KR20180057042A - 금 나노 입자를 포함하는 유전자 검출용 장치 및 금 나노 입자를 이용한 유전자 검출 방법 - Google Patents

금 나노 입자를 포함하는 유전자 검출용 장치 및 금 나노 입자를 이용한 유전자 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 금 나노 입자를 포함하는 유전자 검출용 장치 및 금 나노 입자를 이용한 유전자 검출 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 유전자 검출용 장치 및 금 나노 입자를 이용한 유전자 검출 방법을 이용하면, 기존의 PCR 등을 이용한 유전자 증폭 방식의 경우 세 단계 온도를 거치지 위한 열순환기 등의 장비가 필수적으로 필요한데, 이를 사용하지 않으면서, 빠르고 민감한 정량적 분석이 가능하며, 다중 검출이 가능하다.

Description

금 나노 입자를 포함하는 유전자 검출용 장치 및 금 나노 입자를 이용한 유전자 검출 방법{Device for Detecting a Gene Comprising Gold Nanoparticle and Method for Detecting a Gene Using Gold Nanoparticle}
본 발명은 금 나노 입자를 포함하는 유전자 검출용 장치 및 금 나노 입자를 이용한 유전자 검출 방법에 관한 것이다.
유전자를 이용한 질병 등의 진단 방법이 널리 활용되고 있으나, 유전자 진단을 위하여 검출해야 하는 유전자의 양은 시료 속에 극히 드물기 때문에, 이 양을 증폭하여 관찰할 수 있는 방법에 대한 연구가 계속되어 왔다.
유전자 양을 증폭하기 위하여 PCR(중합효소연쇄반응; Polymerase Chain Reaction) 기술이 이용되어 왔다. 고전적인 PCR 방법은 측정 시료에 PCR 반응을 일으킬 수 있도록 중합효소, 프라이머(primer) 등 여러 가지 시약을 첨가하고 열순환기(thermal cycler)를 사용하여 온도를 가변하는 사이클을 30~40회 진행한 후에 최종 산물에 측정하고자 하는 유전자가 있는지 조사한다. 이에 소요되는 시간은 열순환기의 히팅 블록(heating block)의 큰 열용량 때문에 각 단계별 온도조절에 걸리는 시간이 오래 걸리게 되어 측정 준비 단계를 제외하고도 2시간에서 2시간 30분이라는 긴 시간을 요구한다. 게다가 고전적인 PCR 방법은 정량적인 분석이 아닌 정성적인 분석만 수행할 수 있는 한계를 지닌다.
이에 따라 실시간 PCR (Real-time PCR)이 개발되었다. 실시간 PCR은 유전자가 증폭됨에 따라 증폭된 유전자에서 형광을 내도록 설계가 된 시약을 사용하고, 매 사이클을 마칠 때마다 형광량을 측정하여 증폭이 일어나기까지의 시간을 이용하여 초기에 샘플 내에 존재하던 유전자의 양을 추정한다. 하지만 형광을 내도록 설계된 시약의 가격이 매우 고가이기 때문에 진단비용이 높아진다. 또한, 실시간 PCR도 고전적인 PCR과 마찬가지로 큰 열용량을 갖는 히팅블럭을 사용하기 때문에 온도 조절에 소요되는 시간이 길어져, 측정 시간이 길다는 단점이 존재한다.
아울러, 기존의 PCR 방법은 유전자 자체의 양을 증폭하는 방식이기에 반응 초기에 에러가 발생하면 그 에러가 계속적으로 증폭이 되어 잘못된 결과를 얻게 될 수 있는 위험성을 지니고 있다. 게다가 암진단과 같은 분야의 유전자 진단은 전체 염기서열 중 하나의 변이까지 측정해야 할 필요가 있기 때문에 기존의 PCR 기반의 방법으로 측정하는 데에 한계점을 드러내고 있다.
최근 분자진단으로서, NGS(Next Generation Sequencing) 기법을 이용하여 DNA의 서열을 직접 분석하는 방식이 채택되고 있으나, 방식이 복잡하고 한 번에 측정할 수 있는 시료의 개수가 한정적으로 적다는 단점을 지니고 있다(Elaine R. Mardis, Trends in Genetics, 24(3): 133-141, 2008).
따라서, 질병 진단 등 다양한 분야에 적용하기 위하여, 적은 시료 속 유전자를 이용하여 다중 검출이 가능한 방법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 적은 양의 타겟 유전자를 이용하여 다중 검출이 가능한 방법을 개발하고자 노력한 결과, 금 나노 입자를 이용하여, 빠르고 민감한 정량적 분석이 가능하며 하나의 타겟 유전자로부터 다수의 생성물을 얻어 다중 검출이 가능하다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 금 나노 입자를 포함하는 유전자 검출용 장치 및 금 나노 입자를 이용한 유전자 검출 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 금 나노 입자; 타겟 유전자와 결합하도록 상보적인 염기서열을 갖는 타겟 검출 DNA 및 센서 표면에 결합하도록 염기서열을 갖는 센싱 DNA로 구성되어 있고, 금 나노 입자에 부착되어 DNA의 말단이 금 나노 입자와 결합하도록 기능화된 프로브 DNA; 센싱 DNA와 상보적으로 결합하도록 염기서열을 갖는 프로브 링커 DNA; 프로브 DNA 중 타겟 유전자와 이중가닥으로 결합된 타겟 검출 DNA의 3' 부분부터 이중결합을 이루는 부분을 제거하는 DNA 분해효소; 및 프로브 링커 DNA가 고정되어 검출을 수행하는 센서를 포함하는, 유전자 검출용 장치를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 금 나노 입자의 표면에 타겟 유전자 검출을 위한 프로브 DNA의 개수를 조절하여 부착하여 프로브 금 나노 입자를 형성하는 단계; (b) 시료에 상기 프로브 금 나노 입자를 혼합하여 프로브 DNA의 바깥 말단 부분인 타겟 결합 DNA가 혼성화되는 단계; (c) 타겟 유전자에 상보적으로 결합한 타겟 결합 DNA에 노출된 3' 부분을 핵산 분해효소가 분해하여 상보적으로 결합한 부분을 전부 제거하는 단계; (d) 프로브 금 나노 입자에 남아있는 상보적으로 결합하지 않은 프로브 DNA 부분은 센싱 DNA로, 센서 표면에 상보적인 결합을 하는 부위만 남은 생성물을 얻는 단계; (e) 상기 (b) 내지 (d) 단계를 반복하여 많은 양의 생성물을 얻는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계에서 얻어진 생성물이 센서 표면에 고정화된 프로브 링커 DNA와 상보적 결합을 하여 검출 신호를 발생시키는 단계를 포함하는 금 나노 입자를 이용한 유전자 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 유전자 검출용 장치 및 금 나노 입자를 이용한 유전자 검출 방법을 이용하면, 기존의 PCR 등을 이용한 유전자 증폭 방식의 경우 세 단계 온도를 거치지 위한 열순환기 등의 장비가 필수적으로 필요한데, 이를 사용하지 않으면서, 빠르고 민감한 정량적 분석이 가능하며, 다중 검출이 가능하다.
도 1은 프로브 DNA가 고정된 금 나노 입자를 이용한 타겟 유전자의 검출을 위한 재료를 나타낸 것이다. 100은 타겟 유전자, 200은 프로브 DNA가 고정된 금 나노 입자, 201은 금 나노 입자, 202는 프로브 DNA, 202a는 센싱 DNA, 202b는 타겟 검출 DNA, 300은 DNA 분해효소를 나타낸다.
도 2는 프로브 DNA가 고정화된 금 나노 입자를 이용하여 타겟 유전자를 검출하기 위해 검출 신호를 발생시키는 생성물을 만드는 과정을 나타낸 것이다. 1은 프로브 DNA가 고정화된 금 나노 입자(200)가 타겟 유전자에 이중가닥으로 혼성화되는 과정이고, 2는 DNA 분해효소가 이중가닥으로 결합한 타겟 검출 DNA의 3' 부터 DNA를 dNTP의 형태로 하나씩 분해하는 과정이며, 3은 이중가닥을 형성하고 있던 타겟 검출 DNA 부분이 전부 DNA 분해효소에 의해 분해되어 더 이상 상보적인 부분이 존재하지 않아 프로브 DNA에서 센싱 DNA 부분만을 남긴 검출 생성물(200a)를 생성하는 과정이고, 4는 시료 상에 존재하는 아직 반응하지 않은 프로브 DNA가 고정된 금 나노 입자가 다시 타겟 유전자로 이중가닥을 형성하는 과정을 나타낸다.
도 3은 생성물이 검출되는 과정을 나타낸 것이다. 센서(400) 표면에 프로브 링커 DNA(205)가 고정되어 있다.
도 4는 샘플 내에 타겟 유전자가 없어서 반응이 일어나지 않았거나 생성물로 전환되지 못한 프로브 DNA가 고정된 금 나노 입자에 의한 위양성 신호를 제거하기 위한 과정을 나타낸다. 200은 프로브 DNA가 고정된 금 나노 입자, 200a는 타겟 검출 DNA 부분이 제거되어 프로브 DNA만 존재하는 금 나노 입자, 200b는 블로킹 과정을 거친 금 나노 입자, 203은 타겟 검출 DNA 부분에 특이적으로 결합하는 프라이머, 204는 블로킹 DNA를 나타낸다.
도 5는 실시예 2-1의 금 나노 입자의 표면 처리 여부에 대한 검증 실험 방법을 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 2-2의 금 나노 입자 표면 처리에 따른 나노 플라즈몬 현상의 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 실시예 2-3의 엑소뉴클리에이즈 Ⅲ에 의한 DNA 제거 효과 확인 실험 및 그 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 2-4의 블로킹 과정 및 그 검증 결과를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 금 나노 입자(201); 타겟 유전자와 결합하도록 상보적인 염기서열을 갖는 타겟 검출 DNA(202b) 및 센서 표면에 결합하도록 염기서열을 갖는 센싱 DNA(202a)로 구성되어 있고, 금 나노 입자에 부착되어 DNA의 말단이 금 나노 입자와 결합하도록 기능화된 프로브 DNA(202); 센싱 DNA와 상보적으로 결합하도록 염기서열을 갖는 프로브 링커 DNA(205); 프로브 DNA 중 타겟 유전자와 이중가닥으로 결합된 타겟 검출 DNA의 3' 부분부터 이중결합을 이루는 부분을 제거하는 DNA 분해효소(300); 및 프로브 링커 DNA가 고정되어 검출을 수행하는 센서(400)를 포함하는, 유전자 검출용 장치에 관한 것이다(도 1 및 3).
본 발명에 있어서, 금 나노 입자는 질량 증대 효과 또는 나노플라즈모닉 현상에 의해 검출 신호를 증폭시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 센서는 질량 변화, 전기적 특성 변화, 또는 굴절률 변화 등을 측정하는, 표면 측정용 센서인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 금 나노 입자는 상기 센서의 종류에 따라 검출 신호를 증폭시킬 수 있는 물성치를 가지는, 폴리머 입자, 자성 입자, 금속성 입자, 형광 입자 등의 다른 종류의 나노 입자로 대체될 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 유전자 검출용 장치는 스페이서를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 유전자 검출용 장치는 다중 검출이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 금 나노 입자의 표면에 타겟 유전자 검출을 위한 프로브 DNA의 개수를 조절하여 부착하여 프로브 금 나노 입자를 형성하는 단계; (b) 시료에 상기 프로브 금 나노 입자를 혼합하여 프로브 DNA의 바깥 말단 부분인 타겟 결합 DNA가 혼성화되는 단계; (c) 타겟 유전자에 상보적으로 결합한 타겟 결합 DNA에 노출된 3' 부분을 핵산 분해효소가 분해하여 상보적으로 결합한 부분을 전부 제거하는 단계; (d) 프로브 금 나노 입자에 남아있는 상보적으로 결합하지 않은 프로브 DNA 부분은 센싱 DNA로, 센서 표면에 상보적인 결합을 하는 부위만 남은 생성물을 얻는 단계; (e) 상기 (b) 내지 (d) 단계를 반복하여 많은 양의 생성물을 얻는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계에서 얻어진 생성물이 센서 표면에 고정화된 프로브 링커 DNA와 상보적 결합을 하여 검출 신호를 발생시키는 단계를 포함하는 금 나노 입자를 이용한 유전자 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 센서는 표면 측정용 센서인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 금 나노 입자는 상기 센서의 종류에 따라 검출 신호를 증폭시킬 수 있는 물성치를 가지는, 폴리머 입자, 자성 입자, 금속성 입자, 형광 입자 등의 다른 종류의 나노 입자로 대체될 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 짧은 길이의 DNA 또는 프로브 DNA 보다 길이가 짧은 표면 처리 물질을 추가하여 프로브 DNA가 표면 전체에 붙지 못하게 하고 특정한 개수로 부착되게 하는 스페이서를 이용하여 금 나노 입자 표면에 부착되는 프로브 DNA의 개수를 조절하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, 상기 표면 처리 물질로는 Polyethylene glycol (PEG), 11-Mercapto-1-undecanol 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, DNA 분해효소가 시료 내에서 확산에 의해 자유롭게 떠돌아다니며 이중결합을 이루는 타겟 유전자와 프로브 DNA가 고정된 금 나노 입자의 타겟 검출 DNA 부분을 제거하고, 이 과정이 반복될수록 하나의 타겟 유전자로부터 여러 개의 생성물이 발생하게 되므로, 하나의 타겟 유전자로부터 다수의 생성물을 얻어, 수량 증가에 의한 신호 증폭 효과가 발생하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 프로브 DNA가 부착된 금 나노 입자가 타겟 유전자와 반응을 하지 못한 경우 센서 표면에서 검출되어 위양성 신호를 나타내는 것을 방지하기 위하여, 타겟 검출 DNA에 상보적으로 결합하는 짧은 DNA 가닥인 프라이머, 타겟 검출 DNA에 결합한 프라이머를 시작점을 프로브 DNA를 따라가며 상보적인 DNA를 합성하여 블로킹 DNA를 형성하는 중합효소, 및 블로킹 DNA 중합의 재료가 되는 dNTP와 DNA 중합 시약을 이용하여 반응하지 못한 금 나노 입자에 부착된 프로브 DNA를 이중가닥으로 만드는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 프로브 DNA의 타겟 검출 DNA 부분이 검출하고자 하는 타겟 유전자 별로 각각 염기서열이 형성되어, 해당되는 유전자에만 결합하고, 이때 센싱 DNA 부분 또한 각각 달리 염기서열이 형성되어, 센서 표면의 각기 다른 프로브 링커 DNA와 이중가닥을 이루어, 다중 검출이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
실시예 1: 금 나노 입자를 이용한 타겟 유전자의 검출
금 나노 입자의 표면에 타겟 유전자 검출을 위한 프로브 DNA의 개수를 조절하여 부착함으로써 프로브 금 나노 입자를 형성하였다. 검체 시료에 상기 프로브 금 나노 입자를 혼합하여 타겟 유전자의 특정 서열에 결합하도록 상보적인 서열로 디자인된 프로브 DNA의 바깥 말단 부분인 타겟 결합 DNA를 혼성화(hybridization)하였다. 그 다음 타겟 유전자에 상보적으로 결합한 타겟 결합 DNA에 노출된 3' 부분을 핵산 분해효소가 분해하여 상보적으로 결합한 부분을 전부 제거하였다. 그 후 프로브 금 나노 입자 및 타겟 유전자와 상보적으로 결합한 부분이 제거되면 프로브 금 나노 입자에 남아있는 상보적으로 결합하지 않았던 프로브 DNA의 부분은 센싱 DNA로서, 센서 표면에 상보적인 결합을 하는 부위만 남게 되는 생성물을 얻었다.
타겟 유전자는 핵산 분해효소에 의해 분해되지 않으므로, 상기 과정을 반복하여, 적은 양의 타겟 유전자로부터 많은 양의 생성물을 얻을 수 있었다.
대량으로 발생한 생성물이 센서의 표면에 미리 고정화된 링커 DNA와 상보적 결합을 하여 검출 신호를 발생시켰다.
1-1: 금 나노 입자를 이용한 타겟 유전자의 검출을 위한 재료의 준비
타겟 유전자는 단일가닥 형태의 유전자로, 이중가닥 유전자일 경우, 95℃로 가열하여 단일가닥으로 만들어주는 변성(denaturation) 과정을 거쳤다. RNA를 검출하기 위해서는 역전사 과정을 거쳐 cDNA를 형성하여 단일가닥 유전자를 만들어낸 후 검출하였다.
금 나노 입자에 프로브 DNA를 고정화한 형태로 유전자를 검출하였다. 프로브 DNA의 고정화는 금 표면에 결합을 하는 싸이올(thiol)을 DNA의 5' 말단에 기능화하여 결합시키거나, 바이오틴(biotin)을 표면에 기능화하여 스트렙트아비딘(streptavidin)을 고정화한 뒤, 프로브 DNA의 5' 말단에 바이오틴을 기능화하여 결합하여 고정화하였다.
프로브 DNA는 센서 칩 표면과 결합하는 센싱 DNA 부분과 여기에 연속적으로 연결되는 타겟 결합 DNA 부분으로 구성된다.
이중가닥 DNA의 3' 말단을 제거하는 DNA 분해효소가 표함된다. DNA 분해효소는 엑소뉴클리에이즈 3을 사용하였으며, 다른 형태의 DNA 분해효소 또는 RNA 분해효소를 사용할 수 있으며, 이 경우 프로브 DNA의 구조를 변경하여 적용한다.
1-2: 검출 신호를 발생시키는 생성물의 생성
프로브 DNA가 고정화된 금 나노 입자가 타겟 유전자에 이중가닥으로 혼성화하였다. 프로브 DNA의 타겟 검출 DNA 부분만이 타겟 유전자의 검출하고자 하는 부분의 염기서열과 상보적이기 때문에 이중가닥을 형성하며 혼성화된다(도 2의 1).
DNA 분해효소가 이중가닥으로 결합한 타겟 검출 DNA의 3' 쪽부터 DNA를 dNTP 형태로 하나씩 분쇄하였다. 타겟 유전자의 3' 부분은 이중가닥을 형성하고 있지 않으므로 DNA 분해효소에 의해 분쇄되지 않는다(도 2의 2).
이중가닥을 형성하고 있던 타겟 검출 DNA 부분이 전부 DNA 분해효소에 의해 분해되어, 더 이상 상보적인 부분이 존재하지 않아, 프로브 DNA에서 센싱 DNA 부분만을 남긴 검출 생성물(200a)이 생성된다. 타겟 유전자는 아무런 손상 없이 다시 단일 가닥 형태로 돌아온다(도 2의 3).
반응 시료 상에 존재하는 아직 반응하지 않은 프로브 DNA가 고정된 금 나노 입자가 다시 타겟 유전자로 이중가닥을 형성한다(도 2의 4).
상기 과정이 반응 시료 내에서 확산에 의해 자유롭게 떠돌아다니는 타겟 유전자와 프로브 DNA가 고정된 금 나노 입자, DNA 분해효소에 의해 일어나므로, 어떠한 외부적인 에너지의 공급 없이 이루어지며, 상기 과정이 반복될수록 하나의 타겟 유전자로부터 많은 양의 검출 생성물을 얻을 수 있었다. 따라서, 타겟 유전자의 수보다 더 많은 수의 검출 생성물을 얻을 수 있으므로, 수량 증가에 의한 신호 증폭 효과가 발생함을 확인할 수 있었다.
상기 과정 반복 후 DNA 분해효소를 비활성화하기 위해서 비활성 온도(~70℃)에 15분간 시료를 노출시켜 비활성화하였다.
1-3: 검출 생성물의 검출
센서 표면에 프로브 링커 DNA(205)가 고정되어 있고, 이 프로브 링커 DNA는 센싱 DNA와 상보적으로 결합하도록 염기서열이 구성되어 있다. 이에 따라 상기 실시예 1-2에서 생성된 검출 생성물이 센서 표면에 특이적 결합을 할 수 있게 된다. 센서는 다양한 형태의 표면 검출 방식의 센서를 말하며, 타겟 유전자의 질량보다 큰 금 나노 입자의 질량에 의해 검출 신호의 향상을 가져온다. 특히 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance) 센서에 적용할 경우 금 나노 입자에 의한 나노 플라즈모닉 현상이 센서 칩 표면의 표면 플라즈몬 현상과 상승 작용을 일으켜 더 큰 검출 신호를 얻을 수 있게 되어, 검출 신호의 증폭 효과를 발생시킬 수 있음을 확인하였다(도 3).
1-4: 금 나노 입자에 의한 신호 제거
타겟 유전자가 없어 반응이 일어나지 않거나, 검출 생성물로 전환되지 못한 프로브 DNA가 고정된 금 나노 입자에 의한 위양성 신호를 제거하였다.
검출 생성물은 프로브 DNA의 말단에 해당하는 타겟 검출 DNA 부분이 제거되어 센서 표면에 고정된 프로브 링커 DNA와 수월하게 상보적 결합을 할 수 있지만, 반응을 거치지 않은 금 나노 입자(200)는 남아 있는 타겟 검출 DNA에 의해 방해를 받아 상대적으로 낮은 결합력을 갖는다. 그러나 단일가닥 유전자는 유연하기 때문에 센싱 DNA 부분이 상보적인 결합을 할 수도 있는바 완전히 결합을 하지 않도록 블로킹하는 과정이 필요하다. 블로킹 과정은 반응을 하지 않은 프로브 DNA가 고정된 금 나노 입자의 말단 부분인 타겟 검출 DNA 부분에 특이적으로 결합하는 프라이머(203)와 DNA 폴리머레이즈와 dNTP 등을 포함하는 PCR 시약을 넣고 어닐링(annealing) 온도(~50℃; 프라이머 염기서열에 따라 다름)에 노출시켜 타겟 검출 DNA에 프라이머가 상보적 결합을 하게 만든다. 그 후 연장(extention) 온도(~75℃)에 노출시켜 DNA 중합과정을 거치면 반응을 하지 않은 금 나노 입자의 프로브 DNA에 상보적으로 이중가닥을 이루는 블로킹 DNA(204)를 형성하게 된다. 블로킹 과정을 거친 금 나노 입자(200b)는 센싱 DNA 부분이 단일가닥으로 노출되지 않아 센서 표면의 프로브 링커 DNA에 결합하지 않는다(도 4).
실시예 2: 검증 실험
2-1: 금 나노 입자 표면 처리에 대한 검증
금 나노 입자의 표면에 프로브 DNA가 정상적으로 결합하였는지를 확인하기 위한 실험을 하였다. 실시예 1의 금 나노 입자(도 5의 좌측 상단의 금 나노 입자, 이하 '좌측 상단 금 나노 입자'라 함), 실시예 1의 금 나노 입자의 타겟 결합 DNA 부분과 상보적으로 결합할 수 있는 상보적인 염기서열을 가지는 DNA가 부착된 금 나노 입자(도 5의 우측 상단의 금 나노 입자, 이하 '우측 상단 금 나노 입자'라 함), 및 응집되지 않도록 처리만 한 금 나노 입자(도 5d의 하단의 금 나노입자, 이하 '하단 금 나노 입자'라 함)의 세 가지 금 나노 입자를 서로 짝을 지어 혼합시킨 결과(샘플 1: 좌측 상단 금 나노 입자 및 하단 금 나노 입자 혼합, 샘플 2: 우측 상단 금 나노 입자 및 하단 금 나노 입자 혼합, 샘플 3: 좌측 상단 금 나노 입자 및 우측 상단 금 나노 입자 혼합), 샘플 1 및 2에서는 금 나노 입자간 결합이 일어나지 않고, 샘플 3의 경우에만 서로 상보적인 금 나노 입자들이 둘씩 쌍을 이루어 결합함을 확인할 수 있었다(도 5).
2-2: 나노 플라즈몬 현상의 변화 관찰
상기 실시예 2-1의 세 가지 샘플의 나노 플라즈모닉 현상의 변화를 관찰하였다. 나노 플라즈모닉 현상은 나노미터 크기를 갖는 금속 나노 입자에서 일어나는 광학적 현상으로 나노 금속 입자의 표면에 존재하는 유전자들이 입사하는 광에 의해 공명하며 특정 파장의 빛을 흡수하여 어떠한 색으로 나타나게 되는 현상으로, 금속 나노 입자의 크기에 따라 그 특정 파장이 달라져 다른 색으로 나타난다. 금속 나노 입자들의 거리가 가까워지는 경우 나노 플라즈모닉 현상이 서로 영향을 미쳐 흡수하는 특정 파장이 변화하게 된다.
샘플 1 및 샘플 2는 금 나노 입자끼리 서로 결합하지 않기 때문에 서로 간의 거리를 일정하게 유지하며 잘 분산된 상태로 존재하게 된다. 그러나 샘플 3은 서로 상보적으로 결합하여 금 나노 입자들의 간격이 가까워져 흡수하는 빛의 파장대가 달라지는 현상이 관찰될 것이다. 이를 확인하기 위하여 분광기로 세 가지 샘플의 광 흡수 영역을 분석하였다.
샘플 1 내지 3을 혼합한 후 1시간, 하루 방치하였을 때, 샘플 1 및 샘플 2에서는 광 흡수 영역이 변화하지 않았으나, 샘플 2은 광 흡수 영역이 1시간 후에는 2nm, 하루 후에는 8nm가 이동하는 것을 확인할 수 있었다(도 6).
추가로 DNA에 의한 상보적인 결합이 맞는지 확인하기 위하여 서로 상보적으로 결합한 DNA의 결합을 끊어주는 변성(denaturation) 과정인, 95℃에서 노출시키는 과정을 거친 뒤 다시 광 흡수 영역을 확인한 결과, 원래의 광 흡수 영역으로 되돌아 간 것을 확인할 수 있었는바, 금 나노 입자 표면에 부착된 프로브 DNA의 존재를 확인할 수 있었다(도 6).
2-3: 엑소뉴클리에이즈 Ⅲ에 의한 DNA 제거 효과 확인
엑소뉴클리에이즈 Ⅲ는 서로 상보적으로 결합한 이중가닥 DNA의 3' 부분부터 차례로 DNA를 제거해나간다. 서로 상보적으로 결합하지 않은 곳에 도달하는 동안 제거 과정이 진행되고, 상보적으로 결합한 이중가닥 부분이 존재하지 않으면 반응이 종료된다. 이에 따라 타겟 결합 DNA가 제거된 금 나노 입자가 생성되게 된다.
이를 확인하기 위하여 Lane 2의 샘플에는 엑소뉴클리에이즈 Ⅲ를 첨가하지 않아 이중가닥 DNA 부분을 남겨 두었고, Lane 1의 샘플에는 엑소뉴클리에이즈 Ⅲ를 첨가하여 이중가닥이 제거될 수 있도록 충분한 시간을 두었다(도 7의 좌측).
이후 이중가닥 DNA 부분이 존재해야 강한 형광을 나타내는 형광 시약을 첨가하여 전기영동(electrophoresis) 과정을 거쳐 형광을 분석하였다. 그 결과, Lane 2의 샘플(2)은 이중가닥 DNA가 존재하여 형광 밴드가 나타났으나, Lane 1의 샘플(1)은 이중가닥이 제거되어 형광 시약이 강하게 빛을 내지 못해 밴드가 보이지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 7의 우측).
이를 통해, 엑소뉴클리에이즈 Ⅲ가 타겟 결합 DNA 부분을 잘 제거하는 것을 확인할 수 있었다.
2-4: 블로킹 과정에 대한 검증
엑소뉴클리에이즈 Ⅲ에 의해 타겟 결합 DNA 부분이 잘리지 않은 금 나노 입자(도 8의 우측 블로킹 과정 최상단)는 위양성(false-positive) 신호를 일으킬 수 있는 금 나노 입자이다. 따라서, 금 나노 입자에 부착된 프로브 DNA를 이중가닥으로 만들어주어 표면에 결합할 수 있는 부분을 막아주는 블로킹 과정을 거치게 된다.
다음으로, 타겟 결합 DNA 부분에 상보적으로 결합하는 프라이머(도 8의 우측 블로킹 과정 두 번째 단계)는 엑소뉴클리에이즈 Ⅲ에 의해 이 부분이 잘려나간 금 나노 입자의 프로브 DNA와는 결합할 수 없으며, 엑소뉴클리에이즈 Ⅲ의 영향을 받지 않은 프로브 DNA와 결합하게 된다.
다음으로, PCR 과정의 연장(extrension) 과정을 거치며 프로브 DNA에 상보적인 DNA로 이중가닥을 이루게 된다. 이 과정을 마치면 이중가닥이 되어 센서 표면의 고정된 DNA와 상보적 결합을 할 수 없게 된다(도 8의 좌측 상단 중 오른쪽 그림).
이러한 블로킹 과정을 확인하기 위하여 추가로 프라이머(도 8의 우측 블로킹 과정의 붉은색 표시)를 첨가하여 프로브 DNA에 해당하는 부분이 계속 증폭되는지 확인하였다. 프로브 DNA는 45mer 길이로 이루어져 있고 이를 계속 증폭하면 형광 시약으로 염색하여 전기영동을 통해 관찰할 수 있다. 계속적으로 증폭이 되었다는 것은 초기 1회 반응이 잘 일어났다는 것을 의미하는바, 블로킹 과정이 잘 수행되었다는 것을 확인할 수 있었다. 45mer에 해당하는 위치에 PCR 프로덕트가 잘 나타나는 것을 확인함으로써, 블로킹 과정의 성공 여부를 확인할 수 있었다(도 8의 좌측 하단).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (12)

  1. 금 나노 입자;
    타겟 유전자와 결합하도록 상보적인 염기서열을 갖는 타겟 검출 DNA 및 센서 표면에 결합하도록 염기서열을 갖는 센싱 DNA로 구성되어 있고, 금 나노 입자에 부착되어 DNA의 말단이 금 나노 입자와 결합하도록 기능화된 프로브 DNA;
    센싱 DNA와 상보적으로 결합하도록 염기서열을 갖는 프로브 링커 DNA;
    프로브 DNA 중 타겟 유전자와 이중가닥으로 결합된 타겟 검출 DNA의 3' 부분부터 이중결합을 이루는 부분을 제거하는 DNA 분해효소; 및
    프로브 링커 DNA가 고정되어 검출을 수행하는 센서를 포함하는, 유전자 검출용 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 센서는 표면 측정용 센서인 것을 특징으로 하는, 유전자 검출용 장치.
  3. 제1항에 있어서, 상기 금 나노 입자는 상기 센서의 종류에 따라 검출 신호를 증폭시킬 수 있는 물성치를 가지는 다른 종류의 나노 입자로 대체될 수 있는 것을 특징으로 하는, 유전자 검출용 장치.
  4. 제1항에 있어서, 스페이서를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 검출용 장치.
  5. 제1항에 있어서, 다중 검출이 가능한 것을 특징으로 하는, 유전자 검출용 장치.
  6. 다음 단계를 포함하는 금 나노 입자를 이용한 유전자 검출 방법:
    (a) 금 나노 입자의 표면에 타겟 유전자 검출을 위한 프로브 DNA의 개수를 조절하여 부착하여 프로브 금 나노 입자를 형성하는 단계;
    (b) 시료에 상기 프로브 금 나노 입자를 혼합하여 프로브 DNA의 바깥 말단 부분인 타겟 결합 DNA가 혼성화되는 단계;
    (c) 타겟 유전자에 상보적으로 결합한 타겟 결합 DNA에 노출된 3' 부분을 핵산 분해효소가 분해하여 상보적으로 결합한 부분을 전부 제거하는 단계;
    (d) 프로브 금 나노 입자에 남아있는 상보적으로 결합하지 않은 프로브 DNA 부분은 센싱 DNA로, 센서 표면에 상보적인 결합을 하는 부위만 남은 생성물을 얻는 단계;
    (e) 상기 (b) 내지 (d) 단계를 반복하여 많은 양의 생성물을 얻는 단계; 및
    (f) 상기 (e) 단계에서 얻어진 생성물이 센서 표면에 고정화된 프로브 링커 DNA와 상보적 결합을 하여 검출 신호를 발생시키는 단계.
  7. 제6항에 있어서, 상기 센서는 표면 측정용 센서인 것을 특징으로 하는, 금 나노 입자를 이용한 유전자 검출 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 금 나노 입자를 상기 센서의 종류에 따라 검출 신호를 증폭시킬 수 있는 물성치를 가지는 다른 종류의 나노 입자로 대체할 수 있는 것을 특징으로 하는, 금 나노 입자를 이용한 유전자 검출 방법.
  9. 제6항에 있어서, 짧은 길이의 DNA 또는 프로브 DNA 보다 길이가 짧은 표면 처리 물질을 추가하여 프로브 DNA가 표면 전체에 붙지 못하게 하고 특정한 개수로 부착되게 하는 스페이서를 이용하여 금 나노 입자 표면에 부착되는 프로브 DNA의 개수를 조절하는 것을 특징으로 하는, 금 나노 입자를 이용한 유전자 검출 방법.
  10. 제6항에 있어서, 하나의 타겟 유전자로부터 다수의 생성물을 얻어, 수량 증가에 의한 신호 증폭 효과가 발생하는 것을 특징으로 하는, 금 나노 입자를 이용한 유전자 검출 방법.
  11. 제6항에 있어서, 타겟 검출 DNA에 상보적으로 결합하는 짧은 DNA 가닥인 프라이머, 타겟 검출 DNA에 결합한 프라이머를 시작점을 프로브 DNA를 따라가며 상보적인 DNA를 합성하여 블로킹 DNA를 형성하는 중합효소, 및 블로킹 DNA 중합의 재료가 되는 dNTP와 DNA 중합 시약을 이용하여 반응하지 못한 금 나노 입자에 부착된 프로브 DNA를 이중가닥으로 만드는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 금 나노 입자를 이용한 유전자 검출 방법.
  12. 제6항에 있어서, 다중 검출이 가능한 것을 특징으로 하는, 금 나노 입자를 이용한 유전자 검출 방법.
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