DE10035750A1 - Vorrichtung mit einer Vielzahl von Probenkammern zur Behandlung von Zellen und zur Analyse mittels lichterzeugender Verfahren sowie Filterverbund - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung mit einer Vielzahl von Probenkammern zur Behandlung von Zellen und zur Analyse mittels lichterzeugender Verfahren sowie einen Filterverbund. DOLLAR A Mit Hilfe von sogenannten Mikrotiterplatten kann eine Vielzahl von Proben gleichzeitig behandelt und untersucht werden. Diese Platten werden häufig für DNA Aufreinigung, bei der PCR oder bei der Erstellung von Immunoassays eingesetzt. Nachteilig bei diesen Platten ist jedoch, daß eine direkte mikroskopische Auswertung der Proben, z. B. bei einer Hybridisierung von Zellen, in der Platte nicht möglich ist, da u. a. aus technischen Gründen eine genaue Fokussierung mit einem Mikroskop nicht möglich ist. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung und dem Filterverbund kann auf einfache Weise z. B. eine Hybridisierung in einer Art Mikrotiterplatte durchgeführt werden und anschließend durch einfache Entnahme der Filter mit den behandelten Zellen eine mikroskopische Auswertung durchgeführt werden.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung mit einer Viel­ zahl von Probenkammern zur Behandlung von Zellen sowie einen Filterverbund.

In der Umweltmikrobiologie ist die Fluoreszenzfärbung eine gängige Methode, um Zellzahl und phylogenetische Zuordnung von Bakterien aus Umweltproben zu bestimmen. Der Markt bietet eine ständig wachsende Zahl von Fluo­ reszenzfarbstoffen mit einer Vielzahl von Eigenschaf­ ten. So binden einige spezifisch an freie funktionelle Gruppen von Proteinen, andere interkalieren mit oder binden an Nukleinsäuren, wieder andere dienen als Sub­ stratanaloga bestimmter Enzyme oder zeigen die Konzen­ tration bestimmter Ionen an. Speziell die Bindung von Gensonden an zelleigene Nukleinsäuren (Hybridisie­ rung)stellt einen interessanten Bereich dar. Diese Bin­ dung wurde bisher auf Filtern oder speziellen Diagno­ stikobjektträgern durchgeführt.

Bei der Untersuchung von Zellen mit fluoreszenzmarkier­ ten Gensonden müssen folgende Verfahrensschritte vorge­ nommen werden. Zunächst werden die Zellen immobilisiert bzw. fixiert. Es handelt sich bei der Immobilisierung bzw. Fixierung um einen Vorgang, bei dem die Proteine der Zellen durch Degeneration in ihrer Aktivität soweit eingeschränkt werden, daß sie Nukleinsäuren nicht ab­ bauen. Zu diesem Zweck wird ein Fixativ zugesetzt. Nach einem Verfahren von F. O. Glöckner, M. F. Fuchs und R. Amann, 1999, "Bacterioplankton Compositions of Lakes and Oceans: A First Comparsion Based an Fluorescence In Situ Hybridization", Appl. Environ. Microbiol. 65: 3721-3726, werden die Zellen mit einem Fixativ ver­ setzt, inkubiert und später auf einem Filter abfil­ triert. Zur Filtration werden Standardfilter eines Durchmessers von 25 oder 47 mm eingesetzt. In einem al­ ternativen Verfahren von Amann werden die Zellen mit dem Fixativ versetzt, inkubiert, zentrifugiert, resus­ pendiert und auf einen speziellen Objektträger mit Ver­ tiefungen aufgetragen und luftgetrocknet.

Das Verfahren ist in R. I. Amann, L. Krumholz und D. A. Stahl, 1990, "Fluorescent-oligonucleotide pro­ bing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology", J. Bacteriol. 172: 762-770, veröffentlicht.

Die Methode von Amann hat zum Nachteil, daß bei der Trocknung die Lösungen nicht immer homogen verdunsten und sich ringförmige Ansammlungen von Objekten bilden können. Hinzu kommt, daß mehrere Arbeitsschritte, wie Zentrifugieren, Resuspendieren und Verdünnen, die Zel­ len beeinträchtigen können bis hin zu deren Zerstörung. Die Trocknung der Objektträger nimmt viel Zeit in An­ spruch, so daß die Proben nicht sofort weiterverarbei­ tet werden können. Aus diesen Gründen wird in der Regel die Filtermethode nach Glöckner bevorzugt.

Nach der Fixierung der Zellen folgt als zweiter Verfah­ rensschritt die Hybridisierung.

Nach dem Verfahren von H. M. Christensen, H. M. Hansen und J. Sorensen, 1999, "Counting and size classifica­ tion of active soil bacteria by fluorescence in situ hybridization with RNA oligonucleotide probe", Appl. Environ. Microbiol. 65: 1753-1761, erfolgt die Hybridi­ sierung in einem Reaktionsgefäß. Bei der Hybridisierung werden der Zellsuspension die fluoreszenzmarkierten Gensoden zugefügt. Die Hybridisierung erfordert je nach Art der verwendeten Gensonde einen Zeitraum von 30 bis 90 min bei einer Temperatur von 40 bis 50°C. Die Tem­ peratur hängt ebenfalls von der gewählten Gensonde ab. Wurden die suspendierten Zellen nach der Methode von Christensen in den Reaktionsgefäßen hybridisiert, so wird eine Zentrifugation durchgeführt, welche aber, wie erwähnt, die Qualität des Zellmaterials vermindert. Nach der Zentrifugation werden die Zellen gewaschen. Zur mikroskopischen Betrachtung werden die Zellen dann abfiltriert und der Filter auf einen Objektträger über­ tragen. Nach der Methode von Glöckner wird der Filter, welcher sich auf dem Objektträger befindet, mit Hybri­ disierungslösung überschichtet und in einer feuchten Hybridisierungskammer plaziert. Zum Waschen wird das Filter in ein Glasfläschchen mit Waschpuffer überführt, anschließend getrocknet und auf einen Objektträger zur mikroskopischen Aufnahme aufgezogen. Bei dieser Methode gehen unter optimalen Bedingungen mindestens 10% der Zellen verloren. Der Verlust der Zellen ist jedoch in Umweltproben unkontrolliert.

Das Verfahren ist in der Veröffentlichung F. O. Glöckner, R. Amann, A. Alfreider, J. Pernthaler, R. Psenner, K. Trebesius und K. H. Schleifer, 1996, "An in Situ Hybridization Protocol for Detection and Iden­ tification of Planktonic Bacteria System, Appl. Micro­ biol. 19: 403-406, beschrieben.

Die nach dem Stand der Technik bekannten Methoden zur Fluoreszenzfärbung haben den Nachteil, daß mehrere Ar­ beitsschritte unter Verwendung unterschiedlicher Gerät­ schaften erforderlich sind, bei denen Zellmaterial ver­ loren gehen kann, oder bei denen die Zellen durch me­ chanische Beanspruchung, wie beispielsweise durch Zen­ trifugation oder Resuspendieren, beschädigt werden kön­ nen. Aus DE 199 54 713.0-41 ist eine Vorrichtung zur Hybridisierung von Zellen bekannt, bei der in einem temperierbaren Hybridisierungsraum eine Absaugvorrich­ tung in Form einer Fritte angebracht ist, um die Reak­ tionslösung bei Bedarf absaugen zu können. Bei dieser Vorrichtung werden die zu untersuchenden Zellen mit der Hybridisierlösung in den Hybridisierungsraum gegeben, inkubiert und nach gewünschter Inkubationszeit kann die flüssige Phase mittels einer Vakuumpumpe abgezogen wer­ den. Die Zellen werden durch einen Filter, der sich am Boden des Hybridisierraums befindet, zurückgehalten. Der Filter kann anschließend zur weiteren mikroskopi­ schen Auswertung aus der Vorrichtung entnommen werden. Dieses Verfahren hat den Nachteil, daß ein hoher Mate­ rialaufwand für die benötigten Apparaturen notwendig wird, wenn mehrere Proben gleichzeitig behandelt und untersucht werden sollen. Außerdem wird ein relativ ho­ hes Volumen an Probe und Reagenzlösung benötigt (ca. 2 ml).

In der angewandten Umweltmikrobiologie haben sich in den letzten Jahren verstärkt sogenannte Mikrotiterplat­ ten durchgesetzt. Diese besitzen eine Abmessung von ca. 125 × 81 mm und sind mit 32, 96 oder auch 396 Vertie­ fungen versehen, welche beispielsweise ein Volumen von 60 bis 300 µl aufnehmen können. Diese Vertiefungen wer­ den mittels apparativer Hilfsmittel einzeln befüllt; dazu werden Pipetten mit einem Kanal oder mit 8, 48 oder 96 Kanälen benutzt. Der Vorteil der Mikrotiter­ platten liegt darin, daß eine Vielzahl von gleichen oder unterschiedlichen Proben, einschließlich Referenz­ lösungen, parallel behandelt und ausgewertet werden können. Auf dem Markt sind eine Vielzahl spezifischer Mikrotiterplatten, z. B. zur DNA-Aufreinigung, für Im­ munoassays sowie entsprechend angepaßtes Zubehör wie z. B. Photometer, Thermoblöcke, erhältlich. Ebenfalls Stand der Technik sind Filtrationssysteme, die im Zusammenhang mit Mikrotiterplatten eingesetzt werden. Hier werden Filter, die fest in die Vertiefungen der Mirotiterplatten verschweißt werden oder ganze Filter­ matten, die auf die gesamte Mikrotiterplatte gelegt werden, eingesetzt. Nachteilig bei dem Einsatz von fest verschweißten Filtern in der Mikrotiterplatte ist, daß eine direkte mikroskopische Auswertung der Filter nicht möglich ist, da auf Grund der Dicke der Mikrotiterplat­ te eine genaue Fokussierung der Proben mit dem Mikro­ skop unmöglich wird. Ein weiterer Nachteil dieser Mi­ krotiterplatten liegt darin, daß sie nur einmal benutzt werden können und die Probenbehandlung dadurch relativ kostenintensiv wird (ca. 30 DM/Platte). Die üblichen Ausführungen der Mikrotiterplatten aus Hartplastik be­ hindern zudem eine gerichtete Temperierung auf Grund der verminderten Wärmeleitfähigkeitgegenüber Metall. Nachteilig bei dem Einsatz ganzer Filtermatten ist das Auftreten von Kreuzkontaminationen mit Reagenzien be­ nachbarter Proben und optischen Interferenzen benach­ barter Proben, da eine Diffusion über die gesamte Fil­ termatte, ohne Abgrenzung der einzelnen Probenbereiche voneinander, leicht möglich ist. Auch eine mikroskopi­ sche Auswertung der gesamten Filtermatten ist wenig praktikabel, da diese auf Grund ihrer Größe nicht kom­ plett auf einen handelsüblichen Mikroskoptisch gelegt werden können.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung zu schaffen, mit der sowohl eine große Anzahl von Proben unter Einsatz geringer Mengen Reagenzlösung unter glei­ chen Bedingungen behandelt werden können, als auch eine direkte optische Auswertung zu ermöglichen. Weiterhin ist es Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung mit einem hohen Anteil an wieder verwendbaren Elementen zu schaffen, um den Einsatz dieser Vorrichtung kostengün­ stiger zu gestalten.

Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Auf­ gabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen. Die Aufgabe wird weiterhin ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 20 erfindungsgemäß gelöst mit dem im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 20 angegebenen Merkmal.

Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung und dem Filter­ verbund ist es nunmehr möglich, eine hohe Anzahl von Proben (z. B. 96) unter gleichen Bedingungen, insbeson­ dere gleichen thermischen Bedingungen, zu untersuchen. Die Vorrichtung ermöglicht die Verwendung kleiner Pro­ benmengen und damit auch einen geringen Verbrauch an Gensonden und Zellmaterial, sowie eine direkte mikro­ skopische Auswertung der Proben durch Entnahme der mo­ bilen Filter. Weiterhin ist es möglich, die Vorrichtung nach Entfernen der Filter erneut einzusetzen.

Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprü­ chen angegeben.

Die Zeichnungen zeigen eine beispielhafte Ausführungs­ form der erfindungsgemäßen Vorrichtung sowie des Fil­ terverbunds.

Es zeigt:

Fig. 1 Aufsicht obere Platte

Fig. 2 Aufsicht untere Platte

Fig. 3 Seitenansicht obere und untere Platte

Fig. 4 Filterverbund

Fig. 5 Aufsicht Grundplatte

Fig. 6 Seitenansicht Grundplatte

Die in Fig. 1 dargestellte obere Platte 1 zeigt eine Platte mit 96 Vertiefungen. Diese Vertiefungen bilden Rohrfortsätze 2, deren Öffnungen in Fig. 1 von oben zu sehen sind. Die Vertiefungen sind in einem gleichmäßi­ gen Muster angeordnet.

In der Aufsicht der unteren Platte 3 in Fig. 2 sind die auf den Aussparungen 4 der unteren Platte 3 aufliegen­ den Filter 5 zu sehen, die über einen Steg 6 miteinan­ der verbunden sind und jeweils von einem Ring 7 be­ grenzt werden.

In der Seitenansicht in Fig. 3 ist sowohl die obere Platte 1 mit den Rohrfortsätzen 2 als auch die untere Platte 3 mit den Aussparungen 4 zu sehen. Die Rohrfort­ sätze 2 der oberen Platte 1 werden bei Benutzung der Vorrichtung in die Aussparungen 4 der unteren Platte 3 eingesteckt.

Fig. 4 zeigt einen Filterverbund aus 8 Filtern 5, die über Stege 6 miteinander verbunden sind und jeweils von einem Ring 7 umgeben werden.

Fig. 5 zeigt eine Aufsicht auf die Grundplatte 8 mit Innenraum 11. Sie weist einen Dichtungsring 9, der den Innenraum 11 abdichtet, und ein Absaugrohr 10 auf.

In der Seitenansicht der Grundplatte in Fig. 6 ist das Absaugrohr 10, welches in den Innenraum 11 der Grund­ platte 8 mündet, zu sehen. Der Dichtungsring 9 begrenzt den Innenraum 11 der Grundplatte 8.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung gemäß Anspruch 1 mit einer oberen Platte 1 mit Rohrfortsätzen 2 sowie einer unteren Platte 3 mit Aussparungen 4, in die mobile Fil­ ter 5 eingelegt werden sowie Mittel zum Absaugen von Flüssigkeit, ermöglicht es, eine hohe Anzahl von Proben unter gleichen Bedingungen zu behandeln und zu untersu­ chen. Die Aussparungen 4 der unteren Platte 3 können die Form von runden Bohrungen, die u. a. konisch zulau­ fen, sowie eckig ausgestanzte Formen aufweisen. In die­ se Aussparungen 4 werden Filter 5 eingelegt, die das Material, welches untersucht werden soll, zurückhalten und nur für die Flüssigkeit, mit der die Proben behan­ delt werden sollen oder in welcher die Proben gelöst sind, durchlässig sind. Mit Hilfe der Mittel zum Absau­ gen von Flüssigkeit können diese durch die Filter 5 aus der Vorrichtung entfernt werden.

Die vorteilhafte Ausgestaltung der Vorrichtung gemäß Anspruch 2 mit der zugehörigen temperierbaren Kammer ermöglicht eine Behandlung von Zellmaterial unter kon­ stanten, temperierten Bedingungen. So kann beispiels­ weise eine Hybridisierung von Zellen durchgeführt wer­ den, ohne daß die Zellen zur Filtration oder weiteren Zugabe von Reagenzien aus der Vorrichtung entnommen werden müssen. Die Vorrichtung kann beispielsweise in einen Thermoblock gegeben werden. Hier ist es von be­ sonderem Vorteil, daß ein Temperaturgradient zur Er­ mittlung der jeweils optimalen Temperatur gefahren wer­ den kann.

Mit Hilfe der Ausgestaltung der Vorrichtung nach An­ spruch 3, die eine Pumpe zum Absaugen von Flüssigkeit umfaßt, ist es möglich, Separationsverfahren direkt mit der Vorrichtung durchzuführen. Die Pumpe kann bei­ spielsweise eine Vakuumpumpe, eine Wasserstrahlpumpe oder auch Membranpumpe sein. Das Absaugen der Flüssig­ keiten kann hier entweder komplett über die gesamte un­ tere Platte 3 erfolgen, indem die Pumpe an eine Grund­ platte 8, welche die Gesamtheit der Aussparungen 4 ab­ dichtet, angeschlossen wird, oder auch je nach Bedarf an die einzelnen Aussparungen 4 angeschlossen werden, so, daß jede einzelne Probe abgesaugt werden kann (An­ spruch 4). Dies hat den Vorteil, unter sonst gleich­ bleibenden Bedingungen, unterschiedliche Inkubations­ zeiten einsetzen zu können.

Durch die vorteilhafte Ausgestaltung der Vorrichtung gemäß Anspruch 5, in der die Filter 5 über Stege 6 mit­ einander verbunden sind, wird es möglich, mehrere Fil­ ter 5 gleichzeitig aus der Vorrichtung zu entfernen. Die Anzahl der Filter 5, die entfernt werden sollen, wird durch die Verknüpfung der einzelnen Filter 5 mit­ tels der Stege 6 festgelegt und kann, je nach Bedarf, variiert werden.

Die Ausgestaltung der Vorrichtung gemäß Anspruch 6, bei welcher der Filterdurchmesser dem Durchmesser der Aus­ sparungen 4 entspricht, dient dazu, die Aussparungen 4 der unteren Platte 3 abzudichten und damit den Boden für den Reaktionsraum der Vorrichtung zu bilden.

Die vorteilhafte Ausgestaltung der Vorrichtung gemäß Anspruch 7, in der der Abstand zwischen den Filtern 5 dem Abstand zwischen den Aussparungen 4 der unteren Platte 3 entspricht, ermöglicht es, daß die Filter 5 durch die Stege 6 so angeordnet sind, daß beispielswei­ se eine Anzahl von 8 oder 16 Filtern in einem Arbeits­ schritt in die Aussparungen 4 eingelegt werden können, ohne daß die Filter 5 einzeln eingelegt werden müssen.

Die vorteilhafte Ausführung der Vorrichtung gemäß An­ spruch 8, bei der die Filter 5 jeweils von einem Ring 7 umgeben sind, ermöglicht einen dichten Abschluß der Filter 5 mit den Aussparungen 4 der unteren Platte 3. Gleichzeitig ermöglichen sie die Fixierung der Filter 5 auf den Aussparungen 4 und eine Stabilisierung der sonst brüchigen Filter 5.

In der Ausführung der Vorrichtung nach Anspruch 9, bei der der Durchmesser des Ringes 7 oberhalb des Durchmes­ sers der Aussparungen 4 der unteren Platte 3 liegt, wird erreicht, daß der Ring 7 um die Filter 5 sich wie ein Kragen um die Aussparungen 4 legt und diese abdich­ tet.

Durch die vorteilhafte Ausgestaltung der Vorrichtung gemäß Anspruch 10, bei der der Ring 7 eine Dicke von 0,2 mm nicht überschreitet, wird es möglich, daß die Filter 5 direkt nach der Färbung oder einer anderen chemischen oder biologischen Behandlung aus der Vor­ richtung entnommen und unter ein Mikroskop gelegt wer­ den können. Durch die geringe Dicke der Filter 5 mit Ring 7 ist es möglich, daß das Objektiv des Mikroskops ausreichend nah an den Filter 5 herangefahren werden kann, um eine gute Fokussierung zu erreichen.

Die Ausgestaltung der Vorrichtung nach Anspruch 11, in der die Filter 5 eine Porengröße von 0,20 bis 0,45 µm aufweisen, bewirkt, daß mit den Filtern 5 ein großer Bereich an unterschiedlichen Mikroorganismen durch die Filter 5 zurückgehalten werden kann und damit Behand­ lungen, wie z. B. eine Hybridisierung, mit unterschied­ lich großen Mikroorganismen durchgeführt werden können.

Durch die Ausführung der Vorrichtung gemäß Anspruch 12, in der die Filter 5 aus Polycarbonat, Aluminiumoxid oder Cellulosenitrat bestehen, wird es möglich, die un­ terschiedlichen Anforderungen, die sich durch unter­ schiedliche Verwendung von Lösungsmitteln und Säuren ergeben und sich weiterhin durch unterschiedliches Pro­ teinbindungsverhalten sowie der Eigen- und Hintergrundfluoreszenzen der jeweiligen Filtereigenschaften erge­ ben, zu berücksichtigen.

In der vorteilhaften Ausgestaltung der Vorrichtung nach Anspruch 13, in der der Durchmesser der Rohrfortsätze 2 der oberen Platte 1 dem Durchmesser der Aussparungen 4 der unteren Platte 3 entspricht, wird ein genaues Ab­ schließen der Rohrfortsätze 2 der oberen Platte 1 mit den Aussparungen 4 der unteren Platte 3 erreicht, ohne daß Flüssigkeit austreten kann oder sich Toträume bil­ den.

Durch die Ausführung der Vorrichtung gemäß Anspruch 14, bei der die Rohrfortsätze 2 nach Aufsetzen auf die un­ tere Platte 3 ein Volumen bis 300 µl bilden, wird es möglich, mit einem kleinen Probenvolumen und auch mit einem kleinen Volumen an Reagenzlösung zu arbeiten, wo­ durch Kosteneinsparungen erreicht werden.

Gegenüber dem Stand der Technik wird eine Reduzierung der benötigten Hybridisierungsreagenz um das 10fache erreicht.

Die Ausführung der Vorrichtung gemäß Anspruch 15, in der die Vorrichtung aus wärmeleitfähigem Material be­ steht, bewirkt, daß bei Temperierung der Vorrichtung, z. B. durch Einlassen in einen Thermoblock, eine schnelle Einstellung der gewünschten Temperatur er­ folgt. Bei Einstellung eines Temperaturgradienten wird die Temperaturänderung schnell vom Thermoblock an die Vorrichtung übertragen. Besonders bevorzugt eignet sich hierzu eine Vorrichtung, die VA-Stahl umfaßt (Anspruch 17).

Durch die vorteilhafte Ausführung der Vorrichtung nach Anspruch 16, die aus lichtundurchlässigem Material besteht, wird eine Schädigung lichtempfindlicher Reagen­ zien oder Mikroorganismen verhindert.

Durch die Verwendung von chemisch inertem Material ge­ mäß der Ausführungsform nach Anspruch 18, in der der VA-Stahl mit Teflon, Glas, Kunststoff, Gold oder Kera­ mik beschichtet ist, ist es möglich auch chemisch reak­ tivere Reagenzien, wie z. B. Lösungsmittel und Säuren einzusetzen.

Die vorteilhafte Ausgestaltung der Vorrichtung nach An­ spruch 19, in der die Vorrichtung sterilisierbar ist, ermöglicht den vielfachen Einsatz der Vorrichtung. Es kann unter sterilen Bedingungen gearbeitet werden, in­ dem die Vorrichtung beispielsweise komplett autokla­ viert wird. Als Einwegmaterial fallen lediglich die verwendeten Filter 5 an.

Der Filterverbund nach Anspruch 20, in dem die einzel­ nen Filter 5 über Stege 6 miteinander verbunden sind, ermöglicht es, daß eine beliebig variable Anzahl an Filtern 5 miteinander verbunden werden können und so je nach Bedarf eingesetzt werden können. Es können bei­ spielsweise 8er Ketten von Filtern 5 verbunden werden, die in einer handelsüblichen Mikrotiterplatte mit 8 × 12 Vertiefungen genau in eine Reihe dieser Platte ein­ gesetzt werden können. Grundsätzlich ist ein Gitter von verbundenen Filtern 5 denkbar, welches je nach Anforde­ rung an den Stegen 6 zwischen den Filtern 5 beliebig wieder getrennt werden kann, um z. B. eine 4er Kette oder auch eine quadratische Anordnung zu erhalten. Durch die Verbindung der Filter 5 nur über die Stege 6 ist die Austauschfläche zwischen den einzelnen Filtern 5 sehr klein, so daß Kreuzkontaminationen mit benach­ barten Filtern 5 verhindert werden. Die relativ kleinen Filter 5 können durch die Verbindung der Filter 5 untereinander besser aus Filterhaltern entnommen werden, da der ganze Verbund an Filtern aus den Haltern heraus­ gezogen werden kann.

Die vorteilhafte Ausgestaltung des Filterverbunds nach Anspruch 21, in der die Stege 6 aus Kunststoffmaterial bestehen, bewirkt zum einen eine mechanisch stabile Verbindung zwischen den Filtern 5 und zum anderen eine chemisch inerte Verbindung. Gleichzeitig wird ein Dif­ fusionsaustausch zwischen den benachbarten Filtern 5 erschwert.

Die Ausführung des Filterverbundes nach Anspruch 22, in der die einzelnen Filter 5 von einem Ring 7 umgeben werden, bewirkt einen dichten Abschluß der Filter 5 mit der Filterhalterung, in die der Filterverbund eingelegt wird. Gleichzeitig ermöglichen sie die Fixierung der Filter 5 in der Halterung und eine Stabilisierung der eventuell brüchigen Filter 5.

Die Ausgestaltung des Filterverbundes nach Anspruch 23, in der der Ring 7 aus Kunststoffmaterial besteht, be­ wirkt zum einen eine mechanisch stabile Verbindung zwi­ schen den Filtern 5 und zum anderen eine chemisch iner­ te Stabilisierung der Filter. Gleichzeitig wird ein Diffusionsaustausch zwischen benachbarten Filtern 5 er­ schwert.

Durch die Ausführung des Filterverbundes nach Anspruch 24, in der der Ring eine Dicke von 0,2 mm nicht über­ schreitet, wird es möglich, daß die Filter 5 direkt nach der Färbung oder einer anderen chemischen oder biologischen Behandlung aus der Filterhalterung entnom­ men und unter ein Mikroskop gelegt werden können. Durch die geringe Dicke der Filter 5 mit Ring 7 ist es mög­ lich, daß das Objektiv des Mikroskops ausreichend nah an den Filter 5 herangefahren werden kann, um eine gute Fokussierung zu erreichen.

Die Ausgestaltung des Filtervebundes nach Anspruch 25, in der der Durchmesser des Ringes 7 um die Filter 5 größer ist als der Durchmesser der Aussparungen 4 in der unteren Platte 3 einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, bewirkt, daß der Ring 7 um die Fil­ ter 5 sich wie ein Kragen um die Aussparungen 4 legt und diese abdichtet.

In einer vorteilhaften Ausführung des Filterverbundes nach Anspruch 26, in dem die Filter linear miteinander verbunden sind, wird es möglich, je nach Bedarf eine Filterkette mit den benötigten Filtern einzusetzen und diese Filterkette der vorhandenen Anzahl an Filterha­ terungen anzupassen. Die Filterketten können so gut den matrixartig angeordneten Bohrungen einer Mikrotiter­ platte angepaßt werden.

Durch die Ausgestaltung des Filterverbundes nach An­ spruch 27, in der 8 Filter 5 linear miteinander verbun­ den werden, können diese Filterketten komplett in eine entsprechende Halterung, wie z. B. eine Reihe einer Mi­ krotiterplatte, eingelegt werden und nach Abschluß der Behandlung auch wieder entnommen werden.

Die Ausführung des Filterverbundes nach Anspruch 28, in der der Durchmesser der Filter 5 dem Durchmesser der Aussparungen 4 in der unteren Platte 3 gemäß einer Vor­ richtung nach einem der Ansprüche 1 bis 19 entspricht, bewirkt, daß die Aussparungen 4 der unteren Platte 3 abgedichtet werden und damit der Boden für den Reakti­ onsraum der Vorrichtung gebildet wird.

Die Ausführung des Filterverbundes nach Anspruch 29, in der die Filter 5 aus Polycarbonat, Aluminiumoxid oder Cellulosenitrat bestehen, ermöglicht, die unterschied­ lichen Anforderungen, die sich durch unterschiedliche Verwendung von Lösungsmitteln und Säuren ergeben und sich weiterhin durch unterschiedliches Proteinbindungs­ verhalten der jeweiligen Filtereigenschaften ergeben, zu berücksichtigen.

Die Ausgestaltung des Filterverbundes nach Anspruch 30, in der die Filter 5 eine Porengröße von 0,2 bis 0,45 mm aufweisen, bewirkt, daß mit den Filtern 5 ein großer Bereich an unterschiedlichen Mikroorganismen durch die Filter 5 zurückgehalten werden kann und damit Behand­ lungen, wie z. B. Hybridisierungen, unterschiedlich großer Mikroorganismen durchgeführt werden können.

Ausführungsbeispiel

Die obere Platte 1 mit 96 Rohrfortsätzen 2, in einer Anordnung von 12 × 8, wird mit der unteren Platte 3, die ebenfalls 96 Aussparungen in einer Anordnung von 12 × 8 aufweist und die mit 12 Filterverbünden aus je 8 Filtern 5 pro Reihe bestückt wurde, flüssigkeitsdicht zusammengesteckt. Die obere Platte 1 wird mit einem Deckel komplett verschlossen. Die untere Platte 3 wird mit einer Grundplatte 8, verstärkt durch einen Dich­ tungsring 9, flüssigkeitsdicht abgedichtet. An die ge­ samte Vorrichtung kann über die Grundplatte 8, die über ein Absaugrohr 10 an eine Vakuumpumpe angeschlossen ist, ein Vakuum angelegt werden. Zur sicheren Abdich­ tung der zusammengesteckten Platten kann noch eine Klammer um die gesamte Vorrichtung gespannt werden. Zur Temperierung wird die gesamte Vorrichtung in einen Thermoblock gegeben.

200 µl vorgewärmter Hybridisierungspuffer mit einem entsprechenden Anteil Gensonden werden in den Reaktionsraum, der aus den Rohrfortsätzen 2 der oberen Platte 1 zusammen mit den Filtern in den Aussparungen 4 der unteren Platte 3 gebildet wird, gegeben. Anschließend werden 100 µl fixierte Zellen hinzu gegeben. Nach einer Hybridisierungsdauer von einer Stunde wird die Flüssig­ keit abgesaugt, die Temperatur der Vorrichtung wird auf die gewünschte Waschtemperatur reguliert und mit 200 µl Waschpuffer aufgefüllt. Nach einer Stunde wird der Waschpuffer mit Hilfe der Vakuumpumpe, die an die Grundplatte 8 über das Absaugrohr 10 angeschlossen wur­ de, abgesaugt. Es werden erneut 200 µl Waschpuffer zu­ gegeben und wieder abgesaugt. Die Filter werden nun aus der Vorrichtung entfernt, indem der gesamte Filterver­ bund aus 8 Filtern pro Reihe aus der unteren Platte entnommen wird. Dieser Filterverbund kann direkt mikroskopisch untersucht werden. Bei Bedarf kann auch eine Gegenfärbung in der Vorrichtung durchgeführt wer­ den. Die Filter verbleiben während des gesamten Verfah­ rens in den Aussparungen 4 der unteren Platte 3. Dies hat den Vorteil, daß eventuell vom Filter abgelöste Zellen durch Absaugen wieder aufgefangen werden können.

Claims (30)

1. Vorrichtung mit einer Vielzahl von Probenkammern zur Behandlung von Zellen und zur Analyse mittels lichterzeugender Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine obere Platte (1) mit Rohrfortsätzen (2) sowie eine untere Platte (3) mit Aussparungen (4), in die mobile Filter (5) eingelegt werden, so­ wie Mittel zum Absaugen von Flüssigkeit, umfaßt.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Vorrichtung eine temperierbare Kammer zuge­ hörig ist.

3. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zum Absaugen von Flüssigkeit eine Pumpe umfassen.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Pumpe direkt an die einzelnen Aussparungen (4) der unteren Platte (3) oder an eine Grundplatte (8) angeschlossen wird, welche die Gesamtheit der Aussparungen abdichtet.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Filter (5) über Stege (6) miteinander ver­ bunden sind.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Filterdurchmesser, dem Durchmesser der Aus­ sparungen (4) entspricht.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand zwischen den Filtern (5) dem Ab­ stand zwischen den Aussparungen (4) der unteren Platte (3) entspricht.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Filter (5) jeweils von einem Ring (7) umge­ ben sind.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchmesser des Ringes (7) oberhalb des Durchmessers der Aussparungen (4) der unteren Plat­ te (3) liegt.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Ring (7) eine Dicke von 0,2 mm nicht über­ schreitet.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Filter (5) eine Porengröße von 0,2 bis 0,45 µm aufweisen.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Filter (5) aus Polycarbonat, Aluminiumoxid oder Cellulosenitrat sind.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchmesser der Rohrfortsätze (2) der obe­ ren Platte (1) dem Durchmesser der Aussparungen (4) der unteren Platte (3) entspricht.

14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Rohrfortsätze (2) nach Aufsetzen auf die untere Platte (3) ein Volumen bis 300 µl bilden.

15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus wärmeleitfähigem Material besteht.

16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus lichtundurchlässigem Material besteht.

17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie VA-Stahl umfaßt.

18. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der VA-Stahl mit Teflon, Glas, Kunststoff, Gold oder Keramik beschichtet ist.

19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie sterilisierbar ist.

20. Filterverbund, dadurch gekennzeichnet, daß einzelne Filter (5) über Stege (6) miteinander verbunden werden.

21. Filterverbund nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Stege (6) aus Kunststoffmaterial bestehen.

22. Filterverbund nach einem der Ansprüche 20 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Filter (5) von einem Ring (7) um­ geben werden.

23. Filterverbund nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Ring (7) aus Kunststoffmaterial besteht.

24. Filterverbund nach einem der Ansprüche 22 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Ring (7) eine Dicke von 0,2 mm nicht über­ schreitet.

25. Filterverbund nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchmesser des Ringes (7) um die Filter (5) größer ist als der Durchmesser der Aussparungen (4) in der unteren Platte (3) einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 19.

26. Filterverbund nach einem der Ansprüche 20 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Filter (5) linear miteinander verbunden sind.

27. Filterverbund nach einem der Ansprüche 20 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß 8 Filter (5) linear miteinander verbunden sind.

28. Filterverbund nach einem der Ansprüche 20 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchmesser der Filter (5) dem Durchmesser der Aussparungen (4) in der unteren Platte (3) gemäß einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 19 entspricht.

29. Filterverbund nach einem der Ansprüche 20 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Filter (5) aus Polycarbonat, Aluminiumoxid oder Cellulosenitrat bestehen.

30. Filterverbund nach einem der Ansprüche 20 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Filter (5) eine Porengröße von 0,2 bis 0,45 µm aufweisen.