JP2018537955A - 増幅産生物の富化のための方法および組成物 - Google Patents

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Abstract

一部の態様では、本開示は標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーのコンカテマーを含むアンプリコンまたは増幅産生物を富化するための方法を提供する。一部の実施形態では、方法は標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーを含むアンプリコンをシーケンシングするステップを含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、これだけに限らないが、点変異、単一ヌクレオチド変異多型、挿入、欠失、および融合遺伝子を含む転座を含む染色体再配列の結果生じた配列を含む。一部の態様では、本開示は記述した方法に有用な組成物および反応混合物を提供する。

Description

関連出願
本出願は、２０１５年１０月９日に出願された米国仮特許出願第６２／２３９，６９０号に対する利益を主張し、この出願は参考として本明細書に援用される。
大スケールの並列核酸シーケンシングの出現によって、複雑な集団の中の配列多様性を同定することが実現可能になった。ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、即ち鎖置換能を有するポリメラーゼを用いる増幅プロセスが、シーケンシング解析のために核酸を調製するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順の有用な代替および補完として出現した。ＲＣＡには、環状ＤＮＡ鋳型等の環状ポリヌクレオチド鋳型にアニーリングされたプライマーにヌクレオチドを連続的に付加することによって繰り返し配列を有するポリヌクレオチドを成長させるステップが含まれる。この延長プロセスによって環状ポリヌクレオチド鋳型の全長を多数回カバーすることができ、それにより鋳型の繰り返し配列、即ちコンカテマーと称されるものの形成がもたらされる。コンカテマーはさらなる増幅産生物を発生させるための鋳型としても役立つことができる。しかし、この延長は直鎖状コンカテマーの末端に達するまでしか進行しない。成長するポリヌクレオチド鎖の先端がＤＮＡの二本鎖部分に到達すると、成長する鎖は鋳型から存在する鎖を置換する。その結果、鋳型配列の様々な数のリピートからなる種々の長さの二本鎖ＤＮＡの形成がもたらされることが多い。従来のＲＣＡ法においては、短いコンカテマーは、標的配列の多くのリピートを含む長いコンカテマーに比べて不均合に増幅されることが多い。したがって長いコンカテマーを引き続いて解析することはより困難になり得る。
大スケール並列シーケンシングには、広く用いられている技法における固有のエラーの頻度が集団中の実際の配列多様性の多くにおける頻度よりも大きいという顕著な限界がある。例えば、標準的な高スループットシーケンシングにおいては０．１〜１％のエラー率が報告されている。バリアントの頻度が低く、例えばエラー率と同じまたはこれより低い場合には、稀な配列バリアントの検出は高い偽陽性率を伴う。
稀な配列バリアントを検出する能力は種々の理由によって重要である。例えば、稀な特徴配列の検出は、細菌分類群等の有害な環境汚染物質の存在を同定し識別するために用いることができる。細菌分類群を特徴付ける一般的な方法は、ｒＲＮＡ配列等の高度に保存された配列における差異を同定することである。しかし今日までの典型的なシーケンシングに基づくアプローチは、所与の試料中の異なるゲノムの圧倒的な数およびメンバー間の相同性の程度に関連する困難に直面しており、既に煩雑になっている手順にとって複雑な問題となる。
配列多様性を検出するための既存の技法は、融合遺伝子の多様性および染色体の再配列の検出において特に非効率的である。再配列された遺伝子と融合した「パートナー」遺伝子は知られていないことが多く、そのため検出が困難になる。接合部位が観察されない場合には融合遺伝子の検出も困難であり得る。
上記に鑑みて、稀な配列多様性、特に稀な配列変化および遺伝子融合事象を検出するための代替のおよび／または堅固な方法および組成物に対するニーズが存在する。本開示の組成物および方法はこのニーズに対処するものであり、さらなる利点も提供する。特に本開示の種々の態様は、大量並列シーケンシング法のために用いることができる標的ポリヌクレオチドの複数のコピーを含むアンプリコンを提供する。標的ポリヌクレオチドの複数のコピーを含むアンプリコンを用いることによって、標的ポリヌクレオチドを１回より多くシーケンシングすることができ、稀な配列バリアントおよび融合遺伝子をシーケンシングする際のエラーを減少させることができる。
一態様では、標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーのコンカテマーを含むアンプリコンを富化する方法が開示される。この方法は、（ａ）第１のプライマーの延長によって環状標的ポリヌクレオチドから一本鎖ポリヌクレオチドを含むコンカテマーを生成するステップであって、前記第１のプライマーが、配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端と、配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列を含む第１の５’末端とを含むステップと、（ｂ）配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端と、配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列を含む第２の５’末端とを含む第２のプライマーの延長によって前記標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数のコピーを含む複数の延長産生物を生成するステップであって、前記第１の共通配列および前記第２の共通配列が、それぞれ５’末端に少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、最適にアライメントした場合に少なくとも９０％同一であるステップと、（ｃ）複数のアンプリコンを生成する条件下でステップ（ｂ）の前記複数の延長産生物を増幅するステップであって、前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーを含むアンプリコンが富化されるステップとを含む。一部の実施形態では、ステップ（ａ）が鎖置換活性を有するポリメラーゼによって達成される。一部の実施形態では、前記第１の共通配列と前記第２の共通配列とが同一である。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）の前記増幅が第３のプライマーのプライマー延長を含み、前記第３のプライマーが、配列相補性によって前記第１の共通配列または前記第２の共通配列に特異的にハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、（ｃ）の前記増幅するステップによって、前記標的ポリヌクレオチドの２つより少ないコピーを有するアンプリコンの百分率よりも大きな、前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が得られる。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの前記百分率が少なくとも９０％である。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの前記百分率が少なくとも８０％である。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの前記百分率が少なくとも６０％である。一部の実施形態では、前記延長産生物が、（ｉ）前記第１の共通配列と前記第２の共通配列の相補体との間、または（ｉｉ）前記第２の共通配列と前記第１の共通配列の相補体との間の分子内ハイブリダイゼーションを含むステムループ構造を形成する。一部の実施形態では、前記ステムループ産生物の形成が、アニーリングステップを前記第３のプライマーの融解温度の±５℃以内の温度に保ってステップ（ｃ）の前記増幅を実施することによって達成される。一部の実施形態では、前記ステムループ産生物の形成が、アニーリングステップを７０℃未満の温度に保ってステップ（ｃ）の前記増幅を実施することによって達成される。一部の実施形態では、前記ステムループ構造が少なくとも９塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、前記ステムループ構造が少なくとも１５塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、前記ステムループ構造が少なくとも２０塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、前記ステムループ構造が少なくとも２５塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、前記ステムループ構造が少なくとも３０塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）が６サイクル以下の前記第２のプライマーの延長を含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）が８サイクル以下の前記第２のプライマーの延長を含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）が１０サイクル以下の前記第２のプライマーの延長を含む。一部の実施形態では、前記第１の共通配列、前記第２の共通配列、および前記第３のプライマーのハイブリダイジング配列が、全て互いに±５℃以内の融解温度（Ｔｍ）を有する。一部の実施形態では、前記環状標的ポリヌクレオチドが環状化された無細胞ＤＮＡである。一部の実施形態では、前記環状標的ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡの環状化された断片である。一部の実施形態では、前記環状標的ポリヌクレオチドが染色体再配列の結果生じた配列を含む。一部の実施形態では、前記染色体再配列が、欠失、重複、逆位、および転座のうちの少なくとも１つである。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチドに沿って５’から３’に向かって（ｉ）前記第１の３’末端に相補的な配列、（ｉｉ）前記第２の３’末端と同一の配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との間の介在配列に対応する、前記標的ポリヌクレオチドの配列部分を併せた長さが７５ヌクレオチドまたはそれ未満である。一部の実施形態では、コンカテマーの少なくとも５０％が少なくとも７５ヌクレオチドの長さの標的ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記環状標的ポリヌクレオチドが一本鎖である。一部の実施形態では、方法は、ステップ（ｃ）で産生された前記複数のアンプリコンをシーケンシングするステップさらに含む。一部の実施形態では、前記シーケンシングするステップが、前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを含むアンプリコンを、前記標的ポリヌクレオチドのただ１つのコピーを含むアンプリコンから選択的に精製することなく実施される。一部の実施形態では、方法は、前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを含む、ステップ（ｃ）で産生された前記複数のアンプリコンの中のアンプリコンを精製するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、前記精製されたアンプリコンをシーケンシングするステップをさらに含む。一部の実施形態では、同じ反応混合物中で複数の異なる標的ポリヌクレオチドが増幅される。
別の態様では、標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーのコンカテマーを含むアンプリコンを富化するための反応混合物が開示される。一実施形態では、反応混合物は、（ａ）環状標的ポリヌクレオチド、（ｂ）配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端、および配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列を含む第１の５’末端を含む第１のプライマー、ならびに（ｃ）配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端、および配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列を含む第２の５’末端を含む第２のプライマーであって、前記第１の共通配列および前記第２の共通配列は、それぞれ５’末端に少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、最適にアライメントした場合に少なくとも９０％同一である、第２のプライマーを含み、前記コンカテマーは、前記第１のプライマーの延長産生物である。一部の実施形態では、前記第１の共通配列と前記第２の共通配列とが同一である。一部の実施形態では、前記反応混合物が容器に入れられている。一部の実施形態では、前記容器が、ウェル、プレート、チューブ、チャンバー、フローセル、またはチップである。一部の実施形態では、反応混合物は、配列相補性によって前記第１の共通配列または前記第２の共通配列に特異的にハイブリダイズする配列を有する第３のプライマーをさらに含む。一部の実施形態では、前記第１の共通配列、前記第２の共通配列、および前記第３のプライマーのハイブリダイジング配列が、全て互いに±５℃以内の融解温度（Ｔｍ）を有する。一部の実施形態では、前記第１の共通配列および前記第２の共通配列がそれぞれ少なくとも１５ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記環状標的ポリヌクレオチドが環状化された無細胞ＤＮＡである。一部の実施形態では、前記環状標的ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡの環状化された断片である。一部の実施形態では、前記環状標的ポリヌクレオチドが染色体再配列の結果生じた配列を含む。一部の実施形態では、前記染色体再配列が、欠失、重複、逆位、および転座のうちの少なくとも１つである。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチドに沿って５’から３’に向かって（ｉ）前記第１の３’末端に相補的な配列、（ｉｉ）前記第２の３’末端と同一の配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との間の介在配列に対応する、前記標的ポリヌクレオチドの配列部分を併せた長さが７５ヌクレオチドまたはそれ未満である。一部の実施形態では、前記環状標的ポリヌクレオチドが一本鎖である。
別の態様では、標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーのコンカテマーを含むアンプリコンを富化するためのキットが開示される。一実施形態では、キットは、（ａ）配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端、および配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列を含む第１の５’末端を含む第１のプライマー、（ｂ）配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端、および配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列を含む第２の５’末端を含む第２のプライマーであって、前記第１の共通配列および前記第２の共通配列が、それぞれ５’末端に少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、最適にアライメントした場合に少なくとも９０％同一であり、前記コンカテマーが前記第１のプライマーの延長産生物である、第２のプライマー、ならびに（ｃ）配列相補性によって前記第１の共通配列または前記第２の共通配列に特異的にハイブリダイズする配列を有する第３のプライマーを含む。一部の実施形態では、前記第１の共通配列と前記第２の共通配列とが同一である。一部の実施形態では、前記第１の共通配列、前記第２の共通配列、および前記第３のプライマーのハイブリダイジング配列が、全て互いに±５℃以内の融解温度（Ｔｍ）を有する。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチドに沿って５’から３’に向かって（ｉ）前記第１の３’末端に相補的な配列、（ｉｉ）前記第２の３’末端と同一の配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との間の介在配列に対応する、前記標的ポリヌクレオチドの配列部分を併せた長さが７５ヌクレオチドまたはそれ未満である。
別の態様では、標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーのコンカテマーを含むアンプリコンを富化するのに使用するためのプライマーを設計するためのシステムが開示される。一実施形態では、システムは、（ａ）特定の標的配列を増幅するためのプライマーを設計するための利用者の要求を受けるように構成されたコンピュータ、（ｂ）１つまたは複数のプロセッサによる実行によって前記標的配列の増幅のための少なくとも３つのプライマーを設計するコードを含むコンピュータ読み込み可能な媒体であって、前記少なくとも３つのプライマーが、（ｉ）配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端、および配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列を含む第１の５’末端を含む第１のプライマー、（ｉｉ）配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端、および配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列を含む第２の５’末端を含む第２のプライマーであって、前記第１の共通配列および前記第２の共通配列が、それぞれ５’末端に少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、最適にアライメントした場合に少なくとも９０％同一であり、前記コンカテマーが前記第１のプライマーの延長産生物である、第２のプライマー、ならびに（ｉｉｉ）配列相補性によって前記第１の共通配列または前記第２の共通配列に特異的にハイブリダイズする配列を有する第３のプライマーを含む、コンピュータ読み込み可能な媒体、ならびに（ｃ）受容者にレポートを送るレポートジェネレータであって、前記レポートが前記少なくとも３つのプライマーの配列を含む、レポートジェネレータを含む。一部の実施形態では、前記第１の共通配列と前記第２の共通配列とが同一である。一部の実施形態では、前記第１の共通配列、前記第２の共通配列、および前記第３のプライマーのハイブリダイジング配列が、全て互いに±５℃以内の融解温度（Ｔｍ）を有する。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチドに沿って５’から３’に向って（ｉ）前記第１の３’末端に相補的な配列、（ｉｉ）前記第２の３’末端と同一の配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との間の介在配列に対応する、前記標的ポリヌクレオチドの配列部分を併せた長さが７５ヌクレオチドまたはそれ未満である。
ある態様では、本開示は、ローリングサークル増幅を実施する方法を提供する。この方法は、（ａ）標的ポリヌクレオチドを含む環状ポリヌクレオチドを準備するステップ、（ｂ）増幅反応混合物を複数サイクルのローリングサークル増幅に供してコンカテマーを含む複数の増幅産生物を生成するステップを含み、前記増幅反応混合物が、（ｉ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ、（ｉｉ）前記環状ポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）プライマーを含み、前記複数サイクルのローリングサークル増幅の各サイクルが、前記複数の増幅産生物を生成するように、変性温度における変性、アニーリング温度におけるプライマーアニーリング、および所与の伸長時間にわたる伸長温度におけるプライマーの伸長を含み、生成した前記複数の増幅産生物が、変性およびプライマーアニーリングについて同等の条件下であるが前記複数サイクルの伸長時間の合計と同等の伸長時間である１サイクルの増幅を用いることによって生成する複数の増幅産生物と比較した場合に、より高い割合で前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを有するコンカテマーを含むことで特徴付けられる。
ある態様では、本開示は、ローリングサークル増幅によって生成される標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを有するコンカテマーの割合を増加させる方法を提供する。この方法は、（ａ）標的ポリヌクレオチドを含む環状ポリヌクレオチドを準備するステップ、（ｂ）増幅反応混合物を複数サイクルのローリングサークル増幅に供してコンカテマーを含む複数の増幅産生物を生成するステップを含み、前記増幅反応混合物が（ｉ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ、（ｉｉ）前記環状ポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）プライマーを含み、前記複数サイクルのローリングサークル増幅の各サイクルが、前記複数の増幅産生物を生成するように、変性温度における変性、アニーリング温度におけるプライマーアニーリング、および所与の伸長時間にわたる伸長温度におけるプライマーの伸長を含み、それにより前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを有するコンカテマーの割合を増加させる。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを有する前記複数の増幅産生物におけるコンカテマーの割合が、変性およびプライマーアニーリングについて同等の条件下であるが前記複数サイクルの伸長時間の合計と同等の伸長時間である１サイクルの増幅を用いることによって生成する複数の増幅産生物と比較した場合に増加している。
一部の実施形態では、前記ポリメラーゼが、ＢｓｕＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ３１７３ポリメラーゼ、これらの任意のバリアント、およびこれらの任意の断片からなる群から選択される。
一部の実施形態では、前記反応混合物中で用いられる前記環状ポリヌクレオチドがヒト無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む場合に、前記複数の増幅産生物が約１８０塩基対の平均断片長さを示す。一部の実施形態では、前記反応混合物中で用いられる前記環状ポリヌクレオチドがヒト無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む場合に、前記複数の増幅産生物が約１７０塩基対の平均断片長さを示す。一部の実施形態では、前記反応混合物中で用いられる前記環状ポリヌクレオチドがヒト無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む場合に、前記複数の増幅産生物が約４０塩基〜約４５０塩基の断片長さ分布を示す。一部の実施形態では、前記反応混合物中で用いられる前記環状ポリヌクレオチドがヒト無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む場合に、前記複数の増幅産生物が約１００塩基〜約２００塩基の断片長さ分布を示す。
一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを有するコンカテマーの割合が少なくとも約１％増加する。一部の実施形態では、方法は、前記複数サイクルのローリングサークル増幅の少なくとも１つのサイクルの後に前記反応混合物に前記ポリメラーゼを補充するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、前記環状ポリヌクレオチドが約４０塩基〜約５００塩基の長さを有する。一部の実施形態では、前記環状ポリヌクレオチドが無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、前記環状ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡの断片を含む。一部の実施形態では、前記環状ポリヌクレオチドが染色体再配列の結果生じた配列を含む。一部の実施形態では、前記染色体再配列が、欠失、重複、逆位、および転座のうちの少なくとも１つである。一部の実施形態では、前記環状ポリヌクレオチドが二本鎖である。一部の実施形態では、前記環状ポリヌクレオチドが一本鎖である。
一部の実施形態では、複数の異なる環状ポリヌクレオチドが前記増幅反応混合物中で増幅される。一部の実施形態では、前記複数サイクルが少なくとも２つのサイクルを含む。一部の実施形態では、前記複数サイクルの各サイクルが、（ｉ）約７５℃〜約９５℃の変性温度における約５秒〜約６０秒間の変性、（ｉｉ）約４５℃〜約６５℃のアニーリング温度における約５秒〜約６０秒間のプライマーアニーリング、および（ｉｉｉ）約６５℃〜約７５℃の伸長温度における約３０秒〜約１０分間の伸長時間のプライマー伸長を含む。一部の実施形態では、前記複数サイクルの各サイクルが、（ｉ）約８０℃の変性温度における約１５秒〜約３０秒間の変性、（ｉｉ）約５０℃のアニーリング温度における約１５秒〜約４５秒間のプライマーアニーリング、および（ｉｉｉ）約７０℃の伸長温度における約３分〜約１０分間の伸長時間のプライマー伸長を含む。
一部の実施形態では、前記プライマーが、プライマー延長のための環状ポリヌクレオチドの種々の領域にランダムにハイブリダイズし、これをプライミングするランダム配列を含む。一部の実施形態では、前記プライマーが、配列特異的な様式でプライマー延長のための環状ポリヌクレオチドの種々の領域にランダムにハイブリダイズし、これをプライミングする遺伝子特異的配列を含む。一部の実施形態では、前記プライマーが、（ｉ）配列相補性によって前記環状ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端、および（ｉｉ）配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列を含む第１の５’末端を含む第１のプライマーを含み、前記環状ポリヌクレオチドを鋳型として用いる前記第１のプライマーの延長によって前記複数サイクルのローリングサークル増幅の間に一本鎖ポリヌクレオチドを含むコンカテマーが生成される。一部の実施形態では、前記プライマーが、（ｉ）配列相補性によって前記一本鎖ポリヌクレオチドを含む前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端、および（ｉｉ）配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列を含む第２の５’末端を含む第２のプライマーを含み、前記コンカテマーを鋳型として用いる前記第２のプライマーの延長によって前記複数サイクルのローリングサークル増幅の間に前記標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数のコピーを含む複数の延長産生物が生成される。一部の実施形態では、前記第１の共通配列および前記第２の共通配列が、それぞれ５’末端に少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、最適にアライメントした場合に少なくとも９０％同一である。一部の実施形態では、前記第１の共通配列と前記第２の共通配列とが同一である。
一部の実施形態では、方法は、複数のアンプリコンを生成する条件下で前記複数の延長産生物を増幅するステップをさらに含み、前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーを含むアンプリコンが富化される。一部の実施形態では、増幅するステップが第３のプライマーのプライマー延長を含み、前記第３のプライマーが、配列相補性によって前記第１の共通配列または前記第２の共通配列に特異的にハイブリダイズする配列を含む。一部の実施形態では、増幅するステップによって、前記標的ポリヌクレオチドの２つより少ないコピーを有するアンプリコンの百分率よりも大きな、前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が得られる。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が少なくとも５％である。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が少なくとも１０％である。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が少なくとも２０％である。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が少なくとも３０％である。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が少なくとも４０％である。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が少なくとも６０％である。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が少なくとも８０％である。一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が少なくとも９０％である。
一部の実施形態では、前記複数の延長産生物が、（ｉ）前記第１の共通配列と前記第２の共通配列の相補体との間、または（ｉｉ）前記第２の共通配列と前記第１の共通配列の相補体との間の分子内ハイブリダイゼーションを含むステムループ構造を形成する。一部の実施形態では、前記ステムループ構造の形成が、アニーリングステップを前記第３のプライマーの融解温度の±５℃以内の温度に保って前記増幅を実施することによって達成される。一部の実施形態では、前記ステムループ構造の形成が、アニーリングステップを約７０℃未満の温度に保って前記増幅を実施することによって達成される。一部の実施形態では、前記ステムループ構造が少なくとも９塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、前記ステムループ構造が少なくとも１５塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、前記ステムループ構造が少なくとも２０塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、前記ステムループ構造が少なくとも２５塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、前記ステムループ構造が少なくとも３０塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、前記第１の共通配列、前記第２の共通配列、および前記第３のプライマーのハイブリダイジング配列が、全て互いに±５℃以内の融解温度（Ｔｍ）を有する。
一部の実施形態では、前記標的ポリヌクレオチドに沿って５’から３’に向かって（ｉ）前記第１の３’末端に相補的な配列、（ｉｉ）前記第２の３’末端と同一の配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との間の介在配列に対応する、前記標的ポリヌクレオチドの配列部分を併せた長さが７５ヌクレオチドまたはそれ未満である。
一部の実施形態では、方法は、コンカテマーを含む前記複数の増幅産生物をシーケンシングするステップをさらに含む。一部の実施形態では、前記シーケンシングするステップが、前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを有するコンカテマーを、前記標的ポリヌクレオチドの２つ未満のコピーを含むコンカテマーから選択的に分離することなく実施される。
一部の実施形態では、方法は、前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを含むコンカテマーを、前記標的ポリヌクレオチドの２つ未満のコピーを含むコンカテマーから分離するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを含む前記コンカテマーをシーケンシングするステップをさらに含む。
参照による組み込み
本明細書に述べる全ての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれの個別の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれると具体的にかつ個別に示されるのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の新規な特徴を、特に添付した特許請求の範囲において説明する。本発明の原理を用いた実例的な実施形態を説明する以下の詳細な説明および付随する図面（図）を参照することによって、本発明の特徴および利点をより良く理解することができる。
図１は、１つの実施形態による、ステムループ産生物の形成を説明する図である。
図２は、１つの実施形態による、ＲＣＡ増幅のための隣接する５’末端を有するフォワードおよびリバースプライマーを設計するバックツーバック（Ｂ２Ｂ）プライマー設計を説明する図である。
図３は、１つの実施形態による、バックツーバックプライマーを用いるシーケンシングライブラリーを構築する方法を説明する図である。
図４は、１つの実施形態による、アプリコンを富化する方法を説明する図である。
図５は、１サイクルのローリングサークル増幅および複数サイクルのローリングサークル増幅によって生成された増幅産生物のアガロースゲルによるサイズ分布を示す図である。
図６は、異なるリピート数を有する増幅産生物の間の比を示す表を提示する図である。
図７は、１サイクルおよび複数サイクルを含む例示的なローリングサークル増幅反応における個別のリピート要素のサイズ分布を示す図である。
図８は、１サイクルのローリングサークル増幅および複数サイクルのローリングサークル増幅によって生成された、シーケンシングされた標的の断片サイズ分布を示す図である。
図９は、１つの実施形態による、ＨＤ６６４、即ちＥＬＭ４／ＡＬＫ融合ＤＮＡ試料と野生型参照ＤＮＡ試料とを異なる比で混合するステップを説明する表を提示する図である。
図１０は、１つの実施形態における融合アレルの検出を説明する図である。
図１１は、１つの実施形態において、多重標的ポリヌクレオチド配列が多重反応で検出可能であることを示す図である。
本明細書に開示するいくつかの方法の実施は、他に指示がない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組み換えＤＮＡの従来の技法を利用しており、これらは当技術の範囲内である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋおよびＧｒｅｅｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、４版（２０１２年）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙシリーズ（Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）、ＰＣＲ ２： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｍ．Ｊ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５年））；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９８８年） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；ならびにＣｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、６版（Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（２０１０年））を参照されたい。
「約」または「ほぼ」という用語は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し、これは部分的にその値がどのようにして測定されたか、または決定されたか、即ち測定系の限界に依存することになる。例えば、「約」は当技術における慣習によって標準偏差の１倍または１倍より多い範囲内を意味し得る。その代わりに、「約」は所与の値の２０％まで、１０％まで、５％まで、または１％までの範囲を意味してもよい。その代わりに、特に生物学的システムまたはプロセスに関しては、この用語はある値と同じ桁内、その値の好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味してもよい。出願および特許請求の範囲に特定の値が記載されている場合には、他に言明しない限り、特定の値についての許容される誤差範囲内を意味する「約」という用語を仮定すべきである。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は相互変換可能に用いられる。これらはデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体であろうと、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味する。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有することができ、公知または未知の任意の機能を果たし得る。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である。遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、リンケージ解析によって定義される座位（単数または複数）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドはメチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体等の１つまたは複数の改変ヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合には、ヌクレオチド構造の改変はポリマーのアセンブリーの前または後に行ってよい。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは標識成分とのコンジュゲーション等によって重合の後にさらに改変されてもよい。
「標的ポリヌクレオチド」という用語は、その存在、量、および／もしくはヌクレオチド配列、またはこれらの１つまたは複数における変化を決定することが望まれる標的配列を有する、核酸分子の出発母集団中の核酸分子またはポリヌクレオチドを意味する。標的ポリヌクレオチドはより大きなポリヌクレオチドの一部（例えば増幅すべき、シーケンシングすべき、さもなければ分析すべき一部）であってもよく、標的配列を含むより大きなポリヌクレオチドを意味するために用いてもよい。一般に、「標的配列」という用語は核酸の一本鎖の上の核酸配列を意味する。標的配列は遺伝子、調節配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、融合遺伝子、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡを含むＲＮＡ、またはその他の一部であってよい。標的配列は試料からの標的配列、または増幅反応の産生物等の二次標的であってよい。
一般に、「配列バリアント」という用語は、１つまたは複数の参照配列に関する任意の配列の多様性を意味する。典型的には、配列バリアントは参照配列が公知の個体の所与の母集団に関する参照配列よりも低い頻度で発生する。ある場合には、参照配列は単一の個体のゲノム配列等の、単一の公知の参照配列である。ある場合には、参照配列は、参照母集団として役立つ多数の個体のゲノム配列等の多数の公知の配列、または同じ個体からのポリヌクレオチドの多数のシーケンシングリードをアライメントさせることによって形成されるコンセンサス配列である。ある場合には、配列バリアントは母集団の中で低い頻度で起こる（「稀な」配列バリアントとも称される）。例えば、配列バリアントは約５％もしくは約５％未満、約４％もしくは約４％未満、約３％もしくは約３％未満、約２％もしくは約２％未満、約１．５％もしくは約１．５％未満、約１％もしくは約１％未満、約０．７５％もしくは約０．７５％未満、約０．５％もしくは約０．５％未満、約０．２５％もしくは約０．２５％未満、約０．１％もしくは約０．１％未満、約０．０７５％もしくは約０．０７５％未満、約０．０５％もしくは約０．０５％未満、約０．０４％もしくは約０．０４％未満、約０．０３％もしくは約０．０３％未満、約０．０２％もしくは約０．０２％未満、約０．０１％もしくは約０．０１％未満、約０．００５％もしくは約０．００５％未満、約０．００１％もしくは約０．００１％未満、またはそれより低い頻度で起こり得る。ある場合には、配列バリアントは約０．１％または約０．１％未満の頻度で起こる。配列バリアントは参照配列に関する任意の多様性であってよい。配列多様性は単一のヌクレオチドまたは複数のヌクレオチド（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多いヌクレオチド）の挿入または欠失の変化からなってよい。配列バリアントが２つまたはそれより多いヌクレオチドの相違を含む場合には、異なるヌクレオチドは互いに連続していてもよく、不連続であってもよい。配列バリアントの種類の非限定的な例には、単一ヌクレオチド変異多型（ＳＮＰ）、欠失／挿入多型（ＤＩＰ）、コピー数バリアント（ＣＮＶ）、短タンデムリピート（ＳＴＲ）、単純配列リピート（ＳＳＲ）様々な数のタンデムリピート（ＶＮＴＲ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、レトロトランスポゾンに基づく挿入多型、配列特異的増幅多型、および配列バリアントとして検出可能なエピジェネティックマークの相違（例えばメチル化の相違）が含まれる。ある実施形態では、配列バリアントは染色体再配列を意味し得、これには、これだけに限らないが、トランスロケーションまたは融合遺伝子が含まれる。
本明細書において用いる「コンカテマー」という用語は一般に、標的ポリヌクレオチド配列の複数コピー（例えば標的配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０コピー、ある場合には少なくとも２コピー）を含む連続ポリヌクレオチドを含むライゲーション産生物または増幅産生物を意味する。ある場合には、コンカテマーはタンデムに連結された標的ポリヌクレオチド配列の複数コピーを含む。ある場合には、追加のポリヌクレオチド配列が標的ポリヌクレオチド配列の複数コピーの間に散在している。
本明細書において用いる「ハイブリダイズ」、「ハイブリダイゼーション」、ハイブリダイジング」、「アニール」、および「アニーリング」という用語は一般に、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基の間の水素結合によって安定化された複合体を形成する反応を意味する。水素結合はワトソンクリック塩基対形成、フーグスタイン結合、または他の任意の配列特異的な様式によって起こり得る。複合体はデュプレックス構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３つもしくはそれより多い鎖、単一の自己ハイブリダイジング鎖、またはこれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応はＰＣＲの開始またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素切断等のより広範囲のプロセスにおけるステップを構成し得る。第２の配列のヌクレオチド残基の塩基との水素結合によって安定化され得る第１の配列は、第２の配列に「ハイブリダイズ可能」と称される。そのような場合には、第２の配列は第１の配列にハイブリダイズ可能とも称され得る。
本明細書において用いる「相補体」（単数または複数）、「相補的」、および「相補性」という用語は一般に、所与の配列に完全に相補的かつハイブリダイズ可能な配列を意味する。ある場合には、所与の核酸とハイブリダイズした配列は、その所与の領域にわたる塩基の配列がその結合相手の塩基の配列と相補的に結合することができ、それにより例えばＡ−Ｔ、Ａ−Ｕ、Ｇ−Ｃ、およびＧ−Ｕ塩基対が形成される場合には、所与の分子の「相補体」または「逆相補体」と称される。一般に、第２の配列にハイブリダイズ可能な第１の配列は第２の配列に特異的にまたは選択的にハイブリダイズ可能であり、したがってハイブリダイゼーション反応の間、第２の配列または第２の配列の組に対するハイブリダイゼーションは、非標的配列とのハイブリダイゼーションに優先する（例えば当技術で広く用いられている厳しい条件等の所与の条件の組において熱力学的により安定である）。典型的には、ハイブリダイズ可能な配列は、それらの個別の長さの全部または一部にわたって配列相補性の程度、例えば２５％〜１００％の相補性、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％を含む配列相補性を共有している。相補性百分率を評価する目的等のための配列同一性は、これだけに限らないが、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（例えばｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌで入手可能で任意選択によりデフォルトセッティングを伴うＥＭＢＯＳＳニードルアライナーを参照されたい）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えばｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉで入手可能で任意選択によりデフォルトセッティングを伴うＢＬＡＳＴアラインメントツールを参照されたい）、またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えばｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌで入手可能で任意選択によりデフォルトセッティングを伴うＥＭＢＯＳＳウォーターアライナーを参照されたい）を含む任意の好適なアラインメントアルゴリズムによって測定することができる。最適のアラインメントはデフォルトパラメーターを含む選択されたアルゴリズムの任意の好適なパラメーターを用いて評価することができる。
本明細書において用いる「延長産生物」という用語は一般に、ヌクレオチドプライマーがヌクレオチドの共有結合付加によって延長される反応の産生物を意味する。ある場合には、ヌクレオチドの組み込みは鋳型によってガイドすることができる。ある場合には、ヌクレオチドの組み込みは鋳型なして起こることもある。ある場合には、延長産生物はＰＣＲ増幅、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、または等温増幅等の増幅産生物である。
本明細書において用いる「増幅する」、「増幅された」、「増幅」という用語は一般に、標的ポリヌクレオチドまたはその一部から１つまたは複数のコピーが作られる任意のプロセスを意味する。ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を増幅する種々の方法が利用可能であり、そのいくつかの例を本明細書に記載する。増幅は線形もしくは指数関数的であってよく、または多相増幅プロセス中に直線相と指数相の両方を含んでもよい。増幅法には熱変性ステップ等の温度の変化が含まれてよく、または熱変性を必要としない等温プロセスであってもよい。
本明細書において用いる「ステムループ産生物」および「ステムループ構造」という用語は一般に、ポリヌクレオチドの部分の間で分子内ハイブリダイゼーションが起こるポリヌクレオチドの二次構造を意味する。ステムループは単一のポリヌクレオチド鎖の２つの領域がハイブリダイズして、「ステム」と称される二本鎖部分と、対を形成せず「ループ」と称される一本鎖ループを形成する際に形成され得る。ステムは塩基対の任意の様々な長さであってよく、ステムに沿った塩基対は、ステムに関与する一方または両方の部分で１つまたは複数の対になっていない塩基のギャップによって内部で中断されてもよい。ループは対になっていない塩基の任意の様々な長さであってよい。ある場合には、ループは少なくとも３塩基の長さである。ある場合には、「ステム」を形成する２つの領域は完全に相補的である。ある場合には、「ステム」を形成する２つの領域は部分的に相補的である。ある場合には、単一のポリヌクレオチドが１つのステムループ構造を含んでよい。ある場合には、単一のポリヌクレオチドが１つより多いステムループ構造を含んでよい。ステムループ構造のステム部分は、オーバーハングを伴わず、５’オーバーハングを含む一本鎖セクションを伴い、３’オーバーハングを含む一本鎖セクションを伴い、または５’末端および３’末端の両方から延びる一本鎖部分を伴って、二重鎖セクションとして終端してよい。
本開示は、標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを含むアンプリコンを生成するために用いられ得る方法および組成物を提供する。一部の実施形態では、本方法は稀な配列バリアントおよび融合遺伝子を検出するために有用である。一部の実施形態では、遺伝子融合はパートナー遺伝子の予備知識なしに検出され、無細胞ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ試料等の中での遺伝子再配列事象をスクリーニングするために適用することができる。本開示の種々の態様は、大量並列シーケンシング法とともに用いられ得る標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを含むアンプリコンを提供する。
一態様では、本開示は、ローリングサークル増幅によって生成された標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを有するコンカテマーの割合を増大させる方法を提供する。この方法は、（ａ）標的ポリヌクレオチドを含む環状ポリヌクレオチドを準備するステップ、（ｂ）増幅反応混合物を複数サイクルのローリングサークル増幅に供してコンカテマーを含む複数の増幅産生物を生成するステップを含む。増幅反応混合物は、（ｉ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ、（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドを含む環状ポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）プライマーを含み得る。複数サイクルのローリングサークル増幅の各サイクルは、変性温度における変性、アニーリング温度におけるプライマーアニーリング、および所与の伸長時間にわたる伸長温度におけるプライマーの伸長を含み得る。複数サイクルのローリングサークル増幅は、標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを有するコンカテマーの増大した割合を有する複数の増幅産生物を生成し得る。生成した複数の増幅産生物は、変性およびプライマーアニーリングについて同等の条件下であるが複数サイクルの伸長時間の合計と同等の伸長時間である１サイクルの増幅を用いることによって生成する複数の増幅産生物と比較した場合に、より高い割合で標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを有するコンカテマーを含むことで特徴付けられ得る。
ローリングサークル増幅は、鎖置換活性を有するポリメラーゼ、例えば鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって促進することができる。本方法において有用な種々のポリメラーゼが入手可能であり、その非限定的な例には、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ大断片；ＢｓｕＤＮＡポリメラーゼ大断片；Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ；Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲ（商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ；Ｋｌｅｎｏｗ断片（３’−５’エキソ）；ＤＮＡポリメラーゼＩ大断片；Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素；ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ；ＰｙｒｏＰｈａｇｅ３１７３ポリメラーゼ；ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；およびＶｅｎｔＲ（登録商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。
ローリングサークル増幅を実施するための増幅反応混合物は、これだけに限らないが、鋳型（例えば環状ポリヌクレオチド）、１つまたは複数のプライマー、ｄＮＴＰ、および緩衝成分を含む、プライマー延長反応のために必要な試薬を含んでよい。増幅の１サイクルは（ｉ）二本鎖鋳型が一本鎖ポリヌクレオチドに変換される変性温度における変性、（ｉｉ）プライマーが一本鎖ポリヌクレオチドにハイブリダイズするアニーリング温度におけるプライマーアニーリング、および（ｉｉｉ）一本鎖ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたプライマーを一本鎖ポリヌクレオチドを鋳型として用いて延長させる所与の伸長時間の間の伸長温度におけるプライマー伸長が含まれ得る。鎖置換性ポリメラーゼはＲＣＡにおいて特に有用である。それは、置換によってポリメラーゼが環状鋳型の周囲で１回より多く連続して環状鋳型に相補的な配列のコンカテマーのタンデムコピーを生成することが可能になるからである。環状ポリヌクレオチドを鋳型として用いることによってプライマー延長を鋳型上で連続させることができ、それにより環状ポリヌクレオチド配列の複数コピーを含む増幅産生物（例えばコンカテマー）を生成することができる。一部の実施形態では、増幅反応混合物を複数サイクルのローリングサークル増幅に供することによって、複数の増幅産生物が生成される。
一部の実施形態では、複数サイクルは少なくとも２サイクル（例えば少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０サイクル）を含む。複数サイクルＲＣＡにより、環状鋳型から複数の直鎖状コンカテマーの形成をもたらすことができる。変性の間に、環状鋳型からの第１のコンカテマーの延長が停止する。プライマーの結合と延長を繰り返すことによって、環状鋳型から複数のコンカテマーを複数サイクルにわたって生成することができる。一部の実施形態では、３つの温度相、即ち変性のための第１の温度相、プライマー結合のための第２の温度相、およびプライマー延長のための第３の温度相が用いられる。一部の実施形態では、プライマー延長の間のプライマー結合を最小化するために、プライマー結合のためより高いプライマー延長のための温度が選択される。プライマー延長の間のプライマー結合を最小化することによってより短い増幅産生物の形成を減少させることができ、短い断片の偏った増幅を低減させることができる。それは、増幅反応混合物中に含まれる逆プライマーの場合のように、増幅産生物が形成されるとともにプライマーが増幅産生物にハイブリダイズする可能性が低くなるからである。増幅産生物が形成されるとともに増幅産生物にハイブリダイズしたプライマーはプライマー延長に関与することもできるが、小断片の優先的な増幅をもたらす可能性がある。それは、延長の間に小さな環は所与の時間内に大きな断片よりも多くの繰り返し単位のコピーおよび多くのプライマー結合部位を生成する傾向があるからである。一部の実施形態では、プライマー延長のために選択される温度は、プライマーアニーリングのために選択される温度よりも少なくとも５℃（例えば少なくとも６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃またはそれより大きい）高くてもよい。プライマー延長のために選択される温度は、プライマーアニーリングのために選択される温度よりも約１℃〜２０℃高く（例えば約２℃〜１８℃、約４℃〜１５℃、または約５℃〜１０℃高く）てよい。非等温ＲＣＡのために好適な温度の範囲は用いるポリメラーゼ酵素の特性に依存し得る。
複数サイクルの各サイクルは、少なくとも約７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃または９５℃の変性温度における変性を含み得る。複数サイクルの各サイクルの各サイクルは、約７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃または９５℃の変性温度における変性を含み得る。複数サイクルの各サイクルは、最大で約７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃または９５℃の変性温度における変性を含み得る。複数サイクルの各サイクルは、約７０℃〜約１００℃、約７０℃〜約９５℃、約７０℃〜約９０℃、約７０℃〜約８５℃、約７０℃〜約８０℃または約７０℃〜約７５℃の変性温度における変性を含み得る。複数サイクルの各サイクルは、約７０℃〜約１００℃、約７５℃〜約１００℃、約８０℃〜約１００℃、約８５℃〜約１００℃、約９０℃〜約１００℃または約９５℃〜約１００℃の変性温度における変性を含み得る。複数サイクルの各サイクルは、少なくとも約５秒、１０秒、１５秒、２０秒、２５秒、３０秒、３５秒、４０秒、４５秒、５０秒、５５秒または６０秒にわたる変性温度における変性を含み得る。複数サイクルの各サイクルは、約５秒、１０秒、１５秒、２０秒、２５秒、３０秒、３５秒、４０秒、４５秒、５０秒、５５秒または６０秒にわたる変性温度における変性を含み得る。複数サイクルの各サイクルは、最大で約５秒、１０秒、１５秒、２０秒、２５秒、３０秒、３５秒、４０秒、４５秒、５０秒、５５秒または６０秒にわたる変性温度における変性を含み得る。複数サイクルの各サイクルは、約５秒〜６０秒、５秒〜５５秒、５秒〜５０秒、５秒〜４５秒、５秒〜４０秒、５秒〜３５秒、５秒〜３０秒、５秒〜２５秒、５秒〜２０秒、５秒〜１５秒または５秒〜１０秒にわたる変性温度における変性を含み得る。複数サイクルの各サイクルは、約５秒〜６０秒、１０秒〜６０秒、１５秒〜６０秒、２０秒〜６０秒、２５秒〜６０秒、３０秒〜６０秒、３５秒〜６０秒、４０秒〜６０秒、４５秒〜６０秒、５０秒〜６０秒または５５秒〜６０秒にわたる変性温度における変性を含み得る。
複数サイクルの各サイクルは、少なくとも約４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃または６５℃のアニーリング温度におけるプライマーアニーリングを含み得る。複数サイクルの各サイクルは、約４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃または６５℃のアニーリング温度におけるプライマーアニーリングを含み得る。複数サイクルの各サイクルは、最大で約４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃または６５℃のアニーリング温度におけるプライマーアニーリングを含み得る。複数サイクルの各サイクルは、約４５℃〜約６５℃、約４５℃〜約６０℃、約４５℃〜約５５℃または約４５℃〜約５０℃のアニーリング温度におけるプライマーアニーリングを含み得る。複数サイクルの各サイクルは、約４５℃〜約６５℃、約５０℃〜約６５℃、約５５℃〜約６５℃または約６０℃〜約６５℃のアニーリング温度におけるプライマーアニーリングを含み得る。複数サイクルの各サイクルは、少なくとも約５秒、１０秒、１５秒、２０秒、２５秒、３０秒、３５秒、４０秒、４５秒、５０秒、５５秒または６０秒にわたるアニーリング温度におけるプライマーアニーリングを含み得る。複数サイクルの各サイクルは、約５秒、１０秒、１５秒、２０秒、２５秒、３０秒、３５秒、４０秒、４５秒、５０秒、５５秒または６０秒にわたるアニーリング温度におけるプライマーアニーリングを含み得る。複数サイクルの各サイクルは、最大で約５秒、１０秒、１５秒、２０秒、２５秒、３０秒、３５秒、４０秒、４５秒、５０秒、５５秒または６０秒にわたるアニーリング温度におけるプライマーアニーリングを含み得る。複数サイクルの各サイクルは、約５秒〜６０秒、５秒〜５５秒、５秒〜５０秒、５秒〜４５秒、５秒〜４０秒、５秒〜３５秒、５秒〜３０秒、５秒〜２５秒、５秒〜２０秒、５秒〜１５秒または５秒〜１０秒にわたるアニーリング温度におけるプライマーアニーリングを含み得る。複数サイクルの各サイクルは、約５秒〜６０秒、１０秒〜６０秒、１５秒〜６０秒、２０秒〜６０秒、２５秒〜６０秒、３０秒〜６０秒、３５秒〜６０秒、４０秒〜６０秒、４５秒〜６０秒、５０秒〜６０秒または５５秒〜６０秒にわたるアニーリング温度におけるプライマーアニーリングを含み得る。
複数サイクルの各サイクルは、少なくとも約６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃または７５℃の伸長温度におけるプライマー伸長を含み得る。複数サイクルの各サイクルは、約６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃または７５℃の伸長温度におけるプライマー伸長を含み得る。複数サイクルの各サイクルは、最大で約６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃または７５℃の伸長温度におけるプライマー伸長を含み得る。複数サイクルの各サイクルは、約６５℃〜約７５℃または約６５℃〜約７０℃の伸長温度におけるプライマー伸長を含み得る。複数サイクルの各サイクルは、約６５℃〜約７５℃または約７０℃〜約７５℃の伸長温度におけるプライマー伸長を含み得る。複数サイクルの各サイクルは、少なくとも約３０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分または１０分の伸長時間にわたる伸長温度におけるプライマー伸長を含み得る。複数サイクルの各サイクルは、約３０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分または１０分の伸長時間にわたる伸長温度におけるプライマー伸長を含み得る。複数サイクルの各サイクルは、最大で約３０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分または１０分の伸長時間にわたる伸長温度におけるプライマー伸長を含み得る。複数サイクルの各サイクルは、約３０秒〜１０分、３０秒〜９分、３０秒〜８分、３０秒〜７分、３０秒〜６分、３０秒〜５分、３０秒〜４分、３０秒〜３分、３０秒〜２分または３０秒〜１分の伸長時間にわたる伸長温度におけるプライマー伸長を含み得る。複数サイクルの各サイクルは、約３０秒〜１０分、１分〜１０分、２分〜１０分、３分〜１０分、４分〜１０分、５分〜１０分、６分〜１０分、７分〜１０分、８分〜１０分または９分〜１０分の伸長時間にわたる伸長温度におけるプライマー伸長を含み得る。増幅産生物の収率を最適化するために伸長時間の長さを選択することができる。伸長時間を選択する際に考慮するいくつかの要素として、これだけに限らないが、環状ポリヌクレオチド（例えば環状鋳型）のサイズ、環状ポリヌクレオチド配列のＧＣ含量、および増幅産生物中の二次構造の形成が含まれる。例えば、増幅産生物の同様の収率を得るために、より長い環状ポリヌクレオチドは、より短い環状ポリヌクレオチドと比較してより長い伸長時間を用いてよい。さらなる例として、増幅産生物の同様の収率を得るために、より高いＧＣ含量を有する環状ポリヌクレオチドは、ＧＣ含量がより低いが同等の長さを有する環状ポリヌクレオチドと比較して、より長い伸長時間を用いてよい。
一部の実施形態では、複数サイクルの各サイクルは、約５秒〜約６０秒にわたる約７５℃〜約９５℃の変性温度における変性、（ｉｉ）約５秒〜約６０秒にわたる約４５℃〜約６５℃のアニーリング温度におけるプライマーアニーリング、および（ｉｉｉ）約３０秒〜約１０分の伸長時間にわたる約６５℃〜約７５℃の伸長温度におけるプライマー伸長を含む。一部の実施形態では、複数サイクルの各サイクルは、約１５秒〜約３０秒にわたる約８０℃の変性温度における変性、（ｉｉ）約１５秒〜約４５秒にわたる約５０℃のアニーリング温度におけるプライマーアニーリング、および（ｉｉｉ）約３分〜約１０分の伸長時間にわたる約７０℃の伸長温度におけるプライマー伸長を含む。一部の実施形態では、複数サイクルの各サイクルは、約２０秒にわたる約８０℃の変性温度における変性、（ｉｉ）約３０秒にわたる約５０℃のアニーリング温度におけるプライマーアニーリング、および（ｉｉｉ）約６分の伸長時間にわたる約７０℃の伸長温度におけるプライマー伸長を含む。
一部の実施形態では、ローリングサークル増幅の複数サイクルの任意のサイクルにおいて反応混合物にポリメラーゼが補充される。一部の実施形態では、ローリングサークル増幅の複数サイクルの少なくとも２つのサイクルにおいて反応混合物にポリメラーゼが補充される。ある場合にはポリメラーゼ活性の熱不活性化により、増幅反応混合物への補充が望ましいことがある。いくつかのポリメラーゼは高温で熱不活性化される。熱不活性化の温度は用いるポリメラーゼに依存し得る。増幅のために選択したポリメラーゼならびに変性温度、プライマーアニーリング温度、およびプライマー延長温度のうちのいずれか１つのために選択した温度に依存して、ポリメラーゼは任意選択で、増幅の少なくとも１つのサイクルの後で補充され得る。一部の実施形態では、１サイクルおき後に反応混合物にポリメラーゼが補充される。種々の実施形態では、例えば増幅産生物の収率によって必要であると決定されたなら、反応混合物にポリメラーゼが補充される。
一部の実施形態では、本明細書に開示した方法を用いて生成した複数の増幅産生物は、これらが変性およびプライマーアニーリングについて同等の条件下であるが複数サイクルの伸長時間の合計と同等の伸長時間である１サイクルの増幅を用いて生成する複数の増幅産生物と比較した場合に、より高い割合で標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピー（例えば少なくとも３つ、４つ、または５つのコピー）を有するコンカテマーを含むことで特徴付けられる。
より少ない標的ポリヌクレオチドのコピーを有する増幅産生物と比較してより多い標的ポリヌクレオチドのコピーを有するコンカテマーまたは増幅産生物は、より大きな断片サイズを有し得る。増幅産生物またはコンカテマー中の標的ポリヌクレオチドのコピー数の決定は種々の方法、例えばアガロースゲルによる分析、サイズ排除クロマトグラフィー、または次世代シーケンシングを用いて確認することができる。本明細書に開示する複数サイクルのローリングサークル増幅を含む方法を用いて生成したコンカテマーまたは増幅産生物は、任意の好適な方法（例えばアガロースゲル、サイズ排除クロマトグラフィー、または次世代シーケンシング）によって確認されるように、１サイクルを含むローリングサークル増幅と比較して、標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを有するコンカテマーの割合が増加し得る。標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを有するコンカテマーの割合は、一部の実施形態においては、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２５％、または５０％増加している。
一部の実施形態では、複数の増幅産生物は、少なくとも約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０塩基対の平均断片長を呈する。一部の実施形態では、複数の増幅産生物は、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０塩基対の平均断片長を呈する。一部の実施形態では、複数の増幅産生物は、最大で約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０塩基対の平均断片長を呈する。一部の実施形態では、複数の増幅産生物は、約１５０塩基対の平均断片長を呈する。一部の実施形態では、複数の増幅産生物は、約１６０塩基対の平均断片長を呈する。一部の実施形態では、複数の増幅産生物は、約１７０塩基対の平均断片長を呈する。一部の実施形態では、複数の増幅産生物は、約１８０塩基対の平均断片長を呈する。一部の実施形態では、複数の増幅産生物は、約１９０塩基対の平均断片長を呈する。一部の実施形態では、複数の増幅産生物は、約２００塩基対の平均断片長を呈する。
一部の実施形態では、複数の増幅産生物は、少なくとも約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０塩基対の断片長中央値を呈する。一部の実施形態では、複数の増幅産生物は、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０塩基対の断片長中央値を呈する。一部の実施形態では、複数の増幅産生物は、最大で約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０塩基対の断片長中央値を呈する。一部の実施形態では、複数の増幅産生物は、約１５０塩基対の断片長中央値を呈する。一部の実施形態では、複数の増幅産生物は、約１６０塩基対の断片長中央値を呈する。一部の実施形態では、複数の増幅産生物は、約１７０塩基対の断片長中央値を呈する。一部の実施形態では、複数の増幅産生物は、約１８０塩基対の断片長中央値を呈する。一部の実施形態では、複数の増幅産生物は、約１９０塩基対の断片長中央値を呈する。一部の実施形態では、複数の増幅産生物は、約２００塩基対の断片長中央値を呈する。
一部の実施形態では、無細胞ポリヌクレオチド、例えば無細胞ＤＮＡの分析が望ましい。本明細書において他の箇所でさらに述べるように、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は循環腫瘍ＤＮＡまたは循環胎児ＤＮＡであり得る。無細胞ポリヌクレオチドは、ある場合には無細胞ＲＮＡを含み得る。無細胞ＤＮＡは、例えばリガーゼ等の酵素を用いるライゲーションによって環状化し、本方法によって増幅することができる。一部の実施形態では、反応混合物において利用される環状ポリヌクレオチドがｃｆＤＮＡを含む場合、複数の増幅産生物は、約４０塩基〜約４５０塩基、４０塩基〜約４００塩基、４０塩基〜約３５０塩基、４０塩基〜約３００塩基、４０塩基〜約２５０塩基、４０塩基〜約２００塩基、４０塩基〜約１５０塩基、４０塩基〜約１００塩基または４０塩基〜約５０塩基の断片長の分布を呈する。一部の実施形態では、反応混合物において利用される環状ポリヌクレオチドがｃｆＤＮＡを含む場合、複数の増幅産生物は、約４０塩基〜約４５０塩基、５０塩基〜約４５０塩基、１００塩基〜約４５０塩基、１５０塩基〜約４５０塩基、２００塩基〜約４５０塩基、２５０塩基〜約４５０塩基、３００塩基〜約４５０塩基、３５０塩基〜約４５０塩基または４００塩基〜約４５０塩基の断片長の分布を呈する。一部の実施形態では、反応混合物において利用される環状ポリヌクレオチドがｃｆＤＮＡを含む場合、複数の増幅産生物は、約１００塩基〜約２００塩基、１１０塩基〜約２００塩基、１２０塩基〜約２００塩基、１３０塩基〜約２００塩基、１４０塩基〜約２００塩基、１５０塩基〜約２００塩基、１６０塩基〜約２００塩基、１７０塩基〜約２００塩基、１８０塩基〜約２００塩基または１９０塩基〜約２００塩基の断片長の分布を呈する。一部の実施形態では、反応混合物において利用される環状ポリヌクレオチドがｃｆＤＮＡを含む場合、複数の増幅産生物は、約１００塩基〜約２００塩基、１００塩基〜約１９０塩基、１００塩基〜約１８０塩基、１００塩基〜約１７０塩基、１００塩基〜約１６０塩基、１００塩基〜約１５０塩基、１００塩基〜約１４０塩基、１００塩基〜約１３０塩基、１００塩基〜約１２０塩基または１００塩基〜約１１０塩基の断片長の分布を呈する。
一部の実施形態では、増幅反応混合物中のプライマーはランダム配列を含む。一部の実施形態では、増幅反応混合物中のプライマーは遺伝子特異的配列を含む。一部の実施形態では、プライマーは複数遺伝子（例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０遺伝子）の遺伝子特異的配列を含む。一部の実施形態では、プライマーは、（ｉ）配列相補性によって環状ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端、および（ｉｉ）配列相補性によって標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列を含む第１の５’末端を含む第１のプライマーを含む。環状ポリヌクレオチドを鋳型として用いる第１のプライマーの延長による複数サイクルのローリングサークル増幅の間に一本鎖ポリヌクレオチドを含むコンカテマーを生成することができる。プライマーは、（ｉ）配列相補性によって一本鎖ポリヌクレオチドを含むコンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端、および（ｉｉ）配列相補性によってコンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列を含む第２の５’末端を含む第２のプライマーを含み得る。コンカテマーを鋳型として用いる第２のプライマーの延長による複数サイクルのローリングサークル増幅の間に標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数のコピーを含む複数の延長産生物を生成することができる。このような第１のプライマーと第２のプライマーを用いる増幅を実施する方法は、本明細書でさらに説明するように、標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーのコンカテマーを含むアンプリコンを富化するために用いることができる。
一態様では、本開示は、標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーのコンカテマーを含むアンプリコンを富化する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、（ａ）第１のプライマーの延長によって環状標的ポリヌクレオチドから一本鎖ポリヌクレオチドを含むコンカテマーを生成するステップであって、前記第１のプライマーが、配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端と、配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列を含む第１の５’末端とを含むステップと、（ｂ）配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端と、配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列を含む第２の５’末端とを含む第２のプライマーの延長によって前記標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数のコピーを含む複数の延長産生物を生成するステップであって、前記第１の共通配列および前記第２の共通配列が、それぞれ５’末端に少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、最適にアライメントした場合に少なくとも９０％同一であるステップと、（ｃ）複数のアンプリコンを生成する条件下でステップ（ｂ）の前記複数の延長産生物を増幅するステップであって、前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーを含むアンプリコンが富化されるステップとを含む。
一部の実施形態では、環状標的ポリヌクレオチドから一本鎖ポリヌクレオチドを含むコンカテマーを生成するステップは、第１のプライマーの延長を含む。プライマー延長は、これだけに限らないが、熱サイクル反応および等温反応を含む増幅反応によって実現することができる。一部の実施形態では、熱サイクル反応には例えば変性、プライマー結合、およびプライマー延長のいくつかのサイクルが含まれる。一部の実施形態では、本方法のコンカテマーを生成するステップはポリメラーゼによって達成される。本方法において有用な種々のポリメラーゼが入手可能であり、その非制限的な例を本明細書に提供する。一部の実施形態では、コンカテマーの生成を達成させるためのポリメラーゼは鎖置換活性を有する。一部の実施形態では、環状標的ポリヌクレオチドから一本鎖ポリヌクレオチドを含むコンカテマーを生成するステップは、等温ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含む。鎖置換性ポリメラーゼはＲＣＡにおいて特に有用である。それは、置換によってポリメラーゼが環状鋳型の周囲で１回より多く連続して環状鋳型に相補的な配列のコンカテマーのタンデムコピーを生成することが可能になるからである。一部の実施形態では、一本鎖ポリヌクレオチドを含むコンカテマーを生成するステップは非等温ＲＣＡを含む。非等温ＲＣＡは少なくとも２つの温度相（例えば少なくとも２、３、４、またはそれより多い温度相）の少なくとも２つのサイクル（例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多いサイクル）を含み得る。例えば、第１の温度相はプライマーの結合および延長に好適であり、第２の温度相は二本鎖ポリヌクレオチドの変性に好適であり得る。一部の実施形態では、非等温ＲＣＡは少なくとも２つの温度相の２〜３５サイクル（例えば３〜３０、４〜２０、５〜１５、または６〜１０サイクル）を含む。非等温ＲＣＡの間の二本鎖ポリヌクレオチドの変性に好適な第２の温度相を含む温度相を通してのサイクリングにより、環状鋳型から複数の直鎖状コンカテマーの形成をもたらすことができる。変性の間に、環状鋳型からの第１のコンカテマーの延長が停止する。プライマーの結合と延長を繰り返すことによって、環状鋳型から複数のコンカテマーを数回のサイクルにわたって生成することができる。一部の実施形態では、３つの温度相、即ちプライマーアニーリングのための第１の温度相、プライマー延長のための第２の温度相、および二本鎖ポリヌクレオチドを変性させるための第３の温度相が用いられる。一部の実施形態では、プライマー延長の間のプライマー結合を最小化するために、プライマー結合のためより高いプライマー延長のための温度が選択される。プライマー延長の間のプライマー結合を最小化することによってより短い増幅産生物の形成を減少させることができ、短い断片の偏った増幅を低減させることができる。それは、ＲＣＡ反応混合物中に含まれる逆プライマーの場合のように、増幅産生物が形成されるとともにプライマーが増幅産生物にハイブリダイズする可能性が低いからである。増幅産生物が形成されるとともに増幅産生物にハイブリダイズしたプライマーはプライマー延長に関与することもできるが、小断片の優先的な増幅をもたらす可能性がある。それは、延長の間に小さな環は所与の時間内に大きな断片よりも多くの繰り返し単位のコピーおよび多くのプライマー結合部位を生成する傾向があるからである。一部の実施形態では、プライマー延長のために選択される温度は、プライマーアニーリングのために選択される温度よりも少なくとも５℃（例えば少なくとも６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃またはそれより大きい）高い。プライマー延長のために選択される温度は、プライマーアニーリングのために選択される温度よりも約１℃〜２０℃高く（例えば約２℃〜１８℃、約４℃〜１５℃、または約５℃〜１０℃高く）てよい。一部の実施形態では、非等温ＲＣＡは第４の温度相を含んでよい。第４の温度相は、例えば延長産生物中に二次構造を形成させ、例えばステムループ構造を形成させるために好適であってよい。非等温ＲＣＡのために好適な温度の範囲は用いるポリメラーゼ酵素の特性に依存し得る。
一部の実施形態では、ＲＣＡ（等温または非等温）は環状鋳型に沿ったプライマー延長によって産生される直鎖状コンカテマーに沿った逆プライマーの延長等の、直鎖状鋳型に沿ったプライマー延長反応を含み得る。例えば、第２のプライマーは第１のプライマーの延長産生物として生成された直鎖状コンカテマー鋳型を含む鋳型にハイブリダイズすることができ、プライマー延長相の間の第２のプライマーのプライマー延長によって直鎖状二本鎖ポリヌクレオチドが生成され得、その鎖は第１および第２のプライマーの追加的なコピーによる延長のための鋳型としてさらに役立ち得る。
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数のコピーを含む複数の延長産生物を生成するステップは、第１のプライマーの延長産生物として生成した直鎖状コンカテマー鋳型にハイブリダイズした第２のプライマーの延長を含む。一部の実施形態では、複数の延長産生物は非等温ＲＣＡの間の環状鋳型からの直鎖状コンカテマーの生成と同時に生成することができる。プライマーの延長および増幅の方法は、長い断片と比較して短い断片の増幅の方が有利であることが多い。一部の実施形態によれば、延長産生物を生成するためのプライマー延長反応は、より短い産生物に有利になるような偏りを低減し、それにより標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを含む産生物等のより長い産生物の割合を増加させるように最適化することができる。本開示はこの目的を実現するための、単独でまたは組み合わせて用いられ得る種々の方法を意図している。これを実現するための１つの方法は、プライマー延長サイクルの数を制限し、それにより短い断片が優先的に増幅されないようにするか、または同じ長さであるがヘアピン構造を欠いた鋳型と比較して低減された頻度で増幅されるようにすることである。一部の実施形態では、延長産生物を生成するステップは、１５サイクル以下（例えば１０、８、６、またはそれより少ないサイクル以下）の第２のプライマーの延長を含む。一部の実施形態では、延長産生物を生成するステップは、２〜１５サイクルの第２のプライマーの延長を含む。一部の実施形態では、延長産生物を生成するステップは、２〜１０サイクルの第２のプライマーの延長を含む。一部の実施形態では、第２のプライマーの延長は第１のプライマーの延長と同時に起こる。
一部の実施形態では、本明細書において環状ポリヌクレオチドと相互交換可能に用いられ、コンカテマーの生成に用いられ得る環状標的ポリヌクレオチドは、直鎖状標的ポリヌクレオチドから形成される。一部の実施形態では、環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは一本鎖である。一部の実施形態では、環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは二本鎖である。環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは任意の長さであってよい。一部の実施形態では、環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは、約２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００または８００ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは、２５〜１０００ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは、５０〜５００ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは、７５〜２５０ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは、１００〜２００ヌクレオチドの長さである。環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは染色体または遺伝子断片を含んでよい。一部の実施形態では、環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは、これだけに限らないが、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡが挙げられる遺伝子産生物を含む。一部の実施形態では、環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは、点変異、ＳＮＰ、挿入、または欠失の結果生じた配列を含む。一部の実施形態では、環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは、染色体再配列の結果生じた配列を含む。染色体再配列は１つまたは複数の逆位、１つまたは複数の欠失、１つまたは複数の重複、１つまたは複数の転座、またはそれらの組合せであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の転座を含む環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは、融合遺伝子の融合点、または融合接合部を含む。一部の実施形態では、環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは、逆位、欠失、重複、および転座のうちの少なくとも１つを含む。
コンカテマーを生成するための１つまたは複数の本方法において用いられる第１のプライマーは、配列相補性によって標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端と、配列相補性によって標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列を含む第１の５’末端とを含み得る。第１のプライマーは少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、または１００ヌクレオチド等の任意の好適な長さであってよく、その任意の部分は、このプライマーがハイブリダイズする対応する標的配列（例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチド）に相補的であってよい。配列相補性によって標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１のプライマーの第１の３’末端は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５ヌクレオチドの長さ等の任意の好適な長さであってよい。一部の実施形態では、第１のプライマーは、プライマー延長のための環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドの種々のランダムな領域にランダムにハイブリダイズしてこれをプライミングするランダムなヌクレオチド配列を含む第１の３’末端を含み、それぞれのランダム配列は配列相補性によって対応する相補配列に特異的にハイブリダイズする。プライマーがランダムな３’末端配列を含む場合には、標的配列はプライマー延長によって増幅された配列である。典型的には、３’末端は３’ 終端ヌクレオチドを含む。第１の５’末端（配列相補性によって標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１のプライマーの第１の共通配列を有する）は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５ヌクレオチドの長さ等の任意の好適な長さであってよい。第１の共通配列は任意の好適な長さであってよい。一部の実施形態では、第１のプライマーの第１の共通配列は、少なくとも１０（例えば、少なくとも１５、２０、２５、３０、またはそれより多いヌクレオチドの長さ）である。一般に、５’末端は３’末端に関して５’であるポリヌクレオチドの部分を意味する。一部の実施形態では、５’末端は５’終端ヌクレオチドを含む。
配列相補性によってコンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端、および配列相補性によってコンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列を含む第２の５’末端を含む第２のプライマーは、プライマー延長によって標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数のコピーを含む複数の延長産生物を生成するために用いることができる。複数の延長産生物を生成するための第２のプライマーは、約または少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、または１００ヌクレオチド等の任意の好適な長さであってよく、その任意の部分は、このプライマーがハイブリダイズする対応する標的配列（例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド）に相補的であってよい。配列相補性によってコンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２のプライマーの第２の３’末端は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５ヌクレオチドの長さ等の任意の好適な長さであってよい。一部の実施形態では、第２のプライマーは、プライマー延長のためのコンカテマーの種々のランダムな領域にランダムにハイブリダイズしてこれをプライミングするランダムなヌクレオチド配列を含む第２の３’末端を含む。配列相補性によってコンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２のプライマーの第２の共通配列を含む第２の５’末端は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５ヌクレオチドの長さ等の任意の好適な長さであってよい。第２の共通配列は任意の好適な長さであってよい。一部の実施形態では、第２のプライマーの第２の共通配列は、少なくとも１０ヌクレオチドの長さ（例えば、少なくとも１５、２０、２５、３０、またはそれより多いヌクレオチドの長さ）である。一般に、５’末端は３’末端に関して５’であるポリヌクレオチドの部分を意味する。一部の実施形態では、５’末端は５’終端ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、第２の共通配列は第１の共通配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも９０％、９５％、または１００％同一）であり、そうすることで第２の共通配列は、好適な反応条件下（例えば、プライマーハイブリダイゼーションおよび／またはプライマー延長ステップ等の増幅反応における１つまたは複数のステップ）で第１の共通配列の相補体にハイブリダイズ可能である。一部の実施形態では、第１の共通配列と第２の共通配列は同一である。
一般に、標的に特異的にハイブリダイズしない共通配列は、３’末端が標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする条件下で標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしないように設計される（例えば増幅反応中の１つまたは複数のステップ）。一部の実施形態では、共通配列は、３’末端がハイブリダイズする部位に関して３’である標的ポリヌクレオチドに沿う配列との、標的ポリヌクレオチド内の任意の場所にある配列との、または試料中のポリヌクレオチドの任意の群（例えば細菌、ウイルス、植物、もしくはヒトゲノムＤＮＡ配列を含む動物等の生命体の全てのゲノム配列）との相補性が７５％未満、５０％未満、２５％未満、１０％未満、またはそれ未満であるように設計される。ある特定の実施形態では、第１の共通配列と第２の共通配列はそれぞれ少なくとも１０個（例えば少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０、またはそれより多い）の連続するヌクレオチドを５’末端に含み、最適にアライメントした場合には少なくとも９０％同一である。ある特定の実施形態では、第１の共通配列と第２の共通配列は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、または３０個の連続するヌクレオチドを５’末端に含み、最適にアライメントした場合には少なくとも７０％同一（例えば少なくとも８０％、９０％、９５％、または１００％同一）である。
一部の実施形態では、本方法の延長産生物は、（ｉ）第１の共通配列と第２の共通配列の相補体との間、および／または（ｉｉ）第２の共通配列と第１の共通配列の相補体との間の分子内ハイブリダイゼーションを含むステムループ構造を形成する。延長産生物は、非等温ＲＣＡの間、例えばステムループ構造の形成に好適な温度による第４の温度相の間に、ステムループ構造を形成することができる。一部の実施形態では、ステムループ構造はＲＣＡの後の引き続く増幅反応の間に形成される。ステムループ構造の形成は二本鎖ステム領域と一本鎖ループ領域の安定性に依存し得る。ステムの安定性はその長さ、ミスマッチの数、および塩基組成に依存し得る。ステムループ構造の安定性はループの長さにも依存する。二次構造のない大きなループは不安定であることがあり、３塩基長より短いループは立体的に不可能であろう。一部の実施形態では、より長いステム部分を有するステムループ構造は、同じループとより短いステムを有するステムループ構造よりも安定であり得る。一部の状況では、より長いループを有するステムループ構造は、同じステムとより短いループを有するステムループ構造よりも不安定であり得る。
コンカテマーを生成する方法の実例的な実施形態を図１に示す。配列相補性によって標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端と、配列相補性によって標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列、５’−ＴＡＣＧＣＡ−３’を含む第１の５’末端とを含む第１のプライマーを、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって延長する。次に、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数のコピーを含む複数の延長産生物を生成するステップは、配列相補性によってコンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端と、配列相補性によってコンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列、５’−ＴＡＣＧＣＡ−３’（第１の共通配列と同一）を含む第２の５’末端とを含む第２のプライマーの延長を含む。延長産生物は第２の共通配列と第１の共通配列の相補体との間の分子内ハイブリダイゼーションの結果としてステムループ構造を形成することができる。ステムループ構造は標的ポリヌクレオチドの様々な数のコピーを含み得る。塩基対で表わしたステムの長さは様々であり得る。一部の実施形態では、ステムは少なくとも６、９、１５、２０、２５、３０またはそれより多い塩基対の長さである。一部の実施形態では、ステムループ構造は５〜３０塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、ステムループ構造は１０〜２０塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む。第１または第２の共通配列として用いることができる配列の非限定的な例を表１に示す。
分子内ハイブリダイゼーションに関与する塩基対の数は、第１の共通配列と第２の共通配列の連続するヌクレオチドの数、または第２の共通配列と第１の共通配列の相補体の連続するヌクレオチドの数に依存し得る。分子内ハイブリダイゼーションに関与する塩基対の数は、第１の共通配列と第２の共通配列の同一性百分率にも依存し得、ここで同一性百分率は第１および第２の共通配列が最適にアライメントした場合の第１および第２の共通配列の間の同一の塩基の百分率を意味する。一部の実施形態では、第１の共通配列と第２の共通配列はそれぞれ５’末端に少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、最適にアライメントした場合には少なくとも９０％同一である。一部の実施形態では、第１の共通配列と第２の共通配列はそれぞれ５’末端に少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０個の連続するヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、第１の共通配列と第２の共通配列はそれぞれ５’末端に５〜２５個の連続するヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、第１の共通配列と第２の共通配列は、最適にアライメントした場合には少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。一部の実施形態では、第１の共通配列と第２の共通配列は、最適にアライメントした場合には６０％〜１００％同一である。一部の実施形態では、第１と第２の共通配列は５’末端に５〜２５個の連続するヌクレオチドを含み、最適にアライメントした場合には６０％〜１００％同一である。
第１および第２のプライマーの複数の延長産生物を増幅するステップは、第３のプライマーのプライマー延長を含み得る。一部の実施形態では、第３のプライマーは、配列相補性によって第１の共通配列および／または第２の共通配列に特異的にハイブリダイズする配列を含む。核酸増幅のための第３のプライマーは少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、または１００ヌクレオチド等の任意の好適な長さであってよく、その任意の部分または全部は、対応する（例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチドまたはそれより多い）標的配列に相補的であってよい。第３のプライマーは、１つまたは複数の増幅プライマーアニーリング配列またはその相補体；１つまたは複数のシーケンシングプライマーアニーリング配列またはその相補体；１つまたは複数のバーコード配列；複数の異なるプライマーの間で共有された１つまたは複数の共通配列；１つまたは複数の制限酵素認識部位；（例えば大量並列シーケンシングのためのフローセル等のシーケンシングプラットフォームへの付着のための）１つまたは複数のプローブ結合部位またはシーケンシングアダプター；１つまたは複数のランダムまたはニアーランダム配列（例えば１つまたは複数の位置で２つまたはそれより多い異なるヌクレオチドの組からランダムに選択された１つまたは複数のヌクレオチド）；ならびにそれらの組合せを含むセグメントを含み得る。増幅プライマーアニーリング配列は、シーケンシングプライマーアニーリング配列としても役立ち得る。
ステムループ構造は、ステムループ構造の安定性に依存して様々な効率で増幅することができる。一般に、同じ長さのステムと様々な長さのループとを含む複数のステムループ構造の中で、より長いループを含むステムループ構造は熱力学的安定性が低く、鋳型としてより利用し易く、より効率的に増幅することができる。したがって一部の実施形態では、ハイブリダイズ可能な共通配列に隣接する標的配列の増幅によって、標的配列の少なくとも２つまたはそれより多いコピーを含むアンプリコンが富化される。第３のプライマーのプライマー延長の結果生じたアンプリコンは、標的ポリヌクレオチドの様々な数のコピーを含み得る。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率は少なくとも５０％（例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれより多い）である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率は１０％〜１００％（例えば２０％〜９０％、３０％〜８０％、または４０％〜６０％）である。
本方法を実施する際に、ステムループ産生物の形成および標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーを含むアンプリコンの富化は、第１の共通配列、第２の共通配列、および第３のプライマー配列のハイブリダイジング配列の融解温度を特定すること、ならびに増幅を行う温度を調節することの１つまたは複数によって最適化することができる。プライマー延長産生物の増幅が第１の共通配列および／または第２の共通配列に特異的にハイブリダイズする第３のプライマーのプライマー延長を含む実施形態においては、第３のプライマーのプライマー結合効率は、第１の共通配列、第２の共通配列、および第３のプライマーのハイブリダイジング配列の融解温度の１つまたは複数に依存し得る。一部の実施形態では、第１の共通配列、第２の共通配列、および第３のプライマーのハイブリダイジング配列は、全て互いに±１５℃以内（例えば±１０℃、±５℃、または±１℃以内）の融解温度（Ｔｍ）を有する。一部の実施形態では、第１の共通配列、第２の共通配列、および第３のプライマーのハイブリダイジング配列は、全て互いに±５℃以内の融解温度（Ｔｍ）を有する。一般に、Ｔｍは一般に参照配列（これは事実上、より大きなポリヌクレオチドの中のサブ配列であり得る）およびその相補配列からなるオリゴヌクレオチドの５０％がハイブリダイズする（または分離する）温度を表す。Ｔｍは当技術で利用可能な標準的な計算、アルゴリズム、または測定に基づいてよい。Ｔｍを測定するための例示的なツールであるＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｃａｌｃ／ａｎａｌｙｚｅｒによって利用可能であり、デフォルトパラメーターを用いるように設定できる。他の同様なツールも利用可能である。
増幅を行う温度はプライマー結合ならびに長いステムループ産生物および短いステムループ産生物のための延長の効率にも影響し得る。ある特定の実施形態では、ステムループ構造の形成は、アニーリングステップを第３のプライマーの融解温度の±１５℃以内（例えば±１０℃、±５℃、または±１℃以内）の温度に保って（ｃ）の増幅ステップを実施することによって達成することができる。一部の実施形態では、ステムループ産生物の形成は、アニーリングステップを７５℃未満（例えば７０℃、６５℃、６０℃、またはそれより低い）の温度に保って（ｃ）の増幅ステップを実施することによって達成することができる。一部の実施形態では、ステムループ産生物の生成は、アニーリングステップを５５℃〜７５℃（例えば６０℃〜７０℃）の温度に保って（ｃ）の増幅ステップを実施することによって達成することができる。
一部の実施形態では、環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは、環状化された無細胞ポリヌクレオチド（例えば、無細胞ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡ）である。一部の実施形態では、環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡの環状化された断片である。一部の実施形態では、環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは、染色体再配列の結果生じた配列を含む。ある特定の実施形態では、染色体再配列は、欠失、重複、逆位、および転座のうちの少なくとも１つである。一部の実施形態では、本方法の環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは一本鎖である。一部の実施形態では、本方法の環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは二本鎖である。ある特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドに沿って５’から３’に向かって（ｉ）第１の３’末端に相補的な配列、（ｉｉ）第２の３’末端と同一の配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との間の介在配列に対応する、標的ポリヌクレオチドの配列部分を併せた長さは７５ヌクレオチドまたはそれ未満である。一部の実施形態では、配列部分の併せた長さは、６０ヌクレオチドまたはそれ未満である。一部の実施形態では、配列部分の併せた長さは、５０ヌクレオチドまたはそれ未満である。一部の実施形態では、配列部分の併せた長さは、４０ヌクレオチドまたはそれ未満である。一部の場合には、配列部分の併せた長さは、３０ヌクレオチドまたはそれ未満である。
１つの実例的な実施形態では、第１のプライマーと第２のプライマーは図２に示すように配置される。簡単にするため、第１および第２のプライマーの相対的ハイブリダイズ位置は、標的ポリヌクレオチドの一本鎖に対して図示している。しかし以下に注記するように、１つのプライマーは標的配列を含む鎖にハイブリダイズし、他は標的配列の相補体を含む鎖にハイブリダイズする。第１のプライマー、即ちフォワードプライマー（Ｆプライマー）の第１の３’末端は配列相補性によって標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、第１の５’末端は標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない。第２のプライマー、即ちリバースプライマー（Ｒプライマー）の第２の３’末端は配列相補性によって標的ポリヌクレオチドの相補体に特異的にハイブリダイズし、第２の５’末端は標的ポリヌクレオチドの相補体に特異的にハイブリダイズしない。標的配列のモノマーに関するフォワードプライマー（Ｆプライマー）およびリバースプライマー（Ｒプライマー）の配向を考えると、この配置は「バックツーバック」（Ｂ２Ｂ）または「逆向きの」プライマーと称してもよい。このようなプライマーの設計は、従来のヘッドツーヘッド設計と比較してプライマーのフットプリント（１対のプライマーにわたる総距離）が低減している。図２において、標的ポリヌクレオチドに沿って５’から３’末端に向かって（ｉ）第１の３’末端に相補的な配列、（ｉｉ）第２の３’末端と同一の配列、および（ｉ）と（ｉｉ）の間に介在する配列に対応する標的ポリヌクレオチドの配列部分を併せた長さは約３０〜１００ヌクレオチド（例えば４０〜８０、または５０〜７０ヌクレオチド）である。この併せた長さは「プライマーフットプリント」とも称される。一部の実施形態では、プライマーフットプリントは１００ヌクレオチド未満の長さ（例えば９０未満、８０未満、７０未満、６０未満、５０未満、またはそれより少ないヌクレオチドの長さ）である。一部の実施形態では、点変異、インデル（挿入／欠失）、または遺伝子融合を含む環状化された標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは、バックツーバック配置を有する第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いて増幅することができる。このようなプライマー対のプライマーフットプリントの低減により、標的配列の周囲の断片化事象のより多様な増幅が可能になる。接合部、例えば融合接合部が、典型的な増幅反応において見られるプライマーの（標的配列にわたって互いに対向する）配置におけるよりもＢ２Ｂプライマーの間で起こる可能性が少ないからである。
１つの実例的な実施形態では、図３に示すようにシーケンシングライブラリーが構築される。最初に直鎖状ＤＮＡ分子が環状化されてＲＣＡのための鋳型を形成する。共通のシーケンシングアダプターを５‘末端に有するバックツーバックプライマーが標的分子に結合し、一方、鎖置換活性を有するポリメラーゼがＲＣＡの間に標的を増幅する。配列バリアント、例えば点変異、ＳＮＰ、および融合遺伝子の検出のために、ライブラリーをシーケンシングすることも、シーケンシングの前にＰＣＲ増幅によってさらに増幅することもできる。
一部の実施形態では、試料中の複数の標的ポリヌクレオチドから複数のコンカテマーを生成することができる。試料は１つまたは複数の標的配列を含むことができる。各標的配列は１つまたは複数の対応するコンカテマーを有し得る。固有の標的ポリヌクレオチドに対応する各コンカテマーは、標的ポリヌクレオチドの様々な数のコピーを含むことができる。一部の実施形態では、本方法は様々な長さのコンカテマーを生成するように最適化することができる。コンカテマーの長さの多様性は、標的ポリヌクレオチドの長さおよび／またはコンカテマーあたりの標的ポリヌクレオチドのコピー数の変動の結果生じ得る。一部の実施形態では、コンカテマーの少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれより多く）は少なくとも７５ヌクレオチドの長さ（例えば、少なくとも１００、１５０、２００またはそれより多いヌクレオチドの長さ）の標的ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、コンカテマーの少なくとも８０％は、少なくとも７５ヌクレオチドの長さの標的ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、コンカテマーの少なくとも６０％は、少なくとも１００ヌクレオチドの長さの標的ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、コンカテマーの少なくとも５０％は、少なくとも１５０ヌクレオチドの長さの標的ポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、本開示の方法はステップ（ｃ）で産生された複数のアンプリコンをシーケンシングするステップを含む。一部の実施形態では、シーケンシングするステップは、標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを含むアンプリコンを標的ポリヌクレオチドのただ１つのコピーを含むアンプリコンから選択的に精製することなく実施される。一部の実施形態では、本開示の方法は、標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを含む、ステップ（ｃ）で産生された複数のアンプリコンの中のアンプリコンを精製するステップを含む。一部の実施形態では、本方法の精製されたアンプリコンがシーケンシングされる。ある特定の実施形態では、本開示の方法は、同じ反応混合物中の複数の異なる標的ポリヌクレオチドを増幅するステップを含む。複数の標的ポリヌクレオチドの構成成分は様々な長さであってよい。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは３０ヌクレオチド〜１０００ヌクレオチドの長さ（例えば５０〜６００、７５〜５００、１００〜４００、または２００〜３００ヌクレオチドの長さ）である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは単一の反応混合物中でのライゲーションによって環状化される。
実例的な実施形態では、無細胞ポリヌクレオチドの混合物を含む核酸試料は、図４に示すように増幅される。混合物中のポリヌクレオチド（例えば一本鎖ＤＮＡ、「ｓｓＤＮＡ」）を環状化して環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドを形成させることができる。非等温ＲＣＡの第１の温度相、例えば５５℃におけるプライマー結合、および非等温ＲＣＡの第２の温度相、例えば７０℃における１つまたは複数の第１のプライマーのプライマー延長によって、コンカテマーの混合物が生成される。プライマー結合のために選択した温度よりも高い温度をプライマー延長のために選択することによって、プライマー延長の間の追加的なプライマー結合を最小化することができる。各標的ポリヌクレオチドは１つまたは複数の対応するコンカテマーを有し得る。固有の標的ポリヌクレオチドに対応する各コンカテマーは、標的ポリヌクレオチドの様々な数のコピーを含み得る。図によれば、１つまたは複数の第１のプライマーは、配列相補性によって標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端、および配列相補性によって標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列を含む第１の５’末端を含む。続く非等温増幅のサイクルにおいて、コンカテマーの生成と同時に複数の第２の延長産生物が生成され、この延長産生物は第２の温度相における１つまたは複数の第２のプライマーのプライマー延長の結果生じ、この１つまたは複数の第２のプライマーは、第１の温度相において第１のプライマーの延長産生物として生成された直鎖状コンカテマー鋳型にハイブリダイズし、前のサイクルにおける９４℃等の第３の温度相の間の変性により環状鋳型にはハイブリダイズしない。環状鋳型の周囲で進行するポリメラーゼによる置換に際して、第２のプライマーのための新たなハイブリダイゼーション部位も露出される。１つまたは複数の第２のプライマーは、配列相補性によってコンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端、および配列相補性によってコンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列を含む第２の５’末端を含む。延長産生物は標的ポリヌクレオチドの種々の数のコピーを含み得る。混合試料中において、標的ポリヌクレオチドは種々の長さであってよく、得られる延長産生物も種々の長さであってよい。種々のサイズのステムループ構造を、第１の共通配列と第２の共通配列の相補体との分子内ハイブリダイゼーションの結果として、または第１の共通配列の相補体と第２の共通配列との分子内ハイブリダイゼーションから、形成させることができる。ステムループ構造は、アニーリング、延長等の１つまたは複数の増幅の相、またはステムループ形成のための第４の温度相（例えば５８℃）の間に形成し得る。ステムループ構造は、ＲＣＡの後の引き続く増幅反応の間にも形成し得る。延長産生物はアンプリコンを生成するための増幅反応の鋳型としても役立ち、ステムループ構造の安定性はプライマー結合および延長に影響し得る。引き続く増幅反応の間、より長い標的ポリヌクレオチド配列またはより多くのコピーのどちらかを含む延長産生物は、そのステムループ構造がより小さなループを有する延長産生物と比較して優先的に富化することができる。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを含むアンプリコンが富化される。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多くのコピーを有するアンプリコンの百分率は、少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより多く）である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多くのコピーを有するアンプリコンの百分率は、１０％〜１００％（例えば、２０％〜９０％、３０％〜８０％または４０％〜６０％）である。一部の実施形態では、より長い標的ポリヌクレオチドを含むアンプリコンが富化される。一部の実施形態では、コンカテマーの少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより多く）は、少なくとも７５ヌクレオチドの長さ（例えば、少なくとも１００、１５０、２００またはそれより多くのヌクレオチドの長さ）の標的ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、コンカテマーの少なくとも８０％は、少なくとも７５ヌクレオチドの長さの標的ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、コンカテマーの少なくとも６０％は、少なくとも１００ヌクレオチドの長さの標的ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、コンカテマーの少なくとも５０％は、少なくとも１５０ヌクレオチドの長さの標的ポリヌクレオチドを含む。
別の態様では、本開示は本開示の方法による方法を実施するための反応混合物を提供する。反応混合物は種々の態様および方法のいずれに関しても本明細書に記載した１つまたは複数の種々の成分を含み得る。一部の実施形態では、本開示は標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーのコンカテマーを含むアンプリコンを富化するための反応混合物を提供する。一実施形態では、反応混合物は（ａ）環状標的ポリヌクレオチド、（ｂ）配列相補性によって標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端、および配列相補性によって標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列を含む第１の５’末端を含む第１のプライマー、ならびに（ｃ）配列相補性によってコンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端、および配列相補性によってコンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列を含む第２の５’末端を含む第２のプライマーであって、第１の共通配列と第２の共通配列はそれぞれ５’末端に少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、最適にアライメントした場合には少なくとも９０％同一である、第２のプライマーを含む。
一部の実施形態では、本開示の反応混合物は容器に入れられる。各成分は異なる容器に包装され得るか、または交差反応性および保存期間が許せば成分の組合せが容器で提供され得る。容器はウェル、プレート、チューブ、チャンバー、フローセル、またはチップであってよい。
一部の実施形態では、反応混合物は配列相補性によって第１の共通配列または第２の共通配列に特異的にハイブリダイズする配列を有する第３のプライマーを含む。一部の実施形態では、第３のプライマーは複数の延長産生物を増幅するために用いることができる。核酸増幅のための第３のプライマーは少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、または１００ヌクレオチド等の任意の好適な長さであってよく、その任意の部分または全部は、対応する（例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチドまたはそれより多い）標的配列に相補的であってよい。第３のプライマーは、１つまたは複数の増幅プライマーアニーリング配列またはその相補体；１つまたは複数のシーケンシングプライマーアニーリング配列またはその相補体；１つまたは複数のバーコード配列；複数の異なるプライマーの間で共有された１つまたは複数の共通配列；１つまたは複数の制限酵素認識部位；（例えば大量並列シーケンシングのためのフローセル等のシーケンシングプラットフォームへの付着のための）１つまたは複数のプローブ結合部位またはシーケンシングアダプター；１つまたは複数のランダムまたはニアーランダム配列（例えば１つまたは複数の位置で２つまたはそれより多い異なるヌクレオチドの組からランダムに選択された１つまたは複数のヌクレオチド）；ならびにそれらの組合せを含むセグメントを含み得る。増幅プライマーアニーリング配列は、シーケンシングプライマーアニーリング配列としても役立ち得る。
ある特定の実施形態では、延長産生物はステムループ産生物を形成することができ、第３のプライマーのプライマー延長からのアンプリコン収率は、第１の共通配列、第２の共通配列、および第３のプライマーの第３のハイブリダイジング配列の特性を最適化すること、例えばそれらの融解温度を最適化することによって、最適化することができる。一部の実施形態では、第１の共通配列、第２の共通配列、および第３のプライマーのハイブリダイジング配列は、全て互いに±１５℃以内の融解温度（Ｔｍ）を有する。一部の実施形態では、第１の共通配列、第２の共通配列、および第３のプライマーのハイブリダイジング配列は、全て互いに±１０℃以内の融解温度（Ｔｍ）を有する。一部の実施形態では、第１の共通配列、第２の共通配列、および第３のプライマーのハイブリダイジング配列は、全て互いに±５℃以内の融解温度（Ｔｍ）を有する。一部の実施形態では、第１の共通配列、第２の共通配列、および第３のプライマーのハイブリダイジング配列は、全て互いに±１℃以内の融解温度（Ｔｍ）を有する。
一部の実施形態では、本開示の反応混合物は、環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドとして環状化された無細胞ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、本開示の反応混合物は、環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドとしてゲノムＤＮＡの環状化された断片を含む。一部の実施形態では、環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは染色体再配列の結果生じた配列を含む。ある特定の実施形態では、染色体再配列は欠失、重複、逆位、および転座のうちの少なくとも１つである。一部の実施形態では、本方法の環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは一本鎖である。一部の実施形態では、本方法の環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは二本鎖である。
一部の実施形態では、本開示の反応混合物は、標的ポリヌクレオチドに沿って５’から３’ に向かって（ｉ）第１の３’末端に相補的な配列、（ｉｉ）第２の３’末端と同一の配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との間の介在配列に対応する、標的ポリヌクレオチドの配列部分の併せた長さが７５ヌクレオチドまたはそれ未満であるものを含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの配列部分の併せた長さは６０ヌクレオチドまたはそれ未満である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの配列部分の併せた長さは、５０ヌクレオチドまたはそれ未満である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの配列部分の併せた長さは、４０ヌクレオチドまたはそれ未満である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの配列部分の併せた長さは、３０ヌクレオチドまたはそれ未満である。
本開示の方法および反応混合物を含む本明細書に記載した種々の態様の一部の実施形態では、環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは、直鎖状の標的ポリヌクレオチドをライゲーションすることによって形成される。直鎖状の標的ポリヌクレオチドから形成される環状化された標的ポリヌクレオチドは、特徴付けされるべき配列、例えば稀な配列バリアントまたは融合遺伝子を含み得る。一部の実施形態では、直鎖状の標的ポリヌクレオチドは一本鎖である。他の実施形態では、直鎖状の標的ポリヌクレオチドは二本鎖である。標的ポリヌクレオチドの非限定的な例には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ（ミトコンドリアＤＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチおよびウイルスＲＮＡ（例えばレトロウイルスＲＮＡ）が含まれる。
種々の態様のいずれかの一部の実施形態では、環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは、これだけに限らないが、無細胞ＤＮＡまたはＲＮＡ（ｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡ）を含む無細胞ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、無細胞ポリヌクレオチドは循環腫瘍ＤＮＡまたはＲＮＡ（ｃｔＤＮＡまたはｃｔＲＮＡ）である。一部の実施形態では、無細胞ポリヌクレオチドは胎児ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。一部の実施形態では、無細胞ポリヌクレオチドは細胞由来であるが組織試料等の細胞源から直接に得られないポリヌクレオチドである。無細胞ポリヌクレオチドがそれに由来し得る源の非限定的な例は、正常細胞および組織、異常細胞および組織（例えばがん細胞または組織）、胎児細胞および組織、ならびに病原体である。非細胞源中に存在する無細胞ポリヌクレオチドは、細胞死（例えばアポトーシスまたはネクローシス）または細胞のシェディングに起因し得る。無細胞ポリヌクレオチドの配列解析を用いて、それから無細胞ＤＮＡが誘導された細胞または細胞の集団、例えば腫瘍細胞（例えばがんの検出において）、胎児細胞（例えば出生前診断において）、移植された組織からの細胞（例えば移植の失敗の早期検出において）、または病原体（例えば細菌またはウイルス）の特徴付けることができる。
本開示の実施形態によって、任意の無細胞ポリヌクレオチドを用いることができる。無細胞ポリヌクレオチドは任意の動物または生命体等の対象から得ることができる。対象の非限定的な例には、ヒト、非ヒト霊長類、マウスおよびラット等のげっ歯類、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、その他の哺乳動物がある。一部の実施形態では対象は健康であり、対象から得られた無細胞ポリヌクレオチドは疾患または障害に付随する配列バリアントを含まなくてもよい。一部の実施形態では、対象は疾患または障害を有する疑いがあり、対象から得られた無細胞ポリヌクレオチドは疾患または障害に付随する配列バリアントを含んでいる可能性がある。一部の実施形態では対象は妊娠しており、対象から得られた無細胞ポリヌクレオチドは胎児ポリヌクレオチドを含む。
無細胞ポリヌクレオチドは種々の非細胞源から得ることができる。それから無細胞ポリヌクレオチドが得られる非細胞源の非限定的な例には、血清、血漿、血液、汗、唾液、尿、糞便、精液、粘膜分泌物、脊髄液、羊水、およびリンパ液がある。それから無細胞ポリヌクレオチドが得られる非細胞源の試料を収集するための種々の方法が利用可能である。一部の実施形態では、それから無細胞ポリヌクレオチドが得られる非細胞源の試料は、対象から得られる。一部の実施形態では、試料は血管穿刺によって得られる。一部の実施形態では、試料は吸引によって得られる。
試料から無細胞ＤＮＡ等の無細胞ポリヌクレオチドを得るための種々の方法および市販のキットが利用可能である。無細胞ＤＮＡを含む無細胞ポリヌクレオチドを抽出し分離するための方法およびキットの例は、フェノール／クロロホルム抽出、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ＰＣＩ）グリコーゲン抽出、ＮａＩ（ヨウ化ナトリウム）抽出、グアニジン−レジン抽出、キャリアＲＮＡを用いるＱＩＡｍｐ ＤＮＡ血液Ｍｉｄｉキット、ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ血清キット、ＺＲ血清ＤＮＡキット、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｕｂｉｔ（商標）ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキット、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）ＤＮＡ１０００キット、ＴｒｕＳｅｑ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、およびＰｕｒｅｇｅｎｅ ＤＮＡ精製システム血液キットである。
無細胞ＤＮＡを含む無細胞ポリヌクレオチドは、細胞および体液の他の非可溶性成分から無細胞ポリヌクレオチドを分離する分画ステップによって体液から抽出し単離することができる。分画技法の例は遠心分離および濾過である。一部の実施形態では、細胞は最初に無細胞ポリヌクレオチドから分画されず、むしろ溶解される。一部の実施形態では、未処理細胞のゲノムＤＮＡは選択的沈殿によって分画される。ＤＮＡを含む無細胞ポリヌクレオチドは可溶性のままであり得、不溶性のゲノムＤＮＡから分離され抽出され得る。一部の手順によれば、緩衝液の添加および異なるキットに特有の他の洗浄ステップの後で、イソプロパノール沈殿を使用してＤＮＡを沈殿させてもよい。夾雑物質または塩を除去するために、シリカ系カラム等のさらなる浄化ステップが用いられ得る。一般的なステップは特定の用途のために最適化され得る。例えば手順のある特定の態様、例えば収率を最適化するために、反応にわたって非特異的バルクキャリアポリヌクレオチドを添加してもよい。
本明細書で開示する種々の態様のいずれかの一部の実施形態では、環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡを含む。一部の実施形態では、環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡから誘導される。ゲノムＤＮＡは種々の方法およびＱｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ等の利用可能な市販のキットを用いて細胞試料から得ることができる。ゲノムＤＮＡは任意の抽出、単離および本明細書の別の箇所で既に述べた精製方法を使用して試料から得て精製することができる。抽出技法の他の非限定的な例には、（１）自動核酸抽出器、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）から入手可能なＭｏｄｅｌ ３４１ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒを用いるまたは用いない、例えばフェノール／クロロホルム有機試薬（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９３年）を用いる有機抽出およびそれに続くエタノール沈殿、（２）固定相吸着法（Ｗａｌｓｈら、米国特許第５，２３４，８０９号、１９９１年）、および（３）塩誘起核酸沈殿法（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８年））が含まれる。そのような沈殿法は典型的には「塩析」法と称される。核酸の単離および／または精製の別の例には、核酸が特異的または非特異的に結合することができる磁性粒子の使用およびそれに続く磁石を用いるビーズの単離、ならびにビーズから核酸を洗浄して溶出する方法（例えば米国特許第５，７０５，６２８号を参照）が含まれる。例えば、核酸は固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ）を用いて単離し精製することができる。一部の実施形態では、試料からの望ましくないタンパク質の除去を助けるために、上記の単離法の前に酵素消化ステップ、例えばプロテイナーゼＫまたは他の同様のプロテアーゼによる消化を行ってもよい。所望であれば、ＲＮａｓｅ阻害剤を溶解緩衝液に加えてもよい。ある特定の細胞または試料の種類については、タンパク質変性／消化ステップをプロトコールに加えることが望ましい。精製法はＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方を単離することを指向してよい。抽出手順の間またはその後にＤＮＡとＲＮＡの両方をともに単離する場合には、一方または両方を他方から分離して精製するために、さらなるステップを用いてもよい。抽出された核酸のサブ画分も、例えばサイズ、配列、またはその他の物理的、化学的特性による精製によって生成することができる。当初の核酸単離ステップに加えて、過剰または不要の試薬、反応物、または産生物を除去する等のために、開示した方法における任意のステップの後に、核酸の精製を行うことができる。試料中の核酸の量および／または純度を決定するための種々の方法、例えば吸光度（例えば２６０ｎｍ、２８０ｎｍにおける吸光度、およびこれらの比）ならびに標識（例えばＳＹＢＲグリーン、ＳＹＢＲブルー、ＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム、Ｈｏｅｃｈｓｔステイン、ＳＹＢＲゴールド、臭化エチジウム等の蛍光色素およびインターカレート剤）の検出が利用可能である。
一部の実施形態では、環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは、断片化された無細胞ＤＮＡまたは断片化されたゲノムＤＮＡを含む。ポリヌクレオチドを断片化するための、これだけに限らないが、化学的、酵素的、および機械的方法、例えば超音波、剪断、および制限酵素との接触を含む種々の方法が利用可能である。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡ断片は、およそ均一の長さである。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡ断片は、およそ均一の長さでない。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡ断片は、約５０〜約１０００ヌクレオチドの長さの平均長を有する。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡ断片は、約５０〜約５００ヌクレオチドの長さの平均長を有する。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡ断片は、約５０〜約２５０ヌクレオチドの長さの平均長を有する。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡ断片は、約５０〜約２００ヌクレオチドの長さの平均長を有する。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡ断片は、約５０〜約１００ヌクレオチドの長さの平均長を有する。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡ断片は、約４０〜約１０００ヌクレオチドの長さの平均長を有する。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡ断片は、約４０〜約５００ヌクレオチドの長さの平均長を有する。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡ断片は、約４０〜約２５０ヌクレオチドの長さの平均長を有する。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡ断片は、約４０〜約２００ヌクレオチドの長さの平均長を有する。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡ断片は、約４０〜約１００ヌクレオチドの長さの平均長を有する。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡは、より短い長さのポリヌクレオチドに断片化される。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡ断片は、およそ均一の長さである。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡ断片は、およそ均一の長さでない。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡ断片は、約５０〜約１００ヌクレオチドの長さの平均長を有する。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡ断片は、約５０〜２５０ヌクレオチドの長さの平均長を有する。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡ断片は、約５０〜５００ヌクレオチドの長さの平均長を有する。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡ断片は、約５０〜７５０ヌクレオチドの長さの平均長を有する。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡ断片は、約１００〜１０００ヌクレオチドの長さの平均長を有する。
環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは、直鎖状標的ポリヌクレオチドから種々の方法で形成させることができる。一部の実施形態では、単一の直鎖状標的ポリヌクレオチドが末端連結によって環状化される。一部の実施形態では、第１の直鎖状標的ポリヌクレオチドが第２の直鎖状標的ポリヌクレオチドに連結され、次いで第１の標的ポリヌクレオチドの非連結末端が第２の直鎖状標的ポリヌクレオチドの非連結末端に連結されて、第１および第２の標的ポリヌクレオチドを含む環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドを形成する。環状化されるポリヌクレオチドは一本鎖でも二本鎖でもよい。一本鎖の環が望ましい場合には、ポリヌクレオチドは最初に単離された一本鎖のポリヌクレオチドであってもよく、あるいはポリヌクレオチドが（例えば変性によって）一本鎖になるように処理してもよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを環状化するための方法には、リガーゼ（例えばＲＮＡリガーゼまたはＤＮＡリガーゼ）の使用のように酵素を含んでもよい。直鎖状標的ポリヌクレオチドを環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドにライゲーションするために用いられ得る酵素の非限定的な例は、ＡＴＰ依存二本鎖ポリヌクレオチドリガーゼ、ＮＡＤ＋依存ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼ、および一本鎖ポリヌクレオチドリガーゼである。リガーゼの非限定的な例は、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩおよびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ （Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ ＤＮＡリガーゼ（ＩおよびＩＩ）、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．）、ＶａｎＣ−型リガーゼ、９°Ｎ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｓｐ ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶ，Ｓｓｏ７−Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、Ｓｓｏ７−Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｓｓｏ７−Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、Ｓｓｏ７−Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｓｓｏ７−Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、Ｓｓｏ７−Ａｍｐｌｉｇａｓｅ ＤＮＡリガーゼ、および熱安定性リガーゼ類である。リガーゼ酵素は野生型、変異体アイソフォーム、および遺伝子操作バリアントであってよい。ライゲーション反応は緩衝成分、小分子ライゲーションエンハンサー、および他の反応成分を含んでよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドおよび酵素の濃度は分子内ライゲーションよりも分子内ライゲーションを促進するように調節される。一部の実施形態では、反応温度および反応時間または反応の長さが調節される。反応温度および時間も同じく調節できる。一部の実施形態では、分子内サークルを促進するために６０℃が用いられる。一部の実施形態では、反応時間は１２〜１６時間である。反応条件は選択した酵素の製造者によって特定されるものであってよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの末端を連結させて環状ポリヌクレオチドを形成するステップ（それ自体に直接、または１つもしくは複数の他のポリヌクレオチドに対してのいずれかで。例えば環状標的ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドは２つの標的ポリヌクレオチドを含む）によって、接合配列を有する接合部が産生される。一部の実施形態では、環状化反応の後でライゲーションされなかった核酸を消化するためにエクソヌクレアーゼステップを含むことができる。即ち、閉じた環は遊離の５’または３’末端を含まず、したがって５’または３’エクソヌクレアーゼの導入によって閉じた環は消化されないが、ライゲーションされなかった成分は消化される。これによって多重システムにおける特別の用途が見出され得る。
環状化の後、その後のステップに関与するために利用可能な環状化されたポリヌクレオチドの相対的濃度または純度を増加させるため、増幅またはシーケンシングに先立って反応産生物を（例えば環状ポリヌクレオチドの単離または反応中の１つまたは複数の他の分子の除去によって）精製してよい。例えば、環状化反応またはその成分を処理して、例えばエクソヌクレアーゼによる処理によって、一本鎖（環状化されていない）ポリヌクレオチドを除去してよい。さらなる例として、環状化反応またはその一部をサイズ排除クロマトグラフィーに供してよく、これにより小さな試薬は保持されて廃棄され、または環状化産生物は保持されて別の体積中に放出される。ライゲーション反応を浄化するための種々のキット、例えばＺｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈが製造しているＺｙｍｏオリゴ精製キットによって提供されるキット等が利用可能である。一部の実施形態では、精製には環状化反応に用いたリガーゼを除去または分解し、および／または環状化されたポリヌクレオチドをそのようなリガーゼから離して精製する処理が含まれる。一部の実施形態では、リガーゼを分解する処理にはプロテイナーゼＫ等のプロテアーゼによる処理が含まれる。プロテイナーゼＫ処理は製造者のプロトコール、または標準プロトコール（例えばＳａｍｂｒｏｏｋおよびＧｒｅｅｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、４版（２０１２年）に提供されている）に従ってよい。プロテアーゼ処理の後に抽出および沈殿を行ってもよい。１つの例では、環状化されたポリヌクレオチドは０．１％のＳＤＳおよび２０ｍＭのＥＤＴＡの存在下にプロテイナーゼＫ（Ｑｉａｇｅｎ）処理によって精製され、１：１フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムによって抽出され、エタノールまたはイソプロパノールによって沈殿される。一部の実施形態では、沈殿はエタノール中である。
本開示の一部の実施形態は、コンカテマーを生成するステップ、複数の延長産生物を生成するステップ、および複数の延長産生物を増幅するステップの１つまたは複数等のプライマー延長および増幅反応を含む。プライマー延長反応は温度の変化（熱サイクリング）または定温（等温）を含み得る。一部の実施形態では、プライマー延長反応はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。ＰＣＲには多段階の変性によるサイクリング、対向する鎖へのプライマー対のアニーリング、および標的配列のコピー数を指数関数的に増加させるためのプライマー延長が含まれ、これらの段階の少なくともいくつかは一般に異なる反応温度で起こる。ＰＣＲ増幅技法の非限定的な例は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲまたはｄｅＰＣＲ）、標的特異的ＰＣＲ、および定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）である。ＰＣＲに用いることができるポリメラーゼ酵素の例は、これだけに限らないが、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８；Ｔｈｅｒｍｕｓ ｏｓｈｉｍａｉ変異体；Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ；Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ １Ｂ２１；Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＧＫ２４；Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＦＳまたはＴａｑ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６７Ｙ）、Ｔａｑ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６７Ｙ；Ｅ６８１１）およびＴａｑ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６７Ｙ；Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓポリメラーゼ；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓポリメラーゼ；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ＧＢ−Ｄ ポリメラーゼ；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（９°Ｎ−７株）ポリメラーゼ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼ；Ｔｓｐポリメラーゼ；ＴｈｅｒｍａｌＡｃｅ（商標）ポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓポリメラーゼ；Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ；Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｚ０５ポリメラーゼ；デルタＺ０５ポリメラーゼ（例えばデルタＺ０５Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ）；およびそれらの変異体、バリアント、または誘導体を含む熱安定性ポリメラーゼである。ＰＣＲに用いることができるポリメラーゼ酵素の追加的な例には、これだけに限らないが、ＤＮＡポリメラーゼＩ；ＤＮＡポリメラーゼＩ変異体を含み、これだけに限らないが、Ｋｌｅｎｏｗ断片およびＫｌｅｎｏｗ断片（３’〜５’エクソヌクレアーゼマイナス）；Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ変異体；Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ変異体；ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ；およびｐｈｉ２９変異体ＤＮＡポリメラーゼを含む非熱安定性ポリメラーゼである。一部の実施形態では、ホットスタートポリメラーゼが用いられる。ホットスタートポリメラーゼは熱活性化を必要とする改変された形態のＤＮＡポリメラーゼである。そのようなポリメラーゼは、例えば感度、特異性、および収率をさらに増加させるために、および／または低いコピー標的増幅をさらに改善するために用いることができる。典型的には、ホットスタート酵素は不活性状態で提供される。熱活性化されると改変または改変剤が放出され、活性酵素が生成される。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ；ｅＥｎｚｙｍｅ ＬＬＣ；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ；Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ；ＧｅｎｅＣｈｏｉｃｅ，Ｉｎｃ．；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ；ＭＩＤＳＣＩ；Ｍｉｎｅｒｖａ Ｂｉｏｌａｂｓ ＧｍｂＨ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｎｏｖａｇｅｎ；Ｐｒｏｍｅｇａ；ＱＩＡＧＥＮ；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｔａｋａｒａ Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ；ＵＳＢ Ｃｏｒｐ．；Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．；その他の種々の販売元からいくつかのホットスタートポリメラーゼが入手可能である。
一部の実施形態では、プライマー延長および増幅反応は等温反応を含む。等温増幅技術の非限定的な例は、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）（例えば米国特許第５，４９４，８１０号および第５，８３０，７１１号）；トランスクリプション介在増幅（ＴＭＡ）（例えば米国特許第５，３９９，４９１号、第５，８８８，７７９号、第５，７０５，３６５号、第５，７１０，０２９号）；核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）（例えばＭａｌｅｋら、米国特許第５，１３０，２３８号）；ＲＮＡ技術のシグナル介在増幅（ＳＭＡＲＴ）（例えばＷｈａｒａｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２００１年、２９巻、ｅ５４頁）；鎖置換増幅（ＳＤＡ）（例えば米国特許第５，４５５，１６６号）；好熱性ＳＤＡ（Ｓｐａｒｇｏら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ、１９９６年、１０巻、２４７〜２５６頁；欧州特許第０６８４３１５号）；ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（例えばＬｉｚａｒｄｉ，「Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、米国特許第５，８５４，０３３号）；ＤＮＡのループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）（例えばＮｏｔｏｍｉら、「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ」、米国特許第６，４１０，２７８号）；ヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）（例えば米国特許出願第２００４／００５８３７８号）；シングルプライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）（例えば国際公開第２００１／０２００３５号および米国特許第６，２５１，６３９号）；ならびに環状ヘリカーゼ依存増幅（ｃＨＤＡ）（例えば米国特許出願第１０／５９４，０９５号）である。
一部の実施形態では、プライマー延長反応はＲＣＡ用等の鎖置換活性を有するポリメラーゼによって達成される。一部の実施形態では、等温増幅はローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含む。ＲＣＡ反応混合物は、１つまたは複数のプライマー、鎖置換活性を有するポリメラーゼ、およびｄＮＴＰを含み得る。鎖置換は合成の間に下流のＤＮＡを置換する能力を意味する。鎖置換活性を有するポリメラーゼは、様々な程度の鎖置換活性を有し得る。一部の実施形態では、ポリメラーゼは弱い鎖置換活性を有し得、または鎖置換活性を有し得ない。一部の実施形態では、ポリメラーゼは強い鎖置換活性を有し得る。一部の実施形態では、鎖置換活性を有するポリメラーゼは異なる反応温度で異なるレベルの鎖置換活性を有し得る。一部の実施形態では、ポリメラーゼは穏和な温度、例えば２０℃〜３７℃で鎖置換活性を示し得る。一部の実施形態では、ポリメラーゼは高温、例えば６５℃で鎖置換活性を示し得る。反応温度は鎖置換活性を有するポリメラーゼの活性のレベルに有利になるように調節することができる。一部の実施形態では、反応温度は、少なくとも２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃または９０℃である。一部の実施形態では、反応温度は、２０℃〜８０℃である。一部の実施形態では、反応温度は、２０℃〜７０℃である。一部の実施形態では、反応温度は、２０℃〜６０℃である。一部の実施形態では、反応温度は、２０℃〜５０℃である。一部の実施形態では、異なる段階にわたって種々の反応温度をサイクルさせてポリメラーゼの鎖置換活性を増加または減少させることができる。鎖置換活性を有するポリメラーゼの非限定的な例は、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ大断片；ＢｓｕＤＮＡポリメラーゼ大断片；Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ；Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲ（商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ；Ｋｌｅｎｏｗ断片（３’−５’エキソ）；ＤＮＡポリメラーゼＩ大断片；Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素；ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ；ＰｙｒｏＰｈａｇｅ３１７３ポリメラーゼ；ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；およびＶｅｎｔＲ（登録商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼである。
熱サイクル法、等温法、およびこれらの組合せを含む増幅反応の産生物として生成されるコンカテマーは、標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを含み得る。コンカテマーは、標的ポリヌクレオチドの約２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多いコピーを含み得る。一部の実施形態では、コンカテマーは複数の標的ポリヌクレオチドからプライマー延長反応の産生物として生成し、複数の構成成分の長さは均一でなく、複数の配列を含む。
本開示の種々の態様のいずれかの一部の実施形態では、プライマーは１つまたは複数の部分を含み得る。例えば、プライマーは１つまたは複数の増幅プライマーアニーリング配列またはその相補体；１つまたは複数のシーケンシングプライマーアニーリング配列またはその相補体；１つまたは複数のバーコード配列；複数の異なるプライマーの間で共有された１つまたは複数の共通配列；１つまたは複数の制限酵素認識部位；（例えば大量並列シーケンシングのためのフローセル等のシーケンシングプラットフォームへの付着のための）１つまたは複数のプローブ結合部位またはシーケンシングアダプター；１つまたは複数のランダムまたはニアーランダム配列（例えば１つまたは複数の位置で２つまたはそれより多い異なるヌクレオチドの組からランダムに選択された１つまたは複数のヌクレオチドで、異なるヌクレオチドのそれぞれはランダム配列を含むプライマーのプールの中で代表される１つまたは複数の位置で選択される）；ならびにそれらの組合せを含み得る。一部の実施形態では、第３のプライマー等のプライマーはシーケンシングアダプターエレメント（本明細書ではアダプターとも称する）を含み、これは一般にポリヌクレオチドシーケンシング反応の１つまたは複数のステップを促進するためにポリヌクレオチドの５’および／または３’末端に組み込まれるオリゴヌクレオチドを意味する。一部の実施形態では、シーケンシングアダプターはシーケンシングアダプターを含むポリヌクレオチドを次世代シーケンシングのためにフローセルに結合させるために用いられる。次世代シーケンシング法の非限定的な例は、単分子リアルタイムシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、パイロシーケンシング、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、および鎖停止である。フローセルへの付着のためのシーケンシングアダプターは、次世代シーケンシングシステム、例えば４５４シーケンシング、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ＰｒｏｔｏｎまたはＰＧＭ、およびＩｌｌｕｍｉｎａ Ｘ１０が適合できる任意の好適な配列を含み得る。次世代シーケンシング法のためのシーケンシングアダプターの非限定的な例には、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングシステムの使用に好適なＰ５およびＰ７アダプター；ＴｒｕＳｅｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ａｄａｐｔｅｒ、ならびにＴｒｕＳｅｑ Ｉｎｄｅｘｅｄ Ａｄａｐｔｅｒが含まれる。一部の実施形態では、シーケンシングアダプターは、例えばポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）等の増幅によってアダプターシーケンスを含むポリヌクレオチドを富化するために用いることができる。シーケンシングアダプターは、バーコード配列および／または試料インデックス配列をさらに含んでもよい。
他のある特定の実施形態では、第３のプライマー等のプライマーはバーコード配列を含む。バーコード配列は、バーコードが同定されるように付随したポリヌクレオチドのある特徴を可能にする公知の核酸配列を意味する。バーコードはそれぞれ、５〜３５ヌクレオチド、６〜３０ヌクレオチド、または８〜２０ヌクレオチドの範囲内の長さを有し得る。一部の実施形態では、バーコードは少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、バーコードは６ヌクレオチド未満の長さである。一部の実施形態では、いくつかの標的ポリヌクレオチドに付随するバーコードは、他の標的ポリヌクレオチドに付随するバーコードとは異なる長さであってよい。１つの組の中のバーコードの融解温度は、互いの±１０℃以内、互いの±５℃以内、または互いの±２℃以内であってよい。バーコードは最小限に交差ハイブリダイズする組のメンバーであってよい。例えば、そのような組の各メンバーのヌクレオチド配列は、その組の他の全てのメンバーの配列と十分に異なり得るので、どのメンバーも穏和なまたは厳しいハイブリダイゼーション条件の下で他の任意のメンバーの相補体と安定な二本鎖を形成することはできない。最小限に交差ハイブリダイズする組の各メンバーのヌクレオチド配列は、他の全てのメンバーの配列と少なくとも２つのポリヌクレオチドだけ異なってよい。いくつかのバーコード技術はＷｉｎｚｅｌｅｒら（１９９９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８５巻、９０１頁；Ｂｒｅｎｎｅｒ（２０００年）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．、１巻、１頁；Ｋｕｍａｒら（２００１年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．、２巻、３０２頁；Ｇｉａｅｖｅｒら（２００４年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１０１巻、７９３頁；Ｅａｓｏｎら（２００４年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１０１巻、１１０４６頁；およびＢｒｅｎｎｅｒ（２００４年）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．、５巻、２４０頁に記載されており、そのそれぞれは参照により全体が本明細書に組み込まれる。
本開示の実施形態のあるものは複数のアンプリコンをシーケンシングするステップを含む。複数のアンプリコンをシーケンシングするための種々のシーケンシング方法が利用可能である。一部の実施形態では、高スループットシーケンシング方法が用いられる。用いることができるシーケンシング方法の非限定的な例には、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＨｉＳｅｑ（登録商標）およびＭｉＳｅｑ（登録商標）等のシーケンシングシステム）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標）、ＳＯＬｉＤ（登録商標）等）、Ｒｏｃｈｅの４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｓｙｓｔｅｍｓ等によって製造されるシーケンシングシステムが含まれる。一部の実施形態では、シーケンシングするステップには約５０もしくは約５０より多い、約７５もしくは約７５より多い、約１００もしくは約１００より多い、約１２５もしくは約１２５より多い、約１５０もしくは約１５０より多い、約１７５もしくは約１７５より多い、約２００もしくは約２００より多い、約２５０もしくは約２５０より多い、約３００もしくは約３００より多いヌクレオチド、またはそれより多いヌクレオチドの長さのリードを産生させるためのＨｉＳｅｑ（登録商標）またはＭｉＳｅｑ（登録商標）の使用が含まれる。一部の実施形態では、シーケンシングするステップにはシーケンシングバイシンセシスプロセスが含まれ、ここでは個別のヌクレオチドが成長するプライマー延長産生物に添加されるととともに反復して同定される。ピロシーケンシングは得られる合成混合物をシーケンシング反応の副生物、即ちピロリン酸塩の存在についてアッセイすることによってヌクレオチドの組み込みを同定するシーケンスバイシンセシスプロセスの例である。特に、プライマー／鋳型／ポリメラーゼの複合体が単一型のヌクレオチドと接触させられる。そのヌクレオチドが組み込まれると、重合反応によってトリリン酸塩鎖のαおよびβリン酸塩の間のヌクレオシドトリリン酸塩が切断され、ピロリン酸塩が放出される。次いで放出されたピロリン酸塩の存在が、ＡＭＰによってピロリン酸塩をＡＴＰに変換する化学発光酵素レポーターシステムを用いて同定され、次いで測定できる光信号を発生させるルシフェラーゼ酵素を用いてＡＴＰが測定される。光が検出される場合には塩基が組み込まれており、光が検出されない場合には塩基が組み込まれていない。適当な洗浄ステップの後、種々の塩基が繰り返して複合体と接触し、鋳型配列中のその後の塩基が連続的に同定される。例えば米国特許第６，２１０，８９１号を参照されたい。
一部の実施形態では、アンプリコンがシーケンシングされ、参照配列に関するまたは変異のないバックグラウンドにおける配列バリアント、例えば逆位、欠失、重複、転座、および稀な体細胞変異が検出される。一部の実施形態では、配列バリアントは疾患に相関している。一部の実施形態では、配列バリアントは疾患に相関していない。一般に、疾患または形質と関連する統計学的、生物学的、および／または機能的証拠が存在する配列バリアントは、「原因遺伝子バリアント」と称される。単一の原因遺伝子バリアントは１つより多いの疾患または形質に関連することがある。一部の場合には、原因遺伝子バリアントはメンデル形質、非メンデル形質、またはその両方に関連し得る。原因遺伝子バリアントは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０またはそれより多い（例えば同じ相対的ゲノム位置における原因遺伝子バリアントを含むポリヌクレオチドと原因遺伝子バリアントを欠いているポリヌクレオチドとの間の）配列の相違等のポリヌクレオチドの多様性として現れることがある。原因遺伝子バリアントの種類の非限定的な例には、単一ヌクレオチド変異多型（ＳＮＰ）、欠失／挿入多型（ＤＩＰ）、コピー数バリアント（ＣＮＶ）、短タンデムリピート（ＳＴＲ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、単純配列リピート（ＳＳＲ）、様々な数のタンデムリピート（ＶＮＴＲ）、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、レトロトランスポゾン間増幅多型（ＩＲＡＰ）、長短散在要素（ＬＩＮＥ／ＳＩＮＥ）、長タンデムリピート（ＬＴＲ）、可動要素、レトロトランスポゾンマイクロサテライト増幅多型、レトロトランスポゾンに基づく挿入多型、配列特異的増幅多型、および遺伝性エピジェネティック修飾（例えばＤＮＡのメチル化）が含まれる。原因遺伝子バリアントは、密接に関連した原因遺伝子バリアントの組であってもよい。いくつかの原因遺伝子バリアントは、ＲＮＡポリヌクレオチドにおける配列多様性として影響を及ぼすことがある。このレベルにおいては、いくつかの原因遺伝子バリアントはＲＮＡポリヌクレオチドの種の有無によっても示される。また、いくつかの原因遺伝子バリアントはタンパク質ポリペプチドにおける配列多様性をもたらす。いくつかの原因遺伝子バリアントが報告されている。ＳＮＰである原因遺伝子バリアントの例は鎌状赤血球貧血を引き起こすヘモグロビンのＨｂ Ｓバリアントである。ＤＩＰである原因遺伝子バリアントの例は嚢泡性線維症を引き起こすＣＦＴＲ遺伝子のデルタ５０８変異である。ＣＮＶである原因遺伝子バリアントの例はトリソミー２１であり、これはダウン症候群を引き起こす。ＳＴＲである原因遺伝子バリアントの例は、ハンティントン病を引き起こすタンデムリピートである。原因遺伝子バリアントのさらなる非限定的な例は、国際公開第２０１４／０１５０８４号に記載されている。稀な配列バリアントの同定のための方法のさらなる非限定的な例は、国際公開第２０１５／０８９３３３号に記載されている。
本開示の種々の態様のいずれかのある特定の実施形態では、アンプリコンはシーケンシングに先立って精製される。アンプリコンは種々の方法によって精製することができる。アンプリコンは過剰のまたは望ましくない試薬、反応物、または産生物を除去するために精製してよい。アンプリコンはサイズ、配列、またはその他の物理的もしくは化学的特徴によってさらに精製してよい。一部の実施形態では、アンプリコンはサイズ排除クロマトグラフィーに供してよく、これにより標的ポリヌクレオチドのただ１つのコピーを含むアンプリコンおよび／または小さな試薬（例えばプライマー）は保持されて廃棄され、または標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを含むアンプリコンは保持されて別の体積中に放出される。一部の実施形態では、アンプリコンは（例えば、約３００、４００、５００、またはそれより多いヌクレオチドの長さより大きい断片を富化するための）ゲルからの断片切除およびゲル濾過、ならびに結合緩衝液の濃度を微調整することによるサイズ選択のためのＳＰＲＩビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ）に供してもよい。例えば、ＤＮＡ断片との混合の間の０．６×結合緩衝液の使用が、約５００塩基対（ｂｐ）より大きなＤＮＡ断片を優先的に結合させるために用いられ得る。一部の実施形態では、特にＢ２Ｂプライマーによる増幅を行った場合には、増幅産生物は、得られるアンプリコンをサイズによって濾過して、コンカテマーを含む混合物中のモノマーの数を減少および／または除去するように処理される。これは、本明細書の他の箇所に記載した任意の精製技法を使用して行うことができる。
本明細書に提供する開示の実施形態は、１つまたは複数の種類のがんに関連する種々の配列バリアントを含むアンプリコンを富化するために用いることができる。本開示の方法において用いることができる腫瘍学的意義を有する好適な標的配列には、これだけに限らないが、ＴＰ５３遺伝子、ＡＬＫ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子、ＢＲＡＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、およびＫＩＴ遺伝子の変化が含まれる。特異的に増幅され、および／または配列バリアントのために特異的に分析され得る標的配列は、がん関連遺伝子の全部または一部であってよい。一部の実施形態では、ＴＰ５３遺伝子において１つまたは複数の配列バリアントが同定される。ＴＰ５３はヒトのがんにおいて最も高頻度に変異した遺伝子の１つであり、例えばＴＰ５３の変異は卵巣がんの４５％、大腸がんの４３％、および上部気道消化路のがんの４２％で見出されている（例えばＭ． Ｏｌｉｖｉｅｒら、ＴＰ５３Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒｓ： Ｏｒｉｇｉｎｓ， Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ， ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｕｓｅ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ．、２０１０年１月、２巻（１号）を参照されたい）。ＴＰ５３の変異状態の特徴付けは臨床診断の助けになり、予後値を提供し、がん患者の処置に影響し得る。例えば、ＴＰ５３の変異はグリア細胞に由来するＣＮＳ腫瘍の患者の不良な予後の予兆として、また慢性リンパ球性白血病の患者の急速な疾患の進行の予兆として用いられ得る（例えばＭｃＬｅｎｄｏｎ ＲＥら、Ｃａｎｃｅｒ、２００５年１０月１５日、１０４巻（８号）１６９３〜１６９９頁；Ｄｉｃｋｅｒ Ｆら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２００９年１月、２３巻（１号）１１７〜１２４頁を参照されたい）。配列多様性は遺伝子の中のいかなる場所でも起こり得る。したがって、本明細書においてＴＰ５３遺伝子の全部または一部を評価することができる。即ち、本明細書の他の箇所に記載したように、標的特異的な成分（例えば標的特異的なプライマー）を用いる場合には、複数のＴＰ５３特異的配列を用いることによって、例えば選択された標的に用いられ得る１つまたは複数の選択されたサブ配列（変異「ホットスポット」等）のみよりも、遺伝子全体にわたって断片を増幅し検出することができる。あるいは、１つまたは複数の選択されたサブ配列（対象のクラスの中の増大した変異割合に関連するヌクレオチドまたはヌクレオチド領域、また「ホットスポット」という用語に包含される）の上流または下流にハイブリダイズする標的特異的プライマーを設計してもよい。そのようなサブ配列にわたる標準的なプライマーが設計され得、および／またはそのようなサブ配列の上流または下流にハイブリダイズするＢ２Ｂプライマーが設計され得る。
一部の実施形態では、ＡＬＫ遺伝子の全部または一部において１つまたは複数の配列バリアントが同定されている。肺腫瘍の７％もの多くでＡＬＫ融合が報告されており、そのいくつかはＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）耐性に関連している（例えばＳｈａｗら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．、２００９年９月１０日、２７巻（２６号）、４２４７〜４２５３頁を参照されたい）。２０１３年までに、ＡＬＫチロシンキナーゼドメイン全体にわたるいくつかの異なる点変異が、ＡＬＫチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）に対する二次耐性を有する患者で見出されている（Ｋａｔａｙａｍａ Ｒ、２０１２年、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．、２０１２年２月８日、４巻（１２０号））。したがって、ＡＬＫ遺伝子における変異検出は、がん治療の決定を助けるために用いることができる。
一部の実施形態では、ＫＲＡＳ遺伝子の全部または一部において１つまたは複数の配列バリアントが同定されている。肺腺癌の患者のほぼ１５〜２５％および結腸直腸がんの患者の４０％が腫瘍関連ＫＲＡＳ変異を有していることが報告されている（例えばＮｅｕｍａｎ、２００９年、Ｐａｔｈｏｌ Ｒｅｓ Ｐｒａｃｔ．、２００９年、２０５巻（１２号）、８５８〜８６２頁を参照されたい）。変異の大部分はＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２、１３、および６１に位置している。これらの変異によってＫＲＡＳシグナリング経路が活性化され、これが腫瘍細胞の成長および増殖の引き金となる。いくつかの研究により、ＫＲＡＳの変異を有する腫瘍の患者は、抗ＥＧＦＲ抗体の単独または化学療法との組合せ治療による恩恵を受けないであろうということが示されている（例えばＡｍａｄｏら、２００８年、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎ ｃｏｌ．、２００８年４月１日、２６巻（１０号）、１６２６〜１６３４頁；Ｂｏｋｅｍｅｙｅｒら、２００９年、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．、２００９年２月１０日、２７巻（５号）、６６３〜６７１頁を参照されたい）。配列多様性を同定するための標的となり得る配列多様性の１つの特定の「ホットスポット」は、遺伝子の３５位にある。ＫＲＡＳ配列バリアントの同定は、結腸直腸がんを有する対象の治療の選択等の治療の選択に用いることができる。
一部の実施形態では、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の全部または一部において１つまたは複数の配列バリアントが同定されている。ＰＩＫ３ＣＡにおける体細胞変異は、種々の型のがんにおいてしばしば、例えば結腸直腸がんの１０〜３０％において見出されている（例えばＳａｍｕｅｌｓら、２００４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００４年４月２３日、３０４巻（５６７０号）、５５４頁を参照されたい）。これらの変異はエクソン９（ヘリカルドメイン）とエクソン２０（キナーゼドメイン）の中の２つの「ホットスポット」領域内に最も多く位置しており、これらは検出配列バリアントの増幅および／または分析のために特異的に標的とされ得る。３１４０位も特異的に標的とされ得る。
一部の実施形態では、ＢＲＡＦ遺伝子の全部または一部において１つまたは複数の配列バリアントが同定されている。全悪性黒色腫の５０％近くがＢＲＡＦの体細胞変異を有していることが報告されている（例えばＭａｌｄｏｎａｄｏら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、２００３年１２月１７日、９５巻（２４号）、１８７８〜１８９０頁を参照されたい）。ＢＲＡＦ変異は全黒色腫サブタイプに見られるが、慢性日射誘導損傷のない皮膚由来の黒色腫において最も頻度が高い。黒色腫において最も一般的なＢＲＡＦ変異の中に、６００位のバリンがグルタミンで置換されたミスセンス変異Ｖ６００Ｅがある。ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異には、ＢＲＡＦ阻害剤治療の臨床的有益性が関連している。ＢＲＡＦ変異の検出は、黒色腫の処置の選択および標的治療への耐性の研究に用いることができる。
一部の実施形態では、ＥＧＦＲ遺伝子の全部または一部において１つまたは複数の配列バリアントが同定されている。ＥＧＦＲ変異はしばしば非小細胞肺がんに関連している（米国において約１０％、東アジアにおいて３５％。例えばＰａｏら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ Ａ、２００４年９月７日、１０１巻（３６号）、１３３０６〜１３３１１頁を参照されたい）。これらの変異は典型的にはＥＧＦＲエクソン１８〜２１の中で起こり、通常ヘテロ接合である。これらの変異のほぼ９０％はエクソン１９の欠失またはエクソン２１ Ｌ８５８Ｒの点変異である。
一部の実施形態では、ＫＩＴ遺伝子の全部または一部において１つまたは複数の配列バリアントが同定されている。消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）の８５％近くがＫＩＴ変異を有していることが報告されている（例えばＨｅｉｎｒｉｃｈら、２００３年、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．、２００３年１２月１日、２１巻（２３号）４３４２〜４３４９頁を参照されたい）。ＫＩＴ変異の大部分は膜近傍ドメイン（エクソン１１、７０％）、細胞外二量化モティーフ（エクソン９、１０〜１５％）、チロシンキナーゼＩ（ＴＫＩ）ドメイン（エクソン１３、１〜３％）、およびチロシンキナーゼ２（ＴＫ２）ドメイン、ならびに活性ループ（エクソン１７、１〜３％）に見出される。二次的ＫＩＴ変異は標的治療イマチニブの後、および患者が治療に耐性を生じた後で広く同定されている。
その全部または一部が本明細書に記載した方法によって配列バリアントについて分析することができるがんに関連する遺伝子のさらなる非限定的な例には、これだけに限らないが、ＰＴＥＮ；ＡＴＭ；ＡＴＲ；ＥＧＦＲ；ＥＲＢＢ２；ＥＲＢＢ３；ＥＲＢＢ４；Ｎｏｔｃｈ１；Ｎｏｔｃｈ２；Ｎｏｔｃｈ３；Ｎｏｔｃｈ４；ＡＫＴ；ＡＫＴ２；ＡＫＴ３；ＨＩＦ；ＨＩＦ１ａ；ＨＩＦ３ａ；Ｍｅｔ；ＨＲＧ；Ｂｃｌ２；ＰＰＡＲアルファ；ＰＰＡＲガンマ；ＷＴ１（ウィルムス腫瘍）；ＦＧＦ受容体ファミリーメンバー（５メンバー：１，２，３，４，５）；ＣＤＫＮ２ａ；ＡＰＣ；ＲＢ（網膜芽腫）；ＭＥＮ１；ＶＨＬ；ＢＲＣＡ１；ＢＲＣＡ２；ＡＲ（アンドロゲン受容体）；ＴＳＧ１０１；ＩＧＦ；ＩＧＦ受容体；Ｉｇｆ１（４バリアント）；Ｉｇｆ２（３バリアント）；Ｉｇｆ１受容体；Ｉｇｆ２受容体；Ｂａｘ；Ｂｃｌ２；カスパーゼファミリー（９メンバー：１，２，３，４，６，７，８，９，１２）；Ｋｒａｓ；およびＡｐｃが含まれる。さらなる例は本明細書の他の箇所で提供される。本明細書に開示する方法によって１つまたは複数の配列バリアントを呼び出すことに基づいて診断することができるがんの例には、制限はないが、棘細胞腫、腺房細胞癌、聴神経腫、末端性黒子性黒色腫、先端汗腺腫、急性好酸球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性単球性白血病、化膿性急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄樹状細胞白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、アダマンチノーマ、腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、腺様歯原性腫瘍、副腎皮質癌、成人Ｔ細胞白血病、侵攻性ＮＫ細胞白血病、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、胞状軟部肉腫、エナメル上皮線維腫、肛門がん、未分化大細胞リンパ腫、未分化甲状腺がん、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、血管筋脂肪腫、血管肉腫、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形横紋筋腫、基底細胞癌、基底様癌、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫、ベリニ管癌、胆管がん、膀胱がん、芽細胞腫、骨がん、骨腫瘍、脳幹グリオーマ、脳腫瘍、乳がん、ブレナー腫瘍、気管支腫瘍、細気管支肺胞癌、ブラウン腫瘍、バーキットリンパ腫、未知原発部位のがん、カルチノイド腫瘍、癌腫、インサイチュ癌腫、陰茎癌、未知原発部位の癌腫、癌肉腫、キャッスルマン病、中枢神経系胚芽腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頚がん、胆管癌、軟骨腫、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛腫、脈絡叢乳頭腫、慢性リンパ球性白血病、慢性単球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、慢性好中球性白血病、透明細胞腫瘍、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、デゴス病、隆起性皮膚線維肉腫、皮様嚢腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、瀰漫性大Ｂ細胞リンパ腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、胎生期癌、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜がん、内膜子宮がん、子宮内膜腫瘍、腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫、上衣芽細胞腫、上衣腫、類上皮肉腫、赤白血病、食道がん、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング腫瘍ファミリー、ユーイング肉腫ファミリー、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、乳腺外ページェット病、卵管がん、封入奇形胎児、線維腫、線維肉腫、濾胞性リンパ腫、濾胞性甲状腺がん、胆嚢がん、胆嚢がん、神経節膠腫、神経節細胞腫、胃がん、胃リンパ腫、消化管がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、消化管間質腫瘍、胚細胞腫瘍、胚細胞腫、妊娠性絨毛癌、妊娠性絨毛性腫瘍、骨巨細胞腫、多型性膠芽腫、神経膠腫、大脳神経膠腫、グロムス腫瘍、グルカゴン産生腫瘍、性腺芽腫、顆粒膜細胞腫、ヘアリー細胞白血病、ヘアリー細胞白血病、頭頸部がん、頭頸部がん、心臓がん、血管芽細胞腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、悪性血液疾患、肝細胞癌、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、遺伝性乳卵巣がん症候群、ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、視床下部膠腫、炎症性乳がん、眼球内黒色腫、島細胞癌、島細胞腫瘍、若年性骨髄単球性白血病、カポシ肉腫、カポシ肉腫、腎がん、クラツキン腫瘍、クルケンバーグ腫瘍、喉頭がん、喉頭がん、悪性黒子型黒色腫、白血病、白血病、唇口腔がん、脂肪肉腫、肺がん、黄体腫、リンパ管腫、リンパ管肉腫、リンパ上皮腫、リンパ性白血病、リンパ腫、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、悪性線維性組織球腫、骨悪性線維性組織球腫、悪性神経膠腫、悪性中皮腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、悪性横紋筋腫瘍、悪性トリトン腫瘍、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、マスト細胞白血病、縦隔生殖細胞腫瘍、縦隔腫瘍、髄様甲状腺がん、髄芽腫、髄芽腫、髄様上皮腫、黒色腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、中皮腫、潜在性原発腫瘍を伴う転移性扁平上皮頚部がん、転移性尿路上皮癌、混合ミューラー腫瘍、単球性白血病、口腔がん、粘液性腫瘍、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、菌状息肉腫、骨髄異形成疾患、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄性肉腫、骨髄増殖性疾患、粘液腫、鼻腔がん、鼻咽頭がん、鼻咽頭癌、新生物、神経線維腫、神経芽細胞腫、神経芽細胞腫、神経線維腫、神経腫、結節型黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚がん、非小細胞肺がん、眼科腫瘍、乏突起星細胞腫、乏突起膠腫、好酸性顆粒細胞腫、視神経鞘髄膜腫、口腔がん、口腔がん、口腔咽頭がん、骨肉腫、骨肉腫、卵巣がん、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣生殖細胞腫瘍、卵巣低悪性潜在性腫瘍、乳腺パジェット病、パンコースト腫瘍、膵臓がん、膵臓がん、乳頭甲状腺がん、乳頭腫、傍神経節腫、副鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、血管周囲類上皮細胞腫瘍、咽頭がん、褐色細胞腫、中分化松果体腫瘍、松果体芽細胞腫、下垂体細胞腫、下垂体腺腫、下垂体腫瘍、形質細胞新生物、胸膜肺芽腫、多胚腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、原発性肝細胞がん、原発性肝がん、原発性腹膜がん、未分化神経外胚葉性腫瘍、前立腺がん、腹膜偽粘膜腫、直腸がん、腎細胞癌、染色体１５上のＮＵＴ遺伝子が関与する呼吸器癌、網膜芽腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、リヒタートランスフォーメーション、仙尾部奇形腫、唾液腺がん、肉腫、神経鞘腫、皮脂腺癌、続発性新生物、セミノーマ、漿液腫瘍、セルトリ−ライディヒ細胞腫瘍、性索間質腫瘍、セザリー症候群、シグネットリング細胞癌、皮膚がん、小青色円形細胞腫瘍、小細胞癌、小細胞肺がん、小細胞リンパ腫、小腸がん、軟組織肉腫、ソマトスタチノーマ、煤煙性疣贅、脊索腫瘍、脊髄腫瘍、脾性辺縁部リンパ腫、扁平上皮細胞癌、胃がん、表在拡大型黒色腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、表層上皮性間質性腫瘍、滑膜肉腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、奇形腫、末期リンパ腺がん、精巣がん、莢膜細胞腫、咽喉がん、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺がん、腎盂および尿管の移行細胞がん、移行細胞癌腫、尿膜管がん、尿道がん、泌尿生殖器新生物、子宮肉腫、ブドウ膜黒色腫、膣がん、ウェルナーモリソン症候群、疣状癌、視覚伝導路神経膠腫、外陰がん、ワルデンストロームマクログロブリン血症、ワルチン腫瘍、ウィルムス腫瘍、およびこれらの組合せが含まれる。
その全部または一部（例えばプロモーター領域、イントロン、エクソン等）が本明細書に記載した方法によって配列バリアントについて分析することができるがんに関連する遺伝子のさらなる非限定的な例を表２に示す。
一態様では、本開示は標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーのコンカテマーを含むアンプリコンを富化するためのキットを提供する。キットは、任意の組合せで任意の種々の態様に関連する本明細書に開示した１つまたは複数の要素を含むことができる。一部の実施形態では、キットは、（ａ）配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端、および配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列を含む第１の５’末端を含む第１のプライマー、（ｂ）配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端、および配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列を含む第２の５’末端を含む第２のプライマーであって、前記第１の共通配列および前記第２の共通配列が、それぞれ５’末端に少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、最適にアライメントした場合に少なくとも９０％同一であり、前記コンカテマーが前記第１のプライマーの延長産生物である、第２のプライマー、ならびに（ｃ）配列相補性によって前記第１の共通配列または前記第２の共通配列に特異的にハイブリダイズする配列を有する第３のプライマーを含む。キット中の試薬およびその他の材料は任意の好適な容器に入れられていてもよく、直ちに使用可能な形態であってもよいし、またはキット中の他の試薬もしくは使用者によって供給される試薬と組み合わせること（例えば、濃縮組成物の希釈または凍結乾燥組成物の再構成）を必要としてもよい。キットは緩衝液を提供することができ、その非限定的な例には、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、トリス緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、およびこれらの組合せが含まれる。キットは対照試料、例えば、陽性対照または定量標準として用いるための精製ＤＮＡを含んでもよい。一部の実施形態では、キットはポリヌクレオチドを増幅するための１つまたは複数の酵素、例えば１つまたは複数の逆転写酵素およびポリメラーゼを含む。所望であれば、本キットは増幅産生物の集積をリアルタイム等でモニタリングすることを可能にする１つまたは複数の検出可能なマーカーをさらに含んでもよい。検出可能なマーカーの非限定的な例は上に述べたが、増幅ステップの間に二本鎖ＤＮＡに優先的にまたは排他的に結合するＳＹＢＲ緑色素またはＢＥＢＯ色素等の色素が挙げられる。一部の実施形態では、キットは増幅反応の進行または産生物を検出するためのフルオロフォアおよびクエンチャーを含むプローブオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、キットは本明細書に開示した１つまたは複数の方法にしたがってキットを使用するための説明書を含む。一部の実施形態では、第１の共通配列と第２の共通配列は同一である。一部の実施形態では、第１の共通配列、第２の共通配列、および第３のプライマーのハイブリダイジング配列は、全て互いに±５℃以内の融解温度（Ｔｍ）を有する。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドに沿って５’から３’に向かって（ｉ）前記第１の３’末端に相補的な配列、（ｉｉ）前記第２の３’末端と同一の配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との間の介在配列に対応する、標的ポリヌクレオチドの配列部分を併せた長さは７５ヌクレオチドまたはそれ未満である。
一態様では、本開示は、標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーのコンカテマーを含むアンプリコンを富化するのに使用するためのプライマーを設計するためのシステムを提供する。プライマーは、本開示の任意の種々の態様に関連する本明細書に開示した任意の特徴を含むことができる。一部の実施形態では、システムは、（ａ）特定の標的配列を増幅するためのプライマーを設計するための利用者の要求を受けるように構成されたコンピュータ、（ｂ）１つまたは複数のプロセッサによる実行によって前記標的配列の増幅のための少なくとも３つのプライマーを設計するコードを含むコンピュータ読み込み可能な媒体であって、前記少なくとも３つのプライマーが、（ｉ）配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端、および配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列を含む第１の５’末端を含む第１のプライマー、（ｉｉ）配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端、および配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列を含む第２の５’末端を含む第２のプライマーであって、前記第１の共通配列および前記第２の共通配列が、それぞれ５’末端に少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、最適にアライメントした場合に少なくとも９０％同一であり、前記コンカテマーが前記第１のプライマーの延長産生物である、第２のプライマー、ならびに（ｉｉｉ）配列相補性によって前記第１の共通配列または前記第２の共通配列に特異的にハイブリダイズする配列を有する第３のプライマーを含む、コンピュータ読み込み可能な媒体、ならびに（ｃ）受容者にレポートを送るレポートジェネレータであって、前記レポートが前記少なくとも３つのプライマーの配列を含む、レポートジェネレータを含む。一部の実施形態では、第１の共通配列と第２の共通配列とは同一である。一部の実施形態では、第１の共通配列、第２の共通配列、および第３のプライマーのハイブリダイジング配列は、全て互いに±５℃以内の融解温度（Ｔｍ）を有する。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドに沿って５’から３’に向かって（ｉ）第１の３’末端に相補的な配列、（ｉｉ）第２の３’末端と同一の配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との間の介在配列に対応する、標的ポリヌクレオチドの配列部分を併せた長さは７５ヌクレオチドまたはそれ未満である。
一部の実施形態では、コンピュータは１つまたは複数のプロセッサを含む。プロセッサには１つまたは複数のコントローラ、計算ユニット、および／またはコンピュータシステムの他のユニットが付随し、または所望によりファームウェアに埋め込まれていてよい。ソフトウェアで実装する場合には、ルーチンは任意のコンピュータ読み込み可能なメモリ、例えばＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュメモリ、磁気ディスク、レーザーディスク（登録商標）、または他の保存媒体に保存してよい。同様に、このソフトウェアは任意の公知の送達方法を介して、例えば電話線、インターネット、無線接続、その他等の通信チャネルを通して、またはコンピュータ読み込み可能なディスク、フラッシュドライブ、その他等の可搬型媒体を介して、コンピューティングデバイスに送達することができる。種々のステップは種々のブロック、操作、ツール、モジュール、または技法として実装でき、これらはまた、ハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア、またはこれらの任意の組合せで実装できる。ハードウェアで実装する場合には、ブロック、操作、技法等のいくつかまたは全部は、例えばカスタム集積回路（ＩＣ）、アプリケーション特有集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブル論理アレイ（ＦＰＧＡ）、プログラマブル論理アレイ（ＰＬＡ）等で実装できる。一部の実施形態では、コンピュータは利用者の要求を受けて、特定された標的配列（これも利用者によって提供され得る）を増幅するためのプライマーを設計するように構成される。コンピュータは利用者の要求を直接（例えば利用者の要求を入力する利用者または使用者によって操作されるキーボード、マウス、もしくはタッチスクリーン等の入力デバイスによって）、または間接的に（例えばインターネット上を含む有線または無線接続を通して）受けることができる。
一部の実施形態では、システムは、少なくとも３つのプライマーの配列を含むレポートを受容者に送るレポートジェネレータを含む。レポートジェネレータは利用者の要求に応じて自動的にレポートを送ってよい。あるいは、レポートジェネレータはオペレータからの指示に応じてレポートを送ってよい。レポートは任意の好適な通信媒体を用いてローカルまたはリモートの場所にある受容者に送信される。例えば通信媒体はネットワーク接続、無線接続、またはインターネット接続であってよい。レポートは、そのようなネットワークまたは接続（またはこれだけに限らないが、プリントアウト等の物理的レポートをメールすることを含む他の任意の好適な情報を送信する手段）を通して受容者が受容しおよび／または閲覧できるように送信することができる。受容者は、これだけに限らないが利用者または電子システム（例えば１つまたは複数のコンピュータ、および／または１つまたは複数のサーバ）であってよい。一部の実施形態では、レポートジェネレータはパソコン、電話、タブレット、またはその他のデバイス等の受容者のデバイスにレポートを送る。レポートはオンラインで閲覧され、受容者のデバイスに保存され、または印刷され得る。
一態様では、本開示は１つまたは複数のプロセッサによる実行によって本明細書に開示する方法のいずれかによる方法を実装するコードを含むコンピュータ読み込み可能な媒体を提供する。コンピュータ読み込み可能な媒体は、これだけに限らないが、有形的保存媒体、搬送波媒体、または物理的送信媒体を含む多くの形態であってよい。非揮発性保存媒体には、例えば計算ステップ、プロセシングステップ等を実装するために用いられ得るような任意のコンピュータ等の保存デバイスのいずれか等の光学ディスクまたは磁気ディスクが含まれる。揮発性保存媒体には、コンピュータのメインメモリ等のダイナミックメモリが含まれる。有形的送信媒体には同軸ケーブル、コンピュータシステムの内部のバスを含むワイヤ等の銅ワイヤおよび光学ファイバーが含まれる。搬送波送信媒体はラジオ周波数（ＲＦ）および赤外（ＩＲ）データ通信の際に発生するような電気もしくは電磁気信号、または音波または光波の形態であってよい。したがってコンピュータ読み込み可能な媒体の一般的な形態には、例えばフロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、他の任意の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤもしくはＤＶＤ−ＲＯＭ、他の任意の光学媒体、パンチカード、紙テープ、孔のパターンを有する他の任意の物理的保存媒体、ＲＡＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、他の任意のメモリチップもしくはカートリッジ、搬送波輸送データもしくは指示、そのような搬送波を輸送するケーブルまたはリンク、またはそれからコンピュータがプログラムコードおよび／もしくはデータを読み込むことができる他の任意の媒体が含まれる。コンピュータ読み込み可能な媒体のこれらの形態の多くは、プロセッサに実行させるための１つまたは複数の指示の１つまたは複数の配列の輸送に関与し得る。
以下の実施例は本発明の種々の実施形態を説明するために与えられ、いかなる様式でも本発明を限定することを意味していない。本実施例は、本明細書に記載した方法とともに、好ましい実施形態を今のところ代表するものであり、例示的であって、本発明の範囲を限定することを意図していない。その変更および特許請求の範囲によって定義される本発明の精神の中に包含されるその他の使用が、当業者には生じるであろう。
（実施例１）
１サイクルＲＣＡ増幅および複数サイクルＲＣＡ増幅からの産生物の比較
ゲノムＤＮＡを超音波処理して、平均断片サイズをほぼ１８０ｂｐとした。断片化したＤＮＡを０．９×Ａｍｐｕｒｅビーズで精製して、１００ｂｐより小さい断片を除去した。次いで超音波処理したＤＮＡをライゲーションして環状標的ポリヌクレオチドを形成させた。ライゲーションのため、１２μｌの精製したＤＮＡ断片（＞１０μｇ）を９５℃で３０秒加熱し、氷の上で２分間冷やすことによって変性させた。次いで変性したＤＮＡ試料に２μｌの１０×ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ緩衝液、４μｌの５Ｍベタイン、１μｌの５０ｍＭ ＭｎＣｌ２、および１μｌのＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩを含む８μｌのライゲーション混合物を加え、反応物を６０℃で少なくとも１２時間インキュベートする。ライゲーションプロセスの終了時に、残存する直鎖状一本鎖ＤＮＡ分子をエクソヌクレアーゼ処理ステップによって除去した。エクソヌクレアーゼ処理のため、ライゲーション産生物を８０℃で４５秒間加熱し、それに次いで１μｌのエクソヌクレアーゼ混合物（ＥｘｏＩ ２０Ｕ／μｌ、ＥｘｏＩＩＩ １００Ｕ／μｌ、比１：２）を加えた。試料をサーマルサイクラーで３７℃で３０分間、次いで８０℃で２０分間インキュベートした。エクソヌクレアーゼ処理の後、１μｌの５０ｍＭ ＥＤＴＡを各チューブに加えた。
環状標的ポリヌクレオチドを１サイクルＲＣＡ増幅または複数サイクルＲＣＡ増幅の対象とした。１サイクルＲＣＡ増幅および複数サイクルＲＣＡ増幅の両方のため、１０ｎｇの環状化されたＤＮＡ試料を出発材料として用いた。各反応のため、０．３４μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、１μｌの１００ｍＭ ＭｇＳＯ４、２．７８μｌの１８０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７５μＬのｄＮＴＰ混合物（それぞれ２５ｍＭ）、０．５μｌの１０％ Ｔｗｅｅｎ２０、１．２０μｌの１Ｍ ＫＣｌ、２μｌの１０μＭバックツーバックフォワードプライマーおよびリバースプライマー、１８．２８μｌの水をそれぞれ１０ｎｇのＤＮＡ試料に加えた。反応物を８０℃で１分間加熱し、６３℃で５分間インキュベートし、その後４℃に冷却した。次に１５単位のＢｓｔ２．０ウォームスタートＤＮＡポリメラーゼを各反応物に加えた。１サイクルのＲＣＡ増幅については反応物を６３℃で２時間インキュベートした。複数サイクルのＲＣＡ増幅については、反応物をサーマルサイクラーで以下のプログラム、即ち６０℃で３０秒、７０℃で４．５分、９４℃で２０秒、および５８℃で１０秒の８サイクルによってインキュベートした。２サイクルごとの終了時に、１５単位のＢｓｔ２．０ウォームスタートＤＮＡポリメラーゼを加えた。
全ての増幅産生物を、残存する洗浄ステップのために製造者の説明書に従って５０μｌのＡｍｐｕｒｅビーズを加えることによって精製した。溶出のため、５５μｌの溶出緩衝液を各チューブに加え、ビーズを６５℃で５分間インキュベートした。短時間の遠心の後、チューブをマグネットに戻した。各反応物から約５０μｌの溶出産生物が回収された。
１サイクルのＲＣＡからの増幅産生物にアダプターを付着させるため、それぞれ５０μｌの溶出物を、５．７μｌの１０×ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ緩衝液、前の増幅反応で用いたプライマーの３’末端の共通配列に相補的な１μｌの２５μＭアダプタープライマー、および２単位のＡｃｃｕＰｒｉｍｅ ＨｉＦｉ Ｔａｑポリメラーゼと混合した。アダプターは、以下のＰＣＲプログラム、即ち９５℃で２分；９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２．５分の３０サイクル；および７２℃で７分の最終延長を用いた増幅によって付着させた。複数サイクルのＲＣＡからの増幅産生物については、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＫＡＰＡハイパープレップキットを用いてシーケンシングアダプターを付着させた。ＰＣＲで増幅したライブラリー産生物を、アガロースゲルまたは次世代シーケンシングによって分析した。シーケンシングデータについてバイオインフォーマティクスを実施するため、ＨｉＳｅｑランからＦＡＳＴＱファイルを入手した。ＦＡＳＴＱファイルは標的配列を含む参照ファイルにアライメントさせた。挿入サイズはシーケンシングデータに基づいて計算した。
図５のアガロースゲルで定性的に示されるように、Ｂ２Ｂプライマーおよび温度サイクリングを用いる増幅によって、１サイクルのＲＣＡと比較してより多くのポリヌクレオチドコピーを含むアンプリコン、ならびにより長い標的ポリヌクレオチドを含むアンプリコンが得られた。図６において、表はアガロースゲルの強度解析による１リピート（サイズ約１５０ｂｐ）、２リピート（約３００ｂｐ）、または３リピート（約４５０ｂｐ）を含む産生物の比の半定量的な比較を提供する。１サイクルのＲＣＡと比較して、複数サイクルのＲＣＡではただ１つのリピートを有する産生物の相対量が低減していた。
増幅産生物のシーケンシング解析により、１サイクルのＲＣＡと比較して複数サイクルのＲＣＡを用いた場合により大きなＤＮＡ断片の割合が増加していることも示される。図７にリードカウントによる断片サイズの分布を示し、図８に分子の百分率による観察された分子サイズの分布を示す。
（実施例２）
ステム構造を有するプライマーまたはステム構造を有しないプライマーのいずれかを用いた複数サイクルのＲＣＡからの産生物の比較
ゲノムＤＮＡを超音波処理して、平均断片サイズをほぼ１５０ｂｐとした。断片化したＤＮＡを０．９×Ａｍｐｕｒｅビーズで精製して、１００ｂｐより小さい断片を除去した。次いで超音波処理したＤＮＡをライゲーションして環状標的ポリヌクレオチドを形成させた。ライゲーションのため、１２μｌの精製したＤＮＡ断片（＞１０μｇ）を９５℃で３０秒加熱し、氷の上で２分間冷やすことによって変性させた。次いで変性したＤＮＡ試料に２μｌの１０×ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ緩衝液、４μｌの５Ｍベタイン、１μｌの５０ｍＭ ＭｎＣｌ２、および１μｌのＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩを含む８μｌのライゲーション混合物を加え、反応物を６０℃で少なくとも１２時間インキュベートする。ライゲーションプロセスの終了時に、残存する直鎖状一本鎖ＤＮＡ分子をエクソヌクレアーゼ処理ステップによって除去した。エクソヌクレアーゼ処理のため、ライゲーション産生物を８０℃で４５秒間加熱し、それに次いで１μｌのエクソヌクレアーゼ混合物（ＥｘｏＩ ２０Ｕ／μｌ、ＥｘｏＩＩＩ １００Ｕ／μｌ、比１：２）を加えた。試料をサーマルサイクラーで３７℃で３０分間、次いで８０℃で２０分間インキュベートした。エクソヌクレアーゼ処理の後、１μｌの５０ｍＭ ＥＤＴＡを各チューブに加えた。
環状標的ポリヌクレオチドを、１９マーのステム構造を形成することができるプライマーまたはステム構造なしに設計したプライマーを用いる複数サイクルのＲＣＡ増幅の対象とした。ステム構造を形成することができる例示的な共通配列には、表１に示すものおよびその任意の断片が含まれる。
各反応のため、０．３４μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、１μｌの１００ｍＭ ＭｇＳＯ４、２．７８μｌの１８０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７５μＬのｄＮＴＰ混合物（それぞれ２５ｍＭ）、０．５μｌの１０％ Ｔｗｅｅｎ２０、１．２０μｌの１Ｍ ＫＣｌ、２μｌの１０μＭ バックツーバックフォワードプライマーおよびリバースプライマー、１８．２８μｌの水をそれぞれ１０ｎｇのＤＮＡ試料に加えた。反応物を８０℃で１分間加熱し、６３℃で５分間インキュベートし、その後４℃に冷却した。次に１５単位のＢｓｔ２．０ウォームスタートＤＮＡポリメラーゼを各反応物に加えた。反応物をサーマルサイクラーで以下のプログラム、即ち６０℃で３０秒、７０℃で４．５分、９４℃で２０秒、および５８℃で１０秒の８サイクルによってインキュベートした。２サイクルごとの終了時に、１５単位のＢｓｔ２．０ウォームスタートＤＮＡポリメラーゼを加えた。
全ての増幅産生物を、残存する洗浄ステップのために製造者の説明書に従って５０μｌのＡｍｐｕｒｅビーズを加えることによって精製した。溶出のため、５５μｌの溶出緩衝液を各チューブに加え、ビーズを６５℃で５分間インキュベートした。短時間の遠心の後、チューブをマグネットに戻した。各反応物から約５０μｌの溶出産生物が回収された。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＫＡＰＡハイパープレップキットを用いてシーケンシングアダプターを付着させた。ＰＣＲで増幅したライブラリー産生物をアガロースゲルで分析し、サイズ範囲が５５０ｂｐ〜１０００ｂｐの産生物をシーケンシングのためにさらに収集した。得られた増幅産生物をシーケンシングによって分析した。シーケンシングデータについてバイオインフォーマティクスを実施するため、ＨｉＳｅｑランからＦＡＳＴＱファイルを入手した。ＦＡＳＴＱファイルは標的配列を含む参照ファイルにアライメントさせた。挿入サイズはシーケンシングデータに基づいて計算した。
表３に示すように、ステム構造を含むＢ２Ｂプライマーおよび温度サイクリングを用いる増幅によって、より多くのポリヌクレオチドコピーを含むアンプリコンが得られた。１つより多いリピートを含むシーケンシングリードの百分率を表３に示す。ステムを含まないプライマーと比較して、１９塩基のステムを含むプライマーを用いた増幅によって１つより多いリピートを含むリードの百分率が顕著に増加した。
（実施例３）
混合ゲノムＤＮＡ試料からの低頻度融合アレルの検出
多くのがんの型で染色体再配列が観察される。本実施例は環状化されたＤＮＡ分子およびバックツーバック（Ｂ２Ｂ）プライマーデザインを用いて融合アレルを検出する方法を記載する。本方法により「パートナー」遺伝子に関する予備知識なしにＤＮＡ試料からの融合の検出が可能になり、本方法は無細胞ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ試料における遺伝子再配列事象をスクリーニングするために応用することができる。
５０％のＥＭＬ４／ＡＬＫ融合アレルを含むＥＭＬ４／ＡＬＫ ＤＮＡ標準参照（ＨＤ６６４ Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）からのゲノムＤＮＡおよび参照ゲノムＤＮＡを超音波処理して、平均断片サイズをほぼ１５０ｂｐとした。断片化したＤＮＡを０．９×Ａｍｐｕｒｅビーズで精製して、１００ｂｐより小さい断片を除去した。ライゲーションのため、１２μｌの精製したＤＮＡ断片（＞１０ｎｇ）を９５℃で３０秒加熱し、氷の上で２分間冷やすことによって変性させた。次いで変性したＤＮＡ試料に２μｌの１０×ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ緩衝液、４μｌの５Ｍベタイン、１μｌの５０ｍＭ ＭｎＣｌ２、および１μｌのＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩを含む８μｌのライゲーション混合物を加え、反応物を６０℃で少なくとも１２時間インキュベートした。ライゲーションプロセスの終了時に、残存する直鎖状一本鎖ＤＮＡ分子をエクソヌクレアーゼ処理ステップによって除去した。エクソヌクレアーゼ処理のため、ライゲーション産生物を８０℃で４５秒間加熱し、次いで１μｌのエクソヌクレアーゼ混合物（ＥｘｏＩ ２０Ｕ／μｌ、ＥｘｏＩＩＩ １００Ｕ／μｌ、比１：２）を加え、サーマルサイクルで３７℃で３０分間、次いで８０℃で２０分間インキュベートした。エクソヌクレアーゼ処理の後、１μｌの５０ｍＭ ＥＤＴＡを各チューブに加えた。
次いで超音波処理したゲノムＤＮＡをライゲーションして環状標的ポリヌクレオチドを形成させた。２つの環状化されたＤＮＡ試料、ＨＤ６６４および参照ゲノムＤＮＡをｑＰＣＲによって定量し、その後ともに混合して、濃度に基づいて２．５％、０．５％、０．０５％および０％の融合アレルを得た（図９）。ローリングサークル増幅のため、それぞれ１０ｎｇの混合したＤＮＡ試料を出発材料として用いた。各反応のため、０．３４μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、１μｌの１００ｍＭ ＭｇＳＯ４、２．７８μｌの１８０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７５μｌのｄＮＴＰ混合物（それぞれ２５ｍＭ）、０．５μｌの１０％ Ｔｗｅｅｎ２０、１．２０μｌの１Ｍ ＫＣｌ、ＡＬＫ／ＥＭＬ４融合領域を標的とするよう特に設計した２μｌの１０μＭフォワードプライマーおよびリバースプライマー（プライマー配列を表４に示す）、１８．２８μｌの水をそれぞれ１０ｎｇのＤＮＡ試料に加えた。反応物を８０℃で１分間加熱し、６３℃で５分間インキュベートし、その後４℃に冷却した。各反応物に１５単位のＢｓｔ２．０ウォームスタートＤＮＡポリメラーゼを加え、次いで各反応物を６３℃で２時間インキュベートした。
増幅産生物を、残存する洗浄ステップのために製造者の説明書に従って５０μｌのＡｍｐｕｒｅビーズを加えることによって精製した。溶出のため、５５μｌの溶出緩衝液を各チューブに加え、ビーズを６５℃で５分間インキュベートした。短時間の遠心の後、チューブをマグネットに戻した。各反応物から約５０μｌの溶出産生物が回収された。それぞれ５０μｌの溶出物を、５．７μｌの１０×ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ緩衝液、１μｌの２５ｕＭの各Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリーアダプタープライマー、および２単位のＡｃｃｕＰｒｉｍｅ ＨｉＦｉ Ｔａｑポリメラーゼと混合した。増幅によるアダプターの付着には以下のＰＣＲプログラム、即ち９５℃で２分；９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２．５分の２５サイクル；および７２℃で７分の最終延長を用いた。ＰＣＲ産生物をアガロースゲルで分析し、サイズ範囲が５５０ｂｐ〜１０００ｂｐの産生物をシーケンシングのために収集した。
シーケンシングデータについてバイオインフォーマティクスを実施するため、ＨｉＳｅｑランからＦＡＳＴＱファイルを入手した。ＦＡＳＴＱファイルは標的配列を含む参照ファイルにアライメントさせた。図１０に示すように、２．５％、０．５％、または０．０５％の融合アレルをスパイクとして添加した試料では融合アレルが見出されたが、０％の融合アレルをスパイクとして添加した試料では見出されなかった。
（実施例４）
Ｂ２Ｂプライマーを用いる多重ＲＣＡにおける標的の検出
試料中の複数の標的ポリヌクレオチドの構成成分標的ポリヌクレオチドを、複数のＲＣＡおよびＢ２Ｂプライマーを用いる増幅で検出した。ヒト血清試料から抽出した対照ｃｆＤＮＡ（Ｈ６９１４、Ｓｉｇｍａ）２０ｎｇを全部で１２μｌのＴｒｉｓ ｐＨ８緩衝液中に再懸濁し、９５℃で３０秒加熱することによって変性し、氷の上で２分間冷やした。次いで変性したＤＮＡ試料に２μｌの１０×ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ緩衝液、４μｌの５Ｍベタイン、１μｌの５０ｍＭ ＭｎＣｌ２、および１μｌのＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩを含む８μｌのライゲーション混合物を加え、反応物を６０℃で少なくとも１２時間インキュベートした。ライゲーションプロセスの終了時に、残存する直鎖状一本鎖ＤＮＡ分子をエクソヌクレアーゼ処理ステップによって除去した。エクソヌクレアーゼ処理のため、ライゲーション産生物を８０℃で４５秒間加熱し、次いで１μｌのエクソヌクレアーゼ混合物（ＥｘｏＩ ２０Ｕ／μｌ、ＥｘｏＩＩＩ １００Ｕ／μｌ、比１：２）を加えた。試料をサーマルサイクラーで３７℃で３０分間、次いで８０℃で２０分間インキュベートした。エクソヌクレアーゼ処理の後、１μｌの５０ｍＭ ＥＤＴＡを各チューブに加えた。
環状標的ポリヌクレオチドをローリングサークル増幅の対象とし、次いでＢ２Ｂプライマーで増幅した。Ｂ２Ｂプライマーの例を表５に示す。
この反応のため、０．３４μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、１μｌの１００ｍＭ ＭｇＳＯ４、２．７８μｌの１８０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７５μｌのｄＮＴＰ混合物（それぞれ２５ｍＭ）、０．５μｌの１０％ Ｔｗｅｅｎ２０、１．２０μｌの１Ｍ ＫＣｌ、２μｌの１０μＭバックツーバックフォワードプライマーおよびリバースプライマー（図１１の標的リスト表に列挙した特定の標的を標的とする８対のプライマーの混合物）、１８．２８μｌの水をそれぞれ１０ｎｇのＤＮＡ試料に加えた。反応物を８０℃で１分間加熱し、６３℃で５分間インキュベートし、その後４℃に冷却した。次に１５単位のＢｓｔ２．０ウォームスタートＤＮＡポリメラーゼを各反応物に加えた。Ｂ２Ｂプライマーを用いる等温増幅のため、反応物を６３℃で２時間インキュベートした。
全ての増幅産生物を、残存する洗浄ステップのために製造者の説明書に従って５０μｌのＡｍｐｕｒｅビーズを加えることによって精製した。溶出のため、５５μｌの溶出緩衝液を各チューブに加え、ビーズを６５℃で５分間インキュベートした。短時間の遠心の後、チューブをマグネットに戻した。各反応物から約５０μｌの溶出産生物が回収された。
アダプターを付着させるため、それぞれ５０μｌの溶出物を、５．７μｌの１０×ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ緩衝液、等温およびＢ２Ｂ増幅で用いたプライマーの３’末端の共通配列に相補的な１μｌの２５μＭアダプタープライマー、および２単位のＡｃｃｕＰｒｉｍｅ ＨｉＦｉ Ｔａｑポリメラーゼと混合した。アダプターは、以下のＰＣＲプログラム、即ち９５℃で２分；９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２．５分の３０サイクル；および７２℃で７分の最終延長を用いた増幅によって付着させた。ＰＣＲ産生物をアガロースゲルで分析し、サイズ範囲が５５０ｂｐ〜１０００ｂｐの産生物をシーケンシングのためにさらに収集した。得られた増幅産生物をシーケンシングによって分析した。図１１に示すシーケンシング分析結果は、多重標的ポリヌクレオチド配列が多重反応によって検出可能であることを示している。
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示して記述したが、そのような実施形態は実施例としてのみ提供されることは当業者には明白である。ここで当業者には本発明から逸脱することなく数多くの変形、変更、および置換が想到されよう。本発明を実施するにあたって本明細書に記載した本発明の実施形態に対する種々の選択肢が採用できることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲およびその同等物の範囲内の方法および構造がその範囲に含まれることが意図されている。

Claims (105)

  1. 標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーのコンカテマーを含むアンプリコンを富化する方法であって、
    （ａ）第１のプライマーの延長によって環状標的ポリヌクレオチドから一本鎖ポリヌクレオチドを含むコンカテマーを生成するステップであって、前記第１のプライマーが、配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端と、配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列を含む第１の５’末端とを含むステップと、
    （ｂ）配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端と、配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列を含む第２の５’末端とを含む第２のプライマーの延長によって前記標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数のコピーを含む複数の延長産生物を生成するステップであって、前記第１の共通配列および前記第２の共通配列が、それぞれ５’末端に少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、最適にアライメントした場合に少なくとも９０％同一であるステップと、
    （ｃ）複数のアンプリコンを生成する条件下でステップ（ｂ）の前記複数の延長産生物を増幅するステップであって、前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーを含むアンプリコンが富化されるステップと
    を含む方法。
  2. ステップ（ａ）が鎖置換活性を有するポリメラーゼによって達成される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第１の共通配列と前記第２の共通配列とが同一である、請求項１に記載の方法。
  4. ステップ（ｃ）の前記増幅が第３のプライマーのプライマー延長を含み、前記第３のプライマーが、配列相補性によって前記第１の共通配列または前記第２の共通配列に特異的にハイブリダイズする配列を含む、請求項１に記載の方法。
  5. （ｃ）の前記増幅するステップによって、前記標的ポリヌクレオチドの２つより少ないコピーを有するアンプリコンの百分率よりも大きな、前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が得られる、請求項１に記載の方法。
  6. 前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの前記百分率が少なくとも９０％である、請求項５に記載の方法。
  7. 前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの前記百分率が少なくとも８０％である、請求項５に記載の方法。
  8. 前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの前記百分率が少なくとも６０％である、請求項５に記載の方法。
  9. 前記延長産生物が、（ｉ）前記第１の共通配列と前記第２の共通配列の相補体との間、または（ｉｉ）前記第２の共通配列と前記第１の共通配列の相補体との間の分子内ハイブリダイゼーションを含むステムループ構造を形成する、請求項１に記載の方法。
  10. 前記ステムループ構造の形成が、アニーリングステップを前記第３のプライマーの融解温度の±５℃以内の温度に保ってステップ（ｃ）の前記増幅を実施することによって達成される、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ステムループ構造の形成が、アニーリングステップを７０℃未満の温度に保ってステップ（ｃ）の前記増幅を実施することによって達成される、請求項９に記載の方法。
  12. 前記ステムループ構造が少なくとも９塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む、請求項９に記載の方法。
  13. 前記ステムループ構造が少なくとも１５塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む、請求項９に記載の方法。
  14. 前記ステムループ構造が少なくとも２０塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む、請求項９に記載の方法。
  15. 前記ステムループ構造が少なくとも２５塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む、請求項９に記載の方法。
  16. 前記ステムループ構造が少なくとも３０塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む、請求項９に記載の方法。
  17. ステップ（ｂ）が６サイクル以下の前記第２のプライマーの延長を含む、請求項１に記載の方法。
  18. ステップ（ｂ）が８サイクル以下の前記第２のプライマーの延長を含む、請求項１に記載の方法。
  19. ステップ（ｂ）が１０サイクル以下の前記第２のプライマーの延長を含む、請求項１に記載の方法。
  20. 前記第１の共通配列、前記第２の共通配列、および前記第３のプライマーのハイブリダイジング配列が、全て互いに±５℃以内の融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項４に記載の方法。
  21. 前記環状標的ポリヌクレオチドが環状化された無細胞ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
  22. 前記環状標的ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡの環状化された断片である、請求項１に記載の方法。
  23. 前記環状標的ポリヌクレオチドが染色体再配列の結果生じた配列を含む、請求項１に記載の方法。
  24. 前記染色体再配列が、欠失、重複、逆位、および転座のうちの少なくとも１つである、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記標的ポリヌクレオチドに沿って５’から３’に向かって（ｉ）前記第１の３’末端に相補的な配列、（ｉｉ）前記第２の３’末端と同一の配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との間の介在配列に対応する、前記標的ポリヌクレオチドの配列部分を併せた長さが７５ヌクレオチドまたはそれ未満である、請求項１または２３に記載の方法。
  26. コンカテマーの少なくとも５０％が少なくとも７５ヌクレオチドの長さの標的ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
  27. 前記環状標的ポリヌクレオチドが一本鎖である、請求項１に記載の方法。
  28. ステップ（ｃ）で産生された前記複数のアンプリコンをシーケンシングするステップさらに含む、請求項１に記載の方法。
  29. 前記シーケンシングするステップが、前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを含むアンプリコンを、前記標的ポリヌクレオチドのただ１つのコピーを含むアンプリコンから選択的に精製することなく実施される、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを含む、ステップ（ｃ）で産生された前記複数のアンプリコンの中のアンプリコンを精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  31. 前記精製されたアンプリコンをシーケンシングするステップをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 同じ反応混合物中で複数の異なる標的ポリヌクレオチドが増幅される、請求項１に記載の方法。
  33. 標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーのコンカテマーを含むアンプリコンを富化するための反応混合物であって、
    （ａ）環状標的ポリヌクレオチド、
    （ｂ）配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端、および配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列を含む第１の５’末端を含む第１のプライマー、ならびに
    （ｃ）配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端、および配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列を含む第２の５’末端を含む第２のプライマーであって、前記第１の共通配列および前記第２の共通配列は、それぞれ５’末端に少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、最適にアライメントした場合に少なくとも９０％同一である、第２のプライマー
    を含む反応混合物。
  34. 前記第１の共通配列と前記第２の共通配列とが同一である、請求項３３に記載の反応混合物。
  35. 前記反応混合物が容器に入れられている、請求項３３に記載の反応混合物。
  36. 前記容器が、ウェル、プレート、チューブ、チャンバー、フローセル、またはチップである、請求項３５に記載の反応混合物。
  37. 配列相補性によって前記第１の共通配列または前記第２の共通配列に特異的にハイブリダイズする配列を有する第３のプライマーをさらに含む、請求項３３に記載の反応混合物。
  38. 前記第１の共通配列、前記第２の共通配列、および前記第３のプライマーのハイブリダイジング配列が、全て互いに±５℃以内の融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項３７に記載の反応混合物。
  39. 前記第１の共通配列および前記第２の共通配列がそれぞれ少なくとも１５ヌクレオチドを含む、請求項３３に記載の反応混合物。
  40. 前記環状標的ポリヌクレオチドが環状化された無細胞ＤＮＡである、請求項３３に記載の反応混合物。
  41. 前記環状標的ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡの環状化された断片である、請求項３３に記載の反応混合物。
  42. 前記環状標的ポリヌクレオチドが染色体再配列の結果生じた配列を含む、請求項３３に記載の反応混合物。
  43. 前記染色体再配列が、欠失、重複、逆位、および転座のうちの少なくとも１つである、請求項４２に記載の反応混合物。
  44. 前記標的ポリヌクレオチドに沿って５’から３’に向かって（ｉ）前記第１の３’末端に相補的な配列、（ｉｉ）前記第２の３’末端と同一の配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との間の介在配列に対応する、前記標的ポリヌクレオチドの配列部分を併せた長さが７５ヌクレオチドまたはそれ未満である、請求項３３または４２に記載の反応混合物。
  45. 前記環状標的ポリヌクレオチドが一本鎖である、請求項３３に記載の反応混合物。
  46. 標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーのコンカテマーを含むアンプリコンを富化するためのキットであって、
    （ａ）配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端、および配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列を含む第１の５’末端を含む第１のプライマー、
    （ｂ）配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端、および配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列を含む第２の５’末端を含む第２のプライマーであって、前記第１の共通配列および前記第２の共通配列が、それぞれ５’末端に少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、最適にアライメントした場合に少なくとも９０％同一であり、前記コンカテマーが前記第１のプライマーの延長産生物である、第２のプライマー、ならびに
    （ｃ）配列相補性によって前記第１の共通配列または前記第２の共通配列に特異的にハイブリダイズする配列を有する第３のプライマー
    を含むキット。
  47. 前記第１の共通配列と前記第２の共通配列とが同一である、請求項４６に記載のキット。
  48. 前記第１の共通配列、前記第２の共通配列、および前記第３のプライマーのハイブリダイジング配列が、全て互いに±５℃以内の融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項４６に記載のキット。
  49. 前記標的ポリヌクレオチドに沿って５’から３’に向かって（ｉ）前記第１の３’末端に相補的な配列、（ｉｉ）前記第２の３’末端と同一の配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との間の介在配列に対応する、前記標的ポリヌクレオチドの配列部分を併せた長さが７５ヌクレオチドまたはそれ未満である、請求項４６に記載のキット。
  50. 標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーのコンカテマーを含むアンプリコンを富化するのに使用するためのプライマーを設計するためのシステムであって、
    （ａ）特定の標的配列を増幅するためのプライマーを設計するための利用者の要求を受けるように構成されたコンピュータ、
    （ｂ）１つまたは複数のプロセッサによる実行によって前記標的配列の増幅のための少なくとも３つのプライマーを設計するコードを含むコンピュータ読み込み可能な媒体であって、前記少なくとも３つのプライマーが、
    （ｉ）配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端、および配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列を含む第１の５’末端を含む第１のプライマー、
    （ｉｉ）配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端、および配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列を含む第２の５’末端を含む第２のプライマーであって、前記第１の共通配列および前記第２の共通配列が、それぞれ５’末端に少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、最適にアライメントした場合に少なくとも９０％同一であり、前記コンカテマーが前記第１のプライマーの延長産生物である、第２のプライマー、ならびに
    （ｉｉｉ）配列相補性によって前記第１の共通配列または前記第２の共通配列に特異的にハイブリダイズする配列を有する第３のプライマー
    を含む、コンピュータ読み込み可能な媒体、ならびに
    （ｃ）受容者にレポートを送るレポートジェネレータであって、前記レポートが前記少なくとも３つのプライマーの配列を含む、レポートジェネレータ
    を含むシステム。
  51. 前記第１の共通配列と前記第２の共通配列とが同一である、請求項５０に記載のシステム。
  52. 前記第１の共通配列、前記第２の共通配列、および前記第３のプライマーのハイブリダイジング配列が、全て互いに±５℃以内の融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項５０に記載のシステム。
  53. 前記標的ポリヌクレオチドに沿って５’から３’に向かって（ｉ）前記第１の３’末端に相補的な配列、（ｉｉ）前記第２の３’末端と同一の配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との間の介在配列に対応する、前記標的ポリヌクレオチドの配列部分を併せた長さが７５ヌクレオチドまたはそれ未満である、請求項５０に記載のシステム。
  54. ローリングサークル増幅を実施する方法であって、
    （ａ）標的ポリヌクレオチドを含む環状ポリヌクレオチドを準備するステップ、
    （ｂ）増幅反応混合物を複数サイクルのローリングサークル増幅に供してコンカテマーを含む複数の増幅産生物を生成するステップ
    を含み、前記増幅反応混合物が、（ｉ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ、（ｉｉ）前記環状ポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）プライマーを含み、前記複数サイクルのローリングサークル増幅の各サイクルが、前記複数の増幅産生物を生成するように、変性温度における変性、アニーリング温度におけるプライマーアニーリング、および所与の伸長時間にわたる伸長温度におけるプライマーの伸長を含み、
    生成した前記複数の増幅産生物が、変性およびプライマーアニーリングについて同等の条件下であるが前記複数サイクルの伸長時間の合計と同等の伸長時間である１サイクルの増幅を用いることによって生成する複数の増幅産生物と比較した場合に、より高い割合で前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを有するコンカテマーを含むことで特徴付けられる、方法。
  55. ローリングサークル増幅によって生成される標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを有するコンカテマーの割合を増加させる方法であって、
    （ａ）標的ポリヌクレオチドを含む環状ポリヌクレオチドを準備するステップ、
    （ｂ）増幅反応混合物を複数サイクルのローリングサークル増幅に供してコンカテマーを含む複数の増幅産生物を生成するステップ
    を含み、前記増幅反応混合物が（ｉ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ、（ｉｉ）前記環状ポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）プライマーを含み、前記複数サイクルのローリングサークル増幅の各サイクルが、前記複数の増幅産生物を生成するように、変性温度における変性、アニーリング温度におけるプライマーアニーリング、および所与の伸長時間にわたる伸長温度におけるプライマーの伸長を含み、
    それにより前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを有するコンカテマーの割合を増加させる、方法。
  56. 前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを有する前記複数の増幅産生物におけるコンカテマーの割合が、変性およびプライマーアニーリングについて同等の条件下であるが前記複数サイクルの伸長時間の合計と同等の伸長時間である１サイクルの増幅を用いることによって生成する複数の増幅産生物と比較した場合に増加している、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記ポリメラーゼが、ＢｓｕＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ３１７３ポリメラーゼ、これらの任意のバリアント、およびこれらの任意の断片からなる群から選択される、請求項５４または５５に記載の方法。
  58. 前記反応混合物中で用いられる前記環状ポリヌクレオチドがヒト無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む場合に、前記複数の増幅産生物が約１８０塩基対の平均断片長さを示す、請求項５４または５５に記載の方法。
  59. 前記反応混合物中で用いられる前記環状ポリヌクレオチドがヒト無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む場合に、前記複数の増幅産生物が約１７０塩基対の平均断片長さを示す、請求項５４または５５に記載の方法。
  60. 前記反応混合物中で用いられる前記環状ポリヌクレオチドがヒト無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む場合に、前記複数の増幅産生物が約４０塩基〜約４５０塩基の断片長さ分布を示す、請求項５４または５５に記載の方法。
  61. 前記反応混合物中で用いられる前記環状ポリヌクレオチドがヒト無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む場合に、前記複数の増幅産生物が約１００塩基〜約２００塩基の断片長さ分布を示す、請求項５４または５５に記載の方法。
  62. 前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを有するコンカテマーの割合が少なくとも約１％増加する、請求項５６に記載の方法。
  63. 前記複数サイクルのローリングサークル増幅の少なくとも１つのサイクルの後に前記反応混合物に前記ポリメラーゼを補充するステップをさらに含む、請求項５４または５５に記載の方法。
  64. 前記環状ポリヌクレオチドが約４０塩基〜約５００塩基の長さを有する、請求項５４または５５に記載の方法。
  65. 前記環状ポリヌクレオチドが無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む、請求項５４または５５に記載の方法。
  66. 前記環状ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡの断片を含む、請求項５４または５５に記載の方法。
  67. 前記環状ポリヌクレオチドが染色体再配列の結果生じた配列を含む、請求項５４または５５に記載の方法。
  68. 前記染色体再配列が、欠失、重複、逆位、および転座のうちの少なくとも１つである、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記環状ポリヌクレオチドが二本鎖である、請求項５４または５５に記載の方法。
  70. 前記環状ポリヌクレオチドが一本鎖である、請求項５４または５５に記載の方法。
  71. 複数の異なる環状ポリヌクレオチドが前記増幅反応混合物中で増幅される、請求項５４または５５に記載の方法。
  72. 前記複数サイクルが少なくとも２つのサイクルを含む、請求項５４または５５に記載の方法。
  73. 前記複数サイクルの各サイクルが、（ｉ）約７５℃〜約９５℃の変性温度における約５秒〜約６０秒間の変性、（ｉｉ）約４５℃〜約６５℃のアニーリング温度における約５秒〜約６０秒間のプライマーアニーリング、および（ｉｉｉ）約６５℃〜約７５℃の伸長温度における約３０秒〜約１０分間の伸長時間のプライマー伸長を含む、請求項５４または５５に記載の方法。
  74. 前記複数サイクルの各サイクルが、（ｉ）約８０℃の変性温度における約１５秒〜約３０秒間の変性、（ｉｉ）約５０℃のアニーリング温度における約１５秒〜約４５秒間のプライマーアニーリング、および（ｉｉｉ）約７０℃の伸長温度における約３分〜約１０分間の伸長時間のプライマー伸長を含む、請求項５４または５５に記載の方法。
  75. 前記プライマーがランダム配列を含む、請求項５４または５５に記載の方法。
  76. 前記プライマーが遺伝子特異的配列を含む、請求項５４または５５に記載の方法。
  77. 前記プライマーが、（ｉ）配列相補性によって前記環状ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の３’末端、および（ｉｉ）配列相補性によって前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズしない第１の共通配列を含む第１の５’末端を含む第１のプライマーを含み、前記環状ポリヌクレオチドを鋳型として用いる前記第１のプライマーの延長によって前記複数サイクルのローリングサークル増幅の間に一本鎖ポリヌクレオチドを含むコンカテマーが生成される、請求項５４または５５に記載の方法。
  78. 前記プライマーが、（ｉ）配列相補性によって前記一本鎖ポリヌクレオチドを含む前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズする第２の３’末端、および（ｉｉ）配列相補性によって前記コンカテマーに特異的にハイブリダイズしない第２の共通配列を含む第２の５’末端を含む第２のプライマーを含み、前記コンカテマーを鋳型として用いる前記第２のプライマーの延長によって前記複数サイクルのローリングサークル増幅の間に前記標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数のコピーを含む複数の延長産生物が生成される、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記第１の共通配列および前記第２の共通配列が、それぞれ５’末端に少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、最適にアライメントした場合に少なくとも９０％同一である、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記第１の共通配列と前記第２の共通配列とが同一である、請求項７９に記載の方法。
  81. 複数のアンプリコンを生成する条件下で前記複数の延長産生物を増幅するステップをさらに含み、前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つまたはそれより多いコピーを含むアンプリコンが富化される、請求項７８に記載の方法。
  82. 増幅するステップが第３のプライマーのプライマー延長を含み、前記第３のプライマーが、配列相補性によって前記第１の共通配列または前記第２の共通配列に特異的にハイブリダイズする配列を含む、請求項８１に記載の方法。
  83. 増幅するステップによって、前記標的ポリヌクレオチドの２つより少ないコピーを有するアンプリコンの百分率よりも大きな、前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が得られる、請求項８１に記載の方法。
  84. 前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が少なくとも５％である、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が少なくとも１０％である、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が少なくとも２０％である、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が少なくとも３０％である、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が少なくとも４０％である、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が少なくとも６０％である、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が少なくとも８０％である、請求項８９に記載の方法。
  91. 前記標的ポリヌクレオチドの２つまたはそれより多いコピーを有するアンプリコンの百分率が少なくとも９０％である、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記複数の延長産生物が、（ｉ）前記第１の共通配列と前記第２の共通配列の相補体との間、または（ｉｉ）前記第２の共通配列と前記第１の共通配列の相補体との間の分子内ハイブリダイゼーションを含むステムループ構造を形成する、請求項７８〜８０のいずれか１項に記載の方法。
  93. 前記ステムループ構造の形成が、アニーリングステップを前記第３のプライマーの融解温度の±５℃以内の温度に保って前記増幅を実施することによって達成される、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記ステムループ構造の形成が、アニーリングステップを約７０℃未満の温度に保って前記増幅を実施することによって達成される、請求項９２に記載の方法。
  95. 前記ステムループ構造が少なくとも９塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む、請求項９２に記載の方法。
  96. 前記ステムループ構造が少なくとも１５塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記ステムループ構造が少なくとも２０塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む、請求項９６に記載の方法。
  98. 前記ステムループ構造が少なくとも２５塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記ステムループ構造が少なくとも３０塩基対の分子内ハイブリダイゼーションを含む、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記第１の共通配列、前記第２の共通配列、および前記第３のプライマーのハイブリダイジング配列が、全て互いに±５℃以内の融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項８２に記載の方法。
  101. 前記標的ポリヌクレオチドに沿って５’から３’に向かって（ｉ）前記第１の３’末端に相補的な配列、（ｉｉ）前記第２の３’末端と同一の配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との間の介在配列に対応する、前記標的ポリヌクレオチドの配列部分を併せた長さが７５ヌクレオチドまたはそれ未満である、請求項７８〜８０のいずれか１項に記載の方法。
  102. コンカテマーを含む前記複数の増幅産生物をシーケンシングするステップをさらに含む、請求項５４から１０１のいずれか１項に記載の方法。
  103. 前記シーケンシングするステップが、前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを有するコンカテマーを、前記標的ポリヌクレオチドの２つ未満のコピーを含むコンカテマーから選択的に分離することなく実施される、請求項１０２に記載の方法。
  104. 前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを含むコンカテマーを、前記標的ポリヌクレオチドの２つ未満のコピーを含むコンカテマーから分離するステップをさらに含む、請求項５４から１０１のいずれか１項に記載の方法。
  105. 前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを含む前記コンカテマーをシーケンシングするステップをさらに含む、請求項１０４に記載の方法。
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