JP2016516437A - 標的核酸の多重化分析 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2013年4月25日に出願された米国仮特許出願第61/816,070号および2014年2月6日に出願された同第61/936,826号(これらの全体の内容は、参考として本明細書に援用される)に対する優先権およびそれらの利益を主張する。
37 CFR 1.52(e)(5)に従って、テキストファイル形式の配列表(表題「Sequence Listing.txt」、作成日2014年4月25日、サイズ5キロバイト)は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明をより理解しやすくするために、最初に特定の用語を以下に定義する。以下の用語および他の用語に関する追加的な定義は、本明細書全体にわたって説明されている。
本発明は、とりわけ、標的核酸を多重化分析する(例えば、単一または複数の標的を同時に)ための方法および組成物を提供する。本明細書で使用される場合、多重化分析は、これだけに限定されないが、単一の標的核酸または複数の標的核酸を同時に捕捉すること、増幅すること、検出すること、分析すること、および、/または定量化することを含む。
本明細書に記載の方法および組成物は、任意の標的核酸を分析するために使用することができる。一般に、標的核酸は、試料中に存在する任意の形態のDNA、RNA、DNA/RNAキメラ、またはそれらの任意の組合せであってよい。
これだけに限定されないが、生体試料および化学的調製物または組換え調製物を含めた種々の試料はいずれも、本明細書に開示されている方法で使用するために適し得る。一般に、核酸を含有する任意の生体試料(例えば、細胞、組織など)を使用することができる。生体試料の型としては、これだけに限定されないが、細胞、細胞溶解物、FFPE(FASPタンパク質消化)消化物、組織生検材料を含めた組織、全血、血漿、血清、尿、便、唾液、臍帯血、絨毛膜絨毛試料、羊水、および経頸管洗浄液が挙げられる。上述の生体試料のいずれかの細胞培養物、例えば、絨毛膜絨毛培養物、羊水および/または羊膜細胞培養物、血液細胞培養物(例えば、リンパ球培養物)なども本発明の方法に従って使用することができる。一部の実施形態では、生体試料は、がん細胞または腫瘍細胞などの疾患細胞を含む。一部の実施形態では、生体試料は出生前試料である。
種々の実施形態では、標的核酸は、例えば微生物または感染因子を含めた生物学的生物体に見いだされる核酸であってもよく、任意の天然に存在するその構成成分、バイオエンジニアリングによって作製されたその構成成分または合成されたその構成成分であってもよい。本発明のある特定の実施形態では、標的核酸は、遺伝子の一部、調節配列、ゲノムDNA、cDNA、mRNA、rRNA、マイクロRNA、低分子干渉RNA(siRNA)、長鎖非コードRNA(lnc RNA)、低分子核内RNA(snRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)を含めたRNA、またはそれらの任意の組合せであってもよく、それを含有するものであってもよい。本発明のある特定の実施形態では、標的核酸は、核酸類似体または人工核酸、例えばDNA/RNAキメラなどであってよい。
本発明によると、まず、試料を1つまたは複数の捕捉用プローブと接触させることによって標的核酸を捕捉する。本明細書で使用される場合、「捕捉用プローブ」という用語は、少なくとも1つの標的捕捉配列を含むプローブを指す。本明細書で使用される場合、「標的捕捉配列」という用語は、標的核酸、例えば、マイクロRNAに結合し得る核酸配列を指す。一部の実施形態では、捕捉用プローブは、単一の標的捕捉配列を含み、1つの別個の標的核酸に特異的に結合する。一部の実施形態では、捕捉用プローブは、複数(例えば、2、3、4、5、10、またはそれ超)の別個の標的捕捉配列を含み、複数(例えば、2、3、4、5、10、またはそれ超)の別個の標的核酸に結合する。例示的な適切な標的捕捉配列が下に記載されている。
一部の実施形態では、適切な標的捕捉配列は標的核酸(例えば、DNA、mRNA、またはマイクロRNA)に特異的である。「特異的な」という用語は、ハイブリダイゼーションプローブに関連して使用される場合、ストリンジェントな条件下でその標的に結合し得るが、他の領域には結合しない配列を指す。一部の実施形態では、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、少なくとも以下と同様にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を指す:50%ホルムアミド、5×SSC、50mMのNaH2PO4、pH6.8、0.5%SDS、0.1mg/mLの超音波処理したサケ精子DNA、および5×デンハルト溶液中、42℃で一晩のハイブリダイゼーション;45℃、2×SSC、0.1%SDSを用いた洗浄;および45℃、0.2×SSC、0.1%SDSを用いた洗浄。一部の実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、20個の連続したヌクレオチドの一続きにわたって3つ以上の塩基が異なる2つの核酸のハイブリダイゼーションが可能になるものであるべきではない。他の例示的なストリンジェントな条件は当技術分野で周知である。少なくとも所望のレベルの相補性を有する配列は安定にハイブリダイズするが、より低い相補性を有する配列はハイブリダイズしないように、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーをどのように推定し調整するかは当業者には理解される。ハイブリダイゼーション条件およびパラメータの例に関しては、例えば、Sambrookら、1989年、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Press、Plainview、N.Y.;Ausubel, F. M.ら、1994年、Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons、Secaucus、N.Jを参照されたい。
一般に、アダプター結合性配列により、一般には、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応プライミング、逆転写、または他のDNA修飾酵素またはRNA修飾酵素による修飾のための部位として働くように設計されるアダプターに対する結合部位がもたらされる。適切な例示的なアダプターが下に記載されている。したがって、捕捉用プローブ上のアダプター結合性配列は、アダプターと相補的または実質的に相補的である。一般には、アダプター結合性配列および長さは、(1)ライゲーション緩衝液中の融解温度が約10〜20℃になるように、(2)ヘアピン、他の二次構造またはホモ二量体の形成を回避するために、配列が著しく自己相補的にならないように、かつ/または(3)完全なDNAプローブ(アダプターおよびmiRNA配列を伴う)により相当のヘアピンまたは他の二次構造が形成されないように設計される。一部の実施形態では、適切なアダプター配列は、最大20ヌクレオチド(例えば、最大19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1ヌクレオチド)を含有する。
一部の実施形態では、本発明に適した捕捉用プローブは、担体または物体と結びついている。例えば、捕捉用プローブは、担体または物体に付着または固定化されていてもよく、担体または物体のマトリックス内に包埋されていてもよい。適切な担体または物体は、平面状の形態、球状の形態または非球状の形態を有してよい。適切な担体または物体は固体、半固体、ポリマーなどであってよい。例示的な適切な担体は、ヒドロゲル、ガラス、フォトレジスト、シリカ、ポリスチレン、ポリエチレングリコール、アガロース、キトサン、アルギナート、PLGA、光ファイバー、セルロース、およびその組合せからなる群より選択される材料から作製されている。一部の実施形態では、適切な材料はヒドロゲルである。適切な担体はまた、種々の形態、サイズおよび形状であってよい。例えば、適切な担体は、パターン化平面担体、マイクロチップ、プラスチック、ビーズ、バイオフィルム、または粒子であってよい。一部の実施形態では、適切な担体は粒子である。例示目的で、粒子が下で詳述されている。
捕捉用プローブまたは捕捉用プローブを有する担体(例えば、粒子)を、試料と、捕捉用プローブが試料中の1つまたは複数の標的核酸を捕捉することを可能にする条件下で混合することができる。種々の核酸ハイブリダイゼーション条件および技法を捕捉条件として使用することができる。一般には、ストリンジェントな条件を使用する。一部の実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、少なくとも以下と同様にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を指す:50%ホルムアミド、5×SSC、50mMのNaH2PO4、pH6.8、0.5%SDS、0.1mg/mLの超音波処理したサケ精子DNA、および5×デンハルト溶液中、42℃で一晩のハイブリダイゼーション;45℃、2×SSC、0.1%SDSを用いた洗浄;および45℃、0.2×SSC、0.1%SDSを用いた洗浄。他の例示的な条件は当技術分野で周知である。例えば、Sambrookら、1989年、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Press、Plainview、N.Yを参照されたい。少なくとも所望のレベルの相補性を有する配列は安定にハイブリダイズするが、より低い相補性を有する配列はハイブリダイズしないように、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーをどのように推定し調整するかは当業者には理解される。例えば、条件は、ストリンジェントな捕捉をもたらすために、温度、時間、一価塩濃度、二価塩濃度、dNTP濃度、または、DMSO、ホルムアミド、ポリエチレングリコール、2−ピロリドン、もしくはDNA二重鎖形成の動態を変更する他の作用剤の添加を制御することによって調整することができる。
一部の実施形態では、増幅を容易にするために、増幅前に1つまたは複数のアダプターを捕捉された標的核酸とカップリングする。一般には、アダプターは、ポリメラーゼ連鎖反応プライミング、逆転写、または他のDNA修飾酵素またはRNA修飾酵素による修飾のための部位として働くように特異的に設計された配列を含む。一部の実施形態では、適切なアダプターは、公知の普遍的なオリゴヌクレオチド配列を含有し、その結果、同じアダプターを使用して異なる標的核酸を増幅することができる。例えば、適切なアダプターは、PCRを開始するためのフォワードプライマーまたはリバースプライマー認識部位を含有するものであってよい。同じアダプターを異なる標的核酸とカップリングし、PCRプライミング部位として機能させることができる。そのようなアダプターは、普遍的アダプターとも称される。一部の実施形態では、共通の普遍的アダプターを使用して複数の標的を単一反応で増幅することができる。例示的なアダプターの設計および配列は実施例の節に記載されている。
本発明によると、増幅とは、標的核酸をコピーし、それにより、選択された核酸配列のコピー数を増加させるための、当技術分野で公知の任意の方法を指す。増幅は、指数関数的なものであっても線形のものであってもよい。標的核酸はDNAまたはRNAのいずれであってもよい。一般には、このように増幅された配列により「アンプリコン」が形成される。増幅は、これだけに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応(“PCR”)、転写に基づく増幅、等温増幅、ローリングサークル増幅などを含めた種々の方法を用いて達成することができる。
一部の実施形態では、標的核酸、特に標的RNAの増幅には、DNAポリメラーゼ活性と逆転写酵素活性の両方を有する単一の酵素を使用する(いくつかの場合には1酵素系と称される)。そのような酵素の例としては、これだけに限定されないが、PyrophageおよびTtHが挙げられる。
本発明によると、プライマーとは、核酸試料またはアダプター中の相補配列とハイブリダイズ可能な短い一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。一般には、プライマーは、鋳型依存性DNA合成の開始点として働く。DNAポリメラーゼによってデオキシリボヌクレオチドをプライマーに付加することができる。一部の実施形態では、そのようなプライマーへのデオキシリボヌクレオチドの付加は、プライマー伸長としても公知である。プライマーという用語は、本明細書で使用される場合、ペプチド核酸プライマー、ロックド核酸プライマー、ホスホロチオエート修飾プライマー、標識化されたプライマーなどを含めた、合成することができるプライマーの全形態を含む。PCR反応用の「プライマー対」または「プライマーセット」とは、一般には、「フォワードプライマー」および「リバースプライマー」を一般に含むプライマーのセットを指す。本明細書で使用される場合、「フォワードプライマー」とは、dsDNAのアンチセンス鎖とアニーリングするプライマーを指す。「リバースプライマー」はdsDNAのセンス鎖とアニーリングする。
本発明によると、標識化された増幅された標的核酸を作製するための複数のやり方が存在する。一部の実施形態では、標識化されたリバースプライマーを増幅に使用した結果として、増幅された核酸が標識化される。一部の実施形態では、標識化されたdNTPを増幅の間に使用した結果として、増幅された核酸が標識化される。一部の実施形態では、挿入色素を増幅の間に使用した結果として、増幅された核酸が標識化される。
多種多様な検出可能な作用剤のいずれも本発明の実施において使用することができる。適切な検出可能な実体としては、これだけに限定されないが、種々のリガンド、放射性核種;蛍光色素;化学発光剤(例えば、アクリジニウム(acridinum)エステル、安定化ジオキセタンなど);生物発光剤;スペクトル分解可能な無機蛍光半導体ナノ結晶(すなわち、量子ドット);金属ナノ粒子(例えば、金、銀、銅、プラチナなど);ナノクラスター;常磁性金属イオン;酵素;比色標識(例えば、色素、コロイド金など);ビオチン;ジゴキシゲニン(dioxigenin);ハプテン;および抗血清またはモノクローナル抗体が入手可能なタンパク質が挙げられる。
ある特定の実施形態では、検出可能な部分は蛍光色素である。多種多様な化学構造および物理的特性の複数の公知の蛍光色素が本発明の実施において使用するために適している。蛍光検出可能な部分をレーザーによって刺激し、放出光を検出器によって捕捉することができる。検出器は、その強度を記録する電荷結合素子(CCD)または共焦点顕微鏡であってよい。
ある特定の実施形態では、検出可能な部分は放射性同位元素である。例えば、分子を同位体で標識化する(すなわち、天然で通常見いだされる原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子によって置き換えられた1つまたは複数の原子を含有させる)こともでき、同位元素を分子に付着させることもできる。分子に組み入れることができる同位元素の非限定的な例としては、水素、炭素、フッ素、リン、銅、ガリウム、イットリウム、テクネチウム、インジウム、ヨウ素、レニウム、タリウム、ビスマス、アスタチン、サマリウム、およびルテチウムの同位元素(すなわち、3H、13C、14C、18F、19F、32P、35S、64Cu、67Cu、67Ga、90Y、99mTc、111In、125I、123I、129I、131I、135I、186Re、187Re、201Tl、212Bi、213Bi、211At、153Sm、177Lu)が挙げられる。
一部の実施形態では、次いで、増幅産物を、再捕捉用プローブとともにインキュベートすることができ、その結果、増幅された1つまたは複数の標的核酸を検出し、かつ/または分析することができる。一般に、再捕捉用プローブは、捕捉用プローブと同様に、増幅された標的核酸に特異的に結合するように設計することができる。一部の実施形態では、再捕捉用プローブのそれぞれが単一の標的捕捉配列を含有し、1つの別個の標的核酸に特異的に結合する。一部の実施形態では、再捕捉用プローブのそれぞれが複数の別個の標的捕捉配列を含有し、複数の別個の標的核酸に結合し得る。一部の実施形態では、再捕捉用プローブは捕捉用プローブと同一である。一部の実施形態では、捕捉用プローブを使用して、増幅された標的核酸を再捕捉することができる。捕捉用プローブと同様に、再捕捉用プローブの標的化捕捉配列は標的核酸と実質的に相補的である。一部の実施形態では、再捕捉用プローブの標的捕捉配列は、標的核酸に対して1つまたは複数のミスマッチ塩基を含有してよい。
種々の方法を使用して標的核酸を検出、定量化および/または分析することができる。一般には、標的核酸は、再捕捉された増幅された標的核酸と結びついた検出可能な実体によって生じるシグナルを検出することによって検出することができる。一部の実施形態では、プローブと物理的に結びついた実体(例えば、検出可能な部分)からシグナルが発せられ、その時にシグナルが検出される。一部の実施形態では、プローブと物理的に結びついていない実体からシグナルが発せられ、その時にシグナルが検出される。一部の実施形態では、標的核酸の量は、検出されたシグナルの量を参照または対照と比較して定量化することによって決定することができる。
本発明は、種々の適用に使用することができる。例えば、本発明は、生体試料中の標的核酸(例えば、マイクロRNA、DNAまたはmRNA)の検出または定量化に基づいて疾患、障害または状態の診断および予後のために使用することができる。一部の実施形態では、捕捉された標的核酸を核酸ライブラリーの生成および/または配列決定のために使用することもできる。本発明の例示的な適用は、以下および実施例の節で詳述されている。
一部の実施形態では、本発明を使用して、これだけに限定されないが、がん(例えば、肺がん、乳がん、胃がん、膵がん、リンパ腫、白血病、結腸がん、肝臓がんなど)、糖尿病、神経変性疾患(例えば、アルツハイマー病)、感染症、および遺伝病を含めた種々の疾患を診断または予後判定することができる。
ライブラリー構築および試料の調製が依然として配列決定の広範にわたる臨床的採用における2つの主要な障害になっている。本発明は、サイズが制御され、それぞれが所望のプラットフォームに特異的なPCRアダプターおよび/または試料をプールするための配列バーコードを担持するライブラリーを生成するために適合させることができる。この方法は、断片化されたDNAから、またはRNAから直接ライブラリーを生成するために適している。
この実施例では、例示的な粒子によりマイクロRNAを捕捉することができること、および、それらのシグナルをPCRまたはPCR様反応および蛍光産物の生成によって増幅することができることが実証される。例示的な方法が以下に詳述されている。
ヒドロゲル粒子は、Pregibon、Doyleらによって開発されたストップフローリソグラフィーによって作製し、その結果、桿形状の粒子が作出され、それぞれが独自のDNAプローブおよび蛍光コードを含有する。各DNAプローブは、特異的な低分子RNAと相補的な領域、および、全てのプローブに共通する5’末端と3’末端の両方の隣接領域からなる。
Firefly Plasma/Serum(PS)プロトコールを実行するための調製物では、PCRコンタミネーションを最小限にするために、全ての作業面を、最良の実施を反映する様式で調製することが重要である。これらとしては、これだけに限定しなくてもよいが、作業面を漂白し、次いでUVに少しの間曝露する、または作業面をLookOut DNA Erase(Sigma)などのDNA除去洗浄剤できれいにすることが挙げられる。常にフィルターチップを使用するべきである。
ハイブリダイゼーション後、粒子をライゲーション溶液75μlに再懸濁させ、室温で1時間振とうする。ライゲーション溶液は、Tris−EDTA、T4 RNAリガーゼ2、ATP、MgCl2、Tween−20、グリセロール、5’アダプターおよび3’アダプターからなる。5’アダプター配列は、rGrCrUrArGrUrCrCrUrArUrGrCrArArUrGrUrCrArUrArArArUrArUrArArArU(配列番号1)、CCTATGCAATGTCArUrArArArUrArUrArArArU(配列番号2)、GGCTGAGTGCAGTGCGAGrArArArUrArUrArArArU(配列番号3)およびGGTTGGCCACGTGACTTGATCTTrArArArUrArUrArArArU(配列番号4)を含む。配列番号1〜4において、G、C、AまたはUの前の「r」はリボヌクレオチドを指す。3’アダプター配列は、
/5Phos/TAATAAAATATATCCGTCGATAAGCGGATCTATC(配列番号5)、
/5Phos/TAATAAAATATATCCGTCGATAAGCG(配列番号6)、
/5Phos/TTTAAAATATATCCGTCGATAAGCG(配列番号7)、
/5Phos/TAATAAAATATATCCGTCGATAAGCG(配列番号8)、および
/5Phos/TTTAAAATATATCAAGCGTCAATTAGCGCGA(配列番号9)。
を含む。
前のステップからの溶離液30μlをPCRマスターミックス20μlに添加することによってPCRを実施する。このPCRマスターミックスは、PCR Buffer、フォワードプライマー、リバースプライマー、dNTP、およびPyrophage Exo(−)ポリメラーゼ酵素からなる。
/5Cy5/CCTATGCAATGTCATAAATATAAAT(配列番号12)、
/5Cy5/GGCTGAGTGCAGTGCGAGAAA(配列番号13)、および
/5Cy5/GGTTGGCCACGTGACTTGATCTT(配列番号14)を含む。
CGCTTATCGACGGATATATTTTATTA(配列番号17)、
CGCTTATCGACGGATATATTTTAAA(配列番号18)、
CGCTTATCGACGGATATATTTTATTA(配列番号19)および
TCGCGCTAATTGACGCTT(配列番号20)を含む。
PCR反応が完了したすぐ後に、ヒドロゲル粒子を含有するフィルタープレートを室温に戻し、再ハイブリダイゼーション緩衝液(1MのNaCl、5×TE、pH8.0、50%2−ピロリドンからなる)100μlを、粒子を含有する各ウェルに添加し、PCR産物40μlも添加する。この混合物を37℃で30分振とうして、標識化された産物と粒子をハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後、200μlのRinse Solutionを用いて粒子を2回洗浄する。最後に、密度を釣り合わせたRun Buffer、175μlを各ウェルに添加し、試料を適切なフローサイトメーターに流す。
最終的なアンプリコン測定は、エンコーディングされた微小粒子をフローサイトメーター(例えば、Guava 8HTフローサイトメーターなど)を介して走査するか、またはマイクロアレイリーダーなどの標準の器械使用において蛍光コードをデコンボリューションすることにより行うことができる。
合成マイクロRNAでの検出限界
既知濃度でアッセイした合成マイクロRNA標的を使用して、この多重化PCRカップリングハイブリダイゼーションアッセイの絶対的な性能を評価した。下記の図3のデータにより、このアッセイの検出限界が、使用するサイクリング条件で試料当たり100分子までの低さであり得ることが実証される。
多重化PCRカップリングハイブリダイゼーションアッセイからの増幅の程度は、サイクル数によって調整することができる。図4のデータは、サイクル数の増加を伴う、3つの検出された標的および3つの検出されなかった標的についてのシグナルを示すものである。これにより、このアッセイによって網羅される感度およびダイナミックレンジを必要に応じてシフトさせることができることが示される。
以下ではFirefly HS’’と称される多重化PCRカップリングマイクロRNAアッセイを用いて、3つの組織型:肺、脳、および胎盤から単離したRNAにわたってのマイクロRNAプロファイルを測定した。これらの結果を、IlluminaプラットフォームでのRNA−Seq、Taqman qPCR(TLDA カード形式)、およびマイクロアレイ解析によってもたらされたプロファイルと直接比較した(図5を参照されたい)。3連の測定値により、使用した異なる解析方法間で適切にクラスター形成する堅固なプロファイルが実証される。各方法間のピアソン相関が図5に示されている。
脳組織から単離した全RNAを、PCRカップリングハイブリダイゼーションアッセイを用いて2 logの全RNAインプットにわたってアッセイした。図6において実証されている通り、100ナノグラム、10ナノグラム、および1ナノグラムの全RNAインプットで、選択されたマイクロRNA標的のパネルについて堅固なプロファイルを得た。シグナルの大きさはRNAインプットが減少すると小さくなった。しかし、平均正規化を適用した場合のマイクロRNAプロファイルは事実上同一であった。種々の試料インプットにわたるR平方相関は0.9574から0.9894の間であることが見いだされ、これにより、種々のレベルのRNAインプットについて高レベルの一致が示される。
ヒト血清から単離したRNAを30種のマイクロRNA標的について新規のPCRカップリングアッセイを用いて3連でアッセイした。図7に示されている結果により、血清試料からほとんど全ての標的マイクロRNAが検出されたので、このアッセイが血清試料中の低分子RNA分子の存在量を測定するためによく適していることが実証される。
臨床的な状況において循環核酸バイオマーカーを広範にわたって採用することの主要な障壁は依然として、組織および生体液からのRNAの有機抽出に付随する時間および労力である。これは、依然として、抽出によって除去しなければならない混入物および潜在的なPCR阻害剤に起因して、最新のアッセイの要件になっている。この新規のPCRカップリングハイブリダイゼーションアッセイでは、非汚損性ヒドロゲル粒子を利用して、低分子RNA標的が複合試料からさえも選択的に捕捉される。したがって、この方法では、粗製のまたは最小限の精製がなされた試料をインプットとして採り入れることができる。この概念を試験するために、プロテイナーゼK、界面活性物質、およびカオトロピック塩を含有する緩衝液を様々な量の血清に直接添加した。この緩衝液は、RNA関連タンパク質およびエキソソームを破壊する機能、ならびにRNAseの活性を阻害する機能を果たす。図8に示されている通り、このアッセイから得られたデータにより、わずか1マイクロリットルの粗製血清から堅固なマイクロRNA測定を行うことができることが示唆される。図8には、5マイクロリットル、2マイクロリットル、および1マイクロリットルの粗製血清インプットから行ったマイクロRNA測定が示されている。これにより、このアッセイを使用して、循環マイクロRNAマーカーを最小限の精製がなされた試料からさえ検出することができることが実証される。
この実施例では、例示的な粒子によりmRNAを捕捉し、それらのシグナルをPCRまたはPCR様反応および蛍光産物の生成によって増幅することができることが実証される。例示的な方法が下に記載されている。
この実施例では、例示的な粒子により、lncRNAを捕捉し、それらのシグナルをPCRまたはPCR様反応および蛍光産物の生成によって増幅することができることが実証される。例示的な方法が下に記載されている。
この実施例では、核酸量子化において本発明と併せてヌクレアーゼ消化を使用することができることが実証される。例示的な方法が下に記載されている。
この実施例では、実施例1に記載の例示的なアッセイをタンパク質検出アッセイに適合し得ることが実証される。例示的な方法が下に記載されている。
この実施例では、実施例1に記載の例示的なアッセイを、制御されたサイズの配列決定ライブラリーの構築において使用することができることが実証される。例示的な方法が下に記載されている。
この実施例では、病原体DNAまたはRNAの検出、環境試料中の種の検出、食物混入物の検出、遺伝的バリアントの検出、および医薬品産業のための化合物のハイスループットなスクリーニングを含めた多くの特異的な目的のために、実施例1に記載の例示的なアッセイを使用することができることが実証される。
バイオセーフティ、疫学的目的または診断目的のために、試料中の特定の病原体由来の低レベルのDNAまたはRNAを検出することが多くの場合に有利である。この目的のために本発明の方法を以下の通り利用することができる:1)標的配列に特異的な浮動性プローブを試料由来の核酸とハイブリダイズさせる。2)アダプターを記載の通り両側面にライゲーションするが、アダプター配列はライゲーション部位の近くの標的DNAにマッチするように設計する。3)上記の通り増幅を実施する。および4)多重検出のために増幅産物をヒドロゲル粒子上に捕捉する。プローブは、関連する病原体の間での標的化された配列の保存の程度に応じて、特定の病原体種に特異的なものであっても、進化クレード全体に特異的なものであってもよい。
病原体の検出と同様に、生態学的モニタリングまたは生態学的研究のために、本発明の方法を使用して、環境試料中の関連する種の少量の特定の種またはクレードを検出することができる。
病原体の検出と同様に、食物の安全性および標識化の正確度をモニタリングするために、本発明の方法を使用して、食物試料中の関連する種の少量の特定の種またはクレードを検出することができる。
病原体の検出に関して上記された実施形態は、ライゲーション部位における一塩基差異に対して感受性である。これにより、医学的目的、法医学的目的、農業に関する目的、および生態学的目的のために、生体試料中の一塩基多型を検出するために適したものになる。任意の他の多型も検出することができる。少数の異常な細胞が多くのより正常な細胞によって遮蔽される腫瘍学的適用において重要な、低レベルの多型を検出することができる。
本開示は種々の実施形態または実施例と関連して記載されているが、本開示はそのような実施形態または実施例に限定されるものではない。それどころか、本開示は、当業者に理解される種々の代替物、修飾、および等価物を包含する。したがって、説明、方法および図は、その旨が明示されていない限り、記載されている要素の順序に限定されるものと解釈されるべきではない。
Claims (149)
- 標的核酸を検出する方法であって、
a)試料を、それぞれが少なくとも1つの標的捕捉配列を含む1つまたは複数の捕捉用プローブと、前記1つまたは複数の捕捉用プローブが前記試料中の1つまたは複数の標的核酸を捕捉することを可能にする条件下で接触させるステップ;
b)前記捕捉された1つまたは複数の標的核酸を、検出可能な実体を含む反応混合物中で増幅するステップであって、前記ステップにより、前記増幅された1つまたは複数の標的核酸が、前記検出可能な実体で標識化される、ステップ;
c)増幅産物を複数の再捕捉用プローブとともにインキュベートするステップであって、前記ステップにより、前記増幅された1つまたは複数の標的核酸が前記複数の再捕捉用プローブによって再捕捉される、ステップ;
d)前記再捕捉された増幅された1つまたは複数の標的核酸と結びついた検出可能な実体によって生じるシグナルを検出するステップであって、前記検出可能なシグナルの存在および/または存在量により、前記試料中の前記1つまたは複数の標的核酸の存在および/または存在量が示される、ステップ
を含む、方法。 - 前記捕捉用プローブのそれぞれが、1つの標的捕捉配列を含み、かつ1つの別個の標的核酸に特異的に結合する、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉用プローブのそれぞれが、複数の別個の標的捕捉配列を含み、かつ複数の別個の標的核酸に結合する、請求項1に記載の方法。
- 前記再捕捉用プローブのそれぞれが、1つの標的捕捉配列を含み、かつ1つの別個の標的核酸に特異的に結合する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記再捕捉用プローブのそれぞれが、複数の別個の標的捕捉配列を含み、かつ複数の別個の標的核酸に結合する、請求項1から3までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉用プローブが同一のものであり、前記再捕捉用プローブが同一のものである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉用プローブおよび/または前記再捕捉用プローブが担体に結びついている、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体が、ヒドロゲル、ガラス、フォトレジスト、シリカ、ポリスチレン、ポリエチレングリコール、アガロース、キトサン、アルギナート、PLGA、光ファイバー、セルロース、およびその組合せからなる群より選択される材料から作製されている、請求項7に記載の方法。
- 前記材料がヒドロゲルである、請求項8に記載の方法。
- 前記担体がパターン化平面担体、マイクロチップ、プラスチック、ビーズ、バイオフィルム、粒子である、請求項7または8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体が粒子である、請求項7から10までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉用プローブまたは前記再捕捉用プローブが前記粒子の1つまたは複数のプローブ領域全体にわたって包埋されている、請求項11に記載の方法。
- 前記粒子が、1つまたは複数のエンコーディング領域をさらに含み、前記1つまたは複数のエンコーディング領域が前記捕捉用プローブまたは前記再捕捉用プローブの同一性をもたらす検出可能な部分を担持する、請求項12に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の標的核酸がマイクロRNA、mRNA、非コード転写物、ゲノムDNA、cDNA、siRNA、DNA/RNAキメラ、またはその組合せである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プローブがDNA、RNA、DNA/RNAキメラ、またはその組合せである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸に特異的なプローブが、前記標的核酸と実質的に相補的な標的捕捉配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 1つまたは複数のアダプターを前記捕捉された標的核酸とカップリングするステップをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のアダプターが普遍的アダプターである、請求項17に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のアダプターを、3’末端、5’末端、または3’末端と5’末端の両方で前記標的核酸とカップリングする、請求項18に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のアダプターがDNA、RNA、DNA/RNAキメラ、またはその組合せである、請求項17から19までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉された標的核酸を、前記1つまたは複数のアダプターのカップリングの前に、まずヌクレアーゼまたは制限酵素によって消化して一本鎖5’領域および/または3’領域を除去する、請求項17から20までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉用プローブのそれぞれが、前記1つまたは複数のアダプターと相補的な配列をさらに含む、請求項17から21までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のアダプターと相補的な配列が前記標的捕捉配列に隣接している、請求項22に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のアダプターをライゲーションによって前記標的核酸とカップリングする、請求項17から23までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記ライゲーションをDNAまたはRNAリガーゼ酵素によって実施する、請求項24に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のアダプターが、ポリメラーゼ連鎖反応プライミング、逆転写、または他のDNA修飾酵素またはRNA修飾酵素による修飾のための部位として働くように特異的に設計された配列を含む、請求項17から25までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉された標的核酸を増幅するステップが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実施することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PCR反応でTaq、Bst、および/またはPhi29から選択されるポリメラーゼ酵素を使用する、請求項27に記載の方法。
- 前記捕捉された標的を増幅する前に逆転写する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 逆転写が、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼ酵素によって触媒される、請求項29に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ酵素がPyrophageまたはTtHである、請求項30に記載の方法。
- 逆転写が1つの酵素によって触媒され、PCR増幅が第2の酵素によって行われる、請求項29に記載の方法。
- 前記捕捉された標的核酸を増幅するステップを等温で実施する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸および/または前記1つまたは複数のアダプターをライゲーションまたは酵素的重合によって環状化する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PCRを、単一のプライマーセットを用いて実施する、請求項27から34までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記PCRを、1種のプライマーを用いて実施する、請求項34に記載の方法。
- 前記PCRを、前記担体に付着させたプライマーを用いて実施する、請求項27から36までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記PCRを、普遍的プライマー、特異的プライマー、またはポリ(A)プライマーの組合せを使用して実施する、請求項27から37までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出可能な実体が、フルオロフォア、色素、ビオチン、放射性同位元素、抗体、アプタマー、ポリペプチド、量子ドット、発色団からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出可能な実体が、前記反応混合物中に、標識化されたプライマー、標識化されたdNTPおよび/または挿入色素として提供される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉された1つまたは複数の標的核酸を、増幅する前に前記捕捉用プローブから分離する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉された1つまたは複数の標的核酸を、熱、化学的変性剤、またはヘリカーゼ酵素を使用した変性によって前記捕捉用プローブから分離する、請求項41に記載の方法。
- 前記担体が増幅時間中存在する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉された1つまたは複数の標的核酸を増幅するステップを、単一のプライマーを使用して実施する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉された1つまたは複数の標的核酸を増幅するステップを、5つ未満のプライマー対を使用して実施する、請求項1から43までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記PCRに、前記増幅された1つまたは複数の標的核酸の相当な割合が一本鎖になるようにバイアスをかける、請求項27から45までのいずれか一項に記載の方法。
- アニーリング温度がリバースプライマーよりも有意に低いフォワードプライマーを設計することによって、前記PCRに一本鎖の増幅された標的核酸の方向にバイアスをかける、請求項46に記載の方法。
- 前記フォワードプライマーを前記PCR反応の間に使い尽くされるような濃度で添加することによって前記PCRに一本鎖の増幅された標的核酸の方向にバイアスをかける、請求項46に記載の方法。
- 前記フォワードプライマーと前記リバースプライマーの比が1:2未満である、請求項48に記載の方法。
- 前記増幅産物および前記複数の再捕捉用プローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ステップの間に前記担体をすすいで、結合していないプローブ、標的核酸および/またはアダプターを除去する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉用プローブまたは前記再捕捉用プローブが、標的核酸に対するミスマッチ塩基を1つまたは複数含有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記条件を、ストリンジェントな捕捉をもたらすために、温度、時間、一価塩濃度、二価塩濃度、dNTP濃度、または、DMSO、ホルムアミド、ポリエチレングリコール、2−ピロリドン、もしくはDNA二重鎖形成の動態を変更する他の作用剤の添加を制御することによって調整する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が生体試料である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体試料が、単離されたDNAまたはRNAの調製物、プロテアーゼ組織消化物、細胞溶解物、血清、血漿、全血、尿、便、唾液、臍帯血、絨毛膜絨毛試料、絨毛膜絨毛試料培養物、羊水、羊水培養物、経頸管洗浄液、およびその組合せである、請求項54に記載の方法。
- 前記検出可能な実体によって生じるシグナルをフローサイトメーターまたはアレイスキャナーによって検出する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シグナルを定量化する、請求項56に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の捕捉用プローブが、複数の標的核酸に特異的な複数の捕捉用プローブを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のプローブが複数の粒子と結びついており、各粒子が同じ標的核酸に特異的なプローブを含む、請求項58に記載の方法。
- 前記各粒子が、前記粒子上の特異的なプローブの同一性をもたらすようにエンコーディングされている、請求項59に記載の方法。
- 前記各粒子が、スペクトル特性が既知である1つまたは複数のフルオロフォアを組み入れることによってエンコーディングされている、請求項60に記載の方法。
- 前記複数の捕捉用プローブが、平面担体の複数の別個の領域上に位置する、請求項59に記載の方法。
- 前記増幅された1つまたは複数の標的核酸を再捕捉するステップを、前記捕捉ステップよりも実質的にストリンジェントな条件下で実施する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記反応混合物が、複数の別個の標的核酸を増幅するために使用される単一のプライマーセットを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記反応混合物が、複数の別個の標的核酸を増幅するために使用される複数のプライマーセットを含む、請求項1から63までのいずれか一項に記載の方法。
- 各標的核酸が前記試料において低存在量で存在する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 各標的核酸が前記生体試料中の全核酸の1%未満である、請求項66に記載の方法。
- 各標的核酸が前記生体試料中の全核酸の0.1%未満である、請求項66に記載の方法。
- 各標的核酸が前記生体試料中の全核酸の百万分の1未満である、請求項66に記載の方法。
- 各標的核酸が前記生体試料中の全核酸の1千万分の1未満である、請求項66に記載の方法。
- 標的核酸を検出する方法であって、
a)1つまたは複数の標的核酸を含む試料を、それぞれが少なくとも1つの標的捕捉配列を含む複数の捕捉用プローブを担持する粒子の第1のセットと、前記複数の捕捉用プローブが前記試料中の1つまたは複数の標的核酸を捕捉することを可能にする条件下で接触させるステップ;
b)前記捕捉された1つまたは複数の標的核酸を、検出可能な実体を含む反応混合物中で増幅するステップであって、前記ステップにより、前記増幅された1つまたは複数の標的核酸が、前記検出可能な実体で標識化される、ステップ;
c)増幅産物を、複数の再捕捉用プローブを担持する粒子の第2のセットとともにインキュベートするステップであって、前記ステップにより、前記増幅された1つまたは複数の標的核酸が前記複数の再捕捉用プローブによって再捕捉される、ステップ
を含み、ここで、
各粒子が前記複数の捕捉用プローブまたは再捕捉用プローブを担持する1つまたは複数のプローブ領域、および前記粒子上の捕捉用プローブまたは再捕捉用プローブの同一性をもたらす検出可能な部分を担持する1つまたは複数のエンコーディング領域を有し、
前記粒子の第2のセット上の前記再捕捉された増幅された1つまたは複数の標的核酸と結びついた検出可能な実体により生じる検出可能なシグナルの存在および/または存在量により、前記試料中の前記1つまたは複数の標的核酸の存在および/または存在量が示される、
方法。 - 前記粒子の第2のセットをフロースルーデバイスによって走査して、前記再捕捉された増幅された1つまたは複数の標的核酸に結びついた前記検出可能なシグナルの存在および/または存在量ならびに前記粒子の1つまたは複数のエンコーディング領域に結びついた前記検出可能な部分を検出するステップを含む、請求項71に記載の方法。
- 前記粒子の第1のセットが、別個の捕捉用プローブを担持する別個の粒子を含む、請求項71または72に記載の方法。
- 各粒子が、複数の同一の捕捉用プローブを担持する、請求項73に記載の方法。
- 前記粒子の第2のセットが、別個の再捕捉用プローブを担持する別個の粒子を含む、請求項71から74までのいずれか一項に記載の方法。
- 各粒子が、複数の同一の再捕捉用プローブを担持する、請求項75に記載の方法。
- 前記粒子の第1のセットと第2のセットが同一である、請求項71から76までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記粒子の第1のセットと第2のセットが同じセットである、請求項71から77までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記粒子が、ヒドロゲル、ガラス、フォトレジスト、シリカ、ポリスチレン、ポリエチレングリコール、アガロース、キトサン、アルギナート、PLGA、光ファイバー、セルロース、およびその組合せからなる群より選択される材料から作製されている、請求項71から78までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記粒子がヒドロゲル粒子である、請求項71から78までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記粒子の少なくとも1つの寸法が約1μm超から約450μmまでである、請求項71から80までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉用プローブまたは前記再捕捉用プローブが、前記粒子の1つまたは複数のプローブ領域全体にわたって包埋されている、請求項71から81までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記粒子が、1つまたは複数のエンコーディング領域をさらに含み、前記1つまたは複数のエンコーディング領域が、前記捕捉用プローブまたは前記再捕捉用プローブの同一性をもたらす検出可能な部分を担持する、請求項82に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の標的核酸がマイクロRNA、mRNA、非コード転写物、ゲノムDNA、cDNA、siRNA、DNA/RNAキメラ、またはその組合せである、請求項71から83までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記プローブがDNA、RNA、DNA/RNAキメラ、またはその組合せである、請求項71から84までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸に特異的なプローブが、前記標的核酸と実質的に相補的な標的捕捉配列を含む、請求項71から85までのいずれか一項に記載の方法。
- 1つまたは複数のアダプターを前記捕捉された1つまたは複数の標的核酸とカップリングするステップをさらに含む、請求項71から86までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のアダプターが普遍的アダプターである、請求項87に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のアダプターを、3’末端、5’末端、または3’末端と5’末端の両方で前記標的核酸とカップリングする、請求項88に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のアダプターがDNA、RNA、DNA/RNAキメラ、またはその組合せである、請求項87から89までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉された標的核酸を、前記1つまたは複数のアダプターのカップリングの前に、まずヌクレアーゼまたは制限酵素によって消化して一本鎖5’領域および/または3’領域を除去する、請求項71から90までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉用プローブのそれぞれが、前記1つまたは複数のアダプターと相補的な配列をさらに含む、請求項71から91までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のアダプターと相補的な配列が前記標的捕捉配列に隣接している、請求項92に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のアダプターをライゲーションによって前記標的核酸とカップリングする、請求項87から93までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記ライゲーションをDNAまたはRNAリガーゼ酵素によって実施する、請求項94に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のアダプターが、ポリメラーゼ連鎖反応プライミング、逆転写、または他のDNA修飾酵素またはRNA修飾酵素による修飾のための部位として働くように特異的に設計された配列を含む、請求項87から94までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉された標的核酸を増幅するステップが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実施することを含む、請求項71から96までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉された1つまたは複数の標的核酸を前記粒子の存在下で増幅する、請求項71から96までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉された1つまたは複数の標的核酸を、増幅する前にまず前記粒子から分離する、請求項71から96までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉された標的を増幅する前に逆転写する、請求項71から96までのいずれか一項に記載の方法。
- 増幅のための前記反応混合物が、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼ酵素を含む、請求項71から96までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ酵素がPyrophageまたはTtHである、請求項101に記載の方法。
- 増幅のための前記反応混合物が、逆転写酵素および別々のポリメラーゼ酵素を含む、請求項71から96までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ酵素がTaq、Bst、および/またはPhi29から選択される、請求項103に記載の方法。
- 前記捕捉された標的核酸を増幅するステップを等温で実施する、請求項71から104までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸および/または前記1つまたは複数のアダプターをライゲーションまたは酵素的重合によって環状化する、請求項71から104までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記PCRを、単一のプライマーセットを用いて実施する、請求項97から106までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記PCRを、1種のプライマーを用いて実施する、請求項106に記載の方法。
- 前記PCRを、前記担体に付着させたプライマーを用いて実施する、請求項97から108までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記PCRを、普遍的プライマー、特異的プライマー、またはポリ(A)プライマーの組合せを使用して実施する、請求項97から109までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出可能な実体が、フルオロフォア、色素、ビオチン、放射性同位元素、抗体、アプタマー、ポリペプチド、量子ドット、発色団からなる群より選択される、請求項71から110までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出可能な実体が、前記反応混合物中に、標識化されたプライマー、標識化されたdNTPおよび/または挿入色素として提供される、請求項71から111までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉された1つまたは複数の標的核酸を、増幅する前に前記捕捉用プローブから分離する、請求項71から112までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉された1つまたは複数の標的核酸を、熱、化学的変性剤、またはヘリカーゼ酵素を使用した変性によって前記捕捉用プローブから分離する、請求項113に記載の方法。
- 前記担体が増幅時間中存在する、請求項71から114までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉された1つまたは複数の標的核酸を増幅するステップを、単一のプライマーを使用して実施する、請求項71から115までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉された1つまたは複数の標的核酸を増幅するステップを、5つ未満のプライマー対を使用して実施する、請求項71から115までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記PCRに、前記増幅された1つまたは複数の標的核酸の相当な割合が一本鎖になるようにバイアスをかける、請求項97から117までのいずれか一項に記載の方法。
- アニーリング温度がリバースプライマーよりも有意に低いフォワードプライマーを設計することによって、前記PCRに一本鎖の増幅された標的核酸の方向にバイアスをかける、請求項118に記載の方法。
- 前記フォワードプライマーを前記PCR反応の間に使い尽くされるような濃度で添加することによって前記PCRに一本鎖の増幅された標的核酸の方向にバイアスをかける、請求項118に記載の方法。
- 前記フォワードプライマーと前記リバースプライマーの比が1:2未満である、請求項120に記載の方法。
- 前記増幅産物および前記複数の再捕捉用プローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、請求項71から121までのいずれか一項に記載の方法。
- ステップの間に前記粒子をすすいで、結合していないプローブ、標的核酸および/またはアダプターを除去する、請求項71から122までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉用プローブまたは前記再捕捉用プローブが、標的核酸に対するミスマッチ塩基を1つまたは複数含有する、請求項71から123までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記条件を、ストリンジェントな捕捉をもたらすために、温度、時間、一価塩濃度、二価塩濃度、dNTP濃度、または、DMSO、ホルムアミド、ポリエチレングリコール、2−ピロリドン、もしくはDNA二重鎖形成の動態を変更する他の作用剤の添加を制御することによって調整する、請求項71から124までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が生体試料である、請求項71から125までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体試料が、単離されたDNAまたはRNAの調製物、プロテアーゼ組織消化物、細胞溶解物、血清、血漿、全血、尿、便、唾液、臍帯血、絨毛膜絨毛試料、絨毛膜絨毛試料培養物、羊水、羊水培養物、経頸管洗浄液、およびその組合せである、請求項126に記載の方法。
- 前記検出可能な実体によって生じるシグナルをフローサイトメーターまたはアレイスキャナーによって検出する、請求項71から127までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記フロースルーデバイスがフローサイトメーターまたはアレイスキャナーである、請求項72から128までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記シグナルを定量化する、請求項128に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の捕捉用プローブが、複数の標的核酸に特異的な複数の捕捉用プローブを含む、請求項71から130までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のプローブが複数の粒子と結びついており、各粒子が同じ標的核酸に特異的なプローブを含む、請求項131に記載の方法。
- 前記各粒子が、前記粒子上の特異的なプローブの同一性をもたらすようにエンコーディングされている、請求項132に記載の方法。
- 前記各粒子が、スペクトル特性が既知である1つまたは複数のフルオロフォアを組み入れることによってエンコーディングされている、請求項133に記載の方法。
- 前記複数の捕捉用プローブが、平面担体の複数の別個の領域上に位置する、請求項132に記載の方法。
- 前記増幅された1つまたは複数の標的核酸を再捕捉するステップを、前記捕捉ステップよりも実質的にストリンジェントな条件下で実施する、請求項71から135までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記反応混合物が、複数の別個の標的核酸を増幅するために使用される単一のプライマーセットを含む、請求項71から136までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記反応混合物が、複数の別個の標的核酸を増幅するために使用される複数のプライマーセットを含む、請求項71から136までのいずれか一項に記載の方法。
- 各標的核酸が前記試料において低存在量で存在する、請求項71から138までのいずれか一項に記載の方法。
- 各標的核酸が前記生体試料中の全核酸の1%未満である、請求項139に記載の方法。
- 各標的核酸が前記生体試料中の全核酸の0.1%未満である、請求項139に記載の方法。
- 各標的核酸が前記生体試料中の全核酸の百万分の1未満である、請求項139に記載の方法。
- 各標的核酸が前記生体試料中の全核酸の1千万分の1未満である、請求項139に記載の方法。
- 前記請求項のいずれか一項に記載の1つまたは複数の標的核酸を検出するステップを含む診断方法。
- 標的核酸を検出するためのキットであって、
粒子であって、標的捕捉配列を含むプローブを担持する1つまたは複数のプローブ領域、および前記粒子上のプローブの同一性をもたらす検出可能な部分を担持する1つまたは複数のエンコーディング領域を含む、粒子;
所定のイオン強度、緩衝化されたpH、および変性試薬を伴うハイブリダイゼーション緩衝液;
ポリメラーゼ連鎖反応プライミングおよび/または逆転写のための部位として働くように設計されたアダプターを含む標識化緩衝液;
プライマー、dNTP、および捕捉された標的を増幅するための試薬を含有するPCR緩衝液
を含む、キット。 - リガーゼを含む、請求項145に記載のキット。
- 逆転写酵素およびポリメラーゼをさらに含む、請求項145または146に記載のキット。
- 逆転写酵素活性を有するポリメラーゼをさらに含む、請求項145または146に記載のキット。
- 前記変性試薬がホルムアミドおよび/または2−ピロリドンである、請求項145から148までのいずれか一項に記載のキット。
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