crick碱基配对与靶标核酸(例如，DNA或RNA，如DNA多联体)的互补序列结合。在一些实施方案中，本文公开的核酸类似物探针在碱基之间具有约3.4埃的间距。在一些实施方案中，核酸类似物探针在合成主链上包含与在糖-磷酸主链上包含核碱基的参考探针相同的核碱基序列。
在前述实施方案中的任一个中，检测探针可与靶标序列直接杂交。在前述实施方案中的任一个中，检测探针可与和靶标序列直接或间接地结合的中间探针杂交。在前述实施方案中的任一个中，检测探针可与和靶标序列直接杂交的中间探针直接杂交。
在前述实施方案中的任一个中，检测探针可包括单链区域和任选地双链区域。
在前述实施方案中的任一个中，合成主链上的核碱基序列可以是第一探针序列，并且检测探针还可包括在糖-磷酸主链上包含核碱基的第二探针序列。在前述实施方案中的任一个中，第一探针序列可以位于第二探针序列的5’或3’处。在前述实施方案中的任一个中，检测探针可包括一个或更多个第一探针序列和/或一个或更多个第二探针序列。在前述实施方案中的任一个中，第二探针序列可以是DNA序列、RNA序列或其组合。
在前述实施方案中的任一个中，检测探针可以任何合适的次序和组合包含核碱基A、T、C、G或U或它们的变体。
在前述实施方案中的任一个中，检测探针的长度可在约5至约50个核碱基之间。在一些情况下，检测探针的长度可在约10至约20个核碱基之间，在约20至约30个核碱基之间，或在约30至约40个核碱基之间。
在前述实施方案中的任一个中，检测探针可在合成主链中包含磷酰二胺键。在前述实施方案中的任一个中，检测探针可在合成主链中包含吗啉环。在前述实施方案中的任一个中，检测探针可以是吗啉代物。
在前述实施方案中的任一个中，检测探针可以是不带电荷的或带正电荷的。
在前述实施方案中的任一个中，DNA多联体可以包含一个或更多个条形码序列，任选地其中所述靶标序列可以包含对应于生物样品中的分析物的条形码序列。
在一些实施方案中，DNA多联体为原位生成的产物。在一些实施方案中，DNA多联体为在细胞、细胞样品或组织样品如组织切片中原位生成的产物。在前述实施方案中的任一个中，DNA多联体可以是生物样品中的内源性核酸分子的产物(例如，延伸产物(例如，通过DNA或RNA聚合酶)、复制产物、逆转录产物和/或扩增产物如滚环扩增(RCA)产物)，任选地其中所述内源性核酸分子可以是病毒或细胞DNA或RNA，如基因组DNA/RNA、mRNA或cDNA。在前述实施方案中的任一个中，DNA多联体可以是延伸产物(例如，通过DNA或RNA聚合酶)、复制产物、逆转录产物和/或扩增产物。在一些实施方案中，DNA多联体为由滚环扩增(RCA)生成的产物。在一些实施方案中，DNA多联体为由在细胞、细胞样品或组织样品如组织切片中原位滚环扩增(RCA)生成的产物。在一些实施方案中，所述产物使用生物样品中的内源性核酸分子生成或与生物样品中的内源性核酸分子相关联。在一些情况下，内源性核酸分子为病毒或细胞DNA或RNA，如基因组DNA/RNA、mRNA或cDNA。
在前述实施方案中的任一个中，DNA多联体可以是标记剂的产物(例如，延伸产物(例如，通过DNA或RNA聚合酶)、复制产物、逆转录产物和/或扩增产物如滚环扩增(RCA)产物)，标记剂可以与生物样品中的分析物直接或间接地结合。在前述实施方案中的任一个中，标记剂可以包含报告寡核苷酸，任选地其中所述报告寡核苷酸可以包含一个或更多个条形码序列并且DNA多联体包含所述一个或更多个条形码序列的一个或多个拷贝。在一些情况下，所述产物使用DNA聚合酶和/或RNA聚合酶生成。
在前述实施方案中的任一个中，DNA多联体可以是与生物样品中的DNA(例如，mRNA的cDNA)或RNA分子杂交的环状或可环化(例如，挂锁)探针或探针组的滚环扩增(RCA)产物。在前述实施方案中的任一个中，可以分析由多个不同的mRNA和/或cDNA分子生成的DNA多联体，特定的环状或可环化(例如，挂锁)探针或探针组中的条形码序列可以唯一地对应于特定的mRNA或cDNA分子，并且特定的环状或可环化(例如，挂锁)探针或探针组还可包含锚定序列，该锚定序列在用于多个不同mRNA和/或cDNA分子的子集的环状或可环化(例如，挂锁)探针或探针组中是共有的。在前述实施方案中的任一个中，标记剂可以包含可与生物样品中的非核酸分析物例如包含肽、蛋白质、碳水化合物和/或脂质的分析物直接或间接地结合的结合部分，并且标记剂中的报告寡核苷酸可以鉴别所述结合部分和/或非核酸分析物。在前述实施方案中的任一个中，标记剂的结合部分可以包含可与蛋白质分析物直接或间接地结合的抗体或其抗原结合片段，并且DNA多联体可以是可与标记剂的报告寡核苷酸杂交的环状或可环化(例如，挂锁)探针或探针组的滚环扩增(RCA)产物。
在前述实施方案中的任一个中，DNA多联体可以呈纳米球的形式，所述纳米球的直径在约0.1μm至约3μm之间，例如约0.1μm至约0.5μm之间，约0.5μm至约1μm之间，或约1μm至约1.5μm之间。
在前述实施方案中的任一个中，DNA多联体的长度可以在约1至约15千碱基之间、约15至约25千碱基之间、约25至约35千碱基之间、约35至约45千碱基之间、约45至约55千碱基之间、约55至约65千碱基之间、约65至约75千碱基之间、或超过75千碱基，例如，在约45至约70千碱基之间。
在前述实施方案中的任一个中，DNA多联体可以包含靶标序列的约10至约100个之间、约100至约1,000个之间、约1,000至约5,000个之间、约5,000至约10,000个之间、或超过10,000个拷贝。
在前述实施方案中的任一个中，DNA多联体中的靶标序列的至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％或至少约90％的拷贝可以与所述多个检测探针的一个或更多个分子直接或间接地结合。
在前述实施方案中的任一个中，DNA多联体可以原位生成。在前述实施方案中的任一个中，DNA多联体可以固定在生物样品中。在前述实施方案中的任一个中，DNA多联体可以与生物样品中的一个或更多个其他分子(例如，细胞分子或细胞外分子)交联。
在前述实施方案中的任一个中，可以在生物样品中原位检测包含检测探针的多个分子的复合物。在前述实施方案中的任一个中，所述方法可以包括例如使用荧光显微术对生物样品成像以检测所述复合物。
在前述实施方案中的任一个中，DNA多联体分子的序列(例如，靶标序列)可以在生物样品中原位分析。在前述实施方案中的任一个中，检测探针可用于通过顺序杂交、边杂交边测序、边连接边测序、边合成边测序、边结合边测序或其组合来分析DNA多联体的序列(例如，靶标序列)。在前述实施方案中的任一个中，待分析的序列可包括条形码序列，例如对应于生物样品中的分析物或其一部分或者用于分析物或其一部分的标记剂的条形码序列。
在前述实施方案中的任一个中，所述方法还可包括去除一个或更多个未与靶标序列结合的检测探针的分子。
在前述实施方案中的任一个中，所述多个检测探针的所述检测探针可以是第一检测探针，并且所述方法还可包括在使生物样品与在合成主链上包含核碱基序列的多个第二检测探针接触之前，去除与靶标序列结合的第一检测探针的分子。在前述实施方案中的任一个中，靶标序列可以是第一靶标序列，并且所述多个第二检测探针中的第二检测探针可以与DNA多联体中的第二靶标序列直接或间接地结合，其中所述第一靶标序列和第二靶标序列可以相同或不同。
在前述实施方案中的任一个中，所述检测探针可以是第一检测探针并且可以与第一中间探针杂交，所述第一中间探针可以与靶标序列杂交，任选地其中所述第一中间探针在合成主链上包含核碱基序列。在前述实施方案中的任一个中，所述方法还可包括去除与靶标序列的第一检测探针和/或第一中间探针结合的分子。在前述实施方案中的任一个中，所述方法还可包括使生物样品与在合成主链上包含核碱基序列的多个第二检测探针和第二中间探针接触，其中所述多个第二检测探针可与所述第二中间探针杂交，所述第二中间探针可与靶标序列杂交，任选地其中所述第一中间探针可在合成主链上包含核碱基序列。
在前述实施方案中的任一个中，生物样品可以是经处理或经清理的生物样品。在前述实施方案中的任一个中，生物样品可以是组织样品。在前述实施方案中的任一个中，组织样品可以是厚度在约1μm至约50μm之间的组织薄片，任选地，其中所述组织薄片的厚度可以在约5μm至约35μm之间。
在前述实施方案中的任一个中，组织样品可以被包埋在水凝胶中。在前述实施方案中的任一个中，分析物或DNA多联体可以与水凝胶交联。在前述实施方案中的任一个中，分析物或DNA多联体可以包含用于附接到水凝胶的一个或更多个官能团。在前述实施方案中的任一个中，分析物可以包含来自组织样品的生物分子和/或其产物。
在一些方面，本文提供了一种分析生物样品的方法，其包括：(a)使生物样品与多个荧光标记的检测探针接触，其中：所述生物样品包含固定在其中的滚环扩增(RCA)产物，其中所述RCA产物包含靶标序列的多个拷贝，所述多个荧光标记的检测探针中的一个荧光标记的检测探针在合成主链上包含与靶标序列或和靶标序列杂交的中间探针杂交的核碱基序列，(b)任选地去除未与RCA产物杂交的荧光标记的检测探针和/或中间探针的分子；和(c)检测与生物样品中的RCA产物结合的荧光标记的检测探针的分子，并且由与RCA产物杂交的荧光标记的检测探针生成的信号大于在糖-磷酸主链上具有相同的荧光标记和核碱基序列的多个参考检测探针。在一些实施方案中，所述多个荧光标记的检测探针中的至少一些在合成主链上包含核碱基序列。在一些实施方案中，所述多个荧光标记的检测探针中的每一个在合成主链上包含核碱基序列。在一些实施方案中，所述多个荧光标记的检测探针中的全部在合成主链上包含核碱基序列。在一些实施方案中，所述多个荧光标记的检测探针中的至少一些、每一个或全部为基于吗啉代物的探针。
在前述实施方案中的任一个中，所述方法还可在步骤(a)之前包括：使生物样品与可和生物样品中的分析物直接或间接地结合的环状或可环化(例如，挂锁)探针或探针组接触，并使用环状或可环化探针或探针组作为模板生成RCA产物。
在前述实施方案中的任一个中，荧光标记的检测探针可以是不带电荷的或者静电负性低于在糖-磷酸主链上具有相同的荧光标记和核碱基序列的参考检测探针。
在前述实施方案中的任一个中，环状或可环化探针或探针组可以与分析物的核酸序列杂交。在前述实施方案中的任一个中，环状或可环化探针或探针组可以与标记剂的报告寡核苷酸杂交，其中所述标记剂还可以包含可以与分析物直接或间接地结合的结合部分，其中所述报告寡核苷酸可以对应于所述结合部分和/或分析物。
在前述实施方案中的任一个中，中间探针可以在合成主链上包含可以与靶标序列杂交的核碱基序列，任选地其中与在糖-磷酸主链上具有相同核碱基序列的参考中间探针相比，可以有更多的中间探针的分子在RCA产物的内部杂交。
在前述实施方案中的任一个中，荧光标记的检测探针和/或中间探针可以是吗啉代物。
在前述实施方案中的任一个中，RCA产物可以具有小于约1.5μm的直径。在一些情况下，RCA产物可以具有约0.1μm至约0.5μm、约0.5μm至约1μm、或约1μm至约1.5μm、任选地小于约1μm的直径。在前述实施方案中的任一个中，RCA产物可以具有约100nm、约200nm、约300nm、约400nm、约500nm、约600nm、约700nm、约800nm、约900nm、约1,000nm、约1,100nm、约1,200nm、约1,300nm、约1,400nm或约1,500nm的直径。
在前述实施方案中的任一个中，在接触步骤中，荧光标记的检测探针的分子数可不超过RCA产物中靶标序列的拷贝数的5倍、不超过4倍、不超过3倍、不超过2倍或不超过1.5倍。
在前述实施方案中的任一个中，RCA产物中的靶标序列的至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％或至少约90％的拷贝可以与中间探针和/或荧光标记的检测探针的一个或更多个分子直接或间接地结合。
在前述实施方案中的任一个中，可以使生物样品与参考检测探针的多个分子接触，并且与参考检测探针相比，更多的荧光标记的检测探针的分子可以与生物样品中的RCA产物结合。
在前述实施方案中的任一个中，所述方法还可包括去除与生物样品中的RCA产物结合的荧光标记的检测探针和中间探针的分子。
在前述实施方案中的任一个中，荧光标记的检测探针可以是第一荧光标记的检测探针，中间探针可以是第一中间探针，所述方法还可包括使生物样品与第二荧光标记的检测探针接触，其中：第二荧光标记的检测探针可以在合成主链上包含与可和靶标序列杂交的第二中间探针杂交的核碱基序列，并且可以检测生物样品中与RCA产物结合的第二荧光标记的检测探针的分子。在前述实施方案中的任一个中，第二中间探针可以在合成主链上包含可以与靶标序列杂交的核碱基序列，任选地其中与在糖-磷酸主链上具有相同核碱基序列的参考中间探针相比，可以有更多的第二中间探针的分子在RCA产物的内部杂交。
在一些方面，本文提供了一种组合物，其包含：包含靶标序列的多个拷贝的DNA多联体、与靶标序列杂交的多个中间探针和各在合成主链上包含核碱基序列的多个荧光标记的检测探针，其中所述DNA多联体、所述中间探针的至少一个分子和所述荧光标记的检测探针的至少一个分子形成杂交复合物。
在前述实施方案中的任一个中，组合物的DNA多联体可以是滚环扩增(RCA)产物。在前述实施方案中的任一个中，组合物的RCA产物可以使用可与生物样品中的分析物直接或间接地结合的环状或可环化(例如，挂锁)探针或探针组作为模板在生物样品中原位生成。
在前述实施方案中的任一个中，组合物的荧光标记的检测探针可以是不带电荷的或者静电负性低于在糖-磷酸主链上具有相同的荧光标记和核碱基序列的参考检测探针。在前述实施方案中的任一个中，组合物的中间探针可以在合成主链上包含可以与靶标序列杂交的核碱基序列，任选地其中所述中间探针可以是不带电荷的或者静电负性低于在糖-磷酸主链上具有相同核碱基序列的参考中间探针。在前述实施方案中的任一个中，组合物的荧光标记的检测探针中的至少一部分可以与中间探针杂交。
在前述实施方案中的任一个中，组合物的荧光标记的检测探针和/或中间探针可以是吗啉代物。
在前述实施方案中的任一个中，组合物的DNA多联体可以具有小于约1.5μm的直径。在一些情况下，RCA产物可以具有约0.1μm至约0.5μm、约0.5μm至约1μm、或约1μm至约1.5μm、任选地小于约1μm的直径。在前述实施方案中的任一个中，DNA多联体可以具有约100nm、约200nm、约300nm、约400nm、约500nm、约600nm、约700nm、约800nm、约900nm、约1,000nm、约1,100nm、约1,200nm、约1,300nm、约1,400nm或约1,500nm的直径。
在前述实施方案中的任一个中，组合物的DNA多联体中的靶标序列的至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％或至少约90％的拷贝可以与中间探针和/或荧光标记的检测探针的一个或更多个分子直接或间接地结合。
在一些方面，本文提供了一种试剂盒，其包含：在合成主链上包含核碱基序列的荧光标记的检测探针，其中所述荧光标记的检测探针中的至少一部分与中间探针杂交，以及中间探针，所述中间探针在合成主链上包含与靶标序列杂交的核碱基序列。
在前述实施方案中的任一个中，试剂盒的荧光标记的检测探针和中间探针可以是吗啉代物。在前述实施方案中的任一个中，试剂盒还可包括包含靶标序列或其补体的环状或可环化(例如，挂锁)探针或探针组，其中所述探针或探针组可能能够与生物样品中的分析物直接或间接地结合并使用所述探针或探针组作为模板生成滚环扩增产物。
在前述实施方案中的任一个中，所述多个检测探针的结合可以在杂交缓冲液的存在下发生。在前述实施方案中的任一个中，杂交缓冲液可以包含将A:T碱基对的稳定性增加至大约G:C对的稳定性的试剂。在前述实施方案中的任一个中，所述试剂可以包含铵离子。在前述实施方案中的任一个中，所述试剂可以是四甲基氯化铵。
附图说明
图1A示出了吗啉代物结构的一个实例。
图1B示出了一种基于吗啉代物主链的示例性核酸类似物。该核酸类似物可包含供用作检测探针的可检测标记，例如以与滚环扩增(RCA)产物或者和RCA产物直接或间接地结合的探针结合。
图2A示出，由于DNA多联体的电荷性质，示例性标准检测探针(例如，在糖-磷酸主链上具有核碱基序列)与DNA多联体(例如，RCA产物)的结合能力有限。在一些实施方案中，电荷场和/或与DNA多联体的物理化学有关的其他屏障可以防止大量标准检测探针由于静电排斥而穿透DNA多联体。
图2B示出，由于它们对DNA多联体的电荷性质的敏感性降低，故示例性核酸类似物检测探针(例如，在合成主链上具有核碱基序列)与DNA多联体(例如，RCA产物)的结合能力增大。在一些实施方案中，与具有相同核碱基序列的标准检测探针相比，核酸类似物检测探针对DNA多联体的性质(例如，静电效应)不敏感，从而允许更多的核酸类似物检测探针对接在DNA多联体上和/或内。图2A-2B中以实例示出了具有poly A序列的核酸分析物，并且应了解，核酸分析物可以是任何核酸，如基因组DNA、编码或非编码RNA(例如，mRNA)或cDNA。
图3示出了用于检测DNA多联体(例如，RCA产物)的示例性探针，其中中间探针或检测探针(例如，荧光标记的检测探针)或两者可以是核酸类似物探针。可以在任何合适的靶上使用任何合适的一级探针或探针组(例如，在RNA分子上使用环化SNAIL探针)来产生RCA产物。
图4示出了一种与核酸分子(例如，mRNA)结合的示例性SNAIL探针组。
图5示出了从使用吗啉代物检测探针或DNA对照检测探针进行的示例性原位检测实验检测到的DNA多联体数目(左侧小图)和高于背景的DNA多联体的信号强度(右侧小图)的结果。
具体实施方式
本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)均全文以引用方式并入本文中用于所有目的，并入程度如同每一单独的出版物均以引用方式单独地并入一样。如果本文阐述的定义与以引用方式并入本文中的专利、专利申请、已公布的专利申请和其他出版物中阐述的定义相反或者说相矛盾，则本文阐述的定义优先于以引用方式并入本文中的定义。
本文所使用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所描述的主题。
I.概述
原位或批量产生的多联体如滚环扩增(RCA)产物可能显示出探针杂交如检测寡核苷酸的结合的有限可及性。例如，DNA多联体(例如，RCA产物或扩增子)大小的分析显示，扩增子大小的增加与使用荧光标记的检测寡核苷酸对扩增子的原位检测中亮度的增加无关。在一些实施方案中，检测探针仅能够与例如在DNA多联体的周边中的暴露位点杂交，并且由于空间或静电效应而不太能够自由地扩散到结构的中心中。在一些实施方案中，仅可利用DNA多联体上的一小部分潜在对接位点。在一些实施方案中，将检测探针与DNA多联体中数目增加的可用对接位点杂交的能力最大化将显著增加每个扩增子的亮度，从而增加测定信号和/或灵敏度，例如，对于DNA多联体中的条形码序列的原位测序。
在一个方面，检测探针与DNA多联体中所有可用对接位点杂交的低效率可能归因于与DNA多联体的物理化学相关的性质，如空间位阻，其中DNA多联体卷曲得如此紧密，以致于检测探针的排斥主要由碱基堆积和其他聚合物内相互作用引起。在另一个方面，沿着DNA多联体主链的负磷酸根电荷通过内部库仑力施加扩增子结构的“膨胀”；从而生成以更松散的构型和更大的拓扑尺寸存在的较小DNA聚合物。在一些实施方案中，原位观察到的大DNA多联体尺寸(例如，直径～1.3μm)呈现出足以抑制检测探针朝向DNA多联体的中心杂交的阴离子电荷场。随着更多的检测探针杂交，阴离子电荷场增加。观察到的DNA多联体尺寸与亮度之间由于静电而缺乏相关性的证据通过在面板中使用大量基因的分子拥挤事件期间DNA多联体的平均尺寸减小而同时亮度增加的这一观察结果得到了进一步增强。通过使用具有合成主链(例如，吗啉代物)的荧光标记的检测寡核苷酸作为标准探针(例如，中间探针，如二级探针，和/或检测探针)的替代物，可以降低DNA多联体对检测探针杂交可及性的静电影响或其他影响。
在一个方面，本文提供了一种方法，其中使包含DNA多联体的生物样品与探针(例如，检测探针和/或中间探针)接触，其中所述探针在合成主链上包含核碱基序列，并且所述探针与DNA多联体中的靶标序列直接或间接地杂交，并且其中与在糖-磷酸主链上具有相同核碱基序列的参考探针相比有更多探针与DNA多联体杂交。在一些实例中，与在糖-磷酸主链上具有相同核碱基序列的参考探针相比，有更多的在合成主链上具有核碱基序列的探针在DNA多联体的内部杂交。在一些实施方案中，由与DNA多联体结合的在合成主链上具有核碱基序列的多个检测探针生成的信号大于由与DNA多联体结合的在糖-磷酸主链上具有相同核碱基序列的多个参考检测探针生成的信号。在一些实施方案中，探针(例如，基于吗啉代物的检测或中间探针)的静电负性低于在糖-磷酸主链上具有相同核碱基序列的参考探针。
吗啉代物是一类在其主链中具有吗啉代物(例如，亚甲基吗啉)环的核酸类似物(图1A)，所述吗啉代物环替代DNA和RNA寡核苷酸特征性的脱氧核糖(或核糖)环。在一些实施方案中，吗啉代物含有不带电荷的磷酰二胺子单元间键，而不是天然核酸中发现的阴离子磷酸二酯键。在一些实施方案中，吗啉环带有A、C、G或T或适当地排列用于Watson-Crick碱基配对的其他天然或合成碱基，并可商购获得。在一些实施方案中，吗啉代物为不带电荷的分子，其对DNA多联体的阴离子电荷性质不敏感。在一些实施方案中，静电效应导致DNA多联体尺寸与亮度之间的非相关性，并且与DNA检测寡核苷酸相比，用吗啉代物检测寡核苷酸(图1B)的信号增加。由于多联体的阴离子电荷场，标准DNA探针(用可检测标记标记或未标记)可能被阻碍朝向DNA多联体(例如，RCA产物)的中心杂交(图2A)。在一些方面，核酸类似物探针如基于吗啉代物的探针(用可检测标记标记或未标记)可能显示出与DNA多联体的结合能力的增加，这是由于其对多联体的电荷性质的敏感性降低(图2B)。
在一个方面，本文公开的方法包括在原位分析或测序期间使用的化学/光学解码循环期间使用荧光标记的吗啉代物作为检测探针。例如，在使用一级探针(例如，挂锁或环状探针)来生成RCA、中间探针(例如，二级探针)与RCA产物结合并且检测探针与二级探针结合的情况下，检测探针、任何中间探针或这两者都可以是核酸类似物探针，如基于吗啉代物的探针(图3)。可以使用另外的中间探针来桥接可检测地标记的探针与RCA产物的结合，并且可检测地标记的探针和中间探针中的任何一个或更多个可以是核酸类似物探针，如基于吗啉代物的探针(例如，包含通过磷酰二胺基团连接的核碱基)。
在一些实施方案中，使用核酸类似物探针如基于吗啉代物的探针(例如，作为检测探针和/或中间探针)允许更短的扩增时间和更小的DNA多联体(例如，在亚微米范围内)，同时保持同等或甚至更高程度的信号亮度。在一些实施方案中，更亮且更小的扩增子将减少光学拥挤，从而允许在单个实验期间在它们的位置背景下分析更多的基因。在一些实施方案中，本文描述的方法允许使用更少的探针(例如，一级和/或二级探针)来实现足够的信号检测。在一些实施方案中，本文描述的方法还允许每个RNA靶使用更少的挂锁探针(例如，单个挂锁探针)，而不是每个RNA靶包含4个探针的常规设计。在一些实施方案中，本文公开的方法允许同时检查目的基因的个体同种型的定位，因为单个探针可被设计成跨坐唯一的外显子/外显子接头，例如，如图4中所示。
在一些情况下，每个分析物(例如，RNA)使用单个探针(例如，单个环状或可环化探针，如挂锁探针)的主要优点在于，由于分析物(例如，转录物)到探针的一对一映射，故分子拥挤问题可以简单地通过稀释探针来解决。因此，如果DNA多联体的静电和/或其他性质在一定程度上阻止DNA多联体中大百分比的可用对接位点(例如，条形码区域)的杂交，则可以实现在增加DNA多联体的亮度的同时减小DNA多联体(例如，RCA扩增子)的尺寸。在一些情况下，本文提供了不带电荷的寡核苷酸类似物，如基于吗啉代物的探针，其将克服或减少杂交的阻止并提供优于当前标准核酸探针如DNA探针的多种优点。
II.样品、分析物和靶标序列
A.样品
本文公开的样品可以是或源自任何生物样品。本文公开的方法和组合物可用于分析生物样品，所述生物样品可使用多种技术中的任何一种从受试者获得，所述多种技术包括但不限于活组织检查、外科手术和激光捕获显微镜法(LCM)，并通常包括来自受试者的细胞和/或其他生物材料。除了上述受试者外，生物样品可以从原核生物体如细菌、古细菌、病毒或类病毒获得。生物样品也可以从非哺乳动物生物体(例如，植物、昆虫、蛛形纲动物、线虫、真菌或两栖动物)获得。生物样品也可以从真核生物如组织样品、患者来源的类器官(PDO)或患者来源的异种移植物(PDX)获得。来自生物体的生物样品可以包含一种或多种其他生物体或来自其的组分。例如，除哺乳动物细胞和非细胞组织组分外，哺乳动物组织切片可以包含来自其他生物体的朊病毒、类病毒、病毒、细菌、真菌或组分。可以从其获得生物样品的受试者可以是健康的或无症状的个体、具有或疑似具有疾病的个体(例如，具有疾病如癌症的患者)或对疾病有易感性的个体，和/或需要治疗或疑似需要治疗的个体。
生物样品可以包含任何数目的大分子，例如细胞大分子和细胞器(例如，线粒体和细胞核)。生物样品可以是核酸样品和/或蛋白质样品。生物样品也可以是碳水化合物样品或脂质样品。生物样品可以作为组织样品如组织切片、活组织检查、核心活组织检查、针抽吸物或细针抽吸物获得。样品可以是流体样品，如血液样品、尿液样品或唾液样品。样品可以是皮肤样品、结肠样品、面颊拭子、组织学样品、组织病理学样品、血浆或血清样品、肿瘤样品、活细胞、培养细胞、临床样品例如全血或血液来源产品、血细胞、或者培养组织或细胞，包括细胞悬浮液。在一些实施方案中，生物样品可以包含沉积在表面上的细胞。
无细胞生物样品可以包含细胞外多核苷酸。可以从身体样品例如血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜分泌物、痰、粪便和泪液分离细胞外多核苷酸。
生物样品可以源自本文提及的受试者或生物体的同质培养物或种群，或者可替代地源自若干不同生物体的集合，例如，在群落或生态系统中。
生物样品可以包含一个或更多个患病的细胞。患病的细胞可以具有改变的代谢性能、基因表达、蛋白表达和/或形态特征。疾病的例子包括炎症性障碍、代谢障碍、神经系统障碍和癌症。癌细胞可以来源于实体瘤、血液系统恶性肿瘤、细胞系，或作为循环肿瘤细胞获得。生物样品还可以包含胎儿细胞和免疫细胞。
生物样品可以包含包埋在3D基质中的分析物(例如，蛋白质、RNA和/或DNA)。在一些实施方案中，源自分析物(例如，蛋白质、RNA和/或DNA)或与分析物相关联的扩增子(例如，滚环扩增产物)可被包埋在3D基质中。在一些实施方案中，3D基质可以包含天然分子和/或合成分子的网络，所述天然分子和/或合成分子例如通过交联化学和/或酶促连接。在一些实施方案中，3D基质可以包含合成聚合物。在一些实施方案中，3D基质包含水凝胶。
在一些实施方案中，本文的基材可以是不溶于水性液体中并允许将生物样品、分析物、特征和/或试剂(例如，探针)定位在支撑物上的任何支撑物。在一些实施方案中，生物样品可以附接到基材。生物样品的附接可以是不可逆的或可逆的，具体取决于样品的性质和分析方法中的后续步骤。在某些实施方案中，可以通过向基材施加合适的聚合物涂层并且使样品与聚合物涂层接触而将样品可逆地附接到基材。然后可以例如使用至少部分地溶解聚合物涂层的有机溶剂来将样品从基材分离。水凝胶是适合于此目的的聚合物的实例。
在一些实施方案中，可以用一种或多种物质涂布基材或使基材官能化以促进样品向基材的附接。可用于涂布基材或使基材官能化的合适物质包括但不限于凝集素、聚赖氨酸、抗体和多糖。
可以进行各种步骤来制备或处理用于测定和/或测定期间的生物样品。除非另有说明，否则下文描述的制备或处理步骤通常可以以任何方式和以任何次序组合以适当地制备或处理特定的样品用于和/或分析。
(i)组织切片
生物样品可以从受试者采集(例如，经由手术活组织检查、全受试者切片)或在生长底物或培养皿上作为细胞群体在体外生长，并制备为组织薄片或组织切片用于分析。生长的样品可能足够薄，无需进一步的处理步骤即可用于分析。或者，可以使用机械切割装置如振动刀片切片机将生长的样品和经由活组织检查或切片获得的样品制备为薄组织切片。作为另一个替代方案，在一些实施方案中，可以通过向合适的基材材料施加生物样品的触印来制备薄组织切片。
组织切片的厚度可以是细胞的最大横截面尺寸的分数(例如，小于0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1)。然而，也可以使用厚度大于最大横截面细胞尺寸的组织切片。例如，可以使用恒冷箱切片，其厚度可以为例如10-20μm。
更一般地，组织切片的厚度通常取决于用于制备切片的方法和组织的物理特性，并因此可以制备和使用具有多种不同厚度的切片。例如，组织切片的厚度可以为至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、1.0、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、20、30、40或50μm。如果需要或方便，也可以使用较厚的切片，例如至少70、80、90或100μm或更多。通常，组织切片的厚度在1-100μm、1-50μm、1-30μm、1-25μm、1-20μm、1-15μm、1-10μm、2-8μm、3-7μm或4-6μm之间，但是如上所述，也可以分析厚度大于或小于这些范围的切片。
还可以从单个生物样品获得多个切片。例如，可以通过使用切片刀片进行活组织检查样品的连续切片来从手术活组织检查样品获得多个组织切片。可以以这种方式保存连续切片之间的空间信息，并且可以依次分析切片以获得关于生物样品的三维信息。
(ii)冷冻
在一些实施方案中，生物样品(例如，如上所述的组织切片)可以通过在适于维持或保持组织结构的完整性(例如，物理特性)的温度下深度冷冻来制备。可以使用任何数量的合适方法将冷冻的组织样品切片例如薄切到基材表面上。例如，组织样品可以使用设置在适合于保持组织样品的结构完整性和样品中核酸的化学性质两者的温度下的冷冻切片机(例如，恒冷切片机)来制备。这样的温度可以是例如低于-15℃、低于-20℃或低于-25℃。
(iii)固定和后固定
在一些实施方案中，可以使用福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)来制备生物样品，这是已经建立的方法。在一些实施方案中，可以使用福尔马林固定和石蜡包埋来制备细胞悬浮液和其他非组织样品。在固定样品并包埋在石蜡或树脂块中之后，可以如上所述对样品切片。在分析之前，可以通过在适当的溶剂(例如，二甲苯)中温育组织切片、然后冲洗(例如，99.5％的乙醇2分钟，96％的乙醇2分钟，70％的乙醇2分钟)来从组织切片去除石蜡包埋材料(例如，去石蜡化)。
作为上述福尔马林固定的一种替代方案，可以将生物样品固定在多种其他固定剂中的任何一种中以在分析之前保持样品的生物结构。例如，样品可以通过浸泡在乙醇、甲醇、丙酮、多聚甲醛(PFA)-Triton及其组合中来固定。
在一些实施方案中，对新鲜冷冻样品使用丙酮固定，所述新鲜冷冻样品可以包括但不限于皮质组织、小鼠嗅球、人脑肿瘤、人死后脑和乳腺癌样品。当进行丙酮固定时，可以不进行预透化步骤(下文描述)。或者，丙酮固定可以与透化步骤结合进行。
在一些方面，所述方法包括固定完整组织。在一些方面，所述方法在被固定的完整组织上进行。通常，固定(fixing或fixation)涉及保存生物材料(例如，组织、细胞、细胞器、分子等)使之免于腐烂和/或降解。可以使用任何方便的操作规程来完成固定。固定可以包括使样品与固定试剂(例如，含有至少一种固定剂的试剂)接触。样品可以与固定试剂接触范围广泛的时间，这可取决于温度、样品的性质和固定剂。例如，样品可以与固定试剂接触24小时或更短时间、18小时或更短时间、12小时或更短时间、8小时或更短时间、6小时或更短时间、4小时或更短时间、2小时或更短时间、60分钟或更短时间、45分钟或更短时间、30分钟或更短时间、25分钟或更短时间、20分钟或更短时间、15分钟或更短时间、10分钟或更短时间、5分钟或更短时间、或2分钟或更短时间。
样品可以在各种温度下与固定试剂接触，具体取决于操作规程和所用试剂。例如，在一些情况下，样品可以在-22℃至55℃的范围内的温度下与固定试剂接触，其中感兴趣的特定范围包括但不限于50至54℃、40至44℃、35至39℃、28至32℃、20至26℃、0至6℃和-18至-22℃。在一些情况下，样品可以在-20℃、4℃、室温(22-25℃)、30℃、37℃、42℃或52℃的温度下与固定试剂接触。
可以使用任何方便的固定试剂。常用的固定试剂包括交联固定剂、沉淀固定剂、氧化固定剂、汞制剂等。交联固定剂通过共价键化学联结两个或更多个分子，并且可以使用范围广泛的交联试剂。合适的交联固定剂的实例包括但不限于醛(例如，甲醛，通常也称为“多聚甲醛”和“福尔马林”；戊二醛等)、亚氨酸酯、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)酯等。合适的沉淀固定剂的实例包括但不限于醇(例如，甲醇、乙醇等)、丙酮、乙酸等。在一些实施方案中，固定剂为甲醛(例如，多聚甲醛或福尔马林)。固定试剂中合适的甲醛最终浓度为0.1至10％、1-8％、1-4％、1-2％、3-5％或3.5-4.5％，包括约1.6％达10分钟。在一些实施方案中，将样品固定在最终浓度为4％的甲醛(如从更浓的储备溶液例如38％、37％、36％、20％、18％、16％、14％、10％、8％、6％等稀释)中。在一些实施方案中，将样品固定在最终浓度为10％的甲醛中。在一些实施方案中，将样品固定在最终浓度为1％的甲醛中。在一些实施方案中，固定剂为戊二醛。固定试剂中戊二醛的合适浓度为0.1至1％。固定试剂可以以任何组合含有多于一种固定剂。例如，在一些实施方案中，使样品与含有甲醛和戊二醛两者的固定试剂接触。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括一个或更多个后固定(post-fixing，也称为postfixation)步骤。在一些实施方案中，在使样品与本文公开的多核苷酸例如一个或更多个探针如环状或挂锁探针接触之后进行一个或更多个后固定步骤。在一些实施方案中，在包含探针和靶的杂交复合物在样品中形成之后进行一个或更多个后固定步骤。在一些实施方案中，在本文公开的连接反应如连接以使挂锁探针环化之前进行一个或更多个后固定步骤。
在一些实施方案中，在使样品与用于非核酸分析物如蛋白质分析物的结合或标记剂(例如，抗体或其抗原结合片段)接触之后进行一个或更多个后固定步骤。标记剂可以包含核酸分子(例如，报告寡核苷酸)，所述核酸分子包含对应于标记剂并因此对应于(例如，唯一地鉴别)分析物的序列。在一些实施方案中，标记剂可以包含报告寡核苷酸，所述报告寡核苷酸包含一个或更多个条形码序列。
可以使用本文公开的任何合适的固定试剂例如3％(w/v)的多聚甲醛/DEPC-PBS来进行后固定步骤。
(iv)包埋
作为上述石蜡包埋的一种替代方案，可以将生物样品包埋在多种其他包埋材料中的任何一种中以便在切片和其他处理步骤之前为样品提供结构基材。在一些情况下，可以例如在分析从样品获得的组织切片之前去除包埋材料。在一些方面，可以一次或多次向样品施加包埋材料。合适的包埋材料包括但不限于蜡、树脂(例如，甲基丙烯酸酯树脂)、环氧树脂和琼脂。
在一些实施方案中，可以将生物样品包埋在基质(例如，水凝胶基质)中。以这种方式包埋样品通常涉及使生物样品与水凝胶接触使得生物样品被水凝胶包围。例如，可以通过使样品与合适的聚合物材料接触并活化聚合物材料以形成水凝胶来包埋样品。在一些实施方案中，形成水凝胶使得水凝胶内化在生物样品中。
在一些实施方案中，通过形成水凝胶的聚合物材料的交联而将生物样品固定在水凝胶中。交联可以以化学和/或光化学方式进行，或者替代地通过本领域已知的任何其他水凝胶形成方法进行。
水凝胶基质的组成和向生物样品的施加通常取决于生物样品的性质和制备(例如，切片、非切片、固定的类型)。作为一个实例，在生物样品为组织切片的情况下，水凝胶基质可以包含单体溶液和过硫酸铵(APS)引发剂/四甲基乙二胺(TEMED)加速剂溶液。作为另一个实例，在生物样品由细胞(例如，培养的细胞或从组织样品分离的细胞)组成的情况下，细胞可以与单体溶液和APS/TEMED溶液一起温育。对于细胞，水凝胶基质凝胶在区室中形成，区室包括但不限于用于培养、维持或运输细胞的装置。例如，可以通过向区室中添加单体溶液加APS/TEMED到约0.1μm至约2mm的深度来形成水凝胶基质。
生物样品的水凝胶包埋的其他方法和方面见述于例如Chen等人,Science 347(6221):543–548,2015中，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，所公开的方法包括将样品包埋在基质形成材料中，例如以基本上保留样品中多个核酸的相对三维空间关系的方式。在一些实施方案中，所公开的方法包括制备核酸的三维基质。在一些实施方案中，核酸共价结合到基质中或结合到基质材料中或结合到基质材料。核酸可以与基质材料共聚或与基质材料交联或既与基质材料共聚又与基质材料交联。根据一个方面，一定长度的多个核酸序列如DNA或RNA序列是三维共聚物的一部分。然后可以例如在基质内原位扩增和检测和/或分析(例如，测序)核酸。在某个方面，核酸的三维基质提供了信息存储介质，其中核酸例如一个或更多个核苷酸的序列代表可以在三维基质内读取的存储信息。基质形成材料可以包括聚丙烯酰胺、纤维素、藻酸盐、聚酰胺、交联琼脂糖、交联葡聚糖、交联聚乙二醇、二硫化物交联聚丙烯酰胺、琼脂糖、藻酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)-二丙烯酸酯、PEG-丙烯酸酯、PEG-硫醇、PEG-叠氮化物、PEG-炔烃、其他丙烯酸酯、壳聚糖、透明质酸、胶原蛋白、纤维蛋白、明胶或弹性蛋白，例如，如美国专利号10,138,509中所述，该专利通过引用明确并入本文。基质形成材料可以使用基质形成材料特有的方法及已知的方法、试剂和条件通过基质形成材料的聚合和/或交联形成基质。
在一些方面，基质足够光学透明或以其他方式具有适合于检测、成像和/或测序的光学性质，例如，如本文所述和/或使用标准的高通量测序化学物和用于高通量信息读取的深度三维成像。利用荧光成像的示例性高通量测序化学物包括ABI SoLiD(LifeTechnologies)，其中模板上的测序引物连接到具有可切割终止子的荧光标记的九聚体的文库。连接后，然后使用四个颜色通道(FITC、Cy3、Texas Red和Cy5)对珠成像。然后切割终止子，留下游离端以参与下一个连接-延伸循环。在已确定所有二核苷酸组合之后，将图像映射到颜色代码空间以确定每个模板的特定碱基调用。该工作流程使用自动流控和成像装置(例如，SoLiD 5500W Genome Analyzer，ABI Life Technologies)实现。另一个测序平台使用边合成边测序，其中使用DNA聚合酶并入具有可切割终止子的单核苷酸池。成像后，切割终止子并重复该循环。然后分析荧光图像以为流动池(HiSeq,Illumina)内的每个DNA扩增子调用碱基。
在一些实施方案中，所公开的方法包括制备生物组织试样进行显微分析，例如通过将组织包埋在水凝胶中并使目的分子可及于光学探测和分子标记同时允许不期望的分子如脂质被冲走来维持组织的3-D完整性的过程。参见Chung等人，“CLARITY for mappingthe fine system”,Nature Methods 10(2013)和美国专利号10,545,075，其通过引用明确并入本文。在一些实施方案中，本文公开的方法包括通过使生物组织试样与固定剂和多个水凝胶子单元接触来固定从哺乳动物获得的生物组织试样，从而使水凝胶子单元与生物组织试样内的生物分子交联以产生生物分子结合的水凝胶子单元。在一些实施方案中，所述方法还包括使生物分子结合的水凝胶子单元聚合以形成水凝胶包埋的生物组织试样。在一些实施方案中，所述方法还包括对水凝胶包埋的生物组织试样进行电泳以从试样中去除多种细胞组分并形成经清理的水凝胶包埋生物组织试样。
在一些实施方案中，所公开的方法包括将样品包埋在水凝胶中。所描述的水凝胶组织化学包括将核酸共价附接到原位合成的水凝胶以进行组织清理、酶扩散和多周期测序。在一些实施方案中，水凝胶或水凝胶网络包含不溶于水的聚合物链网络，其有时以其中水为分散介质的胶体凝胶存在。换句话说，水凝胶是可以吸收大量水而不溶解的一类聚合材料。水凝胶可以含有超过99％的水并且可以包含天然或合成聚合物或其组合。
水凝胶由于其显著的水含量还具有与天然组织非常相似的柔性程度。合适的水凝胶的详细描述可见于公开的美国专利申请20100055733，该美国专利申请通过引用明确并入本文。如本文所用，术语“水凝胶子单元”或“水凝胶前体”指的是可以交联或“聚合”形成三维(3D)水凝胶网络的亲水性单体、预聚物或聚合物。不受任何科学理论的束缚，据信在存在水凝胶子单元的情况下对生物试样的这种固定将试样的组分与水凝胶子单元交联，从而将分子组分固定在适当的位置，从而保持组织结构和细胞形态。
在一些实施方案中，包埋包括使一个或更多个扩增子与丙烯酰胺共聚，例如以形成含有多于一种类型的子单元的共聚物。共聚物涵盖包含两种、三种、四种、五种或六种类型的子单元的聚合物。
(v)染色和免疫组织化学(IHC)
为了促进可视化，可以使用各种各样的染色剂和染色技术来对生物样品染色。在一些实施方案中，例如，可以使用任何数量的染色剂和/或免疫组织化学试剂来对样品染色。可以进行一个或更多个染色步骤来制备或处理用于本文所述的测定的生物样品，或者可以在测定期间和/或之后进行。在一些实施方案中，可以使样品与一种或多种核酸染色剂、膜染色剂(例如，细胞或核膜)、细胞学染色剂或其组合接触。在一些实例中，染色剂可以是对蛋白质、磷脂、DNA(例如，dsDNA、ssDNA)、RNA、细胞器或细胞的区室特异性的。可以使样品与一种或多种标记的抗体(例如，对目的分析物特异性的一抗和对所述一抗特异性的标记的二抗)接触。在一些实施方案中，可以使用对染色样品拍摄的一个或更多个图像来分割样品中的细胞。在一些实施方案中，使用亲脂性染料进行染色。在一些实例中，染色用亲脂性羰花青或氨基苯乙烯基染料或其类似物(例如，DiI、DiO、DiR、DiD)进行。其他细胞膜染色剂可包括FM和RH染料或对细胞膜蛋白特异性的免疫组织化学试剂。在一些实例中，染色剂可包括但不限于吖啶橙、酸性品红、俾斯麦棕、胭脂红、考马斯蓝、甲酚紫、DAPI、曙红、溴化乙锭、酸性品红、苏木精、Hoechst染色剂、碘、甲基绿、亚甲蓝、中性红、尼罗蓝、尼罗红、四氧化锇、碘化丙啶、罗丹明或番红。
可以使用苏木精和曙红(H&E)染色技术、使用巴氏染色技术、Masson三色染色技术、银染色技术、苏丹染色技术和/或使用过碘酸希夫(PAS)染色技术来染色。PAS染色通常在福尔马林或丙酮固定后进行。在一些实施方案中，可以使用Romanowsky染色剂对样品染色，包括Wright染色剂、Jenner染色剂、Can-Grunwald染色剂、Leishman染色剂和Giemsa染色剂。还可以对样品进行细胞核染色，如通过荧光染料(包括DAPI、Hoechst 33258、橄榄霉素和/或吖啶黄)和/或非荧光染色。
在一些实施方案中，可对生物样品脱色。使生物样品脱色或褪色的方法是本领域已知的，并通常取决于施加到样品的一种或多种染色剂的性质。例如，在一些实施方案中，经由抗体偶联向样品施加一种或多种免疫荧光染色剂。这样的染色剂可使用技术如经由用还原剂处理和洗涤剂洗涤、离液序列高的盐处理、用抗原回收溶液处理和用酸性甘氨酸缓冲液处理以切割二硫键来去除。用于多重染色和脱色的方法在例如以下文献中有述：Bolognesi等人,J.Histochem.Cytochem.2017；65(8):431-444,Lin等人,NatCommun.2015；6:8390,Pirici等人,J.Histochem.Cytochem.2009；57:567–75,和Glass等人,J.Histochem.Cytochem.2009；57:899–905，其每一个的全部内容通过引用并入本文。
(vi)等容膨胀
在一些实施方案中，包埋在基质(例如，水凝胶)中的生物样品可以被等容膨胀。可以使用的等容膨胀方法包括水合，这是膨胀显微术中的一个制备步骤，如Chen等人,Science 347(6221):543-548,2015中所述。
等容膨胀可以通过将生物样品的一个或更多个组分锚定到凝胶、随后是凝胶形成、蛋白水解和溶胀来进行。在一些实施方案中，可以将样品中的分析物、分析物的产物和/或与样品中的分析物相关的探针锚定到基质(例如，水凝胶)。生物样品的等容膨胀可以在将生物样品固定在基材上之前或在将生物样品固定在基材上之后进行。在一些实施方案中，可以在使基材与本文公开的探针接触之前从基材去除等容膨胀的生物样品。
通常，用于对生物样品进行等容膨胀的步骤可取决于样品的特性(例如，组织切片的厚度、固定、交联)和/或目的分析物(例如，将RNA、DNA和蛋白质锚定到凝胶的不同条件)。
在一些实施方案中，将生物样品中的蛋白质锚定到可溶胀凝胶如聚电解质凝胶。抗体可以在被锚定到可溶胀凝胶之前、之后或同时被引导至蛋白质。生物样品中的DNA和/或RNA也可经由合适的接头锚定到可溶胀凝胶。这样的接头的实例包括但不限于6-((丙烯酰基)氨基)己酸(丙烯酰基-X SE)(可得自ThermoFisher,Waltham,MA)、Label-IT Amine(可得自MirusBio,Madison,WI)和Label X(例如Chen等人,Nat.Methods 13:679-684,2016中所述，其全部内容通过引用并入本文)。
样品的等容膨胀可以增加样品后续分析的空间分辨率。可以通过将等容膨胀的样品与未经等容膨胀的样品进行比较来确定空间分析中分辨率的增加。
在一些实施方案中，生物样品被等容膨胀到其非膨胀尺寸的至少2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍或4.9倍的尺寸。在一些实施方案中，样品被等容膨胀到其非膨胀尺寸的至少2倍并小于20倍。
(vii)交联和去交联
在一些实施方案中，使生物样品在原位测定回合之前或期间可逆地交联。在一些方面，分析物、多核苷酸和/或与其结合的分析物或探针的扩增产物(例如，扩增子)可以锚定到聚合物基质。例如，聚合物基质可以是水凝胶。在一些实施方案中，多核苷酸探针和/或其扩增产物(例如，扩增子)中的一个或更多个可以经修饰以含有可用作锚定位点以将多核苷酸探针和/或扩增产物附接到聚合物基质的官能团。在一些实施方案中，可以使用包含寡聚dT的经修饰的探针来与目的mRNA分子结合，随后是mRNA分子的可逆交联。
在一些实施方案中，通过形成水凝胶的聚合物材料的交联而将生物样品固定在水凝胶中。交联可以以化学和/或光化学方式进行，或者替代地通过本领域已知的任何其他水凝胶形成方法进行。水凝胶可以包括含有网络的大分子聚合物凝胶。在网络中，一些聚合物链可以任选地交联，但并不总是发生交联。
在一些实施方案中，水凝胶可以包括水凝胶子单元，如但不限于丙烯酰胺、双丙烯酰胺、聚丙烯酰胺及其衍生物、聚(乙二醇)及其衍生物(例如，PEG-丙烯酸酯(PEG-DA)、PEG-RGD)、明胶-甲基丙烯酰基(GelMA)、甲基丙烯酸酯化透明质酸(MeHA)、聚脂族聚氨酯、聚醚型聚氨酯、聚酯型聚氨酯、聚乙烯共聚物、聚酰胺、聚乙烯醇、聚丙二醇、聚四亚甲基氧化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚(丙烯酸羟乙酯)和聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖、右旋糖酐、琼脂糖、明胶、藻酸盐、蛋白质聚合物、甲基纤维素等以及它们的组合。
在一些实施方案中，水凝胶包括混杂材料，例如，水凝胶材料包括合成聚合物和天然聚合物两者的成分。合适的水凝胶的实例见述于例如美国专利号6,391,937、9,512,422和9,889,422中以及美国专利申请公开号2017/0253918、2018/0052081和2010/0055733中，这些专利中的每一个的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，水凝胶可以形成基材。在一些实施方案中，基材包含水凝胶和一种或多种第二材料。在一些实施方案中，将水凝胶放置在一种或多种第二材料之上。例如，水凝胶可以预先形成，并然后放置在一种或多种第二材料之上、之下或以任何其他配置放置。在一些实施方案中，水凝胶形成发生在基材形成期间接触一种或多种第二材料之后。水凝胶形成也可以发生在位于基材上的结构(例如，孔、脊、突起和/或标记)内。
在一些实施方案中，基材上的水凝胶形成发生在向样品提供探针之前、同时或之后。例如，可以在已经含有探针的基材上进行水凝胶形成。
在一些实施方案中，水凝胶形成发生在生物样品内。在一些实施方案中，将生物样品(例如，组织切片)包埋在水凝胶中。在一些实施方案中，将水凝胶子单元输注到生物样品中，并通过外部或内部刺激引发水凝胶的聚合。
在其中在生物样品内形成水凝胶的实施方案中，可以使用官能化化学。在一些实施方案中，官能化化学包括水凝胶组织化学(HTC)。可以使用适合于HTC的任何水凝胶组织主链(例如，合成的或天然的)来锚定生物大分子和调节官能化。使用HTC主链变体的方法的非限制性实例包括CLARITY、PACT、ExM、SWITCH和ePACT。在一些实施方案中，生物样品内的水凝胶形成是永久性的。例如，生物大分子可以永久地粘附到水凝胶，从而允许多轮询问(interrogation)。在一些实施方案中，生物样品内的水凝胶形成是可逆的。
在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后向水凝胶子单元中添加另外的试剂。例如，另外的试剂可以包括但不限于寡核苷酸(例如，探针)、使DNA片段化的核酸内切酶、DNA片段化缓冲液、DNA聚合酶、用于扩增核酸并将条形码附接到扩增片段的dNTP。可以使用其他酶，包括但不限于RNA聚合酶、转座酶、连接酶、蛋白质酶K和DNAse。另外的试剂还可以包括逆转录酶，包括具有末端转移酶活性的酶、引物和开关寡核苷酸。在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后向水凝胶子单元中添加光学标记。
在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后向水凝胶中添加HTC试剂。在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后向水凝胶中添加细胞标记剂。在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后向水凝胶中添加细胞穿透剂。
可以使用任何合适的方法来清理包埋在生物样品内的水凝胶。例如，可以使用电泳组织清理方法来从水凝胶包埋的样品去除生物大分子。在一些实施方案中，在清理水凝胶之前或之后将水凝胶包埋的样品储存在介质(例如，安装介质、甲基纤维素或其他半固体介质)中。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括使可逆地交联的生物样品去交联。去交联不需要完全。在一些实施方案中，可逆地交联的生物样品中只有一部分交联分子被去交联并允许迁移。
(viii)组织透化和处理
在一些实施方案中，生物样品可以被透化以促进分析物从样品中转移出来，和/或促进物种(如探针)转移到样品中。如果样品没有充分透化，则从样品捕获的分析物的量可能太低而不能够进行充分的分析。相反，如果组织样品太过透化，则组织样品内分析物的相对空间关系可能会丢失。因此，需要在充分透化组织样品以获得良好的信号强度同时仍保持样品中分析物分布的空间分辨率之间取得平衡。
通常，生物样品可以通过将样品暴露于一种或多种透化剂而被透化。用于该目的的合适试剂包括但不限于有机溶剂(例如，丙酮、乙醇和甲醇)、交联剂(例如，多聚甲醛)、去污剂(例如，皂草苷、Triton X-100TM或Tween-20TM)和酶(例如，胰蛋白酶、蛋白酶)。在一些实施方案中，生物样品可以与细胞透化剂一起温育以促进样品的透化。用于样品透化的其他方法见述于例如Jamur等人,Method Mol.Biol.588:63-66,2010中，其全部内容通过引用并入本文。任何合适的样品透化方法通常都可以与本文描述的样品结合使用。
在一些实施方案中，在分析程序期间，使用抗扩散介质来限制分析物或其他物种的迁移，抗扩散介质可以包含至少一种透化试剂。例如，抗扩散介质可以包括含有透化缓冲液或试剂的孔(例如，微米孔、纳米孔或皮米孔)。在一些实施方案中，当抗扩散介质为水凝胶时，水凝胶可以包含透化缓冲液。在一些实施方案中，在使水凝胶与样品接触之前，将水凝胶浸泡在透化缓冲液中。在一些实施方案中，当向生物样品施加抗扩散介质时，水凝胶或其他抗扩散介质可以含有干燥的试剂或单体以递送透化试剂。在一些实施方案中，抗扩散介质(例如，水凝胶)共价附接到固体基材(例如，丙烯酸酯化玻璃载片)。
在一些实施方案中，透化溶液可以通过多孔膜递送至样品。在一些实施方案中，使用多孔膜来限制扩散性分析物损失，同时允许透化试剂到达样品。可以操控膜化学和孔隙尺寸以最大限度地减少分析物损失。在一些实施方案中，多孔膜可由玻璃、硅、纸、水凝胶、聚合物整料或其他材料制成。在一些实施方案中，材料可以是天然多孔的。在一些实施方案中，材料可具有蚀刻到固体材料中的孔隙或孔。在一些实施方案中，使透化试剂流动通过多孔膜上方的微流控腔室或通道。在一些实施方案中，流动控制样品向透化试剂的及于。在一些实施方案中，透化试剂通过膜的孔隙扩散并进入到组织中。
在一些实施方案中，生物样品可以通过向样品中添加一种或多种裂解试剂来透化。合适的裂解剂的实例包括但不限于生物活性试剂如用于裂解不同细胞类型(例如，革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物等)的裂解酶，如溶菌酶、无色肽酶、溶葡萄球菌素、labiase、立枯丝核菌裂解酶(kitalase)、溶壁酶和多种其他可商购获得的裂解酶。
可以另外或替代地向生物样品中添加其他裂解剂以促进透化。例如，可以使用基于表面活性剂的裂解溶液来裂解样品细胞。裂解溶液可包含离子表面活性剂，例如月桂酰肌氨酸钠和十二烷基硫酸钠(SDS)。更一般地，化学裂解剂可包括但不限于有机溶剂、螯合剂、去污剂、表面活性剂和离液序列高的试剂。
在一些实施方案中，生物样品可以通过非化学透化方法进行透化。非化学透化方法是本领域已知的。例如，可以使用的非化学透化方法包括但不限于物理裂解技术如电穿孔、机械透化方法(例如，使用均质器和研磨球进行珠击打以机械破坏样品组织结构)、声学透化(例如，声处理)和热裂解技术如加热以诱导样品的热透化。
在一些方面，本文提供的方法包括使组织透化。在一些实施方案中，使用透化组织进行所述方法。在一些方面，透化包括使样品的细胞(细胞膜等)可渗透实验试剂如核酸探针、抗体、化学底物等的过程。可以使用任何方便的透化方法和/或试剂。合适的透化试剂包括去污剂(例如，皂草苷、Triton X-100、吐温-20等)、有机固定剂(例如，丙酮、甲醇、乙醇等)、酶等。可以在一定的浓度范围内使用去污剂。例如，可以使用0.001％-1％的去污剂、0.05％-0.5％的去污剂或0.1％-0.3％的去污剂来进行透化(例如，0.1％的皂草苷、0.2％的吐温-20、0.1-0.3％的triton X-100等)。在一些实施方案中，使用在冰上的甲醇达至少10分钟来进行透化。
在一些实施方案中，样品可以与透化试剂接触范围广泛的时间，这可取决于温度、样品的性质和透化试剂。例如，样品可以与透化试剂接触24小时或更多时间、24小时或更短时间、18小时或更短时间、12小时或更短时间、8小时或更短时间、6小时或更短时间、4小时或更短时间、2小时或更短时间、60分钟或更短时间、45分钟或更短时间、30分钟或更短时间、25分钟或更短时间、20分钟或更短时间、15分钟或更短时间、10分钟或更短时间、5分钟或更短时间、或2分钟或更短时间。在一些实施方案中，样品可以在各种温度下与透化试剂接触，具体取决于操作规程和所用试剂。例如，在一些情况下，样品可以在-82℃至55℃的范围内的温度下与透化试剂接触，其中感兴趣的特定范围包括但不限于：50至54℃、40至44℃、35至39℃、28至32℃、20至26℃、0至6℃、-18至-22℃和-78至-82℃。在一些情况下，样品可以在-80℃、-20℃、4℃、室温(在一些实例中，低于30℃，或22-25℃)、30℃、37℃、42℃或52℃的温度下与透化试剂接触。
在一些实施方案中，样品与酶促透化试剂接触。酶促透化试剂通过部分地降解细胞外基质或阻碍测定试剂渗透样品的表面蛋白来透化样品。与酶促透化试剂的接触可以在固定之后和靶标检测之前的任何时间点进行。在一些情况下，酶促透化试剂为蛋白质酶K，这是一种可商购获得的酶。在一些情况下，在向样品提供探针多核苷酸(例如，环状或挂锁探针、引物和锚固件)之前进行透化。
在这样的情况下，样品先与蛋白质酶K接触，然后再与固定后试剂接触。蛋白质酶K处理(例如，通过蛋白质酶K的接触；通常也称为“蛋白质酶K消化”)可以在一定的时间范围内在一系列温度下在针对所研究的每种细胞类型或组织类型根据经验确定的一定的酶浓度范围内进行。例如，样品可以与蛋白质酶K接触30分钟或更短时间、25分钟或更短时间、20分钟或更短时间、15分钟或更短时间、10分钟或更短时间、5分钟或更短时间、或2分钟或更短时间。样品可以与1pg/ml或更少、2pg/ml或更少、4pg/ml或更少、8pg/ml或更少、10pg/ml或更少、20pg/ml或更少、30pg/ml或更少、50pg/ml或更少、或100pg/ml或更少的蛋白质酶K接触。在一些实施方案中，样品可以在2℃至55℃的范围内的温度下与蛋白质酶K接触，其中感兴趣的特定范围包括但不限于：50至54℃、40至44℃、35至39℃、28至32℃、20至26℃、和0至6℃。在一些情况下，样品可以在4℃、室温(在一些实例中，低于30℃，或22-25℃)、30℃、37℃、42℃或52℃的温度下与蛋白质酶K接触。在一些实施方案中，样品不与酶促透化试剂接触。在一些实施方案中，样品不与蛋白质酶K接触。在一些方面，完整组织与至少一种固定试剂和透化试剂的接触导致产生经固定和透化的组织。
可以在分析样品之前向生物样品中添加另外的试剂以执行各种功能。在一些实施方案中，可以向样品中添加DNase和RNase灭活剂或抑制剂如蛋白质酶K和/或螯合剂如EDTA。例如，本文公开的方法可包括用于增加核酸的结合可及性的步骤，例如开放细胞中的DNA以供探针杂交的变性步骤。例如，可以使用蛋白质酶K处理来释放与其结合了蛋白质的DNA。
(ix)RNA物种的选择性富集
在一些实施方案中，在RNA为分析物的情况下，可以选择性地富集一种或多种目的RNA分析物物种。例如，可以通过向样品中添加一种或多种寡核苷酸来选择一种或多种目的RNA物种。在一些实施方案中，另外的寡核苷酸为用于通过酶(例如，聚合酶)引发反应的序列。例如，可以使用与一种或多种目的RNA具有序列互补性的一种或多种引物序列来扩增所述一种或多种目的RNA，从而选择性地富集这些RNA。
在一些实施方案中，可以使用一种或多种核酸探针来与靶标核酸(例如，cDNA或RNA分子，如mRNA)杂交并在模板化连接反应(例如，RNA-模板化连接(RTL)或DNA-模板化连接(例如，在cDNA上))中连接生成供分析的产物。在一些方面，在分析两种或更多种分析物时，使用对每种RNA或cDNA分析物特异性(例如，与每种RNA或cDNA分析物特异性杂交)的第一探针和第二探针。例如，在本文提供的方法的一些实施方案中，使用模板化连接来检测生物样品中的基因表达。可以靶向目的分析物(如蛋白质)进行分析，所述目的分析物由标记剂或结合剂(例如，抗体或其表位结合片段)结合，其中所述结合剂与报告寡核苷酸缀合或以其他方式关联，所述报告寡核苷酸包含鉴别所述结合剂的报告序列。探针可以与报告寡核苷酸杂交并在模板化连接反应中连接生成供分析的产物。在一些实施方案中，探针寡核苷酸之间的间隙可以在连接之前先进行填充，使用例如Mu聚合酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶、VENT聚合酶、Taq聚合酶和/或其任何组合、衍生物和变体(例如，经工程改造的突变体)。在一些实施方案中，测定还可包括扩增模板化连接产物(例如，通过多路复用PCR)。
在一些实施方案中，与捕获的RNA的互补链(例如，cDNA)具有序列互补性的寡核苷酸可以与cDNA结合。例如，与一种或多种目的cDNA具有序列互补性的生物素化寡核苷酸与cDNA结合并且可以使用本领域已知的多种方法中的任何一种(例如，链霉亲和素珠)使用生物素化-链霉亲和素亲和性来选择。
或者，可以使用多种方法中的任何一种来向下选择(例如，去除)一种或多种RNA物种。例如，可将探针施用到样品，其选择性地与核糖体RNA(rRNA)杂交，从而减少样品中rRNA的池和浓度。另外并且替代地，双链特异性核酸酶(DSN)处理可以去除rRNA(参见例如Archer等人,Selective and flexible depletion of problematic sequences fromRNA-seq libraries at the cDNA stage,BMC Genomics,15 401,(2014)，其全部内容通过引用并入本文)。此外，羟基磷灰石色谱可以去除丰富的物种(例如，rRNA)(参见例如Vandernoot,V.A.,cDNA normalization by hydroxyapatite chromatography to enrichtranscriptome diversity in RNA-seq applications,Biotechniques,53(6)373-80,(2012)，其全部内容通过引用并入本文)。
生物样品可以包含一种或多种目的分析物。提供了用于进行多路复用测定以分析单个生物样品中的两种或更多种不同分析物的方法。
B.分析物
可以使用本文公开的方法和组合物来检测和分析多种不同的分析物。在一些方面，分析物可以包括待分析的任何生物物质、结构、部分或组分。在一些方面，本文公开的靶标可以类似地包括任何目的分析物。在一些实例中，可以直接或间接地检测靶标或分析物。
分析物可以源自特定类型的细胞和/或特定的亚细胞区域。例如，分析物可以源自胞质溶胶，源自细胞核，源自线粒体，源自微粒体，更通常地，源自细胞的任何其他区室、细胞器或部分。可以使用特异性地靶向某些细胞区室和细胞器的透化剂来从细胞选择性地释放供分析的分析物，和/或允许一种或多种试剂(例如，用于分析物检测的探针)及于细胞或细胞区室或细胞器中的分析物。
分析物可以包括任何生物分子、大分子或化学化合物，包括蛋白质或肽、脂质或核酸分子，或小分子，包括有机或无机分子。分析物可以是细胞或微生物，包括病毒或其片段或产物。分析物可以是可以为其开发特异性结合配偶体(例如亲和性结合配偶体)的任何物质或实体。这样的特异性结合配偶体可以是核酸探针(对于核酸分析物)并且可以直接导致RCA模板(例如，挂锁或其他可环化探针)的生成。或者，可以将特异性结合配偶体偶联至核酸，其可使用RCA策略检测，例如在使用或生成可以是RCA模板的环状核酸分子的测定中。
特别感兴趣的分析物可以包括核酸分子，如DNA(例如，基因组DNA、线粒体DNA、质体DNA、病毒DNA等)和RNA(例如，mRNA、microRNA、rRNA、snRNA、病毒RNA等)和合成和/或经修饰的核酸分子(例如，包括包含合成或经修饰的核苷酸如LNA、PNA、吗啉代物等或者由合成或经修饰的核苷酸如LNA、PNA、吗啉代物等组成的核酸结构域)、蛋白质分子如肽、多肽、蛋白质或朊病毒或任何包括蛋白质或多肽组分的分子等或其片段、或脂质或碳水化合物分子、或任何包含脂质或碳水化合物组分的分子。分析物可以是含有两个或更多个分子亚基的单个分子或复合物，例如包括但不限于蛋白质-DNA复合物，其可以或可以不彼此共价结合，并且其可以相同或不同。因此，除了细胞或微生物之外，这样的复合物分析物也可以是蛋白质复合物或蛋白质相互作用。这样的复合物或相互作用因此可以是同源多聚体或异源多聚体。分子的聚集体，例如蛋白质，也可以是靶标分析物，例如相同蛋白质或不同蛋白质的聚集体。分析物还可以是蛋白质或肽与核酸分子如DNA或RNA之间的复合物，例如蛋白质与核酸之间的相互作用，例如调节因子，如转录因子，以及DNA或RNA。
(i)内源性分析物
在一些实施方案中，本文的分析物对于生物样品是内源性的并且可以包括核酸分析物和非核酸分析物。可以以任何合适的组合使用本文公开的方法和组合物来分析核酸分析物(例如，使用与核酸分析物直接或间接地杂交的核酸探针或探针组)和/或非核酸分析物(例如，使用包含报告寡核苷酸并且与非核酸分析物直接或间接地结合的标记剂)。
非核酸分析物的实例包括但不限于脂质、碳水化合物、肽、蛋白质、糖蛋白(N-连接或O-连接)、脂蛋白、磷蛋白、蛋白质的特定磷酸化或乙酰化变体、蛋白质的酰胺化变体、蛋白质的羟基化变体、蛋白质的甲基化变体、蛋白质的泛素化变体、蛋白质的硫酸化变体、病毒外壳蛋白、胞外和胞内蛋白、抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，分析物在细胞内部或细胞表面上，如跨膜分析物或附着于细胞膜的分析物。在一些实施方案中，分析物可以是细胞器(例如，细胞核或线粒体)。在一些实施方案中，分析物为胞外分析物，如分泌的分析物。示例性的分析物包括但不限于受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白通道、蛋白泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞-细胞相互作用蛋白质复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化的T细胞受体、T细胞受体、B细胞受体、嵌合抗原受体、胞外基质蛋白、细胞表面蛋白的翻译后修饰(例如，磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化或脂化)状态、间隙连接和粘附连接。
核酸分析物的实例包括DNA分析物如单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、基因组DNA、甲基化DNA、特定甲基化DNA序列、片段化DNA、线粒体DNA、原位合成PCR产物和RNA/DNA杂交体。DNA分析物可以是存在于组织样品中的另一核酸分子(例如，DNA或RNA如mRNA)的转录物。
核酸分析物的实例还包括RNA分析物如各种类型的编码和非编码RNA。不同类型的RNA分析物的实例包括信使RNA(mRNA)，包括新生RNA、pre-mRNA、初级转录物RNA和加工的RNA，如加帽的mRNA(例如，具有5'7-甲基鸟苷帽)、多聚腺苷酸化mRNA(3'末端处的poly-A尾)和其中一个或更多个内含子已被去除的剪接的mRNA。本文公开的分析物中还包括非加帽的mRNA、非多腺苷酸化的mRNA和非剪接的mRNA。RNA分析物可以是存在于组织样品中的另一核酸分子(例如，DNA或RNA如病毒RNA)的转录物。未翻译成蛋白质的非编码RNA(ncRNA)的实例包括转移RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)，以及小的非编码RNA如microRNA(miRNA)、小的干扰RNA(siRNA)、Piwi-相互作用RNA(piRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、小核RNA(snRNA)、细胞外RNA(exRNA)、小的Cajal体特异性RNA(scaRNA)和长的ncRNA如Xist和HOTAIR。RNA可以是小的(例如，长度小于200个核酸碱基)或大的(例如，长度大于200个核酸碱基的RNA)。小的RNA的实例包括5.8S核糖体RNA(rRNA)、5S rRNA、tRNA、miRNA、siRNA、snoRNA、piRNA、tRNA衍生的小RNA(tsRNA)和小rDNA衍生的RNA(srRNA)。RNA可以是双链RNA或单链RNA。RNA可以是环状RNA。RNA可以是细菌rRNA(例如，16s rRNA或23s rRNA)。
在本文描述的一些实施方案中，分析物可以是变性核酸，其中所得变性核酸是单链的。可以例如任选地使用甲酰胺、热或甲酰胺和热两者使核酸变性。在一些实施方案中，核酸未被变性即用于本文公开的方法中。
在某些实施方案中，可以从活细胞中提取分析物。可以调节处理条件以确保生物样品在分析期间保持活性，并从样品的活细胞中提取(或释放)分析物。活细胞来源的分析物可以只从样品中获得一次，或者可以每隔一段时间从继续保持活体状态的样品中获得。
可以使用本文公开的方法和组合物来分析任何数目的分析物。例如，分析的分析物的数目可以是存在于样品的区域中或基材的单个特征内的至少约2种、至少约3种、至少约4种、至少约5种、至少约6种、至少约7种、至少约8种、至少约9种、至少约10种、至少约11种、至少约12种、至少约13种、至少约14种、至少约15种、至少约20种、至少约25种、至少约30种、至少约40种、至少约50种、至少约100种、至少约1,000种、至少约10,000种、至少约100,000种或更多种不同的分析物。
在本文描述的任何实施方案中，分析物包含靶标序列。在一些实施方案中，靶标序列可以是样品内源性的、在样品中生成的、添加到样品中的、或与样品中的分析物相关联的。在一些实施方案中，靶标序列为单链靶标序列(例如，滚环扩增产物中的序列)。在一些实施方案中，分析物包含一个或更多个单链靶标序列。在一个方面，第一单链靶标序列与第二单链靶标序列不相同。在另一个方面，第一单链靶标序列与一个或更多个第二单链靶标序列相同。在一些实施方案中，所述一个或更多个第二单链靶标序列包含在与第一单链靶标序列相同的分析物(例如，核酸)中。或者，所述一个或更多个第二单链靶标序列包含在与第一单链靶标序列不同的分析物(例如，核酸)中。
(ii)标记剂
在一些实施方案中，本文提供了使用一种或多种标记剂分析样品中的内源性分析物(例如，RNA、ssDNA和细胞表面或细胞内蛋白质和/或代谢物)的方法和组合物。在一些实施方案中，分析物标记剂可包括与分析物(例如，样品中的内源性分析物)相互作用的试剂。在一些实施方案中，标记剂可以包含指示分析物或其与标记剂相互作用的部分的报告寡核苷酸。例如，报告寡核苷酸可以包含允许鉴别标记剂的条形码序列。在一些情况下，与标记剂接触的样品可以进一步与和标记剂的报告寡核苷酸杂交的探针(例如，单链探针序列)接触，以鉴别与标记剂相关联的分析物。在一些实施方案中，分析物标记剂包含分析物结合部分和标记剂条形码结构域，所述标记剂条形码结构域包含一个或更多个条形码序列，例如对应于分析物结合部分和/或分析物的条形码序列。分析物结合部分条形码包括与分析物结合部分相关联或以其他方式鉴别分析物结合部分的条形码。在一些实施方案中，通过鉴别其相关联的分析物结合部分条形码来鉴别分析物结合部分，分析物结合部分所结合的分析物也可被鉴别。分析物结合部分条形码可以是给定长度的核酸序列和/或与分析物结合部分相关联的序列。分析物结合部分条形码通常可以包括本文描述的条形码的多个方面中的任何一个。
在一些实施方案中，所述方法包括在使样品与一种或多种标记剂接触之后的一个或更多个后固定(post-fixing，也称为post-fixation)步骤。
在本文描述的方法和系统中，可以使用能够与一种或多种特征结合或以其他方式偶联的一种或多种标记剂来表征分析物、细胞和/或细胞特征。在一些情况下，细胞特征包括细胞表面特征。分析物可包括但不限于蛋白质、受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白通道、蛋白泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞-细胞相互作用、蛋白复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化的T细胞受体、T细胞受体、B细胞受体、嵌合抗原受体、间隙连接和粘附连接或它们的任何组合。在一些情况下，细胞特征可以包括细胞内分析物，诸如蛋白质、蛋白质修饰(例如，磷酸化状态或其他翻译后修饰)、核蛋白、核膜蛋白或它们的任何组合。
在一些实施方案中，分析物结合部分可以包括能够与分析物(例如，生物分析物，例如大分子组分)结合的任何分子或部分。标记剂可以包括但不限于蛋白质、肽、抗体(或其表位结合片段)、亲脂部分(诸如胆固醇)、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性T细胞衔接体、T细胞受体衔接体、B细胞受体衔接体、抗体前药、适体、单抗体、affimer、darpin和蛋白质支架或它们的任何组合。标记剂可以包括(例如，连接至)报告寡核苷酸，该报告寡核苷酸指示结合基团所结合的细胞表面特征。例如，报告寡核苷酸可以包含允许鉴别标记剂的条形码序列。例如，对一种类型的细胞特征(例如，第一细胞表面特征)具有特异性的标记剂可以具有与之偶联的第一报告寡核苷酸，而对不同细胞特征(例如，第二细胞表面特征)具有特异性的标记剂可以具有与之偶联的不同报告寡核苷酸。关于示例性标记剂、报告寡核苷酸和使用方法的描述，参见例如美国专利10,550,429；美国专利公开20190177800；以及美国专利公开20190367969，这些专利均全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，分析物结合部分包括一种或多种抗体或其抗原结合片段。包括分析物结合部分的抗体或抗原结合片段可以与靶标分析物特异性地结合。在一些实施方案中，分析物为蛋白质(例如，生物样品(例如，细胞)表面上的蛋白质或细胞内蛋白质)。在一些实施方案中，包含多个分析物结合部分的多个分析物标记剂结合生物样品中存在的多个分析物。在一些实施方案中，所述多个分析物包括单一物种的分析物(例如，单一物种的多肽)。在其中所述多个分析物包括单一物种的分析物的一些实施方案中，所述多个分析物标记剂的分析物结合部分是相同的。在其中所述多个分析物包括单一物种的分析物的一些实施方案中，所述多个分析物标记剂的分析物结合部分是不同的(例如，所述多个分析物标记剂的成员可以具有两个或更多个物种的分析物结合部分，其中所述两个或更多个物种的分析物结合部分中的每一个都结合单一物种的分析物，例如在不同的结合位点处)。在一些实施方案中，所述多个分析物包括多个不同物种的分析物(例如，多个不同物种的多肽)。
在其他情况下，例如为了促进样品复用，对特定细胞特征具有特异性的标记剂可以具有偶联至第一报告寡核苷酸的第一多种标记剂(例如，抗体或亲脂部分)和偶联至第二报告寡核苷酸的第二多种标记剂。
在一些方面，这些报告寡核苷酸可以包含一定核酸条形码序列，所述核酸条形码序列允许鉴别报告寡核苷酸与之偶联的标记剂。将寡核苷酸选择为报告子可以提供以下优点：能够在序列方面产生显著多样性，同时还可易于连接至大多数生物分子(例如，抗体等)，而且易于进行检测(例如，使用测序或阵列技术)。
报告寡核苷酸连接(偶联)至标记剂可以通过多种直接或间接、共价或非共价缔合或连接中的任何一种来实现。例如，寡核苷酸可以使用化学缀合技术(例如，可从InnovaBiosciences获得的抗体标记试剂盒)共价连接至标记剂(诸如蛋白质，例如抗体或抗体片段)的一部分，以及使用其他非共价连接机制进行连接，例如使用生物素酰化抗体和带有亲和素或链霉亲和素接头的寡核苷酸(或包括偶联至寡核苷酸的一个或更多个生物素酰化接头的珠粒)。抗体和寡核苷酸生物素酰化技术是可用的。参见例如Fang等人,“Fluoride-Cleavable Biotinylation Phosphoramidite for 5′-end-Labelling andAffinity Purification of Synthetic Oligonucleotides,”Nucleic Acids Res.2003年1月15日；31(2):708-715，该文献全文以引用方式并入本文以用于所有目的。同样，蛋白质和肽生物素酰化技术已经被开发并且是现成的。参见例如美国专利号6,265,552，该专利全文以引用方式并入本文以用于所有目的。此外，可以使用点击反应化学来将报告寡核苷酸偶联至标记剂。可商购获得的试剂盒(诸如来自Thunderlink和Abcam的那些)以及本领域中常见的技术可以在适当时用于将报告寡核苷酸偶联至标记剂。在另一个实例中，标记剂间接(例如，经由杂交)偶联至报告寡核苷酸，该报告寡核苷酸包含鉴别该标记剂的条形码序列。例如，标记剂可以直接偶联(例如，共价结合)至杂交寡核苷酸，该杂交寡核苷酸包含与报告寡核苷酸的序列杂交的序列。杂交寡核苷酸与报告寡核苷酸的杂交将标记剂偶联至报告寡核苷酸。在一些实施方案中，诸如在施加刺激时，报告寡核苷酸可从标记剂释放。例如，报告寡核苷酸可以通过不稳定键(例如，化学不稳定、光不稳定、热不稳定等)连接至标记剂，如本文其他地方针对从支持物释放分子大体描述的。在一些情况下，本文描述的报告寡核苷酸可以包括可用于后续处理中的一个或更多个功能序列，如衔接子序列、独特分子标识符(UMI)序列、测序仪特异性流动池连接序列(如P5、P7或者部分P5或P7序列)、引物或引物结合序列、测序引物或引物结合序列(如R1、R2或者部分R1或R2序列)。
在一些情况下，标记剂可以包含报告寡核苷酸和标签。标签可以是荧光团、放射性同位素、能够发生比色反应的分子、磁性颗粒或者能够检测的任何其他合适的分子或化合物。标签可以直接或间接缀合至标记剂(或报告寡核苷酸)(或，标签可以缀合至可结合于标记剂或报告寡核苷酸的分子)。在一些情况下，标签缀合至与报告寡核苷酸的序列互补(例如，杂交)的第一寡核苷酸。
在一些实施方案中，可以随后将来自生物样品的多个不同物种的分析物(例如，多肽)与生物样品的一个或更多个物理性质相关联。例如，可以将所述多个不同物种的分析物与生物样品中的分析物的位置相关联。可以与其他空间信息(例如，来自生物样品的遗传信息，如DNA序列信息、转录组学信息(即，转录物的序列)或两者)相关联地使用这样的信息(例如，当分析物结合部分识别多肽时的蛋白质组学信息)。例如，可以将细胞的细胞表面蛋白与细胞的一个或更多个物理性质(例如，细胞的形状、大小、活性或类型)相关联。可以通过对细胞成像来表征所述一个或更多个物理性质。细胞可以被分析物标记剂结合，该分析物标记剂包含与细胞表面蛋白结合的分析物结合部分和鉴别该分析物结合部分的分析物结合部分条形码。可以将样品(例如，组织样品或细胞)中蛋白质分析的结果与样品中的DNA和/或RNA分析相关联。
(iii)内源性分析物和/或标记剂的产物
在一些实施方案中，本文提供了用于分析生物样品中的内源性分析物和/或标记剂的一种或多种产物的方法和组合物。在一些实施方案中，分析内源性分析物(例如，病毒或细胞DNA或RNA)或其产物(例如，杂交产物、连接产物、延伸产物(例如，通过DNA或RNA聚合酶)、复制产物、转录/逆转录产物和/或扩增产物如滚环扩增(RCA)产物)。在一些实施方案中，分析与生物样品中的分析物直接或间接地结合的标记剂。在一些实施方案中，分析与生物样品中的分析物直接或间接地结合的标记剂的产物(例如，杂交产物、连接产物、延伸产物(例如，通过DNA或RNA聚合酶)、复制产物、转录/逆转录产物和/或扩增产物如滚环扩增(RCA)产物)。
a.杂交
在一些实施方案中，内源性分析物和/或标记剂的产物为杂交产物，所述杂交产物包含两个不同分子内的基本上互补或互补的核酸序列的配对，其中一个为内源性分析物或标记剂(例如，与其连接的报告寡核苷酸)。其他分子可以是另一个内源性分子或外源性分子如探针。配对可以通过其中核酸序列通过碱基配对与基本上或完全互补的序列联结形成杂交复合物的任何过程来实现。就杂交的目的而言，如果它们的各个碱基中的至少60％(例如，至少70％、至少80％或至少90％)彼此互补，则两个核酸序列是“基本上互补的”。
可以使各种探针和探针组与内源性分析物和/或标记剂杂交，并且每个探针可以包含一个或更多个条形码序列。示例性的加有条形码的探针或探针组可以基于挂锁探针、带间隙的挂锁探针、SNAIL(Splint Nucleotide Assisted Intramolecular Ligation)探针组、PLAYR(Proximity Ligation Assay for RNA)探针组、PLISH(Proximity Ligationin situ Hybridization)探针组和RNA-模板连接探针。具体的探针或探针组设计可以变化。
b.连接
在一些实施方案中，内源性分析物和/或标记剂的产物为连接产物。在一些实施方案中，连接产物在两个或更多个内源性分析物之间形成。在一些实施方案中，连接产物在内源性分析物与标记剂之间形成。在一些实施方案中，连接产物在两个或更多个标记剂之间形成。在一些实施方案中，连接产物为内源性分析物的分子内连接。在一些实施方案中，连接产物为标记剂或探针的分子内连接，例如，可环化探针或探针组在与靶标序列杂交后的环化。靶标序列可以包含在内源性分析物(例如，核酸如基因组DNA或mRNA)或其产物(例如，来自细胞mRNA转录物的cDNA)中，或包含在标记剂(例如，报告寡核苷酸)或其产物中。
在一些实施方案中，本文提供了一种能够进行DNA模板连接的探针或探针组，如来自cDNA分子。参见例如美国专利8,551,710，其通过引用以其全文并入本文。在一些实施方案中，本文提供了一种能够进行RNA模板连接的探针或探针组。参见例如美国专利公开2020/0224244，其通过引用以其全文并入本文。在一些实施方案中，探针组为SNAIL探针组。参见例如美国专利公开20190055594，其通过引用以其全文并入本文。
在一些实施方案中，本文提供了一种多路复用的邻近连接测定。参见例如美国专利公开20140194311，其通过引用以其全文并入本文。在一些实施方案中，本文提供了一种能够邻近连接的探针或探针组，例如针对RNA(例如，PLAYR)探针组的邻近连接测定。参见例如美国专利公开20160108458，其通过引用以其全文并入本文。在一些实施方案中，可以使环状探针与靶标核酸间接杂交。在一些实施方案中，环状构建体由能够进行邻近连接的探针组形成，例如邻近连接原位杂交(PLISH)探针组。参见例如美国专利公开2020/0224243，其通过引用以其全文并入本文。
在一些实施方案中，可以使用探针如挂锁探针来分析报告寡核苷酸，其可以使用邻近连接生成或经受邻近连接。在一些实例中，可以使用原位杂交(例如，顺序杂交)和/或原位测序(例如，使用挂锁探针和连接的挂锁探针的滚环扩增)来分析特异性识别蛋白质的标记剂的报告寡核苷酸。此外，标记剂和/或其补体和/或其产物(例如，杂交产物、连接产物、延伸产物(例如，通过DNA或RNA聚合酶)、复制产物、转录/逆转录产物和/或扩增产物)的报告寡核苷酸可以由另一种标记剂识别并分析。
在一些实施方案中，分析物(核酸分析物或非核酸分析物)可以被两种标记剂(例如，抗体)特异性结合，其中每一种都附接到可以参与连接、复制和序列解码反应的报告寡核苷酸(例如，DNA)，例如使用探针或探针组(例如，挂锁探针、SNAIL探针组、环状探针、或挂锁探针和连接体)。在一些实施方案中，探针组可以包含两个或更多个探针寡核苷酸，每个探针寡核苷酸包含彼此互补的区域。例如，邻近连接反应可以包括附接到抗体对的报告寡核苷酸，如果抗体已经彼此靠近，则所述抗体对可以通过连接联结，例如通过结合相同的靶蛋白(复合物)，然后使用形成的DNA连接产物来模板化PCR扩增，如例如等人,Methods.(2008),45(3):227-32中所述，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，邻近连接反应可以包括附接到各自与结合对或复合物的一个成员结合的抗体的报告寡核苷酸，例如以分析结合对或复合物的成员之间的结合。关于使用邻近的寡核苷酸检测分析物，参见例如美国专利申请公开号2002/0051986，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，邻近的两种分析物可以被两种标记剂(例如，抗体)特异性结合，这两种标记剂中的每一种都附接到报告寡核苷酸(例如，DNA)，所述报告寡核苷酸在与它们各自的靶标结合时而邻近时可以参与连接、复制和/或序列解码反应
在一些实施方案中，一种或多种报告寡核苷酸(和任选地一种或多种其他核酸分子如连接体)有助于探针的连接。连接后，探针可形成环化探针。在一些实施方案中，可以使用并连接一种或多种合适的探针，其中所述一种或多种探针包含与一种或多种报告寡核苷酸(或其一部分)互补的序列。探针可包含一个或更多个条形码序列。在一些实施方案中，所述一种或多种报告寡核苷酸可以充当环化探针的滚环扩增(RCA)的引物。在一些实施方案中，使用所述一种或多种报告寡核苷酸以外的核酸充当环化探针的滚环扩增(RCA)的引物。例如，可以使用能够在与所述一种或多种报告寡核苷酸杂交的序列以外的序列处与环化探针杂交的核酸作为RCA的引物。在其他实例中，使用SNAIL探针组中的引物作为RCA的引物。
在一些实施方案中，一种或多种分析物可以被两种一抗特异性结合，每种一抗又被各自附接到报告寡核苷酸(例如，DNA)的二抗识别。每个核酸分子都可以帮助探针的连接形成环化探针。在一些情况下，探针可包含一个或更多个条形码序列。此外，报告寡核苷酸可以充当环化探针的滚环扩增的引物。可以使用本文公开的用于原位分析的任何合适的方法来分析核酸分子、环化探针和RCA产物。
在一些实施方案中，连接涉及化学连接。在一些实施方案中，连接涉及模板依赖性连接。在一些实施方案中，连接涉及模板非依赖性连接。在一些实施方案中，连接涉及酶促连接。
在一些实施方案中，酶促连接涉及连接酶的使用。在一些方面，本文使用的连接酶包括通常用来将多核苷酸联结在一起或联结单个多核苷酸的末端的酶。可以使用RNA连接酶、DNA连接酶或另一种类型的连接酶来将两个核苷酸序列连接在一起。连接酶包括ATP依赖性双链多核苷酸连接酶、NAD-i依赖性双链DNA或RNA连接酶和单链多核苷酸连接酶，例如EC 6.5.1.1(ATP依赖性连接酶)、EC 6.5.1.2(NAD+依赖性连接酶)、EC 6.5.1.3(RNA连接酶)中描述的任何连接酶。连接酶的具体实例包括细菌连接酶如大肠杆菌DNA连接酶、TthDNA连接酶、嗜热球菌(菌株9°N)DNA连接酶(9°NTM DNA连接酶，New England Biolabs)、TaqDNA连接酶、AmpligaseTM(Epicentre Biotechnologies)和噬菌体连接酶如T3 DNA连接酶、T4 DNA连接酶和T7 DNA连接酶及其突变体。在一些实施方案中，连接酶为T4 RNA连接酶。在一些实施方案中，连接酶为splintR连接酶。在一些实施方案中，连接酶为单链DNA连接酶。在一些实施方案中，连接酶为T4 DNA连接酶。在一些实施方案中，连接酶为具有DNA夹板式DNA连接酶活性的连接酶。在一些实施方案中，连接酶为具有RNA夹板式DNA连接酶活性的连接酶。
在一些实施方案中，本文的连接为直接连接。在一些实施方案中，本文的连接为间接连接。“直接连接”指的是多核苷酸的末端彼此紧邻杂交以形成连接酶的底物，从而导致它们彼此连接(分子内连接)。或者，“间接”指的是多核苷酸的末端彼此不邻近地杂交，即，由一个或更多个介于中间的核苷酸或“间隙”分开。在一些实施方案中，所述末端不彼此直接连接，而是经由一个或更多个介于中间的(所谓的“间隙”或“间隙填充”(寡)核苷酸)的居间性或通过延伸探针的3’末端以“填充”对应于所述介于中间的核苷酸的“间隙”而发生(分子间连接)。在一些情况下，多核苷酸的杂交末端之间一个或更多个核苷酸的间隙可以由与夹板、挂锁探针或靶标核酸互补的一个或更多个“间隙”(寡)核苷酸“填充”。间隙可以是1至60个核苷酸的间隙或1至40个核苷酸的间隙或3至40个核苷酸的间隙。在特定的实施方案中，间隙可以是约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸、指示值之间任何整数(或整数范围)的核苷酸的间隙。在一些实施方案中，所述末端区域之间的间隙可以由间隙寡核苷酸或通过延伸多核苷酸的3’末端来填充。在一些情况下，连接涉及将探针的末端连接到至少一个间隙(寡)核苷酸，使得间隙(寡)核苷酸并入到所得多核苷酸中。在一些实施方案中，本文的连接之前是间隙填充。在其他实施方案中，本文的连接不需要间隙填充。
在一些实施方案中，多核苷酸的连接产生熔融温度高于未连接多核苷酸的多核苷酸。因此，在一些方面，在包括扩增和检测的后续步骤之前，连接使含有连接的多核苷酸的杂交复合物稳定化。
在一些方面，使用高保真度连接酶，如热稳定的DNA连接酶(例如，Taq DNA连接酶)。热稳定的DNA连接酶在升高的温度下是活性的，从而允许通过在接近DNA链的熔融温度(Tm)的温度下温育连接来进一步区分。这选择性地降低退火的完全碱基配对底物上退火的错配底物的浓度(预计在错配周围具有略低的Tm)。因此，可以通过连接酶活性位点的固有选择性与平衡条件的组合来降低退火的错配dsDNA的发生率，从而实现高保真度连接。
在一些实施方案中，本文的连接是例如通过酶促手段(例如，连接酶)使彼此邻近的两个(或更多个)核酸序列连接起来的邻近连接。在一些实施方案中，邻近连接可以包括“间隙填充”步骤，其涉及基于模板核酸分子的核酸序列通过聚合酶跨越两个目的核酸分子之间的距离并入一种或多种核酸(参见例如美国专利号7,264,929，其全部内容通过引用并入本文)。可以使用各种不同的方法来邻近连接核酸分子，包括(但不限于)“粘端”和“平端”连接。另外，可以使用单链连接来在单链核酸分子上进行邻近连接。粘端邻近连接涉及在连接事件本身之前待连接的两个核酸分子之间互补的单链序列的杂交。平端邻近连接通常不包括来自每个核酸分子的互补区的杂交，因为两个核酸分子在连接位点处均缺乏单链突出端。
c.引物延伸和扩增
在一些实施方案中，产物为分析物、标记剂、与分析物结合的探针或探针组(例如，与基因组DNA、mRNA或cDNA结合的挂锁探针)或与标记剂结合的探针或探针组(例如，与来自相同或不同标记剂的一个或更多个报告寡核苷酸结合的挂锁探针)的引物延伸产物。
引物通常是具有3’末端的单链核酸序列，所述3’末端可以用作核酸延伸反应中的核酸聚合酶的底物。RNA引物由RNA核苷酸形成并用于RNA合成中，而DNA引物由DNA核苷酸形成并用于DNA合成中。引物还可以包括RNA核苷酸和DNA核苷酸两者(例如，以随机或设计的模式)。引物还可以包括本文描述的可以具有另外的功能性的其他天然或合成核苷酸。在一些实例中，可以使用DNA引物来引发RNA合成，反之亦然(例如，可以使用RNA引物来引发DNA合成)。引物的长度可以变化。例如，引物可以是约6个碱基至约120个碱基。例如，引物可以包括至多约25个碱基。在一些情况下，引物可以指引物结合序列。引物延伸反应通常是指其中两个核酸序列通过其各自的末端互补核酸序列(即，例如，3’末端)的重叠而连接(例如，杂交)的任何方法。这样的连接之后可以是使用另一核酸序列作为延伸模板进行的一个或两个末端的核酸延伸(例如，酶促延伸)。酶促延伸可以通过包括但不限于聚合酶和/或逆转录酶的酶进行。
在一些实施方案中，内源性分析物和/或标记剂的产物为一种或多种多核苷酸的扩增产物，例如环状探针或可环化探针或探针组。在一些实施方案中，扩增通过进行滚环扩增(RCA)来实现。在其他实施方案中，添加与环状探针或环化探针杂交的引物并原样用于扩增。在一些实施方案中，RCA包括线性RCA、分支RCA、树突RCA或其任何组合。
在一些实施方案中，扩增在约20℃至约60℃之间的温度下进行。在一些实施方案中，扩增在约30℃至约40℃之间的温度下进行。在一些方面，扩增步骤如滚环扩增(RCA)在25℃或约25℃至50℃或约50℃之间的温度下进行，如在或约25℃、27℃、29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃、41℃、43℃、45℃、47℃或49℃。
在一些实施方案中，在存在适当的dNTP前体和其他辅因子的情况下添加DNA聚合酶后，引物被延长以产生环状模板的多个拷贝。该扩增步骤可以利用等温扩增或非等温扩增。在一些实施方案中，在杂交复合物的形成和扩增探针的缔合之后，杂交复合物被滚环扩增以生成含有cDNA的多个拷贝的cDNA纳米球(即，扩增子)。用于滚环扩增(RCA)的技术是本领域已知的，如线性RCA、分支RCA、树突RCA或其任何组合。(参见例如Baner等人,NucleicAcids Research,26:5073-5078,1998；Lizardi等人,Nature Genetics 19:226,1998；Mohsen等人,Acc Chem Res.2016November 15；49(11):2540–2550；Schweitzer等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA 97:101 13-1 19,2000；Faruqi等人,BMC Genomics 2:4,2000；Nallur等人,Nucl.Acids Res.29:el 18,2001；Dean等人,Genome Res.1 1:l095-1099,2001；Schweitzer等人,Nature Biotech.20:359-365,2002；美国专利号6,054,274、6,291,187、6,323,009、6,344,329和6,368,801)。用于RCA中的示例性聚合酶包括DNA聚合酶如phi29聚合酶、Klenow片段、嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶(BST)、T4 DNA聚合酶、T7DNA聚合酶或DNA聚合酶I。在一些方面，可以采用已经工程化或突变以具有所需特征的DNA聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶为phi29 DNA聚合酶。
在一些方面，在扩增步骤期间，可以向反应中添加经修饰的核苷酸以将经修饰的核苷酸并入到扩增产物(例如，纳米球)中。经修饰的核苷酸的示例包括经胺修饰的核苷酸。在方法的一些方面中，例如，用于将生成的扩增产物(例如，纳米球)锚定或交联到支架、到细胞结构和/或到其他扩增产物(例如，其他纳米球)。在一些方面，扩增产物包含经修饰的核苷酸，如经胺修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经胺修饰的核苷酸包含丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺部分修饰。其他经胺修饰的核苷酸的实例包括但不限于5-氨基烯丙基-dUTP部分修饰、5-丙炔基氨基-dCTP部分修饰、N6-6-氨基己基-dATP部分修饰或7-去氮杂-7-丙炔基氨基-dATP部分修饰。
在一些方面，多核苷酸和/或扩增产物(例如，扩增子)可以锚定到聚合物基质。例如，聚合物基质可以是水凝胶。在一些实施方案中，多核苷酸探针中的一个或更多个可以经修饰以含有可用作锚定位点以将多核苷酸探针和/或扩增产物附接到聚合物基质的官能团。可以根据所提供的实施方案采用的示例性修饰和聚合物基质包括在例如US 2021/0324450、US 2021/0363579、US 2016/0024555、US 2018/0251833和US 2017/0219465中描述的那些。在一些实例中，支架还含有可以与探针组或扩增产物的修饰或官能团反应或并入探针组或扩增产物的修饰或官能团的修饰或官能团。在一些实例中，支架可以包含寡核苷酸、聚合物或化学基团，以提供基质和/或支撑结构。
扩增产物可以固定在基质内，通常在被扩增核酸的位置处，从而产生局部化的扩增子集落。扩增产物可以通过空间因子固定在基质内。扩增产物也可以通过共价或非共价键合固定在基质内。以这种方式，可以认为扩增产物附接到基质。通过固定到基质，如通过共价键合或交联，原始扩增子的大小和空间关系得以保持。通过固定到基质，如通过共价键合或交联，扩增产物对机械应力下的移动或解体具有抗性。
在一些方面，扩增产物与周围基质共聚和/或共价附接，从而保持它们的空间关系和其固有的任何信息。例如，如果扩增产物为由包埋在基质中的细胞内的DNA或RNA生成的那些，则扩增产物也可以被官能化以形成与保留了其在细胞内的空间信息的基质共价附接，从而提供亚细胞定位分布模式。在一些实施方案中，所提供的方法涉及在水凝胶子单元的存在下包埋所述一个或更多个多核苷酸探针组和/或扩增产物以形成一个或更多个水凝胶包埋的扩增产物。在一些实施方案中，所描述的水凝胶组织化学包括将核酸共价附接到原位合成的水凝胶以进行组织清理、酶扩散和多周期测序，而现有的水凝胶组织化学方法则不能。在一些实施方案中，为了使得扩增产物能够包埋在组织-水凝胶环境中，将经胺修饰的核苷酸包含在扩增步骤(例如，RCA)中，使用丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯用丙烯酰胺部分官能化，并与丙烯酰胺单体共聚以形成水凝胶。
在一些实施方案中，RCA模板可以包含靶标分析物或其一部分，其中靶标分析物为核酸，或者其可以作为分析物的代替物或标志物提供或生成。如上所述，已知许多测定用于检测许多不同的分析物，它们使用基于RCA的检测系统，例如，其中通过从测定中提供或生成的环状RCA模板生成RCP来提供信号并检测RCP以检测分析物。因此，RCP可被视为被检测以检测靶标分析物的报告子。然而，RCA模板也可被视为靶标分析物的报告子；RCP基于RCA模板生成，并且包含RCA模板的互补拷贝。RCA模板确定检测到的信号，并因此指示靶标分析物。如下文将更详细地描述的，RCA模板可以是探针、或探针的一部分或组分、或可由探针生成，或者其可以是检测测定的组分(即，检测测定中的试剂)，其被用作检测的报告子、或报告子的一部分、或信号生成系统。用于生成RCP的RCA模板因此可以是环状(例如，环化的)报告核酸分子，即来自任何基于RCA的检测测定，其使用或生成环状核酸分子作为测定的报告子。由于RCA模板生成RCP报告子，故其可被视为用于测定的报告子系统的一部分。
在一些实施方案中，本文的产物包括以任何合适的组合在一系列反应中生成的分子或复合物，所述反应有例如杂交、连接、延伸、复制、转录/逆转录和/或扩增(例如，滚环扩增)。例如，包含本文公开的探针的靶标序列的产物(例如，基于吗啉代物的探针)可以是由样品中的细胞核酸和外源添加的核酸探针形成的杂交复合物。外源添加的核酸探针可以包含不与细胞核酸杂交但与另一探针(例如，可检测地标记的探针，如基于吗啉代物的探针，或可环化探针或探针组)杂交的突出端。外源添加的核酸探针可以任选地连接到细胞核酸分子或另一外源性核酸分子。在其他实例中，包含本文公开的探针(例如，基于吗啉代物的探针)的靶标序列的产物可以是可环化探针或探针组的RCP，其与细胞核酸分子(例如，基因组DNA或mRNA)或其产物(例如，转录物如cDNA、两个探针的DNA模板连接产物或两个探针的RNA模板连接产物)杂交。在其他实例中，包含本文公开的探针(例如，基于吗啉代物的探针)的靶标序列的产物可以是与RCP杂交的探针。探针可以包含不与RCP杂交但与另一探针(例如，可检测地标记的探针，如基于吗啉代物的探针)杂交的突出端。探针可以任选地连接到细胞核酸分子或另一探针，例如与RCP杂交的锚固探针。
C.靶标序列
本文公开的探针(例如，基于吗啉代物的检测探针和/或中间探针)的靶标序列可以包含在本文公开的任何分析物中，包括内源性分析物(例如，病毒或细胞核酸)、标记剂(或与其附接的报告寡核苷酸)、或与内源性分析物和/或标记剂(或与其附接的报告寡核苷酸)相关联的产物。在一些方面，靶标序列的至少一部分和由本文公开的探针包含的序列(例如，基于吗啉代物的检测探针和/或中间探针)是互补的并且能够杂交。
在一些方面，一个或更多个靶标序列包括一个或更多个条形码，例如至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个条形码。条形码可以在空间上分辨存在于生物样品中例如存在于细胞或组织样品内的分子组分。条形码可以以可逆或不可逆方式附接到分析物或另一个部分或结构。条形码可以在样品测序之前或期间加入到例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)样品的片段中。条形码可以允许鉴别和/或定量单独测序读段(例如，条形码可以是或可以包括独特分子标识符或“UMI”)。在一些方面，条形码包含约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或多于30个核苷酸。
在一些实施方案中，条形码包括一起充当单个条形码的两个或更多个子条形码。例如，多核苷酸条形码可以包括由一个或更多个非条形码序列分开的两个或更多个多核苷酸序列(例如，子条形码)。在一些实施方案中，所述一个或更多个条形码还可以提供用于靶向功能的平台，如寡核苷酸、寡核苷酸-抗体缀合物、寡核苷酸-链霉亲和素缀合物、经修饰的寡核苷酸、亲和纯化、可检测部分、酶、用于检测测定或其他功能和/或用于检测和鉴定多核苷酸的酶。
核酸分子(包括加有条形码的核酸分子或其衍生物)的序列分析可以是直接的或间接的。因此，序列分析底物(其可以被视为经受序列分析步骤或过程的分子)可以直接是加有条形码的核酸分子(例如，挂锁探针)或者它可以是自其衍生的分子(例如，其补体，如RCA产物)。
可以使用本文公开的或本领域已知的任何合适的方法来分析、检测条形码或对条形码测序。在一些实施方案中，考虑N个碱基的测序读段，N-聚体条形码序列包含4N的复杂性，并且与非条形码测序方法如直接测序相比，分子鉴别可能需要远更短的测序读段。例如，可以使用5个核苷酸的条形码序列(45＝1024)来鉴别1024个分子物种，而可以使用8个核苷酸的条形码来鉴别多达65,536个分子物种，这个数目大于人类基因组中不同基因的总数。在一些实施方案中，检测包含在探针或RCP中的条形码序列，而不是内源性序列，内源性序列可以是每个测序循环的信息方面的有效读出。因为条形码序列是预先确定的，所以它们也可以被设计成以错误检测和纠正机制为特征，参见例如US 2019/0055594和US 2021/0164039，其通过引用以其全文并入本文。
可以使用任何合适的方法或技术来分析(例如，检测或测序)条形码(例如，一级和/或二级条形码序列)，包括本文描述的那些，如靶标的RNA连续探测(RNA SPOT)、连续荧光原位杂交(seqFISH)、单分子荧光原位杂交(smFISH)、多重错误鲁棒荧光原位杂交(MERFISH)、原位测序、基于杂交的原位测序(HybISS)、靶向原位测序、荧光原位测序(FISSEQ)、边合成边测序(SBS)、边连接边测序(SBL)、边杂交边测序(SBH)或空间分辨转录物扩增子读出映射(STARmap)。
在一些实施方案中，靶标和/或加有条形码的探针的序列分析可以通过顺序杂交(例如，边杂交边测序和/或顺序原位荧光杂交)来进行。顺序荧光杂交可以涉及包含寡核苷酸和可检测标记的检测探针的顺序杂交。在一些实施方案中，本文公开的方法包括本文公开的核酸类似物探针的顺序杂交，包括可检测地标记的探针(例如，荧光团缀合寡核苷酸)和/或本身未被可检测地标记但能够结合可检测地标记的探针(例如，经由核酸杂交)并被可检测地标记的探针检测的探针。包含可检测探针的顺序荧光杂交的示例性方法见述于US2019/0161796、US 2020/0224244、US 2022/0010358、US 2021/0340618和WO 2021/138676中，所有这些文献均通过引用并入本文。
用于对遗传物质测序的方法的其他实例包括但不限于DNA杂交方法(例如，DNA印迹法)、限制性酶消化方法、Sanger测序方法、下一代测序方法(例如，单分子实时测序、纳米孔测序和Polony测序)、连接方法和微阵列方法。可以使用的测序方法的另外的实例包括靶向测序、单分子实时测序、外显子测序、基于电子显微术的测序、面板测序、晶体管介导的测序、直接测序、随机鸟枪测序、Sanger双脱氧终止测序、全基因组测序、边杂交边测序、焦磷酸测序、毛细管电泳、凝胶电泳、双链测序、循环测序、单碱基延伸测序、固相测序、高通量测序、大规模平行签名测序、低变性温度共扩增-PCR(COLD-PCR)、可逆染料终止物测序、配对末端测序、近期测序(near-term sequencing)、核酸外切酶测序、边连接边测序、短读段测序、单分子测序、边合成边测序、实时测序、反向终止子测序、纳米孔测序、454测序、Solexa基因组分析仪测序、SOLiDTM测序、MS-PET测序以及它们的任何组合。
III.原位分析
A.探针和探针杂交
在进行杂交测定(例如，原位杂交测定)时，将寡核苷酸探针退火至靶标分析物(例如，RNA或DNA)是必需的。在一些实施方案中，本文描述的方法包括使用检测探针，其中所述探针在合成主链上包含核碱基序列，并且所述探针与DNA多联体(例如，RCA)中的靶标序列直接或间接地杂交。在一些实施方案中，探针(例如，检测探针和/或中间探针)包含单链探针序列。在一些实施方案中，探针包含单链区域和任选地双链区域。在一些实施方案中，探针为寡核苷酸。在一些实施方案中，多个检测探针中的至少一些、每一个或全部为基于吗啉代物的检测探针。
靶标分析物可以是任何靶标分子，包括核酸分子，或非核酸分子的分析物，如蛋白质、肽、碳水化合物等。基于检测指示潜在靶标分析物的此类报告靶标核酸序列的各种方法在本领域中得到了良好的描述，包括例如如上所述的免疫RCA和免疫PCR，以及使用挂锁探针或邻近探针的测定。包含在探针与靶标分析物结合时相互作用的分析物结合结构域和核酸结构域的邻近探针的使用是众所周知的并在文献中有述。在邻近探针的情况下，可以通过延伸或连接邻近探针的核酸结构域或与邻近探针的核酸结构域杂交的另外的核酸分子(例如，寡核苷酸)来生成靶标核酸序列。在挂锁探针的情况下，靶标核酸序列可以作为该探针的RCP生成，或者实际上只是探针连接的结果。在免疫PCR或免疫RCA的情况下，可以生成PCR或RCA产物以提供靶标核酸序列。更进一步地，可以将靶标核酸序列作为分析物结合探针或标记剂的核酸结构域添加到样品中。
例如，样品中的蛋白质或其他分析物可以由与寡核苷酸(例如，报告寡核苷酸)一起提供的标记剂(例如，抗体或其他分析物特异性结合配偶体)检测，并且该寡核苷酸可被视为是或包含靶标核酸序列。在这种情况下，杂交探针可以被设计成与寡核苷酸杂交，使得可以检测寡核苷酸，因此可以指示抗体的存在，并因此指示分析物的存在。类似地，寡核苷酸序列可以作为分析物检测测定的一部分生成，例如，延伸或连接产物可以作为邻近测定的结果生成，并且这种寡核苷酸可被视为是靶标核酸序列。
在一些实施方案中，本文的探针(例如，检测探针和/或中间探针)与靶标序列直接杂交。在替代的实施方案中，探针与靶标序列间接杂交。在一些实施方案中，杂交原位进行。例如，探针可以与和靶标序列直接或间接地杂交的中间探针(例如，二级探针、三级探针等)杂交。检测探针可以与中间探针的第一序列直接杂交，并且中间探针包含与靶标序列直接杂交的第二序列。在一些实施方案中，探针可以在合成主链上包含一个或更多个核碱基序列和/或在糖-磷酸主链上包含一个或更多个核碱基序列，其中所述序列可以以任何合适的次序排列在探针中。在一些实施方案中，合成主链上的核碱基序列为第一探针序列，并且探针还可包括在糖-磷酸主链上包含核碱基的第二探针序列。第一探针序列可以位于第二探针序列的5’或3’处。在一些实施方案中，探针包括一个或更多个第一探针序列和/或一个或更多个第二探针序列。在一些实施方案中，第二探针序列为DNA序列、RNA序列或其组合。
探针(例如，检测探针和/或中间探针)与DNA多联体的直接或间接原位杂交可以在杂交缓冲液的存在下进行。杂交缓冲液可以提供结合的特异性(例如，在DNA多联体与探针之间)，同时保持原位检测信号强度。在一些实施方案中，杂交缓冲液包含增加DNA多联体的稳定性的试剂。在一些实施方案中，杂交缓冲液包含增加探针的稳定性的试剂。在一些实施方案中，杂交缓冲液包含增加DNA多联体与探针之间的分子间杂交的稳定性的试剂。在一些实施方案中，杂交缓冲液包含选择性地增加A:T碱基对的稳定性的试剂。例如，A:T碱基对的稳定性可以增加到近似地G:C碱基对的稳定性。在一些实施方案中，杂交缓冲液包含选择性地增加DNA多联体与探针之间的A:T碱基对的稳定性的试剂。在一些实施方案中，杂交缓冲液减少潜在的碱基对错配(如在DNA多联体与探针之间)。在一些实施方案中，杂交缓冲液改善杂交反应中的严格性。在一些实施方案中，杂交缓冲液减少背景信号(例如，非特异性结合)。在一些实施方案中，杂交缓冲液减少探针与DNA多联体的非特异性结合。
用于本文描述的杂交缓冲液中的示例性试剂可以包括但不限于水、各种非离子去污剂、盐水-柠檬酸钠(SSC)、磷酸钠、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、牛血清白蛋白(BSA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、肌氨酰化合物(例如，月桂酰肌氨酸钠；肌氨酰，铵盐；或肌氨酰，钾盐)、三(羟甲基)氨基甲烷(tris)、tris-HCl(tris盐酸盐)、3-吗啉代丙烷-1-磺酸(MOPS)、TAE缓冲液(tris EDTA)、TBS缓冲液(tris缓冲盐水)、双-tris甲烷、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES缓冲液)、二甲基亚砜(DMSO)、季铵盐(例如，四甲基氯化铵(TMAC))、三甲基苄基氯化铵(TMBAC)、四乙基氯化膦(TEPC)、三乙基苄基氯化铵(TEBAC)、四正丙基氯化铵(TPAC)、三正丁基苄基氯化铵(TBBAC)、四正丁基氯化膦(TBPC)、(3-((3-胆酰胺基丙基)二甲氨基)-1-丙磺酸盐)(3-((3-胆酰胺基丙基)二甲氨基)-1-丙磺酸盐)(CHAPS去污剂)和磷酸二氢胆碱(胆碱DHP)。用于本文描述的杂交缓冲液中的示例性试剂可以包括两性离子去污剂。用于本文描述的杂交缓冲液中的示例性试剂可以包括适合于保护生物样品中的分析物如蛋白质的天然状态的试剂。
在一些实施方案中，杂交缓冲液包含铵离子。在一些情况下，杂交缓冲液包含季铵离子。在一些实施方案中，杂交缓冲液包含TMAC。在一些实施方案中，杂交缓冲液中TMAC的浓度在0.5X TMAC至3X TMAC之间，如在3X TMAC至2X TMAC、2.5X TMAC至1.5X TMAC、或1XTMAC至0.5X TMAC中的任何之间。在一些实施方案中，杂交缓冲液包含约0.1M至约3M之间的TMAC，如约0.1M至约1M TMAC、约0.5M至约1.5M TMAC和约1M至约3M TMAC中的任何之间。在一些实施方案中，杂交缓冲液包含大于约0.1M的TMAC，如大于约0.2M TMAC、0.3M TMAC、0.4M TMAC、0.5M TMAC、0.6M TMAC、0.7M TMAC、0.8M TMAC、0.9M TMAC、1M TMAC、1.5MTMAC、2M TMAC、2.5M TMAC、3MMAC或更多中的任何一个。在一些实施方案中，杂交缓冲液包含小于约3M的TMAC，如小于约2.5M TMAC、2M TMAC、1.5M TMAC、1M TMAC、0.9M TMAC、0.8MTMAC、0.7M TMAC、0.6M TMAC、0.5M TMAC、0.4M TMAC、0.3M TMAC、0.2M TMAC、0.1M TMAC或更少中的任何一个。在一些实施方案中，杂交缓冲液包含1M的TMAC。
在一些实施方案中，探针(例如，检测探针和/或中间探针)的长度在约5至约10个核碱基之间、在约10至约20个核碱基之间、在约20至约30个核碱基之间、或在约30至约40个核碱基之间。在一些实施方案中，探针的长度为约5、10、15、20、25、30、40、45或50个核碱基。在一些实施方案中，探针的长度为约20个核碱基。在一些实施方案中，探针以任何合适的次序和组合包含核碱基A、T、C、G或U或它们的变体。探针可以包含适当排列的A、T、C、G或U碱基，用于直接或间接地与DNA多联体进行Watson-Crick碱基配对。在一些实施方案中，探针在合成主链中包含磷酰二胺键。例如，探针可以含有不带电荷的磷酰二胺子单元间键，而不是天然核酸中发现的阴离子磷酸二酯键。在一些实施方案中，探针的合成主链包含亚甲基吗啉环，其取代基于DNA和RNA寡核苷酸的检测探针的脱氧核糖(或核糖)环特征。在一些实施方案中，探针在合成主链中包含吗啉环。优选地，探针为基于吗啉代物的检测探针(图1A)。在一些实施方案中，多个检测探针中的至少一些、每一个或全部为基于吗啉代物的检测探针。
在一些实施方案中，探针(例如，检测探针和/或中间探针)的静电负性低于在糖-磷酸主链上具有相同核碱基序列的参考探针。探针可以不带电荷，或者探针可以带正电荷。例如，探针可以包含对DNA多联体的阴离子电荷或其他静电性质不敏感的合成主链。
在一些实施方案中，探针(例如，检测探针和/或中间探针)还包含任选地可修饰的可检测部分。在一些实施方案中，探针还包含一个或更多个可检测部分。在一些实施方案中，可检测部分用于直接化学、光学或酶促检测。在一些实施方案中，可检测部分为用于直接化学、光学或酶促检测或修饰的化学部分。在一些实施方案中，可检测部分为用于下游化学、光学或酶促检测的化学部分。在一些实施方案中，可检测部分为用于下游化学、光学或酶促修饰的化学部分。例如，检测探针可以被可检测地标记(例如，荧光标记，参见图1B)。在一些实施方案中，荧光标记的检测探针是不带电荷的或者静电负性低于在糖-磷酸主链上具有相同的荧光标记和核碱基序列的参考检测探针。在一些实施方案中，可检测部分与探针的3’末端缀合。在一些实施方案中，可检测部分与探针的5’末端缀合。
在一些方面，本文提供了一种方法，其包括使靶标核酸序列与和靶标序列直接或间接地杂交的中间探针(例如，二级探针、三级探针等)接触。中间探针可以是核酸类似物探针(例如，基于吗啉代物的探针)，其静电负性低于在糖-磷酸主链上具有相同核碱基序列的参考中间探针。在一些实施方案中，靶标核酸序列为细胞核酸序列，如基因组DNA序列或细胞RNA序列。在一些实施方案中，靶标核酸序列由包含细胞的样品中的内源性核酸序列(如来自mRNA的cDNA)原位产生。在一些实施方案中，一级探针与细胞靶标序列直接结合并可用于生成其产物，如扩增(RCA)产物。中间探针序列可以与靶标序列(例如，单链靶标序列)互补，从而允许中间探针与靶标序列的杂交。
在一些实施方案中，二级探针为核酸类似物探针(例如，基于吗啉代物的探针)，并且二级探针用于结合一级探针或其一部分，例如，不与靶标核酸杂交的单链突出端。在一些实施方案中，三级探针为核酸类似物探针(例如，基于吗啉代物的探针)，并且三级探针用于结合二级探针或其一部分，例如，不与一级探针杂交的单链突出端。在一些实施方案中，可以提供另外的核酸类似物探针(例如，基于吗啉代物的探针作为四级探针)。
在一些实施方案中，为核酸类似物探针(例如，基于吗啉代物的探针)的中间探针(例如，二级探针、三级探针和/或更高阶中间探针)被直接或间接地标记。在一些实施方案中，任何一个或更多个或所有中间探针可以与可检测部分共价缀合。在一些实施方案中，任何一个或更多个或所有中间探针与化学部分共价缀合。在一些实施方案中，任何一个或更多个或所有中间探针可以是核酸类似物探针(例如，基于吗啉代物的探针)并且可以用作检测寡核苷酸(例如，可检测地标记的探针)。在一些实施方案中，例如，一级探针被可检测地标记，而其靶标核酸未被可检测地标记。在一些实施方案中，例如，基于吗啉代物的二级探针被可检测地标记，而二级探针与之结合的一级探针未被可检测地标记。在一些实施方案中，例如，基于吗啉代物的三级探针被可检测地标记，而二级探针和/或一级探针未被可检测地标记。
在前述实施方案中的任何一个中，基于吗啉代物的中间探针(例如，二级探针、三级探针和/或更高阶中间探针)和/或检测探针可以是加有条形码的探针或加有条形码的探针组。
在一些方面，核酸类似物探针中的一个或更多个(例如，基于吗啉代物的检测探针和/或中间探针)包含一个或更多个条形码，例如至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个条形码。在一些方面，核酸类似物探针中的一个或更多个(例如，基于吗啉代物的检测探针和/或中间探针)包含与一个或更多个条形码互补的序列。条形码可以在空间上分辨存在于生物样品中例如存在于细胞或组织样品内的分子组分。在一些实施方案中，条形码包括一起充当单个条形码的两个或更多个子条形码。例如，多核苷酸条形码可以包括由一个或更多个非条形码序列分开的两个或更多个多核苷酸序列(例如，子条形码)。在一些实施方案中，所述一个或更多个条形码还可以提供用于靶向功能的平台，如寡核苷酸、寡核苷酸-抗体缀合物、寡核苷酸-链霉亲和素缀合物、经修饰的寡核苷酸、亲和纯化、可检测部分、酶、用于检测测定或其他功能和/或用于检测和鉴定多核苷酸的酶。在一些方面，可以使用核酸类似物探针(例如，基于吗啉代物的检测探针和/或中间探针)来检测一个或更多个条形码(例如，通过与条形码序列杂交)。
在任何前述实施方案中的一些中，所述方法还包括使用环状多核苷酸作为模板来形成扩增产物。在一些实施方案中，使用等温扩增或非等温扩增来形成扩增产物。在任何前述实施方案中的一些中，使用滚环扩增(RCA)来形成扩增产物。在一些实施方案中，RCA包括线性RCA、分支RCA、树突RCA或其任何组合。在一些实施方案中，使用核酸类似物探针(例如，基于吗啉代物的探针)中的一个或更多个来结合包含糖-磷酸主链的单链RCA产物。
在一些实施方案中，由扩增产生的DNA多联体具有约0.1μm至约0.5μm之间的直径，如约0.2μm至约0.3μm之间或约0.3μm至约0.4μm之间、约0.5μm至约1μm之间、约1μm至约1.5μm之间、或约0.1μm至约3μm之间。在一些实施方案中，DNA多联体具有约0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2μm、2.5μm或3μm的直径，或在任何前述值之间的范围内的直径。示例性DNA多联体如RCA产物见公开于Deng等人,Chem,4(6):1373-1386(2018)and Hu andKuang,Chem,4(6):1194-1196(2018)中，其通过引用以其全文并入本文。
在一些方面，本文提供了一种分析生物样品的方法，其包括：将多个检测探针与生物样品中包含多个DNA多联体的复合物直接或间接地结合，其中所述多个检测探针中的一个检测探针在合成主链上包含核碱基序列，并且所述检测探针与所述复合物中任何一个或更多个DNA多联体中的靶标序列直接或间接地结合，和检测来自所述多个结合的检测探针的信号，其中生成的信号大于在糖-磷酸主链上具有相同核碱基序列的多个参考检测探针。在一些实施方案中，同一复合物中的多个DNA多联体是同一分析物(例如，同一目的基因的DNA或RNA分子)的RCA产物或靶向同一分析物的探针的产物。在一些实例中，可以使用与同一核酸分子杂交但在同一分子内的不同序列处杂交的探针或探针组(例如，环状或挂锁探针或SNAIL探针组)来生成RCA产物。在一些实施方案中，DNA多联体复合物包含两个、三个、四个、五个或更多个DNA多联体。在一些实施方案中，DNA多联体复合物具有约0.5μm至约1μm之间、约1μm至约1.5μm之间、或约0.1μm至约3μm之间的直径。在一些实施方案中，DNA多联体复合物具有约0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2μm、2.5μm或3μm的直径，或在任何前述值之间的范围内的直径。
在一些实施方案中，DNA多联体的长度在约1至约10千碱基之间、约10至约50千碱基之间、约45至约75千碱基之间、或约75至100千碱基之间。在一些实施方案中，DNA多联体的长度为约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95或100千碱基，或在任何前述值之间的范围内。示例性DNA多联体如RCA产物见公开于Blanco等人,JBC 264(15):8935-8940(1989)中，其通过引用以其全文并入本文。在一些实施方案中，DNA多联体包含重复约100至约1,000次、约1,000至约5,000次、或约5,000至约10,000次的靶标序列。
RCA反应可用于多路复用情形或进行顺序标记的情形(例如，对每种分析物顺序生成多种产物的情形)，和/或用于结果分析，例如通过成像检测靶的情形。在一些实施方案中，所述方法还包括一系列杂交、洗涤和检测步骤以检测分析物，任选地其中分析物为RCA产物，其中探针为核酸类似物探针(例如，基于吗啉代物的检测探针或中间探针)。在一些实施方案中，一级探针为核酸探针，并使用各自包含检测部分的多个一级探针来检测具有糖-磷酸主链的靶标序列在样品内的定位。在一些实施方案中，使用一级探针的检测步骤可包括破坏(例如，通过洗涤)一级探针的结合以将它们从样品中去除。在一些实施方案中，为核酸类似物探针(例如，基于吗啉代物的探针)的多个中间探针(例如，二级探针)与样品内的一个或更多个一级探针杂交。在一些实施方案中，使用各自包含检测部分的多个中间探针来检测一级探针(其可具有糖-磷酸主链或者可以是核酸类似物探针)在样品内的定位。在一些实施方案中，使用基于吗啉代物的中间探针的检测步骤可包括破坏(例如，通过洗涤)所述多个中间探针的结合以将它们从样品中去除。在一些实施方案中，为核酸类似物探针(例如，基于吗啉代物的探针)的多个三级探针与样品内的一个或更多个二级探针杂交。在一些实施方案中，使用各自包含检测部分的多个三级探针来检测二级探针(其可具有糖-磷酸主链或者可以是核酸类似物探针)在样品内的定位。在一些实施方案中，所述方法还可包括破坏(例如，通过洗涤)三级探针的结合以将它们从样品中去除。在一些实施方案中，每个一级探针和中间探针(例如，二级、三级和/或更高阶中间探针)中的检测部分包含荧光团。在一些实施方案中，每个一级探针和中间探针中的每个检测部分包含不同的荧光团。在一些实施方案中，在检测步骤之后进行破坏和/或去除中间探针如二级探针、三级探针或更高阶中间探针和/或检测探针与样品的结合的洗涤步骤。
在一些实施方案中，荧光标记的检测探针与包含与RCA产物的靶标序列直接杂交的序列的中间探针(例如，二级探针或桥接探针)杂交。在一些实施方案中，RCA产物中的靶标序列的至少约5％、至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％或至少约90％的拷贝与荧光标记的检测探针的一个或更多个分子直接或间接地杂交。在一些实施方案中，RCA产物中的靶标序列的约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的拷贝与荧光标记的检测探针的一个或更多个分子直接或间接地杂交。
在一些实施方案中，所述方法还可包括去除一个或更多个未与靶标序列杂交的探针(例如，检测探针和/或中间探针)的分子。此去除步骤可在例如检测步骤之前进行。在一些实例中，探针为第一探针，并且方法还包括在使生物样品与在合成主链上包含核碱基序列的第二探针接触之前，去除与靶标序列杂交的第一探针的分子。在一些实施方案中，靶标序列为第一靶标序列，并且第二探针与DNA多联体中的第二靶标序列直接或间接地杂交。第一靶标序列和第二靶标序列可以相同。或者，第一靶标序列和第二靶标序列可以不同。
B.探针检测和分析
在一些方面，本文公开的方法涉及使用一种或多种与靶标核酸如RNA分子直接或间接地杂交的探针或探针组。在一些方面，使样品与多个加有条形码的探针组接触，每个探针组用于分析分析物(例如，生物标志物)面板。样品可以以分开的几轮与不同的可检测地标记的寡核苷酸接触，以分析加有条形码的探针组中的一个或更多个组(并由此分析对应于所述一个或更多个组的一个或更多个分析物面板)。在一些实施方案中，可检测地标记的探针(例如，检测探针和/或中间探针)可以在几轮之间改变，而一级探针或中间探针保持与样品中的分析物结合。一级探针或中间探针可以是加有条形码的探针。
在一些实施方案中，可检测地标记的探针(例如，检测探针)与其靶标例如转录物或DNA基因座直接杂交。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸通过与一种或多种中间体例如与靶标结合、杂交或以其他方式特异性连接的寡核苷酸结合或杂交而与其靶标特异性地相互作用(识别其靶标)。在一些实施方案中，中间探针包含条形码。
在一些实施方案中，中间探针(例如，中间寡核苷酸)与其具有突出端的靶标杂交，使得具有互补序列的第二寡核苷酸(检测探针)可以与其结合。在一些实施方案中，中间探针靶向核酸并任选地用可检测部分标记，并且在与靶标杂交之后包含突出端序列。在一些实施方案中，中间探针包含与靶标、突出端序列和任选地可检测部分杂交的序列。在一些实施方案中，中间探针(例如，直接结合样品中的分析物的加有条形码的探针)包含与靶标和突出端序列杂交的序列。在一些实施方案中，中间探针不具有可检测部分。在一些实施方案中，第二寡核苷酸为可检测地标记的寡核苷酸(例如，检测探针)。在一些实施方案中，第二可检测地标记的寡核苷酸(例如，检测探针)用染料标记。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸(例如，检测探针)用HCR聚合物标记。在一些实施方案中，通过多个接触、去除和/或成像步骤保存与靶标结合的中间探针；通过可检测标记的组合提供顺序条形码，所述可检测标记通过接触和成像步骤中的桥接探针与中间寡核苷酸连接。例如，当中间探针与靶标结合时，条形码由可检测地标记的寡核苷酸提供，这些寡核苷酸与中间探针通过其突出端序列杂交。在成像步骤之后，任选地如本文所述去除中间探针。在一些实施方案中，对靶标采用一个中间探针。在一些实施方案中，对靶标采用两个或更多个中间探针。在一些实施方案中，对靶标采用三个或更多个中间探针。在一些实施方案中，对靶标采用四个或更多个中间探针。在一些实施方案中，对靶标采用五个或更多个中间探针。
在一些实施方案中，每个中间探针(例如，中间寡核苷酸)与靶标的不同序列杂交。在一些实施方案中，每个中间探针(例如，中间寡核苷酸)与靶标的同一序列杂交。在一些实施方案中，靶标的两个或更多个中间寡核苷酸包含相同的突出端序列。在一些实施方案中，靶标的两个或更多个中间寡核苷酸包含不同的突出端序列。在一些实施方案中，多个中间探针与靶标的同一序列杂交，其中两个或更多个中间探针包含不同的突出端序列。在一些实施方案中，针对同一靶标的多个可检测探针中的每个可检测探针包含与每个突出端序列互补的不同序列，这些突出端序列由包含用于与同一靶标杂交的相同序列的多个中间探针共享。在一些实施方案中，中间探针包含与靶标互补的序列，以及与可检测地标记的寡核苷酸(例如，检测探针)互补的序列。
在一些实施方案中，一组中的每个可检测地标记的寡核苷酸(例如，检测探针或中间探针)具有不同的靶标或与不同的靶标相关联，例如转录物或DNA基因座。在一些实施方案中，一组中的两个或更多个可检测地标记的寡核苷酸(例如，检测探针或中间探针)具有相同的靶标或与同一靶标相关联。在一些实施方案中，两个或更多个可检测地标记的寡核苷酸(例如，检测探针或中间探针)靶向同一转录物。在一些实施方案中，两个或更多个可检测地标记的寡核苷酸(例如，检测探针或中间探针)靶向同一DNA基因座。在一些实施方案中，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90或100个可检测地标记的寡核苷酸靶向同一靶标。在一些实施方案中，两个或更多个可检测地标记的寡核苷酸(例如，检测探针或中间探针)靶向同一靶标。在一些实施方案中，五个或更多个可检测地标记的寡核苷酸靶向同一靶标。
在一些实施方案中，除其他以外，对同一靶标使用多个可检测地标记的寡核苷酸(例如，检测探针或中间探针)将增加信号强度。在一些实施方案中，一组中靶向同一靶标的每个可检测地标记的寡核苷酸(例如，检测探针或中间探针)与靶标的不同部分相互作用。
在一些实施方案中，一组中针对靶标的所有可检测地标记的寡核苷酸(例如，检测探针)具有相同的可检测部分。在一些实施方案中，所有可检测地标记的寡核苷酸以相同的方式标记。在一些实施方案中，针对靶标的所有可检测地标记的寡核苷酸具有相同的荧光团。在一些实施方案中，针对靶标的两个或更多个检测探针具有不同的荧光团。
在一些实施方案中，针对靶标的可检测地标记的寡核苷酸位于靶标的靶向区域内。靶向区域可以具有各种长度。在一些实施方案中，靶向区域的长度为约20个核碱基。在一些实施方案中，靶向区域的长度为约30个核碱基。在一些实施方案中，靶向区域的长度为约40个核碱基。在一些实施方案中，靶向区域的长度为约50个核碱基。在一些实施方案中，靶向区域的长度为约60个核碱基。在一些实施方案中，靶向区域的长度为约80bp。在一些实施方案中，靶向区域的长度为约100个核碱基。在一些实施方案中，靶向区域的长度为约150个核碱基。在一些实施方案中，靶向区域的长度为约200个核碱基。在一些实施方案中，靶向区域的长度为约250个核碱基。在一些实施方案中，靶向区域的长度为约300个核碱基。在一些实施方案中，靶向区域的长度为约350个核碱基。在一些实施方案中，靶向区域的长度为约400个核碱基。在一些实施方案中，靶向区域的长度为约450个核碱基。在一些实施方案中，靶向区域的长度为约500个核碱基。在一些实施方案中，靶向区域的长度为约600个核碱基。在一些实施方案中，靶向区域的长度为约700个核碱基。在一些实施方案中，靶向区域的长度为约800个核碱基。在一些实施方案中，靶向区域的长度为约900个核碱基。在一些实施方案中，靶向区域的长度为约1,000个核碱基。在一些实施方案中，针对靶标的可检测地标记的寡核苷酸在靶标上彼此靠近定位。
在一些实施方案中，一组可检测地标记的寡核苷酸的靶标也是另一组的靶标。在一些实施方案中，一组可检测地标记的寡核苷酸的靶标与另一组的靶标重叠。在一些实施方案中，重叠超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，一组可检测地标记的寡核苷酸的靶标与另一组的靶标相同。在一些实施方案中，每组可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶标。
如本文所用，可检测地标记的寡核苷酸用可检测部分标记。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸包含一个可检测部分。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸包含两个或更多个可检测部分。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸具有一个可检测部分。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸具有两个或更多个可检测部分。
用于结合和鉴别靶标核酸的探针和方法已见述于例如US2003/0013091、US2007/0166708、US2010/0015607、US2010/0261026、US2010/0262374、US2010/0112710、US2010/0047924和US2014/0371088中，它们中的每一者通过引用以其全文并入本文。
在一些实施方案中，可检测部分为或包含纳米材料。在一些实施方案中，可检测部分为或包含纳米颗粒。在一些实施方案中，可检测部分为或包含量子点。在一些实施方案中，可检测部分为量子点。在一些实施方案中，可检测部分包含量子点。在一些实施方案中，可检测部分为或包含金纳米颗粒。在一些实施方案中，可检测部分为金纳米颗粒。在一些实施方案中，可检测部分包含金纳米颗粒。
本领域技术人员理解，在一些实施方案中，可以基于多种因素来确定特定循环中特定探针(例如，检测探针)的标记选择，所述多种因素包括例如大小、所生成的信号的类型、附接到探针或并入到探针中的方式、细胞组成物的性质(包括它们在细胞内的位置)、细胞的性质、被分析的相互作用的类型等。
例如，在一些实施方案中，探针(例如，检测探针)用Cy3或Cy5标记，所述Cy3或Cy5已被合成以携带N-羟基琥珀酰亚胺基酯(NHS-酯)反应性基团。由于NHS-酯容易与脂族胺基团反应，故可以用氨基烷基基团来修饰核苷酸。这可以通过在合成反应期间并入经氨基烷基修饰的核苷酸来完成。在一些实施方案中，在每60个碱基中使用一个标记以避免猝灭效应。
在一些实施方案中，靶标和/或加有条形码的探针的序列分析可以通过顺序荧光杂交(例如，边杂交边测序)来进行。顺序荧光杂交可以涉及包含寡核苷酸和可检测标记的检测探针的顺序杂交。
在一些实施方案中，测序可以通过边合成边测序(SBS)来进行。在一些实施方案中，测序引物与一个或更多个条形码处或附近的序列互补。在这样的实施方案中，边合成边测序可以包括逆转录和/或扩增以生成引物序列可从其结合的模板序列。示例性SBS方法包括例如但不限于US 2007/0166705、US 2006/0188901、US 7,057,026、US 2006/0240439、US2006/0281109、US 10,953,379、US 2005/0100900、WO 06/064199、US 10,710,046、US2012/0270305、US 2013/0260372和US 2013/0079232描述的那些。
在一些实施方案中，测序可以使用单个分子边连接边测序来进行。这样的技术利用DNA连接酶来并入寡核苷酸并鉴别这样的寡核苷酸的并入。寡核苷酸通常具有与寡核苷酸与之杂交的序列中的特定核苷酸的身份相关的不同标记。边连接边测序中涉及的方面和特征见述于例如Shendure等人,Science(2005),309:1728-1732中，以及US 5,599,675；US5,750,341；US 6,969,488；US 6,172,218；和US 6,306,597中。
在一些实施方案中，条形码被可检测地标记的检测寡核苷酸(例如，检测探针)如荧光标记的寡核苷酸(例如，荧光标记的检测探针)靶向。在一些实施方案中，使用一个或更多个解码方案来解码信号，如荧光，用于序列确定。在本文的任何实施方案中，可以使用任何合适的方法或技术来分析(例如，检测或测序)条形码(例如，一级和/或二级条形码序列)，包括本文描述的那些，如靶标的RNA连续探测(RNA SPOT)、连续荧光原位杂交(seqFISH)、单分子荧光原位杂交(smFISH)、多重错误鲁棒荧光原位杂交(MERFISH)、基于杂交的原位测序(HybISS)、原位测序、靶向原位测序、荧光原位测序(FISSEQ)或空间分辨转录物扩增子读出映射(STARmap)。在一些实施方案中，本文提供的方法包括通过用多个标记的探针(例如，检测寡核苷酸)顺序杂交和检测来分析条形码。示例性解码方案见述于Eng等人,“Transcriptome-scale Super-Resolved Imaging in Tissues by RNA SeqFISH+,”Nature 568(7751):235-239(2019)；Chen等人,“Spatially resolved,highlymultiplexed RNA profiling in single cells,”Science；348(6233):aaa6090(2015)；Gyllborg等人,Nucleic Acids Res(2020)48(19):e112；US 10,457,980B2；US 2016/0369329 A1；WO 2018/026873 A1；和US 2017/0220733 A1中，所有这些文献均通过引用以其全文并入。在一些实施方案中，这些测定使得能够同时实现信号放大、组合解码和纠错方案。
在一些实施方案中，可以使用核酸杂交来进行测序。这些方法利用与条形码序列的至少一部分互补的标记的核酸解码器探针。可以用具有可区分标签的许多不同探针的池来进行多路复用解码。核酸杂交测序的非限制性实例见述于例如US 8,460,865中和Gunderson等人,Genome Research 14:870-877(2004)中，这些文献中的每一个的全部内容通过引用并入本文。在任何前述实施方案中，本文提供的方法可以包括通过用多个标记的探针(例如，检测探针)顺序杂交和检测来分析条形码。
在一些实施方案中，可以在测序期间使用DNA聚合酶活性的实时监测。例如，可以通过荧光共振能量转移(FRET)来检测核苷酸并入，如例如Levene等人,Science(2003),299,682-686、Lundquist等人,Opt.Lett.(2008),33,1026-1028和Korlach等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2008),105,1176-1181中所述。
在一些方面，分析和/或序列确定可以在室温下进行，以在低背景噪声和减少错误的情况下最好地保存组织形态。在一些实施方案中，分析和/或序列确定包括随着测序的进行消除错误累积。
在一些实施方案中，分析和/或序列确定涉及洗涤以去除未结合的多核苷酸，其后显露荧光产物以便成像。
在一些方面，使用许多不同类型的显微术中的任何一种来进行检测(包括成像)，例如共聚焦显微术、双光子显微术、光场显微术、完整组织扩张显微术和/或CLARITYTM-优化的光片显微术(COLM)。
在一些实施方案中，使用荧光显微术来进行检测探针的检测和成像。在一些方面，荧光显微镜为光学显微镜，其使用荧光和磷光代替或补充反射和吸收来研究有机或无机物质的性质。在荧光显微术中，用在样品中激发荧光的波长的光照射样品。然后通过显微镜物镜对荧光成像，荧光波长通常比照射波长长。该技术中可以使用两个滤光片；照射(或激发)滤光片，其确保照射接近单色且在正确的波长下，和第二发射(或屏障)滤光片，其确保没有激发光源到达检测器。或者，这些功能都可以由单个二向色滤光片实现。“荧光显微镜”包括使用荧光来生成图像的任何显微镜，无论其是像落射荧光显微镜这样的更简单的装置，还是像共聚焦显微镜这样的更复杂的设计，其都使用光学切片来获得荧光图像的更好分辨率。
在一些实施方案中，使用共聚焦显微术来进行检测探针的检测和成像。共聚焦显微镜使用点照射和检测器前方光学共轭平面中的针孔来消除离焦信号。由于只能检测到非常靠近焦平面的荧光产生的光，故图像的光学分辨率，特别是在样品深度方向上，比宽视场显微镜要好得多。然而，由于来自样品荧光的许多光在针孔处被阻挡，故分辨率的这种提高是以信号强度的降低为代价的——因此通常需要长的曝光时间。由于一次仅照射样品中的一个点，故2D或3D成像需要在试样中以规则光栅(即，平行扫描线的矩形图案)扫描。焦平面的可实现厚度主要由所用光的波长除以物镜的数值孔径限定，但也由试样的光学性质限定。薄光学切片使得这些类型的显微镜在样品的3D成像和表面轮廓分析方面特别好。CLARITYTM-优化的光片显微术(COLM)提供了用于大型澄清样品的快速3D成像的替代显微术。COLM询问大型免疫染色组织，允许提高采集速度并产生更高质量的生成数据。
可以采用的其他类型的显微术包括明场显微术、斜照显微术、暗场显微术、相差显微术、微分干涉差(DIC)显微术、干涉反射显微术(也称为反射干涉差或RIC)、单平面照明显微术(SPIM)、超高分辨率显微术、激光显微术、电子显微术(EM)、透射电子显微术(TEM)、扫描电子显微术(SEM)、反射电子显微术(REM)、扫描透射电子显微术(STEM)和低电压电子显微术(LVEM)、扫描探针显微术(SPM)、原子力显微术(ATM)、弹道电子发射显微术(BEEM)、化学力显微术(CFM)、导电原子力显微术(C-AFM)、电化学扫描隧道显微镜(ECSTM)、静电力显微术(EFM)、流体力显微镜(FluidFM)、力调制显微术(FMM)、特征导向扫描探针显微术(FOSPM)、开尔文探针力显微术(KPFM)、磁力显微术(MFM)、磁共振力显微术(MRFM)、近场扫描光学显微术(NSOM)(或SNOM、扫描近场光学显微术、SNOM、压电响应力显微术(PFM)、PSTM、光子扫描隧道显微术(PSTM)、PTMS、光热显微光谱/显微术(PTMS)、SCM、扫描电容显微术(SCM)、SECM、扫描电化学显微术(SECM)、SGM、扫描门显微术(SGM)、SHPM、扫描霍尔探针显微术(SHPM)、SICM、扫描离子电导显微术(SICM)、SPSM自旋偏振扫描隧道显微术(SPSM)、SSRM、扫描扩散电阻显微术(SSRM)、SThM、扫描热显微术(SThM)、STM、扫描隧道显微术(STM)、STP、扫描隧道电位法(STP)、SVM、扫描电压显微术(SVM)、同步加速器x-射线扫描隧道显微术(SXSTM)和完整组织扩张显微术(exM)。
本文描述的探针可以用于分析DNA多联体的序列。在一些实施方案中，待分析的序列为核酸条形码序列。例如，核酸条形码序列可以对应于生物样品中的分析物或其一部分(例如，核酸序列)或者分析物或其一部分的标记剂。
在一些实施方案中，检测还包括例如通过光学成像对包含探针的复合物(例如，DNA多联体)成像。例如，所述一个或更多个探针可以是包含一个或更多个核酸条形码序列的加有条形码的探针，所述一个或更多个核酸条形码序列可以被可检测地标记的检测探针直接或间接地结合。可以分析可检测信号或一系列信号如包括空间图案和/或时间图案的荧光，以揭示样品中所述一种或多种分析物的存在/不存在、分布、位置、量、水平、表达或活性。在一些实施方案中，所述一种或多种分析物(例如，DNA多联体内的靶标序列)在组织样品中原位分析(例如，通过成像)而不迁移出组织样品的细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种分析物在组织样品中原位分析(例如，通过成像)而不迁移出组织样品，例如迁移到底物上。在一些实施方案中，探针(例如，检测探针)包含分析物结合部分(例如，抗体)，并且核酸条形码序列在原位分析期间不被切割。
在一些情况下，对捕获的一个或更多个图像进行分析，并且可以包括处理所述一个或更多个图像和/或量化观察到的信号。例如，分析可以包括处理在样品的特定区域中检测到的一种或多种细胞类型、一种或多种类型的生物标志物、生物标志物的数量或水平、和/或细胞的数量或水平的信息。在一些实施方案中，分析包括检测序列，例如样品中存在的条形码。在一些实施方案中，分析包括小点(puncta)的定量(例如，如果检测到扩增产物)。在一些情况下，分析包括确定是否存在与来自特定面板的一种或多种生物标志物相关的特定细胞和/或信号。在一些实施方案中，可以将获得的信息与阳性和阴性对照相比较，或与特征的阈值相比较以确定样品是否表现出某种特征或表型。在一些情况下，信息可以包括来自细胞、区域的信号，和/或包括来自多个可检测标记的读数。在一些情况下，分析还包括显示来自分析或检测步骤的信息。在一些实施方案中，可以使用软件来使数据的处理、分析和/或显示自动化。
C.核酸类似物探针的示例性优点
如本文所述在原位分析期间在化学/光学解码循环期间使用荧光标记的吗啉代物作为检测探针的方法允许增加原位测序的灵敏度。在一些实施方案中，吗啉代物使检测探针与扩增产物(例如，DNA多联体)中所有可用对接位点杂交的能力最大化，如图2A与图2B比较地所示。
在原位测序期间向检测探针中并入吗啉代物(例如，磷酰二胺键)显著增加了每个扩增子(例如，DNA多联体)的亮度，从而导致灵敏度的增加。这种化学方法提供了实现更短的扩增时间和更小的扩增子大小的能力，同时保持同等或甚至更高程度的信号亮度。在一些实施方案中，本文描述的方法提供的优点是由于与不包含吗啉代物的检测探针(图2A)相比更多的检测探针与DNA多联体内先前不可及于的位点杂交的能力(图2B)。此外，更亮且更小的扩增子可以减少光学拥挤，从而允许在单个实验期间在它们的位置背景下分析更多的基因。
在一些方面，目前公开的方法的优点在于更短的扩增时间和更小的RCA产物(例如，亚微米范围内的DNA多联体)，同时保持同等或甚至更高程度的信号亮度。因此，这种方法产生更亮且更小的扩增子以减少光学拥挤并允许在单个实验期间在它们的位置背景下分析更多的基因。所描述的方法还可以允许单探针/RNA实施；而不是使用多探针/RNA(例如，4个探针/RNA)设计。使用不带电荷的寡核苷酸类似物(例如，吗啉代物)将提供优于当前系统的多种优点，包括减小DNA多联体大小，同时可以实现扩增子增加的亮度(图5)。
在一些实施方案中，由于增加的检测灵敏度，故基于吗啉代物的检测探针允许每个RNA仅一个可环化探针(例如，挂锁探针)。采用不考虑DNA多联体的静电效应的传统检测寡核苷酸，典型的原位测序分析需要4-12个挂锁探针/RNA以生成足够亮的信号。单个挂锁探针/RNA提供了若干额外的优点，包括：1)需要较少的挂锁探针；2)剪接变体在其独特位置中的分辨率增加；3)可能更短的扩增时间；4)较小的DNA多联体大小，从而减少分子/光学拥挤；和5)线性稀释能力以允许控制分子拥挤。
在一些实施方案中，使用一个挂锁探针/RNA提供了使选择性剪接实例具有提高的分辨率的能力，如图4中所示意。例如，如果两个外显子彼此紧邻(例如，如图4中所示，外显子跨坐同种型‘X’的剪接位点接头)，则一个挂锁探针可能仅导致DNA的指定区域的扩增。或者，如果所述外显子彼此不紧邻(例如，紫色外显子已从图4剪出)，则挂锁探针将不杂交，并且不会发生扩增。在一些实施方案中，与传统检测寡核苷酸相比，基于吗啉代物的检测寡核苷酸允许提高剪接变体的分辨率，因为提高的检测灵敏度意味着RCA产物可以更小，和/或需要更少的挂锁探针(例如，每个核酸靶标仅一个挂锁探针)来与靶标序列杂交。
IV.组合物和试剂盒
在一些方面，本文提供了一种组合物，其包含：包含靶标序列的多个拷贝的DNA多联体、与靶标序列杂交的中间探针的分子和在合成主链上包含与中间探针杂交的核碱基序列的荧光标记探针(例如，中间探针和/或检测探针)的分子，其中所述DNA多联体、所述中间探针的分子和所述荧光标记的检测探针(例如，可检测探针)的分子形成杂交复合物。在前述实施方案中的任一个的组合物中，DNA多联体可以是滚环扩增(RCA)产物。在前述实施方案中的任一个的组合物中，RCA产物可以使用可与生物样品中的分析物直接或间接地结合的环状或可环化(例如，挂锁)探针或探针组作为模板在生物样品中原位生成。
本文还提供了试剂盒，例如包含具有合成主链(任选地包含荧光部分)的探针(例如，中间探针和/或检测探针)和用于进行本文提供的方法的试剂，例如包括如本文所述的杂交、连接、扩增、检测、测序和/或样品制备的一个或更多个步骤所需的试剂。
在一些方面，本文提供了一种试剂盒，其包含：在合成主链上包含与中间探针杂交的核碱基序列的荧光标记探针(例如，检测探针)，和中间探针，所述中间探针在合成主链上包含与靶标序列杂交的核碱基序列。在一些实施方案中，荧光标记的检测探针和/或中间探针可以是吗啉代物。在一些实施方案中，荧光标记的检测探针和/或中间探针可以包含磷酰二胺子单元间键。在一些实施方案中，试剂盒还可包括包含靶标序列或其补体的环状或可环化(例如，挂锁)探针或探针组(一级、二级或其他中间探针)，其中所述探针或探针组可能能够与生物样品中的分析物直接或间接地结合并且可以使用所述探针或探针组作为模板生成滚环扩增产物。在一些实施方案中，试剂盒还包括包含在生物样品(例如，包含DNA多联体的生物样品)中的靶标核酸。
试剂盒的各种组分可以存在于单独的容器中，或者某些相容的组分可以预先合并到单个容器中。在一些实施方案中，试剂盒还含有使用试剂盒的组分来实践所提供的方法的说明。
在一些实施方案中，试剂盒可以含有进行所提供的方法的一个或更多个步骤所需的试剂和/或消耗品。在一些实施方案中，试剂盒含有用于固定、包埋和/或透化生物样品的试剂。在一些实施方案中，试剂盒含有试剂，如用于连接和/或扩增的酶和缓冲液，如连接酶和/或聚合酶。在一些方面，试剂盒还可以包含任何本文描述的试剂，例如杂交缓冲液、洗涤缓冲液和连接缓冲液。在一些实施方案中，试剂盒含有用于检测和/或测序的试剂，如条形码检测探针或可检测标记。在一些实施方案中，试剂盒任选地含有其他组分，例如核酸引物、酶和试剂、缓冲液、核苷酸、经修饰的核苷酸、用于另外的测定的试剂。
V.术语
在整个本公开中使用特定的术语来解释所描述的装置、系统、方法和组合物的各种方面。
已经描述了本公开的一些示意性实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，前述内容仅是示意性的而非限制性的，已仅以举例的方式呈现。许多修改和其他示意性实施方案在本领域普通技术人员的范围内并且被视为落在本公开的范围内。特别地，尽管本文中呈现的许多实例涉及方法动作或系统要素的特定组合，但应理解，这些动作和这些要素可以以其他方式组合以实现相同的目标。
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物，除非上下文另有明确规定。例如，“一个”或“一种”意指“至少一个(种)”或“一个(种)或多个(种)”。
如本文所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文对“约”值或参数的引用包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。
在整个本公开中，要求保护的主题的各个方面以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对要求保护的主题的范围的不灵活限制。因此，范围的描述应被认为已经具体公开了在该范围内的所有可能的子范围以及单独的数值。例如，在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限之间的每个居间值以及该陈述的范围中的任何其他陈述的或居间的值均涵盖在要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围中，并且也涵盖在要求保护的主题内，但受制于陈述的范围中的任何具体排除的极限。在陈述的范围包括这些极限中的一个或两个极限的情况下，排除那些包括的极限中的任一个或两个极限的范围也包括在要求保护的主题中。不管范围的广度如何，这都适用。
在权利要求书中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”等序数词来修饰权利要求要素本身并不意味着一个权利要求要素优于另一个权利要求要素的任何优先级、先后次序或顺序，也不意味着执行方法的多个动作的时间顺序，而是仅用作将具有某一名称的一个权利要求要素与具有用于区分权利要求要素的相同名称(但使用的序数词不同)的另一个要素区分开的标签。类似地，在权利要求中使用a)、b)等或i)、ii)等本身并不意味着任何优先级、先后次序或步骤顺序。类似地，在说明书中使用这些术语本身并不意味着任何要求的优先级、先后次序或顺序。
(i)条形码
“条形码”为传达或能够传达信息(例如，关于样品、珠和/或捕获探针中的分析物的信息)的标记或标识符。条形码可以是分析物的一部分，也可以独立于分析物。条形码可以附接到分析物。特定条形码相对于其他条形码可以是独特的。
条形码可以具有多种不同的形式。例如，条形码可以包括多核苷酸条形码、随机核酸和/或氨基酸序列以及合成的核酸和/或氨基酸序列。条形码可以以可逆或不可逆方式附接到分析物或另一个部分或结构。条形码可以在样品测序之前或期间加入到例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)样品的片段中。条形码可以允许鉴别和/或定量单独测序读段(例如，条形码可以是或可以包括独特分子标识符或“UMI”)。
条形码可以在空间上分辨存在于生物样品中的分子组分，例如以单细胞分辨率(例如，条形码可以是或可以包括“空间条形码”)。在一些实施方案中，条形码包括UMI和空间条形码两者。在一些实施方案中，条形码包括一起充当单个条形码的两个或更多个子条形码。例如，多核苷酸条形码可以包括由一个或更多个非条形码序列分开的两个或更多个多核苷酸序列(例如，子条形码)。
(ii)核酸和核苷酸
术语“核酸”和“核苷酸”意在与它们在本领域中的使用一致并且包括天然存在的物种或其功能类似物。核酸的特别有用的功能类似物能够以序列特异性方式杂交于核酸(例如，能够杂交于两个核酸，使得可以在两个杂交的核酸之间发生连接)或能够用作特定核苷酸序列的复制模板。天然存在的核酸一般具有含磷酸二酯键的骨架。类似物结构可以具有另选的骨架连键，包括本领域中已知的多种骨架连键中的任一种。天然存在的核酸一般具有脱氧核糖(例如，存在于脱氧核糖核酸(DNA)中)或核糖(例如，存在于核糖核酸(RNA)中)。
核酸可以含有本领域中已知的这些糖部分的多种类似物中的任一种的核苷酸。核酸可以包含天然或非天然核苷酸。就这一点而言，天然脱氧核糖核酸可以具有选自由腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)组成的组的一个或更多个碱基，并且核糖核酸可以具有选自由尿嘧啶(U)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)组成的组的一个或更多个碱基。可以包含在核酸或核苷酸中的有用非天然碱基是本领域中已知的。
(iii)探针和靶标
当参考核酸或核酸序列使用时，“探针”或“靶标”意在作为方法或组合物的上下文中核酸或序列的语义标识符，并且不限制明确指示的之外的核酸或序列的结构或功能。
(iv)寡核苷酸和多核苷酸
术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，指长度为约2至约500个核苷酸的核苷酸单链多聚体。寡核苷酸可以是合成的、以酶促方式(例如，经由聚合)或使用“分裂池”方法制备的。寡核苷酸可以包括核糖核苷酸单体(即，可以是寡核糖核苷酸)和/或脱氧核糖核苷酸单体(即，寡脱氧核糖核苷酸)。在一些实例中，寡核苷酸可以包括寡核苷酸中的脱氧核糖核苷酸单体和核糖核苷酸单体两者的组合(例如，脱氧核糖核苷酸单体和核糖核苷酸单体的随机或有序组合)。寡核苷酸的长度可以例如是4至10、10至20、21至30、31至40、41至50、51至60、61至70、71至80、80至100、100至150、150至200、200至250、250至300、300至350、350至400或400-500个核苷酸。寡核苷酸可以包括一个或更多个附接(例如，共价或非共价地)到多聚体结构的功能部分。例如，寡核苷酸可以包括一个或更多个可检测标记(例如，放射性同位素或荧光团)。
(v)杂交(Hybridizing、Hybridize)、退火(Annealing、Anneal)
术语“杂交(hybridizing、hybridize)”、“退火(annealing、anneal)”在本公开中可互换使用，并且是指两个不同分子内基本上互补或互补的核酸序列的配对。配对可以通过其中核酸序列通过碱基配对与基本上或完全互补的序列联结形成杂交复合物的任何过程来实现。就杂交的目的而言，如果它们的各个碱基中的至少60％(例如，至少70％、至少80％或至少90％)彼此互补，则两个核酸序列是“基本上互补的”。
(vi)引物
“引物”为具有3’末端的单链核酸序列，所述3’末端可以用作核酸延伸反应中的核酸聚合酶的底物。RNA引物由RNA核苷酸形成并用于RNA合成中，而DNA引物由DNA核苷酸形成并用于DNA合成中。引物还可以包括RNA核苷酸和DNA核苷酸两者(例如，以随机或设计的模式)。引物还可以包括本文描述的可以具有另外的功能性的其他天然或合成核苷酸。在一些实例中，可以使用DNA引物来引发RNA合成，反之亦然(例如，可以使用RNA引物来引发DNA合成)。引物的长度可以变化。例如，引物可以是约6个碱基至约120个碱基。例如，引物可以包括至多约25个碱基。在一些情况下，引物可以指引物结合序列。
(vii)引物延伸
“引物延伸”是指其中两个核酸序列(例如，来自两个不同捕获探针中的每一个的恒定区)通过其各自的末端互补核酸序列(即，例如，3’末端)的重叠而连接(例如，杂交)的任何方法。这样的连接之后可以是使用另一核酸序列作为延伸模板进行的一个或两个末端的核酸延伸(例如，酶促延伸)。酶促延伸可以通过包括但不限于聚合酶和/或逆转录酶的酶进行。
(viii)核酸延伸
“核酸延伸”通常涉及以模板依赖性方式向分子(如但不限于核酸序列)中并入一种或多种核酸(例如，A、G、C、T、U、核苷酸类似物或其衍生物)，使得连续的核酸被酶(如聚合酶或逆转录酶)并入，从而生成新合成的核酸分子。例如，可以使用与互补核酸序列杂交的引物通过使用互补核酸序列作为核酸合成的模板来合成新的核酸分子。类似地，可以使用与聚(dT)序列(例如，捕获结构域)杂交的mRNA转录物的3’多腺苷酸化尾作为相应的cDNA分子的单链合成的模板。
(ix)PCR扩增
“PCR扩增”是指使用聚合酶链反应(PCR)来生成遗传物质的拷贝，包括DNA和RNA序列。用于实施PCR的合适的试剂和条件例如见述于美国专利4,683,202、4,683,195、4,800,159、4,965,188和5,512,462中，这些专利中的每一个的全部内容通过引用并入本文。在典型的PCR扩增中，反应混合物包括待扩增的遗传物质、酶、用于引物延伸反应中的一种或多种引物以及用于反应的试剂。寡核苷酸引物具有足够的长度以在退火条件下提供与互补遗传物质的杂交。引物的长度通常取决于扩增结构域的长度，但通常将为至少4个碱基、至少5个碱基、至少6个碱基、至少8个碱基、至少9个碱基、至少10个碱基对(bp)、至少11bp、至少12bp、至少13bp、至少14bp、至少15bp、至少16bp、至少17bp、至少18bp、至少19bp、至少20bp、至少25bp、至少30bp、至少35bp，并且可以长达40bp或更长，其中引物的长度通常将在18至50bp的范围内。可以使遗传物质与单个引物或一组两个引物(正向引物和反向引物)接触，这取决于是否需要引物延伸、遗传物质的线性或指数式扩增。
在一些实施方案中，PCR扩增过程使用DNA聚合酶。DNA聚合酶活性可以由一种或多种不同的DNA聚合酶提供。在某些实施方案中，DNA聚合酶来自细菌，例如，DNA聚合酶为细菌DNA聚合酶。例如，DNA聚合酶可以来自埃希氏菌属、芽孢杆菌属、嗜热菌属或火球菌属的细菌。
可以使用的DNA聚合酶的合适实例包括但不限于：大肠杆菌DNA聚合酶I、Bsu DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、VENTTM DNA聚合酶、DEEPVENTTM DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、/>Hot Start Taq DNA聚合酶、CrimsonTaq DNA聚合酶、Crimson Taq DNA聚合酶、/>DNA聚合酶、Quick-/>DNA聚合酶、Hemo />DNA聚合酶、/>DNA聚合酶、/>DNA聚合酶、/>High-Fidelity DNA聚合酶、Platinum Pfx DNA聚合酶、AccuPrime Pfx DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、Klenow片段、Pwo DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶和T7 DNA聚合酶。
术语“DNA聚合酶”不仅包括天然存在的酶，而且包括其所有修饰的衍生物，还包括天然存在的DNA聚合酶的衍生物。例如，在一些实施方案中，DNA聚合酶可以经过修饰以去除5’-3’核酸外切酶活性。可以使用的DNA聚合酶的序列修饰衍生物或突变体包括但不限于保留至少一些功能例如野生型序列的DNA聚合酶活性的突变体。突变可以影响酶的活性特征，例如，在不同的反应条件例如温度、模板浓度、引物浓度等下提高或降低聚合的速率。突变或序列修饰也可以影响酶的核酸外切酶活性和/或热稳定性。
在一些实施方案中，PCR扩增可以包括反应如但不限于链置换扩增反应、滚环扩增反应、连接酶链反应、转录介导扩增反应、等温扩增反应和/或环介导扩增反应。
在一些实施方案中，PCR扩增使用与靶标DNA片段的3’标签互补的单个引物。在一些实施方案中，PCR扩增使用第一引物和第二引物，其中第一引物的至少3’末端部分与靶标核酸片段的3’标签的至少一部分互补，并且其中第二引物的至少3’末端部分展现出靶标核酸片段的5’标签的至少一部分的序列。在一些实施方案中，第一引物的5’末端部分与靶标核酸片段的3’标签不互补，并且第二引物的5’末端部分不展现出靶标核酸片段的5’标签的至少一部分的序列。在一些实施方案中，第一引物包含第一通用序列和/或第二引物包含第二通用序列。
在一些实施方案中(例如，当PCR扩增扩增捕获的DNA时)，可以使用DNA连接酶将PCR扩增产物连接至另外的序列。DNA连接酶活性可以由一种或多种不同的DNA连接酶提供。在一些实施方案中，DNA连接酶来自细菌，例如，DNA连接酶为细菌DNA连接酶。在一些实施方案中，DNA连接酶来自病毒(例如，噬菌体)。例如，DNA连接酶可以是T4DNA连接酶。适合于连接步骤的其他酶包括但不限于Tth DNA连接酶、Taq DNA连接酶、嗜热球菌(菌株9oN)DNA连接酶(9oNTM DNA连接酶，可得自New England Biolabs,Ipswich,MA)和AmpligaseTM(可得自Epicentre Biotechnologies,Madison,WI)。也可以使用衍生物，例如序列修饰的衍生物，和/或其突变体。
在一些实施方案中，遗传物质通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增。所需逆转录酶活性可以由一种或多种不同的逆转录酶提供，其合适的实例包括但不限于：M-MLV、MuLV、AMV、HIV、ArrayScriptTM、MultiScribeTM、ThermoScriptTM及I、II、III和IV酶。“逆转录酶”不仅包括天然存在的酶，而且包括其所有此类经修饰的衍生物，还包括天然存在的逆转录酶的衍生物。
另外，可以使用M-MLV、MuLV、AMV和HIV逆转录酶的序列修饰衍生物或突变体进行逆转录，包括保留至少一些功能例如野生型序列的逆转录酶活性的突变体。逆转录酶可以作为组合物的一部分提供，该组合物包含其他组分，例如增强或改善逆转录酶的活性的稳定组分，如RNase抑制剂、DNA依赖性DNA合成的抑制剂，例如放线菌素D。逆转录酶的许多序列修饰衍生物或突变体，例如M-MLV，以及包含未修饰和修饰酶的组合物是可商购获得的，例如，ArrayScriptTM、MultiScribeTM、ThermoScriptTM以及I、II、III和IV酶。
某些逆转录酶(例如，禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶和莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV、MMLV)逆转录酶)可以使用RNA(cDNA合成)和单链DNA(ssDNA)作为模板合成互补DNA链。因此，在一些实施方案中，逆转录反应可以使用能够使用RNA和ssDNA两者作为延伸反应的模板的酶(逆转录酶)，例如AMV或MMLV逆转录酶。
在一些实施方案中，RNA和/或DNA的定量通过实时PCR(也称为定量PCR或qPCR)使用本领域公知的技术如但不限于“TAQMANTM”或或在毛细管(“/>Capillaries”)上进行。在一些实施方案中，遗传物质的定量通过光学吸光度和实时PCR来确定。在一些实施方案中，遗传物质的定量通过数字PCR来确定。在一些实施方案中，可以将分析的基因与对应于表达(mRNA)和数量(DNA)的参考核酸提取物(DNA和RNA)进行比较，以便比较靶标核酸的表达水平。
(x)抗体
“抗体”为识别并结合互补靶标抗原的多肽分子。抗体通常具有类似于Y形状的分子结构形状。天然存在的抗体，称为免疫球蛋白，属于免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE中之一。抗体也可以以合成方式产生。例如，为单克隆抗体的重组抗体可以使用合成基因来合成，做法是从源细胞回收抗体基因、扩增到适当的载体中并将该载体引入到宿主中以使得宿主表达重组抗体。一般而言，重组抗体可以使用合适的寡核苷酸引物和/或杂交探针从任何物种的产生抗体的动物克隆。可以使用重组技术来生成抗体和抗体片段，包括非内源性物种。
合成抗体可以来源于非免疫球蛋白来源。例如，抗体可以从核酸(例如，适体)和从非免疫球蛋白蛋白支架(如肽适体)产生，高变环被插入其中以形成抗原结合位点。基于核酸或肽结构的合成抗体可以比免疫球蛋白衍生的抗体小，从而导致更大的组织穿透。
抗体还可以包括affimer蛋白，其是分子量通常为约12-14kDa的亲和试剂。Affimer蛋白通常以高亲和力和高特异性两者与靶标(例如，靶标蛋白)结合。此类靶标的实例包括但不限于泛素链、免疫球蛋白和C反应蛋白。在一些实施方案中，affimer蛋白衍生自半胱氨酸蛋白酶抑制剂，并包括肽环和提供结合位点的可变N-末端序列。
抗体还可以指“表位结合片段”或“抗体片段”，如本文所用，其通常是指能够结合与完整抗体相同的表位的完整抗体的一部分，虽然其程度不一定相同。尽管多种类型的表位结合片段是可能的，但是表位结合片段通常包含至少一对结合在一起(例如，通过二硫键)以保留抗原结合位点的重链可变区和轻链可变区(分别为VH和VL)，并且不包含Fc区的全部或一部分。抗体的表位结合片段可以通过任何合适的技术(例如，重组DNA技术，或者完整抗体的酶促或化学切割)从给定抗体获得，并且通常能够以与筛选完整抗体相同的方式来筛选特异性。在一些实施方案中，表位结合片段包括F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、Fd片段或Fv片段。在一些实施方案中，术语“抗体”包括抗体衍生的多肽，诸如单链可变片段(scFv)、双体或其他多聚体scFv、重链抗体、单结构域抗体，或者包含抗体的足够部分(例如，一个或更多个互补决定区(CDR))以赋予多肽特异性抗原结合能力的其他多肽。
(xi)亲和基团
“亲和基团”是分子或分子部分，其具有与另一特定或特别的分子或部分缔合或结合的高亲和力或偏好。与另一特定或特别的分子或部分的缔合或结合可以经由非共价相互作用，如氢键、离子力和范德华相互作用。亲和基团可以是例如生物素，其具有与蛋白质抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缔合或结合的高亲和力或偏好。例如，亲和基团也可以指对生物素具有亲和力的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。亲和基团和与其结合或缔合的特定或特别的分子或部分的其他实例包括但不限于抗体或抗体片段及其相应的抗原，如地高辛和抗地高辛抗体、凝集素和碳水化合物(例如，糖、单糖、二糖或多糖)，以及受体和受体配体。
任何一对亲和基团和与其结合或缔合的特定或特别的分子或部分可以逆转其角色，例如，使得在第一分子与第二分子之间，在第一情况下，第一分子被描述为第二分子的亲和基团，而在第二情况下，第二分子被描述为第一分子的亲和基团。
(xii)标记、可检测标记和光学标记
术语“可检测标记”、“光学标记”和“标记”在本文中可互换使用，是指与待检测的分子相关联(例如，缀合至待检测的分子)的可直接或可间接检测部分，待检测的分子有例如用于原位测定的探针、捕获探针或分析物。可检测标记可以是本身可直接检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶促标记的情况下，可以是可间接检测的，例如，通过催化底物化合物或组合物的化学改变，所述底物化合物或组合物是可直接检测的。可检测标记可以适用于小规模检测和/或适用于高通量筛选。因此，合适的可检测标记包括、但不限于放射性同位素、荧光团、化学发光的化合物、生物发光的化合物和染料。
可以定性检测可检测标记(例如，光学地或光谱地)，或者其可以被量化。定性检测通常包括其中确认可检测标记的存在或出现的检测方法，而可量化检测通常包括具有可量化(例如，数值可报告)值如强度、持续时间、极化和/或其他性质的检测方法。在一些实施方案中，可检测标记与特征或和特征相关联的捕获探针结合。例如，可检测地标记的特征可以包括附接到珠的荧光、比色或化学发光标记(参见例如Rajeswari等人,J.MicrobiolMethods 139:22-28,2017和Forcucci等人,J.Biomed Opt.10:105010,2015，这些文献中的每一者的全部内容通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，可以向待检测的特征、捕获探针或组合物附接多个可检测标记。例如，可检测标记可以在核酸聚合或扩增期间并入(例如，-标记的核苷酸，如-dCTP)。可以使用任何合适的可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记为荧光团。例如，荧光团可以来自包括以下的组：7-AAD(7-氨基放线菌素D)、吖啶橙(+DNA)、吖啶橙(+RNA)、Alexa/>350、Alexa/>430、Alexa/>488、Alexa/>532、Alexa546、Alexa/>555、Alexa/>568、Alexa/>594、Alexa/>633、Alexa/>647、Alexa/>660、Alexa/>680、Alexa/>700、Alexa750、别藻蓝蛋白(APC)、AMCA/AMCA-X、7-氨基放线菌素D(7-AAD)、7-氨基-4-甲基香豆素、6-氨基喹啉、苯胺蓝、ANS、APC-Cy7、ATTO-TAGTM CBQCA、ATTO-TAGTM FQ、Auramine O-Feulgen、BCECF(高pH)、BFP(蓝色荧光蛋白)、BFP/GFP FRET、BOBOTM-1/BO-PROTM-1、BOBOTM-3/BO-PROTM-3、/>FL、/>TMR、/>TR-X、/>530/550、558/568、/>564/570、/>581/591、/>630/650-X、/>650-665-X、BTC、钙黄绿素、钙黄绿素蓝、Calcium CrimsonTM、Calcium Green-1TM、Calcium OrangeTM、/>白、5-羧基荧光素(5-FAM)、5-羧基萘基荧光素、6-羧基罗丹明6G、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、羧基-X-罗丹明(5-ROX)、Cascade/>Cascade YellowTM、CCF2(GeneBLAzerTM)、CFP(青色荧光蛋白)、CFP/YFP FRET、色霉素A3、Cl-NERF(低pH)、CPM、6-CR 6G、CTC甲/> Cychrome(PE-Cy5)、丹酰胺、丹酰尸胺、丹酰氯、DAPI、Dapoxyl、DCFH、DHR、DiA(4-Di-16-ASP)、DiD(DilC18(5))、DIDS、Dil(DilC18(3))、DiO(DiOC18(3))、DiR(DilC18(7))、Di-4ANEPPS、Di-8 ANEPPS、DM-NERF(4.5-6.5pH)、DsRed(红色荧光蛋白)、EBFP、ECFP、EGFP、-97醇、曙红、赤藓红、溴化乙锭、溴乙啡锭二聚体-1(EthD-1)、氯化铕(III)、5-FAM(5-羧基荧光素)、Fast Blue、荧光素-dT亚磷酰胺、FITC、Fluo-3、Fluo-4、/>Fluoro-GoldTM(高pH)、Fluoro-GoldTM(低pH)、Fluoro-Jade、/>1-43、Fura-2(高钙)、Fura-2/BCECF、Fura RedTM(高钙)、Fura RedTM/Fluo-3、GeneBLAzerTM(CCF2)、GFP RedShifted(rsGFP)、GFP野生型、GFP/BFP FRET、GFP/DsRed FRET、Hoechst 33342&33258、7-羟基-4-甲基香豆素(pH 9)、1,5 IAEDANS、Indo-1(高钙)、Indo-1(低钙)、吲哚二羰花青、吲哚三羰花青、JC-1、6-JOE、JOJOTM-1/JO-PROTM-1、LDS 751(+DNA)、LDS 751(+RNA)、LOLOTM-1/LO-PROTM-1、荧光黄、LysoSensorTM蓝(pH5)、LysoSensorTM绿(pH 5)、LysoSensorTM黄/蓝(pH4.2)、/>绿、/>红、/>黄、Mag-Fura-2、Mag-Indo-1、Magnesium GreenTM、Marina/>4-甲基伞形酮、光辉霉素、/>绿、橙、/>红、NBD(胺)、尼罗红、Oregon/>488、Oregon500、Oregon/>514、Pacific Blue、PBF1、PE(R-藻红蛋白)、PE-Cy5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白)、PerCP-Cy5.5(TruRed)、PharRed(APC-Cy7)、C-藻青蛋白、R-藻青蛋白、R-藻红蛋白(PE)、PI(碘化丙啶)、PKH26、PKH67、POPOTM-1/PO-PROTM-1、POPOTM-3/PO-PROTM-3、碘化丙啶(PI)、PyMPO、芘、派若宁Y、Quantam Red(PE-Cy5)、喹吖因氮芥、R670(PE-Cy5)、Red 613(PE-Texas Red)、红色荧光蛋白(DsRed)、Resorufin、RH 414、Rhod-2、罗丹明B、Rhodamine GreenTM、Rhodamine RedTM、罗丹明鬼笔环肽、罗丹明110、罗丹明123、5-ROX(羧基-X-罗丹明)、S65A、S65C、S65L、S65T、SBFI、SITS、-1(高pH)、/>-2、/>-1(高pH)、/>-1(低pH)、SodiumGreenTM、/>#1、/>#2、11、/>13、/>17、45、/>蓝、/>绿、/>橙、5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)、四甲基罗丹明(TRITC)、Texas/>/Texas/>-X、Texas/>-X(NHS酯)、硫杂二羰花青、噻唑橙、/>-1//>-1、/>-3//>-3、/>-5、Tri-color(PE-Cy5)、TRITC(四甲基罗丹明)、TruRed(PerCP-Cy5.5)、WW 781、X-罗丹明(XRITC)、Y66F、Y66H、Y66W、YFP(黄色荧光蛋白)、/>-1//>-1、/>-3/-3、6-FAM(荧光素)、6-FAM(NHS酯)、6-FAM(叠氮化物)、HEX、TAMRA(NHS酯)、Yakima Yellow、MAX、TET、TEX615、ATTO 488、ATTO 532、ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rho101、ATTO 590、ATTO 633、ATTO 647N、TYE 563、TYE 665、TYE 705、5’/>700、5’/>800、5’/>800CW(NHS酯)、WellRED D4染料、WellRED D3染料、WellRED D2染料、640(NHS酯)和Dy 750(NHS酯)。
如上文所提及的，在一些实施方案中，可检测标记为发光或化学发光部分或者包括发光或化学发光部分。常见的发光/化学发光部分包括但不限于过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRP)、大豆过氧化物酶(SP)、碱性磷酸酶和荧光素酶。给定适当的底物(例如，氧化试剂加化学发光化合物)，这些蛋白质部分可以催化化学发光反应。已知许多化合物家族在多种条件下提供化学发光。化学发光化合物家族的非限制性实例包括5-氨基-6,7,8-三甲氧基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮鲁米诺和二甲基氨基[ca]苯类似物。这些化合物可以在碱性过氧化氢或次氯酸钙和碱的存在下发光。化学发光化合物家族的其他实例包括例如2,4,5-三苯基咪唑、对-二甲基氨基和-甲氧基取代基、草酸酯如草酰活性酯、对-硝基苯基、N-烷基吖啶酯、荧光素、光泽精或吖啶酯。在一些实施方案中，可检测标记为基于金属或基于质量的标记或者包括基于金属或基于质量的标记。例如，小簇金属离子、金属或半导体可以充当质量编码。在一些实例中，金属可以选自周期表的第3-15族，例如Y、La、Ag、Au、Pt、Ni、Pd、Rh、Ir、Co、Cu、Bi或其组合。
实施例
包括以下实施例仅用于说明目的，并不旨在限制本公开的范围。
实施例1：不带电荷的核酸探针增加原位检测信号
本实施例展示增加原位分析期间用于检测探针(例如，检测寡核苷酸)杂交的可及位点的数目、因此增加原位检测灵敏度的方法。特别地，本实施例展示使用与靶标序列直接杂交的包含吗啉代物主链的不带电荷的检测探针(图1B)来克服与原位测序期间生成的扩增子的物理化学有关的静电效应和/或其他障碍。
在一些实施方案中，进行原位分析，在扩增步骤期间产生各种滚环扩增子(RCA)产物，例如DNA多联体。通过使挂锁探针(例如，一级探针)与样品中的靶标核酸杂交、连接挂锁探针并使用环化的挂锁探针作为扩增的模板来生成DNA多联体。由于沿着DNA多联体主链的磷酸根负电荷，故此类DNA多联体可具有大的负电荷。带负电荷的DNA多联体主链可通过内部库仑力诱导扩增子结构的“膨胀”，同时仍然呈现足以抑制检测探针朝向DNA多联体的中心杂交的阴离子电荷场(图2A)。在其中使用标准检测探针(例如，荧光DNA检测寡核苷酸)来检测DNA多联体的一些实例中，由于静电排斥，故电荷场(例如，如图2A中所示)可能防止大量检测探针穿透RCA。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括使用吗啉代物检测探针，其与在原位分析期间产生的DNA多联体(例如，来自RCA的扩增子)内的靶标序列直接杂交。吗啉代物是一类在其主链中具有亚甲基吗啉环的核酸类似物，所述亚甲基吗啉环替代DNA和RNA寡核苷酸特征性的脱氧核糖(或核糖)环(图1A)。吗啉代物含有不带电荷的磷酰二胺子单元间键，而不是天然核酸中发现的阴离子磷酸二酯键。吗啉环带有适当地排列用于Watson-Crick碱基配对的A、C、G或T碱基并且可商购获得(图1B)。
当荧光吗啉代物检测探针与DNA多联体(例如，来自RCA的扩增子)内的靶标序列直接杂交时，与不包含吗啉代物的参考探针相比，更多的检测探针可以对接在DNA多联体上和内，因为吗啉代物对静电效应不敏感(图2B)。因此，吗啉代物可以增加DNA多联体的亮度，并最终可以增加原位测序的检测灵敏度。在一些情况下，吗啉代物检测探针的使用还减少在使用不包含吗啉代物的参考探针时可能观察到的光学拥挤。
在一些实例中，可能仅需要单个包含不带电荷的主链(例如，吗啉代物主链)的挂锁探针/RNA来进行有效的原位检测。如图4中所示，可以使用这种实验设计来同时确定目的基因的各种个体同种型的位置(例如，单个探针可被设计成跨坐唯一的外显子/外显子接头)。
实施例2：使用不带电荷的核酸探针进行间接杂交以增加原位检测信号
本实施例展示使用与靶标序列间接杂交的包含吗啉代物主链的不带电荷的检测探针(图1B)来克服原位测序期间生成的扩增子的静电效应。
进行原位分析，在扩增步骤期间产生各种滚环扩增子(RCA)产物，例如DNA多联体。通过使挂锁探针(例如，一级探针)与样品中的靶标核酸杂交、连接挂锁探针并使用环化的挂锁探针作为扩增的模板来生成DNA多联体。在一些实施方案中，中间探针与RCA产物内的靶标序列直接杂交(图3)。中间探针具有用于与RCA产物内的靶标序列杂交的区域和用于与荧光标记的检测探针杂交的突出端区域。荧光标记的检测探针与中间探针的序列杂交，例如与靶标序列间接杂交，从而形成检测复合物。在一些实施方案中，荧光标记的检测探针包含吗啉代物主链。在一些实施方案中，荧光标记的检测探针和中间探针包含吗啉代物主链。一旦荧光标记的检测探针与中间探针杂交，就可以检测靶标。
实施例3：吗啉代物探针增加原位检测信号
本实施例展示与DNA检测探针相比使用包含吗啉代物主链的不带电荷的检测探针(图1B中示出的示例性结构)来增加原位检测信号的数量和强度。通过使可环化探针(例如，挂锁探针)与平板上孔中细胞中的靶标核酸杂交、连接可环化探针并使用环化的探针作为扩增的模板来生成DNA多联体。
将设计成靶向ActB的挂锁探针添加到经固定并透化的培养细胞(3T3)的样品中。连接挂锁探针以生成环化的探针，并然后将样品与含有Phi29DNA聚合酶和用于环化探针的RCA的dNTP的滚环扩增(RCA)混合物一起温育以生成DNA多联体。
在平板上的细胞中原位检测到DNA多联体。使用标准杂交操作规程让具有相同长度(20个碱基对)并靶向DNA多联体的相同序列且包含相同的3’6-FAM(6-羧基荧光素)荧光团的吗啉代物或DNA对照检测探针在水或杂交缓冲液中与DNA多联体杂交。杂交缓冲液包含1x四甲基氯化铵(TMAC)。每个孔拍摄九张图像以检测与吗啉代物或DNA对照检测探针杂交的DNA多联体的原位信号。
如图5的左侧小图中所示，与TMAC杂交缓冲液中的DNA对照检测探针相比，使用吗啉代物检测探针检测到更多的DNA多联体(例如，“斑点”)。与TMAC杂交缓冲液(图5，右侧小图)中的DNA对照检测探针相比，吗啉代物检测探针还生成了高于背景的增高的检测信号强度(例如，看起来更亮)。这些数据表明，包含吗啉代物主链的检测探针可以成功地检测DNA多联体，并且使用此类探针产生的原位检测信号比DNA对应物更强。
本公开不旨在在范围上限制于特定公开的实施方案，这些特定公开的实施方案是例如为了示意本公开的各种方面而提供的。根据本文的描述和教导，对所描述的这些组合物和方法的各种修改将变得显而易见。可以在不脱离本公开的真实范围和实质的情况下实践此类变化，并且此类变化旨在落入本公开的范围内。

Claims (80)

1.一种分析生物样品的方法，所述方法包括：
将多个检测探针与所述生物样品中的DNA多联体直接或间接地结合，其中所述多个检测探针中的一个检测探针在合成主链上包含核碱基序列，并且所述检测探针与所述DNA多联体中的靶标序列直接或间接地结合，和
检测来自所述多个结合的检测探针的信号，其中生成的信号大于在糖-磷酸主链上具有相同核碱基序列的多个参考检测探针。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测探针的静电负性低于所述参考检测探针。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述检测探针直接或间接地偶联至可检测标记、任选地荧光标记。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述检测探针与所述靶标序列直接杂交。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述检测探针与和所述靶标序列直接或间接地结合的中间探针杂交。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述检测探针与和所述靶标序列直接杂交的中间探针直接杂交。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述检测探针包括单链区域和任选地双链区域。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述合成主链上的所述核碱基序列为第一探针序列，并且所述检测探针还包含在糖-磷酸主链上包含核碱基的第二探针序列。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一探针序列位于所述第二探针序列的5’或3’处。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述检测探针包含一个或更多个第一探针序列和/或一个或更多个第二探针序列。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其中所述第二探针序列为DNA序列、RNA序列或其组合。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述检测探针以任何合适的次序和组合包含核碱基A、T、C、G或U或它们的变体。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述检测探针的长度在约5至约50个核碱基之间。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述检测探针在所述合成主链中包含磷酰二胺键。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述检测探针在所述合成主链中包含吗啉环。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述检测探针为吗啉代物。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述检测探针是不带电荷的或带正电荷的。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述DNA多联体包含一个或更多个条形码序列，任选地其中所述靶标序列包含对应于所述生物样品中的分析物的条形码序列。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述DNA多联体为所述生物样品中的内源性核酸分子的延伸产物、复制产物、逆转录产物和/或扩增产物。
20.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述DNA多联体为与所述生物样品中的分析物直接或间接地结合的标记剂的延伸产物、复制产物、逆转录产物和/或扩增产物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述标记剂包含报告寡核苷酸，任选地其中所述报告寡核苷酸包含一个或更多个条形码序列并且所述DNA多联体包含所述一个或更多个条形码序列的一个或多个拷贝。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述DNA多联体为与所述生物样品中的DNA或RNA分子杂交的环状或可环化探针或探针组的滚环扩增(RCA)产物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中分析由多个不同的mRNA和/或cDNA分子生成的DNA多联体，特定的环状或可环化探针或探针组中的条形码序列唯一地对应于特定的mRNA或cDNA分子，并且所述特定的环状或可环化探针或探针组还包含锚定序列，所述锚定序列在用于所述多个不同mRNA和/或cDNA分子的子集的环状或可环化探针或探针组中是共有的。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的方法，其中所述标记剂包含与所述生物样品中的非核酸分析物直接或间接地结合的结合部分，并且所述标记剂中的所述报告寡核苷酸鉴别所述结合部分和/或所述非核酸分析物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述标记剂的所述结合部分包含与蛋白质分析物直接或间接地结合的抗体或其抗原结合片段，并且所述DNA多联体为与所述标记剂的报告寡核苷酸杂交的环状或可环化探针或探针组的滚环扩增(RCA)产物。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述DNA多联体呈纳米球的形式，所述纳米球的直径在约0.1μm至约3μm之间，例如约0.1μm至约0.5μm之间、约0.5μm至约1μm之间、约0.8μm至约1.3μm之间、或约1μm至约1.5μm之间。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述DNA多联体的长度在约1至约15千碱基之间、约15至约25千碱基之间、约25至约35千碱基之间、约35至约45千碱基之间、约45至约55千碱基之间、约55至约65千碱基之间、约65至约75千碱基之间、或超过75千碱基。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述DNA多联体包含所述靶标序列的约10至约100个之间、约100至约1,000个之间、约1,000至约5,000个之间、约5,000至约10,000个之间、或超过10,000个拷贝。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述DNA多联体中的所述靶标序列的至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％或至少约90％的拷贝与所述多个检测探针的一个或更多个分子直接或间接地结合。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述DNA多联体原位生成。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述DNA多联体固定在所述生物样品中。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述DNA多联体与所述生物样品中的一个或更多个其他分子交联。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中在所述生物样品中原位检测包含所述检测探针的多个分子的复合物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述方法包括任选地使用荧光显微术对所述生物样品成像以检测所述复合物。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中在所述生物样品中原位分析所述DNA多联体分子的序列。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述检测探针用于通过顺序杂交、边杂交边测序、边连接边测序、边合成边测序、边结合边测序或其组合来分析所述DNA多联体的序列。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中待分析的序列包括对应于所述生物样品中的分析物或其一部分的条形码序列。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，所述方法还包括去除一个或更多个未与所述靶标序列结合的所述检测探针的分子。
39.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述多个检测探针的所述检测探针为第一检测探针，并且所述方法还包括在使所述生物样品与在合成主链上包含核碱基序列的多个第二检测探针接触之前，去除与所述靶标序列结合的所述第一检测探针的分子。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述靶标序列为第一靶标序列，并且所述多个第二检测探针中的第二检测探针与所述DNA多联体中的第二靶标序列直接或间接地结合，其中所述第一靶标序列和第二靶标序列相同或不同。
41.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述检测探针为第一检测探针并且与第一中间探针杂交，所述第一中间探针与所述靶标序列杂交，任选地其中所述第一中间探针在合成主链上包含核碱基序列。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述方法还包括去除与所述靶标序列结合的所述第一检测探针和/或所述第一中间探针的分子。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述方法还包括使所述生物样品与在合成主链上包含核碱基序列的多个第二检测探针和第二中间探针接触，其中所述多个第二检测探针与所述第二中间探针杂交，所述第二中间探针与所述靶标序列杂交，任选地其中所述第一中间探针在合成主链上包含核碱基序列。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述生物样品为经处理或经清理的生物样品。
45.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述生物样品为组织样品。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述组织样品为厚度在约1μm至约50μm之间的组织薄片，任选地其中所述组织薄片的厚度在约5μm至约35μm之间。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中将所述组织样品包埋在水凝胶中。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述分析物或所述DNA多联体与所述水凝胶交联。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述分析物或所述DNA多联体包含用于附接到所述水凝胶的一个或更多个官能团。
50.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述分析物包含来自组织样品的生物分子和/或其产物。
51.一种分析生物样品的方法，所述方法包括：
(a)使生物样品与多个荧光标记的检测探针接触，其中：
所述生物样品包含固定在其中的滚环扩增(RCA)产物，其中所述RCA产物包含靶标序列的多个拷贝，
所述多个荧光标记的检测探针中的荧光标记的检测探针在合成主链上包含与所述靶标序列或和所述靶标序列杂交的中间探针杂交的核碱基序列，
(b)任选地去除未与所述RCA产物杂交的所述荧光标记的检测探针和/或所述中间探针的分子；和
(c)检测与所述生物样品中的所述RCA产物结合的所述荧光标记的检测探针的分子，
其中由与所述RCA产物杂交的所述荧光标记的检测探针生成的信号大于在糖-磷酸主链上具有相同的荧光标记和核碱基序列的多个参考检测探针。
52.根据权利要求51所述的方法，所述方法在步骤(a)之前还包括：
使所述生物样品与和所述生物样品中的分析物直接或间接地结合的环状或可环化探针或探针组接触，和
使用所述环状或可环化探针或探针组作为模板生成所述RCA产物。
53.根据权利要求51或52所述的方法，其中所述荧光标记的检测探针是不带电荷的或者静电负性低于在糖-磷酸主链上具有相同的荧光标记和核碱基序列的参考检测探针。
54.根据权利要求52-53中任一项所述的方法，其中所述环状或可环化探针或探针组与所述分析物的核酸序列杂交。
55.根据权利要求52-53中任一项所述的方法，其中所述环状或可环化探针或探针组与标记剂的报告寡核苷酸杂交，其中所述标记剂还包含与所述分析物直接或间接地结合的结合部分，其中所述报告寡核苷酸对应于所述结合部分和/或所述分析物。
56.根据权利要求51-55中任一项所述的方法，其中所述中间探针在合成主链上包含与所述靶标序列杂交的核碱基序列，任选地其中与在糖-磷酸主链上具有相同核碱基序列的参考中间探针相比，有更多的所述中间探针的分子在所述RCA产物的内部杂交。
57.根据权利要求51-56中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的检测探针和/或所述中间探针为吗啉代物。
58.根据权利要求51-57中任一项所述的方法，其中所述RCA产物具有小于约1.5μm的直径。
59.根据权利要求51-58中任一项所述的方法，其中在所述接触步骤中，所述荧光标记的检测探针的分子数不超过所述RCA产物中所述靶标序列的拷贝数的5倍、不超过4倍、不超过3倍、不超过2倍或不超过1.5倍。
60.根据权利要求51-59中任一项所述的方法，其中所述RCA产物中的所述靶标序列的至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％或至少约90％的拷贝与所述中间探针和/或所述荧光标记的检测探针的一个或更多个分子直接或间接地结合。
61.根据权利要求51-60中任一项所述的方法，其中使所述生物样品与所述参考检测探针的多个分子接触，并且与所述参考检测探针相比，更多的所述荧光标记的检测探针的分子与所述生物样品中的所述RCA产物结合。
62.根据权利要求51-61中任一项所述的方法，所述方法还包括：
去除与所述生物样品中的所述RCA产物结合的所述荧光标记的检测探针和所述中间探针的分子。
63.根据权利要求51-62中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的检测探针为第一荧光标记的检测探针，所述中间探针为第一中间探针，并且所述方法还包括使所述生物样品与第二荧光标记的检测探针接触，其中：
所述第二荧光标记的检测探针在合成主链上包含与第二中间探针杂交的核碱基序列，所述第二中间探针与所述靶标序列杂交，并且
检测与所述生物样品中的所述RCA产物结合的所述第二荧光标记的检测探针的分子。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述第二中间探针在合成主链上包含与所述靶标序列杂交的核碱基序列，任选地其中与在糖-磷酸主链上具有相同核碱基序列的参考中间探针相比，有更多的所述第二中间探针的分子在所述RCA产物的内部杂交。
65.一种组合物，所述组合物包含：
DNA多联体，所述DNA多联体包含靶标序列的多个拷贝，
多个中间探针，所述多个中间探针与所述靶标序列杂交，和
多个荧光标记的检测探针，所述多个荧光标记的检测探针中的每一个在合成主链上包含核碱基序列，
其中所述DNA多联体、所述中间探针的至少一个分子和所述荧光标记的检测探针的至少一个分子形成杂交复合物，任选地其中所述杂交复合物包含所述中间探针的多个分子和所述荧光标记的检测探针的多个分子。
66.根据权利要求65所述的组合物，其中所述DNA多联体为滚环扩增(RCA)产物。
67.根据权利要求66所述的组合物，其中所述RCA产物使用与所述生物样品中的分析物直接或间接地结合的环状或可环化探针或探针组作为模板在生物样品中原位生成。
68.根据权利要求65-67中任一项所述的组合物，其中所述荧光标记的检测探针是不带电荷的或者静电负性低于在糖-磷酸主链上具有相同的荧光标记和核碱基序列的参考检测探针。
69.根据权利要求65-68中任一项所述的组合物，其中所述中间探针在合成主链上包含与所述靶标序列杂交的核碱基序列，任选地其中所述中间探针是不带电荷的或者静电负性低于在糖-磷酸主链上具有相同核碱基序列的参考中间探针。
70.根据权利要求65-69中任一项所述的组合物，其中所述荧光标记的检测探针中的至少一部分与所述中间探针杂交。
71.根据权利要求65-70中任一项所述的组合物，其中所述荧光标记的检测探针和/或所述中间探针为吗啉代物。
72.根据权利要求65-71中任一项所述的组合物，其中所述DNA多联体具有小于约1.5μm的直径。
73.根据权利要求65-72中任一项所述的组合物，其中所述DNA多联体中的所述靶标序列的至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％或至少约90％的拷贝与所述中间探针和/或所述荧光标记的检测探针的一个或更多个分子直接或间接地结合。
74.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
荧光标记的检测探针，所述荧光标记的检测探针在合成主链上包含核碱基序列，其中所述荧光标记的检测探针中的至少一部分与中间探针杂交，和
中间探针，所述中间探针在合成主链上包含与靶标序列杂交的核碱基序列。
75.根据权利要求74所述的试剂盒，其中所述荧光标记的检测探针和所述中间探针为吗啉代物。
76.根据权利要求74或75所述的试剂盒，所述试剂盒还包括包含所述靶标序列或其补体的环状或可环化探针或探针组，其中所述探针或探针组能够与生物样品中的分析物直接或间接地结合并且使用所述探针或探针组作为模板生成滚环扩增产物。
77.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其中所述多个检测探针的所述结合在杂交缓冲液的存在下发生。
78.根据权利要求78所述的方法，其中所述杂交缓冲液包含将A:T碱基对的稳定性增加至大约G:C对的稳定性的试剂。
79.根据权利要求79所述的方法，其中所述试剂包含铵离子。
80.根据权利要求80所述的方法，其中所述试剂为四甲基氯化铵。
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