KR101556798B1 - 고성능 분석을 위한 다중기능성 인코딩된 입자 - Google Patents

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Abstract

다중기능성 입자(multifunctional particle)를 만드는 방법. 상기 방법은 마이크로유동 채널(microfluidic channel)을 따라서 형광 존재(fluorescent entity)를 구비한 첫 번째 단량체 흐름(monomer stream)을 흘려보내는 단계 및 마이크로유동 채널을 따라서 첫 번째 단량체 흐름에 인접하도록, 프로브를 구비한 두 번째 단량체 흐름을 흘려보내는 단계를 포함한다. 이들 단량체 흐름은 중합하여 형광의 그래픽 인코딩 영역과 프로브-보유 영역을 보유하는 입자를 합성한다.
다중기능성 입자(multifunctional particle)

Description

고성능 분석을 위한 다중기능성 인코딩된 입자{Multifunctional Encoded Particles for High-Throughput Analysis}
본 출원은 2006년 10월 5일 제출된 가출원 No. 60/849,651에 우선권을 주장하는데, 이의 내용은 본 명세서에 참조로서 편입된다.
본 발명의 기술 분야
본 발명은 고성능 생물분자 분석(high-throughput biomolecule analysis), 더욱 구체적으로, 다중기능성 인코딩된 입자(multifunctional encoded particle)를 이용하는 시스템에 관계한다.
단일 샘플을 이용하여 복수 단백질(protein), 사이토킨(cytokine), 또는 핵산 서열(nucleic acid sequence)을 동시에 정량하는 능력은 연구자와 임상의가 최소의 분석 시간(minimal assay time), 샘플 용적(sample volume)과 비용(cost)으로 고밀도 정보(high-density information)를 얻는 것을 가능하게 한다. 이런 다중 분석은 분자 인코딩(molecular encoding) 및 검사 감도(sensitivity), 특이성(specificity)과 복합 혼합물의 이용에서 재현성(reproducibility)을 유지하는 필요성을 비롯한 여러 과제를 동반한다. 다중화(multiplexing)에 이용되는 2가지 대분류의 기술이 존재한다: 평면 어레이(planar array)(1-3)와 서스펜션(suspension)(입자-기초된) 어레이(4-21), 둘 모두 적용-특이적 이점을 갖는다. 괄호 안에 숫자는 본 명세서에 첨부된 참고문헌을 지칭하는데, 이들의 내용은 본 명세서에 참조로서 편입된다. 평면 어레이, 예를 들면, DNA와 단백질 마이크로어레이(microarray)는 초고밀도 분석(ultra-high-density analysis)을 요하는 적용에 가장 적합하다. 이에 비하여, 서스펜션 어레이는 용해 동력학(solution kinetics), 검사 변형의 용이함, 더욱 많은 샘플 처리량(sample throughput) 및 배치 합성(batch synthesis)에 의한 더욱 우수한 품질 조절(quality control)의 이점을 갖는다(22). 입자-기초된 어레이가 고밀도 지노타이핑(genotyping) 적용에 이용되고 있긴 하지만(23), 이들은 대규모 집단에서 상당수의 표적을 탐지할 때, 또는 신속한 프로브-세트 변형이 요구될 때, 마이크로어레이와 비교하여 가장 선호된다. 평면 어레이가 위치 인코딩(positional encoding)에 엄격하게 의존하는 반면, 서스펜션 어레이는 분광(spectrometric)(4-11), 그래픽(graphical)(12-16), 전자(electronic)(17-19), 또는 물리(physical)(20, 21)로 분류될 수 있는 다수의 인코딩 설계(encoding scheme)를 이용한다.
분광 인코딩에서는 광(light) 또는 방사(radiation)[형광단(fluorophore)(4-7), 발색단(chromophore)(8), 광 구조(photonic structure)(9)와 Raman 태그(tag)(10, H) 포함]의 특정 파장을 이용하여 화학종(species)을 확인한다. 형광-인코딩된 마이크로비드(microbead)(4-7)는 전통적인 유세포분석법(flow cytometry)을 이용하여[또는 광섬유(fiber-optic) 어레이(24) 상에서] 신속하게 처리될 수 있기 때문에, 다중화를 위한 인기 있는 플랫폼(platform)이다. 하지만, 바코딩(barcoding)의 수단으로서 다중 형광 신호(multiple fluorescent signal)를 이용하는 경우에, (i) 스펙트럼 중복(spectral overlap)에 따른 제한된 달성가능 바코드(barcode)(전형적으로, ~100), (ii) 대형 유세포분석기(flow cytometer)의 휴대성(portability) 부족, (iii) 필요한 각 형광 여진기(fluorescent exciter)와 탐지기(detector)로 추가된 비용, (iv) 분석물-탐지 형광(analyte-detection fluorescence)으로 인코딩 형광(encoding fluorescence)의 잠재적 간섭(interference)을 비롯한 여러 단점이 존재한다. 이들 이유로, 마이크로담체(microcarrier) 상에 바코드를 공간적으로 매립하기 위해 그래픽 기술(graphical technique)을 이용하는 단일-형광 방법이 존재한다.
그래픽 바코드(graphical barcode)는 마이크로담체(microcarrier) 상에서 광학 요소(optical element)의 패턴화(patterning)에 의존한다; 일부 실례에는 줄무늬 막대(striped rod)(12, 13), 융기된 입자(14)와 점-패턴화된 입자(14, 15)가 포함된다. 이들 입자(금속(metallic) 또는 포토레지스트(photoresist))를 제조하는데 이용되는 화학작용은 생물분자를 표면에 결합시키기 위하여 추가의 결합 화학을 필요로 하고, 줄무늬 막대의 경우에, 각 금속성 패턴(metallic pattern)이 한 번에 한 배치(batch)씩 생성되어야 한다. 전형적으로, 이들 입자 상에서 패턴은 표적 신호(target signal)의 형광이 충분히 높을 경우에만 구별될 수 있다. 마이크로담체 인코딩을 위한 다른 그래픽 방법은 형광 비드(fluorescent bead) 내로 코드의 선택적인 포토블리칭(photobleaching)이다(16). 이러한 방법에서, 입자 합성과 디코딩(decoding) 둘 모두 많은 시간이 소요되기 때문에, 상기 방법은 고성능 분석을 위한 후보로서 부적합하다. 형광을 완전히 제거하는 방법에서 무선 주파수 기억 태그(radio frequency memory tag)가 이용된다(17-19). 이러한 접근법은 매우 강력한데, 그 이유는 거의 무제한의 바코드(>1012)가 가능하고, 바코딩 설계(barcoding scheme)를 분석물 정량(analyte quantification)(형광)으로부터 분리하기 때문인데, 이들 전자 마이크로칩(electronic microchip)-기초된 담체의 다수(수천 개 또는 수백만 개) 합성은 값비싸고 진행이 느리다. 다중화 분석(multiplexed analysis)을 위한 이들 방법은 기존 문헌에서 철저하게 재검토되었다(25, 26).
본 발명의 요약
한 측면에서, 본 발명은 다중기능성 입자(multifunctional particle)를 만드는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 마이크로유동 채널(microfluidic channel)을 따라서 형광 존재(fluorescent entity)를 구비한 첫 번째 단량체 흐름(monomer stream)을 흘려보내는 단계를 포함한다. 첫 번째 단량체 흐름에 인접한 프로브를 구비한 두 번째 단량체 흐름은 마이크로유동 채널을 따라서 흘러간다. 이들 단량체 흐름은 중합하여 형광의 그래픽 인코딩 영역과 프로브-보유 영역을 보유하는 입자를 합성한다. 원하는 경우에, 2개 이상의 단량체 흐름이 존재할 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 중합화 단계는 첫 번째와 두 번째 단량체 흐름을 포토마스크(photomask)를 통하여 전달된 자외선(ultraviolet light)에 노출시켜 인코딩된 영역을 생성한다. 이러한 인코딩된 영역은 복수의 열린 코딩 요소(open coding element)와 닫힌 코딩 요소(closed coding element)를 포함한다. 적절하게는, 이들 코딩 요소는 2-차원 격자에 정렬된다. 전형적인 격자는 20개의 코딩 요소를 포함한다. 격자는 또한, 최소한 하나의 정위 인디케이터(orientation indicator)를 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서, 중합화 단계는 하나이상의 프로브-보유 영역을 생성한다.
바람직한 구체예에서, 자외선은 현미경 대물렌즈에 의해 집중된다. 첫 번째와 두 번째 단량체 흐름에 적합한 재료는 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴산염이다. 적절하게는, 첫 번째와 두 번째 단량체 흐름은 광개시제(photoinitiator)를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 그래픽 인코딩된 첫 번째 영역 및 프로브-보유된 두 번째 영역을 보유하는 다중기능성 입자를 제시한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 그래픽 인코딩 영역과 프로브-보유 영역을 보유하는 다중기능성 입자를 포함하는 고성능 스크리닝 시스템(high-throughput screening system)을 제시한다. 이들 입자를 정렬하고 판독하기 위하여 흐름-집중 마이크로유동 장치(flow-focusing microfluidic device)가 제공된다.
도 1A는 단일-프로브, 반-형광 입자를 만드는 2개의 인접하는 박막 흐름(laminar stream)을 교차하는 중합화를 보여주는 점-코딩된 입자 합성의 개략적 투시도이다.
도 1B는 단일-프로브, 반-형광 입자의 실례이다.
도 1C는 인코딩과 분석물 탐지를 위한 입자 특징의 도식적인 표 현(diagrammatic representation)이다.
도 1D는 도 1A에 도시된 기술에 의해 생성된 입자의 차등 간섭 효과(differential interference contrast, DIC) 영상이다.
도 1E는 단일-프로브 입자의 현미경사진이다.
도 1F는 멀티-프로브 입자를 보여주는 현미경사진이다.
도 1G는 프로브-구배(gradient) 인코딩된 입자를 보여주는 현미경사진이다.
도 1H는 구배 입자의 중심선(center line)을 따라서 형광 강도(fluorescent intensity)의 도표이다.
도 2A-C에서는 단일-프로브 입자를 이용한 다중화 분석을 도시한다.
도 2D-F에서는 멀티-프로브 인코딩된 입자를 이용한 다중화 분석을 도시한다.
도 3A는 혼성화(hybridization) 실험 이후에 입자를 정렬하고 판독하는데 이용되는 흐름-집중 마이크로유동 장치의 개략적 모양의 투시도이다.
도 3B는 도 3A에 도시된 유통 장치(flow-through device)에서 포착된 입자의 전형적인 영상이다.
도 3C는 코드를 노출시키고 올리고머 표적(oligomer target)을 탐지하기 위하여 입자의 5개 레인을 교차하여 포착된 형광 강도의 스캔(scan)을 보여주는 그래프이다.
도 4A는 1-차원 인코딩 설계를 보유하는 입자의 개요도(schematic illustration)이다.
도 4B는 실트 조명(slit illumination)을 보여주는 개요도이다.
도 4C는 획득된 형광 신호에서 변하는 깊이(depth)를 갖는 일련의 밸리(valley)를 포함하는 신호 대 시간의 그래프이다.
도 5는 변하는 프로브 농도를 갖는 입자의 형광 강도를 보여주는 그래프이다.
도 6은 표적 혼성화 이후 입자 단편(particle section)을 가로지르는 형광 강도의 도표이다. 입자 영상에서 흰색 선은 스캔된 영역을 지시한다.
도 7은 변하는 표적 농도에서 항온처리된 입자의 혼성화 신호(형광 강도)의 도표이다.
본 발명에서는 이들 다중화 한계 중에서 대부분을 극복하는 기술을 도입한다. 마이크로유동의 박막 흐름(laminar flow) 특징을 이용함으로써, 분석물 인코딩과 표적 포획을 위한 분명한 영역을 보유하는 다중기능성 입자를 생성하는 능력을 증명한다(도 1). 전형적인 실험에서, 마이크로유동 채널(microfluidic channel) 아래에 인접하게 2개의 단량체 흐름(형광 염료를 보유한 흐름과 아크릴산염-변형된 프로브를 보유한 다른 흐름)을 흘려보내고, 이들 흐름을 교차하여 입자를 중합하는[30-ms 버스트(burst)의 자외선(UV)으로](28) 연속-흐름 식각공정(continuous-flow lithography)(27)의 변이(variation)를 이용하였다. 이러한 방식으로, 형광의 그래픽 인코딩 영역과 프로브-보유 영역을 보유하는 입자가 단일 단계에서 합성될 수 있다. 각 입자는 돌출된 2-차원(2D) 형상(도 1B)인데, 이의 형태는 현미경의 필드 스톱 위치(field-stop position) 내로 삽입된 포토마스크(photomask)에 의해 결정되고, 이의 화학적 성질은 동시-유동(co-flowing) 단량체 흐름의 내용물에 의해 결정된다. 가교-연결된 중합체 입자는 이후, 채널 아래로 흘러가는데[채널 표면(channel surface) 근처에 산소 저해(oxygen inhibition)에 기인한 점착(sticking) 없이(27)], 여기서 이들은 저장소(reservoir) 내에 집합된다. 이들 입자는 과량의 단량체(monomer)를 씻어내고, 이후 생물 검사(biological assay)에 이용할 수 있다.
본 발명에서는 프로브 결합(probe conjugation)후 표면을 “차단”하는 필요성을 없애는 입자 기초(particle foundation)로서 및 양쪽 입자 표면으로부터 형광 신호의 전달을 가능하게 하는 투명 물질(transparent material)로서 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)(널리 공지된 생물-불활성 중합체(bio-inert polymer))을 이용하였다. 이들 특성은 분석물 탐지의 특이성(specificity)과 감도(sensitivity)를 강화시킬 것이다. 증가하는 분석물 탐지 신호는 입자의 프로브 영역에서 표면적을 증가시켜 이들 프로브가 더욱 접근가능하도록 만듦으로써 달성될 수 있다. 표면적은 예로써, 융기(ridge) 또는 오목한 곳(dimple)을 추가함으로써 증가될 수 있다. 신호는 또한, 구멍 크기를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 본 발명에서는 백만개이상(220)의 코드를 보유할 수 있는 입자를 생성하기 위하여 간단한 점-코딩 설계(dot-coding scheme)를 이용하였다(도 1C). 입자는 5개 레인을 따라서 세로로 판독(read)되도록 설계되었는데, 입자 정위(particle orientation)에도 불구하고 코드 위치(code position)와 판독 “방향”(read direction)을 확인하기 위하여 정렬 인디케이터(alignment indicator)가 이용되었다(도 1C). 이들 입자의 편평하고 긴 형상은 유통 장치(flow-through device)에서 스캐닝(scanning)을 위하여 이들을 정렬하는데 도움을 준다. 이들 입자에서 다양한 화학물질의 공간적 분리(spatial separation)는 단일 형광단(fluorophore)을 이용하여 달성되는 디코딩(decoding)과 표적 탐지(target detection)를 가능하게 한다.
입자 합성의 융통성(versatility)을 증명하기 위하여, 형광단으로 단량체 흐름을 선택적으로 표지하고, 다양한 채널 설계를 이용하여 단일 프로브 영역, 멀티 프로브 영역과 프로브-영역 구배(gradient)를 보유하는 입자를 생성하였다(도 1, E 내지 G). 여러 입력 흐름(inlet stream)을 갖는 채널의 이용으로 만들어지는 멀티프로브 입자(도 1F)는 여러 표적의 직접적인 단일-입자 비교를 가능하게 한다. 더 나아가, 긴 채널 내에서 흐름을 교차하여 프로브의 확산(diffusion)을 가능하게 함으로써 만들어지는 프로브 구배(도 1G)는 고정된 탐지 감도(detection sensitivity)를 이용할 때(신호가 포화될 때), 분석물의 탐지 범위(detection range)를 확대하는데 유용하다. 자성 나노입자(magnetic nanoparticle)가 구배 내에 통합되면, 진동 자기장(oscillating magnetic field)에서 자극될 때 입자를 따라서 온도 편차(temperature variation)를 발생시키는 것이 가능하다(29).
본 발명의 방법의 핵심적인 특징은 인코딩된 입자 내로 프로브의 직접적인 통합이다. 이는 아크릴산염-변형된 생물분자(biomolecule)를 단량체 용액(monomer solution) 내로 단순히 첨가함으로써 달성된다. 중합화후, 이들 프로브는 중합체 네트워크(polymer network)에 공유 결합된다. 이러한 과정은 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)와 단백질 프로브 모두에 적용가능하다(30-32). 본 발명에서는 프로브-결합된 입자를 합성하는데 이용되는 짧은 버스트(burst)의 UV가 통합된 올리고뉴클레오티드의 기능성(functionality)에 유해하지 않음을 증명한다. 기존 문헌에서, 거의 동일한 단량체 성분으로부터 만들어진 중합체 구조(polymer structure) 내에 통합된 비드-결합된 항체(bead-bound antibody)가 유사한 결과를 나타내는 것으로 밝혀졌다(28, 33).
다중화 능력을 증명하기 위하여, DNA 서열 탐지에 아크릴산염-변형된 올리고뉴클레오티드 프로브(이는 상업적으로 가용하다)를 이용하였다(도 2, A 내지 C). 본 발명에서는 입자의 3가지 배치(batch)를 합성하였다: 이들 중에서 하나는 20개-염기쌍(base pair, bp) 올리고뉴클레오티드 프로브 1(5'-ATA GCA GAT CAG CAG CCA GA-3')를, 다른 배치는 프로브 2(5'-CAC TAT GCG CAG GTT CTC AT-3')를, 세 번째 배치는 대조(control)로서 기능하는 프로브 없이 구성하였다. 표적은 이들 2개의 프로브에 상보성 서열(complementary sequence)을 갖는 형광 표지된 올리고뉴클레오티드이었다. 이들 입자는 혼합하고, 표적 1(1 μM), 표적 2(1 μM), 2가지 표적 모두(각각, 0.5 μM), 또는 표적 없음을 포함하는 마이크로웰(microwell) 내에서 실온에서 10분 동안 항온처리하였다(28). 양성 표적 탐지는 프로브-영역 형광에 의해 지시되었는데, 이는 입자 모서리 부근에서 더욱 현저하였다. 이러한 결과는 표적이 입자 본체(particle body) 내로 확산하고 수 ㎛ 혼성화(hybridization)할 수 있음을 암시하였다(28). 각 경우에, 이들 입자는 올리고머에 대한 높은 특이성(specificity)과 함께 균일성(uniformity)(28)을 보였는데, 표적이 존재할 때에만 형광을 나타냈다(도 2C).
다중화 설계의 능력을 더욱 증명하기 위하여, 복수의 인접 기능기(functionality)를 갖는 입자의 이용으로 동일한 서열 탐지 검사를 수행하였다(도 2, D 내지 F). 이러한 방식으로, 단일 입자 상에서 2개의 표적 서열(음성 대조와 함께)을 동시에 검사할 수 있었다. 이러한 검사는 각 입자마다 고도로 특이적이고(도 2F) 매우 균일하였다(도 2D)(28). 입자 상에서 프로브간 계면(interface)은 매우 분명한데, 더욱 큰 다중화 능력을 위하여 더욱 얇은 조각이 이용될 수 있다.
이러한 다중화 분석 방법이 고-처리량 적용(high-throughput application)에 실용될 수 있음을 증명하기 위하여, 유통 장치(도 3) 내에서 입자를 스캔하는 간단한 설계를 개발하였다. 앞서 기술된 혼성화 실험에 이용되는 멀티프로브 입자(도 2, D 내지 F)는 마이크로유동 채널을 통하여 흘려보내고, 도립 형광 현미경(inverted fluorescence microscope)(28)에서 관찰하였다. 입자는 흐름-집중(flow-focusing)을 이용하여 정렬하고, 입자 너비(particle width)보다 약간 큰 채널을 통하여 이동시켰다(도 3A). 이들 입자가 점착 없이 이들 채널을 부드럽게 흘러내려갈 수 있도록 담보하기 위하여 생물친화성 계면활성제(28)를 이용하였다. 영상은 이들 입자가 시야각(field of view)(2Ox 대물렌즈를 이용하여)을 통과하는 동안 1/125 sec의 노출시간(exposure)에서 채널 내에 지정된 탐지 영역에서 촬영하였다. 영상 순서는 이후, 분석하여 입자 코드를 결정하고 표적을 정량하였다.
대표적인 입자 영상은 5개 입자 “판독 레인(reading lane)”을 따라서, 상응하는 강도 도표(intensity plot)와 함께 도시된다(도 3B). 각 레인을 따라서 코드는 이들 강도 도표 내에서 급격한 하락(dip)과 고원(plateau)을 분석함으로써 결정될 수 있다. 대조-영역 형광을 이용함으로써, 양성 표적 탐지를 대조 평균 강도(control average intensity) + 각 입자에 대한 3회 표준 편차(standard deviation)로서 정의하였다. 10분 정도의 짧은 항온처리(incubation) 이후에, 양쪽 올리고뉴클레오티드 표적의 존재를 정확하게 확인할 수 있었다.
앞서 논의된 2-차원 점-패턴(dot-pattern) 설계가 극히 강력하긴 하지만, 이는 상당히 정교한 공간적 탐지를 요구할 것이다. 도 4에 도시된 더욱 실용적인 “1-차원” 인코딩 설계는 대략 2,500개의 코드를 제공할 수 있다. 2-차원 정렬에서처럼, 이러한 코드는 형광 배경(fluorescent background)에서 일련의 구멍이지만, 도 4C에 도시된 바와 같이 전체 너비에서 스캔될 때 일련의 피크(peak)와 밸리(valley)를 제공한다는 점에서 1-차원이다. 도 4에서 구체예는 디코딩 정확도(decoding accuracy)가 담보되도록 재현될 수 있고(바람직하게는, 빌트-인(built-in) “보정(calibration)”으로), 입자 완전성(integrity) 또는 요구되는 크기에 별다른 영향을 주지 않는다.
이러한 구체예에서 입자를 정확하고 신속하게 스캔하기 위하여, 신속 샘플링(sampling)에 극히 민감한 광 탐지를 제공하는 탐지 설계가 이용된다. 전통적인 마이크로어레이 스캐너(microarray scanner)와 유세포분석기(flow cytometer)(및 이들의 마이크로유동 대응물)는 이러한 목적을 위하여 광전자 증배관(photomultiplier tube, PMT) 모듈(module)을 이용한다(37, 42, 43). 이들 시스템은 극히 높은 샘플링 속도(sampling rate)(~MHz)와 특별한 감도(sensitivity)를 제공하는데, 이로 인하여 이들은 이러한 적용에 이상적이다. 이들 모듈은 현미경의 카메라 포트(camera port)에 직접적으로 적재되고, 적절한 조명 공급원(illumination source)이 제공되면 앞서 언급된 흐름-집중 장치와 이음매 없이 이용되고, 표준 데이터 획득 소프트웨어(data acquisition software)와 함께 이용될 수 있다.
본 발명의 이러한 구체예의 간단한 기구에서, PMT 모듈은 현미경 포트를 통하여 중계되는 광 전부를 회수한다. 이런 이유로, 이들 입자를 디코딩하는데 이용되는 공간적 정보를 획득하기 위하여, 입자 움직임의 방향에 직각으로 얇은 실트(thin-slit) 영역만을 조명하는 것이 바람직하다. 실트 크기(slit size)는 10 ㎛의 자릿수(order)에 있을 가능성이 높은 인코딩과 프로브 특징 크기에 의해 설정될 것이다. 이러한 해상도(resolution)는 투사 사진석판술 기구(projection photolithography setup)를 보유하는 마스크(mask)를 이용함으로써 달성될 수 있다(27). 더욱 정교한 조명 공급원, 예를 들며, 라인-집중된 레이저 빔(line-focused laser beam) 역시 이용될 수 있다(44, 45). 본 발명의 다른 구체예에서, 넓은 조명이 이용될 수 있는데, 실트-유사 필터(slit-like filter)가 PMT 탐지기의 앞에 놓여진다.
본 발명의 시스템의 처리량(throughput)은 일차적으로, 탐지 설계와 입자 크기에 의해 결정된다. 본 연구를 위하여 합성된 입자는 다른 유통(flow-through) 방법에서 입자와 비교하여 상대적으로 크고, 90 ㎛ 너비, ~30 ㎛ 두께와 180 내지 270 ㎛ 길이를 갖는다. 큰 크기는 시스템의 처리량을 제한할 뿐만 아니라 샘플 용적(sample volume)을 증가시킨다. 하지만, 큰 입자-대-입자 재현성(particle-to-particle reproducibility)(28)은 유통 시스템에서 전형적인 것보다 훨씬 낮은 중복(redundancy)을 제공하고, 효율(efficiency)을 향상시킬 것이다. 보수적 추정치를 이용함으로써, 본 발명의 시스템은 외관상으로 큰 입자 크기에도 불구하고 관리가능 샘플 용적을 갖는 신속한 고밀도 분석을 제공할 수 있다(28).
매우 높은 재현성 이외에, 본 발명의 시스템은 매우 민감한 것으로 밝혀졌다. 30-분 항온처리로, 비오틴(biotin)-아비딘(avidin)-보조된 신호 증폭 없이 500 attomole에서 DNA 올리고머(oligomer)를 편의하게 탐지할 수 있다(28). 이에 비추어, 본 발명의 시스템은 최소한, 현재의 상업적으로 가용한 다중화 기술만큼 민감하고, 올인원(all-in-one) 입자 합성, 멀티프로브의 통합, 적은 비용(28), 거의 무제한의 코드, 표준 형광 현미경 정도를 이용한 수행을 비롯한 부가된 이점을 가질 것으로 생각된다.
재료와 방법
재료
본 실시예에서 합성된 입자는 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴산염(PEG-DA, Aldrich, Mn = 700)에 기초한 단량체 용액(monomer solution)으로부터, 2-하이드록시-2-메틸프로피오페논(2-hydroxy-2-methylpropiophenone) 광개시제(Aldrich)로 만들었다. 혼성화 실험을 위하여, 1 - 2.5% 개시제(initiator)와 50 μM의 농도에서 DNA 올리고머 프로브와 함께, 2:1 PEG-DA:TE 완충액(10 mM Tris pH 8.0(Rockland), 1 mM EDTA(OmniPur))의 단량체 용액을 이용하였다. 올리고머 프로브(IDT)는 반응성 Acrydite 기와 18-탄소 스페이서(spacer)로 변형하였다(프로브 #1: 5'-Acrydite-C18-ATA GCA GAT CAG CAG CCA GA-3', 프로브 #2: 5'- Acrydite-C18-CAC TAT GCG CAG GTT CTC AT-3'). 인코딩된-영역 형광은 명시야 검경(bright-field microscopy)을 이용하여 동시-유동 흐름(co-flowing stream)을 용이하게 가시화시키기 위한 1% 블루 푸드 컬러링(blue food coloring)과 함께, 개별 단량체 용액에 0.005 wt%의 메타아크릴옥시에틸 티오카르바모일 로다민 B(methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B)(Polysciences)를 통합함으로써 달성하였다.
마이크로유동 장치
마이크로채널은 연성 식각공정(soft lithography)에서 표준 절차를 이용하여 생성하였다. 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 탄성중합체(elastomer)(Sylgard 184, Dow Corning)는 SU-8 포토레지스트(photoresist)(Microchem)를 이용하여 만들어진 채널 릴리프(channel relief)를 보유하는 실리콘 와이퍼(silicon wafer)에서 경화시켰다. 채널은 복수(2 - 7)의 100 ㎛-너비 입력 채널(inlet channel)이 더욱 넓은(200 - 500 ㎛ 너비) 하나의 공통 채널로 수렴하도록 설계하였다. 이들 채널(및 저장소)은 외과용 메스(scalpel)로 절단하고, 각 입력(inlet)에 구멍을 뚫고, PDMS-코팅된 유리 슬라이드(glass slide)에 밀봉하였다. 공통의 압력 공급원(pressure source)(압력 밸브(pressure valve)에 의해 조절됨, Controlair Inc.)에 고무관(rubber tubing)(Tygon)으로 연결된 피펫 팁(pipette tip)(10 ㎕, Molecular BioProducts)은 각각, ~5 ㎕의 중합체로 채우고 채널 입력 포트(channel inlet port) 내로 삽입하였다. 3원 솔레노이드 밸브(three way solenoid valve)(Burkert, 수동으로 작동됨)는 가압 상태(~1 psi, 고속)와 주위 압력(ambient-pressure)(흐름 없음) 상태 사이에 진동(oscillation)을 가능하게 하였다.
광전자중합화(photopolymerization) 기구
AUTOCAD를 이용하여 설계된 포토마스크는 CAD/Art Services, Inc.(Brandon, OR)에서 20,000 dpi 해상도(resolution)로 인쇄하였다. 이들 마스크는 1OOW HBO 수은 램프(mercury lamp)와 광폭-여기(wide-excitation) 자외선(UV) 필터 세트(11000v2:UV, Chroma)가 구비된 Zeiss Axiovert 200 현미경의 필드 스톱 위치(field-stop position) 내로 삽입하였다. UV 여기(excitation)의 원하는 펄스(pulse)를 제공하기 위하여 컴퓨터-작동된 셔터 시스템(computer-driven shutter system)(UniBlitz)을 배치하였다. 입자는 마이크로유동 채널 내에서 인접하는 흐름을 교차하여, 30 - 50 ms 버스트(burst)의 UV 여기로 중합화시켰다. 유속(flowrate)을 조절하는 3원 밸브(three way valve)를 이용하여, 입자는 비-흐름 상태에서 중합화시키고 가압 상태에서 채널 아래로 즉시 분출시켜, 입자 특징(particle feature)의 높은 해상도를 갖는, 인접 흐름 간에 완전한 계면을 제공하였다. 중합화를 위한 시각적 정렬(visual alignment)은 NIH 영상 소프트웨어가 설치된 CCD 카메라(KPM IA, Hitachi)를 이용하여 달성하였다.
입자 회수
입자는 중합화후 저장소에서 회수하였는데, 여기서 이들은 반응되지 않은 단량체가 제거되었다. 이들 입자는 TE 완충액으로, 이후 PEG-DA 단량체로, 그 다음 모든 잔류 형광이 소멸될 때까지 다시 TE 완충액으로 수회 씻어냈다. 각 씻음 이후, 이들 입자는 저장소의 바닥에 가라앉히고, 과량의 씻음 용액(rinsing solution)은 정상으로부터 피펫으로 제거하였다. 입자는 전형적으로, 혼성화 실험에 즉시 이용되지만, 때때로 어두운 환경에서 수일 동안 보관된 이후에 이용되었는데, 기능성의 상실이 관찰되지 않았다.
올리고머 혼성화
입자는 각 혼성화 실험을 위한 별도의 PDMS 저장소 내로 피펫으로 이전하였다. Cy3 형광단(IDT)으로 변형된 상보성 표적 DNA 올리고머는 혼성화 완충액(0.2M NaCl(Mallinckrodt)과 0.5% 황산도데실나트륨(sodium dodecyl sulfate)(SDS, Invitrogen)을 포함하는 TE 완충액)에서 1 μM 농도로 현탁시켰다. 표적 올리고머의 용액은 피펫으로 적절한 저장소 내로 이전하고, 입자는 실온에서 10분 동안 항온처리하였다. 이들 입자는 이후, TE 완충액으로 수회 씻어내고, 로다민 B와 Cy3 형광단 둘 모두에 융화성인 오렌지 롱패스(orange longpass) 필터 세트(XF 101-2, Omega)를 이용하여 가시화시켰다. 정지 영상은 Nikon D200 디지털 카메라를 이용하여 포착하였다.
입자 판독
흐름-집중 마이크로유동 채널은 PDMS-코팅된 유리 슬라이드 상에서 입력에서 플라스마-밀봉하였다. 입자 판독에 앞서, 채널은 “판독 완충액”(25% PEG-DA와 0.5% Tween 20을 포함하는 TE)을 5분 동안 분출시켰다. 혼성화 실험에 이용된 멀티-프로브 입자는 판독 완충액에 재현탁시키고, 채널 저장소 내로 피펫으로 이전하였다. 앞서 기술된 압력 시스템(pressure system)은 채널에 진공을 끌어들이고 유체 흐름(fluid flow)을 유도하기 위하여 물기둥(a column of water)과 함께 이용하였다. 100 ㎛ 채널 컨스트릭션(channel constriction)을 유통하는 입자는 Zeiss Axiovert 200 현미경으로 관찰하고, 1/250 sec의 노출시간에서 형광 하에 CCD 카메라(Hitachi KPMlA)로 이미지화하였다. 움직임은 초당 10 프레임(frame)으로 NIH image를 이용하여 촬영하였다 - 입자 속도(particle velocity)를 산정하고, 각 입자의 5개 “레인”을 따라서 강도 프로필(intensity profile)을 측정하였다. 입자의 대조 영역을 따라서 강도의 평균과 표준 편차를 측정하였다. 올리고머 표적에 대한 양성 판독(positive reading)은 평균 + 음성 대조 신호의 3회 표준 편차로서 정의되었다.
입자 조성의 조사
프로브 농도
신호 탐지에 대한 농도의 효과를 결정하기 위하여 단량체에서 연속 희석된 올리고머 프로브를 이용하였다. 150, 75, 37.5와 18.75 μM의 프로브 농도를 갖는 입자를 합성하였다. 대조 입자(0 μM 프로브)를 이용하여 배경 강도(background intensity)(Ib)를 결정하였다. 이들 입자는 1 μM에서 형광-표지된 표적과 함께 30분 동안 항온처리하고, 씻어내고, 이미지화하여 형광 강도(Ip)를 결정하였다. 형광 신호는 차이 Ip - Ib로서 표시되는 임의 단위(arbitrary unit, AU)로서 보고된다. 결과는 도 5에 도시된다. 그래프에서 오차 막대(error bar)는 각 척도(measurement)에서 표준 편차를 나타내고, 변위 계수 평균(average coefficient of variation, COV)은 9%이다.
보이는 바와 같이, 강도는 프로브 농도에 비례하여 선형적으로 증가한다. 이러한 조사 결과는 2개의 상보성 올리고머의 결합을 고려할 때 예측된다 - 평형에서, 상관관계는 아래와 같이 제시된다:
T + P ⇔ TP
여기서 T = 표적, P = 프로브, T P = 이중 가닥 복합체이다. 평형에서, 화학종의 농도는 해리 상수(dissociation constant), Kd로 특징될 수 있다:
Kd = [P][T]/[PT]
본 실험의 경우에서처럼 [T] 0 >> [P] 0 이면, [T] [T] 0 이다. 이러한 방정식 및 상관관계 [P] = [P] 0 - [PT]를 이용하여, 아래의 방정식이 획득된다:
Figure 112009026056327-pct00001
따라서 표적의 일정한 최초 농도에서, 상기 신호(이는 [PT]에 비례함)는 프로브 농도와 관련하여 선형일 것으로 예측될 수 있다. 증가된 프로브 농도에서 더 욱 높은 신호를 획득할 수 있었지만, 원리 실험의 증명을 위하여 50 μM 프로브 통합을 선택하였다 - 상기 농도는 올리고머의 최소 이용으로 표적 탐지를 위한 충분한 신호를 제공하였다.
단량체
3가지 사슬 길이(Mn = 200, 400, 700)의 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴산염 및 아크릴아마이드(acrylamide)와 가교제(crosslinker)로서 PEG-DA의 혼합물을 비롯한, 바코드화된 입자에 여러 중합체의 이용을 조사하였다. 중합체 혼합물을 선택할 때 조사된 특징은 (1) 신속한 중합화 동역학, (2) 혼성화 이전 낮은 배경 형광, (3) 혼성화 이후 강한 형광 신호이었다. 만들어진 모든 용액은 단량체(순수한, 또는 TE 완충액과 2:1), 2.5% 광개시제와 50 μM에서 DNA 올리고머로 구성되었다. 입자는 2Ox 대물렌즈로 30 ms UV 노출을 이용하여 만들었다.
혼성화 신호는 TE 완충액이 단량체 혼합물에 포함될 때 더욱 높은 것으로 밝혀졌다. 이는 기존 연구(33)와 일치하는데, 여기서 중합화된 PEG 하이드로겔(hydrogel)에 통합된 비드-결합된 단백질은 완충액의 부재에서 기능성(functionality)을 상실하는 것으로 밝혀졌다. PEG-DA(Mn, = 700)는 다른 단량체보다 훨씬 빠른 반응 동역학(reaction kinetics)을 나타내고, 또한 훨씬 낮은 배경 신호(background signal)를 보이는 것으로 밝혀졌다. 혼성화 실험을 위하여 선택된 최종 단량체 용액은 1 - 2.5% 광개시제를 포함하는, PEG-DA:TE의 2:1 혼합물이었다.
입자 특성화
다분산(polydispersity)
정량적 생물분자 분석(quantitative biomolecule analysis)에 이용되는 입자가 형태적으로, 그리고 기능적으로 일관되도록 하는 것이 매우 중요하다. 연속-흐름 식각공정(continuous-flow lithography)을 이용하여 합성된 입자는 물리적 크기와 관련하여 매우 낮은 변이 계수(coefficient of variation)(< 2%)를 갖는 것으로 이미 밝혀졌다(27). 또한, 혼성화 연구에 이용되는 입자에 대한 형광 신호의 변이를 조사하는 실험을 수행하였다.
혼성화 연구에 이용되는 입자의 형광 강도는 이들 입자의 “기능성” 다분산의 증거를 제공한다. 하지만, 이러한 척도는 입자뿐만 아니라, 혼성화 실험 자체에도 좌우된다 - 제시된 숫자는 보수적 추정치이다. 형광 신호의 COV는 1 μM - 10 nM의 농도에서 표적과 함께 항온처리할 때 6 - 10% 범위이고, 더욱 낮은 농도(10 pM까지 하향)에서 ~15 - 30%로 증가하는 것으로 밝혀졌다.
활성 프로브 농도
입자 표면 상에서 프로브의 농도를 산정하기 위하여, 올리고머가 입자 내로 확산하고 반응할 수 있는 깊이의 추정치로 단량체 용액(50 μM) 내로 통합되는 프로브의 농도를 이용하였다. 도 6에는 형광 강도의 스캔이 이의 감지 영역(sensing region)을 교차하는 혼성화 연구에 이용된 전형적인 입자가 도시된다.
보이는 바와 같이, 이러한 입자는 감지 영역의 모서리에서 훨씬 높은 신호를 보인다 - 코딩된 영역은 통합된 형광 염료가 전체적으로 균일하게 분포되기 때문에, 이러한 특징을 나타내지 않는다. 이러한 “모서리” 신호는 입자의 30 ㎛-두께 모서리에 결합된 올리고머의 양에 비례하는 것으로 가정하였다. 조사된 여러 입자에서, 이들 입자의 내부에서 강도는 모서리에서 강도의 대략 1/2이었다. 모든 표면이 유사하다고 가정하면, 입자의 내부에서 활성 결합 두께(active binding thickness)는 30 ㎛ x
Figure 112009026056327-pct00002
= 15 ㎛, 또는 표면(face)당 ~7.5 ㎛인 것으로 추론되었다. 근거(validation)로서, 각 입자 모서리에서 고밀도 영역의 너비가 ~20 픽셀(pixel) = 8 ㎛임을 확인할 수 있다. 물리적으로, 이는 구멍 크기에 의해 설명될 수 있다. 입자의 중합화는 중심(여기서 산소가 가장 멀리 확산하고 유리 라디칼(free radical)의 농도가 가장 높다)에서 가장 빠르게 진행되고, 입자 표면에서 더욱 느리게 진행된다. 이런 이유로, 이들 입자는 표면 부근보다 중심에서 더욱 단단하게 가교 연결되고, 짧은 올리고머가 확산하고 상보성 프로브와 반응할 수 있는 더욱 큰 구멍을 제공한다고 가정할 수 있다. 다른 연구에 기초하여, 본 발명에 이용되는 PEG 중합체는 완전히 가교 연결될 때 ~10Å의 구멍 크기를 갖는다(34, 35).
50 μM의 프로브 농도(단량체에서), 표면당 7.5 ㎛의 활성 두께(active thickness)와 50% 통합 효율(incorporation efficiency)을 이용하여, 효과적인 표면 농도(surface concentration)를 아래와 같이 추정하였다:
표면(face)당
Figure 112009026056327-pct00003
이들 입자가 투명하기 때문에, 양쪽 면의 형광은
Figure 112009026056327-pct00004
의 예측된 프로브 농도를 제공해야 한다. 이는 다른 연구에서 보고된 것들과 유사한 “표면” 농도이다(36). 앞서 언급된 바와 같이, 이들 입자 내로 훨씬 많은 양의 프로브를 통합하여 표면 농도를 더욱 높게 하고, 따라서 본 발명의 시스템의 감도(sensitivity)를 증가시킬 수 있다.
처리량의 추정
최근에, 통합된 광전자 증배관(integrated photomultiplier tube)으로 매우 높은 처리량을 달성하는 마이크로유동-기초된 유세포분석기가 개발되었다. 이들 시스템에서 유동 속도(fluid velocity)는 10 m/s(전통적인 유세포분석기와 유사)의 자릿수에 있을 수 있는 반면, 탐지는 5MHz의 높은 샘플 레이트(sample rate)에서 수행되고 17,000/sec의 입자 판독 속도(particle read rate)를 가능하게 한다(37). 이를 기초로 하여, 더욱 정교한 감지 설계를 통합할 때 본 발명의 시스템으로 달성할 수 있는 처리량을 추정하였다. 보수적으로, 1 m/s의 유속 및 입자 사이에 10 입자 길이(particle length)의 간격(spacing)(각 200㎛ 길이)이 추정되었다. 따라서 아래의 처리량을 산정할 수 있다:
처리량 =
Figure 112009026056327-pct00005
이러한 “입자/sec” 처리량이 유세포분석법에서 전형적으로 관찰되는 것보다 낮으로 것으로 보이긴 하지만, “표적/sec” 기초에서, 이러한 기술이 고밀도 분석(high-density analysis)을 위한 충분한 처리량을 제공하는 이유를 하기에 논의한다. 본 발명의 시스템은 우수한 입자-대-입자 재현성을 나타내는 것으로 밝혀졌다(앞서 언급된 바와 같이). 감지에서 황금 기준으로 간주되는 효소-결합 면역흡착법(enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA)은 본 발명의 기술과 유사한 정확도(38)를 보이고, 전형적으로 중복 수행된다. 이러한 수준의 중복은 유세포분석법-기초된 검사에서 관찰되는 것보다 훨씬 낮다. 평가 목적으로, 본 발명의 검사는 정확한 정보를 생성하기 위하여 삼중 수행될 수 있는 것으로 가정한다. 3의 중복(redundancy)에서, “표적/sec” 처리량은 아래와 같다:
처리량 =
Figure 112009026056327-pct00006
더욱 높은 처리량을 제공하는 2가지 간단한 변형은 (1) 입자 크기의 감소와 (2) 단일 입자에 여러 프로브의 통합이다. 본 발명에서는 ~1 ㎛의 자릿수에서 특징을 갖는 입자를 생산하는 능력을 증명하였고, 따라서 각 치수에서 절반 크기인 인코딩된 입자의 생산을 고려하는 것은 충분히 합리적이다. 이는 입자 수/용적을 8의 인자(factor)로 증가시킬 것이다. 더 나아가, 이들 입자가 3가지 기능기(도 6에서처럼 2개의 프로브와 1개의 대조)를 보유하면, 이는 처리량을 2의 인자로 더욱 증가시킨다. 이들 독립변수(argument)를 이용하여, 일부 예측된 처리량을 산정할 수 있다:
삼중으로 수행되는 검사를 위한 처리량과 입자 용적의 추정치(각 프로브는 3개의 입자 상에 나타난다). “정상” 입자 크기는 ~100 x 200 x 30 ㎛인 반면, “절반” 크기는 ~50 x 100 x 15 ㎛이다. 입자 용적은 조사된 106개 표적에 기초하는데, 이는 단일과 2개-프로브 입자의 경우에, 각각 3 x 106개와 1.67 x 106개 총 입자에 해당한다.
입자 크기 프로브/입자 처리량
(target/sec)		 입자 용적
(㎕/106 target)
정상 1 150 1,800
절반 1 300 225
정상 2 300 900
절반 2 600 113
이러한 간단한 분석으로부터, 감소된 크기 및/또는 멀티-프로브 입자를 이용할 때 1시간 이내에 백만 개 표적을 분석하는 것은 합리적으로 보인다. 이러한 분석은 또한, 용적의 관점에서 입자 크기의 중요성을 강조한다 - 고밀도 분석을 위하여 감소된-크기 입자가 필요할 것으로 보인다.
탐지 한계
적절한 탐지 범위를 결정하기 위하여 여러 크기 자릿수(order of magnitude)에 걸쳐있는 농도에서 입자와 형광 표적을 혼성화하였다. 공통 배치(batch)(50 μM 프로브가 통합됨)로부터 입자의 샘플은 소용돌이 혼합기(vortex mixer)상에서 실온에서 30분 동안 50 ㎕의 표적 용액과 함께 항온처리하였다 - 표적 농도는 500 fmol - 500 amol(10-18 mole)의 올리고머에 해당하는 10 nM - 10 pM 범위이었다. 혼성화후, 이들 입자는 씻어내고 현미경에 탑재된 EB-CCD 카메라(C7 190-20, Hamamatsu)로 탐지를 위하여 형광 하에 이미지화하였다. 상기 시스템은 8-비트 한정된 동적 범위(dynamic range)를 보유하기 때문에, 형광 신호에서 넓은 범위를 수용하기 위하여 3가지 상이한 감도 설정을 이용하는 것이 필요하였다. 따라서 이들 입자 배치 중에서 2개가 3가지 감도 설정 중에서 2가지 설정에서 이미지화되었고, 이들 신호는 공통 등급(common scale)에서 표준화(normalization)되고 도획될 수 있었다. 이러한 탐지 연구의 결과는 도 7에 도시된다.
보이는 바와 같이, 이러한 도표는 변하는 프로브 농도(도 5)의 경우에서처럼 선형이 아니다. 이는 더욱 낮은 표적 농도에서, 표적의 양이 더 이상 프로브의 양보다 많지 않고([T]0 >> [P]0), 어림셈(approximation) [T] = [T]0이 더 이상 성립하지 않기 때문이다. 부가적으로, 평형에 도달하는데 걸리는 시간이 표적이 감소함에 따라 증가하는 것으로 알려져 있다(39) - 본 실험에 이용된 항온처리(incubation) 시간(30 분)은 이런 현상이 발생하기에는 불충분하였다.
이러한 검사는 매우 민감한 것으로 밝혀졌는데, 비오틴(biotin)/아비딘(avidin)-기초된 신호 증폭 없이, 조사된 최저량(500 amole)에서 올리고머가 편의하게 탐지되었다. 이러한 조사 결과는 본 발명의 시스템이 Affymetrix(40)와 Luminex(41)를 비롯한 당분야의 최신 다중화 시스템에 필적하는 감도를 갖는다는 것을 암시한다. 더 나아가, 입자 내로 더욱 높은 프로브 농도를 통합함으로써 이러한 검사의 감도를 증가시킬 수 있음이 증명되었다.
재료의 비용
표준 벌크외(non-bulk) 가격에서, 본 명세서에서 제공된 것들과 유사한 1 백만 단일-프로브 입자를 생산하기 위한 원료비(raw material cost)는 하기에 개설된 바와 같이 $ 4.28(DNA 프로브 없으면, $ 0.14)에 불과하다.
50 μM의 농도로 통합된 DNA 올리고머 프로브를 보유하는 106개 입자(~100 x 200 x 300 ㎛)를 생산하기 위한 원료비의 추정
성분 단위 가격 106개 입자당 가격
PEG 단량체 $ 50/500 ㎖ $ 0.06
광개시제 $ 80/250 ㎖ <$ 0.01
형광 염료 $ 560/1g $ 0.08
20bp DNA 프로브 & 276/1 μmole $ 4.14
총합: $ 4.28
앞서 기술된 바와 같이, 각 치수에서 절반 크기인 입자를 만드는 것은 합리적인데, 이는 입자 용적과 비용을 8의 인자로 감소시킬 것이다(106개 입자당 $ 0.54). 다른 주목할 점은 이러한 저용적 마이크로유동 가공(low-volume microfluidic processing)으로 인하여 낭비되는 샘플이 극히 적다는 것이다.
입자 합성(particle synthesis)과 유통 판독(flow-through reading)에 이용되는 마이크로채널(microchannel)은 설계가 간단하고, 매우 경제적으로 생산될 수 있다. 표준 SU-8 식각공정을 이용하여 생성된 단일 4" 와이퍼(< $ 100)는 10개 이상의 채널을 용이하게 보유하고, 여러 번 성형될 수 있다(차후 산정에서 10회를 가정한다). 이에 더하여, 각 장치는 여러 번 이용될 수 있다(5회 가정). 이런 이유로, 매우 보수적인 추정치를 이용한 장치 비용은 아래와 같다:
입자 합성과 유통 판독에 이용되는 마이크로장치(microdevice)의 추정된 비용. 원판 와이퍼(master wafer)는 10개 채널을 보유하고 10회 성형될 수 있고, 각 장치는 폐기에 앞서 5회 이용될 수 있는 것으로 가정되었다.
성분 단위 가격 장치당 가격
원판 제조 $ 100/100 채널 $ 1.00
PDMS $ 0.10/g $ 0.25
현미경 슬라이드 $ 100/400 $ 0.25
총합: $ 1.50
이용당 가격: $ 0.30
백만 개 입자로 단일 복합 실험(single multiplex experiment)을 위한 재료비는 < $ 5.00(입자의 경우에 $ 4.28 및 1회 “합성”과 1회 “판독” 패널의 경우에 $ 0.60)이다. 이러한 추정치에는 입자 판독에 이용되는 완충액이 포함되지 않는데, 그 이유는 상기 완충액이 저렴한 재료로 구성되어 전체 비용에서 그 비용이 극히 미미하기 때문이다.
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Claims (25)

  1. 다중기능성 입자(multifunctional particle)를 만드는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    마이크로유동 채널(microfluidic channel)을 따라서 형광체(fluorescent entity)를 지닌 첫 번째 단량체 스트림(monomer stream)을 흘려보내는 단계;
    마이크로유동 채널을 따라서 첫 번째 단량체 스트림에 인접하도록, 프로브를 지닌 두 번째 단량체 스트림을 흘려보내는 단계;
    상기 첫번째 단량체 스트림과 상기 두번째 단량체 스트림을 중합화하여 형광의 그래픽 인코딩 영역과 프로브-보유 영역을 갖는 입자를 합성하는 단계.
  2. 청구항 1에 있어서, 프로브는 DNA 또는 RNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 프로브는 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 프로브는 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 프로브는 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 프로브는 탄소 나노튜브(carbon nanotube)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 프로브는 세포소기관(organelle)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 프로브는 음성 대조(negative control)로서 기능하는 불활성 화학종(inert species)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 중합화 단계는 단량체 스트림을 포토마스크(photomask)를 통해 전달된 자외선(ultraviolet light)에 노출시켜 인코딩된 영역을 갖는 입자를 생성하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 인코딩된 영역은 복수의 인코딩 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 인코딩 요소는 2-차원 격자에 정렬되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 격자는 20개의 인코딩 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구항 10에 있어서, 최소한 하나의 정위 인디케이터(orientation indicator)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 청구항 10에 있어서, 인코딩 요소는 비-균일한 형상 또는 크기를 보유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 청구항 1에 있어서, 중합화 단계는 2개 이상의 프로브-보유 영역을 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 청구항 1에 있어서, 중합화 단계는 2개 이상의 인코딩 영역을 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 청구항 9에 있어서, 자외선은 현미경 대물렌즈에 의해 포커싱되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 청구항 1에 있어서, 첫 번째와 두 번째 단량체 스트림은 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴산염을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 첫 번째와 두 번째 단량체 스트림은 광개시제(photoinitiator)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 청구항 1의 방법에 의해 제조되는 다중기능성 입자(multifunctional particle)에 있어서,
    상기 다중기능성 입자는 최소한 하나의 그래픽 인코딩 영역과, 하나의 프로브-보유 영역을 보유하고,
    상기 프로브-보유 영역은 상기 다중기능성 입자 내에 포함된 프로브를 포함하는
    다중기능성 입자.
  21. 고성능 스크리닝 장비(high-throughput screening system)에 있어서,
    청구항 1의 방법에 의해 제조되는 다중기능성 입자(multifunctional particle)와,
    상기 다중기능성 입자를 정렬 및 판독하도록 구성되는 마이크로유동 장치(flow-focusing microfluidic device)를 포함하며,
    각각의 다중기능성 입자는 최소한 하나의 그래픽 인코딩 영역과, 하나의 프로브-보유 영역을 보유하고,
    상기 프로브-보유 영역은 상기 다중기능성 입자 내에 포함된 프로브를 포함하는
    고성능 스크리닝 장비(high-throughput screening system).
  22. 청구항 1에 있어서, 프로브 접근성(probe accessibility)을 증가시키는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 청구항 22에 있어서, 프로브 접근성은 입자의 프로브-보유 영역에서 표면적(surface area)을 증가시킴으로써 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 표면적은 입자의 프로브-보유 영역에서 융기(ridge) 또는 오목한 곳(dimple)을 형성함으로써 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 청구항 22에 있어서, 프로브 접근성은 입자의 프로브-보유 영역에서 구멍 크기를 증가시킴으로써 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
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