DE10035750A1 - Vorrichtung mit einer Vielzahl von Probenkammern zur Behandlung von Zellen und zur Analyse mittels lichterzeugender Verfahren sowie Filterverbund - Google Patents
Vorrichtung mit einer Vielzahl von Probenkammern zur Behandlung von Zellen und zur Analyse mittels lichterzeugender Verfahren sowie FilterverbundInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung mit einer Vielzahl von Probenkammern zur Behandlung von Zellen und zur Analyse mittels lichterzeugender Verfahren sowie einen Filterverbund. DOLLAR A Mit Hilfe von sogenannten Mikrotiterplatten kann eine Vielzahl von Proben gleichzeitig behandelt und untersucht werden. Diese Platten werden häufig für DNA Aufreinigung, bei der PCR oder bei der Erstellung von Immunoassays eingesetzt. Nachteilig bei diesen Platten ist jedoch, daß eine direkte mikroskopische Auswertung der Proben, z. B. bei einer Hybridisierung von Zellen, in der Platte nicht möglich ist, da u. a. aus technischen Gründen eine genaue Fokussierung mit einem Mikroskop nicht möglich ist. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung und dem Filterverbund kann auf einfache Weise z. B. eine Hybridisierung in einer Art Mikrotiterplatte durchgeführt werden und anschließend durch einfache Entnahme der Filter mit den behandelten Zellen eine mikroskopische Auswertung durchgeführt werden.
Description
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung mit einer Viel
zahl von Probenkammern zur Behandlung von Zellen sowie
einen Filterverbund.
In der Umweltmikrobiologie ist die Fluoreszenzfärbung
eine gängige Methode, um Zellzahl und phylogenetische
Zuordnung von Bakterien aus Umweltproben zu bestimmen.
Der Markt bietet eine ständig wachsende Zahl von Fluo
reszenzfarbstoffen mit einer Vielzahl von Eigenschaf
ten. So binden einige spezifisch an freie funktionelle
Gruppen von Proteinen, andere interkalieren mit oder
binden an Nukleinsäuren, wieder andere dienen als Sub
stratanaloga bestimmter Enzyme oder zeigen die Konzen
tration bestimmter Ionen an. Speziell die Bindung von
Gensonden an zelleigene Nukleinsäuren (Hybridisie
rung)stellt einen interessanten Bereich dar. Diese Bin
dung wurde bisher auf Filtern oder speziellen Diagno
stikobjektträgern durchgeführt.
Bei der Untersuchung von Zellen mit fluoreszenzmarkier
ten Gensonden müssen folgende Verfahrensschritte vorge
nommen werden. Zunächst werden die Zellen immobilisiert
bzw. fixiert. Es handelt sich bei der Immobilisierung
bzw. Fixierung um einen Vorgang, bei dem die Proteine
der Zellen durch Degeneration in ihrer Aktivität soweit
eingeschränkt werden, daß sie Nukleinsäuren nicht ab
bauen. Zu diesem Zweck wird ein Fixativ zugesetzt. Nach
einem Verfahren von F. O. Glöckner, M. F. Fuchs und
R. Amann, 1999, "Bacterioplankton Compositions of Lakes
and Oceans: A First Comparsion Based an Fluorescence In
Situ Hybridization", Appl. Environ. Microbiol. 65:
3721-3726, werden die Zellen mit einem Fixativ ver
setzt, inkubiert und später auf einem Filter abfil
triert. Zur Filtration werden Standardfilter eines
Durchmessers von 25 oder 47 mm eingesetzt. In einem al
ternativen Verfahren von Amann werden die Zellen mit
dem Fixativ versetzt, inkubiert, zentrifugiert, resus
pendiert und auf einen speziellen Objektträger mit Ver
tiefungen aufgetragen und luftgetrocknet.
Das Verfahren ist in R. I. Amann, L. Krumholz und
D. A. Stahl, 1990, "Fluorescent-oligonucleotide pro
bing of whole cells for determinative, phylogenetic and
environmental studies in microbiology", J. Bacteriol.
172: 762-770, veröffentlicht.
Die Methode von Amann hat zum Nachteil, daß bei der
Trocknung die Lösungen nicht immer homogen verdunsten
und sich ringförmige Ansammlungen von Objekten bilden
können. Hinzu kommt, daß mehrere Arbeitsschritte, wie
Zentrifugieren, Resuspendieren und Verdünnen, die Zel
len beeinträchtigen können bis hin zu deren Zerstörung.
Die Trocknung der Objektträger nimmt viel Zeit in An
spruch, so daß die Proben nicht sofort weiterverarbei
tet werden können. Aus diesen Gründen wird in der Regel
die Filtermethode nach Glöckner bevorzugt.
Nach der Fixierung der Zellen folgt als zweiter Verfah
rensschritt die Hybridisierung.
Nach dem Verfahren von H. M. Christensen, H. M. Hansen
und J. Sorensen, 1999, "Counting and size classifica
tion of active soil bacteria by fluorescence in situ
hybridization with RNA oligonucleotide probe", Appl.
Environ. Microbiol. 65: 1753-1761, erfolgt die Hybridi
sierung in einem Reaktionsgefäß. Bei der Hybridisierung
werden der Zellsuspension die fluoreszenzmarkierten
Gensoden zugefügt. Die Hybridisierung erfordert je nach
Art der verwendeten Gensonde einen Zeitraum von 30 bis
90 min bei einer Temperatur von 40 bis 50°C. Die Tem
peratur hängt ebenfalls von der gewählten Gensonde ab.
Wurden die suspendierten Zellen nach der Methode von
Christensen in den Reaktionsgefäßen hybridisiert, so
wird eine Zentrifugation durchgeführt, welche aber, wie
erwähnt, die Qualität des Zellmaterials vermindert.
Nach der Zentrifugation werden die Zellen gewaschen.
Zur mikroskopischen Betrachtung werden die Zellen dann
abfiltriert und der Filter auf einen Objektträger über
tragen. Nach der Methode von Glöckner wird der Filter,
welcher sich auf dem Objektträger befindet, mit Hybri
disierungslösung überschichtet und in einer feuchten
Hybridisierungskammer plaziert. Zum Waschen wird das
Filter in ein Glasfläschchen mit Waschpuffer überführt,
anschließend getrocknet und auf einen Objektträger zur
mikroskopischen Aufnahme aufgezogen. Bei dieser Methode
gehen unter optimalen Bedingungen mindestens 10% der
Zellen verloren. Der Verlust der Zellen ist jedoch in
Umweltproben unkontrolliert.
Das Verfahren ist in der Veröffentlichung
F. O. Glöckner, R. Amann, A. Alfreider, J. Pernthaler,
R. Psenner, K. Trebesius und K. H. Schleifer, 1996, "An
in Situ Hybridization Protocol for Detection and Iden
tification of Planktonic Bacteria System, Appl. Micro
biol. 19: 403-406, beschrieben.
Die nach dem Stand der Technik bekannten Methoden zur
Fluoreszenzfärbung haben den Nachteil, daß mehrere Ar
beitsschritte unter Verwendung unterschiedlicher Gerät
schaften erforderlich sind, bei denen Zellmaterial ver
loren gehen kann, oder bei denen die Zellen durch me
chanische Beanspruchung, wie beispielsweise durch Zen
trifugation oder Resuspendieren, beschädigt werden kön
nen. Aus DE 199 54 713.0-41 ist eine Vorrichtung zur
Hybridisierung von Zellen bekannt, bei der in einem
temperierbaren Hybridisierungsraum eine Absaugvorrich
tung in Form einer Fritte angebracht ist, um die Reak
tionslösung bei Bedarf absaugen zu können. Bei dieser
Vorrichtung werden die zu untersuchenden Zellen mit der
Hybridisierlösung in den Hybridisierungsraum gegeben,
inkubiert und nach gewünschter Inkubationszeit kann die
flüssige Phase mittels einer Vakuumpumpe abgezogen wer
den. Die Zellen werden durch einen Filter, der sich am
Boden des Hybridisierraums befindet, zurückgehalten.
Der Filter kann anschließend zur weiteren mikroskopi
schen Auswertung aus der Vorrichtung entnommen werden.
Dieses Verfahren hat den Nachteil, daß ein hoher Mate
rialaufwand für die benötigten Apparaturen notwendig
wird, wenn mehrere Proben gleichzeitig behandelt und
untersucht werden sollen. Außerdem wird ein relativ ho
hes Volumen an Probe und Reagenzlösung benötigt (ca. 2 ml).
In der angewandten Umweltmikrobiologie haben sich in
den letzten Jahren verstärkt sogenannte Mikrotiterplat
ten durchgesetzt. Diese besitzen eine Abmessung von ca.
125 × 81 mm und sind mit 32, 96 oder auch 396 Vertie
fungen versehen, welche beispielsweise ein Volumen von
60 bis 300 µl aufnehmen können. Diese Vertiefungen wer
den mittels apparativer Hilfsmittel einzeln befüllt;
dazu werden Pipetten mit einem Kanal oder mit 8, 48
oder 96 Kanälen benutzt. Der Vorteil der Mikrotiter
platten liegt darin, daß eine Vielzahl von gleichen
oder unterschiedlichen Proben, einschließlich Referenz
lösungen, parallel behandelt und ausgewertet werden
können. Auf dem Markt sind eine Vielzahl spezifischer
Mikrotiterplatten, z. B. zur DNA-Aufreinigung, für Im
munoassays sowie entsprechend angepaßtes Zubehör wie z. B.
Photometer, Thermoblöcke, erhältlich. Ebenfalls
Stand der Technik sind Filtrationssysteme, die im Zusammenhang
mit Mikrotiterplatten eingesetzt werden.
Hier werden Filter, die fest in die Vertiefungen der
Mirotiterplatten verschweißt werden oder ganze Filter
matten, die auf die gesamte Mikrotiterplatte gelegt
werden, eingesetzt. Nachteilig bei dem Einsatz von fest
verschweißten Filtern in der Mikrotiterplatte ist, daß
eine direkte mikroskopische Auswertung der Filter nicht
möglich ist, da auf Grund der Dicke der Mikrotiterplat
te eine genaue Fokussierung der Proben mit dem Mikro
skop unmöglich wird. Ein weiterer Nachteil dieser Mi
krotiterplatten liegt darin, daß sie nur einmal benutzt
werden können und die Probenbehandlung dadurch relativ
kostenintensiv wird (ca. 30 DM/Platte). Die üblichen
Ausführungen der Mikrotiterplatten aus Hartplastik be
hindern zudem eine gerichtete Temperierung auf Grund
der verminderten Wärmeleitfähigkeitgegenüber Metall.
Nachteilig bei dem Einsatz ganzer Filtermatten ist das
Auftreten von Kreuzkontaminationen mit Reagenzien be
nachbarter Proben und optischen Interferenzen benach
barter Proben, da eine Diffusion über die gesamte Fil
termatte, ohne Abgrenzung der einzelnen Probenbereiche
voneinander, leicht möglich ist. Auch eine mikroskopi
sche Auswertung der gesamten Filtermatten ist wenig
praktikabel, da diese auf Grund ihrer Größe nicht kom
plett auf einen handelsüblichen Mikroskoptisch gelegt
werden können.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung zu
schaffen, mit der sowohl eine große Anzahl von Proben
unter Einsatz geringer Mengen Reagenzlösung unter glei
chen Bedingungen behandelt werden können, als auch eine
direkte optische Auswertung zu ermöglichen. Weiterhin
ist es Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung mit
einem hohen Anteil an wieder verwendbaren Elementen zu
schaffen, um den Einsatz dieser Vorrichtung kostengün
stiger zu gestalten.
Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Auf
gabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden
Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen. Die Aufgabe
wird weiterhin ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs
20 erfindungsgemäß gelöst mit dem im kennzeichnenden
Teil des Anspruchs 20 angegebenen Merkmal.
Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung und dem Filter
verbund ist es nunmehr möglich, eine hohe Anzahl von
Proben (z. B. 96) unter gleichen Bedingungen, insbeson
dere gleichen thermischen Bedingungen, zu untersuchen.
Die Vorrichtung ermöglicht die Verwendung kleiner Pro
benmengen und damit auch einen geringen Verbrauch an
Gensonden und Zellmaterial, sowie eine direkte mikro
skopische Auswertung der Proben durch Entnahme der mo
bilen Filter. Weiterhin ist es möglich, die Vorrichtung
nach Entfernen der Filter erneut einzusetzen.
Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprü
chen angegeben.
Die Zeichnungen zeigen eine beispielhafte Ausführungs
form der erfindungsgemäßen Vorrichtung sowie des Fil
terverbunds.
Es zeigt:
Fig. 1 Aufsicht obere Platte
Fig. 2 Aufsicht untere Platte
Fig. 3 Seitenansicht obere und untere Platte
Fig. 4 Filterverbund
Fig. 5 Aufsicht Grundplatte
Fig. 6 Seitenansicht Grundplatte
Die in Fig. 1 dargestellte obere Platte 1 zeigt eine
Platte mit 96 Vertiefungen. Diese Vertiefungen bilden
Rohrfortsätze 2, deren Öffnungen in Fig. 1 von oben zu
sehen sind. Die Vertiefungen sind in einem gleichmäßi
gen Muster angeordnet.
In der Aufsicht der unteren Platte 3 in Fig. 2 sind die
auf den Aussparungen 4 der unteren Platte 3 aufliegen
den Filter 5 zu sehen, die über einen Steg 6 miteinan
der verbunden sind und jeweils von einem Ring 7 be
grenzt werden.
In der Seitenansicht in Fig. 3 ist sowohl die obere
Platte 1 mit den Rohrfortsätzen 2 als auch die untere
Platte 3 mit den Aussparungen 4 zu sehen. Die Rohrfort
sätze 2 der oberen Platte 1 werden bei Benutzung der
Vorrichtung in die Aussparungen 4 der unteren Platte 3
eingesteckt.
Fig. 4 zeigt einen Filterverbund aus 8 Filtern 5, die
über Stege 6 miteinander verbunden sind und jeweils von
einem Ring 7 umgeben werden.
Fig. 5 zeigt eine Aufsicht auf die Grundplatte 8 mit
Innenraum 11. Sie weist einen Dichtungsring 9, der den
Innenraum 11 abdichtet, und ein Absaugrohr 10 auf.
In der Seitenansicht der Grundplatte in Fig. 6 ist das
Absaugrohr 10, welches in den Innenraum 11 der Grund
platte 8 mündet, zu sehen. Der Dichtungsring 9 begrenzt
den Innenraum 11 der Grundplatte 8.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung gemäß Anspruch 1 mit
einer oberen Platte 1 mit Rohrfortsätzen 2 sowie einer
unteren Platte 3 mit Aussparungen 4, in die mobile Fil
ter 5 eingelegt werden sowie Mittel zum Absaugen von
Flüssigkeit, ermöglicht es, eine hohe Anzahl von Proben
unter gleichen Bedingungen zu behandeln und zu untersu
chen. Die Aussparungen 4 der unteren Platte 3 können
die Form von runden Bohrungen, die u. a. konisch zulau
fen, sowie eckig ausgestanzte Formen aufweisen. In die
se Aussparungen 4 werden Filter 5 eingelegt, die das
Material, welches untersucht werden soll, zurückhalten
und nur für die Flüssigkeit, mit der die Proben behan
delt werden sollen oder in welcher die Proben gelöst
sind, durchlässig sind. Mit Hilfe der Mittel zum Absau
gen von Flüssigkeit können diese durch die Filter 5 aus
der Vorrichtung entfernt werden.
Die vorteilhafte Ausgestaltung der Vorrichtung gemäß
Anspruch 2 mit der zugehörigen temperierbaren Kammer
ermöglicht eine Behandlung von Zellmaterial unter kon
stanten, temperierten Bedingungen. So kann beispiels
weise eine Hybridisierung von Zellen durchgeführt wer
den, ohne daß die Zellen zur Filtration oder weiteren
Zugabe von Reagenzien aus der Vorrichtung entnommen
werden müssen. Die Vorrichtung kann beispielsweise in
einen Thermoblock gegeben werden. Hier ist es von be
sonderem Vorteil, daß ein Temperaturgradient zur Er
mittlung der jeweils optimalen Temperatur gefahren wer
den kann.
Mit Hilfe der Ausgestaltung der Vorrichtung nach An
spruch 3, die eine Pumpe zum Absaugen von Flüssigkeit
umfaßt, ist es möglich, Separationsverfahren direkt mit
der Vorrichtung durchzuführen. Die Pumpe kann bei
spielsweise eine Vakuumpumpe, eine Wasserstrahlpumpe
oder auch Membranpumpe sein. Das Absaugen der Flüssig
keiten kann hier entweder komplett über die gesamte un
tere Platte 3 erfolgen, indem die Pumpe an eine Grund
platte 8, welche die Gesamtheit der Aussparungen 4 ab
dichtet, angeschlossen wird, oder auch je nach Bedarf
an die einzelnen Aussparungen 4 angeschlossen werden,
so, daß jede einzelne Probe abgesaugt werden kann (An
spruch 4). Dies hat den Vorteil, unter sonst gleich
bleibenden Bedingungen, unterschiedliche Inkubations
zeiten einsetzen zu können.
Durch die vorteilhafte Ausgestaltung der Vorrichtung
gemäß Anspruch 5, in der die Filter 5 über Stege 6 mit
einander verbunden sind, wird es möglich, mehrere Fil
ter 5 gleichzeitig aus der Vorrichtung zu entfernen.
Die Anzahl der Filter 5, die entfernt werden sollen,
wird durch die Verknüpfung der einzelnen Filter 5 mit
tels der Stege 6 festgelegt und kann, je nach Bedarf,
variiert werden.
Die Ausgestaltung der Vorrichtung gemäß Anspruch 6, bei
welcher der Filterdurchmesser dem Durchmesser der Aus
sparungen 4 entspricht, dient dazu, die Aussparungen 4
der unteren Platte 3 abzudichten und damit den Boden
für den Reaktionsraum der Vorrichtung zu bilden.
Die vorteilhafte Ausgestaltung der Vorrichtung gemäß
Anspruch 7, in der der Abstand zwischen den Filtern 5
dem Abstand zwischen den Aussparungen 4 der unteren
Platte 3 entspricht, ermöglicht es, daß die Filter 5
durch die Stege 6 so angeordnet sind, daß beispielswei
se eine Anzahl von 8 oder 16 Filtern in einem Arbeits
schritt in die Aussparungen 4 eingelegt werden können,
ohne daß die Filter 5 einzeln eingelegt werden müssen.
Die vorteilhafte Ausführung der Vorrichtung gemäß An
spruch 8, bei der die Filter 5 jeweils von einem Ring 7
umgeben sind, ermöglicht einen dichten Abschluß der
Filter 5 mit den Aussparungen 4 der unteren Platte 3.
Gleichzeitig ermöglichen sie die Fixierung der Filter 5
auf den Aussparungen 4 und eine Stabilisierung der
sonst brüchigen Filter 5.
In der Ausführung der Vorrichtung nach Anspruch 9, bei
der der Durchmesser des Ringes 7 oberhalb des Durchmes
sers der Aussparungen 4 der unteren Platte 3 liegt,
wird erreicht, daß der Ring 7 um die Filter 5 sich wie
ein Kragen um die Aussparungen 4 legt und diese abdich
tet.
Durch die vorteilhafte Ausgestaltung der Vorrichtung
gemäß Anspruch 10, bei der der Ring 7 eine Dicke von
0,2 mm nicht überschreitet, wird es möglich, daß die
Filter 5 direkt nach der Färbung oder einer anderen
chemischen oder biologischen Behandlung aus der Vor
richtung entnommen und unter ein Mikroskop gelegt wer
den können. Durch die geringe Dicke der Filter 5 mit
Ring 7 ist es möglich, daß das Objektiv des Mikroskops
ausreichend nah an den Filter 5 herangefahren werden
kann, um eine gute Fokussierung zu erreichen.
Die Ausgestaltung der Vorrichtung nach Anspruch 11, in
der die Filter 5 eine Porengröße von 0,20 bis 0,45 µm
aufweisen, bewirkt, daß mit den Filtern 5 ein großer
Bereich an unterschiedlichen Mikroorganismen durch die
Filter 5 zurückgehalten werden kann und damit Behand
lungen, wie z. B. eine Hybridisierung, mit unterschied
lich großen Mikroorganismen durchgeführt werden können.
Durch die Ausführung der Vorrichtung gemäß Anspruch 12,
in der die Filter 5 aus Polycarbonat, Aluminiumoxid
oder Cellulosenitrat bestehen, wird es möglich, die un
terschiedlichen Anforderungen, die sich durch unter
schiedliche Verwendung von Lösungsmitteln und Säuren
ergeben und sich weiterhin durch unterschiedliches Pro
teinbindungsverhalten sowie der Eigen- und Hintergrundfluoreszenzen
der jeweiligen Filtereigenschaften erge
ben, zu berücksichtigen.
In der vorteilhaften Ausgestaltung der Vorrichtung nach
Anspruch 13, in der der Durchmesser der Rohrfortsätze 2
der oberen Platte 1 dem Durchmesser der Aussparungen 4
der unteren Platte 3 entspricht, wird ein genaues Ab
schließen der Rohrfortsätze 2 der oberen Platte 1 mit
den Aussparungen 4 der unteren Platte 3 erreicht, ohne
daß Flüssigkeit austreten kann oder sich Toträume bil
den.
Durch die Ausführung der Vorrichtung gemäß Anspruch 14,
bei der die Rohrfortsätze 2 nach Aufsetzen auf die un
tere Platte 3 ein Volumen bis 300 µl bilden, wird es
möglich, mit einem kleinen Probenvolumen und auch mit
einem kleinen Volumen an Reagenzlösung zu arbeiten, wo
durch Kosteneinsparungen erreicht werden.
Gegenüber dem Stand der Technik wird eine Reduzierung
der benötigten Hybridisierungsreagenz um das 10fache
erreicht.
Die Ausführung der Vorrichtung gemäß Anspruch 15, in
der die Vorrichtung aus wärmeleitfähigem Material be
steht, bewirkt, daß bei Temperierung der Vorrichtung,
z. B. durch Einlassen in einen Thermoblock, eine
schnelle Einstellung der gewünschten Temperatur er
folgt. Bei Einstellung eines Temperaturgradienten wird
die Temperaturänderung schnell vom Thermoblock an die
Vorrichtung übertragen. Besonders bevorzugt eignet sich
hierzu eine Vorrichtung, die VA-Stahl umfaßt (Anspruch
17).
Durch die vorteilhafte Ausführung der Vorrichtung nach
Anspruch 16, die aus lichtundurchlässigem Material besteht,
wird eine Schädigung lichtempfindlicher Reagen
zien oder Mikroorganismen verhindert.
Durch die Verwendung von chemisch inertem Material ge
mäß der Ausführungsform nach Anspruch 18, in der der
VA-Stahl mit Teflon, Glas, Kunststoff, Gold oder Kera
mik beschichtet ist, ist es möglich auch chemisch reak
tivere Reagenzien, wie z. B. Lösungsmittel und Säuren
einzusetzen.
Die vorteilhafte Ausgestaltung der Vorrichtung nach An
spruch 19, in der die Vorrichtung sterilisierbar ist,
ermöglicht den vielfachen Einsatz der Vorrichtung. Es
kann unter sterilen Bedingungen gearbeitet werden, in
dem die Vorrichtung beispielsweise komplett autokla
viert wird. Als Einwegmaterial fallen lediglich die
verwendeten Filter 5 an.
Der Filterverbund nach Anspruch 20, in dem die einzel
nen Filter 5 über Stege 6 miteinander verbunden sind,
ermöglicht es, daß eine beliebig variable Anzahl an
Filtern 5 miteinander verbunden werden können und so je
nach Bedarf eingesetzt werden können. Es können bei
spielsweise 8er Ketten von Filtern 5 verbunden werden,
die in einer handelsüblichen Mikrotiterplatte mit 8 ×
12 Vertiefungen genau in eine Reihe dieser Platte ein
gesetzt werden können. Grundsätzlich ist ein Gitter von
verbundenen Filtern 5 denkbar, welches je nach Anforde
rung an den Stegen 6 zwischen den Filtern 5 beliebig
wieder getrennt werden kann, um z. B. eine 4er Kette
oder auch eine quadratische Anordnung zu erhalten.
Durch die Verbindung der Filter 5 nur über die Stege 6
ist die Austauschfläche zwischen den einzelnen Filtern
5 sehr klein, so daß Kreuzkontaminationen mit benach
barten Filtern 5 verhindert werden. Die relativ kleinen
Filter 5 können durch die Verbindung der Filter 5 untereinander
besser aus Filterhaltern entnommen werden,
da der ganze Verbund an Filtern aus den Haltern heraus
gezogen werden kann.
Die vorteilhafte Ausgestaltung des Filterverbunds nach
Anspruch 21, in der die Stege 6 aus Kunststoffmaterial
bestehen, bewirkt zum einen eine mechanisch stabile
Verbindung zwischen den Filtern 5 und zum anderen eine
chemisch inerte Verbindung. Gleichzeitig wird ein Dif
fusionsaustausch zwischen den benachbarten Filtern 5
erschwert.
Die Ausführung des Filterverbundes nach Anspruch 22, in
der die einzelnen Filter 5 von einem Ring 7 umgeben
werden, bewirkt einen dichten Abschluß der Filter 5 mit
der Filterhalterung, in die der Filterverbund eingelegt
wird. Gleichzeitig ermöglichen sie die Fixierung der
Filter 5 in der Halterung und eine Stabilisierung der
eventuell brüchigen Filter 5.
Die Ausgestaltung des Filterverbundes nach Anspruch 23,
in der der Ring 7 aus Kunststoffmaterial besteht, be
wirkt zum einen eine mechanisch stabile Verbindung zwi
schen den Filtern 5 und zum anderen eine chemisch iner
te Stabilisierung der Filter. Gleichzeitig wird ein
Diffusionsaustausch zwischen benachbarten Filtern 5 er
schwert.
Durch die Ausführung des Filterverbundes nach Anspruch
24, in der der Ring eine Dicke von 0,2 mm nicht über
schreitet, wird es möglich, daß die Filter 5 direkt
nach der Färbung oder einer anderen chemischen oder
biologischen Behandlung aus der Filterhalterung entnom
men und unter ein Mikroskop gelegt werden können. Durch
die geringe Dicke der Filter 5 mit Ring 7 ist es mög
lich, daß das Objektiv des Mikroskops ausreichend nah
an den Filter 5 herangefahren werden kann, um eine gute
Fokussierung zu erreichen.
Die Ausgestaltung des Filtervebundes nach Anspruch 25,
in der der Durchmesser des Ringes 7 um die Filter 5
größer ist als der Durchmesser der Aussparungen 4 in
der unteren Platte 3 einer Vorrichtung nach einem der
Ansprüche 1 bis 19, bewirkt, daß der Ring 7 um die Fil
ter 5 sich wie ein Kragen um die Aussparungen 4 legt
und diese abdichtet.
In einer vorteilhaften Ausführung des Filterverbundes
nach Anspruch 26, in dem die Filter linear miteinander
verbunden sind, wird es möglich, je nach Bedarf eine
Filterkette mit den benötigten Filtern einzusetzen und
diese Filterkette der vorhandenen Anzahl an Filterha
terungen anzupassen. Die Filterketten können so gut den
matrixartig angeordneten Bohrungen einer Mikrotiter
platte angepaßt werden.
Durch die Ausgestaltung des Filterverbundes nach An
spruch 27, in der 8 Filter 5 linear miteinander verbun
den werden, können diese Filterketten komplett in eine
entsprechende Halterung, wie z. B. eine Reihe einer Mi
krotiterplatte, eingelegt werden und nach Abschluß der
Behandlung auch wieder entnommen werden.
Die Ausführung des Filterverbundes nach Anspruch 28, in
der der Durchmesser der Filter 5 dem Durchmesser der
Aussparungen 4 in der unteren Platte 3 gemäß einer Vor
richtung nach einem der Ansprüche 1 bis 19 entspricht,
bewirkt, daß die Aussparungen 4 der unteren Platte 3
abgedichtet werden und damit der Boden für den Reakti
onsraum der Vorrichtung gebildet wird.
Die Ausführung des Filterverbundes nach Anspruch 29, in
der die Filter 5 aus Polycarbonat, Aluminiumoxid oder
Cellulosenitrat bestehen, ermöglicht, die unterschied
lichen Anforderungen, die sich durch unterschiedliche
Verwendung von Lösungsmitteln und Säuren ergeben und
sich weiterhin durch unterschiedliches Proteinbindungs
verhalten der jeweiligen Filtereigenschaften ergeben,
zu berücksichtigen.
Die Ausgestaltung des Filterverbundes nach Anspruch 30,
in der die Filter 5 eine Porengröße von 0,2 bis 0,45 mm
aufweisen, bewirkt, daß mit den Filtern 5 ein großer
Bereich an unterschiedlichen Mikroorganismen durch die
Filter 5 zurückgehalten werden kann und damit Behand
lungen, wie z. B. Hybridisierungen, unterschiedlich
großer Mikroorganismen durchgeführt werden können.
Die obere Platte 1 mit 96 Rohrfortsätzen 2, in einer
Anordnung von 12 × 8, wird mit der unteren Platte 3,
die ebenfalls 96 Aussparungen in einer Anordnung von
12 × 8 aufweist und die mit 12 Filterverbünden aus je 8
Filtern 5 pro Reihe bestückt wurde, flüssigkeitsdicht
zusammengesteckt. Die obere Platte 1 wird mit einem
Deckel komplett verschlossen. Die untere Platte 3 wird
mit einer Grundplatte 8, verstärkt durch einen Dich
tungsring 9, flüssigkeitsdicht abgedichtet. An die ge
samte Vorrichtung kann über die Grundplatte 8, die über
ein Absaugrohr 10 an eine Vakuumpumpe angeschlossen
ist, ein Vakuum angelegt werden. Zur sicheren Abdich
tung der zusammengesteckten Platten kann noch eine
Klammer um die gesamte Vorrichtung gespannt werden. Zur
Temperierung wird die gesamte Vorrichtung in einen
Thermoblock gegeben.
200 µl vorgewärmter Hybridisierungspuffer mit einem
entsprechenden Anteil Gensonden werden in den Reaktionsraum,
der aus den Rohrfortsätzen 2 der oberen Platte
1 zusammen mit den Filtern in den Aussparungen 4 der
unteren Platte 3 gebildet wird, gegeben. Anschließend
werden 100 µl fixierte Zellen hinzu gegeben. Nach einer
Hybridisierungsdauer von einer Stunde wird die Flüssig
keit abgesaugt, die Temperatur der Vorrichtung wird auf
die gewünschte Waschtemperatur reguliert und mit 200 µl
Waschpuffer aufgefüllt. Nach einer Stunde wird der
Waschpuffer mit Hilfe der Vakuumpumpe, die an die
Grundplatte 8 über das Absaugrohr 10 angeschlossen wur
de, abgesaugt. Es werden erneut 200 µl Waschpuffer zu
gegeben und wieder abgesaugt. Die Filter werden nun aus
der Vorrichtung entfernt, indem der gesamte Filterver
bund aus 8 Filtern pro Reihe aus der unteren Platte
entnommen wird. Dieser Filterverbund kann direkt
mikroskopisch untersucht werden. Bei Bedarf kann auch
eine Gegenfärbung in der Vorrichtung durchgeführt wer
den. Die Filter verbleiben während des gesamten Verfah
rens in den Aussparungen 4 der unteren Platte 3. Dies
hat den Vorteil, daß eventuell vom Filter abgelöste
Zellen durch Absaugen wieder aufgefangen werden können.
Claims (30)
1. Vorrichtung mit einer Vielzahl von Probenkammern
zur Behandlung von Zellen und zur Analyse mittels
lichterzeugender Verfahren,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie eine obere Platte (1) mit Rohrfortsätzen
(2) sowie eine untere Platte (3) mit Aussparungen
(4), in die mobile Filter (5) eingelegt werden, so
wie Mittel zum Absaugen von Flüssigkeit, umfaßt.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Vorrichtung eine temperierbare Kammer zuge
hörig ist.
3. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Mittel zum Absaugen von Flüssigkeit eine
Pumpe umfassen.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Pumpe direkt an die einzelnen Aussparungen
(4) der unteren Platte (3) oder an eine Grundplatte
(8) angeschlossen wird, welche die Gesamtheit der
Aussparungen abdichtet.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Filter (5) über Stege (6) miteinander ver
bunden sind.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Filterdurchmesser, dem Durchmesser der Aus
sparungen (4) entspricht.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Abstand zwischen den Filtern (5) dem Ab
stand zwischen den Aussparungen (4) der unteren
Platte (3) entspricht.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Filter (5) jeweils von einem Ring (7) umge
ben sind.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Durchmesser des Ringes (7) oberhalb des
Durchmessers der Aussparungen (4) der unteren Plat
te (3) liegt.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 oder 9,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Ring (7) eine Dicke von 0,2 mm nicht über
schreitet.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Filter (5) eine Porengröße von 0,2 bis
0,45 µm aufweisen.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Filter (5) aus Polycarbonat, Aluminiumoxid
oder Cellulosenitrat sind.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Durchmesser der Rohrfortsätze (2) der obe
ren Platte (1) dem Durchmesser der Aussparungen (4)
der unteren Platte (3) entspricht.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Rohrfortsätze (2) nach Aufsetzen auf die
untere Platte (3) ein Volumen bis 300 µl bilden.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie aus wärmeleitfähigem Material besteht.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie aus lichtundurchlässigem Material besteht.
17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 16,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie VA-Stahl umfaßt.
18. Vorrichtung nach Anspruch 17,
dadurch gekennzeichnet,
daß der VA-Stahl mit Teflon, Glas, Kunststoff, Gold
oder Keramik beschichtet ist.
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 18,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie sterilisierbar ist.
20. Filterverbund,
dadurch gekennzeichnet,
daß einzelne Filter (5) über Stege (6) miteinander
verbunden werden.
21. Filterverbund nach Anspruch 20,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Stege (6) aus Kunststoffmaterial bestehen.
22. Filterverbund nach einem der Ansprüche 20 bis 21,
dadurch gekennzeichnet,
daß die einzelnen Filter (5) von einem Ring (7) um
geben werden.
23. Filterverbund nach Anspruch 22,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Ring (7) aus Kunststoffmaterial besteht.
24. Filterverbund nach einem der Ansprüche 22 bis 23,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Ring (7) eine Dicke von 0,2 mm nicht über
schreitet.
25. Filterverbund nach einem der Ansprüche 22 bis 24,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Durchmesser des Ringes (7) um die Filter
(5) größer ist als der Durchmesser der Aussparungen
(4) in der unteren Platte (3) einer Vorrichtung
nach einem der Ansprüche 1 bis 19.
26. Filterverbund nach einem der Ansprüche 20 bis 25,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Filter (5) linear miteinander verbunden
sind.
27. Filterverbund nach einem der Ansprüche 20 bis 26,
dadurch gekennzeichnet,
daß 8 Filter (5) linear miteinander verbunden sind.
28. Filterverbund nach einem der Ansprüche 20 bis 27,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Durchmesser der Filter (5) dem Durchmesser
der Aussparungen (4) in der unteren Platte (3)
gemäß einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1
bis 19 entspricht.
29. Filterverbund nach einem der Ansprüche 20 bis 28,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Filter (5) aus Polycarbonat, Aluminiumoxid
oder Cellulosenitrat bestehen.
30. Filterverbund nach einem der Ansprüche 20 bis 29,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Filter (5) eine Porengröße von 0,2 bis
0,45 µm aufweisen.
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