JP2002503948A - 単分子セグメントの増幅および検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ローリングサークル複製を含む目的の分子の増幅および複合検出のための組成物および方法が開示される。この方法は、サンプル中の複数の特定の核酸を高い特異性および感度で、同時に検出するために有用である。この方法はまた、本来的に低いレベルのバックグラウンドシグナルを有する。この方法の好ましい形態は、会合操作、増幅操作、および検出操作からなる。会合操作は、１つ以上の特異的に設計されたプローブ分子（全体的にか、または部分的にかのいずれかの核酸）の、目的の標的分子への会合を含む。この操作は、プローブ分子をサンプル中の標的分子に会合させる。増幅操作は、環状核酸分子（増幅標的サークルと呼ばれる）のローリングサークル複製であり、これは、プローブ分子の一部であるかまたは標的分子にハイブリダイズするかのいずれかである。ローリングサークル複製を用いた１回の増幅は、増幅標的サークルの大きな増幅を生じる。ローリングサークル複製の後、増幅された配列は、組合せ多色コードプローブを用いて検出され、これは、複数の異なる標的分子を表す複数の異なる増幅された標的サークルの、別々、同時、および定量的な検出を可能にする。増幅された産物は、サンプル中に存在する標的配列の量に直接比例するので、定量的な測定は、サンプル中の標的配列の量を信頼をもって表す。本方法の主要な利点は、非常に多くの異なる標的分子が、同時に検出され得ることであり、そしてサンプル中の種々の標的分子の量の差が、正確に定量され得ることである。DNA複製工程が等温性であり、そして増幅反応が直線的であり、そして高度に進行する酵素によって触媒されるのでシグナルは厳密に定量的であることもまた有利である。

Description

【発明の詳細な説明】 単分子セグメントの増幅および検出 開示される発明は、一般に核酸の検出のためのアッセイの分野にあり、そして 特に核酸の増幅および配列決定の分野にある。本発明はまた、ローリングサーク ル増幅の分野にある(例えば、Lewin、「Genes II」（J．Wiley and sons，1985 ）525頁を参照のこと)。 多くの方法が開発されており、これらは、核酸の検出に基づく極めて感度の良 い診断アッセイの実行を可能にする。これらの方法のほとんどは、標的またはプ ローブの指数関数的な増幅を利用する。これらには、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR )、連結鎖反応(LCR)、自己維持（self-sustained）配列複製(3SR)、核酸配列に 基づく増幅(NASBA)、鎖置換増幅(SDA)、およびQβレプリカーゼでの増幅（Birke nmeyerおよびMushahwar，J．Virological Methos，35:117H26(1991);Landegren ，Trends Genetics，9:199-202(1993)）が含まれる。 これらの方法の全てが、約100標的分子の実施上の検出限界を有しつつ、良好 な感度を提供する一方、これらの全てが、定量的な測定において比較的精度の低 いことに悩まされる。この精度のなさは、診断アッセイが複数のフォーマットで 、つまりいくつかの異なる標的配列の同時検出のために設計されたフォーマット で実行される場合、それ自体が最も劇的に顕著になる。 実際の診断への適用において、多くの標的について同時にアッセイすることが 望ましい。このような複合アッセイは、代表的には５つ以上の標的を検出するた めに用いられる。これらのアッセイにおける標的についての正確な定量的データ を得ることがまた望ましい。例えば、ウイルス血症は、HIV-1、およびＣ型肝炎 のようなウイルスについての疾患状態に相関され得ることが実証されている(Lef rereら、Br．J．Haematol.，82(2):467-471(1992)，Gunjiら、Int．J．Cancer， 52(5):726-730(1992)，Hagiwaraら、Hepatology，17(4):545-550(1993)，Luら、 J．Infect．Dis.，168(5):1165-8116(1993)，Piatakら、Science，259(5102):17 49-1754(1993)，Guptaら、Ninth International Conference on AIDS/Fourth STD World Congress，June 7-11，1993，Berlin，Germany，Sakselaら、Proc．N atl．Acad．Sci．USA，91(3):1104-1108(1994))。ウイルス負荷（load）を正確 に定量するための方法は有用である。 複合アッセイにおいて、異なる標的の定量的測定は、標的配列の真の比を反映 するとこが特に望ましい。しかし、複合的、指数関数的核酸増幅法を用いて得ら れるデータは、せいぜい半定量的である。多くの因子が関与している： １．複合アッセイが、異なる標的配列に対して異なるプライミング事象を包含す る場合、これらの事象の相対的効率は、異なる標的について変化し得る。これは 、用いられる種々のプライマー間での安定性および構造の差に起因する。 ２．産物鎖再生の速度が異なる標的に対して異なる場合、プライミング事象との 競合の程度は、全ての標的に対して同一ではない。 ３．複数の連結事象を包含する反応（例えば、LCR）については、各標的配列に 対する連結事象の相対的効率における小さいがしかし有意な差が存在し得る。連 結事象は多数回繰り返されるので、この効果は増幅される。 ４．逆転写（3SR、NASBA）またはクレノウ鎖置換（SDA）を包含する反応につい ては、重合の進行度の程度は、異なる標的配列間で異なり得る。 ５．異なる複製可能RNAプローブを包含するアッセイについては、各プローブの 複製効率は、通常同一ではなく、従って、プローブは、Qβレプリカーゼによっ て触媒される複製反応において不均等に競合する。 ６．増幅の１サイクルにおける収量の比較的小さい差は、数回のサイクルの後に 、増幅収量の大きな差を生じる。例えば、25増幅サイクルで、そして１サイクル あたり10％の収量差（つまり１サイクルあたり２倍対1.8倍増幅）を伴うPCR反応 においては、収量は2.0²⁵=33,554,000対1.8²⁵=2,408,800である。25サイクル後 の全収量差は、14倍である。増幅の30サイクル後には、収量差は、20倍より多い 。 従って、複合アッセイにおいて可変のそしておそらくは誤差を有するシグナル を生じる可能性の低い増幅方法についての必要性が存在する。 それゆえ、サンプル中の標的配列の量に比例する増幅収量を伴う診断的核酸増 幅方法を提供することが、開示される発明の目的である。 検出効率が標的配列の構造に依存しないサンプル中に存在する特定の標的核酸 配列を検出する方法を提供することは、開示される発明の別の目的である。 測定されるシグナルレベルが、サンプル中の標的配列の量に比例し、そして異 なる標的配列について測定されるシグナルレベルの比が、サンプル中に存在する 異なる標的配列の量の比に実質的に適合するサンプル中に存在する、特定の標的 核酸配列の量を決定する方法を提供することは、開示される発明の別の目的であ る。 異なる標的核酸配列について測定されるシグナルレベルの比が、サンプル中に 存在する異なる標的核酸配列の量の比に実質的に適合する単一のサンプル中の複 数の特定の標的核酸配列の量を検出および決定する方法を提供することは、開示 される発明の別の目的である。 インサイチュで標的核酸配列の単一のコピーの存在を検出する方法を提供する ことは、開示される発明の別の目的である。 標的遺伝子エレメントの個々の対立遺伝子を表す標的核酸配列の存在を検出す る方法を提供することは、開示される発明の別の目的である。 サンプル中の目的の複数の分子の相対的な量を検出し、そして決定する方法を 提供することは、開示される発明の別の目的である。 標的核酸配列の配列を決定するための方法を提供することは、開示される発明 の別の目的である。 標的核酸配列の混合物中に存在する配列の範囲を決定する方法を提供すること は、本発明の別の目的である。 発明の要旨 開示されるのは、特定の標的配列または分析物の存在に基づく核酸配列を増幅 するための組成物および方法である。サンプル中の特定の核酸または分析物を、 高い特異性および感度を伴って検出するために、本方法は有用である。本方法は また、固有の低レベルのバックグラウンドシグナルを有する。本方法の好ましい 実施態様は、DNA連結操作、増幅操作、および必要に応じて検出操作からなる。D NA連結操作は、特別に設計された核酸プローブ分子を環状にする。この工程は、 標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションに依存し、そしてサンプル中に 存在する標的配列の量に比例して環状のプローブ分子を形成する。増幅操作は、 環状化されたプローブのローリングサークル複製である。ローリングサークル複 製を用いた増幅の単一ラウンドは、各サイクルが標的配列のコピー数の２倍化に 限定されるPCR複製および他の増幅技術の単一サイクルよりも数オーダー大きい 環状化プローブ配列の大きな増幅を生じる。ローリングサークル増幅はまた、連 結操作とは独立に行われ得る。核酸タグを特定の結合分子（例えば、抗体）に結 合することによって、核酸タグの増幅は、サンプル中の分析物を検出するために 用いられ得る。これは、増幅標的サークルが、レポーター結合分子上の増幅可能 なタグとして作用するか、または増幅標的サークルが、レポーター結合分子の一 部であるローリングサークル複製プライマーを用いて増幅される場合の分析物の 検出のために好ましい。必要に応じて、さらなる増幅操作が、ローリングサーク ル複製によって生成されるDNAにおいて行われ得る。 増幅に続いて、増幅された配列は、核酸のための従来の検出システム（例えば 、蛍光標識の検出、酵素結合検出システム、抗体媒介標識検出、および放射標識 の検出）のいずれかを用いて検出および定量され得る。増幅された生成物は、サ ンプル中に存在する標的配列の量に直接比例するので、定量的測定は、サンプル 中の標的配列の量を信頼性を有して表す。本方法の主要な利点は、連結操作が対 立遺伝子区別（allelic discrimination）を得るために操作され得ること、増幅 操作が等温性であること、および増幅反応が直線的であり、そして高度に進行す る酵素によって触媒されるので、シグナルが厳密に定量的であることである。複 合アッセイにおいて、DNA複製のために用いられるプライマーオリゴヌクレオチ ドは、全てのプローブについて同一であり得る。 増幅に続いて、増幅された配列のヌクレオチド配列は、従来の手段によるか、 または増幅された標的配列のプライマー伸長配列決定によるかのいずれかで決定 され得る。プライマー伸長配列決定の２つの好ましい態様が開示される。単分子 セグメント増幅および配列決定（USA-SEQ）（単一ヌクレオチドプライマー伸長 配列決定の一形態）は、識別ヌクレオチドの同定に基づく特定のそして同定可能 なヌクレオチドの組み込みによる増幅された標的配列中での単一ヌクレオチドの 識別を含む。単分子セグメント増幅およびCAGE配列決定（USA-CAGESEQ）（縮重 プローブプライマー伸長配列決定の一形態）は、増幅された標的配列にハイブリ ダイズした識別プライマーへの縮重プローブの逐次的付加を含む。複数のプロー ブの付加は、3'末端の除去可能なケージの存在によって防止される。縮重プロー ブの付加の後、このケージは除去されそしてさらに縮重したプローブが付加され 得るか、または最後の操作として、識別プライマーの末端の隣のヌクレオチドま たは最後に付加された縮重プローブがUSA-SEQにおけると同様に識別されてその 同一性を決定する。開示されるプライマー伸長配列決定法は、標的配列の混合物 中の複数の異なる配列の存在を同定するために有用である。 開示される方法は、標的核酸配列の単純で、定量的で、そして一定の増幅およ び検出を提供する２つの特徴を有する。第一に、標的配列は、不定のプライマー 結合配列を有する小さな診断プローブを介して増幅されることである。このこと により、プライミングおよび複製反応が、非常に異なる標的配列を有するプロー ブ間でさえも一定になる。第二に、増幅が、サイクルではなく、逐次的な等温性 の複製：ローリングサークル複製で起こることである。このことにより、増幅が より複雑ではなくそして出力においてより一定になる。 さらに開示されるのは、ローリングサークル複製を含む、目的の分子の複合検 出のための組成物および方法である。本方法は、高い特異性および感度を伴いつ つ、サンプル中の複数の特定の核酸を同時に検出するために有用である。本方法 はまた、固有の低レベルのバックグラウンドシグナルを有する。本方法の好まし い形態は、会合操作、増幅操作、および検出操作からなる。会合操作は、一つ以 上の特別に設計されたプローブ分子（全部または部分的のいずれかで核酸）の目 的の標的分子への会台を含む。この操作は、プローブ分子をサンプル中に存在す る目的の標的分予に会合させる。増幅操作は、環状核酸分子（増幅標的サークル と呼ばれる）のローリングサークル複製であり、これらの環状核酸分子はプロー ブ分子の一部かまたはプローブ分子にハイブリダイズされる。ローリングサーク ル複製を用いる単一ラウンドの増幅は、各サイクルが標的配列のコピー数の２倍 化に限定されるPCR増幅および他の増幅技術の単一サイクルよりも、数オーダー 大きい増幅標的サークルの大きな増幅を生じる。核酸タグを特定の結合分子（例 えば、抗体）に結合することによって、核酸タグの増幅は、サンプル中の分析物 を検出するために用いられ得る。 ローリングサークル複製に続いて、増幅された配列は、複数の異なる標的分子 を表す複数の異なる増幅標的配列の別々の、同時の、そして定量的な検出を可能 にする組合せ多色コードプローブを用いて検出され得る。増幅された生成物は、 サンプル中の標的配列の量に直接比例するので、定量的な測定は、サンプル中の 標的配列の量を信頼性を有して表す。本方法の主要な利点は、非常に多くの異な る標的分子が、同時に検出され得ることであり、そしてサンプル中の種々の標的 分子の量の差が、正確に定量され得ることである。DNA複製工程が等温性であり 、そして増幅反応が直線的であり、そして高度に進行する酵素によって触媒され るのでシグナルは厳密に定量的であることもまた有利である。 開示される方法は、複数の標的分子の単純で、定量的で、そして一定の検出を 提供する２つの特徴を有する。第一に、増幅が、サイクルではないが、逐次的な 等温性の複製：ローリングサークル複製で起こることである。このことにより、 増幅がより複雑ではなくそして出力においてより一定になる。第二に、組合せ多 色コードは、多くの異なる標的分子の感度の良い同時検出を可能にすることであ る。 図面の簡単な説明 図１は、標的配列にハイブリダイズする開環プローブの一例の線図である。こ の線図は、標的配列と右および左標的プローブとの間の関係を示す。 図２は、ギャップオリゴヌクレオチドおよび標的配列にハイブリダイズした開 環プローブの一例の線図である。この線図は、標的配列、ギャップオリゴヌクレ オチド、ならびに右および左標的プローブとの間の関係を示す。 図３は、標的配列にハイブリダイズしそして連結した開環プローブの線図であ る。この線図は、開環プローブが、どのように位相幾何学的に標的配列にロック されるかを示す。 図４は、標的配列を含む核酸に位相幾何学的にロックされた開環プローブのロ ーリングサークル増幅の線図である。 図５は、開環プローブの一例の線図である。開環プローブの種々の部分は、異 なる中塗りによって示される。 図６は、縦列配列DNA（TS-DNA）ならびに開環プローブおよびギャップオリゴ ヌクレオチドの右および左標的プローブの一部に対応するTS-DNAの部分にハイブ リダイズするように設計されたアドレスプローブの線図である。TS-DNAは、配列 番号２、そしてアドレスプローブは配列番号３である。 図７は、TS-DNAの捕捉および検出の線図である。捕捉は、固体状態検出器に結 合したアドレスプローブへのTS-DNAのハイブリダイゼーションによってもたらさ れる。検出は、捕捉されたTS-DNAへの二次検出プローブのハイブリダイゼーショ ンによってもたらされる。開環プローブの種々の部分に対応するTS-DNAの部分は 、異なる中塗りによって示される。 図８は、連結媒介ローリングサークル複製およびその後の転写（LM-RCT）の一 例の線図である。上段に図示されるのは、ギャップオリゴヌクレオチドおよび開 環プローブであり、プライマー相補部分ならびにそれぞれ標的配列にハイブリダ イズされた右および左標的プローブ部分に隣接するプロモーダー部分を有してい る。下段に図示されるのは、開環プローブおよびギャップオリゴヌクレオチドの 連結されていないコピーにハイブリダイズしたローリングサークル複製産物であ る。このハイブリダイゼーションは、転写のための２本鎖基質を形成する。 図９は、増幅されたシグナルの生成のための開環プローブおよびLM-RCTを利用 する複合抗体アッセイの一例の線図である。図示されているのは、３つのレポー ター抗体であり、それぞれ異なるオリゴヌクレオチドをDNAタグとして有する。 下段に図示されるのは、結合したレポーター抗体に結合したDNAタグのみの増幅 である。 図10は、特定の増幅された核酸の複合検出のための２つのスキームの線図であ る。上段に図示されるのは、増幅された核酸への異なる標識を有する検出プロー ブのハイブリダイゼーションである。下段に図示されるのは、ある形態で結合し た異なる可能な増幅産物のためのアドレスプローブを有する固体状態検出器への 増幅された核酸のハイブリダイゼーションである。 図11Aおよび11Bは、二次DNA鎖置換の一例の線図である。図11Aの上段に図示さ れるのは、ギャップオリゴヌクレオチドおよび標的配列にハイブリダイズした開 環プローブである。図11Aの下段に図示されるのは、二次DNA鎖置換プライマーに ハイブリダイズしたローリングサークル複製産物である。図11Bに図示されるの は、複数のプライマーから開始される二次DNA鎖置換である。図11Bは、ローリン グサークル複製と同時に行われる二次DNA鎖置換を図示する。 図12は、増幅されていない第一開環プローブを標的配列として用いてネストさ れた（nested）RCAの一例の線図である。上段に図示されるのは、ギャップオリ ゴヌクレオチドおよび標的配列にハイブリダイズした第一開環プローブ、ならび に第一開環プローブにハィブリダイズした二次開環プローブである。下段に図示 されるのは、二次開環プローブのローリングサークル複製産物である。 図13は、鎖置換カスケード増幅の一例の線図である。図示されているのは、４ つのTS-DNAの生成の合成およびテンプレート関係である。TS-DNA-1は、ローリン グサークル複製プライマーによって開始されるローリングサークル複製によって 生成される。TS-DNA-2およびTS-DNA-4は、二次DNA鎖置換プライマー（P2）によ って開始される二次DNA鎖置換によって生成される。TS-DNA-3は、三次DNA鎖置換 プライマー（P1）によって開始される鎖置換二次DNA鎖置換によって生成される 。 図14は、反対の鎖の増幅の一例の線図である。図示されているのは、DNA合成 が進行するにつれての反応の５つの異なる段階である。TS-DNA-2は、二次DNA鎖 置換プライマーによって開始されるTS-DNAの二次DNA鎖置換によって生成される 。ローリングサークル複製が、新たなTS-DNA配列を作製するにつれ、二次DNA鎖 置換プライマーは、新たに合成されるDNAにハイブリダイズし、そしてTS-DNA-2 の別のコピーの合成を開始する。 図15は、ギャップ配列を含む開環プローブの線図である。線図の下半分は、開 環プローブおよび識別プライマーの配列間の好ましい関係を示す。 図16A、16B、および16Cは、３つの異なる核酸サンプルに関して行った単分子 セグメントの増幅および配列決定（USA-SEQ）の結果を示す線図である。大きな 円は、固体状態支持体上にドットされた標的サンプルを示す。小さい円は、個々 のTS-DNA分子であって、サンプル中の標的核酸の位置でインサイチュで増幅され 、プライマー伸長配列決定に供されたものを表す。図16Aは、野生型配列につい てホモ接合性であるサンプルの代表例である（シスチンの組込みによって示され る）。図16Bは、野生型および変異体についてヘテロ接合性であるサンプルの代 表例である（シスチンおよびアデニンの組込みを生じる同数のTS-DNA分子によっ て示される）。図16Cは、ホモ接合体であるが、体細胞性変異を有するいくつか の細胞を含むサンプルの代表例である。 図17Aおよび17Bは、反復配列の異なる量を有する２つの標的配列に対する開環 プローブの関係の一例の線図である。開環プローブの左標的プローブおよび右標 的プローブの、２つの異なる標的配列へのハイブリダイゼーションが示される 列中の配列に相補的なヌクレオチドであり、これは左および右標的プローブの間 のギャップスペースを充填して開環プローブを増幅標的サークルへ連結させる。 線図に示される配列は、実施例10に記載されるアッセイに関する。図17Aにおい て、標的配列は、配列番号24であり、左標的配列は、配列番号25のヌクレオチド 76〜96であり、右標的配列は、配列番号25のヌクレオチド１〜24であり、そして 充填配列は、配列番号25のヌクレオチド97〜128である。図17Bにおいて、標的配 列は、配列番号23であり、左標的配列は、配列番号18のヌクレオチド２〜21であ り、右標的配列は、配列番号25のヌクレオチド１〜24であり、そして充填配列は 、配列番号18のヌクレオチド22〜51である。 図18A、18B、18C、18D、および18Eは、一連の核酸サンプルを含むスライドお よび単分子セグメント増幅およびケージ配列決定（USA-CAGESEQ）の間のマスク を有するサンプルの列の適用範囲を示す線図である。 図19は、USA-CAGESEQに供されたスライド上のサンプルの第一カラムに組み込 まれたヌクレオチドを示す線図である。標的配列に対応するザンプルは、図17A に示される。 図20は、USA-CAGESEQに供されたスライド上のサンプルの第一のカラムに組み 込まれたヌクレオチドを示す線図である。標的配列に対応するサンプルは、図17 Bに示される。 図21A、21B、22A、22B、23A、23B、24A、および24Bは、TS-DNAにハイブリダイ ズされた識別プローブおよび縮重プローブから形成された識別プライマーを示す 。図は、５つのスライドおよび各スライドからの５つのサンプルドットの単一カ ラ ムを表すTS-DNAを示す。各列において、上部（より短い）配列は、識別プライマ ーであり、そして下部（より長い）配列は、TS-DNAの一部分である。識別プライ マーの下線を付していない部分は、識別プローブを示す。識別プライマーの下線 を付した部分は、一つ以上の縮重プローブの識別プローブの末端への逐次的な連 結によって形成された。太字のヌクレオチドは、プライマー伸長の間に識別プラ イマーに付加されたヌクレオチドである。図21A、21B、22A、および22Bに示され るTS-DNA配列は、図17Aに示される標的配列に関連し、そして配列番号19のヌク レオチド１〜60に対応する。図21A、21B、22A、および22B中の識別プライマー配 列は、配列番号25のヌクレオチド76〜125の種々の部分に対応する。図23A、23B 、24A、および24Bに示される配列は、図17Bに示される標的配列に関し、そして 配列番号26のヌクレオチド１〜58に対応する。図23A、23B、24Aおよび24B中の識 別プライマー配列は、配列番号18のヌクレオチド１〜50の種々の部分に対応する 。 図25Aおよび25Bは、ペプチド核酸（親和性部分として）およびローリングサー クル複製プライマー（オリゴヌクレオチド部分として）からなるレポーター結合 分子の線図である。親和性部分は、標的DNAにハイブリダイズすることが示され る。図25Bにおいて、増幅標的サークルは、オリゴヌクレオチド部分（つまり、 ローリングサークル複製プライマー）にハイブリダイズすることが示される。 図26Aおよび26Bは、標的DNAに位相幾何学的にロックされた連結された開環プ ローブにハイブリダイズするレポーター結合分子の線図である。レポーター結合 分子は、ペプチド核酸（親和性部分として）およびローリングサークル複製プラ イマー（オリゴヌクレオチド部分として）からなる。図26Bにおいて、増幅標的 サークルは、オリゴヌクレオチド部分（つまり、ローリングサークル複製プライ マー）にハイブリダイズすることが示される。 図27Aおよび27Bは、化学的に連結したトリプルヘリックス形成オリゴヌクレオ チド（親和性部分として）およびオリゴヌクレオチド部分としてのローリングサ ークル複製プライマーからなるレポーター結合分子の線図である。親和性部分は 、標的DNAにハイブリダイズすることが示された。PSは、親和性部分と標的DNAと の間の化学的連結を作製するソラレン誘導体を示す。図27Bにおいて、増幅標的 サークルは、オリゴヌクレオチド部分（つまり、ローリングサークル複製プライ マ ー）にハイブリダイズすることが示される。 図28Aおよび28Bは、標的DNAに位相幾何学的にロックされた連結した開環プロ ーブにハイブリダイズするレポーター結合分子の線図である。レポーター結合分 子は、化学的に連結したトリプルヘリックス形成オリゴヌクレオチド（親和性部 分として）およびオリゴヌクレオチド部分としてのローリングサークル複製複製 プライマーからなる。PSは、親和性部分と標的DNAとの間の化学的連結を作製す るソラレン誘導体を示す。図28Bにおいて、増幅標的サークルは、オリゴヌクレ オチド部分（つまり、ローリングサークル複製プライマー）にハイブリダイズす ることが示される。 図29Aおよび29Bは、抗体（親和性部分として）およびローリングサークル複製 プライマー（オリゴヌクレオチド部分として）からなるレポーター結合分子の線 図である。親和性部分は標的抗原に結合することが示される。図29Bにおいて、 増幅標的サークルは、オリゴヌクレオチド部分（つまり、ローリングサークル複 製プライマー）にハイブリダイズすることが示される。 発明の詳細な説明 開示された組成物および方法は、標的核酸配列の一致しそして定量的な増幅お よび検出を可能にする、特定の材料および手順を使用する。これらの材料および 手順は、以下に詳細に記載される。 開示された方法のいくつかの主要な特徴は以下の通りである： １．連結操作は、対立遺伝子区別（allelic discrimination）を得るために、特 に、ギャップ充填工程を使用して操作し得る。 ２．増幅操作は、等温である。 ３．シグナルは、厳密に定量的であり得る。なぜなら、増幅操作の特定の実施態 様において、増幅は線形であり、そして高度に進行する酵素によって触媒される 。複合アッセイにおいて、DNA複製に用いられるプライマーは、全てのプローブ について同一である。 ４．改変されたヌクレオチドまたは他の部分は、DNA複製またはDNA転写の間に取 り込まれ得る。 ５．増幅産物は、反復DNA分子であり、そして検出に有用である、任意に選択さ れたタグ配列を含み得る。 Ｉ．材料 Ａ．開環プローブ 開環プローブ（OCP）は、一般的には50〜1000ヌクレオチド、好ましくは約60 〜150ヌクレオチド、そして最も好ましくは約70〜100ヌクレオチドを含む、線状 一本鎖DNA分子である。OCPは、5'リン酸基および3'水酸基を有する。これは、末 端がDNAリガーゼを用いて連結されること、またはギャップ充填操作において伸 長されることを可能にする。OCPの部分は、OCPをRCAおよびLM-RCAのために有用 にする特異的な機能を有する。これらの部分を、標的プローブ部分、プライマー 相補体部分、スペーサー領域、検出タグ部分、二次標的配列部分、アドレスタグ 部分、およびプロモーター部分という（図５）。標的プローブ部分およびプライ マー相補体部分は、開環プローブに必要とされるエレメントである。プライマー 相補体部分は、スペーサー領域の一部分である。検出タグ部分、二次標的配列部 分、およびプロモーター部分は任意であり、そして存在する場合、スペーサー領 域の一部である。アドレスタグ部分は任意であり、そして存在する場合、スペー サー領域の一部であり得る。一般的に、開環プローブは、スペーサー領域の一部 として存在するプライマー相補部分とともに、5'末端から3'末端に、5'リン酸基 、右標的プローブ部分、スペーサー領域、左標的プローブ部分、および3'水酸基 を含む、一本鎖の線状DNA分子である。OCPの特定の部分に対応しないスペーサー 領域のセグメントは、任意に選択された配列であり得る。OCPは自己相補的であ る配列を全く有さないことが好ましい。この条件は、ミスマッチまたはギャップ を伴わずに、６より長いヌクレオチド長の相補的領域が存在しない場合に満たさ れると考えられる。プロモーター部分を含むOCPが、転写ターミネーター（例え ば、８以上のひと続きのチミジンヌクレオチド）が類似している配列を全く有さ ないこともまた好ましい。 開環プローブは、連結および複製される場合、開環プローブに相補的な配列の 複数の反復を含む長いDNA分子を生じる。この長いDNA分子を、本明細書中では縦 列配列DNA（TS-DNA）という。TS-DNAは、標的プローブ部分、プライマー相補体 部分、スペーサー領域、ならびに開環プローブ上に存在する場合、検出タグ部分 、二次標的配列部分、アドレスタグ部分、およびプロモーター部分に相補的な配 列を含む。TS-DNA中のこれらの配列を、標的配列（これは、もとの標的配列に適 合する）、プライマー配列（これは、ローリングサークル複製プライマーの配列 に適合する）、スペーサー配列（スペーサー領域に相補的である）、検出タグ、 二次標的配列、アドレスタグ、およびプロモーター配列という。 特に好ましい実施態様は、20ヌクレオチドの左標的プローブおよび20ヌクレオ チドの右標的プローブを含む、70〜100ヌクレオチドの開環プローブである。左 標的プローブおよび右標的プローブは、５ヌクレオチドのギャップ（これは、単 一のペンタヌクレオチドギャップオリゴヌクレオチドによって充填される）を残 して標的細胞にハイブリダイズする。 １．標的プローブ部分 各OCP上に二つの標的プローブ部分が（OCPの各末端に一つ）存在する。標的プ ローブ部分は、各々、標的プローブと標的配列との間の特異的かつ安定なハイブ リダイゼーションを支持する、任意の長さであり得る。この目的のためには、各 標的プローブ部分について10〜35ヌクレオチド長が好ましく、標的プローブ部分 については15〜20ヌクレオチド長が最も好ましい。OCPの3'末端の標的プローブ 部分を、左標的プローブといい、そしてOCPの5'末端の標的プローブ部分を、右 標的プローブという。これらの標的プローブ部分を、本明細書中で、左および右 標的プローブ、または左および右プローブともいう。標的プローブ部分は、標的 核酸配列に相補的である。 標的プローブ部分は、標的配列に相補的であり、その結果、ハイブリダイゼー ションすると、右標的プローブ部分の5'末端および左標的プローブ部分の3'末端 は、これらが連結のための基質として作用するという目的で、標的配列中の隣接 ヌクレオチドに対して塩基対合する（図１）。必要に応じて、標的プローブ部分 の5'末端および3'末端は、ギャップスペースによって隔てられるような方法でハ イブリダイズし得る。この場合、OCPの5'末端および3'末端は、１つ以上のさら なるオリゴヌクレオチド（ギャップオリゴヌクレオチドという）が用いられる場 合、またはギャップスペースが連結操作の間に充填される場合にのみ、連結され 得る。ギャップオリゴヌクレオチドは、ギャップスペース中の標的配列にハイブ リダイズして、連続したプローブ／標的ハイブリッドを形成する（図２）。ギャ ップスペースは、所望される任意の長さであり得るが、一般的には、10ヌクレオ チド以下である。ギャップスペースは、約３〜10ヌクレオチド長であることが好 ましく、ギャップスペースが４〜８ヌクレオチド長であることが最も好ましい。 あるいは、ギャップスペースは、DNAポリメラーゼを用いて、連結操作の間に充 填され得る（実施例３を参照のこと）。このようなギャップ充填操作を用いる場 合、３〜５ヌクレオチド長のギャップスペースが最も好ましい。別の代替法とし て、ギャップスペースは、１つ以上のギャップオリゴヌクレオチドによって、DN Aポリメラーゼを用いて充填されたギャップの残りに、部分的に架橋され得る。 ２．プライマー相補体部分 プライマー相補体部分は、開環プローブのスペーサー領域の一部分である。プ ライマー相補体部分は、ローリングサークル複製プライマー（RCRP）に相補的で ある。各OCPは、単一のプライマー相補体部分を有するべきである。これは、ロ ーリングサークル複製が、連結されたOCP上の単一部位で開始するのを可能にす る。プライマー相補体部分およびコグネイトプライマーは、互いに相補的である 限り、任意の所望の配列を有し得る。一般に、プライマー相補体の配列は、OCP の任意の他の部分と著しく類似しないように選択され得る。プライマー相補体部 分は、プライマー相補体部分とプライマーとの間の特異的かつ安定なハイブリダ イゼーションを支持する、任意の長さであり得る。この目的のために、10〜35ヌ クレオチド長が好ましく、16〜20ヌクレオチド長のプライマー相補体部分が最も 好ましい。プライマー相補体部分は、OCPのスペーサー領域内の任意の場所に位 置し得る。プライマー相補体部分は、右標的プローブに隣接することが好ましく 、右標的プローブ部分およびプライマー相補体部分は、好ましくは３〜10ヌクレ オチドによって隔てられ、そして最も好ましくは６ヌクレオチドによって隔てら れる。この位置は、DNA複製の間に連結されていない開環プローブから任意の他 のスペーサー配列（例えば、検出タグおよび二次標的配列）が生じることを防ぐ 。 ３．検出タグ部分 検出タグ部分は、開環プローブのスペーサー領域の一部分である。検出タグ部 分は、検出プローブの相補的部分の配列に適合する配列を有する。これらの検出 タグ部分は、ローリングサークル複製の間に増幅される場合、検出プローブの相 補的部分に相補的な検出タグ配列を有するTS-DNAを生じる。存在する場合、OCP 上に１つ、２つ、３つ、または３つより多くの検出タグ部分が存在し得る。OCP は、２つ、３つ、または４つの検出タグ部分を有することが好ましい。最も好ま しくは、OCPは、３つの検出タグ部分を有する。一般に、OCPは、60以下の検出タ グ部分を有することが好ましい。OCPの大きさを除いて、OCP上に存在し得る検出 タグ部分の数に対する基本的制限はない。複数の検出タグ部分が存在する場合、 それらは同じ配列を有し得るか、または異なる配列を有し得、各異なる配列は異 なる検出プローブに対して相補的である。OCPは同じ配列を有する検出タグ部分 を含み、その結果、それらは単一の検出プローブに対して全て相補的であること が好ましい。いくつかの複合検出法のためには、OCPが６までの検出タグ部分を 含むこと、および検出タグ部分が異なる配列を有し、その結果、各検出タグ部分 が異なる検出プローブに相補的であることが好ましい。検出タグ部分は、各々、 検出タグと検出プローブとの間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支 持する、任意の長さであり得る。この目的のために、10〜35ヌクレオチドの長さ が好ましく、15〜20ヌクレオチド長の検出タグ部分が最も好ましい。 ４．二次標的配列部分 二次標的配列部分は、開環プローブのスペーサー領域の一部である。二次標的 配列部分は、二次開環プローブの標的プローブの配列に適合する配列を有する。 これらの二次標的配列部分は、ローリングサークル複製中に増幅される場合、二 次開環プローブの標的プローブに相補的である二次標的配列を有する、TS-DNAを 生じる。存在する場合、OCP上に１つ、２つ、または２つより多くの二次標的配 列部分が存在し得る。OCPは、１つまたは２つの二次標的配列部分を有すること が好ましい。最も好ましくは、OCPは１つの二次標的配列部分を有する。一般的 に、OCPは、50以下の二次標的配列部分有することが好ましい。OCPの大きさを除 いて、OCP上に存在し得る二次標的配列部分の数に対する基本的な制限はない。 複数の二次標的配列部分が存在する場合、これらは同じ配列を有し得るか、また はこれらは異なる配列を有し得、各異なる配列は異なる二次OCPに相補的である 。OCPは同じ配列を有する二次標的配列部分を含み、その結果、それらが二次OCP の単一の標的プローブ部分に全て相補的であることが好ましい。二次標的配列部 分は各々、二次標的配列とそのコグネイトOCPの標的配列プローブとの間の、特 異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する、任意の長さであり得る。こ の目的のために、20〜70ヌクレオチドの長さが好ましく、30〜40ヌクレオチド長 の二次標的配列部分が最も好ましい。本明細書で使用されるように、二次開環プ ローブは、標的プローブ部分が別の開環プローブまたは増幅標的サークルにおけ る二次標的配列に適合するかまたは相補的である、開環プローブである。二次開 環プローブは、それ自身別の二次開環プローブの標的プローブ部分に適合するか または相補的である、二次標的配列を含み得ることが意図される。この様式で互 いに関連する二次開環プローブを、本明細書中では、ネストされた開環プローブ という。 ５．アドレスタグ部分 アドレスタグ部分は、標的プローブ部分または開環プローブのスペーサー領域 のいずれかの一部分である。アドレスタグ部分は、アドレスプローブの相補的な 部分の配列に適合する配列を有する。このアドレスタグ部分は、ローリングサー クル複製中に増幅される場合、アドレスプローブの相補的部分に相補的であるア ドレスタグ配列を有するTS-DNAを生じる。存在する場合、OCP上に１つまたは１ つより多くのアドレスタグ部分が存在し得る。OCPは１つまたは２つのアドレス タグ部分を有することが好ましい。最も好ましくは、OCPは１つのアドレスタグ 部分を有する。一般的に、OCPは50以下のアドレスタグ部分を有することが好ま しい。OCPの大きさを除いて、OCP上に存在し得るアドレスタグ部分の数に対する 基本的な制限はない。複数のアドレスタグ部分が存在する場合、それらは同じ配 列を有し得るかまたはそれらは異なる配列を有し得、各異なる配列は、異なるア ドレスプローブに相補的である。OCPは、同じ配列を有するアドレスタグ部分を 含み、その結果それらは単一のアドレスプローブに全て相補的であることが好ま しい。好ましくは、アドレスタグ部分は、標的プローブ部分の全てまたは一部、 および任意の介在ギャップスペースの全てに重複する（図６）。最も好ましくは 、 アドレスタグ部分は、左および右の両方の標的プローブ部分の全てまたは一部に 重複する。アドレスタグ部分は、アドレスタグとアドレスプローブとの間の特異 的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する、任意の長さであり得る。この 目的のために、10〜35ヌクレオチドの長さが好ましく、15〜20ヌクレオチド長の アドレスタグ部分が最も好ましい。 ６．プロモーター部分 プロモーター部分は、RNAポリメラーゼプロモーターの配列に対応する。プロ モーター部分は、開環プローブ中に含まれて、その結果、転写産物がTS-DNAから 生成し得る。任意のプロモーターの配列が用いられ得るが、複雑な必要条件を伴 わないRNAポリメラーゼのための単純なプロモーターが好ましい。プロモーター は、標的核酸配列を含む試料中に存在し得る、任意のRNAポリメラーゼによって 認識されないこともまた好ましい。好ましくは、プロモーター部分は、T7または SP6 RNAポリメラーゼプロモーターの配列に対応する。T7およびSP6 RNAポリメラ ーゼは、特定のプロモーター配列について高度に特異的である。この特徴を有す るRNAポリメラーゼに特異的な他のプロモーター配列もまた、好ましい。なぜな ら、プロモーター配列は、一般的に、特異的RNAポリメラーゼによって認識され るため、OCPのプロモーター部分についてのコグネイトポリメラーゼは、転写増 幅に用いられるべきであるからである。多数のプロモーター配列が既知であり、 そして適切なRNAポリメラーゼに特異的な任意のプロモーターが用いられ得る。 プロモーター部分は、OCPのスペーサー領域内の任意の場所に位置し得、そして いずれの方向でも存在し得る。好ましくは、プロモーター部分は、左標的プロー ブに直接隣接し、そして転写を、開環プローブの3'末端の方向に向かって進める ように方向付ける。この方向は、TS-DNAに相補的である転写産物を生じ、このこ とは、TS-DNAおよび転写産物の独立した検出を可能にし、そして転写がローリン グサークル複製に干渉するのを防ぐ。 Ｂ．ギャップオリゴヌクレオチド ギャップオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズした開環プローブの末端の間 のギャップスペースをカバーする標的配列の部分の全てまたは一部分に相補的で あるオリゴヌクレオチドである。ギャップオリゴヌクレオチドの例および標的配 列および開環プローブへのその関連を、図２に示す。ギャップオリゴヌクレオチ ドは、その5'末端にリン酸基を有し、そしてその3'末端に水酸基を有する。これ は、開環プローブへの、または他のギャップオリゴヌクレオチドへのギャップオ リゴヌクレオチドの連結を容易にする。ハイブリダイズした開東プローブの末端 の間のギャップスペースは、単一のギャップオリゴヌクレオチドで充填され得る か、またはこれは複数のギャップオリゴヌクレオチドで充填され得る。例えば、 ２つの３ヌクレオチドのギャップオリゴヌクレオチドは、６ヌクレオチドのギャ ップスペースを充填するために用いられ得るか、または３ヌクレオチドのギャッ プオリゴヌクレオチドおよび４ヌクレオチドのギャップオリゴヌクレオチドは、 ７ヌクレオチドのギャップスペースを充填するために用いられ得る。ギャップオ リゴヌクレオチドは、密接に関連する標的配列間を区別するために特に有用であ る。例えば、複数のギャップオリゴヌクレオチドは、標的配列の異なる対立遺伝 子改変体を増幅するために用いられ得る。変化が生じる標的配列の領域を開環プ ローブによって形成されるギャップペース中に配置することによって、単一の開 環プローブは、ギャップオリゴヌクレオチドの適切なセットを用いて、各々の個 々の改変体を増幅するために用いられ得る。 Ｃ．増幅標的サークル 増幅標的サークル（ATC）は、環状一本鎖DNA分子であり、一般的に、40〜1000 ヌクレオチド、好ましくは、約50〜150ヌクレオチド、そして最も好ましくは、 約50〜100ヌクレオチドを含む。ATCの部分は、ATCをローリングサークル増幅（R CA）に有用にする特定の機能を有する。これらの部分を、プライマー相補体部分 、検出タグ部分、二次標的配列部分、アドレスタグ部分、およびプロモーター部 分という。プライマー相補体部分は、増幅標的サークルの必要とされるエレメン トである。検出タグ部分、二次標的配列部分、アドレスタグ部分、およびプロモ ーター部分は、任意である。一般的に、増幅標的サークルは、ブライマー相補体 部分を含む一本鎖環状DNA分子である。ATCの特定の部分に対応しないATCのセグ メントは、任意に選択された配列であり得る。ATCは、自己相補的である配列を 全く有さないことが好ましい。ミスマッチまたはギャップを伴わない６より大き なヌクレオチド長の相補的な領域が存在しない場合、この条件を満たすと考えら れ る。プロモーター部分を含むATCが、転写ターミネーター（例えば、８以上のひ と続きのチミジンヌクレオチド）に類似の配列を全く有さないこともまた好まし い。連結された開環プローブは、一種のATCであり、そして本明細書中で用いら れる用語、増幅標的サークルは、連結された開環プローブを含む。ATCは、連結 されたOCPについて本明細書中に記載されたのと同様の様式で用いられ得る。 増幅標的サークルは、複製される場合、増幅標的サークルに相補的な配列の複 数の反復を含む、長いDNA分子を生じる。この長いDNA分子を、本明細書中で縦列 配列DNA（TS-DNA）という。TS-DNAは、プライマー相補体部分に相補的な配列を 含み、そして存在する場合、増幅標的サークル、検出タグ部分、二次標的配列部 分、アドレスタグ部分、およびプロモーター部分上である）。TS-DNAにおけるこ れらの配列を、プライマー配列（これは、ローリングサークル複製プライマーの 配列に適合する）、スペーサー配列（スペーサー領域に相補的）、検出タグ、二 次標的配列、アドレスタグ、およびプロモーター配列という。増幅標的サークル は、特定の結合分子のためのタグとして有用である。 Ｄ．ローリングサークル複製プライマー ローリングサークル複製プライマー（RCRP）は、OCPまたはATCのプライマー相 補体部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。この配列を、RCRP の相補的な部分という。RCRPの相補的な部分およびコグネイトプライマー相補体 部分は、それらがお互いに相補的である限り、任意の所望の配列を有し得る。一 般的に、RCRPの配列は、OCPまたはATCの任意の他の部分に著しく相補的でないよ うに選択され得る。ローリングサークル複製プライマーの相補的な部分は、プラ イマーとプライマー相補体部分との間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーショ ンを支持する、任意の長さであり得る。一般的に、これは10〜35ヌクレオチド長 であるが、好ましくは、16〜20ヌクレオチド長である。 ローリングサークル複製プライマーはまた、OCPまたはATCのいずれの部分にも 相補的ではないさらなる配列をRCRPの5'末端に含むことが好ましい。この配列を 、RCRPの非相補的な部分という。RCRPの非相補的な部分は、存在する場合、DNA 複製中に鎖置換を容易にするために作用する。RCRPの非相補的な部分は、任意の 長さであり得るが、一般的には、１〜100ヌクレオチド長、そして好ましくは、 ４ 〜８ヌクレオチド長である。ローリングサークル複製プライマーはまた、それを エキソヌクレアーゼ消化に耐性にする、改変されたヌクレオチドを含み得る。例 えば、プライマーは、プライマーの5'末端でのヌクレオチド間の、３または４の ホスホロチオエート結合を有し得る。このようなヌクレアーゼ耐性プライマーは 、過剰な非連結OCPおよびギャップオリゴヌクレオチドの選択的分解を可能にす る。さもなければこれらは、増幅された核酸に対する、検出プローブ、アドレス プローブ、および二次OCPのハイブリダイゼーションに干渉し得る。ローリング サークル複製プライマーは、鎖置換カスケード増幅における三次DNA鎖置換プラ イマーとして用いられ得る。 Ｅ．検出標識 RCAおよびRCTを用いて増幅された核酸の検出および定量を補助するために、検 出標識は、増幅された核酸に直接取り込まれ得るか、または検出分子に結合し得 る。本明細書で使用する場合、検出標識は、増幅された核酸と直接的または間接 的に会合し得、そして測定可能で検出可能なシグナルを、直接的または間接的の いずれかで生じる任意の分子である。核酸に取り込まれる、または核酸もしくは 抗体プローブに結合するための多くのこのような標識は、当業者に公知である。 RCAおよびRCTにおける使用に適切な検出標識の例は、放射性同位体、蛍光分子、 燐光分子、酵素、抗体、およびリガンドである。 適切な蛍光標識の例は、フルオレセイン（FITC）、5,6-カルボキシメチルフル オレセイン、テキサスレッド（Texas red）、ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジア ゾール-4-イル（NBD）、クマリン、ダンシルクロリド、ローダミン、4'-6-ジア ミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）、およびシアニン染料Cy3、Cy3.5、Cy5、 Cy5.5およびCy7を含む。好ましい蛍光標識は、フルオレセイン(5-カルボキシフ ルオレセイン-N-ヒドロキシサクシンイミドエステル)およびローダミン(5,6-テ トラメチルローダミン)である。組合せ多色コードのための好ましい蛍光標識は 、FITCおよびシアニン染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、およびCy7である。これら の蛍光の吸収極大および放出極大は、それぞれ：FITC（490nm；520nm）、Cy3（5 54nm；568nm）、Cy3.5（581nm；588nm）、Cy5（652nm；672nm）、Cy5.5（682nm ；703nm）、およびCy7（755nm；778nm）であり、従って、それらの 同時検出を可能にする。蛍光標識は、種々の市販の供給源（Molecular Probes， Eugene，OR and Research Organics，Cleveland，Ohioを含む）から入手可能で ある。 標識されたヌクレオチドは、検出標識の好ましい形態である。なぜなら、それ らは合成中にRCAおよびRCTの産物に直接取り込まれ得るからである。増幅された DNAまたはRNAに取り込まれ得る検出標識の例は、BrdUrd（HoyおよびSchimke，Mu tation Research 290:217-230(1993)）、BrUTP（Wansickら、J．Cell Biology 1 22:283-293(1993)）、およびビオチン（Langerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:6633(1981)）またはジゴキシゲニン（Kerkhof，Anal．Biochem．205:359-36 4(1992)）のような適切なハプテンで改変されたヌクレオチドのようなヌクレオ チドアナログを含む。適切な蛍光で標識されたヌクレオチドは、フルオレセイン -イソチオシアネート-dUTP、シアニン-3-dUTP、およびシアニン-5-dUTP（Yuら、 Nucleic Acids Res.，22:3226-3232(1994)である。DNAの好ましいヌクレオチド アナログ検出標識は、BrdUrd（BUDR三リン酸、Sigma）であり、そしてRNAの好ま しいヌクレオチドアナログ検出標識は、ビオチン-16-ウリジン-5'-三リン酸（ビ オチン-16-dUTP、Boehringher Mannheim）である。フルオレセイン、Cy3、およ びCy5は、直接標識のためにdUTPに結合し得る。Cy3.5およびCy7は、ビオチンで 標識したプローブまたはジゴキシゲニンで標識したプローブの二次検出のための アビジンまたは抗ジゴキシゲニン結合体として入手可能である。 増幅された核酸に取り込まれる検出標識（例えば、ビオチン）は、続いて、当 該分野で周知の鋭敏な方法を用いて検出され得る。例えば、ビオチンは、ストレ プトアビジン-アルカリホスファターゼ結合体（Tropix,Inc.）（これは、ビオチ ンに結合し、続いて適切な基質（例えば、化学発光基質CSPD：3-(4-メトキシス ピロ-[1,2,-ジオキシエタン-3-2'-(5'-クロロ)トリシクロ[3.3.1.1^3.7]デカン]- 4-イル)フェニルホスフェートニナトリウム；Tropix,Inc.)の化学発光によって 次に検出される）を用いて検出され得る。 増幅されたRNAの検出における使用のために好ましい検出標識は、アクリジニ ウム-エステル標識したDNAプローブ（GenProbe，Inc.，Arnoldら、Clinical Che mistry 35:1588-1594(1989)に記載される）である。アクリジニウム-エステル標 識した検出プローブは、洗浄を伴わないで、増幅されたRNAの検出を可能にする 。なぜなら、ハイブリダイズしていないプローブはアルカリで破壊され得るから である（Arnoldら、(1989)）。 これらの検出標識の２つ以上を組み合わせた分子はまた、検出標識と考えられ る。任意の公知の検出標識は、開示されたプローブ、タグ、および方法で、開示 された方法を用いて増幅された核酸を標識および検出するために用いられ得る。 検出標識によって生じるシグナルを検出および測定するための方法はまた、当業 者に公知である。例えば、放射性同位体は、シンチレーションカウンティングま たは直接的可視化によって検出され得る；蛍光分子は、蛍光分光光度計で検出さ れ得る；燐光分子は、分光光度計によって検出され得るかまたはカメラで直接可 視化され得る；酵素は、酵素によって触媒される反応の産物の検出または可視化 によって検出され得る；抗体は、抗体に結合した二次検出標識を検出することに よって検出され得る。このような方法は、増幅および検出の開示された方法にお いて直接用いられ得る。本明細書中で用いられる場合、検出分子は、増幅された 核酸と相互作用し、そして一つ以上の検出標識が結合された分子である。 Ｆ．検出プローブ 検出プローブは、TS-DNAまたはTS-DNAの転写産物上の検出タグに相補的な配列 を有する標識されたオリゴヌクレオチドである。検出プローブの相補的な部分は 、検出プローブと検出タグとの間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを 支持する、任意の長さであり得る。この目的のために、10〜35ヌクレオチドの長 さが好ましく、16〜20ヌクレオチド長の検出プローブの相補的な部分が最も好ま しい。検出プローブは、上記の任意の検出ラベルを含み得る。好ましい標識は、 ビオチンおよび蛍光分子である。特に好ましい検出プローブは、分子ビーコンで ある。分子ビーコンは、検出プローブがハイブリダイズされた場合にのみ蛍光部 分が蛍光を発する蛍光部分で標識された検出プローブである（TyagiおよびKrame r，Nature Biotechnology 14:303-308(1996)）。このようなプローブの使用は、 標識検出の前にハイブリダイズしていないプローブを除去する必要性を排除する 。なぜなら、ハイブリダイズしていない検出プローブは、シグナルを生成しない からである。これは、複合アッセイに特に有用である。 好ましい形態の検出プローブ（本明細書中では折り畳み（collapsing）検出プ ローブという）は、２つの別々の相補的な部分を含む。これは、各検出プローブ がTS-DNAにおける２つの検出タグにハイブリダイズするのを可能にする。このよ うにして、検出プローブは、TS-DNAの異なる部分の間で架橋を形成する。TS-DNA にハイブリダイズしている多数の折り畳み検出プローブの協同作用（combined a ction）は、架橋したTS-DNAの折り畳まれたネットワークを形成する。折り畳ま れたTS-DNAは、遊離の伸長したTS-DNAよりもずっと小さな容量を占め、そして検 出プローブ上に存在する検出標識はどんなものでも含む。この結果は、各TS-DNA についてのコンパクトでそして別々の検出可能なシグナルである。折り畳みTS-D NAは、インサイチュハイブリダイゼーション適用および複合検出の両方に有用で ある。なぜなら、それは検出可能なシグナルがぴっちりとパックされる場合です ら空間的に隔てられるのを可能にするからである。折り畳みTS-DNAは、組合せ多 色コードでの使用に特に好ましい。 TS-DNA折り畳みはまた、リガンド／リガンド結合対（例えば、ビオチンおよび アビジン）またはハプテン／抗体対の使用を通じて達成され得る。実施例６に記 載のように、ヌクレオチドアナログ（BUDR）は、ローリングサークル複製中にTS -DNAに取り込まれ得る。BUDRに特異的なビオチン化抗体およびアビジンが添加さ れる場合、TS-DNAの架橋が形成され、アビジン-ビオチン-抗体結合体によって架 橋され、そしてTS-DNAは、折り畳まれてコンパクトな構造になる。折り畳み検出 プローブおよびビオチン媒介折り畳みはまた一緒に用いられて、TS-DNAを折り畳 み得る。 Ｇ．アドレスプローブ アドレスプローブは、TS-DNAまたはTS-DNAの転写産物上のアドレスタグに相補 的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。アドレスプローブの相補的な部分 は、アドレスプローブとアドレスタグとの間の特異的かつ安定なハイブリダイゼ ーションを支持する、任意の長さであり得る。この目的のために、10〜35ヌクレ オチドの長さが好ましく、12〜18ヌクレオチド長のアドレスプローブの相補的な 部分が最も好ましい。好ましくは、アドレスプローブの相補的な部分は、OCPの 標的プローブ部分の全てまたは一部に相補的である。最も好ましくは、アドレス プローブの相補的な部分は、OCPの左標的プローブ部分および右標的プローブ部 分のいずれかまたは両方の一部、ならびに任意のギャップオリゴヌクレオチドま たはギャップ充填操作において作製されるギャップ配列の全てまたは一部に相補 的である（図６を参照のこと）。アドレスプローブは、単一の相補的な部分また は複数の相補的な部分を含み得る。好ましくは、アドレスプローブは、直接的に またはスペーサー分子を介してのいずれかで、固体状態の支持体に結合される。 アドレスプローブと固体状態の支持体とのこのような組み合わせは、固体状態の 検出器の好ましい形態である。 Ｈ．DNA鎖置換プライマー 二次DNA鎖置換に用いられるプライマーを、本明細書中ではDNA鎖置換プライマ ーという。DNA鎖置換プライマーの一つの形態（本明細書中では二次DNA鎖置換プ ライマーという）は、OCPまたはATCの配列の一部に適合する配列を有するオリゴ ヌクレオチドである。この配列を、二次DNA鎖置換プライマーの適合部分という 。この二次DNA置換プライマーの適合部分は、TS-DNA中の配列に相補的である。 二次DNA鎖置換プライマーの適合部分は、TS-DNAの任意の配列に相補的であり得 る。しかし、これが用いられる場合、ローリングサークル複製プライマーまたは 三次DNA鎖置換プライマーのいずれかに適合する、相補的なTS-DNA配列ではない ことが好ましい。これは、プライマーの相互のハイブリダイゼーションを妨げる 。二次DNA鎖置換プライマーの適合部分は、標的配列の全てまたは一部に相補的 であり得る。この場合、二次DNA鎖置換プライマーの3'末端ヌクレオチドは、標 的配列におけるギャップ配列に相補的であることが好ましい。二次DNA鎖置換プ ライマーの3'末端におけるヌクレオチドは、標的配列のギャップ配列における最 後のヌクレオチド（すなわち、標的配列のギャップ配列における5'ヌクレオチド ）に相補的になることが最も好ましい。二次DNA鎖置換プライマーの適合部分は 、プライマーとその相補体との間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを 支持する、任意の長さであり得る。一般的には、これは12〜35ヌクレオチド長で あるが、好ましくは18〜25ヌクレオチド長である。 二次DNA鎖置換プライマーはまた、OCPまたはATCの任意の部分に適合しないさ らなる配列をそれらの5'末端に含むことが好ましい。この配列を、二次DNA鎖置 換プライマーの非適合部分という。二次DNA鎖置換プライマーの非適合部分は、 存在する場合、DNA複製中の鎖置換を容易にするために作用する。二次DNA鎖置換 プライマーの非適合部分は、任意の長さであり得るが、一般的には１〜100ヌク レオチド長、そして好ましくは４〜８ヌクレオチド長である。 DNA鎖置換プライマーの別の形態（本明細書中では三次DNA鎖置換プライマーと いう）は、OCPまたはATCの配列の一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチ ドである。この配列を、三次DNA鎖置換プライマーの相補的な部分という。この 三次DNA鎖置換プライマーの相補的な部分は、TS-DNAにおける配列に適合する。 三次DNA鎖置換プライマーの相補的な部分は、OCPまたはATCにおける任意の配列 に相補的であり得る。しかし、それは二次DNA鎖置換プライマーに適合する、相 補的なOCPまたはATC配列でないことが好ましい。これは、プライマーの相互のハ イブリダイゼーションを妨げる。好ましくは、三次DNA鎖置換プライマーの相補 的な部分は、OCPのスペーサー部分の一部に相補的な配列を有する。三次DNA鎖置 換プライマーの相補的な部分は、プライマーとその相補体との間の特異的かつ安 定なハイブリダイゼーションを支持する、任意の長さであり得る。一般的には、 これは12〜35ヌクレオチド長であるが、好ましくは、18〜25ヌクレオチド長であ る。三次DNA鎖置換プライマーはまた、OCPまたはATCのいずれの部分にも相補的 でないさらなる配列をそれらの5'末端に含むことが好ましい。この配列を、三次 DNA鎖置換プライマーの非相補的な部分という。三次DNA鎖置換プライマーの非相 補的な部分は、存在する場合、DNA複製中の鎖置換を容易にするために作用する 。三次DNA鎖置換プライマーの非相補的な部分は、任意の長さであり得るが、一 般的には、１〜100ヌクレオチド長、そして好ましくは４〜８ヌクレオチド長で ある。ローリングサークル複製プライマーは、好ましい形態の三次DNA鎖置換プ ライマーである。 DNA鎖置換プライマーはまた、エキソヌクレアーゼ消化に対してそれらを抵抗 性にする、改変されたヌクレオチドを含み得る。例えば、プライマーは、プライ マーの5'末端におけるヌクレオチドの間の３つまたは４つのホスホロチオエート 結合を有し得る。このようなヌクレアーゼ耐性プライマーは、過剰の結合されて いないOCPおよびギャップオリゴヌクレオチドの選択的分解を可能にする。さも なければこれらは、増幅された核酸への、検出プローブ、アドレスプローブ、お よび二次OCPのハイブリダイゼーションに干渉し得る。DNA鎖置換プライマーは、 二次DNA鎖置換および鎖置換カスケード増幅（両方とも以下に記載される）に用 いられ得る。 Ｉ．識別プローブ 識別プローブは、TS-DNAまたはTS-DNAの転写産物の部分に相補的な配列を有す るオリゴヌクレオチドである。識別プローブは、OCPまたは増幅標的サークル（ 例えば、USA-SEQおよびUSA-CAGESEQ）のローリングサークル増幅後のプライマー 伸長配列決定操作において用いられることが意図される。識別プローブは、プラ イマー伸長配列決定操作における識別プライマーとして直接用いられ得るか、ま たはそれらは他の識別プローブまたは縮重プローブと組み合わされて識別プライ マーを形成し得る。本明細書中で用いられる場合、識別プライマーは、プライマ ー伸長配列決定のためのプライマーとして作用するオリゴヌクレオチドである。 OCPまたはATC中（および、それゆえ、増幅された標的配列中）の配列に対する識 別プローブの関係は、好ましくは、OCPまたはATC中の配列に対する識別プライマ ー（これは識別プローブから形成される）の関係によって決定される。 識別プローブの相補的な部分は、識別プローブとTS-DNAとの間のハイブリダイ ゼーションを支持する、任意の長さであり得る。この目的のために、10〜40ヌク レオチドの長さが好ましく、15〜30ヌクレオチド長の識別プローブの相補的な部 分が最も好ましい。識別プローブの好ましい使用は、増幅された標的配列のプラ イマー伸長配列決定のための識別プライマーを形成することである。この目的の ために、識別プローブは、配列決定されるべきである増幅された標的配列の部分 のTS-DNA5'にハイブリダイズするべきである。 プライマー伸長配列決定操作（例えば、USA-CAGESEQ）のために、識別プロー ブのネストされたセットは、配列が決定されるべきである、増幅された標的配列 の領域のちょうど5'にハイブリダイズするように設計されることが好ましい。従 って、例えば、識別プローブのセットは、各プローブが、標的配列の20ヌクレオ チド領域に相補的であるように設計され得、各20ヌクレオチド領域は先の領域か ら１ヌクレオチドだけずれている。この好ましい関係は、以下に示され得る：プローブ１は配列番号25のヌクレオチド76〜95であり、プローブ２は配列番号25 のヌクレオチド77〜96であり、プローブ３は配列番号25のヌクレオチド78〜97で あり、プローブ４は配列番号25のヌクレオチド79〜98であり、プローブ５は配列 番号25のヌクレオチド80〜99であり、そして標的（3'〜5'に示す）は配列番号19 のヌクレオチド19〜60である。このようなネストされたセットにおける識別プロ ーブの数は、プライマー伸長配列決定操作において用いられる縮重プローブの長 さに等しいことが好ましい。 識別プローブの3'水酸基は、他のオリゴヌクレオチドへの所望でない連結を防 ぐ目的で可逆的にブロックされることもまた好ましい。このようなブロックされ たプローブは、識別プローブへのさらなるプローブ（例えば、縮重プローブ）の 制御された連結反応を可能にする。例えば、USA-CAGESEQ（縮重プローブプライ マー伸長配列決定の１形態）は、可逆的にブロックされた識別プローブを使用し て継続的な、そして制御された、識別プローブに対する縮重プローブの付加を可 能にする。オリゴヌクレオチドにおける3'水酸基を可逆的にブロックする任意の 公知の手段は、ブロックされた識別プローブを生成するために用いられ得る。可 逆的なブロッキングエレメントの好ましい形態は、下記のケージ構造である。ブ ロックされた識別プローブとして有用なケージ化オリゴヌクレオチドは、以下に 記載される。 Ｊ．変性プローブ 変性プローブは、OCPまたは増幅標的サークル（例えば、USA-SEQおよびUSA-CA GESEQ)のローリングサークル増幅に続くプライマー伸長配列決定操作における使 用が意図されるオリゴヌクレオチドである。変性プローブは識別プローブと結 合し、識別プライマーを形成する。これは識別プローブおよび変性プライマーを TS-DNAにハイブリダイズし、そして識別プローブと識別プローブに隣接してハイ ブリダイズする任意の変性プローブとを共に連結することにより、達成される。 この目的のために、完全なセットの変性プローブが共に使用されることが好まし い。これは変性プローブの少なくとも１つが、ハイブリダイズされる識別プロー ブに直接隣接するTS-DNAの一部に相補的であることを保証する。この好ましい関 係は、以下のように例示され得る。 識別プローブおよび変性プローブは共に、配列番号25のヌクレオチド80〜104を 表し、そして標的（３'→５'で示される）は配列番号19のヌクレオチド19〜60で ある。下線部の配列は変性プローブを表し、これは識別プローブ（上段の、下線 のない部分）に連結されている。 変性プローブの完全なセットが、変性プローブを含むプライマー伸長配列決定 操作において使用されることが好ましい。本明細書中で使用されるように、変性 プローブの完全なセットは、全てが同一の長さであるオリゴヌクレオチドのセッ トをいい、そこでは全ての可能なヌクレオチド配列が表される。そのようなプロ ーブの数は式４^Nで記載され、ここで４はDNA中（またはRNA中）に見出される４ 種のヌクレオチドを表し、そしてNはセットにおけるオリゴヌクレオチドの長さ を表す。従って、３ヌクレオチド長の変性プローブの完全なセットは64の異なる オリゴヌクレオチドを含み、そして４ヌクレオチド長の変性プローブの完全なセ ットは256の異なるオリゴヌクレオチドを含み、そして５ヌクレオチド長の変性 プローブの完全なセットは1024の異なるオリゴヌタレオチドを含む。そのような ネストされたセットにおける識別プローブの数は、変性プローブプライマー伸長 配列決定において使用される変性プローブの長さに等しいことが好ましい。変性 プローブのセットは、１つの識別プローブと共に、または識別プローブのセット と共に、使用され得る。そのような識別プローブのセットが、上記のネストされ たセットを表すことが好ましい。 プライマー伸長操作において、変性プローブのセット中のただ１つの変性プロ ーブが、増幅される標的配列にハイブリダイズされる所定の識別プローブに隣接 して、ハイブリダイズする。識別プローブにハイブリダイズされた標的配列の領 域に隣接（すなわち、３'側）するヌクレオチド配列は、どの変性プローブがハ イブリダイズするかを決定する。識別プローブに直接に隣接してハイブリダイズ された変性プローブのみが、識別プローブに連結されるべきである。この理由の ために、配列決定されるべき標的配列の領域が、識別プローブにハイブリダイズ される領域に隣接することが好ましい。好ましくは、この領域はTS-DNAにおける ギャップ配列である（充填されたギャップスペースの全部または一部を表す）。 ギャップ充填連結の使用は、RCAにおいて増幅される標的核酸における、配列多 様性の潜在的な、予期される、または公知の領域を表す、TS-DNA中のギャップ配 列の存在を可能にする。 変性プローブは、識別プローブと、または他の変性プローブと結合されて、識 別プライマーを形成し得る。本明細書中で使用されるように、識別プライマーは 、プライマー伸長配列決定のためのプライマーとして作用するオリゴヌクレオチ ドである。 変性プローブの３'ヒドロキシルが、他のオリゴヌクレオチドとの望ましくな い連結を防ぐために可逆的にブロックされていることが、また好ましい。そのよ うなブロックされたプローブは、さらなる変性プローブの変性プローブへの制御 された連結を可能にする。例えば、USA-CAGESEQは、可逆的にブロックされた変 性プローブを使用して、変性プローブの識別プローブへの連続的かつ制御された 付加を可能にする。オリゴヌクレオチド中の３'ヒドロキシルを可逆的にブロッ キングする任意の公知の方法が、ブロックされた変性プローブを生成するために 使用され得る。可逆的ブロッキング要素の好ましい形態は、以下に記載されるケ ージ構造(cage structure)である。ブロックされた変性プローブとして有用なケ ージされた(caged)オリゴヌクレオチドは、以下に記載される。 識別プローブのネストされたセットが使用される場合、それらは一連のプライ マー伸長配列決定操作に使用されて、隣接ヌクレオチドの同一性を決定し得る。 上に例示される識別プローブのセット、および５量体変性プローブの完全なセッ トを使用することで、標的配列中の強調されたヌクレオチドは、１つの変性プロ ーブが各識別プローブに連結されている場所で同定され得る： プローブ１は配列番号25のヌクレオチド76〜95であり、プローブ２は配列番号25 のヌクレオチド77〜96であり、プローブ３は配列番号25のヌクレオチド78〜97で あり、プローブ４は配列番号25のヌクレオチド79〜98であり、プローブ５は配列 番号25のヌクレオチド80〜99であり、そして標的（３'→５'で示される）は配列 番号19のヌクレオチド19〜60である。強調されたヌクレオチドは、識別プローブ と変性プライマーとの連結により形成される識別プライマーに隣接（すなわち、 ３'側）するヌクレオチドを表す。さらなるヌクレオチドの同一性は、さらなる 変性プローブを、識別プローブに既に連結された変性プローブに連結することに より決定され得る。このプロセスは、実施例10に例示される。変性プローブの長 さが、ネストされたセットにおける識別プローブの数に等しいことが好ましい。 Ｋ．識別プライマー 識別プライマーは、TS-DNAまたはTS-DNAの転写物の一部に相補的な配列を有す るオリゴヌクレオチドである。識別プライマーは、増幅標的サークル（例えば、 USA-SEQおよびUSA-CAGESEQ）のローリングサークル増幅に続くプライマー伸長配 列決定操作における使用が意図される。好ましくは、識別プライマーは、OCPの 左側標的プローブ部分の全部または一部を表すTS-DNA中の標的配列の一部に相補 的である。第２のTS-DNAとの使用のために、識別プライマーが、OCPの右側標的 プローブ部分を表す第２のTS-DNA中の標的配列の一部に相補的であることが好ま しい。そのような識別プライマーはまた、好ましくは、左側標的プローブ部分に 隣接するスペーサー領域の一部に相補的である。従って、好ましい識別プライマ ーは、OCPの５'末端を表すTS-DNAの隣接セグメントに相補的である。この好まし い関係は、TS-DNAにおけるギャップ配列の、プライマー伸長配列決定を可能にす る。識別プライマーとOCPとの間の、この好ましい関係の例は、実施例15に示さ れる。しかし、識別プローブは、増幅された核酸における任意の所望の配列に相 補的であり得る。 一般に、識別プライマーは、連結されていない識別プライマー、２以上の識別 プローブの組合せ（すなわち、共に連結された識別プローブ）、または１以上の 識別プローブと１以上の変性プローブとの組合せ（すなわち、共に連結された識 別プローブおよび変性プローブ）であり得る。従って、識別プローブは、プライ マー伸長配列決定操作における識別プライマーとして直接使用され得るか、ある いは他の識別プローブと、または変性プローブと結合されて、識別プライマーを 形成し得る。本明細書中で使用されるように、識別プライマーは、プライマー伸 長配列決定のためのプライマーとして作用するオリゴヌクレオチドである。識別 プライマーがブロックされた３'ヒドロキシルを有するプローブから作製され、 そして得られた識別プライマーがブロックされている場合、ブロックはプライマ ー伸長操作に先立って除去されなければならない。 識別プライマーの相補的部分は、識別プライマーとTS-DNAとの間の特異的かつ 安定なハイブリダイゼーションを支持する任意の長さであり得る。この目的のた めに、10〜40ヌクレオチドの長さが好ましく、15〜30ヌクレオチド長の識別プラ イマーの相補的部分が最も好ましい。増幅された標的配列のプライマー伸長配列 決定におけるプライマーとしての識別プライマーの使用が好ましい。この目的の ために、識別プライマーは、配列決定されるべき増幅された標的配列のTS-DNA５ '側部分にハイブリダイズするべきである。配列決定されるべき増幅された標的 配列の部分が、ギャップ配列を表すことが好ましい。そのようなギャップ配列は 、好ましくは、OCPが標的核酸にハイブリダイズするときに形成されるギャップ スペースの反対側の標的核酸の部分に存在する、公知の、予期される、または潜 在的な配列改変体を集合的に表す。この目的のために、ギャップスペースがギャ ップ充填連結操作においてDNAポリメラーゼにより充填されることが好ましい。 Ｌ．ケージされたオリゴヌクレオチド ケージされたオリゴヌクレオチドは、それらの３'末端にケージされたヌクレ オチドを有するオリゴヌクレオチドである。ケージ構造は、３'ヒドロキシルが ヌクレオチド付加および連結反応に加わることを防ぐ、除去可能なブロッキング 基である。ケージされたオリゴヌクレオチドは、本明細書中に開示される増幅、 検出、および配列決定操作における使用のための上記プライマーおよびプローブ として有用である。多くのケージ構造が公知である。ケージ構造の好ましい形態 は、光への曝露によるそれらの除去を可能にする、光に不安定な構造である。オ リゴヌクレオチドの３'末端を可逆的にブロッキングするために有用なケージ構 造の例は、以下により記載される：Metzkerら，Nucleic Acids Research 22:425 9-4267（1994）、BurgessおよびJacutin，Am．Chem Soc．要約集第211巻，要約2 81（1996）、Zehaviら，J．Organic Chem．37:2281-2288（1972）、Kaplanら，B iochem．17:1929-1935（1978）、およびMcCrayら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 77:7237-7241（1980）。ケージされたオリゴヌクレオチドにおける使用のため のケージされたヌクレオチドの好ましい形態は、Metzkerらにより記載される。 最も好ましいケージ構造は、３'-0-(2-ニトロベンジル)基であり、それは紫外光 への曝露に不安定である（Pillai，Synthesis 1-26(1980)）。このケージ構造の 除去は、好ましくは、ケージされたヌクレオチドを含む物質を、３〜10分間トラ ンスイルミネーターを使用して長波長紫外光（好ましくは354nm）で照射するこ とにより、達成される。 開示されかつ公知であるケージ構造は、保護されたケージされたヌクレオチド を使用するための公知でありかつ確立されたオリゴヌクレオチド合成方法論（下 に記載される）を適用することにより、またはオリゴヌクレオチド合成に続いて ケージ構造を付加することにより、オリゴヌクレオチドに取り込まれ得る。 上記のように、ケージされたオリゴヌクレオチドは、識別プローブまたは変性 プローブとして使用され得る。ケージされたオリゴヌクレオチドはまた、複製プ ライマー（例えば、増幅反応におけるプライマーの全集団または一部のいずれか のための、ローリングサークル複製プライマー）としても使用され得る。これは 、機能的な（すなわち、伸長可能な）プライマーのプールを、反応または増幅操 作の特定の時点で増加することを可能にする。例えば、異なる長さのTS-DNAを生 成 するために異なるローリングサークル複製プライマーを使用する場合（以下のセ クションIIBを参照のこと）、１つのローリングサークル複製プライマーは、ケ ージされたオリゴヌクレオチドであり得る。 Ｍ．ペプチド核酸クランプ ペプチド核酸（PNA）は、ペプチド骨格を有する核酸の改変された形態である 。ペプチド核酸は、DNAと極度に安定なハイブリッドを形成し（Hanveyら，Scien ce 258:1481-1485（1992）；Nielsenら，Anticancer Drug Des．8:53-63(1993) ）、そしてPCR反応の特異的なブロッカーとして使用されている（Orumら，Nucle ic Acids Res.，21:5332-5336(1993)）。PNAクランプは、OCPの左側標的プロー ブ部分および右側標的プローブ部分の両方の部分中の配列に相補的であるが、連 結されたOCPの任意のギャップオリゴヌクレオチドまたは充憤されたギャップス ペースの配列に相補的ではないペプチド核酸である。従って、PNAクランプは、 不合理に連結された、すなわち標的に指向されていない様式で連結された、OCP の連結接合部のみにハイブリダイズし得る。PNAクランプは、クランプとその相 補鎖との間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する、任意の長さ であり得る。一般にこれは７〜12ヌクレオチド長であるが、好ましくは８〜10ヌ クレオチド長である。PNAクランプは、不合理に連結されたOCPの複製を防ぐこと により、ローリングサークル増幅におけるバックグラウンドシグナルを減少させ るために使用され得る。 Ｎ．オリゴヌクレオチド合成 開環プローブ、ギャップオリゴヌクレオチド、ローリングサークル複製プライ マー、検出プローブ、アドレスプローブ、増幅標的サークル、DNA鎖置換プライ マー、および任意の他のオリゴヌクレオチドが、確立されたオリゴヌクレオチド 合成法を使用して合成され得る。オリゴヌクレオチドを生成または合成する方法 は、当該分野において周知である。そのような方法は、標準的な酵素消化後のヌ クレオチドフラグメント単離（例えば、Sambrookら，Molecular Cloning:A Labo ratory Manual，第２版（Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989）第５、６章）を参照のこと）から、純粋な合成法、例えば 、MilligenまたはBeckman System 1 Plus DNA合成機（例えば、Millingen-Bio search，Burlington，MAのModel 8700自動合成機、またはABI Model 380B）を用 いるシアノエチルホスホルアミダイト法による合成法まで広がり得る。オリゴヌ クレオチドを作製するのに有用な合成法はまた、Ikutaら，Ann．Rev．Biochem． 53:323-356（1984）（ホスホトリエステルおよびホスファイト-トリエステル法 ）およびNarangら，Methods Enzymol.，65:610-620（1980）（ホスホトリエステ ル法）に記載される。タンパク質核酸分子は、Nielsenら，Bioconjug．Chem．5: 3-7（1994）に記載される方法のような、公知の方法を使用して作製され得る。 本明細書中に記載される多くのオリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチ ドまたは核酸の特定の部分に相補的であるように設計され、その結果、安定なハ イブリッドがそれらの間に形成され得る。これらのハイブリッドの安定性は、Le snickおよびFreier，Biochemistry 34:10807-10815（1995）、McGrawら，Biotec hniques 8:674-678（1990）、およびRychlikら，Nucleic Acids Res．18:6409-6 412（1990）に記載される方法のような、公知の方法を用いて計算され得る。 Ｏ．固体状態検出器 固体状態検出器は、それらにアドレスプローブまたは検出分子を結合した固体 基質または支持体である。固体状態検出器の好ましい形態は、アレイ検出器であ る。アレイ検出器は、そこに複数の異なるアドレスプローブまたは検出分子がア レイ、格子、または他の組織的な様式で結合した固体状態検出器である。 固体状態検出器における使用のための固体基質は、そこにオリゴヌクレオチド を結合し得る任意の固体物質を含み得る。これはアクリルアミド、セルロース、 ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポ リプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ガ ラス、ポリケイ酸塩、ポリカーボネート、テフロン、フルオロカーボン、ナイロ ン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエス テル、ポリフマル酸プロピル(polypropylfumerate)、コラーゲン、グリコサミノ グリカン、およびポリアミノ酸のような物質を含む。固体基質は、薄いフィルム または膜、ビーズ、ボトル、ディッシュ、繊維、不織布、成形された高分子、粒 子、および微粒子を含む、任意の有用な形態を有し得る。固体基質のための好ま しい形態は、マイクロタイターディッシュである。マイクロタイターディッシュ の最も好ましい形態は、標準96ウエルタイプである。 固体基質上で固定されたアドレスプローブは、固体状態検出器上のRCAおよびR CTの産物の捕捉を可能にする。そのような捕捉は、続く検出工程を妨げ得る反応 成分を洗い去る、好都合な手段を提供する。異なるアドレスプローブを固体状態 検出器の異なる領域に付着させることにより、異なるRCAまたはRCT産物が、固体 状態検出器上の異なる位置、従って診断的な位置で捕捉され得る。例えば、マイ クロタイタープレート複合アッセイにおいて、96までの異なるTS-DNA（各々が異 なる標的配列を介して増幅された）に特異的なアドレスプローブは、各々が異な るウェル中で、マイクロタイタープレート上に固定され得る。捕捉および検出は 、TS-DNAに対応する標的配列がサンプル中に存在した、TS-DNAに対応するそれら のウェルの中でのみ起こる。 固体基質へのオリゴヌクレオチドの固定のための方法は、良く確立されている 。アドレスプローブおよび検出プローブを含むオリゴヌクレオチドは、確立され た結合法を用いて基質に結合され得る。例えば、適切な付着法は、Peaseら，Pro c．Natl．Acad．Sci．USA 91(11):5022-5026（1994）、およびKhrapkoら，Mol B iol(Mosk)(USSR)25:718-730（1991）により記載される。カゼイン被覆スライド 上の３'アミンオリゴヌクレオチドの固定方法は、Stimpsonら，Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 92:6379-6383（1995）により記載される。固体基質にオリゴヌクレ オチドを付着させる好ましい方法は、Guoら，Nucleic Acids Res．22:5456-5465 （1994）により記載される。 RCAおよびRCTアッセイにおいて有用ないくつかの固体状態検出器は、固体基質 に付着された検出抗体を有する。そのような抗体は、目的の分子に対して特異的 であり得る。次いで、目的の捕捉された分子は、第二のレポーター抗体の結合に より、続いてRCAまたはRCTにより、検出され得る。固体状態検出器における抗体 のそのような使用は、RCAアッセイが、抗体を生じ得る任意の分子の検出のため に開発されることを可能にする。固体基質へ抗体を固定するための方法は、良く 確立されている。固定は、例えば、アミノ化された表面、カルボキシル化された 表面、またはヒドロキシル化された表面への、標準的な固定化学を用いる付着に より達成され得る。付着剤の例は、臭化シアン、スクシンイミド、アルデヒド、 塩化トシル、アビジン-ビオチン、光架橋剤、エポキシド、およびマレイミドで ある。好ましい付着剤はグルタルアルデヒドである。これらの、および他の付着 剤は、付着におけるそれらの使用法と同様に、Protein immobilization:fundame ntals and applications，Richard F．Taylor編（M．Dekker，New York，1991） 、JohnstoneおよびThorpe，Immunochemistry In Practice（Blackwell Scientif ic Publications，Oxford，England，1987）209-216頁および241-242頁、および Immobilized Affinity Ligands，Craig T．Hermansonら編（Academic Press，Ne w York，1992）に記載される。抗体は、固体基質内に存在する反応性の側部基に 抗体上の遊離アミノ基を化学的に架橋することにより基質に付着され得る。例え ば、抗体は、架橋剤としてグルタルアルデヒドまたはカルボジイミドを使用して 、遊離のアミノ基またはカルボキシル基を含む基質に化学的に架橋され得る。こ の方法では、遊離の抗体を含む水溶液が、グルタルアルデヒドまたはカルボジイ ミドの存在下、固体基質と共にインキュベートされる。グルタルアルデヒドとの 架橋のために、反応物は、0.1Mカコジル酸ナトリウム（pH7.4）のような緩衝化 溶液中２容量％のグルタルアルデヒドと共にインキュベートされ得る。他の標準 的な固定化学は、当業者に公知である。 Ｐ．固体サンプル 固体サンプルは、そこに標的分子または標的配列を結合または接着している、 固体基質または支持体である。標的分子または標的配列は、好ましくは、標的サ ンプルまたはアッセイサンプル中に送達される。固体サンプルの好ましい形態は 、アレイサンプルである。アレイサンプルは、そこに複数の異なる標的サンプル またはアッセイサンプルをアレイ、格子、または他の組織的な様式で結合または 接着している、固体サンプルである。 固体サンプルにおける使用のための固体基質は、そこに標的分子または標的配 列を結合または接着し得る、任意の固体物質を含み得る。これはアクリルアミド 、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンビニル アセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレ ンオキシド、ガラス、ポリケイ酸塩、ポリカーボネート、テフロン、フルオロカ ーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、 ポ リオルトエステル、ポリフマル酸プロピル(polypropylfumerate)、コラーゲン、 グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸のような物質を含む。固体基質は、 薄いフィルムまたは膜、ビーズ、ボトル、ディッシュ、スライド、繊維、不織布 、成形された高分子、粒子、および微粒子を含む、任意の有用な形態を有する。 固体基質のための好ましい形態は、マイクロタイターディッシュおよびガラスス ライドである。マイクロタイターディッシュの最も好ましい形態は、標準96ウェ ルタイプである。 固体基質上で固定された標的分子および標的配列は、固体基質上に局在される 標的特異的TS-DNAの形成を可能にする。そのような配置は、続く検出工程を妨げ 得る反応成分を洗い去る好都合な手段を提供し、そして複数の異なるサンプルを 同時にアッセイする好都合な方法を提供する。診断的TS-DNAは、異なるサンプル が接着する各部位に個々に形成され得る。固体サンプルを形成するための標的配 列または他のオリゴヌクレオチド分子の固定のために、上記の方法が使用され得 る。標的分子がタンパク質の場合、タンパク質は、抗体の固定について一般的に 上記されるように固体基質上に固定され得る。 固体基質の好ましい形態は、そこに256までの別々の標的またはアッセイサン プルが小さな点のアレイとして接着しているガラススライドである。各点は、好 ましくは直径0.1〜2.5mmであり、最も好ましくは直径およそ2.5mmである。その ような微少アレイは、例えば、Schenaら，Science 270:487-470（1995）により 記載される方法を使用して製造され得る。簡潔には、微少アレイは、プリントチ ップを備えたアレイマシンによって、ポリ-L-リジン被覆顕微鏡スライド（Sigma ）上に製造され得る。チップは、例えば、96-ウェルのマイクロタイタープレー トからの１μlのDNAサンプル（0.5mg/ml）と共にロードされ、そして所望の間隔 で複数のスライド上に１スライドあたり約0.005μlで配置される。次いで、プリ ントされたスライドは、湿潤チャンバー内で２時間再水和され、100℃で１分間 急速乾燥(snap-dry)され、0.1％SDS中ですすがれ、そして50％1-メチル-2-ピロ リドンおよび50％ホウ酸から成る緩衝液中に調製された0.05％無水コハク酸で処 理され得る。次いでスライド上のDNAは、例えば、使用の直前に90℃で２分間、 蒸留水中で変性され得る。微少アレイ固体サンプルは、例えば、コンピュータ制 御XYステージおよび顕微鏡対物レンズを有するレーザー蛍光スキャナによって、 スキャンされ得る。混合ガス、多線レーザーは、複数の蛍光物質の連続的な励起 を可能にする。 Ｑ．レポーター結合剤 レポーター結合剤は、オリゴヌクレオチドに結合されるか、または束縛される (tethered)、特異的結合分子である。特異的結合分子は、レポーター結合剤の親 和性部分をいい、オリゴヌクレオチドはレポーター結合剤のオリゴヌクレオチド 部分をいう。本明細書中で使用されるように、特異的結合分子は特定の分子また は部分と特異的に相互作用する分子である。特異的結合分子と特異的に相互作用 する分子または部分は、本明細書中において、標的分子をいう。標的分子という 用語が、別々の分子の両方、および、特異的結合分子と特異的に相互作用するタ ンパク質のエピトープのような分子の部分をいうことが理解される。抗体、レセ プター/リガンド対のメンバーのいずれか、および特異的結合親和性を有する他 の分子が特異的結合分子の例であり、レポーター結合分子の親和性部分に有用で ある。抗体である親和性部分を有するレポーター結合分子は、本明細書中におい て、レポーター抗体をいう。増幅標的サークルの束縛により、または標的配列の そのような特異的標的分子への結合により、特異的結合分子のその特異的標的へ の結合が、ローリングサークル増幅でのATCまたは標的配列の増幅により検出さ れ得る。この増幅は、非常に少数の結合された特異的結合分子の高感度の検出を 可能にする。特定の標的分子と特異的に相互作用するレポーター結合分子は、標 的分子に特異的であると言われる。例えば、特定の抗原に結合する抗体である親 和性部分を有するレポーター結合分子は、その抗原に特異的であると言われる。 この抗原は標的分子である。レポーター結合剤はまた、本明細書中において、レ ポーター結合分子をいう。図25、26、27、28、および29は、レポーター結合分子 およびその使用のいくつかの好ましいタイプの例を示す。図29は、親和性部分と して抗体を使用するレポーター結合分子を示す。 レポーター結合分子の特別な形態（本明細書中においてレポーター結合プロー ブという）は、特異的結合分子としてオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオ チド誘導体を有する。レポーター結合プローブは、特定の核酸配列のために設計 され、そしてそれを検出するために使用される。従って、レポーター結合プロー ブのための標的分子は、核酸配列である。レポーター結合プローブのための標的 分子は、より大きな核酸分子内のヌクレオチド配列であり得る。レポーター結合 分子という用語が、レポーター結合プローブを包含することが理解される。レポ ーター結合プローブの特異的結合分子は、レポーター結合プローブと標的分子と の間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する任意の長さであり得 る。この目的のために、10〜40ヌクレオチド長が好ましく、レポーター結合プロ 一ブの特異的結合分子が16〜25ヌクレオチド長であることが最も好ましい。レポ ーター結合プローブの特異的結合分子は、ペプチド核酸であることが好ましい。 上記のように、ペプチド核酸はDNAと安定なハイブリッドを形成する。このこと は、ペプチド核酸特異的結合分子を有するレポーター結合プローブが、続く増幅 および検出操作の間、標的配列に堅固に接着し続けることを可能にする。この有 用な効果はまた、Gasparroら，Nucleic Acids Res．1994 22(14):2845-2852（19 94）により記載される三重らせん化学結合技術を使用することにより、オリゴヌ クレオチド特異的結合分子を有するレポーター結合プローブでも得られ得る。簡 潔には、レポーター結合プローブの親和性部分は、標的配列にハイブリダイズさ れた場合、三重らせんを形成するように設計される。これは、一般に知られるよ うに、好ましくは、主としてホモプリンの標的配列か、または主としてホモピリ ミジンの標的配列のいずれかを選択することにより達成される。レポーター結合 プローブの親和性部分を構成する、適合オリゴヌクレオチド配列は、選択される 標的配列に相補的であり、従って、それぞれ、主としてホモピリミジンであるか 、または主としてホモプリンである。レポーター結合プローブ（Gasparroらによ り記載される三重らせんプローブに対応する）は、化学的に連結したソラレン誘 導体を含む。標的配列へのレポーター結合プローブのハイブリダイゼーションに 際して、三重らせんが形成される。三重らせんを低波長紫外線に曝露することに より、ソラレン誘導体が、標的配列へのプローブの架橋を媒介する。図25、26、 27、および28は、レポーター結合プローブであるレポーター結合分子の例を示す 。 レポーター結合プローブ中の特異的結合分子はまた、Landegrenら，Science 2 41:1077-1080（1988）により記載されるDNAプローブから改変される連結可能なD NAプローブのような、２つの部分を有するDNA分子であり得る。そのようなプロ ーブを使用する場合、プローブの親和性部分は、標的核酸の隣接領域にハイブリ ダイズする２つのオリゴヌクレオチド部分の標的媒介性連結により構築される。 従って、そのようなレポーター結合プローブの親和性部分を形成するために使用 される成分は、切形のレポーター結合プローブ（標的配列の一部にハイブリダイ ズする切形の親和性部分を有する）、および切形のレポーター結合プローブに連 結され得るように標的配列の隣接部にハイブリダイズする連結プローブである。 連結プローブはまた、両者が標的配列にハイブリダイズされる場合、切形のレポ ーター結合プローブから分離され得る（すなわち、隣接していない）。次いで、 それらの間に生じる空間は、第２の連結プローブにより、またはギャップ充填合 成により充填され得る。開示される方法における使用のためには、切形の親和性 部分は、標的媒介性連結を可能にするに十分長いが、連結プローブへの連結の不 存在下において、続く増幅操作の間、標的配列への切形のレポーター結合プロー ブの安定なハイブリダイゼーションを防ぐのに十分に短いことが好ましい。この 目的のために、標的配列と未連結の切形のレポーター結合プローブとの間のハイ ブリッドを除去するために設計される特定の工程が、連結操作に続いて使用され 得る。 １つの実施態様において、レポーター結合剤のオリゴヌクレオチド部分は、標 的配列と呼ばれる配列を含み、それはOCPのための標的配列として作用する。標 的配列の配列は、任意に選択され得る。複数のレポーター結合剤を使用する複合 アッセイにおいては、各レポーター結合剤のための標的配列が、非特異的標的の 検出の可能性を制限するために、実質的に異なることが好ましい。あるいは、い くつかの複合アッセイにおいて、関連配列と共に標的配列を使用することが望ま れ得る。異なるギャップスペースを充填するために異なる独特のギャップオリゴ ヌクレオチドを使用することにより、そのようなアッセイは、より多くの標的配 列を増幅しそして検出するために、１つまたはいくつかのOCPを使用し得る。オ リゴヌクレオチド部分は、任意のいくつかの確立された結合反応により親和性部 分に結合し得る。例えば、Hendricksonら，Nucleic Acids Res.，23(3):522-529 （1995）は、オリゴヌクレオチドを抗体に結合させるための適切な方法を記載す る。 別の実施態様において、レポーター結合剤のオリゴヌクレオチド部分は、ロー リングサークル複製プライマー配列と呼ばれる配列を含み、それはATCのための ローリングサークル複製プライマーとして作用する。このことは、生じるTS-DNA がレポーター結合剤に結合される場合の、付加されたATCのローリングサークル 複製を可能にする。このために、TS-DNAは、標的分子の部位において効果的に固 定される。好ましくは、次いで固定されたTS-DNAが、検出に先立ってインサイチ ュで折り畳み得る。ローリングサークル複製プライマー配列の配列は、任意に選 択され得る。複数のレポーター結合剤を使用する複合アッセイにおいては、各レ ポーター結合剤のためのローリングサークル複製プライマー配列は、非特異的標 的の検出の可能性を制限するために、実質的に異なることが好ましい。あるいは 、いくつかの複合アッセイにおいては、関連配列と共にローリングサークル複製 プライマー配列を使用することが望まれ得る。そのようなアッセイは、多数の標 的分子を検出するために、１つまたは少しのATCを使用し得る。レポーター結合 剤のオリゴヌクレオチド部分がローリングサークル複製プライマーとして使用さ れる場合、オリゴヌクレオチド部分は、オリゴヌクレオチド部分と増幅標的サー クルのプライマー相補的部分との間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーション を支持する、任意の長さであり得る。一般に、これは10〜35ヌクレオチド長であ るが、好ましくは16〜20ヌクレオチド長である。図25、26、27、28、および29は 、そのオリゴヌクレオチド部分がローリングサークル複製プライマーである、レ ポーター結合分子の例を示す。 別の実施態様において、レポーター結合剤のオリゴヌクレオチド部分は、ロー リングサークル複製のための鋳型として作用する、増幅標的サークルを含み得る 。複数のレポーター結合剤を使用する複合アッセイにおいては、各レポーター結 合剤のオリゴヌクレオチド部分を含むATCのアドレスタグ部分および検出タグ部 分は、各レポーター結合剤の独特な検出のために、実質的に異なることが好まし い。しかし、複合アッセイにおいて使用される全てのATCにおいて、同一のプラ イマ一相補部分を使用することが望ましい。ATCは、束縛ループ(tether loop)の 周囲にATCをループさせることにより、特異的結合分子に束縛される。このこと は、A TCがローリングサークル複製の間、親和性部分に結合された状態で、自由に回転 することを可能にする。束縛ループは、ループを形成し得かつ特異的結合分子に 結合し得る任意の物質であり得る。直鎖状ポリマーは、束縛ループのために好ま しい物質である。 束縛されたATCを有するレポーター結合剤の好ましい生成方法は、ATCの周囲の 特異的結合分子に結合したオリゴヌクレオチドの端部を連結することにより、束 縛ループを形成することである。オリゴヌクレオチドは、公知の技術を使用して 、特異的結合分子に結合し得る。例えば、Hendricksonら（1995）は、オリゴヌ クレオチドを抗体に結合するための適切な方法を記載する。この方法は、オリゴ ヌクレオチドを任意のタンパク質に結合させるために、一般に有用である。連結 を可能にするために、束縛ループの２つの半部を含むオリゴヌクレオチドは、一 方の自由末端が５'末端でありそして他方の自由末端が３'末端であるように逆方 向で、特異的結合分子に結合するべきである。束縛オリゴヌクレオチドの末端の 連結は、束縛されるべきATCにおける隣接配列への束縛ヌクレオチドの末端のハ イブリダイゼーションにより、媒介され得る。この方法において、束縛オリゴヌ クレオチドの末端は、標的配列を含むATCを有する、開環プローブの標的プロー ブ部分に類似する。 束縛されたATCを有するレポーター結合剤の別の好ましい生成方法は、特異的 結合分子上のオリゴヌクレオチド束縛ループにハイブリダイズされる間に、開環 プローブを連結することである。これはLM-RCAの連結操作に類似する。この場合 において、標的配列は、特異的結合分子に結合する両端を有するオリゴヌクレオ チドの部分である。この方法では、単一の束縛オリゴヌクレオチドの両端が、特 異的結合分子に結合する。これは、上に記載されるような公知の結合技術を使用 して、達成され得る。 束縛ループの末端は、適切な活性化基によって誘導体化され得る、官能基を有 する任意の特異的結合分子に結合し得る。特異的結合分子がタンパク質または同 様の官能基を有する分子である場合、束縛末端の結合は、タンパク質付着の公知 の方法を使用して、達成され得る。多くのそのような方法は、Protein immobili zation：fundamentals and applications Richard F．Taylor編（M．Dekker，Ne w York，1991）に記載される。 レポーター結合剤の親和性部分として有用な抗体は、商業的に得られ得、また は良く確立された方法を使用して生産され得る。例えば、JohnstoneおよびThorp e、30-85頁は、ポリクローナルおよびモノクローナルの両抗体を生産するために 有用な一般的方法を記載する。書籍全体は、アッセイ系における抗体の使用のた めの、多くの一般的技術および原理を記載する。 Ｒ．DNAリガーゼ 任意のDNAリガーゼが、開示される増幅方法における使用に適切である。好ま しいリガーゼは、優先的に、二本鎖DNAのニックでホスホジエステル結合を形成 するリガーゼである。すなわち、有意な率で一本鎖DNAの遊離末端を連結しない リガーゼが好ましい。耐熱性リガーゼが特に好ましい。以下のような多くの適切 なリガーゼが公知である：T4 DNAリガーゼ(Davisら、Advanced Bacterial Genet ics-A Manual for Genetic Engineering(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1980))、E.coli DNAリガーゼ(Panasnkoら、J.Biol.C9-123(1992);Winn-Deenら、Mol Cell Probes（England）7(3):179-186(1993))、 Taq DNAリガーゼ(Barany,Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:189-193(1991)、Ther mus thermophilus DNAリガーゼ(Abbott Laboratories)、Thermus scotoductus D NAリガーゼ、およびRhodothermus marinus DNAリガーゼ(Thorbjarnardottirら、 Gene 151:177-180(1995))。T4 DNAリガーゼは、DNA:RNAハイブリッドに含まれる DNA末端を連結するその能力のために、RNA標的配列を含む連結に好ましい(Hsuih ら、Quantitative detection of HCV RNA using novel ligation-dependent pol ymerase chainreaction，American Association for the Study of Liver Disea ses(Chicago，IL，November 3-7，1995)。 リガーゼにより触媒される非標的指向連結の頻度は、以下のように決定され得 る。LM-RCAは、標的配列の存在下で、開環プローブおよびギャップオリゴヌクレ オチドを用いて行われ得る。次いで、非標的指向連結産物は、このような連結さ れたプローブ由来のTS-DNAを捕獲するために、ギャップオリゴヌクレオチドを伴 わずに連結された開環プローブに特異的なアドレス(address)プローブを用いる ことにより検出され得る。標的指向連結産物は、ギャップオリゴヌクレオチドを 伴って連結された開環プローブに特異的なアドレスプローブを用いることにより 検出され得る。これらのアドレスプローブのそれぞれを含む領域と共に固体状態 検出器を用いることにより、標的指向連結産物および非標的指向連結産物の両方 が検出され、そして定量され得る。生成された標的指向および非標的指向TS-DNA は、連結操作の特異性の尺度を提供する。標的指向連結はまた、Barany（1991） に議論されるように評価され得る。 Ｓ．DNAポリメラーゼ RCAのローリングサークル複製工程に有用なDNAポリメラーゼは、プライムされ た(primed)一本鎖サークルのローリングサークル複製を行わなければならない。 このようなポリメラーゼを、本明細書中ではローリングサークルDNAポリメラ-ゼ と呼ぶ。ローリングサークル複製について、DNAポリメラーゼは、鋳型鎖に相補 的な鎖に置換し得（鎖置換と呼ばれる）、そして5'→3'エキソヌクレアーゼ活性 を欠くことが好ましい。鎖置換は、連結されたOCPの複数縦列コピーの合成を生 じるために必要である。5'→3'エキソヌクレアーゼ活性は、存在すれば、合成鎖 の破壊をもたらし得る。開示された方法における使用のためのDNAポリメラーゼ は、高度に進行することもまた好ましい。開示された方法における使用のための DNAポリメラーゼの適合性は、ローリングサークル複製を行うその能力を評価す ることにより容易に決定され得る。好ましいローリングサークルDNAポリメラー ゼは、バクテリオファージφ29 DNAポリメラーゼ（Blancoらの、米国特許第5,19 8,543号および同第5,001,050号）、ファージM2 DNAポリメラーゼ(Matsumotoら、 Gene 84:247(1989))、ファージφPRD1 DNAポリメラーゼ(Jungら、Proc. iol.Chem．268:1965-1975(1993))、DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメント(Jac obsenら、Eur.J.Biochem．45:623-627(1974))、T5 DNAポリメラーゼ(Chatterjee ら、Gene 97:13-19(1991))、PRD1 DNAポリメラーゼ(ZhuおよびIto,Biochim.Biop hys.Acta．1219:267-276(1994))、改変T7 DNAポリメラーゼ(TaborおよびRichard son，J.Biol.Chem．262:15330-15333（1987）;TaborおよびRichardson，J.Biol. Chem．264:6447-6458（1989）;Sequenase^TM(U.S.Biochemi cals))、およびT4 DNAポリメラーゼホロ酵素(KaboordおよびBenkovic，Curr.Bio l．5:149-157(1995))である。φ29 DNAポリメラーゼが最も好ましい。 鎖置換は、鎖置換因子（例えば、ヘリカーゼ）の使用により容易にされ得る。 鎖置換因子の存在下でローリングサークル複製を行い得る任意のDNAポリメラー ゼは、このDNAポリメラーゼが、このような因子の非存在下でローリングサーク ル複製を行わないとしても、開示される方法における使用のために適切であると 考えられる。RCAにおいて有用な鎖置換因子として、BMRF1ポリメラーゼアクセサ リーサブユニット(Tsurumiら、J.Virology 67(12):7648-7653(1993))、アデノウ イルスDNA結合タンパク質(Zijderveldおよびvan der Vliet，J.Virology 68(2): 1158-1164(1994))、単純ヘルペスウイルスタンパク質ICP8(BoehmerおよびLehman ，J.Virology 67(2):711-715(1993)；SkaliterおよびLehman，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 91(22):10665-10669(1994))、一本鎖DNA結合タンパク質(SSB;Rigler およびRomano，J.Biol.Chem．270:8910-8919(1995))、およびウシ胸腺ヘリカー ゼ(Siegelら、J.Biol.Chem．267:13629-13635(1992))が挙げられる。 ローリングサークル複製を行うポリメラーゼの能力は、FireおよびXu，Proc． Natl．Acad．Sci．USA 92:4641-4645(1995)および実施例１に記載されるアッセ イのような、ローリングサークル複製アッセイにおいてポリメラーゼを使用する ことにより決定され得る。 DNAポリメラーゼの別の型は、ギャップ充填合成工程（例えば、ギャップ充填L M-RCA（実施例３を参照のこと））が使用される場合に使用され得る。ギャップ を充填するためにDNAポリメラーゼを使用する場合、DNAポリメラーゼによる鎖置 換は所望でない。このようなDNAポリメラーゼを、本明細書中ではギャップ充填D NAポリメラーゼと呼ぶ。他に示されなければ、ローリングサークルDNAポリメラ ーゼまたはギャップ充填DNAポリメラーゼと特定することなく本明細書中で言及 されるDNAポリメラーゼは、ローリングサークルDNAポリメラーゼであって、ギャ ップ充填DNAポリメラーゼでないと理解される。好ましいギャップ充填DNAポリメ ラーゼは、T7 DNAポリメラーゼ(Studierら、Methods Enzymol．185:60-89(1 変T7 DNAポリメラーゼ(TaborおよびRichardson，J.Biol.Chem．262:15330-15333 (1987);TaborおよびRichardson，J.Biol.Chem．264:6447-6458(1989)；Sequenas e^TM(U.S.Biochemicals))、およびT4 DNAポリメラーゼ(Kunkelら、Methods Enzym ol.154:367-382(1987))である。特に好ましいギャップ充填DNAポリメラーゼの型 は、Thermus flavus DNAポリメラーゼ（MBR，Milwaukee，WI）である。最も好ま しいギャップ充填DNAポリメラーゼは、Taq DNAポリメラーゼのStoffelフラグメ ント(Lawyerら、PCR Methods Appl．2(4):275-287(1993)，Kingら、J.Biol.Chem ．269(18):13061-13064(1994))である。 ポリメラーゼのギャップを充填する能力は、ギャップ充填LM-RCAを行うことに より決定され得る。ギャッブ充填LM-RCAは、標的配列にハイブリダイズする場合 にギャップスペースを形成する開環プローブを用いて行われる。連結は、ギャッ プスペースがDNAポリメラーゼで充填される場合にのみ起こり得る。ギャップ充 填が生じる場合、TS-DNAが検出され得、さもなければ、DNAポリメラーゼまたは 反応条件がギャップ充填DNAポリメラーゼに有用でないと結論づけられ得る。 Ｔ．RNAポリメラーゼ インビトロで転写を行い得、そしてプロモーター配列が同定されている任意の RNAポリメラーゼは、開示されたローリングサークル転写方法において使用され 得る。複雑な要求を有さない安定なRNAポリメラーゼが好ましい。特定のプロモ ーター配列(SchenbornおよびMeirendorf，Nucleic Acids Research 13:6223-623 6(1985))に高度に特異的な、T7 RNAポリメラーゼ(Davanlooら、Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 81:2035-2039(1984))およびSP6 RNAポリメラーゼ(ButlerおよびCha mberlin，J.Biol.Chem．257:5772-5778(1982))が最も好ましい。この特徴を有す る他のRNAポリメラーゼもまた好ましい。プロモーター配列は、一般的に特定のR NAポリメラーゼにより認識されるので、OCPまたはATCは、使用されるRNAポリメ ラーゼにより認識されるプロモーター配列を含むべきである。多くのプロモータ ー配列が公知であり、そして同定されたプロモーター配列を有する任意の適切な RNAポリメラーゼが使用され得る。RNAポリメラーゼのプロモーター配列は、確立 された技術を用いて同定され得る。 上記の物質は、開示された方法を行うのに有用なキットとして、任意の適切な 組合せで共にパッケージされ得る。 II．方法 開示されたローリングサークル増幅(RCA)法は、環状一本鎖DNA分子の複製を含 む。RCAにおいて、ローリングサークル複製プライマーは、環状OCPまたはATC分 子にハイブリダイズし、続いて、鎖置換DNAポリメラーゼを用いてOCPまたはATC 分子のローリングサークル複製を行う。増幅は、単一反応サイクルでのローリン グサークル複製間で起こる。ローリングサークル複製は、OCPまたはATC配列の縦 列反復を含む大きなDNA分子を生じる。このDNA分子を、縦列配列DNA（TS-DNA） と呼ぶ。ローリングサークル複製をまた、本明細書中では単分子セグメント増幅 (USA)とも呼ぶ。用語「単分子セグメント増幅」は、一般的に、目的の個々の核 酸セグメント（例えば、標的配列）の増幅を強調するために本明細書中で使用さ れる。 好ましい実施態様である、連結媒介ローリングサークル増幅(LM-RCA)法は、複 製の前に連結操作を含む。連結操作において、OCPは、存在する場合、そのコグ ネイト標的核酸配列にハイブリダイズし、続いてハイブリダイズされたOCPの末 端を連結して、共有結合により閉じた一本鎖OCPを形成する。連結後、ローリン グサークル複製プライマーはOCP分子にハイブリダイズし、続いて鎖置換DNAポリ メラーゼを用いて環状OCP分子のローリングサークル複製を行う。一般的に、LM- RCAは、以下の工程を包含する： （ａ）開環プローブ(OCP)と標的サンプルとを混合する工程、OCP-標的サンプ ル混合物を得る工程、および開環プローブと標的配列との間のハイブリダイゼー ションを促進する条件下で、OCP-標的サンプル混合物をインキュベートする工程 、 （ｂ）リガーゼとOCP-標的サンプル混合物とを混合する工程、連結混合物を得 る工程、および開環プローブの連結を促進する条件下で連結混合物をインキュベ ートして、増幅標的サークル(ATC)を形成する工程、 （ｃ）ローリングサークル複製プライマー(RCRP)と連結混合物とを混合する工 程、プライマー-ATC混合物を得る工程、および増幅標的サークルとローリングサ ークル複製プライマーとの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で、プ ライマー-ATC混合物をインキュベートする工程、 （ｄ）DNAポリメラーゼとプライマー-ATC混合物とを混合する工程、ポリメラ ーゼATC混合物を得る工程、および増幅標的サークルの複製を促進する条件下で 、ポリメラーゼ-ATC混合物をインキュベートする工程であって、ここで増幅標的 サークルの複製は、縦列配列DNA(TS-DNA)の形成をもたらす、工程。 開環プローブは一本鎖線状DNA分子であり、これは5'末端から3'末端に、5'リ ン酸基、右標的プローブ部分、プライマー相補部分、スペーサー領域、左標的プ ローブ部分、および3'水酸基を含み、ここで左標的プローブ部分は標的配列の5' 領域に相補的であり、そして右標的プローブ部分は標的配列の3'領域に相補的で ある。 左および右の標的プローブ部分は、１つ以上のギャップオリゴヌクレオチドに より充填される中央のギャップを伴ってまたは伴わずに、標的核酸配列の２つの 末端にハイブリダイズする。一般的に、ギャップオリゴヌクレオチドを使用する LM-RCAは、LM-RCA反応において、（１）5'領域と3'領域との間に位置する中央領 域を有する標的配列、およびOCPを使用すること（ここで、開東プローブの左標 的プローブ部分も開環プローブの右標的プローブ部分も、標的配列の中央領域に 相補的でない）、ならびに（２）１つ以上のギャップオリゴヌクレオチドと標的 サンプルとを混合すること（その結果、OCP-標的サンプル混合物は、開環プロー ブ、１つ以上のギャップオリゴヌクレオチド、および標的サンプルを含み、ここ で、各ギャップオリゴヌクレオチドは、5'リン酸基および3'水酸基を含む一本鎖 線状DNA分子からなり、各ギャップオリゴヌクレオチドは、標的配列の中央領域 の全てまたは一部に相補的である）により行われ得る。 Ａ．連結操作 開環プローブ（必要に応じて、１つ以上のギャップオリゴヌクレオチドの存在 下で）は、適切なハイブリダイゼーション条件下で、DNA、RNA、またはその両方 を含むサンプルとインキュベートされ、次いで、連結されて共有結合により閉じ た環を形成する。連結された開環プローブは、増幅標的環の形態である。この操 作は、Nilssonら、Science，265:2085-2088(1994)により記載される南京錠(padl ock)プローブの連結と類似している。この連結操作は、後の増幅を、標的配列の 存在に依存させる。連結操作に適切なリガーゼは上述されている。連結条件 は、一般的に公知である。大部分のリガーゼは、Mg⁺⁺を必要とする。リガーゼの ２つの主な型（ATP依存リガーゼおよびNAD依存リガーゼ）が存在する。ATPまた はNADは、リガーゼの型に依存して、連結間に存在すべきである。 リガーゼおよび連結条件は、一本鎖末端の連結の頻度を限定するように最適化 媒連結（60℃で起こる）の場合、一本鎖DNA末端を有する1,000,000分子のうち１ 分子のみが連結されると評価される。これは、リガーゼ連鎖反応においてこのリ ガーゼを用いて示される非特異的増幅のレベルに基づく。いずれのより高い非特 異的連結頻度も、リガーゼ連鎖反応において、非常に高いバックグラウンド増幅 を引き起こす。この評価値を用いて、連結結合部に正しく配置されたギャップオ リゴヌクレオチドを有する、非特異的に連結された開環の生成についての適切な ような事象の頻度は、1,000,000のうち１の平方、または1×10¹²のうち１である べきである。50μlの典型的な連結反応に使用されるプローブの数は２×10¹²で ある。従って、正しいギャップオリゴヌクレオチドを含む非特異的連結環の数は 、反応あたり約２個であると予想される。 RNAが検出される場合、逆転写操作を行って、DNA標的配列を作製することが好 ましい。このような操作の使用の例は、実施例４に記載される。あるいは、RNA 標的配列は、DNA:RNAハイブリッド基質に対して連結を行い得るリガーゼを使用 することにより、直接検出され得る。これについて好ましいリガーゼは、T4 DNA リガーゼである。 Ｂ．複製操作 特定の連結および増幅標的環により形成される環状開環プローブは、ローリン グサークル複製の基質として作用する。この反応は、２つの試薬：（ａ）ローリ ングサークル複製プライマー（これは、OCPまたはATCのプライマー相補部分に相 補的である）、および（ｂ）ローリングサークルDNAポリメラーゼの添加を必要 とする。DNAポリメラーゼは、所望の限り進行する進行的ローリングサークル重 合反応においてプライマー伸長および鎖置換を触媒し、増幅標的環または開環プ ローブに相補的な配列の約1000までの縦列コピーを含む、100,000ヌクレオチド までまたはそれより長い分子を生じる（図４）。この縦列配列DNA(TS-DNA)は、O CPの場合、交互の標的配列およびスペーサー配列からなる。TS-DNAのスペーサー 配列は、元の開環プローブにおける左標的プローブと右標的プローブとの間の配 列の相補物であることに留意のこと。好ましいローリングサークルDNAポリメラ ーゼは、バクテリオファージφ29のDNAポリメラーゼである。 ローリングサークル複製間に、反応において生じるDNAを標識するために、ブ ロモデオキシウリジン三リン酸のような放射性または修飾ヌクレオチドをさらに 含み得る。あるいは、ビオチン化ヌクレオチドのような結合部分を提供する、適 切な前駆体を含み得る(Langerら、(1981))。 ローリングサークル増幅は、複数の連結されたOCPまたはATCを含むアッセイに おいて異なる長さのTS-DNAを生成するように操作され得る。これは、単一のアッ セイにおいて検出され得る異なる標的の数を増やすのに有用であり得る。異なる 長さのTS-DNAは、いくつかの手段で生成され得る。１つの実施態様において、異 なるクラスのOCPまたはATCのスペーサー領域の塩基組成は、特定のヌクレオチド がリッチであるように設計され得る。次いで、リッチにされたヌクレオチドに相 補的な少量のジデオキシヌクレオチドが、ローリングサークル増幅反応に含まれ 得る。いくらかの増幅の後、ジデオキシヌクレオチドは、相補ヌクレオチドにつ いてリッチにされたOCPまたはATCのクラスのTS-DNA産物の伸長を終結させる。他 のOCPまたはATCは、相補ヌクレオチドについてリッチにされていないので、ほと んど終結されないようであり、そして平均して、より長いTS-DNA産物を生成する 。 別の実施態様において、２つの異なるクラスのOCPまたはATCは、異なるプライ マー相補部分と共に設計され得る。これらの異なるプライマー相補部分は、異な るローリングサークル複製プライマーに相補的であるように設計される。次いで 、２つの異なるローリングサークル複製プライマーは、単一のローリングサーク ル増幅反応において（しかし、著しく異なる濃度で）共に使用される。高濃度の プライマーは、有利なキネティックスによりローリングサークル複製を即座にプ ライムするが、一方、低濃度のプライマーは、不利なキネティックスによりプラ イミングが遅延される。従って、高濃度のプライマーについて設計されたOCPま たはATCのクラスのTS-DNA産物は、低濃度のプライマーについて設計されたOCPま た はATCのクラスのTS-DNA産物より長い。なぜならより長い時間の間で複製された からである。別の選択として、ローリングサークル複製プライマーのうちの１つ は、ケージ(caged)オリゴヌクレオチドであり得る。この場合、２つのローリン グサークル複製プライマーは、類似の濃度であり得る。ケージローリングサーク ル複製プライマーは、ケージ構造が取り除かれるまで、ローリングサークル複製 を支持しない。従って、第１に、非ケージ(uncaged)ローリングサークル複製プ ライマーは、複製操作が始まると、そのコグネイト増幅標的環（単数または複数 ）の増幅を始め、第２に、ケージローリングサークル複製プライマーは、ケージ の除去の後にのみ、そのコグネイト増幅標的環（単数または複数）の増幅を始め る。各ローリングサークル複製プライマーから生成されるTS-DNA量は、異なる有 効な複製時間に比例して異なる。従って、ローリングサークル複製プライマーの それぞれの型を用いて生成されたTS-DNA量は、ケージプライマーを用いて制御さ れ得る。このようなケージプライマーの使用は、ケージプライマーが、（低濃度 よりむしろ）、ケージから出されるとすぐにローリングサークル複製を効率的に 開始するのに十分な濃度で、提供され得るという利点を有する。 Ｃ．改変およびさらなる操作 １．増幅産物の検出 現在の検出技術は、多くの場合において不必要なRCAの第２のサイクルを行う 。従って、RCAの第１のサイクルの産物を直接検出するように進め得る。検出は 、以下に記載のように、１次標識または２次標識により達成され得る。 （ａ）１次標識 １次標識は、RCAにおけるローリングサークル複製またはRCTにおける転写の間 に、標識部分（例えば、蛍光ヌクレオチド、ビオチン化ヌクレオチド、ジゴキシ ゲニン含有ヌクレオチド、またはブロモデオキシウリジン）を組み込むことから なる。例えば、100ヌクレオチド毎に４アナログの頻度で、シアニン色素UTPアナ ログ(Yuら、(1994))を組み込み得る。インサイチュで増幅された核酸を検出する ための好ましい方法は、BrdUrdを伴う増幅間にDNAを標識し、続いて組み込まれ たBUDRにビオチン化抗BUDR抗体(Zymed Labs，San Francisco，CA)を結合させ、 続いてビオチン部分にストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ(Life Sciences， Inc.)を結合させ、最終的に、フルオレセイン-トリアミド(DuPont de Nemours&C o.，Medical Products Dept.)による蛍光を発光させることである。 （ｂ）検出プローブでの２次標識 ２次標識は、適切な分子プローブ（検出プローブと呼ばれる）を用いて増幅DN AまたはRNAを検出することからなる。例えば、開環は、公知の任意の配列のいく つかの反復（検出タグと呼ばれる）を含むように設計され得る。２次ハイブリダ イゼーション工程は、これらの検出タグに検出プローブを結合させるために使用 され得る（図７）。検出プローブは、例えば、酵素、蛍光部分、または放射性同 位元素を用いて、上記のように標識され得る。開環プローブあたり３つの検出タ グ、および各検出プローブあたり４つの蛍光部分を用いることにより、TS-DNAに おける開環検出プローブ反復毎に計12の蛍光シグナルを得ることができる。これ は、RCAにより増幅される連結した開環プローブ毎に計12,000の蛍光部分を生じ る。 （ｃ）複合化(multiplexing)およびハイブリダイゼーションアレイ検出 RCAは、異なる開環プローブのセットを用いることにより容易に複合化され、 各セットは、独特の標的への結合のために設計された異なる標的プローブ配列を 有する。それぞれの標的に対して設計された標的プローブ配列は異なるが、プラ イマー相補部分は変化しないままであり得、従ってローリングサークル複製のた めのプライマーは、全ての標的に対して同一のままであり得ることに留意のこと 。それらの標的を見出し得るこれらの開環プローブのみが、TS-DNAを生じる。RC Aにより生成されたTS-DNA分子は、高分子量および低複雑度であり；この複雑度 は開環プローブの長さである。所定のTS-DNAを、固体状態の検出器における固定 位置に捕獲するための２つの代替が存在する。１つは、それぞれの独特の開環プ ローブに対する独特のアドレスタグ配列を、開環プローブのスペーサー領域内に 含ませることである。所定の開環プローブから生じたTS-DNAは、特定のアドレス タグ配列に対応する配列を含む。第２のかつ好ましい代替は、アドレスタグとし てTS-DNAに存在する標的配列を使用することである。 （ｄ）組合せ多色コーディング 複合検出の好ましい形態は、異なる波長で蛍光を発するか、または異なって発 色するかのいずれかの標識の組合せの使用を含む。ハイブリダイゼーションプロ ーブの検出のための蛍光の利点のうちの１つは、いくつかの標的が同一のサンプ ルで同時に視覚化され得ることである。組合せストラテジーを用いて、スペクト ルにより分解可能な発蛍光団の数より多い標的が識別され得る。プローブ蛍光は 、完全に存在しないか（−）または単位量で存在する（＋）かのいずれかである ので、組合せ標識は、複合様式でプローブを標識するための最も単純な方法を提 供し；従って、画像分析は自動化をより受け入れやすく、そして多くの実験的な 人為産物（例えば、蛍光の差別な光退色および励起源出力スペクトルの変化の効 果）が避けられる。 標識の組合せは、異なる検出プローブ、および励起により、これらの検出プロ ーブが関連する異なる検出分子を同定するためのコードを確立する。この標識ス キームを、組合せ多色コーディング(CMC)と呼ぶ。このようなコーディングは、S peicherら、Nature Genetics 12:368-375(1996)により記載される。組み合わせ た場合、別々に検出され得る任意の数の標識が、組合せ多色コーディングに使用 され得る。組合せにおいて、２、３、４、５、または６つの標識が使用されるこ とが好ましい。６つの標識が使用されることが最も好ましい。使用される標識の 数は、式２^N-1（ここで、Ｎは標識の数である）に従って形成され得る、独特の 標識の組合せの数を確立する。この式に従って、２つの標識は３つの標識組合せ を形成し、３つの標識は７つの標識組合せを形成し、４つの標識は15の標識組合 せを形成し、５つの標識は31の標識組合せを形成し、そして６つの標識は63の標 識組合せを形成する。 組合せ多色コーディングについて、異なる検出プローブの群が１セットとして 使用される。このセットにおける各型の検出プローブは、特定かつ独特の蛍光標 識の組合せにより標識される。複合プローブを割り当てられたそれらの検出プロ ーブについて、標識は、各検出プローブ分子を全ての必要とされる標識で標識す ることにより達成され得る。あるいは、所定の型の検出プローブのプールは、そ れぞれ必要とされる標識のうちの１つにより標識され得る。プールを組み合わせ ることにより、検出プローブは、群として、その型の検出プローブに必要とされ る標識の組合せを含む。これは、単純な例で例示され得る。７つの異なる型の検 出プローブ（それぞれは、異なる検出タグに相補的であり、そして１から７と名 付けた）で開始すると、独特同定は、７つの組合せに使用される３つの異なる標 識を必要とする。任意にこの組合せを割り当てると、１つのコーディングスキー ムは以下の通りである： 検出プローブ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ 標識Ａ ＋ ＋ ＋ ＋ 標識Ｂ ＋ ＋ ＋ ＋ 標識Ｃ ＋ ＋ ＋ ＋ 示され得るように、検出プローブ７は、３つの異なる標識（Ａ、Ｂ、およびＣ） で標識されなければならない。これは、それぞれの個々の検出プローブ７分子に 対する標識Ａ、Ｂ、およびＣにより達成され得る。これは、上記の第１の選択で ある。あるいは、検出プローブ７の３つのプールは、別々に標識され得、１つの プールは標識Ａで、１つのプールは標識Ｂで、そして１つのプールは標識Ｃで標 識される。各プールにおいて、個々の検出プールは、単一の型の標識で標識され る。プールの混合は、必要とされる３つの全ての標識を集合的に含む、検出プロ ーブ７の溶液をもたらす。異なる数のプローブを必要とする検出プローブの標識 は、類似の様式で達成され得る。 もちろん、上記の２つの型の標識スキームは組み合わされ得る。これは、異な る標識で複合標識された同一の型の検出プローブ分子と組み合わせた複合標識を 有する検出プローブ分子をもたらす。これは、上記の例を用いて例示され得る。 検出プローブ７型の２つのプールは、別々に標識され得、１つのプールは標識Ａ およびＢの両方で、そして１つのプールは標識Ｃのみで標識される。プールの混 合は、必要とされる３つの全ての標識を集合的に含む、検出プローブ７の溶液を もたらす。組合せ多色コーディングは、実施例７および８においてさらに例示さ れる。 各検出プローブが単一の標識で標識される場合、標識の組合せはまた、異なる 検出プローブに相補的な検出タグのコードされる組合せで、OCPまたはATCを用い ることにより作製され得る。このスキームにおいて、OCPまたはATCは、特異的な 標識コードに必要とされる標識の組合せを表す検出タグの組合せを含む。上記の 例を用いて、１セットの７つのOCPまたはATC（１から７と呼ばれる）は、１セッ トの３つの検出タグ配列（dtA、dtB、およびdtCと呼ばれる）から選択された１ 、２、または３つの検出タグを含む。各検出タグ配列は、標識Ａ、Ｂ、またはＣ のうちの１つに対応し、各標識は３つの検出プローブのうちの１つに結合してお り、これらは、それぞれdpA、dpB、およびdpCと呼ばれる。得られたコーディン グスキームの例は以下の通りである： OCPまたはATC １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ dtA ＋ ＋ ＋ ＋ dtB ＋ ＋ ＋ ＋ dtC ＋ ＋ ＋ ＋ ハイブリダイゼーションは、全ての異なる標識検出プローブ（dpA、dpB、および dpC）のプールを用いて行われ得た。この結果は、OCP 7から生成されたTS-DNAが 、３つ全ての検出プローブにハイブリダイズし、その結果、TS-DNAを３つ全ての 標識で標識したことであった。対照的に、OCP 4から生成されたTS-DNAは、例え ば、検出プローブdpAおよびadBにのみハイブリダイズし、従って、OCP 4由来TS- DNAを標識ＡおよびＢのみで標識した。このコーディングおよび検出方法が好ま しい。このコーディングスキームの使用は、実施例７および８に例示される。 上記のように、ローリングサークル増幅を操作して、複合連結OCPまたはATCを 含むアッセイにおいて異なる長さのTS-DNAを生成し得る。得られた異なる長さの TS-DNAは、単にそれらが生じる検出シグナルの大きさに基づいて区別され得る。 従って、同じセットの検出プローブを用いて、２つの異なるセットの生成された TS-DNAを区別し得る。このスキームにおいて、２つの異なるTS-DNA（それぞれは 、異なるサイズであるが、同じ色コードを割り当てられた）は、ハイブリダイズ した検出プローブにより生成されるシグナルの大きさにより区別される。この方 法で、計126の異なる標的が、63の組合せを有するコードを用いて、単一の固体 状態のサンプルに対して区別され得る。なぜならこのシグナルは、２つの特色（ 低振幅および高振幅）で機能するからである。従って、例えば、ガン遺伝子変異 の検出のために、63プローブの低振幅シグナルセットを使用し得、そして腫瘍サ プレッサーp53変異の検出のために63プローブの高振幅シグナルセットを使用し 得 る。 Speicherらは、スペクトル間隔350〜770nmで配される１セットの蛍光および対 応する光学フィルター（これは、全ての可能な蛍光対間の高度な識別を与える） を記載する。この蛍光セット（組合せ多色コーディングに好ましい）は、4'-6- ジアミジノ-2-フェニルイノドール(DAPI)、フルオレセイン(FITC)、およびシア ニン色素Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、およびCy7からなる。この好ましいセットの 任意のサブセットもまた使用され得る（ここで、組合せはほとんど必要とされな い）。これらの蛍光について、最大吸収および最大発光は、それぞれ以下の通り である：DAPI（350nm;456nm）、FITC（490nm；520nm）、Cy3（554nm；568nm）、 Cy3.5（581nm；588nm）、Cy5（652nm；672nm）、Cy5.5（682nm；703nm）、およ びCy7(755nm；778nm)。これらの蛍光の励起および発光スペクトル、励起係数、 および量子収率は、Ernstら、Cytometry 10:3-10(1989)、Mujumdarら、Cytometr y 10:11-19(1989)、Yu,Nucleic Acids Res．22:3226-3232(1994)、およびWaggon er,Meth.Enzymology 246:362-373(1995)により記載される。これらの蛍光は全て 、75Wキセノンアークにより励起され得る。 選択性を達成するために、５〜16nmの範囲の帯域幅を有するフィルターが好ま しい。シグナル識別を増幅するために、蛍光は、それらの最大スペクトルから離 れた波長で、励起および検出の両方がなされ得る。発光帯域幅はできるだけ広く 作製され得る。低ノイズ検出器（例えば、冷却CCDカメラ）について、励起帯域 幅の制限は、達成され得るシグナル対ノイズ比にほとんど効果を有さない。好ま しい蛍光セットを用いた使用のための好ましいフィルターのリストは、Speicher らの表１に列挙される。アークランプにより発光された赤外光が検出器に達する のを防ぐことは重要である；CCDチップはこの領域で極めて感度が高い。この目 的のために、適切なIR遮断フィルターを、CCD窓の直ぐ前の画像パスに挿入して 、画質の損失を最小にし得る。次いで、画像解析ソフトウェアを使用して、蛍光 ドットのスペクトルサインを計数し、そして解析し得る。 組合せ多色コーディングにおける個々のシグナルの識別は、増幅間に生成され たTS-DNAを折り畳むことにより増強され得る。上記のように、これは、好ましく は、折り畳み検出プローブ、ビオチン-抗体結合体、または両方の組合せを用い て達成される。折り畳んだTS-DNAは、直径が０.3ミクロン以下の空間を占め得る 。これに基づいて、100万までの別々のシグナルが、2.5mmサンプルドットにおい て検出され得ることが期待される。このような識別はまた、定量的シグナル検出 のために大きなダイナミックレンジをもたらす。例えば、２つの別々のシグナル が同じサンプルドットにおいて検出される場合、１：500,000までの２つのシグ ナル比が検出され得る。従って、異なる型のシグナル（例えば、多色コード）の 相対数は、広い範囲にわたって決定され得る。これは、例えば、特定の標的配列 がゲノムDNAサンプルにおいてホモ接合体またはヘテロ接合体であるか否か、標 的配列が遺伝したかまたは体細胞変異を表すか、およびゲノムDNAサンプル（例 えば、腫瘍サンプル）の遺伝的不均一性の決定を可能にすると期待される。第１ の場合では、ホモ接合体標的配列は、ヘテロ接合性標的配列のシグナルの数の２ 倍を生じる。第２の場合では、遺伝した標的配列は、ホモ接合体またはヘテロ接 合体のシグナルに等価な多くのシグナル（すなわち、多くのシグナル）を生じる が、一方、体細胞変異は、サンプルの供給源に依存する、より少ない数のシグナ ルを生じる。第３の場合では、特定の標的配列を有する、サンプルが由来する細 胞の相対数が決定される。特定の標的配列を有するサンプルにおける細胞が多い ほど、シグナルが大きくなる。 （ｅ）標的配列群の検出 複合RCAアッセイは、遺伝子の変異（ここで、多くの異なる変異が特定の疾患 に関連するか、または複数の遺伝子の変異が関与する）の検出に特に有用である 。例えば、ハンチントン舞踏病の原因となる遺伝子が同定されているが、この遺 伝子の異なる部分の広範囲の変異が、羅患した個体間に生じる。挙げ句の果てに 、個体が多くのハンチントン変異の１つ以上を有するかを検出するための単一の 試験がまだ発明されていなかった。単一のLM-RCAアッセイは、任意の数の標的配 列の群のうちの１つ以上のメンバーの存在を検出するために使用され得る。これ は、例えば、この群における各標的配列に対する開環プローブ（および、所望で あれば、関連するギャップオリゴヌクレオチド）を設計することにより達成され 得る。ここで、各開環プローブの標的プローブ部分は異なるが、全ての開環プロ ーブのプライマー部分および検出タグ部分の配列は同一である。開環プローブの 全ては、 同じOCP-標的サンプル混合物中におかれ、そして同じプライマーおよび検出プロ ーブが、TS-DNAを増幅および検出するために使用される。標的配列のいずれかが 標的サンプルに存在する場合、その標的に対するOCPが環に連結され、そして環 は増幅されてTS-DNAを形成する。OCPのいずれかの増幅から生じたTS-DNAに対す る検出タグは同一であるので、OCPのいずれかの連結から生じたTS-DNAが、この アッセイにおいて検出される。検出は、標的配列群のうちの少なくとも１つのメ ンバーが標的サンプルに存在することを示す。これは、単一のチューブまたはウ ェルでの複数の標的配列に関連した形質の検出を可能にする。 ポジティブな結果が見出される場合に、関与する特定の標的配列は、複合アッ セイを用いることにより同定され得る。これは、群の各OCPに、さらなる異なる 検出タグを含ませることにより容易にされ得る。このようにして、それぞれの異 なる標的配列を表す、それぞれの異なるOCPから生成されたTS-DNAは、個々に検 出され得る。このような複合アッセイは、最初のポジティブな結果が見出される 場合にのみ行われる必要があることで便利である。 上記のスキームはまた、多くの標的配列について等しく多くのアッセイを行う 必要なくスクリーニングするために、標的配列の任意の選択された群を用いて使 用され得る。最初のアッセイは、上記のように行われ得、それぞれは、標的配列 の異なる群にハイブリダイズするように設計されたOCPの異なる群を使用する。 次いで、どの標的配列が存在するかを決定するためのさらなるアッセイが、TS-D NAを生じるそれらの群にのみ行われ得る。このような群のアッセイは、所望であ れば、さらにネストされ得る。 (f)RCAを用いたインサイチュ検出 インサイチュハイブリダイゼーション、および蛍光インサイチュハイブリダイ ゼーション(FISH)として知られるその最も強力な履行は、細胞遺伝学において根 本的に重要である。RCAは、以下に示すように、FISHを使用するために適応され 得る。 開環プローブは、顕微鏡スライド上の標的上で連結され、ローリングサークル 複製の間、蛍光前駆体と共にインサイチュでインキュベートされる。ローリング サークルDNAポリメラーゼは、連結した開環プローブを、元々ハイブリダイズし ていた位置から変える。しかしながら、環は、DNAがニックを入れられなければ 、染色体上にトポロジー的にトラップされたままである(Nilssonら，(1994))。 残留クロマチンの存在は、染色体に沿った環の拡散を遅延し得る。あるいは、固 定法が、この拡散効果を最小限にするために改変され得る。この拡散は、染色体 に沿った２方向のいずれかへ等しく起こる可能性を有し、それゆえ、正味の拡散 置換(net diffusional displacement)は、10分間のインキュベートの間、比較的 小さくなり得る。この時間の間、ローリングサークル複製は、約2,500ブロモデ オキシウリジン部分を含む約25,000ヌクレオチドの直線分子（これは、ビオチン 化抗BUDR IgG(Zymed Labs，Inc.)および蛍光標識アビジンで検出され得る）を生 じるはずである。この取り込みのレベルが、顕微鏡を基盤としたCCDシステムを 用いた画像記録を容易にするはずである。拡散はまた、TS-DNAが標的鎖の相補物 とハイブリダイズし得るはずであるので、限定され得る。 インサイチュ検出の好ましい方法は、以下に示すような、レポーター結合試薬 単分子ローリング増幅(RBAURA)である。RBAURAにおいて、レポーター結合試薬が 使用され、ここで、オリゴヌクレオチド部分は、ローリングサークル複製プライ マーとして作用する。一旦レポーター結合試薬が標的分子と結合すると、増幅標 的環（amplification target circle)は、レポーター結合試薬のローリングサー クル複製プライマー配列にハイブリダイズし、続いてRCAによるATCの増幅が起こ る。生じるTS-DNAは、レポーター結合試薬のローリングサークル複製プライマー 配列をその一端に有し、従って、TS-DNAを標的分子のその部位へ固定する。以下 に記載された、ペプチド核酸プローブ単分子ローリング増幅(PNAPURA)およびロ ックされた(locked)抗体単分子ローリング増幅(LAURA)は、RBAURAの好ましい形 態である。 インサイチュ検出のためのTS-DNAの局在はまた、上記の折り畳み(collapsing) 検出プローブを使用したTS-DNAの折り畳み、ビオチン-抗体コンジュゲート、ま たはその両方によって増強され得る。複合的なインサイチュ検出は、以下のよう に行われ得る：ローリングサークル複製は、非標識ヌクレオチドを用いて行われ る。次いで、種々のTS-DNAが、各独特の標的配列またはTS-DNA中の各独特の検出 タグに特異的な検出プローブを用いた標準的な多色FISHを用いて検出される。 あるいは、そして好ましくは、上記の組合せ多色コードが、複合インサイチュ検 出に使用され得る。 (g)酵素結合検出 標識ヌクレオチドの組み込みによって標識された増幅核酸は、確立した酵素結 合検出システムで検出され得る。例えば、ビオチン-16-UTP(Boehringher Mannhe im)の組み込みによって標識された増幅核酸は、以下のように検出され得る。核 酸を、増幅核酸中に存在する標的配列(または、その相補物)に相補的な相補的DN Aオリゴヌクレオチド(アドレスプローブ)とのハイブリダイゼーションによって 、固体ガラス表面上に固定する。ハイブリダイゼーション後、ガラススライドを 洗浄し、そしてアルカリフォスファターゼーストレプトアビジンコンジュゲート (Tropix,Inc.,Bedford,MA)と接触させる。この酵素−ストレプトアビジンコンジ ュゲートは、増幅核酸上のビオチン部分へ結合する。過剰な酵素コンジュゲート を取り除くためスライドを再び洗浄し、そして化学蛍光基質CSPD(Tropix,Inc.) を添加し、そしてカバーガラススリップで覆う。次いで、スライドをBiorad Flu orimagerで画像化し得る。 (h)核酸の折り畳み 上記に記載されたように、TS-DNAまたはTS-RNA(これらは伸長した核酸分子と して生成される)は、コンパクトな構造へと折り畳まれ得る。同じ折り畳み手順 が、あらゆる伸長した核酸分子で行われ得ることがまた理解されるべきである。 例えば、ゲノムDNA、PCR産物、ウイルスのRNAまたはDNA、およびcDNAサンプルは すべて、開示された折り畳み手順を用いてコンパクトな構造に折り畳まれ得る。 折り畳まれるべき核酸が基体上に固定されることが好ましい。核酸を折り畳む好 ましい手段は、１つ以上の折り畳みプローブと、折り畳まれるべき核酸とをハイ ブリダイズすることによる方法である。折り畳みプローブは、折り畳まれるべき 核酸中の配列に各々相補的な多数の部分を有するオリゴヌクレオチドである。こ れらの部分は、折り畳みプローブの相補的な部分として言及され、ここで各々の 相補的な部分は、折り畳まれるべき核酸中の配列に相補的である。折り畳まれる べき核酸中の配列は、折り畳み標的配列(collapsing target sequence)として言 及される。折り畳みプローブの相補的な部分は、折り畳みプローブと折り畳み 標的配列との間の、特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを指持するあらゆ る長さであり得る。この目的のために、折り畳みプローブの相補的部分は、10〜 35ヌクレオチド長が好ましく、16〜20ヌクレオチド長であることが最も好ましい 。折り畳みプローブの少なくとも２つの相補的部分が、折り畳まれるべき核酸上 で分離されている折り畳み標的配列、または別々の核酸分子に存在する折り畳み 標的配列に相補的であることが好ましい。これは、各々の検出プローブが、核酸 サンプル中の少なくとも２つの別々の折り畳み標的配列にハイブリダイズするこ とを可能にする。このように、折り畳みプローブは、折り畳まれるべき核酸の異 なる部分との間の架橋を形成する。核酸にハイブリダイズする多くの折り畳みプ ローブの結合作用は、架橋した核酸の折り畳みネットワークを形成するようであ る。折り畳まれた核酸は、遊離の伸長した核酸よりずっと小さな体積を占め、そ して核酸にハイブリダイズするどんな検出プローブまたは検出標識も含む。この 結果は、伸長した核酸より容易に検出され得るコンパクトで別々な核酸構造であ る。折り畳まれている核酸は、近接してパッケージされている場合でも、検出可 能なシグナルが空間的に分離するのを可能にするので、インサイチュハイブリダ イゼーション適用および複合的検出の両方に有用である。折り畳み核酸は、組合 せ多色コードを用いた使用に特に好ましい。 折り畳みプローブはまた、上記のあらゆる検出標識を含み得る。これは、別々 の検出プローブまたは他の核酸検出手段が利用されない場合、折り畳まれた核酸 の検出を可能にする。好ましい標識は、ビオチンおよび蛍光分子である。特に好 ましい検出プローブは、分子信号(beacon)である。分子信号は、蛍光部分で標識 した検出プローブであり、ここで、蛍光分子は、検出プローブがハイブリダイズ した時だけ蛍光を発する。このようなプローブを使用すると、ハイブリダイズし ていない検出プローブはシグナルを発しないので、標識検出前にハイブリダイズ していないプローブを除去する必要性を除く。これは、複合アッセイに特に有用 である。 TS-DNAの折り畳みはまた、リガンド／リガンド結合対(例えばビオチンおよび アビジン)またはハプテン／抗体対の使用を通じて成し遂げられ得る。実施例６ に記載のように、ヌクレオチドアナログであるBUDRは、ローリングサークル複製 の間にTS-DNAへ組み込まれ得る。BUDRおよびアビジンに特異的なビオチン化抗体 を添加した場合、アビジン−ビオチン−抗体コンジュゲートにより架橋されたTS -DNAが架橋ネットワークを形成し、そしてTS-DNAはコンパクトな構造に折り畳ま れる。ビオチン誘導体化核酸は、cDNA合成、PCR、および他の核酸増幅技術のよ うな多くの共通の核酸複製操作において形成され得る。ほとんどの場合、ビオチ ンは、ビオチン誘導体化ヌクレオチドの組み込みまたはビオチン誘導体化プライ マーの使用のいずれかによって、合成された核酸中に組み込まれ得る。折り畳み プローブおよびビオチンで媒介された折り畳みはまた、核酸を折り畳むために共 に使用され得る。 ２．ネストされたLM-RCA RCA後、１回のLM-RCAが、第１のRCAで産生されたTS-DNA上で行なわれ得る。こ の新しい回のLM-RCAは、二次開環プローブとして言及される新しい開環プローブ を用いて行われ、これは、第１回目で生成されたTS-DNA中の標的配列と相補的な 標的プローブ部分を有する。このような新しい回のLM-RCAが行われる場合、その 増幅は、本明細書中でネストされたLM-RCAとして言及される。ネストされたLM-R CAは特に、LM-RCAのインサイチュハイブリダイゼーション適用に有用である。好 ましくは、二次OCPの標的プローブ部分は、第１のRCAで生成されたTS-DNAのスペ ーサー配列中の二次標的配列に対して相補的である。この二次標的配列の相補物 は、第１のRCAで使用されるOCPまたはATCのスペーサー部分に存在する。二次OCP とTS-DNAとを混合した後、連結およびローリングサークル増幅は、LM-RCAとして 行われる。各々の連結した二次OCPは、新しいTS-DNAを生じる。例えば、第１回 目においてOCPの２つの二次標的配列部分を有することにより、新しい回のLM-RC Aが、第１のRCAで産生されたTS-DNA中のすべてのOCPまたはATC反復に対する２つ の二次TS-DNA分子を生じる。このように、ネストされたLM-RCAの増幅収率は、約 2,000倍となる。従って、RCAの２つのサイクルを用いるすべての増幅は、1000× 2000=2,000,000である。ネストされたLM-RCAは、RCA、LM-RCA、２次DNA鎖置換、 鎖置換カスケード増幅または転写のような、本明細書に記載のあらゆるDNA複製 または転写操作に従い得る。 一般的に、ネストされたLM-RCAは、以下の第１のRCAを包含する： （ａ）二次開環プローブとポリメラーゼ混合物とを混合する工程、OCP-TS混合物 を得る工程、そしてそのOCP-TS混合物を、二次開環プローブど縦列配列DNAとの 間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でインキュベートする工程、 （ｂ）リガーゼとOCP-TS混合物とを混合する工程、二次連結混合物を得る工程、 そして二次連結混合物を、二次増幅標的環を形成するために二次開環プローブの 連結を促進する条件下でインキュベートする工程、 （ｃ）ローリングサークル複製プライマーと二次連結混合物とを混合する工程、 二次プライマー−ATC混合物を得る工程、そして二次プライマー−ATC混合物を、 二次増幅標的環とローリングサークル複製プライマーとの間のハイブリダイゼー ションを促進する条件下でインキュベートする工程、 （ｄ）DNAポリメラーゼと二次のプライマー−ATC混合物とを混合する工程、二次 ポリメラーゼ−ATC混合物を得る工程、そして二次ポリメラーゼ−ATC混合物を、 二次増幅標的環の複製を促進する条件下でインキュベートする工程であって、こ こで、二次増幅標的環の複製は、ネストされた縦列配列DNAの形成をもたらす、 工程。 エキソヌクレアーゼ消化工程は、ネストされたLM-RCAを行なう前に添加され得 る。これは、二次開環プローブの標的プローブ部分が、第１の開環プローブの標 的プローブ部分と同じである場合、特に有用である。連結したいずれのOCPも、 連結したOCPが遊離末端を有さないので消化されない。第１回目のLM-RCA間のTS- DNAにハイブリダイズしたOCPを消化する好ましい方法は、少なくとも約４つのホ スホロチオエート結合を、５’末端でヌクレオチド間に含んでいる特別なローリ ングサークル複製プライマーを使用することである。次いで、ローリングサーク ル複製の後に、反応混合物をエキソヌクレアーゼ消化に供する。これらのホスホ ロチオエート結合を切断できない５’エキソヌクレアーゼを使用することによっ て、TS-DNAにハイブリダイズしたOCPのみが消化され、TS-DNAは消化されない。 増幅の第１サイクルの間に生成されるTS-DNAは、５’末端のホスホロチオエート 結合によって保護されているのでエキソヌクレアーゼによって消化されない。こ の目的のための好ましいエキソヌクレアーゼは、T7遺伝子６エキソヌクレアーゼ である。T7遺伝子６エキソヌクレアーゼは、二次開環プローブを添加する前に9 0℃で10分間加熱することにより不活性化され得る。 エキソヌクレアーゼ消化の使用によって、ネストされたLM-RCAは、第１回目の LM-RCAで使用される同じ標的配列を用いて行なわれ得る。これは、例えば、一般 的に以下のようになされ得る。第１回目のLM-RCAの後、連結していない開環プロ ーブおよびTS-DNAにハイブリダイズしたギャップオリゴヌクレオチドは、T7遺伝 子６エキソヌクレアーゼで消化される。エキソヌクレアーゼは、90℃で10分間加 熱することによって不活性化される。次いで、第２の開環プローブが添加される 。このスキームにおいて、第２の開環プローブは、同じ起源の標的配列と相補的 であるが、異なる(任意の)スペーサー領域配列を含む、標的プローブ部分を有す る。次いで第２回目のLM-RCAが行われる。この第２回目において、第２の開環プ ローブの標的は、第１のサイクルによって生じたTS-DNA中に含まれる反復標的配 列を含む。この手順は、ネストされたLM-RCA後に得られる増幅DNA中の元の標的 配列を保存するのに有利である。 ネストされたLM-RCAはまた、増幅されていない連結したOCPまたはATPで行なわ れ得る。この場合、LM-RCAは、ATCまたは標的依存性連結OCPのいずれかを用いて 行なわれ得る。これは、インサイチュ検出に対して特に有用である。インサイチ ュ検出のために、第１の増幅していないOCP（その標的配列にトポロジー的にロ ックされている）は、ネストされたLM-RCAに供し得る。第１のOCPは増幅しない ことによって、標的配列にハイブリダイズしたままであり得るが、一方LM-RCAは 、第１のOCPにトポロジー的にロックされた二次のOCPを増幅する。これは、図12 に図示している。 ３．二次DNA鎖置換および鎖置換カスケード増幅 二次DNA鎖置換は、TS-DNAを増幅するための別の方法である。二次DNA鎖置換は 、二次DNA鎖置換プライマーをTS-DNAにハイブリダイズし、そしてDNAポリメラー ゼがこれらのプライムされた部位からDNAを合成することによって成し遂げられ る（図11）。二次DNA鎖置換プライマーの相補物は、TS-DNAの各々の反復で生じ るので、二次DNA鎖置換は、RCTで得られる増幅レベルと類似するかまたはより大 きなレベルを生じ得る。二次DNA鎖置換の産物は、二次縦列配列DNAまたはTS-DNA -2として言及される。 二次のDNA鎖置換は、RCAを行なって、TS-DNAをポリメラーゼ-ATC混合物中で生 成し、次いで二次DNA鎖置換プライマーとポリメラーゼ−ATC混合物とを混合し、 二次DNA鎖置換混合物を得、そして二次DNA鎖置換混合物を、縦列配列DNAの複製 を促進する条件下でインキュベートすることによって成し遂げられ得る。二次DN A鎖置換プライマーは、初めに記載されたような生成されたTS-DNAに対して用い られるOCPまたはATCの一部と相補的である。二次DNA鎖置換プライマーは、ロー リングサークル複製プライマー、またはもし使用するならば、三次DNA鎖置換プ ライマーと相補的ではないことが好ましい。 二次DNA鎖置換はまた、ローリングサークル複製と同時に行われ得る。これは 、ローリングサークル複製のために混合物をインキュベートする前に、二次DNA 鎖置換プライマーとポリメラーゼ−ATC混合物とを混合することによって成し遂 げられる。同時ローリングサークル複製および二次DNA鎖置換のために、ローリ ングサークルDNAポリメラーゼが、両方の複製に使用されることが好ましい。こ れは、最適条件が使用されることを可能にし、そして図11Bに示されるように下 流で合成された他の鎖の置換を生じる。二次DNA鎖置換は、本明細書中に開示さ れるあらゆるDNA複製操作(例えば、RCA、LM-RCA、またはネストされたLM-RCA)に 従い得る。 二次DNA鎖置換の効率を最適化するために、十分な濃度の二次DNA鎖置換プライ マーは、あらゆる残存する未連結OCPおよびTS-DNAへの結合のために存在し得る ギャップオリゴヌクレオチドより優れて競合する(outcompete)ために、伸長(gro wing)TS-DNA鎖の十分に迅速なプライミングを得るために使用されることが好ま しい。一般的に、これは、二次DNA鎖置換プライマーが、TS-DNA上の二次DNA鎖置 換プライマーのハイブリダイゼーションのための一本鎖部位の濃度と比較して、 非常に大過剰である場合に成し遂げられる。二次DNA鎖置換プライマーの濃度の 最適化は、YoungおよびAnderson、「Quantitative analysis of solution hybri dization」Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach(IRL Press,1985 )47-71頁によって記載されているような方法を用いた、ハイブリダイゼーション キネティクスの解析によって助けられ得る。例えば、φ29DNAポリメラーゼが、 ローリングサークルDNAポリメラーゼとして使用されると仮定すれば、TS-DNAは 、 １秒間に約53ヌクレオチドの速度で生成され、そして、ローリングサークルDNA ポリメラーゼは、19秒間に約10コピーの増幅標的サークルを生成する。80nMの濃 度（LM-RCA連結操作に使用するための典型的な濃度）で存在するOCP駆動(driver )DNA（連結していないOCP）に対する、理論的溶液ハイブリダイゼーションキネ ティクスの解析、および800nMの濃度で存在する二次DNA鎖置換プライマー駆動DN Aに対する理論的溶液ハイブリダイゼーションキネティクスの解析から、二次DNA 鎖置換プライマーは、30秒間でそれらの10コピーと結合するが、一方連結してい ないOCPは、30秒間に１部位もハイブリダイズしない（８％の部位が充填してい る）ことが示される。DNAポリメラーゼの濃度が、比較的高い（例えば、100から 1000nMの範囲）場合、ポリメラーゼは、ハイブリダイズした二次DNA鎖置換プラ イマー上の利用可能な各３’末端でDNA合成を開始し、そしてこれらの伸長TS-DN A-2分子は、連結していないOCP分子によるあらゆるハイブリダイゼーションをブ ロックする。あるいは、二次DNA鎖置換の効率が、TS-DNA増幅前の連結していな い開環プローブおよびギャップオリゴヌクレオチドの除去によって改善され得る 。二次DNA鎖置換において、二次DNA鎖置換プライマーの濃度は、一般的に500nM から5000nMであることが好ましく、そして700nMから1000nMが最も好ましい。 二次DNA鎖置換プライマーが伸長される時、DNAポリメラーゼは、次のハイブリ ダイズした二次DNA鎖置換分子の５’末端に作動し、そしてその５’末端を置換 する。この様式において、伸長DNAポリメラーゼの縦列が、TS-DNA鋳型上に形成 される。ローリングサークル反応が続く限り、新しい二次DNA鎖置換プライマー および新しいDNAポリメラーゼが、ローリングサークルの伸長末端でTS-DNAに添 加される。TS-DNA-2の生成と、鎖置換による溶液中へのその遊離を図11に図示的 に示す。 一般的に、二次DNA鎖置換は、RCAと同時にまたはそれに続いて、二次DNA鎖置 換プライマーとポリメラーゼ-ATC混合物とを混合し、そして縦列配列DNAと二次D NA鎖置換プライマーとの間のハイブリダイゼーション、および縦列配列DNAの複 製の両方が促進されるような条件下で、ポリメラーゼ−ATC混合物をインキュベ ートすることによって行われ得、ここで、縦列配列DNAの複製は二次縦列配列DNA 形成をもたらす。 二次DNA鎖置換が、三次DNA鎖置換プライマーの存在下で行われる場合、TS-DNA 配列の指数的増幅がおこる。二次DNA鎖置換のこの特別な、好ましい形態は、鎖 置換カスケード増幅(SDCA)と呼ばれる。図13に示されたSDCAにおいて、二次DNA 鎖置換プライマーは、上記のようにTS-DNAの複製をプライムしてTS-DNA-2を形成 する。次いで、三次DNA鎖置換プライマー鎖は、TS-DNA-2にハイブリダイズし、 そしてTS-DNA-2複製をプライムしてTS-DNA-3を形成する。隣接する伸長TS-DNA-3 鎖によるTS-DNA-3の鎖置換は、TS-DNA-3を二次DNA鎖置換プライマーとのハイブ リダイズに利用可能にする。これは、TS-DNA-4(TS-DNA-2と同等である)を生じる 他の回の複製をもたらす。次に、TS-DNA-4は、三次DNA鎖置換プライマーによっ てプライムされるDNA複製のための鋳型となる。このカスケードは、反応が止ま るか、または試薬が限界になるまでこの様式を続ける。この反応は、DNAをほぼ 指数的速度で複製するが、統計学的に分布したプライミングの誤り、および反応 中に生じるDNAネットワークの大きな大きさに関係する立体障害事象があるので 、キネティクスは、正しくは指数的ではない。SDCAの好ましい形態において、ロ ーリングサークル複製プライマーは、三次DNA鎖置換プライマーとして作用し、 従って、別々のプライマーに対する必要性が除かれる。この形態において、ロー リングサークル複製プライマーは、伸長TS-DNA-2鎖上の伸長の迅速なプライミン グを得るために十分に高濃度で使用されるべきである。SDCAの効率を最適化する ために、二次DNA鎖置換プライマーおよび三次DNA鎖置換プライマーの十分な濃度 を使用して、その相補的TS-DNAへの結合についてTS-DNAより優れて競合するため に、および二次DNA鎖置換プライマーの場合においては、あらゆる残存未連結OCP およびTS-DNAへの結合のために存在し得るギャップオリゴヌクレオチドより優れ て競合するために、伸長TS-DNA鎖の十分に迅速なプライミングを得ることが好ま しい。一般的に、これは、二次DNA鎖置換プライマーおよび三次DNA鎖置換プライ マーの両方が、TS-DNA上のDNA鎖置換プライマーのハイブリダイゼーションのた めの一本鎖部位の濃度と比較して非常に大過剰な場合、成し遂げられる。例えば 、二次DNA鎖置換プライマーは、TS-DNA、TS-DNA-3、TS-DNA-5などの一本鎖二次D NA鎖置換プライマー相補的部分の濃度と比較して過剰であることが好ましい。三 次DNA鎖置換プライマーの場合において、三次DNA鎖置換プライマーは、TS-DNA-2 、 TS-DNA-4、TS-DNA-6などの一本鎖三次DNA鎖置換プライマー相補的部分の濃度と 比較して過剰であることが好ましい。そのような過剰物は一般的に、増幅した相 補的TS-DNAがハイブリダイズし得る前に、TS-DNA中でその相補物とハイブリダイ ズするプライマーとなる。プライマー濃度の最適化は、ハイブリダイゼーション キネティクスの解析によって助けられ得る(YoungおよびAnderson)。鎖置換カス ケード増幅において、二次および三次DNA鎖置換プライマーの両方の濃度は一般 的に、500nMから5000nMであることが好ましく、そして最も好ましくは、700nMか ら1000nMである。 二次DNA鎖置換プライマーの場合と同様に、DNAポリメラーゼの濃度が十分高い 場合、ポリメラーゼは、DNA合成をハイブリダイズした三次DNA鎖置換プライマー 上の利用可能な各３’末端で開始し、そしてこれらの伸長TS-DNA-3分子は、TS-D NA-2によるあらゆるハイブリダイゼーションをブロックする。三次DNA鎖置換プ ライマーが伸長して、TS-DNA-3を形成する場合、DNAポリメラーゼは、次のハイ ブリダイズした三次DNA鎖置換プライマー分子の５’末端に達し、そしてその５ ’末端を置換する。この様式において、伸長DNAポリメラーゼの縦列は、TS-DNA- 2鋳型上で形成される。反応が続く限り、新しいローリングサークル複製プライ マーおよび新しいDNAポリメラーゼが、TS-DNA-2の伸長末端で、TS-DNA-2に添加 される。このハイブリダイゼーション／複製／鎖置換サイクルは、伸長TS-DNA-3 上の二次DNA鎖置換プライマーのハイブリダイゼーションと共に繰り返される。T S-DNA生成のカスケード、および溶液中への鎖置換によるそれらの遊離が、図13 に図示されている。 一般的に、鎖置換カスケード増幅は、RCAと同時にまたはRCAの後に、二次DNA 鎖置換プライマーおよび三次DNA鎖置換プライマーとポリメラーゼ−ATC混合物と の混合、および縦列配列DNAと二次DNA鎖置換プライマーとの間のハイブリダイゼ ーションを促進する条件下でのポリメラーゼ−ATC混合物のインキュベート、縦 列配列DNAの複製（ここで、縦列配列DNAの複製が、二次縦列配列DNAの形成をも たらす）、二次縦列配列DNAと三次DNA鎖置換プライマーとの間のハイブリダイゼ ーション、ならびに二次縦列配列DNAの複製（ここで、二次縦列配列DNAの複製が 、三次縦列配列DNA(TS-DNA-3)の形成をもたらす）、によって行われ得る。 鎖置換カスケード増幅によって生じる増幅収率の例は、以下のように大まかに 評価され得る。１秒あたり53ヌクレオチドで35分間行なわれるローリングサーク ル反応は、90ヌクレオチドの増幅標的環の1236コピーを生成する。従って、TS-D NA-1は1236の縦列反復を含む。これらの1236の縦列反復が伸長するにつれて、二 次DNA鎖置換プライマーを用いたプライミングおよび合成は、遅延および誤った プライミング事象を考慮して、少なくとも800のTS-DNA-2分子を生成し得る。こ れらの新しい分子は、１〜799反復の範囲で直線状に分布した長さを有する。次 に、三次DNA鎖置換プライマーによるTS-DNA-2でのプライミング事象は、遅延お よび誤ったプライミング事象を考慮して、少なくとも500のTS-DNA-3分子を生成 し得、そしてこれらの新しい分子は、１〜499反復の範囲で直線状に分布する長 さを有する。次いで、二次DNA鎖置換プライマーによるTS-DNA-3上のプライミン グ事象は、遅延および誤ったプライミング事象を考慮して、少なくとも300のTS- DNA-4分子を生成し得、そしてこれらの新しい分子は１〜299反復の範囲で直線状 に分布する長さを有する。これらの４つの増幅レベルのみの産物として計算され た、保存的な全増幅収率は、元のOCPまたはATCの1.86×10¹⁰反復であると評価さ れる。従って、SDCAは、等温な35分間の反応で極めて高い増幅収率が可能である 。 二次DNA鎖置換はまた、連続して行われ得る。第１回目の二次DNA鎖置換の後に 、三次DNA鎖置換プライマーは、ポリメラーゼ−ATC混合物と混合され得、そして ポリメラーゼ−ATC混合物は、二次縦列配列DNAと三次DNA鎖置換プライマーとの 間のハイブリダイゼーションおよび二次縦列配列DNAの複製を促進する条件下で インキュベートされ得、ここで二次縦列配列DNAの複製は、三次縦列配列DNA(TS- DNA-3)を形成する。この回の鎖置換複製は、三次DNA鎖置換として言及され得る 。しかしながら、ローリングサークル複製後のすべての回の鎖置換複製はまた、 二次DNA鎖置換として集合的に言及され得る。 二次DNA鎖置換の改変された形態は、TS-DNAの増幅を生じ、反対鎖増幅(OSA)と して言及される。OSAは、TS-DNA-2へのハイブリダイズを妨害するローリングサ ークル複製プライマーの特別な形態が使用されることを除いて、二次DNA鎖置換 と同じである。これは、多くの方法で成し遂げられ得る。例えば、ローリングサ ークル複製プライマーは、ローリングサークル複製プライマーを二次DNA鎖置換 の前に除くことが可能なその非相補的部分と結合したアフィニティータグを有し 得る。あるいは、残存ローリングサークル複製プライマーは、ローリングサーク ル複製の開始後に、弱め(cripple)られ得る。OSAの使用のためのローリングサー クル複製プライマーの１つの好ましい形態は、完全な塩基対ヌクレオチドのステ ムを含むヘアピンを形成するように設計される。そのステムは、５〜12塩基対を 含み得、最も好ましくは、６〜９塩基対である。そのようなヘアピン形成ローリ ングサークル複製プライマーは、低温(40℃より低い)で弱いプライマーである。 なぜなら、ヘアピン構造により、相補配列へのハイブリダイズが妨げられるから である。ステムは、プライマーのOCPまたはATCへのハイブリダイゼーションを妨 害するために、十分な数のヌクレオチドを、ローリングサークル複製プライマー の相補部位に含むべきである。一般的に、ステムは、ローリングサークル複製プ ライマーの相補部分の５〜24ヌクレオチドを含むことが好ましく、そして最も好 ましくは、６〜18ヌクレオチドである。ステムの半分にローリングサークル複製 プライマーの相補部分のヌクレオチドを含み、そしてもう半分のステムにローリ ングサークル複製プライマーの非相補部位のヌクレオチドを含む、ローリングサ ークル複製プライマーが最も好ましい。そのような配列は、ヘアピン形成ローリ ングサークル複製プライマーを使用する場合、OCPまたはATCの自己相補領域に対 する必要性が除かれる。 ローリングサークル複製反応が開始されると、二次DNA鎖置換プライマーおよ びローリングサークル複製プライマーは反応混合物へ添加され、そしてこの溶液 は、ローリングサークル複製プライマーのヘアピン構造を壊すのに十分な、しか し依然として、増幅標的環のプライマー相補部分にハイブリダイズできる温度（ 典型的には、50℃より高い）で、短時間インキュベートされる。このインキュベ ーションは、ローリングサークル複製プライマーが、増幅標的環のプライマー相 補部分にハイブリダイズすることを可能にする。次いで、溶液をローリングサー クル複製のための適切な温度にし、そしてローリングサークルDNAポリメラーゼ を添加する。ローリングサークル反応が進行するにつれて、TS-DNAが生成され、 そしてTS-DNA長が伸長するにつれて、二次DNA鎖置換プライマーは、TS-DNA上で 複数の鎖置換反応を伴う迅速なDNA合成を開始する。これらの反応は、TS-DNA-2 （これはTS-DNAと相補的である。）を生成する。TS-DNA-2が、ローリングサーク ル複製プライマーに相補的な配列を含むが、一方、このプライマーは、この温度 でのそのヘアピン構造のため、その反応温度でハイブリダイズも効率的なプライ ミングもできない。このように、ローリングサークル複製プラーイマーによる更 なるプライミングがなく、そして生成される産物は、TS-DNAおよびTS-DNA-2のみ である。反応は、ローリングサークル増幅停止と同時に止まり、そしてTS-DNAは 完全に２本鎖になる。反応経過中、過剰な一本鎖TS-DNA-2が生成される。 OSAにおいて有用なローリングサークル複製プライマーの別の形態は、DNAとRN Aとのキメラである。この実施態様において、ローリングサークルプライマーは 、その３’末端にデオキシリボヌクレオチドを有し、プライマー残りの部分はリ ボヌクレオチドを有する。ローリングサークル複製プライマーは、５つまたは６ つのデオキシリボヌクレオチドをその３’末端に有することが好ましい。リボヌ クレオチドを有するローリングサークル複製プライマーの一部を作製することに よって、プライマーは、DNAにハイブリダイズする場合、RNAse Hによって選択的 に分解され得る。そのようなハイブリッドは、TS-DNA-2が合成されるようにOSA の間形成する。３’末端のデオキシリボヌクレオチドは、ローリングサークルDN Aポリメラーゼがローリングサークル複製を開始することを可能にする。次いで 、RNAse Hは、TS-DNA-2複製のプライミングを防ぐために、OSA反応物へ添加され 得る。 OSAによって生成される増幅収率の例は、大まかに以下のように評価され得る 。１秒間あたり53ヌクレオチドで45分間行われるローリングサークル反応は、90 ヌクレオチドの増幅標的環の縦列1590コピーを生成する。従って、TS-DNA-1は、 1590の縦列反復を含む。これらの1590縦列反復が伸長するにつれて、二次DNA鎖 置換プライマーを用いたプライミングおよび置換反応は、1400までのTS-DNA-2を 生成し、そして放出し、そしてそれらの新しい分子は、１〜1399反復の範囲で直 線的に分布する長さを有する。計算から、45分後、１本鎖TS-DNA-2は、TS-DNA量 を約700の因子分上回っていることが示された。OSAは、標的配列の逆相補物を含 む１本鎖DNAを生成するために有用である。全増幅は、100万倍のオーダーであり 得る。 二次DNA鎖置換が連結したOCPと共に使用される場合、連結していないOCPおよ びギャップオリゴヌクレオチドは、結合していないOCPおよびギャップオリゴヌ クレオチドと、TS-DNAへのハイブリダイゼーションのための二次DNA鎖置換プラ イマーとの間の競合を除くために、ローリングサークル複製の前に取り除かれ得 る。以下に記載のように、二次DNA鎖置換が、ギャップ充填LM-RCAと共に使用さ れる場合、例外がある。あるいは、二次DNA鎖置換プライマーの濃度を、TS-DNA へのハイブリダイゼーションのために結合していないOCPより優れて競合するよ うに、十分高くし得る。これは、二次DNA鎖置換を、連結していないOCPの除去な しで行うことを可能にする。 二次DNA鎖置換によって生成されたDNAは、TS-DNAでの使用のために記載された 、同じ標識、標識方法、および検出方法を用いて、標識および／または検出され 得る。これらの標識および方法の大部分は、一般的に核酸での使用に適合可能で ある。好ましいDNAの標識方法は、標識ヌクレオチドを合成の間に組み込むこと である。 ４．複数の連結サイクル いて、開環プローブ連結反応が、アニーリング温度(55℃)と融解温度(96℃)との 間で何回もサイクル(cycle)され得る。このサイクリングは、サンプル中に存在 する各標的配列に対する複数の連結を生じる。例えば、８サイクルの連結が連結 した環の数の約６倍の増加を提供し、そしてそれに近づける。好ましいサイクリ ングプロトコルは、Perkin Elmer 9600サーマルサイクラーで、96℃２秒間、55 ℃２秒間、そして60℃70秒間である。サイクル数が少ないままである場合、増幅 応答の直線性(linearity)は、解決するはずがない。 ８回の連結サイクル、二次蛍光タグ、そして配列(array)ハイブリダイゼーシ ョンを用いた予期される正味の増幅収率は、以下に示されるように計算され得る 。 連結サイクリング収率：６ OSA収率:1,000,000 蛍光タグ／環数：５ 20％配列ハイブリダイゼーション収率：0.2 正味の収率＝６×1,000,000×５×0.2＝6,000,000 100の標的分子×6,000,000＝６×10⁸の表面上に結合した蛍光 ５．RCA（RCT）後の転写 一旦、TS-DNAがRCAを用いて生成されると、TS-DNA中に包埋されたプロモータ ーからTS-DNAを転写することによりさらなる増幅が達成され得る。この組み合わ せられたプロセス（転写を伴うローリングサークル複製（RCT）、または連結媒 介性の、転写を伴うローリングサークル複製（LM-RCT）と呼ばれる）は、TS-DNA が作製されるOCPまたはACPが、そのスペーサー領域にプロモーター部分を有する ことを必要とする。次いで、プロモーター部分がOCPまたはATCの残りとともに増 幅され、TS-DNAの各縦列反復中に包埋されたプロモーター（図８）を生じる。転 写（ローリングサークル増幅のような）は、連続的に起こり得る（再開始を伴う ）プロセスであるので、複数の転写物は、TS-DNA中に存在する複数のプロモータ ーのそれぞれから産生され得る。RCTを、連結したOCP配列増幅の別のレベルに効 率的に付加する。 一般的に、RCTは、RCAを実施してポリメラーゼ-OCP混合物またはポリメラーゼ -ATC混合物内にTS-DNAを産生すること、次いでRNAポリメラゼととポリメラーゼ- OCP混合物またはポリメラーゼ-ATC混合物とを混合すること、転写混合物を得る こと、および転写混合物を縦列配列DNAの転写を促進する条件下でインキュベー トすることにより達成され得る。OCPまたはATCは、RCTが作用するためのそのス ペーサー領域中にRNAポリメラーゼのプロモーターの配列（プロモーター部分） を含まなければならない。転写工程は、一般的に、使用される特定のRNAポリメ ラーゼのインビトロ転写について確立された条件を用いて実施され得る。好まし い条件は実施例中に記載される。あるいは、転写は、ローリングサークル複製と 同時に行われ得る。これは、ローリングサークル複製のために混合物をインキュ ベートする前に、RNAポリメラーゼを、ポリメラーゼ-OCP混合物またはポリメラ ーゼ-ATC混合物と混合することにより達成される。ローリングサークル複製と転 写とを同時に生じるために、ローリングサークルDNAポリメラーゼおよびRNAポリ メラーゼは、同じ条件下で活性でなければならない。このような条件は、両方の ポリメラーゼの活性のバランスを保つためおよび／または最大にするために最適 化され得る。ポリメラーゼがそれらの最大活性に達する必要はなく、活性の間の バランスが好ましい。転写は、本明細書中に記載される任意のDNA複製操作（例 えば、RCA、LM-RCA、ネストされたLM-RCA、二次のDNA鎖置換、または鎖置換カス ケード増幅（strand displacement cascade amplification）の後に続き得る。 RCT中で生成された転写物は、TS-DNAを用いる使用について記載された同一の 標識、標識方法、および検出方法を用いて標識および／または検出され得る。こ れらの標識および方法のほとんどは、一般的に、核酸を伴う使用に適合性である 。RCT転写物を標識する好ましい方法は、転写の間に標識したヌクレオチド（最 も好ましくは、ビオチン標識したヌクレオチド）の取り込みにより転写物を直接 標識することである。 ６．ギャップ充填（filling）連結 標的配列にハイブリダイズしたOCPにより形成されるギャップスペースは、通 常、上記のような一つまたはそれ以上のギャップオリゴヌクレオチドにより占め られる。このようなギャップスペースはまた、連結操作の間にギャップ充填DNA ポリメラーゼによってもフィルインされ得る。あるいは、ギャップスペースは、 一つまたはそれ以上のギャップオリゴヌクレオチドにより部分的に架橋され、ギ ャップの残りはDNAポリメラーゼを用いて充填される。この改変された連結操作 は、本明細書中でギャップ充填連結と呼ばれ、そして連結操作の好ましい形態で ある。ギャップ充填連結の原理および手順は、一般的に、ギャップLCR中で実施 される充填および連結と類似である（Wiedmannら、PCR法および適用（Cold Spri ng Harbor Laboratory Press,Cold Spring Habor Laboratory，NY，1994）S51-S 64頁；Abravayaら、Nucleic Acids Res.,23(4):675-682(1995);欧州特許出願第E P0439182号(1991)）。LM-RCAの場合、ギャップ充填連結操作は通常の連結操作の 代わりである。ギャップ充填連結は、接近した関連標的配列間の識別の手段を提 供する。この一例を、実施例３に記載する。ギャップ充填連結は、異なるDNAポ リメラーゼ（本明細書中においてギャップ充填DNAポリメラーゼと呼ばれる）を 使用することにより達成され得る。適切なギャップ充填DNAポリメラーゼは、上 記である。あるいは、一般的に、停止塩基（stop base）が使用される場合、DNA ポリメラーゼは、ギャップを充填するために使用され得る。LCRのギャップ充填 操作における停止塩基の使用は、欧州特許出願第EP0439182号に記載されている 。ギャップおよび結合される隣接プローブの末端の設計の原理は、EP0439182に 記載されるように、一般的に、本明細書中で記載されるギャップスペースおよび 標的プローブ部分の末端の設計に適用可能である。 ローリングサークル複製を用いてギャップ充填DNAポリメラーゼの干渉を妨げ るために、ギャップ充填DNAポリメラーゼは、ローリングサークル複製を実施す る前に、抽出または中和抗体を用いる不活性化により除去され得る。このような 不活化は、PCR前のTaq DNAポリメラーゼのブロックする抗体の使用と類似する（ Kelloggら、Biotechniques 16(6):1134-1137(1994)）。 ギャップ充填連結もまた好ましい。なぜなら、上記のような鎖置換カスケード 増幅（SDCA）に類似の指数関数的なOCP配列の増幅と適合性が高いからである。 ローリングサークル複製の間にTS-DNAが形成される場合、反応物中に存在する連 結されていないOCP分子はTS-DNAとハイブリダイズし、あらゆるOCP反復間にギャ ップスペースを残す。ハイブリダイズしたOCP分子は、二次DNA合成のプライマー として作用する。 一般的に、ギャップ充填LM-RCAは、LM-RCA反応において、(1)OCPの開環プロー ブの左側標的プローブ部分および開環プローブの右側標的プローブ部分のいずれ もが標的配列の中心領域（central region）に相補的ではない場合、5'領域と3' 領域との間に配置された中心領域を有する標的配列を使用すること、および(2) ギャップ充填DNAポリメラーゼをOCP-標的サンプル混合物と混合することにより 実施され得る。 ７．組換え多色コーディングを伴う連結媒介性ローリングサークル増幅 多様な検出を含むローリングサークル増幅の好ましい形態は、組換え多色コー ディングを伴う連結媒介性ローリングサークル増幅（LM-RCA-CMC）であり、これ は、上記のLM-RCAとCMCとの両方の組み合わせである。LM-RCA-CMCにおいては、 開環プローブおよび対応するギャップオリゴヌクレオチドが、多数の異なる標的 配列の検出のために設計されている。試験されるDNAサンプルが、上記のように 固体サンプルの中に組み込まれる。固体基体は、好ましくはガラスのスライドで あり、そして好ましくは、固体サンプルはドット内に配置された256個までの 個々の標的またはアッセイサンプルに組み込まれる。さらに多数の個体サンプル を試験するため、または検出される異なる標的配列の数を増加させるためのいず れかのために、複数の固体サンプルが使用され得る。後者の場合、各固体サンプ ルはサンプルドットの同一の一セットを有し、そしてLM-RCAは、各固体サンプル について異なるセットの開環プローブおよびギャップオリゴヌクレオチド（プロ ーブセットと総称される）を用いて行われる。これは、単一のアッセイにおいて 、大量の個体および標的配列をアッセイすることを可能にする。６個までの異な る標識を使用することにより、組合わせ多色コーディングを、単一の固体サンプ ル上で63個までの異なる標的を検出することを可能にする。複数の固体の基体を 使用し、そして各固体の基体についてOCPおよびギャップオリゴヌクレオチドの 別のセットを用いてLM-RCAを行う場合、同一の標識が各固体サンプルとともに使 用され得る（しかし、各セットのOCP間の差異は異なる検出プローブの使用を必 要とし得る）。例えば、10個のレプリカスライド（それぞれ256個の標的サンプ ルドットを有する）が、OCPおよびギャップオリゴヌクレオチドの10個の異なる セットを使用するLM-RCAに供され得る。ここで、各セットは63個の標的の組換え 多色コーディングのために設計される。これは、630個の異なる標的配列の検出 についてのアッセイを生じる。二つまたはそれ以上の異なる標的配列が標的また はアッセイサンプルのDNA中に接近して配置されている場合（例えば、同一の遺 伝子の複数の接近して配置された変異が標的である場合）、接近して配置された 標的配列の各々のためのOCPおよびギャップオリゴヌクレオチドが、異なるプロ ーブセット内に置かれることが好ましい。この目的のために、標識配列が、標的 またはアッセイサンプル中のDNA分子上に相互に20ヌクレオチド以内に接近して 配置されていることが考慮される。同一の遺伝子内の複数の標識が、異なるプロ ーブセットで検出されることは必要でない。先に規定されるように、接近して配 置されている標的配列が別々にプローブされることが単に好ましい。 ローリングサークル複製の後に、プローブ検出の反応混液が添加される（ここ で、反応混液は、各OCPに特異的な色素の組み合わせを含む）。組合わせ多色コ ーディングにおける使用のためのこのような検出プローブの設計および組合わせ は、先に記載されている。OCPが、組み合わせによりコードされる検出タグを有 して設計され、別々に標識された検出プローブの単一のセットの使用を可能にす ることが好ましい。折り畳み検出プローブ（collapsing detection probe）が使 用されることもまた好ましい。上記のように、折り畳みプローブは、二つの相補 的な部分を含む。これは、各検出プローブがTS-DNA中の二つの検出タグにハイブ リダイズすることを可能にする。この方法において、検出プローブは、TS-DNAの 異なる部分間で架橋を形成する。TS-DNAにハイブリダイズする多数の折り畳み検 出プローブの組合わせられた作用は、架橋されたTS-DNAの折り畳まれたネットワ ークを形成する。折り畳まれたTS-DNAは、遊離の伸長されたTS-DNAよりもかなり 少量の容積を占め、そして検出プローブ上に存在するどのような検出標識をも含 む。この結果は、各TS-DNAについて緻密であり、そして別々に検出可能なシグナ ルである。折り畳みの際に、プローブ結合は、各プローブ配列に基づいてプライ オリー（priory）に設計された独特の色の組み合わせを捕捉する。 先に議論したように、ローリングサークル増幅が操作され、異なるOCPについ て異なる長さのTS-DNAが産生され得る。このような生成物は、それらが生成する 検出シグナルのサイズに基づいて簡単に識別され得る。従って、同一のセットの 検出プローブが、生成されたTS-DNAの二つの異なるセットを識別するために使用 され得た。このスキームにおいて、二つの異なるTS-DNA（各々のサイズのクラス が異なるが、同一のカラーコードを充てられている）は、ハイブリダイズした検 出プローブにより産生されるシグナルのサイズにより識別された。この方法にお いて、126個の異なる標的の全てが、63個の組み合わせを有するコードを使用し て単一の固体サンプル上で識別され得る。なぜなら、シグナルは二つの特色のあ る低い振幅および高い振幅を生じるからである。従ってこの方法は、例えば、腫 瘍遺伝子変異の検出のための63個のプローブの低い振幅シグナルのセットおよび 腫瘍サプレッサーp53変異の検出のための63個のプローブの高い振幅シグナルの セットを使用し得た。 ８．レポーター結合剤単分子ローリング増幅 レポーター結合剤単分子ローリング増幅（RBAURA）はRCAの１つの形態であり 、ここでレポーター結合剤は増幅標的サークルの増幅のためのローリングサーク ル複製プライマーを提供する。RBAURAにおいて、レポーター結合剤のオリゴヌク レ オチド部分は、ローリングサークル複製プライマーとして作用する。RBAURAは、 RCAが標的分子へのレポーター結合剤の会合に基づいて増幅されるシグナル（即 ち、TS-DNA）を産生することを可能にする。レポーター結合剤の一部分である特 異的なプライマー配列は、標的分子に対するレポーター結合剤の特異的な相互作 用（レポーター結合剤の親和性部分を介する）とRCAとの関係を提供する。RBAUR Aにおいて、一旦、レポーター結合剤が標的分子に会合すると、増幅標的サーク ルはレポーター結合剤のローリングサークル複製プライマー配列にハイブリダイ ズされ、RCAによるATCの増幅が続く。生じたTS-DNAは、レポーター結合剤のロー リングサークル複製プライマー配列の一端に組み込まれ、従って、TS-DNAを標的 分子の部位に固定する。RBAURAは、インサイチュ検出に好ましいRCA法である。 この目的のために、上記の折り畳み検出プローブ、ビオチン-抗体結合体、また はその両方を用いて、TS-DNAが折り畳まれることが好ましい。RBAURAは、任意の 標的分子を使用して行われ得る。好ましい標的分子は、これはTS-DNAおよび増幅 標的サークルのような増幅された核酸を含む拡散、抗原、ならびリガンドを含む 。このような標的分子の使用例を、図25A〜29Bに示す。下記のペプチド核酸プロ ーブ単分子ローリング複製（PNAPURA）および固定抗体単分子ローリング増幅（L AURA）はRBAURAの好ましい形態である。 (a)ペプチド核酸プローブ単分子ローリング増幅 PNAPURAにおいて、キメラPNA:DNA分子はレポーター結合プローブ（PNAレポー ター結合プローブと呼ばれる）として使用される。PNAレポーター結合剤のオリ ゴヌクレオチド部分は、ローリングサークル複製プライマーとして作用する。PN Aレポーター結合プローブの親和性部分は、目的の標的核酸配列にハイブリダイ ズするように設計されたペプチド核酸（好ましくは12〜20ヌクレオチド塩基長、 そしてさらに好ましくは15〜18塩基長）である。PNAPURAにおいて、PNAレポータ ー結合プローブは最初に、標的配列にハイブリダイズすることを可能にされる( 図25Aに示す)。一旦、PNAレポーター結合プローブが標的配列にハイブリダイズ されると、増幅標的サークルはPNAレポーター結合プローブのローリングサーク ル複製プライマー配列にハイブリダイズされ（図25Bに示す）、RCAによるATCの 増幅が続く。生じるTS-DNAは、PNAレポーター結合プローブのローリングサー クル複製プライマー配列をその一端に組み込み、従って、TS-DNAを標的分子の部 位に固定する。親和性部分の任意の形態を有するレポーター結合剤が、類似の様 式において使用され得る。 好ましくは、PNAPURAは、固体の基体を用いて、そしてCMCとの組み合わせで行 われる。この目的のために、試験されるべきDNAサンプルは、上記のような固体 サンプル中に組み込まれる。固体の基体は、好ましくはガラスのスライドであり 、そして好ましくは固体サンプルは、ドット内に配置された256個までの個々の 標的またはアッセイサンプルに組み込まれる。さらに多数の個々のサンプルを試 験するため、または検出される異なる標的配列の数を増加させるかのいずれかの ために、複数の固体サンプルが使用され得る。後者の場合において、各固体サン プルは同一のセットのサンプルドットを有し、そしてPNAPURAは、各固体サンプ ルについてPNAレポーター結合プローブおよび増幅標的サークル（プローブセッ トと総称される）の異なるセットを使用して行われる。これは、単一のアッセイ において、大量の個体および標的配列をアッセイすることを可能にする。６個ま での異なる標識を使用することにより、組換え多色コーディングは、単一の固体 サンプル上で63個までの異なる標的を検出することを可能にする。複数の固体の 基体を使用し、そして各固体の基体についてPNAレポーター結合プローブおよび 増幅標的サークルの異なるセットを用いてPNAPURAを行う場合、同一の標識が各 固体サンプルとともに使用され得る（しかし、各セットのATC間の差異は異なる 検出プローブの使用を必要とし得る）。例えば、10個のレプリカスライド（それ ぞれ256個の標的サンプルドットを有する）は、PNAレポーター結合プローブおよ び増幅標的サークルの10個の異なるセットを使用するPNAPURAに供され得る。こ こで、各セットは63個の標的の組換え多色コーディングのために設計される。こ れは、630個の異なる標的配列の検出のためのアッセイを生じる。二つまたはそ れ以上の異なる標的配列が標的またはアッセイサンプルのDNA中に接近して配置 されている場合（例えば、同一の遺伝子の複数の接近して配置されている変異が 標的である場合）、接近して配置された標的配列の各々のためのPNAレポーター 結合プローブが、異なるプローブセット内に置かれることが好ましい。この目的 のために、標的配列が、標的またはアッセイサンプル中のDNA分子上に相互に20 ヌ クレオチド以内に接近して配置されていることが考慮される。同一の遺伝子内の 複数の標的が、異なるプローブセットで検出されることは必要でない。先に規定 されるように、接近して配置されている標的配列が別々にプローブされることが 単に好ましい。 ローリングサークル複製の後に、プローブの反応混液が添加される。ここで、 反応混液は、各ATCに特異的な色素の組合わせを含む）。組み合わせ多色コーデ ィングにおける使用のためのこのような検出プローブの設計および組み合わせは 、上に記載されている。ATCが、組み合わせによりコードされる検出タグを有し て設計され、別々に標識された検出プローブの単一のセットの使用を可能にする ことが好ましい。折り畳み検出プローブが使用されることもまた好ましい。上記 のように、折り畳みプローブは、二つの相補的な部分を含む。これは、各検出プ ローブがTS-DNA内の二つの検出タグにハイブリダイズすることを可能にする。こ の方法において、検出プローブは、TS-DNAの異なる部分間で架橋を形成する。TS -DNAにハイブリダイズする多数の折り畳み検出プローブの組合わされた作用は、 架橋されたTS-DNAの折り畳まれたネットワークを形成する。折り畳まれたTS-DNA は、遊離の伸長されたTS-DNAよりもかなり少量であり、そして検出プローブ上に 存在するどのような検出標識をも含む。この結果は、各TS-DNAについて緻密であ り、そして別々の検出可能なシグナルである。折り畳みの際に、プローブ結合は 、各プローブ配列に基づいてプライオリー（priory）に設計された独特の色の組 み合わせを捕捉する。 (b)固定抗体単分子ローリング増幅 LAURAにおいて、共有結合された抗体およびオリゴヌクレオチドは、レポータ ー結合剤として使用される。レポーター結合剤のオリゴヌクレオチド部分は、ロ ーリングサークル複製プライマーとして作用する。レポーター結合剤の親和性部 分は、目的の標的分子に特異的な抗体である。レポーター結合剤は、従来のイム ノアッセイにおけるような、標的分子に結合される（図29Aに示す）。従来のイ ムノアッセイとは異なり、この相互作用の検出は、ローリングサークル増幅によ り媒介される。結合および洗浄後、免疫複合体は、抗体を固定化するための適切 な固定反応（例えば、メタノール-酢酸）を用いて適切な場所に固定される。従 来のイムノアッセイにおけるように、結合していない抗体（この場合、レポータ ー結合剤の形態）を、洗浄することによって除去する。一旦、レポーター結合剤 が標的分子に結合されると、増幅標的サークルはレポーター結合剤のローリング サークル複製プライマー配列にハイブリダイズされ、RCAによるATCの増幅が続く 。生じたTS-DNAは、レポーター結合剤のローリングサークル複製プライマー配列 を一端に組み込み、従って、TS-DNAを標的分子部位に固定する。 この方法の改変において、レポーター結合剤のオリゴヌクレオチド部分は、DN Aの代わりにペプチド核酸であり得る。標的分子へのレポーター結合剤の固定後 、PNAは、PNAに相補的な部分を含むオリゴヌクレオチド（相補的部分と呼ばれる ）および一本鎖のままである部分（プライマー部分と呼ばれる）にハイブリダイ ズされ得る。次いで、プライマー部分は、上記のようなLAURAおいてローリング サークルプライマーとして使用され得る。 好ましくは、LAURAを、固体の基体を用いて、そしてCMCとの組み合わせにおい て行う。この目的のために、試験されるDNAサンプルが、上記のような固体サン プルに組み込まれる。固体の基体は、好ましくはガラスのスライドであり、そし て好ましくは、固体サンプルはドット内に配置された256個までの個々の標的ま たはアッセイサンプルに組み込まれる。さらに多数の個体のサンプルを試験する ため、または検出される異なる標的配列の数を増加させるためのいずれかのため に、複数の固体サンプルが使用され得る。後者の場合、各固体サンプルはサンプ ルドットの同一のセットを有し、そしてLAURAは、各固体サンプルについてPNAレ ポーター結合剤および増幅標的サークル（プローブセットと総称される）の異な るセットを使用して行われる。これは、単一のアッセイにおいて、多数の個体お よび標的配列をアッセイすることを可能にする。６個までの異なる標識を使用す ることにより、組合わせ多色コーディングは、単一の固体サンプル上で63個まで の異なる標的を検出することを可能にする。複数の固体の基体を使用し、そして 各固体の基体についてレポーター結合剤および増幅標的サークルの別々のセット を用いてLAURAを行う場合、同一の標識が各固体サンプルとともに使用され得る （しかし、各セットのATC間の差異は異なる検出プローブの使用を必要とし得る ）。例えば、10個のレプリカスライド（それぞれ256個の標的サンプルドット を有する）が、レポーター結合剤および増幅標的サークルの10個の異なるセット を使用するLAURAに供され得る（ここで、各セットは63個の標的の組合わせ多色 コーディングのために設計する）。これは、630個の異なる標的配列の検出につ いてのアッセイを生じる。二つまたはそれ以上の異なる標的配列が標的またはア ッセイサンプルのDNA中に接近して配置されている場合、上で議論されるように 、接近して配置された標的配列の各々のためのPNAレポーター結合プローブが、 異なるプローブセット内に置かれることが好ましい。 ローリングサークル複製の後に、プローブ検出の反応混液が添加される（ここ で、反応混液は、各ATCに特異的な色素の組合わせを含む）。組合わせ多色コー ディングの使用におけるこのような検出プローブの設計および組合わせは、先に 記載されている。ATCが、組み合わせによりコードされる検出タグを有して設計 され、別々に標識された検出プローブの単一のセットの使用を可能にすることが 好ましい。折り畳み検出プローブが使用されることもまた好ましい。上記のよう に、折り畳みプローブは、二つの相補的な部分を含む。これは、各検出プローブ がTS-DNA中の二つの検出タグにハイブリダイズすることを可能にする。この方法 において、検出プローブは、TS-DNAの異なる部分間で架橋を形成する。TS-DNAに ハイブリダイズする多数の折り畳み検出プローブの組合わされた作用は架橋され たTS-DNAの折り畳まれたネットワークを形成する。折り畳まれたTS-DNAは、遊離 の伸長されたTS-DNAよりもかなり少量であり、そして検出プローブ上に存在する どのような検出標識をも含む。この結果は、各TS-DNAについて緻密であり、そし て別々に検出可能なシグナルである。折り畳みの際に、プローブ結合は、各プロ ーブ配列に基づいてプライオリー（priory）に設計された独特の色の組み合わせ を捕捉する。 ９．プライマー伸長配列決定 増幅に続いて、増幅した配列のヌクレオチド配列を、従来の手段または増幅し た標的配列のプライマー伸長配列決定のいずれかにより決定し得る。プライマー 伸長配列決定はまた、本明細書中で鎖終結プライマー伸長配列決定(chain termi nating primer extension sequencing）と呼ばれる。鎖終結プライマー伸長配列 決定の好ましい形態（本明細書中で、一本鎖ヌクレオチドプライマー伸長配列 決定と呼ばれる）は、プライマーへの一本鎖終結ヌクレオチドの付加を含む（他 のヌクレオチドは付加しない）。プライマー伸長配列決定のこの形態は、プライ マーがハイブリダイズする領域にすぐ近くに隣接する核酸の識別（および確認） を可能にする。一本鎖ヌクレオチドプライマー伸長配列決定の二つの好ましい形 態が開示される。 (a)単分子セグメント増幅および配列決定 単分子セグメント増幅および配列決定（USA-SEQ）は、識別されたヌクレオチ ドの同一性に基づく特異的および同定可能なヌクレオチドの組み込みにより、増 幅された標的配列内の一本鎖ヌクレオチドの識別を含む。単分子セグメント増幅 および配列決定（USA-SEQ）において、個々の標的分子は、ローリングサークル 増幅により増幅する。増幅に続き、識別プライマーを、識別されるべき標的配列 内のすぐ近くの5'塩基にハイブリダイズし、そして一本鎖終結ヌクレオチドをプ ライマーの末端に付加する。識別された塩基の同一性は、どのヌクレオチドが加 えられたかを決定する。独特の検出サインを有するヌクレオチド（例えば、異な る蛍光標識）を使用することによって、識別された塩基の同一性が決定され得る 。識別プライマーは、予め形成された一本鎖の分子であり得るか、または、一つ またはそれ以上の識別プローブが増幅された標的配列へハイブリダイズすること 、およびそれらを互いに連結して識別プライマーを形成することにより、形成さ れ得る。 USA-SEQは標的配列の混合物における複数の異なる配列の存在を同定するため に有用である。特に、標的配列が増幅されるサンプルが標的配列の異なる形態（ 即ち、標的配列の異なる対立遺伝子）を含む場合、次いでUSA-SEQはそれらの存 在を同定し得るだけでなく、異なる形態の相対的な量の情報を提供し得る。各TS -DNA分子が単一の標的配列分子から増幅され、そして各TS-DNA分子は個々に検出 され得るために、これは可能である。 プライマー伸長配列決定は、一般的に、以下のように実施され得る。本明細書 中に開示される任意のローリングサークル増幅技術を用いる標的核酸配列の増幅 後、識別プライマーは増幅された核酸（例えば、TS-DNA）にハイブリダイズする 。増幅された核酸と識別プライマーとの混合物は、識別混合物と呼ばれる。識別 プ ライマーは、識別される（すなわち、配列決定される）べきTS-DNA中のヌクレオ チドに近接して（即ち、3'に）ハイブリダイズするように設計される。当然、標 的配列がTS-DNA分子内で多数回反復されているので、多数の識別プローブが単一 のTS-DNA分子にハイブリダイズする。次に、少なくとも２つの別々に標識された 鎖終結ヌクレオチドおよびDNAポリメラーゼが、識別混合物に添加される。これ は、識別プライマーの末端への単一のヌクレオチドの付加を生じ、その同一性は 識別されたヌクレオチド（即ち、識別プライマーの末端の後の最初の鋳型ヌクレ オチドである）の同一性に基づく。最終的に、各TS-DNA分子について組み込まれ たヌクレオチドの同一性が、蛍光顕微鏡によって決定される。この目的のために 、組み込まれたヌクレオチドの検出の前にTS-DNAが折り畳まれることが好ましい 。実施例９は、遺伝子サンプルにおける特定のヌクレオチドでホモ接合体または ヘテロ接合体を検出するためのUSA-SEQの使用の例を記載する。プライマー伸長 配列決定が、任意の増幅された核酸における一つまたはそれ以上の特異的なヌク レオチド（標的核酸由来のヌクレオチドおよびOCPまたはATCのスペーサー領域に おいて勝手に選択された配列として存在するヌクレオチドを含む）の同一性を決 定するために使用され得ることが、特に企図される。後者の場合において、プラ イマー伸長配列決定は、増幅された特異的なOCPまたはATCを識別または同定する ために使用され得る。他で記載したように、特異的な標的分子または核酸の存在 に基づいて増幅される、特異的なOCPおよびATC（OCPまたはATCの最初のプール中 に由来）の検出は、開示される増幅および検出方法について好ましい用途である 。 好ましい鎖終結ヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドである。他の公知の 鎖終結ヌクレオチド（例えば、3'位に置換基を有するヌクレオチド）もまた、使 用され得る。ジデオキシヌクレオチドの蛍光形態は、従来の鎖終結配列における 使用に関して公知であり、任意のそれらは開示されたプライマー伸長配列決定に 適切である。蛍光またはハプテン化した（haptenated）鎖終結ヌクレオチドの好 ましい形態は、フルオレセイン-N6-ddATP、ビオチン-N6-ddATP、フルオレセイン -12-ddATP、フルオレセイン-12-ddCTP、フルオレセイン-12-ddGTP、フルオレセ イン-12-ddUTP、リサミン-5-ddGTP、エオシン-6-ddCTP、クマリン-ddUTP、テト ラメチルモダミン(tetramethylmodamine)-6-ddUTP、テキサスレッド（Texas Re d）-5-ddATP（全てNEN Life Sciencesから入手可能）を含む。 (b)変性プローブプライマー伸長配列決定 変性プローブプライマー伸長配列決定は、増幅された標的配列にハイブリダイ ズした識別プライマーへの変性プローブの連続的な付加を含む。複数のプローブ の付加は、３末端の除去可能なブロッキング基の存在により妨げられる。変性プ ローブの付加の後、ブロッキング基を除去し、そしてさらに変性プローブが付加 され得るか、または最終的な操作の際に識別プローブの末端の次のヌクレオチド （即ち、最後に付加された変性プローブ）が、単一のヌクレオチドプライマー伸 長配列について記載されたように識別され、その同一性が決定される。除去可能 な3'末端ブロックの任意の形態を有する変性プローブが、プライマー伸長配列決 定手順において使用され得ることが企図される。除去可能なブロッキング基の好 ましい形態は、本明細書中に記載されるようなケージ構造である。各場合におい て、特定のブロッキング構造の除去のための特異的な条件を、適切に使用する。 増幅および変性プローブプライマー伸長配列決定の好ましい形態は、単分子セグ メント増幅およびCAGE配列決定（USA-CAGESEQ）である。 ブロックされた変性プローブ（即ち、変性プローブプライマー伸長配列決定で あり、そのCAGESEQは好ましい形態である）を使用するプライマー伸長配列決定 が、一般的に以下のように実施され得る。ひとつまたはそれ以上の識別プローブ および多数の変性プローブが、配列決定されるべきDNAサンプルと混合され、識 別混合物が形成される。配列決定されるべき核酸が、本明細書中で開示される任 意のローリングサークル複製技術を用いて増幅された核酸であることが好ましい 。この場合、配列決定されるべき核酸が、開環プローブのギャップ充填連結によ り形成される増幅された形態の増幅標的サークルを形成することがさらに好まし い。変性プローブプライマー伸長配列決定について、変性プローブの全てのセッ トが、上記のように使用されることがまた好ましい。識別プローブは標的核酸に ハイブリダイズするように設計され、その結果、配列決定されるべき標的核酸の 領域は識別プローブの3'末端の過ぎたところに位置される。識別混合物は、配列 決定されるべき核酸への識別プローブおよび変性プライマーのハイブリダイゼー ションを促進する条件下でインキュベートされる。変性プローブの一つのみが、 識別プ ローブに隣接する核酸配列と完全なハイブリッドを形成する。完全なハイブリッ ドの形成に好ましいインキュベーション条件が選択されることが好ましい。一旦 、識別および変性プローブがハイブリダイズされると、識別混合物は連結に供さ れる。これは、識別プローブおよび変性プライマーを結合する。最終的に、連結 された変性プローブの3'末端に存在するブロッキング基が除去される。感光性の ケージされたオリゴヌクレオチドを使用する場合、ケージ構造は適切な光への曝 露により除去される。これは、連結された変性プローブの末端を、別の変性プロ ーブの連結またはプライマー伸長のいずれかに有用にする。これらのハイブリダ イゼーション、連結およびブロック除去工程は、本明細書中で変性プローブ連結 のラウンドと呼ばれる。さらなる変性プローブ連結のラウンドが、ブロッキング 構造の除去に次いで実施され得る。一連のプライマー伸長配列決定アッセイが同 一のサンプルを用いて実施され、ここでプライマー伸長の前に異なる回数の変性 プローブ連結のラウンドが実施されることが好ましい。識別プローブのネストさ れたセットが、プライマー伸長配列決定アッセイのセットのようなセットにおい て使用されることもまた好ましい。このようなセットのアッセイの使用が実施例 10において示される。一旦、変性プローブ連結の全てのラウンドが実施されると （従って、識別プライマーが形成される）、識別混合物はプライマー伸長に供さ れる。これについて、少なくとも二つの別々に標識された鎖終結ヌクレオチドお よびDNAポリメラーゼが識別混合物に添加される。これは、識別プライマーの末 端への単一のヌクレオチドの付加を生じ、その同一性は識別されたヌクレオチド （即ち、識別プライマーの末端の後の最初の鋳型ヌクレオチド）の同一性に基づ く。最終的に、各標的核酸に対する各識別プライマーについて組み込まれたヌク レオチドの同一性が、蛍光顕微鏡により決定される。この目的のために、組み込 まれたヌクレオチドの検出の前に核酸が折り畳まれることが好ましい。 実施例10は、USA-CAGESEQの例を記載する（ここで、識別プライマーのネスト されたセットが、増幅された核酸の配列において変性プライマーの連続的な付加 により伸長される）。この実施例中に示されるプライマー伸長配列決定操作の原 理は、異なる数のサンプルおよび識別プローブ、異なる配置のサンプル、ならび にブロッキング構造の異なる形態の使用に同様に適用され得る。一連のアッセイ が、サンプルドットの配列上（実施例10に示す）、サンプルの配列（例えば、マ イクロタイターディッシュ）、または個々の反応容器において実施され得ること が意図される。特に、マルチウェルディッシュ（例えば、マイクロタイターディ ッシュ）の使用は、同一のディッシュ上で複数の別々の反応が容易に自動化され ることを可能にする。複数のウェルの使用はまた、各ウェル中でのサンプルおよ び識別プローブの選択において完全な自由を許容する。例えば、５個の別々に処 理されたスライド（実施例10のような）を使用してプライマー伸長配列決定を実 施するよりも、プライマー伸長配列決定サンプルおよび成分はウェル中に任意の 適切な順番で配置され得る。実施例10の成分を使用して、例えば、同一の核酸サ ンプルの５個のウェル配列の側の５個がウェルを使用され、ここで、所定のカラ ム中の各ウェルは同一の識別プローブを有する。ウェルの第１のカラムは第１の 識別プローブを有し、ウェルの第２のカラムは、第２の識別プローブを有するな どである。実施例10のように、各ケージ除去工程の前にマスクが下に移動され、 一つのさらなる列を覆う。この配列を使用して得られた生じた配列を、交差して 読まれ、次いで下方へ読まれる。 上記のように、TS-DNAまたはTS-RNAの特異的な部分は、プライマー伸長配列決 定操作を用いて配列決定され得る。同一のプライマー伸長配列決定手順が任意の 核酸分子上で実施され得ることがまた理解されるはずである。例えば、遺伝子DN A、PCR産物、ウイルスRNAまたはDNA、およびcDNAサンプルは全て、開示されたプ ライマー伸長配列決定手順を用いて配列決定され得る。この目的のために好まし いプライマー伸長配列決定手順は、CAGE配列決定である。この目的のために、識 別プローブおよび変性プローブが、全てUSA-CAGESEQに関連して先に記載される ように、（TS-DNAまたはTS-RNAよりもむしろ）目的の核酸サンプルにハイブリダ イズさせられ、連結され、鎖終結プライマー伸長に供される。 Ｄ．接近した関連標的配列間の識別 開環プローブ、ギャップオリゴヌクレオチド、およびギャップスペースは密接 に関連する標的配列（例えば、遺伝の対立遺伝子）を識別するように設計され得 る。密接に関連する標的配列が単一のDNAで異なる場合、開環プローブが、開環 プローブの一方の末端、またはギャップオリゴヌクレオチドの一方の末端に存在 するこのヌクレオチドの相補体を有して設計されることが好ましい。ギャップ充 填連結が使用される場合、ヌクレオチドの識別がギャップスペースの反対側に現 れることが好ましい。これは、別（すなわち、対立遺伝子）のギャップオリゴヌ クレオチドを必要とすることなく、連結されたOCPへの別の配列の組み込みを可 能にする。ギャップ充填連結が、部分的にギャップを充填するギャップオリゴヌ クレオチドとともに使用される場合、ヌクレオチドの識別が、ギャップオリゴヌ クレオチドにより充填されていないギャップスペースの部分の反対側に現れるこ とが好ましい。ハイブリッドの不安定性および酵素識別の組合された効果のため に、どちらかの終端でのミスマッチを伴うギャップオリゴヌクレオチドの連結は 非常に好ましくない。TS-DNAが生成される場合、それは正しい連結を導くギャッ プオリゴヌクレオチド配列のコピーを有する。ギャップオリゴヌクレオチドは、 対立遺伝子の不安定な塩基対を含むような特定の状況において関連する標的配列 間のより優れた識別を生じ得る。連結操作の標的依存性を増強する開環プローブ およびギャップオリゴヌクレオチドの特徴は、一般的に、連結鎖反応を伴う使用 のために開発されたこのような特徴に類似する。これらの特徴は、LM-RCAにおけ る使用のために開環プローブおよびギャップオリゴヌクレオチドに組み込まれ得 る。特に、欧州特許出願第EP0439182号は、LM-RCAにおける使用に適合され得るL CRにおいて標的依存性を増大するためのいくつかの特徴を記載する。欧州特許出 願EP0439182に記載されるようなギャップスペースにおける停止塩基の使用は、 ギャップ充填連結操作の標的識別を増大する好ましい形態である。 標的配列識別の好ましい形態が、開環プローブの二つのタイプを使用すること により達成され得る。これら二つのOCPは、図２に示されるようにわずかな改変 を有して基本的に設計される。一つの実施態様において、両方の標的配列に対し て同一である単一のギャップオリゴヌクレオチド（即ち、ギャップオリゴヌクレ オチドは両方の標的配列に相補的である）が使用される。好ましい実施態様にお いて、ギャップ充填連結操作が使用され得る（実施例３）。標的配列の識別は、 相互に排他的な連結事象または伸長連結事象により生じ、このために二つの開環 プローブの一方だけで十分である。好ましくは、識別ヌクレオチドは、各開環プ ローブの3'末端の最後から２番目のヌクレオチドに配置される。二つの開環プロ ーブもまた、別の検出プローブおよび／またはアドレスプローブと結合するよう に設計された二つの異なる検出タグを含む。二つの検出プローブの各々は、異な る検出標識を有する。開環プローブの両方は、同一のプライマー相補部分を有す る。従って、連結された開環プローブの両方が、単一のプライマーを用いて増幅 され得る。配列ハイブリダイゼーションの際に、各検出プローブは、別の標的配 列に対応する独特のシグナル（例えば、二つの別の蛍光色）を生じる。 Ｅ．RCAの最適化 １．アッセイバックグランド バックグランドシグナルの潜在的な供給源は、非標的指向化連結事象による環 状分子の形成である。バックグランドシグナルに対するこのような事象の寄与は 、以下のような５つの戦略を、単独でまたは組合せで使用して最小化され得る： ermophilus DNAリガーゼ（Barany(1991)）の使用は、連結が高い温度（50℃〜75 ℃）で起こるので、非標的指向化連結事象の頻度を最少化する。 （ｂ）インサイチュハイブリダイゼーションの場合において、標的配列への開 環プローブの連結は、大規模な洗浄を可能にする。この洗浄は、非配列指向連結 によって形成され得るいかなる環も除去するが、一方、標的上で連結された環は 位相幾何学的にトラップされるので除去することが不可能である（Nilssonら、( 1994)）。 （ｃ）一つ以上のギャップオリゴヌクレオチド、またはギャップオリゴヌクレ オチドとギャップ充填DNA合成との組合せの使用は、連結事象におけるさらなる 特異性を提供する。ギャップオリゴヌクレオチドの使用は、非標的指向化連結の 可能性を大いに減少する。アドレスプローブの相補的部分が、高度に弁別的な様 式で連結接合部を架橋する捕獲ハイブリダイゼーション工程に結合されるギャッ プオリゴヌクレオチド、またはギャップ充填連結操作の使用は、以下におよび図 ６に示すように特に好ましい。 ギャップオリゴヌクレオチドの相補体（11ヌクレオチド） アドレスプローブの相補的部分（ハイブリダイズされた15ヌクレオチド）中 括弧（{}）は、ギャップオリゴヌクレオチド（または、充填された場合ギャップ 領域）に相補的な配列を標識する。示されるTS-DNAは、配列番号10であり、そし て示されるアドレスプローブ配列は、配列番号4である。この系は、任意の長さ のギャップオリゴヌクレオチドを用いて使用され得る。標的配列にハイブリダイ ズされる開環プローブの末端間のギャップが、所望のアドレスプローブの長さよ り大きい場合、アドレスプローブは、ギャップ配列と開環プローブ配列間の接合 部のちようど一方に重なり合うように設計され得る。ギャップ領域の反対に識別 ヌクレオチドを配置するように開環プローブを設計することによって、単一のOC Pは、標的配列に依存する種々の配列を有する連結された開環プローブを生成す るためにギャップ充填LM-RCAにおいて使用され得る。 捕獲工程は、連結接合部位での特異的配列相互作用を介するアドレスプローブ への増幅されたDNAのハイブリダイゼーションを含み、これは、先に示されたよ うにギャップオリゴヌクレオチドの相補体を含む。Guoら、(1994)は、適切なス ペサーを使用してガラススライド上に共有結合した15-merオリゴヌクレオチドが 、増幅されたDNAをかなり高い効率で捕獲するために使用され得ることを示して きた。この系は、アドレスプローブを使用して増幅された核酸を捕獲することに よって、増幅された核酸（TS-DNAまたはTS-RNA）の検出に適用され得る。上記の 例において、正しい連結事象から生成されたLM-RCA増幅DNAのみが、固体状態検 出器上に捕獲される。 必要に応じて、固体表面に標的配列を含む核酸を結合するために捕獲プローブ （Syvanenら、Nucleic Acid Res.，14:5037(1986)）として当該分野において公 知である付加的な固定化試薬が使用され得る。適切な捕獲プローブはビオチン化 オリゴヌクレオチド（Langerら、(1981)）または末端ビオチン基を含む。固定化 は、連結反応前にまたは後に行われ得る。固定化は、非連結開環プローブならび に非特異的に連結された環の除去を可能にするのに作用する。 (d)分子内連結を促進する連結条件を使用すること。条件は、２つのOCPの縦列 直鎖状連結よりもOCPの環状連結がはるかに頻繁に生じる場合に、容易に見出さ れる。例えば、連結操作が行われる温度が、標的配列にハイブリダイズする時に 標的プローブ左側部分および標的プローブ右側部分の最も安定でない融解温度（ Tm）に近い場合、環状連結は促進される。連結が最も低いTmを有する標的プロー ブ部分のTmの近くで行われる場合、標的プローブ部分は結合／解離平衡にある。 平衡では、シス（すなわち、同じOCPの他の標的プローブ部分との）結合の可能 性は、トランス（すなわち、異なったOCPとの）結合の可能性よりはるかに高い 。可能な場合、連結操作に対して適切な温度に近い融解温度を有する標的プロー ブ部分が設計されることが好ましい。しかし、耐熱性リガーゼの使用は、広範な 連結温度の使用を可能にし、これは標的配列の選択においてより大きな自由度を 可能にする。 (e)ペプチド核酸は、DNAと非常に安定なハイブリッドを形成し、そしてPCR反 応の特異的なブロッカーとして使用されてきた（Orumら、Nucleic Acid Res.，2 1:5332-5336(1993)）。特殊なPNAプローブが、本明細書においてはPNAクランプ として呼ばれる、非正統に連結されている（すなわち、標的の非存在下で連結さ れている）OCPのローリングサークル増幅をブロックするために使用され得る。 連結の間に１つ以上のギャップオリゴヌクレオチドを使用することによって、ギ ャップ充填連結を使用することによって、またはギャップオリゴヌクレオチドと ギャップ充填連結との組合せを使用することによって、非正統に連結された環は ギャップ配列を欠失し、そしてそれらは、OCPの3'末端および5'末端の非正統な 連結から得られる配列に相補的なPNAクランプを用いてブロックされ得る。これ は、以下の図において示され、ここでPNAクランプllllrrrrが、接合部上に正確 に位置決めされる。 この図において、「Ｌ」および「ｌ」は、OCPの標的プローブの左側部分におけ るヌクレオチドおよびPNAクランプにおけるその相補体を示し、そして「Ｒ」お よび「ｒ」は、OCPの標的プローブの右側部分におけるヌクレオチドおよびPNAク ランプにおけるその相補体を示す。PNAクランプについての最も好ましい長さは 、８〜10ヌクレオチドである。PNAクランプは、標的プローブ部分のいずれかで ４〜５塩基対しか形成し得ないので、非連結OCPにハイブリダイズし得ず、そし てPNAクランプはまた、ギャップ配列が存在するので正確に連結されたOCPとハブ リダイズし得ない。しかし、PNAクランプは非正統に連結されたOCPとは強くハイ ブリダイズし、そしてDNAポリメラーゼはハイブリダイズされたPNA分子と置換し 得ないのでローリングサークル反応の進行をブロックする。これは、非正統に連 結されたOCPの増幅を妨げる。 ２．過剰な非連結OCPの除去 ファージT7の遺伝子６エキソヌクレアーゼは、TS-DNAまたはLM-RCT転写産物に 結合し、そして検出プローブへのハイブリダイゼーションを干渉する過剰な開環 プローブおよび過剰なギャップオリゴヌクレオチドの除去のための有用な手段を 提供する。このエキソヌクレアーゼは、２本鎖構造の5'末端を根幹としてDNAを 消化する。それは、PCR増幅後に一本鎖DNAの生成のために首尾よく使用されてき た（Hollowayら、Nucleic Acids Res．21:3905-3906(1993);Nikiforovら、PCR M ethods and Applications 3:285-291(1994)）。LM-RCAアッセイにおいて、この 酵素は、ローリングサークルDNAポリメラーゼと一緒に、連結後に添加され得る 。TS-DNAを分解から保護するために、ローリングサークル複製プライマーは、5' 末端に３つまたは４つのホスホロチオエート結合を含み得、そしてこの分子をエ キソヌクレアーゼに対して抵抗性にする（Nikiforovら、(1994)）。過剰な開環 プローブ分子はローリングサークルDNA産物と結合するので、エキソヌクレアー ゼ は、過剰な開環プローブ分子を分解する。このヌクレーアゼの使用は、捕獲プロ ーブの必要性ならびに過剰なプローブを除去するための洗浄の必要性を排除する 。非連結OCPおよびギャップオリゴヌクレオチドがTS-DNAと二本鎖転写鋳型を形 成するために必要とされるので、一般に、このようなヌクレーアゼ消化は、LM-R CTを行う場合、使用されるべきではない。このヌクレーアゼ消化は、ネスティン グされたLM-RCAが行われるべき場合、非連結OCPおよびギャップオリゴヌクレオ チドを除去する好ましい方法である。 実施例 実施例１：開環プローブの標的媒介性連結および連結開環プローブのローリング サークル複製。 １．開環プローブの連結 5'リン酸を有する直鎖状オリゴヌクレオチドは、相補的な標的配列の存在下に おいてリガーゼによって効率的に連結される。特に、図１に示すように標的配列 にハイブリダイズされた開環プローブ、および図２に示すように標的配列にハイ ブリダイズされたギャップオリゴヌクレオチドを有する開環プローブは容易に連 結される。このような連結の効率は、LM-RCAによって測定され得る。 以下は、開環プローブの標的依存性連結の実施例である： DNA試料（標的試料）を、95℃で３分間熱変性し、そして50μl当たり１単位の （ｂ）以下の5'リン酸化オリゴヌクレオチドの存在下、20mM Tris-HCl(pH8.2)、 25mM KCl、10mM MgCl₂、0.5mM NAD、0.05％ Triton X-100からなる緩衝液中の連 結条件（60℃で45分）下でインキュベートした： 開環プローブ（111ヌクレオチド）： ギャップオリゴヌクレオチド：5'-CCTT-3' これにより、標的配列への開環プローブおよびギャップオリゴヌクレオチドの ハイブリダイゼーション（標的試料に存在する場合）、およびハイブリダイズさ れた開環プローブおよびギャップオリゴヌクレオチドの連結を生じる。 ２．ローリングサークル複製の速度の測定 （ａ） 大きい鋳型上：7kb一本鎖ファージM13環 任意のDNAポリメラーゼによって媒介される一本鎖M13環上でのオリゴヌクレオ チドプライムローリングサークル複製の速度を、Blancoら、J．Biol．Chem．264 :8935-8940(1989)によって記載されるアッセイを使用することによって測定し得 る。φ29 DNAポリメラーゼによるプライム合成の効率は、一本鎖DNA結合タンパ ク質のGene-32タンパク質の存在下で約３倍に刺激される。 （ｂ） 小さい鋳型上：110ヌクレオチド連結開環プローブ 110塩基の一本鎖小環上のオリゴヌクレオチドプライムローリングサークル複 製の速度を、実施例２で一般に記載されるφ29 DNAポリメラーゼを使用して測定 した。５分のインキュベーション後、DNA産物の大きさは、約16キロベースであ る。この大きさは、１秒当たり53ヌクレオチドの重合速度に相当する。Fireおよ びXu，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:4641-4645(1995)によって記載されるよ うに、同様なアッセイを使用して他のDNAポリメラーゼを用いる合成速度を測定 し得、そして最適化し得る。110ヌクレオチドの一本鎖環を、FireおよびXuの34 ヌクレオチドに置換することが望ましい。 φ29 DNAポリメラーゼは、110ヌクレオチド環状鋳型上で速い速度の重合のφ2 9ローリングサークル反応を提供する。１秒当たり50ヌクレオチドの観察速度で 、35分の重合反応は約105,000塩基のDNA産物を産生する。これは、元の110塩基 鋳型の954倍の増幅をもたらす。FireおよびYu（1995）は、細菌性DNAポリメラー ゼによって触媒されるローリングサークル反応が、34ヌクレオチドのみの極小環 状鋳型上で起こり得ることを示している。FireおよびYuの結果に基づいて、ロー リングサークル複製を、90ヌクレオチド未満の環を使用して行い得る。 実施例２：LM-RCA、続いて転写（LM-RCT）を使用して変異オルニチントランスカ ルバミラーゼ（OTC）遺伝子の検出。 本実施例は、オルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子（Hataら、J．Biochem ．103:302-308(1988)）のエキソン９の114位置での変異型（ＧからＣへ）を含む ヒトDNAの検出を記載する。アッセイのためのヒトDNAを、標準的フェノール手順 を使用するバフィーコートからの抽出によって調製する。 １．２つのDNA試料（各々400ng）を、97℃で４分間熱変性し、そして２つの5'リ ン酸化オリゴヌクレオチド、開環プローブおよびギャップオリゴヌクレオチドの 存在下の連結条件でインキュベートする。 開環プローブ（95ヌクレオチド）： 変異遺伝子のためのギャップオリゴヌクレオチド（８ヌクレオチド） 野生型遺伝子のためのギャップオリゴヌクレオチド（８ヌクレオチド） T4DNAリガーゼ（New England Biolabs）は、10mM Tris-HCl(pH7.5)、0.20M NaCl 、10mM MgCl₂、2mM ATPからなる緩衝液中でμl当たり５単位の濃度で存在する。 開環プローブの濃度は80nMで、そしてギャップオリゴヌクレオチドの濃度は100n Mである。総容量は40μlである。連結を37℃で25分間行う。 ２．上記の各反応液から25μlを取り、50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl₂、1mM DTT、各々400μMのdTTP、dATP、dGTP、dCTPからなり、0.2μMの濃度で18塩基の ローリングサークル複製プライマー5'-GCTGAGACATGACGAGTC-3'（配列番号６）を 含む緩衝液と等量で混和する。φ29 DNAポリメラーゼ（50μl当たり160ng）を添 加し、そして反応混合物を30℃で30分間インキュベートする。 ３．上記溶液に補正緩衝液を添加し、以下の濃度の試薬を得る：35mM Tris-HCl( pH8.2)、2mMスペルミジン、18mM MgCl₂、5mM GMP、1mMのATP、CTP、GTP、333μM UTP、667μMビオチン-16-UTP（Boehringher-Mannheim）、0.03％ Tween-20、μ l当たりの２単位のT7 RNAポリメラーゼ、反応液を37℃で90分間インキュベート する。 ４．上記反応液に、10分の１容量の5M NaClを添加し、そして得られる溶液を等 容量のExpressHyb試薬（Clontech Laboratories，Palo Alto，CA）と混合する。 ハイブリダイゼーションを、増幅RNA溶液をカバースリップ下で、配列5'-TTTTTT TTTTTCCAACCTCCATCACTAGT-3'（配列番号７）を有する、２×10¹¹分子の共有結合 された29-merのオリゴヌクレオチド有する2.5mmドットを含むガラススライド（G uoら、(1994)）の表面と接触させることによって行う。この配列の最後の14ヌク レオチドは増幅された変異遺伝子RNAに相補的であり、そしてそれゆえ変異RNAは 特異的に結合する。スライド表面上の別の2.5mmドットは、配列5'-TTTTTTTTTTTC CAACCTCGATCACTAGT-3'（配列番号８）を有する、２×10¹¹分子の共有結合された 29-merのオリゴヌクレオチドを含む。この配列の最後の14ヌクレオチドは増幅さ れた野生型遺伝子RNAに相補的であり、そしてそれゆえ野生型RNAは特異的に結合 する。ガラススライドを、（Guoら、(1994)）に記載されたように２×SSPEで一 回洗浄し、次いで２×SSC（0.36Mクエン酸ナトリウム生理食塩水）で２回洗浄し 、そして次いで蛍光性アビジン（５μg/ml）と30℃で20分間２×SSC中でインキ ュベートする。スライドを、２×SSCで３回洗浄し、そしてスライド結合蛍光を 、Molecular Dynamics Fluorimagerを使用して530nmで映し出す。 実施例３：ギャップ充填LM-RCTを使用して変異オルニチントランスカルバミラー ゼ（OTC）遺伝子の検出 本実施例は、ギャップ充填LM-RCTを使用してオルニチントランスカルバミラー ゼ遺伝子（Hataら、(1988)）のエキソン９の114位置での変異型（ＧからＣへ） を含むヒトDNAの検出を記載する。アッセイのためのヒトDNAを、標準的フェノー ル手順を使用するバフィーコートからの抽出によって調製する。本実施例におい て、２つの異なった開環プローブを遺伝子の変異型および野生型を検出するため に使用する。ギャップオリゴヌクレオチドを全く使用しない。 １．２つのDNA試料（各々400ng）を、97℃で４分間熱変性し、そして以下の5'リ ン酸化開環プローブの一つの存在下でインキュベートする。 変異遺伝子のための開環プローブ（96ヌクレオチド） このプローブが標的配列にハイブリダイズする場合、開環プローブの末端間で７ ヌクレオチドのギャップ間隔がある。 野生型遺伝子のための開環プローブ（96ヌクレオチド） このプローブが標的配列にハイブリダイズする場合、開環プローブの末端間で７ ヌクレオチドのギャップ間隔がある。 OCP標的試料混合物の各々を、Abravayaら、(1995)によって記載される伸長− 連結混合物においてインキュベートする。反応液は、40μlの容量で、50mM Tris -HCl(pH7.8)、25mM MgCl₂、20mM酢酸カリウム、10μM NAD、80nM開環プローブ、 40μM dATP、40μM dGTP、１単位のThermus flavus DNAポリメラーゼ（3'-5'エ キソヌクレアーゼ活性を欠失する；MBR，Milwaukee，WI）、および4000単位のTh ermus thermophilus DNAリガーゼ（Abbott laboratoies）を含む。反応液を、サ ーマルサイクラーで85℃で60秒間、60℃で50秒間インキュベートする。サーマル サイクリングを決して行わない。これにより、標的配列への開環プローブのハイ ブリダイゼーション（標的配列が存在する場合）、T.flavus DNAポリメラーゼに よるギャップ間隔の充填、およびT.thermophilusリガーセによる連結を生じる。 上記の開環プローブにおける識別ヌクレオチドは、最後から２番目のヌクレオチ ドである。T.flavus DNAポリメラーゼは、T.thermophilusリガーゼの熱安定性に 適合する反応液において使用される。 ２．上記反応液の各々から25μlを取り、50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl₂、1 mM DTT、各々400μMのdTTP、dATP、dGTP、dCTPからなり、そして0.2μMの濃度で 18塩基のオリゴヌクレオチドプライマー5'-GCTGAGACATGACGAGTC-3'（配列番号６ ）を含む緩衝液と等量で混合する。φ29 DNAポリメラーゼ（50μl当たり160ng） を添加し、そして反応混合物を30℃で30分間インキュベートして、φ29 DNAポリ メラーゼによって触媒されるローリングサークル増幅を行う。Thermus flavus D NAポリメラーゼは、30℃ではほとんど活性を有しないので、ローリングサークル 複製に有意に干渉しない。所望ならば、PCRに先んじてTaqDNAポリメラーゼ をブロックするための抗体（Kelloggら、Biotechniques 16(6):1134-1137(1994) ）に機能上類似する中和抗体を添加することによって、ローリングサークル複製 に先んじて、Thermus flavus DNAポリメラーゼを失活し得る。 ３．上記の溶液の各々に補正緩衝液を添加し、以下の濃度の試薬を得る：35mM T ris-HCl(pH8.2)、２mMスペルミジン、18mM MgCl₂、5mM GMP、1mMのATP、CTP、GT P、333μM UTP、667μMビオチン-16-UTP（Boehringher-Mannheim）、0.03％ Twe en-20、１μl当たり２単位のT7 RNAポリメラーゼ、反応液を37℃で90分間インキ ュベートする。 ４．T7RNAポリメラーゼによって生成されたビオチン化RNAを含む各溶液に、10分 の１容量の5M NaClを添加し、そして得られた溶液を等容量のExpressHyb試薬（C lontech laboratories，Palo Alto，CA）と混合する。ハイブリダイゼーション を、増幅RNA溶液をカバースリップ下で、配列5'-TTTTTTTTTTTCCAAATTCTCCTCCATC A-3'（配列番号13）を有する、２×10¹¹分子の共有結合された29-merのアドレス プローブを有する2.5mmドットを含むガラススライド（Guoら、(1994)）の表面と 接触させることによって行う。この配列の最後の14ヌクレオチドは増幅された変 異遺伝子RNAに相補的であり、そしてそれゆえ変異RNAは特異的に結合する。スラ イド表面上の別の2.5mmドットは、配列5'-TTTTTTTTTTTCCAAATTCTCCTCGATCA-3'（ 配列番号14）を有する、２×10¹¹分子の共有結合された29-merのアドレスプロー ブを含む。この配列の最後の14ヌクレオチドは増幅された野生型遺伝子RNAに相 補的であり、そしてそれゆえ野生型RNAは特異的に結合する。ガラススライドを 、（Guoら、(1994)）に記載されるように２×SSPEで一回洗浄し、次いで２×SSC （0.36Mクエン酸ナトリウム生理食塩水）で２回洗浄し、そして次いで２×SSC中 で蛍光性アビジン（５μg/ml）と30℃で20分間インキュベートする。スライドを ２×SSCで３回洗浄し、そしてスライド結合蛍光を、Molecular Dynamics Fluori magerを使用して530nmで映し出す。 実施例４：オルニチントランスカルバミラーゼ（OTC）mRNAの逆転写、続いてギ ャップ充填LM-RCTを使用する変異cDNA検出 本実施例は、逆転写によって生成されたcDNAを使用してオルニチントランスカ ルバミラーゼ遺伝子（Hataら、(1988)）のエキソン９の114位置での変異型（Ｇ からＣへ）を含むヒトmRNAの検出を記載する。アッセイのためのRNAを肝生検か らTRIzol（Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD）抽出によって調製し た。 １．OTCエキソン９cDNAを以下のように生成する： 肝生検試料を、40単位のRNaseインヒビター（Boehringher Mannheim）を含む0.5 ml反応チューブ中で-80℃で保管し、そして全RNAを、TRIzol試薬（Life Technol ogies，Inc.，Gaithersburg，MD）を使用して凍結試料から抽出し、そして10μl 水に溶解する。４μlの25mM MgCl₂、２μlの400mM KCl、100mM Tris-HCl(pH8.3) 、８μlの2.5mM dNTP混合物（dATP、dGTP、dTTP、dCTP）、１μlのMuLV逆転写酵 素（50単位，Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD）、１μlのMuLV逆転 写酵素プライマー（5'-TGTCCACTTTCTGTTTTCTGCCTC-3'；配列番号15）、２μlの 水、および１μlのRNaseインヒビター（20単位）を含む19μl反応混合液を調製 する。反応混合液を、１μlのTrizol精製RNA溶液に添加し、そして42℃で20分間 インキュベートし、cDNAを生成した。 ２．工程１からの２つの20μlcDNA試料を98℃で４分間熱変性し、そして２つの5 'リン酸化プローブの存在下の連結条件下でインキュベートする： 開環プローブ（95ヌクレオチド）： 変異遺伝子のためのギャッププローブ（８ヌクレオチド） 野生型遺伝子のためのギャッププローブ（８ヌクレオチド）T4DNAリガーゼ（New England Biolabs）を、10mM Tris-HCl(pH7.5)、0.20M NaCl 、10mM MgCl₂、２mM ATPからなる緩衝液中で、１μl当たり５単位の濃度で添加 する。開環プローブの濃度は80nMで、そしてギャップオリゴヌクレオチドの濃度 は100nMである。総容量は40μlである。連結を37℃で25分間行う。 ３．上記の各反応液から25μlを取り、50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl₂、１m M DTT、各々200μMのdTTP、dATP、dGTP、dCTPからなり、0.2μMの濃度で18塩基 のローリングサークル複製プライマー5'-GCTGAGACATGACGAGTC-3'（配列番号６） を含む緩衝液と等量で混合する。φ29 DNAポリメラーゼ（50μl当たり160ng）を 添加し、そして反応混合液を30℃で30分間インキュベートする。 ４．上記の溶液に、補正緩衝液を添加し、以下の濃度の試薬を得る：35mM Tris- HCl(pH8.2)、２mMスペルミジン、18mM MgCl₂、5mM GMP、１mMのATP、CTP、GTP、 333μM UTP、667μMビオチン-16-UTP（Boehringher-Mannheim）、0.03％ Tween- 20、１μl当たり２単位のT7 RNAポリメラーゼ。反応液を37℃で90分間インキュ ベートする。 ５．T7RNAポリメラーゼによって生成されたビオチン化RNAを含む各溶液に、10分 の１量の5M NaClを添加し、そして得られた溶液を等容量のExpressHyb試薬（Clo ntech laboratories，Palo Alto,CA）と混合する。ハイブリダイゼーションを、 増幅RNA溶液をカバースリップ下で、配列5'-TTTTTTTTTTTTTTTTGATGGAGGAGAAT-3' （配列番号17）を有する、２×10¹¹分子の共有結合された29-merのアドレスプロ ーブを有する2.5mmドットを含むガラススライド（Guoら、(1994)）の表面と接触 させることによって行う。この配列の最後の14ヌクレオチドは増幅された変異遺 伝子RNAに相補的であり、そしてそれゆえ変異RNAは特異的に結合する。スライド 表面上の別の2.5mmドットは、配列5'-TTTTTTTTTTTTTTTTGATCGAGGAGAAT-3'（配列 番号９）を有する、２×10¹¹分子の共有結合された29-merのアドレスプローブを 含む。この配列の最後の14ヌクレオチドは増幅された野生型遺伝子RNAに相補的 であり、そしてそれゆえ野生型RNAは特異的に結合する。ガラススライドを、（G uoら、(1994)）に記載されるように２×SSPEで一回洗浄し、次いで２×SSC(0.36 Mクエン酸ナトリウム生理食塩水）で２回洗浄し、そして次いで２×SSC中で蛍光 性アビジン（５μg/ml）と30℃で20分間インキュベートする。スライドを、２× SSCで３回洗浄し、そしてスライド結合蛍光を、Molecular Dynamics Fluorimage rを使用して530nmで映し出す。 実施例５：ローリングサークル増幅に結合される複合イムノアッセイ 本実施例は、レポーター抗体を使用する異なった標的分子の複合検出の実施例 を記載する。検出されるシグナルを、レポーター抗体の標的配列部分のローリン グサークル増幅によって生成する。 １．３つの異なったモノクロナール抗体（それぞれは、異なった標的分子に対し て特異的である）は、独特の識別タグ（標的配列）として作用する３つの異なっ た任意のDＮＡ配列（Ａ、Ｂ、Ｃ）に結合する。本実施例において、３つの抗体 はマレイミド修飾され、そしてβ−ガラクトシダーゼ、hTSH、およびヒト絨毛性 ゴナドトロピン（hCG）に対して特異的である。Hendricksonら、(1995)によって 記載されたようにSATA化学を使用して抗体をアミノ化DNAオリゴヌクレオチドに 結合する。各オリゴヌクレオチドは、50オリゴヌクレオチドの長さである。得ら れたレポーター抗体を、レポーター抗体Ａ、Ｂ、Ｃと各々名付ける。 ２．標的分子に特異的な抗体（レポーター抗体ではない）を以下のようにマイク ロタイターディッシュ上に固定化する：重炭酸ナトリウム中（pH9）の３つの抗 体の各々の６μg/mlを含む50μl混合液をマイクロタイターディッシュのウェル に加え、一夜でインキュベートし、そしてPBS-BLA（10mMリン酸ナトリウム(pH7. 4)、150mM塩化ナトリウム、２％BSA、10％β−ラクトース、0.02％アジドナトリ ウム）で洗浄して、非吸着部位をブロックする。 ３．１つまたは３つの標的分子（hTSH、hCG、およびβ−ガラクトシダーゼ）の 組合せを含む溶液の連続的希釈液をウエルに添加する。一部のウェルを１つの標 的分子、２つの標的分子の混合物、または３つ全ての標的分子の混合物に曝す。 １時間のインキュベーション後、Hendricksonら、(1995)によって記載されたよ うにウェルをTBS/Tween洗浄緩衝液で３回洗浄する。 ４．３つのレポーター抗体の適切に希釈された混合物（A+B+C）の50μlを、マイ クロタイターディッシュの各ウェルに添加する。プレートを37℃で１時間インキ ュベートし、次いでTBS/Tween緩衝液で４回洗浄する。 ５．各ウェルに、３対の開環プローブおよびギャップオリゴヌクレオチドの混合 物を添加する。各対は、レポーター抗体の３つの標的配列部分の１つに特異的で ある。本実施例において、開環プローブは、汎用プライマー相補部分を含む49塩 基の同様のスペーサー領域を有し、そして各末端に種々の18ヌクレオチド標的プ ローブ部分を有する。開環プローブおよびギャップオリゴヌクレオチドの各コグ ネートの対を、レポーター抗体の標的配列部分における特異的標的配列（Ａ、Ｂ 、またはＣ）にハイブリダイズするように設計する。特に、開環プローブＡ’は 、8ヌクレオチドギャップオリゴヌクレオチドＡ’に相補的な８塩基によって分 けられるタグ配列Ａにおける２つの18塩基配列に相補的な左側および右側標的プ ローブ部分を有する。開環プローブおよびギャップオリゴヌクレオチド対Ｂ’お よびＣ’についても同様である。各開環プローブの濃度は、80nMであり、各ギャ ップオリゴヌクレオチドの濃度は120nMである。 ６．T4DNAリガーゼ（New England Biolabs）を、（10mM Tris-HCI(pH7.5)、40mM 酢酸カリウム、10mM MgCl₂、２mM ATP）からなる反応緩衝液中に、１μlあたり ５単位の濃度で各マイクロタイターウェルに添加する。各ウェルの総容量は40μ lである。連結を37℃で45分間行う。 ７．各マイクロタイターウェルに、dTTP、dATP、dGTP、dCTP（各400μM）、汎用 18塩基オリゴヌクレオチドプライマー5'-GCTGAGACATGACGACTC-3'（配列番号６） （0.2μMの最終濃度で）、およびφ29 DNAポリメラーゼ（50μlあたり160ngで） を含む20μlの補正溶液を添加する。 ８．インキュベーション後、各ウェルに補正緩衝液を添加し、以下の濃度の試薬 を得る：35mM Tris-HCl(pH8.2)、２mMスペルミジン、18mM MgCl₂、5mM GMP、１m MのATP、CTP、GTP、333μM UTP、667μMビオチン-16-UTP（Boehringher-Mannhei m)、0.03％ Tween-20、１μlあたりの２単位のT7 RNAポリメラーゼ。反応液を37 ℃で90分間インキュベートし、ビオチン化RNAを生成する。 ９．各ウェルに10分の１容量の5M NaClを添加し、そして得られた溶液を等容量 のExpressHyb試薬（Clontech laboratories，Palo Alto,CA）と混合する。ハイ ブリダイゼーションを、増幅されたRNAの混合物をカバースリップ下で、共有結 合された３つの異なった31-merのオリゴヌクレオチド（Ａ、Ｂ、Ｃ）の２×10¹¹ 分子の３つの分離ドットを含むガラススライド（Guoら、(1994)）の表面と接触 させることによって行う。各オリゴヌクレオチドの最後の16塩基が、タグ配列Ａ 、Ｂ、またはＣから生成される可能性のある増幅RNAの各々の、８塩基ギャップ 配列を中心とする特異的セグメント（４塩基＋８塩基＋４塩基）に相補的である 。ハイブリダイゼーションを、37℃で90分間行う。このガラススライドを、（Gu o ら、(1994)）に記載されたように２×SSPEで一回洗浄し、次いで２×SSC（0.36M クエン酸ナトリウム生理食塩水）で２回洗浄し、そして次いで２×SSC中で蛍光 性アビジン（５μg/ml）と30℃で20分間インキュベートする。スライドを２×SS Cで３回洗浄し、そしてタグ配列ＡまたはＢまたはＣのいずれかが増幅されたか を決定するために表面結合蛍光を、Molecular Dynamics Fluorimagerを使用して 530nmで映し出す。 実施例６：LM-RCAを使用するオルニチントランスカルボミラーゼ(OTC)および嚢 胞性線維症（CF）標的配列のインサイチュ検出 １．DNA試料を以下のように調製する： リンパ球の試料をPBS中で２回洗浄し、1500RPMで５分間の遠心によって細胞を 収集した。細胞を、10mM PIPES、pH7.6、100mM NaCl、0.3Mスクロース、３mM Mg Cl₂、および0.5％Triton X-100で再懸濁した。次いで、細胞を氷上で15分間イン キュベートし、1700RPMで５分間遠心分離し、２×10⁵核/mlで再懸濁した。1.0× 10⁵核の試料（0.5ml）を、Cytospin遠心機でスライド（500gで５分、設定＃85） 上に遠心分離した。次いで、スライドを、PBSで３分間２回リンスし、2M NaCl、 10mM PIPES pH6.8、10mM EDTA、0.5％ Triton X-100、0.05mMスペルミン、およ び0.125mMスペルミジン中で撹拌して６分間一回リンスした。次いでスライドを 、10×PBSで１分間、５×PBSで１分間、２×PBSで１分間、１×PBSで２分間、10 ％エタノールで１分間、30％エタノールで１分間、70％エタノールで１分間、そ して95％エタノールで１分間リンスした。最後に、スライドを風乾し、そして次 いで70℃での２時間ベーキングによって固定した。 ２．以下のDNA分子を使用した： OTC開環プローブ（OTC OCP、OTC標的配列に対する）： OTCギャップオリゴヌクレオチド： 嚢胞性繊維症開環プローブ（CF OCP、CF標的配列に対する） 嚢胞性繊維症ギャップオリゴヌクレオチド ３．試料スライド上のDNAを２×SSCで５分間スライドを洗浄し、変性緩衝液（２ ×SSC、70％ホルムアミド、pH7.2）中で１分間そして予め加熱した大きなCoplin 瓶中で71℃で45秒間インキュベートすることによって変性した。スライドを氷冷 70％エタノール中で３分間、90％エタノール中で２分間、そして100％エタノー ル中で３分間洗浄することによって直ぐに加熱を停止した。 ４．LM-RCAを以下のように行った： ３つの独立した反応液において、OCPおよびギャップオリゴヌクレオチドをハ イブリダイズし、そして試料スライド上で標的配列に連結した。 ａ．OTCおよびCF連結操作：以下の混合液の42μlを、２つのスライドの各々に 配置した。 ９μl 10×連結緩衝液（Ampligase） ５μl BSA、２mg/mlストック ９μl OTCギャップオリゴ（15μM） ［最終1500nM］ ９μl CFギャップオリゴ（10μM） ［最終1000nM］ ３μl OTC OCP、（６μMストック） ［最終＝200nMolar］ ３μl CF OCP、（６μMストック） ［最終＝200nMolar］ 15μl Ampligase（５U/μl） ［最終＝0.833U/μl］ 38μl H₂O 反応液を50℃で120分間インキュベートした。 ｂ．OTC連結操作：以下の混合液の42μlを、スライドに配置した。 ６μl 10×連結緩衝液（Ampligase） 3.5μl BSA、2mg/mlストック ６μl OTCギャップオリゴ（15μM） ［最終1500nM］ ２μl OT COCP、（６μMストック） ［最終＝200nMolar］ 10μl Ampligase（５U/μl） ［最終＝0.833U/μl］ 33μl H₂O 反応液を50℃で120分間インキュベートした。 ｃ．CF連結操作：以下の混合液の42μlを、スライドに配置した。 ６μl 10×連結緩衝液（Ampligase） 3.5μl BSA、２mg/mlストック ６μl CFギャップオリゴ（10μM） ［最終1000nM］ ２μl CFOCP、（６μMストック） ［最終＝200nMolar］ 10μl Ampligase（５U/μl） ［最終＝0.833U/μl］ 33μl H₂O 反応液を50℃で120分間インキュベートした。 全てのスライドを、20％ホルムアミドを有する２×SSC中で42℃で５分間を２ 回洗浄し、そしてホルムアミドを除去するために20mM Tris、pH7.5、0.075M NaC lで２分間洗浄し、そして50mM Tris、pH7.5、40mM KOAc、10mM MgCl₂、10mM DTT 、100μg/ml BSAで３分間洗浄した。 増幅操作を、24μlの以下の混合液を各スライド上に配置することによって行 った。 18.0μl H₂O ［総容量＝100μl/４スライド］ 20.0μl BSAを有する５×φ29緩衝液 BSAは200μg/ml 16.0μl dNTP（Ａ、Ｇ、およびＣ、各々2.5mM） 5.0μl dTTP（2.5mM） 15.0μl BUdR（2.5mM） 7.0μl ローリングサークル複製プライマー（10μM） 3.0μl 遺伝子32タンパク質（1.37μg/μl）（最終41μg/ml） 16.0μl φ29DNAポリメラーゼ（1:6希釈、16μl=768ng） 反応液を37℃の乾燥器で20分間インキュベートした。 次いで、全てのスライドを、20％ホルムアミドを有する２×SSC中で25℃で４ 分間を２回洗浄し、次いで２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20を用いて37℃で４ 分間２回洗浄した。 ５．増幅操作において生成したTS-DNAを折り畳み、そして以下のように検出した ： ２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20中の抗BUDR-マウスIgG（７μg/ml）の溶液 の50μlを各スライド上に配置し、そしてスライドを37℃で30分間インキュベー トした。次いでスライドを、37℃で２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20を用いて ５分間３回洗浄した。次に、FITC-アビジン（６μg/ml）の溶液の50μlを、各ス ライド上に配置し、そしてスライドを37℃で30分間インキュベートした。次いで 、スライドを２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20を用いて37℃で５分間３回洗浄 し、次いで室温で２×SSC、0.1μg/ml DAPI（50ml中に26μl）を用いて2.6分間 インキュベートした。次にスライドを、室温で１×SSC、0.01％Tweenを用いて10 分間洗浄し、次いで24μl抗退色薬（antifade）で覆った。最後にスライドを、D API核蛍光および分散蛍光シグナルについてCCDカメラを有する顕微鏡で調べた。 実施例７：LM-RCA-CMCを用いる複数の標的配列の複合検出 本実施例は、各々が５つの基本色を用いて31の異なる色の組み合わせを生じる ように設計された、31の異なるOCPおよびギャップオリゴヌクレオチド対を用い る複合検出を例示する。 １．サンプルを含むスライドを以下のように調製する： ポリ-Ｌ-リジンで覆った顕微鏡用スライドを調製し、そしてSchenaらによって 記載された方法を用いて、上記のようにアレイ機(arraying machine)を用いてDN Aをスポットする。サンプルDNAの各スポットの大きさは2.5mmである。DNAを、Sc henaらによって記載された方法を用いて上記のように変性する。 ２．31の異なるOCPおよび31の異なるギャップオリゴヌクレオチドを含む、ギャ ップオリゴヌクレオチドと開環プローブとの混合物を、設計しそして調製する。 OCPおよびギャップオリゴヌクレオチドを、各OCPおよびギャッププローブの対が 目的の特異的標的配列に相補的な配列を含んだ状態で、対として設計する。31の 各OCPのスペーサー領域は、５つの可能な検出タグ（1t、2t、3t、4t、および5t と呼ぶ）の独特の別の組み合わせを含む。組み合わせは、以下に示すスキームに 従って略号化する。対のセットを以下のように呼ぶ： ３.LM-RCAを以下のように行う： OCPとギャップオリゴヌクレオチドとを、50μlの以下の混合物と共にサンプル スライド上でハイブリダイズさせ、そして標的配列に連結する。 1.5μl 10×連結緩衝液（アンプリガーゼ） 8.8μl BSA、２mg/mlストック 15μl 31のギャップオリゴヌクレオチドの混合物（各々の最終濃度400nM） ５μl 31のOCPの混合物（各々の最終濃度＝100nモル） 25μl アンプリガーゼ（５U/μl） 82μl H₂O 反応物を52℃で60分間インキュベートする。 スライドを、２×SSCと20％ホルムアミドで、42℃で５分間２回洗浄し、20mM Tris（pH7.5）、0.075M NaClで２分間洗浄してホルムアミドを除去し、そして50 mM Tris（pH7.5）、40mM KOAc、10mM MgCl₂、10mM DTT、100μg/ml BSAで３分間 洗浄する。 増幅操作は、24μlの以下の混合物を各スライドに置くことにより行う。 18.0μl H₂O（総量＝各４スライドに付100μl） 20.0μl ５×φ29 BSA緩衝液 BSAは200μg/ml 16.0μl dNTP(Ａ，Ｇ，およびＣ、各2.5mM) 5.0μl dTTP(2.5mM) 15.0μl BUdR(2.5mM) 7.0μl ローリングサークル複製プライマー（10μM） 3.0μl 遺伝子32のタンパク質（1.37μg/ml）（最終濃度41μg/ml） 16.0μl φ29 DNAポリメラーゼ(１：６希釈、16μl＝768ng) 反応物を37℃のオーブンで15分間インキュベートする。 次いで、全てのスライドを、２×SSCと20％ホルムアミドで、25℃で４分間２ 回洗浄した。 ４．各々が異なる標識を有しそして各々が５つの検出タグの一つに相補的である 、５つの折り畳み検出プローブを、４×SSCの溶液中でスライド上でTS-DNAにハ イブリダイズさせる。検出プローブは以下のように検出タグに対応する： 検出プローブ 標識 検出タグ dp1 フルオレセイン 1t dp2 Cy3 2t dp3 Cy3.5 3t dp4 Cy5 4t dp5 Cy7 5t 次いで、全てのスライドを２×SSCと20％ホルムアミドで、25℃で４分間２回 洗浄し、そして次いで２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20で、37℃で４分間２回 洗浄した。 ５．増幅操作において生じたTS-DNAを、以下のようにさらに折り畳み、そして検 出する： ２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20中の50μlの抗BUDRマウスIgG(7μg/ml)の溶 液を各スライド上に置き、そしてスライドを37℃で30分間インキュベートする。 次いで、スライドを２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20で、37℃で５分間３回洗 浄する。次に、２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20中のAvidin DN(6μg/ml)溶液5 0μlを、各スライド上に置き、そしてスライドを37℃で30分間インキュベートす る。次いで、スライドを２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20で、37℃で５分間３ 回洗浄し、２×SSC、0.1％Tweenで室温で５分間洗浄し、そして次いで24μlの抗 退色剤で覆う。最後に、スライドを蛍光走査装置中で適切なフィルター（例えば 、Schenaらによって記載されるもの）を用いて走査する。画像分析ソフトウエア を用いて、蛍光点のスペクトルサインを計数しそして分析する。 実施例８：LM-RCA-CMCを用いる複数の標的配列の複合検出 本実施例は、ギャップオリゴヌクレオチドの対が各OCPに結合した、15の異な るOCPおよび30の異なるギャップオリゴヌクレオチドを用いる複合検出を例示す る。OCPおよびギャップオリゴヌクレオチドは、６つの基本標識色を使用して30 の異なる色の組み合わせを生じるように設計される。 １．サンプルを含むスライドを以下のように調製する： ポリ-Ｌ-リジンでコートした顕微鏡用スライドを調製し、そしてSchenaらによ って記載された方法を用いて、上記のようにアレイ機を用いでDNAをスポットす る。サンプルDNAの各スポットの大きさは2.5mmである。DNAを、Schenaらによっ て記載された方法を用いて上記のように変性する。 ２．15の異なるOCPおよび30の異なるギャップオリゴヌクレオチドを含む、ギャ ップオリゴヌクレオチドと開環プローブとの混合物を、設計しそして調製する。 OCPおよびギャップオリゴヌクレオチドを、各OCPおよびギャッププローブの対が 目的の特異的標的配列に相補的な配列を含んだ状態で、対として設計する。15の 各OCPのスペーサー領域は、４つの可能な検出タグ（1t、2t、3t、および4tと呼 ぶ）の独特の別の組み合わせを含む。さらなる検出タグを、OCPをギャップオリ ゴヌクレオチドに連結することにより生成する。これらは、キャップオリゴヌク レオチドの対のいずれが所定のOCPに連結するかに依存して、２つの異なる検出 タグを形成する。この組み合わせを、以下に示すスキームに従って略号化する。 対のセットを以下のように呼ぶ： ３．LM-RCAを以下のように行う： OCPとギャップオリゴヌクレオチドとを、50μlの以下の混合物と共にサンプル スライド上でハイブリダイズさせ、そして標的配列に連結する。 1.5μl 10×連結緩衝液（アンプリガーゼ） 8.8μl BSA、２mg/mlストック 15μl 30のギャップオリゴヌクレオチドの混合物（各々の最終濃度400nM） ５μl 15のOCPの混合物（各々の最終濃度＝100nモル） 25μl アンプリガーゼ（５U/μl） 82μl H₂O 反応物を、52℃で60分間インキュベートする。 スライドを、２×SSCと20％ホルムアミドで、42℃で５分間２回洗浄し、20mM Tris（pH7.5）、0.075M NaClで２分間洗浄してホルムアミドを除去し、そして50 mM Tris（pH7.5）、40mM KOAc、10mM MgCl₂、10mM DTT、100μg/ml BSAで３分間 洗浄する。 増幅操作は、24μlの以下の混合物を各スライドに置くことにより行う。 18.0μl H₂O（総量＝各４スライドに付100μl） 20.0μl ５×φ29 BSA緩衝液 BSAは200μg/ml 16.0μl dNTP(Ａ，Ｇ，およびＣ、各2.5mM) 5.0μl dTTP(2.5mM) 15.0μl BUdR(2.5mM) 7.0μl ローリングサークル複製プライマー（10μM） 3.0μl 遺伝子32のタンパク質（1.37μg/ml）（最終濃度41μg/ml） 16.0μl φ29 DNAポリメラーゼ(１：６希釈、16μl＝768ng) 反応物を37℃のオーブンで15分間インキュベートする。 次いで、全てのスライドを、２×SSCと20％ホルムアミドで、25℃で４分間２ 回洗浄した。 ４．４つの折り畳み検出プローブ（各々が異なる標識を有し、かつ各々が４つの 検出タグ（1t、2t、3t、および4t）の１つに相補的である）を、30の折り畳み検 出プローブ（各々が２つの標識のうちの１つを有し、かつ各々がOCPとギャップ オリゴヌクレオチドとの連結によって形成された検出タグの一つに相補的である ）と共に、４×SSCの溶液中、スライド上で、TS-DNAにハイブリダイズさせる。 検出プローブは以下のように検出タグに対応する： 次いで、全てのスライドを２×SSCと20％ホルムアミドで、25℃で４分間２回 洗浄し、そして次いで２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20で、37℃で４分間２回 洗浄した。 ５．増幅操作において生じたTS-DNAを、以下のようにさらに朽り畳み、そして検 出する： ２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20中の50μlの抗BUDRマウスIgG(7μg/ml)の溶 液を各スライド上に置き、そしてスライドを37℃で30分間インキュベートする。 次いで、スライドを２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20で、37℃で５分間３回洗 浄する。次に、２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20中のAvidin DN(6μg/ml)の溶 液50μlを、各スライド上に置き、そしてスライドを37℃で30分間インキュベー トする。次いでスライドを２×SSC、３％BSA、0.1％Tween-20で、37℃で５分間 ３回洗浄し、２×SSC、0.1％Tweenで室温で５分間洗浄し、そして次いで24μlの 抗退色剤で覆う。最後に、スライドを蛍光走査装置中で適切なフィルター（例え ば、Schenaらによって記載されるもの）を用いて走査する。画像分析ソフトウエ アを用いて、蛍光点のスペクトルサインを計数しそして分析する。 実施例９：単分子(unimolecular)セグメントの増幅および配列決定 本実施例は、単分子セグメントの増幅（すなわち、ローリングサークル増幅） 、それに続く一つのヌクレオチドプライマー伸長配列決定を例示する。本実施例 において、OCPを、既知の配列変異の領域においてギャップを残すために、標的 核 酸にハイブリダイズする。ギャップ充填連結を用いる増幅標的サークルの形成、 および増幅標的サークルのローリングサークル増幅の後、増幅されたDNAを、独 特に標識された鎖終結ヌクレオチドを用いる鎖終結プライマー伸長配列決定に供 する。取り込まれた標識の検出により、目的のヌクレオチドが同定される。 嚢胞性線維症膜透過レギュレーターG542X変異座とハイブリダイズするように 設計された開環プローブを、変異塩基を含む４塩基のギャップを残すために、設 計する。ギャップを、ギャップ充填連結操作でDNAポリメラーゼにより満たし、 それにより、標的嚢胞性線維症膜透過レギュレーターG542Xに存在する全ての配 列を取り込む。 ５’-リン酸化OCP(82塩基)の配列は以下である： このプローブの下線を引いた端は、以下に示されるような標的ヒトDNAとハイブ リダイズする（標的配列を逆に示す、３’〜５’）： 標的DNAは配列番号21である。左標的プローブは、配列番号201のヌクレオチド65 〜82である。右標的プローブは、配列番号20のヌクレオチド１〜21である。標的 DNAのギャップと逆方向の領域は、ｇ（野生型）またはｔ（変異型）のいずれか であるヌクレオチドを含む。識別された(interrogated)（すなわち、配列決定さ れた）のは、このヌクレオチドの位置である。 １．結合DNAサンプルを含む顕微鏡用スライドを、Schenaらによって記載された ように調製する。 ２．150nモルの開環プローブ、アンプリガーゼDNAリガーゼ、およびThermus fla vus DNAポリメラーゼの存在下で、ギャップ充填連結を、上記のように（一般に 、 Abravayaら,Nucleic Acid Research 23:675-682(1995)に記載された条件を用い て）、ギャップが満たされそして迅速に連結されるように、dATPおよびcCTPの存 在下で行う。反応を、22×40mmのカバーグラスで覆ったスライドを用いて（28μ lの容量で）行い、そして58℃で１時間インキュベートする。充填反応により、 塩基配列CCAAが野生型に、または配列CAAAが変異遺伝子に、それぞれ付加される 。 ３．スライドを、２×SSCと20％ホルムアミドで、42℃で５分間２回洗浄する。 ４．スライドを、20mM Tris（pH7.5）、0.075M NaClで２分間洗浄する。 ５．ローリングサークル複製を、30℃で15分間、以下の成分を含む緩衝液中でイ ンサイチュで行う：50mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM MgCl₂、１mM DTT、それぞれ 400μMのdCTP、dATP、およびdGTP、95μMのdTTP、380M BUDRトリホスフェート(S IGMA)、0.7μMの濃度の18ヌクレオチドのローリングサークル複製プライマー、A CGACGTGTGACCATGCA（配列番号22）、1000nモルの濃度のT4ファージ遺伝子32タン パク質、および200nMのφ29DNAポリメラーゼ。この反応で、遺伝子配列の忠実な 複写を含む約400コピーのTS-DNAが生じる。 ６．２×SSCと20％ホルムアミドで、25℃で５分間２回洗浄する。 ７．スライドを、識別ヌクレオチドに隣接したTS-DNA（以下に太字のＮで示す） とハイブリダイズするように設計された20ヌクレオチドの識別プライマー、TAGT GTGATTCCACCTTCTC(配列番号20のヌクレオチド64〜83)とインキュベートする： このTS-DNAは配列番号22である。スライドを以下の条件で37℃で10分間インキュ ベートする： 25μlの50mM Tris-HCl（pH7.5）、20mM MgCl₂、50mM NaCl、５mM DTT、50μg/ mlウシ血清アルブミン(Life Science，Inc.の分子生物学等級)、50μM蛍光ddATP 、蛍光ddCTP、蛍光ddGTP、および蛍光ddTTP中の４ユニットのSequenaseDNAポリ メラーゼ(Amersham-USB)。４つの蛍光ジデオキシヌクレオシドトリホスフェート は、それぞれ異なる放出スペクトルを有し、そして標準的なDNA配列決定キット( Applied Biosystems，Inc.)から得られ得る。 配列DNAポリメラーゼは、たった一つのddNTPを取り込み、取り込まれたddNTP は識別ヌクレオチドに相補的である。これを以下に例示するが、ここで、識別ヌ クレオチドがＴ（変異体型）である場合は、蛍光ddATPが取り込まれる： 伸長プライマーは、配列番号20のヌクレオチド64〜84である。識別ヌクレオチ ドがＧ（野生型）である場合は、蛍光ddCTPが取り込まれる。 ８．２×SSC中で25℃で５分間洗浄する。 ９．２×SSC、2.8％BSA、0.12％ Tween-20中で、37℃で４分間洗浄する。 10．50μl（カバーグラス下で）中で、２×SSC、2.8％BSA、および0.12％ Tween -20中で、５μg/mlのビオチン化抗BUDR-マウスIgG(Zymed Labs)を用いて、37℃ で30分間インキュベートする。 11．２×SSC、2.8％BSA、および0.12％ Tween-20中で、37℃で５分間３回洗浄す る。 12．50μl（カバーグラス下で）中で、２×SSC、2.8％BSA、および0.12％ Tween -20中で、５μg/mlのFITC-アビジンを用いて、37℃で30分間インキュベートする 。 13．２×SSC、2.8％BSA、および0.12％ Tween-20中で、37℃で５分間３回洗浄す る。 14．２×SSC、2.8％BSA、および0.12％ Tween-20中で、室温で５分間洗浄する。 15．スライドの像を、適切なフィルターセットを備えた顕微鏡-CCDカメラシステ ムを用いて捕獲する。各TS-DNA（各々が複数の伸長プライマーを有する）はスラ イドの小さな領域を占める。取り込まれた蛍光ヌクレオチドは、各TS-DNAについ て個々の蛍光点を生じる。蛍光放出色により、各蛍光点において特定の伸長位置 に取り込まれたヌクレオチドが規定される。従って、野生型および変異配列の混 合物を含むサンプルでは、各々の存在は、蛍光ddATP（変異型を示す）の蛍光放 出色を有する蛍光点および蛍光ddCTP（野生型を示す）の蛍光放出色を有する蛍 光点の存在により示される。点は、その折り畳みのために各TS-DNAによって占め られた小さい領域により、明確でありそして識別され得る。 異種および同種サンプルについて予想された結果を、図16に示す。大きい環は スライド上の標的サンプル点に相当する。小さい環は、プライマー伸長配列決定 に供されたサンプル中の標的核酸の位置でインサイチュで増幅された、個々のTS -DNA分子に相当する。実際のアッセイにおいて、一つのサンプル点中に個々に検 出可能な数百または数千のTS-DNA分子が存在し、そして折り畳んだTS-DNAによっ て占められた領域はかなり小さい。より少ないおよびより大きいTS-DNAの点を、 例示を明快にするために図16に示す。取り込まれたヌクレオチドは、その蛍光ス ペクトルにより同定され、そしてTS-DNAにおいて識別された位置に存在するヌク レオチドに基づく。図16Aは、野生型配列（システインの取り込みにより示され る）について同種であるサンプルの例である。サンプル中の全ての細胞は（従っ てサンプル中の標的核酸のほとんどは）、サンプル中の全てのTS-DNA分子につい て取り込まれた同じヌクレオチドをもたらす同じ配列を有する。図16Bは、野生 型および変異体（システインおよびアデニンの取り込みをもたらす等数のTS-DBN A分子により示される）についての異種のサンプルの例である。サンプル中の全 ての細胞は（従ってサンプル中の標的核酸のほとんどは）、両方の配列（野生型 および変異型で）の一つのコピーを有し、これにより２つの異なるヌクレオチド の取り込みが生じる；それぞれサンプル中のTS-DNA分子の半分。図16Cは、同種 であるが体細胞変異を有する少数の細胞を含むサンプルの代表例である。サンプ ル中の細胞のほとんどは（従ってサンプル中の全ての標的核酸は）、同じ配列（ 野生型）、そしてごく少数の変異配列を有する。これは、ほとんどのTS-DNA分子 について一つのヌクレオチドの取り込み、および少数のTS-DNA分子について異な るヌクレオチドの取り込みをもたらす。所定のヌクレオチドが取り込まれている TS-DNA分子の数の比は、サンプル中の対応する標的核酸の比の正確な基準である 。体細胞変異のこのような感度の高い検出は、例えば、ほとんどが正常または感 染されていない細胞であるサンプル中の少数のガン細胞または少数のウイルス感 染細胞の検出に特に有用である。 実施例10：単分子セグメント増幅およびCAGE配列決定 本実施例は、単分子セグメント増幅（すなわち、ローリングサークル増幅）、 それに続くケージしたオリゴヌクレオチドを用いる縮重プローブプライマー伸長 配列決定を例示する。本実施例において、OCPを、既知の配列変化の領域にギャ ップを残すために、標的核酸にハイブリダイズさせる。ギャップ充填連結を用い る増幅標的環の形成、および増幅標的環のローリングサークル増幅後、識別プロ ーブを増幅されたDNAにハイブリダイズさせる。次いで、縮重プローブを識別プ ローブに連結することにより識別プライマーを形成する。次いで、独特に標識さ れた鎖終結ヌクレオチドを用いて、識別プライマーを、鎖終結プライマー伸長配 列決定において伸長する。本実施例は、縮重プローブの整列された固体状態サン プルのハイブリダイズされた識別プローブへの連続的な付加の使用を例示する。 取り込まれた標識の検出により、目的の領域においてヌクレオチド配列が同定さ れる。 開環プローブ(OCP.96)の５'-リン酸を有する96塩基を、GT反復多型座にハイブ リダイズするために設計する。プローブを、GT反復領域において標的DNAにハイ ブリダイズしたときにギャップを残すように設計する。ギャップ充填連結操作に おいてDNAポリメラーゼによってギャップを満たし、これにより全GT反復多型領 域を連結されたOCPに取り込む。 OCP(96塩基)の配列は以下の通りである： このプローブの下線を引いた端は、図17に示されるように標的DNAにハイブリダ イズする。図17において、ギャップスペースは、「充填配列」として示される。 図17Aは、OCPのCAの10反復を有する標的DNAへのハイブリダイゼーションを示す 。図17Bは、OCPの、CAの９反復を有する標的DNAへのハイブリダイゼーションを 示す。示されるように、USA-CAGESEQは、DNAの高度な反復領域においてヌクレオ チド配列を決定する有用かつ正確な方法である。 １．それぞれ変性DNAサンプルに結合した、それぞれ少なくとも一つの縦に配置 された５つのカラムを含む５枚の顕微鏡用スライドを、Schenaらによって記載さ れたように調製する。各スライドは、各カラムのサンプル点の数が５である限り 、１〜100の規則的に空間のあるDNAサンプルのカラムを含み得る。このスライド は、同一（または、少なくともDNAサンプルの同一の対を有する）でなければな らな い。結合DNAサンプルの配列のスライドの例を図18Aに示す。各カラムの５つのサ ンプル点は同一（すなわち、これらは同じDNAサンプル由来）である。サンプル 点の各カラムは、好ましくは異なるサンプルから作製される。 ２ａ．スライドを、50mM Tris-HCl（pH7.5）、0.3M NaCl、0.5mM EDTA、および1 50nM OCP.96オリゴ中で、48℃で１時間インキュベートして、OCPのハイブリダイ ゼーションを達成する。次いで、スライドを、50mM Tris-HCl（pH7.5）、100mM M KCl、および0.05％ Triton X-100中で２分間洗浄する。 ２ｂ．アンプリガーゼDNAリガーゼおよびThermus flavus DNAポリメラーゼの存 在下で、上記の条件（一般にAbravayaらによって記載された条件を用いて）を用 いて、ギャップが満たされかつ迅速に連結されるように、dATP、dCTP、dGTP、お よびdTTPの存在下で、ギャップ充填連結を行う。22×44mmのカバーグラスで覆わ れたスライド（28μlの量）を用いて、54℃で45分間インキュベーションを行う 。 ３．スライドを２×SSCと20％ホルムアミドで、42℃で５分間２回洗浄する。 ４．スライドを20mM Tris（pH7.5）、0.075M NaClで２分間洗浄する。 ５．ローリングサークル増幅を、以下の成分を含む緩衝液中で、インサイチュで 30℃、15分間行う：50mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM MgCl₂、1mM DTT、それぞれ4 00μMのdCTP、dATP、dGTP、およびdTTP、95μMのdTTP、360μM BUDRトリホスフ ェート(SIGMA)、700nMの濃度の、18ヌクレオチドローリングサークル複製プライ マー、ACGACGTGTGACCATGCA（配列番号22）、1000nモルの濃度のT4ファージ遺伝 子32タンパク質、および200nMのφ29 DNAポリメラーゼ。この反応で、約400コピ ーの標的DNAの忠実なコピーを含むTS-DNAが生じる。 ６．２×SSCと20％ホルムアミドで、25℃で５分間２回洗浄する。 ７ａ．一つのスライド（スライド番号１）を、２×SSCおよび300nモルの最初の2 0ヌクレオチド識別プローブ（識別プローブ１）、TCTCGACATCTAACGATCGA（配列 番号25のヌクレオチド76〜95、これはTS-DNAとハイブリダイズする）中でインキ ュベートする。 ７ｂ．別のスライド（スライド番号２）を、２×SSCおよび300nモルの第２の20 ヌクレオチド識別プローブ（識別プローブ２）、CTCGACATCTAACGATCGAT（配列番 号25のヌクレオチド77〜96、これはTS-DNAとハイブリダイズする）中でインキュ ベートする。 ７ｃ．別のスライド（スライド番号３）を、２×SSCおよび300nモルの第３の20 ヌクレオチド識別プローブ（識別プローブ３）、TCGACATCTAACGATCGATC（配列番 号25のヌクレオチド78〜97、これはTS-DNAとハイブリダイズする）中でインキュ ベートする。 ７ｄ．別のスライド（スライド番号４）を、２×SSCおよび300nモルの第４の20 ヌクレオチド識別プローブ（識別プローブ４）、CGACATCTAACGATCGATCC（配列番 号25のヌクレオチド79〜98、これはTS-DNAとハイブリダイズする）中でインキュ ベートする。 ７ｅ．別のスライド（スライド番号５）を、２×SSCおよび300nモルの第５の20 ヌクレオチド識別プローブ（識別プローブ５）、GACATCTAACGATCGATCCT（配列番 号25のヌクレオチド80〜99、これはTS-DNAとハイブリダイズする）中でインキュ ベートする。 ５つの識別プローブは、上記のようにネストされた対を構成する。これらと増 幅されたTS-DNAとの関係を以下に示す： プローブ１は配列番号25のヌクレオチド76〜95であり、プローブ２は配列番号25 のヌクレオチド77〜96であり、プローブ３は配列番号25のヌクレオチド78〜97で あり、プローブ４は配列番号25のヌクレオチド79〜98であり、プローブ５は配列 番号25のヌクレオチド80〜99であり、そしてTS-DNAは（３'〜５'を示す）配列番 号19のヌクレオチド19〜60である。 ８．スライドを、50mM Tris-HCl（pH7.5）、150mM M KCl、および0.05％Triton X-100中で２分間洗浄する。 ９．次いで、スライドを、５回の連続した縮重プローブ連結に供する。各回は、 以下の工程を含む： (a)５枚のスライドを、以下の成分を含む連結反応混合物と共にインキュベー トする： (i)ペンタマー縮重プローブの全ての対（すなわち、1,024の可能なペンタマ ー配列の全てを示すオリゴヌクレオチドの混合物）（各縮重プローブは40nモル の濃度で）、ここで各縮重プローブは、５'リン酸および３'末端（すなわち、３ '末端の一ブロック）で修飾されたヌクレオチドを有する。本実施例において、 修飾ヌクレオチドは、以下の形態でケージしたヌクレオチドである： ２'-デオキシ-３'-Ｏ-（２-ニトロベンジル）アデノシン ２'-デオキシ-３'-Ｏ-（２-ニトロベンジル）グアノシン ２'-デオキシ-３'-Ｏ-（２-ニトロベンジル）チミジン ２'-デオキシ-３’-Ｏ-（２-ニトロベンジル）シトシン これらのヌクレオチドは、Metzkerら、Nucleic Acids Research 22:4259-4267(1 994)に記載されている。修飾塩基は３'水酸基を保護（すなわち、ブロック）し 、そして縮重プローブがDNAポリメラーゼ伸長またはDNA連結に関与するのを不可 能にする。 (ii)適切なDNAリガーゼ、好ましくはT4ファージDNAリガーゼ。 連結を、μl当たり８ユニットの濃度で、10mM Tris-HCl（pH7.5）、0.18M NaC l、12mM MgCl₂、2mM ATP、および10％ポリエチレングリコールからなる緩衝液中 で、T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs)を用いて行う。総量は25μlである。 連結は、32℃で40分間行う。 (b)プライマー伸長反応を、25μlで37℃で５分間、カバーグラスの下で、５ユ ニットのSequenaseDNAポリメラーゼ(Amersham-USB)、50mM Tris-HCl（pH7.5）、 20mM MgCl₂、50mM NaCl、５mM DTT、50μg/mlウシ血清アルブミン(Life Science s,Incの分子生物学等級)、50M ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTPの存在下で、行う。 この反応は、連結事象に関与できなかった全てのプライマーの３'末端をブロッ クする。スライドを、25℃で２×SSCで５分間洗浄して、連結されていない任意 の縮重プローブを除去する。 これらの工程の後に、全ての識別プローブを縮重プローブに連結する。縮重プ ローブ連結の第１回目において、全てのスライドで、不明瞭な「マスク」がDNA のサンプル点の第１の列を覆っている（図18Ｂを参照のこと）。従って、このマ スクは、各カラムの第１のサンプル点を覆う。スライドをUV光に４分間曝して、 列１（照射されない）を除く全てのサンプル列の全ての連結された縮重プローブ からケージ構造を除去する。 縮重プローブ連結の第２回目のために、工程(a)および(b)を繰り返す。縮重プ ローブは、第１の列のDNAサンプル点に連結した縮重プローブの３'末端にケージ 構造が残っているので、２列から５列のDNAサンプル点にのみ連結され得る。こ れらの工程の後に、２列から５列の識別プローブを２つの縮重プローブに連結す る。次いで、不明瞭なマスクが全てのスライドでDNAサンプル点の第１列および 第２列を覆う（図18Ｃを参照のこと）。従って、このマスクは、各カラムの第１ および第２のサンプル点を覆う。スライドをUV光に４分間曝して、列１および２ （照射されない）を除く全てのサンプル列の全ての連結された縮重プローブから ケージ構造を除去する。 縮重プローブ連結の第３回目のために、工程(a)および(b)を繰り返す。縮重プ ローブは、第１列および第２列のDNAサンプル点に連結した縮重プローブの３'末 端にケージ構造が残っているので、列３から５のDNAサンプル点にのみ連結され 得る。これらの工程の後に、列３から５の識別プローブを、３つの縮重プローブ に連結する。次いで、不明瞭なマスクが全てのスライドでDNAサンプル点の列１ 、２、および３を覆う（図18Ｄを参照のこと）。従って、このマスクは、各カラ ムの第１、第２、および第３のサンプル点を覆う。スライドをUV光に４分間曝し て、第４および第５のサンプル列の全ての連結された縮重プローブからケージ構 造を除去する。サンプル列１、２および３は照射されないので、ケージ構造は、 これらのサンプル列中の縮重プローブから除去されない。 縮重プローブ連結の第４回目のために、工程(a)および(b)を繰り返す。縮重プ ローブは、列１、２、および３のDNAサンプル点に連結した縮重プローブの３'末 端にケージ構造が残っているので、第４列および第５列のDNAサンプル点にのみ 連結され得る。これらの工程の後に、第４列および第５列の識別プローブを４つ の縮重プローブに連結する。次いで、不明瞭なマスクが全てのスライドでDNAサ ンプル点の列１、２、３、および４を覆う（図18Ｅを参照のこと）。従って、こ のマスクは、各カラムの第１、第２、第３、および第４のサンプル点を覆う。ス ライドをUV光に４分間曝して、第５のサンプル列中の全ての連結された縮重プロ ーブからケージ構造を除去する。サンプル列１、２、３および４は照射されない ので、ケージ構造は、これらのサンプル列中の縮重プローブから除去されない。 縮重プローブ連結の第５回目のために、工程(a)および(b)を繰り返す。縮重プ ローブは、列１、２、３、および４のDNAサンプル点に連結した縮重プローブの ３'末端にケージ構造が残っているので、第５列のDNAサンプル点にのみ連結され 得る。これらの工程の後に、第５列の識別プローブを５つの縮重プローブに連結 する。次いで、スライドを、マスクなしでUV光に４分間曝して、全てのサンプル 列の全ての連結された縮重プローブからケージ構造を除去する。これは、連結さ れたプローブの全て（これらはこの時点で、識別プライマーであると考えられる ）が、鎖終結プライマー伸長のための準備が整った状態のままにする。 図21Ａ、21Ｂ、23Ａ、および23Ｂは、上記の縮重プローブ連結の結果を表す。 縮重プローブの識別プローブへの連結により形成された識別プライマー（上、列 の標識に続くより短い配列）は、５つの各スライドの一つのカラムにおける５つ のサンプル点全てについて、TS-DNA（各識別プライマーの下のより長い配列）に ハイブリダイズしたことを示す。各スライドにおいて、成功した各列には一つの 付加的縮重プローブが加えられていた。このプローブは、縮重プローブ連結の各 回の間に、サンプル点の一つの付加的な列が首尾よく覆われたことの結果である 。識別プライマーの下線のない部分は、識別プローブを表す。識別プライマーの 下線部は、識別プローブの末端に連結した縮重プローブを表す。５枚のスライド の各セットで全ての識別プライマーを注意深く試験することによって、各末端が 、TS-DNAの異なるヌクレオチドに隣接することが示される。これにより、ヌクレ オチドの全長が別々に識別（すなわち、配列決定）されるのが可能になる。図21 Ａおよび21Ｂは、通常の標的配列（すなわち、CAの10反復を有する）での結果を 示す。図23Ａおよび23Ｂは、変異標的配列（すなわち、CAの９反復のみを有する ） での結果を示す。 10．次いで、スライドを、25μlの量中、カバーグラス下で、以下の存在下で37 ℃で５分間行われる、鎖終結プライマー伸長に供する：５ユニットのSequenase DNAポリメラーゼ(Amersham USB)、50mM Tris-Cl（pH7.5）、20mM MgCl₂、50mM N aCl、５mM DTT、50μg/mlウシ血清アルブミン（Life Sciences，Inc.の分子生物 学等級）、50μMの蛍光ddATP、50μMの蛍光ddCTP、50μMの蛍光ddGTP、および50 μMの蛍光ddTTP（各蛍光dNTPは、異なる放出スペクトルを伴うシグナルを生じ得 る（Applied Biosystems，Inc．配列決定キット））。この反応において、一つ の蛍光ヌクレオチドが各識別プライマーの末端に付加される。付加されたヌクレ オチドの同一性は、テンプレートヌクレオチド（識別プライマーに隣接したヌク レオチド）の同一性に基づく。 11．２×SSC中で25℃で５分間洗浄する。 12．２×SSC、2.8％BSA、0.12％ Tween-20中で、37℃で４分間洗浄する。 13．２×SSC、2.8％BSA、0.12％ Tween-20中で、５μg/mlのビオチン化抗BUDR- マウスIgG（Zymed Labs）を用いて、50μl（カバーグラス下で）中で37℃で30分 間インキュベートする。この反応は、スライド上でTS-DNA分子を小型の構造に折 り畳む。 14．２×SSC、2.8％BSA、0.12％ Tween-20中で、37℃で５分間、３回洗浄する。 15．２×SSC、2.8％BSA、0.12％ Tween-20中で、５μg/mlのFITC-アビジンを用 いて、50μl（カバーグラス下で）中で37℃で30分間インキュベートする。これ は各TS-DNA分子をフルオセインで標識する。 16．２×SSC、2.8％BSA、0.12％ Tween-20中で、37℃で５分間３回洗浄する。 17．２×SSC、0.01％ Tween-20中で、室温で５分間洗浄する。 18．各スライドの像を、適切なフィルターセットを備えた顕微鏡-CCDカメラシス テムを用いて捕獲する。各蛍光ヌクレオチドの蛍光放出色により、各蛍光点にお ける特定の伸長位置のヌクレオチドが定義される。各点は、一つのTN-DNAの分子 に対応する。図22Ａ、22Ｂ、24Ａ、および24Ｂは、鎖終結プライマー伸長の結果 を示す。この時点で、末端に付加された蛍光ヌクレオチド（太字）を有する識別 プライマーは、５枚の各スライドの一つのカラムにおける５つのサンプル点の全 てについて、TS-DNAにハイブリダイズすることを示す。各スライドにおいて、TS -DNAにおけるヌクレオチドのストレッチにおける異なるヌクレオチドを、鎖終結 蛍光ヌクレオチドの取り込みのためのテンプレートとして用いる。従って、この ストレッチにおける各ヌクレオチドが、別々に識別（すなわち、配列決定）され る。図22Ａおよび22Ｂは、通常の標的配列（すなわち、CAの10反復を有する）で の結果を示す。図24Ａおよび24Ｂは、変異標的配列（すなわち、CAの９反復のみ を有する）での結果を示す。 19．配列を、各関連するサンプル点で取り込まれたヌクレオチドを順番に読むこ とにより５枚のスライドの全てから得られた蛍光点のデータから、組み立てる。 図19および21は、５枚の各スライドの対応するカラムにおける各サンプル点につ いての取り込まれたヌクレオチドの概略を示す。図19は、通常の標的配列（すな わち、CAの10反復を有する）での結果を示す。図20は、変異標的配列（すなわち 、CAの９反復のみを有する）での結果を示す。ヌクレオチドを、最初は、各スラ イドからの所定のカラムの第１のサンプル点から順番（すなわち、スライド１の 列１のサンプル点、スライド２の列１のサンプル点、スライド３の列１のサンプ ル点、スライド４の列１のサンプル点、スライド５の列１のサンプル点）に読む 。次のヌクレオチドを、各スライドからのカラムにおける第２のサンプル点から 順番（すなわち、スライド１〜５の順番で列２における第２のサンプル点）に読 む。ヌクレオチドの解読を、同じ様式で順番に列３、４、および５のサンプル点 について続ける。サンプル点の関係は、この読む順番を導き、図22Ａ、22Ｂ、24 Ａ、および24Ｂにおいて識別されたヌクレオチドの関係を注意深く試験すること で見られ得る。図19に示すスライドから読まれた配列は、GTGTGTGTGTGTGTGTGTGT CAATC（配列番号25のヌクレオチド105〜125）である。図20に示すスライドから 読まれた配列は、GTGTGTGTGTGTGTGTGTCAATCTG（配列番号18のヌクレオチド30〜5 0）である。これら２つの配列の間のGT反復の数の差異は、容易に明らかである 。 実施例11：ローリングサークル増幅に結合したヒトTSHについてのイムノアッセ イ 本実施例は、捕獲抗体、およびレポーター抗体を用いる、ヒト甲状腺刺激ホル モン(hTSH)の単一分子検出を記載する。レポーター抗体は、図29Ａに例示された 形であり、ここで抗体はローリングサークル複製プライマーに結合する。検出さ れるシグナルを、レポーター抗体のローリングサークル複製プライマー部分によ ってプライムされるローリングサークル増幅により生成する。 １．Hendricksonらによって記載されたようなSATA化学を用いて、マレイミド修 飾したhTSHに特異的なモノクローナル抗体を、28塩基オリゴヌクレオチドの５' 末端５'-［アミノ]-TTTTTTTTTTGCTGAGACATGACGAGTC-3’(配列番号27)に連結して 、レポーター抗体を形成する。このオリゴヌクレオチドの３'末端の18ヌクレオ チドは、以下に記載されるATCに相補的である。このオリゴヌクレオチドを、ロ ーリングサークル複製プライマーとして以下の増幅操作のために用いる。 ２．レポーター抗体により認識されるエピトープ由来の異なるエピトープに特異 的なhTSH捕獲抗体を、２mm直径の小滴を用いて、派生スライドグラス(deriverti zed glass slides)(Guoら(1994))上の規定された位置に固定して、固体状態検出 器を作製する。1.5マイクロリットルの小滴（重炭酸ナトリウム（pH９０中に５ μg/mlの抗体を含む）を、スライド上の規定された各位置に塗布し、一晩インキ ュベートし、次いでスライド全体をPBS-BLA(10mMリン酸ナトリウム(pH7.4)、150 mM塩化ナトリウム、２％BSA、10％βラクトース、0.02％アジ化ナトリウム）で 洗浄して、吸収されなかった部位をブロックする。 ３．hTSHの段階希釈液を、いくつかの同一の各スライドのカバーグラスの下に添 加する。１時間のインキュベーション後、スライドをTBS/Tween洗浄緩衝液（Hen dricksonら）で３回洗浄する。hTSHは、この時点でスライドガラスの表面に捕獲 されている。 ４．30マイクロリットルの適切に希釈されたレポーター抗体（ローリングサーク ル複製プライマーに結合した抗体）の混合物を、各スライドのカバーグラスの下 に添加する。スライドを37℃で１時間インキュベートし、次いで２×SSC、2.8％ BSA、0.12％Tween-20で、37℃で各洗浄について５分間、４回洗浄する。 ５．ATCは、以下の配列の94塩基の閉環オリゴヌクレオチドである５'-AAATCTCCA ACTGGAAACTGTTCTGACTCGTCATGTCTCAGCTCTAGTACGCTGATCTCAGTCTGATCTCAGTCATTTGGT CTCAAAGTGATTG-３'（配列番号28）。このATCオリゴヌクレオチドを、ATCをレポ ーター抗体のローリングサークル複製プライマー部位とハイブリ ダイズさせるために、スライドの表面上、カバーグラスの下で、50mM Tris-Cl（ pH7.4）、40mM KOAC、10mM MgCl₂からなる緩衝液中で30μlの量でインキュベー トする。このハイブリダイゼーションを図29Ｂに示す。 ６．インサイチュローリングサークル増幅を、カバーグラスの下で、30μlの以 下の成分を含む緩衝液中で、30℃で12分間行う：50mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM MgCl₂、それぞれ400μMのdCTP、dATP、dGTP、95μM dTTP、380μM BUDRトリホ スフェート(SIGMA)、1000nモルの濃度のT4ファージ遺伝子32タンパク質、および 200nMのφ29 DNAポリメラーゼ。この反応で、ATCの約350の縦列コピーが生じる 。ローリングサークル複製プライマーがTS-DNA（５'末端で）に取り込まれてい るのでコピーは単一のTS-DNA分子として抗体に結合したままであり、そしてロー リングサークル複製プライマーは抗体に結合したままである。 ７．スライドを、２×SSC、2.8％BSA、0.12％Tween-20で、37℃で５分間３回洗 浄する。 ８．次いで、スライドを、50μl（カバーグラスの下で）の２×SSC、2.8％BSA、 0.12％Tween-20、および５μg/mlビオチン化抗BUDRマウスIgG(Zymed Labs)中で 、37℃で30分間インキュベートする。 ９．スライドを、２×SSC、2.8％BSA、0.12％Tween-20中で、37℃で５分間３回 洗浄する。 10．次いで、スライドを、50μl（カバーグラスの下で）の２×SSC、2.8％BSA、 0.12％Tween-20、および５μg/mlのFITC-アビジン中で、37℃で30分間インキュ ベートする。 11．スライドを、２×SSC、2.8％BSA、0.12％Tween-20中で、37℃で５分間３回 洗浄する。 12．スライドを、１×SSC、0.01％Tween-20中で、室温で10分間洗浄する。 13．スライドの像を、蛍光検出のための適切なフィルターセットを備えた顕微鏡 -CCDカメラシステムを用いて捕獲し、そして蛍光点の数を計数する。これは、サ ンプル中に存在するhTSHの存在および相対量を示す。なぜなら、各点は単一の折 り畳んだTS-DNA分子を示し、そして各TS-DNA分子は、スライド上に捕獲された単 一のhTSH分子を示すからである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．核酸配列を増幅する方法であって、該方法は、以下： （a）１つ以上のローリングサークル複製プライマーを、１つ以上の増幅標的 サークルと混合してプライマーATC混合物を生成する工程、および該プライマーA TC混合物中で該増幅標的サークルと該ローリングサークル複製プライマーとの間 のハイブリダイゼーションを促進する条件下で該プライマーATC混合物をインキ ュベートする工程であって、 ここで、該増幅標的サークルはそれぞれ、プライマー相補部分を含む１本鎖の 、環状DNA分子を含み、ここで該プライマー相補部分は、少なぐとも１つのロー リングサークル複製プライマーに相補的である、工程、および （b）DNAポリメラーゼを該プライマーATC混合物と混合してポリメラーゼATC混 合物を生成する工程、および該増幅標的サークルの複製を促進する条件下で該ポ リメラーゼATC混合物をインキュベートする工程であって、 ここで、該増幅標的サークルの複製が縦列配列DNAの形成を生じる、工程； を包含し、 ここで、該方法は、少なくとも１つの以下：（１）増幅操作、（２）特定の結 合分子にカップリングした少なくとも１つのローリングサークル複製プライマー の使用、（３）特定の結合分子に結合した少なくとも１つの増幅標的サークルの 使用、（４）核酸折り畳み操作、（５）組合せ多色コード検出操作、（６）少な くとも２つの増幅標的サークルの示差増幅、および（７）プライマー伸長配列決 定、をさらに包含し、 ここで、該増幅操作は、（i）工程（b）と同時かまたはその後に行われ、(ii ）ネストした連結媒介ローリングサークル複製、二次DNA鎖置換、および転写か らなる群より選択され、そして（iii）二次縦列DNAまたは縦列配列RNAの形成を 生じる、方法。 ２．請求項１に記載の方法であって、ここで、 少なくとも１つの前記ローリングサークル複製プライマーが、特定の結合分子 にカップリングし、ここで、該特異的結合分子は、標的分子と相互作用するか、 または 少なくとも１つの該増幅標的サークルは、特定の結合分子に結合し、ここで該 特異的結合分子は、標的分子と相互作用する、方法。 ３．請求項２に記載の方法であって、該方法は、少なくとも１つの以下：（１） 前記増幅操作、（２）固体状態サンプルの使用であって、該固体状態サンプルが 該標的分子を含む、使用、（３）前記特定の結合分子を該標的分子に接触させる 工程、（４）前記核酸折り畳み操作、（５）前記縦列配列DNAに存在する多数の 異なる配列を別々におよび同時に検出する工程を包含する複合検出操作、（６） 少なくとも２つの前記増幅標的サークルの示差増幅、および（７）プライマー伸 長配列決定、 を含む、方法。 ４．前記標的分子が一次増幅標的サークルである請求項２に記載の方法であって 、ここで該一次増幅標的サークルが、 （i）開環プローブを一次標的サンプルと混合してOCP標的サンプル混合物を生 成する工程、および該OCP標的サンプル混合物中で、該開環プローブと一次標的 配列との間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で該OCP標的サンプル混 合物をインキュベートする工程であって、 ここで、該一次標的配列は、5'領域および3'領域を含み、そして 該開環プローブは、5'末端から3'末端方向に、5'リン酸基、右標的プローブ部 分、スペーサー部分、左標的プローブ部分、および3'ヒドロキシル基を含む１本 鎖の、線状DNA分子を含み、ここで該左標的プローブ部分は、該一次標的配列の 該3'領域に相補的であり、そして該右標的プローブ部分は、該一次標的配列の該 5'領域に相補的である、工程、 (ii)リガーゼを該OCP標的サンプル混合物と混合して連結混合物を生成する工 程、および該開環プローブの連結を促進する条件下で該連結混合物をインキュベ ートし、該一次増幅標的サークルの形成を生じる工程、 によって形成される、方法。 ５．請求項１に記載の方法であって、該方法は、前記増幅操作を含み、そして該 増幅操作は、工程（b）と同時またはその後に、 （c）RNAポリメラーゼを前記ATC混合物と混合する工程、および前記縦列配列D NAの転写を促進する条件下で該ポリメラーゼATC混合物をインキュベートする工 程であって、ここで該縦列配列DNAの転写は、縦列配列RNAの形成を生じる、工程 、または （c）二次DNA鎖置換プライマーを該ポリメラーゼATC混合物と混合する工程お よび（i）該縦列配列DNAと該二次DNA鎖置換プライマーとの間のハイブリダイゼ ーションおよび（ii）該ポリメラーゼATC混合物における該縦列配列DNAの複製、 を促進する条件下で該ポリメラーゼATC混合物をインキュベートする工程であっ て、ここで該縦列配列DNAの複製は二次縦列配列DNAの形成を生じる、工程、 を包含する、方法。 ６．請求項５に記載の方法であって、前記増幅操作が、 （c）二次DNA鎖置換プライマーを前記ポリメラーゼATC混合物と混合する工程 、および（i）前記縦列配列DNAと該二次DNA鎖置換プライマーとの間のハイブリ ダイゼーションおよび（ii）該ポリメラーゼATC混合物における該縦列配列DNAの 複製、を促進する条件下で該ポリメラーゼATC混合物をインキュベートする工程 であって、ここで該縦列配列DNAの複製は二次縦列配列DNAの形成を生じる、工程 、および （d）RNAポリメラーゼを前記ATC混合物と混合する工程、および該二次縦列配 列DNAの転写を促進する条件下で該ポリメラーゼATC混合物をインキュベートする 工程であって、ここで該二次縦列配列DNAの転写は、縦列配列RNAの形成を生じる 、工程、 を包含する、方法。 ７．請求項１〜６のいずれかに記載の方法であって、ここで該方法は、少なくと も１つの以下：（１）前記核酸折り畳み操作、（２）縦列配列DNAに存在する多 数の異なる配列を別々におよび同時に検出する工程を包含する複合検出操作、（ ３）少なくとも２つの増幅標的サークルの示差増幅、および（４）プライマー伸 長配列決定、を包含する、方法。 ８．請求項１〜７のいずれかに記載の方法であって、ここで該方法は、縦列配列 DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAの形成の後に、プライマー伸長配列 決定工程を包含し、ここでプライマー伸長配列決定工程は、 （i）識別混合物を形成する工程であって、ここで１つ以上の識別プライマー が、該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAにハイブリダイズさ れる、工程、 （ii）工程（i）と同時またはその後に、少なくとも２つの異なるタグ化鎖終 結ヌクレオチドおよびDNAポリメラーゼを該識別混合物と混合する工程であって 、ここで各異なるタグ化鎖終結ヌクレオチドは、異なるタグ化分子にカップリン グした異なる鎖終結ヌクレオチドトリホスフェートを含む、工程、 （iii）該識別プライマーへの該タグ化鎖終結ヌクレオチドのテンプレートに 基づいた付加を促進する条件下で該識別混合物をインキュベートする工程であっ て、ここで該識別プライマーへの該タグ化鎖終結ヌクレオチドの付加が、該タグ 化鎖終結ヌクレオチドと該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNA との会合を生じる、工程、および （iv）タグ化鎖終結ヌクレオチドの該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または 縦列配列RNAとの会合を検出する工程、 を包含する、方法。 ９．請求項８に記載の方法であって、前記識別混合物の形成が、 (i)(a)識別プローブおよび多数の縮重プローブを、（１）前記縦列配列DNA、 二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと（２）該識別プローブおよび縮重プロー ブとの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で縦列配列DNA、二次縦列 配列DNA、または縦列配列RNAと混合してプローブ混合物を生成する工程であって 、 ここで各縮重プローブは、3'ブロッキング基を有する、工程、 (i)(b)リガーゼと該プローブ混合物を混合して縮重連結混合物を生成する工程 、および該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAにハイブリダイ ズされる該縮重プローブの１つへの該識別プローブの連結を促進する条件下で該 縮重連結混合物をインキュベートする工程であって、ここで該識別プローブに連 結する該縮重プローブは連結した縮重プローブである、工程、 (i)(c)該連結した縮重プローブの該3'ブロッキング基を除去する工程であって 、ここで該連結プローブの１つ以上の縮重プローブへの連結が、該識別プライマ ーの形成を生じ、ここで該識別プライマーの形成が、該識別混合物の形成を生じ る、工程、 を包含する、方法。 １０．請求項９に記載の方法であって、ここで工程(i)(c)に続く該識別混合物の 形成が、以下、 (i)(d)（１）該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと、（２ ）該縮重プローブとの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で、多数の 縮重プローブを該連結混合物と混合して、二次プローブ混合物を生成する工程、 (i)(e)リガーゼを該二次プローブ混合物と混合して二次縮重連結混合物を生成 する工程、および該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、またば縦列配列RNAにハイ ブリダイズされる縮重プローブの１つへの該連結された縮重プローブの連結を促 進する条件下で該二次縮重連結混合物をインキュベートする工程であって、ここ で、該連結された縮重プローブに連結された該縮重プローブが、連結された二次 縮重プローブである、工程、 (i)(f)該二次縮重プローブの該3'ブロッキング基を除去する工程、 をさらに含み、ここで工程(i)(d)、(i)(e)、および(i)(f)が順に１回以上行われ る、方法。 １１．請求項８に記載の方法であって、該識別混合物の形成が、（１）該縦列配 列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと（２）該識別プライマーとの間 のハイブリダイゼーションを促進する条件下で識別プライマーを該縦列配列DNA 、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと混合する工程を包含する、方法。 １２．請求項１〜７のいずれかに記載の方法であって、該方法が、前記組合せ多 色コード検出操作を包含し、ここで該組合せ多色コード検出操作が、前記縦列配 列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAに存在する多数の異なる配列を、 （i）該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと（ii）前記検出 プローブとの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で、検出プローブの セットを該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと混合すること によって、別々にそして同時に検出する工程を包含し、ここで該検出プローブの セットが、組合せ多色コードを用いて標識される、方法。 １３．核酸配列を増幅する方法であって、該方法は、 （a）１つ以上の異なる開環プローブを、１つ以上の標的配列を含む標的サン プルと混合してOCP標的サンプル混合物を生成する工程、および該開環プローブ と該OCP標的サンプル混合物中の該標的配列との間のハイブリダイゼーションを 促進する条件下で該OCP標的サンプル混合物をインキュベートする工程、 （b）リガーゼを該OCP標的サンプル混合物と混合して連結混合物を生成する工 程、および増幅標的サークルを形成するために開環プローブの連結を促進する条 件下で該連結混合物をインキュベートする工程、 （c）ローリングサークル複製プライマーを該連結混合物と混合してプライマ ー-ATC混合物を生成する工程、および該増幅標的サークルと該プライマー-ATC混 合物中の該ローリングサークル複製プライマーとの間のハイブリダイゼーション を促進する条件下で該プライマー-ATC混合物をインキュベードする工程、および （d）DNAポリメラーゼを該プライマー-ATC混合物と混合して、ポリメラーゼ-A TC混合物を生成する工程、および該増幅標的サークルの複製を促進する条件下で 該ポリメラーゼ-ATC混合物をインキュベートする工程、 を包含し、 ここで、該増幅標的サークルの複製が、縦列配列DNAの形成を生じ； ここで、該方法は、少なくとも１つの以下：（１）増幅操作、（２）特定の結 合分子にカップリングした少なくとも１つのローリングサークル複製プライマー の使用、（３）該標的配列の少なくとも１つとしてのレポーター結合因子の使用 、（４）核酸折り畳み操作、（５）組合せ多色コード検出操作、（６）示差増幅 、および（７）プライマー伸長配列決定、（８）１つ以上のギャップオリゴヌク レオチドの使用、（９）少なくとも１つの標的配列をしての一次増幅標的サーク ルの使用、をさらに包含し、 ここで、該増幅操作は、（i）工程（ｄ）と同時にまたはその後に行われ、（i i）ネストした連結媒介ローリングサークル増幅、二次DNA鎖置換、および転写か らなる群より選択され、そして（iii）二次縦列配列DNAまたは縦列配列RNAの形 成を生じ、そして ここで、該一次増幅標的サークルは、 （i）一次開環プローブを一次標的サンプルと混合して一次OCP-標的サンプル 混合物を生成する工程、および一次開環プローブと該一次OCP-標的サンプル混合 物中の一次標的配列との間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で該一次 OCP-標的サンプル混合物をインキュベートする工程であって、 ここで、該１次標的配列は、5'領域および3'領域を含み、そして ここで、該一次開環プローブは、5'末端から3'末端方向に、5'リン酸基、右標 的プローブ部分、スペーサー部分、左標的プローブ部分、および3'ヒドロキシル 基を含む１本鎖線状DNA分子を含み、ここで、該左標的プローブ部分は、該一次 標的配列の該3'領域に相補的であり、そして該右標的プローブ部分は、該一次標 的配列の該5'領域に相補的である、工程、 （ii）リガーゼを該一次OCP-標的サンプル混合物と混合して、一次連結混合物 を生成する工程、および該一次開環プローブの連結を促進する条件下で該一次連 結混合物をインキュベートして該一次増幅標的サークルの形成を生じる工程、 によって形成される、方法。 １４．請求項１３に記載の方法であって、前記標的配列はそれぞれ、5'領域およ び3'領域を含み、 ここで、該開環プローブはそれぞれ、5'末端から3'末端方向に、5'リン酸基、 右標的プローブ部分、スペーサー部分、左標的プローブ部分、および3'ヒドロキ シル基を含む１本鎖、線状DNA分子を含み、ここで、該スペーサー部分はプライ マー相補部分を含み、そしてここで同一の開環プローブの該左標的プローブ部分 および該右標的プローブ部分はそれぞれ、同一の標的配列の該3'領域および該5' 領域にそれぞれ相補的であり、 ここで、少なくとも１つの標的配列は、該5'領域と該3'領域との間に位置する 中央領域をさらに含み、 ここで、前記開環プローブの該左標的プローブ部分も任意の該開環プローブの 該右標的プローブ部分のいずれも該標的配列の該中央領域に相補的でなく、そし て ここで、工程（a）は、インキュベーションの前に、一つ以上のギャップオリ ゴヌクレオチドを該標的サンプルと混合する工程をさらに包含し、その結果、該 OCP-標的サンプル混合物が該一つ以上の開環プローブ、該一つ以上のギャップオ リゴヌクレオチド、および該標的サンプルを含み、ここで、各ギャップオリゴヌ クレオチドは、5'リン酸基および3'ヒドロキシル基を含む１本鎖の線状DNA分子 を含み、ここで各ギャップオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの該標的配列 の該中央領域の全部または部分に相補的である、方法。 １５．請求項１３または１４に記載の方法であって、ここで少なくとも１つの前 記標的配列が、特定の結合分子にカップリングしており、ここで該特定の結合分 子は、標的分子と相互作用する、方法。 １６．請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法であって、少なくとも１つの前 記ローリングサークル複製プライマーが、特定の結合分子にカップリングしてお り、ここで該特定の結合分子は、標的分子と相互作用する、方法。 １７．請求項１３〜１７のいずれかに記載の方法であって、前記標的分子が、固 体状態サンプルの一部である、方法。 １８．請求項１３〜１７のいずれかに記載の方法であって、該方法は、増幅操作 を含み、そしてここで該増幅操作は、工程（d）と同時かまたはその後に、 （e）RNAポリメラーゼを前記ポリメラーゼ-ATC混合物と混合する工程、および 前記縦列配列DNAの転写を促進する条件下で該ポリメラーゼ-ATC混合物をインキ ュベートする工程であって、ここで該縦列配列DNAの転写が、縦列配列RNAの形成 を生じる、工程、または （e）二次DNA鎖置換プライマーを該ポリメラーゼ-ATC混合物と混合する工程、 および（i）該縦列配列DNAと該二次DNA鎖置換プライマーとの間のハイブリダイ ゼーションおよび（ii）該ポリメラーゼ-ATC混合物において該縦列配列DNAの複 製を促進する条件下で該ポリメラーゼ-ATC混合物をインキュベートする工程であ って、ここで該縦列配列DNAの複製が、二次縦列配列DNAの形成を生じる、工程、 を包含する、方法。 １９．請求項１３〜１８のいずれかに記載の方法であって、該方法は、少なくと も１つの以下：（１）前記増幅操作、（２）前記固体状態サンプルの使用であっ て、該固体状態サンプルが、該標的分子を含む、使用、（３）前記特定の結合分 子を該標的分子に接触させる工程、（４）前記核酸折り畳み操作、（５）前記縦 列配列DNAに存在する多数の異なる配列を別々におよび同時に検出する工程を包 含する複合検出操作、（６）少なくとも２つの該増幅標的サークルの示差増幅、 および（７）プライマー伸長配列決定、 を包含する、方法。 ２０．請求項１３〜１９のいずれかに記載の方法であって、該方法は、前記組合 せ多色コード検出操作を包含し、ここで、該組合せ多色コード検出操作は、前記 縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAに存在する多数の異なる配 列を、 （i）該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと（ii）該検出プ ローブとの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で検出プローブのセッ トを該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと、混合することに よって、別々におよび同時に検出する工程を包含し、ここで該検出プローブのセ ットは、組合せ多色コードを用いて標識される、方法。 ２１．請求項１３〜１９のいずれかに記載の方法であって、該方法は、縦列配列 DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAの形成の後に、プライマー伸長配列 決定を包含し、ここで、プライマー伸長配列決定は、 （i）識別混合物を形成する工程であって、ここで一つ以上の識別プライマー は、該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAにハイブリダイズさ れる、工程、 （ii）工程（i）と同時にかまたはその後に、少なくとも２つの異なるタグ化 鎖終結ヌクレオチドおよびDNAポリメラーゼを該識別混合物と混合する工程であ って、各異なるタグ化鎖終結ヌクレオチドは、異なるタグ分子にカップリングし た異なる鎖終結ヌクレオチドトリホスフェートを含む、工程、 （iii）該タグ化鎖終結ヌクレオチドの該識別プライマーへのテンプレートに 基づく付加を促進する条件下で該識別混合物をインキュベードする工程であって 、ここで該タグ化鎖終結ヌクレオチドの該識別プライマーへの付加が、該タグ化 鎖終結ヌクレオチドの該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと の会合を生じる、工程、および （iv）該タグ化鎖終結ヌクレオチドの該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、また は縦列配列RNAとの会合を検出する工程、 を包含する、方法。 ２２．請求項２１に記載の方法であって、前記識別混合物の形成が、 (i)(a)識別プローブおよび多数の縮重プローブを前記縦列配列DNA、二次縦列 配列DNA、または縦列配列RNAと混合して、（１）該縦列配列DNA、二次縦列配列D NA、または縦列配列RNAと、（２）該識別プローブおよび縮重プローブとのハイ ブリダイゼーションを促進する条件下でプローブ混合物を生成する工程であっ て、ここで各縮重プローブが、3'ブロッキング基を有する、工程、 (i)(b)リガーゼを該プローブ混合物と混合して縮重連結混合物を生成する工程 、および該識別プローブの該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RN Aにハイブリダイズされる縮重プローブの１つへの連結を促進する条件下で該縮 重連結混合物をインキュベートする工程であって、ここで該識別プローブに連結 した該縮重プローブは、連結した縮重プローブである、工程、 (i)(c)該連結した縮重プローブの該3'ブロッキング基を除去する工程、 を包含し、ここで、該識別ブローブの一つ以上の縮重プローブへの連結が、該識 別プライマーの該形成を生じ、ここで該識別プライマーの該形成が識別混合物の 形成を生じる、方法。 ２３．請求項２２に記載の方法であって、前記識別混合物の形成が、工程（i） （c）に続いて、 (i)(d)前記多数の縮重プローブを前記連結混合物と混合して、（１）前記縦列 配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと、（２）縮重プローブとの間 のハイブリダイゼーションを促進する条件下で二次プローブ混合物を生成する工 程、 (i)(e)リガーゼを該二次プローブ混合物と混合して、二次縮重連結混合物を生 成する工程、および該識別プローブの該縦列配列DNA、二次縦列配列DNA、または 縦列配列RNAにハイブリダイズされる縮重プローブの１つへの該連結された縮重 プローブの連結を促進する条件下で該二次縮重連結混合物をインキュベートする 工程であって、ここで該連結された縮重プローブに連結した該縮重プローブが、 二次連結縮重プローブである、工程、 (i)(f)該二次縮重プローブの該3'ブロッキング基を除去する工程、 をさらに包含し、ここで、工程(i)(d)、(i)(e)、および(i)(f)が、順に、１回以 上行われる、方法。 ２４．請求項２１に記載の方法であって、該識別混合物の形成が、（１）該縦列 配列DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと、（２）識別プライマーとの 間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で識別プライマーを前記縦列配列 DNA、二次縦列配列DNA、または縦列配列RNAと混合する工程を包含する、方法。 ２５．１つ以上の標的分子を選択的に検出するためのキットであって、該キット は、 （a）１つ以上の増幅標的サークル、 ここで、該増幅標的サークルはそれぞれ、プライマー相補部分を含む１本鎖の環 状DNA分子を含み、そして （b）１つ以上の増幅標的サークルのプライマー相補部分に相補的である相補 部分を含む１本鎖の線状核酸分子を含むローリングサークル複製プライマーを含 み、 ここで、（１）各増幅標的サークルが、特定の結合分子に結合されるか、また は（２）該ローリングサークル複製プライマーが、特定の結合分子にカップリン グしているかのいずれかであり、 ここで、該特定の結合分子は、少なくとも１つの該標的分子と相互作用する、キ ット。 ２６．１つ以上の前記増幅標的サークルの部分に適合する適合部分を含む１本鎖 の線状核酸分子を含む二次DNA鎖置換プライマーをさらに含む、請求項２５に記 載のキット。 ２７．識別プローブおよび多数の縮重プローブをさらに含む、請求項２５に記載 のキット。 ２８．識別プライマーをさらに含む、請求項２５に記載のキット。 ２９．それぞれが5'領域および3'領域を含む１つ以上の標的配列に関連する核酸 配列を選択的に増幅するためのキットであって、該キットは、 （a）5'末端から3'末端方向に、5'リン酸基、右標的プローブ部分、スペーサ ー部分、左標的プローブ部分、および3'ヒドロキシル基を含む１本鎖の線状DNA 分子をそれぞれ含む１つ以上の開環プローブであって、 ここで、該スペーサー部分は、プライマー相補部分を含み、そして ここで、該左標的プローブ部分は、少なくとも１つの該標的配列の該3'領域に 相補的であり、そして該右標的プローブ部分は、同一の標的配列の該5'領域に相 補的である、開環プローブ、 （b）１つ以上の該開環プローブの該プライマー相補部分に相補的である相補 的部分を含む１本鎖、線状核酸分子を含むローリングサークル複製プライマー、 および （c）（１）１つ以上の該開環プローブの部分に適合する適合部分を含む１本 鎖の線状核酸分子を含む二次ＤＮＡ鎖置換プライマー、および（２）親和性部分 およびオリゴヌクレオチド部分をそれぞれ含む１つ以上のレポーター結合因子、 の１方または両方であって、ここで該オリゴヌクレオチド部分は、該標的配列の １つを含む、 を含む、キット。 ３０．１つ以上のギャップオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項２９に記載 のキットであって、ここで、少なくとも１つの前記標的配列が、前記5'領域と前 記3'領域との間に位置する中央領域をさらに含み、 ここで、前記開環プローブの前記左標的プローブ部分も、該開環プローブの前 記右標的プローブ部分のいずれも該中央領域に相補的でなく、そして ここで、各ギャップオリゴヌクレオチドは、5'リン酸基および3'ヒドロキシル 基を含む１本鎖の線状DNA分子キットを含み、 ここで各ギャップオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの該標的配列の該中 央領域の全部または一部と相補的である、キット。 ３１．識別プローブおよび多数の縮重プローブをさらに含む、請求項２９に記載 のキット。 ３２．識別プライマーを含む、請求項２９に記載のキット。